ES2937167T3 - Terapia de combinación que usa inhibidores de factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15) humano y bloqueadores del punto de control inmunitario - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a usos de inhibidores del factor 15 de diferenciación y crecimiento humano (GDF-15), ya usos combinados de tales inhibidores con bloqueadores de puntos de control inmunitarios, en el tratamiento de cánceres sólidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de combinación que usa inhibidores de factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15) humano y bloqueadores de puntos de control inmunitario

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inhibidores de factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15) humano para sus usos en el tratamiento de cánceres sólidos, a productos de combinación de inhibidores de factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15) humano, para su uso en el tratamiento de cánceres sólidos, y a composiciones y a kits que comprenden inhibidores de factor de crecimiento y diferenciación 15 (GDF-15) humano.

Antecedentes

Hasta la fecha, muchos cánceres siguen siendo áreas de necesidades médicas insatisfechas, y por consiguiente, son necesarios medios para tratar más eficazmente el cáncer.

Se sabe que muchos tipos de cáncer expresan factores de crecimiento, incluyendo factores tales como VEGF, PDGF, TGF-p y GDF-15.

GDF-15, el factor crecimiento y diferenciación 15, es un miembro divergente de la superfamilia de TGF-p. Es una proteína que se expresa de manera intracelular como precursor, posteriormente se procesa y finalmente se secreta a partir de la célula al entorno. Tanto la forma activa, completamente procesada (madura) como el precursor de ^g DF-15 pueden encontrarse fuera de las células. El precursor se une covalentemente a través de su secuencia de aminoácidos COOH-terminal a la matriz extracelular (Bauskin AR et al., Cancer Research 2005) y, por tanto, reside en el exterior de una célula. La forma activa, completamente procesada (madura) de GDF-15 es soluble y se encuentra en los sueros sanguíneos. Por tanto, la forma procesada de GDF-15 posiblemente puede actuar sobre cualquier célula diana dentro del cuerpo que está conectada a la circulación sanguínea, siempre que la posible célula diana exprese un receptor para el ligando de GDF-15 soluble.

Durante el embarazo, GDF-15 se encuentra en condiciones fisiológicas en la placenta. Sin embargo, muchos cánceres malignos (especialmente cánceres de cerebro, melanoma, cáncer de pulmón, tumores gastrointestinales, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama agresivos (Mimeault M y Batra SK, J. Cell Physiol 2010)) presentan niveles aumentados de GDF-15 en el tumor así como en el suero sanguíneo. Del mismo modo, se han descrito correlaciones entre la alta expresión de GDF-15 y la quimiorresistencia (Huang CY et al., Clin. Cancer Res. 2009) y entre la alta expresión de GDF-15 y un mal pronóstico, respectivamente (Brown DA et al., Clin. Cancer Res. 2009).

GDF-15 se expresa en gliomas de diferentes grados según la OMS tal como se evalúa mediante inmunohistoquímica (Roth et al., Clin. Cancer Res. 2010). Además, Roth et al. expresaron de manera estable constructos de ADN que expresan ARN de horquilla corta que seleccionan como diana GDF-15 endógeno o constructos de control en células de glioma SMA560. Cuando se usan estas líneas celulares estables preestablecidas, observaron que la formación de tumores en ratones que portan células SMA560 con inactivación de GDF-15 se retrasó en comparación con ratones que portan constructos de control.

Las solicitudes de patente WO 2005/099746 y WO 2009/021293 se refieren a un anticuerpo anti-GDF-15 humano (AcM26) capaz de antagonizar los efectos de GDF-15 humano (hGDF-15) sobre el adelgazamiento inducido por tumor in vivo en ratones. De manera similar, Johnen H et al. (Nature Medicine, 2007) notificaron los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano sobre el adelgazamiento y la anorexia inducidos por cáncer pero no observaron ningún efecto del anticuerpo anti-GDF-15 humano sobre el tamaño del tumor formado por el cáncer.

Los documentos WO 2014/049087 y PCT/EP2015/056654 (correspondiente a WO 2015/144855) se refieren a anticuerpos monoclonales contra hGDF-15 y a usos médicos de los mismos.

Un enfoque recientemente desarrollado para la terapia contra el cáncer es el uso de bloqueadores de puntos de control inmunitario tales como inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana. Un motivo detrás del uso de estos bloqueadores de puntos de control inmunitario es que, al bloquear los puntos de control inmunitarios que impiden que el sistema inmunitario seleccione como diana antígenos cancerosos y las células cancerosas respectivas, una respuesta inmunitaria contra el cáncer puede ser más eficaz. Aunque se ha demostrado que los bloqueadores de puntos de control inmunitario así como las combinaciones particulares de bloqueadores de puntos de control inmunitario mejoran la supervivencia del paciente en pacientes con melanoma (Cully M, “Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy”, Nat Rev Drug Discov. Junio de 2015;14(6):374-5), no todos los pacientes con melanoma mostraban una respuesta completa, y aún quedan por divulgar resultados para otros muchos cánceres, todavía hay motivos (como la carga mutacional) que sugieren que los resultados en otras indicaciones serán menos favorables.

Por tanto, hasta la fecha, sigue existiendo la necesidad en la técnica de medios para tratar más eficazmente el cáncer. Más particularmente, sigue existiendo una falta de medios que puedan usarse para una inmunoterapia contra el cáncer más eficaz.

Descripción de la invención

La invención es tal como se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención cumple las necesidades anteriores y resuelve los problemas anteriores en la técnica al proporcionar las realizaciones descritas a continuación:

En particular, en un esfuerzo por identificar medios para tratar eficazmente el cáncer, los presentes inventores han hallado sorprendentemente que la probabilidad de una respuesta a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario disminuye significativamente con niveles crecientes de hGDF-15 en los sueros del paciente. Por tanto, según la invención, se usa un inhibidor de hGDF-15 para inhibir los efectos negativos de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y para mejorar las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Inesperadamente, los inventores también han hallado que existe una correlación inversa de hGDF-15 con el porcentaje de linfocitos T CD8+ en metástasis de cáncer. Esto es notable porque se requiere específicamente la presencia de linfocitos T CD8+ para la regresión tumoral después de la inhibición de puntos de control inmunitario con un anticuerpo anti-PD-1. Por tanto, según la invención, puede usarse la inhibición terapéutica de hGDF-15 para aumentar el porcentaje de linfocitos T CD8+ en cánceres sólidos incluyendo metástasis tumorales. Este aumento de linfocitos T CD8+ en los cánceres sólidos puede usarse de manera favorable para la terapia, en particular inmunoterapia, de los cánceres sólidos.

Por tanto, los inventores proporcionan una combinación terapéutica favorable de un inhibidor de hGDF-15 con un bloqueador de puntos de control inmunitario. Un efecto ventajoso de esta combinación es que la inhibición de hGDF-15 aumentará el porcentaje de linfocitos T CD8+ en los cánceres sólidos y conducirá de ese modo a un efecto terapéutico sinérgico con la inhibición de puntos de control inmunitario.

En un esfuerzo por dilucidar adicionalmente cómo los inhibidores de hGDF-15 pueden aumentar el porcentaje de linfocitos T CD8+ en los cánceres sólidos, los inventores han hallado que hGDF-15 disminuye la adhesión de las células T a las células endoteliales. Por tanto, según la invención, puede usarse un tratamiento con inhibidores de hGDF-15 para aumentar la adhesión de células T, incluyendo células T CD8+, a las células endoteliales. Tal tratamiento según la invención aumentará la entrada de células T CD8+ desde el torrente circulatorio a los cánceres sólidos. El porcentaje aumentado de células T CD8+ en cánceres sólidos, que será el resultado de tal tratamiento con inhibidores de hGDF-15, es ventajoso para, y puede usarse en, la terapia contra el cáncer, por ejemplo inmunoterapia contra el cáncer. Puesto que la entrada de células T CD8+ a los cánceres sólidos y la presencia de estas células T CD8+ en los cánceres sólidos son particularmente ventajosas para enfoques terapéuticos que usan bloqueadores de puntos de control inmunitario, la invención proporciona ventajosamente el uso de inhibidores de hGDF-15 en combinación con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, la presente invención proporciona medios mejorados para la terapia contra el cáncer, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: esta figura muestra los niveles séricos de GDF-15 para sujetos que responden y sujetos que no responden al régimen de tratamiento.

Figura 2: esta figura muestra los números de sujetos que responden y sujetos que no responden en los grupos de pacientes que tienen niveles séricos de hGDF-15 de <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml y >4,2 ng/ml, respectivamente.

Figura 3: probabilidad de respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando GDF-15 como predictor continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de GDF-15 cuando la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5.

Figura 4: curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia en los tres grupos definidos por el nivel sérico de GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 ng/ml).

Figura 5: Figura 5A: probabilidad de respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando LDH como predictor continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de LDF cuando la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5. La cohorte de pacientes fue idéntica. Sin embargo, no se logró una determinación fiable de los niveles de LDH en cuatro pacientes debido a la hemólisis. Figura 5B: representación gráfica de sujetos que responden y sujetos que no responden y sus respectivos niveles de hGDF-15 y LDH. Cuando se seleccionan valores de corte para cubrir a todos los sujetos que responden, las pruebas basadas en GDF-15 permiten la identificación de 6 (de 9) sujetos que no responden, mientras que los análisis basados en los niveles de LDH sólo pueden discriminar 4 (de 9) sujetos que no responden. Para las pruebas de LDH, tuvieron que excluirse 4 muestras hemolíticas, lo que provoca una pérdida de datos.

Figura 6: esta figura muestra cortes tisulares a modo de ejemplo de metástasis cerebrales de melanoma que no tienen (panel superior) o que tienen alta (panel inferior) inmunorreactividad con GDF-15, que se tiñeron mediante inmunohistoquímica para GDF-15 y para las proteínas marcadoras de células T CD3 y c D8, respectivamente, tal como se indica en la figura. Las células positivas para CD3 y CD8 se indican mediante flechas en las muestras con alto niveles de GDF-15. Las tinciones para CD3 y CD8 se realizaron a partir del mismo área de cortes en serie (sin embargo, no a partir del mismo corte).

Figura 7: esta figura muestra un gráfico del porcentaje de células CD3+ frente a la puntuación de GDF-15 en diferentes metástasis cerebrales de melanoma (7A) y un gráfico del porcentaje de células CD8+ frente a la puntuación de GDF-15 en diferentes metástasis cerebrales de melanoma (7b ).

Figura 8: esta figura muestra un gráfico de la puntuación de GDF-15 frente al porcentaje de células T CD8+ y CD3+, respectivamente, en metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales (melanoma, CRC, RCC, NSCLC y SCLC).

Figura 9: la figura 9A muestra el número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”). La figura 9B muestra la velocidad de rodamiento de las células T (medida en píxeles por 0,2 segundos). Los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”). La figura 9C muestra el número de células adherentes por campo de visión. Los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”). La figura 9D muestra el número de células adherentes por campo de visión. Los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”).

Figura 10: la figura 10A muestra el número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron a partir del canal #1 (células T de control en HUVEC sin estimular como “control neg.”), el canal #2 (células T de control en HUVEC estimuladas como “control pos.”), el canal #3 (“GDF-15”), el canal #4 (“UACC257”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 que contienen GDF-15 secretado) y el canal #5 (“UACC257 anti-hGDF-15”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 agotadas de GDF-15 secretado con el anticuerpo anti-hGDF-15 B1-23 como inhibidor de hGDF-15). Figura 10B: el ensayo de flujo/adhesión se llevó a cabo tal como se describe en el ejemplo 3. Se incubaron previamente células T con 100 ng/ml de GDF-15 durante 1 hora o con 100 ng/ml de GDF-15, que se incubó previamente con 10 |ig/ml de anticuerpo durante 1 hora, tal como se indica. Se usaron los siguientes anticuerpos anti-GDF-15: H1L5 (B1-23 humanizado), 01G06 y 03G05 (anticuerpos anti-GDF-15 humanizados modificados por ingeniería según las secuencias del documento WO 2014/100689). Los resultados se muestran en la figura, que muestra el número de células rodantes por campo de visión por 20 segundos.

Figura 11: a ratones C57BL/6J se les inoculó por vía subcutánea 2*105 células MC38tghGDF'15 de colon. El tratamiento con anticuerpo anti-GDF-15 (20 mg/kg de peso corporal) se inició el día 0 y se repitió los días 3, 7, 10, 14, 17 y 21. El día 13, a los animales que portaban tumores de tamaño similar (100 - 150 mm3) o bien se les trató, o bien no, con poli-ICLC (también abreviado como “poli-IC”) y anticuerpo anti-CD40. A los ratones que rechazaron el tumor preestablecido se les realizó un seguimiento durante 57 días. Se sacrificaron los ratones que portaban tumores según los criterios para el bienestar animal.

Figura 12: supervivencia acumulada en grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y >1,5 ng/ml, respectivamente.

Figura 13: supervivencia acumulada en grupos de pacientes que tienen altos niveles de GDF-15 (es decir, los 50 pacientes con los niveles de GDF-15 más altos) y bajos niveles de GDF-15 (es decir los 49 pacientes con los niveles de GDF-15 más bajos), respectivamente (división por la mediana de la cohorte de estudio total).

Figura 14: los niveles séricos de hGDF-15 no se correlacionan significativamente con la carga mutacional de los tumores. Se representaron gráficamente los niveles de ARNm de hGDF-15 en muestras de pacientes con cáncer frente al número de mutaciones somáticas que se identificaron en los cánceres. Las mutaciones somáticas se determinaron mediante el uso de secuenciación de exomas. Los datos se analizaron usando la herramienta web UZH del Hospital Universitario de Zúrich (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). La figura 14A muestra un gráfico para los datos de pacientes con cáncer obtenidos a partir del Atlas del Genoma del Cáncer (TGCA) considerando sólo a pacientes con melanoma maligno de alto grado (el Atlas del Genoma del Cáncer se describe en la referencia de Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). La expresión de GDF-15 se evaluó por normalización usando el paquete de software RSEM (“secuenciación de ARN por maximización de expectativas”) (Li B y Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 4 de agosto de 2011;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). La figura 14B muestra un gráfico para los datos de pacientes con cáncer a partir de 40 pacientes con melanoma maligno metastásico adicionales del Hospital Universitario de Zúrich, que se analizaron por separado.

Figura 15: se muestran imágenes de inmunocitoquímica para CD8a en ratones que portan tumores de tipo natural o tumores que sobreexpresan hGDF15 transgénico (tg). Los cortes tisulares se tiñeron con anticuerpo anti-CD8a (dilución 1:100; anticuerpo 4SM15 adquirido de eBioscience).

Descripción detallada de la invención

Definiciones y técnicas generales

A menos que se defina lo contrario a continuación, los términos usados en la presente invención deben entenderse según su significado habitual conocido por el experto en la técnica.

El término “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier anticuerpo funcional que es capaz de unirse específicamente al antígeno de interés, tal como se destaca generalmente en el capítulo 7 de Paul, W .E. (Ed).: Fundamental Immunology 2a ed. Raven Press, Ltd., Nueva York 1989. Sin limitación particular, el término “anticuerpo” abarca anticuerpos de cualquier especie de fuente apropiada, incluyendo pollo y mamífero tal como ratón, cabra, primate no humano y ser humano. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal que puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica. El término “anticuerpo” abarca un anticuerpo de isotipo IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgE, IgA, IgM o IgD. El término “anticuerpo” abarca anticuerpos monoméricos (tales como IgD, IgE, IgG) o anticuerpos oligoméricos (tales como IgA o IgM). El término “anticuerpo” también abarca, sin limitaciones particulares, anticuerpos aislados y anticuerpos modificados tales como anticuerpos modificados por ingeniería genética, por ejemplo anticuerpos quiméricos.

La nomenclatura de los dominios de anticuerpos sigue los términos que se conocen en la técnica. Cada monómero de un anticuerpo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, tal como se conoce generalmente en la técnica. De estas, cada cadena pesada y ligera comprende un dominio variable (denominado Vh para la cadena pesada y Vl para la cadena ligera) que es importante para la unión al antígeno. Estos dominios variables de cadena pesada y ligera comprenden (en un orden de N-terminal a C-terminal) las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 (FR , región de entramado; CDR, región determinante de complementariedad que también se conoce como región hipervariable). La identificación y la asignación de las regiones de anticuerpo anteriormente mencionadas dentro de la secuencia de anticuerpo son generalmente según Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de Estados Unidos, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. 1983), o Chothia et al. (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 21-28 de diciembre de 1989;342(6252):877-83), o pueden realizarse usando el software IMGT/V-QUEST descrito en Giudicelli et al. (IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 1 de julio de 2004;32(edición del servidor web):W435-40). Preferiblemente, las regiones de anticuerpo indicadas anteriormente se identifican y asignan usando el software IMGT/V-QUEST.

Un “anticuerpo monoclonal” es un anticuerpo de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, en la que los anticuerpos son sustancialmente idénticos en cuanto a su secuencia (es decir, idénticos excepto por una mínima fracción de anticuerpos que contienen modificaciones de secuencia que se producen de manera natural tales como modificaciones de aminoácidos en sus extremos N-terminal y C-terminal). A diferencia de los anticuerpos policlonales que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos dirigidos contra numerosos epítopos, los anticuerpos monoclonales se dirigen al mismo epítopo y, por tanto, son altamente específicos. El término “anticuerpo monoclonal” incluye (pero no se limita a) anticuerpos que se obtienen a partir de una población de células monoclonales derivadas de un único clon celular, como por ejemplo los anticuerpos generados mediante el método de hibridoma descrito en Kohler y Milstein (Nature, 7 de agosto de 1975;256(5517):495-7) o Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988). Un anticuerpo monoclonal también puede obtenerse a partir de otros métodos adecuados, incluyendo técnicas de presentación en fago tales como las descritas en Clackson et al. (Nature. 15 de agosto de 1991;352(6336):624-8) o Marks et al. (J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991;222(3):581-97). Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo que se ha optimizado en cuanto a propiedades de unión al antígeno tales como valores disminuidos de Kd, cinética de asociación y disociación optimizada, mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los valores de Kd pueden optimizarse mediante métodos de presentación incluyendo presentación en fago, lo que da como resultado anticuerpos monoclonales madurados por afinidad. El término “anticuerpo monoclonal” no se limita a secuencias de anticuerpo de una especie de origen particular o de una única especie de origen. Por tanto, el significado del término “anticuerpo monoclonal” abarca anticuerpos monoclonales quiméricos tales como anticuerpos monoclonales humanizados.

Los “anticuerpos humanizados” son anticuerpos que contienen secuencias humanas y una mínima porción de secuencias no humanas que les confiere especificidad de unión a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Normalmente, los anticuerpos humanizados se generan reemplazando secuencias de región hipervariable de un anticuerpo aceptor humano por secuencias de región hipervariable de un anticuerpo donante no humano (por ejemplo, un anticuerpo donante de ratón, conejo, rata) que se une a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). En algunos casos, también pueden reemplazarse secuencias de región de entramado del anticuerpo aceptor por las correspondientes secuencias del anticuerpo donante. Además de las secuencias derivadas de los anticuerpos donante y aceptor, un “anticuerpo humanizado” o bien puede contener, o bien no, otros residuos u otras secuencias (adicionales o sustitutos). Tales otros residuos u otras secuencias pueden servir para mejorar adicionalmente propiedades del anticuerpo tales como las propiedades de unión (por ejemplo, disminuir los valores de Kd) y/o las propiedades inmunogénicas (por ejemplo, disminuir la antigenicidad en humanos). En la técnica se conocen ejemplos no limitativos de métodos para generar anticuerpos humanizados, por ejemplo a partir de Riechmann et al. (Nature. 24 de marzo de 1988; 332(6162):323-7) o Jones et al. (Nature. 29 de mayo-4 de junio de 1986; 321(6069):522-5).

El término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo que contiene secuencias de dominio variable y constante humanas. Esta definición abarca anticuerpos que tienen secuencias humanas que porta sustituciones o modificaciones de un solo aminoácido que pueden servir para mejorar adicionalmente propiedades del anticuerpo tales como las propiedades de unión (por ejemplo, disminuir los valores de Kd) y/o las propiedades inmunogénicas (por ejemplo, disminuir la antigenicidad en humanos). El término “anticuerpo humano” excluye anticuerpos humanizados en los que una porción de secuencias no humanas les confiere especificidad de unión a un antígeno de interés.

Una “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo que conserva la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno (por ejemplo, hGDF-15, PD-1 o PD-L1). Esta capacidad puede determinarse, por ejemplo, determinando la capacidad de la porción de unión a antígeno para competir con el anticuerpo por la unión específica al antígeno mediante métodos conocidos en la técnica. La porción de unión a antígeno puede contener uno o más fragmentos del anticuerpo. Sin limitación particular, la porción de unión a antígeno puede producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo métodos de ADN recombinante y preparación por fragmentación química o enzimática de anticuerpos. Las porciones de unión a antígeno pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio único, diacuerpos o cualquier otra porción del anticuerpo que conserve la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno.

Un “anticuerpo” (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o una “porción de unión a antígeno” puede haberse derivatizado o estar unido a una molécula diferente. Por ejemplo, moléculas que pueden unirse al anticuerpo son otras proteínas (por ejemplo, otros anticuerpos), un marcador molecular (por ejemplo, una molécula fluorescente, luminiscente, coloreada o radiactiva), un fármaco y/o un agente tóxico. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno pueden unirse directamente (por ejemplo, en forma de una fusión entre dos proteínas), o a través de una molécula ligadora (por ejemplo, cualquier tipo adecuado de ligador químico conocido en la técnica).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “unión” o “unir” se refieren a la unión específica al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Preferiblemente, el valor de Kd es menor de 100 nM, más preferiblemente menor de 50 nM, todavía más preferiblemente menor de 10 nM, todavía más preferiblemente menor de 5 nM y lo más preferiblemente menor de 2 nM.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que es “capaz de competir” con un segundo anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano significa que dicho (primer) anticuerpo o dicha (primera) porción de unión a antígeno del mismo que es “capaz de competir” es capaz de reducir la unión de una disolución de referencia 10 nM del segundo anticuerpo al GDF-15 humano o humano recombinante en un 50%. Generalmente, “capaz de competir” significa que la concentración del (primer) anticuerpo o de la (primera) porción de unión a antígeno del mismo que es necesaria para reducir la unión de la disolución de referencia 10 nM del segundo anticuerpo al GDF-15 humano o humano recombinante en un 50% es menor de 1000 nM, preferiblemente menor de 100 nM y más preferiblemente menor de 10 nM. La unión se mide mediante mediciones por resonancia de plasmón superficial o mediante mediciones por ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), preferiblemente mediante mediciones por resonancia de plasmón superficial.

El término “epítopo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una pequeña porción de un antígeno que forma el sitio de unión para un anticuerpo.

En el contexto de la presente invención, la unión o unión competitiva de anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano) se mide preferiblemente usando mediciones por resonancia de plasmón superficial como ensayo convencional de referencia, tal como se describe a continuación.

Los términos “K^d” o “valor de K^d” se refieren a la constante de disociación en equilibrio tal como se conoce en la técnica. En el contexto de la presente invención, estos términos se refieren a la constante de disociación en equilibrio de un anticuerpo con respecto a un antígeno de interés particular (por ejemplo, GDF-15 humano). La constante de disociación en equilibrio es una medida de la propensión de un complejo (por ejemplo, un complejo antígeno-anticuerpo) a disociarse de manera reversible en sus componentes (por ejemplo, el antígeno y el anticuerpo). Para los anticuerpos según la invención, los valores de Kd (tales como aquellos para el antígeno GDF-15 humano) se determinan preferiblemente usando mediciones por resonancia de plasmón superficial tal como se describe a continuación.

Un “anticuerpo aislado”, tal como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que se ha identificado y separado a partir de la mayoría de los componentes (en peso) de su entorno fuente, por ejemplo a partir de los componentes de un cultivo celular de hibridoma o un cultivo celular diferente que se usó para su producción (por ejemplo, células productoras tales como células CHO que expresan de manera recombinante el anticuerpo). La separación se realiza de tal manera que retira suficientemente los componentes que de otro modo pueden interferir con la idoneidad del anticuerpo para las aplicaciones deseadas (por ejemplo, con un uso terapéutico del anticuerpo anti-GDF-15 humano según la invención). En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos aislados, e incluyen cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, filtración de retención de virus y ultrafiltración. Preferiblemente, la preparación de anticuerpo aislado es al menos el 70% pura (p/p), más preferiblemente al menos el 80% pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 90% pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 95% pura (p/p) y lo más preferiblemente al menos el 99% pura (p/p), tal como se mide usando el ensayo de proteínas de Lowry.

Un “diacuerpo”, tal como se usa en el presente documento, es una pequeña porción de anticuerpo de unión a antígeno bivalente que comprende un dominio variable de cadena pesada unido a un dominio variable de cadena ligera en la misma cadena de polipéptido unida por un ligador peptídico que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto da como resultado el emparejamiento con los dominios complementarios de otra cadena y el ensamblaje de una molécula dimérica con dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes y monoespecíficos (tales como diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno para GDF-15 humano), o pueden ser bivalentes y biespecíficos (por ejemplo, diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno, siendo uno de ellos un sitio de unión para GDF-15 humano y siendo el otro de ellos un sitio de unión para un antígeno diferente). Puede encontrarse una descripción detallada de diacuerpos en Holliger P et al. (““Diabodies”: small bivalent and bispecific antibody fragments.” Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de julio de 1993;90(14):6444-8).

Un “anticuerpo de dominio único” (que también se denomina “Nanobody™”), tal como se usa en el presente documento, es un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico. En la técnica se conocen estructuras de, y métodos para producir, anticuerpos de dominio único, por ejemplo a partir de Holt LJ et al. (“Domain antibodies: proteins for therapy.” Trends Biotechnol. Noviembre de 2003;21(11):484-90), Saerens D et al. (“Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics.” Curr Opin Pharmacol. Octubre de 2008;8(5):600-8. Epub del 22 de agosto de 2008) y Arbabi Ghahroudi M et al. (“Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.” FEB S Lett. 15 de septiembre de 1997;414(3):521-6).

Los términos “cáncer” y “célula cancerosa” se usan en el presente documento según su significado habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: Nueva York 2006. Pág.

850).

Los cánceres que van a tratarse según la presente invención son cánceres sólidos. Un “cáncer sólido” es un cáncer que forma uno o más tumores sólidos. Tales cánceres sólidos que forman tumores sólidos se conocen generalmente en la técnica. El término “cáncer sólido” abarca tanto un tumor primario formado por el cáncer como posibles tumores secundarios, que también se conocen como metástasis. Los cánceres sólidos preferidos que van a tratarse según la invención se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas, preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de cuello uterino, más preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y cáncer de estómago, y lo más preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de próstata.

Tal como se hace referencia en el presente documento, el término “cáncer de cerebro” se refiere a todos los cánceres de cerebro conocidos en la técnica. Incluye, pero no se limita a, glioma (grado I a IV según la OMS), astrocitoma, meningioma y meduloblastoma.

Tal como se hace referencia en el presente documento, el término “cáncer de cabeza y cuello” se refiere a todos los cánceres de cabeza y cuello conocidos en la técnica. Incluye, pero no se limita a, carcinoma de esófago, carcinoma oral de células escamosas y cáncer de hipofaringe. Un cáncer de cabeza y cuello particularmente preferido que va a tratarse según la invención es el carcinoma oral de células escamosas.

El término “crecimiento de cáncer”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier crecimiento medible del cáncer. Para cánceres que forman tumores sólidos, “crecimiento de cáncer” se refiere a un aumento medible en el volumen tumoral a lo largo del tiempo. Si el cáncer ha formado sólo un único tumor, “crecimiento de cáncer” se refiere sólo al aumento en el volumen del único tumor. Si el cáncer ha formado múltiples tumores tales como metástasis, “crecimiento de cáncer” se refiere al aumento en el volumen de todos los tumores medibles. Para tumores sólidos, el volumen tumoral puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo obtención de imágenes por resonancia magnética y tomografía computarizada (TAC).

Los términos tales como “tratamiento de cáncer” o “tratar un cáncer” según la presente invención se refieren a un tratamiento terapéutico. Puede realizarse una evaluación de si un tratamiento terapéutico funciona o no, por ejemplo, evaluando si el tratamiento inhibe el crecimiento de cáncer en el paciente o los pacientes tratados. Preferiblemente, la inhibición es estadísticamente significativa tal como se evalúa mediante pruebas estadísticas apropiadas que se conocen en la técnica. La inhibición del crecimiento de cáncer puede evaluarse comparando el crecimiento de cáncer en un grupo de pacientes tratados según la presente invención con un grupo de control de pacientes sin tratar, o comparando un grupo de pacientes que reciben un tratamiento habitual contra el cáncer de la técnica más un tratamiento según la invención con un grupo de control de pacientes que sólo reciben un tratamiento habitual contra el cáncer de la técnica. Tales estudios para evaluar la inhibición del crecimiento de cáncer se diseñan según normas aceptadas para estudios clínicos, por ejemplo, estudios aleatorizados con doble enmascaramiento con suficiente potencia estadística. El término “tratar un cáncer” incluye una inhibición del crecimiento de cáncer en la que el crecimiento de cáncer se inhibe parcialmente (es decir, en la que el crecimiento de cáncer en el paciente se retrasa en comparación con el grupo de control de pacientes), una inhibición en la que el crecimiento de cáncer se inhibe completamente (es decir, en la que el crecimiento de cáncer en el paciente se detiene) y una inhibición en la que el crecimiento de cáncer se revierte (es decir, el cáncer se reduce). Preferiblemente, puede realizarse una evaluación de si un tratamiento terapéutico funciona o no basándose en una clasificación de sujetos que responden y sujetos que no responden usando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (R EC IS T v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised R EC IST guideline (version 1.1). En: Eur. J . Cancer. 45, n.° 2, enero de 2009, págs. 228-47). Alternativa o adicionalmente, puede realizarse una evaluación de si un tratamiento terapéutico funciona o no basándose en indicadores clínicos conocidos de evolución del cáncer.

El tratamiento de cáncer según la invención puede ser una terapia de primera línea, una terapia de segunda línea o una terapia de tercera línea, o una terapia más allá de la terapia de tercera línea. El significado de estos términos se conoce en la técnica y es según la terminología que usa habitualmente el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos.

Un tratamiento de cáncer según la presente invención no excluye que también se produzcan beneficios terapéuticos adicionales o secundarios en los pacientes. Por ejemplo, un beneficio adicional o secundario puede ser una influencia sobre el adelgazamiento inducido por cáncer. Sin embargo se entiende que el tratamiento primario para el que se busca protección es para tratar el propio cáncer, cualquier efecto secundario o adicional sólo refleja ventajas adicionales opcionales del tratamiento del crecimiento de cáncer.

El término “inmunoterapia contra el cáncer” se conoce en la técnica y generalmente se refiere a un tratamiento de cáncer en el que se usa el sistema inmunitario del paciente para tratar el cáncer. Las células cancerosas albergan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos para las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Por tanto, en un aspecto preferido de la inmunoterapia contra el cáncer según la presente invención, una inmunoterapia contra el cáncer es una inmunoterapia contra el cáncer en la que el sistema inmunitario reconoce tales antígenos de células cancerosas y en la que el sistema inmunitario destruye las células cancerosas que expresan estos antígenos. En un aspecto no limitativo de la invención, las células T CD8+ del sistema inmunitario pueden destruir tales células cancerosas que expresan estos antígenos de células cancerosas. Una inmunoterapia contra el cáncer puede evaluarse mediante métodos de inmunomonitorización conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo la expresión de IFN-y intracelular (por ejemplo en células T CD8+ y/o células NK) en muestras de sangre, midiendo la expresión de CD107a en superficie de células (por ejemplo en células T CD8+ y/o células NK) en muestras de sangre, midiendo la expresión de TNF -a intracelular (por ejemplo en leucocitos) en muestras de sangre, la expresión de interleucina-2 intracelular (por ejemplo en células T c D8+ y/o en células T CD4+) en muestras de sangre, la expresión de CD154 en superficie de células (por ejemplo en células T CD8+ y/o en células T CD4+) en muestras de sangre, la tinción de tetrámeros o dextrámeros para células T específicas de antígeno tumoral en muestras de sangre, la actividad de CTL contra células tumorales autólogas o la presencia de células T contra neoantígenos derivados de mutaciones específicas de tumor. Métodos preferidos para evaluar la inmunoterapia contra el cáncer son los métodos según Gouttefangeas C et al.: “Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future.” (2015) En: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (editor: N. Rezaei). Springer. Capítulo 25: páginas 471­ 486; y los métodos según Van der Burg SH, et al.: “Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer.” (2014) En: Cancer Immunotherapy meets oncology (CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds). Springer International Publishing Suiza págs..37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.

Tal como se usa en el presente documento, una “inmunoterapia contra el cáncer” abarca opcionalmente un tratamiento en el que, además del sistema inmunitario que se usa para tratar el cáncer, se usan mecanismos adicionales de tratamiento de cáncer. Por ejemplo, previamente se demostró que un inhibidor de hGDF-15 puede usarse para el tratamiento de cáncer en un sistema de modelo de ratón en el que el sistema inmunitario se vio comprometido gravemente (documento WO 2014/049087). Por tanto, según la presente invención, una inmunoterapia contra el cáncer mediante inhibidores de hGDF-15 en pacientes humanos también puede abarcar efectos de tratamiento adicionales de los inhibidores de hGDF-15 que son independientes del sistema inmunitario. Otro ejemplo de una inmunoterapia contra el cáncer en la que pueden usarse mecanismos adicionales de tratamiento de cáncer es una terapia de combinación con agente(s) quimioterápico(s) conocido(s). Tal terapia de combinación con agente(s) quimioterápico(s) conocido(s) puede incluir, por ejemplo, no sólo el tratamiento de cáncer en el que se usa el sistema inmunitario para tratar el cáncer sino también un tratamiento de cáncer en el que dicho(s) agente(s) quimioterápico(s) destruyen las células cancerosas directamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aumentar el porcentaje de células T CD8+ en un cáncer sólido” se refiere a cualquier aumento medible en el porcentaje de células T CD8+ (es decir, el porcentaje de células T CD8+ calculado con respecto a todas las células) en el tumor o los tumores formados por el cáncer sólido. Preferiblemente, el aumento es estadísticamente significativo tal como se evalúa mediante pruebas estadísticas apropiadas que se conocen en la técnica. Un aumento en el porcentaje de células T CD8+ en el tumor o los tumores formados por el cáncer sólido puede determinarse mediante métodos conocidos para el análisis de células T CD8+ en tumores sólidos. Tales métodos incluyen análisis de biopsias tumorales para células T CD8+, por ejemplo análisis de tales biopsias tumorales mediante inmunohistoquímica usando anticuerpos contra CD8 y usando una tinción para el número total de células. El aumento puede evaluarse comparando los porcentajes de células T CD8+ en tumores de un grupo de pacientes tratados según la presente invención con un grupo de control de pacientes sin tratar, o comparando un grupo de pacientes que reciben un tratamiento habitual contra el cáncer de la técnica más un tratamiento según la invención con un grupo de control de pacientes que sólo reciben un tratamiento habitual contra el cáncer de la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, “células T CD8+” son preferiblemente células que se producen de manera endógena en el paciente humano.

Los niveles séricos de hGDF-15 pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un método preferido para medir los niveles séricos de hGDF-15 es una medición de los niveles séricos de hGDF-15 mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA ) usando anticuerpos contra GDF-15. Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1. Alternativamente, los niveles séricos de hGDF-15 pueden determinarse mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia conocidos usando anticuerpos contra GDF-15. Por ejemplo, puede usarse la tecnología Elecsys® de Roche para tales inmunoensayos de electroquimioluminiscencia.

El paciente que va a tratarse según la invención es preferiblemente un paciente con niveles séricos de hGDF-15 elevados. El término “niveles séricos de hGDF-15 elevados”, tal como se usa en el presente documento, significa que el paciente humano tiene mayores niveles de hGDF-15 en suero sanguíneo antes de la administración del inhibidor de hGDF-15 según la invención en comparación con la mediana de niveles de hGDF-15 en sueros sanguíneos de individuos de control humanos sanos como referencia.

La mediana del nivel sérico de hGDF-15 de individuos de control humanos sanos es < 0,8 ng/ml. El intervalo esperado está entre 0,2 ng/ml y 1,2 ng/ml en controles humanos sanos (referencia: Tanno T et al.: “Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease.” Curr Opin Hematol. Mayo de 2010; 17(3): 184-190).

Por tanto, en una realización preferida de la invención, un paciente que va a tratarse según la invención es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,2 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,5 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, y más preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15.

En una realización preferida adicional de la invención, un paciente que va a tratarse según la invención es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,2 ng/ml y no más de 12 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,5 ng/ml y no más de 12 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, y más preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,8 ng/ml y no más de 12 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15.

En una realización adicional de la invención según todas las realizaciones anteriores, un paciente que va a tratarse según la invención es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,2 ng/ml y no más de 10 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,5 ng/ml y no más de 10 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, y más preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,8 ng/ml y no más de 10 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15.

En una realización adicional de la invención según todas las realizaciones anteriores, un paciente que va a tratarse según la invención es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,2 ng/ml y no más de 8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,5 ng/ml y no más de 8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, y más preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,8 ng/ml y no más de 8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15.

En otra realización, un paciente que va a tratarse según la invención es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 2 ng/ml, al menos 2,2 ng/ml, al menos 2,4 ng/ml, al menos 2,6 ng/ml, al menos 2,8 ng/ml, al menos 3,0 ng/ml, al menos 3,2 ng/ml, al menos 3,4 ng/ml, al menos 3,6 ng/ml, al menos 3,8 ng/ml, al menos 4,0 ng/ml o al menos 4,2 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15. En esta realización, el paciente es preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de no más de 12 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15. Más preferiblemente, en esta realización, el paciente es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de no más de 10 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15. Lo más preferiblemente, en esta realización, el paciente es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de no más de 8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15.

El término “antes del inicio de la administración”, tal como se usa en el presente documento, significa el periodo de tiempo inmediatamente antes de la administración del inhibidor de hGDF-15 según la invención. Preferiblemente, el término “antes del inicio de la administración” significa un periodo de 30 días inmediatamente antes de la administración; lo más preferiblemente un periodo de una semana inmediatamente antes de la administración.

Los términos “significativo”, “significativamente”, etc., tal como se usan en el presente documento, se refieren a una diferencia estadísticamente significativa entre valores tal como se evalúa mediante métodos apropiados conocidos en la técnica.

Los inhibidores de hGDF-15 y los bloqueadores de puntos de control inmunitario usados según la invención pueden administrarse usando métodos conocidos en la técnica. El experto seleccionará tales métodos basándose en consideraciones bien conocidas, incluyendo la naturaleza química del inhibidor respectivo (por ejemplo, en función de si el inhibidor es un ARN de interferencia pequeño o un anticuerpo). La administración de bloqueadores de puntos de control inmunitario conocidos puede estar basada en esquemas de administración conocidos de estos bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, la administración de los bloqueadores de puntos de control inmunitario puede estar basada en los esquemas de administración usados en el ensayo KEYNOTE-006 (C. Robert et al. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532).

Según la presente invención, cada aparición del término “que comprende” puede sustituirse opcionalmente por el término “que consiste en”.

Inhibidores de hGDF-15

Un “inhibidor de hGDF-15” puede ser cualquier molécula que es capaz de inhibir específicamente la función de GDF-15 humano (hGDF-15), siempre que sea según las reivindicaciones adjuntas.

Si una sustancia de interés es un “inhibidor de hGDF-15” o no puede determinarse usando los métodos divulgados en el presente documento, tal como se detalla en las realizaciones preferidas. Un método preferido según las realizaciones preferidas es el método usado en el ejemplo 3.

Previamente se demostró que un anticuerpo monoclonal puede seleccionar como diana ventajosamente la proteína GDF-15 humana (documento WO2014/049087), y que tal anticuerpo tiene propiedades ventajosas incluyendo una alta afinidad de unión por GDF-15 humano, tal como se muestran por una constante de disociación en equilibrio de aproximadamente 790 pM para GDF-15 humano recombinante (véase el ejemplo de referencia 1). Por tanto, según la invención, el inhibidor de hGDF-15 que va a usarse es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo.

Por tanto, en una realización preferida, el inhibidor de hGDF-15 según la invención es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a la misma, y en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 o una secuencia de aminoácidos al menos el 85% idéntica a la misma. En esta realización, preferiblemente, el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos Ser-Ala-Ser.

Por tanto, en una realización todavía más preferida, el inhibidor de hGDF-15 según la invención es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y en el que el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos Ser-Ala-Ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.

En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, el dominio variable de cadena pesada comprende una región que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o una secuencia el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a la misma.

En una realización preferida según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o una porción de unión a hGDF-15 del mismo. El dominio constante de la cadena pesada de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, o una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la misma, y el dominio constante de la cadena ligera de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, o una secuencia de aminoácidos al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la misma. Más preferiblemente, el dominio constante de la cadena pesada de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, o una secuencia de aminoácidos al menos el 98%, preferiblemente al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio constante de la cadena ligera de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32, o una secuencia de aminoácidos al menos el 98%, preferiblemente al menos el 99% idéntica a la misma. Todavía más preferiblemente, el dominio constante de la cadena pesada de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, y el dominio constante de la cadena ligera de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32. El dominio variable de cadena pesada de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, o una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, todavía más preferiblemente al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, o una secuencia de aminoácidos al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, todavía más preferiblemente al menos el 99% idéntica a la misma. Lo más preferiblemente, el dominio variable de cadena pesada de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, y el dominio variable de cadena ligera de este anticuerpo monoclonal o de esta porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo puede tener secuencias de CDR3 tal como se definen en cualquiera de las realizaciones de la invención descritas anteriormente.

En otra realización según el anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, la porción de unión a hGDF-15 es un anticuerpo de dominio único (también denominado “Nanobody™”). En un aspecto de esta realización, el anticuerpo de dominio único comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, C ^d R2 y CDR3 de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, respectivamente. En otro aspecto de esta realización, el anticuerpo de dominio único comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:6, Ser-Ala-Ser y SEQ ID NO:7, respectivamente. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humanizado.

Preferiblemente, los anticuerpos capaces de unirse a GDF-15 humano o las porciones de unión a hGDF-15 de los mismos tienen una constante de disociación en equilibrio para GDF-15 humano que es igual a o menor de 100 nM, menor de 20 nM, preferiblemente menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 5 nM y lo más preferiblemente de entre 0,1 nM y 2 nM.

En otra realización según las realizaciones anteriores del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo se une al mismo epítopo de ^g DF-15 humano que el anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse a partir de la línea celular B1-23 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) con el n.° de registro DSM ACC3142. Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo que se une a GDF-15 humano según la presente invención se evalúa preferiblemente mediante mediciones por resonancia de plasmón superficial como método convencional de referencia, según los procedimientos descritos en el ejemplo de referencia 1. La unión al mismo epítopo en GDF-15 humano puede evaluarse de manera similar mediante experimentos de unión competitiva por resonancia de plasmón superficial del anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse a partir de la línea celular B1-23 y se espera que el anticuerpo se una al mismo epítopo de GDF-15 humano que el anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse a partir de la línea celular B1-23.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52 o una secuencia que es al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la misma.

En otra realización preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, que es capaz de competir con uno cualquiera de los anticuerpos capaces de unirse a GDF-15 humano a los que se hace referencia en el presente documento por la unión a GDF-15 humano, preferiblemente por la unión a GDF-15 humano recombinante.

En una realización muy preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado o una porción de unión a hGDF-15 del mismo. Para cualquier secuencia dada de anticuerpo no humano según la invención (es decir, una secuencia de anticuerpo donante), los anticuerpos anti-GDF-15 humano monoclonales humanizados de la invención o las porciones de unión a hGDF-15 de los mismos pueden generarse según técnicas conocidas en la técnica, tal como se describió anteriormente.

En una realización muy preferida, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en GDF-15 humano que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26. En un aspecto preferido de esta realización, el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo es un anticuerpo o una porción de unión a hGDF-15 del mismo tal como se define mediante las secuencias de una cualquiera de las realizaciones anteriores.

El anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo puede unirse a un fármaco. En aspectos no limitativos de esta realización, el fármaco puede ser un agente antineoplásico conocido y/o una molécula inmunoestimuladora. Los agentes antineoplásicos conocidos incluyen agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo e ifosfamida; antimetabolitos tales como azatioprina y mercaptopurina; alcaloides tales como alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina), taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel), etopósido y tenipósido; inhibidores de topoisomerasa tales como camptotecinas (por ejemplo, irinotecán y topotecán); antibióticos citotóxicos tales como actinomicina, antraciclinas, doxorubicina, daunorubicina, valrubicina, idarubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina; y radioisótopos.

En una realización adicional según las realizaciones anteriores, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo se modifica mediante una etiqueta de aminoácidos. Los ejemplos no limitativos de tales etiquetas incluyen etiquetas polihistidina (His), etiqueta FLAG, etiqueta hemaglutinina (HA), etiqueta glicoproteína D (gD) y etiqueta c-myc. Las etiquetas pueden usarse con diversos propósitos. Por ejemplo, pueden usarse para ayudar a la purificación del anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo. Preferiblemente, tales etiquetas están presentes en el extremo C-terminal o N-terminal del anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a hGDF-15 del mismo.

Bloqueadores de puntos de control inmunitario

Las células cancerosas albergan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos para las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Por tanto, un sistema inmunitario intacto que no está inhibido debe reconocer estos antígenos de células cancerosas, de tal manera que se provoca una respuesta inmunitaria contra estos antígenos. Sin embargo, la mayoría de los cánceres han desarrollado mecanismos de tolerancia inmunitaria contra estos antígenos. Una clase de mecanismos mediante los que las células cancerosas logran tal tolerancia inmunitaria es la utilización de puntos de control inmunitarios. Un “punto de control inmunitario”, tal como se usa en el presente documento, generalmente significa un mecanismo inmunológico mediante el que puede inhibirse una respuesta inmunitaria. Más particularmente, un punto de control inmunitario es un mecanismo que se caracteriza porque una molécula del sistema inmunitario (o un grupo de moléculas del sistema inmunitario) inhibe la respuesta inmunitaria inhibiendo la activación de células del sistema inmunitario. Tal molécula (o grupo de moléculas) del sistema inmunitario que inhibe (inhiben) la respuesta inmunitaria inhibiendo la activación de células del sistema inmunitario también se conoce(n) como molécula(s) de puntos de control.

Tal como se usa en el presente documento, un “bloqueador de puntos de control inmunitario” es una molécula que es capaz de bloquear un punto de control inmunitario. Aunque se entiende que un inhibidor de hGDF-15 tal como se usa según la invención tiene efectos sobre el sistema inmunitario, incluyendo efectos sobre las células T CD8+, el término “bloqueador de puntos de control inmunitario”, tal como se usa en el presente documento, no se refiere a un inhibidor de hGDF-15 sino que significa una molécula que es diferente de un inhibidor de hGDF-15. Los bloqueadores de puntos de control inmunitario más habituales que se conocen hasta la fecha son inhibidores de moléculas de puntos de control inmunitario tales como inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana. Bloqueadores de puntos de control inmunitario adicionales son los anticuerpos anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti-CD27, anti-CD137 así como los inhibidores de IDO. Por tanto, una forma preferida de un bloqueador de puntos de control inmunitario es un inhibidor de una molécula de puntos de control inmunitario. Alternativamente, un bloqueador de puntos de control inmunitario puede ser un activador de una señal coestimuladora que anula el punto de control inmunitario. Los métodos para medir la potencia de bloqueadores de puntos de control inmunitario incluyen ensayos de unión in vitro, ensayos de liberación de citocinas basados en células T primarias y sistemas de modelos in vivo. Además, Promega ha desarrollado ahora un sistema de indicadores bioluminiscentes disponible comercialmente para PD-1/PD-L1, al que se hace referencia, por ejemplo, en Mei Cong, Ph.D. et al.: Advertorial: Novel Bioassay to Assess PD-1/PD-L1 Therapeutic Antibodies in Development for Immunotherapy Bioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay. (http://www.genengnews.com/gen-articles/advertorial-novel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-l1-therapeutic-antibodies-indevelopment-for-immun/5511/).

Bloqueadores de puntos de control inmunitario preferidos son inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana. En una realización preferida según todas las realizaciones de la invención, el bloqueador de puntos de control inmunitario no es un inhibidor de CTLA4 humana.

Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de PD-1 humana” puede ser cualquier molécula que es capaz de inhibir específicamente la función de PD-1 humana. Ejemplos no limitativos de tales moléculas son anticuerpos capaces de unirse a PD-1 humana y DARPin (proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas) capaces de unirse a PD-1 humana.

El inhibidor de PD-1 que va a usarse según la invención es un anticuerpo capaz de unirse a PD-1 humana, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana. Lo más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana se selecciona del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab y AMP-224.

Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de PD-L1 humana” puede ser cualquier molécula que es capaz de inhibir específicamente la función de PD-L1 humana. Ejemplos no limitativos de tales moléculas son anticuerpos capaces de unirse a PD-L1 humana y DARPin (proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas) capaces de unirse a PD-L1 humana.

El inhibidor de PD-L1 humana que va a usarse según la invención es un anticuerpo capaz de unirse a PD-L1 humana, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana. Lo más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana se selecciona del grupo que consiste en BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 y MSB0010718C.

Métodos y técnicas

Generalmente, a menos que se defina lo contrario en el presente documento, los métodos usados en la presente invención (por ejemplo, métodos de clonación o métodos referentes a anticuerpos) se realizan según procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo los procedimientos descritos en Sambrook et al. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual.”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989), Ausubel et al. (“Current Protocols in Molecular Biology.” Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; Nueva York 1992), y Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988).

La unión de anticuerpos a sus proteínas diana respectivas puede evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica. La unión de anticuerpos monoclonales a sus dianas respectivas se evalúa preferiblemente mediante mediciones por resonancia de plasmón superficial. Estas mediciones se llevan a cabo preferiblemente usando un sistema ProteOn XPR36 de Biorad y chips de sensor GLC de Biorad, tal como se ejemplifica para el anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 en el ejemplo de referencia 1.

Las alineaciones de secuencia de las secuencias según la invención se realizan usando el algoritmo BLAST (véanse Altschul et al.(1990) “Basic local alignment search tool.” Journal of Molecular Biology 215. Págs. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Preferiblemente, se usan los siguientes parámetros: secuencias diana máx. de 10; tamaño de palabra de 3; matriz BLOSUM 62; costes por hueco: existencia de 11, extensión de 1; ajuste de matriz de puntuación composicional condicional. Por tanto, cuando se usan en relación con secuencias, los términos tales como “identidad” o “idéntico” se refieren al valor de identidad obtenido usando el algoritmo BLAST.

Los anticuerpos monoclonales según la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos a los que se hace referencia en Siegel DL (“Recombinant monoclonal antibody technology.” Transfus Clin Biol. Enero de 2002;9(1):15-22). En una realización, un anticuerpo según la invención se produce mediante la línea celular de hibridoma B1-23 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) con el n.° de registro DSM ACC3142 bajo el Tratado de Budapest. El depósito se presentó el 29 se septiembre de 2011.

La proliferación celular puede medirse mediante métodos adecuados conocidos en la técnica, incluyendo (pero sin limitarse a) microscopía visual, ensayos metabólicos tales como aquellos que miden el potencial redox mitocondrial (por ejemplo, ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio); tinción con resazurina que también se conoce como ensayo Alamar Blue®), tinción de biomarcadores de proliferación endógenos conocidos (por ejemplo, Ki-67) y métodos que miden la síntesis de ADN celular (por ejemplo, ensayos de incorporación de BrdU y [3H]-timidina).

Los niveles de GDF-15 humano (hGDF-15) pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo mediciones de los niveles proteicos de hGDF-15 mediante métodos que incluyen (pero no se limitan a) espectrometría de masas para proteínas o péptidos derivados de GDF-15 humano, inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos para GDF-15 humano, citometría de flujo usando anticuerpos específicos para GDF-15 humano, pruebas con tiras reactivas usando anticuerpos específicos para GDF-15 humano o inmunocitoquímica usando anticuerpos específicos para GDF-15 humano. Un método preferido para medir los niveles séricos de hGDF-15 es una medición de los niveles séricos de hGDF-15 mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA ) usando anticuerpos contra GDF-15. Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1. Alternativamente, los niveles séricos de hGDF-15 pueden determinarse mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia conocidos usando anticuerpos contra GDF-15. Por ejemplo, puede usarse la tecnología Elecsys® de Roche para tales inmunoensayos de electroquimioluminiscencia.

Preparación de las composiciones de la invención

Las composiciones según la presente invención se preparan según normas conocidas para la preparación de composiciones farmacéuticas.

Por ejemplo, las composiciones se preparan de manera que puedan almacenarse y administrarse de manera apropiada, por ejemplo, usando componentes farmacéuticamente aceptables tales como portadores, excipientes o estabilizadores.

Tales componentes farmacéuticamente aceptables no son tóxicos en las cantidades usadas cuando se administra la composición farmacéutica a un paciente. Los componentes farmacéuticamente aceptables añadidos a las composiciones farmacéuticas pueden depender de la naturaleza química de los inhibidores presentes en la composición (por ejemplo, dependen de si los inhibidores son anticuerpos, constructos de horquilla de ARNip o ARN de interferencia pequeño), del uso previsto particular de las composiciones farmacéuticas y de la vía de administración.

En general, los componentes farmacéuticamente aceptables usados en relación con la presente invención se usan según el conocimiento disponible en la técnica, por ejemplo a partir de Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. AR Gennaro, 20a edición, 2000, Williams & Wilkins, PA, e E.UU.

Productos para su uso en métodos terapéuticos

La presente invención se refiere a los inhibidores de hGDF-15 para los usos tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización de los inhibidores de hGDF-15 para su uso, los kits para su uso o las composiciones para su uso anteriores, el inhibidor de hGDF-15 y el bloqueador de puntos de control inmunitario son los únicos componentes que son farmacéuticamente activos contra el cáncer.

En una realización alternativa, el inhibidor de hGDF-15 se usa en combinación con uno o más componentes adicionales farmacéuticamente activos contra el cáncer. En un aspecto de esta realización, el uno o más componentes adicionales farmacéuticamente activos contra el cáncer es un agente antineoplásico conocido y/o una molécula inmunoestimuladora. Los agentes antineoplásicos conocidos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo e ifosfamida; antimetabolitos tales como azatioprina y mercaptopurina; alcaloides tales como alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina), taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel), etopósido y tenipósido; inhibidores de topoisomerasa tales como camptotecinas (por ejemplo, irinotecán y topotecán); antibióticos citotóxicos tales como actinomicina, antraciclinas, doxorubicina, daunorubicina, valrubicina, idarubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina; y radioisótopos. Se prefieren particularmente los siguientes componentes farmacéuticamente activos contra el cáncer para su uso en combinación con el inhibidor de hGDF-15: moléculas inmunoestimuladoras que incluyen los anticuerpos anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti-CD27, anti-CD137, anti-Ox40, anti-4-1BB, anti-GITR, anti-CD28, anti-CD40 o los inhibidores de IDO. Además, también se prefieren particularmente otros tratamientos con anticuerpos como anticuerpos anti-Her2, anti-EGFR, anti-claudina o sus sucesores glico-optimizados, ya que se beneficiarán de una combinación con el inhibidor de hGDF-15, por ejemplo debido a una infiltración potenciada de células inmunitarias en el cáncer sólido provocada por el inhibidor de hGDF-15. Del mismo modo, también se prefieren particularmente enfoques de vacunación (por ejemplo, con péptidos o células dendríticas) o terapias celulares adoptivas, células dendríticas o células T reactivas a tumores ya que se beneficiarán de una combinación con el inhibidor de hGDF-15. Además, también se prefieren particularmente los siguientes tratamientos ya que sinergizarán con el inhibidor de hGDF-15:

• tratamientos con anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos que tienen una o más especificidades por células tumorales e inmunitarias (por ejemplo, Bite, DART, DARPIN, catumaxomab);

• tratamientos mediante inmunoterapia basada en vacuna contra péptidos asociados a tumores, por ejemplo con vacunas multipeptídicas tales como IMA901, ISA203 o con vacunas basadas en ARN (por ejemplo, CV9104), y/o

• tratamientos con sustancias activadoras de células inmunitarias (por ejemplo, derivados de FAA para activar macrófagos, o ligandos para receptores tipo Toll tales como conjugados SLP-AMPLIVANT).

Combinaciones para los usos según la invención

La presente invención abarca productos de combinación para su uso tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

La combinación del inhibidor de hGDF-15 y el bloqueador de puntos de control inmunitario puede administrarse o bien conjuntamente o bien por separado.

Por ejemplo, en una realización preferida, la administración del inhibidor de hGDF-15 debe iniciarse antes del inicio de la administración del bloqueador de puntos de control inmunitario. Esta configuración permite ventajosamente aumentar el porcentaje de células T, y en particular el porcentaje de células T CD8+, en el cáncer sólido, de tal manera que un tratamiento posterior con el bloqueador de puntos de control inmunitario puede ser más eficaz debido al mayor porcentaje inicial de células T CD8+ en el cáncer sólido.

Kits

La presente divulgación también proporciona un kit que comprende un inhibidor de hGDF-15 y al menos un bloqueador de puntos de control inmunitario, tal como se definió anteriormente. El kit de la invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

El inhibidor de hGDF-15 y uno o más o la totalidad de los bloqueadores de puntos de control inmunitario pueden estar contenidos en recipientes independientes o en un único recipiente.

Un recipiente que se usa puede ser cualquier tipo de recipiente que sea adecuada para almacenar el inhibidor de hGDF-15 y/o el al menos un bloqueador de puntos de control inmunitario. Ejemplos no limitativos de tales recipientes son viales y jeringas precargadas.

Además del inhibidor de hGDF-15 y el al menos un bloqueador de puntos de control inmunitario, el kit puede contener agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, el kit puede contener uno o más componentes adicionales farmacéuticamente activos contra el cáncer. El uno o más componentes adicionales farmacéuticamente activos contra el cáncer pueden ser tal como se definió anteriormente. Tales componentes adicionales farmacéuticamente activos contra el cáncer pueden usarse en los métodos de la invención junto con el inhibidor de hGDF-15 y el al menos un bloqueador de puntos de control inmunitario.

Preferiblemente, un kit según la invención comprende además instrucciones para su uso.

Secuencias

Las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en la presente solicitud son las siguientes (en el orden de extremo N-terminal a extremo C-terminal; representadas en el código de aminoácidos de una sola letra):

SEQ ID NO:1 (región del dominio variable de cadena pesada que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la secuencia de polipéptido del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISK DPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC SEQ ID NO:2 (región del dominio variable de cadena ligera que comprende una región FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 de la secuencia de polipéptido del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFT LTISNVQSEDLAEYFC SEQ ID NO:3 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

GFSLSTSGMG SEQ ID NO:4 (secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

IYWDDDK SEQ ID NO:5 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

ARSSYGAMDY SEQ ID NO:6 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

Secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23:

SAS SEQ ID NO:7 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal AcM-B1-23):

QQYNNFPYT SEQ ID NO:8 (proteína GDF-15 humana madura recombinante):

GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLK PDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDT GVSLQTYDDLLAKDC HCI SEQ ID NO:9 (proteína precursora de GDF-15 humano):

MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQS WEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQL SLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTV RASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKT DTGVSLQTYDDLLAKDCHCI SEQ ID NO:10 (proteína precursora de GDF-15 humano ligadorGSGS N-terminal y C-terminal): GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLL TRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDV TRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPG RCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASY NPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG

SEQ ID NO:11 (péptido Flag): DYKDDDDKGG

SEQ ID NO:12 (péptido HA): YPYDVPDYAG

SEQ ID NO:13 (péptido derivado de GDF-15 humano): ELH LRPQ AARGRR

SEQ ID NO:14 (péptido derivado de GDF-15 humano): LHLRPQ AARGRRR

SEQ ID NO:15 (péptido derivado de GDF-15 humano): HLRPQAARGRRRA

SEQ ID NO:16 (péptido derivado de GDF-15 humano): LRPQ AARG RRRAR

SEQ ID NO:17 (péptido derivado de GDF-15 humano): RPQ AARGRRRARA

SEQ ID NO:18 (péptido derivado de GDF-15 humano): PQAARGRRRARAR

SEQ ID NO:19 (péptido derivado de GDF-15 humano): QAARGRRRARARN

SEQ ID NO:20 (péptido derivado de GDF-15 humano): MHAQIKTSLHRLK

SEQ ID NO:25 (péptido GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23):

EVQVTMCIGACPSQFR SEQ ID NO:26 (péptido GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23):

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

Las secuencias de ácido nucleico a las que se hace referencia en la presente solicitud son las siguientes (en el orden de extremo 5’ a extremo 3’; representadas en el código de ácido nucleico convencional):

SEQ ID NO:21 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:1):

CAAGT GAAGCT GCAGCAGT CAGGCCCT GGGAT ATT GCAGT CCT CCCAGACCCT CAGT CT GACTT GTT CT TTCTCT GGGTTTT CACT GAGT ACTT CTGGTATGGGTGT G AGCT GGATTCGT C AGCCTTCAGGAAAGGGT C T GGAGT GGCT GGCACACATTTACT GGGAT GAT GACAAGCGCTATAACCCAACCCT GAAGAGCCGGCTCA CAAT CT CCAAGGAT CCCT CCAGAAACCAGGT ATT CCT CAAGAT CACCAGT GT GGACACT GCAGAT ACT GC CACATACTACTGT SEQ ID NO:22 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:2):

GACATT GT GCT CACCC AGT CT CCAAAATTCAT GT CCACAT CAGT AGGAGACAGGGT CAGCGT C ACCT GCA AGGCCAGT CAG AAT GTGGGT ACT AAT GT GGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAAT CT CCT AAAGCACT T ATTT ACTCGGCAT CCT ACCGGT ACAGT GGAGT CCCT G ATCGCTT CACAGGCAGT GGAT CT GGGACAGA TTT CACT CT CACCAT CAGC AACGT GCAGT CT GAAG ACTT GGC AGAGTATTTCT GT SEQ ID NO:23 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:5):

GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC

SEQ ID NO:24 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:7):

CAGCAAT AT AACAACTTT C C G T ACACG

Secuencias de aminoácidos adicionales son las siguientes (en el orden de extremo N-terminal a extremo C-terminal; representadas en el código de aminoácidos de una sola letra):

SEQ ID NO:27 (secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKD PSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:28 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKD PSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:29 (secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:30 (secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTL TISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:31 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTL TISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKR SEQ ID NO:32 (secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 humanizado H1L5):

APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:33 (secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico): QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISK DPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:34 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico):

QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISK DPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO:35 (secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadena pesada del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:36 (secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico):

DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFT LTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:37 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico):

DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFT LTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVA

SEQ ID NO:38 (secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadena ligera del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 quimérico):

APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:39 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 01G06):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQSLEWMGQINPNNGLIFFNQKFQGRVTL TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:40 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 01G06):

SEQ ID NO:41 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 03G05):

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVNQRPGQGLEWIGDINPSNGRSKYNEKFKNKATMT ADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVLDGAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO:42 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 03G05):

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGS GTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGSKLEIK SEQ ID NO:43 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 04F08):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVTWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTI SKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCAQTGYSNLFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO:44 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 04F08):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKLGQSPKTLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDF TLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:45 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 06C11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTI SKDASNNRVFLKITSVDTADTATYYCAQRGYDDYWGYWGQGTLVTISA SEQ ID NO:46 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 06C11):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDF ILTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO:47 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 08G01):

EVLLQQSGPEWKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGEINPNNGGTFYNQKFKGKATLT VDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:48 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 08G01):

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQY SLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSSPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:49 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 14F11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLADIWWDDDKYYNPSLKSRLTI SKDTSSNEVFLKIAIVDTADTATYYCARRGHYSAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:50 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 14F11):

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKAUYSPSYRYSGVPDRFTGSGSGTDF TLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPHTFGGGTKLEMK SEQ ID NO:51 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 17B11):

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHNDWDDDKRYKSSLKSRLTI SKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRVGGLEGYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO:52 (secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 17B11):

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSRFSYMHWFQQKPGQAPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGS GTDFTLNIHPVEGEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK

Ejemplos

Los ejemplos de referencia 1 a 3 ejemplifican un inhibidor de hGDF-15, que puede usarse en las composiciones, los kits, los métodos y los usos según la invención. Este inhibidor de hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal que se conoce a partir del documento WO 2014/049087:

Ejemplo de referencia 1: Generación y caracterización del anticuerpo anti-GDF-15 B1-23

Se generó el anticuerpo B1-23 en un ratón con genes inactivados para GDF-15. Se usó GDF-15 humano recombinante (SEQ ID NO:8) como inmunógeno.

La línea celular de hibridoma B1-23 que produce AcM-B1-23 fue depositada por la Universidad Julius-Maximilians de Wurzburgo, Sanderring 2, 97070 Wurzburgo, Alemania, en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) con el n.° de registro DSM ACC3142, según el Tratado de Budapest.

Por medio de un sistema de tiras de prueba disponible comercialmente, se identificó B1-23 como isotipo IgG2a (cadena kappa). Usando mediciones por resonancia de plasmón superficial, se determinó la constante de disociación (Kd) de la siguiente manera:

Se midió la unión del anticuerpo anti-GDF-15 humano monoclonal, AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano, según la invención empleando mediciones por resonancia de plasmón superficial usando un sistema ProteOn XPR36 de Biorad y chips de sensor GLC de Biorad:

Para preparar los biosensores, se inmovilizó proteína GDF-15 humana madura recombinante en las celdas de flujo 1 y 2. En una celda de flujo se usó GDF-15 recombinante derivado de células de insecto transfectadas con baculovirus (células de insecto HighFive) y en la otra proteína recombinante derivada de la expresión en E. coli. Se activó el chip de sensor G LC usando sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) y EDC (clorhidrato 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) (kit de acoplamiento de aminas ProteOn de Biorad) según la recomendación del fabricante, posteriormente se cargó la superficie de sensor con las proteínas hasta una densidad de aproximadamente 600 UR (1 UR = 1 pg mm-2). Luego se extinguieron los grupos de acoplamiento sin reaccionar mediante perfusión con etanolamina 1 M pH 8,5 y se equilibró el biosensor mediante perfusión del chip con tampón de desarrollo (H EPES 10 M, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4, denominado HBS150). Como controles se usaron dos celdas de flujo, una vacía sin proteína acoplada y una acoplada con una pareja de proteína no fisiológica (interleucina-5 humana), que se inmovilizó usando la misma química de acoplamiento y la misma densidad de acoplamiento. Para las mediciones de interacción, se disolvió anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 en HBS150 y se usó en seis concentraciones diferentes como analito (concentración: 0,4, 0,8, 3, 12, 49 y 98 nM). Se perfundió el analito a lo largo del biosensor usando la configuración de cinética en un solo paso (“one-shot kinetics") para evitar la regeneración intermitente, se realizaron todas las mediciones a 25°C y usando una velocidad de flujo de 100 l^ min-1. Para el procesamiento, se eliminó el efecto de cara a granel (“bulk face") y la unión inespecífica a la matriz de sensor restando los datos de SP R de la celda de flujo vacía (celda de flujo 3) de todos los demás datos de SPR . Se analizó el sensograma resultante usando el software ProteOn Manager versión 3.0. Para el análisis de la cinética de unión, se supuso una interacción de tipo Langmuir 1:1. Para la constante de velocidad de asociación pudo determinarse un valor de 5,4±0,06*105 M-1s-1 (kon) y para la constante de velocidad de disociación pudo determinarse un valor de 4,3±0,03*10-4 s-1 (koff) (los valores son para la interacción del anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 con GDF-15 derivado de la expresión en células de insecto). Se calculó la constante de disociación en equilibrio usando la ecuación KD = koff/kon para dar lugar a un valor de aproximadamente 790 pM. Los valores de afinidad para la interacción de GDF-15 derivado de la expresión en E. coli y el anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 difieren en menos de un factor de 2, las constantes de velocidad para GDF-15 derivado de células de insecto y E. coli se desvían en aproximadamente el 45% y, por tanto, están dentro de la precisión de las mediciones de SP R y probablemente no reflejan una diferencia real en la afinidad.

En las condiciones usadas, el anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 no muestra unión a interleucina-5 humana y, por tanto, confirma la especificidad de los datos de interacción y del anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23.

La secuencia de aminoácidos de GDF-15 humano recombinante (tal como se expresa en células de insecto transfectadas con baculovirus) es:

GSARNGDHCP LGPGRCCRLH TVRASLEDLG WADWVLSPRE VQVTMCIGAC PSQFRAANMH AQIKTSLHRL KPDTVPAPCC VPASYNPMVL IQKTDTGVSL QTYDDLLAKD CHCI

(SEQ ID NO:8)

Por tanto, usando mediciones por resonancia de plasmón superficial, se determinó una constante de disociación (Kd) de 790 pM. Como comparación: el anticuerpo rituximab usado terapéuticamente tiene una afinidad significativamente más baja (Kd = 8 nM).

Previamente se demostró que AcM-B1-23 inhibe la proliferación de células cancerosas in vitro y que AcM-B1-23 inhibe el crecimiento de tumores in vivo (documento WO2014/049087).

Ejemplo de referencia 2: AcM-B1-23 reconoce un epítopo conformacional o discontinuo de GDF-15 humano Mapeo de epítopos: anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 contra péptidos lineales de 13 meros derivados de GDF-15

Antígeno: GDF-15:

GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLL TRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDV TRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPG RCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASY NPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG i (322 aminoácidos con ligador)(SEQ ID NO:10)

La secuencia de proteína se tradujo en péptidos de 13 meros con un desplazamiento de un aminoácido. Los extremos C-terminal y N-terminal se alargaron mediante un ligador G SG S neutro para evitar péptidos truncados (letras en negrita).

Péptidos de control:

Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID NO:13), 78 manchas; HA: YPYDVPDYAG (SEQ ID NO:14), 78 manchas (cada copia de matriz)

Identificador de chip de péptido:

000264_01 (10/90, ligador Ala2Asp)

Condiciones de tinción:

Tampón patrón: PBS, pH 7,4 Tween-20 al 0,05%

Tampón de bloqueo: tampón de bloqueo MB-070 de Rockland

Tampón de incubación: tampón patrón con el 10% de tampón de bloqueo MB-070 de Rockland

Muestra primaria: anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 (1 ^g/ l^): tinción en tampón de incubación durante 16 h a 4°C a una dilución de 1:100 y agitación suave a 500 rpm

Anticuerpo secundario: anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) IRDye680, tinción en tampón de incubación con una dilución de 1:5000 durante 30 min a temperatura ambiente (TA)

Anticuerpos de control: anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), anticuerpo monoclonal anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); tinción en tampón de incubación durante 1 h a TA

Dispositivo de exploración:

Sistema de obtención de imágenes Odyssey, LI-COR Biosciences

Ajustes: compensación (“offset’): 1 mm; resolución: 21 |am; intensidad verde/roja: 7/7

Resultados:

Después de 30 min de hinchamiento previo en tampón patrón y 30 min en tampón de bloqueo, se incubó la matriz de péptidos con péptidos lineales derivados de B7H3 de 10, 12 y 15 meros con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (H+L) IRDye680 sólo a una dilución de 1:5000 durante 1 h a temperatura ambiente para analizar las interacciones de fondo del anticuerpo secundario. El PEPperCHIP® se lavó 2x1 min con tampón patrón, se aclaró con agua dest. y se secó en una corriente de aire. La lectura se realizó con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21 |am e intensidades verde/roja de 7/7: se observó una débil interacción de péptidos ricos en arginina (ELH LRPQ AARG RR (SEQ ID NO:15), LHLRPQ AARGRRR (SEQ ID NO:16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID NO:17), LRPQ AARG RRRAR (SEQ ID NO:18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID NO:19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID NO:20) y QAARGRRRARARN (SEQ ID NO:21)), que se sabe que son frecuentes agentes de unión, y con el péptido básico MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID NO:22) debido a interacciones iónicas con el colorante de anticuerpo cargado.

Después del hinchamiento previo durante 10 min en tampón patrón, se incubó la micromatriz de péptidos durante la noche a 4°C con anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 a una dilución de 1:100. Al lavado repetido en tampón patrón (2x1 min) le siguió una incubación durante 30 min con el anticuerpo secundario a una dilución de 1:5000 a temperatura ambiente. Después del lavado 2x10 s en tampón patrón y breve aclarado con agua dest., se secó el PEPperCHIP® en una corriente de aire. La lectura se realizó con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21 |im e intensidades verde/roja de 7/7 antes y después de la tinción de péptidos de control mediante anticuerpos anti-HA y anti-FLAG(M2).

Se demostró que ninguno de los péptidos lineales de 13 meros derivados de GDF-15 interaccionaban con el anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 incluso a intensidades sobrerreguladas. Sin embargo, la tinción de péptidos de control de Flag y HA que enmarcan la matriz dio lugar a intensidades de mancha buenas y homogéneas.

Sumario:

El mapeo de epítopos del anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 contra GDF-15 no reveló ningún epítopo lineal con los péptidos de 13 meros derivados del antígeno. Según este hallazgo, es muy probable que el anticuerpo de ratón monoclonal anti-GDF-15 reconozca un epítopo conformacional o discontinuo con baja afinidad de epítopos parciales. Debido a la evidente ausencia de cualquier señal de GDF-15 por encima de la tinción de fondo del anticuerpo secundario sólo, se omitieron la cuantificación de intensidades de mancha con el analizador PepSlide® y la posterior anotación de péptidos.

Ejemplo de referencia 3: Identificación estructural de epítopos de ligando de péptido mediante escisión de epítopos por espectrometría de masas y extracción de epítopos

El epítopo de GDF-15 humano recombinante que se une al anticuerpo B1-23 se identificó por medio del método de escisión de epítopos y el método de extracción de epítopos (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A. Diciembre de 1990; 87(24): 9848-9852.; R. Stefanescu et al., Eur. J. Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)).

Para la preparación de la columna de anticuerpos, se añadió el anticuerpo B1-23 a la Sepharose acoplada a ácido 6-aminohexanoico activado con NHS. Luego se cargó el anticuerpo B1-23 acoplado con Sepharose en una microcolumna de 0,8 ml y se lavó con los tampones de bloqueo y de lavado.

Experimento de extracción de epítopos:

Se digirió GDF-15 humano recombinante con tripsina durante 2 h a 37°C (en disolución), dando como resultado diferentes péptidos, según los sitios de escisión de tripsina en la proteína. Después de la completa digestión, se cargaron los péptidos en la columna de afinidad que contenía el anticuerpo B1-23 inmovilizado. Se usaron péptidos de GDF-15 no unidos así como potencialmente unidos para el análisis por espectrometría de masas. No fue posible ninguna identificación de péptidos por medio de espectrometría de masas. Esto fue un indicador adicional de que la región de unión de GDF-15 en el inmunocomplejo B1-23 comprende un epítopo discontinuo o conformacional. En caso de un epítopo lineal continuo, los péptidos digeridos deben unirse a su pareja de interacción, a menos que hay un sitio de escisión de tripsina en el péptido de epítopo. Pudo confirmarse un epítopo discontinuo o conformacional mediante el método de escisión de epítopos descrito en la siguiente parte.

Experimento de escisión de epítopos:

Luego se incubó el anticuerpo B1-23 inmovilizado en la columna de afinidad con GDF-15 recombinante durante 2 h.

Luego se incubó el inmunocomplejo formado en la columna de afinidad con tripsina durante 2 h a 37°C. La escisión dio como resultado diferentes péptidos derivados del GDF-15 recombinante. El propio anticuerpo inmovilizado es proteolíticamente estable. Los péptidos resultantes de la proteína GDF-15 digerida, que estaban protegidos por el anticuerpo y, por tanto, protegidos frente a la escisión proteolítica, se eluyeron en condiciones ácidas (TFA, pH 2), se recogieron y se identificaron mediante espectrometría de masas.

El método de escisión de epítopos usando la identificación por EM/EM dio como resultado los siguientes péptidos:

Péptido Posición en secuencia Masa lon/carga

EVQVTM CIGACPSQFR 40-55 1769,91 590,50(3+)

(SEQ ID NO:25)

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 94-114 2310,96 771:33(3+)

(SEQ ID NO:26)

La parte de GDF-15 humano, que se une al anticuerpo B1-23, comprende un epítopo discontinuo o conformacional.

La espectrometría de masas identificó 2 péptidos en la proteína GDF-15, que son responsables de la formación del inmunocomplejo. Estos péptidos están restringidos a las posiciones 40-55 (EVQVTM CIGACPSQFR) y 94-114 (TD TG VSl Qt Y d DLLAk Dc HCI) en la secuencia de aminoácidos de GDF-15. Por tanto, estos dos péptidos comprenden un epítopo de la proteína GDF-15 que se une al anticuerpo B1-23.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

Ejemplo 1: En pacientes con melanoma humano que habían recibido un tratamiento previo con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y que no mostraron una respuesta completa, y que habían recibido un tratamiento con pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1), los niveles séricos de hGDF-15 se correlacionan con una deficiente respuesta al tratamiento en un punto de tiempo de cuatro meses después del inicio del tratamiento con pembrolizumab.

Los presentes inventores pretendieron investigar si los pacientes con cáncer que reciben bloqueadores de puntos de control inmunitario podían beneficiarse de una inhibición de hGDF-15. Con el fin de someter a prueba esta posibilidad, se analizaron los sueros de pacientes con melanoma, que habían recibido un tratamiento previo con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y que habían recibido un tratamiento con pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) en un estudio clínico, para determinar los niveles séricos de hGDF-15. Con el fin de investigar si hGDF-15 influye en la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario, luego se correlacionaron los niveles séricos de hGDF-15 obtenidos con las respuestas de los pacientes. Los sueros se extrajeron de los pacientes antes del tratamiento con pembrolizumab.

El estudio y los posteriores análisis se llevaron a cabo de la siguiente manera:

Criterios de inclusión del estudio clínico:

Los pacientes idóneos tenían 18 años o más y tenían un melanoma en estadio III o estadio IV no resecable confirmado de manera histológica o citológica no susceptible a terapia local; evolución de la enfermedad confirmada en el plazo de 24 semanas de la última dosis de ipilimumab (mínimo dos dosis, 3 mg/kg una vez cada 3 semanas); terapia previa con inhibidores de BRAF o MEK, o ambos (si eran positivos para el mutante BRAFV600); resolución o mejora de los acontecimientos adversos relacionados con el ipilimumab hasta grado 0-1 y dosis de prednisona de 10mg/día o menos durante al menos 2 semanas antes de la primera dosis del fármaco de estudio; estado de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa Oriental (ECO G) de 0 ó 1; enfermedad medible por criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (R EC IS T v1.1); y valores dentro del intervalo preespecificado para recuento absoluto de neutrófilos (>1500 células por ml), plaquetas (>100.000 células por ml), hemoglobina (>90 g/l), creatinina sérica (<15 límite superior de la normalidad [ULN]), bilirrubina sérica total (<15 ULN o bilirrubina directa <ULN para pacientes con concentraciones de bilirrubina total >15 ULN), aspartato y alanina aminotransferasas (<25 ULN o <5 ULN para pacientes con metástasis hepáticas), razón normalizada internacional o tiempo de protrombina (<15 ULN si no se usan anticoagulantes) y tiempo de tromboplastina parcial activada (<15 ULN si no se usan anticoagulantes). Los pacientes tuvieron un periodo de reposo farmacológico de al menos 4 semanas entre la última dosis de la terapia más reciente y la primera dosis de pembrolizumab. Se excluyeron del estudio los pacientes con metástasis cerebrales activas conocidas o meningitis carcinomatosa, enfermedad autoinmunitaria activa, infección activa que requiere terapia sistémica, antecedentes conocidos de infección por VIH, infección activa por virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C, antecedentes de acontecimientos adversos relacionados con el ipilimumab de grado 4 o acontecimientos adversos relacionados con el ipilimumab de grado 3 que duraron más de 12 semanas, o tratamiento previo con cualquier otra terapia con anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1.

Tratamiento de los pacientes:

Los pacientes con melanoma humano que cumplieron los criterios de inclusión definidos anteriormente (salvo dos excepciones) ya se habían tratado con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y no mostraron una respuesta completa. El pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) se administró o bien a 2 mg/kg de peso corporal o bien a 10 mg/kg de peso corporal. Dado que no se observaron diferencias dependientes de la dosis entre los dos grupos de tratamiento, se evaluaron conjuntamente los pacientes tratados.

Criterios para la respuesta:

Los sujetos que responden y los sujetos que no responden al tratamiento, así como las respuestas en curso, se clasificaron usando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (R EC IS T v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised R EC IST guideline (version 1.1). En: Eur. J . Cancer. 45, n.° 2, enero de 2009, págs. 228-47).

Análisis de los niveles séricos de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se midieron los niveles séricos de GDF-15 humano mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

Tampones y reactivos:

Disolución de bloqueo tamponada: BSA al 1% (fracción V pH 7,0, PAA) en PBS

Disolución de lavado: PBS-Tween (0,05%)

Patrón: GDF-15 humano (concentración de reserva de 120 |ig/ml, de R&D Systems)

Anticuerpo de captura: AcM anti-GDF-15 humano (clon 147627) de R&D Systems, IgG2B de ratón (n.° de catálogo MAB957, de R&D Systems, concentración de reserva de 360 |ig/ml)

Anticuerpo de detección: AcP purificado por afinidad biotinilado anti-GDF-15 humano, IgG de cabra (n.° de catálogo BAF940, de R&D Systems, concentración de reserva de 9 |il/ml)

Estreptavidina-HRP (n.° de catálogo DY998, de R&D Systems)

Disolución de sustrato: 10 ml de NaOAc 0,1 M pH 6,0 100 |il de TMB 2 |il de H2O2

Disolución de parada: H2SO41 M

Procedimiento de análisis:

1. Preparación de placa:

a. Se diluyó el anticuerpo de captura hasta la concentración de trabajo de 2 |ig/ml en PBS. Se recubrió inmediatamente una placa de 96 pocillos (Nunc maxisorp®) con 50 |il por pocillo del anticuerpo de captura diluido excluyendo las filas exteriores (A y H). Se llenaron las filas A y H con tampón para prevenir la evaporación de las muestras durante el experimento. Se golpeó suavemente la placa para garantizar que la parte inferior de cada pocillo se cubrió completamente. Se colocó la placa en una cámara húmeda y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (TA).

b. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

c. Se añadieron 150 |il de disolución de bloqueo a cada pocillo, seguido de incubación a TA durante 1 hora. d. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

2. Procedimiento de ensayo:

a. Se prepararon patrones. Se diluyó GDF-15 en disolución de bloqueo tamponada hasta una concentración final de 1 ng/ml (4,17 |il de GDF 496 |il de disolución de bloqueo tamponada). Se realizaron diluciones en serie de 1:2.

b. Se prepararon muestras duplicadas 1:20 (6 |il 114 |il de disolución de bloqueo tamponada).

c. Se añadieron 50 |il de muestras o patrones diluidos por pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G

H

a. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

b. Se diluyó el anticuerpo de detección hasta una concentración final de 50 ng/ml (56 |il 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 |il del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

c. Se aspiró cada pocilio y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

d. Se diluyó estreptavidina-HRP 1:200 (50 |il 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 |il de la dilución de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA. e. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

f. Se preparó la disolución de sustrato. Se añadieron 50 |il de disolución de sustrato a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

g. Se añadieron 50 |il de disolución de parada a cada pocillo.

h. Se determinó la densidad óptica de cada pocillo inmediatamente usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm.

3. Cálculo del título sérico de GDF-15:

a. Se aplicó cada dilución de muestra/patrón de GDF-15 por duplicado. Para determinar el título de GDF-15, se calculó el promedio de los duplicados y se restó el fondo (muestra sin GDF-15).

b. Para crear una curva de calibración, se representaron gráficamente los valores del intervalo lineal en un diagrama X-Y (eje X: concentración de GDF-15, eje Y: DO450), y se aplicó un ajuste de curva lineal. Se calculó el título sérico de GDF-15 de las muestras de prueba interpolando a partir de los valores de DO450 de las diluciones de patrón con concentración conocida.

c. Para calcular la concentración de GDF-15 final de las muestras, se consideró el factor de dilución distinto. Se analizaron de nuevo las muestras que dieron lugar a valores de DO por debajo o por encima del intervalo patrón a las diluciones apropiadas.

Comparación de niveles séricos de hGDF-15 con datos de pacientes:

A continuación, se compararon los niveles séricos de hGDF-15 medidos con datos de respuesta de los pacientes obtenidos a partir del estudio.

La figura 1 muestra los niveles séricos de GDF-15 para sujetos que responden y sujetos que no responden al régimen de tratamiento. Tal como puede observarse a partir de la figura, la mayoría de los sujetos que no responden tienen niveles séricos de GDF-15 más altos que la totalidad de los sujetos que responden.

Este resultado también se refleja en la figura 2, que muestra los números de sujetos que responden y sujetos que no responden entre los pacientes que tienen niveles séricos de hGDF-15 de <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml y >4,2 ng/ml, respectivamente.

Estos hallazgos sugirieron que altos niveles de GDF-15 están relacionados con una deficiente respuesta al tratamiento. Por tanto, estos hallazgos se sometieron a prueba para determinar su significación estadística:

Correlación estadística de niveles séricos de hGDF-15 con datos de pacientes:

Datos:

El análisis de datos se basó en un archivo de datos que contiene datos de muestras de 35 pacientes que contiene las columnas (variables) de designación de muestra, GDF-15 (ng/ml), sujeto que responde/sujeto que no responde, días (hasta la muerte o censura) y en curso (una variable de índice para la vida en curso). La clasificación de sujetos que responden/sujetos que no responden de estos datos se realizó en un punto de tiempo de cuatro meses después del inicio del tratamiento con pembrolizumab. Dado que algunas muestras de suero sólo se habían obtenido poco antes del análisis, sólo pudo evaluarse la respuesta en 29 pacientes. Un sujeto que responde parcialmente (> 30% de reducción en el tamaño tumoral) se clasificó como sujeto que responde. Para la determinación de LDH, tuvieron que excluirse 4 muestras debido a la hemólisis.

Variables de desenlace (criterios de valoración):

a. Supervivencia global (tiempo hasta la muerte). Este criterio de valoración se compone del indicador de acontecimiento para la muerte (1 = muerto/0 = vivo), que se derivó del archivo de datos, y el tiempo hasta la muerte o censura (último momento en que se sabe que el paciente estaba vivo), correspondiente a la variable “días”.

b. Respuesta al tratamiento, por ejemplo si un paciente era un sujeto que responde o no (codificado como 1=sujeto que responde, 0=sujeto que no responde). Los sujetos que responden parcialmente se consideraron como sujetos que responden.

Análisis de datos:

La supervivencia global se analizó mediante modelos de supervivencia de riesgos proporcionales de Cox. Se ajustó un modelo con GDF-15 (ng/ml) como predictor continuo y otro modelo con una variable de agrupación basada en GDF-15 como predictor categórico (los grupos eran: <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml, >4,2 ng/ml de GDF-15). En conjunto, los datos de supervivencia estaban disponibles de 35 pacientes.

Se analizó la respuesta al tratamiento (variable binaria) mediante modelos lineales generalizados (GLM) con distribución binomial de errores y función de enlace logit (regresión logística). Para la respuesta al tratamiento tal como se evalúa mediante los criterios según RECIST1.1 después de 4 meses, se ajustó un modelo con GDF-15 (ng/ml) como predictor continuo. Puesto que ninguno de los pacientes respondió al tratamiento en el grupo con GDF-15 >4,2 ng/ml, la estimación de razón de posibilidades para este grupo frente al grupo con GDF-15 <1,8 ng/ml sería muy grande, con un intervalo de confianza muy amplio. En lugar de ajustar otro modelo con la variable de agrupación basada en GDF-15 como predictor categórico, se usó una prueba de chi cuadrado (x2) para comparar los grupos (someter a prueba la igualdad de la proporción de sujetos que responden). Puesto que algunas veces el número de sujetos que responden/sujetos que no responden era bastante pequeño (< 5), se realizó además un análisis de sensibilidad usando la prueba exacta de Fisher. Los pacientes que sólo había recibido anticuerpo anti-PD-1 en el plazo de los últimos 4 meses aún no podía clasificarse como sujetos que responden o sujetos que no responden. Por tanto, sólo pudieron evaluarse 29 pacientes para determinar la respuesta a la terapia.

El análisis de datos se realizó usando el paquete de software estadístico R (R Core Team, 2014, versión 3.1.0).

Resultados:

Las tablas 1-2 muestran los resultados de los modelos con GDF-15 como predictor continuo. El riesgo de muerte aumentó significativamente para mayores concentraciones de GDF-15 (HR > 1, tabla 1) mientras que la probabilidad de respuesta al tratamiento disminuyó significativamente, tal como se indica por la razón de posibilidades (OR) (O R < 1, tabla 2). La figura 3 muestra los datos correspondientes en sujetos que responden/sujetos que no responden así como la probabilidad de respuesta al tratamiento predicha por el modelo.

La tabla 3 muestra el resultado del modelo de riesgos proporcionales de Cox con el grupo basado en GDF-15 como predictor categórico. El grupo con GDF-15 <1,8 ng/ml se usa como grupo de referencia (no mostrado en la tabla). Las dos razones de riesgos en la tabla 3 representan la comparación del grupo con GDF-15 entre 1,8 y 4,2 y el grupo con GDF-15 >4,2 con el grupo de referencia. El riesgo de muerte aumenta en ambos de estos grupos (en comparación con el grupo de referencia), pero en mayor medida en el grupo con GDF-15 >4,2. La figura 4 muestra las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia en los tres grupos.

La proporción de sujetos que responden difirió significativamente entre los grupos (sujeto que responde 1: x2df=2=16,04, P=0,0003). Este resultado se confirmó mediante los resultados de la prueba exacta de Fisher (P=0,0003). Los números de muertes y sujetos que responden por grupo se proporcionan en la tabla 4. Además, la tabla 5 muestra algunos parámetros estadísticos descriptivos del GDF-15 para cada grupo.

Tabla 1:

HR IC del 95% z _p

GDF-15 1,27 [1,10, 1,47] 3,27 0,00109

La tabla 1 muestra las estimaciones de la razón de riesgos (HR) a partir del modelo de riesgos proporcionales de Cox con la supervivencia global (tiempo hasta la muerte) como variable de desenlace y GDF-15 como predictor continuo. El análisis incluyó muestras de 35 pacientes.

Tabla 2:

Estimación (OR) IC del 95% z _p

(Ordenada en el origen) 25,281 [4,219, 364,950] 2,94 0,00324

GDF-15 0,389 [0,159, 0,698] -2,54 0,01120

La tabla 2 muestra las estimaciones de la razón de posibilidades (OR) a partir del modelo lineal generalizado con la respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) como variable de desenlace y GDF-15 como predictor continuo. El análisis incluyó muestras de 29 pacientes.

Tabla 3:

HR IC del 95% z _p

Grupo de GDF-15 (1,8, 4,2] 1,54 [0,48, 4,92] 0,73 0,466

Grupo de GDF-15 (4,2, 13] 21,52 [5,20, 89,06] 4,24 <0,001

La tabla 3 muestra las estimaciones de la razón de riesgos (HR) a partir del modelo de riesgos proporcionales de Cox con la supervivencia global (tiempo hasta la muerte) como variable de desenlace y el grupo basado en GDF-15 como predictor categórico. El análisis incluyó muestras de 35 pacientes.

Tabla 4:

Variable Niveles n[0,1,8] %[0, 1,8] n(1,8, 4,2] %(1,8, 4,2] n(4,2, 13] %(4,2, 13] ntodos %todos muerte 0 11 61,1 6 54,5 0 0,0 17 48,6

1 7 38,9 5 45,5 6 100,0 18 51,4 todos 18 100,0 11 100,0 6 100,0 35 100,0 sujeto que responde 1 0 1 7,1 3 33,3 6 100,0 10 34,5

1 13 92,9 6 66,7 0 0,0 19 65,5 todos

14 100,0 9 100,0

6 100,0

29 100,0

La tabla 4 muestra el número de muertes y sujetos que responden (sujeto que responde 1) en los tres grupos definidos por el GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 ng/ml).

Tabla 5:

Variable Niveles n x x s Mín. Máx.

GDF-15 [0, 1,8] 18 0,9 0,9 0,4 0,3 1,6

(1,8, 4,2] 11 2,8 2,9 0,8 2,0 4,0

(4,2, 13] 6 7,1 7,4 2,9 4,6 12,0

todos 35 1,6 2,6 2,7 0,3 12,0

Tabla 5: La variable GDF-15 (ng/ml) como predictor continuo en los tres grupos definidos por el GDF-15 (<1,8, 1,8­ 4,2, >4,2 ng/ml). Se muestran el número de pacientes (n), la mediana (x), la media (x), la desviación estándar (s), el mínimo (Mín.) y el máximo (Máx.).

A continuación, con el fin de comparar los resultados estadísticos obtenidos para los niveles de GDF-15, también se realizaron análisis estadísticos para los niveles de un factor de pronóstico conocido, la lactato deshidrogenasa (LDH), en los sueros de pacientes:

Se considera que la lactato deshidrogenasa es un marcador relevante para el pronóstico de tumores sólidos. Esto se ha confirmado recientemente mediante un meta-análisis completo basado en un gran conjunto de estudios clínicos (31.857 pacientes). Se halló un efecto coherente de LDH elevada sobre OS (HR = 1,48, IC del 95% = de 1,43 a 1,53) en todos los subgrupos y estadios de enfermedad. Además, había una tendencia hacia un valor de pronóstico más fuerte de LDH en enfermedad metastásica en comparación con enfermedad no metastásica, que se pensó que reflejaba una mayor carga tumoral. Aunque el mecanismo exacto sigue siendo desconocido y también puede estar relacionado con hipoxia y reprogramación metabólica a través de un efecto Warburg, puede interpretarse que la LDH refleja una alta carga tumoral o agresividad tumoral (Zhang, J ., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., y Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). Dado que los niveles séricos de LDH se han incorporado en el esquema de estadificación para el melanoma, este parámetro se mide de manera rutinaria durante el diagnóstico clínico por parte del laboratorio de referencia de la universidad.

Tabla 6:

Tabla 6: GDF-15 y LDH en sujetos que responden frente a sujetos que no responden

No se logró la determinación de LDH en 4 muestras de sangre debido a la hemólisis.

La tabla 7 es análoga a la tabla 2, excepto que se usó LDH como predictor continuo de respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) en lugar de GDF-15. La probabilidad de respuesta al tratamiento disminuyó de manera marginalmente significativa al aumentar los valores de LDH (OR < 1, p < 0,1). La figura 5 muestra los datos correspondientes en sujetos que responden/sujetos que no responden, así como la probabilidad de respuesta al tratamiento predicha por el modelo.

Con el fin de determinar si GDF-15 es mejor predictor de respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) que LDH, se ajustaron dos modelos adicionales: un modelo que contiene ambos marcadores como predictores (que automáticamente sólo incluye pacientes con mediciones en ambos marcadores) y un modelo con GDF-15 como único predictor pero también usando sólo los pacientes con una medición de LDH. Luego, se calculó el criterio de información de Akaike (AIC) para los tres modelos (tabla 8). Un AIC más bajo indica un modelo más eficiente. De hecho, el AIC del modelo con GDF-15 fue más pequeño que el AIC del modelo con LDH como predictor. El modelo con GDF-15 sólo tiene incluso un AIC más pequeño que el modelo con ambos predictores, lo que indica que LDH como predictor adicional no mejora el modelo. Por supuesto, el modelo con ambos predictores no puede explicar la peor respuesta al tratamiento, pero como medida de la “eficiencia de modelo”, el AIC penaliza a los modelos con predictores que no mejoran el modelo considerablemente y favorece modelos más sencillos. Se realizó una comparación de modelos alternativos mediante el análisis de la desviación (similar al análisis de la varianza pero para modelos lineales generalizados), es decir, comparando la diferencia en la desviación explicada entre el modelo más complejo con ambos predictores y ambos de los modelos más sencillos con sólo uno de los predictores (correspondientes a una reducción del modelo por cualquiera de LDH o GDF-15). La retirada de GDF-15 a partir del modelo más complejo dio como resultado una reducción significativa en la desviación explicada (P=0,02) mientras que la retirada de LDH no (P=0,41).

Tabla 7:

Estimación (OR) IC del 95% z _p

(Ordenada en el origen) 9,741 [2,055, 89,308] 2,44 0,0146

LDH 0,997 [0,994, 0,999] -1,79 0,0727

Tabla 7: Estimaciones de la razón de posibilidades (OR) a partir del modelo lineal generalizado con respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1, tal como se define en el archivo A) como variable de desenlace y LDH como predictor continuo. El análisis incluyó muestras de 25 pacientes.

Tabla 8:

df AIC

Modelo con LDH y GDF-15 3,00 25,10

Modelo con LDH sólo 2,00 28,55

Modelo con GDF-15 sólo 2,00 23,77

Tabla 8: Comparación de modelos basada en el criterio de información de Akaike (AIC) en el que valores más pequeños indican un modelo más eficiente. df: grados de libertad. Todos los modelos incluyeron muestras de 25 pacientes.

La figura 5A muestra la probabilidad de respuesta al tratamiento (sujeto que responde 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando LDH como predictor continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de LDH cuando la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5. La cohorte de pacientes fue idéntica. Sin embargo, no se logró una determinación fiable de los niveles de LDH en cuatro pacientes debido a la hemólisis. La figura 5B muestra una representación gráfica de sujetos que responden y sujetos que no responden y sus respectivos niveles de hGDF-15 y LDH. Cuando se seleccionan valores de corte para cubrir a todos los sujetos que responden, las pruebas basadas en GDF-15 permiten la identificación de 6 (de 9) sujetos que no responden mientras que los análisis basados en los niveles de LDH sólo pueden discriminar 4 (de 9) sujetos que no responden. Para las pruebas de LDH, tuvieron que excluirse 4 muestras hemolíticas, lo que provoca una pérdida de datos.

Sumario:

En conjunto, los resultados estadísticos anteriores del ejemplo 1 mostraron que la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye significativamente al aumentar los niveles de hGDF-15 en los sueros de pacientes. Por ejemplo, la razón de posibilidades de 0,389 mostrada en la tabla 2 indica que si los niveles séricos de hGDF-15 aumentan en 1 ng/ml, la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye hasta el valor de 0,389 veces del valor original, es decir disminuye en aproximadamente el 60%. Si los niveles séricos de hGDF-15 aumentan en 2 ng/ml, la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye hasta el valor de 0,389x0,389 veces=0,151 veces del valor original, es decir disminuye en aproximadamente el 85%.

Los resultados del ejemplo 1 sugieren que hGDF-15 actúa para afectar negativamente a las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, un inhibidor de hGDF-15 será útil para inhibir los efectos negativos de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y para mejorar las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario no sólo en melanoma, sino en todos los cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Ejemplo 2: Los niveles de GDF-15 se correlacionan de manera inversa con linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) CD8+ en metástasis de diferentes entidades tumorales.

Con el fin de identificar el mecanismo de hGDF-15 que contribuya al efecto negativo de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes, se analizaron metástasis cerebrales a partir de diferentes tumores sólidos para determinar la expresión de hGDF-15 y la presencia de células del sistema inmunitario:

Muestra de tejido y procesamiento de tejidos:

Se analizó tejido fijado en formalina e incrustado en parafina (FFP E ) a partir de metástasis cerebrales archivadas, que se recogió y procesó como micromatrices de tejido (TMA). Todas las muestras se obtuvieron o bien a partir del banco de tumores de UCT (Universidad de Goethe, Fráncfort del Meno, Alemania, miembro del Consorcio Alemán del Cáncer (DKTK), Heidelburgo, Alemania y del Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Heidelburgo, Alemania) o bien a partir del banco de tumores del registro de cáncer “Banco de sangre y tejidos para la investigación de melanomas malignos” (Departamento de Dermato-Oncología, Hospital Universitario de Tubinga, Alemania). La aprobación para este estudio fue concedida por dos comités de ética independientes (comité de ética de UCT de Fráncfort / Universidad de Goethe, Fráncfort del Meno, Alemania: números de proyecto: GS 4/09; SNO_01-12; comité de ética de la Universidad de Tubinga, número de proyecto: 408/2013BO2). En total, se investigaron 190 pacientes con metástasis cerebrales incluyendo: melanoma (n=98), NSCLC (n=33), carcinoma de mama (n=18), ^r C ^c (n=10), SCLC (n=7), carcinoma colorrectal (n=7), carcinomas que no se especificaron de otro modo (carcinoma NOS n=11) y muestras de tumores raros resumidas como otros (n=6). Se recogieron datos de supervivencia de 155 pacientes (tiempo de supervivencia después de la resección tumoral), adicionalmente se analizaron el número de metástasis cerebrales en 169 pacientes y el tamaño de metástasis cerebrales en una subcohorte de 55 pacientes con melanoma.

Inmunohistoquímica:

Se realizó inmunohistoquímica para todos los anticuerpos usando portaobjetos de 3 |im de grosor y protocolos convencionales en el sistema de tinción por IHC automatizado Discovery XT (Roche/Ventana, Tucson, Arizona, EE .UU .). Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-GDF-15 (HPA011191, dilución 1:50, Sigma/Atlas, n.° de protocolo 730), CD3 (clon A0452, dilución 1:500, Da KO, Glostrup, Dinamarca), CD8 (clon C8/144B, dilución 1:100, DAKO, Glostrup, Dinamarca), PD-1 (clon NAT105; dilución 1:50; Abcam, Cambridge, Reino Unido), PD-L1 (E1L3N; dilución 1:200; Cell Signaling, Boston, EE.UU .), FOXP3 (clon 236A/E7; dilución 1:100; eBioscience, San Diego, EE.UU .). Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina y se montaron.

Análisis estadísticos:

Todas las muestras se puntuaron según la frecuencia de células positivas con respecto a todas las células (como porcentaje) en el núcleo de TMA teñido. Para la expresión de hGDF-15, se usó una puntuación tal como se describió previamente en detalle [21,22]: frecuencia del 0-1% puntuación 0; del 1-10% puntuación 1; del 10-25% puntuación 2; del 25-50% puntuación 3; >50% puntuación 4; adicionalmente se multiplicó la puntuación de frecuencia por la intensidad de tinción (1 tinción débil, 2 tinción moderada, 3 tinción fuerte), dando como resultado finalmente la puntuación de hGDF-15 escalada ordinal (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12). Se compararon las variables escaladas ordinales con la prueba no paramétrica de Wilcoxon/Kruskal-Wallis y el método de Dunn para corregir pruebas múltiples. Para las variables continuas, se compararon las medias entre diferentes entidades de metástasis cerebrales usando ANOVA, seguido de la prueba a posteriori HSD de Tukey-Kramer. Para los análisis de correlación del tamaño de metástasis cerebrales y la expresión de marcadores, se realizó un ajuste lineal seguido de ANOVA; en caso de variables escaladas ordinales, se usó el análisis de correlación de rho de Spearman. Se estableció un nivel de significación de p<0,05 para todos los análisis estadísticos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando JMP8 y JMP11 (SAS, Cary, EE.UU.), se crearon gráficos adicionales con Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, EE.UU.).

Resultados:

La figura 6 muestra cortes tisulares a modo de ejemplo de metástasis cerebrales de melanoma que no tienen alta (panel superior) o que tienen alta (panel inferior) inmunorreactividad con GDF-15, que se tiñeron mediante inmunohistoquímica para GDF-15 y para las proteínas marcadoras de células T CD3 y CD8, respectivamente, tal como se indica en la figura. En la sección sin expresión de GDF-15, las numerosas células inmunitarias infiltrantes se observan como manchas oscuras. En la imagen que muestra las metástasis que expresan altos niveles de GDF-15, las escasas células inmunitarias infiltrantes están representadas por flechas (las células positivas para CD3 y CD8 están indicadas por flechas). Tal como puede observarse a partir de la figura, se halló sorprendentemente que, en el corte tisular con alta inmunorreactividad hacia hGDF-15 (panel inferior), el número de células CD3+ y CD8+ se redujo fuertemente en comparación con el corte tisular sin inmunorreactividad hacia hGDF-15 (panel superior). Cabe destacar que todos los demás marcadores teñidos como PD-L1, PD-1 mostraron una correlación positiva con el número de células T CD3+ y CD8+ infiltrantes tumorales.

Por tanto, a continuación se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y el porcentaje de células T CD3+ en diferentes metástasis cerebrales de melanoma. La figura 7A muestra un gráfico del porcentaje de células CD3+ frente a la puntuación de GDF-15 (obtenida tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”). Tal como se indica en la figura 7A, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD3+ y la puntuación de GDF-15 (p=0,0015).

De manera similar, también se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y el porcentaje de células T CD8+ en diferentes metástasis cerebrales de melanoma. La figura 7B muestra un gráfico del porcentaje de células CD8+ frente a la puntuación de GDF-15 (obtenida tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”). Tal como se indica en la figura 7B, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD8+ y la puntuación de GDF-15 (p=0,0038).

La correlación de GDF-15 con FOXP3, en cambio, no proporcionó ningún resultado estadísticamente significativo según la prueba del coeficiente de correlación de rangos de Spearman (rho) (p=0,8495 en diferentes entidades tumorales; p=0,2455 cuando se evalúan sólo metástasis de melanoma).

Finalmente, también se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y los porcentajes de células T CD8+ y CD3+ en metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales. La figura 8 muestra un gráfico de la puntuación de GDF-15 frente al porcentaje de células T CD8+ y CD3+, respectivamente, en 168 (para CD3) o, respectivamente, 169 (para CD8) metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales (melanoma, CRC, RCC, cáncer de mama, NSCLC y SCLC). El gráfico se obtuvo tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”. Tal como se indica en la figura 8, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD8+ y la puntuación de GDF-15 (p=0,0311) así como una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD3+ y la puntuación de GDF-15 (p=0,0093). De nuevo, otros marcadores (PD-L1, PD-1, FOXP3) mostraron correlaciones positivas con la infiltración de células T CD3 y CD8.

Sumario:

Los resultados anteriores muestran que no sólo hay una correlación inversa de hGDF-15 con el porcentaje de células T que expresan la proteína marcadora de células T general CD3 en las metástasis, sino también una correlación inversa con el porcentaje de linfocitos T CD8+ en las metástasis. Esto es notable porque previamente se demostró que la presencia de linfocitos T CD8+ se requería específicamente para la regresión tumoral después de la inhibición de puntos de control inmunitario con un anticuerpo anti-PD-1 (Tumeh et al., Nature. 27 de noviembre de 2014; 515(7528):568-71).

Por tanto, según la invención, puede usarse la inhibición terapéutica de hGDF-15 para aumentar el porcentaje de linfocitos T CD8+ en tumores sólidos, incluyendo metástasis tumorales. Este aumento de linfocitos T CD8+ en los tumores sólidos puede usarse para la terapia de los tumores sólidos. En un aspecto no limitativo de la invención, una combinación terapéutica particularmente favorable es la combinación de un inhibidor de hGDF-15 con un bloqueador de puntos de control inmunitario. Un efecto ventajoso de esta combinación es que la inhibición de hGDF-15 aumentará el porcentaje de linfocitos T CD8+ en los tumores sólidos y, por tanto, conducirá a un efecto terapéutico sinérgico con la inhibición de puntos de control inmunitario. Por tanto, la invención puede aplicarse a todos los tumores sólidos a los que se hace referencia en las realizaciones preferidas.

Ejemplo 3: GDF-15 disminuye la adhesión de células T a células endoteliales.

A continuación, los inventores pretendieron determinar cómo afecta hGDF-15 al porcentaje de células T en los tumores sólidos.

Una etapa que se requiere para la invasión de células T desde el torrente circulatorio hacia el tejido tumoral es que las células T deben adherirse en primer lugar al endotelio antes de que puedan entrar en el tumor. Con el fin de simular esta etapa y evaluar si esta etapa puede verse afectada por hGDF-15, los inventores usaron un sistema de modelo que mide la adhesión de células T a células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC):

Experimento de fluio/adhesión de células T (en HUVEC):

Día 1:

a. Se recubrieron ^-portaobjetos VI 0,4 (ibidi GmbH, Alemania) con fibronectina (100 |ig/ml): 30 |il por puerto de carga. Se incubaron durante 1 h a 37°C (o se usó un portaobjetos recubierto previamente) b. Se aspiró la fibronectina, seguido de un lavado con medio de HUVEC

c. Se sometieron a tripsinización las HUVEC de una placa de 6 pocillos (recuento: 2*105/ml (2 ml en total)) d. Se lavaron y se diluyeron hasta 1*10® células/ml

e. Se aplicaron 30 |il de HUVEC en los puertos de carga del ^-portaobjetos VI y se comprobaron bajo un microscopio

f. Se cubrió el ^-portaobjetos VI con una tapa y se incubó a 37°C, el 5% de CO2

Día 2:

a. Se activaron las HUVEC con TNFa (10 ng/ml) e IFNy (10 ng/ml) en los canales 2-5 (véase la tabla a continuación): se aspiraron todos los medios de los canales y se reemplazaron por medios precalentados que contienen citocinas.

Día 3:

a. Se aislaron las células T (aislamiento negativo de linfocitario de células T (pan T)).

b. Se incubaron previamente las células T en el pocillo 1 (1*10® células/ml) con o sin GDF-15 (100 ng/ml) durante 1 h.

c. Se incubaron previamente las HUVEC en los canales 4 y 5 con GDF-15 (100 ng/ml) durante 1 h: se aspiró todo el medio en los puertos de carga, y se llenaron ambos puertos de carga con medio precalentado que contiene GDF-15.

d. Se precalentó una incubadora superior de platina junto al microscopio, y se conectó una mezcla de gases (el 5% de CO2, el 16% de O2, el 79% de N2).

e. Se prepararon 3 jeringas de 50 ml:

i. Células T (1*10® células/ml): 1 ml

ii. Células T-GDF-15 (1*10® células/ml): 1 ml

iii. Medio

f. Se conectó la jeringa 1 al canal 1 (véase la tabla a continuación) y se inició el flujo (0,5 dinas/cm2: 0,38 ml/min = 22,8 ml/h).

g. Se hicieron fluir las células T durante 3 min y, mientras tanto, se predefinieron 10 campos de visión en el microscopio.

h. Se obtuvieron imágenes por vídeo de cada campo de visión durante 5 s.

i. Se evaluaron los canales restantes de manera análoga al canal 1 (f-h) con las muestras de células T tal como se indican en la tabla a continuación.

Se obtuvo GDF-15 recombinante de Invigate GmbH, Jena, Alemania.

Análisis estadístico:

Todos los datos se compararon usando la prueba de Mann-Whitney para someter a prueba datos no distribuidos normalmente. Se consideraron que los valores de p<0,05 eran estadísticamente significativos.

Resultados:

Los resultados del experimento se muestran en la figura 9. Esta figura muestra análisis de varios parámetros de adhesión, concretamente

a. el número de células T rodantes por campo de visión por segundo (9A; los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”)), que refleja una forma de adhesión moderada de las células T a las células endoteliales,

b. la velocidad de rodamiento de las células T (medida en píxeles por 0,2 segundos) (9B; los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”)), que aumenta al disminuir la adhesión entre las células T y las células endoteliales, y

c. el número de células adherentes por campo de visión (9C; los datos se obtuvieron a partir del canal #3 (“GDF-15”) y el canal #2 (“control”); y 9D).

Tal como puede observarse a partir de la figura 9C, se halló que el tratamiento de las células T con hGDF-15 disminuye significativamente la adhesión a las células endoteliales, tal como se refleja en el número de células adherentes por campo de visión. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizó la adhesión contando los números de células T rodantes (figura 9A). Además, y coherente con los resultados anteriores, se halló que el tratamiento de las células T con hGDF-15 aumenta significativamente la velocidad de rodamiento, lo que indica una disminución en el tiempo de interacción entre las células T y las células endoteliales, y también indica una adhesión reducida entre las células T y las células endoteliales (figura 9B).

A continuación, los inventores analizaron qué células seleccionó como diana hGDF-15 (figura 9D). En la muestra en la que sólo las HUVEC se trataron con hGDF-15, se observó una diminución moderada en la adhesión de las células T a las células endoteliales (HUVEC). En cambio, se observó una fuerte diminución en la adhesión de las células T a las células endoteliales (HUVEC) cuando o bien sólo las células T se trataron con hGDF-15 o bien cuando tanto las células T como las células endoteliales (HUVEC) se trataron con hGDF-15. Estos resultados indican que hGDF-15 actúa tanto sobre las células T como sobre las células endoteliales, pero también indican que el principal efecto de adhesión de hGDF-15 es un efecto sobre las células T.

A continuación, los inventores sometieron a prueba si los efectos de hGDF-15, que se secreta por células tumorales, sobre la adhesión de células T podía inhibirse con un inhibidor de hGDF-15. Con el fin de someter a prueba esto, los inventores usaron una línea celular de melanoma que secreta hGDF-15, UACC257:

Experimento de flujo/adhesión de células T (en HUVEC) en presencia o ausencia de GDF-15 en sobrenadante de células tumorales:

Día 1:

a. Se recubrió un ^-portaobjetos VI 0,4 (ibidi GmbH, Alemania; de ahora en adelante denominado |iportaobjetos) con fibronectina (100 |ig/ml): 30 |il por puerto de carga. Se incubaron durante 1 h a 37°C (o se usó un portaobjetos recubierto previamente).

b. Se aspiró la fibronectina, seguido de un lavado con medio de HUVEC.

c. Se sometieron a tripsinización las HUVEC de una placa de 6 pocillos (recuento: 2*105/ml (2 ml en total))

d. Se lavaron y se diluyeron hasta 1*10® células/ml

e. Se aplicaron 30 |il de HUVEC en los puertos de carga del ^-portaobjetos y se comprobaron bajo un microscopio

f. Se cubrió el ^-portaobjetos con una tapa y se incubó a 37°C, el 5% de CO2.

Día 2:

a. Se activaron las HUVEC con TN Fa (10 ng/ml) e IFNy (10 ng/ml) en los canales 2-5 del ^-portaobjetos (véase la tabla a continuación): se aspiraron todos los medios de los canales y se reemplazaron por medios precalentados que contienen citocinas.

Día 3:

a. Se aislaron las células T (aislamiento negativo de linfocitario de células T).

b. En paralelo, se recubrieron 24 pocillos de una placa de ELISA de 96 pocillos (Nunc maxisorb) con 200 |il de anticuerpo anti-GDF-15 (10 |ig/ml diluido en PBS), se incubaron durante 45 min y luego se lavaron con PBS.

c. Para agotar el sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que secreta GDF-15 (datos no mostrados) de GDF-15, se incubó el sobrenadante en pocillos de la placa de ELISA (véase b) que se recubrieron previamente con anticuerpo anti-GDF-15.

d. Como control, se incubó el sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 en pocillos de la placa de ELISA (véase b) que no se recubrieron previamente con anticuerpo anti-GDF-15.

e. Se incubaron previamente las células T en una placa de cultivo celular de 12 pocillos (1*10® células/ml) con GDF-15 (100 ng/ml), sin GDF-15, en sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 agotada de GDF-15 (véase c) o en sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que contiene GDF-15 (véase d) durante 1 h.

f. Se precalentó una incubadora superior de platina junto al microscopio, y se conectó una mezcla de gases (el 5% de CO2, el 16% de O2, el 79% de N2).

g. Se prepararon 4 tubos de 2 ml de un sistema de flujo microfluídico:

i. Células T (1*10® células/ml): 1 ml

ii. Células T-GDF-15 (1*10® células/ml): 1 ml

iii. Células T-UACC257 (que contienen GDF-15)

iv. Células T-UACC257 agotadas de GDF-15

h. Se conectó el tubo 1 al canal 1 (véase la tabla a continuación) y se inició el flujo (0,4 ml/min = 24 ml/h). i. Se hicieron fluir las células T durante 3 min y, mientras tanto, se predefinieron 5 campos de visión en el microscopio.

j. Se obtuvieron imágenes por vídeo de cada campo de visión durante 5 s.

k. Se evaluaron los canales restantes de manera análoga al canal 1 (f-h) con las muestras de células T tal como se indican en la tabla a continuación.

Se obtuvo GDF-15 recombinante de Invigate GmbH, Jena, Alemania.

Resultados:

Los resultados del experimento se muestran en la figura 10A. Esta figura muestra análisis del número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron a partir del canal #1 (células T de control en HUVEC sin estimular como “control neg.”), el canal #2 (células T de control en HUVEC estimuladas como “control

3®

pos.”), el canal #3 (“GDF-15”), el canal #4 (“UACC257”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 que contienen GDF-15 secretado) y el canal #5 (“UACC257 anti-hGDF-15”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 agotadas de GDF-15 secretado con anticuerpo anti-GDF-15 B1-23)

En comparación con las células T que se hicieron fluir a lo largo de HUVEC sin estimular (“control neg.”; mediana=28 células rodantes por campo de visión por segundo), hacer fluir células T a lo largo de HUVEC estimuladas (“control pos.”) aumentó el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=46). El tratamiento de las células T con hGDF-15 disminuye sustancialmente el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=29). Además, la incubación previa de las células T con sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que secreta GDF-15 disminuye sustancialmente el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=36) en comparación con las células T que se hacen fluir a lo largo de HUVEC estimuladas (“control pos.”). Por el contrario, la incubación previa de las células T con sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 agotada de GDF-15 secretado con anticuerpo anti-GDF-15 B1-23 dio como resultado números de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=45) que eran comparables a las células T que se hacen fluir a lo largo de HUVEc estimuladas (“control pos.”).

Por tanto, según la invención, pueden usarse inhibidores de hGDF-15 para aumentar la adhesión de células T, incluyendo células CD8+, a células endoteliales, por ejemplo en el tratamiento de cánceres sólidos.

Además, el ensayo anterior proporciona un sistema in vitro sencillo que puede usarse para determinar si una sustancia de interés es un inhibidor de hGDF-15.

Sumario:

Este ejemplo muestra que GDF-15, incluyendo GDF-15 secretado por células tumorales, disminuye la adhesión de células T a células endoteliales. Por tanto, según la invención, puede usarse un tratamiento con inhibidores de hGDF-15 para aumentar la adhesión de células T, incluyendo células T CD8+, a células endoteliales. Tal tratamiento aumentará la entrada de células T, incluyendo células T CD8+, desde el torrente circulatorio a los cánceres sólidos. El porcentaje aumentado de células T CD8+ en cánceres sólidos, que será el resultado de tal tratamiento con inhibidores de hGDF-15, es ventajoso para, y puede usarse en, la terapia contra el cáncer, por ejemplo inmunoterapia contra el cáncer. Puesto que la entrada de células T CD8+ en los cánceres sólidos y la presencia de estas células T CD8+ en los cánceres sólidos son particularmente ventajosas para enfoques terapéuticos que usan bloqueadores de puntos de control inmunitario, un uso particularmente ventajoso de inhibidores de hGDF-15 según la invención es su uso en combinación con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Ensayo de flujo-adhesión que incluye la neutralización de anticuerpos mediante los anticuerpos H1L5 (B1-23 humanizado) y 01G06 y 03G05 (anticuerpos anti-GDF-15 humanizados diseñados por ingeniería según las secuencias según el documento WO 2014/100689)

Este experimento se realizó con el fin de confirmar adicionalmente los efectos observados anteriormente, incluyendo el hallazgo de que pueden usarse inhibidores de hGDF-15 para aumentar la adhesión de células T a células endoteliales o el rodamiento de células T.

Procedimientos experimentales:

El ensayo de flujo/adhesión se llevó a cabo tal como se describió anteriormente en el presente ejemplo. Se incubaron previamente células T con 100 ng/ml de GDF-15 durante 1 hora o con 100 ng/ml de GDF-15, que se incubó previamente con 10 |ig/ml de anticuerpo durante 1 hora. Se usaron los siguientes anticuerpos anti-GDF-15: H1L5 (B1-23 humanizado), 01G06 y 03G05 (anticuerpos anti-GDF-15 humanizados diseñados por ingeniería según las secuencias según el documento WO 2014/100689).

Resultados:

Los resultados se muestran en la figura 10B. En comparación con las células T que se hicieron fluir a lo largo de HUVEC sin estimular (control negativo), hacer fluir células T a lo largo de HUVEC estimuladas (control positivo) aumentó el número de células rodantes por campo de visión por 20 segundos. El tratamiento de las células T con hGDF-15 disminuyó sustancialmente el número de células rodantes por campo de visión por 20 segundos. Por el contrario, la incubación previa de las células T con hGDF-15, que se incubó previamente con los anticuerpos anti-GDF-15 H1L5 (B1-23 humanizado), 01G06 o 03G05, dio como resultado números de células rodantes por campo de visión por 20 segundos que estaban sustancialmente aumentados en comparación con la muestra en la que no se añadió anticuerpo anti-GDF-15. Este efecto estaba presente para todos los anticuerpos anti-GDF-15 sometidos a prueba y era más pronunciado para el anticuerpo H1L5 (B1-23 humanizado), que revirtió casi por completo el efecto de hGDF-15 sobre el rodamiento de las células T.

Conclusiones

Por tanto, según la invención, pueden usarse inhibidores de hGDF-15 para aumentar la adhesión de células T, incluyendo células CD8+, a células endoteliales, o el rodamiento de dichas células T, incluyendo células CD8+. Según la invención, los inhibidores de hGDF-15 aumentarán el porcentaje de células CD8+ en cánceres sólidos y pueden usarse para el tratamiento de estos cánceres. Estos inhibidores de hGDF-15 pueden ser, pero no se limitan a, cualquier anticuerpo anti-GDF-15 conocido tal como los anticuerpos H1L5 (B1-23 humanizado), 01G06 y 03G05.

Ejemplo 4: Evaluación de la eficacia antitumoral de anticuerpo de prueba en combinación con inmunización con adyuvante en ratones singénicos que portan tumores MC38tg hGDF-15+.

Con el fin de evaluar si la inhibición del factor de crecimiento y diferenciación (GDF)-15 humano puede mejorar la respuesta a una inmunoterapia, y en particular una respuesta a una inmunoterapia que requiere células T CD8+ en el tumor, se transfectaron células cancerosas de colon MC38 murinas para expresar GDF-15 humano a niveles similares a los hallados en líneas celulares cancerosas humanas. Tal como se evalúa mediante el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA , R&D Systems, Mouse GDF-15 DuoSet ELISA), las células MC38 no expresaron niveles detectables de GDF-15 murino (límite de detección: 7,81 pg/ml).

El día 0, se anestesiaron ratones C57BL/6J hembra de 9 semanas de edad (proporcionados por Charles River Laboratories, BP 0109, F 69592 L'Arbresle, Cedex) y se les inoculó por vía subcutánea 2x105 de células MC38tg hGDF_ 15 de colon. Se inició el tratamiento con anticuerpo anti-GDF-15 (20 mg/kg de peso corporal, es decir aproximadamente 400 |ig por ratón en 100 |il de solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina al 0,5%) el día 0 (aproximadamente 6 h después de la inoculación de células tumorales) y se repitió los días 3, 7, 10, 14, 17 y 21. El día 13, cuando los tumores habían alcanzado un volumen de entre 100 y 150 mm3, se aleatorizaron los animales en los diferentes grupos de tratamiento, y a los animales respectivos se les inyectó por vía intraperitoneal adyuvante (100 |ig de ácido poliinosínico:policitidílico (poli-ICLC (Hiltonol®, Oncovir, Washington D.C., EE .U U .)) y 50 |ig de anticuerpo anti-CD40 murino(m) InVivoMAb (clon FGK4.5/FGK45)) en un volumen total de 50 |il de solución salina tamponada con fosfato.

Debido a su similitud estructural con el ARN bicatenario, que está presente en algunos virus y estimula TLR3, el poli-ICLC simula una infección. El anticuerpo anti-CD40 agonista proporciona una señal adicional a las células presentadoras de antígeno. La “autorización” de células dendríticas a través de la estimulación de CD40 respalda la activación de células T CD8+ específicas de antígeno. Por tanto, el tratamiento con adyuvante sirve para inducir células inmunitarias específicas de tumor en ratones mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos (Yadav M et al., Nature. 27 de noviembre de 2014;515(7528):572-6).

Por tanto, este tratamiento con adyuvante representa un sistema de modelo para una inmunoterapia contra el cáncer que requiere células inmunitarias en el tumor, y en particular células T CD8+ en el tumor. Por tanto, es un sistema de modelo que es adecuado para confirmar adicionalmente que un tratamiento con un inhibidor de hGDF-15 tal como un anticuerpo anti-hGDF-15 sinergiza con la inmunoterapia contra el cáncer, incluyendo una inmunoterapia contra el cáncer que requiere células T CD8+ en el tumor.

Para resumir, se investigaron los siguientes grupos de animales (10 ratones por grupo):

^ grupo de vehículo sin inmunización con adyuvante

^ grupo tratado con anticuerpo anti-hGDF-15 B1-23 sin inmunización con adyuvante

^ grupo de vehículo con inmunización con adyuvante

^ grupo tratado con anticuerpo anti-hGDF-15 B1-23 con inmunización con adyuvante

Se midió el tamaño tumoral 3 veces a la semana mediante una medición basada en compás calibrador de la longitud y la anchura del tumor.

Se sacrificaron los ratones una vez que su volumen tumoral superó los 2.000 mm3 tal como se calcula mediante la fórmula V=longitud * anchura2/2. Del mismo modo, se sacrificaron los ratones cuando se halló que su estado se deterioró más allá de los límites habitualmente aceptados para el bienestar animal (adelgazamiento > 15%, pérdida de movilidad, comportamiento abatido, mal estado del pelaje).

Para los ratones supervivientes, se determinó la presencia de tumores mediante examen físico hasta el día 57 posterior a la inoculación del tumor. Los resultados se muestran en la figura 11.

En un estudio previo realizado por los inventores, se había demostrado que puede usarse ventajosamente un tratamiento con un anticuerpo anti-GDF-15 solo para tratar el cáncer pero no erradicó por completo los tumores, es decir no curó el cáncer. De manera similar, en la figura 11, ni los ratones tratados con vehículo ni los ratones que se trataron con anticuerpo anti-hGDF-15 solo se curaron. El tratamiento con el adyuvante (es decir con poli-ICLC y el anticuerpo anti-CD40) curó a 3 de 10 ratones. En particular, cuando el tratamiento con el adyuvante se combinó con el tratamiento con el anticuerpo anti-hGDF-15, se curaron 8 de 10 ratones. Por tanto, el tratamiento con el anticuerpo anti-hGDF-15 sinergizó fuertemente con el tratamiento con el adyuvante.

Conclusiones:

Los resultados obtenidos en este sistema de modelo confirman adicionalmente que los inhibidores de hGDF-15 sinergizan con la inmunoterapia contra el cáncer, y en particular con la inmunoterapia contra el cáncer que requiere la activación de células inmunitarias tales como células T CD8+ que luego ejercen la actividad citotóxica en el tejido tumoral. Los resultados también confirman adicionalmente que el aumento en el porcentaje de células T CD8+ en el cáncer, que está provocado por los usos de inhibidores de hGDF-15 según la invención, puede usarse ventajosamente en la terapia contra el cáncer.

En las condiciones experimentales elegidas, el sistema de modelo inmunitario murino tiene muy poco tiempo para desarrollar una respuesta de células T CD8+ específicas de antígeno contra un cáncer de crecimiento rápido. Por tanto, se usó un adyuvante para respaldar adicionalmente la respuesta inmunitaria espontánea en el sistema murino. En cambio, en pacientes humanos en los que los cánceres se desarrollan a lo largo de un periodo de tiempo más prolongado (por ejemplo varios años), las células T específicas de antígeno dirigidas contra antígenos cancerosos normalmente ya están presentes en el diagnóstico, es decir la sensibilización de una respuesta inmunitaria se produce habitualmente incluso antes de diagnosticar el cáncer. Estas células T CD8+ específicas de antígeno canceroso ya existen en humanos pero en mucha menor medida en el sistema de modelo murino. Por tanto, según la invención, los usos de inhibidores de hGDF-15 según la invención serán incluso más eficaces en humanos que en el presente sistema de modelo murino. Por consiguiente, los inhibidores de hGDF-15 pueden usarse eficazmente para el tratamiento de pacientes humanos con cáncer según la invención, por ejemplo para aumentar el porcentaje de células T CD8+ en un cáncer sólido, y sinergizarán con otras inmunoterapias contra el cáncer en humanos, y en particular con inmunoterapias contra el cáncer que requieren células T CD8+ en el cáncer, incluyendo inmunoterapias contra el cáncer con bloqueadores de puntos de control inmunitario tales como los anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1.

Ejemplo 5: Los niveles séricos de GDF-15 definen la supervivencia de pacientes con melanoma tratados con anticuerpo anti-PD-1

El estudio en este ejemplo se realizó con el fin de validar adicionalmente los resultados obtenidos en el estudio del ejemplo 1, por ejemplo el hallazgo de que hGDF-15 influye en la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario, mediante un estudio independiente adicional.

Se usaron los siguientes términos en conexión con este estudio:

“Censurado” = El paciente fue retirado de la cohorte de estudio cuando no había disponibles datos de seguimiento adicionales.

“Acontecimiento” = El paciente había muerto.

“Supervivencia” = El paciente estaba vivo en el seguimiento.

Los pacientes del Departamento de Dermatología, Universidad de Tubinga, Alemania, con melanoma histológicamente confirmado, se identificaron en la base de datos del Registro Central de Melanoma Maligno (CMMR) que registra de manera prospectiva a pacientes de más de 60 centros dermatológicos en Alemania. Se seleccionaron 99 pacientes, con (a) muestras de suero archivadas, (b) datos de seguimiento disponibles, (c) antecedentes o presencia de metástasis locorregional o distante en el punto de tiempo de extracción de sangre y (d) tratamiento experimental con anticuerpo anti-PD-1. Los objetivos y los métodos de recogida de datos por el ^c M^m R se han publicado previamente en detalle (Lasitiotakis, KG et al., Cancer / 107 / 1331-9. 2006). Los datos obtenidos para cada paciente incluían la edad, el sexo, la fecha del último seguimiento y la fecha y causa de la muerte, cuando fuera aplicable. Todos los pacientes habían dado el consentimiento informado por escrito para que el registro CMMR registrara sus datos clínicos. El comité de ética institucional de Tubinga ha aprobado el estudio (voto ético 125/2015BO2). Los pacientes idóneos tenían 18 años o más y tenían melanoma de estadio III o de estadio IV no resecable confirmado de manera histológica o citológica no susceptible a terapia local y mostraban evolución de la enfermedad a pesar de haber recibido terapias previas según las pautas actuales. Los pacientes con tumores mutantes BRAFV600 había recibido el tratamiento de primera línea recomendado o uno experimental que incluía terapia con inhibidores de BRAF o MEK, o ambos. Se consideró que el tratamiento previo con ipilimumab, si fuera aplicable, había fracasado cuando los pacientes habían recibido un mínimo de dos dosis, 3 mg/kg una vez cada 3 semanas, pero mostraron evolución de la enfermedad confirmada en el plazo de 24 semanas de la última dosis de ipilimumab. Antes de la administración de anticuerpo anti-PD-1, se demandó resolución o mejora de los acontecimientos adversos relacionados con el ipilimumab hasta grado 0-1 y una dosis de prednisona de 10 mg/día o menos durante al menos 2 semanas antes de la primera dosis del fármaco de estudio. Los pacientes idóneos tenían un estado de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa Oriental (ECO G) de 0 ó 1; enfermedad medible por criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (R EC IS T v1.1); y valores dentro del intervalo preespecificado para recuento absoluto de neutrófilos (>1500 células por ml), plaquetas (>100.000 células por ml), hemoglobina (>90 g/l), creatinina sérica (<15 límite superior de la normalidad [ULN]), bilirrubina sérica total (<15 ULN o bilirrubina directa <ULN para pacientes con concentraciones de bilirrubina total >1,5 ULN), aspartato y alanina aminotransferasas (<25 ULN o <5 ULN para pacientes con metástasis hepáticas), razón normalizada internacional o tiempo de protrombina (<15 ULN si no se usan anticoagulantes) y tiempo de tromboplastina parcial activada (<15 ULN si no se usan anticoagulantes). Los pacientes tuvieron un periodo de reposo farmacológico de al menos 4 semanas entre la última dosis de la terapia más reciente y la primera dosis de pembrolizumab o nivolumab. Análisis de los niveles séricos de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se midieron los niveles séricos de GDF-15 humano mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Tampones y reactivos:

Disolución de bloqueo tamponada: BSA al 1% (fracción V pH 7,0, PAA, Pasching, Austria) en PBS

Disolución de lavado: PBS-Tween (0,05%)

Patrón: GDF-15 humano (concentración de reserva de 120 |ig/ml, de R&D Systems)

Anticuerpo de captura: AcM anti-GDF-15 humano (clon 147627) de R&D Systems, IgG2B de ratón (n.° de catálogo MAB957, de R&D Systems, concentración de reserva de 360 |ig/ml)

Anticuerpo de detección: AcP purificado por afinidad biotinilado anti-GDF-15 humano, IgG de cabra (n.° de catálogo BAF940, de R&D Systems, concentración de reserva de 9 |il/ml)

Estreptavidina-HRP (n.° de catálogo DY998, de R&D Systems)

Disolución de sustrato: 10 ml de NaOAc 0,1 M pH 6,0 100 |il de TMB 2 |il de H2O2

Disolución de parada: H2SO41 M

Procedimiento de análisis:

1. Preparación de placa:

e. Se diluyó el anticuerpo de captura hasta la concentración de trabajo de 2 |ig/ml en PBS. Se recubrió inmediatamente una microplaca de 96 pocillos (Nunc maxisorp®) con 50 |il por pocillo del anticuerpo de captura diluido excluyendo las filas exteriores (A y H). Se llenaron las filas A y H con tampón para prevenir la evaporación de las muestras durante el experimento. Se golpeó suavemente la placa para garantizar que la parte inferior de cada pocillo se cubrió completamente. Se colocó la placa en una cámara húmeda y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (TA).

f. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

g. Se añadieron 150 |il de disolución de bloqueo a cada pocillo, seguido de incubación a TA durante 1 hora. h. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

2. Procedimiento de ensayo:

d. Se prepararon patrones. Se diluyó GDF-15 en disolución de bloqueo tamponada hasta una concentración final de 1 ng/ml (4,17 |il de GDF 496 |il de disolución de bloqueo tamponada). Se realizaron diluciones en serie de 1:2.

e. Se prepararon muestras duplicadas 1:20 (6 |il 114 |il de disolución de bloqueo tamponada).

f. Se añadieron 50 |il de muestras o patrones diluidos por pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

D E F G

H

i. Se aspiró cada pocilio y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

j. Se diluyó el anticuerpo de detección hasta una concentración final de 50 ng/ml (56 |il 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 |il del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

k. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

^l. Se diluyó estreptavidina-HRP 1:200 (50 |il 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 |il de la dilución de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA. m. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05%).

n. Se preparó la disolución de sustrato. Se añadieron 50 |il de disolución de sustrato a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

o. Se añadieron 50 |il de disolución de parada a cada pocillo.

p. Se determinó la densidad óptica de cada pocillo inmediatamente usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm.

3. Cálculo del título sérico de GDF-15:

d. Se aplicó cada dilución de muestra/patrón de GDF-15 por duplicado. Para determinar el título de GDF-15, se calculó el promedio de los duplicados y se restó el fondo (muestra sin GDF-15).

e. Para crear una curva de calibración, se representaron gráficamente los valores del intervalo lineal en un diagrama X-Y (eje X: concentración de GDF-15, eje Y: DO450), y se aplicó un ajuste de curva lineal. Se calculó el título sérico de GDF-15 de las muestras de prueba interpolando a partir de los valores de DO450 de las diluciones de patrón con concentración conocida.

f. Para calcular la concentración de GDF-15 final de las muestras, se consideró el factor de dilución distinto. Se analizaron de nuevo las muestras que dieron lugar a valores de DO por debajo o por encima del intervalo patrón a las diluciones apropiadas.

Comparación de niveles séricos de hGDF-15 con datos de pacientes:

A continuación, se compararon los niveles séricos de hGDF-15 medidos con datos de respuesta de los pacientes obtenidos a partir del estudio.

Correlación estadística de niveles séricos de hGDF-15 con datos de pacientes:

Datos:

El análisis de datos se basó en un archivo de datos que contiene datos de muestras de 99 pacientes que contiene las columnas (variables) de designación de muestra, GDF-15 (ng/ml), días (hasta la muerte o censura) y en curso (una variable de índice para la vida en curso).

Variables de desenlace (criterios de valoración):

a. Supervivencia global (tiempo hasta la muerte). Este criterio de valoración se compone del indicador de acontecimiento para la muerte (1 = muerto/0 = vivo), que se derivó del archivo de datos, y el tiempo hasta la muerte o censura (último momento en que se sabe que el paciente estaba vivo), correspondiente a la variable “días”.

Respuesta al tratamiento, por ejemplo si un paciente era un sujeto que responde o no (codificado como 1=r).

Análisis de datos:

Se definió el tiempo de seguimiento para el análisis de supervivencia a partir de la fecha de extracción de sangre hasta el último seguimiento (es decir la última información obtenida del paciente) o la muerte. Todas las muestras de sangre se extrajeron en el plazo de días antes del tratamiento con el anticuerpo anti-PD1. Para el análisis de OS, los pacientes que estaba vivos en el último seguimiento fueron censurados, mientras que los pacientes que había muerto se consideraron como “acontecimiento”. Se calcularon las probabilidades de supervivencia acumuladas según Kaplan-Meier junto con intervalos de confianza (IC) del 95% y se compararon usando parámetros estadísticos de la prueba de rangos logarítmicos bilateral. Se calcularon los valores de p para la supervivencia global mediante parámetros estadísticos de la prueba de rangos logarítmicos bilateral. Se ajustó un modelo con una variable de agrupación basada en GDF-15 como predictor categórico (los grupos eran: <1,5 ng/ml (n=62), >1,5 ng/ml (n=37) o GDF-15bajo (n=49), GDF-15alto (n=50), basados en una división por la mediana). Las curvas de Kaplan-Meier resultantes se muestran en las figuras 12 y 13 en las que la censura se indica mediante líneas verticales. Además, las siguientes tablas contienen un sumario de los casos (tabla 9), datos de supervivencia de los pacientes para grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y >1,5 ng/ml (tablas 10 y 11) y comparaciones estadísticas totales de grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y >1,5 ng/ml (tabla 12).

Tabla 9: Sumario de los casos

*H = libre de acontecimientos

Tabla 10: Media y mediana para la supervivencia (número de días de supervivencia)

a. Después de la censura, la estimación se limita a la mayor supervivencia conocida.

n/d: No pudieron calcularse datos de mediana de supervivencia debido a la presencia de >50% de supervivientes en el grupo.

Tabla 11: Media y mediana para la duración de supervivencia (número de días de supervivencia)

a. Después de la censura, la estimación se limita a la mayor supervivencia conocida.

n/d: No pudieron calcularse datos de mediana de supervivencia debido a la presencia de >50% de supervivientes en el grupo.

Tabla 12: Comparaciones totales

*df = grados de libertad

Prueba de distribución equitativa de supervivencia para diferentes niveles de GDF-15 (<1,5 ng/ml, >1,5 ng/ml) Resultados y conclusiones:

Los resultados estadísticos anteriores de este ejemplo confirmaron adicionalmente los resultados del ejemplo 1. Por ejemplo, se confirmó que la probabilidad de una respuesta al tratamiento, tal como se indica por la supervivencia de los pacientes, disminuye significativamente al aumentar los niveles de hGDF-15 en los sueros de pacientes. Por ejemplo, la tabla 12 muestra que la supervivencia entre los dos grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y >1,5 ng/ml, respectivamente, era significativamente diferente, tal como se evidencia por un nivel de significación de 0,004. De manera similar, la tabla 9 demuestra que un mayor porcentaje de pacientes (82,3%) sobrevivieron en el grupo que tiene niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml, y las tablas 10 y 11 y las figuras 12 y 13 demuestran que para los pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml, los tiempos de supervivencia eran notablemente más largos que en pacientes que tienen niveles de GDF-15 de >1,5 ng/ml.

Por tanto, los resultados de este ejemplo confirman adicionalmente que hGDF-15 actúa para afectar negativamente a las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, un inhibidor de hGDF-15 sería útil para inhibir los efectos negativos de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y para mejorar las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario no sólo en melanoma, sino en todos los cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Ejemplo 6: En pacientes humanos con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tratados con un anticuerpo anti-PD1, la mediana de niveles séricos de hGDF-15 en pacientes con enfermedad progresiva es mayor que en pacientes que muestran una respuesta parcial.

Este ejemplo se realizó con el fin de validar adicionalmente los resultados obtenidos en el estudio del ejemplo 1, por ejemplo el hallazgo de que hGDF-15 incluye en la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario, en un estudio independiente adicional en un cáncer sólido diferente.

Pacientes:

Los pacientes con NSCLC se trataron con anticuerpos anti-PD1 según la ficha técnica de fármaco aprobado de los anticuerpos anti-PD1. Los pacientes incluían pacientes que se trataron previamente con otras terapias contra el cáncer. Debido al hecho de que rara vez se observa una respuesta completa en pacientes con NSCLC, el grupo de pacientes incluía pacientes que muestran enfermedad progresiva y que muestran una respuesta parcial tras el tratamiento con p D-1, pero no pacientes que muestran una respuesta completa tras el tratamiento con PD-1.

Muestras de suero:

Las muestras de suero se extrajeron de los pacientes antes del tratamiento con los anticuerpos anti-PD1.

Análisis de los niveles séricos de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se analizaron los niveles séricos de hGDF-15 en las muestras de suero mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), tal como se describe en el ejemplo 1.

Resultados:

Se obtuvieron los niveles séricos de hGDF-15 de 5 pacientes que muestran una respuesta parcial tras el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 y de 5 pacientes que muestran enfermedad progresiva tras el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1. En particular, la mediana del nivel sérico de hGDF-15 en los pacientes que muestran una respuesta parcial era de 0,55 ng/ml, mientras que la mediana del nivel sérico de hGDF-15 en los pacientes que muestran enfermedad progresiva era de 1,56 ng/ml. Por tanto, la mediana del nivel sérico de hGDF-15 en los pacientes que muestran enfermedad progresiva era aproximadamente 2,8 veces mayor que en los pacientes que muestran una respuesta parcial.

Conclusiones:

Los resultados de este ejemplo confirman adicionalmente que los niveles de hGDF-15 se correlacionan negativamente con la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario. Los resultados de este ejemplo también confirman adicionalmente que hGDF-15 actúa para afectar negativamente a las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario tales como PD-1. Por tanto, según la invención, un inhibidor de hGDF-15 será útil para inhibir los efectos negativos de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y para mejorar las respuestas de los pacientes al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario no sólo en melanoma, sino también en cánceres de pulmón tales como NSCLC y en todos los demás cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Ejemplo 7: Los niveles séricos de hGDF-15 no se correlacionan significativamente con la carga mutacional de los tumores

La carga mutacional es un factor de pronóstico positivo conocido para una respuesta de pacientes con cáncer a bloqueadores de puntos de control inmunitario. Generalmente, las células cancerosas albergan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos de las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Una alta carga mutacional conduce a un número elevado de tales antígenos específicos de células cancerosas. En cánceres que albergan tal número elevado de antígenos específicos de células cancerosas, se considera que la estimulación de la respuesta inmunitaria mediante bloqueadores de puntos de control inmunitario es particularmente eficaz, porque hay disponibles más antígenos específicos de células cancerosas como antígenos diana para la respuesta inmunitaria.

Con el fin de confirmar adicionalmente que hGDF-15 no es simplemente un marcador sustituto para la carga mutacional de los tumores y con el fin de confirmar adicionalmente que un tratamiento con inhibidores de hGDF-15 actúa a través de un mecanismo que es independiente de la carga mutacional de los tumores, se representaron gráficamente los niveles de ARNm de hGDF-15 en muestras de cáncer de pacientes con cáncer frente al número de mutaciones somáticas que se identificaron en los cánceres. Las mutaciones somáticas se determinaron mediante el uso de secuenciación de exomas. Los datos se analizaron usando la herramienta web UZH del Hospital Universitario de Zúrich (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). Los resultados se muestran en la figura 14. La figura 14A muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer obtenidos del Atlas del Genoma del Cáncer (TGCA) considerando sólo pacientes con melanoma maligno de alto grado (el Atlas del Genoma del Cáncer se describe en la referencia de Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). Se evaluó la expresión de GDF-15 mediante normalización usando el paquete de software RSEM (“Secuenciación de ARN mediante maximización de expectativas”) (Li B y Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 4 de agosto de 2011;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). La figura 14B muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer de 40 pacientes con melanoma maligno metastásico adicional del Hospital Universitario de Zúrich, que se analizaron por separado.

En particular, ambas de las figuras 14A y 14B muestran un valor de p de 0,5, lo que indica que no hay ninguna correlación significativa entre la carga mutacional en los cánceres y los niveles de hGDF-15. Estos resultados confirman adicionalmente que hGDF-15 no es simplemente un marcador sustituto para la carga mutacional de los tumores y que un tratamiento con inhibidores de hGDF-15 actúa a través de un mecanismo que es independiente de la carga mutacional de los tumores.

Ejemplo 8: Infiltración de células T CD8+ en tumores de tipo natural o tumores que (sobre)expresan GDF-15 humano

En un estudio piloto usando células cancerosas de colon MC38 o bien de tipo natural o bien que (sobre)expresan GDF-15 humano implantadas en el flanco derecho de ratones C57BL/6 singénicos inmunocompetentes, la sobreexpresión de GDF-15 se asoció con una infiltración reducida de células inmunitarias. En la figura 15 se muestran imágenes de inmunocitoquímica para CD8a en ratones sacrificados después de 29 días que albergaban tumores de tipo natural o tumores que sobreexpresan hGDF-15 transgénico (tg). Tal como puede observarse a partir de la figura, los tumores de tipo natural contenían más células positivas para CD8a que los tumores que sobreexpresan hGDF-15 transgénico (tg).

Estos resultados respaldan adicionalmente el hallazgo de que, según la presente invención, hGDF-15 disminuye el porcentaje de células T CD8+ en cánceres sólidos, y que por el contrario, pueden usarse inhibidores de hGDF-15 tales como anticuerpos anti-GDF-15 para aumentar el porcentaje de células T CD8+ en un cáncer sólido en un paciente humano.

Aplicabilidad industrial

Las combinaciones de inhibidores, las composiciones y los kits según la presente invención pueden fabricarse a nivel industrial y comercializarse como productos para los métodos y usos reivindicados (por ejemplo, para tratar un cáncer tal como se define en el presente documento), según normas conocidas para la fabricación de productos farmacéuticos. Por consiguiente, la presente invención es aplicable a nivel industrial.

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Documento WO 2014/100689

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i . Inhibidor de hGDF-15 para su uso en un método para la inmunoterapia contra el cáncer, siendo el método un método para tratar un cáncer sólido en combinación con un bloqueador de puntos de control inmunitario en un paciente humano, en el que el inhibidor de hGDF-15 debe administrarse al paciente humano, en el que el inhibidor de hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, y en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario se selecciona de uno o más del siguiente grupo que consiste en:

   i) un inhibidor de PD-1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana, o una porción de unión a PD-1 humana del mismo; y

   ii) un inhibidor de PD-L1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana, o una porción de unión a PD-L1 humana del mismo.
2. 2. Inhibidor de hGDF-15 para su uso según la reivindicación 1, en el que el paciente es un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,2 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, en el que el paciente es preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,5 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15, y en el que el paciente es más preferiblemente un paciente que tiene un nivel sérico de hGDF-15 de al menos 1,8 ng/ml antes del inicio de la administración del inhibidor de hGDF-15;

   y/o en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas, en el que el cáncer se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de cuello uterino, y en el que el cáncer se selecciona más preferiblemente del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y cáncer de estómago;

   y/o en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, carcinoma oral de células escamosas, cáncer colorrectal y cáncer de próstata.
3. 3. Inhibidor de hGDF-15 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

   en el que el inhibidor es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, en el que

   (i) la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15, y en el que el epítopo conformacional o discontinuo está compuesto por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y ^s E ^q ID NO:26, y/o en el que

   (ii) el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y en el que el anticuerpo o la porción de unión a hGDF-15 del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos Ser-Ala-Ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
4. 4. Inhibidor de hGDF-15 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

   en el que el método es un método para el tratamiento de metástasis de cáncer, y/o

   en el que el inhibidor de hGDF-15 aumenta el porcentaje de células T CD8+ en el cáncer al aumentar la adhesión de células T CD8+ a células endoteliales y aumentar de ese modo la entrada de las células T CD8+ desde el torrente circulatorio al cáncer.
5. 5. Composición que comprende un inhibidor de hGDF-15 y un bloqueador de puntos de control inmunitario, en la que el inhibidor de hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, y en la que el bloqueador de puntos de control inmunitario se selecciona de uno o más del siguiente grupo que consiste en:

   i) un inhibidor de PD-1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana, o una porción de unión a PD-1 humana del mismo; y

   ii) un inhibidor de PD-L1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana, o una porción de unión a PD-L1 humana del mismo.
6. 6. Composición según la reivindicación 5, para su uso en medicina.
7. 7. Kit que comprende un inhibidor de hGDF-15 y al menos un bloqueador de puntos de control inmunitario, en el que el inhibidor de hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo, y en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario se selecciona de uno o más del siguiente grupo que consiste en:

   i) un inhibidor de PD-1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana, o una porción de unión a PD-1 humana del mismo; y

   ii) un inhibidor de PD-L1 humana, siendo el inhibidor un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana, o una porción de unión a PD-L1 humana del mismo.
8. 8. Kit según la reivindicación 7, en el que el inhibidor de hGDF-15 y uno o más o la totalidad de los bloqueadores de puntos de control inmunitario están contenidos en recipientes independientes o en un único recipiente.
9. 9. Composición para su uso en medicina según la reivindicación 6, o kit según la reivindicación 7 u 8, para su uso en un método para tratar un cáncer sólido, en el que el método es preferiblemente un método para la inmunoterapia contra el cáncer y en el que el cáncer es preferiblemente tal como se define en la reivindicación 2.
10. 10. Inhibidor de hGDF-15 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el uso es un uso en combinación con ácido poliinosínico:policitidílico, en el que la combinación es una combinación con ácido poliinosínico:policitidílico.
11. 11. Inhibidor de hGDF-15 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 10, en el que el uso es un uso en combinación con un anticuerpo anti-CD40 humana inmunoestimulador, preferiblemente un anticuerpo anti-CD40 humana monoclonal inmunoestimulador.
12. 12. Producto de combinación que comprende un inhibidor de hGDF-15 y uno cualquiera de los siguientes: a) ácido poliinosínico:policitidílico;

    b) un anticuerpo anti-CD40 humana inmunoestimulador, preferiblemente un anticuerpo anti-CD40 humana monoclonal inmunoestimulador; o

    c) ácido poliinosínico:policitidílico y un anticuerpo anti-CD40 humana inmunoestimulador, preferiblemente un anticuerpo anti-CD40 humana monoclonal inmunoestimulador,

    para su uso en un método para tratar un cáncer sólido en un paciente humano, en el que la combinación comprende opcionalmente un bloqueador de puntos de control inmunitario, y en el que el inhibidor es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a hGDF-15 del mismo.