PT1179067E

PT1179067E - Propriedades neuroprotectoras de gdf-15, um membro da superfamília de tgf-beta

Info

Publication number: PT1179067E
Application number: PT00935043T
Authority: PT
Inventors: Klaus Unsicker; Kerstin Krieglstein
Original assignee: Biopharm G Biotechnolo Entwi V
Priority date: 1999-05-17
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ES2275513T3; DE60032355T2; CY1105910T1; WO2000070051A1; CA2372119A1; US20060148709A1; ATE348164T1; AU5067100A; EP1179067B1; DE60032355D1; JP2002543841A; DK1179067T3; EP1179067A1

Description

DESCRIÇÃO "PROPRIEDADES NEUROPROTECTORAS DE GDF-15, UM MEMBRO DA SUPERFAMÍLIA DE TGF-BETA" A presente invenção refere-se à utilização de um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica codificando a sequência primária de aminoácidos de uma proteina, e. g., uma proteína de tipo TGF-β, a qual é derivada, e. g., de neurónios e células gliais, ou um seu fragmento funcionalmente activo possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou seus homólogos funcionalmente activos, possuindo substituições conservadoras de aminoácidos e possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos, facultativamente em conjunto com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurodegenerativos em mamíferos ou de um kit de diagnóstico para a detecção dos referidos distúrbios.

Os membros da superfamília de TGF-β são conhecidos pelas suas importantes implicações multifuncionais no desenvolvimento e manutenção, tal como na organização do plano corporal, regulação da proliferação celular, diferenciação e sobrevivência celular. A superfamília de TGF-β, ainda em expansão, inclui as isoformas de TGF-β 1 a 5, activinas, inibinas, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), factores de crescimento/diferenciação (GDFs), substância inibidora mulleriana, complexo génico decapentaplégico de Drosophila, gene Vg-1 de Xenopus, e uma subfamília em expansão de factores de 1 crescimento derivados de linhas celulares gliais (GDNFs) e proteínas relacionadas. A totalidade dos membros da superfamília de TGF-β partilha diversas estruturas homólogas. São sintetizados como moléculas precursoras grandes contendo um pró-domínio biologicamente inactivo que pode ser segregado como um complexo com a parte carboxiterminal madura. Além disso, as proteínas bioactivas maduras são geradas por proteólise utilizando um sítio de clivagem característico. Mais precisamente, os segmentos carboxiterminais maduros contêm um grupo cisteína altamente conservado.

Bootcov et al. (Bootcov MR. et al., MIC-1, uma nova citocina inibidora de macrófagos, é um membro divergente da superfamília de TGF-β, Proc., Natl., Acad. Sei. USA, Vol. 94, pp. 11514-11519, Out. 1997) descreve a identificação e expressão de uma nova citocina da superfamília do factor β transformador do crescimento (TGF-β) designada citocina 1 inibidora de macrófagos (MIC-1). Para além disso, o documento WO 97/00958 refere-se a uma nova citocina de tipo TGF-β e a moléculas polinucleotídicas isoladas codificando esta proteína. Além disso, o documento WO 98/11224 refere-se a uma proteína recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos de GF-2H madura que inibe selectivamente a proliferação de células do cancro da próstata independente de androgénios quando contactadas com estas.

Visto que as proteínas de tipo TGF-β estão igualmente implicadas na regulação da proliferação de células estaminais neuronais e na manutenção de neurónios, existe uma grande procura para novos membros desta família de proteínas. 2

Consequentemente, o problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar novos compostos relativos a proteínas de tipo TGF-β possuindo actividades neurotróficas que são adequadas para o tratamento e diagnóstico de distúrbios neurodegenerativos. A solução para o problema técnico supracitado é alcançada proporcionando as formas de realização como caracterizadas nas reivindicações.

Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica codificando a sequência primária de aminoácidos de uma proteína compreendendo, pelo menos, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 7B, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 8B, ou os resíduos de aminoácidos 14 a 111 da sequência apresentada na Fig. 8B, e. g., uma proteína de tipo TGF-β, a qual é derivada, e. g.r de neurónios e células gliais, ou um seu fragmento funcionalmente activo possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou seus homólogos funcionalmente activos, possuindo substituições conservadoras de aminoácidos e possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou um vector contendo, pelo menos, o ácido nucleico ou uma proteína codificada pelo ácido nucleico, opcionalmente em conjunto com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurodegenerativos em mamíferos.

Os termos "ácido nucleico" e "sequência nucleotídica" referem-se a moléculas de ácidos nucleicos expressas endogenamente, semi-sintéticas, sintéticas ou modificadas 3 quimicamente, de um modo preferido consistindo, substancialmente, de desoxirribonucleotideos e/ou ribonucleotideos e/ou nucleotideos modificados. Para além disso, o termo "sequência nucleotidica" pode compreender exões, em que a sequência nucleotidica codifica a sequência primária de aminoácidos e pode ser degenerada com base no código genético. 0 termo "sequência primária de aminoácidos" refere-se à sequência de aminoácidos, independentemente da estrutura terciária e quaternária da proteina. 0 termo "proteina de tipo TGF-β" refere-se a proteínas exibindo as características da superfamília de TGF-β, especialmente um motivo conservado rico em cisteína, e compreende tanto as moléculas precursoras grandes contendo um pro-domínio, bem como as proteínas bioactivas maduras que são geradas por proteólise utilizando um sítio de clivagem característico.

Os termos "derivado funcionalmente activo" e "parte funcionalmente activa" referem-se a um composto proteináceo exibindo, pelo menos, um efeito neurotrófico nos neurónios DAergicos. A forma funcionalmente activa da proteína acima definida pode ser uma forma monomérica, dimérica e/ou oligomérica, bem como uma forma heterooligomérica, e. g., um heterodímero compreendendo, pelo menos, dois monómeros diferentes de proteínas de tipo TGF-β possuindo actividade neurotrófica. A expressão "derivado de neurónios e células gliais" significa que o gene que codifica para a proteína é transcrito e/ou traduzido nos neurónios e células gliais, tais como células Purkinje e astrócitos, tal que o ARNm e/ou a proteína é 4 detectável através de métodos conhecidos na técnica, tais como hibridação in situ, RT-PCR, transferência de Northern ou de Western. A expressão "efeito neurotrófico em neurónios DAergicos" refere-se a uma actividade proteinácea que pode conferir, por ela mesma ou em conjunto com outros factores, sobrevivência e diferenciação dos neurónios DAergicos, na gama nanomolar ou abaixo.

Numa forma de realização preferida da utilização acima definida, os neurónios e células gliais são de origem mamífera, e. g., humana, murganho ou rato.

Numa forma de realização adicional preferida, a proteína protege contra eventos neurodegenerativos. Tais eventos neurodegenerativos podem ser, e. g. , mediados por lesão oxidativa, radicais livres, mediadores ou executores de programas de morte neuronal, tais como caspases, membros pró- e anti-apoptóticos da família de bcl-2. Um dano radical tóxico pode ser mediada por ferro, e. g., iões Fe, NO e outros dadores de radicais. Por conseguinte, o ácido nucleico, como acima definido, codifica uma proteína de tipo TGF-β que é capaz de proteger neurónios DAergicos contra intoxicação por ferro, o qual se sugere que causa a doença de Parkinson (PD).

Numa forma de realização adicional preferida, o ácido nucleico utilizado de acordo com a presente invenção compreende, pelo menos, a sequência nucleotídica apresentada na Fig. 7A ou a sequência nucleotídica apresentada na Fig. 8A ou os nucleotídeos 40 a 333 da sequência nucleotídica apresentada na Fig. 8A ou mutantes de tais ácidos nucleicos conduzindo à expressão de 5 polipeptídeos funcionalmente activos. Exemplos de tais mutações incluem eliminações, inserções e substituições de um ou mais nucleotideos, tais como mutações que conduzem a substituições conservadoras de aminoácidos, e. g. , as mutações na gama de nucleotideos 40 a 333 da sequência nucleotidica apresentada na Fig. 8A, i. e., a região da sequência nucleotidica codificando a região 7 do grupo Cys a qual é altamente conservada em proteínas de tipo TGF-β.

Um assunto adicional da presente invenção refere-se a um vector contendo, pelo menos, o ácido nucleico como acima definido. O termo "vector" refere-se a um replicão de ADN e/ou ARN que pode ser utilizado para a amplificação e/ou expressão da sequência nucleotidica acima definida. O vector pode conter quaisquer unidades de controlo úteis, tais como promotores, estimuladores ou outras extensões de sequência dentro das regiões em 5' da sequência servindo para o controlo da sua expressão. O vector pode conter adicionalmente sequências dentro da região 5' e/ou 3' da sequência nucleotidica, que codificam sequências de aminoácidos, tais como um marcador His, os quais são úteis para a detecção e/ou isolamento da proteína codificada pela sequência nucleotidica. Além disso, o vector pode conter elementos de sequência dentro da região 5' e/ou 3' da sequência nucleotidica codificando sequências de aminoácidos que servem para a marcação da proteína codificada pela sequência nucleotidica para tecidos nervosos e/ou para a penetração da barreira hematoencefálica. São exemplos de vectores adequados, vectores de baculovirus. O ácido nucleico ou o vector utilizados de acordo com a presente invenção podem estar contidos num organismo hospedeiro. O termo "organismo hospedeiro" compreende um vírus, uma bactéria 6 tal como Escherichia coli, um fungo, uma planta, um mamífero não humano ou um insecto ou suas partes, tais como células, e. g., células Sf9.

Uma modulação da actividade funcional da proteína utilizada de acordo com a presente invenção também pode ser alcançada por alteração da expressão da sequência nucleotídica do ácido nucleico acima definido relativamente ao nível de expressão numa célula normal. Pode utilizar-se, por exemplo, um ácido nucleico anti-sentido mascarando o ARNm ou uma ribozima que cliva o ARNm para inibir a expressão. Alternativamente, pode influenciar-se a eficiência do promotor que regula a expressão da sequência nucleotídica do ácido nucleico acima definido. 0 ácido nucleico, o vector, ou a proteína utilizada como acima definido podem produzir-se através de um método, e. g., compreendendo as etapas de: (a) cultivando um organismo hospedeiro num meio adequado sob condições adequadas; e (b) isolando o produto desejado a partir do meio e/ou dos organismos hospedeiros.

Uma forma de realização preferida do método para a produção da proteína utilizada de acordo com a presente invenção, utiliza bactérias tais como E. coli, como o organismo hospedeiro. A expressão da proteína pode, então, conduzir a uma forma funcionalmente inactiva, e. g. , de agregados amorfos dentro da bactéria, conhecidos na técnica como "corpos de inclusão". Por conseguinte, o método pode compreender ainda etapas que servem para o reenrolamento e/ou modificação da proteína isolada numa 7 forma funcionalmente activa que pode ser uma forma monomérica, dimérica ou oligomérica. Em particular, este pode ser um método para a produção da forma dimérica biologicamente activa da proteína como acima definido, de um modo preferido GDF-15, a partir da sua forma desnaturada ou, então, não nativa. Este resultado é alcançado pela verificação, inesperada, que são obtidas quantidades consideráveis dos desejados produtos diméricos submetendo a forma monomérica da proteína, utilizada de acordo com a presente invenção, a condições de reenrolamento. Assim, a presente invenção refere-se, igualmente, à utilização de GDF-15 dimérica biologicamente activa, a qual foi produzida pelo método acima definido.

Uma forma de realização adicional da presente invenção refere-se à utilização do ácido nucleico, do vector, da proteína, do anticorpo, do antagonista ou do agonista, como acima definido, opcionalmente em conjunto com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ser utilizada na prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurodegenerativos em mamíferos, de um modo preferido em humanos. Além disso, podem ser concebidas técnicas terapêuticas para o tratamento de distúrbios que estão associados à expressão da sequência nucleotídica do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, utilizando os agentes acima mencionados, os quais são capazes de regular a expressão da sequência nucleotídica do ácido nucleico acima definido, e. g. , ácidos nucleicos anti-sentido, ribozimas e/ou agentes para a influência da actividade promotora. Os distúrbios neurodegenerativos são, de um modo preferido, distúrbios neurológicos e psicológicos agudos e/ou crónicos e podem ser causados por acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou outras do CNS e distúrbios psiquiátricos demências, infecções associados a perturbações em sistemas transmissores do CNS, tais como depressão e esquizofrenia.

Numa forma de realização preferida adicional, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende ainda, além do ácido nucleico, do vector, da proteína, do anticorpo, do antagonista ou do agonista, como acima definido, um ou mais outros agentes possuindo actividade neurotrófica. São agentes preferidos, e. g., citocinas ou seus derivados ou partes funcionalmente activas. Citocinas preferidas utilizadas na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser seleccionadas a partir do grupo consistindo de GDF, tais como GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8 e GDF-9, GDNF, TGF, tais como TGF-α ou TGF-β, e. g. TGF-βΙ, TGF-32 ou TGF-βύ, activina A, BMP tais como BMP-2, BMP-4, BMP-6, ou BMP-7, BMP-11, BMP-12, BDNF, NGF, neurotrofinas, tais como NT-3 ou NT-4, EGF, CNTF e FGF, tal como FGF-2. 0 termo "GDNF" inclui GDNF, neurturina e persefina.

Um assunto adicional da presente invenção refere-se à utilização do ácido nucleico, do vector, da proteína e/ou do anticorpo como acima definido, na preparação de um kit de diagnóstico para a detecção de distúrbios neurodegenerativos e/ou infecções do CNS, tais como meningite, e. g., uma meningite bacteriana, em mamíferos, de um modo preferido humanos. Exemplos de outros distúrbios neurodegenerativos são como acima definido.

As figuras indicam:

Fig. 1 Localização de GDF-15 no CNS. (A) Imagem fotográfica de uma hibridação in situ de um plexo coróide de um rato adulto realizado com sondas de ARN anti-sentido GDF-15 9 específicas para rato. (B) Imagem fotográfica de uma análise de imunotransferência de líquido cefalorraquidiano (CSF) humano sob condições redutoras com anti-soro GDF-15 purificado. (C) RT-PCR de diferentes regiões PO do cérebro de rato (mesocéfalo, bolbo raquidiano, córtex, hipocampo, estriado), gânglios das raízes dorsais (DRG), astrócitos primários cultivados (astr.), linha celular de oligodendrócitos OLI-neu (OLI) e progenitores de oligodendrócitos cultivados (0-2A). (D)

Análise por imunotransferência em condições nativas das correspondentes áreas do cérebro e células de (c) com anti-soro GDF-15 purificado.

Fig. 2 Imagem de análise de transferência Western de GDF-15 em CSF humano sob condições redutoras. Marcador de peso molecular (St.). Amostra de CSF de um doente com meningite bacteriana (corredor 1). Amostra de CSF de um doente de controlo (corredor 2).

Fig. 3 Representação gráfica de experiências exibindo o efeito de sobrevivência de GDF-15 em culturas de neurónios mesencefálicos. Números de neurónios sobreviventes imunorreactivos para tirosina hidroxilase (TH) de culturas mesencefálicas (E15/DIV7) tratados apenas com meio (controlo), lisado purificado de células Sf9 não infectadas (controlo báculo), GDF-15 (0,01 a 1 ng/mL) purificada de lisados infectados de células Sf9, e GDNF (10 ng/mL) . Os dados são apresentados como média ± SEM (n=3), valores P derivados do teste t de Student são ***P<0,001, **P<0,01 para sobrevivência aumentada relativamente a culturas de controlo. 10

Fig. 4 Efeito protector de GDF-15 em culturas tratadas com Fe2+ (100 μΜ) . (A) Representação gráfica de números de neurónios sobreviventes imunorreactivos para TH de culturas mesencefálicas (E15/DIV7) tratadas com ou sem Fe2+ apenas em meio (controlo), na presença de NT-4 (10 ng/mL) e na presença de GDF-15 (10 ng/mL). (B)

Representação gráfica da percentagem de neurónios sobreviventes imunorreactivos para TH de culturas mesencefálicas (E15/DIV7) tratadas com Fe2+ apenas em meio (controlo), na presença de NT-4 (10 ng/mL) e na presença de GDF-15 (10 ng/mL). Valores de culturas sem adição de ferro são fixados em 100%. Os dados são apresentados como média ± SEM (n=3) , valores P derivados do teste t de Student são *P < 0,05 para sobrevivência aumentada relativamente a culturas de controlo.

Fig. 5 Efeitos neurotróficos de GDF-15 in vivo. (A)

Representação gráfica de dados de rotação anfetaminica de ratos com lesões unilaterais de 6-OHDA (6-hidroxidopamina). Rotações por minuto foram monitorizadas durante 60 min com inicio 5 min após administração de anfetamina (5 mg/Kg i.p.). (B)

Representação gráfica de contagens de neurónios positivos para TH no SNpc. Os valores são apresentados como percentagem de neurónios positivos para TH no lado lesionado, em comparação com o lado não lesionado. Os dados são apresentados como média ± SEM (n=4) . Valores P derivados do teste t de Student são *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Fig. 6 Sinalização de GDF-15 através de proteínas Smad. (A) 11

Representação gráfica de experiências demonstrando a activação do Elemento de Ligação Smad (SBE) por TGF-βΙ e GDF-15 em células hFob transfectadas transientemente. (B) Representação gráfica de experiências mostrando gue o promotor PAI-1, gue é activado exclusivamente por TGF-βΙ a -β3 em células MLEC estáveis transfectadas, não responde a GDF-15.

Fig. 7 (A) ADNc e (B) seguência correspondente de aminoácidos de GDF-15 humana pre-pro madura. Nucleotideos e aminoácidos são abreviados de acordo com os códigos internacionais de uma letra.

Fig. 8 (A) ADNc e (B) seguência correspondente de aminoácidos de GDF-15 humana madura. 0 seguinte exemplo não limitante ilustra a invenção:

EXEMPLO

Identificação de GDF-15

Utilizando o grupo motivo de cisteina conservado de proteinas de tipo TGF-β, uma abordagem combinada empregando RT-PCR e rastreio de bibliotecas revelou a sequência completa de ADNc de um novo membro da superfamilia de TGF-β derivada de neurónios. 0 ADNc possui a sequência apresentada na Fig. 7A correspondendo à sequência de aminoácidos apresentada na Fig. 7B. 12

De acordo com um possível codão de iniciação de tradução alternativo que está localizado 39 nucleotídeos a montante do primeiro nucleotídeo da sequência apresentada na Fig. 7A, a proteína correspondente pode também compreender 13 aminoácidos adicionais (MPGQELRTLNGSQ) N-terminais à sequência apresentada na Fig. 7B. A proteína, que é denominada GDF-15, foi expressa recombinantemente utilizando o sistema de baculovírus. Além disso, foi desenvolvido um anticorpo contra um peptídeo específico derivado da sequência (HRTDSGVSLQTYDDL) C-terminal de murídeo e de rato. Em virtude da elevada homologia da região correspondente da sequência humana (QKTDTGVSLQTYDDL) , este anticorpo reconhece igualmente a GDF-15 humana.

Localização de GDF-15 no CNS

Realizaram-se análises de hibridação in situ com sondas de ARN anti-sentido de GDF-15, de RT-PCR bem como de transferência Western para estudar a distribuição de GDF-15 no CNS (Fig. 1). A hibridação in situ revelou sinais em neurónios, especialmente células de Purkinje, no cerebelo, e forte expressão no plexo coróide (Fig. 1 A) de ratos recém-nascidos e adultos. RT-PCR e transferência de Western de amostras retiradas de diferentes regiões de cérebros de ratos recém-nascidos e adultos e sistema nervoso periférico alargaram estes resultados pela detecção de ARNm e proteína no mesocéfalo, bolbo raquidiano, mesencéfalo, estriado, hipocampo, córtex e gânglios das raízes dorsais (Fig. 1C, D) . Os níveis mais elevados de expressão de ARNm foram detectados no plexo coróide (Fig. 1 A). Utilizaram-se nas transferências de Western anticorpos produzidos contra o 13 peptídeo C-terminal supracitado. A análise de amostras de diferentes áreas do cérebro de ratos recém-nascidos revelou uma banda distinta junto a 31 KDa (Fig. 1D) . A massa relativa de GDF-15 celular está em concordância com o peso molecular teórico de 31 KDa da proteína pro.

Visto que GDF-15 é abundante no plexo coróide, foi igualmente testada a presença da proteína no CSF de sujeitos humanos saudáveis bem como em doentes com diversos distúrbios neurológicos. Em contraste com a proteína intracelular detectada em amostras de cérebro, amostras de CSF revelaram uma única banda a cerca de 12 KDa sob condições redutoras representando a parte madura segregada de GDF-15. As quantidades mais elevadas de proteína no CSF foram detectadas em doentes com meningite bacteriana (Fig. 2) . Tomados em conjunto, estes dados proporcionam a prova de que GDF-15, um novo membro da superfamília de TGF-β, é amplamente expressa em diversas regiões do CNS incluindo CSF e sistema nervoso periférico. Além disso, a GDF-15 está significativamente aumentada no CSF de doentes com doença neurológica inflamatória, proporcionando a oportunidade para empregar anticorpos para GDF-15 como instrumentos de diagnóstico na doença neurológica.

Produção de GDF-15 dimérica biologicamente activa 2 pg de proteína GDF-15 monomérica (e. g., produzida em bactérias tais como E. coli) são dissolvidos em 2917,7 pL de tampão de solubilização (NaCl a 1 M, Tris-HCl a 50 mM, EDTA a 50 mM, pH 9,5). À proteína assim dissolvida, é adicionado o seguinte (resultando num volume total de 3580 pL): 14 35,8 pL de Glutationo oxidado a 100 mM (GSSG) 35,8 pL de Glutationo reduzido a 200 mM (GSH) 590,7 pL de CHAPS (3-[(Colamidopropil)-dimetilamino]-1-propano sulfonato)

Após incubação entre 20 a 22 °C durante 48 horas, mais de 80%, tipicamente 90%, da proteína monomérica está reenrolada no desejado produto dimérico. A separação do dímero é realizada por métodos cromatográficos padrão tais como HPLC de fase reversa.

Estudos funcionais utilizando GDF 15 recombinante humana

Utilizando o sistema de baculovírus, a parte madura da proteína recombinante GDF-15 humana foi expressa em células Sf9. Contudo, obtêm-se os mesmos resultados em todos os estudos funcionais quando se utiliza GDF-15 recombinante humana expressa em bactérias que foram renaturadas pelo método de reenrolamento acima descrito. A transferência de Western revelou a forma monomérica ou dimérica da proteína recombinante sob condições redutoras e não redutoras, respectivamente. No seguimento da purificação, a proteína foi testada para os seus efeitos de sobrevivência em neurónios DAergicos do mesencéfalo embrionário de rato. A adição de GDF-15 recombinante a culturas de células E14 do mesencéfalo aumentou os números de neurónios sobreviventes positivos para tirosina hidroxilase (TH) após 7 dias in vitro comparado com culturas controlo (Fig. 3). O efeito dopaminotrófico de GDF-15 é comparável à actividade promotora de sobrevivência documentada de outros membros da superfamília de TGF-β e à família de neutrofina (e. g., membros da subfamília de TGF-β, GDNF ou BDNF). Análises de culturas de mesencéfalo 15 utilizando imunocitoquímica e anticorpos para a proteína de filamento intermédia GFAP específica de astrócitos e ensaios de proliferação celular, proporcionaram a prova de que a aplicação de GDF-15 não exerceu o seu efeito de promoção de sobrevivência através do aumento numérico de células e promoção da maturação de astrócitos, uma fonte bem estabelecida de factores neurotróficos. Isto proporciona a prova de que GDF-15 afecta directamente neurónios dopaminérgicos em vez de indirectamente, como demonstrado para FGF-2 ou BMPs.

De forma a investigar se GDF-15 também é capaz de proteger neurónios DAergicos contra a causa provável de PD, i. e., intoxicação por ferro, foram examinados os seus efeitos sobre neurónios mesencefálicos intoxicados por ferro (Fig. 4A, B) . A exposição de culturas a ferro (Fe2+) causou uma redução de 80% na sobrevivência neuronial comparada a culturas de controlo não tratadas. As perdas celulares foram reduzidas para 50% quando as culturas foram co-tratadas com Fe2+ e GDF-15. Estes dados sugerem fortemente que GDF-15 protege neurónios DAergicos contra lesão mediada por ferro (oxidativo). Os dados suportam igualmente a utilização de GDF-15 como um agente para prevenir ou abrandar eventos neurodegenerativos mediados por radicais livres, stress oxidativo, mediadores e executores de programas de morte neuronial.

Além disso, foi demonstrado que GDF-15 protege igualmente neurónios mesencefálicos DAergicos lesionados in vivo. O sistema nigro-estriatal de ratos adultos foi lesionado por uma injecção unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) mesmo por acima da substância nigra esquerda (SN) . Os resultados destas experiências são apresentados nas Tabelas IA e B, 16 respectivamente. Os dados apresentados na Tabela 1B estão igualmente representados graficamente na Fig. 5A.

Tabela 1: Dados de rotação anfetamínica A: Rotações por minuto durante 60 min com inicio 5 min após administração de anfetamina (5 mg/Kg i.p.)

Rato n° Tratamento Rotações por min 1 6-OHDA 13 2 6-OHDA 11 3 6-OHDA 9 4 6-OHDA 11 5 6-OHDA + GDF-15 0 6 6-OHDA + GDF-15 1 7 6-OHDA + GDF-15 2 8 6-OHDA + GDF-15 0 B: Valores médios

Tratamento Rotações por min (média + SD) 6-OHDA 11,0 + 1,4 6-OHDA + GDF-15 0,8 + 0,8

Todos os ratos exibiram as caracteristicas tipicas de provocação anfetamínica, tal como estereotipia e erecção pilosa. Ratos que foram tratados com 6-OHDA apresentaram apenas taxas de rotação de 11,0 ± 1,41 (média ± SD), indicando, pelo menos, 95% 17 de depleção da via nigro-estriatal (Ungerstedt et al. (1970), Brain. Res., 24, 485-493). Em contraste, ratos que também foram tratados com GDF-15 rodaram a taxas muito baixas (0,75 ± 0,83), mostrando que esta proteina previne eficazmente a depleção de dopamina induzida por 6-OHDA no estriado esquerdo; cf. igualmente Fig. 5A.

Além disso, para confirmar que prevenção supracitada de depleção de dopamina induzida por 6-OHDA no estriado esquerdo se deve a um efeito neuroprotector de GDF-15 em neurónios no SN, analisou-se a pars compacta do SN (SNpc) imunocitoquimicamente. Contagens de neurónios positivos para TH no SNpc medidos em três niveis individuais são apresentados na Tabela 2A e os valores médios para cada rato são dados na Tabela 2B, respectivamente. Os valores médios globais para os ratos tratados com 6-OHDA (n=4) e para os ratos que foram co-tratados com 6-OHDA e GDF-15 (n=4) são apresentados na Tabela 2C. Os dados apresentados na Tabela 2C são igualmente representados graficamente na Fig. 5B. Os resultados mostram que o co-tratamento dos ratos com 6-OHDA e GDF-15 conduziu a um aumento de 10 vezes na contagem de neurónios positivos para TH no estriado esquerdo comparado com o tratamento com apenas 6-OHDA. Por conseguinte, GDF-15 previne a depleção de dopamina induzida por 6-OHDA no estriado esquerdo em virtude do seu forte efeito neuroprotector sobre neurónios imunorreactivos para TH. 18

Tabela 2: Dados de imunocitoquímica de TH A: Contagens de neurónios positivos para TH na substância nigra da pars compacta em três níveis; -2,8, -3,0 e -3,2 com respeito a bregma (de acordo com Pellegrino et tal. A stereotaxic atlas of the rat brain. Plenum Press, Nova Iorque, 1979).

Rato n° Tratamento Contagens TH (-2,8) Contagens TH (-3,0) Contagens TH (-3,2) Direita Esquerda E/D (%) Direita Esquerda E/D (%) Direita Esqiierda E/D (%) 1 6-OHDA 102 6 5,9 121 8 6, 6 125 11 8, 8 2 6-OHDA 114 11 9,6 117 10 8,5 114 12 10,5 3 6-OHDA 98 3 3,1 104 4 3, 8 106 9 8, 5 4 6-OHDA 99 3 3, 0 112 7 6, 3 97 6 6,2 5 6-OHDA + GDF-15 107 69 64,5 111 73 65, 8 114 81 71,1 6 6-OHDA + GDF-15 110 71 64,5 109 65 59, 6 120 84 70, 0 7 6-OHDA + GDF-15 114 78 68,4 123 101 82,1 126 97 77,0 8 6-OHDA + GDF-15 115 80 69, 6 118 95 80,5 118 89 75,4 B: Valores médios de ratos individuais

Rato n° Tratamento Contagens TH (média + SD) Direita Esquerda E/D (%) 1 6-OHDA 116,0+10,0 8,3+2,1 7,1+1,2 2 6-OHDA 115,0+1,4 11,0+0,8 9, 5 + 0,8 3 6-OHDA 102,7+3,4 5,3+2,6 5,1+2,4 4 6-OHDA 102,7+6,6 5,3+1,7 5,2+1,5 5 6-OHDA + GDF-15 110,7+2,9 74,3+5,0 67,1+2,9 6 6-OHDA + GDF-15 113,0+5,0 73,3+7,9 64,7+4,2 7 6-OHDA + GDF-15 121,0+5,1 92,0+10,0 75,8+5,7 8 6-OHDA + GDF-15 117,0+1,4 88,0+6,2 75,2+4,5 19 C:

Valores médios de ratos tratados com 6-OHDA e valores Médios após co-tratamento com 6-OHDA mais GDF-15

Tratamento Contagem TH (média + SD) Direita Esquerda Esq./Dir. (%) 6-OHDA 109, 1 + 6, 4 7,5+2,4 6, 7 + 1,8 6-OHDA + GDF-15 115,4+3,9 81,9+8,2 70,7+4,9

Resumindo, os estudos in vivo supracitados, demonstram que as injecções de GDF-15 imediatamente antes de 6-OHDA por cima do SN esquerdo e dentro do ventrículo lateral esquerdo preveniram o comportamento de rotação patológico induzido por 6-OHDA (Fig. 5A) e reduziram significativamente perdas de neurónios DAergicos SN (Fig. 5B) . Em conjunto, estes dados mostram que GDF-15 pode ser proveitosamente empregue para melhorar consequências de degenerescência nigro-estriatal na doença de Parkinson.

Utilizando o Elemento de Ligação Smad plasmídico (pSBE) que é activado por TGF-βΙ, OP-1 (também referido como BMP-7), activina, BMP-2 e GDF-5, a questão posterior foi dirigida a respeito de se GDF-15 é capaz de induzir a transdução de sinal intracelular através de proteínas Smad. A transfecção transiente da linha celular humana de osteoblastos (hFob) com SBE, mostrou que a administração de GDF-15 aumentou o sinal da luciferase (Fig. 6A). Estes resultados demonstram que GDF-15 activa o elemento responsivo promotor de Smad da construção do gene repórter. Numa experiência adicional foi testada a indutibilidade do promotor do Inibidor do Activador do Plasminogénio (PAI) em Células Epiteliais de Pulmão de Marta (MLEC) estáveis transfectadas por GDF-15. 0 ensaio MLEC, que é 20 exclusivamente sensível para TGF-βΙ, -β2, e -β3, não revelou nenhum efeito de GDF-15 (Fig. 6B) . Visto que a fosforilação de Smad2 e Smad3 está associada especificamente à activação mediada por TGF-β de receptores de TGF-β, conclui-se que GDF-15 parece não sinalizar através da via Smad2/3. Com respeito à activação dependente de GDF-15 de SBE, que é um elemento de resposta para, a Smad2/3 e para a via Smadl/5 mediada por BMP, parece que GDF-15 exerce os seus efeitos celulares por ligação a receptores de tipo BMP.

Sumário

Em conclusão, uma nova molécula neurotrófica derivada de células de neurónios pertencendo à superfamília de TGF-β, GDF-15, foi descoberta, clonada, expressa e caracterizada funcionalmente.

No sistema nervoso, ARNm e proteína de GDF-15 podem ser detectados, e. g., no mesencéfalo, estriado e córtex, mas níveis mais elevados do ARNm e da proteína encontram-se no plexo coróide e líquido cefalorraquidiano (CSF), respectivamente. Interessantemente, os níveis de proteína no CSF estão aumentados em determinados distúrbios neurológicos, e. g., em doentes com meningite bacteriana. De forma a elucidar as suas funções, a forma madura de GDF-15 humana foi expressa recombinantemente utilizando um sistema de expressão de baculovírus. A expressão resultou na síntese da forma dimérica biologicamente activa da proteína. Experiências in vivo utilizando culturas de células dissociadas de neurónios mesencefálicos embrionários de rato revelaram que GDF-15 pode actuar como um factor neurotrófico para neurónios mesencefálicos DAergicos que degeneram na doença 21 de Parkinson (PD) . GDF-15 é igualmente capaz de proteger estes neurónios contra intoxicação por ferro, que pode ser causal da PD. Além disso, pode ser demonstrado que GDF-15 também exibe o seu efeito neuroprotector in vivo. Quanto à via de sinalização sobre a qual actua GDF-15, foi estabelecido que GDF-15 é capaz de induzir a transdução de sinal intracelular através de proteínas Smad.

Por conseguinte, pode concluir-se que GDF-15 possui funções importantes no cérebro em desenvolvimento, maduro, e lesionado envolvendo opções para a utilização de GDF-15 para o tratamento e diagnóstico de distúrbios psicológicos e neurológicos agudos e crónicos, tais como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e outras demências e distúrbios psiquiátricos associados a perturbações em sistemas transmissores do CNS.

Métodos para estudos in vivo demonstrando o efeito protector de GDF-15 em neurónios nigro-estriatais lesionados por 6-OHDA

Ratos Wistar fêmea adultos foram anestesiados utilizando cetamina (75 mg/kg i.p.) e xilazina (15 mg/kg i.p.) e colocados numa estrutura estereotáxica de Kopf. Utilizou-se GDF-15 a uma concentração final de 2 yg/yL em solução salina tamponada com fosfatos (PBS) a 10 mM, pH 7,4. Quatro ratos receberam injecções de 20 yg de GDF-15 mesmo por acima da substância nigra esquerda (SN) e 20 yg de GDF-15 dentro do ventrículo lateral esquerdo (LV). Isto foi imediatamente seguido por uma injecção de hidrobrometo de 6-hidroxidopamina (8 yg como base livre em 4 yL de 0,9% de solução salina com 0,1% de ácido ascórbico) no feixe prosencefálico mediano esquerdo (MFB). Quatro ratos adicionais 22

receberam apenas 6-OHDA. As coordenadas estereotáxicas (Pellegrino et al. A stereotaxic atlas of the rat brain. Plenum Press, Nova Iorque, 1979) foram como se segue: AP -3,0, LV + 2,5, DV -8,5 para o SN; AP + 1,0, LV + 1,2, DV -3,5 para o LV; AP -2,2, LV + 1,5, DV -7,9 para o MFB. Todos os ratos foram testados comportamentalmente nos sete dias após a cirurgia. Rotações ipsilaterais foram contadas durante um período de 60 min com início 5 min após administração de sulfato de anfetamina ( + ) (5 mg/kg, i.p.). Nos dez dias após a cirurgia, todos os ratos foram terminalmente anestesiados com clorofórmio/éter e perfundidos intracardialmente com 200 mL de solução salina fria tamponada com fosfatos (PBS) a 0,1 M, pH 7,4, contendo 500 Unidades de heparina, seguida por 300 mL de 4% de paraformaldeído em PBS preparado de fresco. Os cérebros foram removidos e colocados em 4% de paraformaldeído em PBS de um dia para o outro, crioprotegidos em 30% de sacarose em PBS e depois congelados. Cortaram-se criosecções coronais de 30 ym em série através da pars compacta do SN (SNpc) e foram coradas imunocitoquimicamente para tirosina hidroxilase (TH). As secções foram incubadas em solução de bloqueamento (3% de soro normal de cabra, 0,2% de Triton X-100 em PBS) de um dia para o outro a 4 °C, depois numa solução a 1:2000 de anti-soro de coelho para TH (Affiniti Labs, R.U.) em solução de bloqueamento a 4 °C de um dia para o outro. As secções foram lavadas cinco vezes em PBS contendo 0,02% de Triton X-100, depois incubadas numa solução a 1:1000 de peroxidase de rábano ligada a IgG anti-coelho (Vector Labs) de um dia para o outro a 4 °C. Após lavagem como anteriormente, a imunocoloração TH foi visualizada utilizando 3,3'-diaminobenzidina como cromógeno. As secções foram montadas sobre lamelas gelatinizadas, desidratadas em álcool, clarificadas em xileno e montadas em DePeX® (Bioproducts, Heidelberg, Alemanha). Contaram-se os neurónios imunorreactivos 23 para TH no SNpc em ambos os lados do cérebro em cada de três níveis; -2,8, -3,0, -3,2, com respeito a bregma (Pellegrino et ai. , 1979) .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen ... <120> Propriedades neuroprotectoras de GDF-15, um novo membro da superfamília de TGF-β <130> B 1991 <140> PCT/EP00/04445 <141> 2000-05-16 <150> EP 99 109 714.8 <151> 1999-05-17 <150> EP 99 114 853.7 <151> 1999-07-29 <160> 7 <17 0> Patentln Ver. 2 <210> 1 <211> 888 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 24 atgctcctgg tgttgctggt gctctcgtgg ctgccgcatg ggggcgccct gtctctggcc 60 gaggcgagcc gcgcaagttt cccgggaccc tcagagttgc actccgaaga ctccagattc 120 cgagagttgc ggaaacgcta cgaggacctg ctaaccaggc tgcgggccaa ccagagctgg 180 gaagattcga acaccgacct cgtcccggcc cctgcagtcc ggatactcac gccagaagtg 240 cggctgggat ccggcggcca cctgcacctg cgtatctctc gggccgccct tcccgagggg 300 ctccccgagg cctcccgcct tcaccgggct ctgttccggc tgtccccgac ggcgtcaagg 360 tcgtgggacg tgacacgacc gctgcggcgt cagctcagcc ttgcaagacc ccaggcgccc 420 gcgctgcacc tgcgactgtc gccgccgccg tcgcagtcgg accaactgct ggcagaatct 480 tcgtccgcac ggccccagct ggagttgcac ttgcggccgc aagccgccag ggggcgccgc 540 agagcgcgtg cgcgcaacgg ggacgactgt ccgctcgggc ccgggcgttg ctgccgtctg 600 cacacggtcc gcgcgtcgct ggaagacctg ggctgggccg attgggtgct gtcgccacgg 660 gaggtgcaag tgaccatgtg catcggcgcg tgcccgagcc agttccgggc ggcaaacatg 720 cacgogcaga tcaagacgag cctgcaccgc ctgaagcccg acacggtgcc agcgccctgc 780 tgcgtgcccg ccagctacaa tcccatggtg ctcttacaaa agaccgacac cggggtgtcg 840 ctccagacct atgatgactt gttagccaaa gactgccact gcatatga 888 <210> 2 <211> 339 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gcgcgcaacg gggacgactg tccgctcggg cccgggcgtt gctgccgtct gcacacggtc 60 cgcgcgtcgc tggaagacct gggctgggcc gattgggtgc tgtcgccacg ggaggtgcaa 120 gtgaccatgt gcatcggcgc gtgcccgagc cagttccggg cggcaaacat gcacgcgcag 180 atcaagacga gcctgcaccg cctgaagccc gacacggtgc cagcgccctg ctgcgtgccc 240 gccagctaca atcccatggt gctcttacaa aagaccgaca ccggggtgtc gctccagacc 300 tatgatgact tgttagccaa agactgccac tgcatatga 339 <210> 3 <211> 295 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 25

Met Leu Leu Vai Leu Leu Vai Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala 15 10 15

Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu 20 25 30

Leu His Thr Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu 35 40 45

Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gin Ser Trp Glu Asp Ser Asn 50 55 60

Thr Asp Leu Vai Pro Ala Pro Ala Vai Arg Ile Leu Thr Pro Glu Vai 65 70 75 80

Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala 85 90 95

Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe 100 105 no

Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Vai Thr Arg Pro Leu 115 120 125

Arg Arg Gin Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gin Ala Pro Ala Leu His Leu 130 135 140

Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gin Ser Asp Gin Leu Leu Ala Glu Ser 145 150 155 160

Ser Ser Ala Arg Pro Gin Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gin Ala Ala 26 165 170 175

Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp Hís Cys Pro Leu 180 185 190

Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Vai Arg Ala Ser Leu Glu 195 200 205

Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Vai Leu Ser Pro Arg Glu Vai Gin Vai 210 215 220

Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro 225 230

His Ala Gin Ile Lys Thr Ser Leu 245

Pro Ala Pro Cys Cys Vai Pro Ala 260

Gin Lys Thr Asp Thr Gly Vai Ser 275 280

Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 290 295

Ser Gin Phe Arg Ala Ala Asn Met 235 240

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Vai 250 255

Ser Tyr Asn Pro Met Vai Leu Ile 265 270

Leu Gin Thr Tyr Asp Asp Leu Leu 285 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 27

Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro 1 5

Leu His Thr Vai Arg Ala Ser Leu 20

Vai Leu Ser Pro Arg Glu Vai Gin 35 40

Pro Ser Gin Phe Arg Ala Ala Asn 50 55

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr 65 70

Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 10 15

Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 25 30

Vai Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 45

Met His Ala Gin Ile Lys Thr Ser 60

Vai Pro Ala Pro Cys Cys Vai Pro 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Vai Leu Ile Gin Lys Thr Asp Thr Gly Vai 85 90 95

Ser Leu Gin Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 5

Met Pro Gly Gin Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly Ser Gin 15 10

<210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial 28 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Peptideo derivado da sequência C-terminal de murino e rato de GDF-15 <400> 6

His Arg Thr Asp Ser Gly Vai Ser Leu Gin Thr Tyr Asp Asp Leu 15 10 15

<210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> PEPTÍDEO <222> (1)..(15) <223> O peptideo corresponde aos aminoácidos 273 a 287 de GDF-15 humana pre pro madura <400> 7

Gin Lys Thr Asp Thr Gly Vai Ser Leu Gin Thr Tyr Asp Asp Leu 15 10 15

Lisboa, 9 de Janeiro de 2007 29

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica codificando a sequência primária de aminoácidos de uma proteína compreendendo, pelo menos, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 7B, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 8B, ou os resíduos de aminoácidos 14 a 111 da sequência apresentada na Fig. 8B ou um seu fragmento funcionalmente activo, possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou seus homólogos funcionalmente activos, possuindo substituições conservadoras de aminoácidos e possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou um vector contendo, pelo menos, o ácido nucleico ou uma proteína codificada pelo ácido nucleico, opcionalmente em conjunto com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurodegenerativos em mamíferos.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína ou seu derivado funcionalmente activo ou parte deste, como definido na reivindicação 1, é um monómero, dímero, oligómero ou hetero-oligómero.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a proteína como definida na reivindicação 1, protege contra eventos neurodegenerativos.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o evento neurodegenerativo é mediado por lesão oxidativa e/ou lesão 1 de radicais livres e/ou mediadores e/ou executores de programas de morte neuronal.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que os mediadores da lesão por radicais livres são seleccionados do grupo consistindo de ferro, dadores de NO e outros dadores de radicais livres, e os mediadores e executores de programas de morte neuronal são seleccionados do grupo consistindo de caspases e membros pró- e anti-apoptóticos da família de bcl-2.
6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 5, em que o ácido nucleico compreende , pelo menos, a sequência nucleotídica apresentada na Fig. 7A ou a sequência nucleotídica apresentada na Fig. 8A ou os nucleotídeos 40 a 333 da sequência nucleotídica apresentada na Fig. 8A ou seus mutantes possuindo uma eliminaçãoo, inserção e/ou substituição de um nucleotídeo, os referidos mutantes conduzindo à expressão de um polipeptídeo funcional que possui, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos.
7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a proteína codificada pelo ácido nucleico compreende, pelo menos, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 7B ou a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 8B ou os resíduos de aminoácidos 14 a 111 da sequência apresentada na Fig. 8B bem como os seus homólogos possuindo substituições conservadoras de aminoácidos. 2
8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o mamifero é um humano.
9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os distúrbios neurodegenerativos são seleccionados ir do grupo de distúrbios neurológicos e psicológicos agudos e/ou crónicos.
10. Utilização da reivindicação 9, em que os distúrbios neurológicos e psicológicos são causados por acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou outras demências, infecções do CNS e distúrbios psiquiátricos associados a perturbações nos sistemas transmissores do CNS.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que os distúrbios psiquiátricos são seleccionados do grupo consistindo de depressão e esquizofrenia.
12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 compreendendo ainda um ou mais agentes possuindo actividade neurotrófica ou derivados funcionalmente activos ou partes destes.
13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o agente é uma citocina.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que a citocina é seleccionada do grupo consistindo de GDF, GDNF, TGF, activinas, BMP, BDNF, NGF, EGF, CNTF e FGF. 3
15. Utilização de um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica codificando a sequência primária de aminoácidos de uma proteina compreendendo, pelo menos, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 7B, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 8B, ou os resíduos de aminoácidos 14 a 111 da sequência apresentada na Fig. 8B ou um seu fragmento funcionalmente activo possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos ou seus homólogos funcionalmente activos possuindo substituições conservadoras de aminoácidos e possuindo, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos e/ou um vector contendo, pelo menos, o ácido nucleico e/ou uma proteína codificada pelo ácido nucleico e/ou um anticorpo ou um seu fragmento funcional dirigido contra a proteína, para a preparação de um kit de diagnóstico para a detecção de distúrbios neurodegenerativos em mamíferos.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a proteína ou seu derivado funcionalmente activo ou parte desta, como definido na reivindicação 15, é um monómero, dímero, oligómero ou hetero-oligómero.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a proteína como definido na reivindicação 15 protege contra eventos neurodegenerativos.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o evento neurodegenerativo é mediado por lesão oxidativa e/ou lesão de radicais livres e/ou mediadores e/ou executores de programas de morte neuronal. 4
19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em que os mediadores da lesão por radicais livres são seleccionados do grupo consistindo de ferro, dadores de NO e outros dadores de radicais livres, e os mediadores e executores de programas de morte neuronal são seleccionados do grupo consistindo de caspases e membros pró- e ant-iapoptóticos da familia de bcl-2.
20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 19, em que o ácido nucleico compreende, pelo menos, a sequência nucleotidica apresentada na Fig. 7A ou a sequência nucleotidica apresentada na Fig. 8A ou os nucleotideos 40 a 333 da sequência nucleotidica apresentada na Fig. 8A ou seus mutantes possuindo uma eliminação, inserção e/ou substituição de um nucleotideo, os referidos mutantes conduzindo à expressão de um polipeptídeo funcional que possui, pelo menos, um efeito neurotrófico sobre neurónios DAergicos.
21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 20, em que a proteina codificada pelo ácido nucleico compreende, pelo menos, a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 7B ou a sequência primária de aminoácidos apresentada na Fig. 8B ou os residuos de aminoácidos 14 a 111 da sequência apresentada na Fig. 8B bem como os seus homólogos possuindo substituições conservadoras de aminoácidos. 5
22 . Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o mamifero é um humano. Lisboa, 9 de Janeiro de 2007 6