JP2002519061A - 神経栄養因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ニューロブラスチンポリペプチド、ニューロブラスチンポリペプチドをコード化する核酸及びニューロブラスチンに特異的に結合する抗体並びにこれを調製する方法及び使用する方法に関する。
Description
【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は神経栄養因子ポリペプチド、神経栄養因子ポリペプチドをコード化す
る核酸および神経栄養因子に特異的に結合する抗体に関する。
る核酸および神経栄養因子に特異的に結合する抗体に関する。
【０００２】 従来の技術 神経栄養因子はニューロン細胞およびニューロン組織の生存を促進し、表現型
分化を維持し、変性を防ぎ、活性を増進する、天然のタンパク質である。神経栄
養因子は神経組織、および神経系によって支配される非神経組織から単離され、
機能的および構造的に関連するグループ（ファミリー、スーパーファミリーまた
はサブファミリーとも呼ばれる）に分類されている。神経栄養因子スーパーファ
ミリーには、線維芽細胞成長因子、ニューロトロフィンおよびトランスフォーミ
ング成長因子β（TGF-β）スーパーファミリーが含まれる。神経栄養因子の個々
の分子種は、それらの物理的構造、それらの複合受容体との相互作用および様々
なタイプの神経細胞に対するそれらの作用によって識別される。TGF-βスーパー
ファミリー（Massagueら, Trends in Cell Biology, 1994, 4, 172-178）に分類
されるものには、GDNF、パーセフィン（persephin）（「PSP」；Milbrandtら, N
euron 1998, 20, 245-253、参考文献としてここに援用する）およびニュールツ
リン（neurturin）（「NTN」；WO 97/08196、参考文献としてここに援用する）
を包含するグリア細胞由来神経栄養因子リガンド（「GDNF」；WO 93/06116，参
考文献としてここに援用する）がある。GDNFサブファミリーのリガンドは共通し
て、RET受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を誘導する能力を持ってい
る。GDNFサブファミリーの上記3つのリガンドは、神経栄養受容体のファミリー
、
分化を維持し、変性を防ぎ、活性を増進する、天然のタンパク質である。神経栄
養因子は神経組織、および神経系によって支配される非神経組織から単離され、
機能的および構造的に関連するグループ（ファミリー、スーパーファミリーまた
はサブファミリーとも呼ばれる）に分類されている。神経栄養因子スーパーファ
ミリーには、線維芽細胞成長因子、ニューロトロフィンおよびトランスフォーミ
ング成長因子β（TGF-β）スーパーファミリーが含まれる。神経栄養因子の個々
の分子種は、それらの物理的構造、それらの複合受容体との相互作用および様々
なタイプの神経細胞に対するそれらの作用によって識別される。TGF-βスーパー
ファミリー（Massagueら, Trends in Cell Biology, 1994, 4, 172-178）に分類
されるものには、GDNF、パーセフィン（persephin）（「PSP」；Milbrandtら, N
euron 1998, 20, 245-253、参考文献としてここに援用する）およびニュールツ
リン（neurturin）（「NTN」；WO 97/08196、参考文献としてここに援用する）
を包含するグリア細胞由来神経栄養因子リガンド（「GDNF」；WO 93/06116，参
考文献としてここに援用する）がある。GDNFサブファミリーのリガンドは共通し
て、RET受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を誘導する能力を持ってい
る。GDNFサブファミリーの上記3つのリガンドは、神経栄養受容体のファミリー
、
【０００３】
【外２】 受容体に対する相対的親和性が異なる。
【０００４】 神経栄養因子はニューロン組織に対する作用を持つので、神経系の障害を診断
し処置するために、さらなる神経栄養因子を同定し特徴づけることが、依然とし
て必要とされている。
し処置するために、さらなる神経栄養因子を同定し特徴づけることが、依然とし
て必要とされている。
【０００５】 発明の要約 本発明は、本明細書で「ニューブラスチン（neublastin）」または「NBN」と
呼ぶ、新規神経栄養因子に関する。ニューブラスチンは他のGDNFリガンドと相同
な領域を有し（下記表3および表4参照）、RETと相互作用する能力を持つ（例え
ばAiraksinenら, Mol. Cell. Neuroscience, 1999, 13, 313-325）ので、ニュー
ブラスチンはGDNFサブファミリーに分類され、ニューブラスチンは新規かつユニ
ークな神経栄養因子である。他のGDNFリガンドとは異なり、ニューブラスチンは
GFRα3-RET受容体複合体に対する高い親和性を示し、またそのアミノ酸配列中に
ユニークな亜領域を示す。
呼ぶ、新規神経栄養因子に関する。ニューブラスチンは他のGDNFリガンドと相同
な領域を有し（下記表3および表4参照）、RETと相互作用する能力を持つ（例え
ばAiraksinenら, Mol. Cell. Neuroscience, 1999, 13, 313-325）ので、ニュー
ブラスチンはGDNFサブファミリーに分類され、ニューブラスチンは新規かつユニ
ークな神経栄養因子である。他のGDNFリガンドとは異なり、ニューブラスチンは
GFRα3-RET受容体複合体に対する高い親和性を示し、またそのアミノ酸配列中に
ユニークな亜領域を示す。
【０００６】 本明細書で使用されるとき「ニューブラスチンポリペプチド」は、（例えば実
施例6、7、8および9に記載するように）神経栄養活性活性を有するポリペプチド
であり、配列番号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97 〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140（「プロ」）、配列番号4のAA1〜AA140、配
列番号9のAA-80〜AA140（「野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プ
ロ）、配列番号5のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116
AA）、配列番号7のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟14
0AA）、配列番号11のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟
113AA）に記載のヒト「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも70
％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドおよびそれらの変異体およ
び誘導体を包含する。また本発明では、配列番号16のAA1〜AA224に記載のネズミ
「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するア
ミノ酸配列を持つポリペプチドも考えられる。
施例6、7、8および9に記載するように）神経栄養活性活性を有するポリペプチド
であり、配列番号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97 〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140（「プロ」）、配列番号4のAA1〜AA140、配
列番号9のAA-80〜AA140（「野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プ
ロ）、配列番号5のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116
AA）、配列番号7のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟14
0AA）、配列番号11のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟
113AA）に記載のヒト「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも70
％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドおよびそれらの変異体およ
び誘導体を包含する。また本発明では、配列番号16のAA1〜AA224に記載のネズミ
「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するア
ミノ酸配列を持つポリペプチドも考えられる。
【０００７】 上に定義したニューブラスチンポリペプチドのC末端配列は、好ましくは、配
列番号2のAA72〜AA105（すなわち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは
配列番号2のAA41〜AA105（すなわち配列番号9のAA76〜AA140）に記載のアミノ酸
配列、または配列番号16のAA191〜AA224に記載するアミノ酸配列を持つ。
列番号2のAA72〜AA105（すなわち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは
配列番号2のAA41〜AA105（すなわち配列番号9のAA76〜AA140）に記載のアミノ酸
配列、または配列番号16のAA191〜AA224に記載するアミノ酸配列を持つ。
【０００８】 また、ニューブラスチンポリペプチドはGDNFファミリーおよびTGF-βスーパー
ファミリーに特有の7つの保存されたCys残基を保持していることが好ましい。
ファミリーに特有の7つの保存されたCys残基を保持していることが好ましい。
【０００９】 ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、上記の配列（すなわち配列番
号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97〜AA140、配列
番号4のAA1〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140、配列番号9のAA-80〜AA140（「
野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ）、配列番号5のAA1〜AA1 40 （成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号7のAA1〜AA1 13 （成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号11のAA1〜A
A116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟113AA）および配列番号16の
AA1〜AA224）に対して、85％より高い相同性、最も好ましくは95％より高い相同
性を有する。
号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97〜AA140、配列
番号4のAA1〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140、配列番号9のAA-80〜AA140（「
野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ）、配列番号5のAA1〜AA1 40 （成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号7のAA1〜AA1 13 （成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号11のAA1〜A
A116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟113AA）および配列番号16の
AA1〜AA224）に対して、85％より高い相同性、最も好ましくは95％より高い相同
性を有する。
【００１０】 本明細書で使用されるとき「ニューブラスチン核酸」とは、ニューブラスチン
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。したがって、単離されたニ
ューブラスチン核酸は、翻訳に必要とされる適切な諸成分にばく露された場合に
ニューブラスチンポリペプチドをコード化またはコードするヌクレオチドコドン
のオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチド分子である。本発明
のニューブラスチン核酸はRNAでも、DNA（例えばゲノムDNAまたはニューブラス
チンmRNAに相補的なかつ/またはニューブラスチンmRNAから転写されたDNA（「cD
NA」））でもよい。したがって本発明のニューブラスチン核酸はさらに、ニュー
ブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーション条件で、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド分子を包含する。また本発明は、ニューブラスチンポリペプチドをコード化す
るポリヌクレオチドまたはその断片の同定、単離および増幅に有用な核酸プライ
マーに関する。本発明の一定の態様では、それらプライマーのうち一定のものが
、ニューブラスチン核酸へのハイブリダイゼーションには有用であるがGDNFファ
ミリーの他のメンバーをコードする核酸へのハイブリダイゼーションには役立た
ない、ニューブラスチン特異的プローブである。「特異的」「特異性」または「
特異的に」という用語は、ニューブラスチン核酸とハイブリダイズすることがで
き、GDNFリガンド（例えばGDNF、パーセフィンおよびニュールツリン）を一意的
にコードする核酸にはハイブリダイズできないことを含めて非ニューブラスチン
核酸とはハイブリダイズできないことを意味する。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。したがって、単離されたニ
ューブラスチン核酸は、翻訳に必要とされる適切な諸成分にばく露された場合に
ニューブラスチンポリペプチドをコード化またはコードするヌクレオチドコドン
のオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチド分子である。本発明
のニューブラスチン核酸はRNAでも、DNA（例えばゲノムDNAまたはニューブラス
チンmRNAに相補的なかつ/またはニューブラスチンmRNAから転写されたDNA（「cD
NA」））でもよい。したがって本発明のニューブラスチン核酸はさらに、ニュー
ブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーション条件で、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド分子を包含する。また本発明は、ニューブラスチンポリペプチドをコード化す
るポリヌクレオチドまたはその断片の同定、単離および増幅に有用な核酸プライ
マーに関する。本発明の一定の態様では、それらプライマーのうち一定のものが
、ニューブラスチン核酸へのハイブリダイゼーションには有用であるがGDNFファ
ミリーの他のメンバーをコードする核酸へのハイブリダイゼーションには役立た
ない、ニューブラスチン特異的プローブである。「特異的」「特異性」または「
特異的に」という用語は、ニューブラスチン核酸とハイブリダイズすることがで
き、GDNFリガンド（例えばGDNF、パーセフィンおよびニュールツリン）を一意的
にコードする核酸にはハイブリダイズできないことを含めて非ニューブラスチン
核酸とはハイブリダイズできないことを意味する。
【００１１】 もう一つの態様として、本発明のニューブラスチン核酸は、相補的核酸配列を
持つことにより、または当該核酸がニューブラスチンをコードするポリヌクレオ
チドに高ストリンジェンシー条件で特異的にハイブリダイズすることを立証する
ことにより、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相
補的であると同定される核酸である。ニューブラスチン核酸の具体例には、配列
番号1、配列番号3、配列番号8、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番
号29および配列番号30として本明細書に示す核酸配列ならびに配列番号17〜28、
31および32のプライマーなどがあるが、これらに限定されるわけではない。本発
明のニューブラスチン核酸にはさらに、例えば図8に示す核酸断片など（ただし
これらに限らない）の、ニューブラスチン核酸のユニークな亜領域または断片も
包含される。
持つことにより、または当該核酸がニューブラスチンをコードするポリヌクレオ
チドに高ストリンジェンシー条件で特異的にハイブリダイズすることを立証する
ことにより、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相
補的であると同定される核酸である。ニューブラスチン核酸の具体例には、配列
番号1、配列番号3、配列番号8、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番
号29および配列番号30として本明細書に示す核酸配列ならびに配列番号17〜28、
31および32のプライマーなどがあるが、これらに限定されるわけではない。本発
明のニューブラスチン核酸にはさらに、例えば図8に示す核酸断片など（ただし
これらに限らない）の、ニューブラスチン核酸のユニークな亜領域または断片も
包含される。
【００１２】 本発明のニューブラスチン核酸は、例えばインビトロでニューブラスチンポリ
ペプチドを発現させたり、またはニューブラスチン核酸を動物に投与してインビ
ボで発現させることなどによって、ニューブラスチンポリペプチドを発現させる
ために使用できる。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクター、例えば発現ベクタ
ーまたはクローニングベクターに組み込むことができる。ニューブラスチン核酸
は、核酸ベクターの一部として維持し、複製し、転移させ、または発現させるこ
とができるが、必ずしもその必要はない。ニューブラスチンポリヌクレオチド配
列を含有する組換え発現ベクターは、細胞内に導入しかつ/または細胞内に維持
することができる。ニューブラスチンベクターを保持する細胞は原核細胞であっ
てよい。もう一つの選択肢として、ニューブラスチン核酸を真核細胞（例えばポ
リペプチドを成熟タンパク質に翻訳後プロセシングするための適切な装置および
/またはポリペプチドを当該細胞の細胞外環境に分泌するための適切な装置を含
有する真核細胞）に導入することもできる。
ペプチドを発現させたり、またはニューブラスチン核酸を動物に投与してインビ
ボで発現させることなどによって、ニューブラスチンポリペプチドを発現させる
ために使用できる。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクター、例えば発現ベクタ
ーまたはクローニングベクターに組み込むことができる。ニューブラスチン核酸
は、核酸ベクターの一部として維持し、複製し、転移させ、または発現させるこ
とができるが、必ずしもその必要はない。ニューブラスチンポリヌクレオチド配
列を含有する組換え発現ベクターは、細胞内に導入しかつ/または細胞内に維持
することができる。ニューブラスチンベクターを保持する細胞は原核細胞であっ
てよい。もう一つの選択肢として、ニューブラスチン核酸を真核細胞（例えばポ
リペプチドを成熟タンパク質に翻訳後プロセシングするための適切な装置および
/またはポリペプチドを当該細胞の細胞外環境に分泌するための適切な装置を含
有する真核細胞）に導入することもできる。
【００１３】 さらに本発明はニューブラスチン神経栄養因子「ニューブラスチン」を特徴と
する。ニューブラスチンは単ポリペプチドの形をとってもよいし、2以上のニュ
ーブラスチンポリペプチドの多量体（例えばニューブラスチン二量体）であって
もよい。ニューブラスチンポリペプチドは、例えばシステイン-システイン相互
作用、スルフヒドリル結合および非共有結合的相互作用など（ただしこれらに限
らない）といった、当業者に知られる分子間の構造的結合により、多量体として
会合する。ニューブラスチンポリペプチドの具体例には、配列番号2、配列番号4
、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配
列番号12および配列番号16として本明細書に開示するアミノ酸配列があるが、こ
れらに限定されるわけではない。
する。ニューブラスチンは単ポリペプチドの形をとってもよいし、2以上のニュ
ーブラスチンポリペプチドの多量体（例えばニューブラスチン二量体）であって
もよい。ニューブラスチンポリペプチドは、例えばシステイン-システイン相互
作用、スルフヒドリル結合および非共有結合的相互作用など（ただしこれらに限
らない）といった、当業者に知られる分子間の構造的結合により、多量体として
会合する。ニューブラスチンポリペプチドの具体例には、配列番号2、配列番号4
、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配
列番号12および配列番号16として本明細書に開示するアミノ酸配列があるが、こ
れらに限定されるわけではない。
【００１４】 本発明のニューブラスチンポリペプチドは、ニューロンの欠陥（損傷を受けた
ニューロンおよび外傷を受けたニューロンを含むが、これらに限らない）の処置
に有用である。外傷を受ける末梢神経には、延髄または脊髄の神経が含まれるが
、これらに限らない。ニューブラスチンポリペプチドは、神経変性疾患、例えば
脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、例えば末梢神経障害、アルツハイマー病、
ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの処置に有
用である。さらに、ニューブラスチンポリペプチドには、記憶障害（例えば痴呆
に伴なう記憶障害）の処置での使用が考えられる。
ニューロンおよび外傷を受けたニューロンを含むが、これらに限らない）の処置
に有用である。外傷を受ける末梢神経には、延髄または脊髄の神経が含まれるが
、これらに限らない。ニューブラスチンポリペプチドは、神経変性疾患、例えば
脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、例えば末梢神経障害、アルツハイマー病、
ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの処置に有
用である。さらに、ニューブラスチンポリペプチドには、記憶障害（例えば痴呆
に伴なう記憶障害）の処置での使用が考えられる。
【００１５】 発明の詳細な開示 出願人は、ここに「ニューブラスチン（neublastin）」または「NBN」と呼ぶ
新規神経栄養因子をコード化する核酸を同定した。ニューブラスチンは、神経栄
養因子のトランスフォーミング成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーのグ
リア細胞由来神経栄養因子（GDNF）サブクラスのメンバーである。
新規神経栄養因子をコード化する核酸を同定した。ニューブラスチンは、神経栄
養因子のトランスフォーミング成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーのグ
リア細胞由来神経栄養因子（GDNF）サブクラスのメンバーである。
【００１６】 ニューブラスチンをコード化するcDNAは、最初は、以下のように同定された。
TBLASTN 1.4.11アルゴリズム（Atschulら, Nucl. Acids Res. 1997, 25, 3389-3
402）を使用し、クエリーとしてヒトパーセフィン（GenBank受諾番号AF040962）
を使用することにより、GenBankエントリーAC005038およびAC005051の2つのヒト
細菌人工染色体（BAC）のHGTS（High-Throughput Genomic Sequence）に、290bp
の断片が同定された。AC005038は順序不明の5つのコンティグ約190,000bpからな
り、AC005051は順序不明の12のコンティグ約132,000bpからなる。上記2つのBAC
クローン中に同定された290bp断片は、神経栄養因子ヒトパーセフィンのcDNAの
コード領域と相同であるが同一ではない領域を持つことが判明した。
TBLASTN 1.4.11アルゴリズム（Atschulら, Nucl. Acids Res. 1997, 25, 3389-3
402）を使用し、クエリーとしてヒトパーセフィン（GenBank受諾番号AF040962）
を使用することにより、GenBankエントリーAC005038およびAC005051の2つのヒト
細菌人工染色体（BAC）のHGTS（High-Throughput Genomic Sequence）に、290bp
の断片が同定された。AC005038は順序不明の5つのコンティグ約190,000bpからな
り、AC005051は順序不明の12のコンティグ約132,000bpからなる。上記2つのBAC
クローン中に同定された290bp断片は、神経栄養因子ヒトパーセフィンのcDNAの
コード領域と相同であるが同一ではない領域を持つことが判明した。
【００１７】 この290bp配列から、2つのニューブラスチン特異的PCRプライマー（トップ鎖
（top strand）プライマー［配列番号17］およびボトム鎖（bottom strand）プ
ライマー［配列番号18］）を合成した。ヒト胎児脳cDNAライブラリーのスクリー
ニングを行った。最初のスクリーニングでは、約5,000クローン/ウェルの50,000
cDNAクローンから、上記2つのPCRプライマー［配列番号17および18］によるcDNA
ライブラリー「マスタープレート」の96ウェルPCRスクリーニングを行なった。
第二のPCRスクリーニングは、約5,000クローン/ウェルの大腸菌グリセロール保
存液を含むヒト胎児脳cDNAライブラリー「サブプレート」で行なった。
（top strand）プライマー［配列番号17］およびボトム鎖（bottom strand）プ
ライマー［配列番号18］）を合成した。ヒト胎児脳cDNAライブラリーのスクリー
ニングを行った。最初のスクリーニングでは、約5,000クローン/ウェルの50,000
cDNAクローンから、上記2つのPCRプライマー［配列番号17および18］によるcDNA
ライブラリー「マスタープレート」の96ウェルPCRスクリーニングを行なった。
第二のPCRスクリーニングは、約5,000クローン/ウェルの大腸菌グリセロール保
存液を含むヒト胎児脳cDNAライブラリー「サブプレート」で行なった。
【００１８】 上記マスタープレートとサブプレートの両方のPCRスクリーニングで102bpの断
片［配列番号13］が同定された。陽性cDNAクローン（102bp断片を保持するもの
）を選択し、2枚のLB/抗生物質含有プレートに播種し、終夜生育させた。これら
のプレートから、合計96個の細菌コロニーを選択し、両PCRプライマー［配列番
号17および18］ならびに不可欠なPCR増幅試薬類を含む新しい96ウェルPCRプレー
トの各ウェルに、個別に播種した。次にPCR増幅を行ない、96個の個々のPCR反応
系を2％アガロースゲル電気泳動によって分析した。次に、上記102bp断片を含有
するクローンを持つ陽性コロニーを同定した。上記102bp断片を含有する陽性コ
ロニーからプラスミドDNAを得て、配列決定した。次に、配列決定分析を行なう
ことにより、861bpの完全長cDNA［配列番号8］の存在が明らかになった。配列番
号8中に同定される663bpのオープンリーディングフレーム（ORF）またはコード
領域は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコー
ド化し、これを配列番号9に示す。配列番号9に基づき、3つのニューブラスチン
変異体が同定された。それらの変異体には以下のポリペプチドが含まれる： (i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれる140アミノ
酸ポリペプチド； (ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれる116アミ
ノ酸ポリペプチド； (iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれる113アミ
ノ酸ポリペプチド。
片［配列番号13］が同定された。陽性cDNAクローン（102bp断片を保持するもの
）を選択し、2枚のLB/抗生物質含有プレートに播種し、終夜生育させた。これら
のプレートから、合計96個の細菌コロニーを選択し、両PCRプライマー［配列番
号17および18］ならびに不可欠なPCR増幅試薬類を含む新しい96ウェルPCRプレー
トの各ウェルに、個別に播種した。次にPCR増幅を行ない、96個の個々のPCR反応
系を2％アガロースゲル電気泳動によって分析した。次に、上記102bp断片を含有
するクローンを持つ陽性コロニーを同定した。上記102bp断片を含有する陽性コ
ロニーからプラスミドDNAを得て、配列決定した。次に、配列決定分析を行なう
ことにより、861bpの完全長cDNA［配列番号8］の存在が明らかになった。配列番
号8中に同定される663bpのオープンリーディングフレーム（ORF）またはコード
領域は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコー
ド化し、これを配列番号9に示す。配列番号9に基づき、3つのニューブラスチン
変異体が同定された。それらの変異体には以下のポリペプチドが含まれる： (i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれる140アミノ
酸ポリペプチド； (ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれる116アミ
ノ酸ポリペプチド； (iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれる113アミ
ノ酸ポリペプチド。
【００１９】 782bpの5’非翻訳DNA、663bpのコード化DNAおよび447bpの3’非翻訳DNA（合計
1992bp）を含有する全cDNA配列は、受諾番号AF120274としてGenBankに提出され
ている。
1992bp）を含有する全cDNA配列は、受諾番号AF120274としてGenBankに提出され
ている。
【００２０】 ゲノムニューブラスチンコード化配列は以下のように同定された。
【００２１】 ゲノムニューブラスチンコード化配列をクローニングする目的で、新たなプラ
イマーセットを作成した。具体的に述べると、第1プライマー対はセンス＝配列
番号23およびアンチセンス＝配列番号24からなり、第2プライマー対はセンス＝
配列番号25およびアンチセンス＝配列番号26からなった。
イマーセットを作成した。具体的に述べると、第1プライマー対はセンス＝配列
番号23およびアンチセンス＝配列番号24からなり、第2プライマー対はセンス＝
配列番号25およびアンチセンス＝配列番号26からなった。
【００２２】 第2プライマー対を使って、887bpのDNA断片をヒトゲノムDNAの調製物からPCR
によって増幅し、pCRIIベクター（Invitrogen）にクローニングし、大腸菌に形
質転換した。得られたプラスミドを配列決定したところ、（配列番号3に記載す
るように）861bpの推定cDNA配列（ここにニューブラスチンと名付けるタンパク
質をコード化する）が予測された。同様に、第1プライマー対を使用すると、870
bpのDNA断片がヒトゲノムDNAのPCRによって得られた。この断片には、上記の887
bp配列と比較して、オープンリーディングフレームの3’末端に余分な42bpの領
域が見出された。エキソン-イントロン境界をマッピングして、他の神経栄養因
子の核酸配列と比較することにより、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造を予
測した。この分析により、ニューブラスチン遺伝子は70bpのイントロンによって
分離された少なくとも2つのエキソンを有することが明らかになった。
によって増幅し、pCRIIベクター（Invitrogen）にクローニングし、大腸菌に形
質転換した。得られたプラスミドを配列決定したところ、（配列番号3に記載す
るように）861bpの推定cDNA配列（ここにニューブラスチンと名付けるタンパク
質をコード化する）が予測された。同様に、第1プライマー対を使用すると、870
bpのDNA断片がヒトゲノムDNAのPCRによって得られた。この断片には、上記の887
bp配列と比較して、オープンリーディングフレームの3’末端に余分な42bpの領
域が見出された。エキソン-イントロン境界をマッピングして、他の神経栄養因
子の核酸配列と比較することにより、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造を予
測した。この分析により、ニューブラスチン遺伝子は70bpのイントロンによって
分離された少なくとも2つのエキソンを有することが明らかになった。
【００２３】 また、この配列を用いて、GenBankをニューブラスチンEST配列についてスクリ
ーニングした。GenBankエントリーAA844072、AA931637およびAA533512に、3つの
EST配列が同定されたことから、ニューブラスチン核酸がmRNAに転写されること
が示された。
ーニングした。GenBankエントリーAA844072、AA931637およびAA533512に、3つの
EST配列が同定されたことから、ニューブラスチン核酸がmRNAに転写されること
が示された。
【００２４】 得られた全cDNA配列（AF120274）とGenBankエントリーAC005038およびAC00505
1中に存在するゲノム配列との比較により、ニューブラスチン遺伝子は4つのイン
トロンによって分離された少なくとも5つのエキソン（3つのコーディングエキソ
ンを含む）からなることが明らかになった（例えば図8を参照されたい）。全体
として上記エキソンは完全長ニューブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列
を持つ。887bp断片がプロニューブラスチンの全コード領域を含むことがわかっ
た点にも注目すべきである。予想されるcDNA［配列番号3］は、3つの既知ヒトタ
ンパク質、すなわちパーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFに対して相同性を
示すプロニューブラスチン（181アミノ酸残基）をコード化するオープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を含んでいる。
1中に存在するゲノム配列との比較により、ニューブラスチン遺伝子は4つのイン
トロンによって分離された少なくとも5つのエキソン（3つのコーディングエキソ
ンを含む）からなることが明らかになった（例えば図8を参照されたい）。全体
として上記エキソンは完全長ニューブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列
を持つ。887bp断片がプロニューブラスチンの全コード領域を含むことがわかっ
た点にも注目すべきである。予想されるcDNA［配列番号3］は、3つの既知ヒトタ
ンパク質、すなわちパーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFに対して相同性を
示すプロニューブラスチン（181アミノ酸残基）をコード化するオープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を含んでいる。
【００２５】 本発明のニューブラスチン核酸 もう一つの側面として、本発明は、本発明のポリペプチドを発現させることが
できるポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、DNA、cDNA
およびRNA配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然のポリヌクレオチド、
合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。本
発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果、縮重しているが、ニューブラス
チンポリペプチドを発現時にコードする配列も包含される。
できるポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、DNA、cDNA
およびRNA配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然のポリヌクレオチド、
合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。本
発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果、縮重しているが、ニューブラス
チンポリペプチドを発現時にコードする配列も包含される。
【００２６】 ここに定義される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10塩基長、好まし
くは少なくとも15塩基長のポリマー型ヌクレオチドを指す。「単離されたポリヌ
クレオチド」とは、当該ポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノム中で当
該ポリヌクレオチドが（一つは5’末端側で、一つは3’末端側で）すぐに接して
いる両コード配列と、すぐには接していないポリヌクレオチドを意味する。した
がって、この用語は、発現ベクター、自律複製プラスミドまたは自律複製ウイル
ス、もしくは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、ま
たは他の配列から独立した単独の分子（例えばcDNA）として存在する組換えDNA
を包含する。
くは少なくとも15塩基長のポリマー型ヌクレオチドを指す。「単離されたポリヌ
クレオチド」とは、当該ポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノム中で当
該ポリヌクレオチドが（一つは5’末端側で、一つは3’末端側で）すぐに接して
いる両コード配列と、すぐには接していないポリヌクレオチドを意味する。した
がって、この用語は、発現ベクター、自律複製プラスミドまたは自律複製ウイル
ス、もしくは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、ま
たは他の配列から独立した単独の分子（例えばcDNA）として存在する組換えDNA
を包含する。
【００２７】 本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のヌクレオチド配列と1つまた
は複数のヌクレオチド位置で相違するヌクレオチド配列を持つ対立遺伝子変異体
および「突然変異ポリヌクレオチド」も包含する。
は複数のヌクレオチド位置で相違するヌクレオチド配列を持つ対立遺伝子変異体
および「突然変異ポリヌクレオチド」も包含する。
【００２８】 好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは、下に詳述するように、
少なくとも中、中/高または高ストリンジェンシー条件で、配列番号1として記載
するポリヌクレオチド配列、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列、
配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号15として記載
するポリヌクレオチド配列、その相補鎖もしくは部分配列とハイブリダイズする
ことができる核酸（DNA）配列を有する。
少なくとも中、中/高または高ストリンジェンシー条件で、配列番号1として記載
するポリヌクレオチド配列、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列、
配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号15として記載
するポリヌクレオチド配列、その相補鎖もしくは部分配列とハイブリダイズする
ことができる核酸（DNA）配列を有する。
【００２９】 もう一つの好ましい態様として、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配
列番号1として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号3として記載するポリヌ
クレオチド配列、配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列、または配列
番号15として記載するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、好ましく
は少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも
95％相同な核酸（DNA）配列を有する。
列番号1として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号3として記載するポリヌ
クレオチド配列、配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列、または配列
番号15として記載するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70％、好ましく
は少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも
95％相同な核酸（DNA）配列を有する。
【００３０】 その最も好ましい態様として、本ポリヌクレオチドは、配列番号1として記載
するDNA配列、配列番号3として記載するDNA配列、配列番号8として記載するDNA
配列、または配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列を有する。
するDNA配列、配列番号3として記載するDNA配列、配列番号8として記載するDNA
配列、または配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列を有する。
【００３１】 本発明は、ニューブラスチンポリペプチドまたはその断片を発現時にコードす
るニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するための新規プ
ライマーならびにDNA配列も提供する。そのようなプライマーには、配列番号17
〜28および31〜32に記載のポリヌクレオチドが包含される。また本発明は、それ
らのプライマーから生成するニューブラスチンDNA配列を、配列番号13および14
に記載の配列を含めて、提供する。さらに本発明は、ニューブラスチンエキソン
に隣接するゲノムDNA中の3’または5’非翻訳領域（「UTR」）から得られるDNA
配列を提供する。そのような配列は、ニューブラスチンポリペプチドまたはその
断片を発現時にコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離およ
び増幅するのに有用である。
るニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するための新規プ
ライマーならびにDNA配列も提供する。そのようなプライマーには、配列番号17
〜28および31〜32に記載のポリヌクレオチドが包含される。また本発明は、それ
らのプライマーから生成するニューブラスチンDNA配列を、配列番号13および14
に記載の配列を含めて、提供する。さらに本発明は、ニューブラスチンエキソン
に隣接するゲノムDNA中の3’または5’非翻訳領域（「UTR」）から得られるDNA
配列を提供する。そのような配列は、ニューブラスチンポリペプチドまたはその
断片を発現時にコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離およ
び増幅するのに有用である。
【００３２】 本発明の3’UTR配列には、 配列番号1のヌクレオチド721-865、 配列番号3のヌクレオチド718-861、 配列番号8のヌクレオチド718-861、 配列番号15のヌクレオチド1647-2136、 に記載の配列、および上記の配列に由来する（すなわち上記の配列に含まれる）
10〜25ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、 が包含される。
10〜25ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、 が包含される。
【００３３】 本発明の5’UTR配列には、 配列番号1のヌクレオチド1-10、 配列番号8のヌクレオチド1-57、 配列番号15の1-974、 に記載の配列、および上記の配列に由来する（すなわち上記の配列に含まれる）
10〜25ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、 が包含される。
10〜25ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、 が包含される。
【００３４】 本発明のポリヌクレオチドは、例えば「Current Protocols in Molecular Bio
logy」（John Wiley & Sons）に記載されているようなクローニング法によって
、好ましく取得することができる。好ましい一態様として、本ポリヌクレオチド
は、ヒトゲノムDNAまたはヒト脳のcDNAライブラリーからクローニングされるか
、ヒトゲノムDNAまたはヒト脳のcDNAライブラリーに基づいて作成される。
logy」（John Wiley & Sons）に記載されているようなクローニング法によって
、好ましく取得することができる。好ましい一態様として、本ポリヌクレオチド
は、ヒトゲノムDNAまたはヒト脳のcDNAライブラリーからクローニングされるか
、ヒトゲノムDNAまたはヒト脳のcDNAライブラリーに基づいて作成される。
【００３５】 DNA配列の相同性 上で言及したDNA配列相同性は、第1配列の第2配列からの派生を示す2つの配列
間の同一度として決定することができる。相同性は、例えばGCGプログラムパッ
ケージに含まれるGAPなどの当技術分野で知られるコンピュータープログラムを
使って、適切に決定できる［Needleman, S.B.およびWunsch, C.D., Journal of
Molecular Biology 1970, 48, 443-453］。GAP挿入ペナルティー（GAP creation
penalty）5.0およびGAP伸長ペナルティー（GAP extension penalty）0.3という
DNA配列比較用の設定でGAPを使用することにより、上で言及した類似DNA配列の
コード領域は、配列番号1に示すDNA配列のCDS（コード化）部分または配列番号3
に示すDNA配列のCDS（コード化）部分または配列番号8に示すDNA配列のCDS（コ
ード化）部分、配列番号15に示すDNA配列のCDS（コード化）部分と、好ましくは
少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90
％、より好ましくは少なくとも95％の同一度を示す。
間の同一度として決定することができる。相同性は、例えばGCGプログラムパッ
ケージに含まれるGAPなどの当技術分野で知られるコンピュータープログラムを
使って、適切に決定できる［Needleman, S.B.およびWunsch, C.D., Journal of
Molecular Biology 1970, 48, 443-453］。GAP挿入ペナルティー（GAP creation
penalty）5.0およびGAP伸長ペナルティー（GAP extension penalty）0.3という
DNA配列比較用の設定でGAPを使用することにより、上で言及した類似DNA配列の
コード領域は、配列番号1に示すDNA配列のCDS（コード化）部分または配列番号3
に示すDNA配列のCDS（コード化）部分または配列番号8に示すDNA配列のCDS（コ
ード化）部分、配列番号15に示すDNA配列のCDS（コード化）部分と、好ましくは
少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90
％、より好ましくは少なくとも95％の同一度を示す。
【００３６】 「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が特定の比較領域
にわたってヌクレオチド単位で同一である程度を指す。「配列同一性百分率」と
いう用語は、上記の比較領域にわたって最適に整列された2つの配列を比較し、
同一の核酸塩基（例えばA、T、C、G、UまたはI）が両方の配列中に存在する位置
の数を決定することで一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較領
域の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、その商を100倍して、配
列同一性百分率を求めることによって計算される。本明細書で使用する「実質的
同一」という用語は、当該ポリヌクレオチドが、ある比較領域にわたって基準配
列と比較したときに、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％
の同一性、しばしば90〜95％の配列同一性、より一般には少なくとも99％の配列
同一性を有する配列を含んでなるようなポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
にわたってヌクレオチド単位で同一である程度を指す。「配列同一性百分率」と
いう用語は、上記の比較領域にわたって最適に整列された2つの配列を比較し、
同一の核酸塩基（例えばA、T、C、G、UまたはI）が両方の配列中に存在する位置
の数を決定することで一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較領
域の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、その商を100倍して、配
列同一性百分率を求めることによって計算される。本明細書で使用する「実質的
同一」という用語は、当該ポリヌクレオチドが、ある比較領域にわたって基準配
列と比較したときに、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％
の同一性、しばしば90〜95％の配列同一性、より一般には少なくとも99％の配列
同一性を有する配列を含んでなるようなポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
【００３７】 ハイブリダイゼーションプロトコール 本発明のポリヌクレオチドは、以下に詳述するように、少なくとも中、中/高
または高ストリンジェンシー条件で、配列番号1として記載するポリヌクレオチ
ド配列、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号8とし
て記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号15として記載するポリヌクレ
チド配列、もしくはそれらの相補鎖またはそれらの部分配列とハイブリダイズす
ることができる核酸配列を持つものである。
または高ストリンジェンシー条件で、配列番号1として記載するポリヌクレオチ
ド配列、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号8とし
て記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号15として記載するポリヌクレ
チド配列、もしくはそれらの相補鎖またはそれらの部分配列とハイブリダイズす
ることができる核酸配列を持つものである。
【００３８】 ヌクレオチドプローブと相同DNAまたはRNA配列の間のハイブリダイゼーション
を決定するのに適した実験条件では、ハイブリダイズさせるDNA断片またはRNAを
含んでいるフィルターを5×SSC［塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム；Sambroo
kら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールドスプリングハーバー
研究所, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989を参照されたい］中
で10分間予浸し、5×SSC、5×デンハート液［Sambrookら（前掲）参照］、0.5％
SDSおよび100μg/mlの変性超音波処理サケ精子DNA［Sambrookら（前掲）参照］
の溶液中でフィルターのプレハイブリダイゼーションを行なった後、ランダムプ
ライム法［Feinberg APおよびVogelstein B, Anal.Biochem. 1983, 132, 6-13］
で32P-dCTP標識した（比活性＞1×109cpm/μg）プローブを10ng/mlの濃度で含む
同溶液中、約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを行なう。次いでフィルタ
ーに、0.1×SSC、0.5％SDS中、少なくとも、少なくとも60℃（中ストリンジェン
シー条件）、好ましくは少なくとも65℃（中/高ストリンジェンシー条件）、よ
り好ましくは少なくとも70℃（高ストリンジェンシー条件）、より一層好ましく
は少なくとも75℃（超高ストリンジェンシー条件）の温度での30分間の洗浄を2
回行なう。これらの条件でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分
子は、X線フィルムを使って検出できる。
を決定するのに適した実験条件では、ハイブリダイズさせるDNA断片またはRNAを
含んでいるフィルターを5×SSC［塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム；Sambroo
kら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールドスプリングハーバー
研究所, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989を参照されたい］中
で10分間予浸し、5×SSC、5×デンハート液［Sambrookら（前掲）参照］、0.5％
SDSおよび100μg/mlの変性超音波処理サケ精子DNA［Sambrookら（前掲）参照］
の溶液中でフィルターのプレハイブリダイゼーションを行なった後、ランダムプ
ライム法［Feinberg APおよびVogelstein B, Anal.Biochem. 1983, 132, 6-13］
で32P-dCTP標識した（比活性＞1×109cpm/μg）プローブを10ng/mlの濃度で含む
同溶液中、約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを行なう。次いでフィルタ
ーに、0.1×SSC、0.5％SDS中、少なくとも、少なくとも60℃（中ストリンジェン
シー条件）、好ましくは少なくとも65℃（中/高ストリンジェンシー条件）、よ
り好ましくは少なくとも70℃（高ストリンジェンシー条件）、より一層好ましく
は少なくとも75℃（超高ストリンジェンシー条件）の温度での30分間の洗浄を2
回行なう。これらの条件でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分
子は、X線フィルムを使って検出できる。
【００３９】 クローン化ポリヌクレオチド 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、具体的には、クローン化ポリヌクレ
オチドであってもよい。ここに定義される用語「クローン化ポリヌクレオチド」
は、DNA（具体的にはcDNA、すなわちRNAから酵素的に誘導されたDNAであっても
よい）のセグメントを本来の位置から異なる部位に移動させてその部位で複製さ
せるために、遺伝子工学において現在使用されている標準的クローニング法に従
ってクローン化された、ポリヌクレオチドまたはDNA配列を指す。
オチドであってもよい。ここに定義される用語「クローン化ポリヌクレオチド」
は、DNA（具体的にはcDNA、すなわちRNAから酵素的に誘導されたDNAであっても
よい）のセグメントを本来の位置から異なる部位に移動させてその部位で複製さ
せるために、遺伝子工学において現在使用されている標準的クローニング法に従
ってクローン化された、ポリヌクレオチドまたはDNA配列を指す。
【００４０】 クローニングは任意の適当な方法で達成でき、クローニングには逆転写酵素法
、PCR法などの方法と、所望のDNAセグメントの切り出しおよび単離が必要になり
うる。
、PCR法などの方法と、所望のDNAセグメントの切り出しおよび単離が必要になり
うる。
【００４１】 本発明のクローン化ポリヌクレオチドは、その他に「DNA構築体」または「単
離されたDNA配列」と呼ぶこともでき、具体的には相補DNA（cDNA）であってもよ
い。
離されたDNA配列」と呼ぶこともでき、具体的には相補DNA（cDNA）であってもよ
い。
【００４２】 生物学的供給源 本発明の単離されたポリヌクレオチドは任意の適当な供給源から得ることがで
きる。
きる。
【００４３】 好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは、cDNAライブラリー、例
えば胎児または成人の脳（具体的には前脳、後脳、皮質、線条体、扁桃体、小脳
、尾状核、脳梁、海馬、視床核、視床下核、嗅核、被殻、黒質、後根神経節、三
叉神経節、上腸間膜動脈、または視床）、脊髄、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋
、腎臓、肝臓、膵臓、腸、眼、網膜、歯髄、毛包、前立腺、下垂体、または気管
のcDNAライブラリーなどからクローニングされるか、それらcDNAライブラリーに
基づいて作成される。
えば胎児または成人の脳（具体的には前脳、後脳、皮質、線条体、扁桃体、小脳
、尾状核、脳梁、海馬、視床核、視床下核、嗅核、被殻、黒質、後根神経節、三
叉神経節、上腸間膜動脈、または視床）、脊髄、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋
、腎臓、肝臓、膵臓、腸、眼、網膜、歯髄、毛包、前立腺、下垂体、または気管
のcDNAライブラリーなどからクローニングされるか、それらcDNAライブラリーに
基づいて作成される。
【００４４】 ヒトおよびヒト以外の様々な組織に由来する市販のcDNAライブラリーは、例え
ばStratageneやClontechなどから入手できる。本発明の単離されたポリヌクレオ
チドは、例えば実施例に記載するような標準的方法によって得ることができる。
ばStratageneやClontechなどから入手できる。本発明の単離されたポリヌクレオ
チドは、例えば実施例に記載するような標準的方法によって得ることができる。
【００４５】 本発明のニューブラスチンポリペプチド 上記のように、本明細書で使用されるとき「ニューブラスチンポリペプチド」
は、（例えば実施例6、7、8および9に記載するように）神経栄養活性を有するポ
リペプチドであり、配列番号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番
号4のAA-97〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140、配列番号4のAA1〜AA140、配列
番号9のAA-80〜AA140（「野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ
）、配列番号5のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA
）、配列番号7のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140A
A）、配列番号11のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟11
3AA）、配列番号16のAA1〜AA224（ネズミプレプロ）に記載の「ニューブラスチ
ン」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を持つ
ポリペプチドおよび前記各ポリペプチドの変異体ならびに誘導体を包含する。
は、（例えば実施例6、7、8および9に記載するように）神経栄養活性を有するポ
リペプチドであり、配列番号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番
号4のAA-97〜AA140、配列番号4のAA-41〜AA140、配列番号4のAA1〜AA140、配列
番号9のAA-80〜AA140（「野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ
）、配列番号5のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA
）、配列番号7のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140A
A）、配列番号11のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟11
3AA）、配列番号16のAA1〜AA224（ネズミプレプロ）に記載の「ニューブラスチ
ン」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を持つ
ポリペプチドおよび前記各ポリペプチドの変異体ならびに誘導体を包含する。
【００４６】 上記ニューブラスチンポリペプチドのC末端配列は、好ましくは、配列番号2の
AA72〜AA105（すなわち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは配列番号2
のAA41〜AA105（すなわち配列番号9のAA76〜AA140）に記載するようなアミノ酸
配列を持つ。
AA72〜AA105（すなわち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは配列番号2
のAA41〜AA105（すなわち配列番号9のAA76〜AA140）に記載するようなアミノ酸
配列を持つ。
【００４７】 また、ニューブラスチンポリペプチドはGDNFファミリーおよびTGF-βスーパー
ファミリーに特有の7つの保存されたCys残基を保持していることが好ましい。
ファミリーに特有の7つの保存されたCys残基を保持していることが好ましい。
【００４８】 ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、上記の配列（すなわち配列番
号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97〜AA140、配列
番号4のAA-41〜AA140、配列番号4のAA1〜AA140、配列番号9のAA-80〜AA140（「
野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ）、配列番号5のAA1〜AA1 40 （成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号7のAA1〜AA1 13 （成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号11のAA1〜A
A116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号16のAA1
〜AA224（ネズミプレプロ）に対して、85％より高い相同性、最も好ましくは95
％より高い相同性を有し、上記ニューブラスチンポリペプチドのC末端配列を持
つ前記ポリペプチドはいずれも、好ましくは、配列番号2のAA72〜AA105（すなわ
ち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは配列番号2のAA41〜AA105（すな
わち配列番号9のAA76〜AA140）または配列番号16のA191-A224に記載するような
アミノ酸配列を持つ。
号2のAA-95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA-97〜AA140、配列
番号4のAA-41〜AA140、配列番号4のAA1〜AA140、配列番号9のAA-80〜AA140（「
野生型」プレプロ）、配列番号9のAA-41〜AA140（プロ）、配列番号5のAA1〜AA1 40 （成熟140AA）、配列番号6のAA1〜AA116（成熟116AA）、配列番号7のAA1〜AA1 13 （成熟113AA）、配列番号10のAA1〜AA140（成熟140AA）、配列番号11のAA1〜A
A116（成熟116AA）、配列番号12のAA1〜AA113（成熟113AA）、配列番号16のAA1
〜AA224（ネズミプレプロ）に対して、85％より高い相同性、最も好ましくは95
％より高い相同性を有し、上記ニューブラスチンポリペプチドのC末端配列を持
つ前記ポリペプチドはいずれも、好ましくは、配列番号2のAA72〜AA105（すなわ
ち配列番号9のAA107〜AA140）、より好ましくは配列番号2のAA41〜AA105（すな
わち配列番号9のAA76〜AA140）または配列番号16のA191-A224に記載するような
アミノ酸配列を持つ。
【００４９】 また本発明では、配列番号16のAA1〜AA224に記載のネズミ「ニューブラスチン
」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポ
リペプチドも考えられる。
」ポリペプチドに対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポ
リペプチドも考えられる。
【００５０】 一態様として本発明の好ましいポリペプチドの代表例は、ニューブラスチンの
プレプロ配列（配列番号2、4、9および16にそれぞれ記載するような配列）、プ
ロ配列（配列番号2のAA-75-A105または配列番号4および9のそれぞれAA-41〜AA14 0 に記載するような配列）および成熟配列（配列番号5、6、7、10、11または12、
好ましくは配列番号10、11、12に記載するような配列）である。
プレプロ配列（配列番号2、4、9および16にそれぞれ記載するような配列）、プ
ロ配列（配列番号2のAA-75-A105または配列番号4および9のそれぞれAA-41〜AA14 0 に記載するような配列）および成熟配列（配列番号5、6、7、10、11または12、
好ましくは配列番号10、11、12に記載するような配列）である。
【００５１】 本発明のポリペプチドは変異体ポリペプチドを包含する。本発明に関して「変
異体ポリペプチド」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸位置で配列番号2、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列
番号11、配列番号12または配列番号16として記載する配列と相違するアミノ酸配
列を持つポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。そのような変異体ポリ
ペプチドには、上述の改変ポリペプチド、保存的置換体、スプライス変異体、イ
ソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含される。
異体ポリペプチド」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸位置で配列番号2、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列
番号11、配列番号12または配列番号16として記載する配列と相違するアミノ酸配
列を持つポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。そのような変異体ポリ
ペプチドには、上述の改変ポリペプチド、保存的置換体、スプライス変異体、イ
ソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含される。
【００５２】 ここに定義される用語「保存的置換」とは、あるアミノ酸残基を別の生物学的
に類似する残基で置き換えることを意味する。例えば、保存的アミノ酸置換は、
特にそれらが当該ポリペプチドまたはタンパク質中の残基の総数の10％未満に相
当する場合は、生物活性にほとんどまたは全く影響をもたないと予想される。保
存的アミノ酸置換は、好ましくは、当該ポリペプチドまたはタンパク質の5％未
満、最も好ましくは当該ポリペプチドまたはタンパク質の2％未満の変化に相当
する（例えば、NBN113で計算すると、最も好ましい保存的置換は野生型成熟アミ
ノ酸配列中の3個未満のアミノ酸置換に相当することになる）。特に好ましい一
態様では、成熟配列中にただ一つのアミノ酸置換があり、置換される残基と代替
残基は両者とも非環状アミノ酸である。
に類似する残基で置き換えることを意味する。例えば、保存的アミノ酸置換は、
特にそれらが当該ポリペプチドまたはタンパク質中の残基の総数の10％未満に相
当する場合は、生物活性にほとんどまたは全く影響をもたないと予想される。保
存的アミノ酸置換は、好ましくは、当該ポリペプチドまたはタンパク質の5％未
満、最も好ましくは当該ポリペプチドまたはタンパク質の2％未満の変化に相当
する（例えば、NBN113で計算すると、最も好ましい保存的置換は野生型成熟アミ
ノ酸配列中の3個未満のアミノ酸置換に相当することになる）。特に好ましい一
態様では、成熟配列中にただ一つのアミノ酸置換があり、置換される残基と代替
残基は両者とも非環状アミノ酸である。
【００５３】 特に保存的な置換の他の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたは
メチオニンなどの疎水性残基の別の疎水性残基による置換、極性残基の別の極性
残基による置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるア
スパラギン酸の置換またはグルタミンによるアルパラギンの置換などが挙げられ
る。
メチオニンなどの疎水性残基の別の疎水性残基による置換、極性残基の別の極性
残基による置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるア
スパラギン酸の置換またはグルタミンによるアルパラギンの置換などが挙げられ
る。
【００５４】 保存的置換という用語には、置換ポリペプチドに対して産生させた抗体が非置
換ポリペプチドとも免疫反応するという条件の下で、非置換親アミノ酸残基の代
わりに置換アミノ酸残基を使用することも包含される。
換ポリペプチドとも免疫反応するという条件の下で、非置換親アミノ酸残基の代
わりに置換アミノ酸残基を使用することも包含される。
【００５５】 この一次アミノ酸配列の改変は、無改変の対応ポリペプチドと比較して実質的
に等価な活性を持ち、したがって当該親タンパク質の機能的類似体であるとみな
すことができるタンパク質をもたらしうる。そのような改変は、例えば部位特異
的突然変異誘発による改変のように意図的であってもよいし自発的に起こる場合
もあり、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含
される。本発明では、そのような機能的類似体も考えられている。
に等価な活性を持ち、したがって当該親タンパク質の機能的類似体であるとみな
すことができるタンパク質をもたらしうる。そのような改変は、例えば部位特異
的突然変異誘発による改変のように意図的であってもよいし自発的に起こる場合
もあり、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含
される。本発明では、そのような機能的類似体も考えられている。
【００５６】 さらにまた一次アミノ酸配列の改変は、親タンパク質の生物活性を保っていな
いタンパク質（ドミナントネガティブ型などを含む）も、もたらしうる。ドミナ
ントネガティブタンパク質は、通常は当該ポリペプチドと機能的に相互作用する
上流または下流成分などの調節因子に結合するか、それら調節因子を他の方法で
封鎖することによって、野生型タンパク質を妨害しうる。本発明では、そのよう
なドミナントネガティブ型も考えられている。
いタンパク質（ドミナントネガティブ型などを含む）も、もたらしうる。ドミナ
ントネガティブタンパク質は、通常は当該ポリペプチドと機能的に相互作用する
上流または下流成分などの調節因子に結合するか、それら調節因子を他の方法で
封鎖することによって、野生型タンパク質を妨害しうる。本発明では、そのよう
なドミナントネガティブ型も考えられている。
【００５７】 「シグナルペプチド」とは、さらなる翻訳後プロセッシングと分布のために、
当該シグナルペプチドが結合している新たに合成されたポリペプチドを小胞体（
ER）に誘導するペプチド配列である。
当該シグナルペプチドが結合している新たに合成されたポリペプチドを小胞体（
ER）に誘導するペプチド配列である。
【００５８】 ニューブラスチンに関して本明細書で使用されるとき「異種シグナルペプチド
」とは、ヒトニューブラスチンシグナルペプチドではないシグナルペプチド、通
例はニューブラスチン以外の何らかの哺乳類タンパク質のシグナルペプチドを意
味する。
」とは、ヒトニューブラスチンシグナルペプチドではないシグナルペプチド、通
例はニューブラスチン以外の何らかの哺乳類タンパク質のシグナルペプチドを意
味する。
【００５９】 ヒトニューブラスチンDNA配列（cDNAまたはゲノムDNA）、もしくはサイレント
なコドン変化または保存的アミノ酸置換をもたらすコドン変化を持つ点でヒトニ
ューブラスチンDNAとは相違する配列を使って、培養ヒト細胞が当該酵素を過剰
発現し分泌するように、それらの細胞を遺伝子改変できることは、当業者には理
解されるだろう。
なコドン変化または保存的アミノ酸置換をもたらすコドン変化を持つ点でヒトニ
ューブラスチンDNAとは相違する配列を使って、培養ヒト細胞が当該酵素を過剰
発現し分泌するように、それらの細胞を遺伝子改変できることは、当業者には理
解されるだろう。
【００６０】 本発明のポリペプチドには、ポリペプチドまたはその断片のN末端もしくはC末
端に、別のポリペプチドが融合されているキメラポリペプチドまたは切断可能な
融合ポリペプチドも包含される。キメラポリペプチドは、本発明の核酸配列（ま
たはその一部）に、別のポリペプチドをコード化する核酸配列（またはその一部
）を融合することによって作成できる。
端に、別のポリペプチドが融合されているキメラポリペプチドまたは切断可能な
融合ポリペプチドも包含される。キメラポリペプチドは、本発明の核酸配列（ま
たはその一部）に、別のポリペプチドをコード化する核酸配列（またはその一部
）を融合することによって作成できる。
【００６１】 キメラポリペプチドを製造する技術は標準的技術である。そのような技術では
、通常、各配列をそれらがどちらも同じ読み枠になるように結合し、1つまたは
複数の同じプロモーターおよび同じターミネーターの制御下に、その融合ポリペ
プチドを発現させることが必要とされる。
、通常、各配列をそれらがどちらも同じ読み枠になるように結合し、1つまたは
複数の同じプロモーターおよび同じターミネーターの制御下に、その融合ポリペ
プチドを発現させることが必要とされる。
【００６２】 本発明のポリペプチドには、完全長ニューブラスチン分子の切断型も包含され
る。そのような切断型分子では、1つまたは複数のアミノ酸が、N末端またはC末
端（好ましくはN末端）から削除されている。
る。そのような切断型分子では、1つまたは複数のアミノ酸が、N末端またはC末
端（好ましくはN末端）から削除されている。
【００６３】 アミノ酸配列相同性 候補ポリペプチドが本発明のニューブラスチンポリペプチドと相同性を共有す
る程度は、2つのアミノ酸配列間の同一度として決定される。高レベルの配列同
一性は、第1配列が第2配列に由来する可能性を示す。
る程度は、2つのアミノ酸配列間の同一度として決定される。高レベルの配列同
一性は、第1配列が第2配列に由来する可能性を示す。
【００６４】 相同性は、ClustalXコンピューター整列プログラム［Thompson, JD, Gibson T
J, Plewniak F, Jeanmougin FおよびHiggins DG「The ClustalX windows interf
ace: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by qualit
y analysis tools」Nucleic Acids Res. 197, 25(24): 4876-82］と、ここに提
案するデフォルトパラメーターなど（ただしこれに限らない）のコンピューター
分析によって決定される。このプログラムを使用すると、本発明の類似DNA配列
によってコード化されるポリペプチドの成熟部分は、配列番号2、配列番号4、配
列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番
号12または配列番号16として本明細書に記載するアミノ酸配列と、少なくとも90
％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の同一度を
示す。
J, Plewniak F, Jeanmougin FおよびHiggins DG「The ClustalX windows interf
ace: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by qualit
y analysis tools」Nucleic Acids Res. 197, 25(24): 4876-82］と、ここに提
案するデフォルトパラメーターなど（ただしこれに限らない）のコンピューター
分析によって決定される。このプログラムを使用すると、本発明の類似DNA配列
によってコード化されるポリペプチドの成熟部分は、配列番号2、配列番号4、配
列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番
号12または配列番号16として本明細書に記載するアミノ酸配列と、少なくとも90
％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98％の同一度を
示す。
【００６５】 相同性決定によれば、TGF-βスーパーファミリーに属する本発明のポリペプチ
ドはGDNFサブファミリーと近縁であるが、このサブファミリーの別個のメンバー
であることが確認される。
ドはGDNFサブファミリーと近縁であるが、このサブファミリーの別個のメンバー
であることが確認される。
【００６６】 生物活性ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパ
ク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質の形、または他の翻訳後修
飾を受けた任意のタンパク質の形を含めて、任意の生物活性形で提供できる。
ク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質の形、または他の翻訳後修
飾を受けた任意のタンパク質の形を含めて、任意の生物活性形で提供できる。
【００６７】 本発明のポリペプチドは、具体的には、好ましくは配列表に示すN残基でグリ
コシル化されるN-グリコシル化ポリペプチドであってもよい。
コシル化されるN-グリコシル化ポリペプチドであってもよい。
【００６８】 好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、122位にグリコシル化アスパ
ラギン残基を有する配列番号9として記載のアミノ酸配列、122位にグリコシル化
アスパラギン残基を有する配列番号10として記載のアミノ酸配列、98位にグリコ
シル化アスパラギン残基を有する配列番号11として記載のアミノ酸配列、または
95位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号12として記載のアミノ酸
配列を持つ。
ラギン残基を有する配列番号9として記載のアミノ酸配列、122位にグリコシル化
アスパラギン残基を有する配列番号10として記載のアミノ酸配列、98位にグリコ
シル化アスパラギン残基を有する配列番号11として記載のアミノ酸配列、または
95位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号12として記載のアミノ酸
配列を持つ。
【００６９】 本発明では、例えば参考文献としてここに援用する米国特許第5,434,131号な
どに記載されているようなIg融合物などのニューブラスチン融合タンパク質も考
えられる。
どに記載されているようなIg融合物などのニューブラスチン融合タンパク質も考
えられる。
【００７０】 一態様として本発明は、配列番号2として示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、または配列番号2として記載する配列に少なくとも約85％、好ましくは少
なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約98％、最も好ましくは少なくとも
約99％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
チド、または配列番号2として記載する配列に少なくとも約85％、好ましくは少
なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約98％、最も好ましくは少なくとも
約99％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００７１】 もう一つの態様として本発明は、配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、または配列番号4として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは
少なくとも95％、より一層好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくと
も99％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
チド、または配列番号4として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは
少なくとも95％、より一層好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくと
も99％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００７２】 第三の態様として本発明は、配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号5として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号5として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７３】 第四の態様として本発明は、配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号6として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号6として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７４】 第五の態様として本発明は、配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号7として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号7として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７５】 本発明のニューブラスチンポリペプチドには、例えば配列番号5〜7のポリペプ
チドアミノ酸配列（配列中のXaaはAsnまたはThrを示し、YaaはAlaまたはProを示
す）などの対立遺伝子変異体も包含される。
チドアミノ酸配列（配列中のXaaはAsnまたはThrを示し、YaaはAlaまたはProを示
す）などの対立遺伝子変異体も包含される。
【００７６】 第六の態様として本発明は、配列番号9のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号9として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号9として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７７】 第七の態様として本発明は、配列番号10のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号10として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号10として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７８】 第八の態様として本発明は、配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号11として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号11として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００７９】 第九の態様として本発明は、配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、または配列番号12として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
、または配列番号12として記載する配列に少なくとも90％、より好ましくは少な
くとも95％、最も好ましくは少なくとも98％相同なアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供する。
【００８０】 第十の態様として本発明は、配列番号16のアミノ酸配列を有するポリペプチド
、またはネズミプレプロニューブラスチンである配列番号16として記載の配列に
少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98
％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
、またはネズミプレプロニューブラスチンである配列番号16として記載の配列に
少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも98
％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００８１】 もう一つの態様として、本発明のポリペプチドは、GDNFサブファミリーフィン
ガープリント、すなわち表3の下線部のアミノ酸残基を持つ。
ガープリント、すなわち表3の下線部のアミノ酸残基を持つ。
【００８２】 さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号1として記載するポリヌク
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化されるポ
リペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列
番号1として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌクレ
オチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポ
リペプチドは、配列番号1として記載するポリヌクレオチド配列によってコード
化される。
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化されるポ
リペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列
番号1として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌクレ
オチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポ
リペプチドは、配列番号1として記載するポリヌクレオチド配列によってコード
化される。
【００８３】 さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号3として記載するポリヌク
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
【００８４】 さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号8として記載するポリヌク
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
【００８５】 さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号15として記載するポリヌク
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
レオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新
規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、
配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも70％相同なポリヌ
クレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明
のポリペプチドは、配列番号15として記載するポリヌクレオチド配列によってコ
ード化される。
【００８６】 生物学的起源 本発明のポリペプチドは哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞またはネズミ由来の
細胞から単離できる。
細胞から単離できる。
【００８７】 最も好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、ヒト心臓組織、ヒト骨
格筋、ヒト膵臓、またはヒト脳組織、特に尾状核もしくは視床から単離すること
ができ、または下に詳述するように、哺乳類由来のDNAから得ることができる。
格筋、ヒト膵臓、またはヒト脳組織、特に尾状核もしくは視床から単離すること
ができ、または下に詳述するように、哺乳類由来のDNAから得ることができる。
【００８８】 神経栄養活性 本発明のニューブラスチンポリペプチドは神経細胞またはニューロン細胞の代
謝、成長、分化または生存を調節するのに有用である。具体的に述べると、ニュ
ーブラスチンポリペプチドは、生きている動物（例えばヒト）の障害または疾患
であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用され
る。そのような処置と方法は、下に詳述する。
謝、成長、分化または生存を調節するのに有用である。具体的に述べると、ニュ
ーブラスチンポリペプチドは、生きている動物（例えばヒト）の障害または疾患
であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用され
る。そのような処置と方法は、下に詳述する。
【００８９】 抗体 本発明のニューブラスチンポリペプチドまたはニューブラスチンポリペプチド
断片は、ニューブラスチン特異抗体を作成するために使用される。本明細書で使
用されるとき「ニューブラスチン特異抗体」とは、ニューブラスチンポリペプチ
ドまたはニューブラスチンポリペプチド断片に対して免疫反応性の抗体またはニ
ューブラスチンポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体（例えばポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。
断片は、ニューブラスチン特異抗体を作成するために使用される。本明細書で使
用されるとき「ニューブラスチン特異抗体」とは、ニューブラスチンポリペプチ
ドまたはニューブラスチンポリペプチド断片に対して免疫反応性の抗体またはニ
ューブラスチンポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体（例えばポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。
【００９０】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造は当技術分野では周知で
ある。ポリクローナル抗体は、具体的には、例えばGreenら著「Production of P
olyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Immunochemical Protoco
ls（Manson編, Humana Press，1992）の1〜5頁、Coliganら著「Production of P
olyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters（ウサギ、ラット、
マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の産生）」Current Prot
ocols in Immunology（1992）の2.4.1節、ならびにEd HarlowおよびDavid Lane
（編）「Antibodies: A laboratory manual」（Cold Spring Harbor Lab. Press
, 1988）に記載されているように取得することができる。これらのプロトコール
は参照によりここに援用される。モノクローナル抗体は、具体的には、例えばKo
hlerおよびMilstein, Nature, 1975, 256:495、Colliganら, Current Protocols
in Immunology, 1992の2.5.1〜2.6.7節、およびHarlowら，Antibodies：A Labo
ratory Manual（Cold Spring Harbor, Pub., 1988）の726頁に記載されているよ
うに取得することができ、これらのプロトコールは参照によりここに援用される
。
ある。ポリクローナル抗体は、具体的には、例えばGreenら著「Production of P
olyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Immunochemical Protoco
ls（Manson編, Humana Press，1992）の1〜5頁、Coliganら著「Production of P
olyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters（ウサギ、ラット、
マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の産生）」Current Prot
ocols in Immunology（1992）の2.4.1節、ならびにEd HarlowおよびDavid Lane
（編）「Antibodies: A laboratory manual」（Cold Spring Harbor Lab. Press
, 1988）に記載されているように取得することができる。これらのプロトコール
は参照によりここに援用される。モノクローナル抗体は、具体的には、例えばKo
hlerおよびMilstein, Nature, 1975, 256:495、Colliganら, Current Protocols
in Immunology, 1992の2.5.1〜2.6.7節、およびHarlowら，Antibodies：A Labo
ratory Manual（Cold Spring Harbor, Pub., 1988）の726頁に記載されているよ
うに取得することができ、これらのプロトコールは参照によりここに援用される
。
【００９１】 簡単に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含んでなる組成物を例えばマ
ウスに注射し、血清試料を採取することによって抗体産生の存在を確認し、脾臓
を摘出してBリンパ球を入手し、そのBリンパ球をメラノーマ細胞と融合してハイ
ブリドーマを生成し、そのハイブリドーマをクローン化し、上記抗原に対する抗
体を産生する陽性クローンを選択し、そのハイブリドーマ培養から抗体を単離す
ることによって得ることができる。
ウスに注射し、血清試料を採取することによって抗体産生の存在を確認し、脾臓
を摘出してBリンパ球を入手し、そのBリンパ球をメラノーマ細胞と融合してハイ
ブリドーマを生成し、そのハイブリドーマをクローン化し、上記抗原に対する抗
体を産生する陽性クローンを選択し、そのハイブリドーマ培養から抗体を単離す
ることによって得ることができる。
【００９２】 モノクローナル抗体は、プロテインAセファロースによるアフィニティークロ
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどを含む、種々の確立された技術によって、ハイブリドーマ培養から単離お
よび精製できる。例えばColiganら, Current Protocols in Immunology, 1992,
2.7.1〜2.7.12節および2.9.1〜2.9.3節ならびにBarnesら著「Purification of I
mmunoglobulin G (IgG)」Methods in Molecular Biology（Humana Press, 1992
）の第10巻79〜104頁を参照されたい。ポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体は、随意に、例えば、その抗体を産生させる際に対象としたポリペプチド
が結合しているマトリックスへの結合と、そのマトリックスからの溶出によって
、さらに精製することができる。
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどを含む、種々の確立された技術によって、ハイブリドーマ培養から単離お
よび精製できる。例えばColiganら, Current Protocols in Immunology, 1992,
2.7.1〜2.7.12節および2.9.1〜2.9.3節ならびにBarnesら著「Purification of I
mmunoglobulin G (IgG)」Methods in Molecular Biology（Humana Press, 1992
）の第10巻79〜104頁を参照されたい。ポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体は、随意に、例えば、その抗体を産生させる際に対象としたポリペプチド
が結合しているマトリックスへの結合と、そのマトリックスからの溶出によって
、さらに精製することができる。
【００９３】 本発明のニューブラスチンポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチ
ドまたは興味のある小ペプチドを含有する断片を免疫抗原として使用して、作成
することができる。動物の免疫化に使用するポリペプチドは、組換えDNA技術に
よって、または化学合成によって得ることができ、それらのポリペプチドは随意
に担体タンパク質に結合してもよい。ペプチドに化学的に結合される担体タンパ
ク質であって、よく使用されるものには、キーホールリンペットヘモシアニン（
KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）および破傷風トキソイドが
ある。次に、結合したペプチドを使って動物（具体的にはマウス、ラット、ハム
スターまたはウサギなどが挙げられる）を免疫化する。
ドまたは興味のある小ペプチドを含有する断片を免疫抗原として使用して、作成
することができる。動物の免疫化に使用するポリペプチドは、組換えDNA技術に
よって、または化学合成によって得ることができ、それらのポリペプチドは随意
に担体タンパク質に結合してもよい。ペプチドに化学的に結合される担体タンパ
ク質であって、よく使用されるものには、キーホールリンペットヘモシアニン（
KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）および破傷風トキソイドが
ある。次に、結合したペプチドを使って動物（具体的にはマウス、ラット、ハム
スターまたはウサギなどが挙げられる）を免疫化する。
【００９４】 一態様として、抗体は次のペプチドを用いて作成される：ペプチド1：CRPTRYE
AVSFMDVNST（配列番号9のアミノ酸(AA)108-124）またはペプチド2：ALRPPPGSRPV
SQPC（配列番号9のアミノ酸93-107）。これらのポリペプチドを用いて抗体を作
成する方法は実施例10に記載する。
AVSFMDVNST（配列番号9のアミノ酸(AA)108-124）またはペプチド2：ALRPPPGSRPV
SQPC（配列番号9のアミノ酸93-107）。これらのポリペプチドを用いて抗体を作
成する方法は実施例10に記載する。
【００９５】 本発明者らは、次のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体も作成した。
【００９６】
【外３】 このグループのうち、比較的C末端に近いペプチドR30およびR31だけが、ウェ
スタンブロット上で、還元条件下に、変性タンパク質を認識した。
スタンブロット上で、還元条件下に、変性タンパク質を認識した。
【００９７】 本発明者らは、既知のGDNF構造に基づいて表面露出ループであると予想され（
EigenbrotおよびGerber, Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 435-438）、したがっ
て抗体作成に有用である、成熟タンパク質由来のさらなるニューブラスチン由来
ペプチドも、下に詳述するように同定した。
EigenbrotおよびGerber, Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 435-438）、したがっ
て抗体作成に有用である、成熟タンパク質由来のさらなるニューブラスチン由来
ペプチドも、下に詳述するように同定した。
【００９８】
【外４】 本発明のもう一つの側面として、ニューブラスチンまたはニューブラスチン由
来ペプチドを特異的に結合する抗体は、様々な媒質中のそれらニューブラスチン
神経栄養因子の存在を検出するために、また特に、本発明のニューブラスチン分
子と関係する状態または疾患の診断に使用できる。当技術分野では、例えばELIS
A、RIAおよびFACSなどといった、そのような検出のための様々なプロトコールが
知られている。
来ペプチドを特異的に結合する抗体は、様々な媒質中のそれらニューブラスチン
神経栄養因子の存在を検出するために、また特に、本発明のニューブラスチン分
子と関係する状態または疾患の診断に使用できる。当技術分野では、例えばELIS
A、RIAおよびFACSなどといった、そのような検出のための様々なプロトコールが
知られている。
【００９９】 本発明の抗体は本神経栄養因子の効果を遮断するためにも使用でき、具体的に
は中和抗体でありうる。
は中和抗体でありうる。
【０１００】 本発明のポリペプチドの製造方法 下に詳述するように、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化する
DNA配列を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な条件で培養した後、そ
の培養培地から当該ポリペプチドの回収を行なう。ニューブラスチンポリペプチ
ドを生産する目的で細胞を遺伝子改変する必要がある場合は、細胞を従来の方法
で、または遺伝子活性化法によって、改変することができる。
DNA配列を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な条件で培養した後、そ
の培養培地から当該ポリペプチドの回収を行なう。ニューブラスチンポリペプチ
ドを生産する目的で細胞を遺伝子改変する必要がある場合は、細胞を従来の方法
で、または遺伝子活性化法によって、改変することができる。
【０１０１】 従来の方法では、ニューブラスチンcDNAまたはゲノムDNA配列を含有するDNA分
子が発現構築体内に含まれ、例えばリポソーム-、ポリブレン-またはDEAEデキス
トラン-トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈
殿法、マイクロインジェクション、または加速微粒子法（「バイオリスティック
法」）など（ただしこれらに限らない）の標準的方法によって、細胞中にトラン
スフェクトされる。もう一つの選択肢として、ウイルスベクターによってDNAを
送達する系も使用できるだろう。遺伝子導入に役立つことが知られているウイル
スには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイ
ルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウ
イルス、およびカナリア痘瘡ウイルスなどのワクシニアウイルス、ならびに昆虫
細胞（特にSfP9昆虫細胞）のバキュロウイルス感染などがある。
子が発現構築体内に含まれ、例えばリポソーム-、ポリブレン-またはDEAEデキス
トラン-トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈
殿法、マイクロインジェクション、または加速微粒子法（「バイオリスティック
法」）など（ただしこれらに限らない）の標準的方法によって、細胞中にトラン
スフェクトされる。もう一つの選択肢として、ウイルスベクターによってDNAを
送達する系も使用できるだろう。遺伝子導入に役立つことが知られているウイル
スには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイ
ルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウ
イルス、およびカナリア痘瘡ウイルスなどのワクシニアウイルス、ならびに昆虫
細胞（特にSfP9昆虫細胞）のバキュロウイルス感染などがある。
【０１０２】 もう一つの選択肢として、米国特許第5,733,761号および同第5,750,376号（そ
れぞれ参考文献としてここに援用する）に記載されているような遺伝子活性化（
「GA」）法を使って、細胞を改変することもできる。
れぞれ参考文献としてここに援用する）に記載されているような遺伝子活性化（
「GA」）法を使って、細胞を改変することもできる。
【０１０３】 したがって、細胞に関して本明細書で使用する「遺伝子改変（された）」とい
う用語は、特定の遺伝子産物を、その遺伝子産物をコード化するDNA分子および/
またはその遺伝子産物のコード配列の発現を制御する調節要素をコード化するDN
A分子が導入された結果、発現させる細胞を包含するものとする。上記DNA分子は
、特定のゲノム部位への当該DNA分子の組み込みを可能にする遺伝子ターゲティ
ングによって導入することができる。
う用語は、特定の遺伝子産物を、その遺伝子産物をコード化するDNA分子および/
またはその遺伝子産物のコード配列の発現を制御する調節要素をコード化するDN
A分子が導入された結果、発現させる細胞を包含するものとする。上記DNA分子は
、特定のゲノム部位への当該DNA分子の組み込みを可能にする遺伝子ターゲティ
ングによって導入することができる。
【０１０４】 組換え発現ベクター さらなる側面として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現
ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは任意の適当な真核細胞用発
現ベクターであってよい。好ましい組換え発現ベクターは、ユビキチンプロモー
ター含有ベクターpTEJ-8（Johansen TE, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T
, FEBS Lett. 1990, 267, 289-294）およびその誘導体、例えばpUbi1Zである。
好ましい市販の真核細胞用発現ベクターには、例えばウイルスプロモーター含有
ベクターpcDNA-3（Invitrogenから入手できる）がある。もう一つの好ましい発
現ベクターはSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミド
pAD2betaに由来、NortonおよびCoffin, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 281）を使
用するものである。
ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは任意の適当な真核細胞用発
現ベクターであってよい。好ましい組換え発現ベクターは、ユビキチンプロモー
ター含有ベクターpTEJ-8（Johansen TE, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T
, FEBS Lett. 1990, 267, 289-294）およびその誘導体、例えばpUbi1Zである。
好ましい市販の真核細胞用発現ベクターには、例えばウイルスプロモーター含有
ベクターpcDNA-3（Invitrogenから入手できる）がある。もう一つの好ましい発
現ベクターはSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミド
pAD2betaに由来、NortonおよびCoffin, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 281）を使
用するものである。
【０１０５】 本発明は、原核細胞用発現ベクターおよび原核細胞での発現にコドンを最適化
した合成遺伝子（シンジーン（syngene））も提供する。シンジーンは、より低
いGC含量と好ましい細菌（例えば大腸菌）コドンを持つものを構築した。このシ
ンジーンは2つのベクター、すなわちpET19bと、pET19bの誘導体であるpMJB164に
クローニングされている。pET19bを使った構築を図14に示す。この構築体では、
ニューブラスチンの成熟ドメインをコード化する配列が開始メチオニンに直接融
合されている。pMJB164を使った構築を図15に示す。
した合成遺伝子（シンジーン（syngene））も提供する。シンジーンは、より低
いGC含量と好ましい細菌（例えば大腸菌）コドンを持つものを構築した。このシ
ンジーンは2つのベクター、すなわちpET19bと、pET19bの誘導体であるpMJB164に
クローニングされている。pET19bを使った構築を図14に示す。この構築体では、
ニューブラスチンの成熟ドメインをコード化する配列が開始メチオニンに直接融
合されている。pMJB164を使った構築を図15に示す。
【０１０６】 産生細胞 さらにもう一つの側面として、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチ
ド配列および/または本発明の組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作され
た産生細胞を提供する。本発明の細胞は、具体的には、本発明のポリペプチドを
一過性または安定に発現、過剰発現もしくは同時発現するように遺伝子操作する
ことができる。一過性または安定発現を引き起こす方法は当技術分野では知られ
ている。
ド配列および/または本発明の組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作され
た産生細胞を提供する。本発明の細胞は、具体的には、本発明のポリペプチドを
一過性または安定に発現、過剰発現もしくは同時発現するように遺伝子操作する
ことができる。一過性または安定発現を引き起こす方法は当技術分野では知られ
ている。
【０１０７】 本発明のポリヌクレオチドは発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまた
は他の発現媒体）に挿入することができ、また随意に、発現制御配列に対して、
コード配列の発現が当該発現制御配列に適合する条件で達成されるような方法で
、連結により、機能的に連結することができる。好適な発現制御配列には、プロ
モーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのため
のスプライスシグナル、停止コドンなどがあり、それらは全て、mRNAの適切な翻
訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチドの正しい読み枠内に保たれる。発現
制御配列にはリーダー配列、融合パートナー配列などの追加の成分を含めてもよ
い。
は他の発現媒体）に挿入することができ、また随意に、発現制御配列に対して、
コード配列の発現が当該発現制御配列に適合する条件で達成されるような方法で
、連結により、機能的に連結することができる。好適な発現制御配列には、プロ
モーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのため
のスプライスシグナル、停止コドンなどがあり、それらは全て、mRNAの適切な翻
訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチドの正しい読み枠内に保たれる。発現
制御配列にはリーダー配列、融合パートナー配列などの追加の成分を含めてもよ
い。
【０１０８】 プロモーターは具体的には構成的プロモーターでも誘導性プロモーターでもよ
い。細菌系でクローニングを行なう場合は、バクテリオファージλのpL、plac、
ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを
使用できる。クローニングを哺乳類系で行なう場合は、哺乳類細胞のゲノムに由
来するプロモーター、例えばユビキチンプロモーター、TKプロモーターまたはメ
タロチオネインプロモーターなど、もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモー
ター、例えばレトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターま
たはワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなどを使用できる。組換えDNA法また
は合成法によって得られるプロモーターも、本発明ポリヌクレオチドの転写に備
えて使用することができる。
い。細菌系でクローニングを行なう場合は、バクテリオファージλのpL、plac、
ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを
使用できる。クローニングを哺乳類系で行なう場合は、哺乳類細胞のゲノムに由
来するプロモーター、例えばユビキチンプロモーター、TKプロモーターまたはメ
タロチオネインプロモーターなど、もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモー
ター、例えばレトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターま
たはワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなどを使用できる。組換えDNA法また
は合成法によって得られるプロモーターも、本発明ポリヌクレオチドの転写に備
えて使用することができる。
【０１０９】 好適な発現ベクターは通例、発現起点（origin of expression）、プロモータ
ーおよび形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含み、例
えば細菌における発現のためのT7系発現ベクター［Rosenbergら, Gene 1987, 56
, 125］、哺乳類細胞における発現のためのpTEJ-8、pUbi1Z、pcDNA-3およびpMSX
ND発現ベクター［LeeおよびNathans, J. Biol. Chem. 1988, 263, 3521］、昆虫
細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、および卵母細胞発現
ベクターPTLN［Lorenz C, Pusch MおよびJentsch TJ著「Heteromultimeric CLC
chloride channels with novel properties（新規な特性をもつヘテロ多量体型C
LC塩素イオンチャネル）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 93, 13362-13366
］などが挙げられる。
ーおよび形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含み、例
えば細菌における発現のためのT7系発現ベクター［Rosenbergら, Gene 1987, 56
, 125］、哺乳類細胞における発現のためのpTEJ-8、pUbi1Z、pcDNA-3およびpMSX
ND発現ベクター［LeeおよびNathans, J. Biol. Chem. 1988, 263, 3521］、昆虫
細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、および卵母細胞発現
ベクターPTLN［Lorenz C, Pusch MおよびJentsch TJ著「Heteromultimeric CLC
chloride channels with novel properties（新規な特性をもつヘテロ多量体型C
LC塩素イオンチャネル）」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 93, 13362-13366
］などが挙げられる。
【０１１０】 好ましい一態様として、本発明の細胞は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの
哺乳類細胞、卵母細胞または酵母細胞である。本発明の細胞は、HEK293細胞など
のヒト胎児腎臓（HEK）細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞（XLO）であってよいが
、これらに限定されるわけではない。もう一つの態様としては、本発明の細胞は
、真菌細胞、例えば糸状菌細胞である。もう一つの好ましい態様として、本細胞
は昆虫細胞であり、最も好ましくはSf9細胞である。他の好ましい本発明の哺乳
類細胞はPC12、HiB5、RN33b細胞系およびヒト神経前駆細胞である。ヒト細胞が
最も好ましい。
哺乳類細胞、卵母細胞または酵母細胞である。本発明の細胞は、HEK293細胞など
のヒト胎児腎臓（HEK）細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞（XLO）であってよいが
、これらに限定されるわけではない。もう一つの態様としては、本発明の細胞は
、真菌細胞、例えば糸状菌細胞である。もう一つの好ましい態様として、本細胞
は昆虫細胞であり、最も好ましくはSf9細胞である。他の好ましい本発明の哺乳
類細胞はPC12、HiB5、RN33b細胞系およびヒト神経前駆細胞である。ヒト細胞が
最も好ましい。
【０１１１】 初代または二次細胞の例としては、線維芽細胞、上皮細胞（乳腺上皮細胞およ
び腸上皮細胞を含む）、内皮細胞、血液の固形成分（リンパ球および骨髄細胞を
含む）、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋細胞、神経細胞、またはそれ
ら細胞型の前駆体が挙げられる。本発明方法に有用な不死化ヒト細胞系の例とし
ては、Bowesメラノーマ細胞（ATCC受託番号CRL9607）、Daudi細胞（ATCC受託番
号CCL213）、HeLa細胞およびHeLa細胞の派生株（ATCC受託番号CCL2、CCL2.1、お
よびCCL2.2）、HL-60細胞（ATCC受託番号CCL240）、HT-1080細胞（ATCC受託番号
CCL121）、Jurkat細胞（ATCC受託番号TIB152）、KB癌腫細胞（ATCC受託番号CCL1
7）、K-562白血病細胞（ATCC受託番号CCL243）、MCF-7乳癌細胞（ATCC受託番号B
TH22）、MOLT-4細胞（ATCC受託番号1582）、Namalwa細胞（ATCC受託番号CRL1432
）、Raji細胞（ATCC受託番号CCL86）、RPMI8226細胞（ATCC受託番号CCL155）、U
-937細胞（ATCC受託番号CRL1593）、WI-38VA13亜系統2R4細胞（ATCC受託番号CLL
75.1）、2780AD卵巣癌細胞（Van der Blickら, Cancer Res. 1988, 48, 5927-5
932）およびヒト細胞と別の種の細胞との融合によって作出されるヘテロハイブ
リドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。WI-38（ATCC
受託番号CCL75）およびMRC-5（ATCC受託番号CCL171）などの二次ヒト線維芽細胞
株も使用できる。
び腸上皮細胞を含む）、内皮細胞、血液の固形成分（リンパ球および骨髄細胞を
含む）、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋細胞、神経細胞、またはそれ
ら細胞型の前駆体が挙げられる。本発明方法に有用な不死化ヒト細胞系の例とし
ては、Bowesメラノーマ細胞（ATCC受託番号CRL9607）、Daudi細胞（ATCC受託番
号CCL213）、HeLa細胞およびHeLa細胞の派生株（ATCC受託番号CCL2、CCL2.1、お
よびCCL2.2）、HL-60細胞（ATCC受託番号CCL240）、HT-1080細胞（ATCC受託番号
CCL121）、Jurkat細胞（ATCC受託番号TIB152）、KB癌腫細胞（ATCC受託番号CCL1
7）、K-562白血病細胞（ATCC受託番号CCL243）、MCF-7乳癌細胞（ATCC受託番号B
TH22）、MOLT-4細胞（ATCC受託番号1582）、Namalwa細胞（ATCC受託番号CRL1432
）、Raji細胞（ATCC受託番号CCL86）、RPMI8226細胞（ATCC受託番号CCL155）、U
-937細胞（ATCC受託番号CRL1593）、WI-38VA13亜系統2R4細胞（ATCC受託番号CLL
75.1）、2780AD卵巣癌細胞（Van der Blickら, Cancer Res. 1988, 48, 5927-5
932）およびヒト細胞と別の種の細胞との融合によって作出されるヘテロハイブ
リドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。WI-38（ATCC
受託番号CCL75）およびMRC-5（ATCC受託番号CCL171）などの二次ヒト線維芽細胞
株も使用できる。
【０１１２】 本発明の細胞が真核細胞である場合、異種ポリヌクレオチドの取り込みは、具
体的には、感染（ウイルスベクターを使用）、トランスフェクション（プラスミ
ドベクターを使用）、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エ
レクトロポレーション、リポフェクションまたは当技術分野で知られる他の物理
的化学的方法によって行なうことができる。
体的には、感染（ウイルスベクターを使用）、トランスフェクション（プラスミ
ドベクターを使用）、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エ
レクトロポレーション、リポフェクションまたは当技術分野で知られる他の物理
的化学的方法によって行なうことができる。
【０１１３】 より好ましい態様として、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および/
または本発明の組換え発現ベクターは、細胞の不死化および/またはトランスフ
ォーメーションを媒介することができる少なくとも一つのDNA分子を含む哺乳類
宿主細胞、神経前駆細胞、星状膠細胞、T細胞、造血幹細胞、非分裂細胞または
大脳内皮細胞にトランスフェクトされる。
または本発明の組換え発現ベクターは、細胞の不死化および/またはトランスフ
ォーメーションを媒介することができる少なくとも一つのDNA分子を含む哺乳類
宿主細胞、神経前駆細胞、星状膠細胞、T細胞、造血幹細胞、非分裂細胞または
大脳内皮細胞にトランスフェクトされる。
【０１１４】 宿主細胞における内因性遺伝子の活性化は、調節要素を導入することによって
、具体的には、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化する内因性遺
伝子の転写をもたらすことができるプロモーターを導入することによって、達成
することができる。
、具体的には、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化する内因性遺
伝子の転写をもたらすことができるプロモーターを導入することによって、達成
することができる。
【０１１５】 医薬組成物 もう一つの側面として本発明は、治療有効量の本発明ポリペプチドを含んでな
る新規医薬組成物を提供する。
る新規医薬組成物を提供する。
【０１１６】 本発明のポリペプチドは、治療用として、任意の便利な形態で投与することが
できる。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の佐
剤、賦形剤、担体および/または希釈剤と共に、当技術分野で知られる従来の方
法を使って当業者が製造する医薬組成物に組み込まれる。
できる。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の佐
剤、賦形剤、担体および/または希釈剤と共に、当技術分野で知られる従来の方
法を使って当業者が製造する医薬組成物に組み込まれる。
【０１１７】 上記の医薬組成物は、本発明のポリペプチドまたはその抗体を含みうる。本組
成物は単独でまたは1つもしくは複数の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせ
て投与することができる。
成物は単独でまたは1つもしくは複数の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせ
て投与することができる。
【０１１８】 本発明の医薬組成物は、例えば経口、静脈内、筋肉内、動脈間（interarteria
l）、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸（anter
al）、局所外用、舌下または直腸適用、口腔内、膣、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄
腔内、脳室内、槽内、嚢内、肺内、経粘膜または吸入など（ただしこれらに限ら
ない）の任意の適当な経路で投与できる。
l）、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸（anter
al）、局所外用、舌下または直腸適用、口腔内、膣、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄
腔内、脳室内、槽内、嚢内、肺内、経粘膜または吸入など（ただしこれらに限ら
ない）の任意の適当な経路で投与できる。
【０１１９】 肺内送達の方法、装置および製薬は、例えば米国特許第5,785,049号、第5,780
,019号および第5,775,320号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などに
記載されている。投与は製剤の定期的ボーラス注射によって行なうことができ、
または体外（例えばIVバッグ）もしくは体内（例えば生崩壊性植込み剤、生体人
工器官、または移植されたニューブラスチン産生細胞のコロニー）にあるリザー
バーからの静脈内または腹腔内投与によって、より継続的に行なうことができる
。例えば米国特許第4,407,957号、第5,798,113号および第5,800,828号（それぞ
れ参考文献としてここに援用する）などを参照されたい。肺内送達の方法および
装置は、例えば米国特許第5,654,007号、第5,780,014号および第5,814,607号（
それぞれ参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
,019号および第5,775,320号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などに
記載されている。投与は製剤の定期的ボーラス注射によって行なうことができ、
または体外（例えばIVバッグ）もしくは体内（例えば生崩壊性植込み剤、生体人
工器官、または移植されたニューブラスチン産生細胞のコロニー）にあるリザー
バーからの静脈内または腹腔内投与によって、より継続的に行なうことができる
。例えば米国特許第4,407,957号、第5,798,113号および第5,800,828号（それぞ
れ参考文献としてここに援用する）などを参照されたい。肺内送達の方法および
装置は、例えば米国特許第5,654,007号、第5,780,014号および第5,814,607号（
それぞれ参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
【０１２０】 具体的に述べると、本発明によるニューブラスチンの投与は、 (a）ポンプ（例えばAnnals of Pharmacotherapy, 27:912（1993）；Cancer, 4
1:1270（1993）；Cancer Research, 44:1698（1984）（参考文献としてここに援
用する）を参照されたい）、 (b）マイクロカプセル化（例えば米国特許第4,352,883号、第4,353,888号およ
び第5,084,350号（参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (c）持続放出ポリマー植込み剤（例えばSabel, 米国特許第4,883,66号（参考
文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (d）マクロカプセル化（例えば米国特許第5,284,761号、第5,158,881号、第4,
976,859号および第4,968,733号ならびにPCT特許出願公開WO92/19195、WO95/0545
2（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (e）CNSへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植物（例えば米国特許
第5,082,670号および第5,618,531号（それぞれ参考文献としてここに援用する）
、 (f）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内への、または他の適当な部位への注射、お
よび (g）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、または持続放出製剤としての経口投与 を含めて、任意の適当な送達手段を使って達成できる。
1:1270（1993）；Cancer Research, 44:1698（1984）（参考文献としてここに援
用する）を参照されたい）、 (b）マイクロカプセル化（例えば米国特許第4,352,883号、第4,353,888号およ
び第5,084,350号（参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (c）持続放出ポリマー植込み剤（例えばSabel, 米国特許第4,883,66号（参考
文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (d）マクロカプセル化（例えば米国特許第5,284,761号、第5,158,881号、第4,
976,859号および第4,968,733号ならびにPCT特許出願公開WO92/19195、WO95/0545
2（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、 (e）CNSへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植物（例えば米国特許
第5,082,670号および第5,618,531号（それぞれ参考文献としてここに援用する）
、 (f）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内への、または他の適当な部位への注射、お
よび (g）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、または持続放出製剤としての経口投与 を含めて、任意の適当な送達手段を使って達成できる。
【０１２１】 本発明の一態様では、ニューブラスチンが、CNSに、好ましくは脳室、脳実質
、くも膜下腔または他の適当なCNS部位に、最も好ましくはくも膜下腔内に、直
接送達される。
、くも膜下腔または他の適当なCNS部位に、最も好ましくはくも膜下腔内に、直
接送達される。
【０１２２】 もう一つの好ましい態様として、本発明者らは、皮下注射、静脈内投与または
静脈内注入による全身送達を考えている。
静脈内注入による全身送達を考えている。
【０１２３】 他の有用な非経口送達システムには、エチレン-ビニル酢酸コポリマー粒子、
浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポ
ソーム送達、注射針による注射、ニードルレス注射、噴霧器、エアロゾル化装置
、エレクトロポレーションおよび経皮パッチがある。
浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポ
ソーム送達、注射針による注射、ニードルレス注射、噴霧器、エアロゾル化装置
、エレクトロポレーションおよび経皮パッチがある。
【０１２４】 製剤化と投与の技術に関するさらなる詳細はRemington’s Pharmaceutical Sc
iences（Maack Publishing Co.，ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見る
ことができる。
iences（Maack Publishing Co.，ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見る
ことができる。
【０１２５】 活性成分は1日に1回または数回の投薬で投与することができる。現時点で考え
られる適切な投薬量は、1投与あたり0.5ng/kg-体重〜約50μg/kgおよび1日あた
り約1.0ng/kg〜約100μg/kgのニューブラスチンである。ニューブラスチン医薬
組成物は、神経栄養因子の局所濃度を、約5ng/ml-脳脊髄液（「CSF」）〜25ng/m
l-CSFにするべきである。
られる適切な投薬量は、1投与あたり0.5ng/kg-体重〜約50μg/kgおよび1日あた
り約1.0ng/kg〜約100μg/kgのニューブラスチンである。ニューブラスチン医薬
組成物は、神経栄養因子の局所濃度を、約5ng/ml-脳脊髄液（「CSF」）〜25ng/m
l-CSFにするべきである。
【０１２６】 投与される量はもちろん、処置される個体の年齢、体重および状態ならびに投
与経路、剤形、投与計画および所望する結果に注意深く適応させなければならず
、正確な投薬量はもちろん医師によって決定されるべきである。
与経路、剤形、投与計画および所望する結果に注意深く適応させなければならず
、正確な投薬量はもちろん医師によって決定されるべきである。
【０１２７】 さらなる態様として、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、下記治療法
の項に詳述するように細胞系およびベクターを使用して、遺伝子送達によって投
与することができる。そのような治療用細胞系を作成するために、本発明のポリ
ヌクレオチドを発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体
）に挿入し、発現制御配列に対して、コード配列の発現が当該発現制御配列に適
合する条件で達成されるような方法で、連結により、機能的に連結することがで
きる。好適な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネー
ター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナル、停止コドンが含ま
れ、それらは全て、mRNAの適切な翻訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチド
の正しい読み枠内に保たれる。発現制御配列にはリーダー配列、融合パートナー
配列などの追加の成分を含めてもよい。
の項に詳述するように細胞系およびベクターを使用して、遺伝子送達によって投
与することができる。そのような治療用細胞系を作成するために、本発明のポリ
ヌクレオチドを発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体
）に挿入し、発現制御配列に対して、コード配列の発現が当該発現制御配列に適
合する条件で達成されるような方法で、連結により、機能的に連結することがで
きる。好適な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネー
ター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナル、停止コドンが含ま
れ、それらは全て、mRNAの適切な翻訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチド
の正しい読み枠内に保たれる。発現制御配列にはリーダー配列、融合パートナー
配列などの追加の成分を含めてもよい。
【０１２８】 プロモーターは具体的には構成的プロモーターでも誘導性プロモーターでもよ
い。構成的プロモーターとしては、合成プロモーター、ウイルスプロモーターま
たは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばヒトユビキチンプロモータ
ー）などが考えられる。好ましい一態様として、本治療用細胞系は、本発明のポ
リペプチドを発現させるヒト不死化神経細胞系になるだろう。移植について本発
明者らは、約105〜1010細胞、より好適には106〜約108細胞を移植することを考
えている。
い。構成的プロモーターとしては、合成プロモーター、ウイルスプロモーターま
たは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばヒトユビキチンプロモータ
ー）などが考えられる。好ましい一態様として、本治療用細胞系は、本発明のポ
リペプチドを発現させるヒト不死化神経細胞系になるだろう。移植について本発
明者らは、約105〜1010細胞、より好適には106〜約108細胞を移植することを考
えている。
【０１２９】 治療法 ポリヌクレオチオおよびタンパク質、そこから生産されるポリペプチド、ペプ
チド断片または誘導体、ならびにそれらタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対
する抗体に関する本発明は、動物（ヒトを含む）の生体の障害または疾患であっ
て神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用できる。
チド断片または誘導体、ならびにそれらタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対
する抗体に関する本発明は、動物（ヒトを含む）の生体の障害または疾患であっ
て神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用できる。
【０１３０】 本発明のポリペプチドは、ニューブラスチンポリペプチドに反応する病理学的
過程を処置するために、例えば注射、植込みまたは経口摂取型医薬組成物などを
介して直接使用できる。
過程を処置するために、例えば注射、植込みまたは経口摂取型医薬組成物などを
介して直接使用できる。
【０１３１】 本発明のポリヌクレオチドは、その相補配列を含めて、本発明の神経栄養因子
の発現に使用できる。これは、それら本発明のタンパク質、ペプチドまたは誘導
体を発現させる細胞系によって、またはそれら本発明のタンパク質、ペプチドま
たは誘導体をコード化するウイルスベクターによって、またはそれらタンパク質
、ペプチドまたは誘導体を発現させる宿主細胞によって達成できる。これらの細
胞、ベクターおよび組成物は、ニューブラスチンポリペプチドに反応する疾患過
程に冒されている処置標的領域に投与できる。
の発現に使用できる。これは、それら本発明のタンパク質、ペプチドまたは誘導
体を発現させる細胞系によって、またはそれら本発明のタンパク質、ペプチドま
たは誘導体をコード化するウイルスベクターによって、またはそれらタンパク質
、ペプチドまたは誘導体を発現させる宿主細胞によって達成できる。これらの細
胞、ベクターおよび組成物は、ニューブラスチンポリペプチドに反応する疾患過
程に冒されている処置標的領域に投与できる。
【０１３２】 好適な発現ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、
ヘルペスまたはワクシニアウイルスもしくは種々の細菌産生プラスミドから得る
ことができ、生物全体または標的とする器官、組織または細胞集団へのヌクレオ
チド配列のインビボ送達に使用できる。他の方法には、リポソームトランスフェ
クション、エレクトロポレーション、核その他の局在シグナルを含む担体ペプチ
ドを用いたトランスフェクションおよび徐放系による遺伝子送達などがあるが、
これらに限定されるわけではない。本発明のさらにもう一つの側面として、ニュ
ーブラスチン発現を阻害または増進するために、ニューブラスチン遺伝子または
その一部に相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列を使用できる。
ヘルペスまたはワクシニアウイルスもしくは種々の細菌産生プラスミドから得る
ことができ、生物全体または標的とする器官、組織または細胞集団へのヌクレオ
チド配列のインビボ送達に使用できる。他の方法には、リポソームトランスフェ
クション、エレクトロポレーション、核その他の局在シグナルを含む担体ペプチ
ドを用いたトランスフェクションおよび徐放系による遺伝子送達などがあるが、
これらに限定されるわけではない。本発明のさらにもう一つの側面として、ニュ
ーブラスチン発現を阻害または増進するために、ニューブラスチン遺伝子または
その一部に相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列を使用できる。
【０１３３】 さらにもう一つの側面として、本発明は、動物（ヒトを含む）の生体の障害ま
たは疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減する方法に
関する。
たは疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減する方法に
関する。
【０１３４】 上記の障害または疾患は、具体的には、外傷、手術、虚血、感染、代謝性疾患
、栄養不足、悪性腫瘍または毒物によって起こる神経系の損傷および遺伝性また
は特発性の過程でありうる。
、栄養不足、悪性腫瘍または毒物によって起こる神経系の損傷および遺伝性また
は特発性の過程でありうる。
【０１３５】 上記の損傷は、具体的には、感覚ニューロンまたは網膜神経節細胞（後根神経
節のニューロンまたは次に挙げる組織中の任意のニューロンを含む）に起こって
いるものであってよい：膝、錐体および節状神経節、第八脳神経の前庭聴覚複合
体、三叉神経節の上下顎葉の腹外側極、および中脳三叉神経核。
節のニューロンまたは次に挙げる組織中の任意のニューロンを含む）に起こって
いるものであってよい：膝、錐体および節状神経節、第八脳神経の前庭聴覚複合
体、三叉神経節の上下顎葉の腹外側極、および中脳三叉神経核。
【０１３６】 本発明方法の好ましい一態様では、上記の疾患または障害が、例えば末梢神経
、延髄および/または脊髄の外傷性損傷、脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、
特に末梢神経障害、末梢神経の外傷または損傷、虚血性脳卒中、急性脳損傷、急
性脊髄損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、神経毒へのばく露、糖尿病または腎機
能不全などの代謝性疾患、および感染性物質によって起こる損傷、アルツハイマ
ー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、進行性核
上麻痺（スチール・リチャードソン・オルセウスキー症候群）、オリーブ橋小脳
萎縮症（OPCA）、シャイ・ドレーガー症候群（多系統萎縮症）、グァムパーキン
ソン痴呆症候群、筋萎縮性側索硬化症、または他の任意の先天性または神経変性
疾患、および痴呆に関係する記憶障害などの、損傷したニューロンおよび外傷性
ニューロンが関係する神経変性疾患である。
、延髄および/または脊髄の外傷性損傷、脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、
特に末梢神経障害、末梢神経の外傷または損傷、虚血性脳卒中、急性脳損傷、急
性脊髄損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、神経毒へのばく露、糖尿病または腎機
能不全などの代謝性疾患、および感染性物質によって起こる損傷、アルツハイマ
ー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、進行性核
上麻痺（スチール・リチャードソン・オルセウスキー症候群）、オリーブ橋小脳
萎縮症（OPCA）、シャイ・ドレーガー症候群（多系統萎縮症）、グァムパーキン
ソン痴呆症候群、筋萎縮性側索硬化症、または他の任意の先天性または神経変性
疾患、および痴呆に関係する記憶障害などの、損傷したニューロンおよび外傷性
ニューロンが関係する神経変性疾患である。
【０１３７】 好ましい一態様として、本発明者らは、感覚系および/または自律系ニューロ
ンの処置を考えている。もう一つの好ましい態様として、本発明者らは、筋萎縮
性側索硬化症（「ALS」）および脊髄筋萎縮症などの運動ニューロン疾患の処置
を考えている。さらにもう一つの好ましい態様として、本発明者らは、本発明ニ
ューブラスチン分子を使用して外傷性損傷後の神経回復を増進することを考えて
いる。一態様として、本発明者らは、神経誘導管をニューブラスチンポリペプチ
ドを含有するマトリックスと共に使用することを考えている。そのような神経誘
導管は、例えば米国特許第5,834,029号（参考文献としてここに援用する）に開
示されている。
ンの処置を考えている。もう一つの好ましい態様として、本発明者らは、筋萎縮
性側索硬化症（「ALS」）および脊髄筋萎縮症などの運動ニューロン疾患の処置
を考えている。さらにもう一つの好ましい態様として、本発明者らは、本発明ニ
ューブラスチン分子を使用して外傷性損傷後の神経回復を増進することを考えて
いる。一態様として、本発明者らは、神経誘導管をニューブラスチンポリペプチ
ドを含有するマトリックスと共に使用することを考えている。そのような神経誘
導管は、例えば米国特許第5,834,029号（参考文献としてここに援用する）に開
示されている。
【０１３８】 好ましい一態様として、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびにそれらを
含んでなる医薬組成物）は、末梢神経障害の処置に使用される。本発明の分子に
よる治療が考えられる末梢神経障害には、外傷誘発性の神経障害、例えば物理的
損傷または疾患状態、脳への物理的損傷、脊髄への物理的損傷、脳損傷に伴なう
脳卒中、および神経変性に関係する神経学的障害などよって起こるものなどがあ
る。
含んでなる医薬組成物）は、末梢神経障害の処置に使用される。本発明の分子に
よる治療が考えられる末梢神経障害には、外傷誘発性の神経障害、例えば物理的
損傷または疾患状態、脳への物理的損傷、脊髄への物理的損傷、脳損傷に伴なう
脳卒中、および神経変性に関係する神経学的障害などよって起こるものなどがあ
る。
【０１３９】 本発明者らは、化学療法誘発性の神経障害（タキソールまたはシスプラチンな
どの化学療法剤の送達によって起こるもの）、毒素誘発性の神経障害、薬物誘発
性の神経障害、ビタミン不足誘発性の神経障害、特発性神経障害および糖尿病性
神経障害の処置も考えている。例えば米国特許第5,496,804号および第5,916,555
号（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい。
どの化学療法剤の送達によって起こるもの）、毒素誘発性の神経障害、薬物誘発
性の神経障害、ビタミン不足誘発性の神経障害、特発性神経障害および糖尿病性
神経障害の処置も考えている。例えば米国特許第5,496,804号および第5,916,555
号（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい。
【０１４０】 本発明者らは、本発明のニューブラスチンヌクレオチドおよびニューブラスチ
ンペプチドを使った、非神経障害、多発性単神経障害、多発神経障害（軸索性お
よび脱髄性神経障害を含む）の処置も考えている。
ンペプチドを使った、非神経障害、多発性単神経障害、多発神経障害（軸索性お
よび脱髄性神経障害を含む）の処置も考えている。
【０１４１】 もう一つの好ましい態様として、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびに
それらを含む医薬組成物）は、眼の様々な障害（黄斑変性、網膜色素変性症、緑
内障などの疾患に冒された患者における網膜中の光受容器損失を含む）の処置に
使用される。
それらを含む医薬組成物）は、眼の様々な障害（黄斑変性、網膜色素変性症、緑
内障などの疾患に冒された患者における網膜中の光受容器損失を含む）の処置に
使用される。
【０１４２】 本発明のもう一つの目的は、ヒトを含む哺乳動物の脳に生物活性型のニューブ
ラスチンまたはニューブラスチンの前駆体（すなわち身体によって生物活性型の
ニューブラスチンに容易に変換されうる分子）を産生できるベクターまたは細胞
を移植することによって、上記の疾患および障害に関係する変性変化を予防する
方法を提供することであり、またさらに、ニューブラスチンを分泌する細胞は（
例えば半透性膜に）カプセル化することもできる。
ラスチンまたはニューブラスチンの前駆体（すなわち身体によって生物活性型の
ニューブラスチンに容易に変換されうる分子）を産生できるベクターまたは細胞
を移植することによって、上記の疾患および障害に関係する変性変化を予防する
方法を提供することであり、またさらに、ニューブラスチンを分泌する細胞は（
例えば半透性膜に）カプセル化することもできる。
【０１４３】 細胞はヒトを含む哺乳類の脳への移植または埋植に使用するためにインビトロ
で生育させることができる。
で生育させることができる。
【０１４４】 好ましい一態様として、本発明のポリペプチドをコード化する遺伝子を、例え
ば国際特許出願WO98/32869に記載の発現ベクターを用いて、適当な細胞系に（例
えばHiB5やRN33bにような不死化ラット神経幹細胞系またはヒト不死化神経前駆
細胞系に）トランスフェクトし、得られた細胞株をヒトを含む生体の脳内に植込
んで、CNS中で本発明の治療用ポリペプチドを分泌させる。
ば国際特許出願WO98/32869に記載の発現ベクターを用いて、適当な細胞系に（例
えばHiB5やRN33bにような不死化ラット神経幹細胞系またはヒト不死化神経前駆
細胞系に）トランスフェクトし、得られた細胞株をヒトを含む生体の脳内に植込
んで、CNS中で本発明の治療用ポリペプチドを分泌させる。
【０１４５】 診断およびスクリーニング方法 ニューブラスチン核酸は、ある個体が、ニューブラスチン遺伝子の欠損（例え
ば遺伝によって、または異常な胚発生によって、または後天的なDNA損傷によっ
て獲得されたニューブラスチン対立遺伝子の欠損など）に起因する神経障害を発
生させる素因を持つかどうかを決定するために使用できる。その分析は、例えば
ニューブラスチン遺伝子内の欠失または点突然変異を検出することによって、ま
たはそのような遺伝子欠損の素因の遺伝を特異的制限断片長多型で検出すること
によって、または患者から採取した核酸試料をニューブラスチン遺伝子に特異的
な核酸プローブとハイブリダイズさせて当該核酸にハイブリダイズするそのプロ
ーブの能力を確認することにより正常なニューブラスチン遺伝子の有無を検出す
ることによって、行なうことができる。
ば遺伝によって、または異常な胚発生によって、または後天的なDNA損傷によっ
て獲得されたニューブラスチン対立遺伝子の欠損など）に起因する神経障害を発
生させる素因を持つかどうかを決定するために使用できる。その分析は、例えば
ニューブラスチン遺伝子内の欠失または点突然変異を検出することによって、ま
たはそのような遺伝子欠損の素因の遺伝を特異的制限断片長多型で検出すること
によって、または患者から採取した核酸試料をニューブラスチン遺伝子に特異的
な核酸プローブとハイブリダイズさせて当該核酸にハイブリダイズするそのプロ
ーブの能力を確認することにより正常なニューブラスチン遺伝子の有無を検出す
ることによって、行なうことができる。
【０１４６】 特にニューブラスチン核酸は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用で
きる。そのようなハイブリダイゼーション測定法は、ニューブラスチンタンパク
質をコード化するmRNAのレベルの異常に関係する様々な異常、障害または疾患状
態を検出、予知、診断または監視するために使用できる。ニューブラスチン核酸
は、ニューブラスチン神経栄養因子依存的な生理過程の「マーカー」と解釈する
ことができる。それらの過程には「正常な」生理過程（例えばニューロンの機能
）および病的過程（例えば神経変性疾患）が含まれるが、これらに限らない。ニ
ューブラスチンタンパク質および/またはニューブラスチンコード化mRNAのレベ
ルの異常（すなわち上昇または欠乏）による特定患者部分集団の特徴づけは、新
しい疾患分類につながりうる。ここに定義される「レベルの異常」とは、定量的
または定性的手段によって決定される、対照試料またはその障害をもたない個体
と比較した場合のレベルの増加または減少を意味する。
きる。そのようなハイブリダイゼーション測定法は、ニューブラスチンタンパク
質をコード化するmRNAのレベルの異常に関係する様々な異常、障害または疾患状
態を検出、予知、診断または監視するために使用できる。ニューブラスチン核酸
は、ニューブラスチン神経栄養因子依存的な生理過程の「マーカー」と解釈する
ことができる。それらの過程には「正常な」生理過程（例えばニューロンの機能
）および病的過程（例えば神経変性疾患）が含まれるが、これらに限らない。ニ
ューブラスチンタンパク質および/またはニューブラスチンコード化mRNAのレベ
ルの異常（すなわち上昇または欠乏）による特定患者部分集団の特徴づけは、新
しい疾患分類につながりうる。ここに定義される「レベルの異常」とは、定量的
または定性的手段によって決定される、対照試料またはその障害をもたない個体
と比較した場合のレベルの増加または減少を意味する。
【０１４７】 本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドは、ニュ
ーブラスチン類似体（ニューブラスチンの小分子模倣体を含む）をスクリーニン
グし同定するためにも使用できる。考えられる一態様として、本発明は、ニュー
ロブラスチン（neuroblastin）媒介性の生物学的効果を誘導する候補化合物を同
定する方法であって、ニューブラスチンと接触させると検出可能な産物を発現さ
せる試験細胞を用意し、その細胞を候補化合物にばく露し、上記検出可能な産物
を検出するという各段階を含む方法を提供する。上記検出可能な産物の発現は、
ニューロブラスチン媒介性の生物学的効果を誘導する当該候補化合物の能力を示
す。
ーブラスチン類似体（ニューブラスチンの小分子模倣体を含む）をスクリーニン
グし同定するためにも使用できる。考えられる一態様として、本発明は、ニュー
ロブラスチン（neuroblastin）媒介性の生物学的効果を誘導する候補化合物を同
定する方法であって、ニューブラスチンと接触させると検出可能な産物を発現さ
せる試験細胞を用意し、その細胞を候補化合物にばく露し、上記検出可能な産物
を検出するという各段階を含む方法を提供する。上記検出可能な産物の発現は、
ニューロブラスチン媒介性の生物学的効果を誘導する当該候補化合物の能力を示
す。
【０１４８】 さらに本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドは
、近縁の新規遺伝子配列およびそれらによってコードされるタンパク質（対立遺
伝子変異体および一塩基多型（「SNP」）を含む）を同定するために、DNAチップ
またはタンパク質チップ上で、もしくはコンピュータープログラムで、使用する
ことができる。そのような方法は、例えば米国特許第5,795,716号、第5,754,524
号、第5,733,729号、第5,800,992号、第5,445,934号、第5,525,464号（それぞれ
参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
、近縁の新規遺伝子配列およびそれらによってコードされるタンパク質（対立遺
伝子変異体および一塩基多型（「SNP」）を含む）を同定するために、DNAチップ
またはタンパク質チップ上で、もしくはコンピュータープログラムで、使用する
ことができる。そのような方法は、例えば米国特許第5,795,716号、第5,754,524
号、第5,733,729号、第5,800,992号、第5,445,934号、第5,525,464号（それぞれ
参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
【０１４９】 実施例 実施例１：ニューブラスチン核酸の単離法 方法１：ニューブラスチン遺伝子に関するヒト胎児脳cDNAの迅速スクリーニン
グ GenBankに提出された2つのHGTS（high throughput genomic sequence）（受諾
番号AC005038およびAC005051）に、ヒトパーセフィンとの相同性によって、290b
pの断片が同定された。その290bp断片の核酸配列から、2つのニューブラスチン
特異的プライマーを合成した。ニューブラスチントップ鎖プライマー（「NBNint
.sence」）の配列は5’-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3’［配列番号17］とした。
ニューブラスチンボトム鎖プライマー（「NBNint.antisence」）の配列は、5’-
AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3’［配列番号18］とした。これらのプライマーを
使って、96ウェルのPCR反応を行なった。
グ GenBankに提出された2つのHGTS（high throughput genomic sequence）（受諾
番号AC005038およびAC005051）に、ヒトパーセフィンとの相同性によって、290b
pの断片が同定された。その290bp断片の核酸配列から、2つのニューブラスチン
特異的プライマーを合成した。ニューブラスチントップ鎖プライマー（「NBNint
.sence」）の配列は5’-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3’［配列番号17］とした。
ニューブラスチンボトム鎖プライマー（「NBNint.antisence」）の配列は、5’-
AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3’［配列番号18］とした。これらのプライマーを
使って、96ウェルのPCR反応を行なった。
【０１５０】 500,000個のcDNAクローンから得たプラスミドDNAを含む96ウェルマスタープレ
ートには、1ウェルあたり約5000クローンが負荷された。96ウェルサブプレート
は、1ウェルあたり50クローンの大腸菌DH10Bグリセロール保存液を含むものを使
用した。
ートには、1ウェルあたり約5000クローンが負荷された。96ウェルサブプレート
は、1ウェルあたり50クローンの大腸菌DH10Bグリセロール保存液を含むものを使
用した。
【０１５１】 ニューブラスチン核酸はポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）法を使った3ラウン
ドの増幅によって同定された。増幅は試料中の核酸のコピー数を増加させる。
ドの増幅によって同定された。増幅は試料中の核酸のコピー数を増加させる。
【０１５２】 マスタープレートスクリーニング：上記の96ウェルPCRスクリーニング法を使
って、ヒト胎児脳cDNAマスタープレートを、ヒトニューブラスチンcDNAを単離す
るために、遺伝子特異的プライマーでスクリーニングした。
って、ヒト胎児脳cDNAマスタープレートを、ヒトニューブラスチンcDNAを単離す
るために、遺伝子特異的プライマーでスクリーニングした。
【０１５３】 30ngのヒト胎児脳cDNA（6ng/μl；Origene Technologies）をマスタープレー
トの対応するウェルから取り、次の試薬を含む総液量25μlの反応液に入れた：
上記2つの遺伝子特異的プライマー（すなわちNBNint.senceおよびNBNint.antise
nce）各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologie
s）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Lab
oratories）および0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biot
echnologies）。
トの対応するウェルから取り、次の試薬を含む総液量25μlの反応液に入れた：
上記2つの遺伝子特異的プライマー（すなわちNBNint.senceおよびNBNint.antise
nce）各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologie
s）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Lab
oratories）および0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biot
echnologies）。
【０１５４】 PCR熱サイクル反応は次の手順と条件で行なった。まずDNAを94℃で3分間変性
させた後、94℃で各1分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、72℃で90秒間の
第一伸長を35サイクル行ない、最終伸長を72℃で5分間行った。96の個々のPCR反
応の産物を、臭化エチジウム染料を含む2％アガロースゲルを使ったゲル電気泳
動によって分析した。あるウェルにみられた102bpの陽性PCR産物は、ただ一つの
96ウェルサブプレートに対応することがわかった。
させた後、94℃で各1分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、72℃で90秒間の
第一伸長を35サイクル行ない、最終伸長を72℃で5分間行った。96の個々のPCR反
応の産物を、臭化エチジウム染料を含む2％アガロースゲルを使ったゲル電気泳
動によって分析した。あるウェルにみられた102bpの陽性PCR産物は、ただ一つの
96ウェルサブプレートに対応することがわかった。
【０１５５】 その102bp核酸断片は次の配列［配列番号13］を持っていた。
【０１５６】
【外５】 サブプレートスクリーニング：上記2つの遺伝子特異的プライマー各0.2mM、1
×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各d
NTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）およ
び0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を
含む総液量25μlの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った1μlのグ
リセロール保存液を入れ、PCRによる増幅を行なうことにより、96ウェルヒト胎
児脳サブプレートをスクリーニングした。
×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各d
NTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）およ
び0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を
含む総液量25μlの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った1μlのグ
リセロール保存液を入れ、PCRによる増幅を行なうことにより、96ウェルヒト胎
児脳サブプレートをスクリーニングした。
【０１５７】 マスタープレートスクリーニングについて記載したものと同じPCR熱サイクル
条件を使用した。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロースゲ
ルで分析し、上記の102pbのPCR断片を与える陽性ウェルを同定した。
条件を使用した。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロースゲ
ルで分析し、上記の102pbのPCR断片を与える陽性ウェルを同定した。
【０１５８】 コロニーPCR：陽性サブプレートウェルから取ったグリセロール保存液1mlをル
リアブロスに1：100希釈した。次に、上記の希釈液1mlおよび10mlを、ルリアブ
ロス（「LB」）と100μg/mlカルベニシリンを含む2枚の別個の寒天プレートに播
種した。次にそのLBプレートを30℃で終夜培養した。これらのプレートから96個
のコロニーを拾って、25μlの最終液量に上記2つの遺伝子特異的プライマー各0.
2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV； 英国Advanced Biotechnologies）、0.2
mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratorie
s）、0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies
）を含む新しい96ウェルPCRプレートに入れた。
リアブロスに1：100希釈した。次に、上記の希釈液1mlおよび10mlを、ルリアブ
ロス（「LB」）と100μg/mlカルベニシリンを含む2枚の別個の寒天プレートに播
種した。次にそのLBプレートを30℃で終夜培養した。これらのプレートから96個
のコロニーを拾って、25μlの最終液量に上記2つの遺伝子特異的プライマー各0.
2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV； 英国Advanced Biotechnologies）、0.2
mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratorie
s）、0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies
）を含む新しい96ウェルPCRプレートに入れた。
【０１５９】 マスタープレートスクリーニングについて記載したものと同じPCR熱サイクル
条件を使用した。次に、96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロ
ースゲルで分析した。次いで上記102bp断片を含む陽性コロニーを同定した。
条件を使用した。次に、96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロ
ースゲルで分析した。次いで上記102bp断片を含む陽性コロニーを同定した。
【０１６０】 この陽性コロニーから調製したプラスミドDNAの配列決定により、861bp［配列
番号8］の完全長cDNAが明らかになった。このcDNAはプレプロニューブラスチン
［配列番号9］をコードしていた。BigDye（登録商標）ターミネーターサイクル
シークエンシングキット（米国PE Applied Biosystems）を用いて、自動DNA配列
決定を行なった。配列決定用ゲルはABI Prism 377（米国PE Applied Biosystems
）で泳動した。
番号8］の完全長cDNAが明らかになった。このcDNAはプレプロニューブラスチン
［配列番号9］をコードしていた。BigDye（登録商標）ターミネーターサイクル
シークエンシングキット（米国PE Applied Biosystems）を用いて、自動DNA配列
決定を行なった。配列決定用ゲルはABI Prism 377（米国PE Applied Biosystems
）で泳動した。
【０１６１】 方法２：ヒト脳からのニューブラスチンcDNAのクローニング 完全長ニューブラスチンcDNAまたはcDNA断片を増幅するもう一つの方法は、ベ
クター特異的またはアダプター特異的プライマーと組み合わせた上記ニューブラ
スチン特異的プライマーNBNint.senceおよびNBNint.antisenceならびにRACE（Ra
pid Amplification of cDNA ends）法により、例えばMarathon cDNA増幅キット
（米国Clontech Laboratories,カタログ番号K1802-1）を使って行なうことがで
きる。
クター特異的またはアダプター特異的プライマーと組み合わせた上記ニューブラ
スチン特異的プライマーNBNint.senceおよびNBNint.antisenceならびにRACE（Ra
pid Amplification of cDNA ends）法により、例えばMarathon cDNA増幅キット
（米国Clontech Laboratories,カタログ番号K1802-1）を使って行なうことがで
きる。
【０１６２】 完全長ニューブラスチンcDNAの増幅には、ヒト全脳Marathon-Ready cDNA（米
国Clontech Laboratories，カタログ番号7400-1）を使用することができる。増
幅に有用なプライマーとしては、Marathon-Ready cDNAに同梱されているアダプ
タープライマーAP1と組み合わせたニューブラスチントップ鎖プライマー5’-ATG
GAACTTGGACTTGG-3’［配列番号19］（「NBNext.sence」）およびニューブラスチ
ンボトム鎖プライマー5’-TCCATCACCCACCGGC-3’［配列番号20］（「NBNext.ant
isence」）が挙げられる。代替トップ鎖プライマー5’-CTAGGAGCCCATGCCC-3’［
配列番号28］も使用した。さらにもう一つの代替ボトム鎖プライマー5’-GAGCGA
GCCCTCAGCC-3’［配列番号33］も使用できる。同様に、代替ボトム鎖プライマー
配列番号24および26も使用できる。
国Clontech Laboratories，カタログ番号7400-1）を使用することができる。増
幅に有用なプライマーとしては、Marathon-Ready cDNAに同梱されているアダプ
タープライマーAP1と組み合わせたニューブラスチントップ鎖プライマー5’-ATG
GAACTTGGACTTGG-3’［配列番号19］（「NBNext.sence」）およびニューブラスチ
ンボトム鎖プライマー5’-TCCATCACCCACCGGC-3’［配列番号20］（「NBNext.ant
isence」）が挙げられる。代替トップ鎖プライマー5’-CTAGGAGCCCATGCCC-3’［
配列番号28］も使用した。さらにもう一つの代替ボトム鎖プライマー5’-GAGCGA
GCCCTCAGCC-3’［配列番号33］も使用できる。同様に、代替ボトム鎖プライマー
配列番号24および26も使用できる。
【０１６３】 方法３：ヒト脳からのニューブラスチンcDNAのクローニング ニューブラスチンcDNAをクローニングするもう一つの方法は、ここに記載する
1つまたは複数のニューブラスチンプローブを使って（図1に例示するように）成
人または胎児脳ライブラリーをスクリーニングすることである。これらのライブ
ラリーには、λgt11ヒト脳（米国Clontech Laboratories，カタログ番号HL3002b
）またはλgt11ヒト胎児脳（米国Clontech Laboratories，カタログ番号HL3002b
）が含まれる。
1つまたは複数のニューブラスチンプローブを使って（図1に例示するように）成
人または胎児脳ライブラリーをスクリーニングすることである。これらのライブ
ラリーには、λgt11ヒト脳（米国Clontech Laboratories，カタログ番号HL3002b
）またはλgt11ヒト胎児脳（米国Clontech Laboratories，カタログ番号HL3002b
）が含まれる。
【０１６４】 方法４：ニューブラスチン遺伝子に関するマウス胎児cDNAの迅速スクリーニン
グ ニューブラスチン遺伝子の迅速スクリーニングを次の方法で行なった。500,00
0個のcDNAクローンから得たプラスミドDNAを含む96ウェルマスタープレートには
、1ウェルあたり約5000クローンが負荷された。96ウェルサブプレートは、1ウェ
ルあたり50クローンの大腸菌グリセロール保存液を含むものを使用した。問題の
遺伝子（すなわちニューブラスチン）を同定するために、PCRによる3ラウンドの
増幅を行なった。
グ ニューブラスチン遺伝子の迅速スクリーニングを次の方法で行なった。500,00
0個のcDNAクローンから得たプラスミドDNAを含む96ウェルマスタープレートには
、1ウェルあたり約5000クローンが負荷された。96ウェルサブプレートは、1ウェ
ルあたり50クローンの大腸菌グリセロール保存液を含むものを使用した。問題の
遺伝子（すなわちニューブラスチン）を同定するために、PCRによる3ラウンドの
増幅を行なった。
【０１６５】 マスタープレートスクリーニング：マウスニューブラスチンcDNAを単離するた
めに、遺伝子特異的プライマーを用いた96ウェルPCRにより、マウスフェトル（f
ettle）cDNAマスタープレートをスクリーニングした。次に2つのプライマーを合
成した： （1）ニューブラスチンC2プライマー（NBNint.sence）：5’-GGCCACCGCTCCGACGA
G-3’［配列番号21］および（2）ニューブラスチンC2asプライマー（NBNint.ant
isence）：5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’［配列番号22］。これら2つの遺伝子
特異的プライマーを使用することにより、220bpの陽性PCR産物が同定された。こ
の220bp核酸は次の配列［配列番号14］を持っていた。
めに、遺伝子特異的プライマーを用いた96ウェルPCRにより、マウスフェトル（f
ettle）cDNAマスタープレートをスクリーニングした。次に2つのプライマーを合
成した： （1）ニューブラスチンC2プライマー（NBNint.sence）：5’-GGCCACCGCTCCGACGA
G-3’［配列番号21］および（2）ニューブラスチンC2asプライマー（NBNint.ant
isence）：5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’［配列番号22］。これら2つの遺伝子
特異的プライマーを使用することにより、220bpの陽性PCR産物が同定された。こ
の220bp核酸は次の配列［配列番号14］を持っていた。
【０１６６】
【外６】 次に、96ウェルPCR反応を以下の方法で行なった。30ngのマウス胎仔脳cDNA（6
ng/μl；Origene Technologies）をマスタープレートの対応するウェルから取り
、上記2つの遺伝子特異的プライマー（すなわちC2プライマー（NBNint.sence）
およびC2asプライマー（NBNint.antisence））各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バ
ッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharm
acia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）および0.5単位のTaq DNA
ポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を含む総液量25μlの
反応液に入れた。
ng/μl；Origene Technologies）をマスタープレートの対応するウェルから取り
、上記2つの遺伝子特異的プライマー（すなわちC2プライマー（NBNint.sence）
およびC2asプライマー（NBNint.antisence））各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バ
ッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharm
acia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）および0.5単位のTaq DNA
ポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を含む総液量25μlの
反応液に入れた。
【０１６７】 次のPCR熱サイクル条件を使用した：94℃で3分間の初期変性の後、94℃で各1
分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長を35サイクル、
そして72℃で5分間の最終伸長。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウム染料を含
む2％アガロースゲルで分析した。あるウェルにみられた220bpの陽性PCR産物は
、ただ一つの96ウェルサブプレートに対応することがわかった。次に、96の個々
のPCR反応を、臭化エチジウム染料を含む2％アガロースゲルで分析した。同定さ
れた220bpの陽性PCR産物は、96ウェルサブプレートのただ一つのウェルに対応し
た。
分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長を35サイクル、
そして72℃で5分間の最終伸長。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウム染料を含
む2％アガロースゲルで分析した。あるウェルにみられた220bpの陽性PCR産物は
、ただ一つの96ウェルサブプレートに対応することがわかった。次に、96の個々
のPCR反応を、臭化エチジウム染料を含む2％アガロースゲルで分析した。同定さ
れた220bpの陽性PCR産物は、96ウェルサブプレートのただ一つのウェルに対応し
た。
【０１６８】 サブプレートスクリーニング：上記2つの遺伝子特異的プライマー各0.2mM、1
×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各d
NTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）およ
び0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を
含む最終総液量25μlの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った1μl
のグリセロール保存液を入れてPCRによる増幅を行なうことにより、96ウェルマ
ウス胎児脳サブプレートをスクリーニングした。PCR熱サイクルは、マスタープ
レートスクリーニングについて記載した条件に従って行なった。
×標準PCR緩衝液（バッファーV，英国Advanced Biotechnologies）、0.2mMの各d
NTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clontech Laboratories）およ
び0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advanced Biotechnologies）を
含む最終総液量25μlの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った1μl
のグリセロール保存液を入れてPCRによる増幅を行なうことにより、96ウェルマ
ウス胎児脳サブプレートをスクリーニングした。PCR熱サイクルは、マスタープ
レートスクリーニングについて記載した条件に従って行なった。
【０１６９】 次に、96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで分析
し、上記の220bp断片を生成する陽性ウェルを同定した。
し、上記の220bp断片を生成する陽性ウェルを同定した。
【０１７０】 コロニーPCR：陽性サブプレートウェルから取ったグリセロール保存液1mlをル
リアブロス（LB）に1：100希釈した。次に、上記の希釈液1mlおよび10mlを、100
μg/mlカルベニシリンを含む2枚の別個のLBプレートに播種し、30℃で終夜培養
した。合計96個のコロニーを単離し、25μlの最終液量に上記2つの遺伝子特異的
プライマー各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV； 英国Advanced Biotechn
ologies）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clonte
ch Laboratories）および0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advance
d Biotechnologies）を含んでいる96ウェルPCRプレートに、上記96個のコロニー
を移した。
リアブロス（LB）に1：100希釈した。次に、上記の希釈液1mlおよび10mlを、100
μg/mlカルベニシリンを含む2枚の別個のLBプレートに播種し、30℃で終夜培養
した。合計96個のコロニーを単離し、25μlの最終液量に上記2つの遺伝子特異的
プライマー各0.2mM、1×標準PCR緩衝液（バッファーV； 英国Advanced Biotechn
ologies）、0.2mMの各dNTP（Amersham-Pharmacia）、0.1M GC-Melt（米国Clonte
ch Laboratories）および0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μl；英国Advance
d Biotechnologies）を含んでいる96ウェルPCRプレートに、上記96個のコロニー
を移した。
【０１７１】 PCR熱サイクルを上記の条件に従って行なった（下記「マスタープレート」の
項を参照）。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで
のゲル電気泳動によって分析した。220bp断片の存在によって、陽性コロニーを
同定した。この陽性コロニーからプラスミドを調製した。そのクローンを、BigD
ye（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキットとAmpliTaq DNA
ポリメラーゼとを用いる自動DNA配列決定によって配列決定した。配列決定用ゲ
ルはABI Prism 377（米国PE Applied Biosystems）で泳動した。その結果得られ
たこのクローンの配列から、2136bpの完全長cDNA［配列番号15］が明らかになっ
た。このcDNAは、マウスプレプロニューブラスチンポリペプチドをコードする配
列番号16の予想アミノ酸配列を持つオープンリーディングフレームを含む。
項を参照）。96の個々のPCR反応を、臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで
のゲル電気泳動によって分析した。220bp断片の存在によって、陽性コロニーを
同定した。この陽性コロニーからプラスミドを調製した。そのクローンを、BigD
ye（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキットとAmpliTaq DNA
ポリメラーゼとを用いる自動DNA配列決定によって配列決定した。配列決定用ゲ
ルはABI Prism 377（米国PE Applied Biosystems）で泳動した。その結果得られ
たこのクローンの配列から、2136bpの完全長cDNA［配列番号15］が明らかになっ
た。このcDNAは、マウスプレプロニューブラスチンポリペプチドをコードする配
列番号16の予想アミノ酸配列を持つオープンリーディングフレームを含む。
【０１７２】 実施例２：ゲノムニューブラスチンのクローニング 上述のように本出願人らは、GenBankに登録された2つのヒトBACクローン（受
諾番号AC005038およびAC005051）に、ペーセフィンおよびパーセフィンの隣接配
列に相同な領域を有する290bpの核酸断片を同定した。出願人らは、Lasergene S
oftware（DNAStar, Inc.）を使って、さらなるニューブラスチン核酸をコード化
する核酸をクローニングする目的で、上記861bpの予想配列を使って追加のプラ
イマーを設計した。ゲノムDNAでのPCR反応を用いてニューブラスチン遺伝子をク
ローニグするために、2対のプライマーを使用した。それら2対のプライマーを、
次に示す。
諾番号AC005038およびAC005051）に、ペーセフィンおよびパーセフィンの隣接配
列に相同な領域を有する290bpの核酸断片を同定した。出願人らは、Lasergene S
oftware（DNAStar, Inc.）を使って、さらなるニューブラスチン核酸をコード化
する核酸をクローニングする目的で、上記861bpの予想配列を使って追加のプラ
イマーを設計した。ゲノムDNAでのPCR反応を用いてニューブラスチン遺伝子をク
ローニグするために、2対のプライマーを使用した。それら2対のプライマーを、
次に示す。
【０１７３】 第1プライマー対
【０１７４】
【外７】 第2プライマー対
【０１７５】
【外８】 第1プライマー対を使ったところ、Clontech Laboratoriesから購入したヒトゲ
ノムDNAの調製物（カタログ番号6550-1）から、887bpのDNA断片が増幅された。
ノムDNAの調製物（カタログ番号6550-1）から、887bpのDNA断片が増幅された。
【０１７６】 PCRプロトコール：PCRはExpandTMハイフィデリティ（High Fidelity）PCRシス
テム（Boehringer Mannheim）をバッファー１と共に使用して行なった。PCR反応
混合物には、50μlの総液量で5％ジメチルスルホキシド（DMSO）と17.5pmolの各
dNTPを添加した。熱サイクルは、94℃で2分間の前変性段階の後、それぞれ94℃
で10秒間および68℃で1分間の2段階サイクルを35回行なった。68℃で5分間のイ
ンキュベーションによって熱サイクルを停止した。熱サイクルはPTC-255 DNAエ
ンジンテトラッド（Engine Tetrad）サーモサイクラー（マサチューセッツ州MJ
Research）で行なった。PCR産物を2％アガロース（FMC）でのゲル電気泳動によ
って分析し、写真撮影した。
テム（Boehringer Mannheim）をバッファー１と共に使用して行なった。PCR反応
混合物には、50μlの総液量で5％ジメチルスルホキシド（DMSO）と17.5pmolの各
dNTPを添加した。熱サイクルは、94℃で2分間の前変性段階の後、それぞれ94℃
で10秒間および68℃で1分間の2段階サイクルを35回行なった。68℃で5分間のイ
ンキュベーションによって熱サイクルを停止した。熱サイクルはPTC-255 DNAエ
ンジンテトラッド（Engine Tetrad）サーモサイクラー（マサチューセッツ州MJ
Research）で行なった。PCR産物を2％アガロース（FMC）でのゲル電気泳動によ
って分析し、写真撮影した。
【０１７７】 ヒトゲノムDNAから第1プライマー対を使って増幅された887bp断片をpCRIIベク
ター（Invitrogen）にクローニングし、XL1-Blueコンピテント大腸菌細胞（Stra
tagene）に形質転換した。得られたプラスミド（ニューブラスチン-2と呼ぶ）を
サーモシケナーゼ（Termosequenase）（Amersham Pharmacia Biotech）を使って
配列決定した。配列決定反応生成物を、ALFExpress自動配列決定装置（Amersham
Pharmacia Biotech）での電気泳動によって分析した。
ター（Invitrogen）にクローニングし、XL1-Blueコンピテント大腸菌細胞（Stra
tagene）に形質転換した。得られたプラスミド（ニューブラスチン-2と呼ぶ）を
サーモシケナーゼ（Termosequenase）（Amersham Pharmacia Biotech）を使って
配列決定した。配列決定反応生成物を、ALFExpress自動配列決定装置（Amersham
Pharmacia Biotech）での電気泳動によって分析した。
【０１７８】 第2のプライマー対（上記の第1プライマー対）を用いるヒトゲノムDNAのPCR増
幅によって得られた断片を配列決定したところ、オープンリーディングフレーム
の3’末端に追加された42bp領域が明らかになった。その完全長配列を、他の神
経栄養因子類の核酸の配列と比較すると共に、NetgeneおよびGene Markソフトウ
ェア（Brunakら, J.Mol.Biol. 1991, 220, 49-65；Borodovskyら, Nucl.Acids R
es. 1995, 23, 3554-62）を使って、考えうるスプライス接合部とコードである
可能性が高い領域とを同定する遺伝子発見ソフトウェアプログラムでエキソン-
イントロン境界をマッピングすることによって分析した。エキソン-イントロン
境界は、上記の迅速スクリーニングで得たcDNAによって確認された。
幅によって得られた断片を配列決定したところ、オープンリーディングフレーム
の3’末端に追加された42bp領域が明らかになった。その完全長配列を、他の神
経栄養因子類の核酸の配列と比較すると共に、NetgeneおよびGene Markソフトウ
ェア（Brunakら, J.Mol.Biol. 1991, 220, 49-65；Borodovskyら, Nucl.Acids R
es. 1995, 23, 3554-62）を使って、考えうるスプライス接合部とコードである
可能性が高い領域とを同定する遺伝子発見ソフトウェアプログラムでエキソン-
イントロン境界をマッピングすることによって分析した。エキソン-イントロン
境界は、上記の迅速スクリーニングで得たcDNAによって確認された。
【０１７９】 図7に図示するように、得られたニューブラスチン遺伝子は70bpのイントロン
で分離された2つのエキソンを持つ。それらのエキソンは全体として完全長ニュ
ーブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列を持つ。予想されるcDNA［配列番
号3］は、238アミノ酸残基［配列番号4］をコード化するオープンリーディング
フレーム（ORF）を含んでいる。ニューブラスチン-2クローンはプロニューブラ
スチンの全コード配列を含んでいた。この遺伝子によってコード化されるアミノ
酸配列は3つのタンパク質、パーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFに高い相
同性を示した。
で分離された2つのエキソンを持つ。それらのエキソンは全体として完全長ニュ
ーブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列を持つ。予想されるcDNA［配列番
号3］は、238アミノ酸残基［配列番号4］をコード化するオープンリーディング
フレーム（ORF）を含んでいる。ニューブラスチン-2クローンはプロニューブラ
スチンの全コード配列を含んでいた。この遺伝子によってコード化されるアミノ
酸配列は3つのタンパク質、パーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFに高い相
同性を示した。
【０１８０】 実施例３：ニューブラスチン核酸の発現 ニューブラスチンRNAの発現は、げっ歯類およびヒトの神経組織と非神経組織
の両方に、様々な未成熟および成熟発育段階で、下記の技術を用いて検出された
。
の両方に、様々な未成熟および成熟発育段階で、下記の技術を用いて検出された
。
【０１８１】 RT-PCRを用いてニューブラスチンRNA発現を検出する方法：配列番号1であると
確認されたニューブラスチンDNA配列に基づいて、次のプライマーを合成した：
（1）ニューブラスチンC2プライマー5’-GGCCACCGCTCCGACGAG-3’［配列番号21
］および（2）ニューブラスチンC2asプライマー5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’
［配列番号22］。このプライマーセットを使って、成人およびヒト胎児全脳mRNA
からDNA断片をRT-PCR増幅した。この反応によって生成したDNA断片の中に220bp
の断片があった。220bpのDNA断片が同定されたことから、ニューブラスチン遺伝
子は成人および胎児の脳組織で発現されることが確認された。220bpのDNA断片は
、これらのプライマーを用いてゲノムDNAからも増幅された。
確認されたニューブラスチンDNA配列に基づいて、次のプライマーを合成した：
（1）ニューブラスチンC2プライマー5’-GGCCACCGCTCCGACGAG-3’［配列番号21
］および（2）ニューブラスチンC2asプライマー5’-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’
［配列番号22］。このプライマーセットを使って、成人およびヒト胎児全脳mRNA
からDNA断片をRT-PCR増幅した。この反応によって生成したDNA断片の中に220bp
の断片があった。220bpのDNA断片が同定されたことから、ニューブラスチン遺伝
子は成人および胎児の脳組織で発現されることが確認された。220bpのDNA断片は
、これらのプライマーを用いてゲノムDNAからも増幅された。
【０１８２】 ノーザンブロットハイブリダイゼーションによってニューブラスチンRNA発現
を検出する方法：成人組織由来のポリA+RNAのノーザンブロットを商業的供給者
（米国Clontech Laboratories）から購入し、32P標識ニューブラスチンcDNAでプ
ローブした。この標識ニューブラスチンcDNAは上記実施例１に記載の方法に従っ
て調製した。
を検出する方法：成人組織由来のポリA+RNAのノーザンブロットを商業的供給者
（米国Clontech Laboratories）から購入し、32P標識ニューブラスチンcDNAでプ
ローブした。この標識ニューブラスチンcDNAは上記実施例１に記載の方法に従っ
て調製した。
【０１８３】 プローブの調製：ニューブラスチン核酸DNA断片（配列番号8のヌクレオチド29
6-819）を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、Rediprime
IIラベリングキット（Amersham；カタログ番号RPN1633）により、製造者の推奨
するとおりに標識した。簡単に述べると、DNA試料を、45μlの10mM TE緩衝液（1
0mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA）に2.5〜25ngの濃度になるように希釈した。
次に、その試料を沸騰水浴中95〜100℃に5分間加熱し、その試料を氷上に5分間
置いて急冷した後、それを短時間遠心分離して内容物を反応チューブの底に移動
させることにより、DNAを変性させた。変性させたDNAの全量を、dATP、dGTP、dT
TP、エキソヌクレアーゼフリーのクレノウ酵素およびランダムプライマーの緩衝
溶液が乾燥安定化された形で入っている反応チューブに、5μlのRedivue［32P］
dCTP（Amersham Pharmacia Biotech Ltd.）と共に加えた。ピペットチップを溶
液中で動かして上下に2回ピペット操作することによってその溶液を混合し、そ
の反応混合物を37℃で10分間インキュベートした。5μlの0.2M EDTAを添加する
ことによって標識反応を停止した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用
するために、そのDNA試料を95〜100℃に5分間加熱した後、そのDNA試料を氷上で
5分間急冷することにより、標識DNAを一本鎖に変性させた。そのチューブを遠心
分離し、その内容物をよく混合した。最後に、一本鎖DNAプローブを、ヌクレオ
チド除去キット（Nucleotide Removal Kit; Qiagen）を使って精製した。
6-819）を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、Rediprime
IIラベリングキット（Amersham；カタログ番号RPN1633）により、製造者の推奨
するとおりに標識した。簡単に述べると、DNA試料を、45μlの10mM TE緩衝液（1
0mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA）に2.5〜25ngの濃度になるように希釈した。
次に、その試料を沸騰水浴中95〜100℃に5分間加熱し、その試料を氷上に5分間
置いて急冷した後、それを短時間遠心分離して内容物を反応チューブの底に移動
させることにより、DNAを変性させた。変性させたDNAの全量を、dATP、dGTP、dT
TP、エキソヌクレアーゼフリーのクレノウ酵素およびランダムプライマーの緩衝
溶液が乾燥安定化された形で入っている反応チューブに、5μlのRedivue［32P］
dCTP（Amersham Pharmacia Biotech Ltd.）と共に加えた。ピペットチップを溶
液中で動かして上下に2回ピペット操作することによってその溶液を混合し、そ
の反応混合物を37℃で10分間インキュベートした。5μlの0.2M EDTAを添加する
ことによって標識反応を停止した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用
するために、そのDNA試料を95〜100℃に5分間加熱した後、そのDNA試料を氷上で
5分間急冷することにより、標識DNAを一本鎖に変性させた。そのチューブを遠心
分離し、その内容物をよく混合した。最後に、一本鎖DNAプローブを、ヌクレオ
チド除去キット（Nucleotide Removal Kit; Qiagen）を使って精製した。
【０１８４】 ハイブリダイゼーション技術：調製済のノーザンブロットを商業的供給者から
購入し（「マルチプル・ティシュー・ノーザン・ブロッツ(Multiple Tissue Nor
thern Blots)」米国Clontech Laboratories；カタログ番号7760-１および7769-
１）、製造者の指示に従い、上で調製したニューブラスチン32P標識プローブを
使ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションには、ExpressHyb溶液（
米国Clontech Laboratories）を使用し、約3ng/mlの濃度の標識プローブを使用
した。ExpressHyb溶液を68℃に加熱した後、撹拌してすべての沈殿物を溶解させ
た。各ノーザンブロットメンブレン（10×10cm）を、製造者の指示に従い、Hyba
idハイブリダイゼーションオーブンにて、少なくとも5mlのExpressHyb溶液中、6
8℃で30分間プレハイブリダイズした。ニューブラスチン32P標識プローブを95〜
100℃で2時間変性させ、次に氷上で急冷した。14μlの標識プローブを5mlの新し
いExpressHybに加え、よく混合した。標識DNAプローブを含有する上記5mlの新し
いExperssHyb溶液をブロットの上に均等に分配することにより、プレハイブリダ
イゼーションに使用したExpressHyb溶液を置き換えた。ブロットをHybaidハイブ
リダイゼーションオーブン中、68℃で1時間インキュベートした。インキュベー
ション後に、ブロットを濯ぎ、低ストリンジェンシー（0.05％SDSを含む室温の2
×SSC緩衝液）で数回洗浄した後、高ストリンジェンシー洗浄（0.1％SDSを含む5
0℃の0.1×SSC）を行なった［20×SSCは0.3M NaCl/0.3Mクエン酸Na（pH7.0）で
ある］。そのブロットを、増感紙を使って−80℃でHyperfilm MP（Amersham Pha
rmacia Biotech Ltd.）に接触させた。
購入し（「マルチプル・ティシュー・ノーザン・ブロッツ(Multiple Tissue Nor
thern Blots)」米国Clontech Laboratories；カタログ番号7760-１および7769-
１）、製造者の指示に従い、上で調製したニューブラスチン32P標識プローブを
使ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションには、ExpressHyb溶液（
米国Clontech Laboratories）を使用し、約3ng/mlの濃度の標識プローブを使用
した。ExpressHyb溶液を68℃に加熱した後、撹拌してすべての沈殿物を溶解させ
た。各ノーザンブロットメンブレン（10×10cm）を、製造者の指示に従い、Hyba
idハイブリダイゼーションオーブンにて、少なくとも5mlのExpressHyb溶液中、6
8℃で30分間プレハイブリダイズした。ニューブラスチン32P標識プローブを95〜
100℃で2時間変性させ、次に氷上で急冷した。14μlの標識プローブを5mlの新し
いExpressHybに加え、よく混合した。標識DNAプローブを含有する上記5mlの新し
いExperssHyb溶液をブロットの上に均等に分配することにより、プレハイブリダ
イゼーションに使用したExpressHyb溶液を置き換えた。ブロットをHybaidハイブ
リダイゼーションオーブン中、68℃で1時間インキュベートした。インキュベー
ション後に、ブロットを濯ぎ、低ストリンジェンシー（0.05％SDSを含む室温の2
×SSC緩衝液）で数回洗浄した後、高ストリンジェンシー洗浄（0.1％SDSを含む5
0℃の0.1×SSC）を行なった［20×SSCは0.3M NaCl/0.3Mクエン酸Na（pH7.0）で
ある］。そのブロットを、増感紙を使って−80℃でHyperfilm MP（Amersham Pha
rmacia Biotech Ltd.）に接触させた。
【０１８５】 このノーザンブロットハイブリダイゼーション実験の結果を図1に示す。図1A
（左）および図1B（右）は、実施例3に記述したように32P標識ニューブラスチン
cDNAでプローブしたポリA+RNAのノーザンブロットである。マーカーは1.35キロ
塩基対（「kb」）、2.4kb、4.4kb、7.5kbおよび9.5kbのサイズのポリヌクレオチ
ドを表す。図1Aのメンブレンは、様々な成人組織から抽出されたmRNAで調製した
ものである。このノーザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果より、本
出願人らは、ニューブラスチンmRNAは多くの成人組織で発現されると結論する。
最高レベルのニューブラスチン発現は、心臓、骨格筋および膵臓に検出される。
図1Bのメンブレンは、成人脳の様々な領域から抽出されたRNAを使って調製した
ものである。成人脳内では、最高レベルの発現は尾状核および視床に見られる。
約5kbのmRNA転写物が、脳内で発現されるニューブラスチンmRNAの主な形である
。
（左）および図1B（右）は、実施例3に記述したように32P標識ニューブラスチン
cDNAでプローブしたポリA+RNAのノーザンブロットである。マーカーは1.35キロ
塩基対（「kb」）、2.4kb、4.4kb、7.5kbおよび9.5kbのサイズのポリヌクレオチ
ドを表す。図1Aのメンブレンは、様々な成人組織から抽出されたmRNAで調製した
ものである。このノーザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果より、本
出願人らは、ニューブラスチンmRNAは多くの成人組織で発現されると結論する。
最高レベルのニューブラスチン発現は、心臓、骨格筋および膵臓に検出される。
図1Bのメンブレンは、成人脳の様々な領域から抽出されたRNAを使って調製した
ものである。成人脳内では、最高レベルの発現は尾状核および視床に見られる。
約5kbのmRNA転写物が、脳内で発現されるニューブラスチンmRNAの主な形である
。
【０１８６】 組織におけるインサイチューハイブリダイゼーションによってニューブラスチ
ンRNA発現を検出する方法： 以下の技術は動物組織（例えばげっ歯類組織）におけるニューブラスチンRNA
の発現をニューブラスチンアンチセンスプローブによって測定するために使用さ
れる。
ンRNA発現を検出する方法： 以下の技術は動物組織（例えばげっ歯類組織）におけるニューブラスチンRNA
の発現をニューブラスチンアンチセンスプローブによって測定するために使用さ
れる。
【０１８７】 マウスにおける発現： 組織試料の調製：同期妊娠（time-pregnant）マウス（B&K Universal，スウェ
ーデン・ストックホルム）を、妊娠13.5日または18.5日に頸椎脱臼によって屠殺
した。滅菌条件下での切開によって胚を摘出し、直ちに4％パラホルムアルデヒ
ド（「PFA」）を含む0.1Mリン酸緩衝液（PB）の溶液に24〜30時間浸漬した後、P
FAから取り出してPBS中に保存した。その組織を30％ショ糖の溶液に浸漬し、次
にTissueTech（OCT化合物、Sakura Finetek USA, カリフォルニア州トランス）
に包埋した。6系列の冠状または矢状切片（各12μm）をクリオスタットで切断し
、正に荷電したガラススライド上に解凍してのせた。新生仔頭部/脳（P1、P7）
を胚段階と同じプロトコールで固定し、成体脳組織は解剖して直ちにドライアイ
スで凍結し、前もって包埋を行なわずにクリオスタットで切断した。
ーデン・ストックホルム）を、妊娠13.5日または18.5日に頸椎脱臼によって屠殺
した。滅菌条件下での切開によって胚を摘出し、直ちに4％パラホルムアルデヒ
ド（「PFA」）を含む0.1Mリン酸緩衝液（PB）の溶液に24〜30時間浸漬した後、P
FAから取り出してPBS中に保存した。その組織を30％ショ糖の溶液に浸漬し、次
にTissueTech（OCT化合物、Sakura Finetek USA, カリフォルニア州トランス）
に包埋した。6系列の冠状または矢状切片（各12μm）をクリオスタットで切断し
、正に荷電したガラススライド上に解凍してのせた。新生仔頭部/脳（P1、P7）
を胚段階と同じプロトコールで固定し、成体脳組織は解剖して直ちにドライアイ
スで凍結し、前もって包埋を行なわずにクリオスタットで切断した。
【０１８８】 ニューブラスチンリボプローブの調製：アンチセンスニューブラスチンRNAプ
ローブ（以下「ニューブラスチンリボプローブ」という）を以下のように作成し
た。マウスニューブラスチンcDNA配列［配列番号15］のヌクレオチド1109〜1863
をBlueScriptベクター（Stratagene）にサブクローニングした。得られたプラス
ミドをEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断して直線状DNAにした。そのEcoRI DN
A断片を、T3 RNAポリメラーゼとジゴキシゲニン（「DIG」）RNAラベリングキッ
トにより、製造者（Boehringer Mannheim）の指示に従ってインビトロで転写し
た。
ローブ（以下「ニューブラスチンリボプローブ」という）を以下のように作成し
た。マウスニューブラスチンcDNA配列［配列番号15］のヌクレオチド1109〜1863
をBlueScriptベクター（Stratagene）にサブクローニングした。得られたプラス
ミドをEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断して直線状DNAにした。そのEcoRI DN
A断片を、T3 RNAポリメラーゼとジゴキシゲニン（「DIG」）RNAラベリングキッ
トにより、製造者（Boehringer Mannheim）の指示に従ってインビトロで転写し
た。
【０１８９】 ハイブリダイゼーション：クリオスタット切片を4％PFAで10分間固定し、10mg
/mlのプロテイナーゼKで5分間処理し、70％および95％エタノールで、それぞれ5
分間と2分間、順次脱水した後、風乾した。1μg/mlのDIG標識プローブを含むハ
イブリダイゼーション緩衝液（50％脱イオンホルムアミド、10％の50％デキスト
ラン硫酸溶液、1％デンハート液、250μg/ml酵母tRNA、0.3M NaCl、20mM Tris-H
Cl（pH8）、5mM EDTA、10mM NaPO4、1％サルコシル）を80℃に2分間加熱し、各
切片に適用した。次に、それらの切片をパラフィルムで覆い、55℃で16〜18時間
インキュベートした。
/mlのプロテイナーゼKで5分間処理し、70％および95％エタノールで、それぞれ5
分間と2分間、順次脱水した後、風乾した。1μg/mlのDIG標識プローブを含むハ
イブリダイゼーション緩衝液（50％脱イオンホルムアミド、10％の50％デキスト
ラン硫酸溶液、1％デンハート液、250μg/ml酵母tRNA、0.3M NaCl、20mM Tris-H
Cl（pH8）、5mM EDTA、10mM NaPO4、1％サルコシル）を80℃に2分間加熱し、各
切片に適用した。次に、それらの切片をパラフィルムで覆い、55℃で16〜18時間
インキュベートした。
【０１９０】 翌日、それらの切片を、高ストリンジェンシー（50％ホルムアミドを含む2×S
SC）で55℃で30分間洗浄した後、RNase緩衝液中で洗浄し、20μg/mlのRNase Aと
共に37℃で30分間インキュベートした。DIG標識プローブを検出するために、切
片をブロッキング溶液（0.1％Tween-20および10％熱非働化ヤギ血清を含むPBS）
中で1時間プレインキュベートした後、アルカリホスファターゼ結合抗DIG抗体（
Boehringer Mannheim）の1：5000希釈液と共に4℃で終夜インキュベートした。
翌日、各切片に、0.1％Tween-20を含むPBSでの2時間の洗浄を4回行ない、次にNT
MT緩衝液（100mM NaCl、100mM Tris-HCl（pH9.5）、50mM MgCl2、0.1％Tween-20
）中で10分間の洗浄を2回行なった。次に、それらの切片を、0.5mg/mlのレバミ
ゾールを含むBMパープル基質中で48時間インキュベートした。PBS中で洗浄する
ことによって、発色反応を停止した。切片を風乾し、DPX（スウェーデンKEBO-la
b）を使ってカバーガラスで覆った。
SC）で55℃で30分間洗浄した後、RNase緩衝液中で洗浄し、20μg/mlのRNase Aと
共に37℃で30分間インキュベートした。DIG標識プローブを検出するために、切
片をブロッキング溶液（0.1％Tween-20および10％熱非働化ヤギ血清を含むPBS）
中で1時間プレインキュベートした後、アルカリホスファターゼ結合抗DIG抗体（
Boehringer Mannheim）の1：5000希釈液と共に4℃で終夜インキュベートした。
翌日、各切片に、0.1％Tween-20を含むPBSでの2時間の洗浄を4回行ない、次にNT
MT緩衝液（100mM NaCl、100mM Tris-HCl（pH9.5）、50mM MgCl2、0.1％Tween-20
）中で10分間の洗浄を2回行なった。次に、それらの切片を、0.5mg/mlのレバミ
ゾールを含むBMパープル基質中で48時間インキュベートした。PBS中で洗浄する
ことによって、発色反応を停止した。切片を風乾し、DPX（スウェーデンKEBO-la
b）を使ってカバーガラスで覆った。
【０１９１】 このインサイチューハイブリダイゼーション反応の結果を表1に記載する。
【０１９２】 表１ マウスにおけるニューブラスチンの発現 ──────────────────────────────────── 構造 E13.5 E18.5 P1 P7 成体 ──────────────────────────────────── 前脳 ++ 中脳腹側 - 後根神経節 ++ 脊髄 + 網膜 +++ +++ + 嗅球 ++ ++ ++ 歯髄 ++ ++ + 三叉神経節 ++ ++ ++ 線条体 + + ++ 皮質 ++ ++ ++ + 歯状回 ++ + ──────────────────────────────────── 表１に示すように、胎生13.5日（「E13.5」）で、ニューブラスチンは脊髄と
後脳に発現され、前脳に弱く発現された。ニューブラスチン発現は、発生中の網
膜および感覚神経節（後根神経節および三叉神経節（V））でも検出された。神
経系の外では、腎臓、肺および腸に弱い発現が認められ、ニューブラスチンがこ
れらの組織でも発現されることが示された。
後脳に発現され、前脳に弱く発現された。ニューブラスチン発現は、発生中の網
膜および感覚神経節（後根神経節および三叉神経節（V））でも検出された。神
経系の外では、腎臓、肺および腸に弱い発現が認められ、ニューブラスチンがこ
れらの組織でも発現されることが示された。
【０１９３】 胎生18.5日（「E18.5」）では、ニューブラスチンは、三叉神経節（V）に最も
顕著に発現された。ニューブラスチン発現は、網膜、線条体および皮質にも検出
された。また発現は歯原基にも見られた。
顕著に発現された。ニューブラスチン発現は、網膜、線条体および皮質にも検出
された。また発現は歯原基にも見られた。
【０１９４】 再び表１について述べると、E18.5の時点から生後1日および7日までは、増加
したニューブラスチン発現が皮質、線条体および三叉神経節（V）に見られた。
ニューブラスチン発現は、皮質の外側の層の方が、皮質の内側の層よりも顕著だ
った。P7では、生後1日と同じ構造に発現が見出されたが、それに加えて、海馬
、特に歯状回および小脳にもニューブラスチン発現が見出された。ネズミ成体脳
では、歯状回にニューブラスチンが強く発現され、試験した他の組織ではニュー
ブラスチン発現は極めて低いレベルか、検出不可能だった。
したニューブラスチン発現が皮質、線条体および三叉神経節（V）に見られた。
ニューブラスチン発現は、皮質の外側の層の方が、皮質の内側の層よりも顕著だ
った。P7では、生後1日と同じ構造に発現が見出されたが、それに加えて、海馬
、特に歯状回および小脳にもニューブラスチン発現が見出された。ネズミ成体脳
では、歯状回にニューブラスチンが強く発現され、試験した他の組織ではニュー
ブラスチン発現は極めて低いレベルか、検出不可能だった。
【０１９５】 ラットにおける発現： 以下の実験では、アルカリホスファターゼ標識オリゴデオキシヌクレチドニュ
ーブラスチンアンチセンスプローブによるラット組織のハイブリダイゼーション
を説明する。
ーブラスチンアンチセンスプローブによるラット組織のハイブリダイゼーション
を説明する。
【０１９６】 組織試料の調製：ペントバルビタール麻酔後に妊娠ウィスターラット（デンマ
ーク、Mollegaard Breeding）からラット胚（E14）を得た。出生後ラット（P0、
P7、成体）は断頭によって屠殺した。解剖した脳および頭部全体を直ちに冷0.9
％NaClに浸漬し、新鮮凍結し、クリオスタットで20μmに切片化した（冠状およ
び矢状切片、10系列）。
ーク、Mollegaard Breeding）からラット胚（E14）を得た。出生後ラット（P0、
P7、成体）は断頭によって屠殺した。解剖した脳および頭部全体を直ちに冷0.9
％NaClに浸漬し、新鮮凍結し、クリオスタットで20μmに切片化した（冠状およ
び矢状切片、10系列）。
【０１９７】 インサイチューハイブリダイゼーション：2系列の切片を、アンチセンスアル
カリホスファターゼ（AP）結合オリゴデオキシヌクレオチドプローブ（5’-NCA
GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3’［配列番号27］、オリゴ番号16467
5、デンマーク・DNA Technology）を使ってハイブリダイズさせた。このプロー
ブは、配列番号15のマウスニューブラスチンcDNAの塩基1140〜1169に相補的であ
る。
カリホスファターゼ（AP）結合オリゴデオキシヌクレオチドプローブ（5’-NCA
GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3’［配列番号27］、オリゴ番号16467
5、デンマーク・DNA Technology）を使ってハイブリダイズさせた。このプロー
ブは、配列番号15のマウスニューブラスチンcDNAの塩基1140〜1169に相補的であ
る。
【０１９８】 ハイブリダイゼーションに先立って、切片を室温で風乾し、55℃で10分間加熱
した後、96％エタノールで4℃で終夜処理した。次に、それらの切片を風乾し、
ハイブリダイゼーション媒質（5.0pmolプローブ/ml）中39℃終夜インキュベート
した（Finsenら, Neurosci. 1992, 47, 105-113；Westら, J. Comp. Neurol. 19
96, 370, 11-22）。
した後、96％エタノールで4℃で終夜処理した。次に、それらの切片を風乾し、
ハイブリダイゼーション媒質（5.0pmolプローブ/ml）中39℃終夜インキュベート
した（Finsenら, Neurosci. 1992, 47, 105-113；Westら, J. Comp. Neurol. 19
96, 370, 11-22）。
【０１９９】 ハイブリダイゼーション後の処理は、1×SSC（0.15M NaCl，0.015Mクエン酸Na
）中55℃で30分間のすすぎを3回の後、室温の Tris-HCl（pH9.5）中で10分間の
すすぎを3回行ない、次にAP発色剤を添加することからなった。AP発色剤は使用
直前に調製し、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT, Sigma)、5-ブロモ-4-クロロ-
3-インドリルホスフェート（BCIP, Sigma）および Tris-HCl-MgCl2緩衝液（pH9.
5）を含んだ（Finsenら, Neurosci. 1992, 47, 105-113）。AP発色は暗所室温に
て48時間行なった。切片を蒸留水で濯ぐことによって、発色反応を停止した。切
片をアセトン系列中で脱水し、キシレン-フェノールクレオソート（英国Allchem
）中で軟化させ、キシレンで透徹し、Eukitt（デンマークBie & Berntsen）を使
ってカバーガラスで覆った。
）中55℃で30分間のすすぎを3回の後、室温の Tris-HCl（pH9.5）中で10分間の
すすぎを3回行ない、次にAP発色剤を添加することからなった。AP発色剤は使用
直前に調製し、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT, Sigma)、5-ブロモ-4-クロロ-
3-インドリルホスフェート（BCIP, Sigma）および Tris-HCl-MgCl2緩衝液（pH9.
5）を含んだ（Finsenら, Neurosci. 1992, 47, 105-113）。AP発色は暗所室温に
て48時間行なった。切片を蒸留水で濯ぐことによって、発色反応を停止した。切
片をアセトン系列中で脱水し、キシレン-フェノールクレオソート（英国Allchem
）中で軟化させ、キシレンで透徹し、Eukitt（デンマークBie & Berntsen）を使
ってカバーガラスで覆った。
【０２００】 対照反応は、（1）ハイブリダイゼーションに先立って切片をRNase A（50μg/
ml, スウェーデン・Pharmacia）で前処理すること、（2）100倍過剰の非標識プ
ローブを使って切片をハイブリダイズさせること、および（3）ハイブリダイゼ
ーション緩衝液のみを使って切片をハイブリダイズさせることからなった。この
ハイブリダイゼーション反応の結果を表２に記載する。
ml, スウェーデン・Pharmacia）で前処理すること、（2）100倍過剰の非標識プ
ローブを使って切片をハイブリダイズさせること、および（3）ハイブリダイゼ
ーション緩衝液のみを使って切片をハイブリダイズさせることからなった。この
ハイブリダイゼーション反応の結果を表２に記載する。
【０２０１】 表２ ラットにおけるニューブラスチンの発現 ──────────────────────────────────── 構造 E14 P0/P1 P7 成体 ──────────────────────────────────── 前脳 ++ 中脳腹側 - 後根神経節 ++ 脊髄 + 膜 + 嗅球 (+) ++ ++ 小脳 + ++ + 三叉神経節 ++ ++ 線条体 + +(+) 皮質 (+) ++ ++ + 海馬 (+) ++ ++ ──────────────────────────────────── 胎生14日（E14）で、ニューブラスチンはラット胚の前脳、後脳および脊髄に
弱く発現された。ニューブラスチンmRNAは眼（網膜）、後根神経節、三叉神経節
（V）ならびに腎臓、肺、心臓、肝臓および腸でも検出された。新生仔（P0）ラ
ットでは、顕著なニューブラスチン発現が、皮質および線条体に認められた。ニ
ューブラスチン発現は、嗅球および海馬でも検出された。7日齢（P7）ラットで
は、ニューブラスチンが皮質、線条体、嗅球および小脳に発現された。顕著なシ
グナルが海馬に見られた。成体ラットの場合、脳のほとんどの領域で、ニューブ
ラスチン発現は、極めて低いレベルまたは検出不可能なレベルだった。弱いシグ
ナルが視床核に検出され、顕著なニューブラスチン発現が海馬に検出された。
弱く発現された。ニューブラスチンmRNAは眼（網膜）、後根神経節、三叉神経節
（V）ならびに腎臓、肺、心臓、肝臓および腸でも検出された。新生仔（P0）ラ
ットでは、顕著なニューブラスチン発現が、皮質および線条体に認められた。ニ
ューブラスチン発現は、嗅球および海馬でも検出された。7日齢（P7）ラットで
は、ニューブラスチンが皮質、線条体、嗅球および小脳に発現された。顕著なシ
グナルが海馬に見られた。成体ラットの場合、脳のほとんどの領域で、ニューブ
ラスチン発現は、極めて低いレベルまたは検出不可能なレベルだった。弱いシグ
ナルが視床核に検出され、顕著なニューブラスチン発現が海馬に検出された。
【０２０２】 実施例４：ニューブラスチンポリペプチド 配列番号8に同定されるオープンリーディングフレームまたはコード領域（CDS
）は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコード
化する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列
番号9に示す。配列番号9に基づき、ニューブラスチンポリペプチドの3つの変異
体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含まれる： (i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれるポリペプ
チド、 (ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれるポリペプ
チド、 (iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれるポリペ
プチド。
）は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコード
化する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列
番号9に示す。配列番号9に基づき、ニューブラスチンポリペプチドの3つの変異
体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含まれる： (i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれるポリペプ
チド、 (ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれるポリペプ
チド、 (iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれるポリペ
プチド。
【０２０３】 同様に、（配列番号4の）アミノ酸配列を有するプレプロポリペプチドをコー
ド化する配列番号3に同定されるコード領域（CDS）に基づいて、ニューブラスチ
ンの3つの変異体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含
まれる： (i）配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (ii）配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (iii)配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
ド化する配列番号3に同定されるコード領域（CDS）に基づいて、ニューブラスチ
ンの3つの変異体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含
まれる： (i）配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (ii）配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (iii)配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【０２０４】 Clustal W（1.75）による多重配列整列に基づき、配列番号9をGDNF、パーセフ
ィンおよびニュールツリンと整列させた。このアラインメントを表3に示す。 表３： ニューブラスチンとパーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFとのアミノ酸配列
比較
ィンおよびニュールツリンと整列させた。このアラインメントを表3に示す。 表３： ニューブラスチンとパーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFとのアミノ酸配列
比較
【０２０５】
【表３】 ★ 完全に保存された単一の残基を持つ位置を示す。 : 次の「強（strong）」グループの一つが完全に保存されていることを示す：S
TA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。 . 次の「弱（weaker）」グループの一つが完全に保存されていることを示す：C
SA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。 表3に示すアミノ酸配列アラインメントから、ニューブラスチンは7つの保存さ
れたシステイン残基を、TGF-βスーパーファミリー内で保存されている位置に持
つことがわかる。一態様として、好ましいニューロブラスチンポリペプチドは、
配列番号2の8、35、39、72、73、101および103位、または配列番号4および9の43
、70、74、107、108、136および138位に保存された（7つの）システイン残基を
含有する。これら7つの保存されたシステイン残基は、TGF-βスーパーファミリ
ー内で3つの単量体ジスルフィド結合（例えば配列番号2ではシステイン残基8−7
3、35−101および39−101間、また例えば配列番号4および9ではシステイン残基4
3−108、70−136および74−138間が考えられる）と、1つの単量体間ジスルフィ
ド結合（例えば配列番号2ではシステイン残基72−72間、また例えば配列番号4お
よび9ではシステイン107−107間が考えられる）を形成し、それらは、伸展した
βストランド領域と共にTGF-βスーパーファミリーの保存された構造モチーフを
構成することが知られている。例えばDaopinら, Protein 1993, 17, 176-192を
参照されたい。
TA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。 . 次の「弱（weaker）」グループの一つが完全に保存されていることを示す：C
SA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。 表3に示すアミノ酸配列アラインメントから、ニューブラスチンは7つの保存さ
れたシステイン残基を、TGF-βスーパーファミリー内で保存されている位置に持
つことがわかる。一態様として、好ましいニューロブラスチンポリペプチドは、
配列番号2の8、35、39、72、73、101および103位、または配列番号4および9の43
、70、74、107、108、136および138位に保存された（7つの）システイン残基を
含有する。これら7つの保存されたシステイン残基は、TGF-βスーパーファミリ
ー内で3つの単量体ジスルフィド結合（例えば配列番号2ではシステイン残基8−7
3、35−101および39−101間、また例えば配列番号4および9ではシステイン残基4
3−108、70−136および74−138間が考えられる）と、1つの単量体間ジスルフィ
ド結合（例えば配列番号2ではシステイン残基72−72間、また例えば配列番号4お
よび9ではシステイン107−107間が考えられる）を形成し、それらは、伸展した
βストランド領域と共にTGF-βスーパーファミリーの保存された構造モチーフを
構成することが知られている。例えばDaopinら, Protein 1993, 17, 176-192を
参照されたい。
【０２０６】 この配列アラインメントに基づいて、ニューブラスチンは神経栄養因子のGDNF
サブファミリーの一メンバーであることが示された（表3では、GDNFサブファミ
リーフィンガープリントであるLGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGCに下線を引い
ている）。
サブファミリーの一メンバーであることが示された（表3では、GDNFサブファミ
リーフィンガープリントであるLGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGCに下線を引い
ている）。
【０２０７】 GDNFファミリーの他のメンバーに対するニューブラスチンの相同性を計算した
。その結果を下記表４に記載する。
。その結果を下記表４に記載する。
【０２０８】 表４ GDNFファミリーの他のメンバーに対するニューブラスチンポリペプチドの相同性
【表４】 GDNF＝グリア細胞系由来栄養因子 NTN＝ニュールツリン PSP＝パーセフィン IHA＝インヒビン-α TGF-β2＝トランスフォーミング成長因子β2 「強い相同性」は、次の「強（strong）」グループの一つが保存されていること
を示す：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
を示す：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
【０２０９】 実施例５：ニューブラスチンの生産 本発明者らは、真核細胞と原核細胞の両方で、下記のようにニューブラスチン
を生産した。
を生産した。
【０２１０】 発現ベクター：ニューブラスチンをコード化する完全長cDNAを真核細胞用発現
ベクターpUbi1Zに挿入した。このベクターは、ヒトUbCプロモーターを改変型のp
cDNA3.1/Zeoにクローニングすることによって作成された。無改変のpcDNA3.1/Ze
oは市販されている（Invitrogen）。改変型pcDNA3.1/Zeoは、アンピシリン遺伝
子（3933〜5015位）と2838〜3134位の配列が除去されているために、親ベクター
より小さい。この改変型pcDNA3.1/ZeoのCMVプロモーターをpTEJ-8（Johansenら,
FEBS Lett. 1990, 267, 289-294）由来のUbCプロモーターで置き換えてpUbi1Z
を得た。
ベクターpUbi1Zに挿入した。このベクターは、ヒトUbCプロモーターを改変型のp
cDNA3.1/Zeoにクローニングすることによって作成された。無改変のpcDNA3.1/Ze
oは市販されている（Invitrogen）。改変型pcDNA3.1/Zeoは、アンピシリン遺伝
子（3933〜5015位）と2838〜3134位の配列が除去されているために、親ベクター
より小さい。この改変型pcDNA3.1/ZeoのCMVプロモーターをpTEJ-8（Johansenら,
FEBS Lett. 1990, 267, 289-294）由来のUbCプロモーターで置き換えてpUbi1Z
を得た。
【０２１１】 哺乳類細胞発現：次に、ニューブラスチンコード配列を含む上記pUbi1Zベクタ
ーを、不死化ラットニューロン細胞系である哺乳類細胞系HiB5にトランスフェク
トした（Renfranzら, Cell, 1991, 66, 713-729）。ニューブラスチンを安定に
発現する数系統のHiB5細胞系（RT-PCRによって決定）を樹立した。ノーザンブロ
ット上の全RNAを32P標識ニューブラスチンプローブとハイブリダイズさせること
により、上記安定細胞系のうちの一つに、HiB5pUb1zNBN22発現が確認された。こ
れらの研究の結果を図2に示す。次に、HiB5pUbi1zNBN22を、ニューブラスチン神
経栄養活性研究用のニューブラスチン源として使用した。
ーを、不死化ラットニューロン細胞系である哺乳類細胞系HiB5にトランスフェク
トした（Renfranzら, Cell, 1991, 66, 713-729）。ニューブラスチンを安定に
発現する数系統のHiB5細胞系（RT-PCRによって決定）を樹立した。ノーザンブロ
ット上の全RNAを32P標識ニューブラスチンプローブとハイブリダイズさせること
により、上記安定細胞系のうちの一つに、HiB5pUb1zNBN22発現が確認された。こ
れらの研究の結果を図2に示す。次に、HiB5pUbi1zNBN22を、ニューブラスチン神
経栄養活性研究用のニューブラスチン源として使用した。
【０２１２】 図2は、HiB5pUbi1zNBN22クローン中のニューブラスチンcDNAの発現（すなわち
、後述するように本発明の32P標識ニューブラスチンcDNAでプローブしたノーザ
ンブロット）を示している。このブロットは、表示されているように、それぞれ
非トランスフェクトHiB5細胞、HiB5pUbi1zNBN22細胞およびHiB5pUbi1zGDNF14か
ら抽出された全RNAによって調製した。それぞれ4.1kbおよび1.9kbに相当する28S
および18S rRNAバンドの位置をブロットの上に示してある。
、後述するように本発明の32P標識ニューブラスチンcDNAでプローブしたノーザ
ンブロット）を示している。このブロットは、表示されているように、それぞれ
非トランスフェクトHiB5細胞、HiB5pUbi1zNBN22細胞およびHiB5pUbi1zGDNF14か
ら抽出された全RNAによって調製した。それぞれ4.1kbおよび1.9kbに相当する28S
および18S rRNAバンドの位置をブロットの上に示してある。
【０２１３】 図3に示すように、ニューブラスチン由来ポリペプチドに対して産生された抗
体も、HiB5pUbi1zNBN22クローンから得た調整培地中に約13キロダルトン（「kD
」）のタンパク質を認識したが、非トランスフェクトHiB5細胞から得た調整培地
にはこれが認められなかった（実施例６参照）。
体も、HiB5pUbi1zNBN22クローンから得た調整培地中に約13キロダルトン（「kD
」）のタンパク質を認識したが、非トランスフェクトHiB5細胞から得た調整培地
にはこれが認められなかった（実施例６参照）。
【０２１４】 未修飾（すなわち翻訳後修飾を受けていない）ニューブラスチンポリペプチド
NBN140［配列番号10］およびNBN116［配列番号11］およびNBN113［配列番号12］
の予想分子量は、それぞれ14.7キロダルトン（「kD」）、12.4kDおよび12.1kDで
あると決定された。
NBN140［配列番号10］およびNBN116［配列番号11］およびNBN113［配列番号12］
の予想分子量は、それぞれ14.7キロダルトン（「kD」）、12.4kDおよび12.1kDで
あると決定された。
【０２１５】 方法：非トランスフェクトHiB5細胞およびHiB5pUbi1zNBN22クローンから得た
全RNA（10μg）によるノーザンブロットを、0.8％ホルムアルデヒドアガロース
ゲルでの電気泳動によって調製し、ナイロンメンブレン（Duralone, Stratagene
）にブロットした。そのブロットを、配列番号8とニューブラスチンcDNAの5’UT
Rおよび3’UTRに由来する追加のヌクレオチドとを含む、ランダムラベリング法
で調製した1.3kbの32P標識プローブと、実施例3に記載したようにハイブリダイ
ズさせ、洗浄した。そのブロットをHyperfilm MP（Amersham）に増感紙を使って
−80℃で接触させた。
全RNA（10μg）によるノーザンブロットを、0.8％ホルムアルデヒドアガロース
ゲルでの電気泳動によって調製し、ナイロンメンブレン（Duralone, Stratagene
）にブロットした。そのブロットを、配列番号8とニューブラスチンcDNAの5’UT
Rおよび3’UTRに由来する追加のヌクレオチドとを含む、ランダムラベリング法
で調製した1.3kbの32P標識プローブと、実施例3に記載したようにハイブリダイ
ズさせ、洗浄した。そのブロットをHyperfilm MP（Amersham）に増感紙を使って
−80℃で接触させた。
【０２１６】 N2サプリメント（Life Technologies）を添加した無血清培地中で終夜培養し
たHib5pUbi1NBN22または非トランスフェクトHib5細胞から得た調整培地を濃縮し
、15％ポリアクリルアミドゲル（Amersham Pharmacia Biotech；カタログ番号80
-1262-01）で分離した。タンパク質をPVDFメンブレン（Amersham Pharmacia Bio
tech；カタログ番号RPN-303F）に転写し、非特異的タンパク質結合部位を、0.1
％Tween-20を含むPBS中の5％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをポリクロー
ナルニューブラスチン抗体（1：1000）と共に終夜インキュベートした後、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ウサギIgG二次抗体（Amersham Pharma
cia Biotech；カタログ番号NA934）（1：2000）と共にインキュベートした。ECL
（enhanced chemoluminescence）（Amersham Pharmacia Biotech；カタログ番号
RPN2109）またはECL＋（Amersham Pharmacia Biotech; カタログ番号RPN2132）
を製造者の指示（Amersham）に従って使用することにより、免疫染色を可視化し
た。
たHib5pUbi1NBN22または非トランスフェクトHib5細胞から得た調整培地を濃縮し
、15％ポリアクリルアミドゲル（Amersham Pharmacia Biotech；カタログ番号80
-1262-01）で分離した。タンパク質をPVDFメンブレン（Amersham Pharmacia Bio
tech；カタログ番号RPN-303F）に転写し、非特異的タンパク質結合部位を、0.1
％Tween-20を含むPBS中の5％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをポリクロー
ナルニューブラスチン抗体（1：1000）と共に終夜インキュベートした後、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ウサギIgG二次抗体（Amersham Pharma
cia Biotech；カタログ番号NA934）（1：2000）と共にインキュベートした。ECL
（enhanced chemoluminescence）（Amersham Pharmacia Biotech；カタログ番号
RPN2109）またはECL＋（Amersham Pharmacia Biotech; カタログ番号RPN2132）
を製造者の指示（Amersham）に従って使用することにより、免疫染色を可視化し
た。
【０２１７】 これらの実験の結果を図3に示す。図3Aおよび3Bは、トランスフェクトされたH
iB5細胞におけるニューブラスチンタンパク質の発現を示す図である。非トラン
スフェクトHiB5細胞［レーン1］またはニューブラスチンcDNAをトランスフェク
トされた安定なHiB5クローン［レーン2］から得た終夜培養培地を後述のように
濃縮した。次に、その培地を、ニューブラスチンに特異的な実施例10に記載の2
種類のポリクローナル抗体Ab-1およびAb-2を使って、ウェスタンブロット法で分
析した。トランスフェクト細胞から得た培地では、どちらの抗体も約15kDaの分
子量を持つタンパク質を認識することがわかった。このタンパク質は非トランス
フェクトHiB5細胞には見られなかった。
iB5細胞におけるニューブラスチンタンパク質の発現を示す図である。非トラン
スフェクトHiB5細胞［レーン1］またはニューブラスチンcDNAをトランスフェク
トされた安定なHiB5クローン［レーン2］から得た終夜培養培地を後述のように
濃縮した。次に、その培地を、ニューブラスチンに特異的な実施例10に記載の2
種類のポリクローナル抗体Ab-1およびAb-2を使って、ウェスタンブロット法で分
析した。トランスフェクト細胞から得た培地では、どちらの抗体も約15kDaの分
子量を持つタンパク質を認識することがわかった。このタンパク質は非トランス
フェクトHiB5細胞には見られなかった。
【０２１８】 ニューブラスチンをコード化するクローン化cDNAを、他の真核細胞用発現ベク
ター、例えば真核細胞用発現ベクターTEJ-8（Johansenら, FEBS Lett. 1990, 26
7, 289-294）またはpcDNA-3（Invitrogen）に挿入して、得られた発現プラスミ
ドを別の哺乳類細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（「CHO」）細胞、H
EK293細胞、COS、PC12またはRN33b細胞系、またはヒト神経幹細胞などにトラン
スフェクトすることもできる。ニューブラスチンを発現させる安定な細胞系は、
例えばニューブラスチンタンパク質の生産に使用される。
ター、例えば真核細胞用発現ベクターTEJ-8（Johansenら, FEBS Lett. 1990, 26
7, 289-294）またはpcDNA-3（Invitrogen）に挿入して、得られた発現プラスミ
ドを別の哺乳類細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（「CHO」）細胞、H
EK293細胞、COS、PC12またはRN33b細胞系、またはヒト神経幹細胞などにトラン
スフェクトすることもできる。ニューブラスチンを発現させる安定な細胞系は、
例えばニューブラスチンタンパク質の生産に使用される。
【０２１９】 CHO細胞での発現 プラスミドpJC070.14の構築 チャイニーズハムスター卵巣細胞中でニューブラスチンcDNAを発現させるため
に、プレプロ型のヒトニューブラスチンをコード化するcDNA断片を、哺乳類発現
ベクターpEAG347に挿入して、プラスミドpJC070.14を作成した。pEAG347は、タ
ンデムなSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドpAD2
beta由来：NortonおよびCoffin, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 281）、ユニーク
なNotIクローニング部位を含み、その後ろにSV40後期転写ターミネーターおよび
ポリAシグナル（プラスミドpCMVbeta由来：MacGregorおよびCaskey, Nucl. Acid
s. Res 1989, 17, 2365）が続いている。その他にpEAG347は、pUC19由来のプラ
スミド骨格と、トランスフェクトされたCHO細胞でのMTX選択および増殖用のpSV2
dhf由来のdhfrを含む。
に、プレプロ型のヒトニューブラスチンをコード化するcDNA断片を、哺乳類発現
ベクターpEAG347に挿入して、プラスミドpJC070.14を作成した。pEAG347は、タ
ンデムなSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドpAD2
beta由来：NortonおよびCoffin, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 281）、ユニーク
なNotIクローニング部位を含み、その後ろにSV40後期転写ターミネーターおよび
ポリAシグナル（プラスミドpCMVbeta由来：MacGregorおよびCaskey, Nucl. Acid
s. Res 1989, 17, 2365）が続いている。その他にpEAG347は、pUC19由来のプラ
スミド骨格と、トランスフェクトされたCHO細胞でのMTX選択および増殖用のpSV2
dhf由来のdhfrを含む。
【０２２０】 プラスミドpJC070.14を2段階で作成した。まず、ヒトニューブラスチンのプレ
プロ型をコード化する断片を、オリゴヌクレオチドKD2-824、5’ AAGGAAAAAA GC
GGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG 3’［配列番号31］、KD2-825、5’ TTTTTTCCTT
GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG 3’［配列番号32］およびPFUポリメラーゼ
によるポリメラーゼ連鎖反応を使って、プラスミドpUbi1Z-NBNから単離した。そ
の断片をpPCR-Script Amp SK(+)のSrf-1部位にクローニングして、プラスミドpJ
C069を作成した。第二段階として、部分Not-1消化をプラスミドpJC069に行なっ
て、685bp断片（ニューブラスチン遺伝子を含む）を生成し、それをプラスミドp
EAG347のNot-1部位にクローニングして、プラスミドpJC070.14を作成した。プラ
スミドpJC070.14中のニューブラスチン遺伝子の転写は、アデノウイルス主要後
期プロモーターによって制御される。
プロ型をコード化する断片を、オリゴヌクレオチドKD2-824、5’ AAGGAAAAAA GC
GGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG 3’［配列番号31］、KD2-825、5’ TTTTTTCCTT
GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG 3’［配列番号32］およびPFUポリメラーゼ
によるポリメラーゼ連鎖反応を使って、プラスミドpUbi1Z-NBNから単離した。そ
の断片をpPCR-Script Amp SK(+)のSrf-1部位にクローニングして、プラスミドpJ
C069を作成した。第二段階として、部分Not-1消化をプラスミドpJC069に行なっ
て、685bp断片（ニューブラスチン遺伝子を含む）を生成し、それをプラスミドp
EAG347のNot-1部位にクローニングして、プラスミドpJC070.14を作成した。プラ
スミドpJC070.14中のニューブラスチン遺伝子の転写は、アデノウイルス主要後
期プロモーターによって制御される。
【０２２１】 ニューブラスチンを発現するCHO細胞系の作成 200μgのpJC070.14を、制限エ
ンドヌクレアーゼMlu-1での消化によって直線化した。そのDNAをフェノール：ク
ロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出し、エタノール沈殿し
た。直線化したそのDNAを20mM Hepes（pH7.05）、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM
Na2HPO4、6mMデキストロース（HEBS）に再懸濁し、約4×107個のCHO dukx B1（d
hfr-）細胞（p23）にエレクトロポレーション（280Vおよび960μF）によって導
入した。エレクトロポレーションの後、細胞を、10％ウシ胎仔血清（FBS）を添
加したα+改変イーグル培地（MEM）に戻して2日間培養した。次に、それらの細
胞をトリプシン処理し、10％透析FBSを添加したα-MEM（リボヌクレオシドおよ
びデオキシリボヌクレオシドを欠くもの）中、100mm培養皿（100,000細胞/プレ
ート）で、5日間培養した。次いでそれらの細胞を100,000細胞/100mmプレートの
密度に分割し、200nMメトトレキセート中で選択した。耐性コロニーを拾い、6ウ
ェルプレートに拡大培養し、各クローンから得た調整培地を、ニューブラスチン
に関する後述の特異的測定法を用いてスクリーニングした。最高レベルのニュー
ブラスチンを発現する12個のクローンをT162フラスコに拡大培養した後、再測定
した。図10に示すように、CHO細胞系は25〜50ng/mlの範囲のニューブラスチンを
産生した。
ンドヌクレアーゼMlu-1での消化によって直線化した。そのDNAをフェノール：ク
ロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出し、エタノール沈殿し
た。直線化したそのDNAを20mM Hepes（pH7.05）、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM
Na2HPO4、6mMデキストロース（HEBS）に再懸濁し、約4×107個のCHO dukx B1（d
hfr-）細胞（p23）にエレクトロポレーション（280Vおよび960μF）によって導
入した。エレクトロポレーションの後、細胞を、10％ウシ胎仔血清（FBS）を添
加したα+改変イーグル培地（MEM）に戻して2日間培養した。次に、それらの細
胞をトリプシン処理し、10％透析FBSを添加したα-MEM（リボヌクレオシドおよ
びデオキシリボヌクレオシドを欠くもの）中、100mm培養皿（100,000細胞/プレ
ート）で、5日間培養した。次いでそれらの細胞を100,000細胞/100mmプレートの
密度に分割し、200nMメトトレキセート中で選択した。耐性コロニーを拾い、6ウ
ェルプレートに拡大培養し、各クローンから得た調整培地を、ニューブラスチン
に関する後述の特異的測定法を用いてスクリーニングした。最高レベルのニュー
ブラスチンを発現する12個のクローンをT162フラスコに拡大培養した後、再測定
した。図10に示すように、CHO細胞系は25〜50ng/mlの範囲のニューブラスチンを
産生した。
【０２２２】 ニューブラスチンに関する三元複合体測定法 本発明者らは、Sanicolaらが記
載した三元複合体測定法（Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 6238）の変法を
用いて、CHO細胞系上清の培地中のニューブラスチンの存在について調べた。
載した三元複合体測定法（Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 6238）の変法を
用いて、CHO細胞系上清の培地中のニューブラスチンの存在について調べた。
【０２２３】 この測定法では、GDNF様分子の能力を、RETの細胞外ドメインと様々な補助受
容体GFRα1、GFRα2およびGFRα3との間の結合を媒介するその能力について評価
することができる。可溶型RETと補助受容体を融合タンパク質として作成した。
ラットRETの細胞外ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの融合タンパク
質（RET-AP）およびラットGFRα1の細胞外ドメイン（WO9744356；1997年11月27
日、参考文献としてここに援用する）とヒトIgG1のFcドメインとの融合タンパク
質（rGFRα1-Ig）は記載されている（Sanicolaら, Proc Natl Acad Sci USA 199
7, 94, 6238）。
容体GFRα1、GFRα2およびGFRα3との間の結合を媒介するその能力について評価
することができる。可溶型RETと補助受容体を融合タンパク質として作成した。
ラットRETの細胞外ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの融合タンパク
質（RET-AP）およびラットGFRα1の細胞外ドメイン（WO9744356；1997年11月27
日、参考文献としてここに援用する）とヒトIgG1のFcドメインとの融合タンパク
質（rGFRα1-Ig）は記載されている（Sanicolaら, Proc Natl Acad Sci USA 199
7, 94, 6238）。
【０２２４】 ネズミGFRα3の細胞外ドメインとヒトIgG1との融合タンパク質（mGFRα3-Ig）
を作成するために、ネズミRETL3のアミノ酸1〜359をコード化するDNA断片を、ヒ
トIgG1のFcドメインを含む断片に結合し、発現ベクターpEAG347にクローニング
して、プラスミドpGJ144を得た。プラスミドpGJ144をチャイニーズハムスター卵
巣細胞（CHO）にトランスフェクトして、上記融合タンパク質を産生する安定細
胞系を作成し、その融合タンパク質をプロテインAセファロース免疫アフィニテ
ィーカラムで標準的方法によって精製した。要約すると、そのGDNF様分子がこの
測定法でRETへの補助受容体の結合を媒介できるのであれば、RET-AP融合タンパ
ク質はプレート上に保持され、保持される量はアルカリホスファターゼの化学発
光性基質を使って測定することができる。
を作成するために、ネズミRETL3のアミノ酸1〜359をコード化するDNA断片を、ヒ
トIgG1のFcドメインを含む断片に結合し、発現ベクターpEAG347にクローニング
して、プラスミドpGJ144を得た。プラスミドpGJ144をチャイニーズハムスター卵
巣細胞（CHO）にトランスフェクトして、上記融合タンパク質を産生する安定細
胞系を作成し、その融合タンパク質をプロテインAセファロース免疫アフィニテ
ィーカラムで標準的方法によって精製した。要約すると、そのGDNF様分子がこの
測定法でRETへの補助受容体の結合を媒介できるのであれば、RET-AP融合タンパ
ク質はプレート上に保持され、保持される量はアルカリホスファターゼの化学発
光性基質を使って測定することができる。
【０２２５】 Dynex Microlite-1 ELISAプレート（Dynex Technologies）を50mM重炭酸塩/炭
酸塩（pH9.6）中1μg/mlのヒトFcに特異的なヤギ抗体で16時間被覆した。そのプ
レートを空にし、300μlの1％I-Block（Tropix）TBS溶液/0.5%Tween-20（TBST）
を1時間満たした。TBSTで3回洗浄した後、RET-AP融合遺伝子を発現する293EBNA
細胞から得た調整培地に希釈した100μlの1μg/ml rGFRα1-IgまたはmGFRα3-Ig
で各ウェルを満たし、次に、CHOニューブラスチンクローンから得た100μlの調
整培地をウェルの縦列の最上部のウェルに加え、各横列を下向きに2倍段階希釈
し、室温で1.5時間インキュベートした。次に、そのプレートをTBSTで3回洗浄し
、200mMトリス（pH9.8）、10mM MgCl2（CSPD緩衝液）で2回洗浄した。次に、そ
の洗浄溶液を、1mg/ml Sapphire化学発光増強剤（Tropix）を含むCSPD緩衝液中
の425μM CSPD（Tropix）で置換し、室温で30分間インキュベートした。化学発
光量はDynatech照度計を用いて測定した。
酸塩（pH9.6）中1μg/mlのヒトFcに特異的なヤギ抗体で16時間被覆した。そのプ
レートを空にし、300μlの1％I-Block（Tropix）TBS溶液/0.5%Tween-20（TBST）
を1時間満たした。TBSTで3回洗浄した後、RET-AP融合遺伝子を発現する293EBNA
細胞から得た調整培地に希釈した100μlの1μg/ml rGFRα1-IgまたはmGFRα3-Ig
で各ウェルを満たし、次に、CHOニューブラスチンクローンから得た100μlの調
整培地をウェルの縦列の最上部のウェルに加え、各横列を下向きに2倍段階希釈
し、室温で1.5時間インキュベートした。次に、そのプレートをTBSTで3回洗浄し
、200mMトリス（pH9.8）、10mM MgCl2（CSPD緩衝液）で2回洗浄した。次に、そ
の洗浄溶液を、1mg/ml Sapphire化学発光増強剤（Tropix）を含むCSPD緩衝液中
の425μM CSPD（Tropix）で置換し、室温で30分間インキュベートした。化学発
光量はDynatech照度計を用いて測定した。
【０２２６】 最初の実験では、本発明者らは、CHO細胞系によって産生されたニューブラス
チンがRETの細胞外ドメインへのGFRα1またはGFRα3の結合を媒介できるかどう
かを調べた。図11に示すように、CHO細胞クローン#53から得られた調整培地は、
mGFRα3-Ig融合タンパク質を含めた場合は上記三元複合体測定法で強いシグナル
を生じたが、rGFRα1-Ig融合タンパク質を含めた場合にはシグナルを生じなかっ
たことから、ニューブラスチンはGFRα3に結合するが、GFRα1には結合しないこ
とが示された。この挙動によりニューブラスチンはGDNFとは明確に区別される。
図11に示すように、GDNFはGFRα1に結合するが、GFRα3には結合しない。親CHO
細胞系から得られた調整培地または未調整の培地を測定した場合は、どちらの補
助受容体融合タンパク質でもシグナルは観察されなかった。
チンがRETの細胞外ドメインへのGFRα1またはGFRα3の結合を媒介できるかどう
かを調べた。図11に示すように、CHO細胞クローン#53から得られた調整培地は、
mGFRα3-Ig融合タンパク質を含めた場合は上記三元複合体測定法で強いシグナル
を生じたが、rGFRα1-Ig融合タンパク質を含めた場合にはシグナルを生じなかっ
たことから、ニューブラスチンはGFRα3に結合するが、GFRα1には結合しないこ
とが示された。この挙動によりニューブラスチンはGDNFとは明確に区別される。
図11に示すように、GDNFはGFRα1に結合するが、GFRα3には結合しない。親CHO
細胞系から得られた調整培地または未調整の培地を測定した場合は、どちらの補
助受容体融合タンパク質でもシグナルは観察されなかった。
【０２２７】 CHO細胞系におけるニューブラスチンの発現レベルを定量するために、1ng/ml
の濃度から始まるrGFRα1-IgおよびGDNFを使って標準曲線を作成した。次に、様
々なCHO細胞株に関するニューブラスチン濃度を、この標準曲線を用いて計算し
た。5つのCHO細胞系による産生レベルを図10に示す。この推定値は、GDNFとGFR
α1の間の結合親和力がニューブラスチンとGFRα3の間の結合親和力に類似して
いるという未検証の仮定に依存しているので、これらのレベルは概算値でしかな
い。
の濃度から始まるrGFRα1-IgおよびGDNFを使って標準曲線を作成した。次に、様
々なCHO細胞株に関するニューブラスチン濃度を、この標準曲線を用いて計算し
た。5つのCHO細胞系による産生レベルを図10に示す。この推定値は、GDNFとGFR
α1の間の結合親和力がニューブラスチンとGFRα3の間の結合親和力に類似して
いるという未検証の仮定に依存しているので、これらのレベルは概算値でしかな
い。
【０２２８】 CHO細胞系上清から得られるニューブラスチンの分析 CHO細胞系によって産生されるニューブラスチンをさらに分析するために、こ
のタンパク質をGFRα3-Ig融合タンパク質を使って培地から抽出し、ニューブラ
スチンペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体を使ったウェスタンブロ
ットで分析した。
のタンパク質をGFRα3-Ig融合タンパク質を使って培地から抽出し、ニューブラ
スチンペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体を使ったウェスタンブロ
ットで分析した。
【０２２９】 第1の実験では、セファロースビーズに結合したmGFRα3-Igでニューブラスチ
ンを抽出した。mGFRα3-Igはセファロースビーズに、その製造者であるPharmaci
a Inc.が提案する条件を使って結合した。100μLのmGFRα3-Ig-セファロースを
、陰性対照CHO細胞系またはニューブラスチン産生CHO細胞系＃16から得られる調
整培地の試料1.0mLに加えた。その懸濁液を振盪台の上で2時間インキュベートし
た。各懸濁液を遠心分離し、上清を除去した後、10mM HEPES、100mM NaCl（pH7.
5）1mLによる洗浄を3回行なった。各樹脂を100μLの2×還元試料緩衝液に再懸濁
し、100℃に5分間加熱した。20μLの試料緩衝液上清および10μLの分子量標準（
FMC）を、10〜20％既成SDS-PAGEゲル（Owl Scientific）の各ウェルに充填した
。そのゲルを40mAの一定電流で72分間電気泳動した。
ンを抽出した。mGFRα3-Igはセファロースビーズに、その製造者であるPharmaci
a Inc.が提案する条件を使って結合した。100μLのmGFRα3-Ig-セファロースを
、陰性対照CHO細胞系またはニューブラスチン産生CHO細胞系＃16から得られる調
整培地の試料1.0mLに加えた。その懸濁液を振盪台の上で2時間インキュベートし
た。各懸濁液を遠心分離し、上清を除去した後、10mM HEPES、100mM NaCl（pH7.
5）1mLによる洗浄を3回行なった。各樹脂を100μLの2×還元試料緩衝液に再懸濁
し、100℃に5分間加熱した。20μLの試料緩衝液上清および10μLの分子量標準（
FMC）を、10〜20％既成SDS-PAGEゲル（Owl Scientific）の各ウェルに充填した
。そのゲルを40mAの一定電流で72分間電気泳動した。
【０２３０】 ウェスタンブロット分析のために、Hofer Scientific装置で、10mM CAPS、10
％メタノール、0.05％SDS、pH11.2緩衝系中、ニトロセルロース（Schleicher an
d Schuell）にタンパク質をエレクトロブロットした（400mAの一定電流で45分）
。転写後、そのニトロセルロースフィルターをカセットから取り出し、1％酢酸
中の0.1％Ponceau Sの溶液で60秒間染色することにより、分子量マーカーを可視
化した。そのメンブレンを２片に切断し、蒸留水中で穏やかに撹拌することによ
って、過剰な染料を除去した。それらのメンブレンをTBS中の2％脱脂粉乳で4℃
で終夜ブロックした。それらのメンブレンを、2％脱脂粉乳/TBS中に1.0μg/mLの
濃度の、アフィニティー精製した2種類の抗ニューブラスチンペプチド抗体（R30
およびR31）と共に、個別にインキュベートした。それらのメンブレンにTBS-Twe
enで10分間の洗浄を3回行ない、ヤギ抗ウサギIgG-HRPコンジュゲート（Biorad）
の1：5000希釈液中で30分間インキュベートした。それらのメンブレンにTBS-Twe
enで10分間の洗浄を3回行ない、ECL基質（Amersham）で発色させた。図12に示す
ように、陰性対照細胞系から得た抽出タンパク質に観察されるバンド（レーン1
および3）と比較すると、どちらの抗体でも、ニューブラスチン産生CHO細胞株か
ら抽出したタンパク質に、特異的なバンドが検出された（レーン2および4）。
％メタノール、0.05％SDS、pH11.2緩衝系中、ニトロセルロース（Schleicher an
d Schuell）にタンパク質をエレクトロブロットした（400mAの一定電流で45分）
。転写後、そのニトロセルロースフィルターをカセットから取り出し、1％酢酸
中の0.1％Ponceau Sの溶液で60秒間染色することにより、分子量マーカーを可視
化した。そのメンブレンを２片に切断し、蒸留水中で穏やかに撹拌することによ
って、過剰な染料を除去した。それらのメンブレンをTBS中の2％脱脂粉乳で4℃
で終夜ブロックした。それらのメンブレンを、2％脱脂粉乳/TBS中に1.0μg/mLの
濃度の、アフィニティー精製した2種類の抗ニューブラスチンペプチド抗体（R30
およびR31）と共に、個別にインキュベートした。それらのメンブレンにTBS-Twe
enで10分間の洗浄を3回行ない、ヤギ抗ウサギIgG-HRPコンジュゲート（Biorad）
の1：5000希釈液中で30分間インキュベートした。それらのメンブレンにTBS-Twe
enで10分間の洗浄を3回行ない、ECL基質（Amersham）で発色させた。図12に示す
ように、陰性対照細胞系から得た抽出タンパク質に観察されるバンド（レーン1
および3）と比較すると、どちらの抗体でも、ニューブラスチン産生CHO細胞株か
ら抽出したタンパク質に、特異的なバンドが検出された（レーン2および4）。
【０２３１】 低い方の分子種の分子量は約13kDであり、これはおそらく、プロドメインの切
断後に生成するニューブラスチンの成熟ドメインに相当するのだろう。この切断
は、プレプロニューブラスチンタンパク質の3つのArg-＿（例えば-RXXR↓-）残
基のいずれか一つの後ろで起こって、それぞれ配列番号10、11または12に示すよ
うな、140AA、116AAまたは113AA型を生成するのだろう。非修飾（すなわち翻訳
後修飾を受けていない）ニューブラスチンポリペプチドNBN140［配列番号10］、
NBN116［配列番号11］およびNBN113［配列番号21］の予想分子量は、それぞれ14
.7kD、12.4kDおよび12.1kDと決定された。この分子種と他のニューブラスチン特
異的バンドの構造を確認するには、さらなる分析が必要だろう。
断後に生成するニューブラスチンの成熟ドメインに相当するのだろう。この切断
は、プレプロニューブラスチンタンパク質の3つのArg-＿（例えば-RXXR↓-）残
基のいずれか一つの後ろで起こって、それぞれ配列番号10、11または12に示すよ
うな、140AA、116AAまたは113AA型を生成するのだろう。非修飾（すなわち翻訳
後修飾を受けていない）ニューブラスチンポリペプチドNBN140［配列番号10］、
NBN116［配列番号11］およびNBN113［配列番号21］の予想分子量は、それぞれ14
.7kD、12.4kDおよび12.1kDと決定された。この分子種と他のニューブラスチン特
異的バンドの構造を確認するには、さらなる分析が必要だろう。
【０２３２】 第2の実験では、ELISAプレート上に捕捉したhGFRα3-Igで、ニューブラスチン
を抽出した。ヒトGFRα3の細胞外ドメイン（出願公開WO97/44356（1997年11月27
日、参考文献としてここに援用する）に開示されている）とヒトIgG1のFcドメイ
ンとの融合タンパク質（hGFRα3-Ig）を作成するために、ヒトGFRα3のアミノ酸
1〜364をコード化するDNA断片を、ヒトIgG1のFcドメインを含む断片に結合し、S
anicolaらが記載した発現ベクターCH269（Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 6
238）にクローニングした。このプラスミドによってコードされる融合タンパク
質を、293エプシュタインバーウイルスコード核抗原（EBNA）細胞中で一過性に
発現させ、標準的方法によりプロテインAセファロース免疫アフィニティーカラ
ムで精製した。
を抽出した。ヒトGFRα3の細胞外ドメイン（出願公開WO97/44356（1997年11月27
日、参考文献としてここに援用する）に開示されている）とヒトIgG1のFcドメイ
ンとの融合タンパク質（hGFRα3-Ig）を作成するために、ヒトGFRα3のアミノ酸
1〜364をコード化するDNA断片を、ヒトIgG1のFcドメインを含む断片に結合し、S
anicolaらが記載した発現ベクターCH269（Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 6
238）にクローニングした。このプラスミドによってコードされる融合タンパク
質を、293エプシュタインバーウイルスコード核抗原（EBNA）細胞中で一過性に
発現させ、標準的方法によりプロテインAセファロース免疫アフィニティーカラ
ムで精製した。
【０２３３】 96ウェルプレートの6ウェルを、PBS中25mg/mlの濃度のヤギ抗ヒトIgG（Fcγ断
片特異的；Jackson Immunulogics）（300ml/ウェル）で、4℃で終夜被覆した。
そのウェルを400mlの1％BSA/PBS溶液で室温で1時間ブロックした。PBST（PBS＋0
.05％Tween 20）で3回洗浄した後、300mlのhGFRα3-Ig（0.1％BSAを含むPBS中10
mg/ml）を各ウェルに加えた。そのプレートを室温で1時間インキュベートし、結
合を最大にするために穏やかに振盪（200往復/分）した。次にそのウェルを空に
し、再びPBSTで3回洗浄した。陰性対照CHO細胞またはニューブラスチン産生CHO
細胞系＃25から得た250mlの調整培地を3つのウェルのそれぞれに加えた。そのプ
レートを室温で3時間インキュベートし、穏やかに振盪（300往復/分）した。次
に、ウェルをPBSTで2回洗浄した。25mlの非還元Laemliローディング緩衝液を第1
のウェルに加え、結合しているタンパク質を溶出させるために、そのプレートを
5分間速く振盪した（1300往復/分）。内容物を次のウェルに移し、第2および第3
のウェルで、結合しているタンパク質を溶出させるために、この処置を繰返した
。β-メルカプトエタノール（最終5％）を加えた後、試料を5分間煮沸し、10-20
％ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PAGEによって分析した。
片特異的；Jackson Immunulogics）（300ml/ウェル）で、4℃で終夜被覆した。
そのウェルを400mlの1％BSA/PBS溶液で室温で1時間ブロックした。PBST（PBS＋0
.05％Tween 20）で3回洗浄した後、300mlのhGFRα3-Ig（0.1％BSAを含むPBS中10
mg/ml）を各ウェルに加えた。そのプレートを室温で1時間インキュベートし、結
合を最大にするために穏やかに振盪（200往復/分）した。次にそのウェルを空に
し、再びPBSTで3回洗浄した。陰性対照CHO細胞またはニューブラスチン産生CHO
細胞系＃25から得た250mlの調整培地を3つのウェルのそれぞれに加えた。そのプ
レートを室温で3時間インキュベートし、穏やかに振盪（300往復/分）した。次
に、ウェルをPBSTで2回洗浄した。25mlの非還元Laemliローディング緩衝液を第1
のウェルに加え、結合しているタンパク質を溶出させるために、そのプレートを
5分間速く振盪した（1300往復/分）。内容物を次のウェルに移し、第2および第3
のウェルで、結合しているタンパク質を溶出させるために、この処置を繰返した
。β-メルカプトエタノール（最終5％）を加えた後、試料を5分間煮沸し、10-20
％ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PAGEによって分析した。
【０２３４】 ウェスタンブロット分析を行なうために、タンパク質をニトロセルロースに転
写した。そのメンブレンを5％脱脂粉乳、PBST中でブロックおよびプローブし、P
BSTで洗浄した。ニューブラスチンは、2つのニューブラスチンペプチドに対して
産生させたポリクローナル抗体（R30およびR31）（1μg/ml）との反応に続いて
、HRP結合ヤギ抗ウサギ抗体（BioRad）との反応を行なった後、電気化学発光に
よって検出した。図13に示すように、5本のニューブラスチン特異的バンドが、
ニューブラスチン産生CHO細胞系から得た抽出タンパク質に検出された（レーン2
）。下側の2本のバンドは図12に観察されるバンドと極めて似ている。ここでも
、下側のバンドはおそらく、プロドメインの切断後に生成するニューブラスチン
の成熟ドメインに相当するのだろう。
写した。そのメンブレンを5％脱脂粉乳、PBST中でブロックおよびプローブし、P
BSTで洗浄した。ニューブラスチンは、2つのニューブラスチンペプチドに対して
産生させたポリクローナル抗体（R30およびR31）（1μg/ml）との反応に続いて
、HRP結合ヤギ抗ウサギ抗体（BioRad）との反応を行なった後、電気化学発光に
よって検出した。図13に示すように、5本のニューブラスチン特異的バンドが、
ニューブラスチン産生CHO細胞系から得た抽出タンパク質に検出された（レーン2
）。下側の2本のバンドは図12に観察されるバンドと極めて似ている。ここでも
、下側のバンドはおそらく、プロドメインの切断後に生成するニューブラスチン
の成熟ドメインに相当するのだろう。
【０２３５】 図13のバンドをさらに分析すると（データの記載なし）、PGNase Fによる約18
kDバンドの脱グリコシル化が、そのバンドを、図13のゲルで最も下にあるバンド
に相当するサイズまで減少させることがわかる。このことからニューブラスチン
は哺乳類細胞中でグリコシル化タンパク質として産生されることが示唆される。
kDバンドの脱グリコシル化が、そのバンドを、図13のゲルで最も下にあるバンド
に相当するサイズまで減少させることがわかる。このことからニューブラスチン
は哺乳類細胞中でグリコシル化タンパク質として産生されることが示唆される。
【０２３６】 大腸菌におけるニューブラスチンの発現 大腸菌中でニューブラスチン遺伝子を発現させるために、GC含量が低く好まし
い大腸菌コドンを持つシンジーン（syngene；合成遺伝子）を構築した。このシ
ンジーンは2つのベクターpET19bと、pET19bの誘導体であるpMJB164にクローニン
グされている。pET19bを使った構築を図14に示す。この構築体では、ニューブラ
スチンの成熟ドメイン（NBN113）をコードする配列が開始メチオニンに直接融合
している。pMJB164を使った構築を図15に示す。この構築体では、ニューブラス
チンの成熟ドメインが、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたヒスチジ
ンタグ（すなわち10個のヒスチジン）に融合している。開始メチオニンはそのヒ
スチジンタグの前にある。 図14でニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
い大腸菌コドンを持つシンジーン（syngene；合成遺伝子）を構築した。このシ
ンジーンは2つのベクターpET19bと、pET19bの誘導体であるpMJB164にクローニン
グされている。pET19bを使った構築を図14に示す。この構築体では、ニューブラ
スチンの成熟ドメイン（NBN113）をコードする配列が開始メチオニンに直接融合
している。pMJB164を使った構築を図15に示す。この構築体では、ニューブラス
チンの成熟ドメインが、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたヒスチジ
ンタグ（すなわち10個のヒスチジン）に融合している。開始メチオニンはそのヒ
スチジンタグの前にある。 図14でニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
【０２３７】
【外９】 図15でhis標識ニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
【０２３８】
【外１０】 実施例６：ラット胚ドーパミン作動性ニューロンの生存に対するニューブラス
チンの効果とChAT活性 この一連の実験では、上記のニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞から
得られる調整培地の効果を評価した。
チンの効果とChAT活性 この一連の実験では、上記のニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞から
得られる調整培地の効果を評価した。
【０２３９】 培養物の調製：中脳腹側または脊髄をラットE14胚から冷ハンクス平衡塩類溶
液（HBSS）中で切り出した。組織片を、滅菌ろ過した0.1％トリプシン（Worthin
gon）および0.05％DNase（Sigma）/HBSS溶液中、37℃で20分間インキュベートし
た。次に、組織片をHBSS＋0.5％DNaseで4回すすぎ、1mlの自動ピペットを使って
解離させた。次にその懸濁液を600rpmで5分間遠心分離し、ペレットを血清調整
培地（SCM；10％ウシ胎仔血清を含むDMEM）に再懸濁した。細胞の総数をトリパ
ンブルー色素排除法で測定し、ドーパミン作動性ニューロンの生存の評価につい
てはポリ-L-リジン被覆8ウェルチャンバースライド（Nunc）に100,000細胞/cm2
の密度で、またChAT活性測定については48ウェルプレート（Nunc）に200,000細
胞/cm2の密度で播種した。細胞をSCM中、5％CO2/95％O2および湿度95％、37℃で
24〜48時間インキュベートした後、無血清培地（SFM）に変えて神経栄養因子類
を添加した。
液（HBSS）中で切り出した。組織片を、滅菌ろ過した0.1％トリプシン（Worthin
gon）および0.05％DNase（Sigma）/HBSS溶液中、37℃で20分間インキュベートし
た。次に、組織片をHBSS＋0.5％DNaseで4回すすぎ、1mlの自動ピペットを使って
解離させた。次にその懸濁液を600rpmで5分間遠心分離し、ペレットを血清調整
培地（SCM；10％ウシ胎仔血清を含むDMEM）に再懸濁した。細胞の総数をトリパ
ンブルー色素排除法で測定し、ドーパミン作動性ニューロンの生存の評価につい
てはポリ-L-リジン被覆8ウェルチャンバースライド（Nunc）に100,000細胞/cm2
の密度で、またChAT活性測定については48ウェルプレート（Nunc）に200,000細
胞/cm2の密度で播種した。細胞をSCM中、5％CO2/95％O2および湿度95％、37℃で
24〜48時間インキュベートした後、無血清培地（SFM）に変えて神経栄養因子類
を添加した。
【０２４０】 ドーパミン作動性ニューロン生存評価用の細胞は、SFM＋栄養因子添加物中に5
日間放置した後、4％PFA中で5分間固定し、免疫組織化学によりチロシンヒドロ
キシラーゼについて染色した。
日間放置した後、4％PFA中で5分間固定し、免疫組織化学によりチロシンヒドロ
キシラーゼについて染色した。
【０２４１】 ChAT活性用の細胞はSFMと共に3日間放置した後、HBSS＋0.1％トリトンX-100中
で溶解し、直ちにドライアイスでChAT活性測定まで凍結しておいた。
で溶解し、直ちにドライアイスでChAT活性測定まで凍結しておいた。
【０２４２】 栄養因子の添加：非トランスフェクトHiB5対照もしくはニューブラスチン（Hi
B5pUbi1zNBN22）またはGDNF（HiB5pUbi1zGDNF-L17）を産生するHiB5から、調整
培地を集めた。HiB5pUbi1zNBN22は、その細胞から集めた調整培地をGDNF-ELISA
で測定すると、約20ng/24時間/105細胞のGDNFを産生する。各細胞系をDMEM＋1％
FCSと共に終夜培養し、上清を取り出し、使用時まで−20℃で保存した。その上
清は、細胞に添加するときにSFMで1：50に希釈した。別個のウェルをHiB5対照上
清（1：50）＋精製組換えラットGDNF（0.03〜10ng/ml）で処理した。
B5pUbi1zNBN22）またはGDNF（HiB5pUbi1zGDNF-L17）を産生するHiB5から、調整
培地を集めた。HiB5pUbi1zNBN22は、その細胞から集めた調整培地をGDNF-ELISA
で測定すると、約20ng/24時間/105細胞のGDNFを産生する。各細胞系をDMEM＋1％
FCSと共に終夜培養し、上清を取り出し、使用時まで−20℃で保存した。その上
清は、細胞に添加するときにSFMで1：50に希釈した。別個のウェルをHiB5対照上
清（1：50）＋精製組換えラットGDNF（0.03〜10ng/ml）で処理した。
【０２４３】 これらの実験の結果を図4に示す。図4A〜4Cは、下記実施例5.1に記述するよう
に、培養ラット胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの生存および無血清培地
中の脳神経運動ニューロンのChAT活性に対するHiB5pUbi1zNBN22細胞から分泌さ
れるニューブラスチンの効果を示す図である。
に、培養ラット胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの生存および無血清培地
中の脳神経運動ニューロンのChAT活性に対するHiB5pUbi1zNBN22細胞から分泌さ
れるニューブラスチンの効果を示す図である。
【０２４４】 図4Aは、E14中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中の、DIV5で測定し
たChAT活性（dpm/時）に対する組換えGDNFの用量反応曲線を示す図である［すな
わちHiB5；GDNF 0.03ng/ml；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 0.3ng/ml；GDNF 1ng/ml；GDN
F 10ng/ml；GDNF 100ng/ml］。
たChAT活性（dpm/時）に対する組換えGDNFの用量反応曲線を示す図である［すな
わちHiB5；GDNF 0.03ng/ml；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 0.3ng/ml；GDNF 1ng/ml；GDN
F 10ng/ml；GDNF 100ng/ml］。
【０２４５】 図4Bは、E14中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中の、DIV5で測定し
たCAT活性（dpm/時）を示す図である。ニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細
胞（ニューブラスチン）またはGDNF産生HiB5GDNFL-17（GDNFL-17）細胞から得た
希釈調整培地を、図に表示したように添加した［すなわちニューブラスチン1：1
0；ニューブラスチン1：50；GDNF L-17 1：50］。
たCAT活性（dpm/時）を示す図である。ニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細
胞（ニューブラスチン）またはGDNF産生HiB5GDNFL-17（GDNFL-17）細胞から得た
希釈調整培地を、図に表示したように添加した［すなわちニューブラスチン1：1
0；ニューブラスチン1：50；GDNF L-17 1：50］。
【０２４６】 図4Cは、E14ラット中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中のDIV7での1
ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数［TH+ 細胞数/ウ
ェル］を示す図である。非トランスフェクトHiB5細胞（HiB5）またはニューブラ
スチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞（ニューブラスチン）から得た希釈調整培地を
、様々な濃度で、図に表示したように添加した［すなわちHiB5 1：50；HiB5 1：
40；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/mlおよびニューブラスチン1：4
0］。
ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数［TH+ 細胞数/ウ
ェル］を示す図である。非トランスフェクトHiB5細胞（HiB5）またはニューブラ
スチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞（ニューブラスチン）から得た希釈調整培地を
、様々な濃度で、図に表示したように添加した［すなわちHiB5 1：50；HiB5 1：
40；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/mlおよびニューブラスチン1：4
0］。
【０２４７】 ニューブラスチンをトランスフェクトしたHiB5細胞から得られる調整培地の1
：40希釈液は、同じ希釈率および低い希釈率（1：10および1：40）の対照（非ト
ランスフェクト）HiB5細胞と比較して、TH免疫反応性細胞数を有意に増加させる
（例えば図4B参照）。TH免疫反応性細胞数の増加は、最大GDNF濃度（10ng/ml）
で見られる増加に匹敵する。このことは、培地に分泌されたニューブラスチンが
ラット胚中脳腹側に由来するドーパミン作動性ニューロン集団の生存に効果を持
つことを示している。これに対し、トランスフェクトされたHiB5細胞から分泌さ
れるGDNFとは異なり、ニューブラスチンをトランスフェクトしたHiB5細胞から得
られる調整培地の影響は、同じ培養物中のもう一つのニューロン集団であるコリ
ン作動性ニューロンには見られない（例えば図4A参照）。
：40希釈液は、同じ希釈率および低い希釈率（1：10および1：40）の対照（非ト
ランスフェクト）HiB5細胞と比較して、TH免疫反応性細胞数を有意に増加させる
（例えば図4B参照）。TH免疫反応性細胞数の増加は、最大GDNF濃度（10ng/ml）
で見られる増加に匹敵する。このことは、培地に分泌されたニューブラスチンが
ラット胚中脳腹側に由来するドーパミン作動性ニューロン集団の生存に効果を持
つことを示している。これに対し、トランスフェクトされたHiB5細胞から分泌さ
れるGDNFとは異なり、ニューブラスチンをトランスフェクトしたHiB5細胞から得
られる調整培地の影響は、同じ培養物中のもう一つのニューロン集団であるコリ
ン作動性ニューロンには見られない（例えば図4A参照）。
【０２４８】 実施例７：ブタ胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養の生存に対
するニューブラスチンの効果 この実験では、ニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞とブタ胚由来の中
脳腹側の切片培養物との共培養の効果を評価した。
するニューブラスチンの効果 この実験では、ニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞とブタ胚由来の中
脳腹側の切片培養物との共培養の効果を評価した。
【０２４９】 培養物の調製：ブタ胚（E28；n＝12）から滅菌条件下に中脳腹側（VM）を摘出
し、400μmの切片に切断し、グルコース（6.5mg/ml）を含む冷ゲイ平衡塩類溶液
（GIBCO）に入れた。その組織切片をStoppiniらが最初に開発した界面培養法［L
. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 1991, 37, 173-18
2］によって培養した。
し、400μmの切片に切断し、グルコース（6.5mg/ml）を含む冷ゲイ平衡塩類溶液
（GIBCO）に入れた。その組織切片をStoppiniらが最初に開発した界面培養法［L
. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 1991, 37, 173-18
2］によって培養した。
【０２５０】 簡単に述べると、血清含有培地（Gibco BRL）と共に6ウェルプレート（Coster
）中にインサートとして入れられた半多孔性膜（Millipore，0.3μm；8切片/膜
が1VMに相当）上に、切片を置いた。各ウェルは、最終濃度が25mMになるようにD
-グルコースを添加した1mlの培地（50％Optimem、25％ハンクス平衡塩類溶液（
全てGIBCO））を含んだ。第0日に、7000個のトランスフェクトHiB5pUbi1zNBN22
細胞（ニューブラスチン）または7000個の非トランスフェクトHiB5細胞（対照）
を各組織切片に接種した。その共培養を、まず33℃の培養器中で48時間生育して
、温度感受性癌遺伝子で不死化したHiB5細胞を増殖させた後、37℃の培養器に入
れ、そこでHiB5細胞を分化させた。培地を毎週2回交換した。有糸分裂阻害剤と
抗生物質はどの段階でも使用しなかった。
）中にインサートとして入れられた半多孔性膜（Millipore，0.3μm；8切片/膜
が1VMに相当）上に、切片を置いた。各ウェルは、最終濃度が25mMになるようにD
-グルコースを添加した1mlの培地（50％Optimem、25％ハンクス平衡塩類溶液（
全てGIBCO））を含んだ。第0日に、7000個のトランスフェクトHiB5pUbi1zNBN22
細胞（ニューブラスチン）または7000個の非トランスフェクトHiB5細胞（対照）
を各組織切片に接種した。その共培養を、まず33℃の培養器中で48時間生育して
、温度感受性癌遺伝子で不死化したHiB5細胞を増殖させた後、37℃の培養器に入
れ、そこでHiB5細胞を分化させた。培地を毎週2回交換した。有糸分裂阻害剤と
抗生物質はどの段階でも使用しなかった。
【０２５１】 HPLCによるドーパミンの測定：インビトロ第12日および第21日に培養培地を集
め、HPLCを用いて電気化学的検出法でドーパミンについて分析した（W.N. Sloot
h, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 1995, 60, 141-49）。
め、HPLCを用いて電気化学的検出法でドーパミンについて分析した（W.N. Sloot
h, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 1995, 60, 141-49）。
【０２５２】 組織処理と免疫組織化学：第21日に培養物をリン酸緩衝液中の4％ホルムアル
デヒドで60分間固定し、20％ショ糖溶液で24時間脱水し、凍結し、20μmにクリ
オスタット切片化（4系列）し、ゼラチン被覆顕微鏡スライドにのせた。1系列の
切片をチロシンヒドロキシラーゼ（TH）に関して免疫染色した。簡単に述べると
、切片に、1％トリトンX-100を含む0.05Mトリス緩衝食塩水（TBS, pH7.4）中で1
5分間の洗浄を三回行ない、TBS中、10％フェトル（fettle）ウシ血清（FBS, Lif
e Technologies）と共に30分間インキュベートした。次に、10％FBSを含むTBSに
1：600希釈したモノクローナルマウス抗TH抗体（Boehringer Mannheim）と共に
、組織を4℃で24時間インキュベートした。1％トリトンX-100を含むTBSでの15分
間のすすぎを3回行なった後、10％FBSを含むTBSに1：200希釈したビオチン化抗
マウスIgG抗体（Amersham）と共に、切片を60分間インキュベートした。次に1％
トリトンX-100を含むTBSで洗浄（15分間を3回）し、10％FBSを含むTBSに1：200
希釈したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（Dako）と共に60分間インキュ
ベートした。TBSで洗浄（15分間を3回）した後、0.01％H2O2を含むTBS中の0.05
％3,3-ジアミノベンジジン（Sigma）で処理することによって、結合している抗
体を可視化した。最後に、切片をアルコール中で脱水し、キシレンで透徹し、Eu
kittを使ってカバーガラスで覆った。
デヒドで60分間固定し、20％ショ糖溶液で24時間脱水し、凍結し、20μmにクリ
オスタット切片化（4系列）し、ゼラチン被覆顕微鏡スライドにのせた。1系列の
切片をチロシンヒドロキシラーゼ（TH）に関して免疫染色した。簡単に述べると
、切片に、1％トリトンX-100を含む0.05Mトリス緩衝食塩水（TBS, pH7.4）中で1
5分間の洗浄を三回行ない、TBS中、10％フェトル（fettle）ウシ血清（FBS, Lif
e Technologies）と共に30分間インキュベートした。次に、10％FBSを含むTBSに
1：600希釈したモノクローナルマウス抗TH抗体（Boehringer Mannheim）と共に
、組織を4℃で24時間インキュベートした。1％トリトンX-100を含むTBSでの15分
間のすすぎを3回行なった後、10％FBSを含むTBSに1：200希釈したビオチン化抗
マウスIgG抗体（Amersham）と共に、切片を60分間インキュベートした。次に1％
トリトンX-100を含むTBSで洗浄（15分間を3回）し、10％FBSを含むTBSに1：200
希釈したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（Dako）と共に60分間インキュ
ベートした。TBSで洗浄（15分間を3回）した後、0.01％H2O2を含むTBS中の0.05
％3,3-ジアミノベンジジン（Sigma）で処理することによって、結合している抗
体を可視化した。最後に、切片をアルコール中で脱水し、キシレンで透徹し、Eu
kittを使ってカバーガラスで覆った。
【０２５３】 細胞数および形態計測的分析：免疫反応性TH-irニューロンの定量を、明視野
顕微鏡（オリンパス）を使って行なった。十分に保たれた細胞構造と明確な核を
持ち強い染色を示す細胞だけを数えた。20倍の対物レンズを用いて4培養切片ご
との細胞数に基づいて概算した。TH-irニューロン中の核の平均直径（6.6±0.2
μm，n＝30）を使用し、Abercrombieの式（M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946,
94, 239-47）に従って、細胞数を二重計数について補正した。核のサイズはニュ
ーロン追跡システム（Neurolucida, MicroBrightField, Inc.）を使って見積も
った。
顕微鏡（オリンパス）を使って行なった。十分に保たれた細胞構造と明確な核を
持ち強い染色を示す細胞だけを数えた。20倍の対物レンズを用いて4培養切片ご
との細胞数に基づいて概算した。TH-irニューロン中の核の平均直径（6.6±0.2
μm，n＝30）を使用し、Abercrombieの式（M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946,
94, 239-47）に従って、細胞数を二重計数について補正した。核のサイズはニュ
ーロン追跡システム（Neurolucida, MicroBrightField, Inc.）を使って見積も
った。
【０２５４】 これらの実験の結果を図5に示す。図5A〜5Cは、後述するようにHiB5pUbi1NBN2
2細胞（ニューブラスチン）またはHiB5細胞（対照）と共培養したブタ胚ドーパ
ミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、HiB5pU
bi1zNBN22細胞から分泌されたニューブラスチンの効果を示す図である。図5Aお
よび図5Bは、それぞれDIV12［ドーパミン（pmol/ml）−第12日］およびDIV21［
ドーパミン（pmol/ml）−第21日］に、培地に放出されたドーパミンを示す図で
ある。図5Cは、DIV21での1培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細
胞の数［TH-ir細胞／培養］を示す図である。
2細胞（ニューブラスチン）またはHiB5細胞（対照）と共培養したブタ胚ドーパ
ミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、HiB5pU
bi1zNBN22細胞から分泌されたニューブラスチンの効果を示す図である。図5Aお
よび図5Bは、それぞれDIV12［ドーパミン（pmol/ml）−第12日］およびDIV21［
ドーパミン（pmol/ml）−第21日］に、培地に放出されたドーパミンを示す図で
ある。図5Cは、DIV21での1培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細
胞の数［TH-ir細胞／培養］を示す図である。
【０２５５】 第12日の時点で、HiB5-ニューブラスチン共培養物から得られる培地は、HiB5-
C共培養物から得られる培地よりも84％多いドーパミンを含むことが、HPLC分析
によって明らかになった（図5A）。第21日の時点で相違は78％（図5B）であり、
細胞数は、HiB5-ニューブラスチン共培養物がHiB5-C共培養物よりも66％多いチ
ロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ニューロンを含むことを示した（P＜0.05）
（図5C）。これは、HiB5pUbi1zNBN22クローンから分泌されたニューブラスチン
が、ブタ胚ドーパミン作動性ニューロンに対して強力な生存効果を持つことを示
している。
C共培養物から得られる培地よりも84％多いドーパミンを含むことが、HPLC分析
によって明らかになった（図5A）。第21日の時点で相違は78％（図5B）であり、
細胞数は、HiB5-ニューブラスチン共培養物がHiB5-C共培養物よりも66％多いチ
ロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ニューロンを含むことを示した（P＜0.05）
（図5C）。これは、HiB5pUbi1zNBN22クローンから分泌されたニューブラスチン
が、ブタ胚ドーパミン作動性ニューロンに対して強力な生存効果を持つことを示
している。
【０２５６】 実施例８：無血清培地中の後根神経節の生存 この実施例では、既知の神経栄養因子類と比較したニューブラスチンポリペプ
チドの神経栄養活性を示す。
チドの神経栄養活性を示す。
【０２５７】 妊娠したメスマウスを頸椎脱臼によって屠殺した。培養のために胚を次のよう
に処理した。
に処理した。
【０２５８】 電解研磨したタングステン針を使って、表示した段階のC57/B16マウス（デン
マークMollegaard Breeding）から後根神経節を切り出した。胚性神経節をカル
シウムおよびマグネシウム不含のハンクス平衡塩類溶液中、0.05％トリプシン（
Gibco/BRL）と共に37℃で5分間インキュベートした。生後神経節はコラゲナーゼ
/ディスパーゼ1mg/mlで30〜45分間処理した後、トリプシン/DNAse 0.25％で15分
間処理した。トリプシン溶液を除去した後、10％熱非働化ウマ血清を含む10mlの
DMEMで神経節を1回洗浄し、先端熱加工したパスツールピペットで穏やかに砕い
て、単細胞懸濁液を得た。
マークMollegaard Breeding）から後根神経節を切り出した。胚性神経節をカル
シウムおよびマグネシウム不含のハンクス平衡塩類溶液中、0.05％トリプシン（
Gibco/BRL）と共に37℃で5分間インキュベートした。生後神経節はコラゲナーゼ
/ディスパーゼ1mg/mlで30〜45分間処理した後、トリプシン/DNAse 0.25％で15分
間処理した。トリプシン溶液を除去した後、10％熱非働化ウマ血清を含む10mlの
DMEMで神経節を1回洗浄し、先端熱加工したパスツールピペットで穏やかに砕い
て、単細胞懸濁液を得た。
【０２５９】 ポリオルニチン（0.5mg/ml、終夜）およびラミニン（20mg/mlで4時間；Gibco/
BRL）でプレコーティングした24ウェルプレート（Nunc）に、細胞を播種した。
それらのニューロンを、2mMグルタミン、0.35％ウシ血清アルブミン、60ng/mlプ
ロゲステロン、16mg/mlプトレシン、400ng/ml L-チロキシン、38ng/ml亜セレン
酸ナトリウム、340ng/mlトリヨードチロニン、60mg/mlペニシリンおよび100mg/m
lストレプトマイシンを添加したハムのF14からなる合成培地にて、湿潤5％CO2培
養器中、37℃で培養した。
BRL）でプレコーティングした24ウェルプレート（Nunc）に、細胞を播種した。
それらのニューロンを、2mMグルタミン、0.35％ウシ血清アルブミン、60ng/mlプ
ロゲステロン、16mg/mlプトレシン、400ng/ml L-チロキシン、38ng/ml亜セレン
酸ナトリウム、340ng/mlトリヨードチロニン、60mg/mlペニシリンおよび100mg/m
lストレプトマイシンを添加したハムのF14からなる合成培地にて、湿潤5％CO2培
養器中、37℃で培養した。
【０２６０】 培養48時間後に、ニューロンは、位相差顕微鏡下にその双極性の形態により、
明確に認められた。栄養因子類（ニューロンの播種に先立って10ng/mlの濃度で
培養培地に添加）またはニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞から得た調
製培地の存在下もしくは不在下でのニューロンの生存百分率を、48時間の時点で
ウェル中のニューロン数を数えることによって評価した。
明確に認められた。栄養因子類（ニューロンの播種に先立って10ng/mlの濃度で
培養培地に添加）またはニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞から得た調
製培地の存在下もしくは不在下でのニューロンの生存百分率を、48時間の時点で
ウェル中のニューロン数を数えることによって評価した。
【０２６１】 これらの実験の結果を図9に示す。図中、 0は対照実験（因子類不在下）を表し、 1はGDNF存在下での実験を表し、 2はニュールツリン存在下での実験を表し、 3は本発明のニューブラスチン存在下での実験を表し、 E12は胎生12日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表
し、 E16は胎生16日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表
し、 P0は出生日に単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し
、 P7は生後7日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し
、 P15は生後15日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表
す。
し、 E16は胎生16日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表
し、 P0は出生日に単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し
、 P7は生後7日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し
、 P15は生後15日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表
す。
【０２６２】 これらの結果から、本発明の神経栄養因子が、確立した神経栄養因子に匹敵す
るか、さらにはそれを上回る活性を示すことが、明らかにわかる。
るか、さらにはそれを上回る活性を示すことが、明らかにわかる。
【０２６３】 実施例９：黒質ドーパミンニューロンに対するニューブラスチンのインビボ効
果 成熟した黒質ドーパミン（DA）ニューロンを6-ヒドロキシドーパミン誘導性の
変性から保護するニューブラスチン（ニューブラスチン）の能力を調べるために
、本発明者らは、パーキンソン病のラットモデル（SauerおよびOertel, Neurosc
ience 1994, 54, 401-415）と、ニューブラスチンのレンチウイルス遺伝子導入
を使用した。
果 成熟した黒質ドーパミン（DA）ニューロンを6-ヒドロキシドーパミン誘導性の
変性から保護するニューブラスチン（ニューブラスチン）の能力を調べるために
、本発明者らは、パーキンソン病のラットモデル（SauerおよびOertel, Neurosc
ience 1994, 54, 401-415）と、ニューブラスチンのレンチウイルス遺伝子導入
を使用した。
【０２６４】 レンチウイルスの作成：ニューブラスチンをコード化するレンチウイルス導入
ベクターpHR’-ニューブラスチンを作成するために、ニューブラスチンcDNAから
得られる1331bpのBmaH1断片を、pSL301（Invitrogen）のBamH1/BglII部位にサブ
クローニングした。この構築体から1519bpのBamH1/Xho1断片を切り出し、ウッド
チャック肝炎ウイルス翻訳後断片（Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ
「Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhan
ces expression of transgenes delivered by retroviral vectors（ウッドチャ
ック肝炎ウイルス転写後調節配列はレトロウイルスベクターによって送達された
導入遺伝子の発現を増進させる）」J. Virol. 1999, 73(4), 2886-2892）を保持
するpHR’のBamH1/Xho1部位に結合させた。
ベクターpHR’-ニューブラスチンを作成するために、ニューブラスチンcDNAから
得られる1331bpのBmaH1断片を、pSL301（Invitrogen）のBamH1/BglII部位にサブ
クローニングした。この構築体から1519bpのBamH1/Xho1断片を切り出し、ウッド
チャック肝炎ウイルス翻訳後断片（Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ
「Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhan
ces expression of transgenes delivered by retroviral vectors（ウッドチャ
ック肝炎ウイルス転写後調節配列はレトロウイルスベクターによって送達された
導入遺伝子の発現を増進させる）」J. Virol. 1999, 73(4), 2886-2892）を保持
するpHR’のBamH1/Xho1部位に結合させた。
【０２６５】 レンチウイルスベクターの作成は、例えばZuffereyら（Zufferey R, Nagy D,
Mandel RJ, Naldini L, Trono D「Multiply attenuated lentiviral vector ach
ieves efficient gene delivery in vivo（多重に弱毒化されたレンチウイルス
ベクターによりインビボで効率のよい遺伝子送達が達成される）」Nat. Biotech
nol. 1997, 15(9), 871-875）によって記載されている。簡単に述べると、導入
構築体とヘルパープラスミドpR8.91およびpMDGを293T細胞にトランスフェクトし
た。トランスフェクションの48時間後と72時間後に、培地に放出されたウイルス
粒子を集めた。ウイルスを濃縮するために、培地を141,000gで1.5時間遠心分離
し、そのペレットをDMEMに溶解した。緑色蛍光タンパク質（「GFP」）の遺伝子
を保持する対照の力価は、293T細胞中のGFP蛍光により、108形質転換単位（TU）
/mlと決定された。RNAスロットブロット法（von Schwedler U, Song J, Aiken C
, Trono D「Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 provir
al DNA synthesis in infected cells（Vifは感染細胞でのI型ヒト免疫不全ウイ
ルスのプロウイルスDNA合成にとって極めて重要である）」J. Virol. 1993, 67(
8) 4945-4955）を使って、ウイルス粒子力価を決定した。GDNF上清およびニュー
ブラスチン上清には、GFP上清と比較して10分の1量の粒子が見出された。
Mandel RJ, Naldini L, Trono D「Multiply attenuated lentiviral vector ach
ieves efficient gene delivery in vivo（多重に弱毒化されたレンチウイルス
ベクターによりインビボで効率のよい遺伝子送達が達成される）」Nat. Biotech
nol. 1997, 15(9), 871-875）によって記載されている。簡単に述べると、導入
構築体とヘルパープラスミドpR8.91およびpMDGを293T細胞にトランスフェクトし
た。トランスフェクションの48時間後と72時間後に、培地に放出されたウイルス
粒子を集めた。ウイルスを濃縮するために、培地を141,000gで1.5時間遠心分離
し、そのペレットをDMEMに溶解した。緑色蛍光タンパク質（「GFP」）の遺伝子
を保持する対照の力価は、293T細胞中のGFP蛍光により、108形質転換単位（TU）
/mlと決定された。RNAスロットブロット法（von Schwedler U, Song J, Aiken C
, Trono D「Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 provir
al DNA synthesis in infected cells（Vifは感染細胞でのI型ヒト免疫不全ウイ
ルスのプロウイルスDNA合成にとって極めて重要である）」J. Virol. 1993, 67(
8) 4945-4955）を使って、ウイルス粒子力価を決定した。GDNF上清およびニュー
ブラスチン上清には、GFP上清と比較して10分の1量の粒子が見出された。
【０２６６】 手術法：動物が関わる全ての作業は、ルンド（Lund）大学の実験動物の利用に
関する倫理委員会によって設定された規則に従って行なわれた。
関する倫理委員会によって設定された規則に従って行なわれた。
【０２６７】 21匹の若い雌スプレーグ・ドーリー成体ラット（B&K Universal、スウェーデ
ン・ストックホルム）を使用し、ラット用固形飼料と水を自由に摂取させて12時
間の明暗周期で飼育した。SauerおよびOertel（SauerおよびOertel, Neuroscien
ce 1994, 59, 401-415）に従って、損傷の3週間前に、逆行性標識と6-OHDA損傷
を行なった。簡単に述べると、エクイセシン（Equithesin）麻酔（0.3ml/100g）
下に、逆行性トレーサーFluoro-Gold（FG；Fluorochrome, Inc., コロラド州エ
ングルウッド）の2％溶液（0.9％NaClに溶解）0.2μlを、ラットに両側から注入
した。注入は、2μlハミルトンシリンジを使用し、AP＝＋0.5mm；ブレグマに対
してML＝±3.4mm；硬膜に対してDV＝−5.0mmの座標に、切歯バー（incisor bar
）を0.0mmに設定して行なった。また、針を引き抜く前に、さらに5分間放置して
、0.05μl/分の注入を行なった。
ン・ストックホルム）を使用し、ラット用固形飼料と水を自由に摂取させて12時
間の明暗周期で飼育した。SauerおよびOertel（SauerおよびOertel, Neuroscien
ce 1994, 59, 401-415）に従って、損傷の3週間前に、逆行性標識と6-OHDA損傷
を行なった。簡単に述べると、エクイセシン（Equithesin）麻酔（0.3ml/100g）
下に、逆行性トレーサーFluoro-Gold（FG；Fluorochrome, Inc., コロラド州エ
ングルウッド）の2％溶液（0.9％NaClに溶解）0.2μlを、ラットに両側から注入
した。注入は、2μlハミルトンシリンジを使用し、AP＝＋0.5mm；ブレグマに対
してML＝±3.4mm；硬膜に対してDV＝−5.0mmの座標に、切歯バー（incisor bar
）を0.0mmに設定して行なった。また、針を引き抜く前に、さらに5分間放置して
、0.05μl/分の注入を行なった。
【０２６８】 FG注入の14日後に、緑色蛍光タンパク質（GFP）、合計5デポジット（1μl/デ
ポジット）の、ニューブラスチンまたはGDNFの遺伝子を保持するレンチウイルス
ベクターを、動物に与えた。それらデポジットのうち4つは、2本の針管に沿って
、次の座標で線条体に与えられた：AP＝＋1.0mm、ML＝−2.6mm、DV1＝−5.0mm、
DV2＝−4.5mmおよびAP＝0.0mm、ML＝−3.7mm、DV1＝−5.0mm、DV2＝−4.5mm。黒
質上デポジットはAP＝−5.2mm、ML＝−2.0mm、DV1＝−6.3mmに施した。歯バー（
tooth bar）は−2.3mmに設定した。
ポジット）の、ニューブラスチンまたはGDNFの遺伝子を保持するレンチウイルス
ベクターを、動物に与えた。それらデポジットのうち4つは、2本の針管に沿って
、次の座標で線条体に与えられた：AP＝＋1.0mm、ML＝−2.6mm、DV1＝−5.0mm、
DV2＝−4.5mmおよびAP＝0.0mm、ML＝−3.7mm、DV1＝−5.0mm、DV2＝−4.5mm。黒
質上デポジットはAP＝−5.2mm、ML＝−2.0mm、DV1＝−6.3mmに施した。歯バー（
tooth bar）は−2.3mmに設定した。
【０２６９】 逆行性標識の21日後かつレンチウイルス注入の7日後に動物を再び麻酔し、10
μlハミルトンシリンジで20μgの6-OHDA（Sigma；遊離塩基として計算し、0.02
％アスコルビン酸を添加した氷冷食塩水3μlに溶解した）の1デポジットを、右
線条体のFGデポジットと同じ位置に注入した。注入速度は1μl/分とし、針を引
き抜く前にさらに3分間放置した。
μlハミルトンシリンジで20μgの6-OHDA（Sigma；遊離塩基として計算し、0.02
％アスコルビン酸を添加した氷冷食塩水3μlに溶解した）の1デポジットを、右
線条体のFGデポジットと同じ位置に注入した。注入速度は1μl/分とし、針を引
き抜く前にさらに3分間放置した。
【０２７０】 組織処理：6-OHDA注入の21日後に、動物を抱水クロラールで深く麻酔し、経心
臓的に食塩水（pH7.4、室温）を1分間灌流した後、200mlの氷冷ホルムアルデヒ
ド溶液（0.1％リン酸緩衝液（ph7.4）中の4％パラホルムアルデヒド）を灌流し
た。脳を解剖し、同じ固定液中で3〜4時間、後固定した後、25％ショ糖/0.1Mリ
ン酸緩衝液に48時間移した。線条体および黒質（SN）にわたって5系列の40μm切
片を凍結ミクロトームで切断した。
臓的に食塩水（pH7.4、室温）を1分間灌流した後、200mlの氷冷ホルムアルデヒ
ド溶液（0.1％リン酸緩衝液（ph7.4）中の4％パラホルムアルデヒド）を灌流し
た。脳を解剖し、同じ固定液中で3〜4時間、後固定した後、25％ショ糖/0.1Mリ
ン酸緩衝液に48時間移した。線条体および黒質（SN）にわたって5系列の40μm切
片を凍結ミクロトームで切断した。
【０２７１】 SN中のドーパミン作動性ニューロンの定量的評価：黒質緻密部中のFG標識ニュ
ーロンの数は、先に記載されているように盲検者によって評価された（Sauerお
よびOertel, Neuroscience 1994, 59, 401-415）。簡単に述べると、副視索の内
側終止核（MTN；PaxinosおよびWatsonのアトラス（1997）で−5.3）のレベルを
中心とする3つの連続切片を使用し、MTNに対して外側の全ての標識/染色ニュー
ロンを倍率40倍で数えた（n＝6-7/群）。330nmでの落射照明下に明るく蛍光を発
し、ニューロンの側面を示して、少なくとも一つの神経突起を延ばすものを、FG
標識ニューロンに含めた。
ーロンの数は、先に記載されているように盲検者によって評価された（Sauerお
よびOertel, Neuroscience 1994, 59, 401-415）。簡単に述べると、副視索の内
側終止核（MTN；PaxinosおよびWatsonのアトラス（1997）で−5.3）のレベルを
中心とする3つの連続切片を使用し、MTNに対して外側の全ての標識/染色ニュー
ロンを倍率40倍で数えた（n＝6-7/群）。330nmでの落射照明下に明るく蛍光を発
し、ニューロンの側面を示して、少なくとも一つの神経突起を延ばすものを、FG
標識ニューロンに含めた。
【０２７２】 GFPを保持するレンチウイルスの注入を受けた動物の損傷側では、FG陽性黒質
ニューロンの数が無傷の側の18％まで減少した。これに対し、レンチ-ニューブ
ラスチンを注入した動物では、FG陽性黒質ニューロンの数がほとんど完全に保護
された（89％）。これは、損傷側で逆行性標識されたニューロンの87％が保たれ
たレンチ-GDNF処置動物と同程度の効率だった。これは、ニューブラスチンが損
傷を受けた成熟黒質ドーパミンニューロンにとって強力な生存因子であり、GDNF
と同程度に強力であることを示している。
ニューロンの数が無傷の側の18％まで減少した。これに対し、レンチ-ニューブ
ラスチンを注入した動物では、FG陽性黒質ニューロンの数がほとんど完全に保護
された（89％）。これは、損傷側で逆行性標識されたニューロンの87％が保たれ
たレンチ-GDNF処置動物と同程度の効率だった。これは、ニューブラスチンが損
傷を受けた成熟黒質ドーパミンニューロンにとって強力な生存因子であり、GDNF
と同程度に強力であることを示している。
【０２７３】 図6は黒質ドーパミンニューロンに対するレンチウイルス産生ニューブラスチ
ンのインビボ効果を示す図である。雌スプレーグ・ドーリーラットにおける黒質
緻密部のニューロンを、右線条体への6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）の単回
注入の3週間前に、Fluorogold（FG）で逆行性標識した。6-OHDA注入の1週間前に
、動物に、図に示すようにニューブラスチン［ニューブラスチン］、GDNF［GDNF
］または緑色蛍光タンパク質［GFP］を発現するレンチウイルスベクターを注入
した。6-OHDA注入の21日後に、線条体の両側のFG標識ニューロンの数を決定した
。この図は、3つの動物群の線条体の損傷（右）側対無傷（左）側のFG標識ニュ
ーロンの百分率［％FG損傷/無傷］を示す。
ンのインビボ効果を示す図である。雌スプレーグ・ドーリーラットにおける黒質
緻密部のニューロンを、右線条体への6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）の単回
注入の3週間前に、Fluorogold（FG）で逆行性標識した。6-OHDA注入の1週間前に
、動物に、図に示すようにニューブラスチン［ニューブラスチン］、GDNF［GDNF
］または緑色蛍光タンパク質［GFP］を発現するレンチウイルスベクターを注入
した。6-OHDA注入の21日後に、線条体の両側のFG標識ニューロンの数を決定した
。この図は、3つの動物群の線条体の損傷（右）側対無傷（左）側のFG標識ニュ
ーロンの百分率［％FG損傷/無傷］を示す。
【０２７４】 実施例１０：抗体の産生 ニューブラスチンに対する抗体を作成するために、2匹のウサギを、担体タン
パク質に結合したペプチド1：CRPTRYEAVSFMDVNST（配列番号9のアミノ酸108〜12
4）またはペプチド2：ALRPPPGSRPVSQPC（配列番号9のアミノ酸93〜107）で、3週
間間隔で免疫化した。各ペプチドにつき2匹のウサギを第0週、3週、6週および10
週に免疫化し、第7週および11週に血液を採取した。2回目の採血液をペプチドア
フィニティーカラムでアフィニティー精製した。それらの抗体をペプチドに準じ
てAb-1およびAb-2と名付けた。
パク質に結合したペプチド1：CRPTRYEAVSFMDVNST（配列番号9のアミノ酸108〜12
4）またはペプチド2：ALRPPPGSRPVSQPC（配列番号9のアミノ酸93〜107）で、3週
間間隔で免疫化した。各ペプチドにつき2匹のウサギを第0週、3週、6週および10
週に免疫化し、第7週および11週に血液を採取した。2回目の採血液をペプチドア
フィニティーカラムでアフィニティー精製した。それらの抗体をペプチドに準じ
てAb-1およびAb-2と名付けた。
【０２７５】 ウェスタンブロット：ニューブラスチンのcDNAを安定にトランスフェクトした
2×106個のHiB5細胞（Hib5pUbi1zNBN22）または非トランスフェクトHiB5細胞を
、N2サプリメントを添加した無血清培地で終夜インキュベートした。5kDaのカッ
トオフメンブレンを持つ小濃縮器（Millipore, マサチューセッツ州ベッドフォ
ード）で培地を濃縮した。濃縮試料に5×Laemmli試料緩衝液を加え、95℃に5分
間加熱した。試料を15％アクリルアミドゲルでのSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって分離し、PVDFメンブレンに転写した。残留タンパク質結合部位を
、0.1％Tween-20を含むPBS中の5％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをニュ
ーブラスチン抗体（1：1000）と共に終夜インキュベートした後、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼに結合した二次抗ウサギまたは抗マウスIgG抗体（1：2000）
と共にインキュベートした。
2×106個のHiB5細胞（Hib5pUbi1zNBN22）または非トランスフェクトHiB5細胞を
、N2サプリメントを添加した無血清培地で終夜インキュベートした。5kDaのカッ
トオフメンブレンを持つ小濃縮器（Millipore, マサチューセッツ州ベッドフォ
ード）で培地を濃縮した。濃縮試料に5×Laemmli試料緩衝液を加え、95℃に5分
間加熱した。試料を15％アクリルアミドゲルでのSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって分離し、PVDFメンブレンに転写した。残留タンパク質結合部位を
、0.1％Tween-20を含むPBS中の5％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをニュ
ーブラスチン抗体（1：1000）と共に終夜インキュベートした後、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼに結合した二次抗ウサギまたは抗マウスIgG抗体（1：2000）
と共にインキュベートした。
【０２７６】 免疫染色は、ECL+（enhanced chemoluminiscence Plus）を使用し、製造者の
指示（Amersham）に従って可視化した。これらの実験の結果を図3および実施例5
に示す。
指示（Amersham）に従って可視化した。これらの実験の結果を図3および実施例5
に示す。
【０２７７】 標準的技術を使って、本発明者らは、次のペプチドに対するウサギポリクロー
ナル抗体も産生させた。
ナル抗体も産生させた。
【０２７８】
【外１１】 C末端に比較的近いR30およびR31だけが、ウェスタンブロット上、還元条件下
で、変性タンパク質を認識した。
で、変性タンパク質を認識した。
【配列表】
【図１】 32P標識ニューブラスチンcDNAでプローブされた2枚のノーザンブロットの写真
画像であって、様々な成人組織タイプ（図A）および様々な成人脳領域（図B）に
おけるニューブラスチン遺伝子の相対的発現レベルを比較したものである。
画像であって、様々な成人組織タイプ（図A）および様々な成人脳領域（図B）に
おけるニューブラスチン遺伝子の相対的発現レベルを比較したものである。
【図２】 32P標識ニューブラスチンcDNAでプローブされたノーザンブロットの写真画像
であって、非トランスフェクト細胞系HiB5で発現されるニューブラスチンcDNAの
量を、ニューブラスチンcDNAをトランスフェクトした細胞系で発現されるニュー
ブラスチンcDNAの量およびGDNF-cDNAをトランスフェクトした細胞系と比較した
ものである。
であって、非トランスフェクト細胞系HiB5で発現されるニューブラスチンcDNAの
量を、ニューブラスチンcDNAをトランスフェクトした細胞系で発現されるニュー
ブラスチンcDNAの量およびGDNF-cDNAをトランスフェクトした細胞系と比較した
ものである。
【図３】 ニューブラスチンタンパク質が非トランスフェクトHiB5細胞（レーン1）で発
現される程度を、ニューブラスチンcDNAを安定にトランスフェクトしたHiB5細胞
系（レーン2）と比較する、2枚のウェスタンブロットの写真画像であって、ニュ
ーブラスチン特異抗体Ab-2（左側のブロット；図A）またはニューブラスチン特
異抗体Ab-1（右側のブロット；図B）でプローブしたものである。
現される程度を、ニューブラスチンcDNAを安定にトランスフェクトしたHiB5細胞
系（レーン2）と比較する、2枚のウェスタンブロットの写真画像であって、ニュ
ーブラスチン特異抗体Ab-2（左側のブロット；図A）またはニューブラスチン特
異抗体Ab-1（右側のブロット；図B）でプローブしたものである。
【図４】 無血清培地における培養ラット胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの生
存およびコリン作動性脳神経運動ニューロンのChAT活性に対するニューブラスチ
ンの影響を示す図。具体的に述べると、図4AはChAT活性（dpm/時間）に対する組
換えGDNFの用量反応曲線を示す図である。図4Bはニューブラスチン産生細胞また
はGDNF産生細胞から得られる希釈調整培地を使ったChAT活性（dpm/時間）を示す
図である。図4Cは1ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の
数を示す図である。
存およびコリン作動性脳神経運動ニューロンのChAT活性に対するニューブラスチ
ンの影響を示す図。具体的に述べると、図4AはChAT活性（dpm/時間）に対する組
換えGDNFの用量反応曲線を示す図である。図4Bはニューブラスチン産生細胞また
はGDNF産生細胞から得られる希釈調整培地を使ったChAT活性（dpm/時間）を示す
図である。図4Cは1ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の
数を示す図である。
【図５】 HiB5pUbi1zNBN22細胞（ニューブラスチン）またはHiB5細胞（対照）と同時培
養したブタ胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および
生存に対する、HiB5pUbi1zNBN22細胞から分泌されたニューブラスチンの影響を
示す図。図5Aおよび図5Bは、それぞれDIV12［ドーパミン（pmol/ml）−第12日］
およびDIV21［ドーパミン（pmol/ml）−第21日］の時点で、培地に放出されたド
ーパミンを表す。図5CはDIV21での1培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫
反応性細胞の数を示す図である。
養したブタ胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および
生存に対する、HiB5pUbi1zNBN22細胞から分泌されたニューブラスチンの影響を
示す図。図5Aおよび図5Bは、それぞれDIV12［ドーパミン（pmol/ml）−第12日］
およびDIV21［ドーパミン（pmol/ml）−第21日］の時点で、培地に放出されたド
ーパミンを表す。図5CはDIV21での1培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫
反応性細胞の数を示す図である。
【図６】 黒質ドーパミンニューロンに対するレンチウイルス産生ニューブラスチンのイ
ンビボ効果を示す図である。
ンビボ効果を示す図である。
【図７】 完全長ニューブラスチン遺伝子の同定に使用できる核酸プライマーと、ゲノム
ニューブラスチンコード配列（すなわち遺伝子）に対するそれらの空間的な向き
を含む、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造の模式図である。
ニューブラスチンコード配列（すなわち遺伝子）に対するそれらの空間的な向き
を含む、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造の模式図である。
【図８】 ニューブラスチンポリペプチドをコード化する核酸にはハイブリダイズするが
、他の既知のGDNFファミリーメンバー（すなわちGDNF、パーセフィンおよびニュ
ールツリン）をコード化する核酸にはハイブリダイズしないニューブラスチン特
異的プライマーであって、ヒトニューブラスチンポリペプチドをコード化するcD
NAクローンを同定するために使用したものを示す図である。
、他の既知のGDNFファミリーメンバー（すなわちGDNF、パーセフィンおよびニュ
ールツリン）をコード化する核酸にはハイブリダイズしないニューブラスチン特
異的プライマーであって、ヒトニューブラスチンポリペプチドをコード化するcD
NAクローンを同定するために使用したものを示す図である。
【図９】 様々な発生段階から得た解離ラット後根神経節細胞の培養物に対する本発明ポ
リペプチドの神経栄養活性を、既知の神経栄養因子で得られるものと比較して示
す図［0 対照実験（因子類不在下）；1 GDNF存在下；2 ニュールツリン存在下；
3 本発明ニューブラスチンの存在下；E12 胎生12日；E16 胎生16日；P0 出生日
；P7 生後7日；P15 生後15日］である。
リペプチドの神経栄養活性を、既知の神経栄養因子で得られるものと比較して示
す図［0 対照実験（因子類不在下）；1 GDNF存在下；2 ニュールツリン存在下；
3 本発明ニューブラスチンの存在下；E12 胎生12日；E16 胎生16日；P0 出生日
；P7 生後7日；P15 生後15日］である。
【図１０】 CHO細胞系からのニューブラスチンの産生を示す図である。
【図１１】 GFRα-1受容体およびGFRα-3受容体へのニューブラスチンおよびGDNFの結合の
比較を示す図である。
比較を示す図である。
【図１２】 ニューブラスチンへのR30抗ペプチド抗体およびR31抗ペプチド抗体の結合を図
示するウェスタンブロットの写真画像である。
示するウェスタンブロットの写真画像である。
【図１３】 RETL3-Igへのアフィニティー結合によるニューブラスチンの抽出を示すゲルの
写真である。
写真である。
【図１４】 pET19b-ニューブラスチンのプラスミド地図と、ニューブラスチンの合成遺伝
子の配列である。
子の配列である。
【図１５】 pMJB164-Hisニューブラスチンのプラスミド地図と、Hisニューブラスチンの合
成遺伝子の配列である。
成遺伝子の配列である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月２２日（２０００．８．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【外１】 の配列のいずれかを有するニューブラスチンペプチド。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/48 25/14 16/22 25/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 25/28 21/08 Ｃ０７Ｋ 14/48 Ｃ１２Ｑ 1/02 16/22 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ 21/08 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 37/24 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ 33/68 Ｆ (31)優先権主張番号 １９９８ ０１０４８ (32)優先日 平成10年８月19日(1998．8．19) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ６０／０９７，７７４ (32)優先日 平成10年８月25日(1998．8．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 １９９８ ０１２６５ (32)優先日 平成10年10月６日(1998．10．6) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ６０／１０３，９０８ (32)優先日 平成10年10月13日(1998．10．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／３４７，６１３ (32)優先日 平成11年７月２日(1999．7．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ
Claims (65)
- 【請求項１】 配列番号(SEQ ID NO:)1、3、8、13、14、15、29および30の
いずれか一つの配列を含んでなる単離されたニューブラスチン（neublastin）核
酸。 - 【請求項２】 ニューブラスチン神経栄養因子またはそのユニークな亜領域
をコード化し、配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に対して少なく
とも70％の相同性を含むニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするオ
ープンリーディングフレームを含んでなる核酸配列。 - 【請求項３】 請求項1または2の核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリ
ダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸。 - 【請求項４】 請求項3の核酸に相補的な核酸配列を含んでなる核酸。
- 【請求項５】 請求項1〜4のいずれか一項の核酸を使用する方法であって、
当該核酸によってコード化されるポリペプチドを細胞中で発現させる段階を含む
方法。 - 【請求項６】 上記の核酸を動物に投与し、上記ポリペプチドをその動物中
で発現させる段階をさらに含む請求項5の方法。 - 【請求項７】 請求項1〜4のいずれか一項の核酸を含んでなるベクター。
- 【請求項８】 発現ベクターである請求項7のベクター。
- 【請求項９】 請求項8のベクターを使用する方法であって、上記の核酸に
よってコード化されるポリペプチドを上記の核酸から発現させる段階を含む方法
。 - 【請求項１０】 請求項1〜4のいずれか一項の核酸で形質転換された細胞。
- 【請求項１１】 哺乳類細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および細菌細
胞からなる群より選択される請求項10の細胞。 - 【請求項１２】 上記の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求
項11の方法。 - 【請求項１３】 上記の細胞が哺乳類中枢神経系に由来する細胞である請求
項11の方法。 - 【請求項１４】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
アミノ酸配列のいずれか1つを含んでなるニューブラスチン神経栄養因子ポリペ
プチド。 - 【請求項１５】 グリコシル化されている請求項14のポリペプチド。
- 【請求項１６】 請求項1〜4のいずれか一つの核酸によってコードされる請
求項14のポリペプチド。 - 【請求項１７】 請求項14〜16のいずれか一項のポリペプチドを製造する方
法であって、上記ポリペプチドをニューブラスチン神経栄養因子核酸から発現さ
せる段階を含む方法。 - 【請求項１８】 上記ニューブラスチン神経栄養因子核酸を含む細胞を上記
ポリペプチドの産生が可能な培養培地で培養する段階を含む請求項17の方法。 - 【請求項１９】 上記ポリペプチドを上記培養培地から回収する段階をさら
に含む請求項18の方法。 - 【請求項２０】 請求項19の方法によって得られる精製ポリペプチド。
- 【請求項２１】 請求項14〜16および20のいずれか一項のポリペプチドおよ
び医薬的に許容しうる担体を含んでなる組成物。 - 【請求項２２】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
配列のいずれか一つに少なくとも90％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチド
。 - 【請求項２３】 請求項14〜16および20のいずれか一項のポリペプチドを投
与する方法であって、上記ポリペプチドをインビトロ細胞培養に、またはインビ
ボで哺乳動物に送達する段階を含む方法。 - 【請求項２４】 上記の投与が全身投与を含んでなる請求項23の方法。
- 【請求項２５】 上記の哺乳動物が、脳虚血性ニューロン損傷、外傷性脳損
傷、末梢神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎
縮性側索硬化症および記憶障害からなる群より選択される状態を患っている請求
項23の方法。 - 【請求項２６】 上記の哺乳動物が末梢神経系、延髄または脊髄のニューロ
ン障害を患っている請求項23の方法。 - 【請求項２７】 動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法で
あって、その動物に配列番号1、3、8、13、14、15、29および30に記載のニュー
ブラスチン核酸の1つまたは複数を投与することを含む方法。 - 【請求項２８】 動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法で
あって、その動物に配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載のニ
ューブラスチンポリペプチドの1つまたは複数を投与することを含む方法。 - 【請求項２９】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
ポリペプチドのいずれか一つに結合する抗体。 - 【請求項３０】 モノクローナル抗体である請求項29の抗体。
- 【請求項３１】 ある動物の神経変性疾患または神経変性障害がニューブラ
スチン神経栄養因子ポリペプチドの活性の変化に関係するかどうかを決定する方
法であって、 (a)上記の動物から採取した生物学的試料を請求項29または30の抗体と接触さ
せ、 (b)上記の神経異常が上記ニューブラスチン神経栄養因子ポリペプチドの活性
のレベルの変化に起因するかどうかの指標として、上記抗体と上記タンパク質の
間に免疫複合体が生成するかどうかを決定する 段階を含む方法。 - 【請求項３２】 上記試料中に生成する上記免疫複合体のレベルを、上記の
神経異常を持たない患者から採取した対応する生物学的試料中に生成する上記免
疫複合体のレベルと比較し、上記の比較から、上記の疾患または障害がニューブ
ラスチン神経栄養因子ポリペプチドの上記の異常に起因するかどうかを決定する
段階をさらに含む請求項31の方法。 - 【請求項３３】 配列番号17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、31および32に記載の配列のいずれか一つを含んでなる核酸。 - 【請求項３４】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
ポリペプチドのいずれか一つを製造する方法であって、配列番号1、3、8、13、1
4、15、29および30に記載の核酸配列のいずれか一つを含む細胞を、上記ポリペ
プチドの産生が可能な条件で培養し、その培養培地から上記ポリペプチドを回収
することを含む方法。 - 【請求項３５】 （a）ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードす
るポリヌクレオチドを細胞に導入するか、または調節配列をその調節配列が内因
性ニューブラスチン遺伝子の発現を調節するように相同組換えによって細胞に導
入して、ニューブラスチン産生細胞を作成し、 (b）そのニューブラスチン産生細胞をニューブラスチンポリペプチドの発現を
もたらす培養条件で培養すること、 を含むニューブラスチンポリペプチドの製造方法。 - 【請求項３６】 （a）保存されたCys残基、 (b）配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の配列のいずれか
一つに対して少なくとも70％の相同性、 を含み、神経栄養活性を示す、ニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項３７】 配列番号2のAA72〜AA105に記載のC末端アミノ酸配列を有
する請求項36のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項３８】 配列番号2のAA41〜AA105に記載のC末端アミノ酸配列を有
する請求項36のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項３９】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
配列のいずれか一つに対する上記の相同性が85％より高い請求項36、37または38
のいずれか一項のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項４０】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16に記載の
配列のいずれか一つに対する上記の相同性が95％より高い請求項36、37または38
のいずれか一項のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項４１】 配列番号2、4、5、6、7、9、10、11、12および16のいずれ
か一つのニューブラスチンポリペプチドおよび保存的アミノ酸置換を持つその変
異体。 - 【請求項４２】 上記の保存的アミノ酸置換が当該ポリペプチド中の残基の
総数の10％未満に相当する請求項41のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項４３】 上記の保存的アミノ酸置換が当該ポリペプチドの2％未満
に相当する請求項41のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項４４】 上記の保存的アミノ酸置換が成熟配列中の一アミノ酸置換
に相当し、置換されるアミノ酸と代替アミノ酸がどちらも非環状アミノ酸である
請求項41のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項４５】 配列番号17〜28および31〜32のいずれか一つに記載の単離
された核酸配列。 - 【請求項４６】 配列番号1のヌクレオチド721〜865、配列番号3のヌクレオ
チド718〜861、配列番号8のヌクレオチド718〜861および配列番号15のヌクレオ
チド1647〜2136を含んでなる単離された核酸配列。 - 【請求項４７】 請求項46の配列のいずれか一つに含まれるか、または配列
番号46の配列のいずれか一つから生成される、10〜25個の連続する塩基対からな
る単離された核酸配列。 - 【請求項４８】 配列番号1のヌクレオチド1〜10、配列番号8のヌクレオチ
ド1〜57、配列番号15のヌクレオチド1〜974を含んでなる単離された核酸配列。 - 【請求項４９】 請求項48の配列のいずれか一つに含まれるか、または配列
番号48の配列のいずれか一つから生成される、10〜25個の連続する塩基対からな
る単離された核酸配列。 - 【請求項５０】 請求項45〜49、43、44または45のいずれか一項の核酸をプ
ライマーまたはプローブとして使用することを含む、ニューブラスチン核酸配列
の同定、単離または増幅方法。 - 【請求項５１】 請求項50の方法によって単離されるニューブラスチン核酸
。 - 【請求項５２】 配列番号13または14に記載の配列を含んでなる単離された
核酸配列。 - 【請求項５３】 配列番号29または30に記載の合成遺伝子である、ニューブ
ラスチンポリペプチドをコード化する合成遺伝子。 - 【請求項５４】 以下 【外１】 のペプチドのいずれか一つを用いて作成される、ニューブラスチンペプチドまた
はニューブラスチンポリペプチドに対する抗体。 - 【請求項５５】 配列番号2の8、35、39、72、73、101および103位、または
配列番号4および9の43、70、74、107、108、136および138位に保存されている7
つのシステイン残基を含んでなる請求項36のニューブラスチンポリペプチド。 - 【請求項５６】 1つまたは複数の容器に、ニューブラスチンポリペプチド
、ニューブラスチンポリペプチドに対する抗体、ニューブラスチンのRNAにハイ
ブリダイズできる核酸プローブ、またはニューブラスチン遺伝子の少なくとも一
部の増幅をプライミングできる核酸プライマー対からなる群より選択される物質
を含んでなるキット。 - 【請求項５７】 被験対象におけるニューブラスチンポリペプチドレベルの
異常を特徴とする疾患または障害の存在もしくはそれらの疾患または障害を発生
させる素因の診断またはスクリーニング方法であって、その被験対象から得た試
料中の上記ニューブラスチンポリペプチド、そのニューブラスチンポリペプチド
をコード化するRNA、またはそのニューブラスチンポリペプチドの機能的活性の
レベルを測定することからなり、上記の疾患または障害もしくは上記の疾患また
は障害を発生させる素因を持たない類似試料中に見出される上記ニューブラスチ
ンポリペプチド、ニューブラスチンRNAまたはニューブラスチンの機能的活性の
レベルと比較した場合の上記試料中の上記ニューブラスチンポリペプチド、ニュ
ーブラスチンRNAまたはニューブラスチンポリペプチドの機能的活性のレベルの
増加または減少が、上記の疾患または障害の存在もしくは上記の疾患または障害
を発生させる素因を示す方法。 - 【請求項５８】 精製ニューブラスチンポリペプチド、その誘導体または断
片、もしくは前記の物質の活性の調節物質を、ある疾患の処置または予防におけ
る活性についてスクリーニングする方法であって、ニューブラスチンポリペプチ
ド、誘導体、断片または調節物質と接触させるかそれらを投与した、上記疾患に
由来するまたは上記疾患に関係する特徴を示す細胞系の細胞または試験動物の、
表現型、遺伝子型、挙動、生存または増殖の変化を測定し、上記のようにニュー
ブラスチンポリペプチド、誘導体、断片または調節物質と接触させたりそれらを
投与したりしていない細胞または動物における表現型、遺伝子型、挙動、生存ま
たは増殖と比較することを含む方法。 - 【請求項５９】 哺乳動物の末梢神経障害からなる群より選択される神経障
害を処置する方法であって、治療有効量のニューブラスチンポリペプチドを投与
することを含み、その末梢神経障害が、外傷誘発性神経障害、化学療法誘発性神
経障害、毒素誘発性神経障害、薬物誘発性神経障害、ビタミン不足誘発性神経障
害、特発性神経障害および糖尿病性神経障害からなる群より選択される方法。 - 【請求項６０】 上記ニューブラスチンが中枢神経系に直接送達される請求
項23の方法。 - 【請求項６１】 上記ニューブラスチンが皮下注射、静脈内投与または静脈
内注入によって全身的に送達される請求項23の方法。 - 【請求項６２】 新規核酸配列を同定、単離または検出するために、コンピ
ュータープログラムで請求項1〜4または45〜49のいずれか一項の1つまたは複数
の核酸の配列を使用する方法。 - 【請求項６３】 新規核酸配列を同定、単離または検出するために、固定基
質またはDNAチップ上で請求項1〜4、33または45〜49のいずれか一項の1つまたは
複数の核酸の配列を使用する方法。 - 【請求項６４】 新規核酸配列を同定、単離または検出するために、コンピ
ュータープログラムで請求項14〜16、20、22または36〜44のいずれか一項の1つ
または複数のポリペプチドの配列を使用する方法。 - 【請求項６５】 ニューロブラスチン（neuroblastin）媒介性の生物学的効
果を誘導する候補化合物を同定する方法であって、 （a）ニューブラスチンと接触させると検出可能な産物を発現させる試験細胞
を用意し、 （b）その細胞を候補化合物にばく露して、上記の検出可能な産物を検出する
、 という段階を含み、上記の検出可能な産物の発現が、ニューロブラスチン媒介性
の生物学的効果を誘導する当該候補化合物の能力を示す方法。
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