JP2006122053A - 神経栄養因子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)特定の配列からなるヌクレオチド配列;(b)特定の配列からなるAA1−AA105に対して少なくとも90%の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列;(c)特定の配列からなるヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド;および、(d)特定の配列として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相同性である核酸、より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸からなる。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号(SEQ ID NO:):1 のヌクレオチド配列;
(b)配列番号:2のAA1−AA105に対して少なくとも90%の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列;
(c)配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド;
(d)配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相同性である核酸
より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸。
コード化されたポリペプチドが、配列番号:2、及び配列番号:5,6及び7のAA1−AA105より成る群から選ばれる、項目1記載の核酸。
配列番号:3の配列を含む、項目1記載の核酸。
配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の相同性である,項目1記載の核酸。
配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の相同性である,項目1記載の核酸。
項目1〜5のいずれか1つに記載の核酸を含む発現ベクター。
当該核酸によってコード化されるポリペプチドを、インビトロで当該核酸から発現させる段階を含む、項目6記載のベクターを使用する方法。
項目1〜5のいずれか1つに記載の核酸及び(又は)項目6記載の発現ベクターを用いてインビトロで形質転換させた細胞。
該細胞が真核細胞である、項目8記載の細胞。
該細胞が哺乳類細胞、真菌細胞及び酵母細胞より成る群から選ばれる、項目9記載の細胞。
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b及びヒト神経幹細胞より成る群から選ばれる、項目10記載の細胞。
配列番号:2のアミノ酸1〜105に対して少なくとも90%相同するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
配列番号:2,4,5,6及び7において上記アミノ酸配列のいずれか1つを含むニューブラスチン神経栄養因子ポリペプチド。
当該ポリペプチドがグリコシル化されている、項目12又は13記載のポリペプチド。
当該ポリペプチドが項目1〜5のいずれか1つに記載の核酸によってコードされる、項目12記載のポリペプチド。
項目12〜15のいずれか1つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、当該方法が上記ポリペプチドをニューブラスチン神経栄養因子核酸から発現させる工程を含む、上記方法。
上記ニューブラスチン神経栄養因子核酸を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な培養培地で培養する工程を含む、項目16記載の方法。
当該ポリペプチドを、上記培養培地から回収する工程をさらに含む、項目17記載の方法。
項目18記載の方法によって得られる精製されたポリペプチド。
項目12〜15又は19のいずれか1つに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む調合物。
項目12〜15又は19のいずれか1つに記載のポリペプチドを医薬の製造に使用する方法。
損傷性及び外傷性ニューロンに係わる神経変性疾患、たとえば末梢神経系、延髄及び(又は)脊髄の外傷性障害、脳虚血ニューロン損傷、神経障害及び特に末梢神経障、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又はその他のあらゆる神経変性障害、及び痴呆に関連する記憶障害の治療ために、項目21記載の使用する方法。
配列番号:17、18、19、20、23、24、25、26または28に記載の配列のいずれか1つを含む、PCRプライマー核酸配列。
配列番号:2、4、5、6又は7に記載のポリペプチドのいずれか1つを製造する方法であって、配列番号:1又は3に記載の核酸配列のいずれか1つを含む細胞を、上記ポリペプチドの産生が可能な条件で培養し、その培養培地から上記ポリペプチドを回収することを含む、上記方法。
(a)ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、または調節配列をその調節配列が内因性ニューブラスチン遺伝子の発現を調節するように相同組換えによって細胞に導入して、ニューブラスチン産生細胞を作成し、(b)そのニューブラスチン産生細胞をニューブラスチンポリペプチドの発現をもたらす培養条件で培養すること、
を含む、項目12〜15のいずれか1つに記載のニューブラスチンポリペプチドを製造する方法。
配列番号:29または30に記載の配列を含む、ニューブラスチンポリペプチドをコード化する合成遺伝子。
次の配列:
項目27のペプチドのいずれかに対して産生される抗体。
配列番号:2、4、5、6、7、9、10、11、12及び16に記載の配列のいずれか1つに対して少なくとも70%の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチン神経栄養因子を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
配列番号:2、4、5、6、7、9、10、11、12及び16に記載の配列のいずれか1つに対して少なくとも70%の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
本発明は、本明細書で「ニューブラスチン(neublastin)」または「NBN」と呼ぶ、新規神経栄養因子に関する。ニューブラスチンは他のGDNFリガンドと相同(=同一)な領域を有し(下記表3および表4参照)、RETと相互作用する能力を持つ(例えばAiraksinenら,Mol.Cell.Neuroscience,1999,13,313−325)ので、ニューブラスチンはGDNFサブファミリーに分類され、ニューブラスチンは新規かつユニークな神経栄養因子である。他のGDNFリガンドとは異なり、ニューブラスチンはGFRα3−RET受容体複合体に対する高い親和性を示し、またそのアミノ酸配列中にユニークな亜領域を示す。
出願人は、ここに「ニューブラスチン(neublastin)」または「NBN」と呼ぶ新規神経栄養因子をコード化する核酸を同定した。ニューブラスチンは、神経栄養因子のトランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)スーパーファミリーのグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)サブクラスのメンバーである。
(i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれる140アミノ酸ポリペプチド;
(ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれる116アミノ酸ポリペプチド;
(iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれる113アミノ酸ポリペプチド。
もう一つの側面として、本発明は、本発明のポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、DNA、cDNAおよびRNA配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然のポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果、縮重しているが、ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードする配列も包含される。
配列番号1のヌクレオチド721−865、
配列番号3のヌクレオチド718−861、
配列番号8のヌクレオチド718−861、
配列番号15のヌクレオチド1647−2136、
に記載の配列、および上記の配列に由来する(すなわち上記の配列に含まれる)10〜25ヌクレオチドの連続する配列(例えばプライマーとして有用なもの)、
が包含される。
配列番号1のヌクレオチド1−10、
配列番号8のヌクレオチド1−57、
配列番号15の1−974、
に記載の配列、および上記の配列に由来する(すなわち上記の配列に含まれる)10〜25ヌクレオチドの連続する配列(例えばプライマーとして有用なもの)、
が包含される。
上で言及したDNA配列相同性は、第1配列の第2配列からの派生を示す2つの配列間の同一度として決定することができる。相同性は、例えばGCGプログラムパッケージに含まれるGAPなどの当技術分野で知られるコンピュータープログラムを使って、適切に決定できる[Needleman,S.B.およびWunsch,C.D.,Journal of Molecular Biology 1970,48,443−453]。GAP挿入ペナルティー(GAP creation penalty)5.0およびGAP伸長ペナルティー(GAP extension penalty)0.3というDNA配列比較用の設定でGAPを使用することにより、上で言及した類似DNA配列のコード領域は、配列番号1に示すDNA配列のCDS(コード化)部分または配列番号3に示すDNA配列のCDS(コード化)部分または配列番号8に示すDNA配列のCDS(コード化)部分、配列番号15に示すDNA配列のCDS(コード化)部分と、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一度を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、以下に詳述するように、少なくとも中、中/高または高ストリンジェンシー条件で、配列番号1として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号3として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号8として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号15として記載するポリヌクレチド配列、もしくはそれらの相補鎖またはそれらの部分配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を持つものである。
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、具体的には、クローン化ポリヌクレオチドであってもよい。ここに定義される用語「クローン化ポリヌクレオチド」は、DNA(具体的にはcDNA、すなわちRNAから酵素的に誘導されたDNAであってもよい)のセグメントを本来の位置から異なる部位に移動させてその部位で複製させるために、遺伝子工学において現在使用されている標準的クローニング法に従ってクローン化された、ポリヌクレオチドまたはDNA配列を指す。
本発明の単離されたポリヌクレオチドは任意の適当な供給源から得ることができる。
上記のように、本明細書で使用されるとき「ニューブラスチンポリペプチド」は、(例えば実施例6、7、8および9に記載するように)神経栄養活性を有するポリペプチドであり、配列番号2のAA−95〜AA105、配列番号2のAA1〜AA105、配列番号4のAA−97〜AA140、配列番号4のAA−41〜AA140、配列番号4のAA1〜AA140、配列番号9のAA−80〜AA140(「野生型」プレプロ)、配列番号9のAA−41〜AA140(プロ)、配列番号5のAA1〜AA140(成熟140AA)、配列番号6のAA1〜AA116(成熟116AA)、配列番号7のAA1〜AA113(成熟113AA)、配列番号10のAA1〜AA140(成熟140AA)、配列番号11のAA1〜AA116(成熟116AA)、配列番号12のAA1〜AA113(成熟113AA)、配列番号16のAA1〜AA224(ネズミプレプロ)に記載の「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドおよび前記各ポリペプチドの変異体ならびに誘導体を包含する。
候補ポリペプチドが本発明のニューブラスチンポリペプチドと相同性を共有する程度は、2つのアミノ酸配列間の同一度として決定される。高レベルの配列同一性は、第1配列が第2配列に由来する可能性を示す。
本発明のポリペプチドは、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質の形、または他の翻訳後修飾を受けた任意のタンパク質の形を含めて、任意の生物活性形で提供できる。
本発明のポリペプチドは哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞またはネズミ由来の細胞から単離できる。
本発明のニューブラスチンポリペプチドは神経細胞またはニューロン細胞の代謝、成長、分化または生存を調節するのに有用である。具体的に述べると、ニューブラスチンポリペプチドは、生きている動物(例えばヒト)の障害または疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用される。そのような処置と方法は、下に詳述する。
本発明のニューブラスチンポリペプチドまたはニューブラスチンポリペプチド断片は、ニューブラスチン特異抗体を作成するために使用される。本明細書で使用されるとき「ニューブラスチン特異抗体」とは、ニューブラスチンポリペプチドまたはニューブラスチンポリペプチド断片に対して免疫反応性の抗体またはニューブラスチンポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体(例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体)である。
in Immunology,1992の2.5.1〜2.6.7節、およびHarlowら,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,Pub.,1988)の726頁に記載されているように取得することができ、これらのプロトコールは参照によりここに援用される。
下に詳述するように、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化するDNA配列を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な条件で培養した後、その培養培地から当該ポリペプチドの回収を行なう。ニューブラスチンポリペプチドを生産する目的で細胞を遺伝子改変する必要がある場合は、細胞を従来の方法で、または遺伝子活性化法によって、改変することができる。
さらなる側面として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは任意の適当な真核細胞用発現ベクターであってよい。好ましい組換え発現ベクターは、ユビキチンプロモーター含有ベクターpTEJ−8(Johansen TE,Schoeller MS,Tolstoy S,Schwartz T,FEBS Lett.1990,267,289−294)およびその誘導体、例えばpUbi1Zである。好ましい市販の真核細胞用発現ベクターには、例えばウイルスプロモーター含有ベクターpcDNA−3(Invitrogenから入手できる)がある。もう一つの好ましい発現ベクターはSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター(プラスミドpAD2betaに由来、NortonおよびCoffin,Mol.Cell.Biol.1985,5,281)を使用するものである。
さらにもう一つの側面として、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および/または本発明の組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作された産生細胞を提供する。本発明の細胞は、具体的には、本発明のポリペプチドを一過性または安定に発現、過剰発現もしくは同時発現するように遺伝子操作することができる。一過性または安定発現を引き起こす方法は当技術分野では知られている。
好適な発現ベクターは通例、発現起点(origin of expression)、プロモーターおよび形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含み、例えば細菌における発現のためのT7系発現ベクター[Rosenbergら,Gene 1987,56,125]、哺乳類細胞における発現のためのpTEJ−8、pUbi1Z、pcDNA−3およびpMSXND発現ベクター[LeeおよびNathans,J.Biol.Chem.1988,263,3521]、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、および卵母細胞発現ベクターPTLN[Lorenz C,Pusch MおよびJentsch TJ著「Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties(新規な特性をもつヘテロ多量体型CLC塩素イオンチャネル)」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,93,13362−13366]などが挙げられる。
もう一つの側面として本発明は、治療有効量の本発明ポリペプチドを含んでなる新規医薬組成物を提供する。
(a)ポンプ(例えばAnnals of Pharmacotherapy,27:912(1993);Cancer,41:1270(1993);Cancer Research,44:1698(1984)(参考文献としてここに援用する)を参照されたい)、
(b)マイクロカプセル化(例えば米国特許第4,352,883号、第4,353,888号および第5,084,350号(参考文献としてここに援用する)を参照されたい)、
(c)持続放出ポリマー植込み剤(例えばSabel,米国特許第4,883,66号(参考文献としてここに援用する)を参照されたい)、
(d)マクロカプセル化(例えば米国特許第5,284,761号、第5,158,881号、第4,976,859号および第4,968,733号ならびにPCT特許出願公開WO92/19195、WO95/05452(それぞれ参考文献としてここに援用する)を参照されたい)、
(e)CNSへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植物(例えば米国特許第5,082,670号および第5,618,531号(それぞれ参考文献としてここに援用する)、
(f)皮下、静脈内、動脈内、筋肉内への、または他の適当な部位への注射、および
(g)カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、または持続放出製剤としての経口投与
を含めて、任意の適当な送達手段を使って達成できる。
ポリヌクレオチドおよびタンパク質、そこから生産されるポリペプチド、ペプチド断片または誘導体、ならびにそれらタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、動物(ヒトを含む)の生体の障害または疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用できる。
ニューブラスチン核酸は、ある個体が、ニューブラスチン遺伝子の欠損(例えば遺伝によって、または異常な胚発生によって、または後天的なDNA損傷によって獲得されたニューブラスチン対立遺伝子の欠損など)に起因する神経障害を発生させる素因を持つかどうかを決定するために使用できる。その分析は、例えばニューブラスチン遺伝子内の欠失または点突然変異を検出することによって、またはそのような遺伝子欠損の素因の遺伝を特異的制限断片長多型で検出することによって、または患者から採取した核酸試料をニューブラスチン遺伝子に特異的な核酸プローブとハイブリダイズさせて当該核酸にハイブリダイズするそのプローブの能力を確認することにより正常なニューブラスチン遺伝子の有無を検出することによって、行なうことができる。
方法1:ニューブラスチン遺伝子に関するヒト胎児脳cDNAの迅速スクリーニング
GenBankに提出された2つのHGTS(high throughput genomic sequence)(受諾番号AC005038およびAC005051)に、ヒトパーセフィンとの相同性によって、290bpの断片が同定された。その290bp断片の核酸配列から、2つのニューブラスチン特異的プライマーを合成した。ニューブラスチントップ鎖プライマー(「NBNint.sence」)の配列は5’−CCT GGC CAG CCT ACT GGG−3’[配列番号17]とした。ニューブラスチンボトム鎖プライマー(「NBNint.antisence」)の配列は、5’−AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG−3’[配列番号18]とした。これらのプライマーを使って、96ウェルのPCR反応を行なった。
完全長ニューブラスチンcDNAまたはcDNA断片を増幅するもう一つの方法は、ベクター特異的またはアダプター特異的プライマーと組み合わせた上記ニューブラスチン特異的プライマーNBNint.senceおよびNBNint.antisenceならびにRACE(Rapid Amplification of cDNA ends)法により、例えばMarathon cDNA増幅キット(米国Clontech Laboratories,カタログ番号K1802−1)を使って行なうことができる。
ニューブラスチンcDNAをクローニングするもう一つの方法は、ここに記載する1つまたは複数のニューブラスチンプローブを使って(図1に例示するように)成人または胎児脳ライブラリーをスクリーニングすることである。これらのライブラリーには、λgt11ヒト脳(米国Clontech Laboratories,カタログ番号HL3002b)またはλgt11ヒト胎児脳(米国Clontech Laboratories,カタログ番号HL3002b)が含まれる。
ニューブラスチン遺伝子の迅速スクリーニングを次の方法で行なった。500,000個のcDNAクローンから得たプラスミドDNAを含む96ウェルマスタープレートには、1ウェルあたり約5000クローンが負荷された。96ウェルサブプレートは、1ウェルあたり50クローンの大腸菌グリセロール保存液を含むものを使用した。問題の遺伝子(すなわちニューブラスチン)を同定するために、PCRによる3ラウンドの増幅を行なった。
(1)ニューブラスチンC2プライマー(NBNint.sence):5’−GGCCACCGCTCCGACGAG−3’[配列番号21]および(2)ニューブラスチンC2asプライマー(NBNint.antisence):5’−GGCGGTCCACGGTTCTCCAG−3’[配列番号22]。これら2つの遺伝子特異的プライマーを使用することにより、220bpの陽性PCR産物が同定された。この220bp核酸は次の配列[配列番号14]を持っていた。
上述のように本出願人らは、GenBankに登録された2つのヒトBACクローン(受諾番号AC005038およびAC005051)に、ペーセフィンおよびパーセフィンの隣接配列に相同な領域を有する290bpの核酸断片を同定した。出願人らは、Lasergene Software(DNAStar,Inc.)を使って、さらなるニューブラスチン核酸をコード化する核酸をクローニングする目的で、上記861bpの予想配列を使って追加のプライマーを設計した。ゲノムDNAでのPCR反応を用いてニューブラスチン遺伝子をクローニグするために、2対のプライマーを使用した。それら2対のプライマーを、次に示す。
ニューブラスチンRNAの発現は、げっ歯類およびヒトの神経組織と非神経組織の両方に、様々な未成熟および成熟発育段階で、下記の技術を用いて検出された。
以下の技術は動物組織(例えばげっ歯類組織)におけるニューブラスチンRNAの発現をニューブラスチンアンチセンスプローブによって測定するために使用される。
組織試料の調製:同期妊娠(time−pregnant)マウス(B&K Universal,スウェーデン・ストックホルム)を、妊娠13.5日または18.5日に頸椎脱臼によって屠殺した。滅菌条件下での切開によって胚を摘出し、直ちに4%パラホルムアルデヒド(「PFA」)を含む0.1Mリン酸緩衝液(PB)の溶液に24〜30時間浸漬した後、PFAから取り出してPBS中に保存した。その組織を30%ショ糖の溶液に浸漬し、次にTissueTech(OCT化合物、Sakura Finetek USA,カリフォルニア州トランス)に包埋した。6系列の冠状または矢状切片(各12μm)をクリオスタットで切断し、正に荷電したガラススライド上に解凍してのせた。新生仔頭部/脳(P1、P7)を胚段階と同じプロトコールで固定し、成体脳組織は解剖して直ちにドライアイスで凍結し、前もって包埋を行なわずにクリオスタットで切断した。
以下の実験では、アルカリホスファターゼ標識オリゴデオキシヌクレチドニューブラスチンアンチセンスプローブによるラット組織のハイブリダイゼーションを説明する。
配列番号8に同定されるオープンリーディングフレームまたはコード領域(CDS)は、プレプロポリペプチド(「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ)をコード化する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列番号9に示す。配列番号9に基づき、ニューブラスチンポリペプチドの3つの変異体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含まれる:
(i)配列番号10のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN140と呼ばれるポリペプチド、
(ii)配列番号11のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN116と呼ばれるポリペプチド、
(iii)配列番号12のアミノ酸配列を有し、本明細書でNBN113と呼ばれるポリペプチド。
(i)配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ii)配列番号6のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(iii)配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(表3)
(ニューブラスチンとパーセフィン、ニュールツリンおよびGDNFとのアミノ酸配列比較)
: 次の「強(strong)」グループの一つが完全に保存されていることを示す:STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
. 次の「弱(weaker)」グループの一つが完全に保存されていることを示す:CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。
(GDNFファミリーの他のメンバーに対するニューブラスチンポリペプチドの相同性)
NTN=ニュールツリン
PSP=パーセフィン
IHA=インヒビン−α
TGF−β2=トランスフォーミング成長因子β2
「強い相同性」は、次の「強(strong)」グループの一つが保存されていることを示す:STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
本発明者らは、真核細胞と原核細胞の両方で、下記のようにニューブラスチンを生産した。
プラスミドpJC070.14の構築
チャイニーズハムスター卵巣細胞中でニューブラスチンcDNAを発現させるために、プレプロ型のヒトニューブラスチンをコード化するcDNA断片を、哺乳類発現ベクターpEAG347に挿入して、プラスミドpJC070.14を作成した。pEAG347は、タンデムなSV40初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター(プラスミドpAD2beta由来:NortonおよびCoffin,Mol.Cell.Biol.1985,5,281)、ユニークなNotIクローニング部位を含み、その後ろにSV40後期転写ターミネーターおよびポリAシグナル(プラスミドpCMVbeta由来:MacGregorおよびCaskey,Nucl.Acids.Res 1989,17,2365)が続いている。その他にpEAG347は、pUC19由来のプラスミド骨格と、トランスフェクトされたCHO細胞でのMTX選択および増殖用のpSV2dhf由来のdhfrを含む。
CHO細胞系によって産生されるニューブラスチンをさらに分析するために、このタンパク質をGFRα3−Ig融合タンパク質を使って培地から抽出し、ニューブラスチンペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体を使ったウェスタンブロットで分析した。
大腸菌中でニューブラスチン遺伝子を発現させるために、GC含量が低く好ましい大腸菌コドンを持つシンジーン(syngene;合成遺伝子)を構築した。このシンジーンは2つのベクターpET19bと、pET19bの誘導体であるpMJB164にクローニングされている。pET19bを使った構築を図14に示す。この構築体では、ニューブラスチンの成熟ドメイン(NBN113)をコードする配列が開始メチオニンに直接融合している。pMJB164を使った構築を図15に示す。この構築体では、ニューブラスチンの成熟ドメインが、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたヒスチジンタグ(すなわち10個のヒスチジン)に融合している。開始メチオニンはそのヒスチジンタグの前にある。
図14でニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
この一連の実験では、上記のニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞から得られる調整培地の効果を評価した。
この実験では、ニューブラスチン産生HiB5pUbi1zNBN22細胞とブタ胚由来の中脳腹側の切片培養物との共培養の効果を評価した。
この実施例では、既知の神経栄養因子類と比較したニューブラスチンポリペプチドの神経栄養活性を示す。
0は対照実験(因子類不在下)を表し、
1はGDNF存在下での実験を表し、
2はニュールツリン存在下での実験を表し、
3は本発明のニューブラスチン存在下での実験を表し、
E12は胎生12日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
E16は胎生16日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
P0は出生日に単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
P7は生後7日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
P15は生後15日で単離したDRG細胞に対して行なった実験から得られたデータを表す。
成熟した黒質ドーパミン(DA)ニューロンを6−ヒドロキシドーパミン誘導性の変性から保護するニューブラスチン(ニューブラスチン)の能力を調べるために、本発明者らは、パーキンソン病のラットモデル(SauerおよびOertel,Neuroscience 1994,54,401−415)と、ニューブラスチンのレンチウイルス遺伝子導入を使用した。
ニューブラスチンに対する抗体を作成するために、2匹のウサギを、担体タンパク質に結合したペプチド1:CRPTRYEAVSFMDVNST(配列番号9のアミノ酸108〜124)またはペプチド2:ALRPPPGSRPVSQPC(配列番号9のアミノ酸93〜107)で、3週間間隔で免疫化した。各ペプチドにつき2匹のウサギを第0週、3週、6週および10週に免疫化し、第7週および11週に血液を採取した。2回目の採血液をペプチドアフィニティーカラムでアフィニティー精製した。それらの抗体をペプチドに準じてAb−1およびAb−2と名付けた。
Claims (30)
- (a)配列番号(SEQ ID NO:):1のヌクレオチド配列;
(b)配列番号:2のAA1−AA105に対して少なくとも90%の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列;
(c)配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド;
(d)配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の相同性である核酸
より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸。 - コード化されたポリペプチドが、配列番号:2のAA1−AA105、及び配列番号:5,6及び7のAA1−AA105より成る群から選ばれる、請求項1記載の核酸。
- 配列番号:3の配列を含む、請求項1記載の核酸。
- 配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の相同性である,請求項1記載の核酸。
- 配列番号:1として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の相同性である,請求項1記載の核酸。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載の核酸を含む発現ベクター。
- 当該核酸によってコード化されるポリペプチドを、インビトロで当該核酸から発現させる段階を含む、請求項6記載のベクターを使用する方法。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載の核酸及び(又は)請求項6記載の発現ベクターを用いてインビトロで形質転換させた細胞。
- 該細胞が真核細胞である、請求項8記載の細胞。
- 該細胞が哺乳類細胞、真菌細胞及び酵母細胞より成る群から選ばれる、請求項9記載の細胞。
- 哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b及びヒト神経幹細胞より成る群から選ばれる、請求項10記載の細胞。
- 配列番号:2のアミノ酸1〜105に対して少なくとも90%相同するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 配列番号:2,4,5,6及び7に記載のアミノ酸配列のいずれか1つを含むニューブラスチン神経栄養因子ポリペプチド。
- 当該ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項12又は13記載のポリペプチド。
- 当該ポリペプチドが請求項1〜5のいずれか1つに記載の核酸によってコードされる、請求項12記載のポリペプチド。
- 請求項12〜15のいずれか1つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、当該方法が上記ポリペプチドをニューブラスチン神経栄養因子核酸から発現させる工程を含む、上記方法。
- 上記ニューブラスチン神経栄養因子核酸を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な培養培地で培養する工程を含む、請求項16記載の方法。
- 当該ポリペプチドを、上記培養培地から回収する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 請求項18記載の方法によって得られる精製されたポリペプチド。
- 請求項12〜15又は19のいずれか1つに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む調合物。
- 請求項12〜15又は19のいずれか1つに記載のポリペプチドを医薬の製造に使用する方法。
- 損傷性及び外傷性ニューロンに係わる神経変性疾患、たとえば末梢神経系、延髄及び(又は)脊髄の外傷性障害、脳虚血ニューロン損傷、神経障害及び特に末梢神経障、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又はその他のあらゆる神経変性障害、及び痴呆に関連する記憶障害の治療ために、請求項21記載の使用する方法。
- 配列番号:17、18、19、20、23、24、25、26または28に記載の配列のいずれか1つを含む、PCRプライマー核酸配列。
- 配列番号 2、4、5、6又は7に記載のポリペプチドのいずれか1つを製造する方法であって、配列番号:1又は3に記載の核酸配列のいずれか1つを含む細胞を、上記ポリペプチドの産生が可能な条件で培養し、その培養培地から上記ポリペプチドを回収することを含む、上記方法。
- (a)ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、または調節配列をその調節配列が内因性ニューブラスチン遺伝子の発現を調節するように相同組換えによって細胞に導入して、ニューブラスチン産生細胞を作成し、
(b)そのニューブラスチン産生細胞をニューブラスチンポリペプチドの発現をもたらす培養条件で培養すること、
を含む、請求項12〜15のいずれか1つに記載のニューブラスチンポリペプチドを製造する方法。 - 配列番号:29または30に記載の配列を含む、ニューブラスチンポリペプチドをコード化する合成遺伝子。
- 請求項27のペプチドのいずれかに対して産生される抗体。
- 配列番号:2、4、5、6、7、9、10、11、12及び16に記載の配列のいずれか1つに対して少なくとも70%の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチン神経栄養因子を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
- 配列番号:2、4、5、6、7、9、10、11、12及び16に記載の配列のいずれか1つに対して少なくとも70%の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
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