JP2003531618A - 新規ヒト・ホスホリパーゼｃ・デルタ５ - Google Patents

新規ヒト・ホスホリパーゼｃ・デルタ５

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JP2003531618A
JP2003531618A JP2001580378A JP2001580378A JP2003531618A JP 2003531618 A JP2003531618 A JP 2003531618A JP 2001580378 A JP2001580378 A JP 2001580378A JP 2001580378 A JP2001580378 A JP 2001580378A JP 2003531618 A JP2003531618 A JP 2003531618A
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Japan
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seq
polypeptide
polynucleotide
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JP2001580378A
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ズィルケ ブラント、
クラウス デュッカー、
ヨハネス グライツ、
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Merck Patent GmbH
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Merck Patent GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

(57)【要約】 ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術によって製造するための方法が開示される。また、診断アッセイにおいて、該ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、以降、時に、「ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）」と称
する、新たに同定されたポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、診断ならびに、治療において潜在的に有用なアゴニスト、ア
ンタゴニストとなりえる化合物の同定におけるそれらの使用、ならびに、かかる
ポリヌクレオチドの製造に関する。
【０００２】 （発明の背景） 医薬探索プロセスは、現在、「機能的ゲノミクス」、すなわち、ハイ・スルー
プットな、ゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を取り込むことで、根本的な革新
を経験しつつある。治療の標的として、遺伝子および遺伝子産物を同定する手段
として、この方法は、急速に、「ポジショナル・クローニング」に基づく従前の
方法に取って代わりつつある。表現型、すなわち、生物学的機能または遺伝子的
疾患を同定し、その後、その遺伝子地図の位置に基づいて、その原因となる遺伝
子の探知がなされる。
【０００３】 機能的ゲノミクスは、ハイ・スループットなＤＮＡ配列決定技術、および現に
利用可能な多くの分子生物学データベースから、潜在的な重要性を有する遺伝子
配列を同定するためのバイオ・インフォマティクスの様々なツールに、大きく頼
っている。医薬探索の標的として、さらなる遺伝子およびその関連するポリペプ
チド／タンパク質を同定し、その特定を行うことが引き続き求められている。
【０００４】 治療されうる疾患は、重い静脈血栓症、不安定な狭心症、ＰＴＣＡ（経皮経管
的冠動脈造影）、血栓塞栓症の発作、播種性血管内（血液）凝固、動脈硬化、て
んかん、鬱病、神経変性疾患、卒中、発作、慢性関節リウマチ及び免疫疾患を含
む。
【０００５】 （発明の概要） 本発明は、ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）、特には、ホスホリパ
ーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）ポリペプチド、ホスホリパーゼＣ・デルタ５（
ＰＬＣＤ５）ポリヌクレオチド、およびそれらのスプライス変異体、組換え体お
よびその製造方法に関する。かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、そ
れらに限定はされないものの、（発明の背景）に示されている、特定の疾患（以
降、「本発明の疾患」と称する）を含む、それらの治療する方法に関連して、注
目されている。さらなる形態において、本発明は、本発明により提供される材料
を使用して、アゴニストおよびアンタゴニスト（例えば阻害剤）を同定するため
の方法、ならびにその同定された化合物を用いて、ホスホリパーゼＣ・デルタ５
（ＰＬＣＤ５）の不均衡に関連する症状を治療するための方法に関する。さらに
他の形態において、本発明は、不適当なホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ
５）の活性および濃度に付随する疾患を検出するための診断アッセイにも関する
。
【０００６】 （発明の説明） 第１の形態において、本発明はホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）ポ
リペプチドに関する。かかるポリペプチドには、 （ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５の配列を含んで
なるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド； （ｂ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一
性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離されたポリペプチド； （ｃ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列を含んでなる単離されたポリペプチド； （ｄ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一
性を有する単離されたポリペプチド； （ｅ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列；ならびに （ｆ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列と比較して、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同
一性指標を有するポリペプチド配列を有するか、または含んでなる単離されたポ
リペプチド； （ｇ）（ａ）〜（ｆ）に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異
体 が含まれる。
【０００７】 本発明のポリペプチドは、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ
Ｃ（ＰＬＣ）ファミリーのポリペプチドの一員であると考えられる。従って、そ
れらは、分泌型、おそらくは膜結合型（ＧＰＩアンカー型）の信号伝達タンパク
質の新しいクラスを構成するため、注目されている。ホスホリパーゼＣはホスフ
ァチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）を加水分解し、そ
の生成物はイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）であり、それ
は筋小胞体からカルシウム、及び１，２−ジアシルグリセロールを放出し、タン
パク質キナーゼＣを活性化する。
【０００８】 該ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）の生物学的性質を、以降、「ホ
スホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）の生物学的活性」、または「ホスホリ
パーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）活性」と称する。好ましくは、本発明のポリ
ペプチドは、少なくとも１つのホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）の生
物学的活性を示す。
【０００９】 本発明のポリペプチドには、全ての対立遺伝子形およびスプライス変異体を含
む、上記ポリペプチドの変異体もまた含まれる。かかるポリペプチドは、挿入、
欠失、ならびに保存的または非保存的であってもよい置換、あるいはそれらの任
意の組合せによって、基準のポリペプチドから変異している。特に好ましい変異
体は、幾つかの、例えば、５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５
〜３、３〜２、２〜１、または１個のアミノ酸が、任意の組合せで、挿入、置換
または欠失されているものである。
【００１０】 本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号：２もしくは配
列番号：４または配列番号：６のアミノ酸配列に由来する、少なくとも３０、５
０または１００個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペ
プチド、あるいは配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のアミ
ノ酸配列から、少なくとも３０、５０または１００の連続したアミノ酸が末端か
ら除去または欠失しているアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。
好ましいフラグメントは、ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）の生物学
的活性をもたらす、生物学的に活性なフラグメントであり、類似する活性または
改善された活性を有するか、あるいは望ましくない活性の低下したものも含まれ
る。また、動物、特に、ヒトにおいて抗原性または免疫原性である、それらのフ
ラグメントも好ましい。
【００１１】 本発明のポリペプチドのフラグメントは、対応する完全長型ポリペプチドをペ
プチド合成によって製造するために用いることができ；従って、これらの変異体
は、本発明の完全長型ポリペプチドを製造するための中間体として用いることが
できる。本発明のポリペプチドは、「成熟型」タンパク質の形態であってもよく
、あるいは、前駆体または融合タンパク質などの、より大きなタンパク質の一部
であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列、例え
ば、反復するヒスチジン残基、あるいは組換え生産の間の安定性に利する付加配
列が含まれる、付加的なアミノ酸配列を含むことは、しばしば、有益である。
【００１２】 本発明のポリペプチドは、何れかの好適な方法、例えば、天然に存在する提供
源や、発現システム（下記参照）を含んでなる遺伝子操作された宿主細胞からの
単離、または、例えば、自動化されたペプチド合成機を使用した化学合成によっ
て、あるいは、かかる方法の組合せによって、調製することができる。かかるポ
リペプチドを調製するための手段は、当該分野では十分に理解されている。
【００１３】 さらなる形態において、本発明は、ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５
）ポリヌクレオチドに関する。かかるポリヌクレオチドには、 （ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
チド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の
同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
チドを含んでなるポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
チドに対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一
性を有するポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
チド； （ｅ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一
性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポ
リヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一
性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチド； （ｈ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド； （ｉ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
チド配列と比較して、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９
の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を有するか、または含んでなるポリ
ヌクレオチド； （ｊ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
配列と比較して、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同
一性指標を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する
か、または含んでなるポリヌクレオチド；ならびに 上記のポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体である、またはその全長
にわたって、上記のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド が含まれる。
【００１４】 本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントには、配列番号：１もしく
は配列番号：３または配列番号：５の配列に由来する、少なくとも１５、３０、
５０または１００の連続した塩基を有する塩基配列を含んでなるポリヌクレオチ
ド、あるいは配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５の配列から
、少なくとも３０、５０または１００個の連続した塩基が末端から削除または欠
失している配列を含んでなるポリヌクレオチドが含まれる。
【００１５】 本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体には、スプライス変異体、対立遺
伝子変異体、および１つまたは複数の単一塩基多型（ＳＮＰ）を有するポリヌク
レオチドを含む多型体が含まれる。
【００１６】 本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２もしくは配列番号：４または配
列番号：６のアミノ酸配列を含んでなり、かつ幾つかの、例えば、５０〜３０、
３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１、または１個のア
ミノ酸残基が、任意の組合せで置換、欠失または付加されているポリペプチド変
異体をコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。
【００１７】 さらなる形態において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である
ポリヌクレオチドを提供する。従って、 （ａ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含んでなる； （ｂ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である； （ｃ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のＤＮＡ配列の
ＲＮＡ転写物を含んでなる；あるいは （ｄ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のＤＮＡ配列の
ＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド； ならびにそれらに対して相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド が提供される。
【００１８】 配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオチド配
列は、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ホスホリパーゼＣデルタ４（ＰＲＦ：２２０
６４３１Ａ）、Ｒｈｅｅ ＳＧ及びＬｅｅ ＳＢ（１９９６）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈ
ｅｍ，２７１（１），２５−３１、との相同性を示す。配列番号：１もしくは配
列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオチド配列は、配列番号：２もしく
は配列番号：４または配列番号：６のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列で
ある。配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列は、配列番号：１もしくは配列番号：４または
配列番号：６の配列をコードするポリペプチドと同一であってもよく、あるいは
遺伝子暗号の縮退（縮重性）の結果によって、同じく配列番号：２もしくは配列
番号：４または配列番号：６のポリペプチドをコードする、配列番号：１もしく
は配列番号：３または配列番号：５以外の配列であってもよい。配列番号：２も
しくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチドは、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉ
ｃｕｓ ホスホリパーゼＣデルタ４（ＰＲＦ：２２０６４３１Ａ）、Ｒｈｅｅ
ＳＧ及びＬｅｅ ＳＢ（１９９６）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，２７１（１），２５
−３１、との相同性および／または構造的類似性を有する、ホスファチジルイノ
シトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）ファミリーの他のタンパク質と類縁
している。
【００１９】 本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相
同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似する生物学的な機能／性質を
有することが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドは、少なくとも１つのホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）活
性を有する。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの心臓の細胞中のｍＲＮＡに由来するｃＤ
ＮＡライブラリーから標準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を使
用して取得することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照）。本発明のポ
リヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然の供給源から取得
することもでき、あるいは、周知の、市販の手法を使用して合成することもでき
る。
【００２１】 本発明のポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドの組換え製造に使用する
際には、該ポリヌクレオチドは、成熟型ポリペプチドのコード配列、それ自体、
あるいはリーダーまたは分泌配列、プレ−、もしくはプロ−またはプレプロ−タ
ンパク質配列、あるいは、他の融合ペプチド部分をコードするコード配列などの
、他のコード配列と読み枠を合わせた成熟型ポリペプチドのコード配列を含むこ
とができる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にする、マーカー配列がコ
ードされていてもよい。本発明のこの形態の幾つかの好ましい実施態様において
、該マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提供され
、そしてＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、（１９８９）８６：８２１〜８２４に記載されている、ヘキサ・ヒスチ
ジン・ペプチド、あるいはＨＡタグである。該ポリヌクレオチドはまた、転写さ
れる非翻訳の配列、スプライシングならびにポリアデニレーション・シグナル、
リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定化させる配列などの、非コードの
５’ならびに３’配列を含んでもよい。
【００２２】 配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオチド配
列に対して、同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション・プローブとして
、あるいは核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）用のプライマーとして、利用するこ
とができる。かかるプローブおよびプライマーは、本発明のポリペプチドをコー
ドする完全長型ｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離するために、ならびに、
配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５に対して、高い配列類似
性、典型的には、少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子（ヒトの供給源
に由来するパラログ、ならびにヒト以外の種に由来するオルソログおよびパラロ
グをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離するた
めに使用してもよい。好ましいプローブおよびプライマーは、一般に、少なくと
も１５塩基、好ましくは少なくとも３０塩基を含み、そして少なくとも１００塩
基ではなくとも、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは
、３０〜５０塩基を有するであろう。特に好ましいプライマーは、２０〜２５塩
基を有するであろう。
【００２３】 ヒト以外の種に由来するホモログをも含む、本発明のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５
の配列、またはそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも１５塩基の標
識されたプローブを用いて、厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ライブラ
リーをスクリーニングする過程；および前記ポリヌクレオチド配列を含有する完
全長型ｃＤＮＡクローンおよびゲノム・クローンを単離する過程を含んでなる工
程によって取得してもよい。かかるハイブリダイゼーション技術は、当業者には
周知である。好ましい厳格なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、
５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデ
キストラン硫酸および２０マイクログラム／ｍｌの変性させた剪断サケ精子ＤＮ
Ａを含んでなる溶液中で、４２℃、一晩インキュベーションし、その後、０．１
×ＳＳＣ中で、約６５℃にてフィルターを洗浄することが含まれる。従って、本
発明にはまた配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５の配列、ま
たはそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも１５塩基の標識されたプ
ローブを用いて、厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ライブラリーをスク
リーニングすることによって取得される、単離されたポリヌクレオチド、好まし
くは少なくとも１００塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドも含まれる。
【００２４】 当業者は、多くの場合において、該ポリペプチドをコードする領域は、５’末
端に至るまで完全には伸長していない点で、単離されたｃＤＮＡ配列は不完全で
あることもあることを理解している。これは、第１鎖のｃＤＮＡ合成の際に、ｍ
ＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完成させることができない、逆転写酵素、
すなわち、本来、低い「プロセシング能」（ポリメリゼーション反応の間、テン
プレートに結合した状態を維持する酵素の能力の指標）を有する酵素の結果であ
る。
【００２５】 完全長型ｃＤＮＡを取得する、あるいは短いｃＤＮＡを伸長させるために利用
でき、かつ当業者に周知の方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ端の迅速な増
幅（ＲＡＣＥ）方法に基づく方法がある（例えば、Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００
２、１９８８参照）。例えば、Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で例示される、この技術の最近の改良
は、より長いｃＤＮＡの探索を著しく簡単としている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標
）法では、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡと、その両端に連結された「
アダプター」配列とから、ｃＤＮＡが調製される。その後、遺伝子特異的ななら
びにアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを使用して、ｃ
ＤＮＡの「失われている」５’端を増幅するために、核酸増幅（ＰＣＲ）を実施
する。その後、「ネスティッド（入れこ型）」プライマー、すなわち、増幅産物
の内部にアニーリングするように設計されたプライマー（典型的には、アダプタ
ー配列においてさらに３’側にアニーリングするアダプター特異的なプライマー
、および既知の遺伝子配列においてさらに５’側にアニーリングする遺伝子特異
的なプライマー）を使用して、ＰＣＲ反応を繰り返す。そして、この反応の生成
物をＤＮＡ配列決定によって分析することができ、また、完全な配列を与えるよ
うに、既存のｃＤＮＡに該生成物を直接結合させる、あるいは、５’プライマー
の設計のために新しい配列情報を利用して、別途に完全長のＰＣＲを実施するこ
とのいずれかによって、完全長型のｃＤＮＡを構築することができる。
【００２６】 本発明の組換えポリペプチドは、発現システムを含んでなる遺伝子操作された
宿主細胞から、当該分野で周知の製法によって調製することができる。従って、
さらなる形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数
を含んでなる発現システム、かかる発現システムで遺伝子操作されている宿主細
胞、ならびに、組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。無細胞
翻訳システムもまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して、かか
るタンパク質を製造するために使用することができる。
【００２７】 組換え製造のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドに対する発現シ
ステムまたはその一部を取り込むように、遺伝子操作することができる。ポリヌ
クレオチドは、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（前述）などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されて
いる方法によって宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入する好ましい方法には、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレイプ負荷、バリスティッ
ク導入または感染が含まれる。
【００２８】 適当な宿主の代表的な例には、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属
、大腸菌、ストレプトミセス属ならびに枯草菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞や
アスペルギルス属細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ）Ｓ２細胞やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３ならびにＢｏｗｅｓ
メラノーマ細胞などの動物細胞；および植物細胞が含まれる。
【００２９】 非常に多様な発現システムを使用することができ、例えば、染色体、エピソー
ムおよびウイルスに由来するシステム、例えば、細菌プラスミド、バクテリオフ
ァージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメ
ント、バキュロウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスやレトロウイルスなどの
ウイルスに由来するベクター、ならびに、コスミドやファージミドなどの、プラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントから誘導されたものなどの
、それらの組合せに由来するベクターを使用することができる。該発現システム
は、発現を生じさせるとともに、調節をする制御領域を含有してもよい。一般に
、宿主内において、ポリペプチドを生産するためのポリヌクレオチドを維持、増
殖、または発現させることが可能である、システムまたはベクターはいずれも使
用することができる。適切なポリヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．（前述）中に示されているものなどの、周知で慣用の手法種々
のいずれかによって発現システムに挿入することができる。適当な分泌シグナル
を、小胞体の内腔、ペリプラズム腔または細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌
を可能にするために、所望するポリヌクレオチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルは、該ポリペプチドに対して内因性であってもよく、あるいは異種
のシグナルであってもよい。
【００３０】 スクリーニング・アッセイにおいて使用するために、本発明のポリペプチドを
発現させる際には、該ポリペプチドは細胞の表面で産生されることが、一般に好
ましい。この場合、スクリーニング・アッセイにおいて使用するに先立ち、細胞
を集菌してもよい。該ポリペプチドが培地内に分泌される場合には、該ポリペプ
チドの回収および精製を行うため、培地を回収することができる。細胞内で産生
される場合には、ポリペプチドを回収する前に、細胞を予め溶解しなければなら
ない。
【００３１】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース・クロマトグ
ラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティー・クロマトグラフィ
、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィおよびレクチン・クロマトグラフ
ィを含む、周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することが
できる。最も好ましくは、ハイ・パフォーマンス・液体クロマトグラフィが精製
のために使用される。該ポリペプチドが、細胞内合成、単離および／または精製
の間に変性する際には、周知のタンパク質のリフォールディング方法を、活性な
立体配座を再生させるために使用することができる。
【００３２】 本発明のポリヌクレオチドは、関連する遺伝子における変異の検出を通して、
診断試薬として使用することができる。ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列において
、配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオチドに
よって特定され、また、機能不全に関連している、変異体型遺伝子の検出は、そ
の遺伝子の過少な発現、過剰発現、あるいは変更された空間的または時間的な発
現に起因する、疾患または疾患に対する感受性の診断に付加、あるいは、確定さ
せることができる診断ツールを提供する。遺伝子に変異を有する個体は、当該分
野で周知な様々な手法によって、ＤＮＡレベルで検出することができる。
【００３３】 診断に供する核酸は、対象の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織生検または
剖検試料などから得ることできる。ゲノムＤＮＡを、直接、検出のために使用し
てもよく、あるいは、分析に先立ち、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または
他の増幅技術を使用して、酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもま
た、同様な手順で使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と
比較して、増幅産物のサイズにおける変化によって検出することができる。点変
異は、増幅されたＤＮＡを、標識されたホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ
５）の塩基配列に対して、ハイブリダイゼーションさせることによって同定する
ことができる。完全に一致する配列は、ミスマッチした二重鎖と、ＲＮａｓｅ消
化、あるいは融解温度における差によって、弁別することができる。ＤＮＡ配列
の相違はまた、変性剤の存在下または非存在下での、ゲルにおけるＤＮＡフラグ
メントの電気泳動移動度の変化によって、あるいは、直接的なＤＮＡ配列決定に
よって検出してもよい（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
（１９８５）２３０：１２４２参照）。特定の位置における配列の変化もまた、
ＲＮａｓｅならびにＳ１保護などの、ヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいは化学
的な切断方法によって、明らかにすることもできる（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９８５）８５：４３
９７〜４４０１参照）。
【００３４】 ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）のポリヌクレオチド配列またはそ
のフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチド・プローブのアレイを、例えば
、遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築することができる。か
かるアレイは、好ましくは、高密度のアレイまたは格子状である。アレイ化技術
の方法は、周知であり、一般的な適用性を有しており、また、遺伝子発現、遺伝
子連鎖および遺伝子変動性を含む、分子遺伝学における様々な問題を解明するた
めに使用することができ、例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２７４，６１０〜６１３（１９９６）およびそれに引用されている他の参考
文献を参照する。
【００３５】 異常に、低下または増大しているポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルの
検出もまた、本発明の疾患に対する、被験体の感受性を診断または検出するため
に使用することができる。低下、または増大した発現は、例えば、核酸増幅、例
えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン・ブロットおよび他の
ハイブリダイゼーション法などの、当該分野で周知の、ポリヌクレオチドの定量
方法のいずれかを使用して、ＲＮＡレベルで測定することができる。宿主に由来
するサンプルにおける、本発明のポリペプチドなどのタンパク質レベルを決定す
るために使用することができるアッセイ手法は、当業者には周知である。かかる
アッセイ方法には、放射免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタン・ブロ
ット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【００３６】 したがって、別の形態において、本発明は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号：１もしくは配列番号
：４または配列番号：６のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくはそ
のＲＮＡ転写物； （ｂ）（ａ）の配列に対して相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号：２もしくは配列番号：４
または配列番号：６のポリペプチドまたはそのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号：２もしくは配列番号：４
または配列番号：６のポリペプチドに対する抗体 を含んでなる診断キットに関する。
【００３７】 かかるキットの何れにおいても、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、実
質的な成分を構成することできることは理解される。かかるキットは、疾患また
は疾患に対する感受性、中でも、特に本発明の疾患を診断する際に有用である。
【００３８】 本発明のポリヌクレオチド配列は、染色体局在化の研究に有益である。該配列
は、個々のヒト染色体上の特定位置に対して、特異的に標的化されており、そし
て、ハイブリダイゼーションすることができる。本発明に従って、関連する配列
を染色体にマッピングすることは、それらの配列を遺伝子関連疾患と相関させる
上での、重要な最初の過程である。一度、配列を正確な染色体位置にマッピング
されると、染色体上における該配列の物理的な位置を、遺伝地図データと相関さ
せることができる。かかるデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、ヒトにお
けるメンデル遺伝（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ大学 Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能である）中で見出される。
同じ染色体領域にマッピングされている、遺伝子と疾患と間の関係は、その後、
連鎖解析（物理的に隣り合う遺伝子の同時遺伝）を通して、同定される。ゲノム
配列（遺伝子フラグメントなど）に関する、正確なヒト染色体上の局在化は、放
射ハイブリッド（ＲＨ）マッピングを使用して決定することができる（Ｗａｌｔ
ｅｒ，Ｍ．、Ｓｐｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．、Ｗｅｉｓｓｅｎｂ
ａｃｈ，Ｊ．およびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｐ．、（１９９４）、ゲノム全体の
放射ハイブリッド・マップを構築するための方法、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、７、２２〜２８）。多数のＲＨパネルを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国）から、例えば、ＧｅｎｅＢｒｉｄ
ｇｅ４ ＲＨパネル（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６、Ｍａｒ；５（
３）：３３９〜４６、ヒトゲノムの放射ハイブリッド・マップ。Ｇｙａｐａｙ
Ｇ．、Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｋ．、Ｆｉｚａｍｅｓ Ｃ．、Ｊｏｎｅｓ Ｈ．、Ｖｅ
ｇａ−Ｃｚａｒｎｙ Ｎ．、Ｓｐｉｌｌｅｔｔ Ｄ．、Ｍｕｓｅｌｅｔ Ｄ．、
Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ Ｊ．Ｆ．、Ｄｉｂ Ｃ．、Ａｕｆｆｒａｙ Ｃ．、Ｍｏ
ｒｉｓｓｅｔｔｅ Ｊ．、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．およびＧｏｏｄｆｅｌ
ｌｏｗ，Ｐ．Ｎ．）を入手可能である。このパネルを使用して遺伝子の染色体上
の位置を決定するためには、ＲＨ ＤＮＡ上の関心のある遺伝子から設計された
プライマーを使用して、９３回のＰＣＲが行われる。これらのＤＮＡのそれぞれ
は、ハムスターのバックグラウンド（ヒト／ハムスターのハイブリッド細胞株）
中に維持された、ランダムなヒト・ゲノム・フラグメントを含んでいる。このよ
うなＰＣＲは、目的とする遺伝子のＰＣＲ産物の存在または非存在を示す、９３
のスコアをもたらす。これらのスコアは、既知の位置のゲノム配列に由来するＰ
ＣＲ産物を使用して作製されたスコアと比較される。この比較は、ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／において行われる。本発明の
遺伝子は、ヒト染色体２ｑ３４−２ｑ３５，Ｉｎｔｅｒｖａｌ Ｄ２ｓ１６４−
Ｄ２ｓ１６３にマッピングされている。
【００３９】 本発明のポリヌクレオチド配列はまた、組織発現の研究に対する有益なツール
である。かかる研究は、それらをコードするｍＲＮＡを検出することによって、
コードされたポリペプチドの組織内の発現パターンに関する指標を与える、本発
明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能とする。使用される技術は、
当該分野では周知であり、また、ｃＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーシ
ョン（Ｓｃｈｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、４６７〜４７０
、１９９５およびＳｈａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、
６３９〜６４５、１９９６）などの、格子上に配列されたクローンに対する系内
・ハイブリダイゼーション技術、ならびにＰＣＲなどの塩基増幅技術を含む。好
ましい方法は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＴＡＱＭＡＮ（商標）
法を使用する。これらの研究による結果は、生物におけるポリペプチドの正常な
機能の指標を提供する。加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パターンと、同じ遺伝子
の別の形態（例えば、潜在的または調節的な変異をコードするポリペプチドにお
ける変化を有するもの）によってコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較
研究は、本発明のポリペプチドの役割、または疾患におけるその不適切な発現の
役割に対する有益な見識を提供することができる。かかる不適切な発現は、時間
的、空間的または単に量的な性質のものであってもよい。
【００４０】 本発明のポリペプチドは、心臓、脳、肺および網膜において発現される。
【００４１】 本発明のさらなる形態は、抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそのフ
ラグメント、あるいはそれらを発現している細胞は、本発明のポリペプチドに対
して免疫特異的である抗体を作製するための免疫原として、使用することができ
る。「免疫特異的」の用語は、抗体が、先行技術における他の関連するポリペプ
チドに対するそれらの親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して、実質的に
より大きな親和性を有することを意味する。
【００４２】 本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、慣用的なプロトコルを使用
して、該ポリペプチドまたはエピトープ保持したフラグメント、あるいは細胞を
、動物、好ましくは、非ヒト動物に、投与することによって取得することができ
る。モノクローナル抗体の調製には、継代的な細胞株培養物によって産生される
抗体を提供する技術のいずれをも、使用することができる。例には、ハイブリド
ーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ（
１９７５）、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
（１９８３）、４：７３）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９
８５）が含まれる。
【００４３】 米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているものなどの、一本鎖抗体を
製造するための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造す
る上で応用することができる。また、トランスジェニック・マウスあるいは他の
哺乳動物を含む他の生物を、ヒト化抗体を発現させるために使用してもよい。
【００４４】 上記抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために
、あるいはアフィニティー・クロマトグラフィによって該ポリペプチドを精製す
るために使用してもよい。本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、中でも
、本発明の疾患を治療するために使用することができる。
【００４５】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとして使用す
ることができる。従って、さらなる形態において、本発明は、その疾患が個体に
おいて既に慢性化しているか否かに関わらず、前記動物を疾患から保護するため
に、抗体および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞また
は細胞傷害性Ｔ細胞を含む）を生じさせるに適する、本発明のポリペプチドを哺
乳動物に接種することを含んでなる、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する
ための方法に関する。哺乳動物における免疫学的応答はまた、本発明にかかる疾
患から前記動物を保護するための抗体を産生するような、かかる免疫学的応答を
誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで、該ポリヌクレオチドの発現を支配し、かつ
該ポリペプチドをコードしているベクターによって、本発明のポリペプチドを送
達することを含んでなる方法によって誘導してもよい。該ベクターを投与する１
つの方法は、粒子またはそれ以外のものの上へのコーティング物として、所望す
る細胞中へのそれを促進することによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、修飾型核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことができる。用途に
よって、ワクチン、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン配合物
（組成物）として提供される。該配合物はさらに、適合するキャリアを含むこと
ができる。ポリペプチドは胃において分解されることもあるため、それは、好ま
しくは非経口的に投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、あるいは皮内注
射）。非経口投与に好適な配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに配
合物を接種者の血液と等張性にする溶質を含んでもよい、水性および非水性の無
菌注射液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでもよい、水性および非水性の無
菌懸濁剤が含まれる。該配合物は、単位用量または多回用量容器、例えば、密封
されたアンプルならびにバイアルに入れて提供することができ、また、使用直前
に無菌の液体キャリアを添加するだけでよい、凍結乾燥状態で保存することがで
きる。該ワクチン配合物はまた、水中油型システムや当該分野で既知のその他の
システムなどの、配合物の免疫原性を増強するためのアジュバント・システムを
含むことができる。投与量は、該ワクチンの比活性に依存し、型どおりの実験に
よって容易に決定することができる。
【００４６】 本発明のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の疾患状態、特に、既に記載し
た本発明の疾患に関連している、１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。
従って、該ポリペプチドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定す
ることは有用である。従って、さらなる形態において、本発明は、該ポリペプチ
ドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定するために、化合物をス
クリーニングする方法を提供する。かかる方法は、上に記載したような本発明に
の疾患に対する治療および予防目的のために使用することができる、アゴニスト
またはアンタゴニストを同定する。化合物は、様々な供給源、例えば、細胞、無
細胞調製物、化学的ライブラリー、化学化合物のコレクション、および天然産物
混合物から同定することができる。このように同定される、かかるアゴニストま
たはアンタゴニストは、場合によっては、ポリペプチド自体の、天然または修飾
された基質、リガンド、受容体、酵素など；その構造的または機能的な模倣体（
Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１（２）：５章（１９９１）参照）あるいは小分子であ
ってもよい。
【００４７】 該スクリーニング方法は、候補化合物に直接的または間接的に連結されている
標識を利用して、該ポリペプチド、あるいは該ポリペプチドまたはその融合タン
パク質を表出している細胞または膜に対する候補化合物の結合を単に測定するこ
とでもよい。代わりに、該スクリーニング方法は、標識された競合剤（例えば、
アゴニストまたはアンタゴニスト）に対して、候補化合物のポリペプチドに対す
る競合的な結合の（定性的または定量的に）測定または検出を含んでもよい。さ
らに、これらのスクリーニング方法では、該ポリペプチドを表出している細胞に
適する検出システムを使用して、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害
によって誘起されるシグナルをもたらすか否かを調べることでもよい。活性化の
阻害剤は、一般には既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして、候補化
合物の存在による、アゴニストによる活性化に対する作用を観測する。さらに、
該スクリーニング方法は、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液
と混合して、混合体を形成させる工程、混合物におけるホスホリパーゼＣ・デル
タ５（ＰＬＣＤ５）活性を測定する工程、および混合物のホスホリパーゼＣ・デ
ルタ５（ＰＬＣＤ５）を、候補化合物を含有しないコントロール混合物と比較す
る工程を単に含んでなることでもよい。
【００４８】 本発明のポリペプチドは、従来の低い容量のスクリーニング方法、そして、ま
た、ハイ・スループットなスクリーニング（ＨＴＳ）形態においても、使用する
ことができる。かかるＨＴＳ形態には、十分に確立された、９６−、また、最近
では、３８４−ウエル・マイクロ・タイター・プレートの使用のみでなく、Ｓｃ
ｈｕｌｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４６，２０〜２
９（１９９７）に記載されている、ナノウエル法などの開発途上の方法もまた含
まれる。
【００４９】 既に記載したような、Ｆｃ部分およびホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ
５）ポリペプチドから作製されるものなどの、融合タンパク質もまた、本発明の
ポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための、ハイ・スループットな
スクリーニング・アッセイのために使用することができる（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２〜５８（１９
９５）；ならびにＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２７０（１６）：９４５９〜９４７１（１９９５）参照）。
【００５０】 スクリーニング技術 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および該ポリペプチドに対する抗
体はまた、細胞内におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する、添加さ
れた化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を形成するために使用す
ることができる。例えば、当該分野で公知の標準的な方法によって、モノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体を使用して、ポリペプチドの分泌または細胞結合
している濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを構築することができる。
これは、適当に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害また
は増強することができる薬剤（また、それぞれアンタゴニストまたはアゴニスト
とも呼ばれる）を発見するために使用することができる。
【００５１】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的な受容体結合手法を通して
、存在する場合には、膜結合型または可溶性の受容体を同定するために使用する
ことができる。これらには、それに限定されないものの、ポリペプチドを、放射
性同位体（例えば、125Ｉ）で標識、化学修飾（例えば、ビオチン化され）、あ
るいは検出または精製に好適なペプチド配列と融合して、そして推定される受容
体の供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）とインキュベーショ
ンする、リガンド結合ならびにクロスリンク・アッセイが含まれる。他の方法に
は、表面プラズモン共鳴および分光測定法などの、生物物理学的技術が含まれる
。これらのスクリーニング方法はまた、存在する場合には、ポリペプチドのその
受容体に対する結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニ
ストを同定するために使用することができる。かかるアッセイを行うための標準
的な方法は、当該分野では十分に理解されている。
【００５２】 本発明のポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体、あるいは、ある場合
には、該ポリペプチド自体のリガンド、基質、受容体、酵素などに密接に関連す
るオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、場合により、例えば、該リガンド、基
質、受容体、酵素などのフラグメント；あるいは本発明のポリペプチドに結合す
るものの、応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる、小分
子が含まれる。
【００５３】 スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびホスホリパーゼＣ
・デルタ５（ＰＬＣＤ５）遺伝子の使用を含んでもよい。トランスジェニック動
物を構築する手法は十分に確立されている。例えば、受精した卵母細胞の雌性前
核へのマイクロインジェクション、移植前または移植後の胚へのレトロウイルス
移入、エレクトロポレーションなどによって、遺伝子操作された胚性幹細胞の宿
主胚盤胞への注入を通して、ホスホリパーゼＣ・デルタ５（ＰＬＣＤ５）遺伝子
を導入することができる。特に有用なトランスジェニック動物は、その動物のゲ
ノム内において、動物の遺伝子がヒトの等価体によって置き換えられている、所
謂「ノック・イン」動物である。ノック・イン・トランスジェニック動物は、医
薬探索のプロセスにおいて、化合物はヒトの標的に対して特異的であるという、
標的の妥当性検証用に有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、内因
性ＤＮＡ配列によってコードされている、本発明のポリペプチドに対する動物オ
ルソログの発現が細胞内で部分的または完全に無効とされている、所謂「ノック
・アウト」動物である。遺伝子のノック・アウトは、技術の限界の結果として、
特異的な細胞または組織を対象とする、特定の細胞または組織においてのみ起き
ていてもよく、あるいは、動物内の全て、または実質的に全ての細胞において生
じてもよい。トランスジェニック動物の手法はまた、導入された遺伝子が、本発
明のポリペプチドを大量に供するために発現させられる動物全体の発現−クロー
ニング・システムを提供する。
【００５４】 上記の方法において使用されるスクリーニング・キットは、本発明のさらなる
形態をなす。かかるスクリーニング・キットは、 （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現している細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体； を含んでなり、好ましくは、前記のポリペプチドは、配列番号：２もしくは配列
番号：４または配列番号：６のものである。
【００５５】 かかるキット何れの中においても、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、
実質的な構成要素を構成することは理解される。
【００５６】 （用語集） 下記の定義は、本明細書中で既に頻繁に使用されているいくつかの用語の理解
を容易にするために提供される。
【００５７】 本明細書中に用いられる「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗
体、キメラ、一本鎖、ならびにヒト化抗体、同様に、Ｆａｂフラグメントをも包
含し、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリンの発現ライブラリー生成物をも包含する
。
【００５８】 「単離（された）」は、その天然の状態から、「ヒトの手によって」変化して
いること、すなわち、自然界に存在する場合、その本来の環境から変化、または
移動されているか、あるいは、その両方であることを意味する。例えば、生きた
生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」され
てはいないが、その天然状態の共存物質から分離された、同じポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、この用語の本明細書中での用法に従うと、「単離」され
ている。さらに、形質転換、遺伝子操作、または何らかの他の組換え方法によっ
て、生物中に導入されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物
が生存または非生存かのいずれでも、前記生物中に依然として存在している場合
でさえ、「単離」されている。
【００５９】 「ポリヌクレオチド」は、一般には、非改変型または改変型のＲＮＡあるいは
ＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオ
キシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を指す。「ポリヌクレオチド」には、限定では
ないものの、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合物であ
るＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖と二本鎖の領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖、または、より典型的には、二本鎖の、あるいは、一本
鎖と二本鎖の領域の混合物であってもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハ
イブリッド分子が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含んでなる三重鎖領域をもいう。用語
「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾（された）」塩基には、例えば、トリチル化
された塩基、ならびに、イノシンなどの非通常型の塩基が含まれる。様々な修飾
をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ、従って、「ポリヌクレオチド」
は、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態と同様に、
自然界に典型的に見出されるような、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または
代謝的に修飾された形態をも包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしば
オリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
【００６０】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち
ペプチド等配電子体）によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含んでな
るポリペプチドのいずれをも指す。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプ
チドまたはオリゴマーと広く呼ばれる短い鎖、ならびに、一般にはタンパク質と
呼ばれる、より長い鎖の双方ともをいう。ポリペプチドは、遺伝子によってコー
ドされる２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することができる。「ポリ
ペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、あるいは当該分野
で周知の化学的な修飾方法のいずれかによって、修飾がなされたアミノ酸配列が
含まれる。かかる修飾は、基本的な教本、およびより詳細な専門書、ならびに数
多くの研究文献中に、広く記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側
鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内のいずれの
位置に生じさせることもできる。同じタイプの修飾が、所与ポリペプチド内のい
くつかの部位に同じ程度または異なる程度で存在してもよいことが理解される。
また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。ポリペプチ
ドは、ユビキチン化の結果として分枝がなされてもよく、また、分枝を有する、
または有していない、環状であってもよい。環状、分枝状および分枝した環状の
ポリペプチドは、翻訳に続く天然のプロセスに起因しても、あるいは合成的方法
によって作製されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、クロス・リンク形成、環化、ジスル
フィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピロ
グルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩ
・アンカー形成、ヒドロキシ化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化
、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファー・ＲＮ
Ａ媒介付加、ならびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２
版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．、翻訳後のタンパク質修
飾：全体像および展望、１〜１２、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ
．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９
８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、「タンパク質修飾および非タンパク質補
助因子の分析」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２、６２６〜６４６、１９
９０；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．、「タンパク質合成：翻訳後修飾およびエー
ジング」、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３、４８〜６２、１９９２
参照）。
【００６１】 ポリペプチド配列の「フラグメント」は、基準の配列よりも短いものの、基準
となるポリペプチドと同一の生物学的な機能または活性を本質的に保持している
ポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、配列番
号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５の基準配列よりも短いポリヌク
レオチド配列をいう。
【００６２】 「変異体」は、基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるも
のの、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
いう。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、基準となるポリヌクレオチドに対
して、塩基配列に相違がある。変異体の塩基配列における変異は、基準となるポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて
も、させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、下記に説明するように、基準の
配列によってコードされるポリペプチド中における、アミノ酸の置換、付加、欠
失、融合および末端の短縮化を引き起こしてもよい。ポリペプチドの典型的な変
異体は、基準となるポリペプチドに対して、アミノ酸配列に相違がある。一般に
、改変は、基準となるポリペプチドおよび変異体の配列が全体的には非常に類似
し、そして多くの領域において同一となるように制限される。変異体ならびに基
準となるポリペプチドは、アミノ酸配列において、１つまたは複数の置換、挿入
、欠失の任意の組合せによって相違してもよい。置換または挿入されるアミノ酸
残基は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸残基であっても、なくても
よい。典型的な、保存的置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ； Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
； Ａｓｐ、Ｇｌｕ； Ａｓｎ、Ｇｌｎ； Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； Ｌｙｓ、Ａｒｇ
； ならびにＰｈｅおよびＴｙｒが含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体は、対立遺伝子などの天然に存在するものであってもよく、あるい
は天然では存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの天然には存在しない変異体は、変異誘発方法によって
、あるいは直接合成によって作製することもできる。また、１つまたは複数の翻
訳後の修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化
などを有するポリペプチドも、また変異体には含まれる。実施態様には、Ｎ末端
アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、ならびにＣ末端グリ
シンの修飾が含まれる。
【００６３】 「対立遺伝子」は、ゲノム中の所与の遺伝子座に存在する遺伝子の、２つまた
はそれ以上の選択的な形態の１つをいう。
【００６４】 「多型」は、集団内における、ゲノムにおける所与の位置における塩基配列（
仮に関連する場合には、コードされるポリペプチド配列）の変動をいう。
【００６５】 「単一塩基多型」（ＳＮＰ）は、集団内においてゲノム内の１つの塩基位置に
おける、塩基変動の発生をいう。ＳＮＰは、遺伝子内で、あるいはゲノムの遺伝
子間領域内で起こってもよい。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）を使
用してアッセイすることができる。該プロセスには、少なくとも３つのプライマ
ーが必要とされる。共通プライマーが、アッセイされる多型に対して、逆方向に
相補となるように使用される。この共通プライマーは、多型な塩基から５０ｂｐ
から１５００ｂｐの間で隔たったものとできる。それ以外の２つ（またはそれ以
上）のプライマーは、最後の３’塩基が、多型を構成する２つ（またはそれ以上
）の対立遺伝子の１つと一致するように変化している点を除いて、互いに同一で
ある。そして、それぞれ、共通プライマーおよび１つの対立遺伝子特異的プライ
マーを使用して、２つ（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を、サンプルＤＮＡにつ
いて行う。
【００６６】 本明細書中で使用されている「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列
から一旦転写され、ただし、択一的なＲＮＡスプライシングを受けている、ＲＮ
Ａ分子から作製されたｃＤＮＡ分子をいう。択一的なＲＮＡスプライシングは、
一般には、イントロンを除くために、一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受け
る際に生じ、それぞれ、異なるアミノ酸配列をコードしてもよい、１つ以上のｍ
ＲＮＡ分子の産生を引き起こす。スプライス変異体の用語はまた、上記のｃＤＮ
Ａ分子によってコードされるタンパク質をもいう。
【００６７】 「同一性」は、その配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリ
ペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間における相互関係を反
映している。一般に、同一性は、対比がなされている配列の長さにわたって、２
つのポリヌクレオチド配列、あるいは２つのポリペプチド配列の、それぞれ塩基
毎またはアミノ酸毎の厳密な一致をいう。
【００６８】 「％同一性」−正確な一致が存在しない配列については、「％同一性」を決定
することができる。一般に、対比すべき２つの配列を、配列間で最大の相関を与
えるようにアラインメントされる。これには、アラインメントの程度を高めるた
めに、「ギャップ」をいずれか一方の配列または両方の配列に挿入することを含
んでもよい。％同一性は、比較されている配列のそれぞれの全長にわたって、決
定してもよく（所謂、全体的なアラインメント）、同じ長さまたは非常に類似す
る長さの配列に対して、特に適している；あるいは、より短い、限定された長さ
にわたって、決定してもよく（所謂、局所的なアラインメント）、不ぞろいな長
さの配列において、より好適である。
【００６９】 「類似性」は、２つのポリペプチド配列の間における関係に対する、より精巧
な、さらなる尺度である。一般に、「類似性」は、残基毎に基づき、（同一性に
関してと、同様に）比較されている配列それぞれからの、相互に対をなす残基間
における正確な一致だけでなく、正確な一致が存在しない場合にも、進化的な基
準に基づいて、１つの残基は、他方に対する適当な置換であるかどうかをも考慮
する、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間での比較を意味する。この蓋然性は、
付随した「スコア」を有し、２つの配列の「％類似性」は、それに基づき決定す
ることができる。
【００７０】 ２つ以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法は、当該分野では
周知となっている。従って、例えば、ウイスコンシン配列分析パッケージ バー
ジョン ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、３８７〜３９５、１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）中の
利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ およびＧＡＰ プログラムを
、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、ならびに２つのポリペプチド配列間の
％同一性および％類似性を決定するために使用してもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所的相同性」アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．、１４７、１９５〜１９７、１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２、４８２〜４８９、１９８１）
を使用して、２つの配列間における、類似性の最も良い１つの領域を見出す。Ｂ
ＥＳＴＦＩＴは、長さが類似していない２つのポリヌクレオチド配列または２つ
のポリペプチド配列の比較に対してより適しており、該プログラムは、より短い
配列は、より長いものの一部を表すことを仮定している。一方、ＧＡＰは、Ｎｅ
ｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、
４８、４４３〜４５３、１９７０）に従って、「最大の類似性」を見出しつつ、
２つの配列をアラインメントする。ＧＡＰは、ほぼ同じの長さであり、また、ア
ラインメントが長さ全体にわって期待される配列の比較に対してより適している
。好ましくは、比較されるものを、最適にアラインメントするための、各プログ
ラムにおいて使用される「ギャップ加重」および「長さ加重」のパラメーターは
、それぞれ、ポリヌクレオチド配列に対しては、５０および３であり、ポリペプ
チド配列に対しては、１２および４である。好ましくは、比較されている２つの
配列を最適にアラインメントした上で、％同一性および類似性を決定する。
【００７１】 配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた
、当該分野では知られており、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、
４０３〜４１０、１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３８９〜３４０２、１９９７；Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）か
ら入手することができ、またｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣ
ＢＩのホームページからアクセス可能である）、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓ
ｏｎ ＷＲ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３、６３〜９
９、１９９０；Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５、２４４４〜２４４８、１９８
８；ウイスコンシン配列分析パッケージの一部として入手可能である）。
【００７２】 好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２ アミノ酸置換行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ
ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８９、１０９１５〜１０９１９、１９９２）を、比較の前に、ヌクレオチド
配列をアミノ酸配列に予め翻訳する場合をも含み、ポリペプチド配列の比較にお
いて使用する。
【００７３】 好ましくは、プログラム ＢＥＳＴＦＩＴが、基準とするポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列に関して、検討するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
配列の％同一性を決定するために使用され、前に記載したように、検討と基準と
する配列とは、最適にアラインメントされ、また、プログラムのパラメーターは
、暫定の値に設定されている。
【００７４】 「同一性指標」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と基準
の配列とを比較するために使用することができる、配列関連性の尺度である。す
なわち、例えば、基準とするポリヌクレオチド配列と比較して、例えば０．９５
の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は、該候補ポリヌクレオチド配
列は、基準の配列の各１００塩基あたり平均して５個までの相違を含んでもよい
点を除いて、基準の配列と同一である。かかる相違は、少なくとも１つの塩基欠
失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる
群から選択される。これらの相違は、基準となるポリヌクレオチド配列の５’ま
たは３’末端部位に、あるいはこれら末端部位の間の任意な位置で、基準配列内
の塩基間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは複数の連続した群中
で点在して、起こってもよい。換言すると、基準となるポリヌクレオチド配列と
比較した際、０．９５の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るために
は、既に記載したように、基準配列内の塩基１００個毎に、平均して５個までが
、任意の組合せで、欠失、置換または挿入されていてもよい。同じことが、同一
性指標の他の値、例えば、０．９６、０．９７、０．９８および０．９９につい
ても、必要に応じて変更して適用される。
【００７５】 同様に、ポリペプチドの場合には、基準のポリペプチド配列と比較したときに
、例えば、０．９５の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、基準の配列
の各１００アミノ酸あたり、平均して５個までの違いを該ポリペプチド配列が含
んでもよいことを除いて、基準の配列と同一である。かかる相違は、少なくとも
１つのアミノ酸の欠失、保存的ならびに非保存的な置換を含む置換、または挿入
からなる群から選択される。これらの相違は、基準となるポリペプチド配列のア
ミノ末端またはカルボキシ末端部位に、あるいはこれら末端部位間の任意の位置
に、基準配列内のアミノ酸間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは
複数の連続した群中に点在して、起こってもよい。換言すると、基準のポリペプ
チド配列と比較した際、０．９５の同一性指標を有するポリペプチド配列を得る
ためには、既に記載したように、基準配列内のアミノ酸の１００個毎に、平均し
て５個まで、任意の組合せで、欠失、置換または挿入がなされてもよい。同じこ
とが、同一性指標の他の値、例えば、０．９６、０．９７、０．９８および０．
９９についても、必要に応じて変更して適用される。
【００７６】 塩基またはアミノ酸の相違数と同一性指標との関係は、下記の式で表記でき、
ｎa≦ｘa−（ｘa・Ｉ） 式中、 ｎaは、塩基またはアミノ酸の相違数であり、 ｘaは、配列番号：１，２，３あるいは配列番号：４における塩基またはアミ
ノ酸のそれぞれの総数であり、 Ｉは、同一性指標であり、 ・は、乗算演算子に対する記号であり、 その際、ｘaとＩとの非整数の積は、ｘaから減ずるに先立ち、最も近い整数に
切り捨てられる。
【００７７】 「ホモログ」は、基準の配列に対して、高度の配列関連性を有するポリヌクレ
オチド配列またはポリペプチド配列を示すために、当該分野で使用されている一
般的な用語である。かかる関連性は、既に定義されているように、２つの配列間
の同一性および／または類似性の程度を決定することによって、定量化すること
もできる。この総称的な用語には、「オルソログ」および「パラログ」の用語が
含まれる。「オルソログ」は、別の種中における、該ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの機能的等価体であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
「パラログ」は、機能的に類似している、同じ種内にあるポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。
【００７８】 「融合タンパク質」は、２つの、関連しない、融合された遺伝子またはそのフ
ラグメントによってコードされるタンパク質をいう。その例が、米国特許第５５
４１０８７号、米国特許第５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−ＰＬＣＤ
５の場合、融合タンパク質の一部として、免疫グロブリンのＦｃ領域の使用は、
治療に使用する際のかかる融合タンパク質の薬物動態学的性質を改善するため、
ならびに、二量体型のＰＬＣＤ５を形成させるために、Ｆｃ−ＰＬＣＤ５または
該ＰＬＣＤ５の断片の機能的発現を行う上で好都合である。Ｆｃ−ＰＬＣＤ５の
ＤＮＡ構築物は、５’から３’の方向に、分泌カセット、すなわち、哺乳動物細
胞からの細胞外への輸送を誘起するシグナル配列、融合パートナーとして、免疫
グロブリンのＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＰＬＣＤ５をコ
ードするＤＮＡまたはその断片を含んでなる。ある用途では、融合タンパク質の
残部には手を触れることなく、機能的なＦｃ側を変異させ、その固有的な機能的
性質（補体結合、Ｆｃ受容体結合）を変える、あるいは発現後にＦｃ部分を完全
に除くことを可能とすることが望ましい。
【００７９】 特許および特許出願に限らず、これらを含む、本明細書中で引用されている刊
行物および参考文献の全ては、十分に述べているように、個々の刊行物または参
考文献を、参照して組み込むために、明示的かつ個別的に示唆されているように
、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。本出願が優先権を
主張する特許出願はいずれも、先に刊行物および参考文献に関して記載したと同
様に、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。
【００８０】 （さらなる実施例） 全長遺伝子のクローニング マラソン・ヒト骨格筋ｃＤＮＡ（Ｌｏｔ Ｎｏ．：８１１０４５０）（ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇ
ｅｒｍａｎｙ製）が逆配向性で遺伝子特異的プライマーＮｏ．１（配列番号：７
）及びＮｏ．２（配列番号：８）を用いて、ＰＣＲに使用された。ＰＣＲの条件
は、９４℃で１．３０分、９４℃で３０秒及び６８℃で１分を５サイクル、９４
℃で３０秒及び６６℃で１分を５サイクル、９４℃で３０秒及び６４℃で１分を
３２サイクル行い、続いて追加のステップとしてアドバンテイジ・ポリメラーゼ
（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて７２℃で３分間、である。ｃＤＮＡ増幅物はクロ
ーンされ配列決定された。
【００８１】 組織分布： 標準化されたヒトｃＤＮＡのセットを用いて、短い遺伝子フラグメントを増強
し、ＰＬＣＤ５の組織分布を調べた。この目的のためにｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍｕ
ｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ Ｐａｎｅｌ Ｉ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ
）を逆配向性の２つのＰＬＣＤ５遺伝子特異的プライマーＮｏ．３（配列番号：
９）及びＮｏ．３（配列番号：１０）と共に使用した。ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から
購入したアドバンテイジ・ポリメラーゼ混合物を用いて、７６２塩基長のＰＣＲ
フラグメントをゲル・フォトにおいて増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０
秒、さらに９４℃で３０秒、６１℃で１分、６８℃で３分を３０サイクルであり
、アドバンテイジ・ポリメラーゼを使用した。Ｇ３ＰＤＨ特異的プライマー５（
配列番号：１１）をプライマー５（配列番号：１２）を混合して、ポジティブコ
ントロールとして提供し、その結果、１．０９ｋｂの生成物を得た。ネガティブ
コントロールＰＣＲはＰＣＲ鋳型として滅菌水を使用した結果、ＰＣＲ生成物を
得ることができなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 複数の組織のｃＤＮＡパネルの１．１％アガロース・ゲルである。ヒト組織及
びコントロールを示す。ゲル上にはそれぞれ２０μｌのＰＣＲ反応が行われた。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 9/16 Ｄ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/16 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/58 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 5/00 Ａ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 ブラント、 ズィルケ ドイツ連邦共和国 64283 ダルムシュタ ット アデルンクシュトラーセ 35 (72)発明者 デュッカー、 クラウス ドイツ連邦共和国 64291 ダルムシュタ ット エッテステルシュトラーセ ５ (72)発明者 グライツ、 ヨハネス ドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタ ット リービックシュトラーセ 26 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA13 DA36 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 4B050 CC03 DD07 LL01 LL03 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QQ32 QQ53 QR08 QR42 QR56 QS25 QS33 QS34 QX02 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA27 CA44 CA46 4H045 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA24 EA50 FA72 FA74

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：
    ５の配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド； （ｂ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでな
    るポリペプチド； （ｃ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド； （ｄ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    配列、および （ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異
    体 からなる群から選択されるポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポ
    リペプチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポ
    リペプチド配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 （ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：
    ５のポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌ
    クレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
    チドに対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードす
    るポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードす
    るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、 （ｅ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５の配列または少
    なくとも１５塩基長を有するそのフラグメントを有する、標識されたプローブを
    用いて、厳格なハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニング
    することによって得られる、少なくとも１００塩基長の塩基配列を有するポリヌ
    クレオチド； （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドのＲＮＡ等価体であるポリヌクレオ
    チド； または前記ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド配列、 および前記ポリヌクレオチドの変異体またはフラグメントであるか、あるいは前
    記のポリヌクレオチドに対して、その全長にわたって相補的であるポリヌクレオ
    チド からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 （ａ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：
    ５のポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３または配列番号：５のポリヌクレオ
    チド； （ｃ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、および （ｄ）配列番号：２もしくは配列番号：４または配列番号：６のポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド からなる群から選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 該発現ベクターが適合性宿主細胞に存在する際、請求項１に
    記載のポリペプチドの生産が可能なポリヌクレオチドを含んでなる発現システム
    。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載されるポリペプチドを発現している、請求項
    ６に記載される発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞またはその膜。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリペプチドを製造するための方法であっ
    て、 請求項７に記載される宿主細胞を前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で培養
    して、該培養培地から該ポリペプチドを回収する工程を含んでなる方法。
  9. 【請求項９】 免疫グロブリンのＦｃ領域と請求項１のポリペプチドのいず
    れかとからなる融合タンパク質。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチドに
    対して免疫特異的な抗体。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載されるポリペプチドの機能または濃度を刺
    激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、 （ａ）該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現している細胞もしくは膜
    ）あるいはその融合タンパク質に対する、候補化合物の結合を、該候補化合物に
    直接的または間接的に結合している標識によって、定量的または定性的に測定ま
    たは検出すること； （ｂ）標識された競合剤の存在下で、該ポリペプチド（または該ポリペプチド
    を発現している細胞あるいは膜）あるいはその融合タンパク質に対する、候補化
    合物の結合の競合を測定すること； （ｃ）該ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを、該候補
    化合物がもたらすか否かを、該ポリペプチドを発現している細胞または細胞膜に
    適合している検出システムを使用して試験すること； （ｄ）候補化合物を、請求項１に記載されるポリペプチドを含有する溶液に混
    合して、混合物を作製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、そして
    、何らの候補化合物をも含有しないコントロールの混合物に対して、該混合物の
    活性を比較すること、または （ｅ）細胞中における前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは前記ポリ
    ペプチドの産生に対する候補化合物の作用を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使
    用して検出すること、 からなる群から選択される方法と、 （ｆ）生物工学的または化学的な標準的な手法に従って、前記化合物を製造す
    ること とを含んでなる方法。
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