NO330689B1

NO330689B1 - Isolert neublastin polynukleotid, ekspresjonsvektor, isolert vertscelle, polypeptid, fremgangsmate for fremstilling av et polypeptid, preparat samt polypeptid for anvendelse som et medikament.

Info

Publication number: NO330689B1
Application number: NO20010088A
Authority: NO
Inventors: Teit E Johansen; Nikolaj Blom; Claus Hansen
Original assignee: Nsgene As
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2011-06-14
Also published as: EA200100110A1; NO20010088D0; CN1311818A; BR9911908A; NO20010088L; IL140259A0; IL140259A; CZ303358B6; PL345950A1; CZ200153A3; PL198599B1; EA003734B1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert neublastin polynukleotid, ekspresjonsvektor, isolert vertscelle, polypeptid, fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, preparat samt polypeptid for anvendelse som et medikament.

Bakgrunn

Neurotrofiske faktorer er naturlig forekommende proteiner som fremmer overlevelse, opprettholder fenotypisk differensiering, forhindrer degenerering og øker aktiviteten til nerveceller og -vev. Neurotrofiske faktorer er isolert fra nervevev og fra ikke-nervevev som er innervert av nervesystemet, og er blitt klassifisert i funksjonelt og struktu-relt beslektede grupper, også henvist til som familier, super-familier eller underfamilier. Blant neurotrofisk faktor-superfamiliene er fibroblastvekstfaktor-, neurotrofin- og transformerende vekstfaktor-p(TGF-p)-superfamiliene. Individuelle arter av neurotrofiske faktorer skjelnes fra hverandre ved deres fysiske struktur, deres interaksjon med sine komposittreseptorer og deres virkninger på forskjellige typer av nerveceller. Klassifisert innenfor TGF-(3-superfamilien

(Massague, et al., Trends in Cell Biology, 1994, 4, 172-178)

er gliacellelinjeavledede neurotrofisk faktor-ligander ("GDNF", WO 93/06116), som omfatter GDNF, persephin ("PSP", Milbrandt et al., Neuron, 1998, 20, 245-253) og neurturin ("NTN", WO 97/08196). Ligandene i GDNF-underfamilien har til felles deres evne til å indusere signalgiving gjennom RET-reseptortyrosinkinasen. Disse tre ligandene i GDNF-underfamilien atskiller seg i sine relative affiniteter for en familie av neurotrofiske reseptorer, GFR-reseptorene.

Nucleotide Sequence Database EMBL, Accession Number AA844072 beskriver en EST-nukleotidsekvensmed henholdsvis 86% og 88,8% sekvensidentitet med deler av sekvensene med identifikasjonsnummer 1 og 3 i foreliggende oppfinnelse.

På grunn av påvirkningene av neurotrofiske faktorer på nervevev er det fortsatt et behov for å identifisere og karakterisere ytterligere neurotrofiske faktorer for diagnos-tisering og behandling av forstyrrelser i nervesystemet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert neublastin polynukleotid, kjennetegnet ved at den er utvalgt fra gruppen bestående av: a) et polynukleotid som omfatter nukleotidsekvensen SEQ ID NO: 1, b) et polynukleotid som omfatter en åpen leseramme som koder for ekspresjon av et neublastinpolypeptid eller et polypeptid avledet derfra, hvori den modne delen av polypeptidet har en likhetsgrad med aai-aaiosi SEQ ID NO: 2 på minst 90 %, c) et polynukleotid som under hybridisering under høye stringens løsningsbetingelser spesifikt hybridiserer til

nukleinsyren som har nukleotidsekvensen SEQ ID NO: 1,

d) et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som er minst 80 % lik polynukleitidsekvensen angitt som SEQ ID NO: 1,

hvori det kodede polypeptidet har neurotrofisk aktivitet.

Også omfattet av oppfinnelsen er ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også isolert vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet av oppfinnelsen er polypeptid, kjennetegnet ved at den modne del av polypeptidet har en likhetsgrad med aminosyrene 1-105 i SEQ ID NO: 2 på minst 90%, hvori polypeptidet har neurotrofisk aktivitet.

Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnet med å uttrykke polypeptidet fra et neublastin-neurotrofisk faktor-polynukleotid ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet av oppfinnelsen er preparat, kjennetegnet ved at det omfatter polypeptidet ifølge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Til slutt omfatter oppfinnelsen polypeptid ifølge oppfinnelsen for anvendelse som et medikament.

Utfyllende informasjon

Denne oppfinnelsen vedrører en ny neurotrofisk faktor som her er kalt "neublastin" eller "NBN". Neublastin er klassifisert i GDNF-underfamilien ettersom den har til felles homologiområder med andre GDNF-ligander (se tabellene 3 og 4 nedenunder), og på grunn av dens evne til å reagere med RET (se f.eks. Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 1999, 13, 313-325), neublastin er en ny og unik neurotrofisk faktor. I motsetning til andre GDNF-ligander utviser neublastin høy affinitet for GFRa3-RET-reseptorkomplekset og har unike under-områder i sin aminosyresekvens.

Et "neublastinpolypeptid" er, slik det her er brukt, et polypeptid som har neurotrofisk aktivitet (f.eks. som beskrevet i eksemplene 6, 7, 8 og 9), og omfatter de polypeptidene som har en aminosyresekvens som har minst 70 % homologi med human-"neublastin"-polypeptidene angitt i AA-95-AA105i SEQ ID NO: 2, AA1-AA105i SEQ ID NO: 2, AA-97-AA140i SEQ ID NO: 4, AA-41-AAno i SEQ ID NO: 4 ("pro"), AAi-AAi40i SEQ ID NO: 4, AA_8o-AAi4oi SEQ ID NO: 9 ("villtype"-pre-pro) , AA-41-AA140i SEQ ID NO: 9 (pro), AAi-AAi40i SEQ ID NO: 5 (modent 140AA) , AAi-AAn6 i SEQ ID NO: 6 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 7 (modent 113AA) , AAi-AA^o i SEQ ID NO: 10 (modent 14 0AA) , AAi-AAn6 i SEQ ID NO: 11 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 12 (modent 113AA) og varianter og derivater derav. I tillegg omfatter denne oppfinnelsen de polypeptidene som har en aminosyresekvens som har minst 70% homologi med de murine "neublastin"-polypeptidene som er angitt i AA1-AA224i SEQ ID NO: 16.

Fortrinnsvis har den C-terminale sekvens i de ovenfor identifiserte neublastinpolypeptider en aminosyresekvens som angitt i AA72-AA105i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA107-AA140i SEQ ID NO: 9), mer foretrukket AA41-AA105i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA76-AAi40i SEQ ID NO: 9) , eller aminosyresekvensen angitt i AA191-AA224i SEQ ID NO: 16.

Det er dessuten foretrukket at neublastinpolypeptidet bibeholder de 7 konserverte Cys-restene som er karakteristiske for GDNF-familien og TGF-(3-superf amilien.

Fortrinnsvis har neublastinpolypeptidet en aminosyresekvens som er mer enn 85 % homolog, mest foretrukket mer enn 95 % homolog, med de ovenfor nevnte sekvenser (dvs. AA-95-AA105i SEQ ID NO: 2, AA1-AA105i SEQ ID NO: 2, AA-97-AA140i SEQ ID NO: 4, AAi-AAi4o i SEQ ID NO: 4, AA-4i-AAi40 i SEQ ID NO: 4, AA-8o-AAi40 i SEQ ID NO: 9 ("villtype"-pre-pro) , AA-41-AA140i SEQ ID NO: 9 (pro), AA1-AA140i SEQ ID NO: 5 (modent 140AA) , AAi-AAn6i SEQ ID NO: 6 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 7 (modent 113AA) , AA1-AA140i SEQ ID NO: 10 (modent 14 0AA) , AAi-AAu6i SEQ ID NO: 11 (modent 116AA) , AAi-AA113i SEQ ID NO: 12 (modent 113AA) ) og AA1-AA224i SEQ ID NO: 16.

En "neublastinnukleinsyre" er, som anvendt her, et polynukleotid som koder for et neublastinpolypeptid. Følgelig er en isolert neublastinnukleinsyre et polynukleotidmolekyl som har en åpen leseramme med nukleotidkodoner som, når den eksponeres for de passende komponentene som trengs for translasjon, vil kode eller kode for et neublastinpolypeptid. Neublastinnukleinsyrer ifølge oppfinnelsen kan være RNA eller DNA, f.eks. genom-DNA, eller DNA som er komplementært til og/eller transkribert fra et neublastin-mRNA ("cDNA"). En neublastinnukleinsyre ifølge oppfinnelsen omfatter således videre polynukleotidmolekyler som hybridiserer med spesifisitet under strenge hybridiseringsbetingelser til et polynukleotid som koder for et neublastinpolypeptid. Denne oppfinnelsen vedrører også nukleinsyreprimere som kan anvendes ved identifisering, isolering og amplifisering av polynukleotider som koder for neublastinpolypeptider, eller fragmenter derav. I bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen er enkelte av disse primerne neublastinspesifikke prober som kan anvendes for hybridisering til en neublastinnukleinsyre, men ikke til nukleinsyrer som koder for de øvrige medlemmene i GDNF-familien. Med "spesifikk", "spesifisitet" eller "spesifikt" er det ment en evne til å hybridisere med neublastinnukleinsyre og en manglende evne til å hybridisere med ikke-neublastinnukleinsyrer, inkludert en manglende evne til å hybridisere til nukleinsyrer som koder unikt for GDNF-ligandene (f.eks. GDNF, persephin og neurturin).

Ved en annen utførelsesform er en neublastinnukleinsyre ifølge oppfinnelsen en som identifiseres som å være komplementær til et polynukleotid som koder for et neublastinpolypeptid, enten ved å ha en komplementær nukleinsyresekvens eller ved å vise at den hybridiserer med spesifisitet ved strenge hybridiseringsbetingelser til et polynukleotid som koder for neublastin. Bestemte neublastinnukleinsyrer omfatter uten begrensning nukleinsyresekvensene som er vist her, og som er betegnet SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 29 og SEQ ID NO: 30, samt primerne SEQ ID NOS: 17-28, 31 og 32. En neublastinnukleinsyre ifølge oppfinnelsen omfatter videre et unikt underområde, eller fragment, av en neublastinnukleinsyre, inkludert uten begrensning nukleinsyrefragmentene som er vist i figur 8.

Neublastinnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å uttrykke et neublastinpolypeptid, f.eks. ved å uttrykke et neublastinpolypeptid in vitro eller ved å admini-strere en neublastinnukleinsyre til et dyr for in vivo-ekspresjon. Neublastinnukleinsyrer kan være inkludert i en nukleinsyrevektor, f.eks. en ekspresjonsvektor eller en klonings-vektor. En neublastinnukleinsyre kan, men behøver ikke nødven-digvis, opprettholdes, reproduseres, overføres eller uttrykkes som del av en nukleinsyrevektor. En rekombinant ekspresjonsvektor som inneholder en neublastinpolynukleotidsekvens, kan innføres i og/eller opprettholdes i en celle. Celler som bærer en neublastinvektor, kan være prokaryote. Alternativt kan en neublastinnukleinsyre innføres i en eukaryot celle, f.eks. en eukaryot celle som inneholder det passende apparat for etter-translasjonell prosessering av et polypeptid til et modent protein, og/eller det passende apparat for utskillelse av et polypeptid i det ekstracellulære miljø til cellen.

Det beskrives videre en neublastinneurotrofisk faktor, "neublastin". Neublastin kan være i form av et polypeptid, eller kan være en multimer av to eller flere neublastinpolypeptider, f.eks. en neublastindimer. Neublastinpolypeptider er forbundet som multimerer ved hjelp av inter-molekylære strukturbindinger som er kjent for fagfolk innen teknikken, inkludert uten begrensning cystein-cysteininter-aksjon, sulfhydrylbindinger og ikke-kovalente interaksjoner. Bestemte neublastinpolypeptider omfatter, uten begrensning, en aminosyresekvens som er beskrevet her og betegnet SEQ ID

NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7,

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 og SEQ ID NO: 16.

Et neuplastinpolypeptid som beskrevet heri kan anvendes til behandling av en defekt i et neuron, inkludert uten begrensning skadde neuroner og traumatiserte neuroner. Perifere nerver som opplever traumer, omfatter, men er ikke begrenset til, nerver i margen eller i ryggmargen. Neublastinpolypeptider kan anvendes ved behandling av neurodegenerativ sykdom, f.eks. cerebral, iskemisk nerveskade; neuropati, f.eks. perifer neuropati, Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrof lateral sklerose (ALS). Neublastinpolypeptider er videre omfattet for anvendelse ved behandling av forstyrret hukommelse, f.eks. hukommelsesforstyrrelser forbundet med demens.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er et fotografisk bilde av to northern blots probet med<32>P-merket neublastin-cDNA, hvor relative nivåer av ekspresjon av neublastingenet sammenlignes i forskjellige humane voksenvevstyper (panel A) og i forskjellige områder i den voksne menneskehjerne (panel B). Figur 2 er et fotografisk bilde av et northern blot probet med<32>P-merket neublastin-cDNA, hvor mengden av neublastin-cDNA uttrykt i en ikke-transfektert cellelinje, HiB5, sammenlignes med mengden av neublastin-cDNA uttrykt i en cellelinje transfektert med neublastin-cDNA, og med en cellelinje transfektert med GDNF-cDNA. Figur 3 er et fotografisk bilde av to western blots som sammenligner gradene som neublastinprotein uttrykkes i hos ikke-transfekterte HiB5-celler (felt 1) i forhold til en HiB5-cellelinje stabilt transfektert med neublastin-cDNA (felt 2), som ble probet med enten det neublastinspesifikke antistoff Ab-2 (venstre flekk, panel A) eller det neublastinspesifikke antistoff Ab-1 (høyre flekk, panel B). Figur 4 er en grafisk illustrasjon av effekten av neublastin på overlevelsen til dyrkede rotteembryo-, dopaminerg-, ventralmesencefalneuroner og ChAT-aktivitet hos cholinerge kranienervebevegelsesneuroner i serumfritt medium. Figur 4A er særlig en illustrasjon av dose-responskurven for rekombinant GDNF på ChAT-aktivitet (dpm/time). Figur 4B er en illustrasjon av ChAT-aktivitet (dpm/time) under anvendelse av fortynnet kondisjonert medium fra enten neublastinproduserende eller GDNF-produserende celler. Figur 4C er en illustrasjon av antallet tyrosinhydroksylaseimmunreaktive celler pr. brønn. Figur 5 er en illustrasjon av effekten av neublastin utskilt fra HiB5pUbilzNBN22-celler på funksjonen og overlevelsen av snittkulturer av griseembryodopaminerg ventralmesen-cefale neuroner samdyrket med enten HiB5pUbilzNBN22-celler (neublastin) eller HiB5-celler (kontroll). Figur 5A og figur 5B illustrerer dopamin frigjort til mediet ved henholdsvis DIV12 [dopamin (pmol/ml) - dag 12] og DIV21 [dopamin (pmol/ml) - dag 21]. Figur 5C er en illustrasjon av antallet tyrosinhydroksylaseimmunreaktive celler pr. kultur [TH-ir-celler pr. kultur] ved DIV21. Figur 6 er en illustrasjon av effekten in vivo av lentivirusprodusert neublastin på nigraldopaminneuroner. Figur 7 er et skjematisk diagram over genomstrukturen til neublastingenet, inkludert nukleinsyreprimerne som kan anvendes til å identifisere fullengdeneublastingenet, og deres romlige orientering i forhold til den genomiske neublastinkodende sekvens (det vil si gen). Figur 8 er en illustrasjon av neublastinspesifikke primere som brukes til å identifisere cDNA-klonen som koder for humanneublastinpolypeptidet som hybridiserer til nukleinsyrer som koder for neublastinpolypeptider, men ikke hybridiserer til nukleinsyrer som koder for de øvrige kjente GDNF-familiemedlemmene (det vil si GDNF, persephin og neurturin). Figur 9 illustrerer den neurotrofiske aktivitet i kulturer av dissosierte rottedorsalrotganglionceller fra forskjellige utviklingsstadier hos et polypeptid beskrevet i foreliggende oppfinnelse sammenlignet med dem som ble erholdt med kjente neurotrofiske faktorer [0 kontrollforsøk (i fravær av faktorer); 1 i nærvær av GDNF; 2 i nærvær av neurturin; 3 i nærvær av neublastin ifølge oppfinnelsen; E12 - embryo på dag 12; E16 - embryo på dag 16; PO - dagen for fødsel; P7 - dag 7 etter fødsel; og P15 - dag 15 etter fødsel]. Figur 10 illustrerer neublastinproduksjon fra CHO-cellelinjer. Figur 11 illustrerer en sammenligning mellom neublastin- og GDNF-binding til GFRa-1- og GFRa-3-reseptorer. Figur 12 er et fotografisk bilde av et western blot som illustrerer R30-antipeptidantistoff- og R31-antipeptid-antistoffbinding til neublastin. Figur 13 er et bilde av en gel som viser ekstraksjon av neublastin ved hjelp av affinitetsbinding på RETL3-Ig. Figur 14 er et plasmidkart over pET19b-neublastin sammen med sekvensen til det syntetiske gen for neublastin. Figur 15 er et plasmidkart over pMJB164-His-neublastin sammen med sekvensen til det syntetiske gen for His-neublastin.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Søkeren har identifisert en nukleinsyre som koder for en ny neurotrofisk faktor som her er henvist til som "neublastin" eller "NBN". Neublastin er et medlem av underklassen med gliacellelinjeavledet neurotrofisk faktor (GDNF) av superfamilien av neurotrofiske faktorer med transformerende vekst-faktor-p (TGF-P).

cDNA-et som koder for neublastin, ble opprinnelig identifisert på følgende måte. Ved å anvende TBLASTN 1.4.11-algoritmen (Atschul et al., Nucl. Acids Res., 1997, 25, 3389-3402) og humanpersephin som "spørsmål" (GenBank-deponeringsnummer AF040962), ble et 290 bp stort fragment opprinnelig identifisert i High-Throughput Genomic Sequence (HGTS) fra to humane bakterielle kunstige kromosomer (BAC) med GenBank-numrene AC005038 og AC005051. AC005038 består av omtrent 190 000 bp i 5 "contigs" av uordnede sekvenser, og AC005051 består av ca. 132 000 bp i 12 "contigs" av uordnede sekvenser. Det 290 bp store fragment identifisert i de to BAC-klonene viste seg å ha regioner som var homologe, men ikke identiske, med en kodende region i cDNA-et til den neurotrofiske faktor, humanpersephin.

Fra denne 290 bp store sekvens ble det syntetisert to neublastinspesifikke PCR-primere ("Top Stand Primer" [SEQ ID NO: 17] og "Bottom Strand Primer" [SEQ ID NO: 18]). Screening av human fosterhjerne-cDNA-bibliotek ble utført. Den innledende screening omfattet 96-brønners PCR-basert screening med to PCR-primere [SEQ ID NOS: 17 og 18] i en cDNA-bibliotek-"Master Plate" fra 500 000 cDNA-kloner som inneholder ca. 5 000 kloner/brønn. En andre PCR-basert screening ble utført på en human fosterhjerne-cDNA-bibliotek-"Sub-Plate" som inneholder E. coli-glyserolstandard med ca. 5 000 kloner/brønn. Et 102 bp stort fragment [SEQ ID NO: 13] ble identifisert i den PCR-baserte screening av både "Master Plate" og "Sub Plate". En positiv cDNA-klon (med det 102 bp store fragment) ble valgt ut, platet ut på to LB/antibiotikaholdige plater og dyrket over natten. Fra disse platene ble i alt 96 bakteriekolonier valgt ut og plassert individuelt i brønnene i en ny 96-brønners PCR-plate som inneholder begge PCR-primerne [SEQ ID NOS: 17 og 18] og de nødvendige PCR-amplifikasjonsreagensene. PCR-amplifikasjon ble så utført, og de 96 individuelle PCR-reaksjonsblandingene ble analysert ved hjelp av 2 % agarosegelelektroforese. Den positive koloni med klonen som inneholder det 102 bp store fragment, ble så identifisert. Plasmid-DNA ble erholdt fra den positive koloni som inneholder det 102 bp store fragment og sekvensert. Etter-følgende sekvensanalyse avslørte tilstedeværelsen av et fullengde-cDNA med 861 bp [SEQ ID NO: 8]. Den åpne leseramme (ORF) med 663 bp, eller den kodende region (CDS), identifisert i SEQ ID NO: 8, koder for pre-pro-polypeptidet (betegnet "pre-pro-neublastin") og er vist i SEQ ID NO: 9. Basert på SEQ ID NO: 9 ble det identifisert tre varianter av neublastin. Disse variantene omfatter: (i) det 140 aminosyrer store polypeptid betegnet her som NBN14 0, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 10; (ii) det 116 aminosyrer store polypeptid betegnet her som NBN116, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 11;

og

(iii) det 113 aminosyrer store polypeptid betegnet her som NBN113, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 12.

Hele cDNA-sekvensen som inneholder 782 bp 5'-utrans-latert DNA, 663 bp kodende DNA og 447 3<1->utranslatert (i alt 1992 bp) er blitt innlevert i GenBank under deponeringsnummer AF 120274.

Den genomiske neublastinkodende sekvens ble identifisert på følgende måte: Med det mål å klone den genomiske neublastinkodende sekvens ble det fremstilt et tilleggssett av primere. Nærmere bestemt omfattet primerpar nr. 1 [sense = SEQ ID NO: 23, og antisense = SEQ ID NO: 24], og primerpar nr. 2 omfattet [sense = SEQ ID NO: 25, og antisense = SEQ ID NO: 26].

Ved å anvende primerpar nr. 2 ble et 887 bp stort DNA-fragment amplifisert ved hjelp av PCR fra et preparat av humangenom-DNA og klonet i pCRII-vektoren (Invitrogen) og transformert i E. coli. Det resulterende plasmid ble sekvensert, og en 8 61 bp putativ cDNA-sekvens (som koder for et protein kalt neublastin her) ble forutsagt (som angitt i SEQ ID NO: 3). Likeledes ble det ved å anvende primerpar nr. 1 erholdt et 870 bp stort DNA-fragment ved hjelp av PCR av humangenom-DNA. En ytterligere 42 bp stor region i 3'-enden av den åpne leseramme (ORF) ble funnet i dette fragmentet, sammenlignet med sekvensen med 887 bp. Genomstrukturen til neublastingenet ble forutsagt ved å sammenligne med sekvensene i nukleinsyrer i andre neurotrofiske faktorer ved å kartlegge ekson-introngrenser. Denne analysen viser at neublastingenet har minst to eksoner atskilt med et 70 bp stort intron.

Denne sekvensen ble også brukt til å screene GenBank med hensyn til neublastin-EST-sekvenser. Tre ble identifisert med GenBank-numrene AA844072, AA931637 og AA533512, noe som indikerer at neublastinnukleinsyrer transkriberes i mRNA.

Sammenligning av hele cDNA-sekvensen erholdt

(AF 120274) og genomsekvensen som er til stede i GenBank-numrene AC005038 og AC005051, avslørte at neublastingenet består av minst fem eksoner (inkludert tre kodende) atskilt med fire introner (se f.eks. figur 8). Til sammen har eksonene en forutsagt aminosyresekvens til et fullengdeneublastinpolypeptid. Det bør også legges merke til at det 887 bp store fragment ble funnet å inneholde hele den kodende region i pro-neublastin. Det forutsagte cDNA [SEQ ID NO: 3] inneholder en åpen leseramme (ORF) som koder for pro-neublastin (181 amino-

syrerester), som oppviste homologi med de tre kjente human-proteinene persephin, neurturin og GDNF.

Neublastinnukleinsyrer

Ved et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen polynukleotider som er i stand til å uttrykke polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter DNA-, cDNA- og RNA-sekvenser, samt antisensesekvenser, og omfatter naturlig forekommende, syntetiske og påtenkt mani-pulerte polynukleotider. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter også sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode, men som koder for et neublastinpolypeptid etter ekspresjon.

Slik det her er definert, henviser uttrykket "polynukleotid" til en polymer form av nukleotider som er minst 10 baser lange, fortrinnsvis minst 15 baser lange. Med "isolert polynukleotid" er det ment et polynukleotid som ikke er umiddelbart sammenhengende med begge de kodende sekvensene som det er umiddelbart sammenhengende med (én på 5'-enden og én på 3'-enden) i det naturlig forekommende genom til organis-men hvorfra det er utvunnet. Uttrykket omfatter derfor rekombinant DNA som er inkorporert i en ekspresjonsvektor, i et autonomt replikerende plasmid eller virus, eller i det genomiske DNA til en prokaryot eller eukaryot, eller som fore-ligger som et separat molekyl, f.eks. et cDNA, uavhengig av andre sekvenser.

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter også allelvarianter og "muterte polynukleotider" som har en nukleotidsekvens som atskiller seg fra nukleotidsekvensene som er vist her, i én eller flere nukleotidstillinger.

Ved en foretrukket utførelsesform har polynukleotidet ifølge oppfinnelsen en nukleinsyresekvens (DNA-sekvens) som er i stand til å hybridisere med polynukleotidsekvensen som er vist som SEQ ID NO: 1, polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3, polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8 eller polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15, dens komplementære tråd eller en undersekvens herav under minst middels, middels/høye eller høye strenghetsbetingelser, som beskrevet nærmere nedenunder.

Ved en annen foretrukket utførelsesform har det isolerte polynukleotid ifølge oppfinnelsen en nukleinsyresekvens (DNA-sekvens) som er minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mest foretrukket minst 95 %, homolog med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 1, polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3, polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8 eller polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15.

I sin mest foretrukne utførelsesform har polynukleotidet DNA-sekvensen vist som SEQ ID NO: 1, DNA-sekvensen vist som SEQ ID NO: 3, DNA-sekvensen vist som SEQ ID NO: 8 eller polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også nye primere og DNA-sekvenser for identifisering, isolering og amplifisering av neublastinpolynukleotider som etter ekspresjon koder for neublastinpolypeptider eller fragmenter derav. Slike primere omfatter polynukleotidene angitt i SEQ ID NOS: 17-28 og 31-32. I tillegg tilveiebringer denne oppfinnelsen neublastin-DNA-sekvenser generert fra disse primerne, inkludert dem som er angitt i SEQ ID NOS: 13 og 14. Denne oppfinnelsen tilveiebringer videre DNA-sekvenser fra 3'- eller 5<1->utranslaterte regioner ("UTR") i genom-DNA som flankerer neublastineksoner; slike sekvenser kan anvendes til identifisering, isolering og amplifisering av neublastinpolynukleotider som etter ekspresjon koder for neublastinpolypeptider eller fragmenter derav.

3'-UTR-sekvenser ifølge denne oppfinnelsen omfatter sekvensene angitt i:

nukleotidene 721-865 i SEQ ID NO: 1,

nukleotidene 718-861 i SEQ ID NO: 3,

nukleotidene 718-861 i SEQ ID NO: 8,

nukleotidene 1647-2136 i SEQ ID NO: 15, og

sammenhengende sekvenser med mellom 10 og 25 nukleotider avledet fra (det vil si fallende innenfor) sekvensene ovenfor (som kan anvendes f.eks. som primere).

5'-UTR-sekvenser ifølge denne oppfinnelsen omfatter sekvensene angitt i:

nukleotidene 1-10 i SEQ ID NO: 1,

nukleotidene 1-57 i SEQ ID NO: 8,

nukleotidene 1-974 i SEQ ID NO: 15, og

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan fortrinnsvis fås ved hjelp av kloningsfremgangsmåter, f.eks. som beskrevet i "Current Protocols in Molecular Biology" [John Wiley & Sons, Inc.]. Ved en foretrukket utførelsesform er polynukleotidet klonet fra eller fremstilt på grunnlag av humangenom-DNA eller et cDNA-bibliotek fra humanhjerne.

DNA- sekvensers homologi

DNA-sekvenshomologien henvist til ovenfor kan bestemmes som graden av identitet mellom to sekvenser, idet den angir et avvik i den første sekvensen fra den andre. Homologien kan passende bestemmes ved hjelp av datamaskinprogrammer som er kjent innenfor teknikken, slik som GAP tilveiebrakt i GCG-programpakningen [Needleman, S.B. og Wunsch, C.D., Journal of Molecular Biology, 1970, 48, 443-453]. Anvendelse av GAP med de følgende innstillinger for DNA-sekvenssammen-ligning: GAP-dannelsestillegg på 5,0 og GAP-forlengeIses-tillegg på 0,3, den kodende region for de analoge DNA-sekvensene henvist til ovenfor oppviser en identitetsgrad på fortrinnsvis minst 70 %, mer foretrukket minst 80 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, med CDS-delen (kodende) av DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 1, eller CDS-delen (kodende) av DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 3, eller CDS-delen (kodende) av DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 8, CDS-delen (kodende) av DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 15.

Uttrykket "sekvensidentitet" henviser til den grad som to polynukleotidsekvenser er identiske på et nukleotid-for-nukleotid-grunnlag over et bestemt sammenligningsområde. Uttrykket "prosentvis sekvensidentitet" beregnes ved å sammenligne to optimalt sammenstilte sekvenser over sammenligningsområdet, bestemme antallet stillinger hvor den identiske nukleinsyrebase (f.eks. A, T, C, G, U eller I) opptrer i begge sekvensene slik at man får antallet sammenfallende stillinger, dividere antallet sammenfallende stillinger med det totale

antall stillinger i sammenligningsområdet (det vil si vindus-størrelse) og multiplisere resultatet med 100, hvorved man får

den prosentvise sekvensidentitet. Uttrykket "i det vesentlige identisk" betegner, slik det her er brukt, en karakteristisk størrelse for en polynukleotidsekvens hvor polynukleotidet omfatter en sekvens som har minst 80 % sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 85 % identitet og ofte 90-95 % sekvensidentitet, mer vanlig minst 99 % sekvensidentitet, sammenlignet med en referansesekvens over et sammenligningsområde.

Hybridiseringsfremgangsmåte

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen er slike som har en nukleinsyresekvens som er i stand til å hybridisere med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 1, polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3 eller polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8, eller polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15, eller deres komplementære tråd, eller en undersekvens herav under minst middels, middels/høye eller høye strenghetsbetingelser, som beskrevet nærmere nedenunder.

Egnede forsøksbetingelser for å bestemme hybridisering mellom en nukleotidprobe og en homolog DNA- eller RNA-sekvens omfatter forbløting av filteret som inneholder DNA-fragmentene eller RNA for å hybridisere i 5 x SSC [natrium-klorid/natriumsitrat; jf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] i 10 minutter og prehybridisering av filteret i en oppløsning av 5 x SSC, 5 x Denhardts oppløsning [jf. Sambrook et al., op. eit.], 0,5 % SDS og 100 ug/ml denaturert, sonikert laksesperma-DNA [jf. Sambrook et al., op. eit.], etterfulgt av hybridisering i den samme oppløsning inneholdende en konsentrasjon på 10 ng/ml av en vilkårlig primet [Feinberg, A.P.&Vogelstein, B., Anal. Biochem., 1983, 132, 6-13],<32>P-dCTP-merket (spesifikk aktivitet > 1 x IO<9>cpm/uq) probe i 12 timer ved omtrent 45 °C. Filteret vaskes så to ganger i 30 minutter i 0,1 x SSC, 0,5 % SDS ved en temperatur på minst ca. 60 °C (middels strenghetsbestemmelser), fortrinnsvis minst 65 °C (middels/høye strenghetsbestemmelser), mer foretrukket minst 70 °C (høye strenghetsbestemmelser) og enda mer foretrukket minst 75 °C (svært høye strenghetsbestemmelser) . Molekyler som oligonukleotidprober hybridiserer til under disse betingelsene, kan påvises ved å anvende en røntgenfilm.

Klonede polynukleotider

Det isolerte polynukleotid ifølge oppfinnelsen kan særlig være et klonet polynukleotid. Slik det her er definert, henviser uttrykket "klonet polynukleotid" til et polynukleotid eller en DNA-sekvens klonet i overensstemmelse med standard kloningsfremgangsmåter som for tiden anvendes innenfor gen-teknikk for å omplassere et segment av DNA som særlig kan være cDNA, det vil si enzymatisk avledet fra RNA, fra dets natur-lige lokalisering til et annet sted hvor det vil bli reprodu-sert .

Kloning kan utføres ved hjelp av hvilken som helst egnet vei, og kan omfatte slike teknikker som reverstranskrip-taseteknologi, PCR-teknologi og lignende, samt utkutting og isolering av det ønskede DNA-segment.

Det klonede polynukleotid ifølge oppfinnelsen kan alternativt kalles "DNA-konstruksjon" eller "isolert DNA-sekvens", og kan særlig være et komplementært DNA (cDNA).

Biologiske kilder

Det isolerte polynukleotid ifølge oppfinnelsen kan fås fra hvilken som helst egnet kilde.

Ved en foretrukket utførelsesform som polynukleotidet ifølge oppfinnelsen klones fra, fremstilles det på grunnlag av et cDNA-bibliotek, f.eks. av et cDNA-bibliotek fra foster-eller voksenhjerne, særlig forhjernen, bakhjernen, hjernebarken, striatum, amygdala, cerebellum, kaudatkjernen, corpus callosum, hippocampus, talamuskjernen, subtalamuskjernen, luktesenteret, egghinnen, substantia nigra, ryggrotsganglia, trigeminalganglion, den store mesenterialarterie eller talamus, ryggmargen, hjertet, placenta, lungene, leveren, skjelettmusklene, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, tynntarmen, øyet, netthinnen, tannerven, hårfollikkel, prostata, hypofysen eller luftrøret.

Kommersielle cDNA-biblioteker fra mange forskjellige vev, både humane og ikke-humane, er tilgjengelige fra f.eks. Stratagene og Clontech. Det isolerte polynukleotid ifølge opp finnelsen kan fås ved hjelp av standardmetoder, f.eks. dem beskrevet i arbeidseksemplene.

Neublastinpolypeptider

Som angitt ovenfor, er et "neublastinpolypeptid", slik det her er brukt, et polypeptid som har neurotrofisk aktivitet (f.eks. som beskrevet i eksemplene 6, 7, 8 og 9), og omfatter de polypeptidene som har en aminosyresekvens som har minst 70 % homologi med "neublastin"-polypeptidene angitt i AA_95-AA105i SEQ ID NO: 2, AA1-AA105i SEQ ID NO: 2, AA-97-AA140i SEQ ID NO: 4, AA-41-AAi4oi SEQ ID NO: 4, AAi-AAi40i SEQ ID NO: 4, AA-80-AAi4oi SEQ ID NO: 9 ("villtype"-prepro) , AA_4i-AAi4oi SEQ ID NO: 9 (pro), AA1-AA140i SEQ ID NO: 5 (modent 14 0AA) , AA1-AA116i SEQ ID NO: 6 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 7 (modent 113AA) , AAi-AA140i SEQ ID NO: 10 (modent 140AA) , AAi-AAU6 i SEQ ID NO: 11 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 12 (modent 113AA) , AAi-AA224i SEQ ID NO: 16 (murin pre-pro) , og varianter og derivater av hver av de ovenfor nevnte.

Fortrinnsvis har den C-terminale sekvens i de ovenfor identifiserte neublastinpolypeptider en aminosyresekvens som angitt i AA72-AA105i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA107-AA140i SEQ ID NO: 9), mer foretrukket AA4i-AAi05i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA76-AA140i

SEQ ID NO: 9).

Det er dessuten foretrukket at neublastinpolypeptidet bibeholder de 7 konserverte Cys-restene som er karakteristiske for GDNF-familien og TGF-|3-superfamilien.

Fortrinnsvis har neublastinpolypeptidet en aminosyresekvens som er mer enn 85 % homolog, mest foretrukket mer enn 95 % homolog, med de ovenfor nevnte sekvenser, det vil si AA-95-AA105i SEQ ID NO: 2, AA1-AA105i SEQ ID NO: 2, AA-97-AA140i SEQ ID NO: 4, AA_4i-AAi40i SEQ ID NO: 4, AA1-AA140i SEQ ID NO: 4, AA-80-AA140i SEQ ID NO: 9 ("villtype"-prepro) , AA-4i-AAi40i SEQ ID NO: 9 (pro), AAi-AA140i SEQ ID NO: 5 (modent 140AA) , AAi-AAiiei SEQ ID NO: 6 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 7 (modent 113AA) , AA1-AA140i SEQ ID NO: 10 (modent 140AA) , AAi-AA116i SEQ ID NO: 11 (modent 116AA) , AA1-AA113i SEQ ID NO: 12 (modent 113AA) , AA1-AA224i SEQ ID NO: 16 (murin pre-pro), og fortrinnsvis har hvilket som helst av de ovenfor nevnte polypeptider med en C-terminal sekvens fra de ovenfor identifiserte neublastinpolypeptider en aminosyresekvens som angitt i AA72-AA105i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA107-AA140i SEQ ID NO: 9), mer foretrukket AA4i-AAi05i SEQ ID NO: 2 (dvs. AA76-AAi40i SEQ ID NO: 9) eller AA191-AA224i SEQ ID NO: 16.

I tillegg vedrører denne oppfinnelsen de polypeptidene som har en aminosyresekvens som har minst 70 % homologi med de murine "neublastin"-polypeptidene angitt i AAi-AA224i SEQ ID NO: 16.

Blant de foretrukne polypeptidene ifølge oppfinnelsen er ved én utførelsesform pre-pro-sekvensen (som angitt i SEQ ID NOS: henholdsvis 2, 4, 9 og 16), prosekvensen (som angitt i AA-75-AAi05i SEQ ID NO: 2 eller AA-4i-AAi40i henholdsvis SEQ ID NOS: 4 og 9) og den modne sekvensen til neublastin (som angitt i SEQ ID NO: 5, 6, 7, 10, 11 eller 12, fortrinnsvis SEQ ID NOS: 10, 11, 12.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen omfatter variantpolypeptider. I sammenheng med denne oppfinnelsen betyr uttrykket "variantpolypeptid" et polypeptid (eller protein) som har en aminosyresekvens som atskiller seg fra sekvensen angitt som SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 12 eller SEQ ID NO: 16, i én eller flere aminosyre-stillinger. Slike variantpolypeptider omfatter de modifiserte polypeptidene beskrevet ovenfor, samt konservative substitusjoner, spleisevarianter, isoformer, homologer fra andre arter og polymorfismer.

Slik det her er definert, betegnet uttrykket "konservative substitusjoner" erstatningen av en aminosyrerest med en annen, biologisk lik rest. For eksempel ville man forvente at konservative aminosyresubstitusjoner har liten eller ingen effekt på den biologiske aktivitet, særlig dersom de utgjør mindre enn 10 % av det totale antall rester i polypeptidet eller proteinet. Konservative aminosyresubstitusjoner utgjør fortrinnsvis endringer i mindre enn 5 % av polypeptidet eller proteinet, mest foretrukket mindre enn 2 % av polypeptidet eller proteinet (f.eks. når det beregnes i overensstemmelse med NBN113, vil mest foretrukne konservative substitusjoner utgjøre færre enn tre aminosyresubstitusjoner i den modne villtypeaminosyresekvens). Ved en særlig foretrukket utførel- sesform er det en eneste aminosyresubstitusjon i den modne sekvens, hvor både den substituerte og erstatningsaminosyren er ikke-sykliske.

Andre eksempler på særlig konservative substitusjoner omfatter substitusjonen av én hydrofob rest, slik som iso-leucin, valin, leucin eller metionin, med en annen, eller substitusjonen av én polar rest med en annen, slik som substitusjonen av arginin for lysin, glutaminsyre for asparaginsyre, eller glutamin for asparagin og lignende.

Uttrykket konservativ substitusjon omfatter også anvendelsen av en substituert aminosyrerest i stedet for en usubstituert opphavsaminosyrerest, forutsatt at antistoffer frembrakt mot det substituerte polypeptid også reagerer immunologisk med det usubstituerte polypeptid.

Modifikasjoner av denne primære aminosyresekvensen kan resultere i proteiner som har i det vesentlige ekvivalent aktivitet sammenlignet med det umodifiserte motpartpolypeptid, og således kan anses som funksjonelle analoger til opphavs-proteinene. Slike modifikasjoner kan være tilsiktet, f.eks. som ved seterettet mutagenese, eller de kan opptre spontant, og omfatter spleisevarianter, isoformer, homologer fra andre arter og polymorfismer. Slike funksjonelle analoger er også omfattet ifølge oppfinnelsen.

Modifikasjoner av den primære aminosyresekvens kan dessuten resultere i proteiner som ikke bibeholder den biologiske aktivitet til opphavsproteinet, inkludert dominante negative former etc. Et dominant negativt protein kan virke inn på villtypeproteinet ved binding til eller på annen måte sekvestrering av regulerende midler, slik som oppstrøms- eller nedstrømskomponenter, som normalt reagerer funksjonelt med polypeptidet. Slike dominante negative former er også omfattet ifølge oppfinnelsen.

Et "signalpeptid" er en peptidsekvens som styrer et nysyntetisert polypeptid som signalpeptidet er bundet til, til det endoplasmatiske retikulum (ER) for videre posttranslasjo-nell prosessering og fordeling.

Et "heterologt signalpeptid" betyr, slik det er brukt her i sammenheng med neublastin, et signalpeptid som ikke er det humane neublastinsignalpeptid, vanligvis signalpeptidet til et annet pattedyrprotein enn neublastin.

Fagfolk innen teknikken vil erkjenne at den humane neublastin-DNA-sekvens (enten cDNA eller genom-DNA) eller sekvenser som atskiller seg fra human neublastin-DNA på grunn av enten stille kodonendringer eller kodonendringer som gir konservative aminosyresubstitusjoner, kan anvendes til genetisk å modifisere dyrkede humanceller slik at de vil overuttrykke og utskille enzymet.

Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også kimære polypeptider eller spaltbare fusjonspolypeptider hvor et annet polypeptid fusjoneres i N-enden eller C-enden av polypeptidet eller fragmentet derav. Et kimært polypeptid kan fremstilles ved å fusjonere en nukleinsyresekvens (eller en del derav) som koder for et annet polypeptid til en nukleinsyresekvens (eller en del derav) ifølge foreliggende oppfinnelse .

Teknikker for fremstilling av kimære polypeptider er standardteknikker. Slike teknikker krever vanligvis sammen-knytning av sekvensene på en slik måte at de begge er i den samme leseramme, og ekspresjon av det fusjonerte polypeptid under kontroll av den eller de samme promotere og den samme terminator.

Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også avkortede former av fullengdeneublastinmolekylet. I slike avkortede molekyler er én eller flere aminosyrer blitt delert fra N-enden eller C-enden, fortrinnsvis N-enden.

Aminosyresekvenshomologi

Graden som et kandidatpolypeptid har homologi til felles med et neublastinpolypeptid ifølge oppfinnelsen, bestemmes som identitetsgraden mellom to aminosyresekvenser. Et høyt nivå av sekvensidentitet indikerer en sannsynlighet for at den første sekvensen er avledet fra den andre.

Homologi bestemmes ved hjelp av en datamaskinanalyse, slik som, uten begrensninger, ClustalX-datamaskinsammenstil-lingsprogrammet [Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F.&Higgins, D.G.: The ClustalX windows inter-face: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools; Nucleic Acids Res., 1997, 25 (24):4876-82], og standardparametrene som her er foreslått. Ved å anvende dette programmet utviser den modne del av et polypeptid kodet for av en analog DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen en identitetsgrad på minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, med aminosyresekvensen som er vist her som SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,

SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 eller SEQ ID NO: 16.

Basert på homologibestemmelsen bekreftes det at polypeptidet ifølge oppfinnelsen som tilhører TGF-(3-superf amilien, er beslektet med GDNF-underfamilien, men utgjør et eget medlem av denne underfamilien.

Bioaktive polypeptider

Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes på hvilken som helst bioaktiv form, inkludert formen til pre-pro-proteiner, pro-proteiner, modne proteiner, glykosylerte proteiner, fosforylerte proteiner eller ethvert annet posttranslasjonelt, modifisert protein.

Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan særlig være et N-glykosylert polypeptid som fortrinnsvis er glykosylert i N-restene angitt i sekvenslisten.

Ved en foretrukket utførelsesform har polypeptidet ifølge oppfinnelsen aminosyresekvensen angitt som SEQ ID

NO: 9, med en glykosylert asparaginrest i 122-stilling; aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO: 10, med en glykosylert asparaginrest i 122-stilling; aminosyresekvensen vist som

SEQ ID NO: 11, med en glykosylert asparaginrest i 98-stilling; eller aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO: 12, med en glykosylert asparaginrest i 95-stilling.

Denne oppfinnelsen omfatter også neublastinfusjons-proteiner, slik som Ig-fusjoner, som beskrevet f.eks. i US patentskrift nr. 5 434 131.

Ved én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid med aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO: 2, eller en aminosyresekvens som er minst ca. 85 %, fortrinnsvis minst ca. 90 %, mer foretrukket minst ca. 98 % og mest foretrukket minst ca. 99 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 2.

Ved en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 4, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, enda mer foretrukket minst 98 %, mest foretrukket minst 99 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 4.

Ved en tredje utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID

NO: 5, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 5.

Ved en fjerde utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID

NO: 6, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 6.

Ved en femte utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 7, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 7.

Neublastinpolypeptidet omfatter allelvarianter, f.eks. polypeptidaminosyresekvensene ifølge SEQ ID NOS: 5-7, hvor Xaa betegner Asn eller Thr, og Yaa betegner Ala eller Pro.

Ved en sjette utførelsesform tilveiebringes et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 9, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 9.

Ved en sjuende utførelsesform tilveiebringes et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 10, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 10.

Ved en åttende utførelsesform tilveiebringes et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 11, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 11.

Ved en niende utførelsesform tilveiebringes et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 12, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 12.

Ved en tiende utførelsesform tilveiebringes et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 16, eller en aminosyresekvens som er minst 90 %, mer foretrukket minst 95 %, mest foretrukket minst 98 %, homolog med sekvensen vist som SEQ ID NO: 16, som er et pre-pro-neublastin av murin opprinnelse.

Ved en annen utførelsesform har polypeptidet GDNF-underfamiliefingeravtrykket, det vil si aminosyrerestene understreket i tabell 3.

Ved en ytterligere utførelsesform tilveiebringes et polypeptid kodet for av en polynukleotidsekvens som er i stand til å hybridisere under betingelser med høy strenghet med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 1, dens komplementære tråd eller en undersekvens derav. Ved en foretrukket utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av en polynukleotidsekvens som er minst 70 % homolog med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 1. I sin mest foretrukne utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 1.

Ved enda en ytterligere utførelsesform tilveiebringes nye polypeptider kodet for av en polynukleotidsekvens som er i stand til å hybridisere under betingelser med høy strenghet med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3, dens komplementære tråd eller en undersekvens derav. Ved en foretrukket utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av en polynukleotidsekvens som er minst 70 % homolog med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3. I sin mest foretrukne utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 3.

Ved enda en ytterligere utførelsesform tilveiebringes nye polypeptider kodet for av en polynukleotidsekvens som er i stand til å hybridisere under betingelser med høy strenghet med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8, dens komplementære tråd eller en undersekvens derav. Ved en foretrukket utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av en polynukleotidsekvens som er minst 70 % homolog med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8. I sin mest foretrukne utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 8.

Ved enda en ytterligere utførelsesform tilveiebringes nye polypeptider kodet for av en polynukleotidsekvens som er i stand til å hybridisere under betingelser med høy strenghet med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15, dens komplementære tråd eller en undersekvens derav. Ved en foretrukket utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av en polynukleotidsekvens som er minst 70 % homolog med polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15. I sin mest foretrukne utførelsesform kodes polypeptidet ifølge oppfinnelsen av polynukleotidsekvensen vist som SEQ ID NO: 15.

Biologisk opprinnelse

Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra pattedyrceller, fortrinnsvis fra en humancelle eller fra en celle av murin opprinnelse.

Ved en svært foretrukket utførelsesform kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen isoleres fra menneskehjertevev, fra menneskeskjelettmuskel, fra menneskebukspyttkjertel eller fra menneskehjernevev, særlig fra kaudalkjerne eller fra talamus, eller det kan fås fra DNA av pattedyropprinnelse, som omtalt nærmere nedenunder.

Neurotrofisk aktivitet

Neublastinpolypeptider ifølge oppfinnelsen kan anvendes til moderering av metabolisme, vekst, differensiering eller overlevelse av nerve- eller neuroncelle. Særlig anvendes neublastinpolypeptider til å behandle eller lindre en forstyrrelse eller sykdom hos et levende dyr, f.eks. et menneske, hvor forstyrrelsen eller sykdommen gir respons på aktiviteten til et neurotrofisk middel. Slike behandlinger og fremgangsmåter er beskrevet nærmere nedenunder.

Antistoffer

Neublastinpolypeptider eller polypeptidfragmenter ifølge oppfinnelsen anvendes til å fremstille neublastinspesifikke antistoffer. Slik det her er brukt, er et "neublastin-spesif ikt" antistoff et antistoff, f.eks. et polyklonalt antistoff eller et monoklonalt antistoff, som er immunreaktivt mot et neublastinpolypeptid eller polypeptidfragment, eller som bindes med spesifisitet til en epitop på et neublastinpolypeptid.

Fremstillingen av polyklonale og monoklonale antistoffer er vel kjent innenfor teknikken. Polyklonale antistoffer kan særlig fås som beskrevet f.eks. av Green et al.,

"Production of Polyclonal Antisera" i Immunochemical Protocols (Manson, red.); Humana Press, 1992, s. 1-5; av Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters" i Current Protocols in Immunology, 1992, avsnitt 2.4.1, og av Ed Harlow og David Lane (red.) i "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab. Press, 1988. Monoklonale antistoffer kan særlig fås som beskrevet f.eks. av Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495; Coligan et al. i Current Protocols in Immunology, 1992, avsnittene 2.5.1-2.6.7, og Harlow et al. i Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pub., 1988, s. 726.

I korte trekk kan monoklonale antistoffer fås ved å injisere f.eks. mus med et preparat som omfatter et antigen, verifisere tilstedeværelsen av antistoffproduksjon ved å fjerne en serumprøve, fjerne milten for å oppnå B-lymfocytter, fusjonere B-lymfocyttene med myelomceller for å fremstille hybridomer, klone hybridomene, velge ut positive kloner som produserer antistoffene mot antigenet, og isolere antistoffene fra hybridomkulturene.

Monoklonale antistoffer kan isoleres og renses fra hybridomkulturer ved hjelp av mange forskjellige veletablerte teknikker, inkludert affinitetskromatografi med protein A-Sepharose, størrelsesutelukkelseskromatografi og ionebytter-kromatografi, se f.eks. Coligan et al. i Current Protocols in Immunology, 1992, avsnittene 2.7.1-2.7.12, og avsnittene 2.9.1-2.9.3; og Barnes et al.: "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" i Methods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, vol. 10, s. 79-104. Polyklonale eller monoklonale antistoffer kan eventuelt renses ytterligere f.eks. ved å binde til og eluere fra en matriks som polypeptidet som antistoffene ble frembrakt mot, er bundet til.

Antistoffer som bindes til neublastinpolypeptidet ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles ved å anvende et intakt polypeptid eller fragmenter som inneholder små peptider av interesse som det immuniserende antigen. Polypeptidet som anvendes for å immunisere et dyr, kan fås ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker med eller ved hjelp av kjemisk syntese, og kan eventuelt konjugeres til et bærerprotein. Vanlig brukte bærerproteiner som kobles kjemisk til peptidet, omfatter albuskjellhemocyanin (KLH), tyroglobulin, bovint serumalbumin (BSA) og tetanustoksoid. Det tilkoblede peptid kan så anvendes til å immunisere dyret, som særlig kan være en mus, en rotte, en hamster eller en kanin.

Ved én utførelsesform fremstilles antistoffer ved å anvende de følgende peptider: peptid 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminosyrene 108-124 i SEQ ID NO: 9); eller peptid 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminosyrene 93-107 i SEQ ID NO: 9). Fremgangsmåter for fremstilling av antistoffer under anvendelse av disse polypeptidene er beskrevet i eksempel 10.

Vi frembrakte også polyklonale kaninantistoffer mot de følgende peptider:

peptid R27: GPGSRARAAGARGC (aminosyrene 30-43 i

SEQ ID NO: 9) ;

peptid R28: LGHRSDELVRFRFC (aminosyrene 57-70 i

SEQ ID NO: 9);

peptid R29: CRRARSPHDLSL (aminosyrene 74-85 i SEQ ID NO: 9) ;

peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC (aminosyrene 94-107 i SEQ ID NO: 9); og

peptid R31: STWRTVDRLSATAC (aminosyrene 123-136 i

SEQ ID NO: 9).

Av denne gruppen gjenkjente bare peptidene R30 og R31, forholdsvis nært C-enden, det denaturerte protein under reduserende betingelser på et western blot.

Vi har også identifisert ytterligere neublastinavledede peptider avledet fra det modne protein, som nærmere omtalt nedenunder, som er forutsagte, overflateeksponerte sløyfer basert på den kjente GDNF-struktur (Eigenbrot og Gerber, Nat. Struct. Biol., 1997, 4, 435-438), og således kan anvendes til antistoffgenerering: region 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA43-70 i

SEQ ID NO: 9);

region 2: CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA74-107 i SEQ ID NO: 9);

region 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA108-136 i

SEQ ID NO: 9).

Ved et annet aspekt av oppfinnelsen kan antistoffer som spesifikt binder neublastin eller neublastinavledede peptider, anvendes til påvisning av tilstedeværelsen av slike neurotrofiske neublastinfaktorer i forskjellige medier, og særlig til diagnose av tilstander eller sykdommer som er forbundet med neublastinmolekylene ifølge oppfinnelsen. Mange forskjellige fremgangsmåter for slik påvisning, inkludert ELISA, RIA og FACS, er kjent innenfor teknikken.

Antistoffene ifølge denne oppfinnelsen kan også anvendes til å blokkere effekten av den neurotrofiske faktor, og kan særlig være nøytraliserende antistoffer.

Fremgangsmåter for fremstilling av polypeptidene

En celle som omfatter en DNA-sekvens som koder for et neublastinpolypeptid ifølge oppfinnelsen, dyrkes under betingelser som muliggjør fremstillingen av polypeptidet, etterfulgt av utvinning av polypeptidet fra dyrkingsmediet, som nærmere omtalt nedenunder. Når celler skal modifiseres genetisk for det formål å fremstille et neublastinpolypeptid, kan cellene modifiseres ved hjelp av vanlige metoder eller ved hjelp av genaktivering.

Ifølge vanlige metoder kan et DNA-molekyl som inneholder en neublastin-cDNA- eller genom-DNA-sekvens, være inneholdt i en ekspresjonskonstruksjon og transfekteres i celler ved hjelp av standardmetoder, inkludert, men ikke begrenset til, liposom-, polybren- eller DEAE-dekstran-mediert transfeksjon, elektroporasjon, kalsiumfosfatutfelling, mikroinjek-sjon eller hastighetsdrevne mikroprosjektiler ("biolistics"). Alternativt kan man anvende et system som avgir DNA ved hjelp av virusvektor. Virus som er kjent for å kunne anvendes til genoverføring, omfatter adenovirus, adenoassosiert virus, lentivirus, herpesvirus, meslingvirus, poliovirus, retrovirus, Sindbis-virus og vacciniavirus, slik som kanarifuglkoppevirus, samt baculovirusinfeksjon av insektceller, særlig SfP9-insektceller.

Alternativt kan cellene modifiseres ved å anvende en genaktiveringsfremgangsmåte ("GA"), slik som beskrevet i US patentskrifter nr. 5 733 761 og 5 750 376.

Følgelig er uttrykket "genetisk modifisert", slik det er brukt her med henvisning til celler, ment å omfatte celler som uttrykker et bestemt genprodukt etter innføring av et DNA-molekyl som koder for genproduktet, og/eller regulatorelementer som kontrollerer ekspresjon av en kodende sekvens for genproduktet. DNA-molekylet kan innføres ved hjelp av genmålret-ting, noe som gjør det mulig å inkorporere DNA-molekylet på et bestemt genomisk sted.

Rekombinante ekspresjonsvektorer

Ved et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen. Den rekombinante ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen kan være hvilken som helst egnet eukaryot ekspresjonsvektor. Foretrukne rekombinante ekspresjonsvektorer er ubiquitinpromoteren som inneholder vektoren pTEJ-8 (Johansen, T.E., Schoeller, M.S., Tolstoy, S., Schwartz, T., FEBS Lett., 1990, 257, 289-294) og derivater herav, f.eks. pUbilz. En foretrukket, kommersielt tilgjengelig eukaryot ekspresjonsvektor er f.eks. viruspromoteren som inneholder vektor pcDNA-3 (tilgjengelig fra Invitrogen). En annen foretrukket ekspresjonsvektor gjør bruk av SV40 tidlig- og adenovirushoved-senpromoterne (avledet fra plasmid pAD2beta; Norton og Coffin, Mol. Cell. Biol., 1985, 5, 281).

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også prokaryote ekspresjonsvektorer og syntetiske gener (syngener) med kodon-optimalisering for prokaryot ekspresjon. Syngener ble konstruert med lavere GC-innhold og foretrukne bakterielle kodoner (f.eks. E. coli). Syngenet klones i to vektorer, pET19b og pMJB164, et derivat av pET19b. Konstruksjonen med pET19b er vist i figur 14. I denne konstruksjonen fusjoneres sekvensen som koder for det modne neublastindomenet direkte til et initierende metionin. Konstruksjonen med pMJB164 er vist i figur 15.

Produksj onsceller

Ved nok et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en produksjonscelle som er genetisk manipulert til å omfatte den isolerte polynukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen og/eller en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. Cellen ifølge oppfinnelsen kan særlig være genetisk manipulert til forbigående eller stabilt å uttrykke, overuttrykke eller samuttrykke polypeptid ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter for generering av forbigående og stabil ekspresjon er kjent innenfor teknikken.

Polynukleotidet ifølge oppfinnelsen kan innføyes i en ekspresjonsvektor, f.eks. et plasmid, et virus eller en annen ekspresjonsbærer, og bindes operativt til ekspresjonskontrollsekvenser ved ligering på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er sammenlignbare med ekspresjonskontrollsekvensene. Egnede ekspresjonskontrollsekvenser omfatter promotere, enhancere, transkripsjonsterminatorer, startkodoner, spleisesignaler for introner og stoppkodoner, alle holdt i den korrekte leseramme til polynukleotidet ifølge oppfinnelsen for å muliggjøre korrekt translasjon av mRNA. Ekspresjonskontrollsekvenser kan også omfatte ytterligere komponenter, slik som ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser.

Promoteren kan særlig være en konstitutiv eller en induserbar promoter. Når den klones i bakteriesystemer, kan

det anvendes slike induserbare promotere som pL fra bakterio-fag X, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-hybridpromoter). Ved kloning i pattedyrsystemer kan promotere avledet fra genomet i pattedyrceller, f.eks. ubiquitinpromoteren, TK-promoteren eller metallotioneinpromoteren, eller fra pattedyrvirus, f.eks. retrovirus-langendegjentakelsen, adenovirus-senpromoteren eller vacciniavirus-7,5K-promoteren, anvendes. Promotere erholdt ved hjelp av rekombinant DNA- eller syntetiske

teknikker kan også anvendes for å tilveiebringe transkripsjon av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen.

Egnede ekspresjonsvektorer omfatter vanligvis et ekspresjonsopprinnelsessted, en promoter samt spesifikke gener som muliggjør fenotypisk seleksjon av de transformerte celler, og omfatter vektorer som den T7-baserte ekspresjonsvektor for ekspresjon i bakterier [Rosenberg et al., Gene, 1987, 56 125], pTEJ-8-, pUbilz-, pcDNA-3 og pMSXND-ekspresjonsvektorene for ekspresjon i pattedyrceller [Lee og Nathans, J. Biol. Chem., 1988, 263 3521], baculovirusavledede vektorer for ekspresjon i insektceller og oocyttekspresjonsvektoren PTLN [Lorenz, C., Pusch M. & Jentsch, T.J., Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 13362-13366].

Ved en foretrukket utførelsesform er cellen ifølge oppfinnelsen en eukaryot celle, f.eks. en pattedyrcelle, f.eks. en menneskecelle, en oocytt eller en gjærcelle. Cellen ifølge oppfinnelsen kan uten begrensning være en human embryo-nyrecelle (HEK), f.eks. en HEK293-celle, en BHK21-celle, en ovariecelle fra kinesisk hamster (CHO), en Xenopus laevis-oocyttcelle (XLO). Ved en annen utførelsesform er cellen ifølge oppfinnelsen en soppcelle, f.eks. en celle av filamen-tær sopp. Ved en annen foretrukket utførelsesform er cellen en insektcelle, mest foretrukket Sf9-cellen. Ytterligere foretrukne pattedyrceller ifølge oppfinnelsen er PC12-, HiB5-, RN33b-cellelinjer og humane nerveforløperceller. Mest foretrukket er humanceller.

Eksempler på primære eller sekundære celler omfatter fibroblaster, epitelceller, inkludert bryst- og tarmepitel-celler, endotelceller, formede elementer fra blodet, inkludert lymfocytter og benmargsceller, gliaceller, hepatocytter, keratinocytter, muskelceller, nerveceller eller forløperne til disse celletypene. Eksempler på udødeliggjorte humancelle-linjer som kan anvendes ved de foreliggende fremgangsmåter, omfatter, men er ikke begrenset til, Bowes melanomceller (ATCC deponeringsnummer CRL 9607), Daudi-celler (ATCC deponeringsnummer CCL 213), HeLa-celler og derivater av HeLa-celler (ATCC deponeringsnummer CCL 2, CCL 2.1 og CCL 2.2), HL-60-celler (ATCC deponeringsnummer CCL 240), HT-1080-celler (ATCC depo neringsnummer CCL 121), Jurkat-celler (ATCC deponeringsnummer TIB 152), KB-karsinomceller (ATCC deponeringsnummer CCL 17), K-562-leukemiceller (ATCC deponeringsnummer CCL 243), MCF-7-brystkreftceller (ATCC deponeringsnummer BTH 22), MOLT-4-celler (ATCC deponeringsnummer 1582), Namalwa-celler (ATCC deponeringsnummer CRL 1432), Raji-celler (ATCC deponeringsnummer CCL 86), RPMI-8226-celler (ATCC deponeringsnummer CCL 155), U-937-celler (ATCC deponeringsnummer CRL 1593), WI-38VA13 under linje 2R4-celler (ATCC deponeringsnummer

CLL 75.1) og 2780AD-ovariekarsinomceller (Van der Blick et al., Cancer Res., 1988, 48, 5927-5932, samt heterohybridom-celler produsert ved fusjon av humanceller og celler av andre arter. Sekundære humanfibroblaststammer, slik som WI-38 (ATCC deponeringsnummer CCL 75) og MRC-5 (ATCC deponeringsnummer CCL 171), kan også brukes.

Når cellen ifølge oppfinnelsen er en eukaryot celle, kan inkorporering av det heterologe polynukleotid ifølge oppfinnelsen særlig utføres ved infeksjon (ved anvendelse av en virusvektor), ved transfeksjon (ved anvendelse av en plasmid-vektor), under anvendelse av kalsiumfosfatutfelling, mikro-injeksjon, elektroporasjon, lipofeksjon eller andre fysikalsk-kjemiske metoder som er kjent innenfor teknikken.

Ved en mer foretrukket utførelsesform transfekteres den isolerte polynukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen og/eller en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen i en pattedyrvertscelle, en nerveforløpercelle, en astrocyttcelle, en T-celle, en hematopoesestamcelle, en ikke-delende celle eller en cerebral endotelcelle som omfatter minst ett DNA-molekyl som er i stand til å formidle cellulær udødeliggjøring og/eller transformasjon.

Aktivering av et endogent gen i en vertscelle kan utføres ved hjelp av innføring av regulatorelementer, særlig ved innføringen av en promoter som er i stand til å bevirke transkripsjon av et endogent gen som koder for neublastinpolypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Farmasøytiske preparater

Ved et annet aspekt tilveiebringes nye farmasøytiske preparater som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

For anvendelse i terapi kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen administreres i hvilken som helst passende form. Ved en foretrukket utførelsesform inkorporeres polypeptidet ifølge oppfinnelsen i et farmasøytisk preparat sammen med ett eller flere adjuvanser, eller flere eksipienser, bærere og/eller fortynnere, og det farmasøytiske preparat fremstilles av fagfolk innen teknikken ved å anvende vanlige metoder som er kjent innenfor fagområdet.

Slike farmasøytiske preparater kan omfatte polypeptidet ifølge oppfinnelsen eller antistoffer herav. Preparatet kan administreres alene eller i kombinasjon med ett eller flere andre midler, legemidler eller hormoner.

Det farmasøytiske preparatet kan administreres via hvilken som helst egnet vei, inkludert, men ikke begrenset til, oral, intravenøs, intramuskulær, interarteriell, intra-medullær, intratekal, intraventrikulær, transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, anteral, topisk, sublingual eller rektal applikasjon, bukkal, vaginal, intraorbital, intra-cerebral, intrakranial, intraspinal, intraventrikulær, intra-cisternal, intrakapsulær, intrapulmonal, transmukosal applikasjon eller via inhalasjon.

Intrapulmonale avleveringsmetoder, apparat og lege-middelfremstilling er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 5 785 049, 5 780 019 og 5 775 320. Administrering kan være ved hjelp av periodiske injeksjoner av en bolus med preparatet, eller kan gjøres mer kontinuerlig ved hjelp av intra-venøs eller intraperitoneal administrering fra et reservoar som er eksternt (f.eks. en IV-pose) eller internt (f.eks. et biologisk nedbrytbart implantat, et biologisk kunstig organ eller en koloni av implanterte neublastinproduserende celler). Se f.eks. US patentskrifter nr. 4 407 957, 5 798 113 og 5 800 828. Intrapulmonale avleveringsmetoder og apparat er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 5 654 007, 5 780 014 og 5 814 607.

Administrering av et neublastin ifølge denne oppfinnelsen kan særlig oppnås ved å anvende hvilke som helst egnede avleveringsmidler, inkludert: (a) pumpe (se f.eks. Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984), (b) mikroinnkapsling (se f.eks. US patentskrifter nr. 4 352 883, 4 353 888 og 5 084 350, (c) kontinuerlig avgivende polymerimplantater (se f.eks. Sabel, US patentskrift nr. 4 883 666, (d) makroinnkapsling (se f.eks. US patentskrifter nr. 5 284 761, 5 158 881, 4 976 859 og 4 968 733, og publiserte PCT-patentsøknader nr. WO 92/19195 og WO 95/05452, (e) nakne eller ikke-innkapslede celleimplantater til CNS (se f.eks. US patentskrifter nr. 5 082 670 og 5 618 531, (f) injeksjon, enten subkutan, intravenøs, intra-arteriell, intramuskulær eller til annet egnet sted, og (g) oral administrering i kapsel, som væske,

tablett, pille eller preparat med langvarig frigjørelse.

Ved én utførelsesform avleveres et neublastin direkte i CNS, fortrinnsvis til hjerneventriklene, hjerneparenkyma, det intratekale rom eller annet egnet CNS-sted, mest foretrukket intratekalt.

Ved en annen foretrukket utførelsesform tenker vi på systemisk avlevering ved hjelp av subkutan injeksjon, intra-venøs administrering eller intravenøs innsprøyting.

Andre anvendbare parenterale avleveringssystemer omfatter etylen-vinylacetatkopolymerpartikler, osmotiske pumper, implanterbare innsprøytingssystemer, pumpeavlevering, innkapslet celleavlevering, liposomal avlevering, injeksjon ved avlevering fra nål, nålfri injeksjon, forstøver, aerosol-apparat, elektroporasjon og transdermalt plaster.

Ytterligere detaljer vedrørende teknikker for formu-lering og administrering kan finnes i den siste utgaven av

Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA).

Den aktive bestanddel kan administreres i én eller flere doser pr. dag. For tiden antatte passende doseringer er mellom 0,5 ng neublastin/kg kroppsvekt og ca. 50 ug/kg pr. administrering, og fra ca. 1,0 ng/kg til ca. 100 ug/kg daglig. Det farmasøytiske neublastinpreparat bør gi en lokal konsentrasjon av neurotrofisk faktor fra ca. 5 ng/ml cerebrospinal-væske ("CSF") til 25 ng/ml CSF.

Dosen som administreres, må selvsagt justeres nøye etter alderen, vekten og tilstanden til individet som behand-les, samt administreringsveien, doseringsformen og -regimet og resultatet som ønskes, og den nøyaktige dosering bør selvsagt bestemmes av legen.

Ved ytterligere utførelsesformer kan neublastinpolypeptidet ifølge oppfinnelsen administreres ved hjelp av genetisk avlevering, ved å anvende cellelinjer og vektorer som beskrevet nedenunder under behandlingsmetoder. For å frembringe slike terapeutiske cellelinjer kan polynukleotidet ifølge oppfinnelsen innføres i en ekspresjonsvektor, f.eks. et plasmid, et virus eller en annen ekspresjonsbærer, og bindes operativt til ekspresjonskontrollsekvenser ved ligering på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er forenlige med ekspresjonskontrollsekvensene. Egnede ekspresjonskontrollsekvenser omfatter promotere, enhancere, transkripsjonsterminatorer, startkodoner, spleisesignaler for introner og stoppkodoner, alle holdt i den korrekte leseramme til polynukleotidet ifølge oppfinnelsen for å muliggjøre korrekt translasjon av mRNA. Ekspresjonskontrollsekvenser kan også omfatte ytterligere komponenter, slik som ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser.

Promoteren kan særlig være en konstitutiv eller en induserbar promoter. Konstitutive promotere kan være syntetiske, virale eller avledet fra pattedyrcellers genom, f.eks. humanubiquitinpromoteren. Ved en foretrukket utførelsesform vil den terapeutiske cellelinje være en human, udødeliggjort nervecellelinje som uttrykker polypeptidet ifølge oppfinnelsen. For implantasjon tenker vi på implantering av mellom ca. IO<5>og 10<10>celler, mer foretrukket IO<6>til ca. IO<8>celler.

Behandlingsmetoder

Polynukleotider og proteiner, polypeptider, peptid-fragmenter eller derivater fremstilt derfra, samt antistoffer rettet mot slike proteiner, peptider eller derivater som beskrevet heri, kan anvendes til behandling eller lindring av en forstyrrelse eller sykdom i en levende dyrekropp, inkludert et menneske, hvor forstyrrelsen eller sykdommen gir respons på aktiviteten av neurotrofiske midler.

Polypeptidene som beskrevet heri kan anvendes direkte via f.eks. injiserte, implanterte eller inntatte farmasøytiske preparater for behandling av en patologisk prosess som gir respons på neublastinpolypeptidene.

Polynukleotidet som beskrevet heri, inkludert de komplementære sekvensene derav, kan anvendes til ekspresjonen av den neurotrofiske faktor som beskrevet heri. Dette kan oppnås ved hjelp av cellelinjer som uttrykker slike proteiner, peptider eller derivater ifølge oppfinnelsen, eller ved hjelp av virusvektorer som koder for slike proteiner, peptider eller derivater ifølge oppfinnelsen, eller ved hjelp av vertsceller som uttrykker slike proteiner, peptider eller derivater. Disse cellene, vektorene og preparatene kan administreres til be-handlingsmålområder for å påvirke en sykdomsprosess som gir respons på neublastinpolypeptidene.

Egnede ekspresjonsvektorer kan avledes fra lentivirus, retrovirus, adenovirus, herpes- eller vacciniavirus, eller fra forskjellige bakterielt fremstilte plasmider som kan anvendes for in vivo-avlevering av nukleotidsekvenser til en hel organisme eller et målorgan, -vev eller -cellepopulasjon. Andre metoder omfatter, men er ikke begrenset til, liposom-transfeksjon, elektroporasjon, transfeksjon med bærerpeptider som inneholder kjerne- eller andre lokaliseringssignaler, og en avlevering via systemer med sakte frigjørelse. Ved enda et annet aspekt av oppfinnelsen kan "antisense"-nukleotidsekvenser som er komplementære til neublastingenet eller deler derav, anvendes til å inhibere eller fremme neublastinekspresjon.

Forstyrrelsen eller sykdommen kan særlig være skader på nervesystemet forårsaket av traume, kirurgi, iskemi, infeksjon, metabolske sykdommer, næringsmiddelmangel, ondartethet eller toksiske midler, og genetiske eller idiopatiske prosesser.

Skaden kan særlig ha oppstått på sensorneuroner eller retinale ganglionceller, inkludert neuroner i dorsalrotgangli-onet eller i hvilket som helst av de følgende vev: genikulat-, petrosal- og nodosegangliene; det vestibuloakustiske kompleks i den åttende kranienerve; den ventrolaterale pol i maxillo-mandibularlappen i trigeminalganglionet; og den mesencefal-trigeminale kjerne.

Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten som beskrevet heri er sykdommen eller forstyrrelsen en neurodegenerativ sykdom som omfatter skadde og traumatiske neuroner, slik som traumatiske lesjoner i perifere nerver, medullaen og/eller ryggmargen, cerebral iskemisk nerveskade, neuropati og spesielt perifer neuropati, perifert nervetraume eller perifer nerveskade, iskemisk slag, akutt hjerneskade, akutt ryggmargsskade, nervesystemtumorer, multippel sklerose, eksponering for neurotoksiner, slike metabolske sykdommer som sukkersyke eller renale dysfunksjoner og skade forårsaket av infeksiøse agenser, neurodegenerative forstyrrelser, inkludert Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom, Parkinson-Plus-syndromer, progressiv supranukleær palsi (Steele-Richardson-Olszewski-syndrom), olivopontocerebellar atrofi (OPCA), Shy-Drager-syndrom (atrofi i flere systemer), guamanianparkinsonisme-demenskompleks, amyotrof lateral sklerose eller hvilken som helst annen kongenital eller neurodegenerativ sykdom, og hukommelsesforstyrrelse forbundet med demens.

Ved en foretrukket utførelsesform tenker vi på behandling av sensor- og/eller autonomsystemneuroner. Ved en annen foretrukket utførelsesform tenker vi på behandling av motorneuronsykdommer, slik som amyotrof lateral sklerose ("ALS") og spinalmuskulær atrofi. Ved nok en annen foretrukket utførelsesform tenker vi på anvendelse av neublastinmolekylene som beskrevet heri til å bedre nerveheling etter traumatisk skade. Ved én utførelsesform tenker vi på anvendelse av en nerveledekanal med en matriks som inneholder neublastinpolypeptider. Slike nerveledekanaler er beskrevet f.eks. i US patentskrift nr. 5 834 029.

Ved en foretrukket utførelsesform anvendes polypeptidene og nukleinsyrene som beskrevet heri (og farma-søytiske preparater som inneholder de samme) ved behandlingen av perifere neuropatier. Blant de perifere neuropatiene som det er tenkt på for behandling med molekylene som beskrevet heri, er traumeinduserte neuropatier, f.eks. de som forårsakes av fysisk skade eller sykdomstilstand, fysisk skade på hjernen, fysisk skade på ryggmargen, slag forbundet med hjerneskade og neurologiske forstyrrelser relatert til neuro-degenerasj on.

Vi tenker også på behandling av kjemoterapiinduserte neuropatier (slik som dem forårsaket av avlevering av kjemo-terapeutiske midler, f.eks. taxol eller cisplatin); toksin-induserte neuropatier, legemiddelinduserte neuropatier, vitaminmangelinduserte neuropatier; idiopatiske neuropatier; og diabetiske neuropatier. Se f.eks. US patentskrifter nr. 5 496 804 og 5 916 555.

Vi tenker også på behandling av ikke-neuropatier, monomultipleksneuropatier og polyneuropatier, inkludert aksonale og demyelinerende neuropatier, ved å anvende neu-blastinnukleotidene og polypeptidene som beskrevet heri.

Ved en annen foretrukket utførelsesform anvendes polypeptidene og nukleinsyrene (og farmasøytiske preparater som inneholder de samme) ved behandling av forskjellige forstyrrelser i øyet, inkludert fotoreseptortap i retina hos pasienter som er angrepet av makulær degenerasjon, retinitis pigmentosa, glaukom og lignende sykdommer.

Et annet formål som beskrevet heri er å tilveiebringe en fremgangsmåte for forhindring av de degenerative endringene som er forbundet med de ovenfor nevnte sykdommer og forstyrrelser, ved å implantere i pattedyrhjerne, inkludert menneske, vektorer eller celler som er i stand til å produsere en biologisk aktiv form av neublastin eller en forløper for neublastin, det vil si et molekyl som lett kan omdannes til en biologisk aktiv form av neublastin av kroppen, eller det kan innkapsles ytterligere celler som utskiller neublastin, f.eks. i semipermeable membraner.

Celler kan dyrkes in vitro for anvendelse ved trans-plantasjon eller innpoding i pattedyrhjerne, inkludert menneske.

Ved en foretrukket utførelsesform transfekteres genet som koder for polypeptidet som beskrevet heri i en egnet cellelinje, f.eks. i en udødeliggjort rottenervestamcellelinje som HiB5 og RN33b eller i en human udødeliggjort nerve-forløpercellelinje, og den resulterende cellelinje implanteres i hjernen til en levende kropp, inkludert et menneske, for å utskille det terapeutiske polypeptid ifølge oppfinnelsen i CNS, f.eks. ved å anvende ekspresjonsvektorene som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 98/32869.

Metoder for diagnose og screening

En neublastinnukleinsyre kan anvendes til å bestemme hvorvidt et individ er disponert for utvikling av en neurolog-isk forstyrrelse som skriver seg fra en defekt i neublastingenet, f.eks. en defekt i et neublastinallel, som er blitt ervervet f.eks. ved genetisk arv, ved unormal embryonisk utvikling eller ved ervervet DNA-skade. Analysen kan være f.eks. ved påvisning av én eller flere delesjoner eller én eller flere punktmutasjoner i neublastingenet, eller ved påvisning av arven av slik disposisjon for slike genetiske defekter med polymorfismer med spesifikk restriksjonsfragmentlengde (RFLP-er), ved påvisning av tilstedeværelsen eller fraværet av et normalt neublastingen ved hybridisering av en nukleinsyreprøve fra pasienten med én eller flere nukleinsyreprober som er spesifikke for neublastingenet, og ved å bestemme evnen til proben når det gjelder å hybridisere til nukleinsyren.

En neublastinnukleinsyre kan særlig anvendes som en hybridiseringsprobe. Slike hybridiseringsanalyser kan anvendes til å påvise, stille prognose og diagnose eller overvåke de forskjellige tilstandene, forstyrrelsene eller sykdomstilstan-dene som er forbundet med avvikende nivåer av de mRNA-er som koder for neublastinproteinet. En neublastinnukleinsyre kan konstrueres som en "markør" for neublastin-neurotrofisk faktor-avhengige fysiologiske prosesser. Disse prosessene omfatter, men er ikke begrenset til, "normale" fysiologiske prosesser (f.eks. nervefunksjon) og patologiske prosesser

(f.eks. neurodegenerativ sykdom). Karakteriseringen av én eller flere bestemte pasientunderpopulasjoner med avvikende (det vil si forhøyede eller manglende) nivåer av neublastinproteinet og/eller neublastinkodende mRNA kan føre til nye sykdomsklassifikasjoner. Med "avvikende nivåer" slik det her er definert, er det ment et forøkt eller redusert nivå i forhold til nivået i en kontrollprøve eller hos et individ som ikke har fått forstyrrelsen bestemt ved hjelp av kvantitative eller kvalitative midler.

Neublastinnukleinsyrene og -polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen kan også brukes til å screene med hensyn til å identifisere neublastinanaloger, inkludert småmolekyl-etterligninger av neublastin. Ved én utførelsesform som man har tenkt på, tilveiebringes en fremgangsmåte for identifisering av en kandidatforbindelse som induserer en neublastin-mediert biologisk effekt, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene å tilveiebringe en testcelle som, når den kommer i kontakt med neublastin, induseres til å uttrykke et påvisbart produkt, eksponere cellen for kandidatforbindelsen og påvise det påvisbare produkt. Ekspresjonen av det påvisbare produkt gir indikasjon på kandidatforbindelsens evne til å indusere den neublastinmedierte biologiske effekt.

Neublastinnukleinsyrene og -polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen kan videre anvendes på DNA-chip eller proteinchips, eller i datamaskinprogrammer for å identifisere beslektede nye gensekvenser og proteiner som kodes av dem, inkludert allelvarianter og enkeltnukleotidpolymorfismer ("SNP"-er). Slike fremgangsmåter er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 5 795 716, 5 754 524, 5 733 729, 5 800 992, 5 445 934 og 5 525 464.

Eksempler

Eksempel 1

Metoder for isolering av neublastinnukleinsyrer

Metode 1: Hurtigscreening av humanfosterhjerne- cDNA med hensyn til neublastingenet

Et 290 bp stort fragment ble identifisert i to hurtiggenomsekvenser (HGTS) innlevert til GenBank (deponeringsnummer AC005038 og AC005051) ved dets homologi til humanpersephin. Fra nukleinsyresekvensen til det 290 bp store fragment ble det syntetisert to neublastinspesifikke primere. Neublastintopptrådprimeren ("NBNint.sense") hadde sekvensen 5'-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3<1>[SEQ ID NO: 17]. Neublastin-bunntrådprimeren ("NBNint.antisense") hadde sekvensen 5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' [SEQ ID NO: 18]. Med disse primerne ble det utført 96-brønners PCR-reaksjoner.

En 96-brønners masterplate som inneholdt plasmid-DNA fra 500 000 cDNA-kloner, ble ladet med omtrent 5000 kloner pr. brønn. En 96-brønners subplate ble benyttet med E. coli-DH10B-glyserolstandard inneholdende 50 kloner pr. brønn.

En neublastinnukleinsyre ble identifisert ved hjelp av tre runder av amplifikasjon under anvendelse av polymerase-kjedereaksjonsteknikker ("PCR"); amplifikasjon økte antallet av kopier av nukleinsyren i prøven.

Masterplatescreening: Ved å anvende den 96-brønners PCR-screeningsteknikk som er beskrevet ovenfor, ble en humanfosterhjerne-cDNA-masterplate screenet med de genspesifikke primerne for å isolere humanneublastin-cDNA-et.

Tredve nanogram (30 ng) humanfosterhjerne-cDNA

(6 ng/ul, Origene Technologies) ble erholdt fra den tisvarende brønn i masterplaten og plassert i et totalvolum på 25 yl som inneholdt de følgende reagenser: 0,2 mM hver av de to tidligere nevnte genspesifikke primere (dvs. NBNint.sense og NBNint.antisense), 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og 0,5 enheter Taq-DNA-polymerase (5 U/yl, Advanced Biotechnologies, UK).

PCR-varmesyklusreaksjoner ble utført ved å anvende den følgende fremgangsmåte og de følgende betingelser. DNA ble først denaturert ved 94 °C i 3 minutter og så etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 94 °C i 1 minutt hver, annealering ved 55 °C i 1 minutt, en første forlengelse ved 72 °C i 90 sekunder og en sluttforlengelse ved 72 °C i 5 minutter. Produktene av 96 individuelle PCR-reaksjoner ble analysert ved hjelp av gelelektroforese under anvendelse av en 2 % agarosegel som inneholder etidiumbromidfarge. Det 102 bp store positive PCR-produkt som ses i en brønn, ble funnet å tilsvare en unik 96-brønners subplate.

Det 102 bp store nukleinsyrefragment hadde den følgende sekvens [SEQ ID NO: 13]:

Subplatescreening: Den 96-brønners humanfosterhjerne-subplate ble screenet ved hjelp av PCR-mediert amplifikasjon ved å plassere 1 ul av glyserolstandarden fra den tilsvarende subplatebrønn i et totalvolum på 25 ul som inneholdt: 0,2 mM hver av de to genspesifikke primerne, 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og 0,5 enheter Tag-DNA-polymerase (5 U/yl, Advanced Biotechnologies, UK).

De samme PCR-varmesyklusbetingelser som beskrevet for masterplatescreeningen ble benyttet. De 96 individuelle PCR-reaks jonsblandingene ble analysert på en 2 % agarosegel inneholdende etidiumbromid, og det ble identifisert en positiv brønn som ga det 102 bp store PCR-fragment.

Koloni- PCR: 1 ml av glyserolstandarden fra den positive subplatebrønnen ble fortynnet i forholdet 1:100 i Luria-næringsvæske (LB). 1 ml og 10 ml av den ovenfor nevnte fortynning ble så platet ut på to separate agarplater inneholdende Luria-næringsvæske ("LB") og 100 ug/ml karbenicillin. LB-platene ble så inkubert over natten ved 30 °C. Fra disse platene ble det hentet 96 kolonier til en ny 96-brønners PCR-plate som inneholder: 0,2 mM av hver av de to tidligere nevnte genspesifikke primerne, 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og 0,5 enheter Tag-DNA-polymerase (5 U/ul, Advanced Biotechnologies, UK) i et sluttvolum på 25 ul.

De samme PCR-varmesyklusbetingelser som beskrevet for masterplatescreeningen ble benyttet. De 96 individuelle PCR-reaks jonsblandingene ble så analysert på en 2 % agarosegel inneholdende etidiumbromid. En positiv koloni inneholdende det 102 bp store fragment ble deretter identifisert.

Sekvensering av plasmid-DNA-et fremstilt fra denne positive koloni avslørte et fullengde-cDNA på 861 bp [SEQ ID NO: 8]. cDNA-et kodet for et pre-pro-neublastin [SEQ ID

NO: 9]. Automatisert DNA-sekvensering ble utført ved å anvende "BigDye"-terminatorsyklussekvenseringssettet (PE Applied Biosystems, USA). Sekvenseringsgelene ble kjørt på ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, USA].

Metode 2: Kloning av neublastin- cDNA fra menneskehjerne

En ytterligere metode for amplifisering av fullengdeneublastin-cDNA eller cDNA-fragmentet kan utføres ved hjelp av RACE ("Rapid Amplification of DNA ends") og de neublastin-spesif ikke primerne NBNint.sense og NBNint.antisense beskrevet ovenfor, kombinert med vektorspesifikke eller adapterspesi-fikke primere, f.eks. ved å anvende Marathon-cDNA- amplifika-sjonssettet (Clontech Laboratories, USA, kat. nr. K1802-1).

Hel menneskehjerne-Marathon-Ready-cDNA (Clontech Laboratories, USA, katalog nr. 7400-1) kan anvendes til å amplifisere fullengdeneublastin-cDNA-et. Anvendbare primere for amplifikasjon omfatter en neublastintopptrådprimer, 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' [SEQ ID NO: 19] ("NBNext.sense"), og en neublastinbunntrådprimer, 5'-TCCATCACCCACCGGC-3' [SEQ ID

NO: 20] ("NBNext.antisense"), kombinert med adapterprimeren API inkludert sammen med Marathon-Ready-cDNA. En alternativ topptrådprimer er også blitt brukt, 5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3'

[SEQ ID NO: 28]. En ytterligere alternativ bunntrådprimer, 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' [SEQ ID NO: 33] kan også anvendes. Likeledes kan det også anvendes alternative bunntrådprimere, SEQ ID NOS: 24 og 25.

Metode 3: Kloning av neublastin- cDNA fra menneskehjerne

En annen metode for kloningen av neublastin-cDNA er ved hjelp av screening av voksen- eller fosterhjernebiblio-teker med én eller flere neublastinprober beskrevet her (og som eksemplifisert i figur 1). Disse bibliotekene omfatter: A,gtll-menneskehjerne (Clontech Laboratories, USA, kat. nr. HL3002b) eller Å.gtll-menneskef osterhj erne (Clontech Laboratories, USA, kat. nr. HL-3002b).

Metode 4: Hurtigscreening av musefoster- cDNA med hensyn til neublastingenet

En hurtigscreeningsfremgangsmåte for neublastingenet ble utført på følgende måte. En 96-brønners masterplate inneholdende plasmid-DNA fra 500 000 cDNA-kloner ble fylt med omtrent 5000 kloner pr. brønn. En 96-brønners subplate ble benyttet med E. Coli-glyserolstandard inneholdende 50 kloner pr. brønn. Tre runder med PCR-mediert amplifikasjon ble utført for å identifisere et gen av interesse (dvs. neublastin).

Masterplatescreening: En musefoster-cDNA-masterplate ble screenet ved hjelp av 96-brønners PCR under anvendelse av genspesifikke primere for å isolere museneublastin-cDNA-et. De følgende to primere ble syntetisert:

(1) neublastin-C2-primer (NBNint.sense): 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' [SEO ID NO: 21]; og (2) neublastin-C2as-primer (NBNint.antisense): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID NO: 22]. Ved å anvende disse to genspesifikke primerne ble det identifisert 220 bp stort positivt PCR-produkt. Den 220 bp store nukleinsyren hadde den følgende sekvens [SEQ ID NO: 14]:

96-brønners PCR-reaksjoner ble så utført på følgende måte. 30 ng musefosterhjerne-cDNA (6 ng/ul, Origene Technologies ble erholdt fra den tilsvarende brønn i masterplaten og plassert i et totalvolum på 25 ul som også inneholdt: 0,2 mM av hver av de to tidligere nevnte genspesifikke primere (dvs. C2-primer (NBNint.sense) og neublastin-C2as-primer

(NBNint.antisense)), 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og

0,5 enheter Ta g-DNA-polyrnerase (5 U/pl, Advanced Biotechnologies, UK) .

De følgende PCR-varmesyklusbetingelser ble benyttet: En innledende denaturering ved 94 °C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 94 °C i 1 minutt hver, annealering ved 55 °C i 1 minutt, forlengelse ved 72 °C i 90 sekunder og en sluttforlengelse ved 72 °C i 5 minutter. De

96 individuelle PCR-reaksjonsblandingene ble analysert på en

2 % agarosegel inneholdende etidiumbromidfarge. Det 220 bp

store positive PCR-produkt som ses fra en brønn, ble funnet å tilsvare en unik 96-brønners subplate. De 96 individuelle PCR-reaks j onsblandingene ble så analysert ved hjelp av gelelektroforese på en 2 % agarosegel inneholdende etidiumbromidfarge. Det 220 bp positive PCR-produkt som var blitt identifisert, tilsvarte en unik brønn i en 96-brønners subplate.

Subplatescreening: Den 96-brønners musefoster-subplaten ble screenet ved hjelp av PCR-mediert amplifikasjon ved å plassere 1 ul av glyserolstandarden fra den tilsvarende subplatebrønn i et endelig totalvolum på 25 ul som inneholdt: 0,2 mM av hver av de to tidligere nevnte genspesifikke primere, 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og 0,5 enheter Taq-DNA-polymerase (5 U/ul, Advanced Biotechnologies, UK). PCR-varme-syklusen ble utført i henhold til betingelsene beskrevet ovenfor for masterplatescreeningen.

De individuelle 96 PCR-reaksjonsblandingene ble så analysert på en 2 % agarosegel inneholdende etidiumbromid, og det ble identifisert en positiv brønn som produserte det 220 bp store fragment.

Koloni- PCR: 1 ml av glyserolstandarden fra den positive subplatebrønn ble fortynnet i forholdet 1:100 i Luria-næringsvæske (LB). 1 ml og 10 ml av den tidligere nevnte fortynning ble så platet på to separate LB-plater, inneholdende 100 ug/ml karbenicillin, og inkubert ved 30 °C over natten. I alt 96 kolonier ble isolert og overført til en 96-brønners PCR-plate inneholdende: 0,2 mM av hver av de to tidligere nevnte genspesifikk primerne, 1 x standard PCR-buffer (buffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTP-er (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt (Clontech Laboratories, USA) og

0,5 enheter Tag-DNA-polymerase (5 U/ul; Advanced Biotechnologies, UK) i et sluttvolum på 25 pl.

PCR-varmesyklusbehandling ble utført i henhold til betingelsene beskrevet ovenfor (se "masterplatescreening"). De 96 individuelle PCR-reaksjonsblandingene ble analysert ved hjelp av gelelektroforese på en 2 % agarosegel inneholdende etidiumbromid. En positiv koloni ble identifisert ved tilstedeværelsen av det 220 bp store fragment. Plasmid-DNA ble fremstilt fra denne positive koloni. Klonen ble sekvensert ved hjelp av automatisert DNA-sekvensering under anvendelse av "BigDye"-terminatorsyklussekvenseringssettet med AmpliTaq-DNA-polymerase. Sekvenseringsgelene ble kjørt på ABI Prism 377

(PE Applied Biosystems). Den resulterende sekvens fra denne klonen avslørte et fullengde-cDNA på 2136 bp [SEQ ID NO: 15]. cDNA-et omfatter en åpen leseramme med den forutsagte aminosyresekvens vist i SEQ ID NO: 16, som koder for et muse-pre-pro-neublastinpolypeptid.

Eksempel 2

Kloning av genomisk neublastin

Som omtalt ovenfor, identifiserte søkerne et 290 bp stort nukleinsyrefragment i to human-BAC-kloner med deponeringer i GenBank (med deponeringsnumrene AC005038 og AC005051) som hadde regioner med homologi til persephin og til de flankerende sekvensene i persephin. Søkerne brukte den 8 61 bp store forutsagte sekvens beskrevet ovenfor til å utforme ytterligere primere, med det mål å klone en nukleinsyre som koder for ytterligere neublastinnukleinsyrer under anvendelse av Lasergene Software (DNAStar, Inc.). To par primere ble brukt til å klone neublastingenet ved å anvende PCR-reaksjoner på genomisk DNA. De to parene med primere er illustrert nedenunder .

Primerpar nr. 1

5' CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3' (sense) [SEQ ID NO: 23].

5' CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT CAg 3<*>(antisense) [SEQ ID NO: 24].

Primerpar nr. 2

Ved å anvende primerpar nr. 1 ble et 887 bp stort DNA-fragment amplifisert fra et preparat av humangenom-DNA innkjøpt fra Clontech Laboratories (kat. nr. 6550A-1).

PCR- fremgangsmåte: PCR ble utført ved å anvende Expand High Fidelity PCR-system (Boehringer Mannheim) med buffer 1. PCR-reaksjonsblandingen ble supplert med 5 % di-metylsulfoksid (DMSO) og 17,5 pmol av hvert dNTP i et totalvolum på 50 pl. Varmesyklusbehandling ble utført med et for-denatureringstrinn ved 94 °C i 2 minutter, etterfulgt av 35 to-trinns sykluser ved henholdsvis 94 °C i 10 sekunder og 68 °C i 1 minutt. Varmesyklusbehandling ble avsluttet ved inkubasjon ved 68 °C i 5 minutter. Varmesyklusbehandling ble utført i en PTC-225 DNA Engine Tetrad thermocycler (MJ Research, MA). PCR-produktene ble analysert ved hjelp av gelelektroforese på 2 % agarose (FMC) og så fotografert.

Det 887 bp store fragment amplifisert fra humangenom-DNA med primerpar nr. 1 ble klonet i pCRII-vektoren (Invitrogen) og transformert i XLl-Blue-kompetente E. coli-celler (Stratagene). Det resulterende plasmid, betegnet neublastin-2, ble sekvensert ved å anvende Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech). Sekvenseringsprodukter ble analysert ved hjelp av elektroforese på et ALFExpress automatisert sekven-seringsapparat (Amersham Pharmacia Biotech).

Fragmenter erholdt ved hjelp av PCR-amplifikasjon av humangenom-DNA med det andre par av primere (primerpar nr. 1 ovenfor) ble sekvensert, og det ble avslørt en ytterligere 42 bp stor region i 3'-prime-enden av den åpne leseramme. Fullengdesekvensen ble analysert ved å sammenligne den med sekvensene til nukleinsyrer av andre neurotrofiske faktorer, samt ved kartlegging av ekson-introngrenser under anvendelse av datamaskinprogrammer for å finne gener som identifiserer sannsynlige spleisesammenknytninger og regioner med høyt-kodende potensial under anvendelse av Netgene og Gene Mark programvare (Brunak et al., J. Mol. Biol., 1991, 220, 49-65);Borodovsky et al., Nucl. Acids Res., 1995, 23, 3554-62). Ekson-introngrensene ble bekreftet ved hjelp av det cDNA som ble erholdt fra Rapid Screen beskrevet ovenfor.

Som illustrert i figur 7, har det resulterende neublastingen to eksoner atskilt med et 70 bp stort intron. Til sammen har eksonene en forutsagt aminosyresekvens til et fullengdeneublastinpolypeptid. Det forutsagte cDNA [SEQ ID

NO: 3] inneholder en åpen leseramme (ORF) som koder for

238 aminosyrerester [SEQ ID NO: 4]. Neublastin-2-klonen inneholdt den komplette kodende sekvens for pro-neublastin. Aminosyresekvensen som kodes for av genet, oppviste høy homologi med tre proteiner, persephin, neurturin og GDNF.

Eksempel 3

Ekspresjon av neublastinnukleinsyrer

Ekspresjon av neublastin-RNA ble påvist i både nerve-og ikke-nervevev hos gnagere og hos mennesker, og på forskjellige utviklingsmessige umodne og voksne stadier, under anvendelse av teknikkene som er beskrevet nedenunder.

Metode for påvisning av neublastin- RNA- ekspresjon under anvendelse av RT- PCR: Basert på neublastin-DNA-sekvensen identifisert som SEQ ID NO: 1 ble de følgende primere syntetisert: (1) en neublastin-C2-primer, 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3'

[SEQ ID NO:21], og (2) en neublastin-C2as-primer, 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID NO: 22]. Dette primersettet ble brukt til å RT-PCR-amplifisere et DNA-fragment fra voksen-og fosterhumanhelhjerne-mRNA. Blant DNA-fragmentene fremstilt ved hjelp av denne reaksjonen var ett på 220 bp. Identifika-sjon av dette 220 bp store DNA-fragment bekreftet at neublastingenet uttrykkes i voksen- og fosterhjernevev. Et 220 bp stort DNA-fragment ble også amplifisert fra genom-DNA ved å anvende disse primerne.

Metode for påvisning av neublastin- RNA- ekspresjon ved hjelp av northern blot- hybridisering: Northern blots med polyA<+->RNA fra voksenhumanvev ble innkjøpt fra en kommersiell leverandør (Clontech Laboratories, USA) og probet med et<32>P-merket neublastin-cDNA. Det merkede neublastin-cDNA ble fremstilt i henhold til metodene som er beskrevet i eksempel 1 ovenfor.

Fremstilling av prober: Et neublastinnukleinsyre-DNA-fragment (nukleotidene 296-819 i SEQ ID NO: 8) ble merket ved hjelp av Rediprime II-merkesettet (Amersham, kat. nr. RPN1633) for anvendelse som en hybridiseringsprobe, som anbefalt av produsenten. I korte trekk ble DNA-prøven fortynnet til en konsentrasjon på 2,5-25 ng i 45 ul 10 mM TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA-et ble så denaturert ved oppvarming av prøven til 95-100 °C i 5 minutter i et kokende vannbad, hurtig avkjøling av prøven ved å plassere den på is i 5 minutter og så kort sentrifugering av den for å bringe innholdet til bunnen av reaksjonsrøret. Totalmengden av denaturert DNA ble tilsatt sammen med 5 ul Redivue [<32>P]-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) i reaksjonsrøret som inneholder bufret oppløsning av dATP, dGTP, dTTP, eksonuklease-fritt Klenow-enzym og vilkårlig primer i tørket stabilisert form. Oppløsningen ble blandet ved å pipettere opp og ned to ganger, bevege pipettespissen rundt i oppløsningen, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 °C i 10 minutter. Merkingsreaksjonen ble stanset ved å tilsette 5 ul 0,2 M EDTA. For anvendelse som hybridiseringsprobe ble det merkede DNA denaturert til enkelttråder ved oppvarming av DNA-prøven til 95-100 °C i 5 minutter og så hurtig avkjøle DNA-prøven på is i 5 minutter. Røret ble sentrifugert og dets innhold blandet godt. Til sist ble den enkelttrådede DNA-probe renset ved å anvende nukleotidfjerningssettet (Qiagen).

Hybridiseringsteknikker: Fremstilte northern blots ble innkjøpt fra en kommersiell leverandør ("Multiple Tissue Northern Blots, Clontech Laboratories, USA, katalognr. 7760-1 og 7769-1) og ble hybridisert i henhold til produsentens instruksjoner under anvendelse av den neublastin-<32>P-merkede probe fremstilt ovenfor. For hybridisering ble det brukt ExpressHyb-oppløsning (Clontech Laboratories, USA), og en konsentrasjon på ca. 3 ng/ml av den merkede probe ble anvendt. ExpressHyb-oppløsningen ble varmet opp til 68 °C og så omrørt for å oppløse eventuell utfelling. Hver northern blot-membran (10 x 10 cm) ble forhybridisert i minst 5 ml ExpressHyb-opp-løsning ved 68 °C i 30 minutter i en Hybaid-hybridiseringsovn i henhold til produsentens instruksjoner. Den neublastin-32P-merkede probe ble denaturerert ved 95-100 °C i 2 minutter og så hurtig avkjølt på is. Fjorten mikroliter (14 ul) av den merkede probe ble tilsatt til 5 ml ny ExpressHyb, og det ble grundig blandet. ExpressHyb-oppløsningen som ble brukt ved forhybridiseringen, ble byttet ut ved jevnt å fordele over blotene de 5 ml med ny ExpressHyb-oppløsning inneholdende merket DNA-probe. Blotene ble inkubert ved 68 °C i 1 time i en Hybaid-hybridiseringsovn. Etter inkubasjon ble blotene skylt og vasket flere ganger ved lav strenghet (2 x SSC-buffer inneholdende 0,05 % SDS ved romtemperatur), etterfulgt av en vasking med høy strenghet (0,1 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved 50 °C) [20 x SSC er 0,3 M NaC/0,3 M Na-sitrat, pH 7,0]. Blotene ble eksponert for en Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech, Ltd.) ved -80 °C under anvendelse av forsterkningsskjermer.

Resultatene av northern blot-hybridiseringsforsøkene er vist i figur 1. Figur IA (venstre) og figur IB (høyre) er northern blots av polyA<+->RNA som ble probet med<32>P-merket neublastin-cDNA, som beskrevet i eksempel 3. Markørene repre-senterer polynukleotider med 1,35 kilobasepar ("kb"), 2,4 kb, 4,4 kb, 7,5 kb og 9,5 kb i størrelse. Membranen i figur IA ble fremstilt med mRNA ekstrahert fra forskjellige voksenhumanvev: Fra resultatene av northern blot-hybridiseringsanalysen konkluderer søkerne med at neublastin-mRNA uttrykkes i mange voksenhumanvev. Det høyeste nivå av neublastinekspresjon påvises i hjertet, i skjelettmuskelen og i bukspyttkjertelen. Membranen i figur IB ble fremstilt med RNA ekstrahert fra forskjellige regioner i voksenhumanhjernen. I voksenhjernen ses det høyeste ekspresjonsnivå i kaudatkjernen og i talamus. Et mRNA-transkript på omtrent 5 kb var den dominerende form av neublastin-mRNA uttrykt i hjernen.

Metode for påvisning av neublastin- RNA- ekspresjon under anvendelse av in situ- hybridisering i vev

De følgende teknikker anvendes til å måle ekspresjonen av neublastin-RNA i dyrevev, f.eks. gnagervev, med en neublastin-antisenseprobe.

Ekspresjon i mus

Fremstilling av vevsprøver: Tidsdrektige mus (B&K Universal, Stockholm, Sverige) ble avlivet ved halsdislokasjon på dag 13,5 eller 18,5 etter inntrådt drektighet. Embryoer ble fjernet ved disseksjon under sterile betingelser og umiddelbart senket ned i en oppløsning av 0,1 M fosfatbuffer (PB) inneholdende 4 % paraformaldehyd ("PFA") i 24-30 timer og ble så fjernet fra PFA og lagret i PBS. Vevet ble preparert for oppdeling ved nedsenking av vevet i en oppløsning av 30 % sukrose og så innpakking av det i TissueTech (O.C.T. Compound, Sakura Finetek USA, Torrance, CA). Seks serier av koronal-eller sagittalsnitt (12 pm hver) ble kuttet på en kryostat og tinemontert på positivt ladede objektglass. Neonatale hoder/hjerner (Pl, P7) ble fiksert ved å følge den samme fremgangsmåten som for embryostadiene, og voksenhjernevev ble dissekert, umiddelbart nedfryst på tørris og kuttet på en kryostat uten noen forutgående innpakking.

Fremstilling av neublastinriboprober: En antisense-neublastin-RNA-probe (heretter en "neublastinriboprobe") ble laget på følgende måte. Nukleotidene 1109-1863 fra museneublastin-cDNA-sekvensen [SEQ ID NO: 15] ble underklonet i BlueScript-vektoren (Stratagene). Det resulterende plasmid ble kuttet til et lineært DNA ved å anvende EcoRI-restriksjons-endonuklease. £coRI-DNA-fragmentet ble transkribert in vitro med T3-RNA-polymerase og digoksigenin("DIG")-RNA-merkesett i henhold til produsentens instruksjoner (Boehringer Mannheim).

Hybridisering: Kryostatsnitt ble fiksert i 10 minutter i 4 % PFA, behandlet i 5 minutter med 10 mg/ml proteinase K, dehydratisert sekvensvis i 70 % og 95 % etanol i henholdsvis 5 og 2 minutter og fikk så lufttørke. Hybridiseringsbuffer (50 % avionisert formamid, 10 % av en 50 % dekstran-/sulfat-oppløsning, 1 % Denhardts oppløsning, 250 ug/ml gjær-tRNA, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 10 mM NaP04, 1 % sarkosyl) inneholdende 1 ug/ml av den DIG-merkede probe ble varmet opp til 80 °C i 2 minutter og anvendt på snittene. Snittene ble så dekket med parafilm og inkubert ved 55 °C i 16-18 timer.

Den neste dag ble snittene vasket ved høy strenghet (2 x SSC inneholdende 50 % formamid) ved 55 °C i 30 minutter og så vasket i RNase-buffer og inkubert med 20 ug/ml RNaseA i 30 minutter ved 37 °C. For å påvise den DIG-merkede probe ble snitt forinkubert i blokkeringsoppløsning (PBS inneholdende 0,1 % Tween-20 og 10 % varmeinaktivert geiteserum) i 1 time og så inkubert over natten ved 4 °C med en 1:5000 fortynning av alkalisk fosfatasekoblet anti-DIG-antistoff (Boehringer Mannheim). Den påfølgende dag ble hvert snitt gitt fire 2 timers vaskinger i PBS inneholdende 0,1 % Tween-20 og så gitt to 10 minutters vaskinger i NTMT-buffer (100 mM NaCl,

100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 50 mM MgCl2, 0,1 % Tween-20). Snittene ble så inkubert i BM-fiolettsubstrat inneholdende 0,5 mg/ml levamisol i 48 timer. Fargereaksjonen ble stanset ved å vaske i PBS. Snittene ble lufttørket og dekket med dekkglass med DPX (KEBO-lab, Sverige).

Resultatene av hybridiseringsreaksjonene in situ er vist i tabell 1.

Som vist i tabell 1, ble på embryodag 13,5 ("E13,5") neublastin uttrykt i ryggmargen og i bakhjernen, og svakt i forhjernen. Neublastinekspresjon ble også påvist i den ut-viklede netthinne og i de sensoriske ganglier (dorsale rotganglier og trigeminale ganglier (V)). Utenfor nervesystemet ble det funnet et svakt signal i nyren, lungene og tynntarmen, noe som indikerer at neublastin også uttrykkes i de vevene.

På embryodag 18,5 ("E18,5") ble neublastin uttrykt mest fremtredende i det trigeminale ganglion (V). Neublastinekspresjon ble også påvist i netthinnen, striatumet og hjernebarken. I tillegg ble ekspresjon sett i tannanlegg.

Igjen under henvisning til tabell 1 ble forøkt neublastinekspresjon fra E18,5-tidspunktet til postnatale dager 1 og 7 sett i hjernebarken, striatumet og det trigeminale ganglion (V). Neublastinekspresjon var mer fremtredende i de ytre lag av hjernebarken enn i de indre lag av hjernebarken. På P7 ble ekspresjon funnet i de samme strukturene som på dag 1, men i tillegg ble neublastinekspresjon funnet i hippocampus, spesielt i de takkete hjernevindinger og i cerebellum. I den voksne, murine hjerne ble neublastin sterkt uttrykt i takkete hjernevindinger, med svært lave eller upåvisbare nivåer av neublastinekspresjon påvist i andre vev som ble testet.

Ekspresjon i rotte

Det følgende forsøk beskriver hybridiseringen av rottevev med en alkalisk fosfatasemerket oligodeoksynukleotid-neublastin-antisenseprobe.

Preparering av vevsprøver: Rotteembryoer (E14) ble erholdt fra drektige Wistar-rotter (Mollegaard Breeding, Danmark) etter pentobarbitalbedøvelse. Postnatale rotter (PO, P7, voksne) ble avlivet ved dekapitasjon. Dissekerte hjerner og hele hoder ble umiddelbart senket ned i kaldt 0,9 % NaCl, nedfryst og snittet opp ved 20 um på en kryostat (koronal- og sagittalsnitt, 10 serier).

In situ- hybridisering: To serier av snitt ble hybridisert under anvendelse av en antisense-alkalisk fosfatase-(AP)konjugert oligodeoksynukleotidprobe (5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3' [SEQ ID NO: 27], oligo nr.

164675, DNA Technology, Danmark). Denne proben er komplementær til basene 1140-1169 i museneublastin-cDNA-et ifølge SEQ ID NO: 15.

Før hybridisering ble snittene lufttørket ved romtemperatur, varmet opp ved 55 °C i 10 minutter og så behandlet med 96 % etanol ved 4 °C over natten. Snittene ble så luft-tørket og inkubert i hybridiseringsmedium (5,0 pmol probe/ml) over natten ved 39 °C (Finsen et al., Neurosci., 1992, 47, 105-113; West et al., J. Comp. Neurol., 1996, 370, 11-22).

Etterhybridiseringsbehandling bestod av fire

30 minutters skyllinger i 1 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Na-sitrat) ved 55 °C, etterfulgt av tre 10 minutters skyllinger i Tris-HCl, pH 9,5, ved romtemperatur før tilførsel av AP-fremkaller. AP-fremkaller ble fremstilt umiddelbart før bruk og inneholdt nitroblått-tetrazolium (NBT, Sigma), 5-brom, 4-klor, 3-indolylfosfat (BCIP, Sigma) og Tris-HCl-MgCl2-buffer, pH 9,5 (Finsen et al., Neurosci., 1992, 47, 105-113). AP-fremkalling fant sted i mørket ved romtemperatur i 48 timer. Fargereaksjonen ble stanset ved å skylle snittene i destillert vann. Snittene ble dehydratisert i gradert aceton, myknet i xylen-fenol-kreosot (Allchem, UK), klaret i xylen og plassert under dekkglass under anvendelse av Eukitt (Bie&Berntsen, Danmark).

Kontrollreaksjoner bestod av (1) forbehandling av snittene med RNase A (50 ug/ml, Pharmacia, Sverige) før hybridisering; (2) hybridisering av snittene med et 100 gangers overskudd av umerket probe; og (3) hybridisering av snittene med hybridiseringsbuffer alene. Resultatene av hybridiseringsreaksjonene er vist i tabell 2.

På embryodag 14 (E14) ble neublastin svakt uttrykt i rotteembryoer i forhjernen, i bakhjernen og i ryggmargen. Neublastin-mRNA ble også påvist i øyet (netthinnen), dorsale rotganglier, trigeminale ganglier (V) og i nyrene, lungene, hjertet, leveren og tarmene. Hos nyfødte (PO) rotter var det markert neublastinekspresjon i ryggmargen og i striatumet. Neublastinekspresjon ble også påvist i luktekolben og i hippocampus. Hos 7 dager gamle (P7) rotter ble neublastin uttrykt i hjernebarken, striatumet, luktekolben og i cerebellum. Et markert signal kunne ses i hippocampus. Hos voksne rotter ble svært lave eller upåvisbare nivåer av neublastinekspresjon påvist i de fleste områdene av hjernen. Svake signaler ble påvist i talamuskjernen, og markert neublastinekspresjon ble påvist i hippocampus.

Eksempel 4

Neublastinpolypeptider

Den åpne leseramme eller den kodende region (CDS) identifisert i SEQ ID NO: 8 koder for pre-pro-polypeptidet (betegnet "pre-pro-neublastin"). Aminosyresekvensen forutsagt fra denne åpne leserammen er vist i SEQ ID NO: 9. Basert på SEQ ID NO: 9 ble tre varianter av neublastinpolypeptider identifisert. Disse variantene omfatter:

(i) polypeptidet betegnet her som NBN140, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 10; (ii) polypeptidet betegnet her som NBN116, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 11; og (iii) polypeptidet betegnet her som NBN113, som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 12.

Basert på den kodende region (CDS), som identifisert i SEQ ID NO: 3, som koder for pre-pro-polypeptidet som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 4, ble likeledes tre varianter av neublastin identifisert. Disse variantene omfatter: (i) polypeptidet som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 5; (ii) polypeptidet som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 6; og (iii) polypeptidet som har aminosyresekvensen betegnet som SEQ ID NO: 7.

Basert på klustal W (1,75)-basert multippelsekvens-sammenstilling ble SEQ ID NO: 9 sammenstilt med aminosyre-sekvensene til GDNF, persephin og neurturin. Denne sammen-stillingen er illustrert i tabell 3.

Fra aminosyresekvenssammenstillingen vist i tabell 3 kan det ses at neublastin har sju konserverte cysteinrester på steder som er konservert innenfor TGF-p-superfamilien. Ved én utførelsesform inneholder det foretrukne neublastinpolypeptid sju cysteiner konservert som i SEQ ID NO: 2 i stillingene 8, 35, 39, 72, 73, 101 og 103, eller som i SEQ ID NOS: 4 og 9 i stillingene 43, 70, 74, 107, 108, 136 og 138. Disse sju konserverte cysteinrestene er kjent innenfor TGF-p-superfamilien for å danne tre intramonomerdisulfidbindinger (som kan ses f.eks. i SEQ ID NO: 2 mellom cysteinrestene 8-73, 35-101 og 39-103, og f.eks. i SEQ ID NOS: 4 og 9 mellom cysteinrestene 43-108, 70-136 og 74-138) og én intermonomerdisulfid-binding (som kan ses f.eks. i SEQ ID NO: 2 mellom cysteinrestene 72-72, og f.eks. i SEQ ID NOS: 4 og 9 mellom cysteinrestene 107-107), som sammen med den forlengede betatrådregion utgjør det konserverte strukturmotiv for TGF-p-superfamilien. Se f.eks. Daopin et al., Proteins, 1993, 17, 176-192.

Basert på denne sekvenssammenstillingen ble neublastin påvist å være et medlem av GDNF-underfamilien av neurotrofiske faktorer (LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP - SAxxCGC, GDNF-underfamiliefingeravtrykket, understreket i tabell 3).

Homologien mellom neublastin og andre medlemmer av GDNF-familien ble beregnet, og resultatene er vist i tabell 4 nedenunder.

Eksempel 5

Fremstilling av neublastin

Vi har fremstilt neublastin i både eukaryote og prokaryote celler, som beskrevet nedenunder.

Ekspresjonsvektorer. Det fullengde-cDNA som koder for neublastin, ble innføyd i den eukaryote ekspresjonsvektor pUbilz. Denne vektoren ble generert ved å klone human-UbC-promoteren i en modifisert versjon av pcDNA3.1/Zeo. Den umodifiserte pcDNA3.1/Zeo er kommersielt tilgjengelig (Invitrogen). Den modifiserte pcDNA3.1/Zeo er mindre enn opphavsvektoren fordi ampicillingenet (fra stilling 3933 til 5015) og en sekvens fra stilling 2838 til 3134 ble fjernet. I denne modifiserte versjon av pcDNA3.1/Zeo ble CMV-promoteren erstattet med UbC-promoteren fra pTEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett, 1990, 257, 289-294), noe som resulterte i pUbilz.

Pattedyrcelleekspresjon. pUbilz-vektoren, som inneholdt neublastinkodende sekvenser, ble så transfektert i pattedyrcellelinjen HiB5, som er en udødeliggjort rottenerve-cellelinje (Renfranz et al., Cell, 1991, 66, 713-729). Flere HiB5-cellelinjer som stabilt uttrykker neublastin (som bestemt ved hjelp av RT-PCR), er blitt etablert. I en av disse stabile cellelinjene ble HiB5pUbilzNBN22-ekspresjon bekreftet ved hybridisering av total-RNA på et northern blot med en32P-merket neublastinprobe. Resultatene av disse undersøkelsene er vist i figur 2. HiB5pUbilzNBN22 ble så brukt som en neu-blastinkilde for undersøkelser av neurotrofisk neublastin-aktivitet.

Figur 2 viser ekspresjonen av neublastin-cDNA i HiB5pUbilzNBN22-klonen (dvs. northern blot probet med32P-merket neublastin-cDNA ifølge foreliggende oppfinnelse, som beskrevet nedenunder). Blotet ble fremstilt ved hjelp av total-RNA ekstrahert fra utransfekterte HiB5-celler, henholdsvis HiB5pUbilzNBN22-celler og HiB5pUbilzGDNF14, som angitt). Stillingene til 28S- og 18S-rRNA-båndene som tilsvarer henholdsvis 4,1 kb og 1,9 kb, er angitt på blotet.

Som vist i figur 3, gjenkjente antistoffer frembrakt mot neublastinavledede polypeptider også et protein på omtrent 13 kilodalton ("kD") i kondisjonert medium fra HiB5pUbilz- NBN22-klonen, men ikke fra ikke-transfekterte HiB5-celler (jf. eksempel 6).

De forutsagte molekylvekter til de ikke-modifiserte (dvs. som mangler posttranslasjonelle modifikasjoner) neublastinpolypeptidene NBN140 [SEQ ID NO: 10], NBN116 [SEQ ID NO: 11] og NBN113 [SEQ ID NO: 12] ble bestemt til å være henholdsvis 14,7 kilodalton ("kD"), 12,4 kD og 12,1 kD.

Metoder: Et northern blot med total-RNA (10 ug) fra utransfekterte HiB5-celler og HiB5pUbilzNBN22-klonen ble fremstilt ved hjelp av elektroforese på en 0,8 % formaldehyd-agarosegel og blottet på en nylonmembran (Duralone, Stratagene). Blotet ble hybridisert og vasket som beskrevet i eksempel 3 med en 1,3 kb<32>P-merket probe fremstilt ved hjelp av vilkårlig merking som dekker SEQ ID NO: 8 og tilleggs-nukleotider fra 5'UTR og 3<1>UTR i neublastin-cDNA-et. Blotet ble eksponert for en Hyperfilm MP (Amersham) ved -80 °C under anvendelse av forsterkningsskjermer.

Kondisjonert medium fra HiB5pUbilzNBN22 eller utransfekterte HiB5-celler inkubert over natten i serumfritt medium supplert med N2-supplement (Life Technologies, kat. nr. 17502-048) ble konsentrert og separert på 15 % polyakrylamidgeler (Amersham Pharmacia Biotech, kat. nr. 80-1262-01). Proteiner ble overført til PVDF-membraner (Amersham Pharmacia Biotech, kat. nr. RPN-303F), og ikke-spesifikke proteinbindende seter ble blokkert med 5 % ikke-fettholdig tørrmelk i PBS med 0,1 % Tween-20. Membraner ble inkubert over natten med et polyklonalt neublastinantistoff (1:1000), etterfulgt av inkubasjon med et sekundært antikanin-IgG-antistoff (Amersham Pharmacia Biotech, kat. nr. NA 934) konjugert til pepperrotperoksidase (1:2000). Immunofarging ble visualisert under anvendelse av forsterket kjemiluminescens (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, kat. nr. RPN2109) eller ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech, kat. nr. RPN2132) i henhold til produsentens instruksjoner (Amersham).

Resultatene av disse forsøkene er vist i figur 3.

Figurene 3A og 3B er illustrasjoner av ekspresjonen av neublastinprotein i transfekterte HiB5-celler. Over natten-medium fra ikke-transfekterte HiB5-celler [felt 1] eller fra en HiB5-klon som er stabilt transfektert med neublastin-cDNA

[felt 2], ble konsentrert som beskrevet nedenunder. Mediet ble så analysert ved hjelp av western blotting under anvendelse av to forskjellige polyklonale antistoffer, Ab-1 og Ab-2 beskrevet i eksempel 10, som er spesifikke for neublastin. I mediet avledet fra transfekterte celler ble begge antistoffene funnet å gjenkjenne et protein med en molekylvekt på omtrent 15 kDa. Dette proteinet ble ikke sett i ikke-transfekterte HiB5-celler.

Det klonede cDNA som koder for neublastin, kan også innføyes i annen eukaryot ekspresjonsvektor, f.eks. den eukaryote ekspresjonsvektor TEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett., 1990, 267, 289-294) eller pcDNA-3 (Invitrogen), og det resulterende ekspresjonsplasmid transfekteres i en alternativ pattedyrcellelinje, f.eks. ovarieceller fra kinesisk hamster ("CHO"), HEK293-, COS-, PC12- eller RN33b-cellelinjene, eller humane nervestamceller. Stabile cellelinjer som uttrykker neublastin, anvendes f.eks. til å fremstille neublastinproteinet.

Ekspresjon i CHO- celler

Konstruksjon av plasmid pJC070. 14. For å uttrykke

neublastin-cDNA-et i ovarieceller fra kinesisk hamster ble et cDNA-fragment som koder for pre-pro-formen av humanneublastin innføyd i pattedyrekspresjonsvektoren pEAG347 for å frembringe plasmid pJC070.14. pEAG347 inneholder tandem-SV40-tidlig- og adenovirushoved-senpromoterne (avledet fra plasmid pAD2beta, Norton og Coffin, Mol. Cell. Biol., 1985, 5, 281), et unikt Notl-kloningssete, etterfulgt av SV40-sen-transkripsjons-terminering og polyA-signaler (avledet fra plasmid-pCMVbeta, MacGregor og Caskey, Nucl.Acids. Res., 1989, 17, 2365). I tillegg inneholder pEAG347 en pUC19-avledet plasmidryggrad og en pSV2dhfr-avledet dhfr for MTX-utvelgelse og amplifikasjon i transfekterte CHO-celler.

Plasmid pJC070.14 ble generert i to trinn. Først ble et fragment som koder for pre-pro-formen av humanneublastin isolert fra plasmid pUbilz-NBN under anvendelse av polymerase-kjedereaksjonen med oligonukleotidene KD2-824 5<1>AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3' [SEQ ID NO: 31], KD2-825

5'TTTTTTCCTT GGCGGCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3' [SEQ ID NO: 32]

og PFU-polymerase. Fragmentet ble klonet i Srf-l-setet i pPCR-Script Amp SK(+) for å generere plasmidet pJC069. I det andre trinnet ble en partiell Not-l-fordøyelse utført på plasmid pJC069 for å generere et 685 bp stort fragment (som inneholder neublastingenet) som ble klonet i Not-l-setet i plasmid pEAG347 for å generere plasmid pJC070.14. Transkripsjon av neublastingenet i plasmid pJC070.14 kontrolleres av adenovirushoved-senpromoteren.

Generering av CHO- cellelinjer som uttrykker neublastin . 200 ug pJC070.14 ble linearisert ved fordøyelse med restriksjonsendonukleasen Mlu-1. DNA-et ble ekstrahert med fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) og etanolutfelt. Det lineariserte DNA ble på nytt oppslemmet i 20 mM Hepes,

pH 7, 05, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0,7 mM Na2HP04, 6 mM dekstrose (HEBS) og innført i~4E7 CHO dukx Bl( dhfr-)celler (p23) ved elektroporasjon (280 V og 960 uF). Etter elektroporasjon ble cellene returnert til dyrking i a+ modifisert Eagles medium (MEM) supplert med 10 % bovint fosterserum (FBS) i to dager. Cellene ble så trypsinisert og på nytt platet ut i 100 mm skåler (100 000 celler/plate) i a-MEM (som mangler ribo- og deoksyribonukleosider), supplert med 10 % dialysert FBS, i 5 dager. Cellene ble deretter splittet ved en tetthet på

100 000 celler/100 mm plate og selektert i 200 nM metho-trexate. Resistente kolonier ble plukket ut og oppskalert til 6-brønners plater; kondisjonert medium fra hver klon ble screenet ved å anvende en spesifikk analyse for neublastin, beskrevet nedenunder. De 12 klonene som uttrykker det høyeste neublastinnivået, ble oppskalert til T162-kolber og deretter på nytt analysert. Som vist i figur 10, produserte CHO-cellelinjene neublastin i området 25-50 ng/ml.

Ternær kompleksanalyse for neublastin. Vi analyserte med hensyn på tilstedeværelsen av neublastin i mediet med CHO-cellelinjesupernatanter under anvendelse av en modifisert form av en ternær kompleksanalyse beskrevet av Sanicola et al (Proe Nati Acad Sei USA, 1997, 94, 6238).

I denne analysen kan evnen til GDNF-lignende molekyler evalueres med hensyn til deres evne til å formidle binding mellom det ekstracellulære domenet i RET og de forskjellige koreseptorene, GFRal, GFRa2 og GFRa3. Oppløselige former av RET og koreseptorene ble generert som fusjons-proteiner. Et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domenet i rotte-RET og alkalisk fosfatase fra livmor (RET-AP) og et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domenet i rotte-GFRal (beskrevet i publisert søknad WO 97/44356, 27. november 1997) og Fc-domenet i human-IgGl (rGFRa-Ig) er blitt beskrevet (Sanicola et al., Proe Nati Acad Sei USA, 1997, 94, 6238).

For å generere et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domenet i murin GFRa3 og Fc-domenet i human-IgGl (mGFRa3-Ig) ble et DNA-fragment som koder for aminosyrene 1-359 i murin RETL3 ligert til et fragment som inneholder Fc-domenet i human-IgGl og klonet i ekspresjonsvektoren pEAG347 for å generere plasmid pGJ144. Plasmid pGJ144 ble transfektert i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) for å generere en stabil cellelinje som produserer fusjonsproteinet, som ble renset på en protein A-Sepharose-immunaffinitetskolonne under anvendelse av standardmetoder. Det kan oppsummeres med at dersom det GDNF-lignende molekyl kan mediere binding av ko-reseptoren til RET i denne analysen, så vil RET-AP-fusjonsproteinet bli bibeholdt på platen, og mengden som bibeholdes, kan måles ved å anvende et kjemiluminescerende substrat for alkalisk fosfatase.

Dynex Microlite-1 ELISA-plater (Dynex Technologies) ble belagt med 1 mg/ml geiteantistoff som er spesifikt for human-Fc i 50 mM bikarbonat/karbonat, pH 9,6, i 16 timer. Platene ble tømt og fylt med 300 ul 1 % 1-blokk (Tropix) i TBS/0,5% Tween-20 (TBST) i 1 time. Etter vasking tre ganger med TBST ble brønnene fylt med 100 ul 1 ug/ml rGFRal-Ig eller mGFRa3-Ig fortynnet i kondisjonert medium fra 293-EBNA-celler som uttrykker RET-AP-fusjonsgenet. 100 ul kondisjonert medium fra CHO-neublastinklonene ble så tilsatt på toppbrønnen i en kolonne av brønner, og to ganger seriefortynninger ble utført med hver rad av brønner, og det ble inkubert i 1,5 time ved romtemperatur. Platene ble så vasket tre ganger med TBST og to ganger med 200 mM Tris, pH 9,8, 10 mM MgCl2(CSPD-buffer). Vaskeoppløsningen ble så erstattet med 425 uM CSPD (Tropix) i CSPD-buffer inneholdende 1 mg/ml Sapphire kjemiluminescensøker (Tropix), og det ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Kjemiluminescensresultatet ble målt ved å anvende et Dynatech luminometer.

I de innledende forsøk undersøkte vi hvorvidt neublastin fremstilt ved hjelp av CHO-cellelinjene kunne mediere bindingen av GFRal eller GFRa3 til det ekstracellulære domenet i RET. Som vist i figur 11, ga kondisjonert medium fra CHO-celleklon nr. 53 et robust signal i den ternære kompleksanalyse når mGFRa3-Ig-fusjonsproteinet ble inkludert, men ikke noe signal når rGFRal-Ig-fusjonsproteinet ble inkludert, noe som indikerer at neublastin bindes til GFRa3, men ikke til GFRal. Denne oppførsel skiller neublastin klart fra GDNF; som vist i figur 11, bindes GDNF til GFRal, men ikke til GFRa3. Det ble ikke observert noe signal med koreseptorfusjonsprotein når kondisjonert medium fra opphavs-CHO-cellelinjen eller rent medium ble analysert.

For å kvantifisere ekspresjonsnivåene til neublastin i CHO-cellelinjene ble det fremstilt en standardkurve ved å anvende rGFRal-Ig og GDNF, idet man startet ved en konsentrasjon på 1 ng/ml. Neublastinkonsentrasjoner for de forskjellige CHO-cellelinjene ble så beregnet ved å anvende denne standard-kurven; nivåene fremstilt ved hjelp av fem CHO-cellelinjer er vist i figur 10. Ettersom denne beregningen avhenger av den utestede antakelse at bindingsaffiniteten mellom GDNF og GFRal er lik med bindingsaffiniteten mellom neublastin og GFRa3, er disse nivåene bare omtrentlige.

Analyse av neublastin fra CHO- cellelinjesupernatanter

For ytterligere å analysere neublastinet fremstilt ved hjelp av CHO-cellelinjene ble proteinet ekstrahert fra mediet, under anvendelse av GFRa3-Ig-fusjonsproteinet og analysert ved hjelp av western blots med polyklonale antistoffer frembrakt mot neublastinpeptider.

I det første forsøket ble neublastinet ekstrahert med mGFRa3-Ig festet til Sepharose-kuler. mGFRa3-Ig ble festet til Sepharose-kuler ved å anvende betingelsene foreslått av produsenten, Pharmacia Inc. 100 ul mGFRa3-Ig-Sepharose ble tilsatt til 1,0 ml prøver av kondisjonert medium fra en negativ kontroll-CHO-cellelinje eller fra den neublastinproduserende CHO-cellelinje nr. 16. Suspensjonene ble inkubert i 2 timer på en vuggende plattform. Hver suspensjon ble sentrifugert og supernatanten fjernet, etterfulgt av tre 1,0 ml vaskinger med 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,5. Hver harpiks ble på nytt oppslemmet i 100 ul 2 x reduserende prøvebuffer og varmet opp til 100 °C i 5 minutter. 20 ul av prøvebuffersupernatanten og 10 pl av en molekylvektstandard (FMC) ble tilført hver brønn i en 10-20 % forstøpt SDS-PAGE-gel (Owl Scientific). Gelen ble elektroforesebehandlet ved 40 mA konstant strømstyrke i 72 minutter.

For western blot-analyse ble proteinet elektroblottet til nitrocellulose (Schleicher og Schuell) i et Hofer Scientific-apparat i et buffersystem av 10 mM CAPS, 10 % metanol, 0,05 % SDS, pH 11,2 (45 minutter ved 400 mA konstant strøm-styrke) . Etter overføringen ble nitrocellulosefilteret fjernet fra kassetten, og molekylvektmarkørene ble visualisert ved farging med en oppløsning av 0,1 % Ponceau S i 1 % eddiksyre i 60 sekunder. Membranen ble kuttet i to deler, og overskudds-fargen ble fjernet ved forsiktig risting i destillert vann. Membranene ble blokkert i 2 % ikke-fettholdig tørrmelk i TBS over natten ved 4 °C. Membranene ble inkubert individuelt med to av de affinitetsrensede antineublastinpeptidantistoffene (R30 og R31) ved en konsentrasjon på 1,0 ug/ml i 2 % ikke-fettholdig tørrmelk i TBS). Membranene ble vasket med tre 10 minutters vaskinger i TBS-Tween og inkubert i en 1:5000 fortynning av geite-antikanin-IgG-HRP-konjugat (Biorad) i 30 minutter. Membranene ble vasket med tre 10 minutters vaskinger av TBS-Tween og fremkalt med ECL-substrat (Amersham). Som vist i figur 12, ble spesifikke bånd påvist i proteinene ekstrahert fra den neublastinproduserende CHO-cellelinje med begge antistoffene (feltene 2 og 4) når man sammenlignet med båndene observert i de ekstraherte proteiner fra den negative kontrollcellelinje (feltene 1 og 3).

Molekylvekten til de lavere artene er ca. 13 kD og utgjør sannsynligvis det modne domenet i neublastin, generert etter spalting av pro-domenet. Denne spaltingen kan oppstå etter hvilken som helst av de tre Arg (f. eks. -RXXRJ'-)-restene i pre-pro-neublastinproteinet for å frembringe enten 140AA-, 116AA- eller 113AA-formene, som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 10, 11 eller 12. De forutsagte molekylvekter til de ikke- modifiserte (dvs. som mangler posttranslasjonelle modifikasjoner) neublastinpolypeptidene NBN140 [SEQ ID NO: 10], NBN116 [SEQ ID NO: 11] og NBN113 [SEQ ID NO: 12] ble bestemt til å være henholdsvis 14,7 kD, 12,4 kD og 12,1 kD. Ytterligere analyse vil være nødvendig for å bekrefte strukturen til disse artene samt de øvrige neublastinspesifikke båndene.

I det andre forsøket ble neublastinet ekstrahert med hGFRa3-Ig oppfanget på en ELISA-plate. For å frembringe et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domenet i human-GFRa3 (beskrevet i publisert søknad WO 97/44356, 27. november 1997) og Fc-domenet i human-IgGl (hGFRa3-Ig) ble et DNA-fragment som koder for aminosyrene 1-364 i human-GFRa3, ligert til et fragment som inneholder Fc-domenet fra human-IgGl og klonet i ekspresjonsvektoren CH269 beskrevet av Sanicola et al. (Proe Nati Acad Sei USA, 1997, 94, 6238). Fusjonsproteinet som kodes for av dette plasmidet, ble midlertidig uttrykt i 293-Epstein-Barr-viruskodet kjerneantigenceller (EBNA) og renset på en protein A-Sepharose-immunaffinitetskolonne under anvendelse av standardmetoder.

Seks brønner i en 96-brønners plate ble belagt over natten ved 4 °C med geite-antihuman-IgG (Fcy-fragmentspesifikt, Jackson Immunologics) ved en konsentrasjon på 25 mg/ml i PBS (300 ml/brønn). Brønnene ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med 400 ml 1 % BSA i PBS. Etter tre vaskinger med PBST (PBS + 0,05 % Tween 20) ble 300 ml hGFRa3-Ig (10 mg/ml i PBS inneholdende 0,1 % BSA) tilsatt til hver brønn. Platen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og ristet forsiktig (200 slag/minutt) for å maksimalisere bindingen. Brønnene ble så tømt og vasket igjen tre ganger med PBST. 250 ml kondisjonert medium fra en negativ kontroll-CHO-cellelinje eller fra den neublastinproduserende CHO-cellelinje nr. 25 ble tilsatt til hver av tre brønner. Platen ble inkubert i 3 timer ved romtemperatur og forsiktig ristet (300 slag/minutt). Brønnene ble så vasket to ganger med PBST. 25 ml ikke-reduserende Laemmli-ladebuffer ble tilsatt til den første brønnen, og platen ble ristet hurtig i 5 minutter for å eluere de bundne proteiner (1300 slag/minutt). Innholdet ble overført til den neste brønn, og fremgangsmåten ble gjentatt for å eluere proteinene bundet i den andre og tredje brønnen. Etter tilsetning av (3-merkaptoetanol (5 % sluttkonsentrasjon) ble prøvene kokt i 5 minutter og analysert ved hjelp av SDS-PAGE på en 10-20 % polyakrylamidgel.

For western blot-analyse ble proteinene overført til nitrocellulose. Membranen ble blokkert og probet i 5 % ikke-fettholdig tørrmelk, PBST og vasket i PBST. Neublastin ble påvist ved hjelp av elektrokjemiluminescens etter omsetning med polyklonale antistoffer (R30 og R31) frembrakt mot to neublastinpeptider (ved 1 ug/ml), etterfulgt av omsetning med HRP-konjugerte geite-antikaninantistoffer (BioRad). Som vist i figur 13, ble fem neublastinspesifikke bånd påvist i de ekstraherte proteiner fra den neublastinproduserende CHO-cellelinje (felt 2). De nedre to båndene er svært like med båndene observert i figur 12; igjen utgjør det nedre bånd sannsynligvis det modne domenet i neublastin frembrakt etter spalting av pro-domenet.

Etterfølgende analyse (data ikke vist) av båndene i figur 13 viser at deglykosylering med PGNase F av det ca. 18 kD store bånd reduserer det båndet til en størrelse som er ekvivalent med det nederste båndet i gelen i figur 13. Dette tyder på at neublastin kan fremstilles som et glykosylert protein i pattedyrceller.

Ekspresjon av neublastin i E . coli

For å uttrykke neublastingenet i E. coli ble det konstruert syngener med lavere GC-innhold og foretrukne E. coli-kodoner. Syngenet klones i to vektorer, pET19b og pMJB164, et derivat av pET19b. Konstruksjonen med pET19b er vist i figur 14. I denne konstruksjonen er sekvensen som koder for det modne domenet i neublastin (NBN113) direkte kondensert til et initierende metionin. Konstruksjonen med pMJB164 er vist i figur 15. I denne konstruksjonen er det modne domenet i neublastin fusjonert til et histidinmerke (dvs. 10 histidiner) atskilt av et enterokinasespaltingssete. Det initierende metionin kommer forut for histidinmerket.

Nukleotidsekvens som koder for neublastin i figur 14

Nukleotidsekvens som koder for his- merket neublastin i figur 15

Eksempel 6

Effekt av neublastin på overlevelsen av rotteembryodopaminerge neuroner og ChAT- aktivitet

I denne serien av forsøk ble effekten av kondisjonert medium fra neublastinproduserende HiB5pUbilzNBN22-celler ovenfor fastlagt.

Fremstilling av kulturer: Den ventrale midthjerne eller ryggmargen ble dissekert ut fra rotte-E14-embryoer i kald Hanks bufret saltoppløsning (HBSS). Vevsstykker ble inkubert i sterilfiltrert 0,1 % trypsin (Worthington) og 0,05 % DNase (Sigma) i HBSS ved 37 °C i 20 minutter. Vevsstykker ble så skylt fire ganger i HBSS + 0,05 % DNase og dissosiert under anvendelse av en 1 ml automatisk pipette. Suspensjonen ble så sentrifugert ved 600 rpm i 5 minutter, og pelleten ble re-suspendert i serumkondisjonert medium (SCM, DMEM med 10 % kalvefosterserum). Totalantallet av celler ble fastlagt ved hjelp av tryfanblåfarge-utelukkelsesmetoden og platet ut ved en tetthet på 100 000 celler/cm<2>i poly-L-lysinbelagte, 8-brønners kammerobjektglass (Nunc) for fastleggelse av dopaminerg neuronoverlevelse, eller ved 200 000 celler/cm<2>i 48-brønners plater (Nunc) for ChAT- aktivitetsmålinger. Celler ble inkubert i SCM ved 5 % C02/95 % 02og 95 % fuktighet ved 37 °C i 24-48 timer før det ble skiftet til serumfritt medium (SFM) med tilsetning av neurotrofiske faktorer.

Celler for fastleggelse av dopaminerg neuronoverlevelse fikk stå i 5 dager i SFM + trofisk faktor-tilsetninger og så fiksert i 5 minutter i 4 % PFA og farget for tyrosinhydroksylase ved hjelp av immunhistokjemi.

Celler for ChAT-aktivitet fikk stå i 3 dager med SFM og ble så lysert i HBSS + 0,1 % Triton X-100 og umiddelbart nedfryst på tørris inntil Chat-aktivitetsmåling.

Tilsetning av trofisk faktor: Kondisjonert medium ble samlet opp fra ikke-transfektert HiB5-kontroll eller HiB5-produserende neublastin (HiB5pUbilzNBN22) eller GDNF (HiB5pUbilzGDNF-L17). HiB5pUbilzNBN22 produserer ca. 20 ng GDNF/24 timer/10<5>celler, som bestemt ved hjelp av GDNF-ELISA på kondisjonert medium, samlet opp fra cellene. De respektive cellelinjene ble inkubert over natten med DMEM + 1 % FCS, og supernatanten ble tatt bort og lagret ved -20 °C inntil bruk. Supernatantene ble fortynnet i forholdet 1:50 i SFM når de ble tilsatt til cellene. Separate brønner ble behandlet med Hib5-kontrollsupernatant (1:50) + renset rekombinant rotte-GDNF (fra 0,03 til 10 ng/ml).

Resultatene av disse forsøkene er vist i figur 4. Figurene 4A-4C er illustrasjoner av effekten av neublastin utskilt fra HiB5pUbilzNBN22-celler på overlevelsen til dyrkede rotteembryo-, dopaminerg-, ventralmidthjerneneuroner og ChAT-aktivitet i cholinerge kranienervemotorneuroner i serumfritt medium, som beskrevet nedenunder i eksempel 5.1. Figur 4A er en illustrasjon av dose-responskurven for rekombinant GDNF på ChAT-aktivitet (dpm/time) målt ved DIV5 i serumfrie kulturer som opprinnelig ble etablert fra E14-ventral midthjerne [dvs. HiB5; GDNF 0,03 ng/ml; GDNF

0,1 ng/ml; GDNF 0,3 ng/ml; GDNF 1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml].

Figur 4B er en illustrasjon av ChAT-aktivitet (dpm/time) målt ved DIV5 i serumfrie kulturer som opprinnelig ble etablert fra E14-ventral midthjerne. Fortynnet kondisjo nert medium fra enten neublastinproduserende HiB5pUbilzNBN22-celler (neublastin) eller GDNF-produserende HiB5GDNFL-17-(GDNFL-17)-celler ble tilsatt som angitt i figuren [dvs. neublastin 1:10; neublastin 1:50; GDNFL-17 1:50].

Figur 4C er en illustrasjon av antallet tyrosinhydroksylaseimmunreaktive celler pr. brønn [antall TH<+->celler/brønn] ved DIV7 i serumfrie kulturer som opprinnelig ble etablert fra E14-rotte-ventral midthjerne. Fortynnet kondisjonert medium fra enten ikke-transfekterte HiB5-celler (HiB5) eller neublastinproduserende HiB5pUbilzNBN22-celler (neublastin) eller rekombinant GDNF i forskjellige konsen-trasjoner ble tilsatt som angitt i figuren [dvs. HiB5 1:10; HiB5 1:40; GDNF 0,1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml; og neublastin 1:40].

Kondisjonert medium fra neublastintransfekterte HiB5-celler fortynnet i forholdet 1:40 økte signifikant antallet TH-immunreaktive celler pr. brønn sammenlignet med kontroll-(utransfekterte)-HiB5-celler ved en ekvivalent og en lavere fortynning (1:10 og 1:40) (se f.eks. figur 4B). Økningen i TH-immunreaktive celler er sammenlignbar med økningen som ses ved en maksimal GDNF-konsentrasjon (10 ng/ml). Dette indikerer at neublastin utskilt til mediet har en effekt på overlevelse av den dopaminerge neuronpopulasjon fra rotteembryoventral-midthjerne. I motsetning til dette, ulikt GDNF utskilt fra transfekterte HiB5-celler, ses det ingen effekt av kondisjonert medium fra neublastintransfekterte HiB5-celler på en annen neuronal populasjon i den samme kultur, cholinerg-neuronene (se f.eks. figur 4A).

Eksempel 7

Effekt av neublastin på overlevelsen av snittkulturer av qriseembryo- dopaminerge ventralmidthjerneneuroner

I dette forsøket er effekten av samdyrking av neublastinproduserende HiB5pUbilzNBN22-celler med snittkulturer av ventralmidthjerne fra porcinembryoer vist.

Fremstilling av kulturer: Ventralmidthjerne (VM) ble isolert fra porcinembryoer (E28, n=12) under sterile betingelser, kuttet opp i 400 um stykkes og plassert i avkjølt Geys balanserte saltoppløsning (GIBCO) med glukose (6,5 mg/ml). Vevsstykkene ble dyrket ved hjelp av grenseflatekulturmetoden, opprinnelig utviklet av Stoppini et al. [L. Stoppini,

P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods, 1991, 37, 173-182] .

I korte trekk ble stykker plassert på halvporøse membraner (Millipore, 0,3 pm, 8 stykker/membran tilsvarende én VM) plassert i innsatser i 6-brønners plater (Costar) med serumholdig medium (Gibco BRL). Hver brønn inneholdt 1 ml medium (50 % Optimem, 25 % hesteserum, 25 % Hanks balanserte saltoppløsning (alle GIBCO)) supplert med D-glukose inntil en sluttkonsentrasjon på 25 mM. På dag 0 ble 7000 transfekterte HiB5pUbilzNBN22(neublastin)- eller 7000 ikke-transfekterte HiB5-celler (kontroll) inokulert på hvert vevsstykke. Ko-kulturene ble først dyrket i en inkubator ved 33 °C i 48 timer, noe som lot HiB5-cellene udødeliggjort med et temperatur-sensitivt onkogen proliferere, og så plassert i en inkubator ved 37 °C hvor HiB5-cellene differensierer. Mediet ble skiftet to ganger i uken. Antimitotika og antibiotika ble ikke brukt på noe stadium.

Bestemmelse av dopamin ved hjelp av HPLC: På dagene 12 og 21 in vitro ble kulturmediet samlet inn og analysert med hensyn på dopamin under anvendelse av HPLC med elektrokjemisk påvisning (W.N. Slooth, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth., 1995, 60 141-49).

Vevsprosessering og immunhistokjemi: På dag 21 ble kulturene fiksert i 4 % paraformaldehyd i fosfatbuffer i 60 minutter, dehydratisert i en 20 % sukroseoppløsning i 24 timer, nedfryst, kryostatsnittet ved 20 pm (4 serier) og montert på gelatinbelagte mikroskopobjektglass. Én serie av snitt ble immunofarget for tyrosinhydroksylase (TH). I korte trekk ble snittene vasket i 0,05 M tris-bufret saltoppløsning (TBS, pH 7,4) inneholdende 1 % Triton X-100 i 3 x 15 minutter og inkubert med 10 % bovint serum i god stand (FBS, Life Technologies) i TBS i 30 minutter. Vevet ble så inkubert i 24 timer ved 4 °C med monoklonalt museanti-TH-antistoff (Boehringer Marinheim) fortynnet i forholdet 1:600 i TBS med

10 % FBS. Etter skylling i TBS med 1 % Triton X-100 i 3 x

15 minutter ble snittene inkubert i 60 minutter med biotin-ylert antimuse-IgG-antistoff (Amersham) fortynnet i forholdet 1:200 i TBS med 10 % FBS. Snittene ble så vasket i TBS med 1 % Triton X-100 (3 x 15 minutter) og inkubert i 60 minutter med streptavidin-peroksidase (Dako) fortynnet i forholdet 1:200 i TBS med 10 % FBS. Etter vasking i TBS (3 x 15 minutter) ble bundet antistoff visualisert ved behandling med 0,05% 3,3-di-aminobenzidin (Sigma) i TBS inneholdende 0,01 H202. Til sist ble snittene dehydratisert i alkohol, klaret i xylen og for-synt med dekkglass i Eukitt.

Celletellinger og morfometrisk analyse: Kvantifiser-ing av immunreaktive TH-ir-neuroner ble utført ved å anvende "bright field"-mikroskopi (Olympus). Bare celler som utviser en sterk farging med en godt konservert cellulær struktur og en klar kjerne ble tellet. Beregning ble basert på celletellinger i hver fjerde kulturavdeling under anvendelse av et x 20 objektiv. Celleantall ble korrigert for dobbelttelling i henhold til Abercrombies formel (M. Abercrombie, Anat. Ree, 1946, 94, 239-47) under anvendelse av gjennomsnittsdiameteren for kjernene i TH-ir-neuronene (6,6 ± 0,2 um, n = 30). Størrel-sen på kjernene ble beregnet ved å anvende et neuronsporings-system (Neurolucida, MicroBrightField, Inc.).

Resultatene av disse forsøkene er vist i figur 5.

Figurene 5A-5C er illustrasjoner av effekten av neublastin utskilt fra HiB5pUbilzNBN22-celler på funksjonen og overlevelsen til snittkulturer av griseembryo-dopaminerg ventralmidthjerneneuroner samdyrket med enten HiB5pUbilzNBN22-celler (neublastin) eller HiB5-celler (kontroll), som beskrevet nedenunder. Figur 5A og figur 5B illustrerer dopamin frigjort til mediet ved henholdsvis DIV12 [dopamin (pmol/ml) - dag 12] og DIV21 [dopamin (pmol/ml) - dag 21]. Figur 5C er en illustrasjon av antallet tyrosinhydroksylaseimmunreaktive celler pr. kultur [TH-ir-celler pr. kultur] ved DIV21.

På dag 12 avslørte HPLC-analyse at medium fra HiB5-neublastin-kokulturer inneholdt 84 % mer dopamin enn medium fra HiB5-C-kokulturer (figur 5A). På dag 21 var forskjellen 78 % (figur 5B), og celletellinger viste at HiB5-neublastin-kokulturer inneholdt 66 % mer tyrosinhydroksylaseimmunreaktive neuroner enn HiB5-C-kokulturer (P < 0,05) (figur 5C). Dette indikerer at neublastin utskilt fra HiB5pUbilzNBN22-klonen har en sterk overlevelseseffekt på dopaminerge embryoporcin-neuroner.

Eksempel 8

Overlevelse av dorsale rotganglionceller i serumfritt medium

Dette eksemplet viser den neurotrofiske aktivitet av et neublastinpolypeptid sammenlignet med kjente neurotrofiske faktorer.

Drektige hunnmus ble avlivet ved hjelp av halsdislokasjon. Embryoene ble bearbeidet for dyrking på følgende måte.

Elektrolytisk spissede wolframnåler ble brukt til å dissekere dorsalrotganglia fra angitte stadier av C57/BI6-mus (Mollegaard Breeding, Danmark). Embryoganglia ble inkubert i 5 minutter ved 37 °C med 0,05 % trypsin (Gibco/BRL) i kalsium-og magnesiumfritt Hanks balanserte saltoppløsning. Postnatale ganglia ble behandlet med kollagenase/dispase 1 mg/ml i 30-45 minutter og så trypsin/DNAse 0,25 % i 15 minutter. Etter fjerning av trypsinoppløsningen ble gangliene vasket én gang med 10 ml DMEM inneholdende 10 % varmeinaktivert hesteserum og ble forsiktig triturert med en flammerenset Pasteur-pipette, hvorved man fikk en enkeltcellesuspensjon.

Cellene ble platet ut på 24-brønners plater (Nunc) som var forbelagt med polyornitin (0,5 mg/ml/over natten) og laminin (20 mg/ml i 4 timer, Gibco/BRL). Neuronene ble inkubert ved 37 °C i en fuktet 5 % C02~inkubator i et definert medium bestående av Hams F14 supplert med 2 mM glutamin,

0,35 % bovint serumalbumin, 60 ng/ml progesteron, 16 mg/ml putrescin, 400 ng/ml L-tyroksin, 38 ng/ml natriumselenitt, 340 ng/ml trijodtyronin, 60 mg/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin.

Etter 48 timers inkubasjon ble neuronene klart gjen-kjent ved hjelp av deres bipolare morfologi under fase-kontrastoptikk. Den prosentvise neuronale overlevelse i fravær eller nærvær av trofiske faktorer (tilsatt til dyrkingsmediet før utplating av neuronene ved 10 ng/ml) eller av kondisjonert medium fra de neublastinproduserende HiB5pUbilzNBN22-celler ble fastlagt ved telling av neuronene i brønnene etter

4 8 timer.

Resultatene av disse forsøkene er vist i figur 9, hvor: 0 er kontrollforsøket (i fravær av faktorer); 1 er forsøk i nærvær av GDNF; 2 er forsøk i nærvær av neurturin; 3 er forsøk i nærvær av neublastin ifølge oppfinnelsen;

E12 er data fra forsøk utført på DRG-celler isolert fra embryodag 12;

E16 er data fra forsøk utført på DRG-celler isolert fra embryodag 16;

PO er data fra forsøk utført på DRG-celler isolert fra dagen for fødsel;

P7 er data fra forsøk utført på DRG-celler isolert fra dag 7 etter fødsel; og

P15 er data fra forsøk utført på DRG-celler isolert fra dag 15 etter fødsel.

Disse resultatene viser klart at den neurotrofiske faktor ifølge oppfinnelsen oppviser aktiviteter som er sammenlignbare med eller til og med bedre enn dem til de veletablerte neurotrofiske faktorer.

Eksempel 9

In vivo - ef fekter av neublastin på nigradopaminneuroner

For å teste evnen til neublastin (neublastin) når det gjelder å beskytte voksne nigradopaminneuroner (DA) fra 6-hydroksydopaminindusert degenerasjon anvendte vi en rotte-modell på Parkinsons sykdom (Sauer og Oertel, Neuroscience, 1994, 59, 401-415) og lentiviralgenoverføring av neublastin.

Lentivirusproduksj on: For å generere en lentivirus-overføringsvektor som koder for neublastin ble pHR'-neublastin, et 1331 bp stort BamHI-fragment fra neublastin-cDNA, subklonet i BamHI/Bglll-setet til pSL301 (Invitrogen). Fra denne konstruksjonen ble et 1519 bp stort BamHI/XhoI-fragment skåret ut og ligert i BamHI/XhoI-setet til pHR<1>som bærer et hepatittvirus-posttranslasjonelt fragment fra skogmurmeldyr (Zufferey, R., Donello, J.E., Trono, D., Hope, T.J., "Wood-chuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors"; J. Virol., 1999, 73 (4) 2886-2892). For å generere pHR-GDNF ble et 701 bp BamHI/XhoI-fragment fra pUbilz-GDNF ligert i BamHI/XhoI-setet til pHR'.

Fremstilling av lentiviralvektoren er blitt beskrevet av f.eks. Zufferey et al. (Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R.J., Naldini, L., Trono, D.: "Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo"; Nat. Bio-technol., 1997, 15 (9) 871-875). I korte trekk ble over-føringskonstruksjonene og hjelperplasmidene pR8.91 og pMDG samtransfektert i 293T-celler. Virioner frigjort i mediet ble samlet opp ved 48 og 72 timer etter transfeksjon. For å konsentrere viruset ble mediet sentrifugert i 1,5 time ved 141 000 g, og pelleten ble oppløst i DMEM. Titeren til en kontroll som bærer genet for Green Fluorescent Protein ("GFP"), ble bestemt til å være IO<8>transformerende enheter (TU)/ml ved hjelp av GFP-fluorescens i 293T-celler. En RNA-"slot blot "-teknikk (von Schwedler, U., Song, J. , Aiken, C, Trono, D., "Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells", J. Virol., 1993, 67 (8) 4945-4955) ble brukt til å bestemme virus-partikkeltiter. I GDNF-supernatanten og neublastinsupernatan-ten var det 10 ganger færre partikler sammenlignet med GFP-supernatanten.

Kirurgiske fremgangsmåter: Alt arbeidet som involverer dyr, ble utført i henhold til reglene fastsatt av Ethical Committee for Use of Laboratory Animals ved Lund universitet.

I alt 21 unge, voksne Sprague-Dawley-hunnrotter (B&K Universal, Stockholm, Sverige) ble brukt og oppbevart under 12 timers syklus med lys og mørke med fri tilgang til rottefor og vann. Retrogradmerking og 6-OHDA-lesjoner ble utført 3 uker før lesjon i henhold til Sauer og Oertel (Sauer og Oertel, Neuroscience, 1994, 59, 401-415). I korte trekk fikk under Equithesin-bedøvelse (0,3 ml/100 g) rottene injisert bilate-ralt 0,2 ul av en 2 % oppløsning (oppløst i 0,9 % NaCl) av retrogradsporeren Fluoro-Gold (FG, Fluorochrome, Inc., Englewood, CO). Injeksjoner ble gjort ved å anvende en 2 ul Hamilton-sprøyte ved koordinatene: AP = +0,5 mm; ML = +3,4 mm i forhold til bregma; DV = -5,0 mm i forhold til dura og fortannstykket satt til 0,0 mm. I tillegg ble 0,05 ul/minutt injisert, idet det fikk gå 5 minutter før nålen ble trukket ut igjen.

14 dager etter FG-injeksjonene fikk dyrene i alt fem deponeringer (1 ul/deponering) av en lentivirusvektor som bærer genet for grøntfluorescerende protein (GFP), neublastin eller GDNF. Fire av deponeringene var i striatumet langs to nålområder ved de følgende koordinater: AP = +1,0 mm, ML =

-2,6 mm, DVi = -5,0 mm, DV2= -4,5 mm og AP = 0,0 mm, ML = -3,7 mm, DVi= -5,0 mm, DV2= -4,5 mm. Supranigraldeponeringen ble gjort ved AP = -5,2 mm, ML = -2,0 mm, DVi= -6,3 mm. Tann-stykket ble satt ved -2,3 mm. 21 dager etter retrogradmerking og 7 dager etter lentivirusinjeksjoner ble dyrene på nytt bedøvd, og med en 10 ul Hamilton-sprøyte ble en enkeltdeponering av 20 ug 6-OHDA (Sigma, beregnet som fri base og oppløst i 3 pl iskald salt-oppløsning supplert med 0,02 % askorbinsyre) injisert i høyre striatum på det samme sted som FG-deponeringene. Injeksjons-hastigheten var 1 pl/minutt, idet det fikk gå ytterligere 3 minutter før nålen ble trukket ut igjen. Vevsbearbeidelse: 21 dager etter 6-OHDA-injeksjonen ble dyrene dypt bedøvd med kloralhydrat og transkardialt perfundert med saltoppløsning (pH 7,4, romtemperatur) i 1 minutt, etterfulgt av 200 ml iskald formaldehydoppløsning (4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4). Hjernene ble dissekert og etterfiksert i den samme fikservæske i 3-4 timer og så overført til 25 % sukrose/0,01 M fosfatbuffer i 48 timer. Fem serier av 40 pm snitt gjennom striatum og substantia nigra (SN) ble kuttet på en frysemikrotom.

Kvantitativ fastleggelse av dopaminerge neuroner i SN: Antallet FG-merket i SN "pars compacta" ble fastlagt ved hjelp av en blendet observatør, som beskrevet tidligere (Sauer og Oertel, Neuroscience, 1994, 59, 401-415). I korte trekk ble det brukt tre på hverandre følgende snitt sentrert rundt nivået til den medialterminale kjerne i den aksessoriske synsbane (MTN, -5,3 i atlaset til Paxinos og Watson (1997)), hvor brukte og alle merkede/fargede neuroner lateralt til MTN ble tellet ved 40 x forstørrelse (n = 6-7/gruppe). FG-merkede neuroner ble inkludert dersom de ble klart fluorescerende under epibelysning ved 330 nm, fremviste en neuronal profil og gir minst én nervebetennelsesprosess.

På lesjonssiden hos dyr som fikk injeksjoner av lentivirus som bærer GFP, ble antallet FG-positive nigralneuroner redusert til 18 % av antallet på den intakte siden. I motsetning til dette oppviste dyr injisert med lentineublastin en tilnærmet fullstendig beskyttelse av antallet FG-positive nigralneuroner (89 %). Dette var like effektivt som lenti-GDNF-behandlede dyr, hvor 87 % av de retrogradmerkede neuroner forble på lesjonssiden. Dette viser at neublastin er en sterk overlevelsesfaktor for skadde voksne nigraldopaminneuroner, og at det er like sterkt som GDNF.

Figur 6 er en er en illustrasjon av in vivo- effekten av lentivirusprodusert neublastin på nigraldopaminneuroner. Neuroner i SN "pars compacta", hos Sprague-Dawley-hunnrotter, ble retrogradmerket med Fluorogold (FG) 3 uker før en enkelt-injeksjon av 6-hydroksydopamin (6-OHDA) i høyre striatum. Én uke før 6-OHDA-injeksjonen fikk dyrene injeksjoner med lenti-virusvektorer som uttrykker neublastin [neublastin], GDNF [GDNF] eller Green Fluorescent Protein [GFP], som angitt i figuren. 21 dager etter 6-OHDA-injeksjonene ble antallet FG-merkede neuroner på begge sider av striatumet bestemt. Figuren viser prosentandelen [% FG lesjon/intakt] av FG-merkede neuroner i den skadde (høyre) side versus den intakte (venstre) side av striatumet hos de tre gruppene av dyr.

Eksempel 10

Produksjon av antistoffer

For å fremstille antistoffer mot neublastin ble to kaniner immunisert med enten peptid 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (aminosyrer 108-124 i SEQ ID NO: 9) eller peptid 2: ALRPPPGSRPVSQPC (aminosyrer 93-107 i SEQ ID NO: 9) konjugert til bærerprotein ved 3 ukers intervaller. To kaniner for hvert peptid ble immunisert i ukene 0, 3, 6 og 10, og det ble tatt blodprøver i ukene 7 og 11. Den andre blodprøven ble affini-tetsrenset via en peptidaffinitetskolonne. Antistoffene ble kalt Ab-1 og Ab-2 etter peptidet.

Western blot: 2 x IO<6>HiB5-celler, stabilt transfektert med cDNA for neublastin (Hib5pUbilzNBN22), eller utransfekterte HiB5-celler ble inkubert over natten i serumfritt medium med N2-supplement (GIBCO). Mediet ble konsentrert på små konsentratorer med membraner med grenseverdi på 5 kDa (Millipore, Bedford, MA). Konsentrerte prøver ble tilsatt 5 x Laemmli-prøvebuffer og ble varmet opp til 95 °C i 5 minutter. Prøver ble separert ved hjelp av SDS- polyakrylamidgelelektro-forese på 15 % akrylamidgeler og overført til PVDF-membraner. Restproteinbindingsseter ble blokkert med 5 % ikke-fettholdig tørrmelk i PBS med 0,1 % Tween-20. Membraner ble inkubert over natten med neublastinantistoff (1:1000), etterfulgt av inkubasjon med et sekundært antikanin- eller antimuse-IgG-antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (1:2000).

Immunofarging ble visualisert ved å anvende forsterket kjemiluminescens Plus (ECL+) i henhold til produsentens instruksjoner (Amersham). Resultatene av disse forsøkene er vist i figur 3 og eksempel 5.

Ved å anvende standardteknikker frembrakte vi også polyklonale kaninantistoffer mot de følgende peptider: peptid R27: GPGSRARAAGARGC (aminosyrene 30-43 i SEQ ID NO: 9); peptid R28: LGHRSDELVRFRFC (aminosyrene 57-70 i SEQ ID NO: 9); peptid R29: CRRARSPHDLSL (aminosyrene 74-85 i SEQ ID NO: 9) ; peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC (aminosyrene 94-107 i SEQ ID

NO: 9); og

peptid R31: STWRTVDRLSATAC (aminosyrene 123-136 i SEQ ID

NO: 9).

Bare peptidene R30 og R31, forholdsvis nært til C-enden, gjenkjente det denaturerte protein under reduserende betingelser på et western blot.

Claims

1. Isolert neublastin polynukleotid,karakterisert vedat den er utvalgt fra gruppen bestående av: a) et polynukleotid som omfatter nukleotidsekvensen SEQ ID NO: 1, b) et polynukleotid som omfatter en åpen leseramme som koder for ekspresjon av et neublastinpolypeptid eller et polypeptid avledet derfra, hvori den modne delen av polypeptidet har en likhetsgrad med aai-aaiosi SEQ ID NO: 2 på minst 90 %, c) et polynukleotid som under hybridisering under høye stringens løsningsbetingelser spesifikt hybridiserer til nukleinsyren som har nukleotidsekvensen SEQ ID NO: 1, d) et polynukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som er minst 80 % lik polynukleitidsekvensen angitt som SEQ ID NO:

1, hvori det kodede polypeptidet har neurotrofisk aktivitet.

2. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat den modne del an det kodede poltpeptid har en likhetsgrad med aai-aaio5i SEQ ID NO: 2. på minst 95 %

3. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det kodede polypeptid bestar av aai-aaiosi SEQ ID NO: 2.

4. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det kodede polypeptid er SEQ ID NO: 5.

5. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det kodede polypeptid er SEQ ID NO: 6.

6. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det kodede polypeptid er SEQ ID NO: 7.

7. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter SEQ ID NO: 3.

8. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som er 80% lik polynukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.

9. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som er 90% lik polynukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.

10. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter polynukleotidet ifølge hvilket som helst av kravene 1-9.

11. Isolert vertscelle, karakterisert vedat den omfatter en ekspresjonsvektor ifølge krav 10.

12. Celle ifølge krav 11, karakterisert vedat den er en eukaryot celle.

13. Celle ifølge krav 12, karakterisert vedat den er utvalgt fra gruppen bestående av pattedyrceller, soppceller og gjærceller.

14. Celle ifølge krav 13, karakterisert vedat pattedyrcellen er utvalgt fra gruppen bestående av en ovariecelle fra kinesisk hamster, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b og humane neurale stamceller.

15. Polypeptid, karakterisert vedat den modne del av polypeptidet har en likhetsgrad med aminosyrene 1-105 i SEQ ID NO: 2 på minst 90%, hvori polypeptidet har neurotrofisk aktivitet.

16. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat den modne del av polypeptidet har en likhetsgrad med aminosyrene 1-105 i SEQ ID NO: 2 på minst 95%.

17. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det er et neublastin neurotrofisk faktor polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 2.

18. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det er et neublastin neurotrofisk faktor polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.

19. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det er et neublastin neurotrofisk faktor polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 5.

20. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det er et neublastin neurotrofisk faktor polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 6.

21. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det er et neublastin neurotrofisk faktor polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 7.

22. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 15-21,karakterisert vedat det er glykosylert.

23. Polypeptid ifølge krav 15,karakterisert vedat det kodes for av et polynukleotid ifølge ethvert av kravene 1-9.

24. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet ifølge krav 15-23, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnet med å uttrykke polypeptidet fra et neublastin-neurotrofisk faktor-polynukleotid ifølge ethvert av kravene 1-9.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat den omfatter trinnet med å dyrke en celle ifølge ethvert av kravene 11 til 14 som omfatter nevnte neublastin-neurotrofisk faktor-polynukleotid i et dyrkingsmedium som muliggjør produksjonen av polypeptidet.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25,karakterisert vedat den videre omfatter trinnet med å utvinne polypeptidet fra dyrkingsmediet.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat polypeptidet er renset.

28. Preparat, karakterisert vedat det omfatter polypeptidet ifølge hvilket som helst av kravene 15-23, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

29. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 15-23, for anvendelse som et medikament.

30. Polypeptid ifølge ethvert av kravene 15-23, for terapeutisk eller profylaktisk behandling av en neurodegenererende sykdom som involverer skadde og traumatiske neuroner.

31. Polypeptid ifølge krav 30, hvori sykdommen involverer traumatiske lesjoner av perifere nerver, traumatiske lesjoner av i margen, traumatiske lesjoner av ryggraden, cerebral, iskemisk nerveskade, neuropati, perifer neuropati, Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrof lateral sklerose eller hukommelsesforstyrrelser forbundet med demens.