KR100743376B1 - 신경영양성 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뉴블라스틴 신경영양성 인자 폴리펩타이드, 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화한 핵산, 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

신경영양성 인자, 뉴블라스틴 폴리펩타이드

Description

신경영양성 인자{Neurotrophic factors}

본 발명은 신경영양성 인자 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 및 신경영양성 인자에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

신경영양성 인자는 생존력을 촉진시키고, 표현형 분화를 유지하며, 퇴행을 억제하고, 신경 세포 및 조직의 활성을 강화시켜 주는 천연 단백질이다. 신경영양성 인자는 신경 조직 및 신경계에 의해 신경이 통하게된 비신경 조직으로부터 분리되고, 기능적으로 및 구조적으로 연관된 그룹(또한, 계열, 상위계열 또는 하위계열이라고도 한다)으로 분류되어 왔다. 신경영양성 인자 상위계열중에는 섬유아세포 성장인자, 뉴트로핀 및 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상위계열이 있다. 신경영양성 인자의 각 종류는 이들의 물리적 구조, 이들의 복합 수용체와의 상호작용 및 여러 가지 유형의 신경 세포에 미치는 이들의 영향에 의해 구분된다. GDNF, 퍼세핀[참조: "PSP"; Milbrandt et al., Neuron 1998 20 245-253, 본원에 참고로 인용] 및 뉴투린[참조: "NTN"; WO97/08196, 본원에 참고로 인용]을 포함하는 신경교세포주-유래된 신경영양성 인자 리간드[참조: "GDNF"; WO93/06116, 본원에 참고로 인용]는 TGF-β 상위계열[참조: Massague et al., Trends in Cell Biology, 1994 4 172-178]내로 분류된다. GDNF 하위계열의 리간드는 RET 수용체 티로신 키나제를 통한 신호전달을 유도하는 능력을 공통적으로 지니고 있다. GDNF 하위계열의 세 가지 리간드는 신경영양성 수용체의 계열인 GFR 수용체에 대한 친화성이 상대적으로 다르다.

신경 조직에 미치는 신경영양성 인자의 영향으로 인해 신경 계통의 질환을 진단하고 치료하기 위하여 추가의 신경영양성 인자를 동정하고 성상확인할 필요가 여전히 남아있다.

발명의 요약

본 발명은 본원에서 "뉴블라스틴" 또는 "NBN"으로 명칭되는 신규한 신경영양성 인자에 관한 것이다. 뉴블라스틴은 다른 GDNF 리간드(하기 표 3 및 4 참조)와 상동성의 영역을 공유하고 있기 때문에 GDNF 하위계열로 분류되고, RET[참조: Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 1999 13 313-325]와 상호작용하는 능력이 있기 때문에 신규하고 독특한 신경영양성 인자이다. 다른 GDNF 리간드와는 달리, 뉴블라스틴은 GFRα3-RET 수용체 복합체에 대해 고도의 친화성을 나타내며 이의 아미노산 서열에서 독특한 아영역을 지닌다.

본원에 사용된 "뉴블라스틴 폴리펩타이드"는 신경영양성 활성(예: 실시예 6, 7, 8 및 9에 기술됨)을 가진 폴리펩타이드이며 서열 2의 AA₉₅-AA₁₀₅, 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅, 서열 4의 AA₉₇-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₄₁-AA₁₄₀("pro"), 서열 4의 AA₁-AA₁₄₀, 서열 9의 AA₈₀-AA₁₄₀("야생형" prepro), 서열 9의 AA₄₁-AA₁₄₀(pro), 서열 5의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 6의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 7의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA), 서열 10의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 11의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 12의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA) 및 이들의 변형체 및 유도체로 기술된 사람 "뉴블라스틴" 폴리펩타이드와 70% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 함유한 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 본 발명은 서열 16의 AA₁-AA₂₂₄에 기술된 바와 같은 쥐 "뉴로블라스틴" 폴리펩타이드와 70% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 함유한 폴리펩타이드를 포함한다.

바람직하게는, 상기 동정된 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 C-말단 서열은 서열 2의 AA₇₂-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 AA₁₀₇-AA₁₄₀), 더욱 바람직하게는 서열 2의 AA₄₁-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 A₇₆-AA₁₄₀) 또는 서열 16의 AA₁₉₁-AA₂₂₄에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

또한, 바람직하게는 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 GDNF 계열 및 TGF-베타 상위계열의 특징인 7개 보존된 Cys 잔기를 보유한다.

바람직하게는, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 상기 서열(즉, 서열 2의 AA₉₅-AA₁₀₅, 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅, 서열 4의 AA₉₇-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₁-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₄₁-AA₁₄₀, 서열 9의 AA₈₀-AA₁₄₀("야생형" prepro), 서열 9의 AA ₄₁-AA₁₄₀(pro), 서열 5의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 6의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 7의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA), 서열 10의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 11의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 12의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA)) 및 서열 16의 AA₁-AA₂₂₄와 85% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.

본원에 사용된 "뉴블라스틴 핵산"은 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타드이다. 따라서, 분리된 뉴블라스틴 핵산은 이것이 해독에 필요한 적절한 구성요소에 노출되었을 때 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하고 있는 뉴클레오타이드 코돈의 개방 판독 프레임을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명의 뉴블라스틴 핵산은 RNA 또는 DNA(예: 게놈 DNA)일 수 있으며 또는 뉴블라스틴 mRNA에 상보적이고/이거나 뉴블라스틴 mRNA로부터 전사된 DNA("cDNA")일 수 있다. 따라서, 본 발명의 뉴블라스틴 핵산은 또한 고도의 엄격한 하이브리드화 조건하에서 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 동정, 분리 및 증폭시키는데 유용한 핵산 프라이머에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태에서, 특정한 이들 프라이머로는 뉴블라스틴 핵산과 하이브리화하지만 GDNF 계열의 다른 일원을 암호화하는 핵산에는 하이브리드화하지 않는 유용한 뉴블라스틴-특이적 프로브가 있다. 용어 "특이적", "특이성" 또는 "특이적으로"는 뉴블라스틴 핵산과 하이브리드화할 수 있는 능력 및 GDNF 리간드(예, GDNF, 퍼세핀 및 뉴투린)를 유일하게 암호화한 핵산에 하이브리드화할 수 없는 능력을 포함하여 비-뉴블라스틴 핵산과 하이브리드화할 수 없는 능력을 의미한다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 뉴블라스틴 핵산은, 상보적인 핵산 서열을 가짐으로써 또는 이것이 고도의 엄격한 하이브리드화 조건하에서 뉴블라스틴을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화함을 증명함으로써, 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 것으로서 확인된 것이다. 특정 뉴블라스틴 핵산으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 본원에 제시되어 있고 서열 1, 서열 3, 서열 8, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 29 및 서열 30 뿐만 아니라 프라이머 서열 17 내지 28, 31 및 32로 표시된 핵산 서열이 포함된다. 본 발명의 뉴블라스틴 핵산은 또한 뉴블라스틴 핵산의 유일한 아영역 또는 단편, 예를 들어 이들로 한정되는 것은 아니지만 도 8에 나타낸 핵산 단편을 포함한 다.

본 발명의 뉴블라스틴 핵산은, 시험관내에서 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 또는 생체내 발현을 위해 뉴블라스틴 핵산을 동물에 투여함으로써 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 뉴블라스틴 핵산은 핵산 벡터(예, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터)내에 포함시킬 수 있다. 뉴블라스틴 핵산은 반드시 필요한 것은 아니지만 핵산 벡터의 일부로서 유지, 재생, 전달 또는 발현될 수 있다. 뉴블라스틴 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한 재조합 발현 벡터는 세포내로 도입되고/되거나 세포내에서 유지될 수 있다. 뉴블라스틴 벡터의 숙주 세포는 원핵세포일 수 있다. 다르게는, 뉴블라스틴 핵산은 진핵세포(예, 폴리펩타이드를 성숙 단백질로 해독후 처리하는데 적절한 도구 및/또는 폴리펩타이드를 세포외 환경으로 분비하는데 적절한 도구를 함유한 진핵세포)내로 도입할 수 있다.

본 발명은 또한 뉴블라스틴 신경영양성 인자, 즉 "뉴블라스틴"을 특징으로 한다. 뉴블라스틴은 폴리펩타이드의 형태일 수 있거나 둘 이상의 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 다량체(예, 뉴블라스틴 이량체)일 수 있다. 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 이들로 한정되는 것은 아니지만 시스테인-시스테인 상호작용, 설프하이드릴 결합 및 비공유 상호작용을 포함하여 당업자에게 알려진 분자간 구조적 결합에 의해 다량체로서 결합되어 있다. 특정 뉴블라스틴 폴리펩타이드로서는 이들로 한정되는 것은 아니지만 본원에 기술되어 있고 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 16으로 지정된 아미노산 서열이 포함된다.

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 이들로 한정되는 것은 아니지만 손상된 신경 및 상해된 신경을 포함하여 신경세포의 결함을 치료하는데 유용하다. 상해를 입은 말초 신경으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 수질 또는 척수의 신경이 포함된다. 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 신경퇴행성 질환(예, 뇌허혈성 신경세포손상), 신경방증(예, 말초신경병증), 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 근위축성측색경화증(ALS)을 치료하는데 유용하다. 또한, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 손상된 기억(예, 치매와 연관된 기억손상)을 치료하는데 사용될 수 있다.

도 1은 여러 유형의 성인 조직(패널 A) 및 여러 성인 뇌 영역(패널 B)에서 뉴블라스틴 유전자의 발현 수준을 상대적으로 비교해 주는, ³²P-표지된 뉴블라스틴 cDNA로 탐지된 두 개의 노던 블롯 사진이다.

도 2는 비형질감염된 세포주 HiB5에서 발현된 뉴블라스틴 cDNA의 양을 뉴블라스틴 cDNA로 형질감염된 세포주에서 발현된 뉴블라스틴 cDNA의 양 및 GDNF-cDNA로 형질감염된 세포주에서 발현된 뉴블라스틴 cDNA의 양과 비교해 주는, ³²P-표지된 뉴블라스틴 cDNA로 탐지된 두 개의 노던 블롯 사진이다.

도 3은 비형질감염된 HiB5 세포에서 발현된 뉴블라스틴 단백질의 양(레인 1)과 뉴블라스틴 cDNA로 안정하게 형질감염된 HiB5 세포주에서 발현된 뉴블라스틴의 양(레인 2)을 서로 비교해 주는, 두 개의 웨스턴 블롯 사진이다. 뉴블라스틴 단백질은 뉴블라스틴-특이적 항체 Ab-2(좌측 블롯; 패널 A) 또는 뉴블라스틴-특이적 항체 Ab-1(우측 블롯; 패널 B)로 탐침된다.

도 4는 배양된 랫트의 배아, 도파민, 복측중뇌 신경세포의 생존력 및 무혈청 배지에서 콜린성 뇌신경 운동성 신경세포에서의 ChAT 활성에 미치는 뉴블라스틴의 영향을 그래프로 도시한 것이다. 특히, 도 4A는 ChAT(dpm/시간)에 대한 재조합 GDNF의 용량-반응 곡선을 도시한 것이다. 도 4B는 뉴블라스틴 생성 세포 또는 GDNF 생성 세포로부터의 희석 조성된 배지를 사용한 ChAT 활성(dpm/시간)을 그래프로 나타낸 것이다. 도 4C는 웰당 티로신 하이드록실라제 면역반응 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 HiB5pUbi1zNBN22 세포로부터 분비된 뉴블라스틴이 HiB5pUbi1zNBN22 세포(뉴블라스틴) 또는 HiB5 세포(대조군)과 동시배양된 돼지의 배아 도파민성 복측중뇌 신경세포의 슬라이스(slice) 배양물의 기능 및 생존력에 미치는 영향을 그래프로 도시한 것이다. 도 5A 및 도 5B는 각각 DIV12(도파민 (pmol/ml)-12일째] 및 DIV21[도파민 (pmol/ml)-21일째]에서 배지에 방출된 도파민을 도시한 것이다. 도 5C는 DIV21에서 배양물당 티로신 하이드록실라제 면역반응 세포의 수[TH-ir 세포/배양물]를 도시한 것이다.

도 6은 흑질 도파민 신경세포에 미치는 렌티바이러스-생성된 뉴블라스틴의 생체내 영향을 그래프로 도시한 것이다.

도 7은 전체 길이의 뉴블라스틴 유전자를 동정하는데 사용할 수 있는 핵산 프라이머 및 이들의 게놈 뉴블라스틴-암호화 서열(즉, 유전자)에 대한 공간적 배향을 포함한 뉴블라스틴 유전자의 게놈 구조의 구성도이다.

도 8은 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 하이브리드화하지만 다른 알려진 GDNF 계열의 일원(즉, GDNF, 퍼세핀 및 뉴투린)을 암호화하는 핵산과는 하이브리드화하지 않는 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드 암호화 cDNA 클론을 동정하는데 사용된 뉴블라스틴 특이적 프라이머를 도시한 것이다.

도 9는 상이한 발달 단계로부터 분리된 쥐의 배근 신경절 세포의 배양물에 대한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 신경영양성 활성을 공지된 신경영양성 인자의 신경영양성 활성과 비교하여 도시한 것이다[0-대조 실험(인자 없음); 1-GDNF의 존재; 2-뉴투린의 존재; 3-본 발명에 따른 뉴블라스틴의 존재; E12-배아 12일째; E16-배아 16일째; P0-출생당일; P7-생후 7일째; 및 P15-생후 15일째].

도 10은 CHO 세포주로부터의 뉴블라스틴 생성을 그래프로 도시한 것이다.

도 11은 GFRα-1 및 GFRα-3 수용체에 결합하는 뉴블라스틴 및 GDNF를 비교한 것이다.

도 12는 뉴블라스틴에 결합하는 R30 항-펩타이드 항체 및 R31 항-펩타이드 항체를 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 13은 RETL3-Ig상의 친화성 결합에 의한 뉴블라스틴의 추출을 보여주는 겔 사진이다.

도 14는 뉴블라스틴의 합성 유전자 서열과 함께 pET19b-뉴블라스틴의 플라스미드 지도를 보여준다.

도 15는 His뉴블라스틴의 합성 유전자 서열과 함께 pMJB164-His뉴블라스틴의 플라스미드 지도를 보여준다.

출원인은 신규한 신경영양성 인자를 암호화하는 핵산을 동정하였으며 이는 본원에서 "뉴블라스틴" 또는 "NBN"이라 칭한다. 뉴블라스틴은 신경영양성 인자의 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상위계열의 신경교 세포주-유래된 신경영양성 인자(GDNF) 아부류의 일원이다.

뉴블라스틴 암호화 cDNA는 처음에 다음과 같이 동정되었다. TBLASTN 1.4.11 알고리듬[참조: Atschul et al., Nucl. Acids Res. 1997 25 3389-3402] 및 쿼리(query)로서 사람 퍼세핀(persephin)(GenBank Acc. No. AF040962)을 사용함으로써, 진뱅크 등록번호 AC005038 및 AC005051을 갖는 두 개의 사람 세균 인공 염색체(BAC)의 고속 처리 게놈 서열(HGTS: High-Throughput Genomic Seqeunce)에서 290 bp 단편이 최초로 동정되었다. AC005038은 비정렬 서열의 5개 콘티의 약 190,000 bp로 구성되고 AC005051은 비정렬 서열의 12개 콘티의 약 132,000 bp로 구성된다. 두 개의 BAC 클론에서 동정된 290 bp 단편은 신경영양성 인자 사람 퍼세핀의 cDNA의 암호영역과 동일하지는 않지만 상동성인 영역을 가진 것으로 입증되었다.

이 290 bp 서열로부터 두 개의 뉴블라스틴-특이적 PCR 프라이머가 합성된다(최상위 가닥 프라이머[서열 17] 및 최하위 가닥 프라이머[서열 18]). 사람 태아 뇌 cDNA 라이브러리의 스크리닝이 실시되었다. 최초 스크리닝은 약 5,000개 클론/웰을 함유한 500,000개 cDNA 클론으로부터 cDNA 라이브러리 "마스터 평판(Master Plate)"의 두 개 PCR 프라이머[서열 17 및 18]를 이용한 96-웰 PCR-이용 스크리닝을 포함한다. 두 번째 PCR-이용 스크리닝이 약 5,000개 클론/웰이 포함된 이. 콜라이 글리세롤 스톡을 함유한 사람 태아 뇌 cDNA 라이브러리 "서브-평판(Sub-Plate)"에서 실시되었다.

102 bp 단편[서열 13]이 마스터 평판 및 서브 평판 모두의 PCR- 이용 스크리닝에서 동정되었다. 양성 cDNA 클론(102 bp 단편을 보유함)을 선별하고 두 LB/항생물질-함유 평판상에 플레이팅하고 밤새 성장시켰다. 이들 평판으로부터 총 96개 세균 콜로니를 선별하고 각각 두 PCR 프라이머[서열 17 및 18] 및 필수 PCR 증폭 시약을 함유한 새로운 96-웰 PCR 평판의 웰에 넣었다. 이어서, PCR 증폭을 실시하고 2% 아가로즈 겔 전기영동으로 96개 PCR 반응물을 분석하였다. 그런 다음 102 bp 단편을 함유한 클론을 갖는 양성 콜로니를 동정하였다. 102 bp 단편을 함유한 양성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 수득하고 서열분석하였다. 서열분석 결과 861 bp의 전체 길이 cDNA[서열 8]가 존재하는 것으로 나타났다. 서열 8에서 동정된 663 bp의 개방 판독 프레임(ORF) 또는 암호영역(CDS)는 pre-pro-폴리펩타이드("pre-pro-뉴블라스틴"으로 명명함)를 암호화하며 서열 9로 나타나 있다. 서열 9를 기초로하여 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 세 개 변이체가 동정되었다. 이들 변이체는 다음을 포함한다:

(i) 서열 10으로 지정된 아미노산 서열을 보유하고 본원에서 NBN140으로 표기된 140 AA 폴리펩타이드;

(ii) 서열 11로 지정된 아미노산 서열을 보유하고 본원에서 NBN116으로 표기된 116 AA 폴리펩타이드; 및

(iii) 서열 12로 지정된 아미노산 서열을 보유하고 본원에서 NBN113으로 표기된 113 AA 폴리펩타이드.

782 bp 5' 미해독 DNA, 663 bp 암호화 DNA 및 447 bp 3' 미해독 DNA를 함유한 전체 cDNA 서열(총 1992 bp)이 진뱅크에 기탁되어 수탁번호 AF 120274를 부여받았다.

게놈 뉴블라스틴-암호화 서열은 다음과 같이 동정되었다:

게놈 뉴블라스틴-암호화 서열을 클로닝하고자 하는 목적으로 한 세트의 프라이머를 추가로 제조하였다. 특정적으로, 프라이머 쌍 1번은 [센스 = 서열 23 및 안티센스 = 서열 24]로 구성되었고 프라이머 쌍 2번은 [센스 = 서열 25 및 안티센스 = 서열 26]로 구성되었다.

프라이머 쌍 2번을 사용하여, 사람 게놈 DNA 제조의 PCR에 의해 887 bp DNA 단편을 증폭시킨 다음 이를 pCRII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝하고 이. 콜라이내로 형질전환시켰다. 생성된 플라스미드의 서열을 분석하고 861 pb 추정 cDNA 서열(본원에서 뉴블라스틴으로 명칭된 단백질을 암호화함)이 (서열 3에 기술된 바와 같이) 예상되었다. 유사하게, 사람 게놈 DNA의 PCR에 의해 870 bp DNA 단편을 수득한다. 이 단편에서 887 bp 서열과 비교하여 개방 판독 프레임의 3'-말단에 존재하는 추가의 42 bp 영역이 발견되었다. 이러한 뉴블라스틴 유전자의 게놈 구조는 엑손-인트론 경계를 지도화하여 이를 다른 신경영양성 인자의 핵산 서열과 비교함으로써 예상되었다. 이와 같은 분석에 의해 뉴블라스틴 유전자가 70 bp 인트론을 사이에 두고 두 개 이상의 엑손을 갖고있음이 증명된다.

이 서열은 또한 뉴블라스틴 EST 서열을 스크리닝하는데 사용되었다. 진뱅크 등록번호 AA844072, AA931637 및 AA533512로서 세 개가 동정되었고 이는 뉴블라스틴 핵산이 mRNA로 전사된다는 것을 가리킨다.

수득된 전체 cDNA 서열(AF 120274)과 진뱅크 등록번호 AC005038 및 AC005051에 존재하는 게놈 서열을 비교한 결과 뉴블라스틴 유전자는 4개의 인트론을 사이에 두고 5개 이상의 엑손(3개의 암호영역을 포함함)으로 구성되어 있는 것으로 나타났다(도 8 참조). 합쳤을 때 엑손은 전체 길이의 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 대한 추정된 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 887 bp 단편이 pro-뉴블라스틴의 완전한 암호영역을 함유하는 것으로 밝혀졌음이 주목되어야 한다. 추정된 cDNA[서열 3]는 세 개의 공지된 사람 단백질(즉, 퍼세핀, 뉴투린 및 GDNF)과 상동성을 보여준 pro-뉴블라스틴(181개 아미노산 잔기)을 암호화한 개방 판독 프레임(ORF)을 함유한다.

본 발명의 뉴블라스틴 핵산

본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열 뿐만 아니라 안티-센스 서열을 포함하며 또한 천연, 합성 및 계획적으로 조작된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 유전암호의 결과로서 퇴행하지만 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하고 발현하는 서열을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 길이가 10개 이상의 염기, 바람직하게는 길이가 15개 이상의 염기로 된 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 일컫는다. "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 이것이 유래되는 유기체의 천연 게놈에서 이것이 바로 인접하고 있는 양쪽의 암호서열(5' 말단 상의 서열과 3' 말단 상의 서열)과 바로 인접하지 않고 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 따라서, 이 용어는 발현 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 원핵 또는 진핵 세포의 게놈 DNA내로 삽입되거나 다른 서열과 독립하여 별개의 분자(예, cDNA)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치에서 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 "돌연변이된 폴리뉴클레오타이드" 및 대립형질 변이체를 포함한다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 3으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 서열 15로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 이의 상보 가닥 또는 이의 아서열과 하기에 상세히 설명된 바와 같이 적어도 중간의, 중간/고도의 또는 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산(DNA) 서열을 갖는다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 3로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 서열 15로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 핵산(DNA) 서열을 갖는다.

가장 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 1로 제시된 DNA 서열, 서열 3로 제시된 DNA 서열, 서열 8로 제시된 DNA 서열 또는 서열 15로 제시된 DNA 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 뉴블라스틴 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하고 발현하는 뉴블라스틴 폴리뉴클레오타이드를 동정, 분리 및 증폭하기 위한 신규한 프라이머 및 DNA 서열을 제공한다. 이러한 프라이머는 서열 17-28 및 31-32에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 본 발명은 서열 13 및 14에 기술된 것을 포함하여 상기 프라이머로부터 형성된 뉴블라스틴 DNA 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 뉴블라스틴 엑손옆에 위치한 게놈 DNA내 3' 또는 5' 미해독 영역("UTR")으로부터의 DNA 서열을 제공한다. 이러한 서열은 발현시 뉴블라스틴 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴블라스틴 폴리뉴클레오타이드를 동정, 분리 및 증폭시키는데 유용하다.

본 발명의 3' UTR 서열은 다음과 같은 서열을 포함한다:

서열 1의 뉴클레오타이드 721-865;

서열 3의 뉴클레오타이드 718-861;

서열 8의 뉴클레오타이드 718-861;

서열 15의 뉴클레오타이드 1647-2136 및

(예를 들면, 프라이머로서 유용한) 상기 서열로부터 유도된(즉, 이 서열내에 속하는) 10 내지 25개 뉴클레오타이드의 연속 서열.

본 발명의 5' UTR 서열은 다음과 같은 서열을 포함한다:

서열 1의 뉴클레오타이드 1-10;

서열 8의 뉴클레오타이드 1-57;

서열 15의 뉴클레오타이드 1-974 및

(예를 들면, 프라이머로서 유용한) 상기 서열로부터 유도된(즉, 이 서열내에 속하는) 10 내지 25개 뉴클레오타이드의 연속 서열.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 예를 들면 문헌[참조: "Current Protocols in Molecular Biology" [John Wiley & Sons, Inc.]]에 기술된 바와 같은 클로닝 절차에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 양태로서, 폴리뉴클레오 타이드는 사람 게놈 DNA 또는 사람 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되거나 이를 기초로하여 생성된다.

DNA 서열의 상동성

상기 언급된 DNA 서열 상동성은 제2 서열로부터 제1 서열의 유도를 가리키는 두 서열간의 동일성 정도로서 결정될 수 있다. 상동성은 적절하게는 GCG 프로그램 패키지[참조: Needleman, S.B. and Wunsch C.D., Journal of Molecular Biology 1970 48 443-453]에 제공된 GAP와 같이 본 분야에 알려진 컴퓨터 프로그램의 수단에 의해 결정될 수 있다. DNA 서열 비교를 위해 5.0의 GAP 형성 페널티 및 0.3의 GAP 확장 패널티로 세팅하여 GAP를 사용했을 때 상기 언급된 DNA 서열은 서열 1에 제시된 DNA 서열의 CDS(암호화) 부분, 서열 3에 제시된 DNA 서열의 CDS(암호화) 부분, 서열 8에 제시된 DNA 서열의 CDS(암호화) 부분 또는 서열 15에 제시된 DNA 서열의 CDS(암호화) 부분과 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성 정도를 나타낸다.

용어 "서열 동일성"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 특정 영역에서 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드를 비교했을 때 동일한 정도를 나타낸다. 용어 "서열 동일성의 퍼센트"는 비교 영역상에서 최적으로 배열된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I)가 양 서열에서 존재하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 정하고, 일치된 위치의 수를 비교 영역상의 전체 위 치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고 이 값에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 얻음으로써 산출한다. 본원에 사용된 용어 "실질적인 동일성"은 비교 영역에서 참조 서열과 비교하여 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 일반적으로 90 내지 95%의 서열 동일성, 더욱 일반적으로 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특징을 나타낸다.

하이브리드화 프로토콜

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 이하에 상세히 기술된 바와 같이 적어도 중간의, 중간/고도의 또는 고도의 엄격한 조건하에서 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 3으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 서열 15로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보 가닥 또는 아서열과 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 갖는 것이다.

뉴클레오타이드 프로브와 상동성 DNA 또는 RNA 서열사이의 하이브리드화를 결정하는데 적합한 실험 조건은 DNA 단편 또는 RNA를 함유한 필터를 미리 침지시켜 5 x SSC[염화나트륨/나트륨 시트레이트; 참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989]중에서 10분동안 하이브리드화하고, 필터를 약 45℃하에 5 x SSC, 5 x 덴하르트 용액[상기 문헌 Sambrook et al. 참조], 0.5% SDS 및 100 μg/ml의 변성되고 초음파분해된 연어 정자 DNA[상기 문헌 Sambrook et al. 참조]중에서 예비하이브리드화한 후 10 ng/ml 농도의 랜덤-프라임된[Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13],³²P-dCTP-표지된(특이활성>1x10⁹ cpm/μg) 프로브를 함유하고 상기와 동일한 용액에서 12시간동안 약 45℃에서 하이브리드화한다. 그런 다음, 필터를 60℃ 이상의 온도(중간의 엄격한 조건), 바람직하게는 65℃ 이상의 온도(중간/고도의 엄격한 조건), 더욱 바람직하게는 70℃ 이상의 온도(고도의 엄격한 조건), 더 더욱 바람직하게는 75℃ 이상의 온도(최고도의 엄격한 조건)하에 0.1 x SSC, 0.5% SDS중에서 30분동안 2회 세척한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 이들 조건하에서 하이브리드화하는 분자는 X-선 필름을 사용하여 검출할 수 있다.

삭제

클로닝된 폴리뉴클레오타이드

본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 특히 클로닝된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "클로닝된 폴리뉴클레오타이드"는 유전공학에서 현재 사용되고 있는 표준 클로닝 절차에 따라 클로닝되어 특히 RNA로부터 효소적으로 유도된 cDNA일 수 있는 DNA의 단편이 천연 부위로부터 그 단편이 재생될 다른 부위로 재배치된 폴리뉴클레오타이드 또는 DNA 서열을 가리킨다.

클로닝은 어떠한 적합한 경로에 의해서도 달성될 수 있으며 역전사효소 기술, PCR 기술 등 뿐만 아니라 목적하는 DNA 단편의 절단 및 분리와 같은 기술을 포함할 수 있다.

본 발명의 클로닝된 폴리뉴클레오타이드는 다른 용어 "DNA 작제물" 또는 "분리된 DNA 서열"로 사용될 수 있으며 특히 상보적 DNA(cDNA)일 수 있다.

생물학적 공급원

본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 어떠한 적합한 공급원으로부터도 수득될 수 있다.

바람직한 양태로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 cDNA 라이브러리, 예를 들면 태아 또는 성인 뇌(특히, 전뇌, 능형뇌, 피질, 선조체, 편도, 소뇌, 미상핵, 뇌량, 해마, 시상핵, 시상복측부핵, 후각핵, 피각, 흑질, 배근신경절, 삼차신경절, 상위 장간막 동맥 또는 시상), 척수, 심장, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 장, 눈, 망막, 치수, 모낭, 전립선, 뇌하수체 또는 기관)의 cDNA으로부터 클로닝되거나 이를 기초로하여 생성된다.

사람 및 비사람 모두의 여러 조직으로부터 유도된 cDNA 라이브러리는 공급원[예를 들면, Stratagene 및 Clontech]으로부터 구입할 수 있다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 표준 방법, 예를 들면 실시예에 기술된 방법에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드

상기된 바와 같이 본원에 사용된 "뉴블라스틴 폴리펩타이드"는 신경영양성 활성(예, 실시예 6, 7, 8 및 9에 기술됨)을 보유한 폴리펩타이드이며 서열 2의 AA₉₅-AA₁₀₅, 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅, 서열 4의 AA₉₇-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₄₁-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₁-AA₁₄₀, 서열 9의 AA₈₀-AA₁₄₀("야생형" prepro), 서열 9의 AA₄₁-AA₁₄₀(pro), 서열 5의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 6의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 7의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA), 서열 10의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 11의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 12의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA), 서열 16의 AA₁-AA₂₂₄(쥐 prepro) 및 이들 각각의 변이체 및 유도체로 기술된 사람 "뉴블라스틴" 폴리펩타이드와 70% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 함유한 폴리펩타이드를 포함한다.

상기 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 C-말단 서열은 바람직하게는 서열 2의 AA₇₂-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 AA₁₀₇-AA₁₄₀)를 가지며, 더욱 바람직하게는 서열 2의 AA₄₁-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 AA₇₆-AA₁₄₀)를 가진다.

또한, 바람직하게는, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 GDNF 계열 및 TGF-베타 상위계열의 특징인 7개 보존된 Cys 잔기를 보유한다.

뉴블라스틴 폴리펩타이드는 바람직하게는 상기 서열(즉, 서열 2의 AA₉₅-AA₁₀₅, 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅, 서열 4의 AA₉₇-AA₁₄₀, 서열 4의 AA₄₁ -AA₁₄₀, 서열 4의 AA₁-AA₁₄₀, 서열 9의 AA₈₀-AA₁₄₀("야생형" prepro), 서열 9의 AA₄₁-AA₁₄₀ (pro), 서열 5의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 6의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 7의 AA₁-AA₁₁₃ (성숙 113AA), 서열 10의 AA₁-AA₁₄₀(성숙 140AA), 서열 11의 AA₁-AA₁₁₆(성숙 116AA), 서열 12의 AA₁-AA₁₁₃(성숙 113AA) 또는 서열 16의 AA₁-AA₂₂₄(쥐 prepro))과 85% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가지며 상기 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 C-말단 서열을 가진 상기 폴리펩타이드중 어떠한 것도 바람직하게는 서열 2의 AA₇₂-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 AA₁₀₇-AA₁₄₀), 더욱 바람직하게는 서열 2의 AA₄₁-AA₁₀₅(즉, 서열 9의 AA₇₆-AA₁₄₀) 또는 서열 16의 AA₁₉₁-AA₂₂₄ 로 기술된 아미노산 서열을 가진다.

또한, 본 발명은 서열 16의 AA₁-AA₂₂₄로 기술된 쥐 "뉴블라스틴" 폴리펩타이드와 70% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 함유한 폴리펩타이드를 포함한다.

한가지 양태로 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드는 prepro서열(서열 2, 4, 9 및 16으로 각각 기술됨), pro서열(서열 2의 AA₇₅-AA₁₀₅ 또는 서열 4 및 9의 AA₄₁-AA₁₄₀로 각각 기술됨) 및 뉴블라스틴의 성숙 서열(서열 5, 6, 7, 10, 11 또는 12, 바람직하게는 서열 10, 11 또는 12로 기술됨)을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 변이 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명과 관련하여 용어 "변이 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 16으로 제시된 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(단백질)을 의미한다. 이러한 변이 폴리펩타이드로는 상기된 변형 폴리펩타이드 뿐만 아니라 보존 치환체, 스플리스 변이체, 이소형태, 다른 종으로부터의 상동체 및 동질이상체가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "보존 치환체"는 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 다른 잔기로 대체된 것을 나타낸다. 예를 들면, 보존 아미노산 치환체는 특히 치환이 폴리펩타이드 또는 단백질의 전체 아미노산 수에서 10% 미만을 차지한다면 생물학적 활성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는 보존 아미노산 치환체는 폴리펩타이드 또는 단백질의 5% 미만, 가장 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 단백질의 2% 미만이 변이된 것을 나타낸다. 예를 들면, NBN113에 따라 계산했을 때 가장 바람직한 보존 치환체는 야생형 성숙 아미노산 서열의 3개 이하의 아미노산이 치환된 것을 나타낸다. 특히 바람직한 양태로서, 성숙 서열에서 한 개의 아미노산이 치환된 것이며 치환 및 교체된 아미노산 모두는 환이 아닌 것이다.

특히 보존 치환체의 다른 예로는 이소로이신, 발린 또는 메티오닌과 같은 한 개의 소수성 잔기가 또 다른 소수성 잔기로 치환된 것, 또는 라이신이 아르기닌으로, 아스파트산이 글루탐산으로 또는 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 것과 같이 한 개의 극성 잔기가 또 다른 극성 잔기로 치환된 것이 포함된다.

용어 보존 치환은 또한 치환된 폴리펩타이드에 대해 발생된 항체가 또한 비치환된 폴리펩타이드와 면역반응을 하는 한, 비치환된 모 아미노산 잔기대신에 치환된 아미노산 잔기를 사용하는 것을 포함한다.

이러한 일차 아미노산 서열의 변형은 변형되지 않은 상응하는 폴리펩타이드에 비하여 실질적으로 동일한 활성을 갖는 단백질을 유도할 수 있으며 이에 따라 모 단백질의 기능상 유사체로 간주될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면 부위-지정된 돌연변이유도에 의해 계획적으로 이루어지거나 자발적일 수 있으며 스플리스 변이체, 이소형태, 다른 종으로부터의 상동체 및 동질이상체일 수 있다. 이러한 기능상 유사체도 또한 본 발명에 포함된다.

또한, 일차 아미노산 서열의 변형은 우성의 음성형태 등을 포함하여 모 단백질의 생물학적 활성을 유지하지 않는 단백질을 유도할 수 있다. 우성의 음성 단백질은 상류 또는 하류 성분과 같은 조절제에 결합하거나 조절제를 차단시킴으로써 정상적으로는 폴리펩타이드와 기능상 상호작용하는 야생형 단백질을 방해할 수 있다. 이러한 우성의 음성 형태도 본 발명에 포함된다.

"시그날 펩타이드"는 해독 후 프로세싱 및 분배를 위해 소포체에 결합하여 새로 합성된 폴리펩타이드를 유도하는 펩타이드 서열이다.

뉴블라스틴과 관련하여 본원에 사용된 "이종성 시그날 펩타이드"는 사람의 뉴블라스틴 시그날 펩타이드가 아닌 시그날 펩타이드를 의미하며, 전형적으로는 뉴블라스틴외 다른 일부 포유동물 단백질의 시그날 펩타이드이다.

당업자는 사람 뉴블라스틴 DNA 서열(cDNA 또는 게놈 DNA) 또는 침묵 코돈 변이 또는 보존 아미노산 치환을 형성하는 코돈 변이로 인해 사람 뉴블라스틴 DNA와 상이한 서열이 효소를 과다발현하고 분비하도록 배양된 사람 세포를 유전적으로 변형시키는데 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 다른 폴리펩타이드가 융합된 분리가능한 융합 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드를 포함한다. 키메라 폴리펩타이드는 본 발명의 핵산 서열(또는 이의 일부)에 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(또는 이의 일부)을 융합시켜 제조할 수 있다.

키메라 폴리펩타이드를 제조하는 기술은 표준 기술이다. 이러한 기술은 통상적으로, 서열이 동일한 판독 프레임에 존재하도록 하고 융합된 폴리펩타이드가 동일한 프로모터 및 터미네이터의 조절하에서 발현되도록 하는 서열의 연결을 요구한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 또한 전체 길이 뉴블라스틴 분자의 절단된(truncated) 형태를 포함한다. 이러한 절단된 분자에서 하나 이상의 아미노산이 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단으로부터 결실된다.

아미노산 서열 상동성

후보 폴리펩타이드가 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드와 상동성을 공유하는 정도는 두 아미노산 서열사이의 동일성 정도로서 결정된다. 고 수준의 서열 동일성은 제1 서열이 제2 서열로부터 유도되는 가능성을 가리킨다.

상동성은 이들로 한정되는 것은 아니지만 클러스탈엑스(ClustalX) 컴퓨터 정렬 프로그램[참조: Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG: The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools; Nucleic Acids Res. 1997, 25(24): 4876-82] 및 여기에 제시된 디폴트 변수와 같은 컴퓨터 분석으로 결정한다. 이 프로그램을 사용한 결과, 본 발명의 유사 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 성숙한 부분은 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 16으로 제시된 아미노산 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성 정도를 나타낸다.

상동성 결정을 기준으로 TGF-β 상위계열에 속하는 본 발명의 폴리펩타이드가 GDNF 하위계열과 연관이 있으나 이 하위계열과는 별개의 일원으로 나타남을 확인할 수 있다.

생물활성 폴리펩타이드

본 발명의 폴리펩타이드는 pre-pro-단백질, pro-단백질, 성숙한 단백질, 당화된 단백질, 인산화된 단백질 또는 다른 해독후 변형된 단백질의 형태를 포함한 생물활성 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 특히 N-당화된 폴리펩타이드일 수 있으며 이 폴리펩타이드는 바람직하게는 서열 목록에 표시된 N-잔기에서 당화된다.

바람직한 양태로서 본 발명의 폴리펩타이드는 122번 위치에 당화된 아스파라긴 잔기를 갖는 서열 9의 아미노산 서열, 122번 위치에 당화된 아스파라긴 잔기를 갖는 서열 10의 아미노산 서열, 98번 위치에 당화된 아스파라긴 잔기를 갖는 서열 11의 아미노산 서열 또는 95번 위치에 당화된 아스파라긴 잔기를 갖는 서열 12의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 예를 들면 미국특허 제5,434,131호에 기술된 Ig-융합물과 같은 뉴블라스틴 융합 단백질을 포함한다. 상기 특허의 내용은 본원에 참조로 원용된다.

한 가지 양태로서, 본 발명은 서열 2로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 2로 제시된 서열과 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이 드를 제공한다.

다른 양태로서, 본 발명은 서열 4로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 4로 제시된 서열과 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

세 번째 양태로서, 본 발명은 서열 5로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 5로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

네 번째 양태로서, 본 발명은 서열 6으로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 6으로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

다섯 번째 양태로서, 본 발명은 서열 7로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 7로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 대립형질 변이체, 예를 들면 Xaa가 Asn 또는 Thr이고 Yaa가 Ala 또는 Pro인 서열 5-7의 폴리펩타이드 아미노산 서열을 포함한다.

여섯 번째 양태로서, 본 발명은 서열 9로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 9로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

일곱 번째 양태로서, 본 발명은 서열 10으로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 10으로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

여덟 번째 양태로서, 본 발명은 서열 11로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 11로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

아홉 번째 양태로서, 본 발명은 서열 12로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 11로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

열 번째 양태로서, 본 발명은 쥐 기원의 pre-pro-뉴블라스틴인 서열 16으로 제시된 아미노산 서열 또는 서열 16로 제시된 서열과 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 GDNF 하위계열 핑거프린트, 즉 표 3에 밑줄로 표시된 아미노산 잔기를 갖는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 이의 상보가닥 또는 이의 아서열과 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 70% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 1로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 3으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 이의 상보가닥 또는 이의 아서열과 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 3으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 70% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 3으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 이의 상보가닥 또는 이의 아서열과 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 70% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 8로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 15로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 이의 상보가닥 또는 이의 아서열과 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 신규한 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 15로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 70% 이상 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 15으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

생물학적 기원

본 발명의 폴리펩타이드는 포유동물 세포, 바람직하게는 사람 세포 또는 쥐 기원의 세포로부터 분리될 수 있다.

가장 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 심장 조직, 사람 골격근, 사람 췌장 또는 사람 뇌조직, 특히 미상핵 또는 시상으로부터 분리될 수 있거나 이하에서 보다 상세히 기술된 바와 같이 포유동물 기원의 DNA로부터 얻을 수 있다.

신경영양성 활성

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 신경 또는 신경세포의 신진대사, 성장, 분화 또는 생존력을 조절하는데 유용하다. 특히, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 신경영양성 제제의 활성에 반응하는 살아있는 동물(예, 사람)의 질환을 치료 또는 경감시키는데 사용된다. 이러한 치료 및 방법은 이하에 보다 상세히 기술되어 있다.

항체

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편은 뉴블라스틴- 특이적 항체를 생성하는데 사용된다. 본원에 사용된 "뉴블라스틴-특이적 항체"는 뉴블라스틴 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편에 면역반응하거나 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체(예, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체)이다.

폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있다. 폴리클로날 항체는 특히 문헌[참조: Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" in Immunochemical Protocols(Manson, Ed.); Humana Press, 1992, pages 1-5; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters" in Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.4.1 및 Ed Harlow and David Lane(Eds.) in "Antibodies: A laboratory manual" Cold Spring Harbor Lab. Press 1988]에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이들 프로토콜은 본원에 참고로 원용된다. 모노클로날 항체는 특히 문헌[참조: Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495; Coligan et al., in Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.5.1-2.6.7; 및 Harlow et al., in Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, page 726]에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이들 프로토콜은 본원에 참고로 원용된다.

간단히 설명하면, 모노클로날 항체는 예를 들면 마우스에 항원을 함유한 조성물을 주사하고 혈청 샘플을 제거하여 항체 생성의 존재를 검증하며, 비장을 제거하여 B 림프구를 수득하고, B 림프구를 골수종과 융합시켜 하이브리도마를 생성하며, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선별하 며 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 수득할 수 있다.

모노클로날 항체는 단백질 A 세파로즈에 의한 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한 여러 공기 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리 정제할 수 있다[참조: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology, 1992, Sections 2.7.1 - 2.7.12 및 Sections 2.9.1 - 2.9.3; 및 Barnes et al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)" in Methods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, Vol. 10, Pages 79-104]. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는, 임의로, 예를 들면 항체를 유도하는 폴리펩타이드가 결합된 매트릭스에 결합시키거나 그 매트릭스로부터 용출시켜 추가로 정제할 수 있다.

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 온전한 폴리펩타이드 또는 면역항원으로서 목적하는 작은 펩타이드를 함유한 단편을 사용하여 제조할 수 있다. 동물을 면역화하기 위해 사용된 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성으로 수득할 수 있으며 임의로 운반체 단백질에 연결시킬 수 있다. 흔히 사용되는 것으로 펩타이드에 화학적으로 연결되는 운반체 단백질로는 키홀 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 티로글로불린, 소 혈청 알부민(BSA) 및 파상풍균 독소가 포함된다. 그런 다음 연결된 펩타이드는 특히 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼일 수 있는 동물을 면역화하는데 사용할 수 있다.

한 가지 양태로서, 항체는 다음의 펩타이드를 사용하여 생성한다:

펩타이드 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (서열 9의 아미노산 108-124) 또는 펩타이드 2: ALRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 아미노산 93-107). 이들 폴리펩타이드를 사용하여 항체를 생성하는 방법은 실시예 9에 기술되어 있다.

본 발명자는 또한 다음의 펩타이드에 대한 토끼 폴리펩타이드 항체를 생성한다:

펩타이드 R27: GPGSRARAAGARGC (서열 9의 아미노산 30-43)

펩타이드 R28: LGHRSDELVRFRFC (서열 9의 아미노산 57-70)

펩타이드 R29: CRRARSPHDLSL (서열 9의 아미노산 74-85)

펩타이드 R30: LRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 아미노산 94-107) 및

펩타이드 R31: STWRTVDRLSATAC (서열 9의 아미노산 123-136).

이 그룹 가운데 비교적 C-말단에 가까운 펩타이드 R30 및 R31만이 웨스턴 블로팅시 환원 조건하에서 변성된 단백질을 인식한다.

본 발명자는 아래에 상세히 설명된 바와 같이 성숙 단백질로부터 유도된 추가의 뉴블라스틴-유도된 펩타이드를 동정한다. 이 펩타이드는 공지된 GDNF 구조[참조: Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol., 1997 4 435-438]를 기초로 하여 표면에 루프가 노출된 것으로 예상되며 이에 따라 항체 형성에 유용하다:

영역 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (서열 9의 AA43-70);

영역 2: CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 AA74-107)

영역 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (서열 9의 AA108-136).

본 발명의 또 다른 관점에서, 뉴블라스틴 또는 뉴블라스틴-유도된 펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체는 여러 배지중의 그러한 뉴블라스틴 신경영양성 인자의 존재를 검출하는데 사용될 수 있으며 특히 본 발명의 뉴블라스틴 분자와 연관된 증세 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. ELISA, RIA 및 FACS를 포함한 상기 검출을 위한 여러 프로토콜이 본 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 항체는 또한 신경영양성 인자의 작용을 차단하는데 사용할 수 있으며 특히 중화 항체일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법

본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유한 세포를 폴리펩타이드의 생성을 유도하는 조건하에서 배양한 후 아래에 상세히 설명된 바와 같이 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 회수한다. 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생성하고자 하는 목적으로 세포를 유전학적으로 변형시키고자 할 때 세포는 통상적인 방법 또는 유전자 활성화에 의해 변형시킬 수 있다.

통상적인 방법에 따르면, 뉴블라스틴 cDNA 또는 게놈 DNA 서열을 함유하는 DNA 분자를 발현 작제물내에 삽입시키고 이들로 한정되는 것은 아니지만 리포좀-, 폴리브렌- 또는 DEAE 덱스트란-매개된 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사 또는 속도-추진된 미세분사("바이오리스틱스(biolistics)")를 포함한 표준 방법에 의해 세포내로 형질감염시킨다. 다른 방법으로서, 바이러스성 벡터로 DNA를 전달하는 시스템을 사용할 수 있다. 유전자 전달을 위해 유용한 것으로 알려진 바이러스로는 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오바이러스, 레트로바이러스, 신드비스 바이러스, 백시니아 바이러스(예, 카나리아 수두 바이러스) 및 곤충 세포, 특히 SfP9 곤충 세포의 백큘로바이러스 감염이 포함된다.

또 다른 방법으로, 미국특허 제5,733,761호 및 제5,750,376호에 기술된 바와 같은 유전자 활성화("GA") 방법을 사용하여 세포를 변형시킬 수 있다. 상기 미국특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

따라서, 세포와 관련하여 본원에 사용된 용어 "유전학적으로 변형된"은 유전자 생성물을 암호화한 DNA 분자 및/또는 유전자 생성물을 암호화한 서열의 발현을 통제하는 조절 요소가 도입된 후 특정 유전자 생성물을 발현하는 세포를 포함함을 의미한다. DNA 분자는 특정 게놈 부위에 DNA 분자를 삽입시키는 유전자 표적화에 의해 도입시킬 수 있다.

재조합 발현 벡터

또 다른 관점으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함한 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 어떠한 적합한 진핵성 발현 벡터도 가능 할 수 있다. 바람직한 재조합 발현 벡터는 유비퀴틴 프로모터를 함유한 벡터 pTEJ-8[참조: Johansen TE, Schoeller MS, Tolstoy S, Schwartz T; FEBS Lett. 1990 267 289-294] 및 이의 유도체(예, pUbi1Z)이다. 시판중에 있는 것으로 바람직한 진핵성 발현 벡터는 예를 들면 바이러스 프로모터를 함유한 벡터 pcDNA-3(Invitrogen으로부터 구입가능함)이다. 다른 바람직한 발현 벡터는 SV40 초기 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(플라스미드 pAD2베타로부터 유도됨; Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 1985 5 281)를 사용한다.

또한, 본 발명은 원핵성 발현을 위한 코돈 최적화를 가진 원핵성 발현 벡터 및 합성 유전자를 제공한다. GC 저함량 및 바람직한 세균성(예, 이. 콜라이) 코돈으로 합성 유전자를 작제한다. 합성 유전자를 두 개의 벡터, 즉 pET19b 및 이의 유도체인 pMJB164내로 클로닝한다. pET19b로의 작제가 도 14에 도시되어 있다. 이 작제물에서, 뉴블라스틴의 성숙 도메인을 암호화하는 서열이 출발 메티오닌에 직접 융합되어 있다. pMJB164로의 작제는 도 15에 도시되어 있다.

생성 세포

또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함하도록 유전학적으로 조작된 생성 세포를 제공한다. 특히, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 일시적으로 또는 안정하게 발현하거나, 과발현하거나, 동시발현하도록 유전학적으로 조작할 수 있다. 일시적이고 안정한 발현을 형성하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터(예, 플라스미드, 바이러스 또는 다른 발현 비히클)내로 삽입시키고 암호서열의 발현이 발현조절 서열에 적합한 조건하에서 달성되는 방식으로 결합에 의해 발현 조절 서열에 작동적으로 연결시킬 수 있다. 적합한 발현 조절 서열로는 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, 출발 코돈, 인트론을 위한 스플리싱 시그날 및 정지 코돈이 포함되며 모든 것은 mRNA의 적절한 해독이 이루어지도록 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 정확한 판독 프레임에 유지시킨다. 또한, 발현 조절 서열은 리더 서열 및 융합 파트너 서열과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.

프로모터는 특히 항상성(constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 새균성 시스템에 클로닝시킬 때, 박테리오파아지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터)와 같은 유도 프로모터가 사용될 수 있다. 포유동물 시스템에 클로닝시킬 때는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예, 유비퀴틴 프로모토, TK 프로모터 또는 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스러부터 유도된 프로모터(예, 레트로바이러스 장 말단 반복체, 아데노바이러스 후기 프로모터 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)가 사용될 수 있다. 또한, 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 수득된 프로모터가 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 전사시키기 위해 사용될 수 있다.

적합한 발현 벡터는 전형적으로 발현 기원, 프로모터 및 형질전환 세포의 표현형 선별을 제공하는 특정 유전자를 포함하며, 세균에서의 발현을 위한 T7-계열 발현 벡터와 같은 벡터[참조: Rosenberg et al., Gene 1987 56 125], 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pTEJ-8, pUbi1Z, pcDNA-3 및 pMSXND 발현 벡터[참조: Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 1988 263 3521], 곤충 세포에서의 발현을 위한 백큘로바이러스 유도된 벡터 및 난모세포 발현 벡터 PTLN[참조: Lorenz C, Pusch M & Jentsch T J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366]가 포함된다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 세포는 진핵세포(예, 사람 세포와 같은 포유동물 세포, 난모세포 또는 효모세포)이다. 본 발명의 세포는 이들로 한정되는 것은 아니지만 사람 배아 신장(HEK) 세포(예, HEK293 세포), BHK21 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모(XLO) 세포일 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명의 세포는 진균 세포(예, 사상 진균 세포)이다. 또 다른 바람직한 양태로서, 세포는 곤충 세포이며, 가장 바람직하게는 Sf9 세포이다. 추가로 바람직한 본 발명의 포유동물 세포는 PC12, HiB5, RN33b 세포주 및 사람 신경 선조 세포이다. 가장 바람직한 것은 사람 세포이다.

일차 또는 이차 세포의 예로는 섬유아세포, 포유동물 및 장 상피 세포를 포함한 상피세포, 내피세포, 임파구 및 골수 세포를 포함한 혈액의 형성된 구성요소, 신경교세포, 간세포, 각질세포, 근세포, 신경세포 또는 이들 세포 유형의 전구체가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 불멸화된 사람 세포주의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 보우스(Boews) 흑색종 세포(ATCC 수탁번호 CRL 9607), 다우디 세포(ATCC 수탁번호 CCL 213), 헬라 세포 및 이의 유도체(ATCC 수탁번호 CCL 2, CCL 2.1 및 CCL 2.2), HL-60 세포(ATCC 수탁번호 CCL 240), HT-1080 세포(ATCC 수탁번호 CCL 121), 쥬르캣(Jurkat) 세포(ATCC 수탁번호 TIB 152), KB 암종 세포(ATCC 수탁번호 CCL 17), K-562 백혈병 세포(ATCC 수탁번호 CCL 243), MCF-7 유방암 세포(ATCC 수탁번호 BTH 22), MOLT-4 세포(ATCC 수탁번호 1582), 나말와 세포(ATCC 수탁번호 CRL 1432), 라지(Raji) 세포(ATCC 수탁번호 CCL 86), RPMI 8226 세포(ATCC 수탁번호 CCL 155), U-937 세포(ATCC 수탁번호 CRL 1593), WI-38VA13 서브 라인 2R4 세포(ATCC 수탁번호 CLL 75.1) 및 2780AD 난소 암종 세포[참조: Van der Blick et al., Cancer Res. 1988 48 5927-5932] 및 사람 세포와 다른 종의 세포와 융합시켜 생성된 이종하이브리도마 세포가 포함된다. 또한, WI-38(ATCC 수탁번호 CCL 75) 및 MRC-5(ATCC 수탁번호 CCL 171)과 같은 이차 사람 섬유아세포 종이 사용될 수 있다.

본 발명의 세포가 진핵 세포일 때, 본 발명에 따른 이종성 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 특히 감염(바이러스 벡터를 사용함)에 의해, 형질감염(플라스미드 벡터를 사용함)에 의해, 인산칼슘 침전, 미세주사, 전기천공, 지질감염 또는 본 분야에 공지된 다른 물리화학적 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

더욱 바람직한 양태로서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 본 발명의 재조합 발현 벡터는 세포의 불멸화 및/또는 형질전환을 매개할 수 있는 하나 이상의 DNA 분자를 포함한 포유동물 숙주 세포, 신경 선조 세포, 성상세포, T-세포, 조혈줄기세포, 미분열세포 또는 뇌 상피 세포에 형질감염된다.

숙주 세포에서의 내인성 유전자의 활성화는 조절 구성요소를 도입함으로써, 특히 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화한 내인성 유전자를 전사시킬 수 있는 프로모터를 도입함으로써 달성될 수 있다.

약제학적 조성물

다른 관점에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한 신규한 약제학적 조성물을 제공한다.

치료에 사용하기 위해 본 발명의 폴리펩타이드는 어떠한 편리한 형태로도 투 여될 수 있다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하나 이상의 보조제, 부형제, 담체 및/또는 희석제와 함께 약제학적 조성물내로 혼입되며 약제학적 조성물은 본 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 제조된다.

이러한 약제학적 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 항체를 포함할 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 배합하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 협막내, 심실내, 경피, 피하, 복강내, 비후내, 안테랄(anteral), 국소, 설하 또는 직장 적용, 구강, 질내, 안내, 뇌내, 두개골내, 척수내, 심실내, 수조내, 캡슐내, 폐내, 경점막 또는 흡입을 포함한 어떠한 적절한 경로에 의해서도 투여할 수 있다.

폐내 전달 방법, 장치 및 약물 제제는 예를 들면 미국특허 제5,785,049호, 제5,780,019호 및 제5,775,320호에 기술되어 있다. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 투여는 제제의 주기적인 일시 주사에 의해 이루어질 수 있거나 외부 저장소(예, IV 낭) 또는 내부 저장소(예, 생체부식성 이식페, 생체인공 기관 또는 이식된 뉴블라스틴 생성 세포의 콜로니)로부터 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 보다 연속적으로 이루어질 수 있다[참조: 미국특허 제4,407,957호, 제5,798,113 및 제5,800,828호]. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 폐내 전달 방법 및 장치는 예를 들면 미국특허 제5,654,007호, 제5,780,014호 및 제5,814,607호에 기술되어 있다. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

특히, 본 발명에 따른 뉴블라스틴의 투여는 다음을 포함한 어떠한 적합한 전달 수단을 사용하여서라도 달성될 수 있다:

(a) 펌프[참조: Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984), 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다],

(b) 미세캡슐화[참조: 미국특허 제4,352,883호, 제4,353,888호 및 제5,084,350호, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다],

(c) 연속 방출 중합체 이식체[참조: Sabel, 미국특허 제4,883,666호, 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다],

(d) 거대캡슐화[참조: 미국특허 제5,284,761호, 제5,158,881호, 제4,976,859호 및 제4,968,733호 및 공개된 PCT 특허원 WO 92/19195 및 WO 95/05452, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다],

(e) CNS에 대한 나출(naked) 또는 비캡슐화 세포 이식편[참조: 미국특허 제5,082,670호 및 제5,618,531호, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다],

(f) 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 다른 적합한 부위로의 주사 및

(g) 캡슐, 액체, 정제, 환 또는 지연된 방출 제형을 통한 경구 투여.

본 발명의 한 가지 양태로서, 뉴블라스틴을 CNS내로, 바람직하게는 뇌 공동, 뇌 실질, 수막공간내 또는 다른 적합한 CNS 부위로, 가장 바람직하게는 수막공간내로 직접 전달한다.

다른 바람직한 양태로서, 피하 주사, 정맥내 투여 또는 정맥내 주입에 의한 전신 전달이 고려된다.

다른 유용한 비경구 전달 시스템으로는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식성 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화된 세포 전달, 리포좀 전달, 침-전달된 주사, 무침 주사, 연무기, 분무기, 전기천공 및 경피 패치가 포함된다.

제형 및 투여 기술에 대한 보다 자세한 내용은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences의 최근판(Maack Publishing Co., Easton, PA)]에서 찾아 볼 수 있다.

활성 성분은 1일 일회 또는 수회로 투여될 수 있다. 현재 고려되는 적절한 용량은 투여당 0.5 ng 뉴블라스틴/체중 kg 내지 약 50 μg/체중 kg이고 일일당 약 1.0 ng/kg 내지 약 100 μg/kg이다. 뉴블라스틴 약제 조성물은 약 5 ng/뇌척수액("CSF") ml 내지 25 ng/CSF ml의 신경영양성 인자의 국부 농도를 제공해야 한다.

투여 용량은 물론 연령, 체중, 치료 대상자의 상태, 투여 경로, 투여 형 및 방법, 섭생 및 목적하는 결과에 따라 주의깊게 조절되어야 하고 정확한 투여량은 처방자에 의해 결정되어야 한다.

추가의 양태로, 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 치료 방법하에 하기된 세포주 및 벡터를 사용하여 유전적 전달에 의해 투여될 수 있다. 이러한 치료목적의 세포주를 형성하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터(예, 플라스미드, 바이러스 또는 다른 발현 비히클)내로 삽입하고 암호서열의 발현이 발현 조절 서열에 적합한 조건하에서 달성되도록 하는 결합에 의해 발현 조절 서열에 작동적으로 연결할 수 있다. 적합한 발현 조절 서열로는 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, 출발 코돈, 인트론을 위한 스플리싱 시그날 및 정지 코돈이 포함되며 이들 모두는 mRNA의 정확한 해독이 이루어 지도록 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 정확한 판독 프레임에 유지된다. 또한, 발현 조절 서열은 리더 서열 및 융합 파트너 서열과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.

특히 프로모터는 항상성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 항상성 프로모터는 합성되거나 바이러스성이거나 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도될 수 있다(예, 사람 유비퀴틴 프로모토). 바람직한 양태로서, 치료목적의 세포주는 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 사람 불멸화 신경 세포주이다. 이식과 관련하여, 본 발명자는 약 10⁵ 내지 10¹⁰개 세포, 더욱 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁸개 세포의 이식을 고려한다.

치료방법

폴리뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 단편 및 이로부터 생성된 유도체, 이러한 단백질, 펩타이드 또는 유도체에 대한 항체에 관한 본 발명은 신경영양성 제제의 활성에 반응하는 살아 있는 동물체(사람을 포함함)의 장애 또는 질환을 치료 또는 경감시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 대해 반응하는 병리적 작용을 치료하기 위하여 예를 들면 주사, 이식 또는 섭취 약제학적 조성물을 통해 직접 사용될 수 있다.

상보 서열을 포함한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 신경영양성 인자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이것은 본 발명의 단백질, 펩타이드 또는 유도체를 발현하는 세포주에 의해 달성되거나 본 발명의 단백질, 펩타이드 또는 유도체를 암호화한 바이러스 벡터에 의해 달성되거나 그러한 단백질, 펩타이드 또는 유도체를 발현하는 숙주 세포에 의해 달성될 수 있다. 이들 세포, 벡터 및 조성물은 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 반응하는 질환 과정에 영향을 미치기 위해 치료 표적 부위에 투여할 수 있다.

적합한 발현 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 백시니아 바이러스 또는 여러 박테리아를 통해 생성된 플라스미드로부터 유도될 수 있으며 뉴클레오타이드 서열을 전체 유기체 또는 표적 기관, 조직 또는 세포 군으로 생체내 전달하는데 사용할 수 있다. 다른 방법으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 리포좀 형질감염, 전기천공, 핵 또는 다른 국부 시그날을 함유한 운반체 펩타이드로 형질감염 및 서방출 시스템을 경유한 유전자 전달이 포함된다. 본 발명의 또 다른 관점으로, 뉴블라스틴 유전자 또는 이의 일부분에 상보적인 "안티센스" 뉴클레오타이드 서열을 뉴블라스틴 발현을 억제하거나 증강시키기 위해 사용할 수 있다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 신경영양성 제제의 활성에 반응하는 살아 있는 동물체(사람을 포함함)의 장애 또는 질환을 치료하거나 경감시키는 방법에 관한 것이다.

장애 또는 질환은 특히 외상, 수술, 허혈, 감염, 대사성 질환, 영양결핍, 악성 또는 독성 제제 및 유전 또는 특발성 진행에 의해 유발된 신경계의 손상일 수 있다.

손상은 특히 배근 신경절내 신경세포을 포함한 감각성 신경세포 또는 망막 신경절 세포에서 일어나거나 다음의 조직 어디에서도 일어날 수 있다: 슬상관절, 추제 및 결절 신경절; 8번째 두개골 신경의 전정음향 복합체; 삼차 신경절의 상하악골 엽의 복측외측 극; 및 중뇌 삼차신경 핵.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태로서, 질환 또는 장애는 말초신경, 수질 및/또는 척수의 외상성 장애와 같은 신경세포의 외상성 장애, 뇌 허혈성 신경세포의 손상, 신경병증 및 특히 말초 신경병증, 말초 신경 외상 또는 손상, 허혈성 졸중, 급성 뇌 손상, 급성 척수 손상, 신경계 종양, 다발성 경화증, 신경독소에의 노출, 당뇨병 또는 신장 이상 및 감염 인자에 의해 유발된 손상과 같은 대사성 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 파킨슨-플러스 증후군, 진행성 마비(스틸-리차드슨-올체위스키 증후군), 올리브다리소뇌위축(OPCA), 샤이-드래거(Shy-Drager) 증후군(다발성 계통 위축), 구아마니안(Guamanian) 파킨슨 치매 합병증, 근위축성측색경화증을 포함한 신경퇴행성 장애 또는 기타 다른 선천성 또는 신경퇴행성 질환 및 치매와 연관된 기억 손상이다.

바람직한 양태로서, 본 발명자는 감각 및/또는 자율 계통 신경의 치료를 고려한다. 다른 바람직한 양태로서, 본 발명자는 근위축성측색경화증("ALS") 및 척수 근위축과 같은 운동성 신경세포 질환의 치료를 고려한다. 또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명자는 외상성 손상 후 신경 회복을 촉진하기 위해 본 발명의 뉴블라스틴 분자를 사용하는 것을 고려한다. 한 가지 양태로서, 본 발명자는 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 함유한 매트릭스와 함께 신경 유도 채널의 사용을 고려한다. 이러한 신경 유도 채널은 예를 들면 미국특허 제5,834,029호에 기술되어 있다. 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 (및 이를 함유한 약제학적 조성물)은 말초 신경병증의 치료에 사용된다. 본 발명의 분자로 치료하고자 고려되는 말초 신경병증으로는 외상-유도된 신경병증(예, 육체적 손상 또는 질환 상태에 의해 유발된 것), 뇌의 물리적 손상, 척수의 물리적 손상, 뇌 손상과 연관된 졸중 및 신경퇴행과 연관된 신경 장애가 포함된다.

또한, 본 발명자는 화학요법-유도된 신경병증(예, 택솔 또는 시스플라틴과 같은 화학요법제의 전달에 의해 유발된 것), 독소-유도된 신경병증, 약물-유도된 신경병증, 비타민-결핍-유도된 신경병증, 특발성 신경병증 및 당뇨성 신경병증의 치료를 고려한다[참조예: 미국특허 제5,496,804호 및 제5,916,555호]. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

본 발명자는 또한 본 발명의 뉴블라스틴 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 사용하여 축색 및 수초파괴성 신경병증을 포함한 비-신경병증, 모노-복합 신경병증 및 폴리-신경병증의 치료를 고려한다.

다른 바람직한 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산 (및 이를 함유한 약제학적 조성물)은 황반 변성, 색소성망막염, 녹내장 및 유사 질환을 앓고 있는 환자에게서 망막에서의 광수용체 상실을 포함한 여러 안질환을 치료하는데 사용된다.

본 발명의 또 다른 목적은 뉴블라스틴의 생물학적 활성 형태 또는 뉴블라스틴의 전구체(즉, 체내에서 뉴블라스틴의 생물학적 활성 형태로 쉽게 전환될 수 있는 분자)를 생성할 수 있는 사람 벡터 또는 세포 또는 추가로 뉴블라스틴을 분비하고 반투과성 막내로 캡슐화된 세포를 포유동물 세포내로 이식시켜 상기 질환 및 장애와 연관된 퇴행성 변화를 방지하는 방법을 제공한다.

사람을 포함한 포유동물 뇌내로 이식 또는 주입하는데 사용하기 위해 시험관내에서 세포를 성장시킬 수 있다.

바람직한 양태로서, 예를 들면 국제특허원 WO 98/32869에 기술된 발현 벡터를 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 유전자를 적합한 세포주, 예를 들면 HiB5 및 RN33b와 같은 불멸화 랫트 신경 간 세포주 또는 사람 불멸화 신경 선조 세포주내로 형질 감염시키고 생성된 세포주를 사람을 포함한 살아 있는 신체의 뇌로 이식시켜 CNS에 본 발명의 치료학적 폴리펩타이드를 분비시킨다.

진단 및 스크리닝 방법

뉴블라스틴 핵산은 예를 들면 유전, 비정상적인 태아발생 또는 후천적인 DNA 손상에 의해 획득된 뉴블라스틴 유전자의 결함(예, 뉴블라스틴 대립형질의 결함)으로 기인된 신경 장애가 개인에게서 진행되고 있는 지를 결정하는데 사용할 수 있다. 분석은 예를 들면 뉴블라스틴 유전자내에서 결실 또는 점-돌연변이를 검출하거나 특이적 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 지닌 상기 유전적 결함 소질의 유전을 검출하거나 환자로부터의 핵산 샘플을 뉴블라스틴 유전자에 대해 특이적인 핵산 프로브와 하이브리드시키고 프로브가 핵산에 하이브리드화하는 능력을 결정함으로써 정상적인 뉴블라스틴 유전자의 유무를 검출함으로써 이루어 질 수 있다.

특히, 뉴블라스틴 핵산은 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다. 이러한 하이브리드화 검정은 뉴블라스틴 단백질을 암호화하는 mRNA의 비정상적인 수준과 연관된 여러 증세, 장애 또는 질환 상태를 탐지, 예지, 진단 또는 모니터링하는데 사용할 수 있다. 뉴블라스틴 핵산은 뉴블라스틴 신경영양성 인자-의존성 생리학적 진행에 대한 "마커"로서 이용될 수 있다. 이들 진행에는 이들로 한정되는 것은 아니지만 "정상적인" 생리학적 진행(예, 신경 작용) 및 병리학적 진행(예, 신경퇴행성 질환)이 포함된다. 뉴블라스틴 단백질 및/또는 뉴블라스틴-암호화 mRNA의 비정상적인(즉, 증가되거나 결핍됨) 수준을 갖는 특정한 환자 아군의 특성화는 새로운 질환 분류를 가능하게 할 수 있다. 본원에 사용된 "비정상적인 수준"은 정량 또는 정석 수단에 의해 결정된 장애를 앓고 있지 않는 대조 샘플 또는 대상자에 비하여 증가 또는 감소된 수준을 의미한다.

본 발명의 뉴블라스틴 핵산 및 폴리펩타이드는 또한 뉴블라스틴의 소 분자 유사체를 포함한 뉴블라스틴 유사체를 선별 및 동정하는데 사용할 수 있다. 한 가지 고려될 양태로서, 본 발명은 뉴블라스틴과 접촉했을 때 검출가능한 생성물을 발현하도록 유도되는 시험 세포를 제공하고, 이 세포를 후보 화합물에 노출시키며, 검출가능한 생성물을 검출하는 단계를 포함하여, 뉴블라스틴-매개된 생물학적 효과를 유도하는 후보 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 검출가능한 생성물의 발현은 후보 화합물이 뉴로블라스틴-매개된 생물학적 효과를 유도하는 능력을 가리킨다.

또한, 본 발명의 뉴블라스틴 핵산 및 폴리펩타이드는 DNA 칩 또는 단백질 칩에 사용하거나 컴퓨터 프로그램에 사용하여 대립형질 돌연변이체 및 단일 뉴클레오타이드 다형성("SNP")를 포함하여 연관된 신규한 유전자 서열 및 이들에 의해 암호화된 단백질을 동정할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 미국특허 제5,795,716호, 제5,754,524호, 제5,733,729호, 제5,800,992호, 제5,445,934호 및 제5,525,464호에 기술되어 있다. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

실시예 1: 뉴블라스틴 핵산을 분리하는 방법

방법 1: 뉴블라스틴 유전자에 대한 사람 태아 뇌 cDNA 의 급속한 스크리닝

사람 퍼세핀과의 상동성에 의해 진뱅크에 제시된 두 개의 고속 처리 게놈 서열(HGTS)(수탁번호 AC005038 및 AC005051)에서 290 bp 단편을 동정한다. 290 bp의 핵산 서열로부터, 두 개의 뉴블라스틴 특이적 프라이머를 합성한다. 뉴블라스틴 상부 가닥 프라이머("NBNint.센스")는 서열 5'-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3'[서열 17]을 포함한다. 뉴블라스틴 하부 가닥 프라이머("NBNint.안티센스")는 서열 5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3'[서열 18]을 포함한다. 이들 프라이머를 사용하여 96-웰 PCR 반응을 실시한다.

500,000개 cDNA 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 함유하는 96-웰 마스터 평판에 웰당 약 5000개 클론을 로딩한다. 96-웰 아평판을 웰당 50개 클론을 함유한 이.콜라이 DH10B 글리세롤 스톡과 함께 사용한다.

폴리머라제 연쇄 반응("PCR") 기술을 사용하여 3회 증폭시켜 뉴블라스틴 핵산을 동정한다. 증폭은 샘플중의 핵산의 복제수를 증가시킨다.

마스터 평판 스크리닝 :

상기된 96-웰 PCR 스크리닝 기술을 사용하여 사람 태아 뇌 cDNA 마스터 평판을 유전자-특이적 프라이머로 스크리닝하여 사람 뉴블라스틴 cDNA를 분리한다.

30 ng의 사람 태아 뇌 cDNA(6 ng/μl; Origene Technologies)을 마스터 평판의 상응하는 웰로부터 얻고 다음의 시약을 함유한 총 용량 25 μl에 넣었다: 각각 0.2 mM의 두 상기 유전자-특이적 프라이머(즉, NBNint.센스 및 NBNint.안티센스), 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies).

다음의 절차 및 조건을 사용하여 PCR 열주기 반응을 실시한다. 처음에 DNA를 94℃에서 3분동안 변성시킨 다음 매회 94℃에서 1분동안 35회 변성시키고 55℃에서 1분간 어닐링하고, 이어서 72℃에서 90초동안 일차 연장시키고 72℃에서 5분동안 최종 연장시킨다. 96개 PCR 반응 생성물을 에티듐 브로마이드 염료가 함유된 2% 아가로즈 겔을 사용하여 겔 전기영동하여 분석한다. 웰로부터 관찰된 102 bp 양성 PCR 생성물은 톡특한 96-웰 아평판에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

102 bp 핵산 단편은 다음의 서열[서열 13]을 포함한다:

아평판 스크리닝 :

각각 0.2 mM의 두 유전자-특이적 프라이머, 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies)를 함유한 25 μl의 총 용량에 상응하는 아평판 웰으로부터의 글리세롤 스톡 1 μl를 넣고 PCR-매개된 증폭시켜 96-웰 사람 태아 뇌 아평판을 스크리닝한다.

마스터 평판 스크리닝에 대해 기술된 바와 동일한 PCR 열주기 조건을 사용한다. 에티듐 브로마이드를 함유한 2% 아가로즈 겔에서 96개 PCR 반응물을 분석하고 102 bp PCR 단편을 제공하는 양성 웰을 동정한다.

콜로니 PCR :

양성 아평판으로부터의 글리세롤 스톡 1 ml를 루리아 브로쓰(LB)중에 1:100으로 희석시킨다. 상기 희석액 1 ml 및 10 ml를 루리아 브로쓰 및 100 μg/ml의 카르베니실린을 함유한 별개의 두 한천 평판에 플레이팅한다. 그런 다음, LB 평판을 30℃에서 밤새 배양한다. 이들 평판으로부터의 96개 콜로니를 25 μl의 최종 용량에 각각 0.2 mM의 상기 두 유전자-특이적 프라이머, 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies)를 함유한 새로운 96-웰 PCR 평판으로 옮긴다.

마스터 평판 스크리닝에 대해 기술된 바와 동일한 PCR 열주기 조건을 사용한다. 에티듐 브로마이드를 함유한 2% 아가로즈 겔에서 96개 PCR 반응물을 분석한다. 이어서, 102 bp 단편을 함유한 양성 콜로니를 동정한다.

이 양성 콜로니로부터 제조된 플라스미드 DNA의 염기를 분석한 결과 전체 길이 861 bp의 cDNA[서열 8]로 나타났다. 이 cDNA는 pre-pro-뉴블라스틴[서열 9]을 암호화한다. 자동 DNA 서열분석은 BigDye 터미네이터 사이클 서열분석 키트(미국 소재 PE Applied Biosystems)를 사용하여 실시한다. 서열분석 겔은 ABI 프리즘 377(미국 소재 PE Applied Biosystems)상에서 러닝한다.

방법 2: 사람 뇌로부터의 뉴블라스틴 cDNA 의 클로닝

전체 길이의 뉴블라스틴 cDNA 또는 cDNA 단편을 증폭시키는 방법은 예를 들면 마라톤 cDNA 증폭 키트(미국 소재 Clontech Laboratories, 품목 번호 K1802-1)를 사용함으로써 RACE(cDNA 말단의 급속 증폭) 및 벡터-특이적 또는 어뎁터-특이적 프라이머와 결합된 상기 뉴블라스틴-특이적 프라이머 NBNint.센스 및 NBNint.안티센스로 실시할 수 있다.

완전한 사람 뇌 마라톤-레이디 cDNA(미국 소재 Clontech Laboratories, 품목 번호 7400-1)를 사용하여 전체 길이의 뉴블라스틴 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 증폭에 유용한 프라이머는 마라톤-레이디 cDNA에 포함된 어뎁터 프라이머 AP1과 결합된 뉴블라스틴 상부 가닥 프라이머 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3'[서열 19]("NBNext.센스") 및 뉴블라스틴 하부 가닥 프라이머 5'-TCCATCACCCACCGGC-3'[서열 20]("NBNext.안티센스")을 포함한다. 또한, 다른 상부 가닥 프라이머 5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3'[서열 28]를 사용한다. 또 다른 하부 가닥 프라이머 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3'[서열 33]를 사용할 수 있다. 마찬가지로, 다른 하부 가닥 프라이머 서열 24 및 26을 사용할 수 있다.

방법 3: 사람 뇌로부터의 뉴블라스틴 cDNA 의 클로닝

뉴블라스틴 cDNA를 클로닝하는 다른 방법이 여기에 기술된(및 도 1에 예시된) 하나 이상의 뉴블라스틴 프로브로 사람 성인 또는 태아 뇌 라이브러리를 스크리닝함으로써 실시된다. 이들 라이브러리는 λgt11 사람 뇌(미국 소재 Clontech Laboratories, 품목 번호 HL3002b) 또는 λgt11 사람 태아 뇌(미국 소재 Clontech Laboratories, 품목 번호 HL3002b)를 포함한다.

방법 4: 뉴블라스틴 유전자에 대한 마우스 태아 cDNA 의 급속 스크리닝

뉴블라스틴 유전자의 급속 스크리닝 절차를 다음의 방식으로 실시한다. 500,000 cDNA 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 함유한 96-웰 마스터 평판에 웰당 약 5000개 클론을 로딩한다. 웰당 50개 클론을 함유한 이.콜라이 글리세롤 스톡과 함께 96-웰 아평판을 사용한다. 해당 유전자(즉, 뉴블라스틴)을 동정하기 위해 PCR-매기된 증폭을 3회 실시한다.

마스터 평판 스크리닝 :

유전자-특이적 프라이머를 사용한 96-웰 PCR에 의해 마우스 cDNA 마스터 평판을 스크리닝하여 마우스 뉴블라스틴 cDNA를 분리한다. 하기 두 프라이머를 합성한다:

(1) 뉴블라스틴 C2 프라이머(NBNint.센스): 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3'[서열 21] 및 (2) 뉴블라스틴 C2as 프라이머(NBNint.안티센스): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3'[서열 22]

이들 두 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 220 bp 양성 PCR 생성물을 동정한다. 220 bp 핵산은 다음의 서열[서열 14]을 함유한다:

이어서, 96-웰 PCR 반응을 다음의 방식으로 실시한다. 마스터 평판의 상응하는 웰로부터 30 ng의 마우스 태아 뇌 cDNA(6 ng/μl, Origene Technologies)를 얻고 다음의 시약을 함유한 총 용량 25 μl에 넣었다: 각각 0.2 mM의 두 상기 유전자-특이적 프라이머(즉, C2 프라이머(NBNint.센스) 및 뉴블라스틴 C2as 프라이머(NBNint.안티센스)), 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies).

다음의 PCR 열주기 조건을 사용한다. 처음에 DNA를 94℃에서 3분동안 변성시킨 다음 매회 94℃에서 1분동안 35회 변성시키고 55℃에서 1분간 어닐링하고, 이어서 72℃에서 90초동안 일차 연장시키고 72℃에서 5분동안 최종 연장시킨다. 96개 PCR 반응 생성물을 에티듐 브로마이드 염료가 함유된 2% 아가로즈 겔에서 분석한다. 웰으로부터 관찰된 220 bp 양성 PCR 생성물은 톡특한 96-웰 아평판에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 그런 다음, 96개 PCR 반응물을 에티듐 브로마이드 염료가 함유된 2% 아가로즈 겔에서 겔 전기영동하여 분석한다. 동정된 220 bp 양성 PCR 생성물은 96-웰 아평판의 특정 웰에 상응한다.

아평판 스크리닝 :

각각 0.2 mM의 두 유전자-특이적 프라이머, 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies)를 함유한 25 μl의 총 용량에 상응하 는 아평판 웰으로부터의 글리세롤 스톡 1 μl를 넣고 PCR-매개된 증폭시켜 96-웰 사람 태아 뇌 아평판을 스크리닝한다. 마스터 평판 스크리닝에 대해 상기된 조건에 따라 PCR 열주기를 실시한다.

이어서, 에티듐 브로마이드를 함유한 2% 아가로즈 겔에서 96개 PCR 반응물을 분석하고 102 bp PCR 단편을 생성하는 양성 웰을 동정한다.

콜로니 PCR :

양성 아평판으로부터의 글리세롤 스톡 1 ml를 루리아 브로쓰(LB)중에 1:100으로 희석시킨다. 이어서, 희석액 1 ml 및 10 ml를 100 μg/ml의 카르베니실린을 함유한 별개의 두 LB 평판에 플레이팅하고 30℃에서 밤새 배양한다. 96개 콜로니를 분리하고 25 μl의 최종 용량에 각각 0.2 mM의 상기 두 유전자-특이적 프라이머, 1x표준 PCR 완충액(버퍼 V, 영국 소재 Advanced Biotechnologies), 0.2 mM dNTP(Amersham-Pharmacia), 0.1 M GC-멜트(미국 소재 Clontech Laboratories) 및 0.5 유니트의 Taq DNA 폴리머라제(5 U/μl, 영국 소재 Advanced Biotechnologies)를 함유한 96-웰 PCR 평판으로 옮긴다.

상기된 조건(상기 "마스터 평판 스크리닝" 참조)에 따라 PCR 열주기를 실시한다. 에티듐 브로마이드를 함유한 2% 아가로즈 겔에서 겔 전기영동하여 96개 PCR 반응물을 분석한다. 102 bp 단편의 존재로서 양성 콜로니를 동정한다. 이 양성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 제조한다. AmpliTaq DNA 폴리머라제와 함께 BigDye 터미네이터 사이클 서열분석 키트를 사용한 자동 DNA 서열분석에 의해 클론의 서열을 분석한다. 서열분석 겔은 ABI 프리즘 377(미국 소재 PE Applied Biosystems)상에서 러닝한다. 이 클론의 생성된 서열은 2136 bp의 전체 길이 cDNA[서열 15]로 나타났다. cDNA는 마우스 pre-pro-뉴블라스틴 폴리펩타이드에 해당하는 서열 16으로 제시된 추정 아미노산 서열과 함께 개방 판독 프레임을 포함한다.

실시예 2: 게놈성 뉴블라스틴의 클로닝

상기된 바와 같이 출원인은 퍼세핀 및 이의 측면 서열과의 상동 영역을 갖는 두 사람 BAC 클론(진뱅크 수탁번호 AC005038 및 AC005051)에서 290 bp 핵산 단편을 동정한다. 출원인은 레이져진 소프트웨어(DNAStar, Inc.)를 사용하여 추가의 뉴블라스틴을 암호화한 핵산을 클로닝하고자 하는 목적으로 상기된 861 bp 추정 서열을 사용하여 추가의 프라이머를 디자인한다. 두 쌍의 프라이머로부터 게놈 DNA상에서의 PCR 반응을 사용하여 뉴블라스틴 유전자를 클로닝한다. 두 쌍의 프라이머는 아래 도해된 바와 같다:

프라이머 쌍 1번

5' CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3'(센스)[서열 23]

5' CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT CAg 3'(안티센스)[서열 24]

프라이머 쌍 2번

5' gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgA ggACA 3'(센스)[서열 25]

5' CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3'(안티센스)[서열 26]

프라이머 쌍 1번을 사용하여, Clontech Laboratories로부터 구입한 사람 게 놈 DNA 제제(품목 번호 6550-1)로부터 887 bp DNA 단편을 증폭시킨다.

PCR 프로토콜 :

완충액 1과 함께 익스팬드 고성능 PCR 시스템(Boehringer Mannheim)을 사용하여 PCR을 실시한다. PCR 반응 혼합물은 5% 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 각 17.5 pmol의 dNTP를 함유한 50 μl의 총 용량으로 보충된다. 열주기는 94℃에서 2분동안의 예비-변성에 이어 94℃에서 10초와 68℃에서 1분간을 1주기로 하여 35회 반복한 예비-변성을 실시한다. 열주기는 68℃에서 5분동안 배양함으로써 종료된다. 열주기는 PTC-225 DNA 엔진 테트라드 열순환기(매사추세츠 소재의 MJ 리써치)로 실시한다. PCR 생성물은 2% 아가로즈(FMC)에서의 겔 전기영동에 의해 분석된 다음 촬영된다.

프라이머 쌍 1번과 함께 사람 게놈 DNA로부터 증폭된 887 bp 단편을 pCRII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝시키고 XL 1-블루 적격 이. 콜라이 세포(Stratagene)를 형질전환시킨다. 뉴블라스틴-2로 명명된 플라스미드 생성물의 서열을 써모시퀘나제(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 분석한다. 서열분석한 생성물을 ALFExpress 자동 서열분석기(Amersham Pharmacia Biotech)에서 전기영동하여 분석한다.

프라이머의 두 번째 쌍(상기 프라이머 쌍 1번)으로 사람 게놈 DNA를 PCR 증폭시켜 얻은 단편의 서열을 분석하였고 그 결과 개방 판독 프레임의 3' 말단에 추가로 42 bp 영역이 드러났다. 전체 길이 서열을 다른 신경영양성 인자의 핵산 서열과 비교하고 네트진 및 진 마크 소프트웨어[참조: Brunak et al., J. Mol. Biol. 1991 220 49-65; Boradovsky et al., Nucl. Acids Res. 1995 23 3554-62]를 사용하여 예상 접점 및 고도의 암호 포텐셜 영역을 동정하는 유전자-추적 소프트웨어 프로그램을 사용하여 엑손-인트론 경계를 지도화함으로써 전체 길이 서열을 분석한다. 엑손-인트론 경계는 상기된 급속 스크리닝으로부터 얻은 cDNA에 의해 검증된다.

도 7에 도시된 바와 같이 생성된 뉴블라스틴 유전자는 70 bp 인트론에 의해 분리된 두 엑손을 갖는다. 엑손은 전체 길이 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 추정 아미노산 서열을 갖는다. 추정 cDNA[서열 3]는 238개 아미노산 잔기[서열 4]를 암호화한 개방 판독 프레임(ORF)을 함유한다. 뉴블라스틴-2 클론은 pro-뉴블라스틴의 완전한 암호 서열을 함유한다. 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 세 개 단백질 퍼세핀, 뉴투린 및 GDNF와 고도의 상동성을 보여주었다.

실시예 3: 뉴블라스틴 핵산의 발현

하기된 기술을 사용하여 여러 발생의 미성숙 및 성인 단계에서 설치류 및 사람의 신경 조직 및 비신경 조직 모두로부터 뉴블라스틴 RNA의 발현을 검출된다.

RT - PCR 을 사용하여 뉴블라스틴 RNA 발현을 검출하는 방법:

서열 1로 동정된 뉴블라스틴 DNA 서열을 기초로 다음의 프라이머를 합성한다: (1) 뉴블라스틴 C2 프라이머 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3'[서열 21] 및 (2) 뉴블 라스틴 C2as 프라이머 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3'[서열 22]. 이 프라이머 세트를 사용하여 성인 및 태아 사람 완전-뇌 mRNA로부터 DNA 단편을 RT-PCR 증폭시킨다. 이 반응에 의해 생성된 DNA 단편중에서 220 bp의 단편이 있었다. 이 220 bp DNA 단편을 동정한 결과 뉴블라스틴 유전자가 성인 및 태아 뇌 조직에서 발현되는 것이 검증된다. 또한, 이들 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 220 bp DNA 단편을 증폭시킨다.

노던 블롯 하이브리드화에 의해 뉴블라스틴 RNA 발현을 검출하는 방법:

성인 사람 조직으로부터의 폴리A⁺ RNA를 포함한 노던 블롯을 미국 소재 Clontech Laboratories로부터 구입하고 ³²P-표지된 뉴블라스틴 cDNA로 탐침 검출한다. 표지된 뉴블라스틴 cDNA는 상기 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조한다.

프로브의 제조:

뉴블라스틴 핵산 DNA 단편(서열 8의 뉴클레오타이드 296-819)을 하이브리드화 프로브로 사용하기 위해 제조업자의 권장에 따라 레디프라임 II 표지 키트(Amersham 품목 번호 RPN1633)로 라벨링한다. 간단히 설명하면, DNA 샘플을 45 μl의 10 mM TE 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)중에 2.5 내지 25 ng의 농도로 희석한다. 이어서, 샘플을 끓는 수욕에서 95 내지 100℃로 5분동안 가열시키고 샘플을 빙상에서 5분동안 신속하게 냉각시킨 다음 원심분리하여 내용물을 반응관의 바닥으로 침전시킴으로써 DNA를 변성시킨다. 변성된 DNA 전체 양을 dATP, dGTP, dTTP, 옥소뉴클레아제-유리된 클레노우 효소 및 건조되고 안정화된 형태의 랜덤 프라이머의 완충 용액이 함유된 반응관에 5 μl의 Redivue [³²P] dCTP(Amersham Pharmacia Biotech 리미티드)와 함께 첨가한다. 위 아래로 2회 피펫팅하고 피펫 끝을 용액 가장자리를 휘저음으로써 용액을 혼합시키고 반응 혼합물을 37℃에서 10분동안 배양한다. 5 μl의 0.2 M EDTA를 첨가하여 라벨링 반응을 정지시킨다. 하이브리드화 프로브로 사용하기 위해 DNA 샘플을 95 내지 100℃로 5분동안 가열시킨 다음 DNA 샘플을 빙상에서 5분동안 신속히 냉각시켜 표지된 DNA를 단일 가닥으로 변성시킨다. 관을 원심분리하고 내용물을 잘 혼합한다. 마지막으로 뉴클레오타이드 제거 키트(퀴아겐)를 사용하여 단일 가닥 DNA 프로브를 정제한다.

하이브리드화 기술:

제조된 노던 블롯을 미국 소재 Clontech Laboratories(멀티플 티슈 노던 블롯, 품목 번호 7760-1 및 7769-1)로부터 구입하고 제조업자의 지시에 따라 상기 제조된 뉴블라스틴 ³²P-표지된 프로브를 사용하여 하이드리드화시킨다. 하이브리드화를 위해 ExpressHyb 용액(미국 소재 Clontech Laboratories)을 사용하고 약 3 ng/ml의 표지된 프로브를 사용한다. ExpressHyb 용액을 68℃로 가열한 다음 교반시켜 모든 침전물을 용해시킨다. 제조업자의 지시에 따라 하이베이드 하이브리드화 오븐에서 68℃하에 30분동안 적어도 5 ml의 ExpressHyb 용액에서 각 노던 블롯 막(10x10 cm)을 예비하이브리드화시킨다. 뉴블라스틴 ³²P-표지된 프로브를 95 내지 100℃에서 2분동안 변성시킨 다음 신속하게 빙상에서 냉각시킨다. 14 μl의 표지된 프로브를 5 ml의 새로운 ExpressHyb에 첨가하고 완전히 혼합한다. 블롯상에 표지된 DNA 프로브가 함유된 5 ml의 새로운 ExpressHyb 용액을 균일하게 분포시킴으로써 예비하이브리드화에서 사용된 ExpressHyb 용액을 교체시킨다. 블롯을 하이베이드 하이브리드화 온븐에서 68℃하에 1시간동안 배양한다. 배양 후 블롯을 저 긴축 세척물(실온하에 2 x 0.1% SDS를 함유한 SSC 완충액)에 이어 고 긴축 세척물(50℃하에 0.1 x 0.1% SDS를 함유한 SSC)로 수회 세정하고 세척한다[20 x SSC는 0.3 M NaCl/0.3 M Na 시트레이트, pH 7.0]. 증감 스크린을 사용하여 -80℃에서 블롯을 하이퍼필름 MP(Amersham Pharmacia Biotech Limited)에 노출시킨다.

노던 블롯 하이브리드화 실험의 결과는 도 1에 나타나 있다. 도 1A(좌측) 및 도 1B(우측)는 실시예 3에 기술된 바와 같이 ³²P-표지된 뉴블라스틴 cDNA로 탐침된 폴리A⁺ RNA의 노던 블롯이다. 마커는 크기가 1.35 킬로염기 쌍(kb), 2.4 kb, 4.4 kb, 7.5 kb 및 9.5 kb의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 도 1A의 막은 여러 성인 사람 조직으로부터 추출된 mRNA로 제조된다. 노던 블롯 하이브리드화 분석의 결과로부터 출원인은 뉴블라스틴 mRNA는 많은 성인 사람 조직에서 발현되는 것으로 결론 내렸다. 최고 수준의 뉴블라스틴 발현이 심장, 골격근 및 췌장에서 검출된다. 도 1B의 막은 성인 사람 뇌의 여러 영역으로부터 추출된 RNA로 제조된다. 성인 뇌내의 미형 핵 및 시상하엣 최고 수준의 발현이 관찰된다. 약 5 kb의 mRNA 전사물이 뇌에서 발현된 뉴블라스틴 mRNA의 우성 형태이다.

조직에서의 동일반응계 하이브리드화에 의해 뉴블라스틴 RNA 발현을 검출하는 방법:

뉴블라스틴 안티센스 프보브와 함께 다음의 기술을 사용하여 동물 조직(예, 설치류 조직)에서 뉴블라스틴 RNA의 발현을 측정한다.

마우스에서의 발현:

조직 샘플의 제조:

임신 후 13.5일 또는 18.5일째 마우스(스웨덴 스톡홀름 소재 B&K Universal)를 경부 탈구시켜 치사시킨다. 무균 상태에서 해부하여 태아를 제거하고 즉시 4% 파라포름알데하이드(PFA)가 함유된 0.1 M 인산염 완충액(PB) 용액에 침지시킨 다음 PFA로부터 제거하고 PBS에 저장한다. 조직을 단편화하기 위해 30% 수크로즈 용액에 침지시킨 다음 티슈 테크(O.C.T. 화합물, 캘리포니아 토렌스 소재 Sakura Finetek USA)에 고정시킨다. 6개의 치관 또는 시상 단편(각각 12 μm)을 저온조에서 자르고 양전하 글래스 슬라이드상에 해빙시키면서 올려 놓았다. 태아 단계에서의 프로토콜과 동일하게 실시하여 신생아 머리/뇌(P1, P7)을 고정시키고 성인 뇌 조직을 절개한 후 즉시 드라이 아이스에서 동결시킨 다음 사전에 고정시키지 않은 채로 조온조에서 절단한다.

뉴블라스틴 리보프로브의 제조:

안티센스 뉴블라스틴 RNA 프로브(이하, "뉴블라스틴 리보프로브")를 다음과 같이 제조한다. 마우스 뉴블라스틴 cDNA 서열[서열 15]의 뉴클레오타이드 1109-1863을 블루스크립트 벡터(Stratagene)내로 아클로닝시킨다. 생성된 플라스미드를 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 선형 DNA로 절단시킨다. 제조업자의 지시에 따라 T3 RNA 폴리머라제 및 디곡시제닌(DIG) RNA 라벨링 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 EcoRI DNA 단편을 시험관내에서 전사시킨다.

하이브리드화 :

저온조 절편을 4% PFA에 10분동안 고정시키고 10 mg/ml의 프로테이나제 K로 5분동안 처리한 다음 70% 에탄올에서 5분에 이어 95% 에탄올에서 2분동안 연속하여 탈수시키고 공기 건조시킨다. 1 μg/ml의 DIG-표지된 프로브가 함유된 하이브리드화 완충액(50% 탈이온 포름알데하이드, 10%의 50% 덱스트란 설페이트 용액, 1% 덴하르트 용액, 250 μg/ml 효모 tRNA, 0.3 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 8)을 80℃로 2분동안 가열시키고 절편상에 적용한다. 이어서, 절편을 파라필름으로 덮고 55℃에서 16 내지 18시간동안 배양한다.

다음 날 절편을 55℃하에 고 긴축(2 x 50% 포름알데하이드를 함유한 SSC)으로 30분동안 세척한 다음 RNase 완충액중에서 세척하고 37℃에서 20 μg/ml의 RNaseA와 함께 30분동안 배양한다. DIG-표지된 프로브를 검출하기 위해 절편을 차단 용액(0.1% 트윈-20 및 10% 열-불활성화된 염소 혈청을 함유한 PBS)중에서 1시간동안 예비 배양한 다음 알카리성-포스파타제-결합된 항-DIG 항체(Boehringer Mannheim)의 1:5000 희석액과 함께 4℃에서 밤새 배양한다. 다음 날 각 절편을 0.1% 트윈-20이 함유된 PBS중에서 2시간씩 4회 세척한 다음 NTMT 완충액(100 mM NaCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.5, 50 mM MgCl₂, 0.1% 트윈-20)중에서 10분씩 2회 세척한다. 이어서, 절편을 0.5 mg/ml의 레바미솔이 함유된 BM-퍼플 기질중에서 48시간동안 배양한다. PBS중에서 세척하여 착색 반응을 정지시킨다. 절편을 공기 건조시키고 DPX(스웨덴 소재 케보-랩)와 함께 커버 슬립으로 덮었다.

동일반응계 하이브리드화 반응의 결과는 표 1에 수록되어 있다.

마우스에서의 뉴블라스틴의 발현

구조	E13.5	E18.5	P1	P7	성체
전뇌	++
복측중뇌	-
배근 신경절	++
척수	+
망막		+++	+++	+
후각수		++	++	++
치수		++	++	+
삼차신경절		++	++	++
선조체		+	+	++
피질		++	++	++	+
치상회				++	+

표 1에 수록된 바와 같이, 태아발생 13.5일째("E13.5")에 뉴블라스틴이 척수 및 능뇌에서 발현되었고 전뇌에서 약하게 발현된다. 또한, 뉴블라스틴 발현이 발생중의 망막 및 감각 신경절(배근 신경절 및 삼차신경절(V))에서 검출된다. 신경 계이외에 신장, 폐 및 장에서 미약한 시그날이 발견되었으며 이것은 이들 조직에서 뉴블라스틴이 또한 발현된다는 것을 나타낸다.

태아발생 18.5일째("E18.5")에 뉴블라스틴이 삼차신경절에서 가장 많이 발현된다. 뉴블라스틴 발현이 또한 망막, 선조체 및 피질에서 검출된다. 또한, 발현이 치원기에서 발견된다.

다시 표 1에 있어서, E18.5 시점에서 생후 1일 및 7일사이에 피질, 선조체 및 삼차신경절(V)에서 증가된 뉴블라스틴 발현이 관찰된다. 뉴블라스틴 발현은 피질의 내층 보다는 외층에서 많이 발견된다. P7일째, 1일째에와 동일한 구조에서 발현이 발견되었으나 또한 뉴블라스틴 발현이 해마, 특히 치상 및 소뇌에서 발견된다. 성숙한 쥐 뇌에서 뉴블라스틴은 치상에서 강하게 발현되었으며 아주 낮거나 검출할 수 없는 수준의 뉴블라스틴 발현이 다른 피검 조직에서 탐지된다.

랫트에서의 발현:

하기 실험은 알카리성-포스파타제-표지된 올리고데옥시뉴클레오타이드 뉴블라스틴 안티센스 프로브를 이용한 랫트 조직의 하이브리드화에 관한 것이다.

조직 샘플의 제조:

임신한 위스타 랫트(덴마크 소재 Mollegaard Breeding)를 펜토바르비탈로 마취시킨 후 랫트 태아(E14)를 제거한다. 생후 랫트(P0, P7, 성숙)를 목을 베어 치사시킨다. 절개된 뇌와 전체 두부를 즉시 냉 0.9% NaCl에 침지시키고 동결시킨 다 음 저온조에서 20 μm로 절단한다(10개의 두정 및 시상 단편).

동일반응계 하이브리드화 :

안티센스 알카리성-포스파타제 (AP) 결합된 올리고데옥시뉴클레오타이드 프로브(5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3'[서열 27], 올리고 번호 164675, 덴마크 소재 DNA Technology)을 사용하여 2개의 절편을 하이브리드화시킨다. 이 프로브는 서열 15의 마우스 뉴블라스틴 cDNA의 염기 1140 내지 1169에 상보적이다.

하이브리드화 이전에, 절편을 실온에서 공기 건조시키고 55℃로 10분동안 가열한 다음 4℃에서 밤새 96% 에탄올로 처리한다. 이어서, 절편을 공기 건조시키고 39℃하에 하이브리드화 매질(5.0 pmol/ml)중에서 밤새 배양한다[참조: Finsen et al., Neurosci. 1992 47 105-113; West et al., J. Comp. Neurol. 1996 370 11-22].

하이브리드화 후 처리는 55℃에서 1xSSC(0.15 M NaCl, 0.015 M Na-시트레이트)로 30분 세정 4회에 이어 실온에서 트리스-HCl, pH 9.5로 10분 세정 3회로 구성되며 이후 AP 현상액을 적용한다. AP 현상액은 사용하기 바로 직전에 제조하였으며 니트로블루 테트라졸륨(NBT, Sigma), 5-브로모, 4-클로로, 3-인돌릴포스페이트(BCIP, Sigma) 및 트리스-HCl-MgCl₂ 완충액, pH 9.5[참조: Finsen et al., Neurosci. 1992 47 105-113]을 함유한다. AP 현상은 실온하에 암실에서 48시간동안 진행된다. 절편을 증류수에서 세정하여 착색 반응을 정지시킨다. 절편을 아세톤중에서 탈수시키고 크실렌-페놀 크레오소트(영국 소재 Allchem)중에서 연화시킨 다음 크실렌중에서 세정하고 유키트(덴마크 소재 Bie & Berntsen)을 사용하여 커버슬립으로 덮었다.

대조 반응은 (1) 하이브리드화 이전에 절편을 RNase A(50 μg/ml, 스웨덴 소재 Pharmacia)로 예비 처리하고, (2) 절편을 수백배 과량의 비표지된 프로브로 하이브리드화하며, (3) 절편을 하이브리드화 완충액만으로 하이브리드화하는 것으로 이루어 졌다. 하이브리드화 반응의 결과는 표 2에 수록되어 있다.

랫트에서의 뉴블라스틴의 발현

구조	E14	P0/P1	P7	성체
전뇌	++
복측중뇌	-
배근 신경절	++
척수	+
망막	+
후각수	(+)	++	++
소뇌		+	++	+
삼차신경절		++	++
선조체		+	+(+)
피질	(+)	++	++	+
해마		(+)	++	++

태아발생 14일째(E14)에 뉴블라스틴이 랫트 태아의 전뇌, 능뇌 및 척수에서 미약하게 발현된다. 또한 뉴블라스틴 mRNA가 눈(망막), 배근 신경절, 삼차신경절(V), 신장, 폐, 심장, 간 및 장에서 검출된다. 출생 당일(P0)의 랫트에서 뉴블라스틴 발현이 피질 및 선조체에서 검출된다. 또한, 뉴블라스틴 발현이 후 각수 및 해마에서 검출된다. 출생 후 7일째(P7)된 랫트의 경우 뉴블라스틴이 피질, 선조체, 후각수 및 소뇌에서 발현된다. 뚜렷한 시그날이 해마에서 관찰된다. 성숙 랫트의 경우는 뇌의 대부분 영역에서 아주 낮거나 검출할 수 없는 수준의 뉴블라스틴 발현이 관찰된다. 미약한 시그날이 시상핵에서 검출되었고 현저한 뉴블라스틴 발현이 해마에서 검출된다.

실시예 4: 뉴블라스틴 폴리펩타이드

서열 8로 동정된 개방 판독 프레임 또는 암호영역(CDS)은 pre-pro-폴리펩타이드("pre-pro-뉴블라스틴"으로 명명)를 암호화한다. 이 개방 판독 프레임으로부터 추정된 아미노산 서열이 서열 9로 나타나 있다. 서열 9를 기초로 하여 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 세 개 변이체가 동정된다. 이들 변이체는 다음을 포함한다:

(i) 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 것으로 본원에서 NBN140으로 명명된 폴리펩타이드;

(ii) 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 것으로 본원에서 NBN116으로 명명된 폴리펩타이드; 및

(iii) 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 것으로 본원에서 NBN113으로 명명된 폴리펩타이드.

유사하게, 서열 4로 표시된 아미노산 서열을 갖는 pre-pro-폴리펩타이드를 암호화하는 서열 3의 암호영역(CDS)을 기초로 하여 세 개의 뉴블라스틴 변이체가 동정된다. 이들 변이체는 다음을 포함한다:

(i) 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;

(ii) 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및

(iii) 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.

클러스탈 더블유(1.75)-기초로한 복수 서열 정렬을 기초로하여, 서열 9를 GDNF, 퍼세핀 및 뉴투린의 아미노산 서열과 나란히 정렬시킨다. 이러한 정렬은 표 3에 기술되어 있다.

★는 하나의 완전히 보존된 잔기를 갖는 위치를 가리킨다.

:는 '강력한' 그룹 STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY 및 FYW중 하나가 완전히 보존됨을 가리킨다.

ㆍ는 '약한' 그룹 CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM 및 HFY중 하나가 완전히 보존됨을 가리킨다.

표 3에 나타낸 아미노산 서열 정렬로부터 뉴블라스틴은 TGF-β 상위계열내에 보존된 위치에서 7개의 보존된 시스테인 잔기를 갖고 있음을 알 수 있다. 한 가지 양태로서, 바람직한 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 위치 8, 35, 39, 72, 73, 101 및 103에서 서열 2에서와 같이 또는 위치 43, 70, 74, 107, 108, 136 및 138에서 서열 4 및 9에서와 같이 보존된 7개의 시스테인을 함유한다. 이들 7개의 보존된 시스테인 잔기는 TGF-b 상위계열내에서 3개의 단량체간 디설파이드 결합(예, 서열 2의 시스테인 잔기 8-73, 35-101 및 39-103사이 및 서열 4 및 9의 시스테인 잔기 43-108, 70-136 및 74-138사이) 및 연장된 베타 가닥 영역과 함께 TGF-b 상위계열에 대해 보존된 구조적 모티프를 구성하는 1개의 단량체간 디설파이드 결합(예, 서열 2의 시스테인 잔기 72-72사이 및 서열 4 및 9의 시스테인 잔기 107-107사이)을 형성하는 것으로 알려져 있다[참조예: Daopin et al., Proteins 1993 17 176-192].

이 서열의 배열을 기초로 하여 볼 때 뉴블라스틴은 신경영양성 인자의 GDNF 하위계열의 일원인 것으로 제시된다(GDNF 하위계열 흔적으로서 표 3에서 밑줄로 표시된 LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP - SAxxCGC).

뉴블라스틴과 GDNF 계열의 다른 일원과의 상동성이 계산되었으며 이 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다.

GDNF = 신경교세포로부터 유도된 신경영양성 인자

삭제

NTN = 뉴투린

PSP = 퍼세핀

IHA = 인히빈-α

TF-β2 = 형질전환 성장 인자-β2

강력한 상동성은 다음의 "강력한" 그룹중 하나가 보존됨을 가리킨다: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY 및 FYW.

실시예 5: 뉴블라스틴의 생성

본 발명자는 하기된 바와 같이 진핵 및 원핵 세포 모두에서 뉴블라스틴을 생성한다.

발현 벡터:

뉴블라스틴을 암호화하는 전체 길이 cDNA를 진핵성 발현 벡터 pUbi1Z내로 삽입시킨다. 이 벡터는 사람 UbC 프로모터를 pcDNA3.1/Zeo의 변형된 형태내로 클로닝시켜 형성한다. 미변형된 pcDNA3.1/Zeo는 시판되고 있는 것이다(Invitrogen). 변형된 pcDNA3.1/Zeo는 암피실린 유전자(위치 3933 내지 5015) 및 위치 2838 내지 3134의 서열이 제거되었기 때문에 모 벡터보다 작다. 이러한 pcDNA3.1/Zeo의 변형된 형태에서의 CMV 프로모터를 pTEJ-8[참조: Johansen et al., FEBS Lett. 1990 267 289-294]의 UbC 프로모터로 치환시킴으로써 pUbi1Z를 수득한다.

포유동물 세포 발현:

불멸화된 랫트 신경 세포주[참조: Renfranz et al., Cell, 1991 66 713-729]인 포유동물 세포주 HiB5를 뉴블라스틴 암호화 서열을 함유한 pUbi1Z 벡터로 형질감염시킨다. RT-PCR에 의해 결정된 것으로 뉴블라스틴을 안정하게 발현하는 수개의 HiB5 세포주가 설정된다. 이들 안정한 세포주가운데 하나에서 HiB5pUbi1zNBN22 발현이 노던 블롯상의 전체 RNA를 ³²P-표지된 뉴블라스틴 프로브와 하이브리드화시킴으로써 검증된다. 이어서, HiB5pUbi1zNBN22를 뉴블라스틴 신경영양성 활성의 연구를 위해 뉴블라스틴의 공급원으로서 사용한다.

도 2는 HiB5pUbi1zNBN22 클론에서의 뉴블라스틴 cDNA의 발현을 보여준다( 즉, 하기된 바와 같이 본 발명의 ³²P-표지된 뉴블라스틴 cDNA로 탐침된 노던 블롯). 이 블롯은 표시된 바와 같이 각각 미형질감염된 HiB5 세포, HiB5pUbi1zNBN22 세포 및 HiB5pUbi1zGDNF14로부터 추출된 전체 RNA에 의해 제조된다. 각각 4.1 kb 및 1.9 kb에 상응하는 28S 및 18S rRNA 밴드의 위치가 블롯상에 나타나 있다.

도 3에 도시된 바와 같이 뉴블라스틴-유도된 폴리펩타이드에 대한 항체는 또한 HiB5pUbi1zNBN22 클론으로부터 배양된 배지에서 약 13 kD의 단백질을 인식하였으나 미형질감염된 HiB5 세포로부터는 그러한 단백질의 인식이 없었다(실시예 6 참조).

미변형된(즉, 해독 후 변형이 없는) 뉴블라스틴 폴리펩타이드 NBN140[서열 10], NBN116[서열 11] 및 NBN113[서열 12]의 추정 분자량은 각각 14.7 kD, 12.4 kD 및 12.1 kD인 것으로 결정된다.

방법:

미형질감염된 HiB5 세포 및 HiB5pUbi1zNBN22 클론으로부터의 전체 RNA(10 μg)를 갖는 노던 블롯을 0.8% 포름알데하이드 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 제조하고 나일론 막(Duralone, Stratagene)상에 블롯팅한다. 블롯을 실시예 3에 기술된 바와 같이 서열 8 및 뉴블라스틴 cDNA의 5'UTR 및 3'UTR로부터의 추가 뉴클레오타이드의 랜덤 라벨링에 의해 제조된 1.3 kb ³²P-표지된 프로브와 하이브리드화하고 세척한다. 블롯을 -80℃에서 증강지를 사용하여 하이퍼필름 MP(Amersham)에 노출시킨다.

N2 보조제(Life Technologies, 품목 번호 17502-048)가 보충된 혈청-유리 배지에서 밤새 배양된 HiB5pUbi1zNBN22 또는 미감염된 Hib5 세포의 배지를 농축시키고 15% 폴리아크릴아미드 겔(Amersham Pharmacia Biotech, 품목 번호 80-1262-01)상에서 분리시킨다. 단백질을 PVDF-막(Amersham Pharmacia Biotech, 품목 번호 RPN-303F)으로 옮기고 비특이적 단백질-결합 부위를 0.1% 트윈-20이 함유된 PBS중에서 5% 무지방 분유로 차단시킨다. 막을 폴리클로날 뉴블라스틴 항체(1:1000)와 밤새 배양시키고 이어서 양고추냉이 퍼옥시다제(1:2000)에 연결된 이차 항-토끼 IgG 항체(Amersham Pharmacia Biotech, 품목 번호 NA 934)와 배양시킨다. 제조업자(Amersham)의 지시에 따라 증가된 화학발광(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech, 품목 번호 RPN2109) 또는 ECL+(Amersham Pharmacia Biotech, 품목 번호 RPN2132)을 사용하여 면역염색을 가시화한다.

이들 실험의 결과는 도 3에 나타나 있다. 도 3A 및 도 3B는 형질감염된 HiB5 세포에서의 뉴블라스틴 단백질의 발현을 도시한 것이다. 미형질감염된 HiB5 세포[레인 1] 또는 뉴블라스틴 cDNA로 안정하게 형질감염된 HiB5 세포[레인 2]로부터 밤새 배양된 배지를 하기된 바와 같이 농축시킨다. 이어서, 실시예 10에 기술된 것으로 뉴블라스틴에 대해 특이적인 두 개의 상이한 폴리클로날 항체 Ab-1 및 Ab-2를 사용하여 배지를 웨스턴 블롯팅하여 분석한다. 형질감염된 세포로부터 유도된 배지에서 항체 모두는 분자량이 약 15 kDa인 단백질을 인식하는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 미형질감염된 HiB5 세포에서 관찰되지 않았다.

뉴블라스틴을 암호화한 클론된 cDNA는 또한 다른 진핵성 발현 벡터, 예를 들면 진핵성 발현 벡터 TEJ-8[참조: Johansen et al., FEBS Lett. 1990 267 289-294] 또는 pcDNA-3(Invitrogen)내로 삽입시키고 생성된 발현 플라스미드로 다른 포유동물 세포주(예, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HEK293, COS, PC12 또는 RN33b 세포주) 또는 사람 신경 간 세포를 형질감염시킬 수 있다. 뉴블라스틴을 생성하는 안정한 세포주를 사용하여 예를 들면 뉴블라스틴 단백질을 생성한다.

CHO 세포에서의 발현

플라스미드 pJC 070.14의 작제 :

중국 햄스터 난소 세포에서 뉴블라스틴 cDNA를 발현시키기 위해 사람 뉴블라스틴의 prepro 형태를 암호화하는 cDNA 단편을 포유동물 발현 벡터 pEAG347내로 삽입시켜 플라스미드 pJC070.14를 형성한다. pEAG347은 탠덤 SV40 초기 및 아데노바이러스 주 후기 프로모터(플라스미드 pAD2베타로부터 유도됨, Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 1985 5 281), 톡특한 NotI 클로닝 부위에 이어 SV40 후기 전사 종결 및 폴리A 시그날(플라스미드 pCMV베타로부터 유도됨, MacGregor and Caskey, Nucl. Acids. Res. 1989 17 2365)을 함유한다. 또한, pEAG347은 형질감염된 CHO 세포에서의 MTX 선별 및 증폭을 위해 pUC19-유도된 플라스미드 골격 및 pSV2dhfr-유도된 dhfr을 함유한다.

플라스미드 pJC070.14는 두 단계로 형성된다. 첫째 단계로, 사람 뉴블라스틴의 prepro 형태를 암호화하는 단편을 올리고뉴클레오타이드 KD2-824 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG-3'[서열 31], KD2-825 5'-TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG-3'[서열 32] 및 PFU 폴리머라제를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응으로 플라스미드 pUbi1Z-NBN으로부터 분리한다. 단편을 pPCR-스크립트 Amp SK(+)의 Srf-1 부위내로 클로닝시켜 플라스미드 pJC069를 형성한다. 두 번째 단계로서, 부분적인 Not-1 분해를 플라스미드 pJC069에 실시하여 685bp 단편(뉴블라스틴 유전자 함유)을 형성하고 이를 플라스미드 pEAG347의 Not-1 부위내로 크로닝시켜 플라스미드 pJC070.14를 형성한다. 플라스미드 pJC070.14에서 뉴블라스틴 유전자의 전사는 아데노바이러스 주 후기 프로모터에 의해 조절된다.

뉴블라스틴을 발현하는 CHO 세포주의 형성:

200 μg의 pJC070.14를 제한 효소 Mlu-1로 분해시켜 선형이 되도록 한다. DNA를 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 선형 DNA를 20 mM 헤페스, pH 7.05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na₂HPO₄, 6 mM 덱스트로스(HEBS)중에 현탁시키고 전기천공(280V 및 960 μF)에 의해 ~4E7 CHO dukx B1(dhfr^-) 세포(p23)내로 도입한다. 전기천공 후, 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)가 보충된 α+변형된 이글 배지(MEM)중에서 2일동안 배양시킨다. 이어서, 세포를 트립신으로 처리하고 10% 투석된 FBS가 보충된 α-MEM(리보- 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없음)중의 100 mm 디쉬(100,000 세포/평판)에 5일동안 리플레이팅한다. 세포를 100,000 세포/100 mm 평판의 밀도로 분할하고 200 nM 메토트렉세이트중에서 선별한다. 내성 콜로니를 집어내고 6개 웰 평판으로 증량시킨다. 각 클론으로부터 조성된 배지를 하기된 뉴블라스틴에 대한 특정 검정을 사용하여 스크리닝한다. 최고 수준의 뉴블라스틴을 발현하는 12개 클론을 T162 플라스크로 증량시킨 다음 재검정한다. 도 10에서 보는 바와 같이, CHO 세포주는 25 내지 50 ng/ml의 범위로 뉴블라스틴을 생성한다.

뉴블라스틴에 대한 삼중 복합 검정:

본 발명자는 문헌[참조: Sanicola et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238]에 기술된 삼중 복합 검정을 변형시켜 CHO 세포주 배지의 상등물에서 뉴블라스틴의 존재를 검정하였다.

이 검정에서, GDNF-유사 분자의 능력은 RET의 세포외 도메인과 여러 보조수용체, GFRα1, GFRα2 및 GFRα3사이의 결합을 매개하는 능력에 대해 평가될 수 있다. RET와 보조수용체의 가용성 형태는 융합단백질로서 형성된다. 랫트 RET의 세포외 도메인과 태반 알카리성 포스파타제(RET-AP)사이의 융합단백질 및 랫트 GFRα1의 세포외 도메인[참조: 1997년 11월 27일 공개된 국제특허원 WO9744356, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다]과 사람 IgG1(rGFRα1-Ig)의 Fc 도메인사이의 융합단백질은 공지된 것이다[참조: Sanicola et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238].

쥐 GFRα3의 세포외 도메인과 사람 IgG1(mGFRα3-Ig)의 Fc 도메인사이의 융합단백질을 형성하기 위해 쥐 RETL3의 아미노산 1-359을 암호화한 DNA 단편을 사람 IgG1의 Fc 도메인을 함유한 단편에 연결시키고 발현 벡터 pEAG347내로 클로닝시켜 플라스미드 pGJ144를 형성한다. 플라스미드 pGJ144로 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 형질감염시켜 융합단백질을 생성하는 안정한 세포주를 형성한다. 이 융합단백질은 표준 방법에 따라 프로테인 A 세파로즈 면역친화성 컬럼에서 정제한다. 요약하면, GDNF-유사 분자가 이 검정에서 RET에 보조수용체의 결합을 매개할 수 있는 경우 RET-AP 융합단백질은 평판에 유지될 것이며 유지된 양은 알카리성 포스파타제에 대한 화학발광 기질로 측정할 수 있다.

다이넥스 마이크로라이트-1 ELISA 평판(Dynex Technologies)을 50 mM 중탄산염/탄산염, pH 9.6중의 사람 Fc에 대해 특이적인 1 μg/ml 염소 항체로 16시간동안 피복시킨다. 평판을 비우고 TBS/0.5% 트윈-20(TBST)중의 1% l-블록(Tropix) 300 μl로 1시간동안 채웠다. TBST로 3회 세척한 후 웰을 RET-AP 융합 유전자를 발현하는 293개 EBNA 세포로부터 조성된 배지중에 희석된 100 μl의 1 μg/ml rGFRα3-Ig 또는 mGFRα3-Ig로 채웠다. 이어서, 웰중에서 컬럼의 상부 웰에 CHO 뉴블라스틴 클론으로부터 조성된 배지 100 μl를 첨가하고 각 한줄의 웰에서 2배 연속 희석을 실시한 다음 실온에서 1.5시간동안 배양한다. 그런 다음 평판을 TBST로 3회 세척하고 200 mM 트리스, pH 9.8, 10 mM MgCl₂(CSPD 완충액)로 2회 세척한다. 세척액을 1 mg/ml 삽피어 화학발광 증강제(Tropix)가 함유된 CSPD 완충액중의 425 μM CSPD(Tropix)로 교체시키고 실온에서 30초동안 배양한다. 다이나텍 발광측정기로 화학발광을 측정한다.

이 처음 실험에서, 본 발명자는 CHO 세포주에 의해 생성된 뉴블라스틴이 RET의 세포외 도메인에 GFRα1 또는 GFRα3의 결합을 매개할 수 있는 지를 조사한다. 도 11에서 보눈 바와 같이, CHO 세포 클론 #53으로부터 조성된 배지는 삼중 복합 검정에서 mGFRα3-Ig 융합단백질이 함유되었을 때 강력한 시그날을 나타냈으나 rGFRα1-Ig 융합단백질이 함유되었을 때는 나타나지 않았다. 이와 같은 현상은 도 11에서 보는 바와 같이 뉴블라스틴을 GDNF와 명료하게 구분시켜 준다. GDNF는 GFRα1과 결합하지만 GFRα3과는 결합하지 않는다. 모 CHO 세포주로부터 조성된 배지 또는 순수한 배지를 검정했을 때 어느 보조수용체 융합 단백질로도 시그날이 전혀 관찰되지 않았다.

CHO 세포주에서 뉴블라스틴의 발현 수준을 정량하기 위해 1 ng/ml의 농도에서 출발하여 rGFRα1-Ig 및 GDNF를 사용하여 표준 곡선을 제조한다. 이 표준 곡선을 사용하여 다른 CHO 세포주의 뉴블라스틴 농도를 산출한다. 도 10은 5개 CHO 세포주에 의해 생성된 수준을 보여준다. 이 산정은 GDNF와 GFRα1사이의 결합 친화성이 뉴블라스틴과 GFRα3사이의 결합 친화성과 유사하다는 미시험된 가정에 의존하기 때문에 이들 수준은 단지 대략적인 것에 불과하다.

CHO 세포주 상등액으로부터의 뉴블라스틴의 분석

CHO 세포주에 의해 생성된 뉴블라스틴을 좀더 분석하기 위해 GFRα3-Ig 융합 단백질을 사용하여 배지로부터 단백질을 추출하고 뉴블라스틴에 대한 폴리클로날 항체로 웨스턴 블롯팅하여 분석한다.

1차 실험으로, 세파로즈 비드에 연결된 mGFRα3-Ig로 뉴블라스틴을 추출한다. mGFRα3-Ig는 세파로즈 비드에 제조업자 Pharmacia 인코포레이티드에 의해 권장된 조건을 사용하여 연결된다. 100 μL의 mGFRα3-Ig-세파로즈를 음성 대조 CHO 세포주 또는 뉴블라스틴 생성 CHO 세포주 #6로부터 조성된 배지 1.0 mL 샘플에 첨가한다. 현탁액을 2시간동안 흔들 플랫폼에서 배양한다. 각 현탁액을 원심분리하고 상등물을 제거한 후 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.5의 1.0 mL 용액로 3회 세척한다. 각 수지를 100 μL의 2 x 환원 샘플 완충액중에 재현탁시키고 100℃로 5분동안 가열한다. 20 μL의 샘플 완충 상등액 및 10 μL의 분자량 표준물(FMC)를 미리 만든 10-20% SDS-PAGE 겔(Owl Scientific)의 각 웰에 적용한다. 겔을 40 mA 정전류에서 72분동안 전기영동한다.

웨스턴 블롯 분석을 위해 10 mM CAPS, 10% 메탄올, 0.05% SDS, pH 11.2 완충계(400 mA 정전류에서 45분)중의 호퍼 사이언티픽 장치에서 단백질을 니트로셀룰로즈(Schleicher and Schuell)에 전기블롯팅한다. 전달 후 카세트로부터 니트로셀룰로즈 필터를 제거하고 1% 아세트산중의 0.1% 폰세우 S의 용액으로 60초 동안 염색하여 분자량 마커를 가시화한다. 막을 두 부분으로 자르고 과량의 염료를 증류수에서 약하게 진탕시켜 제거한다. 막을 4℃하에 TBS중의 2% 무지방 분유중에서 밤새 차단시킨다. 막을 TBS중의 2% 무지방 분유중에서 친화성-정제된 항-뉴블라스틴 펩타이드 항체 두개(R30 및 R31)와 1.0 μg/mL의 농도로 개별적으로 배양한다. 막을 TBS-트윈중에서 매회 10분 3회 세척하고 염소 항-토끼 IgG-HRP 결합체(Biorad)의 1:5000 희석액중에서 30분동안 배양한다. 막을 TBS-트윈중에서 매회 10분 3회 세척하고 ECL 기질(Amersham)로 현상시킨다. 도 12에서 보는 바와 같이, 음성 대조 세포주로부터 추출된 단백질에서 관찰된 밴드(레인 1 및 3)와 비교했을 때 특정 밴드가 양 항체로 뉴블라스틴 생성 CHO 세포주로부터 추출된 단백질(레인 2 및 4)에서 검출된다.

보다 낮은 종의 분자량은 약 13 kD이고 pro-도메인의 절단 후 형성된 뉴블라스틴의 성숙 도메인을 나타낸다. 이러한 절단은 서열 10, 11 또는 12에 기술된 바와 같이 prepro 뉴블라스틴 단백질의 세 개 Arg-(예, -RXXR↓-) 잔기중 어느 하나이후에서 일어나 140AA, 116AA 또는 113AA 형태를 형성할 수 있었다. 미변형된 (즉, 해독 후 변형이 없음) 뉴블라스틴 폴리펩타이드 NBN140[서열 10], NBN116[서열 11] 및 NBN113[서열 12]의 추정 분자량은 각각 14.7 kD, 12.4 kD 및 12.1 kD인 것으로 결정된다. 이 종의 구조 뿐만 아니라 다른 뉴블라스틴 특정 밴드를 검정하기 위해 추가의 분석이 필요하다.

2차 실험으로, 뉴블라스틴을 ELISA 평판상에 포획된 hGFRα3-Ig로 추출한다. 사람 GFRα3의 세포외 도메인[참조: 1997년 11월 27일 공개된 국제특허원 WO97/44356, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다]과 사람 IgG1(hGFRα3-Ig)의 Fc 도메인사이의 융합단백질을 형성하기 위해 사람 GFRα3의 아미노산 1-364를 암호화한 DNA 단편을 사람 IgG1의 Fc 도메인을 함유한 단편에 연결시키고 문헌[참조: Sanicola et al., Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 6238]에 기술된 발현 벡터 CH269내로 클로닝시킨다. 이 플라스미드에 암호화된 융합단백질을 293-엡스타인-바르 바이러스-암호화된 핵 항원(EBNA) 세포에서 일시적으로 발현시키고 표준 방법 에 따라 프로테인 A 세파로즈 면역친화성 컬럼상에서 정제한다.

96-웰 평판의 6개 웰을 PBS(300 ml/웰)중의 25 mg/ml의 농도로 염소 항-사람 IgG(Fcγ 단편 특이적, 잭슨 이뮤눌로직스)로 4℃에서 밤새 피복시킨다. 웰을 PBS중의 1% BSA 400 ml로 실온에서 1시간동안 차단시킨다. PBST(PBS + 0.05% 트윈 20)으로 3회 세척한 후 각 웰에 300 ml의 hGFRα3-Ig(0.1% BSA를 함유한 PBS중의 10 mg/ml)를 첨가한다. 평판을 실온에서 1시간동안 배양하고 약하게 진탕시켜(200회 스트로크/분) 결합을 최대화한다. 이어서 웰을 비우고 다시 PBST로 3회 세척한다. 3개 웰의 각각에 음성 대조 CHO 세포주 또는 뉴블라스틴 생성 CHO 세포주 #25으로부터 조성된 배지 250 ml를 첨가했다. 평판을 실온에서 3시간동안 배양하고 약하게 진탕시킨다(300회 스트로크/분). 그런 다음 웰을 PBST로 2회 세척한다. 첫 번째 웰에 25 ml의 비환원성 래믈리 로딩 완충액을 가하고 평판을 급속히 5분동안 진탕시켜 결합된 단백질을 용출시킨다(1300회 스트로크/분). 내용물을 다음 웰로 옮기고 상기 절차를 반복하여 두 번째 및 세 번째 웰에 결합된 단백질을 용출시킨다. b-머캅토에탄올(최종 5%)을 첨가한 후 샘플을 5분동안 끓이고 10-20% 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE하여 분석한다.

웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 니트로셀룰로즈로 옮긴다. 막을 5% 무지방 분유, PBST중에서 차단시키고 프로브로 검사한 다음 PBST중에서 세척한다. 뉴블라스틴을 두 뉴블라스틴 펩타이드(1 μg/ml)에 대한 폴리클로날 항체(R30 및 R31)과 반응시키고 이어서 HRP-결합된 염소 항-토끼 항체(Biorad)와 반응시켜 검출한다. 도 13에서 보는 바와 같이, 5개의 뉴블라스틴 특정 밴드를 뉴블라스틴 생성 CHO 세포주(레인 2)로부터 추출된 단백질에서 검출된다. 보다 낮은 밴드 두 개는 도 12에서 관찰된 밴드와 아주 유사한다. 아마 보다 낮은 밴드는 pro-도메인의 절단 후 형성된 뉴블라스틴의 성숙 도메인을 나타낸다.

도 13의 밴드를 계속 분석한 결과(이의 데이터는 기술되지 않았음) 약 18 kD 밴드를 PGNase F로 탈당화하는 것이 이 밴드의 크기를 도 13의 겔에서 가장 낮은 밴드와 동일한 크기로 줄여 주는 것으로 나타난다. 이는 뉴블라스틴이 포유동물 세포에서 당화된 단백질로 생성될 수 있음을 시사한다.

이. 콜라이에서 뉴블라스틴의 발현

이. 콜라이에서 뉴블라스틴 유전자를 발현시키기 위해 낮은 GC 함량 및 바람직한 이. 콜라이 코돈으로 합성 유전자를 제조한다. 합성 유전자는 두 벡터, pET19b 및 이의 유도체인 pMJB164내로 클로닝된다. pET19b로의 작제는 도 14에 나타나 있다. 이 작제물에서 뉴블라스틴(NBN113)의 성숙 도메인을 암호화한 서열이 개시 메티오닌에 직접 융합된다. pMJB164로의 작제는 도 15에 나타나 있다. 이 작제물에 뉴블라스틴의 성숙 도메인이 엔테로키나제 절단 부위에 의해 분리된 히스티딘 태그(즉, 10개 히스티딘)에 융합된다. 개시 메티오닌 뒤에 히스티딘 태그가 위치한다.

도 14에서 뉴블라스틴을 암호화한 뉴클레오타이드 서열

도 15에서 히스-태그된 뉴블라스틴을 암호화한 뉴클레오타이드 서열

실시예 6: 랫트 태아 도파민성 신경세포의 생존력 및 ChAT 활성에 미치는 뉴블라스틴의 영향

일련의 이 실험에서에서 상기된 뉴블라스틴-생성 HiB5pUbi1zNBN22를 평가한다.

배양물의 제조:

복 중뇌 또는 척수를 냉 한크스 완충된 염 용액(HBSS)중에서 랫트 E14 태아로부터 절개한다. 조직 파편을 37℃하에 HBSS중의 멸균 여과된 0.1% 트립신(Worthington) 및 0.05% DNase(Sigma)중에서 배양한다. 이어서, 이들 조직 파편을 HBSS + 0.05% DNase중에서 4회 세척하고 1 ml 자동 피펫을 사용하여 분리시킨다. 현탁액을 600 rpm으로 5분동안 원심분리하고 펠렛을 혈청 조성된 배지(SCM, 10% 태아 송아지 혈청을 함유한 DMEM)중에 현탁시킨다. 트립판 블루 염료 배제 방법으로 세포의 총 수를 계수하고 도파민성 신경세포 생존력의 평가를 위해 폴리-L-라이신 피복된 8-웰 챔버 슬라이드(Nunc)에서 100,000개 세포/cm²의 밀도 또는 ChAT 활성 측정을 위해 48-웰 평판(Nunc)에서 200,000개 세포/cm²의 밀도로 플레이팅한다. 세포를 37℃, 5% CO₂/95% O₂ 및 95% 습도하에 SCM중에서 24 내지 48시간동안 배양한 후 무혈청 배지(SFM)로 옮기고 신경영양성 인자를 첨가한다.

도파민성 신경세포 생존력을 평가하기 위한 세포를 SFM + 친화성 인자 첨가제중에서 5일동안 둔 다음 4% PFA중에 고정시킨 후 면역조직화학에 의해 티로신 하이드록실라제에 대해 염색한다.

ChAT 활성을 위한 세포를 SFM과 함께 3일동안 둔다음 HBSS + 0.1% 트리톤 X-100중에 용해시킨 후 즉시 ChAT 활성을 측정할 때까지 드라이 아이스에 동결시켜 두었다.

신경영양성 인자 첨가:

조성된 배지를 미감염된 HiB5 대조군 또는 뉴블라스틴을 생성하는 HiB5(HiB5pUbi1zNBN22) 또는 GDNF(HiB5pUbi1zGDNF-L17)로부터 수거한다. HiB5pUbi1zNBN22는 세포로부터 수거된 조성 배지에 대해 GDNF-ELISA를 실시하여 측정한 결과 약 20 ng GDNF/24시간/10⁵개 세포를 생성하는 것으로 나타났다. 각 세포주를 DMEM + 1% FCS와 함께 밤새 배양한 후 상등물을 취하여 사용할 때까지 -20℃에 저장해 두었다. 상등물을 세포에 첨가할 때 SFM중에 1:50으로 희석한다. 개개의 웰을 HiB5 대조 상등물(1:50) + 정제된 재조합 랫트 GDNF(0.03-10 ng/ml)로 처리한다.

이들 실험의 결과는 도 4에 나타나 있다. 도 4A-4C는 실시예 5.1에 기술된 바와 같이 무혈청 배지에서 HiB5pUbi1zNBN22 세포로부터 분비된 뉴블라스틴이 배양된 랫트의 태아, 도파민성, 복중뇌 신경세포의 생존력 및 콜린성 뇌신경 운동 신경세포에서의 ChAT 활성에 미치는 영향을 도시한 것이다.

도 4A는 처음에 E14 복중뇌로부터 설정된 무혈청 배양물중에서 DIV5로 측정된 ChAT 활성(dpm/시간)에 대한 재조합 GDNF의 용량-반응 곡선을 도시한 것이다[즉, HiB5; GDNF 0.03 ng/ml; GDNF 0.1 ng/ml; GDNF 0.3 ng/ml; GDNF 1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml].

도 4B는 처음에 E14 복중뇌로부터 설정된 무혈청 배양물중에서 DIV5로 측정된 ChAT 활성(dpm/시간)을 도시한 것이다. 뉴블라스틴-생성 HiB5pUbi1zNBN22 세포(뉴블라스틴) 또는 GDNF-생성 HiB5GDNFL-17(GDNFL-17) 세포로부터 조성 희석된 배지를 이 도면에 표시된 바와 같이 첨가한다[즉, 뉴블라스틴 1:10; 뉴블라스틴 1:50; GDNF L-17 1:50].

도 4C는 처음에 E14 랫트 복중뇌로부터 설정된 무혈청 배양물중에서 DIV7로 측정된 웰당 티로신 하이드록실라제 면역반응 세포 수[TH+ 세포수/웰]를 도시한 것이다. 여러 가지 농도로 비형질감염된 HiB5 세포(HiB5) 또는 뉴블라스틴-생성 HiB5pUbi1zNBN22 세포(뉴블라스틴) 또는 재조합 GDNF로부터 조성 희석된 배지를 이 도면에 표시된 바와 같이 첨가한다[즉, HiB5 1:10; HiB5 1:40; GDNF 0.1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml; 및 뉴블라스틴 1:40].

뉴블라스틴 형질감염된 HiB5 세포로부터 조성되고 1:40 희석된 배지는 동일한 희석 및 보다 낮은 희석율(1:10 및 1:40)의 대조(비형질감염된) HiB5 세포에 비하여 웰당 TH 면역반응 세포의 수를 현저히 증가시켜 준다(참조예: 도 4B). TH-면역반응 세포의 증가는 최대 GDNF 농도(10 ng/ml)에서 나타난 증가와 거의 대등하다. 이는 배지로부터 분비된 뉴블라스틴이 랫트 태아 복중뇌로부터의 도파민성 신경세포군의 생존력에 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 대조적으로, 형질감염된 HiB5 세포로부터 분비된 GDNF와는 달리 뉴블라스틴 형질감염된 HiB5 세포로부터 조성된 배지가 동일한 배양물중의 다른 신경군, 즉 콜린성 신경세포에 미치는 영향은 전혀 관찰되지 않았다(참조예: 도 4A).

실시예 7: 돼지 태아 도파민성 복중뇌 신경세포의 슬라이스 배양물의 생존력에 미치는 뉴블라스틴의 영향

돼지 태아로부터의 복중뇌의 슬라이스 배양물과 함께 동시 배양하는 뉴블라스틴-생성 HiB5pUbi1zNBN22 세포의 영향을 실험한다.

배양물의 제조:

복중뇌를 멸균조건하에 돼지 태아(E28; n=12)로부터 분리하여 400 μm 슬라이스로 잘게 썰고 글루코즈(6.5 mg/ml)를 함유한 냉각된 게이의 평형 염 용액(GIBCO)에 넣었다. 조직 슬라이스를 스토피니에 의해 최초로 개발된 계면 배양 방법[참조: L. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 1991 37 173-182]으로 배양한다.

간단히 설명하면, 슬라이스를 혈청 함유 배지(Gibco BRL)를 갖는 6-웰 평판(코스타)중의 삽입물로서 둔 반세공 막(밀리포어, 0.3 μm; 하나의 VM에 상응하는 8개 슬라이스/막)에 올려 놓았다. 각 웰은 25 mM의 최종 농도로 D-글루코즈로 보충된 1 ml 배지(50% 옵티멤, 25% 말 혈청, 25% 한크의 평형 염 용액(모두 Gibco로부터 입수함)을 함유한다. 0일째에 각 조직 슬라이스에 7000개 형질감염된 HiB5pUbi1zNBN22(뉴블라스틴) 또는 7000개 비형질감염된 HiB5 세포(대조군)를 접종시킨다. 먼저 온도 민감성 온코진으로 불멸화된 HiB5 세포가 증식되도록 하는 33℃의 배양기에서 48시간동안 동시-배양물을 성장시킨 다음 HiB5 세포가 분화하는 37℃의 배양기에 넣었다. 배지를 1주마다 2회 교체한다. 핵분열 억제제 및 항생물질은 어떤 단계에서도 사용되지 않았다.

HPLC 에 의한 도파민의 측정:

시험관내 12일 및 21일째에 배양 배지를 수거하고 전기화학 검출과 함께 HPLC를 사용하여 도파민에 대해 분석한다[참조: W.N. Slooth, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 1995 60 141-49].

조직 처리 및 면역조직화학:

21일째, 배양물을 인산염 완충액중의 4% 파라포름알데하이드중에 60분동안 고정시키고 20% 수크로즈 용액중에서 24시간동안 탈수시킨 다음 동결시키고 저온조에서 20 μm 단편으로 절단한 후(4회 연속) 젤라틴 피복된 현미경 슬라이드상에 올려 놓았다. 한 개 절편을 티로신 하이드록실라제(TH)에 대해 면역염색한다. 간단히 설명하면, 절편을 1% 트리톤 X-100이 함유된 0.05 M 트리스-완충된 염수(TBS, pH 7.4)중에서 세척하고 TBS중에서 10% 태아 소 혈청(FBS, Life Technologies)과 함께 30분동안 배양한다. 이어서, 조직을 10% FBS가 함유된 TBS중에 1:600으로 희석된 모노클로날 마우스 항-TH 항체(Boehringer Mannheim)와 함께 4℃에서 24시간동안 배양한다. 1% 트리톤 X-100가 함유된 TBS중에서 3 x 15분동안 세정한 후, 절편을 10 FBS가 함유된 TBS중에서 1:200으로 희석된 바이오티닐화된 항-마우스 IgG 항체(Amersham)와 함께 60분동안 배양한다. 이어서, 절편을 1% 트리톤 X-100가 함유된 TBS중에서 3 x 15분동안 세척하고 10% FBS가 함유된 TBS중에서 1:200으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Dako)와 함께 60분동안 배양한다. TBS중에서 3 x 15분동안 세척한 후 결합된 항체를 0.01% H₂O₂가 함유된 TBS중에서 0.05% 3,3-디아미노벤지딘(Sigma)으로 처리하여 가시화한다. 마지막으로, 절편을 알코올중에서 탈수시키고 크실렌중에서 세정한 다음 유키트에서 커버 슬립을 덮는다.

세포 계수 및 형태상 분석:

광학 현미경(올리퍼스)을 사용하여 면역반응 TH-ir 신경세포를 정량한다. 잘 보존된 세포 구조 및 명료한 핵에 강한 염색을 나타낸 세포만을 계수한다. 산정은 20배 대물렌즈를 사용하여 4분의 1 배양물 분획마다 세포를 계수하고 이를 근거로 이루어졌다. 세포수는 TH-ir 신경세포내 핵의 평균 직경(6.6±0.2 μm, n=30)을 사용하여 아버크롬비 공식[참조: M. Abercrombie, Anat. Rec. 1946 94 239-47]에 따라 중복 계수하여 교정한다. 핵의 크기는 신경세포 추적 시스템(Neurolucida, MicroBrightField, Inc.)을 사용하여 산출한다.

이들 실험의 결과는 도 5에 나타나 있다. 도 5A-5C는 하기된 바와 같이 HiB5pUbi1zNBN22 세포(뉴블라스틴) 또는 HiB5 세포(대조군)와 동시 배양된 돼지 태아 도파민성 복중뇌 신경세포의 슬라이스 배양물의 기능 및 생존력에 미치는 HiB5pUbi1zNBN22 세포로부터 분비된 뉴블라스틴의 영향을 도시한 것이다. 도 5A 및 도 5B는 각각 DIV12[도파민(pmol/ml)-12일째] 및 DIV21[도파민(pmol/ml-21일째]에 배지에 방출된 도파민을 도시한 것이다. 도 5C는 DIV21에 배양물당 티로신 하이드록실라제 면역반응 세포수[TH-ir 세포/배양물]를 도시한 것이다.

12일째에 HPLC한 결과 HiB5-뉴블라스틴 동시 배양물로부터의 배지는 HiB5-C 동시 배양물로부터의 배지보다 84% 더 많은 도파민을 함유한다(도 5A). 21일째에 차이는 78%였고(도 5B) 세포 계수는 HiB5-뉴블라스틴 동시 배양물이 HiB5-C 동시 배양물보다 66% 더 많은 티로신 하이드록실라제 면역반응 신경세포를 함유하였음을 보여 주었다(P<0.05)(도 5C). 이는 HiB5pUbi1zNBN22 클론으로부터 분비된 뉴블라스틴이 돼지 태아 도파민성 신경세포에 대해 강력한 생존력에 영향을 미침을 가리킨다.

실시예 8: 무혈청 배지중에서 배근 신경절 세포의 생존력

이 실시예는 공지된 신경영양성 인자에 비교하여 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 신경영양성 활성을 보여준다.

경부 탈구로 임신한 암컷 마우스를 치사시킨다. 태아를 배양을 위해 다음과 같이 처리한다.

전기분해로 뾰족해진 텅스텐 침을 사용하여 C57/B16 마우스(덴마크 소재 Mollegaard Breeding)의 표시된 단계로부터 배근 신경절을 절개한다. 태아 신경절을 칼슘 및 마그네슘-유리 한크스 평형 염 용액중에서 0.05% 트립신(Gibco/BRL)과 함께 37℃에서 5분동안 배양한다. 출생후 신경절을 30 내지 45분동안 콜라게나제/디스파제 1mg/ml로 처리하고 이어서 15분동안 트립신/DNAse 0.25%로 처리한다. 트립신 용액을 제거한 후 신경절을 10% 열불활성화된 말 혈청이 함유된 DMEM 10 ml로 1회 세척하고 열-멸균된 파스퇴르 피펫으로 약하게 분쇄시켜 단일 세포 현탁액을 형성한다.

폴리오르니틴(0.5 mg/ml, 밤새) 및 라미닌(20 mg/ml, 4시간동안, Gibco/BRL)으로 미리 피복된 24 웰 평판(Nunc)상에 세포를 플레이팅한다. 신경세포를 2 mM 글루타민, 0.35% 소 혈청 알부민, 60 ng/ml 프로게스테론, 16 mg/ml 푸트레신, 400 ng/ml L-티록신, 38 ng/ml 나트륨 셀레나이트, 340 ng/ml 트리요오도-티로닌, 60 mg/ml 페닐신린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신으로 이루어진 배지중, 37℃의 가습된 5% CO₂ 배양기에서 배양한다.

배양 48시간 후 신경세포는 위상차 광학하에 이들의 양극 형태에 의해 명백히 인식된다. 영양성 인자(10 ng/ml로 신경세포를 플레이팅하기 전에 배양 배지에 첨가됨) 또는 뉴블라스틴 생성 HiB5pUbi1zNBN22 세포로부터 조성된 배지의 유무에 따른 신경세포 생존율을 48시간째에 웰내의 신경세포를 계수하여 평가한다.

이들 실험의 결과는 도 9에 나타나 있다. 도 9에서,

0은 대조 실험(인자의 부재하)을 나타내고;

1은 GDNF의 존재하에 실험을 나타내며;

2는 뉴투린의 존재하에 실험을 나타내고;

3은 본 발명에 따른 뉴블라스틴의 존재하에 실험을 나타내며;

E12는 태아 12일째에 분리된 DRG 세포에 대해 실시된 실험의 데이터를 나타내고;

E16은 태아 16일째에 분리된 DRG 세포에 대해 실시된 실험의 데이터를 나타내고;

P0은 출생당일에 분리된 DRG 세포에 대해 실시된 실험의 데이터를 나타내고;

P7은 출생 후 7일째에 분리된 DRG 세포에 대해 실시된 실험의 데이터를 나타내고;

P15는 출생 후 15일째에 분리된 DRG 세포에 대해 실시된 실험의 데이터를 나타낸다.

이들 결과는 분명하게 본 발명의 신경영양성 인자가 잘 설정된 신경영양성 인자에 필적하거나 이 보다 훨씬 더 양호한 활성을 나타냄을 보여준다.

실시예 9: 흑질 도파민 신경세포에 미치는 뉴블라스틴의 생체내 영향

6-하이드록시도파민 유도된 퇴행으로부터 성숙 흑질 도파민(DA) 신경세포를 보호하기 위한 뉴블라스틴의 능력을 시험하기 위해 본 발명자는 파킨슨 질환의 랫트 모델[참조: Sauer and Oertel, Neuroscience 1994 59, 401-415] 및 뉴블라스틴의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한다.

렌티바이러스 생성:

뉴블라스틴을 암호화하는 렌티바이러스 전달 벡터(pHR'-뉴블라스틴)을 생성하기 위해, 뉴블라스틴 cDNA로부터의 1331 bp BamH1 단편을 pSL301(Invitrogen)의 BamH1/Bgl II 부위에 아클로닝시킨다. 이 작제물로부터 1519 bp BamH1/Xho1 단편을 절단하고 마못 간염 바이러스 해독 후 단편을 갖는 pHR'[참조: Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors; J. Virol 1999 73 (4) 2886-2892]의 BamH1/Xho1 부위에 연결시킨다. pHR-GDNF를 형성하기 위해 pUbi1z-GDNF로부터의 701 bp BamH1/Xho1 단편을 pHR'의 BamH1/Xho1 부위에 연결시킨다.

렌티바이러스 벡터의 제조는 예를 들면 문헌[참조: Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D: "Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo; Nat. Biotechnol. 1997 15(9) 871-875]에 기술되어 있다. 간단히 설명하면, 전달 작제물 및 헬퍼 플라스미드 pR8.91 및 pMDG로 293T 세포를 동시 형질감염시킨다. 배지에 방출된 비리온을 형질감염 후 48시간 및 72시간 경과하여 수거한다. 바이러스를 농축하기 위해 배지를 141,000 g로 1.5시간동안 원심분리하고 펠렛을 DMEM중에 용해시킨다. 녹색 형광 단백질("GFP")에 대한 유전자를 갖는 대조군의 역가는 293T 세포에서의 GFP 형광에 의해 10⁸ 형질전환 단위(TU)/ml인 것으로 결정된다. RNA 슬롯 블롯 기술[참조: von Schwedler U, Song J, Aiken C, Trono D: "Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells"; J. Virol. 1993 67(8) 4945-4955]을 사용하여 바이러스 입자 역가를 결정한다. GDNF 상등물 및 뉴블라스틴 상등물에서 입자는 GFP 상등물에 비하여 10배 적었다.

수술 절차:

동물과 연관된 모든 작업은 룬트 대학의 실험동물 사용 윤리위원회에 의해 규정된 규칙에 따라 실시된다.

총 21마리의 어린 성숙 암컷 스프라그-돌리 랫트(스웨덴 스톡홀름 소재 비 앤드 케이 유니버설)가 사용되었고 이들은 먹이와 물을 자유롭게 공급받으면서 12시간씩 주야를 주기로 수용된다. 문헌[참조: Sauer and Oertel, Neuroscience 1994 59 401-415]에 따라 상해를 입히기 3주전에 역행성 라벨링 및 6-OHDA 상해를 실시한다. 간단히 설명하면, 에퀴데신(0.3 ml/100 g)으로 마취한 랫트에 역행성 프로브 플루오로-골드(FG; 이글우드 소재 Fluorochrome, Inc.)의 2% 용액(0.9% NaCl중에 용해됨) 0.2 μl를 양쪽으로 주사한다. 주사는 2 μl 하밀톤 주사기를 사용하여 AP=+0.5 mm, 전정에 대하여 ML=±3.4 mm, 경막에 대하여 DV=-5.0 mm 및 0.0 mm로 설정된 절치능의 좌표에서 이루어졌다. 또한, 주사기를 빼기 5분전에 다른 주사기로 0.05 μl/분를 주사한다.

FG를 주사한 후 14일이 경과하여, 녹색 형광 단백질(GFP), 뉴블라스틴 또는 GDNF에 대한 유전자를 갖는 렌티바이러스 벡터를 동물에 총 5회 주입(1 μl/주입)한다. 4회 주입은 다음의 좌표에서 침관을 따라 선조체내로 실시된다: AP=+1.0 mm, ML=-2.6 mm, DV₁=5.0 mm, DV₂=-4.5 mm 및 AP=0.0 mm, ML=-3.7 mm, DV₁=-5.0 mm, DV₂=-4.5 mm. 흑질위 주입이 AP=-5.2 mm, ML=-2.0 mm, DV₁=-6.3 mm에서 이루어졌다. 치능은 -2.3 mm로 설정된다.

역행성 라벨링 후 21일이 경과하고 렌티바이러스 주사 후 7일이 경과하여 동물을 재마취시키고 10 μl 하밀톤 주사기를 사용하여 FG 주입과 동일한 위치에서 우측 선조체내로 1회 주입의 20 μg 6-OHDA(Sigma; 유리 염기로서 계산되었고 0.02% 아스코르빈산이 보충된 3 μl 빙냉 염수중에 용해됨)를 주사한다. 주사 속 도는 1 μl/분이었고 주사바늘을 빼기 3분전에 다른 주사기로 주입된다.

조직 처리:

6-OHDA 주사 후 21일 경과하여 동물을 클로랄 무수물로 완전히 마취시키고 1분동안 염수(pH 7.4, 실온)에 이어 200 ml 빙냉 포름알데하이드 용액(0.1 M 인산염 완충액, pH 7.4중의 4% 파라포름알데하이드)을 심장을 통해 관류시킨다. 뇌를 절개하고 동일한 고정제에서 3 내지 4시간동안 고정시킨 다음 25% 수크로즈/0.1 M 인산염 완충액으로 48시간동안 옮겨 놓는다. 동결 마이크로톰상에서 선조체 및 흑질(SN)을 40 μm 절편으로 4회 절단한다.

SN 내 도파민성 신경세포의 정량 분석:

SN 컴팍타 부에서 표지된 FG의 수를 전술한 바와 같이 관찰자에 의해 평가된다[참조: Sauer and Oertel, Neuroscience 1994 59, 401-415]. 간단히 설명하면, 부시색의 내측 종단 핵(MTN; Paxinos and Watson(1997)의 표해에서 -5.3)의 평면 주변 가운데 3개의 연속 절편을 사용하였고 MTN에 측면으로 표지/염색된 모든 신경세포를 40배율에서 계수한다(n=6-7/그룹). FG-표지된 신경세포는 이들이 330 nm에서 에피-조도로 형광을 발휘하고 신경 윤곽을 나타내며 하나 이상의 신경 과정을 진행하는 경우 포함된다.

GFP를 갖는 렌티바이러스가 주입된 동물의 병소 쪽에서 FG-양성 흑질 신경세포의 수가 온전한 쪽에서의 18% 정도로 감소된다. 대조적으로, 렌티-뉴블라스틴이 주사된 동물은 FG-양성 흑질 신경세포의 수의 거의 완전한 보호를 나타낸다(89%). 이는 역행적으로 표지된 신경세포의 87%가 병소 쪽에 남아있었던 렌티-GDNF 처리된 동물만큼 효율적이었다. 이는 뉴블라스틴이 상해입은 성숙 흑질 도파민 신경세포에 대해 강력한 생존 인자이며 GDNF만큼 효능적임을 보여준다.

도 6은 흑질 도파민 신경세포에 미치는 렌티바이러스-생성된 뉴블라스틴의 생체내 효과를 도시한 것이다. 암컷 스프라그 돌리 랫트에서 SN 컴팍타부의 신경세포를 우측 선조체에 6-하이드록시도파민(6-OHDA)을 일회 주사하기 3주전에 플루오로골드(FG)로 역행적으로 라벨링한다. 6-OHDA 주사하기 1주일 전에, 도 6에 표시된 바와 같이 뉴블라스틴을 발현하는 렌티바이러스 벡터[뉴블라스틴], GDNF을 발현하는 렌티바이러스 벡터[GDNF] 또는 녹색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터[GFP]를 동물에 주사한다. 6-OHDA 주사 후 21일이 경과하여, 선조체의 양쪽에서 FG-표지된 신경세포의 수를 결정한다. 도 6은 세 동물그룹에서 선조체의 온전한 쪽(좌측)에 대한 상해된 쪽(우측)의 FG-표지된 신경세포의 백분율[%FG 병소 쪽/온전한 쪽]을 보여준다.

실시예 10: 항체의 생성

뉴블라스틴에 대한 항체를 제조하기 위해 두 마리 토끼를 3주 간격으로 운반체 단백질에 결합된 펩타이드 1: CRPTRYEAVSFMDVNST(서열 9의 아미노산 108-124) 또는 펩타이드 2: ALRPPPGSRPVSQPC(서열 9의 아미노산 93-107)로 면역화한다. 각 펩타이드에 대해 두 마리 토끼를 0, 3, 6 및 10주 째에 면역화하고 7 및 11주 째에 혈액을 채취한다. 이차 혈액을 펩타이드 친화성 컬럼을 통해 정제한다. 이 항체는 펩타이드에 따라 Ab-1 및 Ab-2로 명명한다.

웨스턴 블롯 :

뉴블라스틴에 대한 cDNA로 안정하게 형질감염된 2 x 10⁶개 HiB5 세포(Hib5pUbi1zNBN22) 또는 미형질감염된 HiB5 세포를 N₂가 보충된 무혈청 배지(Gibco)중에서 밤새 배양한다. 배지를 5 kDa의 차단막(매사추세츠 베드포드 소재 Millipore)으로 작은 농축기에서 농축시킨다. 농축된 샘플에 5 x 램플리 샘플 완충액을 첨가하고 95℃로 5분동안 가열한다. 샘플을 15% 아크릴아미드 겔상에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 분리하고 PVDF-막으로 옮긴다. 나머지 단백질-결합 부위를 0.1% 트윈-20이 함유된 PBS중에서 5% 무지방 분유로 차단시킨다. 막을 뉴블라스틴 항체(1:1000)와 밤새 배양한 후 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 이차 항-토끼 또는 항-마우스 IgG 항체(1:2000)와 배양한다.

면역염색을 제조업자(Amersham)의 지시에 따라 증강된 화학발광 플러스(ECL+)를 사용하여 가시화한다. 이들 실험의 결과는 도 3 및 실시예 5에 나타나 있다.

본 발명자는 또한 표준 기술을 사용하여 다음의 펩타이드에 대하여 토끼 폴리클로날 항체를 유도한다:

펩타이드 R27: GPGSRARAAGARGC (서열 9의 아미노산 30-43);

펩타이드 R28: LGHRSDELVRFRFC (서열 9의 아미노산 57-70);

펩타이드 R29: CRRARSPHDLSL (서열 9의 아미노산 74-85);

펩타이드 R30: LRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 아미노산 94-107); 및

펩타이드 R31: STWRTVDRLSATAC (서열 9의 아미노산 123-136).

C-말단에 비교적 가까운 펩타이드 R30 및 R31만이 웨스턴 블롯에서 환원조건하에 변성된 단백질을 인식한다.

<110> NSGENE A/S <120> Neurotrophic factors <130> 5-2000-054854-4 <150> DK 1998 00904 <151> 1998-07-06 <150> US 60/092,229 <151> 1998-07-09 <150> DK 1998 01048 <151> 1998-08-19 <150> US 60/097,774 <151> 1998-08-25 <150> DK 1998 01265 <151> 1998-10-06 <150> US 60/103,908 <151> 1998-10-13 <150> US 09/347,613 <151> 1999-07-02 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 865 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (120)..(719) <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(119) <220> <221> 3'UTR <222> (721)..(865) <220> <221> sig_peptide <222> (120)..(179) <220> <221> mat_peptide <222> (405)..(719) <220> <221> misc_structure <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: Glycosylated Asparagine at Asn87 <220> <221> misc_structure <222> (426)..(623) <223> DISULFID - Cys8-Cys73 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (507)..(707) <223> DISULFID: Cys35-Cys101 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (519)..(713) <223> DISULFID: Cys39-Cys103 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (616)..(619) <223> DISULFID: Cys72-Cys72 interchain disulfide bridge <400> 1 ctaggagccc atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc 60 tccccaagcc cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgc 119 atg cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg ctg agc agc 167 Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser -95 gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct gcc ccc cgc 215 Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg -79 gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac ctg ccg ggg 263 Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly -63 gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg ccg cgc cgc 311 Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg -47 aga cac ttc tcg gcc cgc gcc ccc gcc gcc tgc acc ccc atc tgc tct 359 Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser -31 tcc ccg cgg gtc cgc gcg gcg cgg ctg ggg ggc cgg gca gcg cgc tcg 407 Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser -15 ggc agc ggg ggc gcg ggg tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg 455 Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val 2 cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt ttc cgc 503 Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg 18 ttc tgc acc ggc tcc tgc ccg cgc gcg cgc tct cca cac gac ctc agc 551 Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser 34 ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc 599 Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser 50 cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa gcg gtc 647 Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val 66 tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc ctc tcc 695 Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser 82 gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc t gagggctcgc tccagggctt 740 Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 98 tgcagactgg acccttaccg gtggctcttc ctgcctggga ccctcccgca gagtcccact 800 agccagcggc ctcagccagg gacgaaggcc tcaaagctga gaggcccctg ccggtgggtg 860 atgga 865 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser -95 Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg -79 Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly -63 Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg -47 Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser -31 Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser -15 Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val 2 Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg 18 Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser 34 Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser 50 Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val 66 Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser 82 Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 98 <210> 3 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)..(717) <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(6) <220> <221> 3'UTR <222> (718)..(861) <220> <221> sig_peptide <222> (7)..(174) <220> <221> mat_peptide <222> (298)..(717) <220> <221> mat_peptide <222> (370)..(717) <220> <221> mat_peptide <222> (379)..(717) <220> <221> misc_structure <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: glycosylated Asparagine as Asn122 <220> <221> misc_structure <222> (424)..(621) <223> DISULFID: Cys43-Cys108 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (505)..(705) <223> DISULFID: Cys70-Cys136 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (517)..(711) <223> DISULFID: Cys74-Cys138 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (616)..(618) <223> DISULFID: Cys107-Cys107 interchain disulfide bridge <400> 3 gagccc atg ccc ggc ctg atc tca gcc cga gga cag ccc ctc ctt gag 48 Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu -97 gtc ctt cct ccc caa gcc cac ctg ggt gcc ctc ttt ctc cct gag gct 96 Val Leu Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala -83 cca ctt ggt ctc tcc gcg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct 144 Pro Leu Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala -67 ctg gct ctg ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc 192 Leu Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro -51 cgc agc cct gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc 240 Arg Ser Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro -35 gcc ggc cac ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga 288 Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg -19 gcc cgg cgg ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct 336 Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro -3 gca ccc cca tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg 384 Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly 14 ggc ccg ggc aac cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg 432 Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu 30 cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc 480 Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser 46 gac gag ctg gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg 528 Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala 62 cgc tct cca cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc 576 Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala 78 ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga 624 Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg 94 ccc acg cgc tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg 672 Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp 110 aga acc gtg gac cgc ctc tcc gcc aac ccc tgc ggc tgc ctg ggc tga 720 Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly 126 gggctcgctc cagggctttg cagactggac ccttaccggt ggctcttcct gcctgggacc 780 ctcccgcaga gtcccactag ccagcggcct cagccaggga cgaaggcctc aaagctgaga 840 ggcccctgcc ggtgggtgat g 861 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu Val Leu -97 Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala Pro Leu -81 Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala -65 Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser -49 Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly -33 His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg -17 Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro -1 Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro 16 Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser 32 Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu 48 Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser 64 Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg 80 Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr 96 Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr 112 Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly 128 <210> 5 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Wherein Xaa at position 134 designates Asn or Thr, and Yaa at position 135 designates Ala or Pro <400> 5 Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro 1 Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 17 Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln 33 Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 49 Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro 65 His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro 81 Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 97 Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val 113 Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys Gly Cys Leu Gly 129 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Wherein Xaa at position 110 designates Asn or Thr, and Yaa at position 111 designates Ala or Pro <400> 6 Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala 1 Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly 17 Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly 33 Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu 49 Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser 65 Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp 81 Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys 97 Gly Cys Leu Gly 113 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Wherein Xaa at position 107 designates Asn or Thr, and Yaa at position 108 designates Ala or Pro <400> 7 Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 17 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 33 Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 49 Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 81 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys Gly Cys Leu 97 Gly 113 <210> 8 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (58)..(717) <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(57) <220> <221> 3'UTR <222> (718)..(861) <220> <221> sig_peptide <222> (58)..(174) <220> <221> mat_peptide <222> (298)..(717) <220> <221> mat_peptide <222> (370)..(717) <220> <221> mat_peptide <222> (379)..(717) <220> <221> misc_structure <222> (661)..(663) <223> CARBOHYD: glycosylated asparagine at Asn122 <220> <221> misc_structure <222> (424)..(621) <223> DISULFID: Gly43-Gly108 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (505)..(705) <223> DISULFID: Gly70-Gly136 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (517)..(711) <223> DISULFID: Gly74-Gly138 disulfide bridge <220> <221> misc_structure <222> (616)..(618) <223> DISULFID: Gly107-Gly107 interchain disulfide bridge <400> 8 aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag 57 atg gaa ctt gga ctt gga ggc ctc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg 105 Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp -80 cct agg cgg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg 153 Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu -64 ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct 201 Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro -48 gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac 249 Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His -32 ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg 297 Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg -16 ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct gca ccc cca 345 Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro 1 tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc 393 Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 17 agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag 441 Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln 33 ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg 489 Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 49 gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca 537 Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro 65 cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg 585 His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro 81 ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc 633 Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 97 tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg 681 Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val 113 gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tga gggctcgctc 730 Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 129 cagggctttg cagactggac ccttaccggt ggctcttcct gcctgggacc ctcccgcaga 790 gtcccactag ccagcggcct cagccaggga cgaaggcctc aaagctgaga ggcccctacc 850 ggtgggtgat g 861 <210> 9 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp -80 Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu -64 Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro -48 Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His -32 Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg -16 Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro 1 Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 17 Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln 33 Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 49 Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro 65 His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro 81 Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 97 Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val 113 Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 129 <210> 10 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARBOHYD <222> (122) <223> glycosylated asparagine <400> 10 Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro 1 Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 17 Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln 33 Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu 49 Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro 65 His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro 81 Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg 97 Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val 113 Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 129 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARBOHYD <222> (98) <223> glycosylated asparagine <400> 11 Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly 17 Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly 33 Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu 49 Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser 65 Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp 81 Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys 97 Gly Cys Leu Gly 113 <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARBOHYD <222> (95) <223> glycosylated asparagine <400> 12 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 17 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 33 Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 49 Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 81 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 97 Gly 113 <210> 13 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc ggcccgtcag 60 ccagccctgc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc tt 102 <210> 14 <211> 220 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <400> 14 ggccaccgct ccgacgagct gatacgtttc cgcttctgca gcggctcgtg ccgccgagca 60 cgctcccagc acgatctcag tctggccagc ctactgggcg ctggggccct acggtcgcct 120 cccgggtccc ggccgatcag ccagccctgc tgccggccca ctcgctatga ggccgtctcc 180 ttcatggacg tgaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc 220 <210> 15 <211> 2136 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <220> <221> CDS <222> (975)..(1646) <400> 15 gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60 tggggtcttc tccaaatgtc tagcccccac ctagagggac ctagcctagc cagcggggac 120 cggatccgga gggtggagcg gccaggtgag ccctgaaagg tggggcgggg cgggggcgct 180 ctgggcccca ccccgggatc tggtgacgcc ggggctggaa tttgacaccg gacggcggcg 240 ggcaggaggc tgctgaggga tggagttggg ctcggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300 gccagcaaca agtccctcgg gccccagccc tcgctgcgac tggggcttgg agccctgcac 360 ccaagggcac agaccggctg ccaaggcccc acttttaact aaaagaggcg ctgccaggtg 420 cacaactctg ggcatgatcc acttgagctt cgggggaaag cccagcactg gtcccaggag 480 aggcgcctag aaggacacgg accaggaccc ctttggtatg gagtgaacgc tgagcatgga 540 gtggaaggaa ctcaagttac tactttctcc aaccaccctg gtaccttcag ccctgaagta 600 cagagcagaa gggtcttaga agacaggacc acagctgtgt gagtctcccc cctgaggcct 660 tagacgatct ctgagctcag ctgagctttg tttgcccatc tggagaagtg agccattgat 720 tgaccttgtg gcatcgcgaa ggaacaggtc ctgccaagca cctaacacag agagcaaggt 780 tctccatcgc agctaccgct gctgagttga ctctagctac tccaacctcc tgggtcgctt 840 cgagagactg gagtggaagg aggaataccc caaaggataa ctaactcatc tttcagtttg 900 caagctgccg caggaagagg gtggggaaac gggtccacga aggcttctga tgggagcttc 960 tggagccgaa agct atg gaa ctg gga ctt gca gag cct act gca ttg 1007 Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu 1 tcc cac tgc ctc cgg cct agg tgg cag tca gcc tgg tgg cca acc cta 1055 Ser His Cys Leu Arg Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu 12 gct gtt cta gcc ctg ctg agc tgc gtc aca gaa gct tcc ctg gac cca 1103 Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro 28 atg tcc cgc agc ccc gcc gct cgc gac ggt ccc tca ccg gtc ttg gcg 1151 Met Ser Arg Ser Pro Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala 44 ccc ccc acg gac cac ctg cct ggg gga cac act gcg cat ttg tgc agc 1199 Pro Pro Thr Asp His Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser 60 gaa aga acc ctg cga ccc ccg cct cag tct cct cag ccc gca ccc ccg 1247 Glu Arg Thr Leu Arg Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro 76 ccg cct ggt ccc gcg ctc cag tct cct ccc gct gcg ctc cgc ggg gca 1295 Pro Pro Gly Pro Ala Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala 92 cgc gcg gcg cgt gca gga acc cgg agc agc cgc gca cgg acc aca gat 1343 Arg Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp 103 gcg cgc ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg agc gcg ctc 1391 Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu 124 ggc cta ggc cac agc tcc gac gag ctg ata cgt ttc cgc ttc tgc agc 1439 Gly Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser 140 ggc tcg tgc cgc cga gca cgc tcc cag cac gat ctc agt ctg gcc agc 1487 Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser 156 cta ctg ggc gct ggg gcc cta cgg tcg cct ccc ggg tcc cgg ccg atc 1535 Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile 172 agc cag ccc tgc tgc cgg ccc act cgc tat gag gcc gtc tcc ttc atg 1583 Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met 188 gac gtg aac agc acc tgg agg acc gtg gac cac ctc tcc gcc act gcc 1631 Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala 204 tgc ggc tgt ctg ggc tgag gatgatctat ctccaagcct ttgcacacta 1680 Cys Gly Cys Leu Gly 220 gacccatgtg ttgccctacc tggaacagct ccaccgggcc tcactaacca ggagcctcaa 1740 ctcagcagga tatggaggct gcagagctca ggccccaggc cggtgagtga cagacgtcgt 1800 cggcatgaca gacagagtga aagatgtcgg aaccactgac caacagtccc aagttgttca 1860 tggatcccag ctctacagac aggagaaacc tcagctaaag agaactcctc tgggagaatc 1920 cagaaatggc cctctgtcct ggggaatgaa ttttgaagag atatatatac atatatacat 1980 tgtagtcgcg ttgctggacc agcctgtgct gaaaccagtc ccgtgttcac ttgtggaagc 2040 cgaagcccta tttattattt ctaaattatt tatttacttt gaaaaaaaac ggccaagtcg 2100 gcctcccttt agtgagggtt aatttgtgat cccggg 2136 <210> 16 <211> 224 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 16 Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg 1 Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu 17 Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro 33 Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His 49 Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg 65 Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala 81 Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala 97 Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg 113 Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser 129 Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg 145 Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly 161 Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys 177 Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr 193 Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 209 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 17 cctggccagc ctactggg 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 18 aaggagaccg cttcgtagcg 20 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 19 atggaacttg gacttgg 17 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 20 tccatcaccc accggc 16 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 21 ggccaccgct ccgacgag 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 22 ggcggtccac ggttctccag 20 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 23 ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc 29 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 24 catcacccac cggcaggggc ctctcag 27 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 25 gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 26 ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc 34 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hybridization probe <400> 27 ncaggtggtcc gtggggggcg ccaagaccgg 31 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 28 ctaggagccc atgccc 16 <210> 29 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 atggctggag gaccgggatc tcgtgctcgt gcagcaggag cacgtggctg tcgtctgcgt 60 tctcaactag tgccggtgcg tgcactcgga ctgggacacc gttccgacga actagtacgt 120 tttcgttttt gttcaggatc ttgtcgtcgt gcacgttctc cgcatgatct atctctagca 180 tctctactag gagccggagc actaagaccg ccgccgggat ctagacctgt atctcaacct 240 tgttgtagac ctactagata cgaagcagta tctttcatgg acgtaaactc tacatggaga 300 accgtagata gactatctgc aaccgcatgt ggctgtctag gatgataata g 351 <210> 30 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcactcga gcggccatat cgacgacgac 60 gacaaggctg gaggaccggg atctcgtgct cgtgcagcag gagcacgtgg ctgtcgtctg 120 cgttctcaac tagtgccggt gcgtgcactc ggactgggac accgttccga cgaactagta 180 cgttttcgtt tttgttcagg atcttgtcgt cgtgcacgtt ctccgcatga tctatctcta 240 gcatctctac taggagccgg agcactaaga ccgccgccgg gatctagacc tgtatctcaa 300 ccttgttgta gacctactag atacgaagca gtatctttca tggacgtaaa ctctacatgg 360 agaaccgtag atagactatc tgcaaccgca tgtggctgtc taggatgata atag 414 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 31 aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 39 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 32 ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 39 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gagcgagccc tcagcc 16

Claims (98)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. a) 서열 1의 뉴클레오타이드 서열 또는

    b) 발현시, 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅와 90% 이상 상동성을 갖는 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 개방형 판독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 뉴블라스틴(Neublastin) 핵산.
69. 제68항에 있어서, 암호화된 폴리펩타이드가 서열 2의 AA₁-AA₁₀₅ 및 서열 5, 6, 및 7로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 핵산.
70. 제68항에 있어서, 암호화된 폴리펩타이드가 서열 9의 서열을 갖는 핵산.
71. 제68항에 있어서, 서열 3의 서열을 포함하는 핵산.
72. 제68항에 있어서, 서열 8의 서열을 포함하는 핵산.
73. 삭제
74. 삭제
75. 제68항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
76. 제68항의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 시험관내에서 당해 핵산으로 부터 발현되도록 유도하는 단계를 포함하는, 제75항의 벡터의 사용 방법.
77. 제68항의 핵산 및/또는 제75항의 발현 벡터로 시험관내에서 형질전환된 세포.
78. 제77항에 있어서, 진핵생물 세포인 세포.
79. 제78항에 있어서, 포유동물 세포, 진균 세포 및 효모 세포로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 세포.
80. 제79항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 세포, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, 및 사람 신경 줄기세포로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 세포.
81. 서열 2의 아미노산 1 내지 105와 90% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
82. 제81항에 있어서, 서열 2, 4, 5, 6, 7 및 9에 제시된 아미노산 서열중의 어느 하나를 포함하는 폴리펩타이드.
83. 제81항에 있어서, 당화된 폴리펩타이드.
84. 제81항에 있어서, 제68항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
85. 제81항의 폴리펩타이드를 뉴블라스틴 신경영양성 인자 핵산으로부터 발현시키는 단계를 포함하는, 제81항의 폴리펩타이드의 제조 방법.
86. 제85항에 있어서, 뉴블라스틴 신경영양성 인자 핵산을 포함하는 세포를 제81항의 폴리펩타이드의 생산을 허용하는 배양 배지중에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
87. 제86항에 있어서, 폴리펩타이드를 배양 배지로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
88. 제87항의 방법에 의해 수득된 정제된 폴리펩타이드.
89. 제81항의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 말초신경, 수질 및/또는 척수의 외상성 장애를 포함하는 신경세포의 외상성 장애, 뇌 허혈성 신경세포의 손상, 신경병증, 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 근위축성축색경화증 또는 기타 신경퇴행성 질환, 및 치매와 연관된 기억 손상을 포함하는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
90. 제89항에 있어서, 신경병증이 말초 신경병증인 약제학적 조성물.
91. 서열 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 또는 28에 제시된 서열 중의 어느 하나로 이루어진 PCR-프라이머 핵산 서열.
92. 서열 1 또는 3에 제시된 핵산 서열중 어느 하나를 함유하는 세포를 폴리펩타이드의 생산을 허용하는 조건하에서 배양하고 당해 폴리펩타이드를 배양 배지로부터 회수함을 포함하는, 서열 2, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩타이드중 어느 하나의 제조 방법.
93. (a) 발현시 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포내로 도입하거나, 또는 조절 서열을 상동성 재조합에 의해 세포내로 도입하여 조절 서열이 내인성 뉴블라스틴 유전자의 발현을 조절하여, 뉴블라스틴 생성 세포를 제조하고,

    (b) 상기 뉴블라스틴 생성 세포를 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 배양 조건하에서 배양함을 포함하여, 제81항의 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
94. 서열 29 또는 30에 제시된 서열을 포함하는, 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 합성 유전자.
95. 하기 서열중 어느 하나로 이루어진 뉴블라스틴 펩타이드:

    GPGSRARAAGARGC (서열 9의 AA 30-43);

    LGHRSDELVRFRFC (서열 9의 AA 57-70);

    CRRARSPHDLSL (서열 9의 AA 74-85);

    LRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 AA 94-107);

    STWRTVDRLSATAC (서열 9의 AA 123-136);

    CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (서열 9의 AA 43-70);

    CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 AA 74-107);

    CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (서열 9의 AA 108-136);

    CRPTRYEAVSFMDVNST (서열 9의 AA 108-124) 및

    ALRPPPGSRPVSQPC (서열 9의 AA 93-107).
96. 제95항의 펩타이드중 어느 하나에 대해 생성되는 항체.
97. 삭제
98. 삭제

Images