PT1095140E - Factores neurotróficos - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "FACTORES NEUROTRÓFICOS"
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a polipéptidos de factor neurotrófico, ácidos nucleicos codificando polipéptidos de factor neurotrófico e anticorpos que se ligam especificamente a factores neurotróficos.
ANTECEDENTES
Os factores neurotróficos são proteínas de ocorrência natural que promovem a sobrevivência, mantêm a diferenciação fenotípica, previnem a degenerescência e melhoram a actividade de células e tecidos neuronais. Os factores neurotróficos são isolados de tecido neural e de tecido não neural que é inervado pelo sistema nervoso e foram classificados em grupos funcionalmente e estruturalmente relacionados, também referidos como famílias, superfamílias ou subfamílias. Entre as superfamílias de factores neurotróficos estão as superfamilias de factor de crescimento de fibroblastos, neurotrofina e factor de crescimento transformante β (TGF-β). As espécies individuais de factores neurotróficos são distinguidas pela sua estrutura física, sua interacção com os seus receptores compósitos e seus efeitos em diversos tipos de células nervosas. Estão classificados dentro da superfamilia de TGF-β (Massague, et al., Trends in Cell Biology, 1994 4 172-178) os ligandos de factor 2 neurotrófico derivados da linha celular glial ("GDNF"; documento WO 93/06116), que incluem GDNF, persefina ("PSP"; Milbrandt et al. , Neuron 1998 20 245-253) e neurturina ("NTN"; documento WO 97/08196) . Os ligandos da subfamilia de GDNF têm em comum a sua capacidade para induzirem a sinalização através do receptor tirosina cinase RET. Estes três ligandos da subfamilia de GDNF diferem nas suas afinidades relativas para uma família de receptores neurotróficos, os receptores de GFR-a.
Devido aos efeitos dos factores neurotróficos em tecido neuronal, permanece uma necessidade para identificar e caracterizar factores neurotróficos adicionais, para o diagnóstico e tratamento de distúrbios do sistema nervoso.
Os membros acima da família do ligando de GDNF e seus receptores e funções correspondentes são adicionalmente revistos por Unsicker (Unsicker et al. , Cell & Tissue Research, 1996 286(2) 175-178). Também é feita referência a registos de base de dados relacionadas com a invenção actual, nomeadamente uma sequência nucleotídica, de 10 de Março de 1998, de uma EST de uma biblioteca de ADNc de tecido tumoral de glândula paratiróide (Registo EMBL N° AA844072) e ao clone BAC de Homo sapiens RP11-486122, de 15 de Junho de 1998 (Acesso EMBL N° AC005038, listando 5 contíguos de ordem desconhecida).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a um novo factor neurotrófico, aqui denominado "neublastina" ou "NBN". A neublastina é classificada dentro da subfamilia de GDNF, porque partilha regiões de homologia com outros ligandos de GDNF (ver as Tabelas 3 e 4, 3 infra) e devido à sua capacidade para interagir com RET (ver, e. g. , Airaksinen et al. , Mol. Cell. Neuroscience, 1999 13 313-325), a neublastina é um factor neurotrófico novo e único. Ao contrário de outros ligandos de GDNF, a neublastina exibe elevada afinidade para o complexo GFRa3-receptor RET e sub-regiões únicas na sua sequência de aminoácidos.
Em particular, a invenção refere-se a um polinucleótido de Neublastina isolado, codificando um polipéptido que possui actividade neurotrófica, em que o polinucleótido é seleccionado do grupo consistindo em: a) um polinucleótido compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID N°: 1, b) um polinucleótido codificando um polipéptido de Neublastina ou um polipéptido dai derivado, em que a parte madura do referido polipéptido exibe um grau de identidade de, pelo menos, 90% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N°: 2; c) um polinucleótido que se híbrida especificamente, sob condições de solução de hibridação de elevada estringência, ao ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica complementar de SEQ ID N°: 1 d) um polinucleótido compreendendo uma sequência nucleotídica que é, pelo menos, 70% idêntica à sequência polinucleótidica apresentada como SEQ ID N°: 1.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um vector de expressão compreendendo esse polinucleótido. A invenção também proporciona uma célula hospedeira isolada, compreendendo esse vector de expressão. A invenção proporciona, adicionalmente, uma sequência de ácidos nucleicos de iniciador 4 de PCR, consistindo em qualquer uma das sequências expostas em SEQ ID N° : 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 ou 28. Também é proporcionado pela invenção um gene sintético codificando um polipéptido de Neublastina, o gene sintético compreendendo uma sequência exposta em SEQ ID N°: 29 ou 30.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um polipéptido que possui actividade neurotrófica e é codificado por um polinucleótido da invenção. A invenção refere-se, adicionalmente, a um polipéptido em que a parte madura do referido polipéptido exibe um grau de identidade de, pelo menos, 90% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N° : 2, em que o referido polipéptido possui actividade neurotrófica. Adicionalmente, a invenção proporciona um método de preparação de tal polipéptido da invenção, assim como um método de produção de qualquer um dos polipéptidos expostos em SEQ ID N°: 2, 4, 5, 6 ou 7, compreendendo o cultivo de uma célula que contém qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos expostas em SEQ ID N°: 1 ou 3, sob condições permitindo a produção do polipéptido e a recuperação do polipéptido do meio de cultura.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um método para a produção de um polipéptido de Neublastina da invenção, o método compreendendo: (a) a introdução de um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 que codifica em expressão para um polipéptido de Neublastina dentro de uma célula ou a introdução de uma sequência reguladora por recombinação homóloga dentro de uma célula, de modo a que a sequência reguladora regule a expressão de um gene endógeno 5 de Neublastina, para preparar uma célula de produção de Neublastina; (b) o cultivo da célula de produção de Neublastina, sob condições de cultura que resultam na expressão de um polipéptido de Neublastina.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um péptido de Neublastina consistindo em qualquer das sequências seguintes: GPGSRARAAGARGC (AA 30-43 de SEQ ID N°: 9); LGHRSDELVRFRFC (AA 57-70 de SEQ ID N°: 9); CRRARSPHDLSL (AA 74-85 de SEQ ID N°: 9); LRPPPGSRPVSQPC (AA 94-107 de SEQ ID N°: 9); STWRTVDRLSATAC (AA 123-136 de SEQ ID N°: 9); CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA 43-70 de SEQ ID N°: 9); CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA 74-107 de SEQ ID N°: 9); CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA 108-136 de SEQ ID N°: 9); CRPTRYEAVSFMDVNST (AA 108-124 de SEQ ID N°: 9) ou ALRPPPGSRPVSQPC (AA 93-107 de SEQ ID N°: 9).
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo que se liga especificamente a qualquer desses péptidos de Neublastina.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma composição compreendendo um polipéptido da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um polipéptido da invenção para utilização como um medicamento, em particular a utilização de um polipéptido da invenção no tratamento de uma doença 6 neurodegenerativa. Também é proporcionado um polipéptido da invenção, para a preparação de uma composição farmacêutica, para o tratamento de uma doença neurodegenerativa.
Um "polipéptido de neublastina", como aqui utilizado, é um polipéptido que possui actividade neurotrófica (e. g., como descrita nos Exemplos 6, 7, 8 e 9) e inclui os polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 70% de homologia com os polipéptidos de "neublastina" humana expostos em AA95-AA105 de SEQ ID N° : 2, AA1-AA105 de SEQ ID N° : 2, AA97-AA140 de SEQ ID N° : 4, AA41-AA140 de SEQ ID N°: 4 ("pro"), AAi-AAi40 de SEQ ID N° : 4, AA8o-AAi40 de SEQ ID N°: 9 (prepro "de tipo selvagem"), AA41-AA140 de SEQ ID N°: 9 (pro), AA1-AA140 de
SEQ ID N°: 5 (140AA maduro), AAi-AAne de SEQ ID N° : 6 (116AA maduro), AA1-AA113 de SEQ ID N°: 7 (113AA maduro), AA1-AA140 de
SEQ ID N° : 10 (140AA maduro), AAi-AAne de SEQ ID N° : 11 (116AA maduro), AA1-AA113 de SEQ ID N° : 12 (113AA maduro) e seus variantes e derivados. Adicionalmente, esta invenção contempla os polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 70% de homologia com os polipéptidos de "neublastina" murinos expostos em AA1-AA224 de SEQ ID N° : 16.
De um modo preferido, a sequência C-terminal dos polipéptidos de neublastina identificados acima tem uma sequência de aminoácidos como exposta em AA72-AA105 de SEQ ID N° : 2 (i. e., AA107-AA140 de SEQ ID N° : 9), de um modo mais preferido AA41-AA105 de SEQ ID N° : 2 (i. e., AA76-AAi4o de SEQ ID N°: 9) ou a sequência de aminoácidos exposta em AA191-AA224 de SEQ ID N°: 16. 7
Também é preferido que o polipéptido de neublastina retenha os 7 resíduos de Cys conservados que são caracterí st icos da família de GDNF e da superfamília de TGF-beta.
De um modo preferido, o polipéptido de neublastina tem uma homologia de sequência de aminoácidos superior a 85%, de um modo muito preferido homologia superior a 95% com as sequências anteriores (í. e., AA95-AA105 de SEQ ID N° : 2, AA1-AA105 de SEQ ID N° : 2, AA97-AA140 de SEQ ID N° : 4, AA1-AA140 de SEQ ID N° : 4, AA4i-AAi40 de SEQ ID N° : 4, AA80-AAi4o de SEQ ID N° : 9 (prepro "de tipo selvagem"), AA41-AA140 de SEQ ID N°: 9 (pro) , AA1-AA140 de SEQ ID N°: 5 (140AA maduro), AAi-AAu6 de SEQ ID N°: 6 (116AA maduro), ΑΑ1-ΑΑ113 de SEQ ID N°: 7 (113AA maduro), AA1-AA140 de SEQ ID N°: 10 (140AA maduro), AAi-AAne de SEQ ID N°: 11 (116AA maduro), AA1-AA113 de SEQ ID N° : 12 (113AA maduro)) e ΑΑ1-ΆΑ224 de SEQ ID N°: 16 .
Um "ácido nucleico de neublastina", como aqui utilizado, é um polinucleótido que codifica para um polipéptido de neublastina. Consequentemente, um ácido nucleico de neublastina isolado é uma molécula polinucleotídica tendo uma fase de leitura aberta de codões nucleotídicos que, se fossem expostos aos componentes apropriados requeridos para tradução, codificariam, ou codificariam para, um polipéptido de neublastina. Os ácidos nucleicos de neublastina da invenção podem ser ARN ou ADN, e. g. , ADN genómico ou ADN que é complementar a, e/ou transcrito a partir de, um ARNm de neublastina ("ADNc"). Deste modo, um ácido nucleico de neublastina da invenção inclui, adicionalmente, moléculas polinucleotídicas que se hibridam com especificidade, sob condições de hibridação de elevada estringência, a um polinucleótido que codifica para um polipéptido de neublastina.
Esta invenção também se refere a iniciadores de ácidos nucleicos que são úteis na identificação, isolamento e amplificação de polinucleótidos que codificam polipéptidos de neublastina ou seus fragmentos. Em determinadas formas de realização da invenção, alguns destes iniciadores são sondas especificas de neublastina, úteis para hibridação a um ácido nucleico de neublastina, mas não a ácidos nucleicos codificando para os outros membros da família de GDNF. Por "especifico", "especificidade" ou "especificamente", entende-se uma capacidade para hibridar com ácido nucleico de neublastina e incapacidade para hibridar com ácidos nucleicos de não neublastina, incluindo uma incapacidade para hibridar a ácidos nucleicos que codificam unicamente para os ligandos de GDNF (e. g. , GDNF, persefina e neurturina).
Noutra forma de realização, um ácido nucleico de neublastina da invenção é aquele que é identificado como sendo complementar a um polinucleótido que codifica para um polipéptido de neublastina, por ter uma sequência de ácidos nucleicos complementar ou demonstrar que se híbrida com especificidade, a condições de hibridação de elevada estringência, a um polinucleótido que codifica para neublastina. Ácidos nucleicos de neublastina particulares incluem, sem limitaçao, as sequências de ácidos nucleicos aqui mostradas e designadas SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N° : 14 , SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 30, assim como os iniciadores SEQ ID N°: 17-28, 31 e 32. Um ácido nucleico de neublastina da invenção inclui, adicionalmente, uma sub-região única, ou fragmento, de um ácido nucleico de neublastina incluindo, sem limitação, os fragmentos de ácidos nucleicos mostrados na FIG. 8. 9
Os ácidos nucleicos de neublastina da invenção podem ser utilizados para expressar um polipéptido de neublastina, e. g., através da expressão de um polipéptido de neublastina in vitro ou através da administração de um ácido nucleico de neublastina a um animal para expressão in vivo. Os ácidos nucleicos de neublastina podem estar incluídos dentro de um vector de ácido nucleico, e. g., um vector de expressão ou um vector de clonagem. Um ácido nucleico de neublastina pode, mas não necessita, de ser mantido, reproduzido, transferido ou expresso como parte de um vector de ácido nucleico. Um vector de expressão recombinante, contendo uma sequência polinucleotídica de neublastina, pode ser introduzido e/ou mantido dentro de uma célula. As células albergando um vector de neublastina podem ser procarióticas. Alternativamente, um ácido nucleico de neublastina pode ser introduzido dentro de uma célula eucariótica, e. g., uma célula eucariótica que contém a maquinaria apropriada para o processamento pós-traducional de um polipéptido numa proteína madura e/ou a maquinaria apropriada para segregar um polipéptido para dentro do ambiente extracelular da célula. A invenção caracteriza, adicionalmente, um factor neurotrófico de neublastina, "neublastina". A neublastina pode ser na forma de um polipéptido ou pode ser um multímero de dois ou mais polipéptidos de neublastina, e. g., um dímero de neublastina. Os polipéptidos de neublastina estão associados como multímeros, por associações estruturais intermoleculares, conhecidas dos especialistas na técnica incluindo, sem limitação, interacção cisteína-cisteína, ligações de sulfidrilo e interacções não covalentes. Polipéptidos de neublastina particulares incluem, sem limitação, uma sequência de aminoácidos aqui divulgada e designada SEQ ID N° : 2; 10 SEQ ID N° : 4; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 6; SEQ ID N°: 7; SEQ ID N° : 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11, SEQ ID N°: 12 e SEQ ID N° : 16 .
Um polipéptido de neublastina da invenção é útil para o tratamento de um defeito num neurónio incluindo, sem limitação, neurónios lesionados e neurónios traumatizados. Os nervos periféricos que sofrem trauma incluem mas não estão limitados a nervos da medula ou da medula espinal. Os polipéptidos de neublastina são úteis no tratamento de doença neurodegenerativa, e. g., dano neuronal isquémico cerebral; neuropatia, e. g. , neuropatia periférica, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS) . Os polipéptidos de neublastina estão adicionalmente contemplados para utilização no tratamento da deficiência de memória, e. g., deficiência de memória associada a demência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma imagem fotográfica de duas transferências de northern, sondadas com ADNc de neublastina marcado com 32P, comparando níveis relativos de expressão do gene de neublastina em diversos tipos de tecido adulto humano (painel A) e em diversas regiões do cérebro humano adulto (painel B). A FIG. 2 é uma imagem fotográfica de uma transferência de northern, sondada com ADNc de neublastina marcado com 32P, comparando a quantidade de ADNc de neublastina expresso numa linha celular não transf ectada, HiB5, com a quantidade de ADNc de neublastina expresso numa linha celular transfectada com ADNc 11 de neublastina e com uma linha celular transfectada com ADNc de GDNF. A FIG. 3 é uma imagem fotográfica de duas transferências de western, que compara os graus a que a proteína de neublastina é expressa em células HiB5 não transfectadas (pista 1), relativamente a uma linha celular HiB5 transfectada de modo estável com ADNc de neublastina (corredor 2), foi sondada com o anticorpo específico de neublastina Ab-2 (transferência da esquerda; Painel A) ou o anticorpo específico de neublastina Ab-1 (transferência da direita; Painel B). A FIG. 4 é uma ilustração gráfica do efeito de neublastina na sobrevivência de neurónios embrionários de rato cultivados, dopaminérgicos, mesencefálicos ventrais e actividade de ChAT em neurónios motores de nervo craniano colinérgico, em meio isento de soro. Em particular, a FIG. 4A é uma ilustração da curva de dose-resposta para GDNF recombinante na actividade de ChAT (dpm/hora) . A FIG. 4B é uma ilustração da actividade de ChAT (dpm/hora), utilizando meio condicionado diluído de células produzindo neublastina ou produzindo GDNF. A FIG. 4C é uma ilustração do número de células imunorreactivas para tirosina hidroxilase por poço. A FIG. 5 é uma ilustração do efeito de neublastina segregada de células HiB5pUbilzNBN22, na função e sobrevivência de culturas em fatias de neurónios mesencefálicos ventrais dopaminérgicos embrionários de porco, co-cultivados com células HiB5pUbilzNBN22 (neublastina) ou células HiB5 (controlo). As FIG. 5A e FIG. 5B ilustram a dopamina libertada para o meio, a DIV12 [Dopamina (pmol/mL)-dia 12] e DIV21 [Dopamina (pmol/mL)-dia 21], respectivamente. A FIG. 5C é uma ilustração 12 do número de células imunorreactivas para tirosina hidroxilase por cultura [células TH-ir por cultura], a DIV21. A FIG. 6 é uma ilustração do efeito in vivo de neublastina produzida por lentivirus em neurónios de dopamina nigral. A FIG. 7 é um diagrama esquemático da estrutura genómica do gene de neublastina, incluindo os iniciadores de ácidos nucleicos que podem ser utilizados para identificar o gene de neublastina de comprimento completo e a sua orientação espacial em relação à sequência genómica codificando Neublastina (i. e., gene) . A FIG. 8 é uma ilustração de iniciadores específicos de neublastina, utilizados para identificar o clone de ADNc codificando o polipéptido de neublastina humana, que se híbrida a ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de neublastina, mas não se hibridam a ácidos nucleicos codificando os outros membros conhecidos da família de GDNF (i. e., GDNF, Persefina e neurturina). A FIG. 9 ilustra a actividade neurotrófica em culturas de células de gânglios das raízes dorsais de rato dissociadas, de diferentes estádios de desenvolvimento, de um polipéptido divulgado na presente invenção, em comparação com os obtidos com factores neurotróficos conhecidos [0 experiência de controlo (na ausência de factores); 1 na presença de GDNF; 2 na presença de Neurturina; 3 na presença de Neublastina da invenção; E12 dia embrionário 12; E16 dia embrionário 16; PO o dia de nascimento; P7 dia 7 após nascimento; e P15 dia 15 após nascimento]. 13 A FIG. 10 ilustra a produção de neublastina a partir de linhas celulares CHO. A FIG. 11 ilustra uma comparação de ligação de neublastina e GDNF aos receptores GFRoí-1 e GFRoí-3 . A FIG. 12 é uma imagem fotográfica de uma transferência de western, que ilustra a ligação de anticorpo anti-péptido R30 e anticorpo anti-péptido R31 a neublastina. A FIG. 13 é uma fotografia de um gel, mostrando a extracção de neublastina por ligação de afinidade em RETL3-Ig. A FIG. 14 é um mapa plasmidico de pET19b-Neublastina, juntamente com a sequência do gene sintético para Neublastina. A FIG. 15 é um mapa plasmidico de pMJB164-HisNeublastina, juntamente com a sequência do gene sintético para
HisNeublastina.
DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A requerente identificou um ácido nucleico que codifica um novo factor neurotrófico, que é aqui referido como "neublastina" ou "NBN". A neublastina é um membro da subclasse do factor neurotrófico derivado da linha celular glial (GDNF) da superfamilia do factor de crescimento transformante β (TGF-β) de factores neurotróficos.
O ADNc codificando a neublastina foi originalmente identificado como se segue. Utilizando o algoritmo TBLASTN 14 1.4.11 (Atschul et al., Nucl. Acids Res. 1997 25 3389-3402) e persefina humana como pesquisa (Acesso GenBank N° AF040962), um fragmento de 290 pb foi inicialmente identificado em Sequência Genómica de Alta Capacidade (HGTS) de dois cromossomas bacterianos artificiais humanos (BAC), com os registos do GenBank AC005038 e AC005051. O AC005038 consiste em, aproximadamente, 190000 pb de 5 contíguos de sequências não ordenadas e o AC005051 consiste em, aproximadamente, 132000 pb de 12 contíguos de sequências não ordenadas. O fragmento de 290 pb, identificado nos dois clones de BAC, provou ter regiões que eram homólogas mas não idênticas a uma região codificante do ADNc do factor neurotrófico, persefina humana.
Desta sequência de 290 pb, foram sintetizados dois iniciadores de PCR específicos de Neublastina (Iniciador da Cadeia de Topo [SEQ ID N° : 17] e Iniciador da Cadeia de Fundo [SEQ ID N°: 18]). Foi realizado o rastreio da biblioteca de ADNc de cérebro fetal humano. 0 rastreio inicial compreendeu um rastreio baseado em PCR de 96 poços, com os dois iniciadores de PCR [SEQ ID N°: 17 e 18] de uma "Placa Principal" de biblioteca de ADNc de 500000 clones de ADNc contendo, aproximadamente, 5000 clones/poço. Um segundo rastreio baseado em PCR foi realizado numa "Subplaca" de biblioteca de ADNc de cérebro fetal humano, contendo stock de glicerol de E. coli com, aproximadamente, 5000 clones/poço.
Um fragmento de 102 pb [SEQ ID N°: 13] foi identificado nos rastreios baseados em PCR da Placa Principal e Subplaca. Um clone de ADNc positivo (possuindo o fragmento de 102 pb) foi seleccionado, plaqueado em duas placas contendo LB/antibiótico e cultivado, de um dia para o outro. Destas placas, foram seleccionadas um total de 96 colónias bacterianas e 15 individualmente colocadas nos poços de uma nova placa de PCR de 96 poços, contendo iniciadores de PCR [SEQ ID N°: 17 e 18] e os reagentes de amplificação de PCR requeridos. A amplificação por PCR foi, depois, realizada e as 96 reacções de PCR individuais foram analisadas por electrof orese em gel de agarose a 2%. A colónia positiva, com o clone contendo o fragmento de 102 pb foi, depois, identificada. O ADN plasmidico foi obtido da colónia positiva contendo o fragmento de 102 pb e sequenciado. A análise de sequenciação subsequente revelou a presença de um ADNc de comprimento completo de 861 pb [SEQ ID N°: 8]. A Fase de Leitura Aberta (ORF) de 663 pb ou região codificante (CDS), identificada em SEQ ID N°: 8, codifica o pre-pro-polipéptido (designado "pre-pro-Neublastina") e é mostrada em SEQ ID N°: 9. Com base em SEQ ID N° : 9, foram identificados três variantes de polipéptidos de Neublastina. Estes variantes incluem: (i) o polipéptido de 140 AA, aqui designado como NBN140, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 10; (ii) o polipéptido de 116 AA, aqui designado como NBN116, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 11 e fiiij o polipéptido de 113 AA, aqui designado como NBN113, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 12 . A sequência de ADNc integral contendo ADN não traduzido 5' de 782 pb, ADN codificando 663 pb e não traduzido 3' de 447 (totalizando 1992 pb) foi submetida ao GenBank, sob o Número de Acesso AF 120274. 16 A sequência codificando Neublastina genómica foi identificada como se segue:
Com o objectivo de clonar a sequência codificando neublastina genómica, foi preparado um conjunto adicional de iniciadores. Em particular, o Par Iniciador N° 1 compreendeu [sentido = SEQ ID N°: 23 e anti-sentido = SEQ ID N°: 24] e o Par Iniciador N° 2 compreendeu [sentido = SEQ ID N°: 25 e anti-sentido = SEQ ID N°: 26].
Utilizando o Par Iniciador N° 2, um fragmento de ADN de 887 pb foi amplificado por PCR a partir de uma preparação de ADN genómico humano e clonado dentro do vector pCRII (Invitrogen) e transformado dentro de E. coli. 0 plasmídeo resultante foi sequenciado e foi prevista uma sequência putativa de ADNc de 861 pb (codificando uma proteina aqui denominada neublastina) (como exposto em SEQ ID N°: 3). De modo semelhante, utilizando o Par Iniciador N° 1, um fragmento de ADN de 870 pb foi obtido por PCR de ADN genómico humano. Neste fragmento, verificou-se uma região adicional de 42 pb na extremidade 3' da Fase de Leitura Aberta (ORF) , em comparação com a sequência de 887 pb. A estrutura genómica do gene de neublastina foi prevista através da sua comparação com as sequências de ácidos nucleicos de outros factores neurotróficos, através do mapeamento de fronteiras exão-intrão. Esta análise demonstrou que o gene de neublastina tem, pelo menos, dois exões separados por um intrão de 70 pb.
Esta sequência também foi utilizada para rastrear o GenBank para as sequências de EST de neublastina. Três foram identificadas com os registos do GenBank AA844072, AA931637 e 17 ΑΑ533512, indicando que os ácidos nucleicos de neublastina são transcritos em ARNm. A comparação da sequência de ADNc integral obtida (AF 120274) e a sequência genómica presente nos registos do GenBank AC005038 e AC005051 revelou que o gene de neublastina consiste em, pelo menos, cinco exões (incluindo três codificantes) separados por quatro intrões (ver, e. g., a Fig. 8). Em conjunto, os exões têm uma sequência de aminoácidos prevista de um polipéptido de Neublastina de comprimento completo. Também deve ser notado que se verificou que o fragmento de 887 pb contém a região codificante completa de pro-neublast ina. O ADNc previsto [SEQ ID N° : 3] contém uma Fase de Leitura Aberta (ORF) codificando pro-neublastina (181 residuos de aminoácidos) que mostrou homologia com as três proteínas humanas conhecidas - Persefina, Neurturina e GDNF. Ácidos Nucleicos de Neublastina da Invenção
Noutro aspecto, a invenção proporciona polinucleótidos capazes de expressarem os polipéptidos da invenção. Os polinucleótidos da invenção incluem sequências de ADN, ADNc e ARN, assim como sequências anti-sentido e incluem polinucleótidos de ocorrência natural, sintéticos e intencionalmente manipulados. Os polinucleótidos da invenção também incluem sequências que são degeneradas, como resultado do código genético, mas que codificam em expressão para um polipéptido de neublastina.
Como aqui se define, o termo "polinucleótido" refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos de, pelo menos, 10 bases em 18 comprimento, de um modo preferido, pelo menos, 15 bases em comprimento. Por "polinucleótido isolado" entende-se um polinucleótido que não é imediatamente contíguo com ambas as sequências codificantes com as quais é imediatamente contíguo (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma de ocorrência natural do organismo de onde deriva. 0 termo, por conseguinte, inclui ADN recombinante que é incorporado dentro de um vector de expressão, dentro de um plasmídeo ou vírus de replicação autónoma ou dentro do ADN genómico de um procariota ou eucariota ou que existe como uma molécula separada, e. g. um ADNc, independente de outras sequências.
Os polinucleótidos da invenção também incluem variantes alélicos e "polinucleótidos mutados", tendo uma sequência nucleotidica que difere das sequências nucleotídicas aqui apresentadas em uma ou mais posições nucleotídicas.
Numa forma de realização preferida, o polinucleótido da invenção tem uma sequência de ácido nucleico (ADN) capaz de se hibridar com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 1, a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 3, a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 8 ou a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 15, sua cadeia complementar ou uma subsequência desta, sob condiçoes de estringência, pelo menos, média, média/elevada ou elevada, como descrito em maior detalhe abaixo.
Noutra forma de realização preferida, o polinucleótido isolado da invenção tem uma sequência de ácido nucleico (ADN) que é, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90%, de um modo muito preferido, pelo menos, 95% homóloga à sequência polinucleotídica 19 apresentada como SEQ ID N°: 1, à sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N°: 3, à sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N° : 8 ou à sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N°: 15.
Na sua forma de realização mais preferida, o polinucleótido tem a sequência de ADN apresentada como SEQ ID N°: 1, a sequência de ADN apresentada como SEQ ID N°: 3, a sequência de ADN apresentada como SEQ ID N°: 8 ou a sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N° : 15.
Esta invenção também proporciona novos iniciadores e sequências de ADN para a identificação, isolamento e amplificação de polinucleótidos de neublastina que codificam em expressão para polipéptidos de neublastina ou seus fragmentos. Tais iniciadores incluem os polinucleótidos expostos em SEQ ID N°: 17-28 e 31-32. Adicionalmente, esta invenção proporciona sequências de ADN de neublastina, geradas a partir desses iniciadores, incluindo os expostos em SEQ ID N°: 13 e 14. Adicionalmente, esta invenção proporciona sequências de ADN de regiões não traduzidas 3' ou 5' ("UTR") em ADN genómico que flanqueiam exões de neublastina; tais sequências são úteis na identificação, isolamento e amplificação de polinucleótidos de neublastina que codificam em expressão para polipéptidos de neublastina ou seus fragmentos.
As sequências UTR 3’ desta invenção incluem as sequências expostas em: nucleótidos 721-865 de SEQ ID N° : 1 nucleótidos 718-861 de SEQ ID N° : 3 nucleótidos 718-861 de SEQ ID N° : 8 20 nucleótidos 1647-2136 de SEQ ID N°: 15 e sequências contíguas compreendidas entre 10 - 25 nucleótidos derivadas das (i. e., abrangidas) sequências anteriores (que são úteis, e. g., como iniciadores).
As sequências UTR 5' desta invenção incluem as sequências expostas em: nucleótidos 1-10 de SEQ ID N°: 1, nucleótidos 1-57 de SEQ ID N°: 8, nucleótidos 1-974 de SEQ ID N°: 15 e sequências contíguas compreendidas entre 10 - 25 nucleótidos derivadas das (i. e., abrangidas) sequências anteriores (que são úteis, e. g., como iniciadores).
Os polinucleótidos da invenção podem, de um modo preferido, ser obtidos através de processos de clonagem, e. g. como descritos em "Current Protocols in Molecular Biology" [John Wiley & Sons, Inc.]. Numa forma de realização preferida, o polinucleótido é clonado ou produzido com base em ADN genómico humano ou uma biblioteca de ADNc do cérebro humano.
Homologia de Sequências de ADN A homologia de sequência de ADN referida acima pode ser determinada como o grau de identidade entre duas sequências indicando uma derivação da primeira sequência da segunda. A homologia pode ser adequadamente determinada por meio de programas informáticos conhecidos na técnica, tal como GAP, proporcionado no pacote de programas GCG [Needleman, S. B. e Wunsch C. D., Journal of Molecular Biology 1970 48 443-453] . 21
Utilizando o GAP com os seguintes parâmetros para comparação de sequência de ADN: Penalidade de criação de GAP de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3, a região codificante das sequências de ADN análogas referidas acima exibem um grau de identidade, de um modo preferido de, pelo menos, 70%, de um modo mais preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, com a parte de CDS (codificante) da sequência de ADN mostrada em SEQ ID N°: 1 ou a parte de CDS (codificante) da sequência de ADN mostrada em SEQ ID N° : 3 ou a parte de CDS (codificante) da sequência de ADN mostrada em SEQ ID N°: 8, a parte de CDS (codificante) da sequência de ADN mostrada em SEQ ID N°: 15. O termo "identidade de sequência" refere-se ao grau com que duas sequências polinucleotídicas são idênticas, numa base de nucleótido-por-nucleótido, ao longo de uma região particular de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado através da comparação de duas sequências alinhadas de modo óptimo, ao longo dessa região de comparação, determinação do número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica (e. g. , A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências, para produzir o número de posições correspondentes, divisão do número de posições correspondentes pelo número total de posições na região de comparação (i. e., o tamanho de janela) e multiplicação do resultado por 100, para produzir a percentagem de identidade de sequência. O termo "identidade substancial", como aqui utilizado, denota uma característica de uma sequência polinucleotídica, em que o polinucleótido compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80 por cento de identidade de sequência, de um modo preferido, pelo menos, 85 por cento de identidade e, frequentemente, 90 a 95 por cento de identidade de sequência, de um modo mais habitual, pelo menos, 99 por cento de 22 identidade de sequência, em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma região de comparação.
Protocolo de Hibridação
Os polinucleótidos da invenção são tais que têm uma sequência de ácido nucleico capaz de se hibridar com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 1, a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 3 ou a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 8 ou a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 15 ou sua cadeia complementar ou uma subsequência desta, sob condições de estringência, pelo menos, média, média/elevada ou elevada, como descrito em maior detalhe abaixo.
As condições experimentais adequadas para determinação da hibridação entre uma sonda nucleotidica e uma sequência de ADN ou ARN homóloga, envolvem pré-impregnação do filtro contendo os fragmentos de ADN ou ARN para hibridar em 5 x SSC [cloreto de Sódio/citrato de Sódio; cf. Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NI 1989], durante 10 minutos e pré-hibridação do filtro numa solução de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt [cf. Sambrook et al. ; Op cit.], SDS a 0,5% e 100 pg/mL de ADN de esperma de salmão sonicado desnaturado [cf. Sambrook et al.; Op cit.], seguida de hibridação na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/mL de uma sonda iniciada aleatoriamente [Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], marcada com 32P-dCTP (actividade específica > 1 x 109 cpm/pg), durante 12 horas a, aproximadamente, 45 °C. O filtro é, depois, lavado duas vezes, durante 30 minutos, em 0,1 x SSC, SDS a 0,5%, a uma temperatura 23 de, pelo menos, pelo menos, 60 °C (condições de estringência média), de um modo preferido de, pelo menos, 65 °C (condições de estringência média/elevada) , de um modo mais preferido, pelo menos, 70 °C (condições de estringência elevada) e, de um modo mais preferido de, pelo menos, 75 °C (condições de estringência muito elevada) . As moléculas a que a sonda oligonucleotídica se híbrida sob estas condições podem ser detectadas utilizando um filme de raios X.
Polinucleótidos Clonados O polinucleótido isolado da invenção pode, em particular, ser um polinucleót ido clonado. Como aqui se define, o termo "polinucleótido clonado", refere-se a um polinucleótido ou sequência de ADN clonado de acordo com processos de clonagem padrão actualmente utilizados em engenharia genética para mudar um segmento de ADN que pode ser, em particular, ADNc, i. e., enzimaticamente derivado de ARN, da sua localização natural para um sítio diferente onde irá ser reproduzido. A clonagem pode ser realizada por qualquer via adequada e pode envolver técnicas, tais como tecnologia de transcriptase reversa, tecnologia de PCR e semelhantes, assim como excisão e isolamento do segmento de ADN desejado. O polinucleótido clonado da invenção pode, alternativamente, ser designado "construção de ADN" ou "sequência de ADN isolada" e pode, em particular, ser um ADN complementar (ADNc). 24
Fontes Biológicas 0 polinucleótido isolado da invenção pode ser obtido de qualquer fonte adequada.
Numa forma de realização preferida, onde o polinucleótido da invenção é clonado ou produzido com base numa biblioteca de ADNc, e. g., numa biblioteca de ADNc do cérebro fetal ou adulto, em particular do prosencéfalo, do rombencéfalo, do córtex, do estriado, da amígdala, do cerebelo, do núcleo caudado, do corpo caloso, do hipocampo, do núcleo talâmico, do núcleo subtalâmico, do núcleo olfactivo, do putâmen, da substância nigra, dos gânglios das raízes dorsais, do gânglio trigeminal, da artéria mesentérica superior ou do tálamo; da medula espinal; do coração; da placenta; do pulmão; do fígado; do músculo esquelético; do rim; do fígado; do pâncreas; dos intestinos; do olho; da retina; da polpa dentária; do folículo piloso; da próstata; da pituitária ou da traqueia.
Bibliotecas de ADNc comerciais, de uma variedade de tecidos, humanos e não humanos, estão disponíveis a partir de, e. g.r Stratagene e Clontech. 0 polinucleótido isolado da invenção pode ser obtido por métodos padrão, e. g. , os descritos nos exemplos de trabalho.
Polipéptidos de Neublastina da Invenção
Como notado acima, um "polipéptido de neublastina", como aqui utilizado, é um polipéptido que possui actividade neurotrófica (e. g. , como descrita nos Exemplos 6, 7, 8 e 9) e inclui os polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos que 25 tem, pelo menos, 70% de homologia com os polipéptidos de "neublastina" expostos em AA95-AA105 de SEQ ID N° : 2, ΑΑχ-ΑΑ105 de SEQ ID N° : 2, AA97-AA140 de SEQ ID N° : 4, AA41-AA140 de
SEQ ID N° : 4, AA1-AA140 de SEQ ID N° : 4, AA80-AAi4o de SEQ ID N°: 9 (prepro "de tipo selvagem"), AA4i-AAi40 de SEQ ID N° : 9 (pro) , ΑΑχ-ΑΑχχο de SEQ ID N°: 5 (140AA maduro), ΑΑχ-ΑΑ116 de SEQ ID N°: 6 (116 A A maduro), ΑΑχ-ΑΑχχ3 de SEQ ID N°: 7 (113AA maduro), ΑΑχ-ΑΑ14ο de SEQ ID N° : 10 (140AA maduro), ΑΑχ-ΑΑ116 de SEQ ID N° : 11 (116AA maduro), ΑΑχ-ΑΑχχ3 de SEQ ID N° : 12 (113AA maduro), AAX-AA224 de SEQ ID N° : 16 (prepro murino) e variantes e derivados de cada dos anteriores.
De um modo preferido, a sequência C-terminal dos polipéptidos de neublastina identificados acima tem uma sequência de aminoácidos como exposta em AA72-AAxos de SEQ ID N°: 2 (i. e., ΑΑχο7~ΑΑχ4ο de SEQ ID N° : 9), de um modo mais preferido ΑΑ41-ΑΑχο5 de SEQ ID N° : 2 (i. e., ΑΑ76-ΑΑ14ο de SEQ ID N°: 9).
Também é preferido que o polipéptido de neublastina retenha os 7 residuos de Cys conservados que são caracterí sticos da família de GDNF e da superfamília de TGF-beta.
De um modo preferido, o polipéptido de neublastina tem uma homologia de sequência de aminoácidos superior a 85%, de um modo muito preferido homologia superior a 95%, às sequências anteriores (i. e., ΑΑ95-ΑΑχο5 de SEQ ID N°: 2, ΑΑχ-ΑΑ105 de SEQ ID N° : 2, AA97-AAi40 de SEQ ID N° : 4, ΑΑ4χ-ΑΑχ40 de SEQ ID N° : 4, ΑΑχ-ΑΑ14ο de SEQ ID N° : 4, ΑΑ80-ΑΑχ40 de SEQ ID N°: 9 (prepro "de tipo selvagem"), ΑΑ4χ-ΑΑχ4ο de SEQ ID N°: 9 (pro), ΑΑχ-ΑΑχχο de SEQ ID N°: 5 (140AA maduro), ΑΑχ-ΑΑχχ6 de SEQ ID N°: 6 (116 A A maduro), ΑΑχ-ΑΑ113 de SEQ ID N°: 7 (113AA maduro), ΑΑχ-ΑΑχ4ο 26 de SEQ ID N°: 10 (140AA maduro), AAi-AAu6 de SEQ ID N° : 11 (116AA maduro), AAi-AAh3 de SEQ ID N° : 12 (113AA maduro), AA1-AA224 de SEQ ID N°: 16 (prepro murino) e, de um modo preferido, quaisquer dos polipéptidos anteriores com uma sequência C-terminal dos polipéptidos de neublastina identificados acima tem uma sequência de aminoácidos como exposta em AA72-AA105 de SEQ ID N°: 2 (i. e., AA107-AA140 de SEQ ID N°: 9), de um modo mais preferido, AA41-AA105 de SEQ ID K°: 2 (i. e., AA76-AA140 de SEQ ID N° : 9) ou AAi9i-AA224 de SEQ ID N° : 16.
Adicionalmente, esta invenção contempla os polipéptidos que têm uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 70% de homologia com os polipéptidos de "neublastina" murinos expostos em AA1-AA224 de SEQ ID N° : 16.
Entre os polipéptidos preferidos da invenção, numa forma de realização, representam a sequência prepro (como exposta em SEQ ID N° : 2, 4, 9 e 16, respectivamente) , a sequência pro (como exposta em AA75-AA105 de SEQ ID N°: 2 ou AA41-AA140 de SEQ ID N° : 4 e 9, respectivamente) e a sequência madura de neublastina (como exposta em SEQ ID N° : 5, 6, 7, 10, 11 ou 12, de um modo preferido, SEQ ID N°: 10, 11, 12) .
Os polipéptidos da invenção incluem polipéptidos variantes. No contexto desta invenção, o termo "polipéptido variante" significa um polipéptido (ou proteína) tendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência apresentada como SEQ ID N° : 2, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N° : 7, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11, SEQ ID N° : 12 ou SEQ ID N° : 16, numa ou mais posições de aminoácido. Tais polipéptidos variantes incluem os polipéptidos modificados descritos acima, assim como substituições 27 conservadoras, variantes de excisao, isoformas, homólogos de outras espécies e polimorfismos.
Como aqui se define, o termo "substituição conservadora" denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante. Por exemplo, poder-se-á esperar que substituições conservadoras de aminoácidos tenham pouco ou nenhum efeito na actividade biológica, particularmente se representarem menos de 10% do número total de resíduos no polipéptido ou proteína. De um modo preferido, substituições de aminoácidos conservadoras representam alterações em menos de 5% do polipéptido ou proteína, de um modo muito preferido menos de 2% do polipéptido ou proteína (e. g., quando calculadas de acordo com NBN113, substituições conservadoras muito preferidas representariam menos de 3 substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos madura de tipo selvagem). Numa forma de realização particularmente preferida, há uma única substituição de aminoácido na sequência madura, em que o aminoácido substituído e de substituição são não cíclicos.
Outros exemplos de substituições particularmente conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ou glutamina por asparagina e semelhantes. O termo substituição conservadora também inclui a utilização de um resíduo de aminoácido substituído, em vez de um resíduo de aminoácido progenitor não substituído, desde que os anticorpos deduzidos para o polipéptido substituído também imunorreajam com o polipéptido não substituído. 28
As modificações desta sequência de aminoácidos primária podem resultar em proteínas que têm actividade substancialmente equivalente, em comparação com o polipéptido equivalente não modificado e, deste modo, podem ser consideradas análogos funcionais das proteínas progenitoras. Tais modificações podem ser deliberadas, e. g. , como por mutagénese dirigida ou podem ocorrer de modo espontâneo e incluir variantes de excisão, isoformas, homólogos de outras espécies e polimorfismos. Tais análogos funcionais também estão contemplados de acordo com a invenção.
Além disso, as modificações da sequência de aminoácidos primária podem resultar em proteínas que não retêm a actividade biológica da proteína progenitora, incluindo formas negativas dominantes, etc. Uma proteína negativa dominante pode interferir com a proteína de tipo selvagem, através da ligação ou, de outro modo, sequestrar agentes de regulação, tais como componentes a montante ou jusante, que normalmente interagem funcionalmente com o polipéptido. Tais formas negativas dominantes também estão contempladas de acordo com a invenção.
Um "péptido sinal" é uma sequência peptídica que dirige um polipéptido sintetizado de novo, ao qual o péptido sinal é conjugado ao retículo endoplasmático (ER) para processamento e distribuição pós-traducional adicional.
Um "péptido sinal heterólogo", como aqui utilizado no contexto de neublastina, significa um péptido sinal que não é o péptido sinal de neublastina humana, tipicamente o péptido sinal de alguma proteína de mamífero que não neublastina. 29
Os especialistas na técnica reconhecerão que a sequência de ADN de neublastina humana (ADNc ou ADN genómico) ou sequências que diferem do ADN de neublastina humana, devido a alterações de codão silenciosas ou a alterações de codão que produzem substituições conservadoras de aminoácidos, podem ser utilizadas para geneticamente modificar células humanas cultivadas, de modo a que superexpressem e segreguem a enzima.
Os polipéptidos da presente invenção também incluem polipéptidos quiméricos ou polipéptidos de fusão cliváveis, nos quais outro polipéptido é fundido na extremidade N ou na extremidade C do polipéptido ou seu fragmento. Um polipéptido quimérico pode ser produzido através da fusão de uma sequência de ácidos nucleicos (ou uma sua porção) codificando outro polipéptido a uma sequência de ácidos nucleicos (ou uma sua porção) da presente invenção.
As técnicas para a produção de polipéptidos quiméricos são técnicas padrão. Tais técnicas habitualmente requerem a junção das sequências numa forma de modo a que fiquem ambas na mesma fase de leitura e a expressão do polipéptido fundido sob o controlo do mesmo promotor(es) e terminador.
Os polipéptidos da presente invenção também incluem formas truncadas da molécula de neublastina de comprimento completo. Em tais moléculas truncadas, um ou mais aminoácidos foram delecionados da extremidade N ou da extremidade C, de um modo preferido da extremidade N. 30
Homologia de Sequência de Aminoácidos O grau com que um polipéptido candidato partilha homologia com um polipéptido de neublastina da invenção é determinado como o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos. Um nível elevado de identidade de sequência indica uma probabilidade de que a primeira sequência é derivada da segunda. A homologia é determinada por análise informática, tal como, sem limitações, o programa de alinhamento informático ClustalX [Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG: A interface de janela ClustalX: estratégias flexíveis para alinhamento de sequências múltiplas auxiliado por ferramentas de análise de qualidade; Nucleic Acids Res. 1997, 25 (24): 4876-82] e os parâmetros predefinidos aqui sugeridos. Utilizando este programa, a parte madura de um polipéptido codificado por uma sequência de ADN análoga da invenção exibe um grau de identidade de, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido de, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido de, pelo menos, 98% com a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 6; SEQ ID N°: 7; SEQ ID N°: 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 12 ou SEQ ID N°: 16.
Com base na determinação de homologia, confirma-se que o polipéptido da invenção, pertencendo à superfamilia de TGF-β, está relacionado com a subfamília de GDNF mas representa um membro distinto desta subfamília. 31
Polipéptidos Bioactivos 0 polipéptido da invenção pode ser proporcionado em qualquer forma bioactiva, incluindo a forma de pré-pro-proteinas, pro-proteinas, proteínas maduras, proteínas glicosiladas, proteínas fosforiladas ou qualquer outra proteína modificada pós-traducionalmente. 0 polipéptido da invenção pode, em particular, ser um polipéptido N-glicosilado, cujo polipéptido está, de um modo preferido, glicosilado nos resíduos N, indicados nas listagens de sequências.
Numa forma de realização preferida, o polipéptido da invenção tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N° : 9, contendo um resíduo de asparagina glicosilado na posição 122; a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N° : 10, contendo um resíduo de asparagina glicosilado na posição 122; a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N° : 11, contendo um resíduo de asparagina glicosilado na posição 98; ou a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N°: 12, contendo um resíduo de asparagina glicosilado na posição 95.
Esta invenção também contempla proteínas de fusão de neublastina, tal como fusões de Ig, como descrito, e. g., na patente dos Estados Unidos 5,434,131.
Numa forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N° : 2 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, cerca de 85%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 90%, de 32 um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 98% e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 99% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 2.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 98%, de um modo muito preferido, pelo menos, 99% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 4.
Numa terceira forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 5 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 5.
Numa quarta forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 6 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 6.
Numa quinta forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 7 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 7. 33 0 polipéptido de neublastina da invenção inclui variantes alélicos, e. g. , as sequências de aminoácidos de polipéptidos de SEQ ID N° : 5-7, nas quais Xaa designa Asn ou Thr e Yaa designa Ala ou Pro.
Numa sexta forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 9 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 9.
Numa sétima forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 10 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 10.
Numa oitava forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 11 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 11 .
Numa nona forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 12 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, como pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada SEQ ID N°: 12. 34
Numa décima forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 16 ou uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 90%, de um modo mais preferido, pelo menos, 95%, de um modo muito preferido, pelo menos, 98% homóloga à sequência apresentada como SEQ ID N°: 16 que é uma pre-pro-neublastina de origem murina.
Noutra forma de realização, o polipéptido da invenção contém a impressão digital da subfamilia de GDNF, i. e., os resíduos de aminoácidos sublinhados na Tabela 3.
Numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um polipéptido codificado por uma sequência polinucleotídica capaz de se hibridar, sob condições de estringência elevada, com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 1, sua cadeia complementar ou uma sua subsequência. Numa forma de realização preferida, o polipéptido da invenção é codificado por uma sequência polinucleotídica sendo, pelo menos, 70% homóloga à sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 1. Na sua forma de realização mais preferida, o polipéptido da invenção é codificado pela sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 1.
Ainda numa forma de realização adicional, a invenção proporciona novos polipéptidos codificados por uma sequência polinucleotídica capaz de se hibridar, sob condições de estringência elevada, com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 3, sua cadeia complementar ou uma sua subsequência. Numa forma de realização preferida, o polipéptido da invenção é codificado por uma sequência polinucleotídica sendo, pelo menos, 70% homóloga à sequência 35 polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 3. Na sua forma de realização mais preferida, o polipéptido da invenção é codificado pela sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 3.
Ainda numa forma de realização adicional, a invenção proporciona novos polipéptidos codificados por uma sequência polinucleotídica capaz de se hibridar, sob condições de estringência elevada, com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 8, sua cadeia complementar ou uma sua subsequência. Numa forma de realização preferida, o polipéptido da invenção é codificado por uma sequência polinucleotídica sendo, pelo menos, 70% homóloga à sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 8. Na sua forma de realização mais preferida, o polipéptido da invenção é codificado pela sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 8.
Ainda numa forma de realização adicional, a invenção proporciona novos polipéptidos codificados por uma sequência polinucleotídica capaz de se hibridar, sob condições de estringência elevada, com a sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N° : 15, sua cadeia complementar ou uma sua subsequência. Numa forma de realização preferida, o polipéptido da invenção é codificado por uma sequência polinucleotídica sendo, pelo menos, 70% homóloga à sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 15. Na sua forma de realização mais preferida, o polipéptido da invenção é codificado pela sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 15. 36
Origem Biológica 0 polipéptido da invenção pode ser isolado de células de mamífero, de um modo preferido de uma célula humana ou de uma célula de origem murina.
Numa forma de realização muito preferida, o polipéptido da invenção pode ser isolado de tecido de coração humano, de músculo esquelético humano, de pâncreas humano ou de tecido de cérebro humano, em particular de núcleo caudado ou de tálamo ou pode ser obtido de ADN de origem mamífera, como discutido em maior detalhe abaixo.
Actividade Neurotrófica
Os polipéptidos de neublastina da invenção são úteis para moderarem o metabolismo, crescimento, diferenciação ou sobrevivência de um nervo ou célula neuronal. Em particular, os polipéptidos de neublastina são utilizados para tratarem ou para aliviarem um distúrbio ou doença de um animal vivo, e. g., um humano, cujo distúrbio ou doença é responsivo à actividade de um agente neurotrófico. Tais tratamentos e métodos são descritos em maior detalhe abaixo.
Anticorpos
Os polipéptidos de neublastina ou fragmentos polipeptídicos da invenção são utilizados para produzir anticorpos específicos de neublastina. Como aqui utilizado, um "anticorpo específico de 37 neublastina" é um anticorpo, e. g., um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal, que é imunorreactivo para um polipéptido de neublastina ou fragmento polipeptídico ou que se liga com especificidade a um epítopo de um polipéptido de neublastina. A preparação de anticorpos policlonais e monoclonais é bem conhecida na técnica. Os anticorpos policlonais podem, em particular, ser obtidos como descrito por, e. g., Green et al., : "Production of Polyclonal Antisera", em Immunochemical Protocols (Manson, Ed.); Humana Press, 1992, páginas 1-5; por Coligan et al. , : "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, rats, mice and Hamsters" em Current Protocols in Immunology, 1992, Secção 2.4.1 e por Ed Harlow e David Lane (Eds.) em "Antibodies; A laboratory manual" Cold Spring Harbor Lab. Press 1988. Estes protocolos são por este meio incorporados por referência. Os anticorpos monoclonais podem, em particular, ser obtidos como descrito por, e. g. , Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495;
Coligan et al. , em Current Protocols in Immunology, 1992, Secções 2.5.1-2.6.7 e Harlow et al., em Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, página 726.
Resumidamente, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos através da injecção, e. g. , de murganhos com uma composição compreendendo um antigénio, verificação da presença de produção de anticorpo através da remoção de uma amostra de soro, remoção de baço para obter linfócitos B, fusão dos linfócitos B com células de mieloma para produzir hibridomas, clonagem dos hibridomas, selecção de clones positivos que produzem os anticorpos para o antigénio e isolamento dos anticorpos das culturas de hibridoma. 38
Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados de culturas de hibridoma por uma variedade de técnicas bem estabelecidas, incluindo cromatografia de afinidade com proteína sepharose A, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatograf ia de permuta iónica, ver, e. g., Coligan et al. em Current Protocols in Immunology, 1992, Secções 2.7.1-2.7.12 e Secções 2.9.1-2.9.3 e Barnes et al.: "Purification of Imunoglobulin G (IgG)" em Methods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, Vol. 10, Páginas 79-104. Os anticorpos policlonais ou monoclonais podem ser, opcionalmente, adicionalmente purificados, e. g. , através de ligação e eluição de uma matriz a que o polipéptido, para o qual os anticorpos foram deduzidos, está ligado.
Os anticorpos que se ligam ao polipéptido de neublastina da invenção podem ser preparados utilizando um polipéptido intacto ou fragmentos contendo pequenos péptidos de interesse como antigénio imunizante. 0 polipéptido utilizado para imunizar um animal pode ser obtido por técnicas de ADN recombinante ou por síntese química e pode ser, opcionalmente, conjugado a uma proteína transportadora. As proteínas transportadoras geralmente utilizadas que são quimicamente ligadas ao péptido incluem hemocianina do caramujo (KLH), tiroglobulina, albumina de soro bovino (BSA) e toxóide tetânico. O péptido ligado pode ser, depois, utilizado para imunizar o animal que pode ser, em particular, um murganho, um rato, um hamster ou um coelho.
Numa forma de realização, os anticorpos são produzidos utilizando os seguintes péptidos: Péptido 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminoácidos 108-124 de SEQ ID N° : 9) ou Péptido 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 93-107 de SEQ ID N°: 9). Os métodos 39 para a produção de anticorpos utilizando estes polipéptidos sao descritos no Exemplo 10.
Também foram gerados anticorpos policlonais de coelho para os seguintes péptidos: Péptido R2 7: GPGSRARAAGARGC (aminoácidos 30-43 de SEQ ID N° : 9); Péptido R2 8 : LGHRSDELVRFRFC (aminoácidos 57-70 de SEQ ID N° : 9); Péptido R2 9 : CRRARSPHDLSL (aminoácidos 74-85 de SEQ ID N° : 9); Péptido R3 0 : LRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 94-107 de SEQ ID N° /~N : 9) ; Péptido R31: STWRTVDRLSATAC (aminoácidos 123-136 de SEQ ID N° : 9) .
Deste grupo, apenas os péptidos R30 e R31, relativamente próximos da extremidade C, reconheceram a proteína desnaturada sob condições redutoras numa transferência de Western.
Também foram identificados péptidos derivados de neublastina adicionais, derivados da proteína madura, como detalhado abaixo, que são ganchos expostos à superfície previstos, baseados na estrutura de GDNF conhecida (Eigenbrot e Gerber, Nat. Struct. Biol., 1997 4 435-438) e são, deste modo, úteis para a geração de anticorpo:
Região 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA43-70 de SEQ ID N°: 9); 40
Região 2: CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA74-107 de SEQ ID N°: 9) ;
Região 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA108-136 de SEQ ID N°: 9).
Noutro aspecto da invenção, os anticorpos que se ligam especificamente a neublastina ou péptidos derivados de neublastina podem ser utilizados para a detecção da presença de tais factores neurotróficos de neublastina em diversos meios e, em particular, para o diagnóstico de estados ou doenças associados às moléculas de neublastina da invenção. Uma variedade de protocolos para essa detecção, incluindo ELISA, RIA e FACS é conhecida na técnica.
Os anticorpos desta invenção também podem ser utilizados para o bloqueio do efeito do factor neurotrófico e podem, em particular, ser anticorpos neutralizantes. Métodos de Produção dos Polipéptidos da Invenção
Uma célula compreendendo uma sequência de ADN codificando um polipéptido de neublastina da invenção é cultivada sob condições permitindo a produção do polipéptido, seguida de recuperação do polipéptido do meio de cultura, como detalhado abaixo. Quando as células devam ser geneticamente modificadas para efeitos de produção de um polipéptido de neublastina, as células podem ser modificadas por métodos convencionais ou por activação génica.
De acordo com métodos convencionais, uma molécula de ADN que contém um ADNc de neublastina ou sequência de ADN genómico 41 pode estar contida dentro de uma construção de expressão e transfectada em células por métodos padrão, incluindo mas não limitados a transfecção mediada por lipossoma, polibreno ou DEAE dextrano, electroporação, precipitação por fosfato de cálcio, micro-injecção ou microprojectéis dirigidos por velocidade ("biolística"). Alternativamente, pode utilizar-se um sistema que distribua ADN por vector virai. Os virus conhecidos como sendo úteis para transferência génica incluem adenovirus, virus adeno-associado, lentivirus, herpesvírus, virus da papeira, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis e virus "vaccínia", tal como virus da varíola aviária, assim como infecção por Baculovírus de células de insecto, em particular células de insecto SfP9.
Alternativamente, as células podem ser modificadas utilizando uma abordagem de activação génica ("GA"), tal como descrito nas patentes dos Estados Unidos 5,733,761 e 5,750,376, cada aqui incorporada por referência.
Consequentemente, o termo "geneticamente modificado," como aqui utilizado em referência a células, tenciona abranger células que expressam um produto génico particular, após introdução de uma molécula de ADN codificando o produto génico e/ou elementos reguladores que controlam a expressão de uma sequência codificante para o produto génico. A molécula de ADN pode ser introduzida por direccionamento génico, permitindo a incorporação da molécula de ADN num sítio genómico particular. 42
Vectores de Expressão Recombinantes
Num aspecto adicional, a invenção proporciona um vector de expressão recombinante, compreendendo o polinucleótido da invenção. 0 vector de expressão recombinante da invenção pode ser qualquer vector de expressão eucariótico adequado. Os vectores de expressão recombinantes preferidos são o promotor de ubiquitina contendo o vector pTEJ-8 (Johansen TE, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T; FEBS Lett. 1990 267 289-294) e derivados deste, e. g., pUbilZ. Um vector de expressão eucariótico comercialmente disponível preferido é, e. g., o promotor virai contendo o vector pcDNA-3 (disponível a partir da Invitrogen). Outro vector de expressão preferido utiliza os promotores precoces de SV40 e tardio principal de adenovírus (derivados do plasmideo pAD2beta; Norton e Coffin, Mol, Cell. Biol. 1985 5 281) .
Esta invenção também proporciona vectores de expressão procarióticos e genes sintéticos (syngenes), com optimização de codão para expressão procariótica. Os syngenes foram construídos com teor de GC inferior e codões bacterianos preferidos (e. g., E. coli) . 0 syngene está a ser clonado dentro de dois vectores, pET19b e pMJBl64, um derivado de pET19b. A construção com pET19b é mostrada na Fig. 14. Nesta construção, a sequência codificando o domínio maduro de neublastina está directamente fundida a uma metionina de iniciação. A construção com pMJB164 é mostrada na Fig. 15. 43 Células de Produção
Ainda num aspecto adicional, a invenção proporciona uma célula de produção geneticamente manipulada para compreender a sequência polinucleotídica isolada da invenção e/ou ou um vector de expressão recombinante da invenção. A célula da invenção pode, em particular, ser geneticamente manipulada para expressar, superexpressar ou co-expressar, de modo transiente ou de modo estável, o polipéptido da invenção. Os métodos para a geração de expressão transiente e estável são conhecidos na técnica. 0 polinucleótido da invenção pode ser inserido dentro um vector de expressão, e. g. , um plasmídeo, vírus ou outro veículo de expressão e operativamente ligado a sequências de controlo de expressão por ligação, num modo em que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo de expressão. As sequências de controlo de expressão adequadas incluem promotores, estimuladores, terminadores de transcrição, codões de iniciação, sinais de excisão para intrões e codões de terminação, todos mantidos na fase de leitura correcta do polinucleótido da invenção, de modo a permitir a tradução conveniente de ARNm. As sequências de controlo de expressão também podem incluir componentes adicionais, tais como sequências líder e sequências parceiras de fusão. 0 promotor pode, em particular, ser um promotor constitutivo ou um indutível. Quando se faz clonagem em sistemas bacterianos, podem ser utilizados promotores indutíveis, tais como pL de bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac). Quando se faz clonagem em sistemas mamíferos, podem 44 ser utilizados promotores derivados do genoma de células de mamífero, e. g., o promotor de ubiquitina, o promotor TK ou o promotor de metalotioneína ou de vírus de mamífero, e. g. , a repetição terminal longa de retrovírus, o promotor tardio de adenovírus ou o promotor 7,5K do vírus da vacínia. Também podem ser utilizados promotores obtidos por técnicas de ADN recombinante ou sintéticas, de modo a proporcionar para transcrição do polinucleótido da invenção.
Os vectores de expressão adequados tipicamente compreendem uma origem de expressão, um promotor, assim como genes específicos que permitem a selecção fenotípica das células transformadas e incluem vectores como o vector de expressão baseado em T7 para expressão em bactérias [Rosenberg et al. ; Gene 1987 56 125], os vectores de expressão pTEJ-8, pUbilZ, pcDNA-3 e pMSXND para expressão em células de mamífero [Lee e Nathans, J. Biol. Chem. 1988 263 3521], vectores derivados de baculovírus para expressão em células de insecto e o vector de expressão de oócito PTLN [Lorenz C, Pusch M & Jentsch T J: Canais de cloreto de CLC heteromultiméricos com novas propriedades; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996 93 13362-13366].
Numa forma de realização preferida, a célula da invenção é uma célula eucariótica, e. g., uma célula de mamífero, e. g., uma célula humana, um oócito ou uma célula de levedura. A célula da invenção pode ser, sem limitação, uma célula de rim embrionário humano (HEK) , e. g., uma célula HEK 293, uma célula BHK21, uma célula de ovário de hamster Chinês (CHO) , uma célula de oócito de Xenopus laevis (XLO). Noutra forma de realização, a célula da invenção é uma célula fúngica, e. g., uma célula fúngica filamentosa. Noutra forma de realização preferida, a célula é uma célula de insecto, de um modo muito preferido a 45 célula Sf9. São células de mamífero preferidas adicionais da invenção as linhas celulares PC12, HiB5, RN33b e células progenitoras neurais humanas. São muito preferidas as células humanas.
Exemplos de células primárias ou secundárias incluem fibroblastos, células epiteliais, incluindo células epiteliais mamárias e intestinais, células endoteliais, elementos formados do sangue, incluindo linfócitos e células de medula óssea, células gliais, hepatócitos, queratinócitos, células de músculo, células neurais ou os precursores destes tipos de célula. Exemplos de linhas celulares humanas imortalizadas úteis nos presentes métodos incluem mas não estão limitados a células de Melanoma de Bowes (Acesso ATCC N° CRL 9607), células Daudi (Acesso ATCC N° CCL 213), células HeLa e derivados de células
HeLa (Acessos ATCC N°: CCL 2, CCL 2.1 e CCL 2.2), células HL-60
(Acesso ATCC N° CCL 240), células HT-1080 (Acesso ATCC N° CCL 121), células Jurkat (Acesso ATCC N° TIB 152), células de carcinoma KB (Acesso ATCC N° CCL 17), células de leucemia K-562 (Acesso ATCC N° CCL 243), células de cancro da mama MCF-7 (Acesso ATCC N° BTH 22), células MOLT-4 (Acesso ATCC N° 1582), células Namalwa (Acesso ATCC N° CRL 1432), células Raji (Acesso ATCC N° CCL 86), células RPMI 8226 (Acesso ATCC N° CCL 155), células U-937 (Acesso ATCC N° CRL 1593), sub-linha WI-38VA13 de células 2R4 (Acesso ATCC N° CLL 75.1) e células de carcinoma ovariano 2780AD (Van der Blick et al., Câncer Res. 1988 48 5927-5932,), assim como células de hetero-hibridoma produzidas por fusão de células humanas e células de outras espécies. Também podem ser utilizadas estirpes secundárias de fibroblastos humanos, tais como WI-38 (Acesso ATCC N° CCL 75) e MRC-5 (Acesso ATCC N° CCL 171). 46
Quando a célula da invenção é uma célula eucariótica, a incorporação do polinucleótido heterólogo da invenção pode ser, em particular, efectuada por infecção (empregando um vector virai), por transfecção (empregando um vector plasmídico), utilizando precipitação por fosfato de cálcio, micro-injecção, electroporação, lipofecção ou outros métodos fisico-quimicos conhecidos na técnica.
Numa forma de realização mais preferida, a sequência polinucleotidica isolada da invenção e/ou ou um vector de expressão recombinante da invenção são transfectados numa célula hospedeira de mamífero, uma célula progenitora neural, uma célula de astrócito, uma célula T, uma célula estaminal hematopoiética, uma célula em não divisão ou uma célula endotelial cerebral compreendendo, pelo menos, uma molécula de ADN capaz de mediar a imortalização e/ou transformação celular. A activação de um gene endógeno numa célula hospedeira pode ser alcançada através da introdução de elementos reguladores, em particular através da introdução de um promotor capaz de efectuar a transcrição de um gene endógeno codificando o polipéptido de neublastina da invenção.
Composições Farmacêuticas
Noutro aspecto, a invenção proporciona novas composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido da invenção.
Para utilização em terapia, o polipéptido da invenção pode ser administrado em qualquer forma conveniente. Numa forma de 47 realização preferida, o polipéptido da invenção é incorporado dentro de uma composição farmacêutica, juntamente com um ou mais adjuvantes, excipientes, veículos e/ou diluentes e a composição farmacêutica preparada pelo especialista na técnica, utilizando métodos convencionais conhecidos na técnica.
Tais composições farmacêuticas podem compreender o polipéptido da invenção ou anticorpos deste. A composição pode ser administrada isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes, fármacos ou hormonas. A composição farmacêutica desta invenção pode ser administrada por qualquer via adequada, incluindo mas não limitada a oral, intravenosa, intramuscular, inter-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, anteral, tópica, sublingual ou aplicação rectal, bucal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraniana, intra-espinal, intraventricular, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, transmucosal ou por meio de inalação. Métodos de distribuição intrapulmonares, instrumentos e preparação de fármacos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,785,049, 5,780,019 e 5,775,320. A administração pode ser por injecções periódicas de um bólus da preparação ou pode ser tornada mais contínua, por administração intravenosa ou intraperitoneal a partir de um reservatório que é externo (e. g. , um saco IV) ou interno (e. g. , um implante bioerodível, um órgão bioartificial ou uma colónia de células de produção de neublastina implantadas) . Ver, e. g. , as Patentes U.S. 4,407,957, 5,798,113 e 5,800,828. São descritos métodos de 48 distribuição intrapulmonares e instrumentos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,654,007, 5,780,014 e 5,814,607.
Em particular, a administração de uma neublastina de acordo com esta invenção pode ser alcançada utilizando quaisquer meios de distribuição adequados, incluindo: (a) bomba (ver, e. g., Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Câncer, 41:1270 (1993); Câncer Research, 44:1698 (1984)), (b) microencapsulação (ver, e. g., patentes dos Estados Unidos 4,352,883; 4,353,888 e 5,084,350), (c) implantes poliméricos de libertação continua (ver, e. g. , Sabei, patente dos Estados Unidos 4, 883,666), (d) macroencapsulação (ver, e. g., patentes dos Estados
Unidos 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 e 4,968,733 e pedidos de patente PCT publicados WO 92/19195, WO 95/05452, (e) enxertos celulares livres ou não encapsulados para o SNC (ver, e. g. , patentes dos Estados Unidos 5, 082,670 e 5,618,531); ou (f) injecção, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente ou para outro local adequado; e (g) administração oral, em cápsula, líquido, comprimido, pílula ou formulação de libertação prolongada.
Numa forma de realização desta invenção, uma neublastina é distribuída directamente dentro do SNC, de um modo preferido para os ventrículos cerebrais, parênquima cerebral, o espaço intratecal ou outro local do SNC adequado, de um modo muito preferido intratecalmente. 49
Noutra forma de realização preferida, está contemplada a distribuição sistémica por injecção subcutânea, administração intravenosa ou infusão intravenosa.
Outros sistemas de distribuição parentéricos úteis incluem partículas de copolímero de acetato de etileno vinílico, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, distribuição por bomba, distribuição celular encapsulada, distribuição lipossomal, injecção distribuída por agulha, injecção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, electroporação e adesivo transdérmico.
Detalhes adicionais sobre técnicas para formulação e administração podem ser consultados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). 0 ingrediente activo pode ser administrado em uma ou várias doses por dia. As dosagens apropriadas presentemente contempladas são entre 0,5 ng de neublastina/kg de peso corporal a cerca de 50 pg/kg por administração e desde cerca de 1,0 ng/kg a cerca de 100 pg/kg diariamente. A composição farmacêutica de neublastina deve proporcionar uma concentração local de factor neurotrófico desde cerca de 5 ng/mL de fluido cerebrospinal ("CSF") a 25 ng/mL de CSF. A dose administrada deve, certamente, ser cuidadosamente ajustada à idade, peso e estado do indivíduo a ser tratado, assim como a via de administração, forma de dosagem e regime e do resultado desejado e a dosagem exacta deve, certamente, ser determinada pelo médico. 50
Em formas de realização adicionais, o polipéptido de Neublastina da invenção pode ser administrado por distribuição genética, utilizando linhas celulares e vectores, como se descrevem abaixo em métodos de tratamento. Para gerar tais linhas celulares terapêuticas, o polinucleótido da invenção pode ser inserido dentro de um vector de expressão, e. g., um plasmídeo, vírus ou outro veículo de expressão e operativamente ligado a sequências de controlo de expressão por ligação, num modo em que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo de expressão. As sequências de controlo de expressão adequadas incluem promotores, estimuladores, terminadores de transcrição, codões de iniciação, sinais de excisão para intrões e codões de terminação, todos mantidos na fase de leitura correcta do polinucleótido da invenção, de modo a permitir a tradução conveniente de ARNm. As sequências de controlo de expressão também podem incluir componentes adicionais, tais como sequências líder e sequências parceiras de fusão. O promotor pode, em particular, ser um promotor constitutivo ou um indutível. Os promotores constitutivos poderiam ser sintéticos, virais ou derivados do genoma de células de mamífero, e. g. , o promotor de ubiquitina humana. Numa forma de realização preferida, a linha celular terapêutica será uma linha celular neural imortalizada humana, expressando o polipéptido da invenção. Para implantação, está contemplada a implantação entre cerca de 105 a IO10 células, de um modo mais preferido 106 a cerca de 108 células. 51 Método de Tratamento A presente invenção, que se refere a polinucleótidos e proteínas, polipéptidos, fragmentos peptídicos ou derivados deles produzidos, assim como a anticorpos dirigidos contra tais proteínas, péptidos ou derivados, pode ser utilizada para tratamento ou alívio de um distúrbio ou doença do corpo de um animal vivo, incluindo um humano, cujo distúrbio ou doença é responsivo à actividade de agentes neurotróficos.
Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados directamente por meio de, e. g., composições farmacêuticas injectadas, implantadas ou ingeridas para tratar um processo patológico responsivo aos polipéptidos de neublastina. 0 polinucleótido da invenção, incluindo as suas sequências complementares, pode ser utilizado para a expressão do factor neurotrófico da invenção. Isto pode ser alcançado por linhas celulares expressando tais proteínas, péptidos ou derivados da invenção ou por vectores virais codificando tais proteínas, péptidos ou derivados da invenção ou por células hospedeiras expressando tais proteínas, péptidos ou derivados. Estas células, vectores e composições podem ser administrados a áreas alvo de tratamento, para afectar um processo de doença responsivo aos polipéptidos de neublastina.
Os vectores de expressão adequados podem ser derivados de lentivírus, retrovírus, adenovírus, vírus de herpes ou da vacínia ou de diversos plasmídeos produzidos de modo bacteriano, podem ser utilizados para distribuição in vivo de sequências nucleotídicas a um organismo intacto ou um órgão, tecido ou população celular alvo. Outros métodos incluem mas não estão 52 limitados a transfecção lipossomal, electroporação, transfecção com péptidos transportadores contendo sinais nucleares ou outros sinais de localização e distribuição génica por meio de sistemas de libertação lenta. Ainda noutro aspecto da invenção, sequências nucleotidicas "anti-sentido" complementares ao gene de neublastina ou suas porções, podem ser utilizadas para inibir ou melhorar a expressão de neublastina.
Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a uma utilização para o tratamento ou alivio de um distúrbio ou doença do corpo de um animal vivo, incluindo um humano, cujo distúrbio ou doença é responsivo à actividade de agentes neurotróficos. 0 distúrbio ou doença pode ser, em particular, danos do sistema nervoso causados por trauma, cirurgia, isquemia, infecção, doenças metabólicas, deficiência nutricional, malignidade ou agentes tóxicos e processos genéticos ou idiopáticos. 0 dano pode ter, em particular, ocorrido a neurónios sensoriais ou células ganglionares retinianas, incluindo neurónios nos gânglios das raízes dorsais ou em quaisquer dos tecidos seguintes: 0 geniculado; gânglios petrosos e nodosos; o complexo vestibuloacústico do VIII nervo craniano; o pólo ventrolateral do lobo maxilomandibular do gânglio trigeminal e o núcleo trigeminal mesencefálico. utilizações da neurodegenerativa tais como lesões e/ou a medula neuropatia e, isquémico cerebral,
Numa forma de realização preferida das invenção, a doença ou distúrbio é uma doença envolvendo neurónios lesionados e traumáticos, traumáticas de nervos periféricos, a medula espinal, dano neuronal isquémico cerebral, 53 especialmente, neuropatia periférica, trauma ou lesão de nervo periférico, AVC isquémico, lesão cerebral aguda, lesão aguda de medula espinal, tumores de sistema nervoso, esclerose múltipla, exposição a neurotoxinas, doenças metabólicas, tais como diabetes ou disfunções renais e dano causado por agentes infecciosos, distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, síndromes de Parkinson-Plus, Paralisia Supranuclear progressiva (Sindrome de Steele-Richardson-Olszewski) , Atrofia Olivopontocerebelar (OPCA), Sindrome de Shy-Drager (atrofia de múltiplos sistemas), complexo de demência de parkinsonismo de Guamanian, esclerose lateral amiotrófica ou qualquer outra doença congénita ou neurodegenerativa e deficiência de memória ligada a demência.
Numa forma de realização preferida, está contemplado o tratamento de neurónios sensoriais e/ou do sistema autónomo. Noutra forma de realização preferida, está contemplado o tratamento de doenças de neurónio motor, tais como esclerose lateral amiotrófica ("ALS") e atrofia muscular espinal. Ainda noutra forma de realização preferida, está contemplada a utilização das moléculas de neublastina desta invenção para melhorar a recuperação nervosa após lesão traumática. Numa forma de realização, está contemplada a utilização de um canal de orientação nervosa, com uma matriz contendo polipéptidos de neublastina. Tais canais de orientação nervosa são divulgados, e. g., na patente dos Estados Unidos N° 5,834,029.
Numa forma de realização preferida, os polipéptidos e ácidos nucleicos desta invenção (e composições farmacêuticas contendo os mesmos) são utilizados no tratamento de neuropatias periféricas. Entre as neuropatias periféricas contempladas para tratamento com as moléculas desta invenção estão neuropatias 54 induzidas por trauma, e. g., as causadas por lesão física ou estado de doença, dano físico ao cérebro, dano físico à medula espinal, AVC associado a dano cerebral e distúrbios neurológicos relacionados com neurodegeneração.
Também está contemplado o tratamento de neuropatias induzidas por quimioterapia (tais como as causadas por distribuição de agentes quimioterapêuticos, e. g., taxol ou cisplatina); neuropatias induzidas por toxina, neuropatias induzidas por fármaco, neuropatias induzidas por deficiência de vitamina; neuropatias idiopáticas e neuropatias diabéticas. Ver, e. g. , as patentes dos Estados Unidos 5, 496, 804 e 5,916,555.
Também está contemplado o tratamento de não neuropatias, neuropatias monomultiplex e polineuropatias, incluindo neuropatias axonais e desmielinizantes, utilizando os nucleótidos e polipéptidos de neublastina desta invenção.
Noutra forma de realização preferida, os polipéptidos e ácidos nucleicos desta invenção (e composições farmacêuticas contendo os mesmos) são utilizados no tratamento de diversos distúrbios no olho, incluindo perda foto-receptora na retina em doentes acometidos com degenerescência macular, retinite pigmentosa, glaucoma e doenças semelhantes.
Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para a prevenção das alterações degenerativas ligadas às doenças e distúrbios acima, através da implantação dentro de cérebro de mamífero, incluindo vectores ou células humanos, capazes de produzirem uma forma biologicamente activa de neublastina ou um precursor de neublastina, i. e., de uma molécula que pode ser facilmente convertida numa forma 55 biologicamente activa de neublastina pelo corpo ou, adicionalmente, as células que segregam neublastina podem ser encapsuladas, e. g. , dentro de membranas semipermeáveis.
As células podem ser cultivadas in vitro para utilização em transplantação ou enxerto dentro de cérebro de mamífero, incluindo humano.
Numa forma de realização preferida, o gene codificando o polipéptido da invenção é transfectado numa linha celular adequada, e. g. , numa linha celular estaminal neural de rato imortalizada, como HiB5 e RN33b, ou numa linha celular progenitora neural imortalizada humana e a linha celular resultante é implantada no cérebro de um corpo vivo, incluindo um humano, para segregar o polipéptido terapêutico da invenção no SNC, e. g., utilizando os vectores de expressão descritos no Pedido de Patente Internacional WO 98/32869. Métodos de Diagnóstico e Rastreio
Um ácido nucleico de neublastina pode ser utilizado para determinar se um indivíduo tem predisposição para desenvolver um distúrbio neurológico, resultante de um defeito no gene de neublastina, e. g., um defeito num alelo de neublastina que tenha sido adquirido por, e. g., herança genética, por desenvolvimento embrionário anormal ou por dano de ADN adquirido. A análise pode ser através da, e . g., detecção de uma deleção(ões) ou uma mutação(ões) pontual dentro do gene de neublastina ou através da detecção da herança de tal predisposição de tais defeitos genéticos com polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs) específicos, 56 através da detecção da presença ou ausência de um gene de neublastina normal através da hibridação de uma amostra de ácido nucleico do doente com uma sonda(s) de ácido nucleico especifica para o gene de neublastina e a determinação da capacidade de a sonda se hibridar ao ácido nucleico.
Em particular, um ácido nucleico de neublastina pode ser utilizado como uma sonda de hibridação. Tais ensaios de hibridação podem ser utilizados para detectar, prognosticar, diagnosticar ou monitorizar os diversos problemas, distúrbios ou estados de doenças associados a níveis aberrantes dos ARNm codificando a proteína de Neublastina. Um ácido nucleico de neublastina pode ser interpretado como um "marcador" para processos fisiológicos dependentes do factor neurotrófico de neublastina. Estes processos incluem, mas não estão limitados a, processos fisiológicos "normais" (e. g., função neuronal) e processos patológicos (e. g. , doença neurodegenerativa) . A caracterização de uma particular subpopulação(ões) de doentes com níveis aberrantes (i. e., elevados ou deficientes) da proteína de neublastina e ou ARNm codificando neublastina pode conduzir a novas classificações de doenças. Por "níveis aberrantes", como aqui se definem, entende-se um nível aumentado ou diminuído relativamente ao nível numa amostra de controlo ou indivíduo não tendo o distúrbio, determinado por meios quantitativos ou qualitativos.
Os ácidos nucleicos e polipéptidos de neublastina desta invenção também podem ser utilizados para rastrear e identificar análogos de neublastina, incluindo miméticos de moléculas pequenas de neublastina. Numa forma de realização contemplada, a invenção proporciona um método para a identificação de um composto candidato que induz um efeito biológico mediado por 57 neuroblastina, o método compreendendo as etapas de proporcionar uma célula de teste que, quando contactada com neublastina, é induzida a expressar um produto detectável, expondo a célula ao composto candidato e a detecção do produto detectável. A expressão do produto detectável é indicativa da capacidade de o composto candidato induzir o efeito biológico mediado por neuroblastina.
Adicionalmente, os ácidos nucleicos e polipéptidos de neublastina desta invenção podem ser utilizados em chip de ADN ou chíps de proteína, ou em programas informáticos, para identificar novas sequências génicas relacionadas e proteínas por elas codificadas, incluindo variantes alélicos e polimorfismos de nucleótido simples ("SNP"). Tais métodos são descritos, e. g., nas patentes dos Estados Unidos N°: 5, 795, 716; 5,754,524; 5,733,729; 5,800,992; 5,445,934; 5,525,464.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Métodos para o Isolamento de Ácidos Nucleicos de Neublastina Método 1: Rastreio Rápido de ADNc de Cérebro Fetal Humano para o Gene de Neublastina
Um fragmento de 290 pb foi identificado em duas sequências genómicas de alta capacidade (HGTS) submetidas ao GenBank (Acesso N° AC005038 e AC005051) pela sua homologia com a persefina humana. A partir da sequência de ácidos nucleicos do fragmento de 290 pb, foram sintetizados dois iniciadores específicos de neublastina. 0 iniciador da cadeia de topo de 58 neublastina ("NBNint.sentido") tinha a sequência 5'-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3' [SEQ ID N° : 17] . O iniciador da cadeia de fundo de neublastina ("NBNint.anti-sentido") tinha a sequência 5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' [SEQ ID N° : 18]. Com estes iniciadores, foram realizadas reacções de PCR de 96 poços.
Uma placa principal de 96 poços, contendo ADN plasmídico de 500000 clones de ADNc, foi carregada com, aproximadamente, 5000 clones por poço. Uma subplaca de 96 poços foi utilizada com stock de glicerol de E. coli DH10B, contendo 50 clones por poço.
Um ácido nucleico de neublastina foi identificado por três ciclos de amplificação, utilizando técnicas de reacção de polimerização em cadeia ("PCR"); a amplificação aumenta o número de cópias do ácido nucleico na amostra.
Rastreio de Placa Principal: Utilizando a técnica de rastreio de PCR de 96 poços descrita acima, uma placa principal de ADNc de cérebro fetal humano foi rastreada com os iniciadores específicos de gene para isolar o ADNc de neublastina humana.
Trinta nanogramas (30 ng) de ADNc de cérebro fetal humano (6 ng/pL, Origene Technologies) foram obtidos a partir do poço correspondente da placa principal e colocados num volume total de 25 pL que continha os seguintes reagentes: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene supramencionados (i. e., NBNint.sentido e NBNint.anti-sentido), lx tampão de PCR padrão (Tampão V, Advanced Biotechnologies, RU), dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia), fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU). 59
As reacções de ciclos de temperatura de PCR foram realizadas utilizando o processo e condições seguintes. 0 ADN foi inicialmente desnaturado, a 94 °C, durante 3 minutos e, depois, seguido de 35 ciclos de desnaturação, a 94 °C, durante 1 minuto cada, emparelhamento a 55 °C, durante 1 minuto, uma primeira extensão, a 72 °C, durante 90 segundos e uma extensão final, a 72 °C, durante 5 minutos. Os produtos de 96 reacções de PCR individuais foram analisados por electroforese em gel, utilizando um gel de agarose a 2% contendo o corante brometo de etidio. Verificou-se que o produto de PCR de 102 pb, positivo, observado a partir de um poço, corresponde a uma subplaca de 96 poços única. O fragmento de ácido nucleico de 102 pb tinha a seguinte sequência [SEQ ID N°: 13]:
5'-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCG
GGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTAC GAAGCGGTCTCCTT-3'
Rastreio de Subplaca: A subplaca de cérebro fetal humano de 96 poços foi rastreada por amplificação mediada por PCR, através da colocação de um 1 pL do stock de glicerol do poço da subplaca correspondente num volume total de 25 pL que continha: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene; lx tampão de PCR padrão (Tampão V, Advanced Biotechnologies, RU), dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia); fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU).
Foram utilizadas as mesmas condições de ciclos de temperatura de PCR, como descritas para o rastreio de placa 60 principal. As 96 reacções de PCR individuais foram analisadas num gel de agarose a 2% contendo brometo de etidio e foi identificado um poço positivo que proporcionou o fragmento de PCR de 102 pb. PCR de Colónia: Um mL do stock de glicerol do poço da subplaca positiva foi diluído 1:100 em caldo de Luria (LB) . Um mL e 10 mL da diluição supramencionada foram, depois, plaqueados em duas placas de ágar separadas contendo caldo de Luria ("LB") e carbenicilina a 100 pg/mL. As placas de LB foram, depois, incubadas, de um dia para o outro, a 30 °C. A partir destas placas, 96 colónias foram repicadas para numa nova placa de PCR de 96 poços, contendo: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene supramencionados; lx tampão de PCR padrão (Tampão V, Advanced Biotechnologies, RU), dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia); fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU), num volume final de 25 pL.
Foram utilizadas as mesmas condições de ciclos de temperatura de PCR, como descritas para o rastreio de placa principal. As 96 reacções de PCR individuais foram, depois, analisadas num gel de agarose a 2% contendo brometo de etidio. Foi subsequentemente identificada uma colónia positiva contendo o fragmento de 102 pb. A sequenciação do ADN plasmídico, preparado a partir desta colónia positiva, revelou um ADNc de comprimento completo de 861 pb [SEQ ID N°: 8] . O ADNc codificava para uma pre-pro-neublastina [SEQ ID N° : 9]. Foi realizada sequenciação de ADN automatizada, utilizando o kit de sequenciação de ciclo terminador BigDye® (PE Applied Biosystems, EUA). Os géis de 61 sequenciação foram corridos no ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, EUA). Método 2: Clonagem de ADNc de Neublastina a partir de Cérebro Humano:
Um método adicional de amplificação do ADNc de comprimento completo, ou fragmento de ADNc, de neublastina pode ser realizado por RACE (Amplificação Rápida de extremidades de ADNc) e os iniciadores específicos de neublastina NBNint.sentido e NBNint.anti-sentido descritos acima, combinado com iniciadores específicos de vector ou específicos de adaptador, por exemplo através da utilização do kit de amplificação de ADNc Marathon (Clontech Laboratories, EUA, Cat. N° K1802-1). 0 ADNc de cérebro humano intacto Marathon-Ready (Clontech Laboratories, EUA, Catálogo N° 7400-1) pode ser utilizado para amplificar o ADNc de neublastina de comprimento completo.
Iniciadores úteis para amplificação incluem um iniciador de cadeia de topo de neublastina 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' [SEQ ID N°: 19] ("NBNext.sentido") e um iniciador de cadeia de fundo de neublastina 5'-TCCATCACCCACCGGC-3, [SEQ ID N° : 20] ("NBNext.anti-sentido"), combinados com o iniciador adaptador AP1, incluído com o ADNc de Marathon-Ready. Também foi utilizado um iniciador de cadeia de topo alternativo, 5' -CTAGGAGCCCATGCCC-3' [SEQ ID N° : 28]. Também pode ser utilizado um iniciador de cadeia de fundo alternativo adicional, 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' [SEQ ID N° : 33] . Do mesmo modo, também podem ser utilizados os iniciadores de cadeia de fundo alternativos SEQ ID N°: 24 e 26. 62 Método 3: Clonagem de ADNc de Neublastina a partir de Cérebro Humano:
Outro método de clonagem de ADNc de neublastina é por rastreio de bibliotecas de cérebro adulto ou fetal humano com uma ou mais sondas de neublastina aqui descritas (e como exemplificado na Figura 1). Estas bibliotecas incluem: cérebro humano Àgtll (Clontech Laboratories, EUA, Cat. N° HL3002b) ou cérebro fetal humano Àgtll (Clontech Laboratories, EUA, Cat. N° HL3002b). Método 4: Rastreio Rápido de ADNc Fetal de Murganho para o Gene de Neublastina
Um processo de rastreio rápido para o gene de neublastina foi realizado do seguinte modo. Uma placa principal de 96 poços, contendo ADN plasmídico de 500000 clones de ADNc, foi carregada com, aproximadamente, 5000 clones por poço. Uma subplaca de 96 poços foi utilizada com stock de glicerol de E. coli, contendo 50 clones por poço. Foram realizados três ciclos de amplificação mediada por PCR, de modo a identificar um gene de interesse (i. e., neublastina).
Rastreio de Placa Principal: Uma placa principal de ADNc fetal de murganho foi rastreada por PCR de 96 poços utilizando iniciadores específicos de gene para isolar o ADNc de neublastina de murganho. Foram sintetizados os seguintes dois iniciadores: 63 (1) iniciador C2 de neublastina (NBNint.sentido): 5' -GGCCACCGCTCCGACGAG-3' [SEQ ID N° : 21] e (2) iniciador C2as de neublastina (NBNint.anti-sentido): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID N° : 22] . Através da utilização destes dois iniciadores específicos de gene, foi identificado um produto de PCR positivo de 220 pb. O ácido nucleico de 220 pb possuía a seguinte sequência [SEQ ID N°: 14]: 5'-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGG CTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAG CCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGC CGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCT CCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3'
Foram, depois, realizadas reacções de PCR de 96 poços do seguinte modo. Trinta nanogramas de ADNc de cérebro fetal de murganho (6 ng/pL, Origene Technologies) foram obtidos a partir do poço correspondente da placa principal e colocados num volume total de 25 pL, que também continha: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene supramencionados (i. e., iniciador C2 (NBNint.sentido) e iniciador C2as de neublastina (NBNint.anti-sentido)), lx tampão de PCR padrão (Tampão V; Advanced Biotechnologies, RU), dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia), fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU).
Foram utilizadas as seguintes condições de ciclos de temperatura de PCR: uma desnaturaçao inicial, a 94 °C , durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturaçao, a 94 °C, durante 1 minuto cada, emparelhamento a 55 °C, durante 1 minuto, extensão, a 72 °C, durante 90 segundos e uma extensão final, a 64 72 °C, durante 5 minutos. As 96 reacções de PCR individuais foram analisadas num gel de agarose a 2% contendo o corante brometo de etidio. Verificou-se que o produto de PCR de 220 pb, positivo, observado a partir de um poço, corresponde a uma subplaca de 96 poços única. As 96 reacções de PCR individuais foram, depois, analisadas por electroforese em gel, num gel de agarose a 2% contendo o corante brometo de etidio. O produto de PCR positivo de 220 pb que tinha sido identificado correspondia a um poço único da subplaca de 96 poços.
Rastreio de Subplaca: A subplaca fetal de murganho de 96 poços foi rastreada por amplificação mediada por PCR, através da colocação de um 1 pL do stock de glicerol do poço da subplaca correspondente num volume final, total, de 25 pL, que continha: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene supramencionados; Ix tampão de PCR padrão (Tampão V, Advanced Biotechnologies, RU), dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia) ; fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU). Os ciclos de temperatura de PCR foram realizados de acordo com as condições descritas acima para o rastreio de placa principal.
As 96 reacções de PCR individuais foram, depois, analisadas num gel de agarose a 2% contendo brometo de etidio e foi identificado um poço positivo que produziu o fragmento de 220 pb. PCR de Colónia: Um mL do stock de glicerol do poço da subplaca positiva foi diluído 1:100 em caldo de Luria (LB) . Um mL e 10 mL da diluição supramencionada foram, depois, plaqueados em duas placas de LB separadas, contendo carbenicilina a 100 pg/mL e incubados, a 30 °C, de um dia para o 65 outro. Um total de 96 colónias foi isolado e transferido para uma placa de PCR de 96 poços, contendo: 0,2 mM de cada dos dois iniciadores específicos de gene supramencionados, lx tampão de PCR padrão (Tampão V, Advanced Biotechnologies, RU) , dNTP a 0,2 mM (Amersham-Pharmacia); fusão de GC a 0,1 M (Clontech Laboratories, EUA) e 0,5 unidades de Taq ADN polimerase (5 U/pL; Advanced Biotechnologies, RU), num volume final de 25 pL.
Os ciclos de temperatura de PCR foram realizados de acordo com as condições descritas acima (ver, "rastreio de placa principal", infra). As 96 reacções de PCR individuais foram analisadas por electrof orese em gel, num gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio. Foi identificada uma colónia positiva pela presença do fragmento de 220 pb. O ADN plasmídico foi preparado a partir desta colónia positiva. O clone foi sequenciado por sequenciação de ADN automatizada, utilizando o kit de sequenciação de ciclo terminador BigDye® com AmpliTag ADN polimerase. Os géis de sequenciação foram corridos no ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems). A sequência resultante deste clone revelou um ADNc de comprimento completo de 2136 pb [SEQ ID N°: 15] . O ADNc inclui uma fase de leitura aberta, com a sequência de aminoácidos prevista mostrada em SEQ ID N°: 16, que codifica para um polipéptido de pre-pro-neublastina de murganho.
Exemplo 2: Clonaqem de Neublastina Genómica
Como discutido acima, a requerente identificou um fragmento de ácido nucleico de 290 pb em dois clones BAC humanos, com registos no GenBank (com os Acessos N° : AC005038 e AC005051) que tinham regiões de homologia com persefina e com as sequências flanquedoras de persefina. A requerente utilizou a sequência prevista de 861 pb descrita acima para conceber iniciadores adicionais, com o objectivo de clonar um ácido nucleico codificando ácidos nucleicos de neublastina adicionais, utilizando o Software Lasergene (DNAStar, Inc.). Foram utilizados dois pares de iniciadores para clonar o gene de neublastina, através da utilização de reacções de PCR em ADN genómico. Os dois pares de iniciadores estão ilustrados abaixo.
Par Iniciador N° 1 5' CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3' (sentido) [SEQ ID N°: 23] . 5' CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT CAg 3' (ant i-sent ido) [SEQ ID N°: 24]
Par Iniciador N° 2 5' gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgAggACA 3' (sentido) [SEQ ID N°: 25] . 5' CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3' (anti-sentido) [SEQ ID N°: 26].
Utilizando o par iniciador N° 1, foi amplificado um fragmento de ADN de 887 pb a partir de uma preparação de ADN genómico humano adquirido à Clontech Laboratories, (Cat. N° 6550-1) .
Protocolo de PCR: O PCR foi realizado utilizando o sistema de PCR Expand™ High Fidelity (Boehringer Mannheim) com o tampão 1. A mistura reaccional de PCR foi suplementada com dimetilsulf óxido (DMSO) a 5% e 17,5 pmol de cada dNTP, num volume total de 50 pL. Os ciclos de temperatura foram realizados 67 com uma etapa de pré-desnaturação, a 94 °C, durante 2 minutos, seguida de 35 ciclos de duas etapas, a 94 °C, durante 10 segundos e 68 °C, durante 1 minuto, respectivamente. Os ciclos de temperatura foram terminados por incubação, a 68 °C, durante 5 minutos. Os ciclos de temperatura foram efectuados num termociclador PTC-225 DNA Engine Tetrad (MJ Research, MA) . Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel, em agarose (FMC) a 2% e, depois, fotografados. 0 fragmento de 887 pb amplificado a partir de ADN genómico humano com o par iniciador N° 1 foi clonado dentro do vector pCRII (Invitrogen) e transformado dentro de células de E. coli competentes XL 1-Blue (Stratagene). 0 plasmídeo resultante, designado neublastina-2, foi sequenciado utilizando Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech). Os produtos de sequenciação foram analisados por electroforeses, num sequenciador automatizado ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech).
Os fragmentos obtidos por amplificação por PCR de ADN genómico humano com o segundo par de iniciadores (Par Iniciador N° 1, acima) foram sequenciados, revelando uma região de 42 pb adicional na extremidade de iniciação 3' da fase de leitura aberta. A sequência de comprimento completo foi analisada através da sua comparação com as sequências de ácidos nucleicos de outros factores neurotróficos, assim como através do mapeamento de fronteiras exão-intrão, utilizando programas de software de pesquisa de genes que identificam junções de excisão prováveis e regiões de elevado potencial codificante, utilizando o software Netgene e Gene Mark (Brunak et al., J. Mol. Biol. 1991 220 49-65; Borodovsky et al. , Nucl. Acids Res. 1995 23 68 3554-62). As fronteiras exão-intrao foram confirmadas pelo ADNc obtido do Rastreio Rápido descrito acima.
Como ilustrado na FIG. 7, o gene de neublastina resultante tem dois exões separados por um intrão de 70 pb. Em conjunto, os exões têm uma sequência de aminoácidos prevista de um polipéptido de Neublastina de comprimento completo. 0 ADNc previsto [SEQ ID N°: 3] contém uma fase de leitura aberta (ORF), codificando 238 resíduos de aminoácidos [SEQ ID N°: 4] . O clone de Neublastina-2 continha a sequência codificante completa de pro-neublastina. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene mostrou elevada homologia com três proteínas, persefina, neurturina e GDNF.
Exemplo 3: Expressão de Ácidos Nucleicos de Neublastina A expressão de ARN de neublastina foi detectada em tecido nervoso e não nervoso em roedores e em humanos e em diversos estádios do desenvolvimento imaturos e adultos, utilizando as técnicas descritas abaixo. Método de detecção de expressão de ARN de Neublastina utilizando RT-PCR: Com base na sequência de ADN de neublastina, identificada como SEQ ID N° : 1, foram sintetizados os seguintes iniciadores: (1) um iniciador C2 de neublastina 5 ’ -GGCCACCGCTCCGACGAG-3' [SEQ ID N° : 21] e (2) um iniciador C2as de neublastina 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID N°: 22]. Este conjunto de iniciadores foi utilizado para amplificar, por RT-PCR, um fragmento de ADN de ARNm de cérebro intacto humano adulto e fetal. Entre os fragmentos de ADN produzidos por esta reacção estava um de 220 pb. A identificação deste fragmento de 69 ADN de 220 pb confirmou que o gene de neublastina é expresso em tecido de cérebro adulto e fetal. Com a utilização destes iniciadores, também foi amplificado um fragmento de ADN de 220 pb a partir de ADN genómico. Método de detecção de expressão de ARN de Neublastina por hibridação de transferência de northern:
As transferências de northern com ARN poliA+ de tecido humano adulto foram adquiridas a um fornecedor comercial (Clontech Laboratories, EUA) e sondadas com um ADNc de neublastina marcado com 32P. O ADNc de neublastina marcado foi preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1, acima.
Preparação de Sondas: Um fragmento de ADN de ácido nucleico de neublastina (nucleótidos 296-819 de SEQ ID N° : 8) foi marcado pelo kit de marcação Rediprime II (Amersham; Cat. N° RPN1633), para utilização como uma sonda de hibridação, como recomendado pelo fabricante. Resumidamente, a amostra de ADN foi diluída para uma concentração de 2,5-25 ng em 45 pL de Tampão TE a 10 mM (Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0, EDTA a 1 mM) . O ADN foi, depois, desnaturado através do aquecimento da amostra a 95-100 °C, durante 5 minutos, num banho-maria em ebulição, rapidamente arrefecendo a amostra através da sua colocação sobre gelo, durante 5 minutos e, depois, centrifugando-a brevemente para trazer o conteúdo para o fundo do tubo de reacção. A quantidade total de ADN desnaturado foi adicionada juntamente com 5 pL de Redivue [32P] dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) no tubo de reacção, contendo solução tamponada de dATP, dGTP, dTTP, enzima de Klenow isenta de exonuclease e iniciador aleatório na forma estabilizada seca. A solução foi misturada através de pipetagem 70 para cima e baixo 2 vezes, movendo a ponta da pipeta à volta na solução e a mistura reaccional foi incubada, a 37 °C, durante 10 minutos. A reacção de marcação foi interrompida através da adição de 5 pL de EDTA a 0,2 M. Para utilização como uma sonda de hibridação, o ADN marcado foi desnaturado em cadeias simples, através do aquecimento da amostra de ADN a 95-100 °C, durante 5 minutos, depois arrefecendo rapidamente a amostra de ADN sobre gelo, durante 5 minutos 0 tubo foi centrifugado e o seu conteúdo bem misturado. Finalmente, a sonda de ADN de cadeia simples foi purificada utilizando o kit Nucleotide Removal (Qiagen). Técnicas de Hibridação: As transferências de northern preparadas foram adquiridas a um fornecedor comercial ("Multiple Tissue Northern Blots", Clontech Laboratories, EUA, Catálogo N°: 7760-1 e 7769-1) e foram hibridadas de acordo com as instruções do fabricante, utilizando a sonda de neublastina marcada com 32P preparada acima. Para hibridação, foi utilizada a solução ExpressHyb (Clontech Laboratories, EUA) e foi empregue uma concentração de, aproximadamente, 3 ng/mL da sonda marcada. A solução ExpressHyb foi aquecida a 68 °C e, depois, agitada para dissolver qualquer precipitado. Cada membrana de transferência de northern (10x10 cm) foi pré-hibridada em, pelo menos, 5 mL de solução ExpressHyb a 68 °C, durante 30 minutos, num Forno de Hibridação Hybaid, de acordo com as instruções do fabricante. A sonda de neublastina marcada com 32P foi desnaturada, a 95-100 °C, durante 2 minutos e, depois, arrefecida rapidamente sobre gelo. Catorze microlitros (14 pL) da sonda marcada foram adicionados a 5 mL de ExpressHyb fresca e exaustivamente misturados. A Solução ExpressHyb utilizada na pré-hibridação foi substituída através de distribuição uniforme sobre as transferências de 5 mL de Solução ExpressHyb fresca, 71 contendo sonda de ADN marcada. As transferências foram incubadas, a 68 °C, durante 1 hora, num Forno de Hibridação Hybaid. Após incubação, as transferências foram enxaguadas e lavadas várias vezes a baixa estringência (tampão 2x SSC contendo SDS a 0,05%, à temperatura ambiente), seguida de uma lavagem de elevada estringência (0,lx SSC contendo SDS a 0,1%, a 50 °C) [20X SSC é NaCl a 0,3 Μ/Na citrato a 0,3 M, pH 7,0]. As transferências foram expostas a um Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.), a -80 °C, utilizando ecrãs de intensificação.
Os resultados das experiências de hibridação da transferência de northern são apresentados na FIG. 1. As FIG. IA (esquerda) e FIG. 1B (direita) são transferências de northern de ARN poliA+ que foram sondadas com ADNc de neublastina marcado com 32P, como descrito no Exemplo 3. Os marcadores representam polinucleótidos de 1,35 quilopares de bases ("kb"), 2,4 kb, 4,4 kb, 7,5 kb e 9,5 kb em tamanho. A membrana da Fig. IA foi preparada com ARNm extraído de diversos tecidos humanos adultos: Dos resultados da análise de hibridação de transferência de northern, a requerente concluiu que o ARNm de neublastina é expresso em muitos tecidos humanos adultos. 0 nível mais elevado de expressão de neublastina é detectado no coração, no músculo esquelético e no pâncreas. A membrana da FIG. 1B foi preparada com ARNm extraído de diversas regiões do cérebro humano adulto. Dentro do cérebro adulto, o nivel mais elevado de expressão é verificado no núcleo caudado e no tálamo. Um transcrito de ARNm de, aproximadamente, 5 kb era a forma predominante de ARNm de neublastina expressa no cérebro. 72 Método de detecção de Expressão de ARN de Neublastina utilizando Hibridação in situ em Tecidos:
As seguintes técnicas são utilizadas para medir a expressão de ARN de neublastina em tecidos animais, e. g., tecidos de roedor, com uma sonda anti-sentido de neublastina.
Expressão em Murganhos:
Preparação de Amostras de Tecido: Murganhos de prenhez regulada (B&K Universal, Estocolmo, Suécia) foram mortos por deslocamento cervical no dia gestacional 13,5 ou 18,5. Os embriões foram removidos por dissecção sob condições estéreis e imediatamente imersos numa solução de tampão de fosfatos a 0,1 M (PB), contendo paraformaldeido ("PFA") a 4%, durante 24-30 horas e, depois, removidos do PFA e armazenados em PBS. O tecido foi preparado para seccionamento através da imersão do tecido numa solução de sacarose a 30% e, depois, embebendo-o em TissueTech (Composto O.C.T., Sakura Finetek EUA, Torrance, CA). Seis séries de secções coronais ou sagitais (12 μιη cada) foram cortadas num crióstato e montadas em descongelação sobre lâminas de vidro positivamente carregadas. Cabeças/cérebros neonatais (Pl, P7) foram fixos, seguindo o mesmo protocolo como para os estádios embrionários e tecido de cérebro adulto foi dissecado, imediatamente congelado em gelo seco e cortado num crióstato, sem qualquer embebimento prévio.
Preparação de Ribossondas de Neublastina: Uma Sonda de ARN de Neublastina Anti-sentido (a seguir uma "ribossonda de neublastina") foi preparada como se segue. Os nucleótidos 1109-1863 da sequência de ADNc de neublastina de murganho 73 [SEQ ID N° : 15] foram subclonados dentro do vector BlueScript (Stratagene). 0 plasmídeo resultante foi cortado num ADN linear utilizando a endonuclease de restrição EcoRI. 0 fragmento de ADN de EcoRI foi transcrito in vitro com T3 ARN polimerase e o Kit de Marcação de ARN de digoxigenina ("DIG") de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim).
Hibridação: Secções de crióstato foram fixas, durante 10 minutos, em PFA a 4%, tratadas, durante 5 minutos, com 10 mg/mL de proteinase K, desidratadas sequencialmente em etanol a 70% e 95%, durante 5 e 2 min, respect ivamente e, depois, deixadas a secar ao ar. O tampão de hibridação (formamida desionizada a 50%, 10% de uma solução de sulfato de dextrano a 50%, solução de Denhardt a 1%, ARNt de levedura a 250 pg/mL, NaCl a 0,3 M, Tris-HCl a 20 mM (pH 8), EDTA a 5 mM, NAP04 a 10 mM, sarcosil a 1%), contendo 1 pg/mL da sonda marcada com DIG, foi aquecido a 80 °C, durante 2 minutos e aplicado nas secções. As secções foram, depois, cobertas com parafilme e incubadas, a 55 °C, durante 16-18 horas.
No dia seguinte, as secções foram lavadas a elevada estringência (2x SSC contendo formamida a 50%), a 55 °C, durante 30 minutos e, depois, lavadas em tampão de RNase e incubadas com 20 pg/mL de RNase A, durante 30 minutos, a 37 °C. De modo a detectar a sonda marcada com DIG, as secções foram pré-incubadas em solução de bloqueamento (PBS contendo Tween-20 a 0,1% e soro de cabra inactivado por calor a 10%), durante 1 hora e, depois, incubadas, de um dia para o outro, a 4 °C, com uma diluição 1:5000 de anticorpo anti-DIG ligado a fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim) . No dia seguinte, a cada secção foram dadas quatro lavagens de duas horas em PBS contendo Tween-20 a 0,1% e, depois, dadas duas lavagens de dez minutos em tampão 74 NTMT (NaCl a 100 mM, Tris-HCl a 100 mM (pH 9,5), MgCl2 a 50 mM, Tween-20 a 0,1%). As secções foram, depois, incubadas em substrato púrpura de BM, contendo 0,5 mg/mL de levamisole, durante 48 horas. A reacção de cor foi interrompida através de lavagem em PBS. As secções foram secas ao ar e cobertas com lamelas com DPX (KEBO-lab, Suécia).
Os resultados das reacções de hibridação in situ são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1: Expressão de neublastina em Murganhos
Estrutura E13.5 E18.5 PI P7 Adulto Prosencéfalo ++ Mesencéfalo Ventral - Gânglios das Raízes + + Dorsais Medula Espinal + Retina + + + +++ + Bolbo olfactivo + + ++ + + Polpa dentária + + ++ + Gânglios trigeminais + + ++ + + Estriado + + + + Córtex + + + + + + + Circunvolução denteada + + + Como mostrado na Tabela 1, no dia embrionári 13,5 ("E13.5"), a neublastina foi expressa na medula espinal e 75 no rombencéfalo e fracamente no prosencéfalo. A expressão de neublastina também foi detectada na retina em desenvolvimento e nos gânglios sensoriais (gânglios das raízes dorsais e gânglios trigeminais (V)). Fora do sistema nervoso, verificou-se um sinal fraco no rim, no pulmão e no intestino, indicando que a neublastina também é expressa nesses tecidos.
No dia embrionário 18,5 ("E18.5"), a neublastina foi expressa mais vincadamente no gânglio trigeminal (V) . A expressão de neublastina também foi detectada na retina, no estriado e no córtex. Adicionalmente, a expressão foi observada no primórdio do dente.
De novo, fazendo referência à Tabela 1, expressão aumentada de neublastina, desde o intervalo de tempo E18.5 até aos dias pós-natais 1 e 7, foi observada no córtex, no estriado e no gânglio trigeminal (V) . A expressão de neublastina foi mais vincada nas camadas externas do córtex do que nas camadas internas do córtex. Em P7, verificou-se expressão nas mesmas estruturas que no dia 1 mas, adicionalmente, verificou-se expressão de neublastina no hipocampo, especialmente na circunvolução denteada e no cerebelo. No cérebro murino adulto, a neublastina foi fortemente expressa na circunvolução denteada, com níveis muito baixos ou indetectáveis de expressão de neublastina detectados em outros tecidos testados.
Expressão no Rato: A seguinte experiência descreve a hibridação de tecidos de rato com uma sonda anti-sentido de neublastina de oligodesoxinucleótido marcado com fosfatase alcalina. 76
Preparação de amostras de tecido: Embriões de rato (E14) foram obtidos de ratos Wistar prenhes (Mollegard, Dinamarca) após anestesia de pentobarbital. Ratos pós-natais (PO, P7, adulto) foram mortos por decapitação. Os cérebros dissecados e cabeças intactas foram imediatamente imersos em NaCl frio a 0,9%, congelados frescos e seccionados a 20 μπι num crióstato (secções coronais e sagitais, 10 séries).
Hibridação in situ: Duas séries de secções foram hibridadas utilizando uma sonda oligodesoxinucleotidica conjugada a fosfatase alcalina (AP) anti-sentido (5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3 ' [SEQ ID N° : 27], Oligo. N° 164675, DNA Technology, Dinamarca). Esta sonda é complementar às bases 1140 a 1169 do ADNc de neublastina de murganho de SEQ ID N°: 15).
Antes da hibridação, as secções foram secas ao ar, à temperatura ambiente, aquecidas a 55 O O durante 10 min e, depois, tratadas com etanol a 96%, a o O > de um dia para o outro. As secções foram, depois, secas ao ar e incubadas em meio de hibridação (5,0 pmol de sonda/mL) , de um dia para o outro, a 39 °C (Fínsen et al., Neurosci. 1992 47 105-113; West et al., J. Comp. Neurol. 1996 370 11-22). O tratamento de pós-hibridação consistiu em quatro enxaguadelas de trinta minutos em lx SSC (NaCl a 0,15 M, Na-citrato a 0,015 M), a 55 °C, seguidas de três enxaguadelas de dez minutos em Tris-HCl, pH 9,5, à temperatura ambiente, antes da aplicação de revelador AP. O revelador AP foi preparado imediatamente antes de utilização e continha tetrazólio nitroazul (NBT, Sigma), 5-bromo, 4-cloro, 3-indolilfosfato 77 (BCIP, Sigma) e tampão de Tris-HCl-MgCl2, pH 9,5 (Finsen et al., Neurosci. 1992 47 105-113). A revelação de AP ocorreu no escuro, à temperatura ambiente, durante 48 horas. A reacção de cor foi interrompida através de enxaguamento das secções em água destilada. As secções foram desidratadas em acetona graduada, amolecidas em creosoto de xileno-fenol (Allchem, RU), clarificadas em xileno e tapadas com lamelas utilizando Eukitt (Bie & Berntsen, Dinamarca).
As reacções de controlo consistiram em (1) pré-tratamento das secções com RNase A (50 pg/mL, Pharmacia, Suécia) antes de hibridação; (2) hibridação das secções com um excesso de cem vezes de sonda não marcada e (3) hibridação das secções só com tampão de hibridação. Os resultados das reacções de hibridação são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Expressão de neublastina em ratos
Estrutura E14 P0/P1 P7 Adulto Prosencéfalo + + Mesencéfalo Ventral - Gânglios das raízes + + dorsais Medula espinal + Retina + Bolbo olfactivo ( + ) ++ + + Cerebelo + + + + Gânglios trigeminais + + + + Estriado + + ( + ) Córtex ( + ) ++ + + + 78 (continuação)
Estrutura E14 P0/P1 P7 Adulto Hipocampo ( + ) + + + +
No dia embrionário 14 (E14), a neublastina foi fracamente expressa em embriões de rato no prosencéfalo, no rombencéfalo e na medula espinal. ARNm de neublastina também foi detectado no olho (retina), gânglios das raizes dorsais, nos gânglios trigeminais (V) e nos rins, pulmões, coração, fígado e intestinos. Em ratos recém-nascidos (PO) havia expressão marcada de neublastina no córtex e no estriado. A expressão de neublastina também foi detectada no bolbo olfactivo e no hipocampo. Em ratos de 7 dias de idade (P7), a neublastina foi expressa no córtex, no estriado, no bolbo olfactivo e no cerebelo. Verificou-se um sinal marcado no hipocampo. Em ratos adultos, foram detectados níveis muito baixos ou indetectáveis de expressão de neublastina em muitas áreas do cérebro. Foram detectados sinais fracos no núcleo talâmico e foi detectada expressão marcada de neublastina no hipocampo.
Exemplo 4: Polipéptidos de Neublastina A fase de leitura aberta ou região codificante (CDS), identificada em SEQ ID N°: 8, codifica o pre-pro-polipéptido (designado "pre-pro-neublastina"). A sequência de aminoácidos prevista a partir desta fase de leitura aberta é mostrada em SEQ ID N°: 9. Com base em SEQ ID N°: 9, foram identificados três variantes de polipéptidos de Neublastina. Estes variantes incluem: 79 (i) o polipéptido aqui designado como NBN140, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 10; (ii) o polipéptido aqui designado como NBN116, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 11 e (iii) o polipéptido aqui designado como NBN113, que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 12.
De modo semelhante, com base na região codificante (CDS), como identificada em SEQ ID N° : 3, que codifica o pré-pro-polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos (designada como SEQ ID N°: 4), foram identificados três variantes de neublastina. Estes variantes incluem: (i) o polipéptido que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 5; (ii) o polipéptido que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 6 e (iii) o polipéptido que possui a sequência de aminoácidos designada como SEQ ID N°: 7.
Com base num alinhamento de múltiplas sequências baseado em Clustal W (1.75), a SEQ ID N°: 9 foi alinhada com as sequências de aminoácidos de GDNF, persefina e neurturina. Este alinhamento é ilustrado na Tabela 3. 80
Tabela 3: Comparação de Sequência de Aminoácidos de Neublastina
com Persefina, Neurturina e GDNF
Neurturina-completa --------------------MQRWKAAALASVL C S SVL SIWMC REGLLLSHRLGPA Neublastina MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPP
Persefina-completa GDNF_HUMANO-completo -----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDS Neurturina-completa LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR Neublastina VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPG Persefina-completa -MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPL GDNF_HUMANO-completo NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKG Neurturina-completa RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLRR Neublastina SRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLAS Persefina-completa ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALAR GDNF_HUMAN0-completO RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN k k . * ****· ·*·**·*·*·* * . *
Neurturina-completa LRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV- Neublastina LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG Persefina-completa LQGQGRAHGG--------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGG GDNF_HUMANO-completo LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI- ★ k k k k · · · ★ · ★ · · . k k k k * indica posições que têm um único resíduo, totalmente conservado. : indica que um dos seguintes grupos 'fortes' é totalmente conservado: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. indica que um dos seguintes grupos 'mais fracos' é totalmente conservado: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY. A partir do alinhamento da sequência de aminoácidos mostrado na Tabela 3, pode verificar-se que a neublastina tem sete resíduos de cisteína conservados nas localizações que são 81 conservadas dentro da superfamília de TGF-β. Numa forma de realização, o polipéptido de neuroblastina preferido contém (sete) cisteínas conservadas, como em SEQ ID N°: 2, nas posições 8, 35, 39, 72, 73, 101 e 103 ou como nas SEQ ID N° : 4 e 9, nas posições 43, 70, 74, 107, 108, 136 e 138. Estes sete resíduos de cisteína conservados são conhecidos dentro da superfamília de TGF-b como formando três ligações dissulfureto intramonoméricas (contempladas, e. g., em SEQ ID N°: 2 entre os resíduos de cisteína 8-73, 35-101 e 39-103, e, e. g. , em SEQ ID N° : 4 e 9 entre os resíduos de cisteína 43-108, 70-136 e 74-138) e uma ligação dissulfureto intermonomérica (contemplada, e. g., em SEQ ID N°: 2 entre os resíduos de cisteína 72-72 e, e. g., em SEQ ID N°: 4 e 9 entre os resíduos de cisteína 107-107) que, em conjunto com a região de cadeia beta prolongada, constituem o motivo estrutural conservado para a superfamília de TGF-b. Ver, e. g., Daopín et al., Proteins 1993 17 176-192.
Com base neste alinhamento de sequência, mostrou-se que a neublastina é um membro da subfamília de GDNF de factores neurotróficos (LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP - SAxxCGC, a impressão digital da subfamília de GDNF, sublinhada na Tabela 3). A homologia de neublastina com outros membros da família de GDNF foi calculada e os resultados são apresentados na Tabela 4, abaixo. 82
Tabela 4: Homologia de Polipéptidos de Neublastina com outros
membros da Familia de GDNF
Proteína NBN140 Madura Proteína NBN113 Madura Homologia Homologia de péptidos de comprimento completo Homologia Hcmologia de péptidos de ccmprimento ccmpleto Factor Neurotrófico Identidade Sobreposição Forte (aa) Homologia Identidade Identidade Sobreposição Forte (aa) Hcmologia Identidade GDNF 34% (47/137) 137 48% (67/137) 31,9% 36% (41/111) 111 52% (59/111) 29,5% ΝΊΝ 48% (61/127) 127 56% (72/127) 36,9% 49% (56/114) 114 57% (66/114) 44,7% PSP 44% (55/125) 125 56% (71/125) 36,9 45% (51/111) 111 57% (65/111) 44,3% IHA 31% (25/81) 81 — 25,2% 31% (25/81) 81 - 22,5% TGF-p2 23% (17/73) 73 — 18,5% 23% (17/73) 73 - 20,2% GDNF = Factor Neurotrófico Derivado de Linha Celular Glial NTN = Neurturina PSP = Persefina IHA = Inibina α TF-p2 = Factor de Crescimento Transformante β2
Forte homologia indica que um dos seguintes grupos "fortes" é conservado: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. 83
Exemplo 5: Produção de Neublastina
Foi produzida neublastina em células eucarióticas e procarióticas, como se descreve abaixo.
Vectores de Expressão 0 ADNc de comprimento completo codificando a neublastina foi inserido dentro do vector de expressão eucariótico pUbilZ. Este vector foi gerado através da clonagem do promotor UbC humano dentro de uma versão modificada de pcDNA3.1/Zeo. 0 pcDNA3.1/Zeo não modificado está comercialmente disponível (Invitrogen). 0 pcDNA3.1/Zeo modificado é mais pequeno do que o vector progenitor, porque o gene de ampicilina (desde a posição 3933 a 5015) e uma sequência desde a posição 2838 a 3134 foram removidos. Nesta versão modificada de pcDNA3.1/Zeo, o promotor CMV foi substituído com o promotor UbC de pTEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett. 1990 267 289-294), resultando em pUbilZ.
Expressão de Célula de Mamífero 0 vector pUbilZ, que continha sequências codificantes de neublastina foi, depois, transfectado na linha celular de mamífero HiB5, que é uma linha celular neural de rato imortalizada (Renfranz et al., Cell, 1991 66 713-729). Foram estabelecidas várias linhas celulares de HiB5 expressando a neublastina de modo estável (como determinado por RT-PCR). Numa destas linhas celulares estáveis, a expressão de HiB5pUbilzNBN22 foi confirmada através da hibridação de ARN total numa transferência de Northern com uma sonda de neublastina marcada com 32P. Os resultados destes estudos são mostrados na Fig. 2. O HiB5pUbilzNBN22 foi, depois, utilizado como uma fonte de neublastina para estudos de actividade neurotrófica de neublastina. 84 A FIG. 2 mostra a expressão de ADNc de neublastina no clone HiB5pUbilzNBN22 (i. e., transferência de Northern sondada com ADNc de neublastina marcado com 32P da presente invenção, como descrito infra) . A transferência foi preparada por ARN total extraído de células HiB5 não transfectadas, células HiB5pUbilzNBN22 e HiB5pUbilzGDNF14, respectivamente, como indicado. As posições das bandas de ARNr 28S e 18S, correspondendo a 4,1 kb e 1,9 kb, respectivamente, estão indicadas na transferência.
Como mostrado na FIG. 3, os anticorpos deduzidos contra polipéptidos derivados de neublastina também reconheceram uma proteína de, aproximadamente, 13 quilodaltons ("kD") em meio condicionado do clone HiB5pUbilzNBN22 mas não de células HiB5 não transfectadas (cf. Exemplo 6).
Os pesos moleculares previstos dos polipéptidos de neublastina não modificados (i. e., desprovidos de modificações pós-traducionais) NBN140 [SEQ ID N°: 10], NBN116 [SEQ ID N°: 11] e NBN113 [SEQ ID N°: 12] foram determinados como sendo 14,7 quilodaltons ("kD"), 12,4 kD e 12,1 kD, respectivamente. Métodos: Uma transferência de Northern com ARN total (10 pg) de células HiB5 não transfectadas e do clone HiB5pUbilzNBN22 foi preparada por electroforese num gel de agarose e formaldeído a 0,8% e transferida sobre uma membrana de nylon (Duralone, Stratagene). A transferência foi hibridada e lavada como descrito no Exemplo 3, com uma sonda de 1,3 kb marcada com 32P, preparada por marcação aleatória abrangendo a SEQ ID N°: 8 e nucleótidos adicionais da UTR em 5' e UTR em 3' do ADNc de neublastina. A transferência foi exposta a um Hyperfilm MP (Amersham), a -80 °C, utilizando ecrãs de intensificação. 85
Meio condicionado de Hib5pUbilzNBN22 ou células Hib5 não transfectadas incubadas, de um dia para o outro, em meio isento de soro suplementado com suplemento de N2 (Life Technologies; Cat. N° 17502-048) foi concentrado e separado em géis de poliacrilamida a 15% (Amersham Pharmacia. Biotech; Cat. N° 80-1262-01). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech; Cat. N° RPN-303F) e os sítios de ligação de proteína não específicos foram bloqueados com leite magro desidratado a 5%, em PBS, com Tween-20 a 0,1%. As membranas foram incubadas, de um dia para o outro, com um anticorpo policlonal de neublastina (1:1000), seguida de incubação com um anticorpo IgG anti-coelho secundário (Amersham Pharmacia Biotech; Cat. N° NA 934) conjugado a peroxidase de rábano (1:2000). A imunocoloração foi visualizada utilizando quimioluminescência melhorada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech; Cat. N° RPN2109) ou ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech; Cat. N° RPN2132), de acordo com as instruções do fabricante (Amersham).
Os resultados destas experiências são mostrados na Figura 3. A Figura 3A e 3B são ilustrações da expressão de proteína de neublastina em células HiB5 transfectadas. Foi concentrado meio, de um dia para o outro, de células HiB5 não transfectadas [Pista 1] ou de um clone de HiB5 transfectado de modo estável com ADNc de neublastina [Pista 2], como descrito infra. O meio foi, depois, analisado por transferência de Western utilizando dois anticorpos policlonais diferentes, Ab-1 e Ab-2, descritos no Exemplo 10, específicos para neublastina. No meio derivado de células transfectadas, verificou-se que ambos os anticorpos reconhecem uma proteína, com um peso molecular de, 86 aproximadamente, 15 kDa. Esta proteína nao foi observada em células HiB5 não transfectadas. 0 ADNc clonado codificando neublastina também pode ser inserido dentro de outro vector de expressão eucariótico, e. g. , o vector de expressão eucariótico TEJ-8 (Johansen et al. , FEBS Lett. 1990 267 289-294) ou pcDNA-3 (Invitrogen) e o plasmídeo de expressão resultante transfectado numa linha celular de mamífero alternativa, e. g. , células de Ovário de Hamster Chinês ("CHO"), as linhas celulares HEK293, as COS, as PC12 ou as RN33b ou uma célula estaminal neural humana. As linhas celulares estáveis expressando neublastina são utilizadas, e. g., para produzir a proteína de neublastina.
Expressão em Células CHO
Construção do plasmídeo pJC070.14 De modo a expressar o ADNc de Neublastina em células de ovário de hamster Chinês, um fragmento de ADNc codificando a forma prepro de Neublastina humana foi inserido dentro do vector de expressão de mamífero pEAG347 para gerar o plasmídeo pJC070.14. O pEAG347 contém os promotores precoce de SV40 e tardio principal de adenovírus em tandem (derivados do plasmídeo pAD2beta; Norton e Coffin, Mol. Cell. Biol. 1985 5 281), um sítio de clonagem Notl único, seguido de terminação de transcrição tardia de SV40 e sinais poliA (derivados do plasmídeo pCMVbeta; MacGregor e Caskey, Nucl. Acids. Res. 1989 17 2365). Adicionalmente, o pEAG347 contém uma estrutura plasmídica derivada de pUC19 e um dhfr derivado de pSV2dhfr para selecção de MTX e amplificação em células CHO transfectadas. 87 0 plasmídeo pJC070.14 foi gerado em duas etapas. Em primeiro lugar, um fragmento codificando a forma prepro de Neublastina humana foi isolado do plasmídeo pUbilZ-NBN, utilizando a reacção de polimerização em cadeia com oligonucleótidos KD2-824 5'AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3' [SEQ ID N° : 31], KD2-825 5 'TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3’ [SEQ ID N°: 32] e PFU polimerase. 0 fragmento foi clonado dentro do sitio Srf-1 de pPCR-Script Amp SK(+) para gerar o plasmídeo pJC069. Na segunda etapa, foi realizada uma digestão parcial de Not-1 no plasmídeo pJC069, para gerar um fragmento de 6 85 pb (contendo o gene de neublastina) que foi clonado dentro do sítio Not-1 do plasmídeo pEAG347, para gerar o plasmídeo pJC070.14. A transcrição do gene de neublastina no plasmídeo pJC070.14 é controlada pelo promotor tardio principal de adenovirus.
Geração de linhas celulares CHO expressando Neublastina. 200 pg de pJC070.14 foram linearizados por digestão com a endonuclease de restrição Mlu-1. 0 ADN foi extraído com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e o etanol precipitou. 0 ADN linearizado foi ressuspenso em Hepes a 20 mM, pH 7,05, NaCl a 137 mM, KC1 a 5 mM, Na2HP04 a 0,7 mM, dextrose a 6 mM (HEBS) e introduzido dentro de ~4E7 células CHO dukx BI(dhfr—) (p23) por electroporação (280V e 960 pF). Após electroporação, as células foram devolvidas à cultura em Meio de Eagle Modificado oí+ (MEM), suplementado com soro bovino fetal (FBS) a 10%, durante dois dias. As células foram, depois tripsinizadas e replaqueadas em placas de 100 mm (100000 células/placa) em α-MEM (desprovido de ribo- e desoxirribonucleósidos) , suplementado com FBS a 10% dialisado, durante cinco dias. As células foram subsequentemente divididas, a uma densidade de 100000 células/placa de 100 mm e 88 seleccionadas em metotrexato a 200 nM. As colónias resistentes foram repicadas e expandidas para placas de 6 poços; foram rastreados meios condicionados de cada clone utilizando um ensaio especifico para neublastina, descrito abaixo. Os doze clones expressando o nível mais elevado de neublastina foram expandidos para frascos T162 e subsequentemente reensaiados. Como mostrado na Figura 10, as linhas celulares CHO produziram neublastina na gama de 25 a 50 ng/mL.
Ensaio de complexo ternário para neublastina. Foi ensaiada a presença de neublastina nos meios de sobrenadantes da linha celular CHO utilizando uma forma modificada de um ensaio de complexo ternário descrito por Sanicola et al. (Proc Natl Acad Sei USA 1997 94 6238) .
Neste ensaio, a capacidade de moléculas semelhantes a GDNF pode ser avaliada para a sua capacidade para mediarem a ligação entre o domínio extracelular de RET e os diversos co-receptores, GFRal, GFRa2 e GFRa3. As formas solúveis de RET e dos co-receptores foram geradas como proteínas de fusão Uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de RET de rato e fosfatase alcalina placentária (RET-AP) e uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de GFRal de rato (divulgado no pedido publicado W09744356; 27 de Novembro de 1997, aqui incorporado por referência) e o domínio Fc de IgGl humana (rGFRal-Ig) foram descritas (Sanicola et al. Proc Natl Acad Sei USA 1997 94 6238) .
Para gerar uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de GFRa3 murino e o domínio Fc de IgGl humana (mGFRa3-Ig), um fragmento de ADN codificando os aminoácidos 1-359 de RETL3 murino foi ligado a um fragmento 89 contendo o domínio Fc de IgGl humana e clonado dentro do vector de expressão pEAG347 para gerar o plasmídeo pGJ144. 0 plasmídeo pGJ144 foi transfectado em células de ovário de hamster Chinês (CHO) para gerar uma linha celular estável produzindo a proteína de fusão, que foi purificada numa coluna de imunoaf inidade de Proteína A Sepharose, utilizando métodos padrão. Em suma, se a molécula semelhante a GDNF puder mediar a ligação do co-receptor a RET neste ensaio, então a proteína de fusão RET-AP será retida na placa e a quantidade que é retida pode ser medida, utilizando um substrato quimioluminescente para fosfatase alcalina.
As placas de ELISA Dynex Microlite-1 (Dynex Technologies) foram revestidas com anticorpo de cabra a 1 μρ/πιμ específico para a Fc humana em bicarbonato/carbonato a 50 mM, pH 9,6, durante 16 h. As placas foram esvaziadas e cheias com 300 μΕ de I-block a 1% (Tropix) em TBS/Tween-20 a 0,5% (TBST), durante 1 h. Após lavagem três vezes com TBST, os poços foram cheios com 100 μΕ de rGFRal-Ig ou mGFRa3-Ig a 1 μg/mL, diluído em meios condicionados de células 293 EBNA expressando o gene de fusão RET-AP. 100 gL de meios condicionados dos clones de neublastina de CHO foram, depois, adicionados ao poço de topo de uma coluna de poços e foram realizadas diluições seriais de 2 vezes para cada fileira de poços e incubados, durante 1,5 h, à temperatura ambiente. As placas foram, depois, lavadas três vezes com TBST e duas vezes com Tris a 200 mM, pH 9,8, MgCl2 a 10 mM (tampão CSPD) . A solução de lavagem foi, depois, substituída com CSPD (Tropix) a 425 μΜ em tampão CSPD, contendo estimulador de quimioluminescência Sapphire (Tropix) a 1 mg/mL e incubada, durante 30', à temperatura ambiente. O débito quimioluminescente foi medido utilizando um luminómetro Dynatech. 90
Nas experiências iniciais, foi investigado se a neublastina produzida pelas linhas celulares CHO podia mediar a ligação de GFRal ou GFRoí3 ao domínio extracelular de RET. Como mostrado na Figura 11, o meio condicionado do clone de célula CHO N° 53 produziu um sinal robusto no ensaio de complexo ternário quando foi incluída a proteína de fusão mGFRa3-Ig, mas sem sinal quando foi incluída a proteína de fusão rGFRal-Ig, indicando que a neublastina se liga a GFRoí3 mas não a GFRal. Este comportamento claramente distingue a neublastina de GDNF; como mostrado na Figura 11, o GDNF liga-se a GFRal mas não a GFRa3. Não foi observado sinal com a proteína de fusão co-receptora, quando foi ensaiado meio condicionado da linha celular CHO progenitora ou meio simples.
De modo a quantificar os níveis de expressão de neublastina nas linhas celulares CHO, foi preparada uma curva-padrão utilizando rGFRal-Ig e GDNF, começando a uma concentração de 1 ng/mL. As concentrações de neublastina para as diferentes linhas celulares CHO foram, depois, calculadas utilizando esta curva-padrão; os níveis produzidos por cinco linhas celulares CHO são mostrados na Figura 10. Devido a esta estimativa depender da suposição não testada de que a afinidade de ligação entre GDNF e GFRal é semelhante à afinidade de ligação entre neublastina e GFRa3, estes níveis são apenas aproximados.
Análise de neublastina a partir de sobrenadantes de linha celular CHO.
De modo a analisar adicionalmente a neublastina produzida pelas linhas celulares CHO, a proteína foi extraída do meio utilizando a proteína de fusão GFRa3-Ig e analisada por 91 transferências de western, com anticorpos policlonais deduzidos contra péptidos de neublastina.
Na primeira experiência, a neublastina foi extraída com mGFRa3-Ig conjugada a esférulas de Sepharose. A mGFRo(3-Ig foi conjugada a esférulas de Sepharose utilizando as condições sugeridas pelo fabricante, Pharmacia Inc. 100 pL de mGFRoí3-Ig-Sepharose foram adicionados a amostras de 1,0 mL de meio condicionado de uma linha celular CHO de controlo negativo ou da linha celular CHO produzindo neublastina N° 16. As suspensões foram incubadas durante duas horas numa plataforma oscilante. Cada suspensão foi centrifugada e o sobrenadante removido, seguido de três lavagens de 1,0 mL com HEPES a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 7,5. Cada resina foi ressuspensa em 100 pL de tampão de amostra redutor 2X e aquecido a 100 °C, durante 5 minutos. 20 pL do sobrenadante do tampão de amostra e 10 pL de um padrão de peso molecular (FMC) foram aplicados a cada poço de um gel de SDS-PAGE a 10-20% pré-moldado (Owl Scientific). O gel foi submetido a electroforese, a corrente constante de 40 mA, durante 72 minutos.
Para análise de transferência de Western, a proteína foi electrotransferida para nitrocelulose (Schleicher and Schuell), num aparelho Hofer Scientific, em sistema tampão de CAPS a 10 mM, metanol a 10%, SDS a 0,05%, pH 11,2, (45 minutos a corrente constante de 400 mA). Após a transferência, o filtro de nitrocelulose foi removido da cassete e os marcadores de peso molecular foram visualizados por coloração com uma solução de Ponceau S a 0,1%, em ácido acético a 1%, durante 60 segundos. A membrana foi cortada em duas secções e o corante em excesso foi removido por agitação suave em água destilada. As membranas foram bloqueadas em leite magro desidratado a 2% em IBS, de um 92 dia para o outro, a 4 °C. As membranas foram incubadas individualmente com dois dos anticorpos peptidicos anti-neublastina purificados por afinidade (R30 e R31), a uma concentração de 1,0 pg/mL, em leite magro desidratado a 2% em IBS). As membranas foram lavadas com três lavagens de 10 minutos em TBS-Tween e incubadas numa diluição 1:5000 de IgG de cabra anti-coelho conjugada a HRP (Biorad), durante 30 minutos. As membranas foram lavadas com três lavagens de 10 minutos de TBS-Tween e reveladas com substrato de ECL (Amersham) . Como mostrado na Figura 12, foram detectadas bandas especificas nas proteínas extraídas da linha celular CHO produzindo neublastina com ambos os anticorpos (pistas 2 e 4), quando comparadas com as bandas observadas nas proteínas extraídas da linha celular de controlo negativo (pistas 1 e 3). 0 peso molecular das espécies inferiores é cerca de 13 kD e representa, provavelmente, o domínio maduro de neublastina gerado após clivagem do pro-domínio. Esta clivagem podia ocorrer após qualquer um dos três resíduos de Arg-_ (e. g. , -RXXRj,-) da proteína prepro de neublastina para gerar as formas 140 AA, 116 AA ou 113 AA, como expostas em SEQ ID N° : 10, 11 ou 12, respectivamente. Os pesos moleculares previstos dos polipéptidos de neublastina não modificados (i. e., desprovidos de modificações pós-traducionais) NBN140 [SEQ ID N°: 10], NBN116 [SEQ ID N° : 11] e NBN113 [SEQ ID N°: 12] foram determinados como sendo 14,7 kD, 12,4 kD e 12,1 kD, respectivamente. Será necessária análise adicional para confirmar a estrutura desta espécie, assim como as outras bandas específicas de neublastina.
Na segunda experiência, a neublastina foi extraída com hGFRa3-Ig capturada numa placa de ELISA. Para gerar uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de GFRa3 humano (divulgado 93 no pedido publicado W097/44356; 27 de Novembro de 1997, aqui incorporado por referência) e o domínio Fc de IgGl humana (hGFRa3-Ig), um fragmento de ADN codificando os aminoácidos 1-364 de GFRa3 humano foi ligado a um fragmento contendo o domínio Fc de IgGl humana e clonado dentro do vector de expressão CH269, descrito por Sanicola et al . (Proc Nat 1
Acad. Sei. USA 1997 94 6238). A proteína de fusão codificada por este plasmideo foi expressa, de modo transiente, em células de antigénio nuclear codificado por vírus de Epstein-Barr 293 (EBNA) e purificada numa coluna de imunoafinidade de Proteína A Sepharose, utilizando métodos padrão.
Seis poços de uma placa de 96 poços foram revestidos, de um dia para o outro, a 4 °C, com IgG de cabra anti-humano (fragmento específico de Fcy; Jackson Immunulogics), a uma concentração de 25 mg/mL em PBS (300 mL/poço) . Os poços foram bloqueados, durante 1 h, à temperatura ambiente, com 400 mL de BSA a 1% em PBS. Após 3 lavagens com PBST (PBS + Tween 20 a 0,05%), 300 mL de hGFRa3-Ig (10 mg/mL em PBS, contendo BSA a 0,1%) foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada, durante 1 h, à temperatura ambiente e agitada suavemente (200 movimentos/min) para maximizar a ligação. Os poços foram, depois, esvaziados e lavados de novo 3 vezes com PBST. 250 mL de meios condicionados de uma linha celular CHO de controlo negativo ou da linha celular CHO produzindo neublastina N° 25 foram adicionados a cada dos 3 poços. A placa foi incubada, durante 3 h, à temperatura ambiente e agitada suavemente (300 movimentos/min). Os poços foram, depois, lavados duas vezes com PBST. 25 mL de tampão de carregamento de Laemmli não redutor foram adicionados ao primeiro poço e a placa foi agitada rapidamente, durante 5 min, para eluir as proteínas ligadas (1300 movimentos/min) . O conteúdo foi transferido para o poço 94 seguinte e o processo foi repetido para eluir as proteínas ligadas no segundo e terceiro poços. Após a adição de b-mercaptoetanol {5% final), as amostras foram fervidas, durante 5 minutos e analisadas por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida a 10-20% .
Para a análise de transferência de western, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose. A membrana foi bloqueada e sondada em leite magro desidratado a 5%, PBST e lavada em PBST. A neublastina foi detectada por electroquimioluminescência, após reacção com anticorpos policlonais (R30 e R31) deduzidos contra dois péptidos de neublastina (a 1 pg/mL), seguida de reacção com anticorpos de cabra anti-coelho conjugados a HRP (BioRad). Como mostrado na Figura 13, foram detectadas cinco bandas específicas de neublastina nas proteínas extraídas da linha celular CHO produzindo neublastina (corredor 2). As duas bandas inferiores são muito semelhantes às bandas observadas na Figura 12; de novo, a banda inferior representa, provavelmente, o domínio maduro de neublastina gerado após clivagem do pro-domínio.
Análise subsequente (dados não mostrados) das bandas na Figura 13 mostra que a deglicosilação com PGNase F da banda de, aproximadamente, 18 kD reduz essa banda a um tamanho equivalente à banda mais abaixo no gel da Figura 13. Isto sugere que a neublastina pode ser produzida como uma proteína glicosilada em células de mamífero. 95
Expressão de Neublastina em E. coli
De modo a expressar o gene de neublastina em E. coli, foram construídos syngenes com teor de GC inferior e codões de E. coli preferidos. 0 syngene está a ser clonado dentro de dois vectores, pET19b e pMJB164, um derivado de pET19b. A construção com pET19b é mostrada na Figura 14. Nesta construção, a sequência codificando o domínio maduro de neublastina (NBN113) está directamente fundida a uma metionina de iniciação. A construção com pMJB164 é mostrada na Figura 15. Nesta construção, o domínio maduro de neublastina está fundido a uma cauda de histidina (i. e., 10 histidinas) , separada por um sítio de clivagem de enterocinase. A metionina de iniciação precede a cauda de histidina.
Sequência nucleotídica codificando a neublastina na
Figura 14 ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTG TCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACC GTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGTCGTCGT GCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGC ACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGAC CTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGA ACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATA G [SEQ ID N°: 29] 96
Sequência nucleotidica codificando a neublastina com cauda de his na Figura 15 ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATAT CGACGACGACGACAAGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAG GAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTC GGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGG ATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTAC TAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAA CCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAA CTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTC TAGGATGATAATAG [SEQ ID N°: 30]
Exemplo 6: Efeito de Neublastina na sobrevivência de Neurónios Dopaminérgicos de Rato Embrionário e Actividade de ChAT.
Nesta série de experiências, foi avaliado o efeito do meio condicionado de células HiB5pUbilzNBN22 produzindo neublastina descritas acima.
Preparação de Culturas: O mesencéfalo ventral ou espinal medula foi dissecado de embriões E14 de rato em Solução Salina Tamponada de Hanks (HBSS) fria. Os pedaços de tecido foram incubados em tripsina a 0,1% filtrada estéril (Worthington) e DNase a 0,05% (Sigma) em HBSS, a 37 °C, durante 20 min. Os pedaços de tecido foram, depois, enxaguados quatro vezes em HBSS + DNase a 0,05% e dissociados utilizando uma pipeta automática de 1 mL. A suspensão foi, depois, centrifugada a 600 rpm, durante 5 min e o sedimento foi ressuspenso em meio sérico condicionado (SCM; DMEM com soro fetal de vitelo a 10%) . O 97 número total de células foi avaliado pelo método de exclusão de corante azul de tripano e plaqueadas a uma densidade de 100000 células/cm2 em lâminas com câmara de oito poços revestidos com poli-L-lisina (Nunc), para avaliação de sobrevivência de neurónio dopaminérgico ou a 200000 células/cm2 em placas de 48 poços (Nunc), para medições de actividade de ChAT. As células foram incubadas em SCM a 5% de CC>2/95% de O2 e 95% de humidade, em 37 °C, durante 24-48 h, antes de mudar para meio isento de soro (SFM), com adição de factores neurotróficos.
As células para avaliação de sobrevivência de neurónio dopaminérgico foram deixadas 5 dias em SFM + adições de factor trófico e, depois, fixas, durante 5 min, em PFA a 4% e coradas para tirosina hidroxilase por imuno-histoquimica.
As células para actividade de ChAT foram deixadas 3 dias com SFM e, depois, lisadas em HBSS + Triton X-100 a 0,1% e imediatamente congeladas em gelo seco, até à medição de actividade de Chat.
Adição de Factor Trófico: O meio condicionado foi recolhido de HiB5 não transfectadas de controlo ou HiB5 produzindo neublastina (HiB5pUbilzNBN22) ou GDNF (HiB5pUbilzGDNF-L17). HiB5pUbilzNBN22 produz, aproximadamente, 20 ng de células GDNF/24 horas/105, como determinado por ELISA de GDNF em meio condicionado, recolhido das células. As respectivas linhas celulares foram incubadas, de um dia para o outro, com DMEM + FCS a 1% e o sobrenadante foi retirado e armazenado, a -20 °C, até à sua utilização. Os sobrenadantes foram diluidos em 1:50 em SFM quando adicionados às células. Poços separados foram tratados com sobrenadante de HiB5 de 98 controlo (1:50) + GDNF de rato recombinante purificado (desde 0,03-10 ng/mL).
Os resultados destas experiências são mostrados na Fig. 4. As FIGS. 4A-4C são ilustrações do efeito de neublastina, segregada de células HiB5pUbilzNBN22, na sobrevivência de neurónios embrionários de rato cultivados, dopaminérgicos, mesencefálicos ventrais e actividade de ChAT em neurónios motores de nervo craniano colinérgico em meio isento de soro, como descrito infra no Exemplo 5.1. A FIG. 4A é uma ilustração da curva de dose-resposta para GDNF recombinante na actividade de ChAT (dpm/hora), medida a DIV5, em culturas isentas de soro que foram inicialmente estabelecidas a partir de mesencéfalos ventrais E14 [i. e., HiB5; GDNF a 0,03 ng/mL; GDNF a 0,1 ng/mL; GDNF a 0,3 ng/mL; GDNF a 1 ng/mL; GDNF a 10 ng/mL; GDNF a 100 ng/mL]. A FIG. 4B é uma ilustração da actividade de ChAT (dpm/hora), medida a DIV5, em culturas isentas de soro que foram inicialmente estabelecidas a partir de mesencéfalos ventrais E14. Foi adicionado meio condicionado diluído de células HiB5pUbilzNBN22 produzindo neublastina (neublastina) ou células HÍB5GDNFL-17 produzindo GDNF (GDNFL-17), como indicado na figura [i. e., neublastina 1:10; neublastina 1:50; GDNF L-17 1:50]. A FIG. 4C é uma ilustração do número de células imunorreactivas para tirosina hidroxilase por poço [N° de células TH+/poço], a DIV7, em culturas isentas de soro que foram inicialmente estabelecidas a partir de mesencéfalos ventrais de rato EI4. Foram adicionados meios condicionados diluídos de células HiB5 não transfectadas (HiB5) ou células HiB5pUbilzNBN22 99 produzindo neublastina (neublastina) ou GDNF recombinante, em diversas concentrações, como indicado na figura [i. e., HiB5 1:10; HiB5 1:40; GDNF a 0,1 ng/mL; GDNF a 10 ng/mL; GDNF a 100 ng/mL e neublastina 1:40]. O meio condicionado de células HiB5 transfectadas com neublastina diluído 1:40 aumenta significativamente o número de células imunorreactivas para TH por poço, em comparação com células HiB5 de controlo (não transfectadas), a uma diluição equivalente e uma inferior (1:10 e 1:40) (ver, e. g., a Fig. 4B). 0 aumento em células imunorreactivas para TH é comparável ao aumento verificado a uma concentração máxima de GDNF (10 ng/mL) . Isto indica que a neublastina segregada para o meio tem um efeito na sobrevivência da população de neurónio dopaminérgico de mesencéfalo ventral embrionário de rato. Em contraste, ao contrário de GDNF segregado de células HiB5 transfectadas, não foi observado efeito do meio condicionado de células HiB5 transfectadas com neublastina noutra população neuronal na mesma cultura, os neurónios colinérgicos (ver, e. g., a Fig. 4A).
Exemplo 7: Efeito de Neublastina na Sobrevivência de Culturas em Fatias de Neurónios Mesencefálicos Ventrais Dopaminérgicos Embrionários de Porco
Nesta experiência, o efeito de co-cultivo de células HiB5pUbilzNBN22 produzindo neublastina com culturas em fatias de mesencéfalos ventrais de embriões porcinos.
Preparaçao de Culturas: Os mesencéfalos ventrais (VM) foram isolados de embriões porcinos (E28; n=12), sob condições 100 estéreis, cortados em fatias de 400 μπι e colocados em solução salina equilibrada de Gey refrigerada (GIBCO), com glucose (6,5 mg/mL). As fatias de tecido foram cultivadas pelo método de cultura de interface, originalmente desenvolvido por Stoppini et al. [L. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 1991 37 173-182] .
Em resumo, as fatias foram colocadas em membranas semiporosas (Millipore, 0,3 pm; 8 fatias/membrana, correspondendo a um VM) , colocadas como insertos em placas de 6 poços (Costar) , com meio contendo soro (Gibco BRL) . Cada poço continha 1 mL de meio (Optimem a 50%, soro de cavalo a 25%, solução salina equilibrada de Hank a 25% (todos GIBCO)), suplementado com D-glucose, para uma concentração final de 25 mM. No dia 0, 7000 células HiB5pUbilzNBN22 transfectadas (neublastina) ou 7000 HiB5 não transfectadas (controlo) foram semeadas em cada fatia de tecido. As co-culturas foram, em primeiro lugar, cultivadas numa incubadora, a 33 °C, durante 48 horas, permitindo que as células HiB5 imortalizadas com um oncogene sensível a temperatura proliferem e, depois, colocadas numa incubadora, a 37 °C, onde as células HiB5 se diferenciam. O meio foi trocado duas vezes por semana. Não foram utilizados antimitóticos e antibióticos em nenhuma fase.
Determinação de Dopamina por HPLC: No dia 12 e 21 in vitro, o meio de cultura foi recolhido e analisado para dopamina, utilizando HPLC com detecção electroquímica (W. N. Slooth, J. B. P. Gramsbergen, J, Neurosci. Meth, 1995 60 141-49).
Processamento de Tecido e Imuno-histoguimica: No dia 21, as culturas foram fixas em paraformaldeído a 4% em tampão de fosfato, durante 60 min, desidratadas numa solução de sacarose a 101 20%, durante 24 horas, congeladas, seccionadas em crióstato a 20 μπι (4 séries) e montadas sobre lâminas de microscópio revestidas com gelatina. Uma série de secções foi imunocorada para tirosina hidroxilase (TH) . Resumidamente, as secções foram lavadas em solução salina tamponada com Tris a 0,05 M (TBS, pH 7,4), contendo Triton X-100 a 1%, durante 3x15 min e incubadas com soro bovino fetal (FBS, Life Technologies) a 10% em TBS, durante 30 min. 0 tecido foi, depois, incubado durante 24 horas, a 4 °C, com anticorpo anti-TH monoclonal de murganho (Boehringer Mannheim) , diluído 1:600 em TBS com FBS a 10%. Após enxaguamento em TBS com Triton X-100 a 1%, durante 3x15 min, as secções foram incubadas, durante 60 min, com anticorpo IgG anti-murganho biotinilado (Amersham), diluído 1:200 em TBS com FBS a 10%. As secções foram, depois, lavadas em TBS com Triton X-100 a 1% (3x15 min) e incubadas, durante 60 min, com estreptavidina-peroxidase (Dako), diluída 1:200 em TBS com FBS a 10%. Após lavagem em TBS (3x15 min), o anticorpo ligado foi visualizado por tratamento com 3,3-diaminobenzidina (Sigma) a 0,05% em TBS contendo H2O2 a 0,01%. Finalmente, as secções foram desidratadas em álcool, clarificadas em xileno e cobertas com lamelas em Eukitt.
Contagens celulares e análise morfométrica: A quantificação de neurónios imunorreactivos para TH-ir foi realizada utilizando microscopia de campo claro (Olympus). Foram contadas apenas as células exibindo uma coloração intensa, com uma estrutura celular bem preservada e um núcleo distinto. A estimativa foi baseada em contagens celulares em uma em cada quatro secções de cultura, utilizando uma objectiva x20. 0 número de células foi corrigido para dupla contagem, de acordo com a fórmula de Abercrombie (M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946 94 239-47), utilizando o diâmetro médio dos núcleos nos neurónios TH-ir 102 (6,6±0,2 μπι, η=30). Ο tamanho dos núcleos foi estimado utilizando um sistema de rastreio de neurónio (Neurolucida, MicroBrightField, Inc.).
Os resultados destas experiências são mostrados na Fig. 5. As FIGS. 5A-5C são ilustrações do efeito de neublastina segregada de células HiB5pUbilzNBN22 na função e sobrevivência de culturas em fatias de neurónios mesencefálicos ventrais dopaminérgicos embrionários de porco co-cultivados com células HiB5pUbilzNBN22 (neublastina) ou células HiB5 (controlo), como descrito infra. FIG. 5A e Fig. 5B: ilustram a dopamina libertada para o meio, a DIV12 [Dopamina (pmol/mL)-dia 12] e DIV21 [Dopamina (pmol/mL)-dia 21], respectivamente. A FIG. 5C é uma ilustração do número de células imunorreactivas para tirosina hidroxilase por cultura [células TH-ir por cultura] a DIV21.
No dia 12, a análise de HPLC revelou que o meio de co-culturas de HiB5-neublastina continha 84% mais dopamina do que o meio de co-culturas de HÍB5-C (Fig. 5A) . No dia 21, a diferença foi 78% (Fig. 5B) e as contagens celulares mostraram que as co-culturas de HiB5-neublastina continham 66% mais neurónios imunorreactivos para tirosina hidroxilase do que co-culturas de HÍB5-C (P<0,05) (Fig. 5C). Isto indica que a neublastina segregada do clone HiB5pUbilzNBN22 tem um potente efeito de sobrevivência em neurónios dopaminérgicos porcinos embrionários. 103
Exemplo 8: Sobrevivência de Células de Gânglios das Raízes Dorsais em Meio Isento de Soro
Este exemplo mostra a actividade neurotrófica de um polipéptido de neublastina, em comparação com factores neurotróficos conhecidos.
Murganhos fêmea prenhes foram mortos por deslocamento cervical. Os embriões foram processados para cultura como se segue.
Foram utilizadas agulhas de tungsténio electroliticamente afiadas para dissecar gânglios das raízes dorsais de estádios indicados de murganhos C57/B16 (Mollegaard Breeding, Dinamarca). Os gânglios embrionários foram incubados, durante 5 minutos, a 37 °C, com tripsina a 0,05% (Gibco/BRL) em solução salina equilibrada de Hanks isenta de cálcio e magnésio. Os gânglios pós-natais foram tratados com colagenase/dispase a 1 mg/mL, durante 30 a 45 minutos e, depois, tripsina/DNAse a 0,25%, durante 15 minutos. Após remoção da solução de tripsina, os gânglios foram lavados, uma vez, com 10 mL de DMEM, contendo soro de cavalo inactivado por calor a 10% e foram suavemente triturados com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, para dar uma suspensão celular simples.
As células foram plaqueadas em placas de 24 poços (Nunc), que foram pré-revestidas com poliornitina (0,5 mg/mL, de um dia para o outro) e laminina (20 mg/mL, durante 4 h; Gibco/BRL) . Os neurónios foram incubados, a 37 °C , numa incubadora de CO 2 a 5% humidificada, num meio definido consistindo em Hams F14, suplementado com glutamina a 2 mM, albumina de soro bovino a 0,35%, progesterona a 60 ng/mL, putrescina a 16 mg/mL, 104 L-tiroxina a 400 ng/mL, selenite de sódio a 38 ng/mL, triiodotironina a 340 ng/mL, penicilina a 60 mg/mL e estreptomicina a 100 mg/mL.
Após 48 horas de incubação, os neurónios eram claramente reconhecidos pela sua morfologia bipolar, sob óptica de contraste de fase. A percentagem de sobrevivência neuronal, na ausência ou presença de factores tróficos (adicionados ao meio de cultura antes de plaqueamento dos neurónios a 10 ng/mL) ou de meio condicionado das células HiB5pUbilzNBN22 produzindo neublastina, foi avaliada através da contagem dos neurónios nos poços a 48 horas.
Os resultados destas experiências são apresentados na Fig. 9, em cuja figura: 0 representa a experiência de controlo (na ausência de factores); 1 representa experiências na presença de GDNF; 2 representa experiências na presença de Neurturina; 3 representa experiências na presença de Neublastina da invenção; E12 representa dados de experiências efectuadas em células DRG isoladas do dia embrionário 12; E16 representa dados de experiências efectuadas em células DRG isoladas do dia embrionário 16; P0 representa dados de experiências efectuadas em células DRG isoladas do dia de nascimento; P7 representa dados de experiências efectuadas em células DRG isoladas do dia 7 após nascimento e P15 representa dados de experiências efectuadas em células DRG isoladas do dia 15 após nascimento. 105
Estes resultados claramente mostram que o factor neurotrófico da invenção mostra actividades comparáveis ou ainda melhores do que as dos factores neurotróficos bem estabelecidos.
Exemplo 9: Efeitos In vivo de Neublastina em Neurónios de Dopamina Nigral
De modo a testar a capacidade de a neublastina (neublastina) proteger neurónios adultos de dopamina nigral (DA) da degenerescência induzida por 6-hidroxidopamina, foi empregue um modelo de rato de doença de Parkinson (Sauer e Oertel, Neuroscience 1994 59, 401-415) e transferência génica lentiviral de neublastina.
Produção de lentivirus: Para gerar um vector de transferência lentiviral codificando neublastina, pHR'-neublastina, um fragmento BamHl de 1331 pb de ADNc de neublastina foi subclonado no sitio BamHl/Bgl II de pSL301 (Invitrogen). Desta construção, um fragmento BamHl/Xhol de 1519 pb foi cortado e ligado no sitio BamHl/Xhol de pHR' transportando um fragmento pós-traducional de virus de hepatite de marmota americana (Zufferey R, Donello J E, Trono D, Hope T J. "Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors"; J. Virol. 1999 73 (4) 2886-2892). Para gerar pHR-GDNF, um fragmento BamHl/Xhol de 701 pb de pUbilz-GDNF foi ligado no sitio BamHl/Xhol de pHR'. A produção do vector lentiviral foi descrita por, e. g., Zufferey et al. (Zufferey R, Nagy D, Mandei R J, Naldini L. 106
Trono D: "Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo"; Nat. Biotechnol. 1997 15 (9) 871-875). Resumidamente, as construções de transferência e os plasmideos auxiliares pR8.91 e pMDG foram co-transfectados dentro de células 293T. Os viriões libertados dentro dos meios foram recolhidos a 48 e 72 h pós-transfecção. Para concentrar o vírus, os meios foram centrifugados 1,5 h, a 141000 g e o sedimento dissolvido em DMEM. 0 titulo de um controlo transportando o gene para a Proteína Verde Fluorescente ("GFP") foi determinado como sendo 108 unidades transformantes (TU)/mL por fluorescência de GFP em células 293T. Foi utilizada uma técnica de transferência de ARN slot (von Schwedler U, Song J, Aiken C, Trono D: "Vif is crucial for human immunodeficiency vírus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells"; J. Virol. 1993 67 (8) 4945-4955) para determinar o título de partícula virai. No sobrenadante de GDNF e sobrenadante de neublastina havia 10 vezes menos partículas, em comparação com o sobrenadante de GFP.
Processos Cirúrgicos: Todo o trabalho envolvendo animais foi conduzido de acordo com as regras fixas pelo comité Ético para Utilização de Animais de Laboratório na Universidade de Lund.
Um total de 21 ratos Sprague-Dawley fêmea adultos jovens (B&K Universal, Estocolmo, Suécia) foi utilizado e alojado sob um ciclo de luz:escuridão de 12 horas, com livre acesso a comida para rato e água. A marcação retrógrada e lesões de 6-OHDA foram realizadas 3 semanas antes da lesão, de acordo com Sauer e Oertel (Sauer e Oertel, Neuroscience 1994 59 401-415). Resumidamente, sob anestesia de Equitesina (0,3 mL/100 g) , os ratos foram injectados bilateralmente com 0,2 pL de uma solução 107 a 2% (dissolvida em NaCl a 0,9%) do rastreador retrógrado Fluoro-Gold (FG; Fluorochrome, Inc., Englewood, CO). As injecções foram preparadas utilizando uma seringa Hamilton de 2 pL, às coordenadas: AP= +0,5 mm; ML= ±3,4 mm relativamente a bregma; DV= -5,0 mm relativamente à dura e a barra incisiva regulada para 0,0 mm. Adicionalmente, 0,05 pL/min foram injectados, com outros 5 min deixados antes de a agulha ser recolhida.
Catorze dias após as injecções de FG, os animais receberam um total de 5 depósitos (1 pL/depósito) de um vector lentiviral transportando o gene para a proteína verde fluorescente (GFP), neublastina ou GDNF. Quatro dos depósitos foram para dentro do estriado, juntamente com dois aparelhos de agulha, às seguintes coordenadas: AP= +1,0 mm, ML= -2,6 mm, DVi= -5,0 mm DV2= -4,5 mm e AP= 0,0 mm, ML= -3,7 mm, DVj= -5,0 mm, DV2= -4,5 mm. 0 depósito supranigral foi preparado a AP= -5,2 mm, ML= -2,0 mm, DVi= -6,3 mm. A barra de dente foi fixa a -2,3 mm.
Vinte e um dias após marcação retrógrada e 7 dias após injecções lentivirais, os animais foram re-anestesiados e, com uma seringa Hamilton de 10 pL, um único depósito de 20 pg de 6-OHDA (Sigma; calculada como base livre e dissolvida em 3 pL de solução salina gelada, suplementada com ácido ascórbico a 0,02%) foi injectado dentro do estriado direito, na mesma localização que os depósitos de FG. A velocidade de injecção foi 1 pL/min, deixando outros 3 min antes de recolher a agulha.
Processamento de Tecido: Aos 21 dias após a injecção de 6-OHDA, os animais foram profundamente anestesiados com hidrato de cloral e transcardialmente perfundidos com solução salina (pH 7,4; temperatura ambiente), durante um min, seguido de 108 200 mL de solução de formaldeído gelada (paraformaldeído a 4% em tampão de fosfatos a 0,1 M, pH 7,4). Os cérebros foram dissecados e pós-fixos no mesmo fixador, durante 3-4 horas e, depois, transferidos para tampão de sacarose a 25%/fosfatos a 0,1 M, durante 48 horas. Cinco séries de secções de 40 pm através do estriado e substância nigra (SN) foram cortadas num micrótomo de congelação.
Avaliação Quantitativa de Neurónios Dopaminérgicos no SN: O número de marcados com FG na pars compacta do SN foi avaliado por um observador tornado cego, como descrito anteriormente (Sauer e Oertel, Neuroscience 1994 59 401-415). Em resumo, foram utilizadas três secções consecutivas centradas à volta do nivel do núcleo terminal medial do aparelho óptico acessório (MTN; -5,3 no atlas de Paxinos e Watson (1997)) e todos os neurónios marcados/corados lateralmente em relação a MTN foram contados, a ampliação de 40 x (n=6-7/grupo). Os neurónios marcados com FG eram incluídos se fossem brilhantemente fluorescentes sob epi-iluminação a 330 nm, exibissem um perfil neuronal e prolongassem, pelo menos, um processo neurítico.
No lado da lesão, em animais recebendo injecções de lentivírus transportando GFP, o número de neurónios nigrais positivos para FG foi reduzido para 18% daquele no lado intacto. Em contraste, os animais injectados com lenti-neublastina mostraram uma protecção quase completa do número de neurónios nigrais positivos para FG (89%). Isto foi tão eficiente como os animais tratados com lenti-GDNF, onde 87% dos neurónios marcados de modo retrógrado permaneceram no lado lesionado. Isto mostra que a neublastina é um potente factor de sobrevivência para neurónios de dopamina nigrais adultos e que é tão potente como GDNF . 109 A FIG. 6 é uma ilustração do efeito in vivo de neublastina produzida por lentivirus em neurónios de dopamina nigral. Os neurónios da pars compacta da SN, em ratos Sprague Dawley fêmea, foram marcados de modo retrógrado com Fluorogold (FG), 3 semanas antes de uma única injecção de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no estriado direito. Uma semana antes da injecção de 6-OHDA, os animais receberam injecções com vectores lentivirais expressando neublastina [neublastina], GDNF [GDNF] ou a Proteína Verde Fluorescente [GFP], como indicado na figura. Vinte e um dias após as injecções de 6-OHDA, foi determinado o número de neurónios marcados com FG em ambos os lados dos estriados. A figura mostra a percentagem [% de FG de lesão/intacto] de neurónios marcados com FG no lado lesionado (direito) versus o lado intacto (esquerdo) dos estriados dos três grupos de animais.
Exemplo 10: Produção de Anticorpos
Para preparar anticorpos contra neublastina, foram imunizados dois coelhos com o péptido 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminoácidos 108-124 de SEQ ID N° : 9) ou péptido 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 93-107 de SEQ ID N°: 9), conjugados a proteína transportadora, em intervalos de 3 semanas. Foram imunizados dois coelhos para cada péptido na semana 0, 3, 6 e 10 e os sangramentos foram recolhidos na semana 7 e 11. O segundo sangramento foi purificado por afinidade, por meio de uma coluna de afinidade peptídica. Os anticorpos foram denominados Ab-1 e Ab-2, de acordo com o péptido. 110
Transferência de western: 2 x 106 células HiB5, transfectadas de modo estável com o ADNc para neublastina (Hib5pUbilzNBN22) ou células HiB5 não transfectadas foram incubadas, de um dia para o outro, em meio isento de soro com suplemento de N2 (GIBCO) . O meio foi concentrado em pequenos concentradores com membranas de exclusão de 5 kDa (Millipore, Bedford, MA) . Às amostras concentradas foi adicionado tampão de amostra 5 x Laemmli e foram aquecidas a 95 °C, durante 5 minutos. As amostras foram separadas por electrof orese em gel de poliacrilamida de SDS em géis de acrilamida a 15% e transferidas para membranas de PVDF. Os sítios de ligação de proteína residuais foram bloqueados com leite magro desidratado a 5% em PBS, com Tween-20 a 0,1%. As membranas foram incubadas, de um dia para o outro, com um anticorpo de neublastina (1:1000), seguida de incubação com um anticorpo IgG anti-coelho ou anti-murganho secundário, conjugado a peroxidase de rábano (1:2000). A imunocoloração foi visualizada utilizando quimioluminescência melhorada Plus (ECL+), de acordo com as instruções do fabricante (Amersham). Os resultados destas experiências são mostrados na FIG. 3 e Exemplo 5.
Utilizando técnicas padrão, também foram deduzidos anticorpos policlonais de coelho contra os seguintes péptidos: Péptido R2 7: GPGSRARAAGARGC (aminoácidos 30-43 de SEQ ID N° : 9) ; Péptido R2 8 : LGHRSDELVRFRFC (aminoácidos 57-70 de SEQ ID N° : 9); Péptido R2 9 : CRRARSPHDLSL (aminoácidos 74-85 de SEQ ID N°: 9); 111 Péptido R3 0 : LRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 94-107 de SEQ ID N°: 9) ; 0 Péptido R31: STWRTVDRLSATAC (aminoácidos 123-136 de SEQ ID N°: 9) . Apenas os péptidos R30 e R31, relativamente próximos da extremidade C, reconheceram a proteína desnaturada sob condiçoes redutoras numa transferência de Western.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 865 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (120)..(719) <22 0> <221> 5'UTR <222> (1)..(119)
<22 0> <221> 3'UTR 112 <222> (721)..(865) <220> <221> péptido_sig <222> (120) .. (179) <220> <221> péptido_mat <222> (405) . . (719) <220> <221> estrutura_misc <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: Asparagina Glicosilada em Asn87 <220> <221> estrutura_misc <222> (426) .. (623) <223> DISULFID - Ponte dissulfureto Cys8-Cys73 <220> <221> estrutura_misc <222> (507)..(707) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Cys35-Cysl01 <220> <221> estrutura_misc <222> (519)..(713) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Cys39-Cysl03 <220> <221> estrutura_misc 113 <222> (616)..(619) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto intercadeia Cys72-Cys72 <400> 1 cfc&ggagocc afcgeccggec fcgatcfccsgc ccgsggacsg cccotccttg aggtccttcc €0 tccccaagcc cacetgggtg ccctcfcfctet ccctgaggofc ccacttgge-e tctccgogc 1.19 afcg cct gcc ctg tgg ccc acc ctg go gct cfcg gct ctg cfcg age age 167 Met -95 Pro A. Ia Leu Trp Pro -30 Thr Leu Ala Ala Leu -85 Ala Lexi Leu Ser Ser ~SD gtc gca gag gcc tcc etg ggrc tcc 9" cg CCC cgc «gc cct gcc ccc cgc 215 Vai Ala GIu Ai a Ser -75 Leu. Gly Ser Ala Pro -70 Arg Ser Pro Ala Pro -65 Arg gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg Sc g tcc ccc gcc «gc cac ct.g ccg ggs 263 G *i. u GX y .Pro Pro -50 Px'o Vai Leu Ala Ser --5S Pro Ala Gly His L&U -50 Pro Gly gg« cgc acg gcc cgc tgg tgc agfc 0 ç?sí aga gcc cgg cgg ccg cgc cgc 311 Gly Arg Thx -45 Ala Arg Trp Cys Ser -40 G Xy Arg' Ala Arg Arg -35 Pro Arçj Arg aga cac tfcc tcg gcc cgc gcc ccc gcc gcc tgc acc ccc afcc fcgc tefc 3 53 Arg His -30 Phe Ser Ala Arg Ala -25 Pro eea Ala Cys Thr -20 Pro 11 e Cys Ser tcc ccg cgg gtc cgc ccc gcg cgg ctg ggg ggc cgg gca g«g ego tcg 407 Ser -15 P.CO Arg Vai Arg Ala -10 Al a Arg Leu Gly Gly ~5 Arg Ala Ala Arg -i Ser 1 114 3SC age ggg ggc gcg ggg tgc ege ctg ege teg cag ctg gtg ccg gtg 455 Gly Sar gly Gly 5 Ala Gly Cys Arg· Leu 10 Arg Ser Glu Leu Vai 15 Pro Vai cg c gcg etc ggc ctg ggc cae ege tec g <3. c ctg gtg cgt ttc ege 503 Arg Ala Leu 20 Gly Leu Gly His Arg 25 Ser Asp Glu Leu Vai 30 Arg Phe Arg ttc tgc uoo ggc tec tgc ccg ege gcg ege tet cca esc gac ctc age 551 Phe Cys 35 Thr Gly Se- Cy* Pr o 40 Arg Ala Arg Ser Pro 45 His Asp Leu Ser ctg gcc age C ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ’,· ccg ggc tCG 509 Leu 50 AI a Ser Leu Ler Gly 55 Ala Gly Ala Leu Arg SO Pro Pro Pro Gly Ser 65 cgg ccc gtc age eag CCC tgc fcgc cga ccc acg ege tac gaa gcg gcc 647 Arg Pro Vai Ser Gcr 70 Pr o Cys Cys Arg Pro 75 Thr· Arg Tyr Glu Ala 80 Vai '· . ν.'Λ— ttc afcg guo gee aac íiCJC «Ã-vC tgg ege. acc gtg gac CCJC ctc tcc 655 Ser Pbe Met 85 Vai ;'*VíÍSax Ssr Thr Trp 50 Arg Thr Vai Asp Arg 55 Leu Ser gcc Ala acc Thr gcc Ala 100 tgc Cys ggc Gly tgc Cys ctg Leu ggc Giv 105 fcgagggcccg àtca&gggct tt ;geagsetg 749 g&ecctt&cc ggtggcfccSt cctgcctggg accctcccgc agagfccceac tagccágcgg 809 cetcagucsg ggacgaaggc cteassgctg agaggcccct gccggfcgggt gatgga 865
<210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Mét -•35 Pro Ala Leu Trp Pro “90 Thr Leu Ala Ala Leu -85 Ala Leu Leu Ser Ser -SO Vai Ala Glu Ala Ser “75 Leu Gly Ser Ala Pro -70 Arg Ser Pro Ala Pro -65 Arg Glu Gly Pro Pro -· 6 0 Pro Vai Leu Ala Ser -55 Pro Ala Gly Hi:3 Leu •50 Pro Gly Gly Arg Thr -45 Ala Arg Trp Cys Ser “40 Gly Arg Ala Arg Arg ~35 Pro Arg Arg 115
Arg Hís Ser .Ala Arg Ara Pró - 3 0 --25 Ser Pra Arg Vai Arg •Λ *» *v5. Jo J15, Ala Arg "1.5 -10 Gly Se.r Gly Ala r Gly Cys Arg Arg A.L S- Leu Gly Leu Gly His 7s >.νΛν 20 p ÍC Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pr o Arg 35 40 LíSU Ara Ser Leu Leu Gly Ala Gly 50 55 Arg Vai Ser Gin r ro Cys Cys 70 Ser Phie Met Asp- Vai Asn Ser Thr 85 ‘5 ... Thr Ala Gvs Gxy Cys Leu O .i. y 1 no A. v \> ^ n s; A v *3
Ai» U Ara /'λ vfv ONÍ-.-v· \vV &> ò. Pro Ile Cys Ser ^ *"> π Gly Gly Arg Ala Ai. a Arg Ser "· X i 5 o&u Arg Ser Gin Leu Vai Pro Vai Λ 15 Sox Asp Glu Leu Vai Arg Phe Arg 30 Ala Arg Ser Pro Asp Leu Ser íy XJ illa Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser 60 L5 Arg Pr o 75 Thr Arg Tvr Gj.u Ala 80 Val Trp 0 «“< Arg Thr Vai Asp Arg 95 <Lt&U
<210> 3 <211> 861 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)..(717) <220>
<221> 5'UTR <222> (1)..(6) <220>
<221> 3'UTR 116 <222> (718) . . (861) <220> <221> péptido. _sig <222> (7) . . (1 74) <220> <221> péptido. _mat <222> (298) . . (717) <220> <221> péptido. _mat <222> (370).. (717) <220> <221> péptido. _mat <222> (379).. (717) <220> <221> estrutura_mi <222> (661) . . (663) <223> CARBOHYD: Asparagina Glicosilada em Asnl22 <220> <221> estrutura_misc <222> (424)..(621) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Cys43-Cysl08 <220> <221> estrutura_misc <222> (505)..(705) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Cys70-Cysl36 117 <2 2 0> <221> estrutura_misc <222> (517) . . (711) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Cys74-Cysl38 <220> <221> estrutura_misc <222> (616)..(618) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto intercadeia Cysl07-Cysl07 <400> 3 yagecc afcg CCC ggc ctg ate tea gee ega gga c&g ccc cfcc cfct g&g 48 Met Pro Gly Leu 11® Ser Ala Arg Glv G.lft Pro .Leu Leu Glu - 35 -PO -85 gte cfct CCfc ccc caa gee cac ctg ggfc gee etc tfct etc cct gag gct $ Vai Leu Pro Pro Gin Ala His Leu Gly Ala Leu Phe LSU Pro Glu A ia -80 -75 -70 cca ett. ggt etc tcc gcg cag ccfc gee ctg tgg cec acc ctg gee gct r 44 Pro Leu Gly Leu Ser Ala Glu. Pro Ala Leu Trp Pro TAr Lsu Ala Ara ~65 -SC -55 erg gct ctg ctg age age gtc gea gag gee tce ctg ggc tcc gcg ccc 152 Lsu- Ala Leu LíSU Ser Ser Vai AI a Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro - 5 0 -45 -40 ege age eco gee ccc CCJO gaa ggc ccc ccg ect ÇJu.O* ctg gcg tcc ccc 240 Arg Ser Pro Ala Pro .Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Lsu Ala Ser Pro -•35 -3 0 -25 -20 gee ggc eae ctg ccg ggg gga ege acg gee ege tgg tge agt gge age 288 Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg -15 -10 -S gee cíjcí cgg ccg ccg ccg cag cct te t cgg ccc gcg cec ccg ccg cct 336 Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro -1 1 S 10 gea ccc cca tet gct ett ccc ege ggg ggc ege gcg gcg cgg g-cfc 3SS 384 Ala Pro Pro Ser" Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly 15 20 2S «gc ccg gge aae ege gct ' G g gea gcg cgg gcg cgg ggc tge ege ctg 432 Gly Pro Gly Aon Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Gly Cys Arg Leu 30 3 5 40 45 11
Ccg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg etc ggc ctg ggc cac cgc tcc 480 Arg Ser Gin Leu Vai 50 Pro Vai Arg Ala Leu 55 Gly Leu Gly Kis Arg 60 Ser gac gag ctg gtg cgt fcte ogc 11 c tgc age ggc tcc tgc cgc cgc gcg 528 Asp Glu Lau Vai 65 Arg' Phe Arg Phe Cys 70 Ser Gly Ser Cys Arg 75 Arg Ala egc tcc CCS cae gac ctc age ctg S'cc age cfca ctg ggc gee gsg gac 576 Arg Ser Pro 80 His Asp Leu Ser Leu 85 Ala Ser Leu Leu Gly 90 Ala Gly Ala ctg cga ccg ccc ccg ggc tce cgg ccc gtc age cag ccc tgc tgc cga 624 Leu Arg 95 Pro Pro Pro Gly Ser 100 Arg Pro Vai Ser Gin 105 Pro Cys Cys Arg ccc acg cgc tac oau gcg gtc tcc fcte ato gac gtc aac age acc tgg 672 Pro 110 Thr Arg Tyr Glu Ala 115 vai Ser Phe Met Asp 120 Vai Asn Ser Thr Trp 125 aga Arg acc Thr gtg Vai gac Asp ego Ara 130 ctc Leu cec Ser gee Ala aac Âsn ccc Pro 13S tgc Cys: ggc Gly tgc Cys ctg Leu ggc Gly 140 717 cgagggctcg etccagggcfc fcfcgcâgacfcg g&cccfctacc ggtggctefct cctgccfcggg 777 accctcccgc agagtcccac tagccagcgg cctcsgcçag ggacgaaggc ctcaasgctg 837 sgaggcccct geçggtgggt gatg S61 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 4
Met Pro Gly »35 Leu He Ser Ala Arg Gly »90 Gin Pro Leu Leu ~S5 Glu Vai Leu Pro Pro »80 Gin Ala His Gly Ala »75 Leu Phe Leu Pro »70 Glu Ala. Pro Leu Gly -65 Leu Ser Ala Gin Pro Ala »60 Leu Trp Pro Thr "55 Leu Ala Ala Leu Ala »50
Leu Leu Ser Ser Vai Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser »45 »40 ~35 119
Pro Ala Pro Arg 'S ·* -v G i y Pro Pro PXO Vai Leu Ala Ser Pro Asa Gly -30 — Λ -.o "20 Hxs Leu 'pV-rÇN Gly í'"' 'i \y yy A-V Arg Thr Ala Au o Cys Sar Gly Arg Ala Arg -15 “ Λ V.· -P Arg Pro pr- Pro dln Pro Ser .Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ara Pr Ο -1 ·; >“> 10 Ι 5 Pro Ser Ala Leu prc Arg Gly Gly Arg Âi.rA -Ala Arg' Ar s. Gly Gly Pro •>n 25 3 0 Gly Asn Arg ·>. ·* ... Arg Λ J. u Ala Gly Ala Arg. Gly Cys Ara Leu Arg 35 40 45 Leu ¥ a 1 Pro Vai Arg Ala nsu Gly XjUu w> .ty Bis Arg Asp Glu 50 55 60 Leu Vsx Arg Ph® Arg p Ua Cys Ser Gly Sar Cys Arg Arg Ala Arg Ser S5 70 η s~N / Λ-J Pro His Asp Len Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ma Λ-ύ ΐΟ Vi Arg .*> Λ V> \J 85 90 95 PxO Pro Pro Gly Q.írr Arg Pro vy„ ’< Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Ίπχ 100 105 110 Arg Tyr Gin Al & Va 1 Ser Plxu Met Asp Vai Asn S ''3 U Thr Tx~d Arg Γ5·?ν> ν' •UiA 115 1 O. Á V 12 5 Vai Asp Arg Ueu £sr Ais ASXX Pro Cys C- * v Cys Leu Gly 130 135 14õ <210> 5 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Em que Xaa na posição 134 designa Asn ou Thr e Yaa na posição 135 designa Ala ou Pro 120 < 4 0 0 > 5
Pro Px'o Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro λ 5 10 15 Ser Ai. a XíSU Pro Arg «--1 Giy Λ v,tfcv fU M Ala Ala Arg Ala Giy Giy Giy G 0 0 s 30 Asn Arg ΑΧ» Arg Ala Ara Giy Ala Arg Giy Cys Arg Leu Arg Ser Gin 35 40 4 5 nau Vai. Χ-ΧΌ '/ai. Arg AI a Leu Giy Leu Giy f·» X kí Arg Ser Asp Glu Goe S 0 55 60 V a a Arg irYlíi Arg Pfee Cys Ser Giy Ser Cys Arg Αχ O' Ala Arg Ser Pro 65 / 0 75 80 His Asp Leu Ssr Leu Ala Ser Leu Leu Giy Ala Giy Ala Leu. Arg P>"0 85 O íN 3 V SS Pro Pro Giy Ser Arg Pro Vai Ser Gin Pro Cys Cys Arg' Pro ApVv γ.» Arg 100 105 Λ ^ <A A, λ, \v Tyr V5 A.U VÃ Vai Ser Phe sv. Ac' v. Ast> vai Asn Pee X' $-\ Trp Λ x- Thr Vai 115 1 Λ Λ. Λ \.i 125 Asp Arg Leu Ser Axh Xaa Y cUi Cys Giy v.v i» Leu r>'« ..> X3 0 X 3 5 u
<210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Em que Xaa na posição 110 designa Asn ou Thr e Yaa na posição 111 designa Ala ou Pro <400> 6
Ala Ala Arg Ala Giy 01y Pxo Giy Aso Ar cr Ala Arg’ Ala Ais r\n. X). •^ϊα. y 1 à 10 15 Arg Giy Cys Arg Leu Arg r*'] ·».% i.: Λ * "U* \l Vai Pro Vai Arg Ala Leu -J /"V 2 5 30 121
Leu Gly Hí s 3 5 A.tcí Se?r Asp Giu 40 V yx A Arg· Phs Arg Phe 4«. Cys Ser Gly Ser Cys 50 Arg Arg Ala A AAt Ser Pro His Asp Leu Ser 60 1.615 A 7 3*ls A, CS. Ser Leu Lee 65 Gly «la λ>Λ' , < y. 'i ... Vír-u y rVX Cv ·ν·· ν^. 70 Pro Pro Pro vy .i. y 7 5. Ser Arg Pro Λ » Λ v ás. r Ser 80 Gin Pro Cys »rt í\ 1AÍV Ly» Ρν,Γ 85 Pro Thr Arg Tyr 51 u CJ0 Al<à Vai Ser Phe Met §5 Asp V&l Ser Thr Tsrp 100 Aro? Thr Vai Asp 105 Arg L·^; ui. S 0 λΓ Ala Xaa .i. JL. v Yaa Cys Gly Cys Leu A *>> 'V·* Gly
<210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Em que Xaa na posição 107 designa Asn ou Thr e <400> 7 Yaa na posição 108 designa Ala ou Pro Ala Gly .··*.- \ . v ύί .1. y Pro Gly Asn 5 Aro1 Ala Are Ala Ala 10 Gly Ala Are Gly 15 Cys Arg Leu A& Τ' Ser 20 Gin Leu Vai Pro Vai 25 Arg Ala Leu Gly 30 Gly Hí s Arg Oar ASp 3 5 « J.U rea Vin. Are? Phe 40 Arg Phe Cys Gly 4 5 Ser Cys Α^'χί Arg' Ala rs .»· W Arg Ser pro Hxe Asp 55 T Ser nau Ara Ser 60 Leu Gly 65 P V 1 £i uiSl-i. Arg Pro Pro i V Pro Gly Ser Arg Pro 7 5 Vai Ser Gin Pro Cys 80 122 ργ:
Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Vai Ser Phe Mefc Asp Vai Asa ftí:, OQ 9 5 v-> u·' Trp Arg Thr V&X Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Yaa Cys Gly vV & 100 105 110
Gly
<210> 8 <211> 861 <212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 0>
<221> CDS <2 2 2> (58) . . (717) <2 2 0> <221> 5'UTR <222> (1)..(57) <2 2 0> <221> 3'UTR <222> (718)..(861) <2 2 0> <221> péptido_sig <2 2 2> (58) . . (174) <2 2 0> <221> péptido_mat <2 2 2> (298) . . (717) 123 <220> <221> pépt ido. _mat <222> (370).. (717 <220> <221> pépt ido. _mat <222> (379).. (717 <220> <221> estrutura_misc <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: asparagina glicosilada em Asnl22 <220> <221> estrutura_misc <2 2 2> (424)..(621) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Gly43-Glyl0 8 <220> <221> estrutura_misc <222> (505)..(705) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Gly70-Glyl36 <220> <221> estrutura_misc <222> (517)..(711) <223> DISULFID: Ponte dissulfureto Gly7 4-Glyl3 8 <220> <221> estrutura_misc <222> (616)..(618) 124 <223> DISULFID: Ponte dissulfureto intercadeia Glyl07-Glyl0 7 <400> 8 aggagcrgtgg ggg&aeagpt eaacaafcggc tgatgggcgc tcctggfegtr. gatagag 57 ata gaa cta gga ctt gga ggc cac tcc acg cfcg t-cc esc tgc ccc tgg 105
Met Glu Leu <31y Leu GXy Sly Las Ser Thr Leu Ser His CVs Pro Trs? -80 "75 -70 -65 125 ccfc agg cgg cag cot gee etg tgg ccc acc etg gee gcfc etg gct etg Λ W «»· Pr ο Arg Arg Gin Pro -50 .Ala Leu Trp Pro Thr -55 Leu AI-a Ala Lsu Ala -50 Lao etg age age gfcc gea gag gee tcc etg ggc tcc «cg ccc; ege age ccfc 201 Leu Ser Ser Vai "45 Ala Glu Ala Ser Leu -40 Gly Ser Ala Pro Arg -35 Sér Pro gee ccc ege gaa SSfo ccc ccg cot çrfcc etg gcg 'tcc ccc gee ggc cac 249 Ala Pro Arg -3 0 Glu Gly Fro Pro Pro -25 Vsl Aj,a Ser Pro -20 Ais Gly His ctg ecg ggg ssra ege acg gex: ege tgg tgc agt gga aga gee egg cgg 297 Lsu Pro -15 Gly Gly Arg Thr Ais -IO Arg Trp Cys Ser Gly ~5 Arg Ala Arg Arg -1 ccg ccg ccg cag ccfc fc.efc cgg ccc gcg ccc ccg ccg ccfc gea ccc cca 345 Pro 1 Pro Pro Gin Pro 5 Ser Arg Pro Ala Pro 10 Pro Pro Pro Ala Pro IS Pro tct gcfc cfcfc CCC ege ggg ggc ege gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc 393 Ser Ais Lsu Pro 20 Arg Gly Gly Arg Ala n a Ala Arg Ala Gly Gly 30 Pro Gly age ege gct; cgg gea gcg ggg gcg cgg ggc tgc ege otg ege fccg c&a 441 Ser Arg Ala 35 Arg Ala AI a Gly Ala 40 Arg Gly Cys Arg Leu 45 A.rg Ser Gin cfcg gcg ccg gfcg ege gcg ct.e ggc etg ggc cac ege tcc gac. gag etg 489 Leu Vai 50 Pro Vai Arg Ala Leu 55 Gly Lsu Gly His Arg 60 Ser Asp Glu Lsu gtg cgfc ttc ege ttc tgc age ggc tcc tcc ege ege gcg ege tcc CCíí 53? Vai SS Arg Phe Arg Phe Cys ?C> Ser Gly Sé ι Cys Arg 75 Arg Ala Arg Ser Pro 00 cac gac etc age etg gee age cfca οί.® ggc gee ggg gee etg ega ccg 5B5 Kis Asp Leu Ser Leu 85 Ala Ser Leu Lei: Gly 90 Ala Gly Ala Leu Arg 95 Pro ccc ccg ggc ccc cgg ccc guo age cag c c c tgc tgc CC;Cl v C CTi acg ege 633 Pro Pro Gly Ser 100 Arg Fro Vai Ser Gl n 105 Pro Cys Cys Arg Pro 110 Thr Arg fc.se gaa gcg gee tcc t: fcc atg gac gtc sac age aec tgg aga acc gfcg 681 Tyr Gl» Ala 115 V&i Ser Phe Met Asp 120 Vai Asn Ser Thr Trp 125 Arg Thr Vai 126 126 gac cgc cfcç tcc gec ace gcc tgc ggc tgc cfcg ggc fcgagggotcg Aep Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 13'δ 135 ct ccagggct 11gcagactg gacccfctacc sgagtcccac fcagccagcgg cctcagccag accggtgggt gatg 140 ggtgget.sfct cctgcatggg acectcccgc 787 ggacgaaggc cte&aegctg sgaggçcccfc 84? 861 <210> 9 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Mefc -80 Glu Li eu Gly Leu Gly Gly -75 Leu Pro Arg Arg Gin Pro -60 Ala Leu Trp Leu Ser Ser Vai -45 Ala Glu Al a Ser Ala Pro Arg -30 Glu Gly Pro Pro Pro -25 Leu Pro Gly Gly -15 Arg Thr Ala. -10 Arg Pro 1 Pro Pro Gin Pro 5 Ser Arg Pro Ser Ala Leu Pro <ώ Arg Gly Gly Arg Ser Arg Ai a 35. Arg Ala Ala Gly Ala 40 Leu Vai 50 Pro Va 1 Arg Ala Leu 55 Gly Vai 65 Arg Phe Arg Phe Cys 70 Ser Gly His Asp Leu Ser Leu 85 Ala Ser Leu
Ser Thr Leu -70 Ser His Cys Pro Trp -65 Pro Thr -55 Leu Ala Ala Leu Ala -50 Leu Leu -40 Gly Ser Ala Pro Arg -35 Sar Pro Vai Leu Ala Ser Pro -20 Ala Gly His Trp Cys Ser Gly -5 Arg Ala Arg Arg -X Ala Pro 10 Pro Pro Pro Ala Pro 15 Pro Ala 25 Ala Arg Ala Gly Gly 30 Pro Gly Arg Gly Cys Arg Leu 45 Arg Ser Gin Leu Gly His Arg 60 Ser ASp Ciu Leu Ser Cys Arg 7 5 Arg Ala Arg Ser Pro 80 Leu Gly 90 Ala Gly Ala Leu Arg 95 Pro 127
Pro Pro Gly Ser .Λ Λ W V Arg Pro Vai Ser Gin Pro 105 Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr 02u Ala 115 Vai Ser Phe Mefc Asp i f\ í. U u Vai Asn Ser *rbr Trp 125 Arg phr Vau Asp Arg Ί Λ Js, >./ Leu Ser Thr Ala 135 rs€V Gly Cys Leu Gly 140
<210> 10 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <221> CARBOHYD <2 2 2> (122) <223> asparagina glicosilada <400> 10
Pro Λ Ο Pro Gin Pro Ser A \Λ Αν s*>r V Pro àXu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro J. 5 10 15 Ser Àvi· Ã Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg AiU Gly Gly Pro v? X V 20 25 30 Arg Ale. Arg Ala Ala Gly Ala Arg οΊν Cys Arg Leu Arg ,s-, .s.s Gin 35 40. 45 Leu Val Pro Val Arg A r a Leu Gly Leu Gly Hia Arg S o r Asp iiisi â Leu 50 55 60 V&l Arg ST AiW Arg Phe cys Ser i*^ "Ί t. »· VlT j, ^· Cys .Arg Au cr Ala Arg Ser Pro 65 70 75 80 Hí s Asp Leu Por vi. Ala Ser T . :ή·* ι m V VV. Leu v*·^ Ala Gly Ala Leu Arg Pro $ s; Si .y> 30 Pro Pro ,-Ι N , , Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 100 * n n sV V w * f\ X si. V Tvr W d- VA Ala V&l Bar ΡΠ*ΐ3 Mec Asp Ya X Asn .Ser* Thr Trp Arg «NV -V .V J. i.i. V&l -? 1 5X Λ <·.·’ ·"$ *** Λ Jw ώ V.· 1 *> Sl -is w’ 140 128 g Leu Ser Ala 0 135
Cys Le'
<210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARBOHYD <222> (98) <223> asparagina glicosilada <400> 11
Ala Ala Αχ-g Ala Gly 3 Gly Px'o Gly Ser Arg 19 Ala Arg Ala Ala Gly Ala 15 Ârg Gly Cys Arg 20 vi- Arg Sar Gin Leu 25 vf. N v&x Vai Arg Ala 30 Leu Gly G J-V A-l S 35 .Arg Ser Asp r* Λ í Leu. Vai A Cv. 4ki; Phe Arg Pbe Cys 45 Ser Gly- Ser Cys Arg sn ^ V Arg Ala Αχ1 Cf Cav W Λ, ^ 'Λ Pro His Asp Lsii Ser 60 Ser Leu Leis Gly Ala 65 Gly Ai. a -*? Λ > v Arg Pro Pro .e'l 0 Gly 7 5 Sst Arg Pro Vai Ser 80 Gin. Pr o Cys Arg 85 Pro T.hr Arg Tyr v*,.· X 90 Ala V-SvX Ser Phe Mat Asp 95 Vai Asm Ser 'Ahr 100 Trp Ax'cj Vai Asp 105 Arg Leu Ser Ala Thr 110 Ala Cys Gly Cys Leu 115 Gly <210> 12 <211> 113 129
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> CARBOHYD <222> (95) <223> asparagina glicosilada <40 0> 12
Ala Gly Gly Pro ΛΝ >· ,v v O o>. V D Ser Axc? Ala Ar ci Ala ·> Λ i.v; Ala Gly Ala Arg Λ'! ,v GxV Ί 5 Cys Arg leu Ârçs Ser 20 Gin Vai "PW"'' A 'SJ Vai 25 Arg Ax n Í;á'U Gly 30 Gly His Arg Ser Asp Gm λ leu Vai Arg Phe 40 Arg Phe Cys Ser Gly 45 Ser Cya Arg Arg Ala 50 Arg Ser Pro His Asp 55 Leu Ser Leu A.í.si Ser so i-pm Leu Gly Ai Si Gly 65 Ai. a leu .Arg Pro Ws 70 PXO Gry Ser Ara Pro 75 Vai Ser Gin Pro Cys 80 Cys Arg Pro Thr Arg 85 £ “· Gin Ala Vai Ser 90 Met Asp Vai. Asn 95 Ser Thr Trp Arg Thr X i.* n Vai Asp Arg Leu ^ ÍJ* 1*' 105 Ala Thr Ala Cys ¢1 "· χ v «ry -i * <L V yv., <wj/ .¾ Leu
<210> 13 <211> 102 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 ostggecagi eeagccefcg· ctaetgggcg cuggggcect gogaecgesc ccgggc ".gccgaccca cgcgctacgs agcggfcetce tfc :ce ggecegtc&g 60 130
<210 > 14 <211> 220 <212> ADN <213> Murinae gen. sp. <400> 14 ggccaGcgct ccgaegsgct gatacgfcttc cgcfctctgca gcggctcgtq cagceg&gca 60 cgctccc&gc aegafcctcag teaggccage ctactgggeg ctggggccct acggtcgcct. 120 ccegggtccc ggccgatcag ccagccctgc tgccggocca ctcgcfcatga ggccgtcfccc 180 ttcacggacg tgaacagcac cfcgg&gaacc gtggaccgcc 220 <210> 15 <211> 2136 <212> ADN <213> Murinae gen. sp. <2 2 0> <221> CDS <2 2 2> (975 0 ..(1646) <400> 15 gcggccgcga atfccggcacg s.gggcgtetc gcfcgcagccc gcgstebcfca cfcctgcctcc «0 -'«sggfcctfcc tec-aaatgtc ta.gc.cccc&c etagagggac ctagcctagc cagcggggac 120 cggatccggs gggtggagcg gcsaggtígag ccctgaaag.g tggggçgggg ç cgç t. 180 ctgggcccca ceccgggatc tggtgacgcc gsS'9-fcÇígaa fcttgaaaccg gacggeggcg 240 ggcaggaggc fcgctgaggga tgg&gttggg cfccggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300 gccagcaaca agtccctegc? gccccagcxc tc:gcfcgcQ-&í: tggggcttgg agccofcgosc 360 cca&gggcsc agaccggctg çcasggcccc acfctttaact ã&aagaggcg ctgccaggtg 420 vâcaaetcfcg ggcatgatsc aefctgagctc c-Sg&SSfa&s-S cccagcactg gtccçaggag 480 aggcgcctag aaggacasgg accaggaeec ctztggt&tg gagtgaacgc tgsgcatgga 540 131 gtggaaggaa eagagc&gaa c a c a o ga t c L tgacctfcgtg tctceatcgc egsgagactg casgcfcgceg etcsagtt&c gggftcttaga ctgagctcag geatcgcgsa. agctaccgcfc gegtggaagg eaggaagagg fc&ctttetec agacaggacc ctgagccttg gg a sc ag g t c gctgagctga aggaataccc gtggggáa&c
aaccaccetg gfcaccttcag ccofcgaagta SôO acagctgcgt gagtcteccc cctgsggcct S6'ô tttgcceafcc tggagsagtg agccatfcgat 720 ctcccaagca ccfcaacaeag agagcaaggt 780 ctctagctac tccaacctce tgggtcgctt 840 caaaggataa cta&ctc&tc ztts&gtttg 800 gggtec&cga sggcttctga tgggagcttc SSO tggagccgaa agct atg Met 1 gaa Glu ctg Leu S0a Gly ctt Leu S gea Ala gag Glu cct Pro ac fc Thr gea Ala 10 ttg Ls;u tcc Ser 1010 ca c tgc cfce cgg cct agg tgg cag tea gee tgg tgg cca acc cta gct 1058 His Cys Lee 15 Arg Pr o Arg Trp Gin 20 Ser Ala Trp Trp Pro 2S Thr Leu Ala gtt cta gee ctg ctg age tgc gte aea gaa gct tcc ctg gac cca atg 1106 Vai Leu 30 Ala Leu Ler Ser Cys 3S Vai Thr Glu Ala Ser 40 Lsu Asp Pro Mst tcc cgc age ccc gee gct cgc gac ggt ccc tea ccg gte ttg gcg CCC 11S4 Ser 45 Arg Ser Pro Ala Ala 30 Arg As p <3Ày Prc Ser SS Pro Vai Lgu Ala Pro 60 ccc scg gac cac ccg cct SOS SSa cac aet Scg eat ttg tgc age gaa 1202 Pro Thr ASD His Leu 65 Pro Gly Gly His Thr 70 Ala His Leu Cys Se χ-Ιο Glu sg® &CC erg cga ccc ccg cct cag tet cct cag ccc gea ccc. ccg ccg 1250 Arg Thr Lee Arg 80 Prc Pro Pro Gin Ssr 85 Pro Glu Pro Ala Prc se- Pro Prc cet ggt ccc gcg etc cag tet cct ccc gct gcg etc cgc ggg gea cgc 1298 Prc Gly Prc 95 Ala Leu Gin Ser Pro 100 Pro Ala Ala Leu Arg 105 Gly Ala Arg ccg gca cgt gea gea acc cgg age: age cgc gea tgg •acc aça gat gcg 1346 Ala Ala ilO Arg Ala Gly Thr Arg 115 Ser Ser Arg Ala Arg 120 Thr Thr Asp Ala ego qgc tgc cgc ctg C.· wf >,·. fccg cag ctg Stg ccg gtg age gc g etc cpc 13.94 Aro 125 Gly Cys Arg Lati Arg 130 Ser Gin Leu Vai Pro 135 Vai Ser Ala L&u Gly 140 cta ggc cac age Ccc gac £fsg ctg ata cgt fcte cgc ttc tgc age ggc 1442 Laa Gly His Ser Ser 143 Asp Glu Lee lis Arg 150 Phe Arg Phe Cys Ser 153 Gly tcg tgc cgc cga gea c g .. tec cag vtí.C gst etc agt ctg gee age cta 1490 Ser Cys Arg Arg 160 Ala Arg Ser Gin His 165 Asp Leu Ser Leu Ala 170 Sor Leu 132 ctg ggc gcfc SSG gee cta cgg teg ccí: ccc sss Lee cgg «cg ate açc IS 3 8 La a Qly Ala 175 Gly Ala Lsu Arg Ser ISO Pro Pr o Gly Ser Arg 185 Pro 11 e Ser cag cce tgc tgc cgg ccc açs ege fcat gag geo gtc fccc 11 c atg gac 1586 Gin Pr o 190 Cys Cys Arg Pro Thr 1.95 Arg Glu Ala Vai 290 Ser Phe hiet Asp gtg a&c age acc tgg SSS acc gtg gac eao cte ccc gee act gee tgc. 1634 Vai 20S Asn Ssr Thr Trp Arg 210 Thr Vai Asp Kiss Leu 215 Ser Ala Thr A.í. a Cys 220
ggc tgt etg ggc fcgsggatgat ctatctccaa ycettcgcac actagaoeca 168S
Gly Cys Leu Gly tgtgrfcgccé uaectggaac agctccaeeg ggecfccacts accaggagcc tcaacteugc 1745 aggafcatgga ggetgeagag efccsggeecc aggccggtga gtgac&gaeg fccgfccggcafc 1805 gae&gseaga gtgaaagatg tcggaaccac tgaccaacag tcccaagttg fcteatggatc 1S66 ccagctctae agscaggaga saccteagct aasgagaact cctefcgggag aafcecag&as 1826 tegyeeefcctg tcetggggaa tgaattfctga agagatatat atacafe&fcat acattgtagt 1.886 cgcgttgctg gaccagcctg tgctgaaaec agtccegfcgt tcacfctgtgg aagecgaagc 2046 eetatttatt atttcfcaa&t tafcttsttta ctfctgaa&aa aaacggeca» gteggcetcc 2106 ctttagtgag ggtfcaatfctg tgatcecggg 2136
<210> 16 <211> 224 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <40 0> 16
Kefc 1 Glu .Lee Gly Leu Ala 5 Glu Pro Thr Ala 10 Leu Ser HiS Cys Leu 15 Arg Pro Arg Trp Gla 20 Ser Ala Trp Trp Pro 25 Thr Leu Ala Vai Leu 30 Ala Leu Leu Ser Cys 35 Vai Thr Glu Ala Ser 40 Leu Asp Pro Met Ser 45 Arg Ser Pro Alâ Ala 50 Arg Asp Gly Pro Ser S5 Pro Vai Leu Ala Pro 60 Pro Thr Asp Hís 133
Pro Gly <5ly Hl s Thr Ala Eis> Leu Cys Ces Glu ÂiT0 Thr jlj eu Arg 65 70 75 80 Pro 'Pro Pro Gin Sor Pro Gin Pro Ala Pro F;ro Pro Pro Gly Pro Ala 85 .90 95 Leu Gin Pro Ala Âi.a Leu íi v^íT ΑλΑ· Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala 100 1 ftSX Λ. V -v^ 110 y Thr Ser Ser Ar 9 A À. a Arg \v‘nr Asp Ala Arg Gly Cys Ax'g 115 "5 '? A Λν W Leu Λ A»V V} Ser /**»" Leu Vai Pro Vai Ser Ala Leu Leu Gly Kis Ser Λ 135 140 Ser Asp G,lu Leu Ile &-?"&· Arg Phe Cys Ser Gly Cys Aro' Arg ί 4 3 ISO 155 160 Arg Ser • ^ Ί Kis Asp teu Ser Leu •js q ,, Ser Leu Gly Aviei Gly 165 Λ f\ A 0 175 Ala Leu Ax'9 Ser Ρ3ΓΟ Pro Gly Ser Arg Ρτ·ς Ile Ser Qln Pro Cys Cys i,&0 185 150 Arg Pro Thr Arg Tyr ôlu Ala Vai. Ser Phe 1' Asp X V .v. -j Sf <.AvÁ. Asn Ser Thr 195 200 205 Trp AstC? r?^vy. Vai Asp His Leu Ser Ala Thr Ai Λ Cys Cys Gly π Λ/ί,ν 215 220
<210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <40 0> 17 cctggccagc ctactggg 18 <210> 18 <211> 20 134 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 18 aaggagaccg cttcgtagcg 20 <210> 19 <211 > 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 19 atggaacttg gacttgg 17 <210> 20 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <40 0> 20 tccati caccc accggc 16 <210> 21 135 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 21 ggccaccgct ccgacgag 18 <210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 22 ggcggtccac ggttctccag 20 <210> 23 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 23 ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc 29 136 <210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Seguência Artificial <220> <223> Descrição de Seguência Artificial: Iniciador de PCR <400> 24 catcacccac cggcaggggc ctctcag 27 <210> 25 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 25 gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca 35 <210> 26 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 26 ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc 34 137
<210> 27 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sonda de
Hibridação <400> 27 ncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g 31
<210> 28 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 28 ctaggagccc atgccc 16
<210> 29 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 afggctgg&g gaccgggat gtgct.cgt ^.agcaggag cacgtggsfg fcogfccfcgcgt 60 138 tçtca&cçag tgcaggtgcg tgcactcgg® ctgggac&cc gtfeccgacgs actagt&cgt 120 tttcgfctttfc gfcteaggate ttgt.cgtcgfc gcacgfctctc cgcatgatct atctefeagca 180 tctctactag gagcçggage açtaagaccg ccgccgggafc ctagacctgfc ac.ctcaacct. 240 tgttgtagac cú&ctagata cg&agcagfca tcfctte&cgg acgt&aactc tseafcggags 300 accgtagata gacfcatotgc aascgc&tgt ggctgtctag gatg&ta&fca g 351
<210> 30 <211> 414 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 30 afcgggccase atcatcatca tcatcafcc&t cafce&ctcga gcggccatat çgaçgaçgac 60 gacaaggcfcg gaggaccggg atctcgtgct cg t gcag cag gagcacgtgg otgacgtctg 120 cgttatca&c tagfg-ccggt gcgtgcactc ggactgggaç acegttccga cgaacfc&gta ISO cgttttcgtt tfctgfcfccagg atcttgtcgt cgtgcacgtt ctccgcatga tct&tcfccta 240 gcafcctct&c taggagccgg ageactsaga ccgccgccgg gatct&çacc tgtstctcaa 300 cctfcgttgta gacctactag atscçraagça gtafccfctfcca tgg&cgtaaa ctcts.ea.tgg 360 agaaccgtag atagacfcatc tgcaaccgca fcgtggctçjtc taggatgata atag 414
<210> 31 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 31 39 aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 139 <210> 32 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 32 ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 39 <210> 33 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador <400> 33 gagcgagccc tcagcc 16
Claims (47)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido de Neublastina isolado, codificando um polipéptido que possui actividade neurotrófica, em que o polinucleótido é seleccionado do grupo consistindo em: a) um polinucleótido compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID N°: 1, b) um polinucleótido codificando um polipéptido de Neublastina ou um polipéptido dai derivado, em que a parte madura do referido polipéptido exibe um grau de identidade de, pelo menos, 90% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N°: 2; c) um polinucleótido que se híbrida especificamente, sob condições de solução de hibridação de elevada estringência, ao ácido nucleico tendo a sequência nucleotidica complementar de SEQ ID N°: 1; d) um polinucleótido compreendendo uma sequência nucleotidica que é, pelo menos, 70% idêntica à sequência polinucleotídica apresentada como SEQ ID N°: 1.
2. Polinucleótido da reivindicação 1, em que a parte madura do polipéptido codificado exibe um grau de identidade de, pelo menos, 95% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N°: 2.
3. Polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado consiste nos aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N°: 2.
4. Polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado é SEQ ID N°: 2. 2
5. Polinucleótido da reivindicação 1, em que 0 polipéptido codificado é SEQ ID N° : 4 .
6. Polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado é SEQ ID N° : 5.
7. Polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado é SEQ ID N° : 6 .
8. Polinucleótido da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado é SEQ ID N°: 7.
9. Polinucleótido da reivindicação 1, compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 3.
10. Polinucleótido da reivindicação 1, compreendendo uma sequência nucleotidica sendo, pelo menos, 80% idêntica à sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N°: 1.
11. Polinucleótido da reivindicação 1, compreendendo uma sequência nucleotidica sendo, pelo menos, 90% idêntica à sequência polinucleotidica apresentada como SEQ ID N°: 1.
12. Vector de expressão compreendendo o polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Célula hospedeira isolada compreendendo o vector de expressão da reivindicação 12.
14. Célula da reivindicação 13, em que a referida célula é uma célula eucariótica. 3
15. Célula da reivindicação 14, em que a referida célula é seleccionada do grupo consistindo numa célula de mamífero, numa célula fúngica e numa célula de levedura.
16. Célula da reivindicação 15, em que a referida célula de mamífero é seleccionada do grupo consistindo numa célula de ovário de hamster Chinês, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b e uma célula estaminal neural humana.
17. Polipéptido em que a parte madura do referido polipéptido exibe um grau de identidade de, pelo menos, 90% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N° : 2, em que o referido polipéptido possui actividade neurotrófica.
18. Polipéptido da reivindicação 17, em que a parte madura do referido polipéptido exibe um grau de identidade de, pelo menos, 95% com os aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID N°: 2.
19. Polipéptido da reivindicação 17, sendo um polipéptido de factor neurotrófico de Neublastina, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID N°: 2.
20. Polipéptido da reivindicação 17, sendo um polipéptido de factor neurotrófico de Neublastina, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID N°: 4.
21. Polipéptido da reivindicação 17, sendo um polipéptido de factor neurotrófico de Neublastina, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID N°: 5. 4
22. Polipéptido da reivindicação 17, sendo um polipéptido de factor neurotrófico de Neublastina, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID N°: 6.
23. Polipéptido da reivindicação 17, sendo um polipéptido de factor neurotrófico de Neublastina, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta em SEQ ID N°: 7.
24. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 17 a 23, em que o referido polipéptido está glicosilado.
25. Polipéptido que possui actividade neurotrófica e é codificado por um polinucleótido de qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
26. Método de preparação do polipéptido de qualquer uma das reivindicações 17 a 25, o referido método compreendendo a etapa de expressão do referido polipéptido a partir de um polinucleótido de factor neurotrófico de Neublastina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11.
27. Método da reivindicação 26, compreendendo a etapa de cultivo de uma célula de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 16, compreendendo o referido polinucleótido de factor neurotrófico de Neublastina num meio de cultura que permite a produção do referido polipéptido.
28. Método da reivindicação 27 compreendendo, adicionalmente, a etapa de recuperação do referido polipéptido a partir do referido meio de cultura. 5
29. Método da reivindicação 28, em que o polipéptido está purificado.
30. Composição compreendendo o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 17 a 25 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
31. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25 para utilização como um medicamento.
32. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença neurodegenerativa.
33. Utilização da reivindicação 32, em que a doença neurodegenerativa envolve neurónios lesionados e traumáticos.
34. Utilização da reivindicação 33, em que os neurónios lesionados e traumáticos são seleccionados de uma ou mais de lesões traumáticas de nervos periféricos, da medula e da medula espinal.
35. Utilização da reivindicação 32, em que a doença neurodegenerativa é seleccionada do grupo consistindo em dano neuronal isquémico cerebral, neuropatia, neuropatia periférica, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e deficiência de memória ligada a demência. 6
36. Utilização de qualquer uma das reivindicações 32 a 35, em que a doença neurodegenerativa é neuropatia periférica.
37. Polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25 para utilização no tratamento de uma doença neurodegenerativa.
38. Polipéptido da reivindicação 37, em que a doença neurodegenerativa envolve neurónios lesionados e traumáticos.
39. Polipéptido da reivindicação 38, em que os neurónios lesionados e traumáticos são seleccionados de uma ou mais de lesões traumáticas de nervos periféricos, da medula e da medula espinal.
40. Polipéptido da reivindicação 37, em que a doença neurodegenerativa é seleccionada do grupo consistindo em dano neuronal isquémico cerebral, neuropatia, neuropatia periférica, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e deficiência de memória ligada a demência.
41. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 37 a 40, em que a doença neurodegenerativa é neuropatia periférica.
42. Sequência de ácidos nucleicos de iniciador de PCR consistindo em qualquer uma das sequências expostas em SEQ ID N°: 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 ou 28.
43. Método de produção de qualquer um dos polipéptidos expostos em SEQ ID N° : 2, 4, 5, 6 ou 7, compreendendo o cultivo de 7 uma célula que contém qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos expostas em SEQ ID N° : 1 ou 3, sob condições permitindo a produção do polipéptido e recuperação do polipéptido do meio de cultura.
44. Método para a produção de um polipéptido de Neublastina de qualquer uma das reivindicações 17 a 25, o método compreendendo: a) a introdução de um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 que codifica em expressão para um polipéptido de Neublastina dentro de uma célula ou a introdução de uma sequência reguladora por recombinação homóloga dentro de uma célula, de modo a que a sequência reguladora regule a expressão de um gene endógeno de Neublastina, para preparar uma célula de produção de Neublastina; b) o cultivo da célula de produção de Neublastina, sob condições de cultura que resultam na expressão de um polipéptido de Neublastina.
45. Gene sintético codificando um polipéptido de Neublastina, o gene sintético compreendendo uma sequência exposta em SEQ ID N°: 29 ou 30 .
46 . Péptido de Neublastina consistindo em qualquer das sequências seguintes: GPGSRARAAGARGC (AA 30-43 de SEQ ID N°: 9); LGHRSDELVRFRFC (AA 57-70 de SEQ ID N°: 9); CRRARSPHDLSL (AA 74-85 de SEQ ID N°: 9); LRPPPGSRPVSQPC (AA 94-107 de SEQ ID N°: 9); STWRTVDRLSATAC (AA 123-136 de SEQ ID N°: 9); CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA 43-70 de SEQ ID N°: 9); CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA 74-107 de SEQ ID N°: 9); CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA 108-136 de SEQ ID N°: 9); CRPTRYEAVSFMDVNST (AA 108-124 de SEQ ID N°: 9); ou ALRPPPGSRPVSQPC (AA 93-107 de SEQ ID N°: 9). Anticorpo que se liga especificamente a qualquer dos péptidos da reivindicação 46.
47 .
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- 2011-04-11 US US13/084,267 patent/US20120252726A1/en not_active Abandoned
- 2011-11-29 CY CY20111101173T patent/CY1112101T1/el unknown
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