CN112778419A - 抗ck-mb的抗体或其抗原结合部分及其应用 - Google Patents

抗ck-mb的抗体或其抗原结合部分及其应用 Download PDF

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段念
姬成东
张丽华
蔡方琴
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了抗CK‑MB的抗体或其抗原结合部分及其应用，公开了特异性识别的CK‑MB且性能稳定的序列，能够抵抗与其结构类似的CK‑BB和CK‑MM的干扰，将其应用到CK‑MB的检测中，能够实现对CK‑MB的高特异性、低成本的检测。

Description

抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分及其应用。
背景技术
肌酸激酶同工酶(CK-MB)主要存在于心肌，在诊断急性心肌梗死上是一种很有效的指标。肌酸激酶同工酶主要存在三种结构近似的亚型，肌型CK-MM、心型CK-MB和脑型CKBB。三种亚型由B亚基与M亚基两种序列相似度85％的亚基组成。而CK-MB只有在心肌细胞受到损伤的情况下才会出现在血液中，相较于CK-MM含量更低，约占血清总肌酸激酶同工酶的1％-3％，因此在临床检测上，类似结构的亚基会对检测结果产生较大的影响。例如，目前临床上最普遍采用免疫抑制法，就因为血清中存在巨CK、CK-BB、AK等影响试剂单克隆抗体与肌酸激酶中的M亚基结合，存在未被抑制的CK-M，M亚基同时与B亚基参加酶反应，而且因计算时结果乘以2，扩大了误差；为了解决众多干扰物存在的问题，近年来，磁微粒化学发光技术逐渐兴起，以双抗体夹心法为主，使抗人CK-MB抗体包被于磁微粒等固相载体，其标记物为酶标抗人CK-MB抗体，对CK-MB进行定量分析检测。该检测方法对抗原抗体反应具有较高的特异性和灵敏度，不受血清中巨CK及其他酶类等因素的影响，而实现其特异性检测的条件是高度特异性的CK-MB抗体，而目前国内研发高度特异性的CK-MB抗体仍然存在众多技术壁垒。
鉴于上述，本领域仍需要一种特异性高、抗CK-MM、CK-BB且价格低廉的CK-MB的单克隆抗体。
发明内容
本发明提供抗CK-MB的单克隆抗体，以解决现有检测中存在的检测灵敏度低的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，包括：
如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，命名为抗体A
或
如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，命名为抗体B。
或
如SEQ ID NO:13所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:14所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:15所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:16所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:17所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:18所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为抗体C。
优选地，所述的抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分为单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体的结合位点位于CK-MM和CK-BB结合区域之外，其识别CK-MB蛋白不受CK-MM、CK-BB的干扰。
另一方面，本发明还提供了包含上述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒采取所述抗体A、抗体B或抗体C中的两种以上同时识别CK-MB蛋白，测定CK-MB蛋白。
另一方面，本发明还包括一种结合物，包含与化学或生物标记共价连接的上述抗体A、B或C。
另一方面，本发明还包括一种偶联物，包含上述抗体A、B或C和/或上述结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
另一方面，本发明还包括上述抗体和/或上述结合物和/或上述偶联物在制备检测CK-MB表达的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开的抗体或抗原识别序列特异性高、抗CK-MM和CK-BB干扰且价格低廉的CK-MB。
附图说明
图1是利用免疫层析和化学发光两种不同方法学检测的相关性数据图；
图2是本发明免疫层析试剂盒抗干扰性实验图；
图3是本发明化学发光试剂盒抗干扰性实验图。
具体实施例
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
本发明提供抗CK-MB的单克隆抗体，以解决现有技术干扰物造成的误差以及成本较高的问题。
实施例1：重组蛋白人CK-MB的表达纯化
将人CK-MB基因序列克隆至pPICZα表达载体构建真核表达质粒，该表达质粒转化毕赤酵母GS115，使用存在浓度梯度的一组G418筛选出表达量最高的一株。进行摇瓶发酵并利用phenyl疏水层析和Q离子交换，获得高纯度CK-MB抗原蛋白。纯化的真核CK-MB抗原蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白条带大小正确，纯度达到90％以上后，可用于单抗的制备。
实施例2：小鼠免疫及抗体检测
将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠。按照每只小鼠注射40ug抗原蛋白，采用足垫或背部皮下途径注射蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化。再次按照每只小鼠注射40ug抗原，采用足垫或背部皮下途径注射蛋白。间隔两周继续免疫2次。在最后一次加强免疫两周后用生理盐水混合抗原蛋白，按照每只小鼠40ug剂量进行腹腔冲击。冲击4天以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。选取尾血效价表现优异的小鼠分离淋巴细胞用于细胞融合。每两周免疫一次并检测血清效价，监控免疫进程。筛选达到106的小鼠取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。
实施例3：细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆
筛选通过三个步骤筛选获得的杂交瘤：1)确认与CK-MB结合的能力；2)确认特异性。
1)为了筛选到高亲和力的抗人CK-MB抗体，采用结合人CK-MB蛋白进行阳性孔筛选。将人源CK-MB抗原包被于酶标板上，于4℃环境中过夜静置。将融合后细胞上清加入包被有CK-MB抗原的酶标板中进行检测，选取阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆。以此筛选出能分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2)特异性的评价：从1)中选择的克隆产生的抗体的特异性进行评价。用PBS调整为1μg/mL。将调整后的样品以100μL的份数添加到96孔板中。同时加入1ug/ml的CKBB、CKMM。用摇床摇动后的操作与上述1)相同。在众多克隆中，选择了与CKBB、CKMM相比显示出对骨髓瘤人CK-MB有强反应的3个克隆。
实施例4：单克隆抗体的生产纯化
使用6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500ul石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向腹腔内注入约1×106数量的目的杂交瘤细胞。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白G的亲和纯化得到目的抗体。
实施例5：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。
1、用包被液(0.05M pH＝9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。
2、用稀释液(1％BSA、0.1％PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、IgM-HRP、kappa-HRP、lamda-HRP)1:3000稀释。
3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，5分钟之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。
经过鉴定，三株抗体的重链均为IgG2，轻链为Kappa。用杂交瘤细胞提取制备mRNA，使用Takara公司的反转录酶PrimeScriptTM II Reverse Transcriptase结合针对特定亚型设计的引物进行反转录。最后采用标准的抗体可变区基因克隆引物进行抗体基因序列扩增。扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。
实施例6：抗体性能验证
(1)抗体A：
将抗体A放入37℃孵育箱中，分别在第7天(d)、第14天、第21天取样进行间接ELISA检测，以4℃保存抗体为参照，其中4℃分别保存7天、1年(y)、两年，5次冻融是指：从4℃取出后溶解，解冻溶解算1次，再放入4℃冻存，取出溶解算第2次，重复5次。
结果如表1所示。
结果表明，抗体A能在37℃条件下稳定保存，不会因为试剂盒打开，放置在室温条件下就影响到后续样本测量的效果，而在4℃条件下可以长期稳定保存，且冻融5次不会影响抗体的性质，可以适用于实际应用环境。
表1抗体A稳定性试验
Figure BDA0002927495360000061
(2)抗体B：
将抗体B放入37℃孵育箱中，分别在第7天、第14天、第21天取样进行捕获法ELSIA检测，以4℃保存抗体为参照，其中4℃分别保存7天、1年(y)、两年，5次冻融是指：从4℃取出后溶解，解冻溶解算1次，再放入4℃冻存，取出溶解算第2次，重复5次。
结果如表2所示，表明抗体B能在37℃条件下稳定保存，不会因为试剂盒打开，放置在室温条件下就影响到后续样本测量的效果，而在4℃条件下可以长期稳定保存，且冻融5次不会影响抗体的性质，可以适用于实际应用环境。
表2抗体B稳定性试验
Figure BDA0002927495360000071
(3)抗体C
将抗体C放入37℃孵育箱中，分别在第7天、第14天、第21天取样进行捕获法ELSIA检测，以4℃保存抗体为参照，其中4℃分别保存7天、1年(y)、两年，5次冻融是指：从4℃取出后溶解，解冻溶解算1次，再放入4℃冻存，取出溶解算第2次，重复5次。
结果如表3所示。
结果表明，抗体C能在37℃条件下稳定保存，不会因为试剂盒打开，放置在室温条件下就影响到后续样本测量的效果，而在4℃条件下可以长期稳定保存，且冻融5次不会影响抗体的性质，可以适用于实际应用环境。
表3抗体C稳定性试验
Figure BDA0002927495360000072
Figure BDA0002927495360000081
综上，表明本发明抗体A、B和C均性能良好，适合应用到试剂盒中，实现对人体内CK-MB的测量。
实施例7：相关性实验
化学发光试剂盒组分：
试剂R1：生物素标记的抗体A、100mmol/L TRIS缓冲液、0.1％叠氮钠；
试剂R2：碱性磷酸酶标记的抗体B、50mmol/L MES缓冲液、0.1％叠氮钠；
试剂M：链霉亲和素包被的磁微粒，100mmol/L PBS缓冲液，0.1％叠氮钠；
将各组分放入重庆中元汇吉生物技术有限公司的1800生化仪中进行测量，结果如下表。
免疫层析试剂盒：
塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件。将硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫依次粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物切成3.72mm宽度的试纸条。
其中硝酸纤维素膜上包含检测线、质控线和标记线。
检测线：将抗体C用10mmol/L pH＝7.2的PBS缓冲液稀释到0.5mg/mL的浓度，0.6μL/cm在离硝酸纤维素膜的右端合适处划线得到检测线。
质控线：将羊抗鸡IgG抗体按0.5mg/mL的浓度，0.6μL/cm的硝酸纤维素膜在NC膜右端合适处划质控线，该线与检测线平行，并有一定间隔。
标记线：将包被抗体B的荧光微球划线于硝酸纤维素膜左端合适处，包被量为0.6μL/cm，得到标记线，
利用重庆中元汇吉生物技术有限公司的Q7免疫分析仪进行测量，结果如下表所示。
结果表明，利用化学发光检测试剂盒与免疫层析试剂盒检测相同的样本，如表4和图1所示，其中R2＝0.99，证明不同的检测方法也存在极好的相关性，表明本发明的抗体适用于多种应用场合。
表4相关性实验
Figure BDA0002927495360000091
实施例8：抗干扰实验
免疫层析：
浓度为1mg/ml的重组CK-MB蛋白为对照样本，浓度为1mg/ml的重组CK-MB蛋白与浓度为1mg/ml的CK-MM和CK-BB混匀，制备干扰样本。用不含CK-MB的血清作为稀释液，分别配置浓度为：5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml对照样本和干扰样本。结果如图2和表5所示。
化学发光：
浓度为100ng/ml的重组CK-MB蛋白与浓度为1mg/ml的CK-MM和CK-BB混匀，制备干扰样本。用不含CK-MB的血清作为稀释液，分别配置浓度为：0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml对照样本和干扰样本。结果如图3和表6所示。
结果表明，添加干扰物质和不加干扰物质的结果相近。如图2和图3所示，不添加干扰物质的对照组和添加了干扰物质的干扰组的R2＝0.99，说明无论是利用抗体A和B制备的试剂盒还是抗体B和C制备的试剂盒都能够耐受CK-MM、CK-BB的干扰，具有较强的抗干扰能力，可以保证检测准确性。
表5免疫层析抗干扰实验
Figure BDA0002927495360000101
Figure BDA0002927495360000111
表6化学发光抗干扰实验
Figure BDA0002927495360000112
实施例9：假阳性实验
利用本发明的抗体B和抗体C制备的免疫层析试剂盒检测临床样本，结果如下表所示。
表7免疫层析假阳性实验
样本 阴性 阳性 总计
阴性 50 0 50
阳性 0 50 50
总计 50 50 100
表8化学发光假阳性实验
样本 阴性 阳性 总计
阴性 50 0 50
阳性 0 50 50
总计 50 50 100
实验结果表明，只要在含有CK-MB的样本中，无论含量高低，都能被检测，显示阳性检测结果，而在不含有CK-MB的样本中，不会出现错检，出现假阴性结果，利用免疫层析实现了准确且快速的检测。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分及其应用
<130> 2021/1/28
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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1 5

Claims (8)

1.抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB抗体或其抗原结合部分，命名为抗体A
或
如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为抗体B。
或
如SEQ ID NO:13所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:14所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:15所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:16所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:17所列的轻链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:18所列的轻链可变区CDR3；
上述抗CK-MB单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为抗体C。
2.如权利要求1所述的抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分为单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗CK-MB的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体的结合位点位于CK-MM和CK-BB结合区域之外。
4.一种CK-MB检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任意一项所述的抗体或其抗原结合部分。
5.如权利要求4所述的CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体A、抗体B或抗体C识别不同的抗原结合位点。
6.一种结合物，包含与化学或生物标记共价连接的权利要求1-3中任意一项所述抗体A、B或C。
7.一种偶联物，包含权利要求1-3中任意一项抗体A、B或C和/或上述结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
8.权利要求1-3中任意一项的抗体和/或权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物在制备检测CK-MB表达的产品中的应用。
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