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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleinsäure, die
eine Nukleotidsequenz enthält,
welche die primäre
Aminosäuresequenz
eines Proteins, z.B. eines TGF-β ähnlichen
Proteins, welches z.B. von Neuronen und Gliazellen abgeleitet wurde,
kodiert oder ein funktionell aktives Fragment davon, welches mindestens
einen neurotrophischen Effekt auf dopaminerge (DA-erge) Neuronen
oder funktionell aktive Homologe davon aufweist, die konservative
Aminosäuresubstitutionen
aufweisen und mindestens einen neurotrophischen Effekt auf DA-erge Neuronen aufweisen,
gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
und/oder Verdünnungsmittel,
in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prävention
und/oder Behandlung von neurodegenerativen Störungen in Säugern oder eines diagnostischen
Kits für
die Detektion der Störungen.
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Mitglieder
der TGF-β-Superfamilie
sind für
ihre wichtigen multifunktionellen Beteiligungen in der Entwicklung
und Aufrechterhaltung, wie der Organisation des Bauplans, der Regulation
der Zellproliferation, der Differenziation und des Zellüberlebens
bekannt. Die sich immer noch erweiternde TGF-β-Superfamilie schließt die TGF-β Isoformen
1 bis 5, Aktivine, Inhibine, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs),
Wachstums/Differenzierungsfaktoren (GDFs), die Anti-Müller Substanz,
den Drosophila Decapentaplegic Genkomplex, das Xenopus Vg-1 Gen
und eine wachsende Superfamilie an von Gliazelllinien abgeleiteten
Wachstumsfaktoren (GDNFs) und verwandte Proteine ein. Alle Vertreter
der TGF-β-Superfamilie
teilen mehrere homologe Strukturen. Sie werden als große Vorläufermoleküle synthetisiert,
die eine biologisch inaktive Pro-Domäne enthalten, welche als ein
Komplex mit dem reifen carboxyterminalen Teil sezerniert werden
kann. Darüber
hinaus werden die reifen bioaktiven Proteine durch Proteolyse unter
Verwendung einer charakteristischen Spaltungsstelle erzeugt. Vor
allem enthalten die reifen carboxyterminalen Segmente einen hochkonservierten
Cysteinknoten.
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Bootcov
et al. (Bootcov MR. et al., MIC-1, a novel macrophage inhibitory
cytokine, is a divergent member of the TGF-β superfamily, Proc. Natl., Acad.
Sci. USA, Vol. 94, S. 11514–11519,
Okt. 1997) beschreiben die Identifikation und Expression eines neuen
Cytokins der transformierenden Wachstumsfaktor (engl.: transforming
growth factor) β (TGF-β) Superfamilie,
bezeichnet als Makrophagen inhibierendes Cytokin-1 (MIC-1). Weiter
betrifft die WO 97/00958 ein neues TGF-β ähnliches Cytokin und isolierte
Polynukleotidmoleküle,
die dieses Protein kodieren. Außerdem
betrifft die WO 98/11224 ein rekombinantes Protein, welches die
Aminosäuresequenz
eines reifen GF-2H umfasst, welcher selektiv die Proliferation von
androgen unabhängigen
Prostatakrebszellen inhibiert, wenn diese damit in Kontakt gebracht
werden.
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Da
TGF-β ähnliche
Proteine ebenfalls an der Regulation der neuronalen Stammzellproliferation
und der Aufrechterhaltung von Neuronen beteiligt sind, besteht ein
großer
Bedarf an neuen Vertretern dieser Proteinfamilie.
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Folglich
ist die technische Aufgabe, welche der vorliegenden Erfindung zugrunde
liegt, neue Verbindungen bereitzustellen, die TGF-β ähnliche
Proteine betreffen, welche neurotrophe Aktivitäten aufweisen, die zur Behandlung
und Diagnose von neurodegenerativen Störungen geeignet sind.
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Die
Lösung
der oben genannten technischen Aufgabe wird durch die Bereitstellung
der Ausführungsformen
erreicht, wie sie in den Ansprüchen
charakterisiert werden.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, enthaltend
eine Nukleotidsequenz, kodierend die primäre Aminosäuresequenz eines Proteins,
umfassend mindestens die in 7B gezeigte
primäre
Aminosäuresequenz,
die in 8B gezeigte primäre Aminosäuresequenz
oder die Aminosäurereste
14 bis 111 der in 8B gezeigten Sequenz, z.B. ein
TGF-β ähnliches
Protein, welches z.B. von Neuronen und Gliazellen abgeleitet wurde
oder ein funktionell aktives Fragment davon, mit mindestens einem
neurotrophen Effekt auf DA-erge
Neuronen oder ein funktionell aktives Homolog davon, mit konservativen
Aminosäuresubstitutionen
und mit mindestens einem neurotrophen Effekt auf DA-erge Neurone oder
einen Vektor, enthaltend mindestens die Nukleinsäure oder ein Protein kodiert
durch die Nukleinsäure,
gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
und/oder Verdünnungsmittel,
in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prävention
und/oder Behandlung von neurodegenerativen Störungen in Säugern.
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Die
Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleotidsequenz" bezeichnen endogen
exprimierte, semisynthetische, synthetische oder chemisch modifizierte
Nukleinsäuremoleküle, die
vorzugsweise substanziell aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden
und/oder modifizierten Nukleotiden bestehen. Der Begriff "Nukleotidsequenz" kann weiter Exons
umfassen, in denen die Nukleotidsequenz die primäre Aminosäuresequenz kodiert und kann
basierend auf dem genetischen Code degeneriert sein. Der Begriff "primäre Aminosäuresequenz" bezeichnet die Sequenz
an Aminosäuren
unabhängig
von der Tertiär-
oder Quartärproteinstruktur.
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Der
Begriff "TGF-β ähnliches
Protein" bezeichnet
Proteine, welche die Charakteristika der TGF-β-Superfamilie zeigen, insbesondere
ein konserviertes Cystein reiches Motiv und die sowohl die großen Vorläufermoleküle, die
eine Pro-Domäne
enthalten, als auch die reifen bioaktiven Proteine umfassen, welche
durch Proteolyse unter Verwendung einer charakteristischen Spaltungsstelle
erzeugt werden.
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Die
Begriffe "funktionell
aktives Derivat" und "funktionell aktiver
Teil" bezeichnen
eine Proteinverbindung, welche mindestens einen neurotrophen Effekt
auf DA-erge Neurone
aufweist. Die funktionell aktive Form des oben definierten Proteins
kann sowohl eine monomere, dimere und/oder oligomere Form sein,
als auch eine heterooligomere Form, z.B. ein Heterodimer, welches
mindestens zwei verschiedene Monomere von TGF-β ähnlichen Proteinen umfasst,
die eine neurotrophe Aktivität
aufweisen.
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Der
Ausdruck "abgeleitet
von Neuronen und Gliazellen" bedeutet,
dass das Gen, welches für
das Protein kodiert, in Neuronen und Gliazellen, wie Purkinje Zellen
und Astrozyten transkribiert und/oder translatiert wird, so dass
die mRNA und/oder das Protein durch Verfahren des Standes der Technik,
wie in situ Hybridisierung, RT-PCR, Northern oder Western Blotting,
nachweisbar ist.
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Der
Ausdruck "neurotropher
Effekt auf DA-erge Neuronen" bezeichnet
eine Proteinaktivität,
die durch sich selbst oder in Kombination mit anderen Faktoren DA-ergen Neuronen Überleben
und Differenzierung innerhalb des nanomolaren Bereichs oder darunter
verleihen kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der oben definierten Verwendung, besitzen die Neurone und Gliazellen
einen Säugerursprung,
z.B. Mensch, Maus oder Ratte.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform,
schützt
das Protein gegen neurodegenerative Ereignisse. Solche neurodegenerativen
Ereignisse können
z.B. durch oxidative Schädigung,
freie Radikale, Vermittler oder Träger neuronaler Todesprogramme
wie Caspasen, pro- und anti-apoptotische Vertreter der bcl-2-Familie vermittelt
werden. Eine toxische Radikalschädigung
kann durch Eisen, z.B. Fe-Ionen,
NO und andere Radikaldonatoren vermittelt werden. Daher kodiert
die wie oben definierte Nukleinsäure
ein TGF-β ähnliches
Protein, welches in der Lage ist, DA-erge Neurone gegen Intoxikation
durch Eisen, von welchem behauptet wird, dass es die Parkinson-Krankheit
(PD) verursacht, zu schützen.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
umfasst die erfindungsgemäß verwendete
Nukleinsäure mindestens
die in 7A gezeigte Nukleotidsequenz
oder die in 8A gezeigte Nukleotidsequenz
oder die Nukleotide 40 bis 333 der in 8A gezeigten
Nukleotidsequenz oder Mutanten solcher Nukleinsäuren, die zur Expression von
funktionell aktiven Polypeptiden führen. Beispiele solcher Mutationen
schließen
Deletionen, Insertionen und Substitutionen von einem oder mehreren
Nukleotiden, wie Mutationen, welche zu konservativen Aminosäuresubstitutionen
führen,
ein, z.B. solche Mutationen im Bereich der Nukleotide 40 bis 333 der
in 8A gezeigten Nukleotidsequenz, d.h. die Region
der Nukleotidsequenz, welche die 7 Cys-Knotenregion kodiert, welche
in TGF-β ähnlichen
Proteinen hoch konserviert ist.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor,
der mindestens die wie oben definierte Nukleinsäure enthält. Der Begriff "Vektor" bezeichnet ein DNA-
und/oder RNA-Replikon, das für
die Amplifikation und/oder Expression der oben definierten Nukleotidsequenz
verwendet werden kann. Der Vektor kann alle geeigneten Kontrolleinheiten
enthalten, wie Promotoren, Enhancer oder andere Sequenzabschnitte innerhalb
der 5'-Regionen
der Sequenz, die der Kontrolle ihrer Expression dient. Der Vektor
kann zusätzlich innerhalb
der 5'- und/oder
3'-Region der Nukleotidsequenz
Sequenzen enthalten, die Aminosäuresequenzen wie
einen His-tag kodieren, welche für
die Detektion und/oder Isolation des durch die Nukleotidsequenz
kodierten Proteins geeignet sind. Darüber hinaus kann der Vektor
Sequenzelemente innerhalb der 5'-
und/oder 3'-Region
der Nukleotidsequenz, die Aminosäuresequenzen
kodiert, enthalten, die der Ausrichtung des durch die Nukleotidsequenz
kodierten Proteins auf Nervengewebe und/oder für das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke
dienen. Beispiele für
geeignete Vektoren sind Baculovirus-Vektoren.
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Die
erfindungsgemäß verwendete
Nukleinsäure
oder der erfindungsgemäß verwendete
Vektor können
in einem Wirtsorganismus enthalten sein. Der Begriff "Wirtsorganismus" umfasst ein Virus,
ein Bakterium wie Escherichia coli, einen Pilz, eine Pflanze, einen
nicht menschlichen Säuger
oder ein Insekt oder Teile davon, wie Zellen, z.B. Sf9 Zellen.
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Eine
Modulation der funktionellen Aktivität des Proteins, das gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, kann ebenfalls durch Verändern der
Expression der Nukleotidsequenz der oben definierten Nukleinsäure, verglichen
zur Expressionsmenge in einer normalen Zelle, erhalten werden. Zum
Beispiel kann eine Antisense Nukleinsäure, welche die mRNA maskiert
oder ein Ribozym, welches die mRNA spaltet, verwendet werden, um
die Expression zu inhibieren. Alternativ kann die Wirkung des Promotors
beeinflusst werden, welcher die Expression der Nukleotidsequenz
der oben definierten Nukleinsäure
reguliert.
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Die
Nukleinsäure,
der Vektor oder das Protein, die wie oben definiert verwendet werden,
können
z.B. durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die folgenden
Schritte umfasst:
- (a) Kultivieren eines Wirtsorganismus
in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen und
- (b) Isolieren des gewünschten
Produktes aus dem Medium und/oder dem Wirtsorganismus.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Proteins, verwendet
Bakterien wie E. coli als Wirtsorganismus. Die Expression des Proteins
kann dann zu einer funktionell inaktiven Form führen, z.B. zu amorphen Aggregaten
innerhalb des Bakteriums, welche im Stand der Technik als "Einschlusskörperchen" bekannt sind. Daher
kann das Verfahren weiterhin Schritte umfassen, welche der Rückfaltung
und/oder der Modifikation des isolierten Proteins in eine funktionell
aktive Form, die eine monomere, dimere oder oligomere Form sein
kann, dienen. Insbesondere kann dies ein Verfahren zur Herstellung
der biologisch aktiven, dimeren Form des oben definierten Proteins,
vorzugsweise GDF-15, aus seiner denaturierten oder in anderer Weise
nicht nativen Form sein. Dies Ergebnis wird durch die unerwartete
Erkenntnis erhalten, dass erhebliche Mengen der gewünschten
dimeren Produkte erhalten werden können, indem die monomere Form
des erfindungsgemäß verwendeten
Proteins Rückfaltungsbedingungen
unterzogen wird. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls
die Verwendung von dimerem, biologisch aktivem GDF-15, welcher mit
den oben definierten Verfahren hergestellt wurde.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
betrifft die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors oder des
Proteins oder des Antikörpers
oder des Antagonisten oder des Agonisten wie oben definiert, gegebenenfalls
in Verbindung bzw. Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
und/oder Verdünnungsmittel
bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Prävention und/oder zur Behandlung
von neurodegenerativen Störungen
bei Säugern, vorzugsweise
bei Menschen verwendet werden. Darüber hinaus können therapeutische
Techniken zur Behandlung von Störungen,
welche mit der Expression der Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden
sind, unter Verwendung der oben erwähnten Mittel entworfen werden,
welche in der Lage sind, die Expression der Nukleotidsequenz der
oben definierten Nukleinsäure
zu regulieren, z.B. Antisense Nukleinsäuren, Ribozyme und/oder Mittel
zur Beeinflussung der Promotoraktivität. Die neurodegenerativen Störungen sind
vorzugsweise akute und/oder chronische neurologische und psychologische
Störungen
und können
durch Schlaganfall, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder
andere Demenzerkrankungen, Infektionen des ZNS und psychiatrische
Störungen,
die mit Störungen
im ZNS-Transmittersystem verbunden sind, wie Depression und Schizophrenie,
verursacht werden.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zusätzlich
zu der Nukleinsäure
oder dem Vektor oder dem Protein oder dem Antikörper oder dem Antagonisten
oder dem Agonisten, wie oben definiert, ein oder mehrere Mittel,
welche eine neurotrophe Aktivität
aufweisen. Bevorzugte Mittel sind z.B. Cytokine oder funktionell
aktive Derivate oder Teile davon. Bevorzugte Cytokine, die in der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung verwendet werden, können aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus GDF wie GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8 und GDF-9, GDNF, TGF
wie TGF-α oder
TGF-β, z.B.
TGF-β1,
TGF-β2 oder
TGF-β3,
Aktivin A, BMP wie BMP-2, BMP-4, BMP-6 oder BMP-7, BMP-11, BMP-12,
BDNF, NGF, Neurotrophine wie NT-3 oder NT4, EGF, CNTF und FGF wie
FGF-2 besteht. Der Begriff "GDNF" schließt GDNF,
Neurturin und Persephin ein.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
der Nukleinsäure,
des Vektors, des Proteins und/oder des Antikörpers, wie oben definiert,
in der Herstellung eines diagnostischen Kits zur Detektion von neurodegenerativen
Störungen
und/oder Infektionen des ZNS wie Meningitis, z.B. einer bakteriellen
Meningitis bei Säugern,
vorzugsweise Menschen. Beispiele für andere neurodegenerative
Störungen
sind wie oben definiert.
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Die
Figuren zeigen:
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1 Lokalisation
von GDF-15 im ZNS. (A) Fotografisches Bild einer in situ Hybridisierung
eines Plexus choroideus einer adulten Ratte, durchgeführt mit
Ratten spezifischen GDF-15 Antisense RNA-Sonden. (B) Fotografisches
Bild einer Immunblot Analyse von menschlicher Cerebrospinalflüssigkeit
(CSF) unter reduzierenden Bedingungen mit gereinigtem GDF-15 Antiserum.
(C) RT-PCR von verschiedenen P0 Rattengehirnregionen (Pons, Medulla
oblongata, Kortex, Hippocampus, Striatum), Spinalganglien (DRG für engl.:
dorsal root ganglia), kultivierte primäre Astrozyten (astr.), oligodendrogliale
Zelllinie OLI-neu (OLI) und kultivierte oligodendrogliale Vorläufer (O-2A).
(D) Immunblot Analyse unter nativen Bedingungen der entsprechenden
Gehirnregionen und Zellen aus (c) mit gereinigtem GDF-15 Antiserum.
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2 Bild
einer Western Blot Analyse von GDF-15 in menschlicher CSF unter
reduzierenden Bedingungen. Molekulargewichtsmarker (St.). CSF-Probe von einem Patienten
mit bakterieller Meningitis (Spur 1). CSF-Probe eines Kontrollpatienten (Spur
2).
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3 Grafische
Darstellung von Untersuchungen, die den Überlebenseffekt von GDF-15
in mesencephalischen Neuronenkulturen zeigen. Anzahl der überlebenden
Tyrosinhydroxylase (TH)-immunreaktiven Neurone der mesencephalen
Kulturen (E15/DIV7) nur mit Medium behandelt (Kontrolle), gereinigtes
Lysat von nicht infizierten Sf9 Zellen (Baculo Kontrolle), GDF-15
(0,01 bis 1 ng/ml) aufgereinigt aus infiziertem Sf9 Zelllysat und
GDNF (10 ng/ml). Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (n = 3) angegeben,
P-Werte aus dem Student T-Test sind ***P < 0,001, **P < 0,01 für gesteigertes Überleben
verglichen mit Kontrollkulturen.
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4 Schutzwirkung von GDF-15 in Fe2+ (100 μM)
behandelten Kulturen. (A) Grafische Darstellung der Anzahl der überlebenden
TH-immunreaktiven Neurone mesencephalischer Kulturen (E15/DIV7),
nur in Medium mit oder ohne Fe2+ behandelt
(Kontrolle), in Anwesenheit von NT-4 (10 ng/ml) und in Anwesenheit
von GDF-15 (10 ng/ml). (B) Grafische Darstellung des prozentualen
Anteils überlebender
TH-immunreaktiver Neurone mesencephalischer Kulturen (E15/DIV7),
behandelt nur mit Medium mit Fe2+ (Kontrolle),
in Anwesenheit von NT-4 (10 ng/ml) und in Anwesenheit von GDF-15
(10 ng/ml). Werte der Kulturen ohne Zugabe von Eisen sind auf 100%
gesetzt. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler (n = 3) angegeben,
P-Werte aus dem Student T-Test sind *P < 0,05 für gesteigertes Überleben
verglichen mit Kontrollkulturen.
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5 Neurotrophe Effekte von GDF-15 in vivo.
(A) Grafische Darstellung von Amphetamin-Rotationsdaten von Ratten
mit unilateralen 6-OHDA (6-Hydroxydopamin)
Läsionen.
Rotationen pro Minute wurden für 60
min. überwacht,
beginnend 5 min. nach Amphetamingabe (5 mg/kg i.p.). (B) Grafhische
Darstellung der Anzahl der TH-positiven Neurone in SNpc. Werte sind
als prozentualer Anteil der TH-positiven Neurone der Seite mit Läsionen verglichen
zur Seite ohne Läsionen
angegeben. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler (n = 4) angegeben.
P-Werte aus dem Student T-Test sind *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
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6 Signalwirkung von GDF-15 durch Smad
Proteine. (A) Grafische Darstellung von Untersuchungen, welche die
Aktivierung des Smad Bindungs elements (SBE) durch TGF-β1 und GDF-15
in transient transfizierten hFob Zellen zeigen. (B) Grafische Darstellung
von Untersuchungen, die zeigen, dass der PAI-1 Promotor, welcher
ausschließlich
durch TGF-β1
bis -β3
aktiviert wird, in stabil transfizierten MLEZ Zellen nicht auf GDF-15 anspricht.
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7(A) cDNA und (B) entsprechende Aminosäuresequenz
des menschlichen prä-pro-reifen GDF-15.
Nukleotide und Aminosäuren
sind gemäß des internationalen
Einbuchstabencodes abgekürzt.
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8(A) cDNA und (B) entsprechende Aminosäuresequenz
des menschlichen reifen GDF-15.
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Das
folgende, nicht einschränkende
Beispiel stellt die Erfindung dar:
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BEISPIEL
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Identifikation von GDF-15
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Das
konservierte Cystein Knotenmotiv von TGF-β ähnlichen Proteinen verwendend,
lässt ein
kombinierter Ansatz, der RT-PCR und Bankenscreening einsetzt, die
vollständige
cDNA-Sequenz eines neuen Vertreters der TGF-β-Superfamilie erkennen, der
von Neuronen abgeleitet ist. Die cDNA weist die in 7A gezeigte
Sequenz auf, die der in 7B gezeigten
Aminosäuresequenz
entspricht.
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Gemäß eines
möglichen
alternativen Translationsstartcodons, welches 39 Nukleotide stromaufwärts von
dem ersten Nukleotid der in 7A gezeigten
Sequenz liegt, kann das entsprechende Protein ebenfalls 13 zusätzliche
Aminosäuren
(MPGQELRTLNGSQ) N-terminal zu der in 7B gezeigten
Sequenz umfassen.
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Das
Protein, welches GDF-15 genannt wird, wurde unter Verwendung des
Baculovirus Systems rekombinant exprimiert. Darüber hinaus wurde ein Antikörper ge gen
ein spezifisches Peptid entwickelt, welches von der Maus und Ratten
C-terminalen Sequenz
(HRTDSGVSLQTYDDL) abgeleitet wurde. Aufgrund der hohen Homologie
der entsprechenden Region der menschlichen Sequenz (QKTDTGVSLQTYDDL)
erkennt dieser Antikörper
ebenfalls menschlichen GDF-15.
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Lage des GDF-15 im ZNS
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Sowohl
in situ Hybridisierung mit GDF-15 Antisense RNA-Sonden, RT-PCR als
auch Western Blot Analysen wurden durchgeführt, um die Verteilung von
GDF-15 im ZNS zu untersuchen (1). Die
In situ Hybridisierung ließ Signale
in Neuronen, insbesondere in Purkinje Zellen, im Cerebellum und
starke Expression im Plexus choroideus (1A)
von neugeborenen und adulten Ratten erkennen. RT-PCR und Western Blotting von Proben,
die von verschiedenen Regionen von neugeborenen und adulten Rattengehirnen
und dem peripheren Nervensystem genommen wurden, weiteten diese
Ergebnisse durch Detektieren von mRNA und Protein in Pons, Medulla
oblongata, Mittelhirn, Striatum, Hippocampus, Kortex und Spinalganglien
aus (1C, D). Die größten Mengen
an mRNA Expression wurden im Plexus choroideus gefunden (1A). Gegen das oben genannte C-terminale Peptid
erzeugte Antikörper
wurden für
die Western Blots verwendet. Die Analyse von Proben verschiedener
Gehirnregionen von neugeborenen Ratten ließ eine distinkte Bande bei
31 kDa erkennen (1D). Die relative Masse von
zellulärem
GDF-15 liegt in guter Übereinstimmung
mit dem theoretischen Molekulargewicht von 31 kDa des Pro-Proteins.
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Da
GDF-15 im Plexus choroideus häufig
auftritt, wurde die Anwesenheit des Proteins in der CSF von sowohl
gesunden menschlichen Patienten, als auch von Patienten mit verschiedenen
neurologischen Störungen überprüft. Im Gegensatz
zum intrazellulären
Protein, welches in Gehirnproben detektiert wurde, ließen CSF-Proben unter reduzierenden
Bedingungen eine einzelne Bande von ungefähr 12 kDa erkennen, welche den
sezernierten, reifen Teil von GDF-15 darstellt. Die größten Mengen
an Protein in der CSF wurden bei Patienten mit bakterieller Me ningitis
(2) gesehen. Diese Daten zusammengenommen weisen
darauf hin, dass GDF-15, ein neuer Vertreter der TGF-β-Superfamilie
häufig
in verschiedenen Regionen des ZNS, einschließlich CSF und peripheres Nervensystem,
exprimiert wird. Darüber
hinaus ist GDF-15 in der CSF von Patienten mit einer entzündlichen
neurologischen Erkrankung signifikant angestiegen, was die Gelegenheit
bereitstellt, Antikörper
gegen GDF-15 als diagnostische Hilfsmittel bei neurologischen Erkrankungen
einzusetzen.
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Herstellung von dimerem,
biologisch aktivem GDF-15
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2 μg monomeres
GDF-15 Protein (z.B. in Bakterien wie E. coli hergestellt) wird
in 2917,7 μl
Lösungspuffer
(1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 9,5) gelöst. Zu dem
denn gelösten
Protein wird das Folgende hinzugefügt (zu einem Gesamtvolumen
von 3580 μl
führend):
35,8 μl 100 mM
oxidiertes Glutathion (GSSG)
35,8 μl 200 mM reduziertes Glutathion
(GSH)
590,7 μl
CHAPS (3-[(Cholamidopropyl)-dimethylamino]-1-propansulfonat)
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Nach
einer Inkubation bei 20 bis 22°C
für 48
h sind mehr als 80%, typischerweise 90% des monomeren Proteins in
das gewünschte
dimere Produkt rückgefaltet.
Die Trennung des Dimers wird mit chromatographischen Standardverfahren
wie Umkehrphasen Chromatographie durchgeführt.
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Funktionsstudien unter
Verwendung des rekombinanten menschlichen GDF-15
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Unter
Verwendung des Baculovirus Systems wurde der reife Teil des menschlichen
rekombinanten GDF-15 Proteins in Sf9 Zellen exprimiert. Die gleichen
Ergebnisse werden jedoch in allen Funktionsstudien erhalten, wenn
in Bakterien exprimierter rekombinanter menschlicher GDF-15 verwendet
wird, welcher mit den oben beschriebenen Rückfaltungsverfahren renaturiert
wurde. Ein Western Blot zeigte die monomere oder dimere Form des
rekombinanten Proteins unter jeweils reduzierenden und nicht reduzierenden
Bedingungen. Einer Aufreinigung folgend, wurde das Protein auf seine Überlebenseffekte
auf embryonale DA-erge Mittelhirnneurone der Ratte getestet. Das
Hinzufügen
von rekombinantem GDF-15 zu Kulturen von E14 Mittelhirnzellen erhöhte die
Anzahl an überlebenden
Tyrosinhydroxylase (TH)-positiven Neuronen in vitro nach 7 Tagen,
verglichen mit Kontrollkulturen (3). Der
dopaminotrophe Effekt von GDF-15 ist vergleichbar zur dokumentierten überlebensbegünstigenden
Aktivität
von anderen Vertretern der TGF-β-Superfamilie
und der Neutrophin-Familie (z.B. TGF-β, Vertreter der GDNF-Superfamilien oder
BDNF). Eine Analyse von Mittelhirnkulturen, die Immunzytochemie
und Antikörper
gegen das Astrozyten spezifische Intermediärfilament Protein GFAP verwendete
und Assays zur Zellproliferation wiesen darauf hin, dass eine GDF-15
Anwendung seinen überlebensbegünstigenden
Effekt nicht durch einen Anstieg der Zellzahlen und das Begünstigen
der Astrozytenreifung ausübt,
eine gängige
Quelle neurotropher Faktoren. Dies weist darauf hin, dass GDF-15
eher direkt als indirekt auf dopaminerge Neurone wirkt, wie für FGF-2
oder BMPs gezeigt.
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Um
zu untersuchen, ob GDF-15 ebenfalls in der Lage ist, DA-erge Neurone
gegen eine wahrscheinliche Ursache von PD zu schützen, d.h. Eisenintoxikation,
wurden seine Effekte auf Eisen intoxizierte mesencephalische Neurone
untersucht (4A, B). Ein Exponieren der Kulturen
auf Eisen (Fe2+) verursachte eine 80%-ige
Reduktion des neuronalen Überlebens
verglichen mit unbehandelten Kontrollkulturen. Zellverluste wurden
auf 50% reduziert, wenn die Kulturen zusammen mit Fe2+ und
GDF-15 behandelt wurden. Diese Daten weisen stark darauf hin, dass
GDF-15 DA-erge Neurone
gegen Eisen vermittelte (oxidative) Schädigung schützt. Diese Daten unterstützen ebenfalls
die Verwendung von GDF-15 als ein Mittel zum Vorbeugen oder Verlangsamen
neurodegenerativer Ereignisse, die durch freie Radikale, oxidativen
Stress, Vermittler und Träger
von neuronalen Todesprogrammen vermittelt werden.
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Darüber hinaus
wurde festgestellt, dass GDF-15 ebenfalls lädierte DA-erge Mittelhirnneurone
in vivo schützt.
Das nigrostriatale System von adulten Ratten wurde durch eine unilaterale
Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) direkt oberhalb der linken
Substantia nigra (SN) lädiert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind jeweils in den Tabellen
1A und B gezeigt. Die Daten, die in Tabelle 1B gezeigt werden, sind
ebenfalls in 5A grafisch dargestellt.
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Tabelle
1: Amphetamin Rotationsdaten A:
Rotationen pro Minute für
60 min., beginnend 5 min. nach Amphetaminverabreichung (5 mg/kg
i.p.)
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Alle
Ratten zeigten die typischen Eigenschaften einer Amphetaminbehandlung
wie Stereotypie und Piloerektion. Ratten, die nur mit 6-OHDA behandelt
wurden, zeigten Rotationsgeschwindigkeiten von 11,0 ± 1,41 (Mittelwert ± Standardabwei chung),
was auf einen mindestens 95%-igen Schwund des nigrostriatalen Weges hinweist
(Ungerstedt et al. (1970), Brain. Res. 24, 485–493). Im Gegensatz dazu rotierten
Ratten, die zusätzlich
mit GDF-15 behandelt wurden, mit sehr niedrigen Geschwindigkeiten
(0,75 ± 0,83),
was zeigt, dass dies Protein effektiv einen 6-OHDA induzierten Schwund von Dopamin
im linken Striatum verhindert, vgl. ebenfalls 5A.
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Um
darüber
hinaus zu bestätigen,
dass die oben genannte Verhinderung eines 6-OHDA induzierten Dopaminschwunds im
linken Striatum aufgrund eines neuroprotektiven Effekts von GDF-15
auf die Neurone in der SN erfolgt, wurden die SN-Pars compacta (SNpc) immunzytochemisch
analysiert. Zählungen
der TH-positiven
Neurone in den SNpc, gemessen in drei einzelnen Ebenen, sind in
Tabelle 2A gezeigt, und die Mittelwerte für jede Ratte sind jeweils in
Tabelle 2B angegeben. Die Gesamtmittelwerte für die 6-OHDA behandelten (n
= 4) und für
die Ratten, die mit 6-OHDA und GDF-15 zusammen behandelt wurden
(n = 4), sind in Tabelle 2C gezeigt. Die in Tabelle 2C gezeigten
Daten sind ebenfalls in 5B grafisch
dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zusammenbehandlung
der Ratten mit 6-OHDA und GDF-15 zu einem 10-fachen Anstieg der Anzahl
der TH-positiven
Neurone im linken Striatum führt,
verglichen zu der Behandlung mit 6-OHDA alleine. Daher verhindert GDF-15
6-OHDA induzierten Schwund von Dopamin im linken Striatum aufgrund
seines starken neuroprotektiven Effekts auf TH-immunreaktive Neurone.
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Tabelle
2: Daten der TH-Immunzytochemie A:
Anzahl der TH-positiven Neurone in den Substantia nigra Pars compacta
in drei Ebenen, –2,8, –3,0 und –3,2 relativ
zum Bregma (nach Pellegrino et al., A stereotaxic atlas of the rat
brain. Plenum Press, New York, 1979)
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B:
Mittelwerte der einzelnen Ratten
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C:
Mittelwerte von 6-OHDA behandelten Ratten und Mittelwerte nach Zusammenbehandlung
mit 6-OHDA plus GDF-15
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Zusammenfassend
zeigen die oben genannten in vivo Studien, dass Injektionen von
GDF-15 direkt vor 6-OHDA über
die linke SN und in den linken lateralen Ventrikel 6-OHDA induziertes
pathologisches Rotationsverhalten verhindern (5A)
und Verluste an DA-ergen SN Neuronen signifikant reduzieren (5B). Zusammen
zeigen diese Daten, dass GDF-15 nützlich eingesetzt werden kann,
um die Folgen der nigrostriatalen Degeneration bei der Parkinson-Krankheit
zu verbessern.
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Die
Verwendung des Plasmid Smad Bindungselements (pSBE), welches durch
TGF-β1,
OP-1 (auch als BMP-7 bezeichnet), Aktivin, BMP-2 und GDF-5 aktiviert
wird, brachte die weitere Frage auf, ob GDF-15 in der Lage ist,
eine intrazelluläre
Signaltransduktion durch Smad Proteine zu induzieren. Transiente
Transfektion der menschlichen Osteoblasten Zelllinie (hFob) mit
SBE zeigte, dass eine GDF-15 Verabreichung das Luciferase Signal
steigerte (6A). Diese Ergebnisse zeigen,
dass GDF-15 das auf Smad ansprechende Promotorelemet des Reportergenkonstrukts
aktiviert. In einer weiteren Untersuchung wurde die Induzierbarkeit
des Plasminogenen Aktivator Inhibitor Promotors (PAI) in stabil
transfizierten Mink Lungen Epithelzellen (MLEZ) durch GDF-15 untersucht.
Der MLEZ Assay, der ausschließlich
für TGF-β1, -β2 und -β3 empfindlich
ist, ließ keinen
Effekt von GDF-15
erkennen (6B). Da Smad2- und Smad3-Phosphorylierung
spezifisch mit der TGF-β vermittelten
Aktivierung von TGF-β Rezeptoren
verbunden ist, wird geschlussfolgert, dass GDF-15 nicht den Smad2/3
Signalweg zu verwenden scheint.
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Bezüglich der
GDF-15 abhängigen
Aktivierung von SBE, welches sowohl für den Smad2/3, als auch für den BMP
vermittelten Smad1/5 Weg ein Antwortelement ist, scheint es, dass
GDF-15 seine zellulären
Effekte durch die Bindung an BMP ähnliche Rezeptoren ausübt.
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Zusammenfassung
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Als
Fazit, ein neues neurotrophes Molekül, GDF-15, welches von Neuronenzellen
abgeleitet wurde, die zur TGF-β-Superfamilie
gehören,
wurde entdeckt, kloniert, exprimiert und funktionell charakterisiert.
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GDF-15
mRNA und Protein kann im Nervensystem detektiert werden, z.B. im
Mittelhirn, im Striatum und im Kortex, aber die größten Mengen
der mRNA und des Proteins werden jeweils im Plexus choroideus und
in der Spinalflüssigkeit
(CSF) gefunden. Interessanterweise sind die Proteinmengen in der
CSF bei bestimmten neurologischen Störungen erhöht, z.B. bei Patienten mit
bakterieller Meningitis. Um seine Funktionen zu erklären, wurde
die reife Form des menschlichen GDF-15 unter Verwendung eines Baculovirus
Expressionssystems rekombinant exprimiert. Die Expression führte zur
Synthese der biologisch aktiven dimeren Form des Proteins. In vitro
Untersuchungen, die dissoziierte Zellkulturen embryonaler Ratten
Mittelhirnneurone verwendeten, ließen erkennen, dass GDF-15 als
ein neurotropher Faktor für
DA-erge Mittelhirnneurone, die bei der Parkinson-Krankheit (PD)
degenerieren, wirken kann. GDF-15 ist ebenfalls in der Lage, diese
Neurone gegen Intoxikation durch Eisen, welches ursächlich für PD sein
kann, zu schützen.
Darüber
hinaus konnte gezeigt werden, dass GDF-15 seinen neuroprotektiven
Effekt ebenfalls in vivo aufweist. Bezüglich des Signalweges über den
GDF-15 wirkt, wurde festgestellt, dass GDF-15 in der Lage ist, eine
intrazelluläre
Signaltransduktion über
Smad Proteine zu induzieren.
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Daher
kann gefolgert werden, dass GDF-15 wichtige Funktionen bei der Entwicklung
von Möglichkeiten
aufweist, die das reife und lädierte
Gehirn einbeziehen, GDF-15 für
die Behandlung und die Diagnose von akuten und chronischen neuro logischen
und psychologischen Störungen
wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit und andere Demenzerkrankungen
und psychiatrische Störungen,
die mit Störungen
im ZNS-Transmittersystem verbunden sind, zu verwenden.
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Verfahren für in vivo
Untersuchungen, die den schützenden
Effekt von GDF-15
auf 6-OHDA lädierte
nigrostriatale Neurone zeigen
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Adulte,
weibliche Wistar Ratten wurden unter Verwendung von Ketamin (75
mg/kg i.p.) und Xylazinum (15 mg/kg i.p.) anästhesiert und in einen Kopf
stereotaktischen Rahmen gesetzt. GDF-15 wurde in einer Endkonzentration
von 2 μg/μl in 10 mM
Phosphat gepufferter Salzlösung
(PBS), pH-Wert 7,4, verwendet. Vier Ratten erhielten Injektionen
von 20 μg
GDF-15 kurz oberhalb der linken Substantia nigra (SN) und 20 μg GDF-15 in
den linken lateralen Ventrikel (LV). Dem folgte sofort eine Injektion
von 6-Hydroxydopaminhydrobromid (8 μg als freie Base in 4 μl 0,9% Salzlösung mit
0,1% Ascorbinsäure)
in das linke mediale Vorderhirnbündel (MVB).
Vier weitere Ratten erhielten nur 6-OHDA. Die stereotaktischen Koordinaten
(Pellegrino et al., A stereotaxic atlas of the rat brain. Plenum
Press, New York, 1979) waren wie folgt: AP –3,0, LV +2,5, DV –8,5 für die SN;
AP +1,0, LV +1,2, DV –3,5
für den
LV; AP –2,2,
LV +1,5, DV –7,9
für das
MVB. Alle Ratten wurden sieben Tage nach der Operation nach Verhaltenskriterien
untersucht. Die ipsilateralen Rotationen wurden über einen Zeitraum von 60 min.
gezählt,
beginnend 5 min. nach der Verabreichung von (+)-Amphetaminsulfat
(5 mg/kg, i.p.). Zehn Tage nach der Operation wurden alle Ratten
terminal mit Chloroform/Äther
anästhesiert
und intrakardial mit 200 ml kalter 0,1 M Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS),
pH-Wert 7,4, welche 500 Units Heparin enthielt, gefolgt von 300
ml frisch angesetztem 4% Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Die
Gehirne wurden entfernt und über
Nacht in 4% Paraformaldehyd in PBS gebracht, gefriergeschützt in 30%
Sucrose in PBS und anschließend
eingefroren. 30 μm
koronale Seriengefrierschnitte durch die SN Pars compacta (SNpc)
wurden geschnitten und immunzytochemisch auf Tyrosinhydroxylase
(TH) gefärbt.
Die Schnitte wurden über
Nacht bei 4°C
in Blockierungslösung
(3% normales Ziegenserum, 0,2% Triton X-100 in PBS), anschließend in
einer 1:2000 Lösung
Kaninchen-Antiserum gegen TH (Affi niti Labs, U. K.) in Blockierungslösung über Nacht
bei 4°C inkubiert.
Die Schnitte wurden fünfmal
in PBS gewaschen, welches 0,02% Triton X-100 enthielt und anschließend über Nacht
bei 4°C
in einer Lösung
aus 1:1000 Meerrettich Peroxidase gekoppeltem Anti-Kaninchen IgG (Vector
Labs) inkubiert. Nach Waschen wie zuvor, wurde die TH-Immunfärbung unter
Verwendung von 3,3'-Diaminobenzidin
als Chromogen sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden auf gelatinisierte
Objektträger
gebracht, in Alkohol dehydriert, in Xylen aufgehellt und mit DePeX® (Bio-products,
Heidelberg, Deutschland) eingedeckt. TH-immunreaktive Neurone wurden
in den SNpc auf beiden Seiten des Gehirns in jedem der drei Ebenen, –2,8, –3,0, –3,2 in
Bezug auf das Bregma (Pellegrino et al., 1979) gezählt.
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