ES2213221T3 - Factor de tipo egf de granulos de cromafina y factor neurotrofico derivado de celulas de glia con actividad promotora de la supervivencia sobre neuronas daergicas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS SIMILARES A EGF, DERIVADAS DE LOS GRANULOS DE CROMAFINA, QUE PRESENTAN UNA ACTIVIDAD PROMOTORA DE LA SUPERVIVENCIA DE NEURONAS DAERGICAS, A SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA DICHAS PROTEINAS O PARA UN DERIVADO FUNCIONALMENTE ACTIVO O PARTE DEL MISMO, Y A PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE LAS MISMAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A FACTORES NEUROTROFICOS DERIVADOS DE LAS CELULAS GLIALES, QUE SON CAPACES DE PROMOVER LA SUPERVIVENCIA DE NEURONAS DAERGICAS, A SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA DICHOS FACTORES O PARA UN DERIVADO FUNCIONALMENTE ACTIVO O UNA PARTE DEL MISMO, Y A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE LOS MISMOS.

Description

Factor de tipo EGF de gránulos de cromafina y factor neurotrófico derivado de células de glía con actividad promotora de la supervivencia sobre neuronas DAérgicas.

La presente invención se refiere a proteínas de tipo EGF derivadas de gránulos de cromafina que están implicadas en promover la supervivencia de neuronas DAérgicas, y a procedimientos para su preparación.

Los injertos de tejido medular adrenal y células de cromafina en el estriatum de pacientes con Morbus Parkinson (PD) y modelos animales de la enfermedad han presentado efectos terapéuticos que conducen a la restauración de los transmisores y las funciones motoras (para revisiones, véase Freed, 1993; Fisher y Gage, 1993). Una explicación común para estos efectos ha sido que las células de cromafina injertadas pueden compensar, secretando dopamina (DA), la ausencia sustancial de este transmisor nigrostriatal en PD (Ehringer y Homykiewicz, 1960). Sin embargo, las cantidades de DA sintetizadas y liberadas por las células de cromafina son pequeñas (aprox. 1% de las catecolaminas totales en ratas adultas; Coulter y col., 1988), y los aumentos de DA estriatal son incluso muy moderados inmediatamente adyacentes a un injerto de célula de cromafina (Becker y Freed, 1988). Se ha argumentado por lo tanto también que la liberación de mediadores químicos distintos a DA puede ser una causa para los efectos beneficiosos de los injertos de células de cromafina en el cerebro parkinsoniano. El brote sustancial de los axones restantes dentro del estriatum lesionado (Bohn y col., 1987; Kordower y col., 1991) ha planteado las especulaciones de que las moléculas neurotróficas o citoquinas que provocan la síntesis y liberación de moléculas neurotróficas pueden subyacer los efectos curativos de los injertos de células de cromafina. Esta idea recibe apoyo de la evidencia creciente de que las células de cromafina sintetizan, almacenan, y liberan un gran número de factores de crecimiento y neuropéptidos activos neurotróficamente (Lachmund y col., 1994; Unsicker y Stögbauer, 1992; véase Unsicker, 1993, y Unsicker y Krieglstein, 1996, para revisiones). Se demostró que la estimulación de la liberación de gránulos desde células de cromafina con el agonista colinérgico carbachol aumentaba el rendimiento de la actividad del factor neurotrófico para varias poblaciones de neuronas de los sistemas nerviosos periférico y central (Lachmund y col., 1994). La secreción inducida por despolarización de la actividad neurotrófica se paraleló por la liberación aumentada de cromo-granina A y catecolaminas sugiriendo una co-liberación desde los gránulos de cromafina.

Durante mucho tiempo, se ha sospechado que el factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2) era el responsable de al menos algunas de las acciones curativas de las células de cromafina injertadas en el sistema nigrostriatal lesionado, dado que el FGF-2 imita los efectos tróficos de los injertos (Otto y Unsicker, 1990, 1993a). Sin embargo, el FGF-2 no está situado en los gránulos de cromafina y no se libera a través de los caminos regulados o constitutivos de secreción (Bieger y col., 1995; Stachowiak y col., 1994).

En consecuencia, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar nuevos compuestos capaces de promover la supervivencia de neuronas DAérgicas (mesencefálicas), que se puedan usar para el tratamiento de alteraciones del SN periférico y/o central en el hombre.

Estos compuestos pueden ser la actividad de tipo EGF de los gránulos de cromafina así como partes funcionales de los mismos o compuestos químicos que hacen la misma función que son lo suficientemente pequeños para cruzar la barrera sangre-cerebro para realizar esa función.

La solución al problema técnico anterior se consigue por las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a la proteína derivada de los gránulos de cromafina que media selectivamente la actividad promotora de la supervivencia sobre las neuronas DAérgicas. El término "proteína derivada de gránulos de cromafina" se refiere a proteínas únicas definidas que, cuando se aplican únicamente o en combinaciones ejercen efectos tróficos, promotores de la supervivencia y diferenciación sobre las neuronas DAérgicas. La expresión "actividad promotora de la supervivencia selectiva sobre neuronas DAérgicas" se refiere a la actividad proteínica que puede conferir, por sí mismo o en combinación con otros factores presentes en los gránulos de cromafina, la supervivencia y diferenciación en las neuronas DAérgicas dentro del intervalo nanomolar o por debajo.

La proteína derivada de gránulos de cromafina de la presente invención es un ligando del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); es decir, la proteína derivada de gránulos de cromafina presenta efectos dentro de un intervalo nanomolar de concentraciones.

La proteína derivada de gránulos de cromafina de la presente invención es capaz de promover la maduración celular astroglial. La expresión "capaz de la maduración celular astroglial" quiere decir que dentro de un sistema de cultivo de células mesencefálicas embriónicas, la proteína aumenta el número de células astrogliales visualizadas por la expresión de proteínas que son específicas para este tipo celular.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la proteína derivada de gránulos de cromafina es capaz de inducir la proliferación de células no DAérgicas, que se supone que son células progenitoras gliales. La expresión "capaz de la proliferación de células no DAérgicas" quiere decir que el incremento del número de células progenitoras astrogliales supuestas es el efecto producido inicialmente por la "proteína derivada de gránulos de cromafina". Se supone que este efecto inicial es el prerrequisito para la promoción de la supervivencia por un factor secretado por el número incrementado de células astrogliales.

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de la proteína derivada de gránulos de cromafina definida anteriormente, que comprende las etapas de aislar gránulos de cromafina de células de cromafina y extraer el contenido de proteína soluble en agua que contiene la proteína derivada de gránulos de cromafina, de los gránulos de cromafina en una solución tampón. La expresión "aislar gránulos de cromafina de células de cromafina" comprende el fraccionamiento subcelular de los organelos celulares de cromafina por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa 1,7 M. La expresión "extraer el contenido de proteína soluble en agua que contiene la proteína derivada de gránulos de cromafina" comprende la lisis de los organelos obtenidos como el sedimento de la centrifugación de sacarosa 1,7 M en un tampón fosfato 10 mM a pH 7,0 siguiendo veinte minutos de congelación a -80ºC.

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína derivada de gránulos de cromafina definida anteriormente, opcionalmente en asociación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede usar para el tratamiento de alteraciones del SN periférico y/o central en el hombre como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer u otras demencias, otras alteraciones neurodegenerativas del sistema nervioso central y neuropatías periféricas que incluyen diabetes, neuropatía de cisplatino u otras enfermedades nerviosas periféricas genéticas o adquiridas.

Un objeto adicional de la presente invención comprende la aplicación del factor anterior derivado de gránulos de cromafina conjuntamente con moléculas neurotróficas encontradas previamente, como neurotrofinas, miembros del TGF-\beta, el factor de crecimiento de fibroblasto, y superfamilias de citoquinas neuropoyéticas.

Las figuras muestran:

Figura 1. Micrográficas electrónicas de preparaciones representativas de gránulos de cromafina bovinos. Bar = 1 \muM.

Figura 2. Fotomicrográficas de cultivos disociados de células mesencefálicas ventrales de rata E14 después de 8 días en cultivo teñido con anticuerpos monoclonales contra TH. Los cultivos eran cultivos control y cultivos tratados con la proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) a una dilución de 1:20, FGF-2 (10 ng/ml), o TGF-\alpha (20 ng/ml). Bar = 25 \muM.

Figura 3. El efecto promotor de la supervivencia de la actividad derivada de gránulos de cromafina se debe a una proteína. Los cultivos se trataron durante 7 días, comenzando 24 después del sembrado, con la proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Los cultivos gemelos se trataron con cantidades idénticas de proteína derivada de gránulos de cromafina inactivada por calor (VP calor), o proteína derivada de gránulos de cromafina digerida con tripsina (VP tripsina). Cada barra representa el número medio de células TH-positivas contadas en +/-MEB de cultivos triplicados de dos experimentos. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas a ***P<0,001.

Figura 4. Bajo estimulación colinérgica, las células de cromafina bovinas liberan la actividad promotora de la supervivencia para las neuronas DAérgicas en el medio. Los cultivos establecidos de células mesencefálicas ventrales de rata E14 se trataron durante 7 días, empezando 24 después del sembrado, con medio condicionado de células de cromafina estimuladas con carbachol, o medio condicionado de células de cromafina no estimuladas sin carbachol (control), o medio de cultivo que contiene carbachol (10^{-5} M). Cada barra representa el número medio de células TH-positivas contadas en +/-MEB de cultivos cuadriplicados de dos experimentos. *P<0,05.

Figura 5. Curva de respuesta a dosis de la actividad derivada de gránulos de cromafina (VP) en la supervivencia de neuronas TH-inmunoreactivas de cultivos mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días. Los cultivos se trataron con VP a diluciones de 1:10, 1:20, 1:50 y 1:200, o con FGF-2 (10 ng/ml). Los resultados son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos reproducidos. *P<0,05, ***P<0,001.

Figura 6. El efecto promotor de la supervivencia de la actividad derivada de gránulos de cromafina no se debe a la encefalina o al neuropéptido Y. Los cultivos se trataron durante 7 días, empezando 24 después del sembrado, con Leu-encefalina (Leu-ENK), Met-encefalina (Met-ENK), neuropéptido Y (NPY) a 100 ng/ml o con proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Cada barra representa el número medio de células TH-positivas contadas en +/-MEB de cultivos triplicados de dos experimentos.

Figura 7. Se muestran la captación de ^{3}H-DA, ^{3}H-GABA, y ^{3}H-serotonina (A) y la supervivencia de las neuronas inmunoreactivas con serotonina (B) para cultivos mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días. Se documenta el efecto de la proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Los controles de estudios de captación se fijaron al 100 por ciento. Los resultados son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos. *P<0,05, **P<0,01.

Figura 8. Fotomicrográficas de cultivos disociados de base de cerebro medio ventral de rata E14 después de 8 días en cultivo. Los paneles superiores muestran el teñido con anticuerpo monoclonal contra GFAP; los paneles de en medio muestran la visualización de la incorporación de BrdU usando anticuerpos monoclonales contra BrdU. Los paneles inferiores muestran el teñido nuclear usando yoduro de propidio (izquierda) y (derecha) doble marcado para TH (rojo) y BrdU (verde). Los cultivos mostrados en la parte a mano izquierda representan los cultivos control; los paneles en la parte a mano derecha son cultivos tratados con VP a una dilución de 1:10. Bar = 25 \mum.

Figura 9. Números de las neuronas TH-inmunoreactivas supervivientes de cultivos mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días. Se usaron el agente antimitótico FOUR y la gliotoxina AA a una concentración de 30 \mum cada uno en los cultivos control, o en los cultivos tratados con VP a una dilución de 1:50. Los resultados son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos.

Figura 10. Números de neuronas TH-inmunoreactivas supervivientes de los cultivos mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días. Los cultivos se trataron o con proteína derivada de gránulos de cromafina a una dilución de 1:20 de DIV1-DIV8(VP), o de DIV1-DIV4 seguido por tratamiento con medio de cultivo solamente (VP/DIV1-4), o tratamiento con medio condicionado con VP (VP-CM). Los resultados son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos. **P<0,01, ***P<0,001.

Figura 11. El efecto de promoción de la supervivencia de la proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) sobre neuronas DAérgicas se puede suprimir usando DAPH, un inhibidor de la ruta de señalización del EGFR. Los cultivos derivados del mesencéfalo ventral de rata E14 se trataron con VP a una dilución de 1:50 en ausencia o presencia, respectivamente, de 10 \muM de DAPH. Los cultivos no tratados sirvieron como controles. A DIV 6 los cultivos se fijaron y se procesaron para la reactividad GFAP o TH. Los números de células TH positivas (barras abiertas) se dan como la +/-MEB media de determinaciones triplicadas de dos experimentos reproducidos, y los números de células GFAP positivas se dan como la media de dos determinaciones de dos experimentos reproducidos.

Figura 12. La aparición de células astrogliales GFAP positivas inducidas por la proteína derivada de gránulos de cromafina, o TGF-\alpha, pero no FGF-2 se puede inhibir por DAPH, un inhibidor de la ruta de señalización del EGFR. Los cultivos derivados del mesencéfalo ventral de rata E14 se trataron con VP a una dilución de 1:50, FGF-2 a 10 ng/ml o TGF-\alpha a 20 ng/ml en ausencia (paneles de la izquierda) o presencia, respectivamente, de 10 \muM de DAPH o Tirfostina B56 (paneles de la derecha). A DIV 6 los cultivos se fijaron y se procesaron para inmunoreactividad TH (panel superior) o GFAP, seguido por visualización DAB. Bar = 25 \mum.

Figura 13. Expresión de GDNF en cultivos celulares mesencefálicos (DIV 8) detectada por RT-PCR. Los carriles - representan los controles, en los que el ARN total no se transcribió, los carriles + representan el ADNc. Se obtiene una señal positiva para GDNF (700 pb) de células de glioma B49, pero no de cultivos celulares mesencefálicos tratados con VP o no tratados.

Figura 14. La proteína derivada de gránulos de cromafina protege contra la toxicidad de MPP+. Se muestran los porcentajes de neuronas supervivientes TH + después del tratamiento con MPP+ (1 \muM), o MPP+ en combinación con VP 1:20. Los controles se fijaron como 100%. Los resultados son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos reproducidos. *P<0,05.

Figura 15. Cromatograma de la purificación de la proteína de los gránulos de cromafina en Heparin Sefarosa.

Figura 16. Números de neuronas TH-inmunoreactivas supervivientes de cultivos mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días, usando las fracciones de proteína después de la cromatografía de Heparin Sefarosa.

Figura 17. Cromatograma de la purificación de la proteína de los gránulos de cromafina usando RP-HPLC.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención:

Medio de cultivo, factores de crecimiento y productos químicos. El medio libre de suero usado consistió en medio Eagle modificado con Dulbecco y Ham F-12 (DMEM/F-12, BioWhittaker), incluyendo los complementos N1 (Bottenstein y col., 1980) apotransferrina, insulina, L-tiroxina, selenito sódico y progesterona (Sigma, Deideshofen, Alemania), y glutamina 2,5 mM (GIBCO, Eggenstein, Alemania), 2,5 mg/ml de albúmina de suero bovino (sigma), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, y fungizona 0,25 \mug/ml (BioWhittaker, Heidelberg, Alemania). La solución de sal equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio (CMF), el suero de caballo, la tripsina, la 5-fluorodesoxiuridina (FDUR), y el ácido \alpha-aminoadípico (AA) eran de Sigma, la ADNasa era de Boehringer. La 4,5-dianilinoftalamida (DAPH) y la Tirfostina B56 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania) se disolvieron en DMSO para dar una concentración final de 1 mM y se almacenaron en alícuotas a -20ºC.

Se usó un tubo de diálisis Spectrapor (Roth, Karlsruhe, Alemania) con un PM de corte de 3.500. Factores de crecimiento: rh FGF-2, rh TGF-\alpha, rh EGF (IC Chemikallen, Ismaningen, Alemania). Los factores de crecimiento liofilizados se resuspendieron en DMEM que contenía BSA 0,25% y penicilina, estreptomicina, y fungizona en la concentración dada, para dar una concentración final de 1 \mug/ml. Se conservaron alícuotas de 100 \mul a -70ºC hasta que se usaron.

Aislamiento del contenido soluble de los gránulos de cromafina. Los procedimientos de aislamiento siguen esencialmente el protocolo de Winkler y Smith (1975). Brevemente, se diseccionaron aprox. 60 adrenales bovinas obtenidas de la casa slughter, Manheim, Alemania, se juntaron de la médula en sacarosa 0,3 M, tampón fosfato 10 mM, pH 7,0, se homogeneizaron, se centrifugaron durante 15 min a 380 g, seguido por centrifugación del sobrenadante a 8.720 g durante 20 min. Se sabe que el sedimento contiene todos los organelos, que pueden entonces fraccionarse adicionalmente por gradientes de sacarosa. Para purificar grandes vesículas de núcleo denso, los gránulos de cromafina, el sedimento resuspendido (0,3 M sacarosa, fosfato 10 mM, pH 7,0) se cargó en un colchón de sacarosa 1,7 M. Los gránulos de cromafina se obtuvieron como un sedimento después de la centrifugación a 100.000 g durante 90 min. El sedimento se resuspendió en fosfato 10 mM pH 7,0, se congeló en nitrógeno líquido y se descongeló posteriormente, para lisar las vesículas y extraer el contenido de proteína soluble. Se recogieron fragmentos de membrana por centrifugación a 100.000 g durante 30 min. El sobrenadante que contenía la mezcla de proteína soluble de los gránulos de cromafina se dializó (PM de corte 3.500) durante la noche contra varios lotes de exceso de 100 veces de tampón fosfato 10 mM pH 7,0 para separar las catecolaminas y otros componentes de bajo peso molecular de las proteínas. Para cuantificar la concentración de proteína se empleó el ensayo de proteína de Bradford (Bio-Rad) usando gammaglobulina bovina como patrón (Bio-Rad). La solución de proteína se diluyó para dar una concentración de proteína final de 20 mg/ml. Esta solución de proteína después se filtró estéril (0,22 \muM) y se almacenó en alícuotas a -70ºC. Para cromatografía en Heparin-Sefarosa (Econo-Pac Cartucho de Heparina, 5 ml Bio-Rad) los gránulos purificados se cargaron en NaCl 100 mM, Tris 10 mM, Chaps 0,1% a pH 7,3. Después del lavado con el mismo tampón, la proteína se eluyó usando un gradiente desde NaCl 100 mM hasta NaCl 1 M en Tris 10 mM, Chaps 0,1% a pH 7,3. Las fracciones recogidas se desalaron por cromatografía en fase inversa (RP-HPLC) en columnas de Aquapore RP-300, 7 micrómetros, Applied Biosystems, usando tampón de separación A (TFA 0,1%) y tampón de separación B (TFA 0,1%/Acetonitrilo 90%). Para la determinación de la actividad biológica, las muestras liofilizadas se resuspendieron en 20 \mul de Acetonitrilo 50% y se añadieron al medio a 5 \mul por 2 ml de Medio a cada cambio de medio. La inactivación por calor se consiguió calentando una muestra de proteína tres veces a 90ºC durante 30 seg. Se digirió una alícuota con tripsina 0,1% a 37ºC durante 1 hora. La digestión se terminó añadiendo 100 \mug de inhibidor de tripsina de soja disueltos en 50 \mul PBS.

Microscopía electrónica. Los gránulos de cromafina aislados se sedimentaron y se fijaron con formaldehído 1,5% y glutaraldehido 1,5% en tampón fosfato (pH 7,4) seguido por tetróxido de osmio 1% en hexacianoferrato-II de potasio 1,5%. Después de la tinción de bloqueo en acetato de uranilo acuoso 1% y deshidratación en etanol, los sedimentos se fijaron en Epon, se seccionaron en un ultratomo LKB III y se vieron en un microscopio electrónico Zeiss EM10.

Cultivo de tejido. Los cultivos celulares mesencefálicos se establecieron esencialmente como describe Kriegstein y Unsicker (1994). En resumen, la base del cerebro medio ventral de fetos de rata Wistar del día embriónico (E) 14 de dos camadas (20-25 embriones) se diseccionó y se recogió en CMF. Las piezas de tejido se disociaron enzimáticamente usando tripsina 0,25% (BioWhittaker) en CMF durante 15 min a 37ºC. Después de la adición de un volumen igual de suero de caballo enfriado en hielo y 1mg ADNasa, las células se trituraron con pipetas pasteur pulidas al fuego y siliconizadas y posteriormente se lavaron con DMEM/F12. La suspensión celular única (100 \mul) se sembró en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina (0,1 mg/ml en tampón borato 15 mM, pH 8,4, Sigma)-laminina (5 \mug/ml; Sigma) a una densidad de 200.000 células/cm^{2}. Los cubreobjetos se incubaron en una atmósfera humidificada de CO_{2} 5%/aire 95% para permitir que las células se pegaran. Después de dos horas los cubreobjetos se transfirieron a placas de 24 pocillos (Falcon) que contenían 750 \mul de medio. Al día siguiente, y posteriormente cada tres días, se reemplazaron 500 \mul del medio y al mismo tiempo se añadieron los factores neurotróficos a las concentraciones dadas.

Las células de cromafina bovina se aislaron por perfusión y digestión de colagenasa como se describe previamente y se enriquecieron hasta >95% de pureza empleando centrifugación en gradiente Percoll (Unsicker y col., 1980; Bieger y col., 1995). Las células de cromafina se sembraron a 200.000 células/cm^{2} en matraces de cultivo de plástico (Falcon; 5x10^{6} células por 25 cm^{2}) y se mantuvieron en 5 ml de DMEM con complementos de N1 durante 40 h. Después del lavado de las células con medio precalentado, las células se expusieron a 2 ml DMEM/N1 que contenía el agonista colinérgico carbachol (10^{-5} M) durante 15 min, mientras que los cultivos control se trataron de forma idéntica, pero sin secretagoga (véase. Lachmund y col., 1994). El medio condicionado de células estimuladas y no estimuladas se almacenó en alícuotas a -80ºC para evitar el congelado y descongelado repetidos y se aplicó a dilución 1:4 a cultivos de neuronas DAérgicas mesencefálicas.

Inmunocitoquímica. Para identificar las neuronas DAérgicas o serotonérgicas, las células se visualizaron usando anticuerpos contra tirosina hidroxilasa (TH), o serotonina, respectivamente. Las células se fijaron con paraformaldehido 4% tamponado en fosfato tamponado salino (PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con acetona a -20ºC durante 10 min y se lavaron con (PBS). Después del bloqueo con H_{2}O_{2} 1% en PBS, seguido por suero de caballo 1%, los cubreobjetos se tiñeron con un anticuerpo monoclonal contra TH de rata (1:200; Boehringer Mannheim, diluido en suero de caballo 1%) o con un anticuerpo contra serotonina (1:50; DAKO) durante 1 h a 37ºC. El teñido específico se visualizó usando el kit anti-ratón Vectastain ABC en combinación con DAB (Camon, Alemania).Para la inmunocitoquímica de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), las células se fijaron y permeabilizaron usando acetona a -20ºC durante 20 min, después se lavaron con PBS y se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra GFAP (1:100; Sigma) durante 1 h a 37ºC. Se usó TRITC anti-Ig de ratón como anticuerpo secundario. Para controlar la proliferación celular se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) al cultivo, 24 horas antes de la fijación, a una concentración final de 10 \muM. Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol 70% tamponado con glicina 50 mM, pH 2,0, durante 20 min a -20ºC. La BrdU incorporada se identificó usando el kit de detección anti-BrdU I (Boehringer, Mannheim). La detección doble de BrdU/TH se consiguió aplicando primero el protocolo para BrdU seguido después de otros cinco lavados con PBS y por el procedimiento para teñido de TH usando TRICT anti- Ig de ratón como anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio (20 s, 0,1 \mug/ml). Los cubreobjetos se fijaron usando Aquatex (Merck, Darmstadt).

Estudios de captación de transmisores. La captación de alta afinidad de ^{3}H-DA, ^{3}H-GABA y ^{3}H-serotonina (Amersham) se determinó según un procedimiento modificado descrito por Alexi y Hefti (1993). Las células se lavaron tres veces con la solución de incubación (glucosa 5 mM y ácido ascórbico 1 mM en PBS, pH 7,4), se preincubaron durante 15 min a 37ºC con 0,5 ml de solución de incubación, antes de añadir ^{3}H-GABA o ^{3}H-serotonina 50 nM durante un periodo adicional de 15 min. Se obtuvieron blancos incubando las células a 4ºC. La captación se paró retirando la mezcla de incubación, seguido por tres lavados rápidos con PBS enfriado en hielo. Después se añadieron 300 \mul de agua destilada, los cultivos se congelaron durante 2 h a -80ºC, se descongelaron, y las células se rasparon dos veces con un volumen adicional de 200 \mul de agua destilada. La radiactividad extraída se midió por espectrometría de centelleo líquido después de la adición de 10 ml de cóctel de centelleo a cada vial.

Tratamiento de cultivos con MPP+, 5-fluorodesoxiuridina, y ácido \alpha-aminoadípico. El día 4 se añadió el ión de N-metil-4-fenilpiridinio (MPP+; RBI) a los cultivos celulares mesencefálicos a una concentración final de 1 \muM durante un periodo de 48 h. La toxina se reemplazó después por medio de cultivo fresco durante un periodo final de 48 h. El tratamiento con la proteína de los gránulos de cromafina comenzó 24 h antes de la adición de la toxina y duró hasta el final del experimento (día 8).

Se añadieron 5-fluorodesoxiuridina (FDUR, Sigma), o ácido \alpha-aminoadípico (AA, Sigma) a los cultivos a concentraciones finales de 30 \muM conjuntamente con cada cambio de medio (O'Malley y col., 1994).

Evaluación de los números de células. La supervivencia de células DAérgicas se evaluó contando todas las neuronas TH-positivas en una franja diagonal del cubreobjetos usando la ampliación de 100 veces. Esta área correspondió al 12% del área total. La cuantificación se hizo por triplicado y en al menos dos experimentos independientes. El número de células GFAP-positivas se calculó de la misma forma.

RT-PCR. A DIV 8 de la proteína de los gránulos de cromafina tratada o no tratada, se aisló el ARN total de los cultivos celulares mesencefálicos por extracción con tiocianato de guanidinio ácido/fenol/cloroformo desde 10 pocillos y se juntó (correspondiente a 2x10^{6} células). El ADNc se sintetizó en un volumen final de 20 \mul con los siguientes componentes: 2,5 \mug del ARN total, Tris-HCl 50 mM (8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, ditiotreitol 10 mM, dNTPs 5 mM, cebador oligo(dT) 25 mM (Gibco), 20 unidades de inhibidor de ARNasa (Boehringer) y 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript RNAasa H^{-}(Gibco). La mezcla se incubó a 37ºC durante 60 min. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 \mul que contenían ADNc (hecho de 625 ng de ARN total), Tris-HCl 10 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, Tween 20 0,002%, dNTPs 0,2 mM, cebadores 5' 1 \muM, cebadores 3' 1 \muM, 1,5 unidades de ADN polimerasa UITma (Perkin Elmer) usando la técnica de inicio caliente según instrucciones de los fabricantes, en un sistema de PCR Perkin Elmer GeneAmp 9600. Las etapas de amplificación implicaron la desnaturalización a 94ºC durante 1 min, alineamiento durante 2 min a 60ºC con cebadores de GDNF, y extensión a 72ºC durante 3 min. Las muestras (5 \mul) de las mezclas de PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 2% en presencia de bromuro de etidio. Los cebadores de GDNF se usaron como describe Schaar y col. (1993), y el tamaño esperado del producto de la PCR fue 700 pares de bases. El ARN aislado de células B49, la línea celular glial de la que se aisló originalmente el GDNF (Lin y col., 1993), se usó como control positivo para la amplificación de GDNF.

Estadísticas. Los datos se analizaron por un ANOVA de un sentido, y el significado de las diferencias intergrupo se determinó aplicando un test Student. Las diferencias se consideraron significativas a **P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Purificación de gránulos de cromafina y valoración de pureza

Se prepararon gránulos de cromafina bovina siguiendo esencialmente un protocolo de Winkler y Smith (1975). El sedimento obtenido que representaba la fracción granular se analizó por microscopía electrónica para detectar contaminaciones con otros organelos. En la Fig. 1 se muestra una micrográfica representativa de una preparación de gránulos de cromafina. El análisis de microscopio electrónico reveló que estas preparaciones están compuestas esencialmente por gránulos de núcleo de gran densidad, identificados por su densidad y tamaño de aproximadamente 280 nm. Los gránulos se rompieron usando un tampón salino bajo, para fluir solo proteínas solubles, que no están unidas a la membrana. Se usó diálisis extensiva para diluir catecolaminas y otros componentes pequeños, lo que dio como resultado una mezcla de proteínas analizada cuidadosamente por Winkler y col. (1986). Los constituyentes de proteínas destacados de los gránulos de cromafina son las cromograninas A y B, las encefalinas, el neuropéptido Y, y la dopamina-\beta-hidroxilasa (no mostrados).

La proteína de los gránulos de cromafina soluble promueve la supervivencia in vitro de las neuronas DAérgicas

Para evaluar los posibles efectos promotores de la supervivencia sobre las neuronas DAérgicas de la proteína de los gránulos de cromafina, los cultivos se trataron con esta mezcla a una dilución de 1:20, empezando el tratamiento el día 1 in vitro (DIV 1). La Fig. 2 muestra que la proteína de los gránulos de cromafina mantiene claramente más neuronas TH-positivas en comparación con los cultivos control después de ocho días en cultivo. Este efecto era comparable al visto tratando los cultivos con una concentración saturante de FGF-2 (10 ng/ml) o TGF-\alpha (20 ng/ml).

Para verificar que este efecto promotor de la supervivencia es de hecho debido a un componente proteínico, la muestra de proteína se incubó con calor y tripsina. Cualquiera de los dos procedimientos suprimió la actividad promotora de la supervivencia (Fig. 3), indicando que la actividad neurotrófica aislada de los gránulos de cromafina es una proteína.

La actividad DAérgica se libera de las células de cromafina por estimulación con carbachol

Para proporcionar pruebas de que la actividad DAérgica se almacenaba y se liberaba de los gránulos de cromafina, se aplicó medio condicionado por células de cromafina bovina a cultivos de neuronas DAérgicas mesencefálicas E14. El medio condicionado de células estimuladas con el agonista colinérgico carbachol (10^{-5} M) aumentó la supervivencia de las neuronas TH-positivas hasta 141,9 +/- 13,5% (n = 4; Fig. 4) de los valores control (medio condicionado de células no estimuladas) a DIV 8. El medio de cultivo que contenía carbachol fue ineficaz (Fig. 4). Así, los gránulos de cromafina almacenan y liberan una actividad neurotrófica que mantiene las neuronas DAérgicas del cerebro medio.

Dependencia de dosis de la supervivencia mediada por la proteína de los gránulos de cromafina de neuronas DAérgicas

La cuantificación del efecto neurotrófico de la proteína de los gránulos de cromafina mostró los mayores efectos promotores de la supervivencia a una dilución 1:20, y no pudo aumentarse adicionalmente usando una dilución 1:10. La CI_{50} se alcanzó a una dilución de 1:50 (Fig. 5).

El efecto trófico de la proteína de los gránulos de cromafina no se debe a neuropéptidos neuroactivos contenidos en los gránulos de cromafina

Para investigar si los componentes destacados de los gránulos de cromafina que se sabe que tienen algunas actividades tróficas (Unsicker y Stögbauer, 1992), pueden imitar los efectos observados, se analizó la capacidad del neuropéptido Y, Leu- y Met-encefalina para promover la supervivencia de las neuronas DAérgicas del cerebro medio. Sin embargo, ninguno de estos neuropéptidos tuvo ninguna actividad promotora de la supervivencia usando concentraciones hasta 100 ng/ml (Fig. 6).

El efecto trófico de la proteína de los gránulos de cromafina es selectivo para neuronas DAérgicas

Las neuronas DAérgicas son el 5-10% de la población de neuronas en el sistema de cultivo celular empleado así como en el mesencéfalo in vivo. Las neuronas no DAérgicas son principalmente GABAérgicas, pero hay también unas pocas neuronas serotonérgicas. Para analizar la selectividad del efecto promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina, se investigó su efecto sobre la captación de DA, GABA y serotonina, siguiendo un protocolo establecido que se usó para probar la selectividad de GDNF para neuronas DAérgicas (Lin y col., 1993). Como se muestra en la Fig. 7a, la captación de ^{3}H-DA y ^{3}H-serotonina, pero no la captación de ^{3}H-GABA se influenciaron por el tratamiento de los cultivos con la proteína de los gránulos de cromafina. El aumento en la captación de serotonina no era debido al efecto promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina, dado que el número de neuronas serotonina-positivas no se alteró significativamente (Fig. 7b).

El efecto trófico de la proteína de los gránulos de cromafina está acompañado por la maduración y proliferación astroglial de células no DAérgicas

Las moléculas que se ha informado que mantienen la supervivencia de las neuronas DAérgicas cultivadas parecen clasificarse en dos grupos. Una categoría ejerce sus efectos incrementando el número de células astrogliales, el otro grupo actúa aparentemente de una forma más directa sobre las neuronas DAérgicas (Unsicker y col., 1996). Para definir el mecanismo de la supervivencia de las neuronas DAérgicas mediada por la proteína de los gránulos de cromafina se estudiaron la proliferación celular y la diferenciación celular glial. Primero, se analizó la presencia de células astrogliales al final del periodo de cultivo usando un anticuerpo monoclonal para GFAP. Muy pocas células astrogliales, si es que alguna, eran detectables en los cultivos control no tratados a DIV8 (Fig. 8). Los cultivos tratados con la proteína de los gránulos de cromafina mostraron un aumento dramático en células GFAP-positivas (Fig. 8). Para controlar la proliferación celular, se administró BrdU a los cultivos, se dejó que se incorporara durante la fase S del ciclo celular, y se detectó usando un anticuerpo monoclonal contra BrdU. Los cultivos control mostraron la incorporación de BrdU en los núcleos de muy pocas células, mientras que los cultivos tratados con la proteína de los gránulos de cromafina mostraron abundantes núcleos marcados (Fig. 8). El doble marcado con anticuerpos contra BrdU y TH mostró que las células TH^{+} nunca incorporaban BrdU (Fig. 8). Estos datos indican que la actividad de los gránulos de cromafina es mitogénica para glioblastos (posiblemente también para otras células presentes en los cultivos) e induce la maduración de los glioblastos para que se conviertan en células astrogliales GFAP-positivas.

El efecto trófico de la proteína de los gránulos de cromafina está mediado por la proliferación celular y la inducción de las células astrogliales

Se ha demostrado previamente que el tratamiento con el agente antimitótico 5-fluorodesoxiuridina (FDUR), y el ácido aminoadípico de gliotoxina (AA) a concentraciones de 30 \muM inhibe eficazmente la proliferación celular y la maduración celular astroglial usando un sistema de cultivo celular similar (O'Malley y col., 1994). El tratamiento antimitótico se usó para bloquear la proliferación y posiblemente suprimir el efecto promotor de la supervivencia de la actividad derivada de los gránulos de cromafina. Se usaron concentraciones de la mitad del máximo de la proteína de los gránulos de cromafina (1:50) en combinación con FDUR, o AA 30 \muM, respectivamente. El tratamiento comenzó el DIV1, y los cultivos se procesaron el DIV8 para inmunocitoquímicas TH y GFAP. Como se muestra en la Fig. 9, ambos tratamientos suprimieron el efecto promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina sin afectar la supervivencia basal, descartando efectos secundarios tóxicos. Estos datos muestran claramente que el efecto promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina requiere el incremento numérico de una población celular en este cultivo, más probablemente glioblastos que maduran posteriormente a células astrogliales GFAP-positivas.

El efecto trófico de la proteína de los gránulos de cromafina está mediado por una molécula neurotrófica ("factor neurotrófico") sintetizada por un tipo celular presente en el sistema de cultivo

Los cultivos de neuronas DAérgicas del cerebro medio se establecieron como normalmente, y el tratamiento con la proteína de los gránulos de cromafina (1:20) empezó 24 h después del sembrado, durante un periodo de 72 h (DIV1-DIV4). En este momento, el medio de cultivo completo se retiró y se reemplazó por medio libre de suero, que se recogió y se renovó cada 48 h (DIV6 y DIV8). Estos medios (almacenados a 4ºC) se juntaron y se designaron "medio condicionado con proteína de gránulos de cromafina (VP-CM)". Los cultivos de neuronas DAérgicas del cerebro medio establecidos nuevamente se trataron entonces con VP-CM, empezando el DIV1, con dos cambios más de medio de cultivo el DIV4 y DIV6, y se procesaron finalmente para las inmunocitoquímicas de TH y GFAP el DIV8. Como se muestra en la Fig. 10, tratar los cultivos con la proteína de los gránulos de cromafina durante un periodo de tres, mejor que de siete días todavía produjo un efecto promotor de la supervivencia significativo a DIV8. Lo que es más importante, el medio condicionado de cultivos tratados con medio condicionado con gránulos de cromafina (VP-CM) produjo un efecto promotor de la supervivencia sobre las neuronas DAérgicas comparable. Este efecto no se acompañó por un aumento en células astrogliales. Así, la proteína de los gránulos de cromafina, en una primera etapa, provoca la maduración celular astroglial que conduce a la producción y/o liberación de un factor neurotrófico, que, en una segunda etapa, mantiene la supervivencia de las neuronas DAérgicas.

Los efectos promotores de la supervivencia y tróficos son detectables todavía después de la purificación de la proteína de los gránulos de cromafina por procedimientos cromatográficos

La Fig. 15 muestra el cromatograma de la purificación en Heparin Sefarosa. Las fracciones se procesaron para inmunocitoquímica de TH y GFAP. Como se muestra en la Fig. 16, después de la purificación en Heparin Sefarosa, las fracciones 4 y 7 produjeron un efecto promotor de la supervivencia significativo. Además, la fracción 4 fue capaz de inducir la maduración de los glioblastos para que se conviertan en células astrogliales GFAP-positivas. Las proteínas contenidas en la fracción 4 se purificaron adicionalmente usando RP-HPLC. La Fig. 17 muestra el cromatograma de la purificación. Las fracciones se procesaron para inmunocitoquímica de GFAP. Como se muestra en la Tabla 2, las fracciones 7 a 9 fueron capaces de inducir la maduración de los glioblastos para que se conviertan en células astrogliales GFAP-positivas.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

\begin{minipage}[t]{150mm} En las Tablas 1 y
2, la indicación  +  quiere decir que la actividad GFAP es
detectable y la indicación  -  quiere decir que la actividad
GFAP no es detectable.\end{minipage}

La inhibición de la superfamilia del receptor de EGF bloquea la maduración celular astroglial y, por consiguiente, el efecto promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina

Se ha demostrado que el FGF-2, el EGF, y el TGF-\alpha tanto promueven la supervivencia de las neuronas DAérgicas como aumentan la proliferación celular en cultivos celulares mesencefálicos (Otto y Unsicker, 1993b; Engele y Bohn, 1991; Knüsel y col., 1990). En una serie inicial de experimentos la actividad derivada de los gránulos de cromafina se analiza bloqueando específicamente su ruta receptora putativa. Se aplica un inhibidor de proteína tirosina-quinasa específico con selectividad por la ruta de transducción de la señal del receptor de EGF (EGFR) (Buchdunger y col. 1994). Habiendo demostrado por los experimentos de AA y FDUR que el efecto neurotrófico de la proteína de los gránulos de cromafina está mediado por astrocitos (véase Fig. 9) se cribó para la supresión del número de células astrogliales. El protocolo usado fue como sigue: 24 horas después del sembrado de células mesencefálicas y después de tres días, la proteína de los gránulos de cromafina a una concentración de 1:50 se mezcló con diferentes concentraciones del bloqueador de señalización de EGFR, DAPH y se administró junto con medio fresco. Después de un total de seis días, los cultivos se fijaron y se procesaron para inmunocitoquímica de GFAP. Como se muestra en las Fig. 11 y 12, el DAPH, a una concentración de 10 \muM inhibió tanto la supervivencia de las neuronas DAérgicas (Fig. 12, panel superior) como la aparición de células astrogliales inducida por la actividad de los gránulos de cromafina. Como se esperaba, la inducción mediada por FGF-2 de las células astrogliales no pudo afectarse por este inhibidor (Fig. 12). Cuando los cultivos se trataron con TGF-\alpha, un ligando de EGFR fisiológico en el SNC, o EGF (10 ng/ml), solo se pudieron detectar unas pocas células astrogliales GFAP-positivas (Fig. 12). Su aparición pudo bloquearse eficazmente por tratamiento de DAPH (Fig. 12). Estos datos muestran claramente que la aparición de células astrogliales inducida por la proteína de los gránulos de cromafina se puede inhibir específicamente por DAPH, un inhibidor selectivo de la ruta de señalización del EGFR, y que los ligandos TGF-\alpha y EGF no explican completamente el efecto mediado por la proteína de los gránulos de cromafina. Se eligió el inhibidor DAPH, porque se ha demostrado que no afecta a la transducción de señales de FGF-2 o a la señalización inducida de PDGF. Sin embargo, el compuesto DAPH inhibe no solo el EGFR sino también la autofosforilación p185^{c-erb82} (Buchdunger y col., 1994). Para probar cual de las dos proteínas quinasas está implicada en los efectos inducidos de la proteína de los gránulos de cromafina, se usó Tirfostina B56 que inhibe selectivamente la autofosforilación de quinasa de EGFR (Gazit y col., 1989). A 10 \muM, la Tirfostina B56 inhibió con éxito la aparición de células astrogliales inducida por la proteína de los gránulos de cromafina (Fig. 12). Este descubrimiento muestra más adelante que la proteína derivada de los gránulos de cromafina es un ligando de EGFR.

La molécula inducida por la proteína de los gránulos de cromafina no es GDNF

Para definir más a fondo la actividad trófica inducida por la proteína de los gránulos de cromafina en el cultivo celular mesencefálico, se llevó a cabo RT-PCR usando ARN de cultivos mesencefálicos a DIV8, que se habían tratado con la proteína de los gránulos de cromafina. Como se muestra en la Fig. 13, el ARNm de GDNF fue claramente detectable en muestras de ARN de la línea celular gliomal B49, de la que se había aislado y clonado la proteína (Lin y col., 1993). Por contraste, no se pudo detectar señal en los cultivos tratados con la proteína de los gránulos de cromafina lo que indica que es improbable que el GDNF sea un factor dopaminotrófico inducido por la proteína de los gránulos de cromafina.

La proteína de los gránulos de cromafina protege las neuronas DAérgicas contra la toxicidad de MPP+

La degeneración de las neuronas DAérgicas y sus terminales en el sistema nigrostriatal inducida por MPTP- y MPP+ se parece a la que se ve en la enfermedad de Parkinson (Kopin y Markey, 1988). Para evaluar si la proteína de los gránulos de cromafina tenía la capacidad para proteger las neuronas DAérgicas mesencefálicas de la muerte inducida por MPP+, se añadió MPP+ (1 \muM) a cultivos celulares mesencefálicos a DIV4, 24 horas posteriores a tratarlos con VP (1:20). El recuento de las neuronas DAérgicas supervivientes a DIV8 indicó que el tratamiento con VP protegía significativamente contra la toxicidad de MPP+ (Fig. 14).

Resumen

La proteína aislada y liberable de los gránulos de cromafina promueve la supervivencia de las neuronas DAérgicas mesencefálicas in vitro y las protege de la toxicidad de MPP+. El efecto neurotrófico se consigue en dos etapas. Primero, la proteína de los gránulos de cromafina provoca la proliferación celular y la maduración celular astroglial que implica un ligando de EGFR. Segundo, un factor derivado de las células de glía distinto de GDNF promueve la supervivencia de las neuronas DAérgicas mesencefálicas.

En particular, los constituyentes de la proteína del contenido soluble de los gránulos de cromafina bovina desencadenan mecanismos que conducen a la supervivencia potenciada de las neuronas DAérgicas cultivadas de la base del cerebro medio de rata embriónica. Así, las células de cromafina injertadas en el sistema nigrostriatal lesionado ejercen sus funciones beneficiosas a través de secretar molécula(s) activa(s) biológicamente distintas a las aminas biogénicas. Se sabe que las células de cromafina sintetizan, almacenan y liberan factor(es) neurotrófico(s) a través de la ruta exocitótica (Lachmund y col., 1994; Unsicker, 1993). No se ha establecido todavía ni su número ni su identidad molecular. El FGF-2, la molécula del factor de crecimiento probablemente más intensivamente estudiado en las células de cromafina (Stachowiak y col., 1994; Bieger y col., 1995) y factor trófico potente para neuronas DAérgicas en desarrollo y debilitadas tóxicamente in vitro e in vivo (Ferrari y col., 1989; Otto y Unsicker, 1990; 1993a, b), no se libera de los gránulos (Stachowiak y col., 1994; Bieger y col., 1995). En consecuencia, el FGF-2 no debe considerarse como un candidato para factores de la presente invención. Los injertos de cromafina en el cerebro reciben conexiones sinápticas funcionales de novo (Jousselin-Hosaja y col., 1994; Ortega y col., 1992). Además, se ha demostrado que las células de cromafina injertadas liberan sus contenidos granulares por exocitosis (Ortega y col., 1992). Se informó que la actividad exocítica era más frecuente en injertos en el estriatum en comparación con otros sitios de injertos en el cerebro. Es probable por lo tanto que las catecolaminas incluyendo DA y la(s) molécula(s) que produce(n) el efecto trófico fueran liberadas y pudieran ejercer sus acciones cerca del sitio del injerto simultáneamente.

Referente al mecanismo de acción del efecto promotor de la supervivencia derivado de los gránulos de cromafina sobre las neuronas DAérgicas embriónicas, podrían estar implicadas dos etapas, (i) la inducción de la proliferación celular y la maduración de una población creciente de células astrogliales GFAP-positivas, y la (ii) estimulación de la producción y/o liberación de un factor dopaminotrófico de las células gliales. Por lo tanto, la proteína derivada de los gránulos de cromafina según la presente invención es un factor de maduración glial y mitogénico. Puede, sin embargo, actuar adicionalmente a través de neuronas no DAérgicas. Varios factores de crecimiento mitogénicos, como el FGF-2, el EGF, y el TGF-\alpha (Knusel y col., 1990; Casper y col., 1991; Engele y Bohn, 1991; Alexi y Hefti, 1993) tienen efectos tróficos sobre neuronas DAérgicas mesencefálicas que están acompañados por un aumento en los números celulares, que incluyen las células astrogliales. Las células de cromafina pueden sintetizar FGF-2.

La inhibición de la superfamilia de EGFR bloquea tanto el aumento en las células astrogliales como el efecto promotor de la supervivencia. Se ha demostrado que el DAPH, el inhibidor de EGFR empleado, inhibe la proteína tirosina-quinasa de EGFR in vitro con alta selectividad y también tiene actividad antitumor potente in vivo (Buchdunger y col., 1994). Por lo tanto, que el factor de los gránulos de cromafina es un ligando para el EGFR. Dado que el EGF y el TGF-\alpha no imitan el efecto del factor granular sobre la maduración in vivo y la proliferación de los progenitores astrogliales mesencefálicos, cabe la posibilidad de que otro ligando de EGFR se almacene en las células de cromafina. Hay una amplia lista de ligandos de EGFR que comprende, además del EGF y el TGF-\alpha, la anfiregulina (Shoyab y col., 1988, 1989), el EGF de unión a heparina (Higashiyama y col., 1991), la betacelulina (Sasada y col., 1993; Shing y col., 1993), y la más recientemente identificada epiregulina (Toyoda y col., 1995). Otro miembro potencial es el factor de crecimiento derivado de Schawnoma (Kimura y col., 1990), que es homólogo a la anfiregulina (véase Lee DY y col., 1995, para revisión). Además, hay varios ARNm's que codifican proteínas relacionadas que pertenecen a la superfamilia de EGF, dlk, pG2, y prel-1 (Lee YL y otros, 1995). Además, varios productos génicos virales, por ejemplo, el VGF, producido por la familia Pox, y proteínas codificadas por los virus del fibroma y mixoma Sophe (véase Carpenter y Wahl, 1990, para revisión) son ligandos para el EGFR. Los mecanismos de transducción de nuevos EGFRs que interaccionan con ligandos todavía desconocidos también pueden se pueden afectar por DAPH y Tirfostina B56. Sin embargo, los ligandos del proto-oncogen p185c-erbB2/HER2/neu, como por ejemplo, la neuregulina, el factor de crecimiento glial/heregulinas (Marchionni y col., 1993) se pueden excluir como candidatos a factor, dado que la Tirfostina B56, que inhibe selectivamente la quinasa de EGFR (CI50 5,0 \muM), pero no la autofosforilación por la HER1-2-quinasa (CI50 > 500 \muM; Gazit y col., 1989), bloqueó completamente el efecto de la proteína del gránulo sobre la glía mesencefálica.

Otro punto relevante para la presente invención afecta a los mecanismos de clasificación y liberación de factores de crecimiento, especialmente en neuronas. Generalmente se ha supuesto, pero no probado previamente, que los factores de crecimiento se liberan a través de la ruta constitutiva de secreción. Ahora está apareciendo la prueba de que esto no es exclusivamente cierto. En la línea celular del feocromocitoma PC12, que se parece a células de cromafina en muchos sentidos, el BDNF y el NT-4 transfectados parecen liberarse principalmente a través de la ruta secretora regulada (Goodman y Hefti, 1994). Por contraste, las neuronas del hipocampo, secretan NGF transfectado por un mecanismo no convencional, que implica la despolarización y el influjo de potasio, pero no calcio externo (Btöchl y Thoenen, 1995). Así, la localización de un factor de crecimiento en los gránulos de cromafina y su secreción regulada puede no constituir un modo inusual de liberación para un factor de crecimiento.

Con respecto a la identidad del factor dopaminotrófico derivado glial inducido por la proteína de los gránulos de cromafina según la presente invención, el GDNF, la molécula dopaminotrófica más destacada, se excluye. Coherente con los resultados de la presente invención de que el efecto dopaminotrófico de la proteína de los gránulos de cromafina implica un incremento numérico y maduración de células astrogliales es el hecho de que los sitios de implantación de injertos de cromafina presenten acumulaciones pronunciadas de astroglía fibrosa (Hansen y col., 1988).

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Claims (4)

1. Uso de un factor receptor de la proteína derivada de los gránulos de cromafina que es un ligando del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), con una actividad promotora de la supervivencia selectiva sobre neuronas DAérgicas, para estimular la maduración celular astroglial.

2. El uso de una proteína derivada de gránulos de cromafina según la reivindicación 1 para estimular la proliferación de las células no DAérgicas.

3. Uso de una proteína derivada de gránulos de cromafina según la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar alteraciones del SNC periférico y/o central en el hombre.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que la alteración del SNC se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, una alteración neurodegenerativa, una neuropatía periférica incluyendo la diabetes y la neuropatía de cisplatino, y una enfermedad nerviosa periférica genética o adquirida.