ES2324433T3 - Tgf-beta novedoso similar a citocina. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UNA NUEVA CITOQUINA "TGF BE} UCLEOTIDO QUE CODIFICAN LA PCL13 Y FRAGMENTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS, ASI COMO METODOS DE EXPRESION Y USOS DE LAS PROTEINAS, FRAGMENTOS Y MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO.
Description
TGF-\beta novedoso similar a
citocina.
Esta invención se relaciona con una novedosa
TGF-b similar a citocina y para aislar moléculas de
polinucleótido que codifican esta proteína. Aplicaciones
particulares de la invención pueden incluir tratamientos para
cicatrización y consolidación de una fractura, ensayos de
tratamientos y diagnósticos para cáncer, enfermedades autoinmunes y
fibróticas.
Los macrófagos juegan un papel central en los
procesos inflamatorios crónicos. La importancia de estas células
deriva de la gran variedad de moléculas bioactivas que ellas
producen y por consiguiente, su capacidad para ampliar la respuesta
inflamatoria. Su papel central es también debido a su capacidad para
la comunicación con muchas otras células. Por ejemplo, el macrófago
derivado de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es
un factor de crecimiento importante para los fibroblastos y las
células de músculo liso. Otro grupo de proteínas de gran
significado en la relación de los macrófagos con varias células del
tejido conjuntivo (por ejemplo fibroblastos, músculo liso,
osteoblas-
tos endoteliales, etc.) son las citocinas de la superfamilia TGF-\beta, especialmente las proteínas TGF-\beta en sí mismas.
tos endoteliales, etc.) son las citocinas de la superfamilia TGF-\beta, especialmente las proteínas TGF-\beta en sí mismas.
La superfamilia TGF-\beta
consiste de factores de crecimiento y diferenciación que comparten
la homología estructural (1). En los vertebrados, las familias
individuales comprenden las proteínas TGF-\beta en
sí mismas, los factores de crecimiento y diferenciación (GDF)
(crecimiento embriónico y desarrollo), proteínas morfogenéticas
óseas (BMP) (inducen formación de cartílago y hueso), las inhibinas
y activinas (regulan la secreción FSH por la pituitaria), y
sustancia inhibidora de Müller (MIS) (regresión de conducto de
Müller durante diferenciación sexual masculina). Estas proteínas
comparten características estructurales importantes. Sus residuos
bioactivos en la región de terminal carboxi de
100-150 aminoácidos. Sobre esta región, los miembros
de esta superfamilia comparten aproximadamente 30% de identidad de
secuencia con TGF-\beta1 y tienen 7 residuos de
cisteína conservados. Dentro de los subgrupos individuales de la
superfamilia, las proteínas comparten 70% a 90% de identidad sobre
el dominio del termina carboxi bioactivo. Todos los miembros de la
superfamilia están a través de ser divididos en un grupo de
residuos básicos de aminoácidos 110 a 140 del terminal carboxi de
una proteína precursora. El procesamiento ocurre inmediatamente
luego de una secuencia RXXR conservada.
Las tres proteínas TGF-\beta
humanas comparten 80% de similitud de secuencia sobre la porción
bioactiva de la molécula. El propéptido (llamado péptido asociado a
latencia (\beta1-LAP)) exhibe menos de 50% de
similitud entre los miembros de la familia. El
\beta1-LAP se divide de la proteína madura, pero
el disulfuro permanece unido a este. La separación del
\beta1-LAP es necesaria para alcanzar actividad
biológica (2).
Han sido estudiadas las proteínas
TGF-\beta intensamente debido a su importancia
biológica y potencial terapéutico. Su biología y funciones son bien
conocidas y se han revisado extensamente (por ejemplo 2, 3, 4). En
términos generales ellas promueven diferenciación y función
diferenciada en una amplia variedad de células. Ellas son factores
quimiotácticos potentes para macrófagos y fibroblastos y
generalmente inhiben la proliferación celular, quizás debido a su
papel en la diferenciación. En el contexto de inflamación, el
TGF-\beta es un potente estimulador de colágeno
de fibroblasto y síntesis de proteína de matriz, promueve
angiogenia, modula expresión de moléculas de adhesión e inhibe
proliferación de linfocito, la producción de algunas linfocinas y
función celular NK. Esta molécula ha sido de gran interés a la
industria farmacéutica principalmente, por su capacidad demostrable
para promover cicatrización y consolidación de una fractura in
vivo. El TGF-\beta también ha estado
ampliamente implicada en la patogenia de procesos y mecanismos
inflamatorios crónicos. Wahl. SM. Enseña la transformación del
factor de crecimiento beta en inflamación (3). Adicionalmente, su
producción ha sido utilizada como un marcador sustituto por ejemplo
en enfermedades fibróticas activas tales como cirrosis y por lo
tanto como potencial en el ámbito diagnóstico.
Los presentes inventores han hora aislado una
molécula de polinucleótido que incluye un gen citosina novedoso,
clon 13 (CL13), que codifica una proteína dimérica (pCL13) que
aparece para representar el primer miembro de una nueva clase de
proteína dentro de la superfamilia TGF-\beta.
Las reivindicaciones describen las modalidades
específicas de la presente invención.
Se describe aquí una molécula de polinucleótido
aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica, o
complementariamente a una secuencia que codifica, una proteína
designada pCL 13 o un fragmento biológicamente activo de la
misma.
La molécula de polinucleótido aislada puede
comprender una secuencia de nucleótido la misma como aquella del
clon CL13 descrito aquí o puede contener sustituciones de nucleótido
sencillas o múltiples y/o eliminaciones y/o adiciones a éstas. Las
sustituciones de nucleótido que se pretenden pueden resultar en una
o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras
mediante sustituciones conservadoras, las combinaciones pretendidas
son -G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; F, Y, W, H; y P,
N\alpha-alquilaminoácidos. El término
"secuencia de nucleótido" también incluye secuencias con
homología suficiente para hibridar con la secuencia de nucleótido
bajo medio o, más preferiblemente, condiciones de restricción altas
(5) y con secuencias de nucleótido que codifican funcionalmente
secuencias equivalentes. En adición, el término "secuencia de
nucleótido" incluye secuencias que tienen por lo menos 70%, más
preferiblemente 90%, homología para clon 13 descrita aquí o
cualquier porción de las mismas de > 10 nucleótidos en
longitud.
Más preferiblemente, la molécula de
polinucleótido aislada una secuencia de nucleótido sustancialmente
correspondiente a la secuencia de nucleótido mostrada en la Figura
1 o una porción de la misma, o una secuencia complementaria a ésta.
El término "porción de la misma", en este respecto, es
entendido como referenciado a las porciones de la secuencia de
nucleótido que codifica fragmentos de proteína biológicamente
activos y también, a porciones de la secuencia de nucleótido,
preferiblemente > 10 nucleótidos en longitud, que se pueden
utilizar en, o para la producción de sondas útiles para, ensayos de
hibridación.
También se describen aquí los cebadores
oligonucleótidos para las anteriores secuencias, secuencias
anticodificantes y homólogos de dichos cebadores y secuencias
anticodificantes, secuencias de ribozima complementarias, sitios de
unión de anticuerpo catalítico y mutantes negativos dominantes de la
molécula de polinucleótido.
Se describe aquí una proteína designada pCL13, o
un fragmento biológicamente activo de la misma, en forma
sustancialmente pura.
Preferiblemente, la proteína, o fragmento
biológicamente activo de las mismas, comprende un polipéptido
monomérico que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde
sustancialmente a la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura
1 o un fragmento de la misma.
Fragmentos biológicamente activos de la misma
como se describen aquí se refiere a polipéptidos pCL13 monoméricos
(con o sin el propéptido) y otro polipéptido o porciones de péptido
(sea monomérico o dimérico) de los mismos que pueden consistir de
secuencias que inhiben, imitan o mejoran el efecto biológico de la
proteína y mutantes de proteína negativos dominantes, que unen
proteínas que incluyen receptores solubles, otras proteínas y/o
glucosaminoglucanos. El propéptido pCL13 también puede representar
un fragmento biológicamente activo de pCL13.
La proteína, o fragmento biológicamente activo
de la misma, como se describe aquí se puede purificar a partir de
fuentes naturales (por ejemplo pulmones, piel etc.) o estirpes
celulares, o se pueden reproducir recombinantemente mediante
cualquiera de los métodos habituales en la técnica (5).
Se describe aquí un organismo no humano
transformado con la molécula de polinucleótido descrita aquí.
Los organismos que se pueden transformar de
manera útil con la molécula de polinucleótido descrita aquí incluyen
bacterias tales como E. coli y B. subtilis, estirpes
celulares eucarióticas tales como CHO, hongos, levadura, animales
no humanos y plantas.
Animales no humanos transformados, o
transgénicos se pueden establecer para, por ejemplo, sobreexpresar
CL13, pCL13 o un fragmento biológicamente activo de los mismos o,
alternativamente, generar moléculas de ARN antisentido o ribozimas
para inhibir expresión CL13 intacta.
Se describe aquí un anticuerpo o fragmento del
mismo específico a pCL13 o una porción antigénica de los mismos. El
anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal y se puede producir
mediante cualquiera de los métodos habituales en la técnica.
También se entiende que la invención se
relaciona con equipos para ensayos diagnósticos, dichos equipos
comprenden un anticuerpo como se describe aquí o cebadores de
nucleótido para ensayos basados en PCR.
Se describe aquí una proteína o porción
antigénica de la misma, capaz de unir a un anticuerpo
anti-pCL13.
El pCL13 es adecuado para procedimientos in
vivo y in vitro que involucran células humanas y
animales. El pCL13 es también adecuado para uso médico y
veterinario. En particular, el pCL 13 puede ser adecuado para
métodos de tratamiento para cualquier enfermedad o afección
benéficamente tratable con TGF-\beta u otro
miembro de la superfamilia TGF-\beta.
Se describe aquí un método de tratamiento para
asistir cicatrización y/o consolidación de fractura y/o lesión
isquémica, que comprende administrar (por ejemplo, oralmente,
tópicamente, intravenosamente o subcutáneamente) a un sujeto una
preparación que comprende una proteína, o fragmento biológicamente
activo de la misma, como se describe aquí, opcionalmente en mezcla
con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado.
La proteína, o fragmento biológicamente activo
de la misma, como se describe aquí, puede también ser útil para uno
o más de los siguientes:
(i) Inmunosupresión y efectos antiinflamatorios
para afecciones tales como enfermedades autoinmunes o
transplante;
(ii) Regulación por disminución de extravasación
y movilidad en procesos infectivos o inflamatorios; y
(iii) Tratamiento de tumores a través de apoyo
de diferenciación y acción de antiproliferación.
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Tales usos se pueden alcanzar mediante
administración de la proteína, o un fragmento biológicamente activo
de las mismas, a un sujeto, o mediante terapia de gen utilizando
todo o parte de la molécula de polinucleótido descrita aquí. Tal
terapia de gen se puede utilizar para, por ejemplo, establecer
sobreexpresión de CL13, o pCL13 o un fragmento biológicamente
activo de los mismos en la célula anfitriona o, alternativamente,
para generar moléculas de ARN antisentido o ribozima para inhibir
expresión CL13 intacta.
Es también posible que la inhibición de la
acción del pCL13 puede proporcionar tratamiento de trastornos
fibróticos/fibroproliferativos tales como artritis reumatoide,
aterosclerosis, fibrosis pulmonar, escleroderma, cirrosis y
queloides, e inhibición de inmunosupresión de tumor asociada con
afecciones tales como tumores, infecciones (especialmente viral) y
enfermedades inflamatorias crónicas. Estos tratamientos se pueden
alcanzar al utilizar:
fragmentos o péptidos de la proteína pCL13 que
inhiben la unión del receptor;
proteínas de unión para pCL13 que incluye
receptores solubles para esta molécula, los glucosaminoglucanos, y
otras moléculas que pueden inhibir o desestabilizar interacción de
ligando de receptor;
anticuerpos dirigidos a pCL13 o su receptor;
estrategias antisentido o ribozima en las que se
altera la expresión o estabilidad del producto de gen pCL13;
mutantes negativos dominantes del gen CL13 que,
cuando se expresa en una célula anfitriona, desestabilizará o
afectará la actividad del pCL13. (Como la proteína pCL13 es un
dímero, un segundo producto de gen que se ha modificado puede unir
al pCL13 nativo para formar un heterodímero). Así, una variante
pCL13 apropiadamente modificada puede esencialmente dar el pCL13
inactivo a través de mecanismos tales como degradación mejorada,
circulación intracelular aberrante e inhibición de exportación de la
célula e inhibición de bioactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, se describe aquí una proteína
heterodimérica que comprende un polipéptido monomérico de pCL13
junto con un polipéptido monomérico de otra proteína de la
superfamilia TGF-\beta.
EL pCL13 o fragmentos biológicamente activos del
mismo se pueden formular en composiciones farmacéuticas estándar
adecuadas para la administración de proteínas. Formulaciones
adecuadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Company,
Easton, PA.
Los niveles de dosificación del pCL13 o
fragmentos biológicamente activos del mismo se pueden comparar con
aquellos útiles para otros miembros de la superfamilia
TGF-\beta. Estos niveles son bien conocidos en la
técnica, y se puede ajustar la dosificación precisa de acuerdo con
la afección del sujeto, el modo de administración, y el juicio del
médico que atiende.
Aplicaciones de diagnóstico posibles incluyen
diagnóstico de cáncer, trastornos inflamatorios y fibróticos tales
como artritis reumatoide, cirrosis y alterosclerosis en los que la
síntesis mejorada de este gen puede estar presente.
Para facilitar las aplicaciones anteriormente
mencionadas para pCL13, será necesario producir la proteína en
cantidades grandes. Sin embargo, estudios extensos con otros
miembros de proteína de la superfamilia TGF-\beta,
ha revelado un número de dificultades en alcanzar la expresión en
cantidades comerciales. Por ejemplo, la expresión en sistemas
procarióticos simples son grandemente inadecuados debido a los
miembros de la superfamilia son grupos de proteínas cisteína
diméricas que tienen unas características complejas de enlaces
disulfuros.
La actual estrategia para la expresión de
proteínas de la superfamilia TGF-\beta es por lo
tanto expresar la proteína completa de una construcción de ADN
adecuada transfectada en células de mamíferos. Sin embargo, esta
estrategia necesita el tratamiento del sobrenadante de cultivo para
separar la proteína madura bioactiva procesada (dividida) del
propéptido y material no procesado (no dividido). Esto crea costos
adicionales y dificultades debido a que algunos de los materiales
expresados es no productivo según típicamente 30%-50% del material
secretado no se dividirá apropiadamente. El procedimiento
cromatográfico también genera pérdidas extra de proteína e incurre
en costos y tiempo adicionales.
Los intentos previos para expresar la porción
bioactiva madura de solo estas proteínas, han sido infructuosos, lo
que indica que el propéptido es esencial para alcanzar expresión y
secreción.
Los presentes inventores, sin embargo, han sido
inesperadamente capaces de alcanzar expresión y secreción del pCL13
sin expresar el líder o propéptido, utilizando cultivos de células
de mamíferos transfectadas.
Así, se describe aquí un método para producir
una proteína designada pCL13 o un fragmento biológicamente activo
de la misma, que comprende transformar un organismo anfitrión no
humano adecuado con una molécula de polinucleótido que comprende
una secuencia de nucleótido que codifica pCL13 o un fragmento
biológicamente activo de la misma, en donde dicha molécula de
polinucleótido se expresa constitutiva e indeciblemente en dicho
organismo anfitrión.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótido que
codifica el pCL13 o un fragmento biológicamente activo del mismo,
no comprende secuencia que codifica el líder o propéptido de
pCL13.
En lugar de las secuencias que codifican el
líder nativo o propéptido, puede ser preferible incluir dentro de
las secuencias de la molécula de polinucleótido que codifican un
líder heterólogo (por ejemplo la secuencia líder de la hormona que
estimula el folículo (FSH)) para asistir la expresión.
Organismos anfitriones no humanos adecuados
transformados con la molécula de polinucleótido descrita aquí puede
ser cualquiera de aquellos mencionados anteriormente. Sin embargo,
organismos preferidos incluyen estirpes celulares de mamíferos,
levadura (por ejemplo Pichia y Saccharomyces) y animales no
humanos.
La expresión de solo la porción activa madura
del pCL13 proporciona por lo tanto las siguientes ventajas:
(i) Altos niveles de expresión; y
(ii) No es necesario purificar a partir del
propéptido y la proteína CL13 de longitud completa no procesada.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, debido a esto no es necesario
expresar las proteína completa, es posible y es simple agregar
etiquetas de epítopo de terminal amino (por ejemplo FLAG y/o HIS)
que pueden asistir significativamente compuesto la purificación y
visualización de proteína recombinante.
También, la capacidad para expresar la porción
bioactiva madura del pCL13 en células de mamífero, indica que serán
capaces de ser fácilmente expresadas en cepas de levadura, tal como
la Pichia pastoris que es capaz de secretar disulfuro ligado a
proteínas. La producción de proteína en la levadura es mucho más
económica y fácil que la producción mediante células de
mamífero.
La invención ahora se describirá adicionalmente
por vía de los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a
las figuras acompañantes.
La figura 1 proporciona la secuencia de
nucleótido y secuencia de aminoácido putativo del clon 13 que
codifica pCL13.
La figura 2 muestra expresión CL13 en cultivos
de macrófago.
Panel A. Se cargan 15 \mug de ARN total por
línea. Tratamientos de macrófagos son: línea 1, sin tratamiento;
línea 2, 1,000 U IFN\gamma durante la noche, línea 3, 1 \mum de
ácido retinoico durante la noche; línea 4,1 \mum de ácido
retinoico durante la noche seguido por 10 \mug/mL de LPS durante 3
horas; línea 5, 10 \mug/mL de LPS durante 3 horas.
Panel B. Se cargan 20 \mug de ARN total por
línea. Tratamiento de macrófagos son: línea 1, 1 \mum de ácido
retinoico durante 3 días seguido por 10 \mug/mL de LPS durante 3
horas; línea 2,1 \mum de ácido retinoico durante la noche seguido
por 50 nM de PMA durante 3 horas; línea 3, 50 nM de PMA durante 3
horas; línea 4, macrófagos no tratados.
La figura 3 muestra un análisis northern blot de
la expresión del clon 13 de macrófagos tratados con citocinas.
Todos los tratamientos son de 3 horas. línea 1, macrófagos no
tratados; línea 2, 50 nM de PMA; línea 3, 50 U/mL de
GM-CSF; línea 4, 100 U/mL de M-CSF;
línea 5, 100 U/mL de IL1-\beta; línea 6, 10 ng/mL
de TGF-\beta; línea 7, 10 U/mL de
PDGF-BB; línea 8, 50 U/mL de IL-2;
línea 9, 100 U/mL de TNF-\alpha, línea 10, 50 U/ml
de IL-6.
La figura 4 muestra un análisis northern blot de
la expresión de clon 13 en U937. Se cargan 20 \mug de ARN total
por línea en 1.2% de una agarosa que desnaturaliza gel de
formaldehído. Línea 1, sin tratamiento; línea 2, 1 \mum de ácido
retinoico durante 3 días, líneas 3, 4, 5, 6, 7, 1 \mum de ácido
retinoico durante 3 días seguido por 160 nM de PMA durante 20 min,
1 h, 2 h, 3 h y 12 h respectivamente; línea 8, 160 nM de PMA
durante 3 h. Se marcan las sondas con 32P. Se hibrida la
transferencia a 65ºC y se somete a lavados posthibridación y
autorradiografía.
La figura 5 proporciona una alineación de
secuencia múltiple de los medios terminal carboxi de pCL13 y otros
miembros de la superfamilia TGF-\beta.
La figura 6 proporciona la secuencia de
nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en la
construcción C13LB. La región de codificación para la porción
bioactiva del pCL13 comienza con el nucleótido 625.
La figura 7 proporciona la secuencia de
nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en
construcción FFC13S. La porción bioactiva predicha del pCL13
comienza con el aminoácido 92.
La figura 8 proporciona las secuencias de
nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en
construcción C13SA. La región de codificación para la porción
bioactiva del pCL13 comienza con el nucleótido 136.
La figura 9 muestra un Westernblot de pCL13
recombinante purificado (construcción FFC13S) visualizada con
anticuerpo anti-FLAG.
La figura 10 proporciona una gráfica de los
resultados obtenidos a partir de análisis de glucosaminoglucano en
células CHO no transfectadas (K1) y CL13 (construcción FFC13S)
transfectadas (P4N, 15 y 24) utilizando ensayo de azul de
dimetil-metileno (DMB).
La figura 11 proporciona una gráfica de
resultados obtenidos a partir de ensayos de producción de colágeno
de células CHO no transfectadas (K1) y CL13 (construcción FFC13S)
transfectadas (P4N, 15 y 24).
La figura 12 proporciona gráficas de resultados
obtenidos a partir de análisis de producción de glucosaminoglucano
en células 3T3 (Figura 12A) y CCD (Figura 12B) luego de adición de
varias concentraciones de pCL13 (expresadas de la construcción
C13SA).
La figura 13 proporciona resultados gráficos
obtenidos a partir de análisis de producción de colágeno en células
CCD luego de adición de varias concentraciones de pCL13 (expresadas
a partir de construcción de C13SA).
La figura 14 proporciona gráficas de resultados
que muestran actividad de factor de crecimiento bajo condiciones de
suero limitantes de pCL13 (expresadas a partir de construcción de
C13SA) contra TGF\beta en fibroblastos de prepucio en lactante
humano (BFF) (Figura 14A) y células 3T3 (Figura 14B).
La figura 15 proporciona gráficas de resultados
que muestran actividad de factor de crecimiento en la presencia de
suero de pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA) y
TGF\beta en bFF y células 3T3.
La figura 16 proporciona gráficas de resultados
que muestran el efecto de pCL13 (expresadas a partir de construcción
de C13SA) de pCL13. El TGF\beta e IFNa2b en la proliferación de
células monocíticas humanas U937 (Figura 16A) y células monolíticas
humanas mono Mac 6 (Figura 16B).
La figura 17 proporciona resultados gráficos de
un análisis de diferenciación pCL13 (expresados de construcción de
C13SA) concentraciones on TNF-\alpha producción in
human macrófagos derivados de cultivo.
La figura 18 proporciona gráficas de resultados
que muestran el efecto de concentraciones pCL13 (expresadas a
partir de construcción de C13SA) en la citotoxicidad de monocitos
hacia células objetivo de vejiga 5637 (Figura 18A) y células
objetivo de tumor de mama MDA-MB-231
(Figura 18B).
La figura 19A proporciona una micrografía de
tejido subcutáneo tomado de una rata a la que se ha administrado
pCL13 (expresada a partir de construcción de C13SA).
La figura 19B proporciona una micrografía de
tejido subcutáneo tomada de una rata de control a la que solo se le
ha administrado solución salina.
La figura 20A muestra las secuencias de
nucleótido de variantes CL13 (a1, b1, b2, d2, dd2, f1, u2 y h1) y
el CL13 original (denota C13).
La figura 20B muestra una comparación de una
porción de a secuencia de aminoácido putativo de las variantes de
CL13 a1, b1, b2, d2, dd2, f1, u2 y h1.
La figura 21 proporciona la secuencia de
nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en
construcción C13SA/5H (sitio de división de Trombina HIS
-FLAG-PKA-péptido CL13 bioactivo
maduro). Esta construcción ha sido utilizada para la expresión en
la levadura Pichia pastoris. El HIS es un motivo de residuo 5
histadina para permitir la purificación por afinidad utilizando
cromatografía de quelado de Níquel. El sitio de trombina permite la
división enzimática del HIS del resto de las la secuencia si se
requiere.
La figura 22 muestra un western blot de medio de
cultivo de Pichia pastoris transformados con construcción C13SA/5H.
Se visualiza la proteína pCL13 utilizando anticuerpo
anti-FLAG.
Este clon hibrida en Northern blot a una especie
única de mARN de 1.2kb de tamaño y se ha localizado el gen mediante
hibridación fluorescente in situ para cromosoma 19p13.1
(TGF-\beta1 está en 19q13.1 y MIS está en
19p13.3). Las características del clon se representan adelante.
Los códigos de marco de lectura abiertos más
grandes para una cisteína alta que contiene proteína con un péptido
de señal. Estos llevan homología fuerte para los miembros de la
superfamilia TGF-\beta (que incluyen
TGF-\beta en sí mismo) cuando se analizan
utilizando el programa fasta en la instalación ANGIS
(clasificaciones opt 180-250). La alineación de
secuencia múltiple extensa utilizando el programa CLUSTAL V en GCG
ha sido emprendida con la secuencia de aminoácido traducida CL13
(pCL13) y más miembros de esta superfamilia (ver Figura 2).
La pCL13 madura es una proteína dimérica con un
sitio RXXR conservado que es apropiada para ser involucrada en la
división de un propéptido grande con el polipéptido codificado que
disminuye de una masa monomérica predicha de aproximadamente 34 kDa
a 13 kDa. El pCL13 tiene unos sitios de glucosilación potenciales en
sus propéptidos, pero ninguno en la proteína madura, lo que sugiere
que la glucosilación puede ser objetivación intracelular como éste
está en TGF-\beta.
En esta superfamilia los residuos bioactivos en
la mitad del terminal carboxi de la molécula. Existe fuerte
conservación en esta región entre todos los miembros de la
superfamilia, especialmente en 7 de los residuos de cisteína. Los
datos de alineación completa demuestran inequívocamente que el pCL13
pertenece a la superfamilia TGF-\beta. En esta
superfamilia en la identidad familiar es del orden de
70-80%. El pCL13 no exhibe identidad de este grado
a cualquiera de las familias individuales y por lo tanto aparece
para representar una categoría completamente nueva y separada
dentro de la superfamilia TGF-\beta.
La secuencia de nucleótido completa y secuencia
de aminoácido putativo para el clon 13 (CL13) se proporciona en la
Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han emprendido estudios extensos de
regulación de expresión de gen CL13 utilizando el inserto de clon
marcado 32P y se resumen los resultados en la Tabla 1. Se ilustran
también algunos ejemplos en las Figuras 2, 3 y 4. Los resultados
indican que el transcripto 1.2 kb se presenta en muy bajos niveles
en U937 no tratado y macrófagos derivados de cultivo. Las expresión
se incrementa de forma marcada con forbol
12-miristato 13-acetato (PMA), pero
no se regula por incremento por LPS o interferón-g
(IFN-g). Se expresa fuertemente el clon 13 en
macrófagos tratados con GM- CSF, M- CSF, IL2 o
TNF-\alpha y para un menor grado con
TGF-\beta, PDGF-BB o
IL-6. También existe expresión incrementada de mARN
CL13 en una estirpe celular de fibroblasto neonatal humano
(CCD34Lu) en respuesta a IGF-1, PDGFbB,
TGF-\beta o TNF-\alpha y en
crecimiento de células endoteliales de vena umbilical humanas con
ECGF. Se encuentra la no expresión de este gen en cualesquier
linfocitos B o T/estirpes celulares activadas o en reposo.
Podemos deducir hipótesis razonables a cerca de
la naturaleza del papel biológico de esta proteína sobre la base de
su expresión y las características generales de la superfamilia. La
expresión CL13 se podría inducir en macrófagos derivados de cultivo
(MAC) mediante una variedad de agentes de activación que incluyen
citocinas y PMA pero sin LPS. También se induce su expresión en
fibroblastos mediante activación y podrían no ser inducidos en
todos los linfocitos. Como se hacen crecer células endoteliales
probadas en la presencia de ECGS, no es posible concluir si la
expresión está ausente bajo condiciones de reposo.
Puede ser de particular significado que el
TGF-\beta induce expresión de CL13 en los
fibroblastos y el MAC. Es posible que algunas de las funciones
atribuidas al TGF-\beta pueden ser debido a una
inducción autocrina o paracrina de TGF-\beta
mediante CL13.
Muchas de la proteínas en esta superfamilia
TGF-\beta actúan en células mesenquimales y se
anticipa que esto será verdadero para pCL13. También se piensa que
el pCL13 puede mejorar la función efectora de estas células, quizás
en una forma similar a TGF-\beta en sí mismo.
Los linfocitos y macrófagos están íntimamente
relacionados en la función biológica. El hecho que los linfocitos
no parecen capaces de expresar CL13, pero el MAC expresa esté en
grandes cantidades sugiere la posibilidad que el linfocito también
puede representar un objetivo para pCL13.
En resumen, las propiedades y característica de
pCL13 de la expresión sugiere que esta puede tener algunas
similitudes con TGF-\beta. Sin embargo, mientras
esta pertenece a esta superfamilia, se puede decir con alguna
certeza, sobre la base de la comparación de secuencia, tal pCL13 es
uno de una nueva clase de proteínas dentro de esta superfamilia y
no es una proteína TGF-\beta no descrita (por
ejemplo TGF-\beta6).
\vskip1.000000\baselineskip
Este se ha emprendido utilizando el vector pGEX
que genera una proteína de fusión
glutationa-S-transferasa. Se
sintetiza el material del peso molecular correcto ya que se
desnaturaliza y es insoluble y por lo tanto inadecuado para la
purificación. Como una consecuencia, sin trabajar adicionalmente se
hace con este vector debido a las dificultades que probablemente se
involucraran.
Han hecho un número de construcciones de ADN
basadas en el CL13. Para algunas de estas construcciones la
secuencia de ADN para el epítopo FLAG ha sido agregada. Estos
códigos de epítopo para el péptido de aminoácido 8 (N- Asp- Tyr-
Lys- Asp- Asp- Asp- Asp- Lys- C) cuyos códigos para un sitio de
división enteroquinasa se reconocen mediante dos anticuerpo
monoclonales. Una proteína que recubre este péptido marcador puede
luego ser purificada por afinidad utilizando estos anticuerpos.
Adicionalmente la proteína también se puede detectar utilizando
Western blotting u otros ensayos basados en anticuerpos. La
adición de este péptido hidrófilo pequeño de la región terminal
amino de la construcción no se esperaría influenciar la bioactividad
de la proteína completa. Sin embargo, si se desea, se puede
utilizar la enteroquinasa para dividir selectivamente el péptido
FLAG de la construcción, sin afectar el resto de la molécula.
La predicción del sitio de división de señal de
cualquier proteína es solo 75-80% exacto. Por esta
razón en algunas construcciones es necesario usar la secuencia
líder de la hormona estimulante del folículo (FSH). Esta es
conocida por funcionar en la célula eucariótica a ser utilizada para
la transfección y se conoce su sitio de división preciso. Esto es
importante para asegurar que el péptido FLAG permanezca adherido al
propéptido y no se remueva con la división de secuencia de
señal.
Se hacen las siguientes construcciones de
ADN:
1. CL13: Secuencia de CL13 completa no
modificada (Figura 1). (Secuencia líder CL13- Secuencia para
propéptido CL13 - Secuencia para péptido CL13 bioactivo
maduro).
2. C13LB: CL13 de longitud completa con FLAG
(Figura 6). (Secuencia líder FSH - FLAG-propéptido
CL13 - Secuencia para péptido CL13 bioactivo maduro).
3. FFC13S: CL13 bioactivo con FLAG (Figura 7)
(secuencia líder FSH - secuencia FLAG - aproximadamente propéptido
de 40 aminoácidos - Secuencia para péptido CL13 bioactivo
maduro).
4. C13SA: CL13 bioactivo con FLAG (Figura 8)
(FSH líder-secuencia FLAG secuencia - PKA - CL13
bioactivo maduro). El PKA es la secuencia de reconocimiento para la
proteína cinasa A para permitir fosforilación in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonan estas construcciones en dos vectores
de expresión de células de mamífero diferentes. Estos son el vector
pCEP4 que es un vector de expresión semipermanente o el vector pCEP4
del cual se ha eliminado la secuencia de gen EBNA para permitirle
permanentemente integración en el genoma de la célula de mamífero en
la que este se transfecta. Todas las construcciones se han
transfectados en células CHO y COS y estirpes celulares
semipermanentes o permanentes que llevan el transfectante
establecido con el uso de higromicina para matar células que llevan
no transfectantes. Se ha emprendido la producción y purificación de
proteínas para datar solo en los números de construcción 2, 3 y 4
(dominantemente 3 y 4), CL13 bioactivo con FLAG.
Se hacen crecer ambas células COS y CHO en medio
Ham's F12 con 5% de suero de becerro fetal (FCS) y 400 ug/ml de
higromicina (solo en estirpes celulares semipermanentes). En la
confluencia, se remueve el medio y se reemplaza con HamF12 que no
contiene suero u otros componentes. Se remueve el medio condicionado
después de días y se utiliza para purificación de
FLAG-CL13 recombinante. Luego se hacen pasar las
células y una vez más se colocan en el medio que contiene
suero.
Un ensayo dotblot se ha establecido para
cuantificación de FLAG recombinante que contiene proteínas -en
cultivo sobrenadante o en forma purificada. Se deposita la proteína
de los sobrenadantes de cultivo (10-100 ul) en
nitrocelulosa utilizando un aparato dotblot. Luego se hace
reaccionar la membrana con anticuerpo anti-FLAG
monoclonal y luego con IgG de conejo antirratón biotinilado. Este
luego se visualiza mediante quimioluminiscencia mejorada en
película autorradiográfica. Se genera una curva estándar utilizando
una proteína fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) que se ha diseñado
mediante ingeniería de tal manera que esta contiene 1 copia de el
epítopo FLAG en su terminal amino (Mr 50-55 kDa).
La sensibilidad de este ensayo es aproximadamente 20 ng de bAP.
Cuando se utiliza este ensayo para analizar la
producción de FLAG-CL13 se encuentra que los
cultivos producidos entre aproximadamente 25 y 400 ng de proteína
recombinante por ml de sobrenadante de cultivo. La mejor expresión
se observa con las construcciones 3 y 4.
Se incuba el medio que contiene proteína
recombinante con glóbulos de sefarosa en los que se ha conjugado el
anticuerpo anti-FLAG. Aproximadamente se utiliza 1
ml de glóbulos por 100 ml de medio condicionado. Se incuban la
sefarosa y el medio durante 18 horas a 3ºC luego se paletizan los
glóbulos y se vierten en una minicolumna. Ellos luego se lavan
extensamente con PBS y se libera la proteína recombinante con
péptido FLAG. Este es un procedimiento muy gentil pero eficiente y
asegura que no se perjudica la bioactividad de la proteína
recombinante. Se remueve el péptido FLAG utilizando cromatografía de
filtración de gel. Luego se pelan los glóbulos con amortiguador de
glicina de pH 3.5 luego se pueden reutilizar.
La Figura 9 muestra un Western blot de
proteína pCL13 purificada de construcciones C13LB y C13SA. Se hace
electroforesis al material purificado utilizando SDS PAGE en un gel
al 15% bajo condiciones de reducción y no reducciones antes de
Western blotting y visualización utilizando anticuerpo
anti-FLAG monoclonal. Las construcciones migran en
pesos moleculares ligeramente más grandes que predicen, algo que
parece ser una función de los aminoácidos en la secuencia FLAG y se
han reportado previamente con el uso de esta etiqueta de epítopo.
Sin embargo, existe el cambio esperado en el peso molecular asociado
con el uso de condiciones de reducción que indican que el material
está en la conformación dimérica.
El hecho de que estas proteínas diméricas se
secretan en el medio también indica que ellas se doblan
correctamente como proteínas agregadas y dobladas impropiamente se
expresan en células eucarióticas no secretadas. Las dos
construcciones (FFC13SC y C13SC) que codifican solo la proteína
bioactiva, ambas parecen ser expresadas en muchos niveles más altos
que la secuencia CL13 nativa que solo se ha modificado para contener
un epítopo FLAG (C13LB). Esto se ejemplifica en la Figura 9 que
compara la expresión de proteína relativa de las construcciones
C13SA y
C13LB.
C13LB.
\vskip1.000000\baselineskip
El TGF-\beta estimula función
de fibroblasto diferenciada e inhibe la replicación. Con el fin de
comparar la función de pCL13 con TGF-\beta, se
puede examinar el efecto de pCL13 en las funciones de fibroblasto
como sigue.
Se pueden hacer crecer fibroblastos de pulmón
neonatal (CCD34LU) para confluenciar y reemplazar el medio de
crecimiento con DMEM. que contiene 0.1% de BSA. Luego se pueden
estimular las células con pCL13 o TGF-\beta
recombinante (10 ng/ml) como un control positivo. Luego se puede
recolectar el sobrenadante de los cultivos 18 horas después y se
ensayan para colágeno total y glucosaminoglucanos (GAG). Se puede
medir la síntesis de colágeno utilizando un ensayo colorimétrico de
placa de microtítulo desarrollado en este laboratorio que depende
de la unión del colágeno total al tinte rojo sirius (18). El GAG
sulfatado total se puede medir con un ensayo colorimétrico adaptado
en este laboratorio para formato de placa de microtítulo y que ya ha
sido utilizado para la determinación in vitro de síntesis
GAG de fibroblastos (9,10). Este ensayo se basa en el cambio
metacromático en el máximo de absorción para el tinte catiónico azul
de dimetil-metileno consecuente en la unión de los
grupos funcionales de los grupos funcionales polifónicos de GAG
(9,10).
Se conoce el TGF-\beta por
tener un efecto variable en la proliferación de fibroblasto in
vitro que depende probablemente del balance entre su capacidad
para regular descendentemente el receptor PDGF y su inducción de
síntesis de fibroblasto PDGF. Para determinar si el pCL13 también
modifica la replicación, un ensayo de factor de crecimiento se
emprenderá con CCD34Lu esencialmente como se describió previamente
(11, 12, 13)). Estas células se colocan escasamente en placas en
una concentración de aproximadamente 1000 células/pozo (placa de 96
pozos). La proteína pCL13 o TGF-\beta (100 ng/ml)
(control positivo) se agregará sola o en combinación con un factor
de crecimiento conocido presente dentro del suero de ternero fetal.
Se puede determinar la actividad del factor de crecimiento mediante
incorporación de 3H-timidina.
Se debe esperar que el pCL13 inhiba la inducción
de actividad de colagenasa. Para probar esto, se pueden hacer
crecer fibroblastos de pulmón neonatal (CCD34LU) para confluenciar
luego se reemplaza el medio de crecimiento con DMEM que contiene
0.1% de BSA. Luego se pueden estimular las células con PMA
recombinante para inducir síntesis de colagenasa en la presencia o
ausencia de pCL13 o TGF-\beta (50 ng/ml -control
positivo). Los sobrenadantes luego se pueden ensayar para actividad
de colagenasa utilizando nuestra adaptación (14) de un ensayo (15)
que se basa en la degradación de 20 ug de colágeno tipo I purificado
que se ha recubierto en una placa de microtítulo. Se visualiza el
colágeno no digerido mediante teñido con rojo sirius y se cuantifica
fotométricamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de TGF-\beta en
los macrófagos son complejos y en algunos casos aparentemente
paradójicos. En términos generales se ha considerado el
TGF-\beta por ser un agente quimiotáctico de
macrófago potente, un regulador descendente de activación de
macrófago y un promotor de diferenciación (3,4). Para probar el
efecto de pCL13 en macrófagos, se utilizarán macrófagos derivados de
cultivo (MAC) como la fuente celular principal libre de suero en
Medio Dulbecco Modificado Iscove, utilizando métodos establecidos
por nuestro laboratorio (15,16). Cuando las células de replicación
no llegan a ser adhesivas. Es posible utilizar ambos MAC adhesivos
y no adhesivos no dañados para estudio.
\newpage
Este se puede examinar utilizando un ensayo de
quimiotropismo Boyden estándar como se desarrolló previamente (17).
Se utilizará TGF-\beta (1pg/ml) como el control
positivo para quimiotropismo, y se comparará su respuesta con
aquella de pCL13.
El PMA y ácido retinoico (RA) son inductores
potentes de mARN CL13. Se conocen los PMA, RA (así como
TGF-\beta) por inducir la diferenciación in
vitro de las estirpes celulares monocitoides humanas primitivas
U937 y HL60 así como precursores de monocito de médula ósea. Para
examinar el papel del CL13 en este proceso, se pueden hacer crecer
las estirpes celulares U937 y HL60 en la presencia de
TGF-\beta, pCL13 (con o sin RA adicional). Se
monitoreará su diferenciación mediante morfología, adherencia
incrementada e inhibición de replicación (incorporación de
3H-timidina).
Se ha demostrado previamente que el crecimiento
de MAC en medio libre de suero, y su diferenciación de monocitos a
macrófagos in vitro se puede monitorear mediante la expresión
de la superficie CD71, el receptor transferrina (13,15). Esto no es
visto en la superficie de monolitos pero se encuentra en más del MAC
en el día 7 del cultivo. Se harán crecer c con
TGF-\beta o pCL13 o interferón gama luego se tiñen
con anticuerpo CD71 tratado con fluoresceína y se examina
citométricamente el flujo en el día 3 del cultivo (13). Se asociará
la promoción de diferenciación con expresión temprana de este
antígeno de superficie.
Se ha reportado TGF-\beta para
inhibir producción inducida por LPS de TNF-\alpha
e IL-1. Adicionalmente, como el
TGF-\beta induce la expresión pCL13 en un número
de situaciones, es posible que algunas de las funciones atribuidas
al TGF-\beta se puedan contribuir mediante pCL13.
Esto se puede examinar utilizando los bioensayos anteriores en los
que el TGF-\beta y pCL13 son activos. Se
estimularán los fibroblastos mediante TGF-\beta
en la presencia de anticuerpo pCL13 de bloqueo y el pCL13 en la
presencia de un anticuerpo TGF-\beta de bloqueo.
Si las rutas autocrinas están en operación, se debe reducir e
inhibir la función en cuestión mediante el anticuerpo de bloqueo.
Se pueden también emprender experimentos de inhibición de
oligonucleótido anticodificante.
\vskip1.000000\baselineskip
Similar a TGF-\beta, el pCL13
puede modificar la expresión endotelial de moléculas de adhesión con
regulación descendente posterior de adhesión de neutrófilos,
monocitos o linfocitos. Adicionalmente el pCL13 puede modificar
angiogenia y producción de mediador endotelial. Esta puede ser
investigada al investigar el efecto de pCL13 en:
(i) Adherencia de leucocito al resto y endotelio
vascular activado por citoquina;
(ii) Producción de citoquinas endoteliales tales
como IL-8, MCP-1,
IL-1, IL-6, y endotelina;
(iii) Síntesis prostanoide endotelial;
(iv) Actividad procoagulante endotelial; y
(v) Angiogenia (in vitro y
vivo).
\vskip1.000000\baselineskip
Similar al TGF-\beta, puede
actuar el pCL13 como un agente inmunosupresor. Este se puede
investigar al determinar el efecto de pCL13 en:
(i) Proliferación celular T y B;
(ii) Síntesis de inmunoglobulina;
(iii) actividad de célula LAK y célula NK; y
(iv) Producción in vitro de citocinas
(proteína y/o mARN) tal como IL-2,
IFN-g, IL-4, IL-5,
IL-10.
\vskip1.000000\baselineskip
El pCL13 puede como el
TGF-\beta inhibir la replicación de células de
tumor y promover diferenciación de tumor. Este se puede investigar
al determinar el efecto de pCL13 en:
(i) Investigación de la proliferación in
vitro de un rango amplio de estirpes celulares de tumor
disponibles a través de el ATCC; y
(ii) Observar el cambio en fenotipo de tumor
hacia una forma más diferenciada (por ejemplo cambio de fenotipo no
adhesivo a adhesivo).
\vskip1.000000\baselineskip
Se investiga el efecto de pCL13 en la producción
de glucosaminoglucano utilizando células CHO no transfectadas y
transfectadas. La Figura 10 muestra análisis de glucosaminoglucano
en las células CHO no transfectadas (KI) y CL13 transfectado (P4N,
15 y 24) utilizando ensayo de azul de
dimetil-metileno (DMB) (9, 10). P4N, 15 y 24
producen cantidades incrementadas de pCL13 respectivamente. Se
cultivan las células en medio DMEM/F-12 que
contiene 5% de FCS durante 5 días. Luego se cargan las células en
DMEM libre de FCS durante 24 horas. A un medio de cultivo celular
de 100 \mul se agrega 100 \mul de tinte DMB y se lee la
absorbancia en 492 nm inmediatamente. Los resultados representan la
media +/-DE de pozos triplicados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investiga el efecto de pCL13 en producción de
colágeno. La Figura 11 muestra el efecto de pCL13 en la producción
de colágeno mediante células CHO no transfectadas (K1) y CL13
transfectadas (P4N, 15 y 24). El P4N, 15 y 24 produce cantidades
incrementadas de pCL13 respectivamente. Se cultivan las células en
medio DMEM/F-12 que contiene 5% de FCS durante 5
días. Luego se cargan las células en DMEM libre de FCS durante 24
horas. Se determina la cantidad de colágeno producida mediante
estas células utilizando un aparato Biodot. Se coloca el
sobrenadante del cultivo (50 \mul) en membrana de nitrocelulosa.
Se lava la membrana en 100 \mul de PBS y se seca. Se tiñe el
colágeno retenido en la membrana de nitrocelulosa con 0.1% de tinte
rojo Sirius (18). Se cortan las manchas individuales y se eluyen
con NaOH 0.1 N y se lee la absorbancia en 550 nm. Los resultados
representan la media +/-DE de pozos triplicados.
Se conducen los Ejemplos 11 a 16 descritos aquí
con la construcción C13SA o pCL13 producida a partir de la
construcción C13SA. Como se describió anteriormente, la construcción
C13SA varía de CL13 en la que no incluye secuencias de codifican
propéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 12 muestra el efecto de pCL13 en
producción de proteoglucano marcado 35S en fibroblastos de pulmón
3T3 (fibroblastos de ratón) y neonatal humano (CCD 34 Lu) después de
24 horas de incubación. Se cargan las células confluentes al medio
de cultivo RPMI que contiene 0.1% de BSA y 50 \mug/ml de ácido
ascórbico durante 24 horas. Luego se incuban las células con
diferentes concentraciones de pCL13 en la presencia de 10
\mulCi/ml de sulfato [^{35}S] durante 24 horas. Al final del
periodo de incubación se remueve el medio y se agregan inhibidores
de proteasa. Se extraen los proteoglucanos presentes en la matriz
extracelular utilizando clorhidrato de guanidina 4M que contiene
inhibidores de proteasa durante una hora a 4ºC. Se determina la
producción de proteoglucano total en el medio y se determina la
fracción celular utilizando columnas cromatográficas Sephadex
G-25 (19). Los resultados representan la media +/-DE
de pozos triplicados.
En las células 3T3, después de 24 horas de
periodo de incubación, el pCL13 origina un incremento dependiente
de dosis en la producción de proteoglucano. Se observa un incremento
del 92% en 25 ng/ml de concentraciones de pCL13 y se observa
incremento del 60% en 6.7 y 2.2 ng/ml de concentración de pCL13. En
comparación el TGF-\beta de 20 ng/ml de
producción de proteoglucano elevada mediante 95%. En las células CCD
34Lu, el pCL13 en 50 ng/ml origina 23% de incremento en la
producción de proteoglucano y 6% de incremento en 25 ng/ml de
concentración de pCL13. En comparación el
TGF-\beta en 10 ng/ml de producción de
proteoglucano elevada por 36%.
La Figura 13 muestra el efecto de pCL13 on
producción de colágeno tipo 1 en fibroblastos de pulmón neonatal
(CCD 34 Lu). Se cargan las células confluentes en medio de cultivo
DMEM que contiene 0.1% de BSA y 50 \mug/ml de ácido ascórbico
durante 24 horas. Luego se incuban las células con concentraciones
de pCL13 diferentes en la presencia de 50 \mug/ml de
b-aminopropionitrilo durante 24 horas. Al final del
periodo de incubación se determina la cantidad de colágeno presente
en el medio utilizando un ELISA. Brevemente, se incuban los
sobrenadantes de los fibroblastos tratados y no tratados así como
estándar de colágeno tipo 1 durante 72 horas a 4ºC en placas de
microtítulo de 96 pozos (NUNC). Al final del periodo de incubación
se lavan las placas, se bloquean con 4% de albúmina de suero bovino
en salina amortiguada con fosfato, se incuba con anticuerpo
monoclonal de colágeno tipo 1 (Sigma). Luego se relavan las placas y
se agrega IgG de ratón biotinilado y se sigue por complejo de
estreptavidina. Después de la adición de sustrato, se leen las
placas en 490/405 nm o en un lector de placa. Los resultados
representan la media +/-DE de pozos triplicados. El pCL13 en 50
ng/ml origina 140% de incremento en la producción de colágeno, 190%
de incremento en 25 ng/ml y 11% en 5 ng/ml de concentración. En
comparación el TGF-\beta en 10 ng/ml de producción
de colágeno elevada mediante 34% después de 24 horas. La respuesta
TGF-\beta relativamente pobre tiene ocurrencia
porque el TGF-\beta requiere
48-78 horas para lograr efecto máximo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina la actividad del factor de
crecimiento de pCL13 y el factor de crecimiento de transformación
beta (TGF\beta) en el crecimiento de células detenidas BFF
(fibroblastos de prepucio de infante humano) y 3T3 (fibroblastos de
ratones). Se agregan las citoquinas a células BFF y 3T3 en 0.2% de
medio suero bovino fetal (FBS) para determinar si ellos son
verdaderos factores de crecimiento que pueden estimular una célula
restante para progreso a través del ciclo celular y experimentar
división. Se desarrolla el ensayo de factor de crecimiento como se
describió previamente (11, 12). En breve, las células se colocan en
placas en 1.2x10^{3} de células/pozo en 200 mL de medio de
detección de crecimiento (0.2% de FBS) durante 72 h. Luego se
reemplaza el medio con 0.2% de medio FBS fresco con o sin
citoquinas y 0.5 mCi/pozo de [3-H] Timidina durante
unas 72 h adicionales. Luego se cultivan las células con un
cultivador de célula automatizado se cuenta la absorción de
timidina en las células de proliferación en un analizador de
centelleo de líquido. Los controles incluyen solo 0.2% de medio
FBS, solo 10% de medio FBS (medio de crecimiento normal), y pCL13
diluyente (0.1% de CHAPS) en 0.2% de medio FBS.
Los resultados mostrados en la Figura 14 indican
que el pCL13 parece tener verdadera actividad de factor de
crecimiento en ambos BFF humanos. El TGF\beta aparece por ser
inhibidor para las células BFF. Ninguno de pCL13 ni TGF\beta
exhiben actividad de factor de crecimiento en 3T3 bajo las
condiciones de este ensayo.
Se determina la actividad de factor de
crecimiento de pCL13 y factor de crecimiento de transformación beta
(TGF\beta) o el crecimiento de células detenidas BFF (fibroblastos
de prepucio de infante humano) y 3T3 (fibroblastos de ratones). Se
agregan las citoquinas a BFF y células 3T3 en 2% de medio de suero
bovino fetal (FBS) para determinar si ellos hacen crecer sustancias
mejoradas que pueden mejorar la velocidad en la que las células se
mueven a través del ciclo celular. Se desarrolla el ensayo de factor
de crecimiento como se describió previamente (11, 12). En breve,
las células se colocan en placa en 1.2x10^{3} de células/pozo en
200 ml de medio de detección de crecimiento (0.2% de FBS) durante 72
h. El medio luego se reemplaza con 2% de medio FBS fresco con o sin
citoquinas y 0.5 mCi/pozo de [3-H] Timidina durante
72 h adicionales. Luego se cultivan las células con un cosechador
celular automatizado y se cuenta la absorción de timidina en las
células de proliferación en un analizador de centelleo de líquido.
Los controles incluyen solo 2% de medio FBS, solo 10% de medio FBS
(medio de crecimiento normal), y diluyente pCL13 (0.1% de CHAPS) en
0.2% de medio FBS.
Los resultados (Figura 15) muestran que el pCL13
tiene un efecto mejorado de crecimiento en células BFF y murino 3T3
humanas. El TGF\beta aparece por ser inhibidor para células BFF ya
que tiene actividad mejoradora de crecimiento en una concentración
en células 3T3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compara el pCL13 con el factor de crecimiento
de transformación beta (TGF\beta) y el interferón alfa 2b
(IFNa2b), durante su efecto antiproliferativo en la estirpe celular
U937 (un linfoma histiocítico similar a monocito humano) y Mono Mac
6 (una estirpe celular de leucemia monoblástica). Las células se
colocan en placa en 3x10^{4} células/pozo en 20 0mL de 10% de
medio FBS (suero bovino fetal) con o sin citocinas. Durante las 6 h
finales de un periodo de incubación de 48 h, se pulsan los pozos con
0.5 mCi/pozo de [3-h] Timidina. Luego se cultivan
las células con un cosechador celular automatizado y se cuenta la
absorción de timidina en las células de proliferación en un
analizador de centelleo de líquido. Los controles incluyen solo 10%
de medio FBS y diluyente pCL13 en 10% de medio FBS.
Los resultados (Figura 16) indican que las dos
tandas de pCL13, b447 y b448A. en concentraciones de 10 y 100 ng/ml
tienen un efecto antiproliferativo pequeño en dos estirpes celulares
humanas origen monocítico. Esto contrasta con los más fuertes
efectos antiproliferativos de TGF\beta (2 y 20 ng/ml) e IFNa2b
(10^{3} y 10^{5} U/ml) en células U937 y Mono Mac 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos en la Figura 17 muestran el efecto de
concentración de pCL13 diferente en LPS estimulado por producción
TNF-\alpha de macrófagos humanos derivados de
cultivo. Se purifican los monocitos por elutitulación de capas
leucocíticas y se cultiva en medio Iscove que contiene 0.1% de BSA
(13, 16). En el día 5, se incuban las células con concentraciones
diferentes de pCL13 en la presencia de 10 \mug/ml de LPS en medio
Iscove durante 24 horas. Al final del periodo de incubación se
remueve el medio y se determina la cantidad de
TNF-\alpha presente utilizando un emparedado
ELISA (Genzyme). Los resultados muestran que el pCL13 origina
inhibición de LPS inducido por producción de
TNF-\alpha. Se observa 47% de una inhibición en 20
ng/ml de pCL13 y se observa 27% de una inhibición en 7 ng/ml de
pCL13. En comparación el TGF-\beta solo tiene
aproximadamente 10% de reducción en 20 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto directo de pCL13 y TGF\beta en
células objetivo de tumor (carcinoma de vejiga 5637 y adenocarcinoma
de mama MDA-MB-231) y se examina el
efecto de pCL13 y TGF\beta en muerte mediada por monocito de
células tumorales al medir la liberación de ADN radiomarcado de
células objetivo de tumor lisado. Se desarrolla el ensayo de
citotoxicidad como se describió previamente (20). Se agregan células
objetivo de tumor (marcadas en la fase de crecimiento exponencial
con 20 \muCi de [3H] Timidina/1x10^{6} de células durante 24 h)
a los monocitos (efectores) en un efector: relaciones objetivo (E:
T) de 10: 1 durante 72 h. Luego se centrifugan las células y se
cuentan los sobrenadantes en fluido de centelleo en un analizador de
centelleo de líquido. Los controles incluyen células de tumor no
tratadas, células de tumor no tratadas cocultivadas con monocitos y
diluyente de citoquina solo. Se incuban en TGF\beta y pCL13 con
monocitos durante 48 h.
Los resultados se muestran en la Figura 18.
Ninguno del pCL13 ni TGF\beta tiene un efecto citotóxico directo
en las líneas de tumor 5637 o MDAMB-231. Sin embargo
el pCL13 mejora la capacidad de los monocitos para matar células
5637. El pCL13 también mejora la muerte mediada por monocito de de
T24 (carcinoma de vejiga), J82 (carcinoma de vejiga), T47D
(carcinoma ductal de la mama) y JCPL (carcinoma de ovario) (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectan ratas (Fisher F343) subcutáneamente
en su lomo con 0.1 ml de tres concentraciones de pCL13, un control
salino negativo y TGF\beta. Se separan ampliamente las inyecciones
y se administra a cada con el panel completo de 5 inyecciones. Las
cantidades de pCL13 inyectadas son 60 ng. 30 ng y 2 ng. La dosis de
TGF\beta administrado es 10 ng. Luego se sacrifican los animales
en intervalos iniciando en 3 horas y hasta 2 semanas luego de
administración. Se utilizan tres animales para cada punto de tiempo,
y luego de sacrificio se extirpan las áreas en las que el material
se ha administrado, se fijan con formalina, se montan, luego se
tiñen con hematoxilina y eosina. Luego se evalúa el material
microscópicamente.
No existen diferencias macroscópicas entre las
biopsias en ninguno de los animales, bajo cualquiera de las varias
condiciones diferentes al punto de tiempo de dos semanas. En el
punto de tiempo de dos semanas sin embargo, las biopsias, solo de
las áreas con las dos más altas dosis de pCL13, muestran obvias
diferencias macroscópicas en el área entre le músculo y la piel.-
esta área parece que se expande un poco y tiene una apariencia
brillante blanca, que sugiere exceso de precipitación de proteína de
matriz.
No se observan diferencias en las secciones
histológicas en puntos de tiempo de tres horas. Sin embargo en el
punto de tiempo del día uno (24 hora) las áreas en las que se han
administrado concentraciones más altas de pCL13 demuestran un
infiltrado celular mononuclear que es un poco desigual en carácter y
está predominantemente presente en el tejido subcutáneo (Figura
19A). No se observan cambios similares en cualquiera del control
salino negativo (Figura 19B) o TGF\beta en una dosis de de 10
ng/ml. El infiltrado parece estar máximamente presente en los días
uno y dos y es marcadamente disminuido o ausente a partir del día
cuatro hacia delante. Estos hallazgos sugieren que el pCL13 es
quimiotáctico para macrófagos y o linfocitos.
Este estudio no se emprende en tal una forma
como para ser capaz de suministrar buenos datos cuantitativos sobre
la cantidad de colágeno que está presente en las áreas en donde se
administran las dos sustancias. Sin embargo en conjunto con la
apariencia macroscópica, parece probable que se incremente la
cantidad de colágeno en las muestras que contienen las dos dosis
más altas del clon 13, por lo menos en el punto de tiempo de la
segunda semana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emprende redetección utilizando colección de
cADN de pulmón fetal utilizando una porción de la secuencia
codificante del clon 13 como una sonda. Este se emprende con el fin
de determinar la existencia de las variantes del clon 13.
Utilizando este método se obtienen un número de clones adicionales
(a1b2, h1, b1, d2, dd2, f1 y u2) y se ilustra la secuencia de estos
clones en la Figura 20A que muestra la secuencia de nucleótido y la
Figura 20B que muestra una porción del marco de lectura abierto.
También se comparan las secuencias con aquellas de la secuencia del
clon 13 original (C13). A partir de la Figura 20B, se puede ver que
la región codificante traducida de estas variantes de clon 13
exhiben solo diferencias menores. Esto ocurre en los aminoácidos 9,
48 y 202. Estos están todos en la región de propéptido y están
probablemente para representar las diferencias genéticas entre los
individuos cuyos ARN se utilizan para prepara la colección de cADN.
Sin embargo, en el nivel de ADN, existe dominantemente variación
sustancial en la región no traducida 5', pero en un grado más
pequeño en la región no traducida 3'. Mientras que estas variantes
pueden ser bien importantes en áreas tales como regulación
transcripcional ellas son no traducidas y por lo tanto no pueden
afectar la bioactividad.
Algunos de los clones aislados y expuestos en la
Figura 20A (por ejemplo b2 y h1) aún aunque tienen región no
traducida 5' muy larga, todavía no representan la secuencia de
codificación completa. Esto puede ser comprobado como cuando se
utiliza la región no trasladada 5' como una soda, en northern blots,
es demostrable la hibridación a una banda de aproximadamente 7 kb.
Las razones para esta variación de longitud marcada no son claras
pero podrían incluir empalme alterno de un exón no traducido, el
uso de sitios de partida transcripcionales alternos o aún
duplicación de gen.
\vskip1.000000\baselineskip
La región bioactiva del clon 13, modificada en
su terminal amino para contener un número de epítopos marcadores
adicionales (construcción C13SA/5H -Figura 21) se clona en el
plásmido pPIC9. Luego se utiliza este plásmido para transformar la
levadura Pichia pastoris de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Invitrogen Corp.). La levadura, se transforma
exitosamente mediante este plásmido seleccionado sobre la base de
sensibilidad al metanol. Luego se hacen crecer colonias de levadura
durante dos días, en suspensión según las instrucciones de los
fabricantes. Se recolecta el medio de cultivo y se somete una
alícuota a SDS-PAGE seguido por western blotting.
Se visualizan las bandas que contienen pCL13 utilizando el
anticuerpo anti-FLAG M2 utilizando procedimientos
estándar. Se lleva a cabo electroforesis bajo las condiciones de
reducción y no reducción. Se puede ver que se producen grandes
cantidades de la proteína que son fácilmente detectables con medio
de cultivo de levadura no concentrado, que indican secreción de la
proteína en una forma apropiada (Figura 22). El peso molecular se
aproxima a aquel esperado en las bases de la composición de
aminoácido y el doblamiento del peso molecular bajo condiciones de
no reducción (Figura 22) indica que la proteína es, como se espera,
un disulfuro unido a dímero. Esta es la configuración estructural
correcta e indica que ha sido procesada y secretada la proteína por
el organismo levadura en una forma apropiada.
La capacidad para expresar este complejo
dimérico, proteína con un alto enlace disulfuro contenido en
sistemas de levadura es altamente ventajoso como su dramáticamente
más bajo costo de producción por cantidad de unidad de proteína y
lo hace mucho más adecuado como un biofarmacéutico comparado con el
material producido mediante células de mamífero.
Mientras que este trabajo ha sido emprendido con
la levadura Pichia pastoris, es completamente probable que
secreción similar ocurrirá con un rango de organismos de levadura
traducidos con un vector de expresión de levadura apropiado. Como
la región bioactiva es expresada no contiene sititos de
n-glucosilación potenciales, la hiperglucosilación,
que algunas veces ocurre con proteínas de mamíferos expresadas
mediante cepas de levadura, no es un problema.
1. Burt DW. Evolutionary grouping of the
transforming growth-factor-b
superfamily. Biochem Biophys Res Commun. 1992:
590-595.
2. Miyazono K, Ichijo H,
Heldin C-H. Transforming growth
factor-b: Latent forms, binding proteins and
receptors. Growth factors 1993; 8:
11-22.
3. Wahl. SM. Transforming growth factor
beta in inflammation: A cause and a cure. J Clin Immunol.
1992; 12: 61-74.
4. Roberts AB, Sporn MB.
Physiological actions and clinical applications of transforming
growth factor-b. Growth factors. 1993;
8: 1-9.
5. Sambrook J., Fritsch EF. &
Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York.
6. Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel FM etal, eds. Green Publishing Associates. New
York. 1989.
7. Ma J, Walsh B, Chen
S-L, Penny R, Breit SN. Restoration of
antibody activity of a monoclonal anti RNP antibody by HPLC under
dissociative conditions: Demonstration of blocking of the antibody
binding sites with antigen released from effete hybridoma cells.
J Immunol methods. 1992: 155:
121-127.
8. Miyazono K, Thyber J,
Heldin C-H. Retention of the
TGF-b1 precursor in the golgi complex in a latent
endoglycosidase H sensitive form. J Biol Chem. 1992;
267: 5668-75.
9. Farndale RW, Buttle DJ,
Barrett AJ. Improved quantitation and discrimination of
sulphated glycosaminoglcans by use of dimethylmethylene blue.
Biochim Biophys Acta. 1986; 883:
173-177.
10. E.M Foulcher. MSc qualifying thesis
submitted to UNSW entitled: Glycosaminoglycans and their role in
inflammation. 1992.
11. Thornton SC, Por SB,
Walsh B, Penny R, Breit SN. The interaction of
immune and connective tissue cells: 1. The effect of lymphokines and
monokines on fibroblast growth. J Leukocyte Biol.
1990; 47: 312-320.
12. Thornton SC, Por SB,
Shelley L, Penny R, Breit SN. Identification of
the major fibroblast growth factors spontaneously released in
inflammatory arthritis as PDGF and TNF alpha. Clin Exp
Immunol. 1991; 86: 79-86.
13. Bennett S, Por SB,
Cooley MA, Breit SN. In vitro replication
dynamics of human culture-derived macrophages in a
long term serum free system. J Immunol. 1993: 150:
2364-2371.
14. Nethery A. Anal Biochem.
1986; 159: 390-395
15. Katelaris A. Doctor of Medicine
thesis submitted to UNSW and entitled: Graft versus host disease as
a model of scleroderma -An investigation into the interaction of the
immune system and connective tissue using a murine model.
1991.
16. Bennett S, Por S,
Stanley ER, Breit SN. Monocyte proliferation in
cytokine-free, serum free system. J Immunol
Methods. 1992; 153: 201-212.
17. Breit SN, Robinson JP, and
Penny R. The effect of alpha 1 antitrypsin on phagocyte
function. LLab Clin Immunol. 1983; 10:
147-149.
18. Walsh B, Penny R, Breit
SN. Microplate reader -based quantitation of collagens. Anal
Biochem 1992; 203: 187-190.
19. Bansal M.K., Ross A.S.A., and
Bard J.B.L., Does chondroitin sulphate have a role to play in
the morphogenesis of the check primary corneal stroma?
Developmental Biology 1989; 133:
185-195.
20. Pryor K, J. Goddard, D.
Goldstein, P. Stricker, P. Russell, D.
Golovsky and R. Penny. Bacillus Calmette- Guerin (BCG)
enhances monocyte-and lymphocyte- mediated blader
tumour cell killing, British Journal of Cancer, 1995;
71: 801-807.
Se apreciará por las personas expertas en la
técnica que numerosas variaciones y/o modificaciones se pueden
hacer a la invención como se muestra en las modalidades específicas.
Las presentes modalidades son, por lo tanto consideradas en todos
los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.
Claims (24)
1. Un polinucleótido aislado que se puede
obtener a partir de cromosoma 19p13.1 humano, en donde dicha
molécula de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido
que codifica una proteína que pertenece a la superfamilia
TGF-\beta que tiene un sitio RXXR conservado y 7
residuos de cisteína conservados, en donde dicha proteína
codificada es capaz de:
(i) ser expresada por línea de fibroblasto
neonatal humano CCD34Lu en niveles incrementados en respuesta a
IGF- 1, PDGF BB, TGF-\beta o
TNF-\alpha;
(ii) ser expresada por macrófagos en niveles
incrementados en respuesta a GM- CSF, M- CSF, IL- 2 o
TNF-\alpha; y
(iii) ser expresada por células endoteliales de
vena umbilical humanas en niveles incrementados en respuesta a
ECGF.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína codificada es
capaz de:
(iv) exhibir actividad de factor de crecimiento
en fibroblastos de prepucio de infante humano.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha molécula de
polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que corresponde
a aquella mostrada en la Figura 1.
4. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de
nucleótido corresponde a una secuencia de nucleótido variante
seleccionada de a1, b1, b2, d2, dd2, f1, h1 y u2 como se muestra en
la Figura 20A.
5. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en
donde la secuencia de nucleótido que codifica dicha proteína no
comprende la secuencia que codifica el líder nativo o
propéptido.
6. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de
nucleótido que codifica la proteína incluye una secuencia que
codifica un líder heterólogo.
7. Una molécula de polinucleótido aislada de
acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho líder heterólogo es
la folitropina (FSH) destacada.
8. Un vector que comprende una molécula de
polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes ligada de forma operable a un promotor adecuado.
9. Un vector que comprende una molécula de
nucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la molécula
de polinucleótido es liga de forma operable en orientación opuesta a
un promotor adecuado tal que la expresión procede 5' al terminal 3'
para producir ARN anticodificante.
10. Un vector de acuerdo con la reivindicación
9, en donde la molécula de polinucleótido incluye o se liga a una
secuencia de nucleótido que codifica un dominio ribozima.
11. Una proteína codificada por una molécula de
polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7.
12. Un organismo transformado con una molécula
de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 o un vector de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 8 a 10, en donde dicho organismo se selecciona
de estirpes celulares eucarióticas, levadura y plantas.
13. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se
une específicamente a la proteína de acuerdo con la reivindicación
11.
14. Una proteína o porción antigénica de la
misma, que se une al anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
13.
15. Un método para producir una proteína de
acuerdo con la reivindicación 11, que comprende transformar un
organismo anfitrión adecuado seleccionado de estirpes celulares
eucarióticas, levadura y plantas con una molécula de polinucleótido
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en
donde dicha molécula de polinucleótido es constitutiva e
indeciblemente expresada en dicho organismo anfitrión.
\newpage
16. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de acuerdo con la reivindicación 11 o una proteína o
porción antigénica de la misma de acuerdo con la reivindicación 14
en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
17. Una proteína de acuerdo con la
reivindicación 11 o una proteína o porción antigénica de la misma de
acuerdo con la reivindicación 14 para uso en el tratamiento de una
enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de
cicatrización y/o consolidación de fractura, lesión isquémica,
cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias
crónicas, inmunosupresión, trastornos fibróticos/fibroproliferativos
tales como artritis reumatoide, arterosclerosis, fibrosis pulmonar,
escleroderma, cirrosis y queloides.
18. Uso de una proteína de acuerdo con la
reivindicación 11 o una proteína o porción antigénica de la misma
de acuerdo con la reivindicación 14 en la fabricación de una
composición para el tratamiento de una enfermedad o afección
seleccionada del grupo que consiste de cicatrización y/o
consolidación de fractura, lesión isquémica, cáncer, enfermedades
autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, inmunosupresión,
trastornos fibróticos/fibroproliferativos tales como artritis
reumatoide, arterosclerosis, fibrosis pulmonar, escleroderma,
cirrosis y queloides.
19. Un método para producir una proteína de
acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha línea celular
eucariótica es una línea celular de mamífero.
20. Un método in vitro para diagnosticar
una enfermedad o trastorno en un sujeto, dicha enfermedad o
trastorno se selecciona de cáncer y trastornos inflamatorios y
fibróticos, dicho método comprende detectar la presencia de una
proteína de acuerdo con la reivindicación 11.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
20, en donde el trastorno inflamatorio o fibrótico es artritis
reumatoide, cirrosis o aterosclerosis.
22. Un equipo para uso en el método de acuerdo
con la reivindicación 20 o 21, en donde el equipo comprende la
proteína de acuerdo con la reivindicación 11 y/o el anticuerpo o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 13.
23. Un equipo para uso en el método de acuerdo
con la reivindicación 20 o 21, en donde el equipo comprende
cebadores de nucleótido para la secuencia de nucleótido de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para ensayos
basados en PCR.
24. Una proteína de acuerdo con la
reivindicación 11 en donde la proteína es la proteína madura.
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---|---|---|---|
AUPN3706 | 1995-06-22 | ||
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Publication Number | Publication Date |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96918521T Expired - Lifetime ES2324433T3 (es) | 1995-06-22 | 1996-06-24 | Tgf-beta novedoso similar a citocina. |
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---|---|
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ES (1) | ES2324433T3 (es) |
NZ (1) | NZ310370A (es) |
WO (1) | WO1997000958A1 (es) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6180602B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Sagami Chemical Research Center | Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent |
US6521227B1 (en) | 1999-11-18 | 2003-02-18 | Peter L. Hudson | Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides |
US5994102A (en) * | 1994-12-15 | 1999-11-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides |
US6524802B1 (en) * | 1996-03-29 | 2003-02-25 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting growth differentiation factor-14 |
NZ334592A (en) * | 1996-09-11 | 2000-10-27 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Protein growth factor related to TNF-beta and coupled with a toxic moiety for use in treating prostate cancer |
US6465181B2 (en) * | 1999-03-25 | 2002-10-15 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate |
JP2002543841A (ja) * | 1999-05-17 | 2002-12-24 | バイオファーム ゲゼルシャフト ツア バイオテクノロジシェン エントヴィックルング ウント ツム フェルトリーブ フォン ファルマカ エムベーハー | TGF−βスーパーファミリーの新規のメンバーであるGDF―15の神経保護特性 |
AU5018201A (en) | 2000-04-20 | 2001-11-07 | St Vincents Hospital Sydney Lt | Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitory cytokine -1 (mic-1) |
SE0002364D0 (sv) * | 2000-06-22 | 2000-06-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Growth Factors |
US7141661B2 (en) | 2000-09-08 | 2006-11-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Non-steroidal anti-inflammatory drug activated gene with anti-tumorigenic properties |
US7157235B2 (en) | 2002-06-17 | 2007-01-02 | St. Vincent's Hospital Sydney Limited | Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease |
US7919084B2 (en) | 2002-06-17 | 2011-04-05 | St. Vincent's Hospital Sydney Limited | Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease |
AU2005205595A1 (en) * | 2004-01-14 | 2005-07-28 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Methods of using peroxisome proliferator-activated receptor alpha target genes |
PL2929891T3 (pl) | 2004-04-13 | 2020-08-24 | St Vincent's Hospital Sydney Limited | Sposób modulowania apetytu |
AU2005247871A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-08 | Research Development Foundation | Antagonism of TGF-beta superfamily receptor signaling |
US20070237713A1 (en) | 2006-04-04 | 2007-10-11 | Fan Rong A | PCan065 Antibody Compositions and Methods of Use |
CN102203619B (zh) | 2008-10-31 | 2015-12-16 | 圣文森特医院悉尼有限公司 | 慢性肾病中的预测方法 |
US20110002897A1 (en) | 2009-06-11 | 2011-01-06 | Burnham Institute For Medical Research | Directed differentiation of stem cells |
CA2862516C (en) | 2012-03-27 | 2023-02-14 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
ES2791183T3 (es) | 2012-12-21 | 2020-11-03 | Aveo Pharmaceuticals Inc | Anticuerpos anti-GDF15 |
US9161966B2 (en) | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
WO2014120619A2 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use in treating metabolic disorders |
US10588980B2 (en) | 2014-06-23 | 2020-03-17 | Novartis Ag | Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules |
CN106573966B (zh) | 2014-07-30 | 2022-03-01 | Ngm生物制药有限公司 | 用于治疗代谢异常的组合物和方法 |
CA2961587A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
EP3393494A1 (en) | 2015-12-22 | 2018-10-31 | Novartis Ag | Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15) |
IL261666B1 (en) | 2016-03-31 | 2024-05-01 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Related proteins and methods of using them |
CA3045700A1 (en) | 2016-12-06 | 2018-06-14 | St Vincent's Hospital Sydney Limited | Treatment of obesity and eating disorders |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994003599A1 (en) * | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Sagami Chemical Research Center | HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR |
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WO1996018730A1 (en) * | 1994-12-15 | 1996-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Prostatic growth factor |
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