CN108463246A - 使用人生长分化因子15(gdf-15)抑制剂和免疫检查点阻断剂的联合治疗 - Google Patents

使用人生长分化因子15(gdf-15)抑制剂和免疫检查点阻断剂的联合治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人生长分化因子15(GDF‑15)抑制剂的应用，以及这些抑制剂与免疫检查点阻断剂在治疗实体癌中的联合应用。

Description

使用人生长分化因子15(GDF-15)抑制剂和免疫检查点阻断剂 的联合治疗
技术领域
本发明涉及人生长分化因子15(GDF-15)抑制剂的应用，以及这些抑制剂与免疫检查点阻断剂在治疗实体癌中的联合应用。
背景技术
迄今为止，许多癌症仍是医疗需求尚未满足的领域，因此需要更有效地治疗癌症的手段。
现已知许多类型的癌症表达生长因子，包括诸如VEGF、PDGF、TGF-β和GDF-15的因子。
GDF-15，生长分化因子15，是TGF-β超家族的一个分支成员。它是一种在细胞内表达出蛋白质前体，随后被加工并且最终从细胞分泌到环境中的蛋白质。GDF-15的活化形式、完全加工(成熟)形式和前体均可在细胞外被发现。前体通过其COOH-末端的氨基酸序列共价结合于细胞外基质(Bauskin AR et al.,Cancer Research 2005)，因此其存在于细胞外部。GDF-15的活化形式、完全加工(成熟)形式是可溶性的，并且可在血清中被发现。因此，只要潜在的靶细胞表达可溶性GDF-15配体的受体，GDF-15的加工形式可潜在地作用于身体内与血液循环相连的任何靶细胞。
在妊娠期间，在生理条件下胎盘中可发现GDF-15。然而，许多恶性肿瘤(特别是侵袭性脑癌、黑色素瘤、肺癌、胃肠肿瘤、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌(Mimeault M andBatra SK,J.Cell Physiol 2010))在肿瘤以及血清中表现出GDF-15水平的增加。同样地，GDF-15的高表达与药物抗性之间的相关性(Huang CY et al.,Clin.Cancer Res.2009)和GDF-15的高表达与不良预后之间的相关性(Brown DA et al.,Clin.Cancer Res.2009)均有相关报道。
通过免疫组织化学评估发现，GDF-15在不同WHO等级的神经胶质瘤中表达(Rothet al.,Clin.Cancer Res.2010)。此外，Roth等人在SMA560神经胶质瘤细胞中稳定地表达了靶向内源性GDF-15的表达短发夹RNA的DNA构建体或对照构建体。当使用这些预先建立的稳定细胞系时，他们观察到携带GDF-15下调的SMA560细胞的小鼠比携带对照构建体的小鼠中的肿瘤形成有所延迟。
专利申请WO 2005/099746和WO 2009/021293涉及一种抗人GDF-15抗体(Mab26)，其能够拮抗人GDF-15(hGDF-15)对小鼠体内肿瘤诱导的体重减轻的作用。同样地，Johnen H等人(Nature Medicine,2007)报道了抗人GDF-15单克隆抗体对癌症诱导的厌食和体重减轻的影响，但并未观察到抗人GDF-15抗体对由癌症形成的肿瘤大小的任何影响。
WO 2014/049087和PCT/EP2015/056654涉及针对hGDF-15的单克隆抗体及其医疗用途。
最近开发的癌症治疗方法是使用免疫检查点阻断剂，例如人PD-1抑制剂和人PD-L1抑制剂。使用这些免疫检查点阻断剂的基本原理是，通过阻断免疫检查点阻止免疫系统靶向癌症抗原和相应的的癌细胞，对癌症的免疫应答可能更有效。已报道免疫检查点阻断剂以及免疫检查点阻断剂的特定组合可提高黑色素瘤患者的患者存活(Cully M,“Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancerimmunotherapy.”,Nat Rev Drug Discov.2015Jun；14(6):374-5.)，但并非所有的黑色素瘤患者都表现出完全的应答，许多其他癌症的结果也尚未公布，仍有理由(如突变负担)表明其他适应症的结果不太理想。
因此，迄今为止，本领域仍然需要更有效地治疗癌症的手段。更具体地说，仍然缺乏可用于更有效的癌症免疫疗法的手段。
发明内容
本发明通过提供下述实施例来满足上述需求并解决本领域中的上述问题：
特别地，在确定有效治疗癌症的手段的努力中，发明人意外地发现，随着患者血清中hGDF-15水平的增加，对用免疫检查点阻断剂治疗的应答的可能性显著降低。因此，根据本发明所述，hGDF-15抑制剂可用于抑制hGDF-15对用免疫检查点阻断剂进行治疗时患者应答的负面影响，并改善患者对用免疫检查点阻断剂进行治疗时的应答。
意想不到的是，发明人还发现hGDF-15与癌转移中CD8+T淋巴细胞的百分比呈负相关。这是值得注意的，因为CD8+T淋巴细胞的存在对于用抗PD-1抗体抑制免疫检查点后肿瘤消退是特别需要的。因此，根据本发明所述，hGDF-15的治疗性抑制可用于增加包括肿瘤转移在内的实体癌中CD8+T淋巴细胞的百分比。这种实体癌中CD8+T淋巴细胞的增加可有利地用于实体癌的治疗，特别是免疫治疗。因此，在本发明的非限制性方面，特别有利的治疗组合是hGDF-15抑制剂与免疫检查点阻断剂的组合。该组合的有利效果是hGDF-15的抑制将增加实体癌中CD8+T淋巴细胞的百分比，从而引起与免疫检查点抑制的协同治疗效果。
为了进一步阐明hGDF-15抑制剂如何增加实体癌中CD8+T淋巴细胞的百分比，发明人发现hGDF-15降低了T细胞对内皮细胞的粘附。因此，根据本发明所述，hGDF-15抑制剂的治疗可用于增加包括CD8+T细胞在内的T细胞对内皮细胞的粘附。根据本发明所述，这种治疗将增加CD8+T细胞从血流进入到实体癌中。由hGDF-15抑制剂的治疗引起的实体癌中CD8+T细胞百分比的增加有利于并且可用于癌症治疗，例如癌症免疫治疗。由于CD8+T细胞进入实体癌中并且实体癌中这些CD8+T细胞的存在对于使用免疫检查点阻断剂的治疗方法特别有利，所以本发明中hGDF-15抑制剂的特别有利的用途是其与免疫检查点阻断剂的联合使用。
因此，本发明通过提供下述优选实施方案从而提供改进的癌症治疗手段：
1、一种人GDF-15抑制剂的应用，所述的应用为在增加人类患者实体癌中CD8+T细胞百分比的方法中的应用，其中，将所述人GDF-15抑制剂施用于所述人类患者。
2、如项目1所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.2ng/ml的人GDF-15血清水平的患者；优选地，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.5ng/ml的人GDF-15血清水平的患者；更优选地，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.8ng/ml的人GDF-15血清水平的患者。
3、如项目1或2所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肾细胞癌、尤文氏肉瘤、非小细胞肺癌和小细胞肺癌组成的组；较佳地，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌组成的组；更佳地，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌和胃癌组成的组。
4、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述癌症选自由黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、结肠直肠癌和前列腺癌组成的组。
5、如前述项目中任一项所使用的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述癌症是黑色素瘤。
6、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述抑制剂是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分。
7、如项目6所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述结合是与人GDF-15上的构象表位或不连续的表位结合，并且所述构象表位或不连续的表位由SEQ ID No：25和SEQ IDNo：26所示的氨基酸序列组成。
8、如项目6或7所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变域，所述重链可变域包括含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1区、含有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2和含有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR3区，并且所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包括含有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1区、含有如氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区和含有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR3区。
9、如项目1～5任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述抑制剂是短干扰RNA或siRNA发夹构建体。
10、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述方法是用于治疗癌症的方法。
11、如项目10所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述用于治疗癌症的方法是通过癌症免疫疗法治疗癌症的方法。
12、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述方法是用于治疗癌症转移的方法。
13、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中的。
14、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述应用是与免疫检查点阻断剂联合使用。
15、如前述项目中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述免疫检查点阻断剂选自以下组中的一个或多个：
iii)人PD-1抑制剂，所述抑制剂优选为能够结合人PD-1的单克隆抗体或其抗原结合部分；和
iv)人PD-L1抑制剂，所述抑制剂优选为能够结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
16、如项目15所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述免疫检查点阻断剂包含能够结合人PD-1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
17、如项目15或16所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述免疫检查点阻断剂包含能够结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
18、一种包含人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合物。
19、如项目18所述的组合物，其中，所述人GDF-15抑制剂是如项目6～9任一项所定义的抑制剂。
20、如项目18或19所述的组合物，其中，所述免疫检查点阻断剂如项目15～17任一项所定义的阻断剂。
21、如项目18～20任一项所述的组合物，其中，其应用于药物中。
22、一种试剂盒，所述试剂盒包含人GDF-15抑制剂和至少一种免疫检查点阻断剂。
23、如项目22所述的试剂盒，其中，所述人GDF-15抑制剂是如项目6～9任一项所定义的抑制剂。
24、如项目22或23所述的试剂盒，其中，所述免疫检查点阻断剂是如项目15～17任一项所定义的阻断剂。
25、如前述项目中任一项所述的试剂盒，其中，所述人GDF-15抑制剂和一种或多种或全部所述免疫检查点阻断剂被容纳在分开的容器中或单个容器中。
26、如项目21～25任一项所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，所述应用为在治疗实体癌的方法中的应用。
27、如项目26所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，其中，所述方法是用于癌症免疫疗法的方法。
28、如项目27所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，其中，所述癌症是如项目3、4或5中所定义的癌症。
29、一种人GDF-15抑制剂的应用，所述应用为在人类患者体内通过免疫检查点阻断剂治疗实体癌的方法中的应用，其特征在于，将所述人GDF-15抑制剂施用于人类患者。
30、如项目29所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述方法是用于癌症免疫治疗的方法。
31、如项目29或30所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述患者是如项目2中所定义的患者。
32、如项目29～31任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述癌症是如项目3、4或5中所定义的癌症。
33、如项目29～32任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂是如项目6～9任一项所定义的抑制剂。
34、如项目29～33任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述免疫检查点阻断剂是如项目15～17任一项所定义的阻断剂。
35、如项目29～34任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂增加癌中CD8+T细胞的百分比。
36、如项目35所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中的。
37、人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，所述应用为在治疗人类患者实体癌的方法中的应用，其中，将人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂施用于人类患者。
38、如项目36所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述方法是用于癌症免疫治疗的方法。
39、如前述任一项项目中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述患者是如项目2中所定义的患者。
40、如前述任一项项目中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述癌症是如项目3、4或5中所定义的癌症。
41、如前述任一项项目中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述hGDF-15抑制剂是如项目6～9任一项所定义的抑制剂。
42、如前述任一项项目中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述免疫检查点阻断剂是如项目15～17任一项所定义的阻断剂。
43、如前述任一项项目中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂增加癌中CD8+T细胞的百分比。
44、如项目43所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中；
较佳地，所述增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附增加了CD8+T细胞在内皮细胞上的滚动，使得从血流进入实体癌中的所述CD8+T细胞增加。
45、一种用于确定感兴趣物质是否是人GDF-15抑制剂的体外方法，其中，所述方法包括：
a)活化内皮细胞；
b)在存在含有人GDF-15的溶液情况下和存在感兴趣物质的情况下，孵育包含T细胞的第一样品；
c)测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自所述第一样品的所述T细胞的粘附以获得第一次粘附测量结果；和
d)基于步骤c)的第一次粘附测量结果，确定感兴趣物质是否是人GDF-15抑制剂。
46、如项目45所述的方法，其中，所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞。
47、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述内皮细胞是人内皮细胞。
48、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述内皮细胞被TNF-α和IFN-γ活化，并且在所述活化步骤中；所述TNF-α和IFN-γ较佳地以终浓度为5-20ng/ml的TNF-α和5-20ng/ml的IFN-γ存在于培养基中；更佳地，以终浓度为10ng/ml的TNF-α和10ng/ml的IFN-γ存在于培养基中。
49、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述感兴趣物质是能够结合人GDF-15的物质，较佳地，是能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合片段。
50、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，所述内皮细胞和所述T细胞以1:2至2:1的数值比进行使用；较佳地，所述数值比为1:1。
51、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在进行步骤c)期间，所述内皮细胞存在于包被的细胞培养表面；较佳地，所述内皮细胞存在于包被纤连蛋白的细胞培养表面。
52、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在进行步骤b)期间，人GDF-15以50-200ng/ml的浓度存在；较佳地，以100ng/ml的浓度存在。
53、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，通过计算滚动的T细胞的数量来测量粘附。
54、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，通过计算粘附的T细胞的数量来测量粘附。
55、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，通过测量所述T细胞的滚动速度来测量粘附。
56、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，如果所述感兴趣物质增加所述粘附，则其被确定为人GDF-15抑制剂。
57、如前述项目中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，如果所述感兴趣物质不增加所述粘附，则其被确定为不是人GDF-15抑制剂。
58、如前述项目中任一项所述的方法，其中，
在步骤b)中，将第二样品在存在包含人GDF-15的所述溶液和不存在所述感兴趣物质的情况下进行孵育，所述第二样品包含T细胞，
在步骤c)中还包括测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自所述第二样品的所述T细胞的粘附以获得第二次粘附测量结果，和
在步骤d)中，如果与所述第二次粘附测量结果相比，所述第一次粘附测量结果增加，则所述感兴趣物质被确定为人GDF-15抑制剂。
59、如前述项目中任一项所述的方法，其中，
在步骤b)中，将第三样品在不存在包含人GDF-15的所述溶液的情况下和在不存在所述感兴趣物质的情况下进行孵育，所述第三样品包含T细胞，
在步骤c)中还包括测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自第三第二样品的所述T细胞的粘附以获得第三次粘附测量结果，和
在步骤d)中，使用第三次粘附测量结果作为指示完全人GDF-15抑制的参考粘附测量结果。
60、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
61、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是pan T细胞。
62、如前述项目中任一项所述的方法，其中，所述T细胞是人T细胞。
63、如项目1～17任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述应用是与聚肌苷酸:聚胞苷酸的组合的应用；或如项目37～44任一项所述的人GDF-15抑制剂与免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中所述组合是与聚肌苷酸：聚胞苷酸的组合。
64、如项目1～17和63任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其中，所述应用是与抗人CD40抗体的组合的应用；较佳地，是与单克隆抗人CD40抗体的组合的应用；或如项目37～44和63中任一项所述的组合的应用，其中所述组合是与抗人CD40抗体的组合；较佳地，是与单克隆抗人CD40抗体的组合。
65、一种人GDF-15抑制剂与选自以下任何一组的组合在人类患者体内治疗实体癌的方法中的应用，所述组包括：
a)聚肌苷酸:聚胞苷酸；
b)抗人CD40抗体；较佳地为单克隆抗人CD40抗体；或
c)聚肌苷酸:聚胞苷酸和抗人CD40抗体；较佳地为单克隆抗人CD40抗体，其中，所述组合任选地包含一种免疫检查点阻断剂。
生物材料保藏信息
本发明中由杂交瘤细胞系B1-23生产的抗体于2011年9月29日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，地址为德国布伦瑞克市英豪丰大街7B(邮编38124)，保藏编号为DSMACC3142。
附图说明
图1显示了治疗方案的应答者和无应答者中GDF-15的血清水平。
图2显示了hGDF-15的血清水平分别为<1.8ng/ml、1.8-4.2ng/ml和>4.2ng/ml的患者组中应答者和无应答者的数目。
图3为使用GDF-15作为连续预测因子通过广义线性模型所预测的对治疗应答的概率(应答者1)。圆圈代表数据，曲线代表模型。垂直线表示治疗应答的概率为0.5时GDF-15的浓度。
图4为根据GDF-15的血清水平(<1.8，1.8-4.2，>4.2ng/ml)定义的三组中Kaplan-Meier的存活曲线。
图5：图5A为使用LDH作为连续预测因子通过广义线性模型所预测的对治疗应答的概率(应答者1)。圆圈代表数据，曲线代表模型。垂直线表示治疗应答的概率为0.5时LDF的浓度。患者群相同。然而，其中四名患者由于溶血导致了LDH水平的可靠性分析失败。图5B为应答者和无应答者及其各自的hGDF-15和LDH水平的示意图。当选择截取值来覆盖所有应答者时，基于GDF-15的检测可以识别6个(一共9个)无应答者，而基于LDH水平的分析只能区分4个(一共9个)无应答者。对于LDH的检测，必须排除会导致数据丢失的4个溶血样本。
图6显示了来自无(上图)或高(下图)GDF-15免疫反应性的黑色素瘤脑转移的示例性组织切片，其通过免疫组织化学技术分别对GDF-15以及T细胞标记蛋白CD3和CD8进行染色，如图所示。在高GDF-15的样品中用箭头表示CD3和CD8阳性细胞。CD3和CD8染色是由连续部分的相同区域制成的(但不是来自相同的部分)。
图7显示了在不同黑色素瘤脑转移灶中CD3+细胞的百分比与GDF-15的评分绘制的曲线图(7A)和在不同黑色素瘤脑转移灶中CD8+细胞的百分比与GDF-15的评分绘制的曲线图(7B)。
图8显示了GDF-15的评分分别与来自不同肿瘤实体(黑色素瘤、CRC、RCC、NSCLC和SCLC)的脑转移的CD8+和CD3+T细胞百分比绘制的曲线图。
图9：图9A显示了每秒每个视场的滚动T细胞的数量。数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照”)中获得。图9B显示了T细胞的滚动速度(以每0.2秒的像素为单位测量)。数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照”)中获得。图9C显示了每个视场粘附的细胞数量。数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照”)中获得。图9D显示了每个视场粘附的细胞数量。数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照”)中获得。
图10：图10A显示了每秒每个视场的滚动T细胞的数量。数据从通道#1(在未刺激的HUVEC上的对照T细胞作为“阴性对照”)、通道#2(刺激的HUVEC上的对照T细胞作为“阳性对照”)、通道#3(“GDF-15”)、通道#4(“UACC 257”：在含有分泌型GDF-15的UACC 257黑素瘤细胞的上清液中培养的T细胞)和通道#5(“UACC257+抗hGDF-15“：在UACC 257黑色素瘤细胞的上清液中培养的T细胞，其中用抗hGDF-15抗体B1-23作为hGDF-15抑制剂消耗上清液中的分泌型GDF-15)中获得。图10B为如实施例3中所述进行的流动/粘附分析。将T细胞与100ng/ml的GDF-15预孵育1小时或与已和10μg/ml的抗体预孵育1小时的100ng/ml GDF-15预孵育，如图所示。使用以下抗GDF-15抗体：H1L5(人源化B1-23)、01G06和03G05(根据WO 2014/100689的序列工程化后的人源化抗GDF-15抗体)。结果显示在图中，其显示了每20秒每个视场的滚动细胞的数量。
图11中给C57BL/6J小鼠皮下接种2×105个结肠MC38tghGDF-15细胞。在第0天用抗GDF-15抗体(20mg/kg重量)处理，并在第3、7、10、14、17和21天重复此处理。在第13天，将携带相似大小的肿瘤(100-150mm3)用或不用Poly-ICLC(也缩写为“Poly-IC”)和抗CD40抗体处理。追踪抵制预建立肿瘤的小鼠57天。根据动物福利标准处死携带肿瘤的小鼠。
图12分别为GDF-15的水平<1.5ng/ml和≥1.5ng/ml的患者组中的累积存活率。
图13分别为具有高GDF-15水平(即具有最高GDF-15水平的50位患者)的患者组和低GDF-15水平(即具有最低GDF-15水平的49位患者)的患者组的累积存活率(整个研究群体的中位数分割)。
图14显示了hGDF-15的血清水平与肿瘤突变负荷无显著相关性。
绘制癌症患者样品中的hGDF-15mRNA水平与在癌症中鉴定出的体细胞突变的数量的关系。通过使用外显子组测序确定体细胞突变。通过使用来自苏黎世大学医院的UZH网络工具(Cheng PF et al.:Data mining The Cancer Genome Atlas in the era ofprecision cancer medicine.Swiss Med Wkly.2015Sep 16；145:w14183)分析数据。图14A显示了来自癌症基因组图谱(TGCA)的仅考虑患有高度恶性黑色素瘤的患者的癌症患者数据图(癌症基因组图谱在Cheng PF等人的参考文献中有所描述：Data mining The CancerGenome Atlas in the era of precision cancer medicine.Swiss Med Wkly.2015Sep16；145:w14183)。使用RSEM(“RNA Seq by expectation maximization”)软件包进行归一化来评估GDF-15的表达量(Li B and Dewey CN:RSEM:accurate transcriptquantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.BMCBioinformatics.2011Aug 4；12:323.doi:10.1186/1471-2105-12-323)。图14B显示了另外40名来自苏黎世大学医院的转移性恶性黑素瘤患者的癌症患者数据图，单独对其进行分析。
图15显示了携带野生型肿瘤或过表达转基因(tg)hGDF15的肿瘤的小鼠中CD8a的免疫细胞化学图片。组织切片用抗CD8a(1:100稀释；4SM15抗体购自eBioscience)进行染色。
具体实施方式
发明详述
定义和一般技术
除非下面另有定义，否则应根据本领域技术人员已知的通用含义来理解本发明使用的术语。
本发明使用的术语“抗体”是指能够特异性结合感兴趣抗原的任何功能性抗体，如Paul,W.E.(编)第七章中的一般概述：Fundamental Immunology 2nd Ed.Raven Press,Ltd.,New York 1989，在此通过引用并入本文。若无特别限制，术语“抗体”涵盖来自任何合适的来源物种的抗体，包括鸡类和哺乳动物，例如小鼠、山羊、非人灵长类动物和人。较佳地，抗体是人源化抗体。所述抗体优选是可以通过本领域公知的方法制备的单克隆抗体。术语“抗体”包括IgG-1、-2、-3或-4、IgE、IgA、IgM或IgD同种型抗体。术语“抗体”涵盖单体抗体(例如IgD、IgE、IgG)或寡聚抗体(例如IgA或IgM)。术语“抗体”还包括但不限于分离的抗体和修饰的抗体，例如基因工程抗体，如嵌合抗体。
抗体结构域的命名遵循本领域已知的术语。如本领域常规已知，抗体的每个单体包含两条重链和两条轻链。其中，每条重链和轻链包含对结合抗原重要的可变结构域(在重链中称为VH和在轻链中称为VL)。这些重链和轻链的可变结构域包含(以N端至C端的顺序)区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4(FR，构架区；CDR，互补决定区，也称为高变区)。包括抗体序列内的上述抗体区域的鉴定和分配通常依据Kabat等(Sequences of proteins ofimmunological interest,U.S.Dept.of Health and Human Services,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.1983)或Chothia等(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature.1989Dec 21-28；342(6252):877-83)，或可以通过使用Giudicelli等人描述的IMGT/V-QUEST软件进行(IMGT/V-QUEST,an integrated software program for immunoglobulin and T cellreceptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleic Acids Res.2004Jul 1；32(Web Server issue):W435-40)，在此通过引用并入本文。较佳地，通过使用IMGT/V-QUEST软件对上述抗体区域进行鉴定和分配。
“单克隆抗体”是来自本质上同源的抗体种群的抗体，其中所述抗体在序列上基本相同(即除了少部分含有天然存在的序列修饰的抗体，例如在其N-和C-末端的氨基酸修饰，其余相同)。与含有针对多种表位的不同抗体混合物的多克隆抗体不同，单克隆抗体针对相同的表位，因此具有高度特异性。术语“单克隆抗体”包括(但不限于)衍生自单细胞克隆的单克隆细胞群获得的抗体，例如通过在和Milstein(Nature,1975Aug 7；256(5517):495-7)或Harlow及Lane(“Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1988)中描述的杂交瘤方法产生抗体。单克隆抗体也可以通过其他合适的方法获得，包括如Clackson等人(Nature.1991Aug 15；352(6336):624-8)或Marks等人(J Mol Biol.1991Dec 5；222(3):581-97)描述的噬菌体展示技术。单克隆抗体可以是已经针对抗原结合特性优化的抗体，例如通过本领域已知的方法降低Kd值、优化结合和解离动力学。举例来说，可以通过包括噬菌体展示的展示方法来优化Kd值，从而产生亲和力成熟的单克隆抗体。术语“单克隆抗体”不限于来自特定来源物种或来自单一来源物种的抗体序列。因此，术语“单克隆抗体”的含义涵盖嵌合单克隆抗体，如人源化单克隆抗体。
“人源化抗体”是含有人源序列和少部分赋予对目标抗原(例如人GDF-15)具有结合特异性的非人源序列的抗体。一般来说，人源化抗体通过用能够结合目的抗原(例如人GDF-15)的非人源供体抗体(例如小鼠、兔、大鼠供体抗体)的高变区序列替换来自人源受体抗体的高变区序列来产生。在一些情况下，受体抗体的构架区序列也可以被供体抗体的相应序列替换。除了来自供体和受体抗体的序列之外，“人源化抗体”也可以包含或不包含其他(额外的或取代的)残基或序列。此类其他残基或序列可用于进一步改善抗体的性质，例如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人类中的抗原性)。用于产生人源化抗体的方法的非限制性例子是本领域已知的，例如Riechmann等在Nature.1988Mar 24；332(6162):323-7)或Jones等人(Nature.1986May 29-Jun 4；321(6069):522-5所述的方法。
术语“全人源抗体”涉及含有人源可变域和恒定域序列的抗体。该定义包括具有携带单个氨基酸取代或修饰的人源序列的抗体，所述的单个氨基酸取代或修饰可用于进一步改善抗体性质，例如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人类中的抗原性)。术语“人源抗体”不包括其中一部分被赋予了对目的抗原具有结合特异性的非人源序列的人源化抗体。
如本发明所用的抗体的“抗原结合部分”是指保留抗体特异性结合抗原(例如hGDF-15、PD-1或PD-L1)的能力的抗体部分。例如，所述能力可以通过本领域已知的方法来确定抗原结合部分和抗体竞争地与抗原特异性结合的能力来确定。抗原结合部分可含有抗体的一个或多个片段。若无特别限制，抗原结合部分可以通过本领域已知的任何合适的方法产生，包括重组DNA方法和通过抗体的化学或酶促片段化来制备。抗原结合部分可以是Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、双抗体或任何保留了特异性结合抗原的能力的其他抗体部分。
“抗体”(例如单克隆抗体)或“抗原结合部分”可以被衍生或连接到不同的分子上。例如，与抗体连接的分子可以是其他蛋白质(例如其他抗体)、分子标记(例如荧光性、冷光性、有色的或放射性分子)、药物和/或毒性剂。抗体或抗原结合部分可以直接连接(例如以两种蛋白质之间的融合体的形式)或通过连接体分子(例如本领域已知的任何合适类型的化学连接体)进行连接。
如本发明所用，术语“结合”是指与目的抗原(例如人GDF-15)的特异性结合。优选地，Kd值小于100nM，更优选小于50nM，还更优选小于10nM，进一步更优选小于5nM，最优选小于2nM。
如本发明所用，与能够结合人GDF-15的第二抗体“能够竞争”的抗体或其抗原结合部分意指所述“能够竞争”的(第一)抗体或其抗原结合部分能够将参比溶液中10nM的第二抗体与人或重组人GDF-15的结合减少50％。通常，“能够竞争”意指为了使参比溶液中10nM的第二抗体与人或重组人GDF-15的结合减少50％时，所需(第一)抗体或其抗原结合部分的浓度少于1000nM，优选少于100nM，更优选少于10nM。所述结合通过表面等离子共振或通过酶联免疫吸附分析(ELISA)来检测，优选通过表面等离子共振来检测。
如本发明所用，术语“表位”是指形成抗体结合位点的一小部分抗原。
在本发明的上下文中，优选通过如下所述的使用表面等离子共振作为参考标准测定来检测抗体或其抗原结合部分与目的抗原(例如人GDF-15)的结合或竞争性结合。
术语“KD”或“KD值”涉及本领域已知的平衡解离常数。在本发明的上下文中，这些术语涉及抗体相对于特定目的抗原(例如人GDF-15)的平衡解离常数。平衡解离常数是复合物(例如抗原-抗体复合物)可逆地解离成其组分(例如抗原和抗体)倾向的量度。对于本发明所述抗体，优选通过使用如下所述的表面等离子共振测量来确定KD值(例如对于抗原人GDF-15来说)。
如本发明所用，“分离的抗体”是指已经鉴定并且从其来源环境的大部分组分(按重量计)分离的抗体，例如来自杂交瘤细胞培养物或用于其生产的不同细胞培养物(例如生产细胞，如重组表达抗体的CHO细胞)的组分。进行分离是为了充分除去可能干扰抗体在所需应用(例如本发明所述的抗人GDF-15抗体的治疗用途)中的适用性的组分。制备分离抗体的方法在本领域中是已知的，包括蛋白A亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、病毒保留过滤和超滤。优选地，制备的分离的抗体至少为70％的纯度(w/w)，更优选至少为80％的纯度(w/w)，更优选至少为90％的纯度(w/w)，进一步更优选至少为95％的纯度(w/w)，最优选至少为99％的纯度(w/w)，如所述纯度通过使用Lowry蛋白质分析法进行测量。
如本发明所用的“双抗体”是小的二价的结合抗原的抗体部分，其包含重链可变区由肽接头连接至相同多肽链上的轻链可变区，所述肽接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间进行配对。这导致其与另一条链的互补结构域进行配对，并且组装成具有两个抗原结合位点的二聚分子。双抗体可以是二价且单特异性的(例如具有两个针对人GDF-15的抗原结合位点的双抗体)，或者可以是二价且双特异性的(例如具有两个抗原结合位点的双抗体，一个是人GDF-15的结合位点，另一个是不同抗原的结合位点)。在Holliger P等人的“"Diabodies":small bivalent and bispecific antibody fragments.”Proc Natl AcadSci U S A.1993Jul 15；90(14):6444-8中有关于双抗体的详细描述。
如本发明所用的“单域抗体”(其也被称为“纳米抗体TM”)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单域抗体的结构用于产生其的方法是本领域已知的，例如HoltLJ等在“Domain antibodies:proteins for therapy.”Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90、Saerens D等在“Single-domain antibodies as building blocks for noveltherapeutics.”Curr Opin Pharmacol.2008Oct；8(5):600-8.Epub 2008Aug 22和ArbabiGhahroudi M等在“Selection and identification of single domain antibodyfragments from camel heavy-chain antibodies.”FEBS Lett.1997Sep 15；414(3):521-6中的描述。
本发明所用的术语“癌症”和“癌细胞”是依据其在本领域中的普通含义使用(参见例如Weinberg R.等在The Biology of Cancer.Garland Science:New York 2006.850p中的描述)。
本发明中治疗的癌症是实体癌。“实体癌”是形成一种或多种实体瘤的癌症。形成实体瘤的这种实体癌在本领域中通常是已知的。术语“实体癌”包括由癌症形成的原发性肿瘤和可能的继发性肿瘤，其也被称为转移瘤。优选地，本发明中待治疗的实体癌选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肾细胞癌、尤文氏肉瘤、非小细胞肺癌和小细胞肺癌组成的组，较佳地选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌组成的组，更佳地选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌和胃癌组成的组，并且最佳地选自由黑色素瘤、结肠直肠癌和前列腺癌组成的组。
本发明所提及的术语“脑癌”是指本领域已知的所有脑癌。它包括但不限于神经胶质瘤(WHO I-IV级)、星形细胞瘤、脑膜瘤和髓母细胞瘤。
本发明所提及的术语“头颈部癌症”是指本领域已知的所有头颈部癌症。它包括但不限于食管癌、口腔鳞状细胞癌和下咽癌。本发明中待治疗的特别优选的头颈癌是口腔鳞状细胞癌。
如本发明所用的术语“癌症生长”涉及癌症的任何可测量的生长。对于形成实体瘤的癌症，“癌症生长”涉及肿瘤体积随着时间的推移其可测量的增加。如果癌症仅形成单一肿瘤，则“癌症生长”仅与单个肿瘤的体积增加有关。如果癌症已经形成多种肿瘤如转移瘤，则“癌症生长”涉及所有可测量肿瘤体积的增加。对于实体瘤而言，肿瘤体积可以通过本领域已知的任何方法测量，包括核磁共振成像和计算机断层扫描(CT扫描)。
诸如本发明中的“癌症的治疗”或“治疗癌症”等术语是指有益于健康的治疗。例如，评估有益于健康的治疗是否有效可通过评估治疗是否抑制所治疗患者或患者们中的癌症生长来进行。较佳地，通过本领域已知的合适的统计测试进行评估，该抑制是具有统计学上的显著性差异。对癌症生长的抑制可以通过比较本发明中接受治疗的一组患者与未接受治疗患者的对照组中的癌症生长来进行评估，或通过比较接受本领域标准癌症治疗以及本发明所述治疗的患者组与仅接受本领域标准癌症治疗的患者对照组来进行评估。此类用于评估癌症生长的抑制的研究是根据临床研究的公认标准进行设计的，例如具有足够统计说服力的双盲、随机研究。术语“治疗癌症”包括所述癌症生长的抑制为癌症生长被部分抑制(即与对照组患者相比，患者的癌症生长被延迟)，所述抑制为癌症生长被完全抑制的(即患者中的癌症生长停止)以及所述抑制为癌症生长逆转(即癌症萎缩)。优选地，使用实体肿瘤中的应答评估标准1.1版本(RECIST v1.1)(Eisenhauer et al.:New responseevaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1.1).In:Eur.J.Cancer.45,No.2,January 2009,pp.228–47)，基于应答者和非应答者的分类来对有益于健康的治疗是否有效进行评估。或者可选地，基于癌症进展的已知临床指标对有益于健康的治疗是否有效进行评估。
本发明中的癌症治疗可以是第一线疗法、第二线疗法或第三线疗法或第三线疗法以外的疗法。这些术语的含义在本领域中是已知的并且符合美国国家癌症研究所通常使用的术语。
本发明中的癌症治疗不排除在患者中同时发生额外的或次要的治疗益处。例如，额外的或次要的益处可能是对癌症诱导的体重减轻的影响。然而，应该理解的是，寻求保护的主要治疗是为了治疗癌症本身，任何额外的或次要的益处仅仅反映了癌症生长治疗的可选的附加优点。
术语“癌症免疫疗法”是本领域已知的，并且通常涉及其中利用患者的免疫系统进行癌症的治疗。癌细胞携带着基因组突变，这些突变产生的癌细胞抗原是癌细胞特有的，与非癌细胞的抗原不同。因此，在本发明中的癌症免疫治疗的优选方面，癌症免疫疗法是癌症细胞抗原被免疫系统识别并且表达这些抗原的癌细胞被免疫系统杀死的癌症免疫疗法。在本发明的非限制性方面，表达这些癌细胞抗原的这些癌细胞可以被免疫系统的CD8+T细胞杀死。癌症免疫治疗可以通过本领域已知的免疫监测方法进行评估，例如通过监测血液样品中胞内IFN-γ的表达(例如在CD8+T细胞和/或NK细胞中)、监测血液样品中细胞表面CD107a的表达(例如在CD8+T细胞和/或NK细胞上)、监测血液样品中胞内TNF-α的表达(例如在白细胞上)、血液样品中胞内白细胞介素2的表达(例如在CD8+T细胞和/或CD4+T细胞中)、血液样品中细胞表面CD154的表达(例如在CD8+T细胞中和/或在CD4+T细胞中)、血液样品中肿瘤抗原特异性T细胞的四聚体或多聚体(dextramer)染色、针对自体肿瘤细胞的CTL活性或针对源自肿瘤特异性突变的新抗原的T细胞的存在情况。评估癌症免疫疗法的优选方法是根据Gouttefangeas C等人在“Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy:Applications,Quality Assurance and Future.”(2015)In:Cancer Immunology:Translational Medicine from Bench to Bedside(N.Rezaei editor).Springer.Chapter 25:pages 471-486中描述的方法；以及根据Van der Burg SH等人在“Immunoguiding,the final frontier in the immunotherapy of cancer.”(2014)InCancer Immunotherapy meets oncology(CM Britten,S Kreiter,M.Diken&HG Rammenseeeds).Springer International Publishing Switzerland p37-51ISBN:978-3-319-05103-1中描述的方法。
如本发明所用，“癌症免疫疗法”任选地包括除了用于治疗癌症的免疫系统之外，使用另外的癌症治疗机制的治疗。例如，先前报道显示hGDF-15抑制剂可用于在免疫系统严重受损的小鼠模型系统中治疗癌症(WO2014/049087)。因此，在本发明中，hGDF-15抑制剂在人类患者中的癌症免疫治疗还可以包括独立于免疫系统的hGDF-15抑制剂的额外治疗效果。可以使用另外的癌症治疗机制的癌症免疫疗法的另一个例子是与已知化疗剂的联合疗法。用已知的化疗剂进行的这种联合疗法，例如，可能不仅利用免疫系统治疗癌症的癌症治疗，而且还包括癌细胞被所述化疗剂直接杀死的癌症治疗。
如本发明所用，术语“增加实体癌中CD8+T细胞的百分比”涉及在由实体癌形成的肿瘤或多个肿瘤中任何可检测的CD8+T细胞百分比的增加(即相对于所有细胞计算的CD8+T细胞的百分比)。较佳地，通过本领域已知的合适的统计测试进行评估，该增加具有统计学上的显著性差异。在由实体癌形成的肿瘤或多个肿瘤中CD8+T细胞百分比的增加，可以通过用于分析实体瘤中CD8+T细胞的已知方法来确定。这些方法包括对肿瘤活检组织中CD8+T细胞的分析，例如使用针对CD8的抗体进行免疫组织化学和使用细胞总数染色来分析此类肿瘤活检组织。这种增加可以通过比较本发明中接受治疗的一组患者与未接受治疗患者的对照组中CD8+T细胞的百分比来进行评估，或通过比较接受本领域标准癌症治疗外加本发明所述治疗的患者组与仅接受本领域标准癌症治疗的患者对照组来进行评估。
如本发明所用，“CD8+T细胞”优选存在于人类患者体内的内源性细胞。
hGDF-15的血清水平可以通过本领域已知的任何方法进行测量。例如，测量hGDF-15血清水平的优选方法是使用针对GDF-15的抗体进行酶联免疫吸附分析(ELISA)来测量hGDF-15血清水平。此类ELISA方法在实施例1中有举例说明。或者，hGDF-15的血清水平可以通过使用针对GDF-15的抗体进行已知的电化学发光免疫分析来确定。例如，罗氏技术可用于此类电化学发光免疫分析。
本发明中待治疗的患者优选为hGDF-15血清水平升高的患者。如本发明所用，术语“升高的hGDF-15血清水平”意指在以健康人类对照个体的血清中hGDF-15水平的中位数作为参考时，在施用本发明的hGDF-15抑制剂之前人类患者的血清中hGDF-15水平更高。
健康人类对照个体的hGDF-15血清水平中位数<0.8ng/ml。在健康的人类对照中，预期范围在0.2ng/ml和1.2ng/ml之间(参考文献：Tanno T等:“Growth differentiationfactor 15in erythroid health and disease.”Curr Opin Hematol.2010May；17(3):184–190)。
因此，在本发明的优选实施方案中，根据本发明治疗的患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.2ng/ml的患者，优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.5ng/ml的患者，更优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.8ng/ml的患者。
在本发明进一步优选的实施方案中，根据本发明治疗的患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.2ng/ml且不超过12ng/ml的患者，优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.5ng/ml且不超过12ng/ml的患者，并且更优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.8ng/ml且不超过12ng/ml的患者。
本发明中依照所有上述实施方案的另一个实施方案中，根据本发明治疗的患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.2ng/ml且不超过10ng/ml的患者，优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.5ng/ml且不超过10ng/ml的患者，并且更优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.8ng/ml且不超过10ng/ml的患者。
本发明中依照所有上述实施方案的另一个实施方案中，根据本发明治疗的患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.2ng/ml且不超过8ng/ml的患者，优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.5ng/ml且不超过8ng/ml的患者，并且更优选在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为1.8ng/ml且不超过8ng/ml的患者。
在另一个实施方案中，根据本发明治疗的患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平至少为2ng/ml、至少为2.2ng/ml、至少为2.4ng/ml、至少为2.6ng/ml、至少为2.8ng/ml、至少为3.0ng/ml、至少为3.2ng/ml、至少为3.4ng/ml、至少为3.6ng/ml、至少为3.8ng/ml、至少为4.0ng/ml或至少为4.2ng/ml。在该实施方案中，患者优选是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平不超过12ng/ml的患者。更优选地，在该实施方案中，患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平不超过10ng/ml的患者。最优选地，在该实施方案中，患者是在开始施用hGDF-15抑制剂之前hGDF-15血清水平不超过8ng/ml的患者。
本发明使用的术语“在开始施用之前”是指在紧接着施用本发明的hGDF-15抑制剂之前的一段时间。优选地，术语“在开始施用之前”是指在施用前30天的一段时间；最优选是在施用前一周的一段时间。
如本发明所用，术语“显著的”、“显著地”等是指通过本领域已知的合适方法评估的数值之间具有统计学的显著性差异。
本发明使用的hGDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂可以通过使用本领域已知的方法进行施用。本领域技术人员对这些方法进行选择时是基于众所周知的考虑因素，包括相应抑制剂的化学性质(例如取决于抑制剂是短干扰RNA还是抗体)。已知的免疫检查点阻断剂的施用可以基于这些免疫检查点阻断剂已知的施用方案。例如，免疫检查点阻断剂的施用可以基于KEYNOTE-006试验中所用的施用方案(C.Robert et al.N Engl J Med 2015；372:2521-2532)。
本发明中，每次术语“包含”的出现可以任选地用术语“由......组成”代替。
本发明中所用的hGDF-15抑制剂
本发明中“hGDF-15抑制剂”可以是任何能够特异性抑制人GDF-15(hGDF-15)功能的分子。
这种hGDF-15抑制剂的非限制性实例是特异性下调hGDF-15的表达并由此抑制hGDF-15功能的分子。例如，使用短干扰RNA或siRNA发夹构建体来特异性下调hGDF-15的表达并抑制hGDF-15的功能。用于设计和选择短干扰RNA和siRNA发夹构建体序列的规则是本领域已知的，并且已经在例如Jackson and Linsley,Recognizing and avoiding siRNAoff-target effects for target identification and therapeutic application,NatRev Drug Discov.2010Jan；9(1):57-67中有所描述。短干扰RNA和siRNA发夹构建体可以通过任何合适的方法，包括病毒递送方法(例如在Knoepfel SA et al.,“Selection ofRNAi-based inhibitors for anti-HIV gene therapy.”World J Virol.2012Jun 12；1(3):79-90中的描述)以及其他递送方法，例如使用能够促进其递送到细胞中的缀合基团的方法(例如在Kanasty R et al.,“Delivery materials for siRNA therapeutics.”,NatMater.2013Nov；12(11):967-77中的描述)递送至人类患者。
可以使用本发明公开的方法来确定目的物质是否为“hGDF-15抑制剂”，所述方法在优选实施方案中有详细说明。较佳实施例中优选的方法是实例3中使用的方法。
先前的研究显示人GDF-15蛋白可以有利地被单克隆抗体(WO2014/049087)靶向识别，并且此类抗体具有包括对人GDF-15的高结合亲和力，如所示的对重组人GDF-15的平衡解离常数约为790pM(参见参考实施例1)的优良性质。因此，在本发明的优选实施方案中，所使用的hGDF-15抑制剂是能够结合hGDF-15的抗体，或其抗原结合部分。较佳地，所述抗体是能够结合hGDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分。
因此，在更优选的实施方案中，本发明的hGDF-15抑制剂是能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中重链可变区包括CDR3区，其含有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变域包括CDR3区，其含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或与其具有至少85％同源性的氨基酸序列。在该实施方案中，较佳地，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包括含有如SEQ IDNO：3所示氨基酸序列的CDR1区和含有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2区，并且所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包括含有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1区和含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区。
因此，在更优选的实施方案中，本发明的hGDF-15抑制剂是能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区，其含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1区、如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2区和如SEQID NO：5所示氨基酸序列的CDR3区。并且其中所述抗体或其抗原结合部分包括轻链可变区，其含有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1区、含有氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区和如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR3区。
在另一个实施方案中，依据能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的上述实施方案，重链可变区包括含有FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3区的结构域，并且包含如SEQID NO：1所示的氨基酸序列或与其有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，以及所述轻链可变区包括含有FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3区，并且包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与其有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一个优选实施方案中，依据能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的上述实施方案，抗体是人源化抗体或其抗原结合部分。该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区可以包含如SEQ ID No：29所示的氨基酸序列或与其有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％同一性的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区可以包含如SEQ ID No：32所示的氨基酸序列或与其有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％同源性的氨基酸序列。更优选地，该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区包含如SEQ ID No：29所示的氨基酸序列或与其有至少98％，优选至少99％同源性的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区包含如SEQ ID No：32所示的氨基酸序列或与其有至少98％，优选至少99％同源性的氨基酸序列。进一步更优选地，该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区包含SEQ ID No：29所示的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区包含如SEQ ID No：32所示的氨基酸序列。该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含如SEQ ID No：28所示的氨基酸序列或与其有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，进一步更优选至少99％同源性的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含如SEQ ID No：31所示的氨基酸序列或与其有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，还更优选至少99％同源性的氨基酸序列。最优选地，该单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含如SEQ ID No：28所示的氨基酸序列，并且该单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含如SEQ IDNo：31所示的氨基酸序列。
在另一实施方案中，依据能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的上述实施方案，重链可变区包括含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1区和含有如SEQID NO：4所示氨基酸序列的CDR2区，并且轻链可变区包括含有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的CDR1区和含有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的CDR2区。在该实施方案的优选方面，抗体可具有如上述本发明任何实施方案中所定义的CDR3序列。
在另一个实施方案中，依据能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，抗原结合部分是单域抗体(也称为“纳米抗体TM”)。在该实施方案的一个方面，单域抗体包括分别含有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在该实施方案的另一方面，单域抗体包括分别含有如SEQ ID NO：6、ser-ala-ser和SEQ ID NO：7氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在该实施方案的优选方面，单域抗体是人源化抗体。
较佳地，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分针对人GDF-15具有等于或小于100nM，小于20nM，优选小于10nM，更优选小于5nM，最优选在0.1nM和2nM之间的平衡解离常数。
在另一个实施方案中，依据能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的上述实施方案，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分结合相同的人GDF-15表位，因为所述针对人GDF-15的抗体来源于细胞系B1-23，其保藏在德国微生物菌种保藏中心(DMSZ)，保藏号为DSM ACC3142。如本发明所述，本发明中与人GDF-15结合的抗体优选通过表面等离子共振测量作为参考标准方法进行评估，具体根据参考实施例1中描述的步骤。
通过抗人GDF-15抗体的表面等离子共振竞争性结合实验，可以类似地评估与人GDF-15上相同表位的结合，其中所述抗人GDF-15抗体可以从细胞系B1-23中获得，并且所述抗体可望结合人GDF-15的相同表位，因为该抗人GDF-15抗体是从细胞系B1-23所得。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变域包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变域包含如SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变域包含如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含如SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含如SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且轻链可变域包含如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或与其有至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体或其抗原结合部分，其能够与本发明中任何一种能够结合人GDF的抗体竞争性结合人GDF-15，优选结合重组的人GDF-15。
在一个非常优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是人源化单克隆抗体或其抗原结合部分。对于本发明中任何给定的非人抗体序列(即供体抗体序列)，本发明中人源化的单克隆抗人GDF-15的抗体或其抗原结合部分可以根据本发明中本领域已知的技术产生，如上所述。
在一个非常优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是与人GDF-15上的构象表位或不连续的表位结合，并且所述构象表位或不连续的表位由SEQ ID No：25和SEQ ID No：26所示的氨基酸序列组成。在该实施方案的优选方面，抗体或其抗原结合部分是由上述任一实施方案的序列所定义的抗体或抗原其结合部分。
能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分可以与药物连接。在该实施方案的非限制性方面，药物可以是已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。已知的抗癌剂包括烷化剂如顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和异环磷酰胺；抗代谢物如硫唑嘌呤和巯嘌呤；生物碱如长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛)、紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛)、依托泊苷和替尼泊苷；拓扑异构酶抑制剂如喜树碱(例如伊立替康和托泊替康)；细胞毒性抗生素如放线菌素、蒽环类抗生素、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、博来霉素、光神霉素和丝裂霉素；和放射性同位素。
在依据上述实施方案的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分被氨基酸标签修饰。这种标签的非限制性实例包括聚组氨酸(His-)标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、糖蛋白D(gD)标签和c-myc标签。标签可以用于各种目的。例如，它们可以用于辅助纯化能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分。较佳地，此类标签存在于能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分的C端或N端。
本发明中使用的免疫检查点阻断剂
癌细胞携带着基因组突变，这些突变产生的癌细胞抗原是癌细胞特有的，与非癌细胞的抗原不同。因此，未被抑制的完整的免疫系统应识别这些癌细胞抗原，从而引发针对这些抗原的免疫应答。然而，大多数癌症已经形成针对这些抗原的免疫耐受机制。癌细胞实现这种免疫耐受的其中一类机制是利用免疫检查点。如本发明所用的“免疫检查点”通常意指可以抑制免疫应答的免疫机制。更具体地说，免疫检查点是一种特征在于免疫系统分子(或一组免疫系统分子)通过抑制免疫系统细胞的活化来抑制免疫应答的机制。这种通过抑制免疫系统细胞的活化而抑制免疫应答的免疫系统分子(或分子组)也称为检查点分子。
如本发明所用，“免疫检查点阻断剂”是能够阻断免疫检查点的分子。虽然可以理解为本发明中使用的hGDF-15抑制剂对免疫系统有影响，包括对CD8+T细胞的影响，但本发明使用的术语“免疫检查点阻断剂”并不是指hGDF-15抑制剂，而是指一种不同于hGDF-15抑制剂的分子。
目前已知的最常见的免疫检查点阻断剂是免疫检查点分子的抑制剂，例如人PD-1抑制剂和人PD-L1抑制剂。其他免疫检查点阻断剂包括抗LAG-3、抗B7H3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT、抗KIR、抗CD27、抗CD137以及IDO的抑制剂。因此，如本发明所使用的，免疫检查点阻断剂优选的形式是免疫检查点分子的抑制剂。或者，免疫检查点阻断剂可以是无视免疫检查点的共刺激信号的激活剂。
免疫检查点阻断剂效力的检测方法包括体外结合分析、基于初始T细胞的细胞因子释放分析和体内模型系统。另外，Promega现在开发了一种用于PD-1/PD-L1的商业上可用的生物发光报道系统，例如Mei Cong博士等人在Advertorial:Novel Bioassay to AssessPD-1/PD-L1Therapeutic Antibodies in Development for ImmunotherapyBioluminescent Reporter-Based PD-1/PD-L1Blockade Bioassay中所提及的(http://www.genengnews.com/gen-articles/advertorial-novel-bioassay-to-assess-pd-1-pd-l1-therapeutic-antibodies-in-development-for-immun/5511/)。
较佳地，免疫检查点阻断剂是人PD-1抑制剂和人PD-L1抑制剂。在本发明中所有实施方案的其中一个优选实施方案中，免疫检查点阻断剂不是人CTLA4的抑制剂。
如本发明所用，“人PD-1抑制剂”可以是能够特异性抑制人PD-1功能的任何分子。这种分子的非限制性实例是能够结合人PD-1的抗体和能够结合人PD-1的DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)。较佳地，本发明中使用的PD-1抑制剂是能够结合人PD-1的抗体，更佳地是能够结合人PD-1的单克隆抗体。最佳地，能够结合人PD-1的单克隆抗体是选自由纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)和AMP-224组成的组。
如本发明所用，“人PD-L1的抑制剂”可以是能够特异性抑制人PD-L1的功能的任何分子。这种分子的非限制性实例是能够结合人PD-L1的抗体和能够结合人PD-L1的DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)。较佳地，本发明中使用的人PD-L1抑制剂是能够结合人PD-L1的抗体，更佳地是能够结合人PD-L1的单克隆抗体。最佳地，能够结合人PD-L1的单克隆抗体是选自由BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736和MSB0010718C组成的组。
方法和技术
通常地，除本发明另有定义外，本发明中使用的方法(例如克隆方法或涉及抗体的方法)是根据本领域已知的步骤进行的，例如Sambrook等人在“Molecular Cloning:ALaboratory Manual.”,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York 1989中的描述、Ausubel等人在“Current Protocols in MolecularBiology.”Greene Publishing Associates and Wiley Interscience；New York 1992中的描述和Harlow和Lane在“Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1988中的描述的步骤，在此全部通过引用并入本发明。
抗体与其各自靶蛋白的结合可以通过本领域已知的方法来评估。单克隆抗体与其各自靶蛋白的结合优选通过表面等离子共振检测来评估。这些检测优选通过使用BioradProteOn XPR36系统和Biorad GLC传感器芯片来进行，如参考实施例1中抗人GDF-15单抗B1-23的示例。
本发明中序列的比对是通过使用BLAST算法来进行的(参见Altschul et al.(1990)“Basic local alignment search tool.”Journal of Molecular Biology215.p.403-410；Altschul et al.:(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。较佳地，使用以下参数：最多目标序列条数为10；字体大小为3；BLOSUM 62矩阵；空位罚分：存在空位扣11分，每个延伸扣1分；组成调整选择参数“条件的组成分数矩阵调整(conditional compositional score matrix adjustment)”。因此，当与序列一起使用时，诸如“同一性”或“相同的”的术语是指通过使用BLAST算法获得的同一性数值。
本发明中单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于SiegelDL在“Recombinant monoclonal antibody technology.”Transfus Clin Biol.2002Jan；9(1):15-22中提及的方法。在一个实施方案中，本发明中的抗体由杂交瘤细胞系B1-23生产，根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系B1-23以保藏号DSM ACC3142保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。该保藏于2011年9月29日提交。
细胞增殖可以通过本领域已知的合适方法进行分析，包括(但不限于)显微镜视觉分析、代谢分析如测量线粒体氧化还原电位的代谢分析法(例如MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)测定；刃天青染色，也称为Alamar实验)、已知内源性增殖生物标志物(例如Ki-67)的染色和测量细胞DNA合成的方法(例如BrdU和[3H]-胸苷掺入实验)。
人GDF-15(hGDF-15)的水平可以通过本领域已知的任何方法来测量，包括通过包括(但不限于)质谱的方法检测衍生自人GDF-15的蛋白质或肽，使用特异性结合人GDF-15的抗体进行蛋白质印迹分析，使用特异性结合人GDF-15的抗体进行流式细胞分析，使用特异性结合人GDF-15的抗体进行试纸检测分析，或特异性结合人GDF-15的抗体进行免疫细胞化学分析来测量hGDF-15蛋白质的水平。检测hGDF-15血清水平的优选方法是使用针对GDF-15的抗体通过酶联免疫吸附分析(ELISA)检测hGDF-15血清水平。此类ELISA方法在实施例1中有举例说明。或者，hGDF-15血清水平可以通过使用针对GDF-15的抗体的已知的电化学发光免疫分析来确定。例如，罗氏技术可用于此类电化学发光免疫分析。
本发明中组合物的制备
本发明中的组合物根据已知的制备药物组合物的标准进行制备。
例如，组合物以可以适当储存和施用的方式，例如通过使用药学上可接受的组分如载体、赋形剂或稳定剂来进行制备。
在向患者施用药物组合物时，这些药学上可接受的组分的用量是无毒的。加入到药物组合物中的药学上可接受的组分可取决于组合物中存在的抑制剂的化学性质(例如取决于抑制剂是抗体、siRNA发夹构建体还是短干扰RNA)、药物组合物的特定预期的用途和施用的方式。
一般而言，与本发明结合使用的药学上可接受的组分是根据本领域可用的公知常识进行使用的，例如来自Remington's Pharmaceutical Sciences,Ed.AR Gennaro,20thedition,2000,Williams&Wilkins,PA,USA中的内容。
治疗方法和用于这些方法的产品
本发明涉及用于如上定义的hGDF-15抑制剂的应用。
此外，依据这些hGDF-15抑制剂及其用途，本发明还涉及相应的治疗方法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于增加人类患者实体癌中CD8+T细胞百分比的方法，所述方法包括向人类患者施用hGDF-15抑制剂的步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及人类患者中使用免疫检查点阻断剂治疗实体癌的方法，所述方法包括向人类患者施用hGDF-15抑制剂的步骤和向人类患者施用免疫检查点阻断剂的步骤。
这些方法的优选实施方案如上文对本发明hGDF-15抑制剂的应用所定义。
在上述方法的另一个实施方案中，hGDF-15抑制剂的应用、试剂盒、组合物或组合物的应用中，所述hGDF-15抑制剂是对癌症具有药学活性的唯一成分。
在上述方法的另一个实施方案中，hGDF-15抑制剂的应用、试剂盒、组合物或组合物的应用中，hGDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂是对癌症具有药学活性的唯一成分。
在上述方法的一个替代实施方案中，hGDF-15抑制剂的应用、试剂盒、联合、组合物或组合物的应用中，所述hGDF-15抑制剂与一种或多种药学上对癌症有活性的其他成分联合使用。在该实施方案的一个方面中，一种或多种其他的抗癌症药物活性成分是已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。已知的抗癌剂包括但不限于烷化剂如顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和异环磷酰胺；抗代谢物如硫唑嘌呤和巯嘌呤；生物碱如长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛)、紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛)、依托泊苷和替尼泊苷；拓扑异构酶抑制剂如喜树碱(例如伊立替康和托泊替康)；细胞毒性抗生素如放线菌素、蒽环类抗生素、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星、博来霉素、光神霉素和丝裂霉素；和放射性同位素。特别优选与hGDF-15抑制剂联合使用的抗癌症药物活性以下成分：免疫刺激分子包括抗LAG-3、抗B7H3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT、抗KIR、抗CD27、抗CD137、抗Ox40、抗4-1BB、抗GITR、抗CD28、抗CD40或IDO抑制剂。此外，其他抗体治疗如抗Her2、抗EGFR、抗紧密连接蛋白或其糖优化的后继产物也是特别优选的，因为它们将得益于与hGDF-15抑制剂的联合使用，例如hGDF-15抑制剂引起的实体癌中免疫细胞浸润增加。同样地，疫苗接种方法(例如用肽或树突细胞)或过继性细胞疗法、肿瘤反应性T细胞或树突细胞也是特别优选的，因为它们将得益于与hGDF-15抑制剂的联合使用。此外，以下处理也是特别优选的，因为它们将与hGDF-15抑制剂协同作用：
·利用对肿瘤和免疫细胞具有一种或多种特异性的抗体或抗体样分子的治疗[例如Bites、药物亲和靶标稳定性(DARTS)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPINS)、卡妥索单抗(Catumaxomab)]；
·利用针对肿瘤相关肽的基于疫苗的免疫疗法的治疗，例如用多肽疫苗如IMA901、ISA203或用基于RNA的疫苗(例如CV9104)，和/或
·利用免疫细胞活化物质的治疗(例如激活巨噬细胞的FAA衍生物，或用于Toll样受体的配体，如SLP-AMPLIVANT缀合物)。
本发明中的联合应用
本发明包括hGDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合在治疗人类患者实体癌的方法中的应用，其中将hGDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂施用于人类患者。这些组合及其优选实施例如上所定义。
hGDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合可以一起施用或分开施用。
例如，在一个优选的实施方案中，hGDF-15抑制剂的施用是在免疫检查点阻断剂开始施用之前进行。该设定有利地允许实体癌中T细胞百分比的增加，特别是CD8+T细胞百分比的增加，实体癌中CD8+T细胞起始百分比的增加可以使得后续利用免疫检查点阻断剂的治疗更有效。
试剂盒
本发明还提供了包含如上定义的hGDF-15抑制剂和至少一种免疫检查点阻断剂的试剂盒。
hGDF-15抑制剂和一种或多种或全部免疫检查点阻断剂可以被容纳在分开的容器中或单个容器中。
所使用的容器可以是适合于储存hGDF-15抑制剂和/或至少一种免疫关卡阻断剂的任何类型的容器。这种容器的非限制性例子是小瓶子和预填充的注射器。
除hGDF-15抑制剂和至少一种免疫检查点阻断剂之外，试剂盒还可以包含其他治疗剂。例如，试剂盒可以包含一种或多种抗癌药物活性的其他成分。一种或多种抗癌药物活性的其他成分可以如上所定义。这些抗癌药物活性的其他成分可与hGDF-15抑制剂和至少一种免疫检查点阻断剂一起用于本发明的方法中。
较佳地，本发明的试剂盒还包含使用说明书。
序列
本申请中提及的氨基酸序列如下(以N端至C端的顺序；以单字母氨基酸密码表示)：
SEQ ID No:1(重链可变区的区域，其包含来自单克隆抗人GDF-15单抗B1-23多肽序列的FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3区域)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC
SEQ ID No:2(轻链可变区的区域，其包含来自单克隆抗人GDF-15单抗B1-23多肽序列的FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3区域)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
SEQ ID No:3(单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的重链CDR1区的多肽序列)：
GFSLSTSGMG
SEQ ID No:4(单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的重链CDR2区的多肽序列)：
IYWDDDK
SEQ ID No:5(单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的重链CDR3区的多肽序列)：
ARSSYGAMDY
SEQ ID No:6(单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的轻链CDR1区的多肽序列)：
QNVGTN
单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的轻链CDR2区的多肽序列
SAS
SEQ ID No:7(单克隆抗人GDF-15单抗B1-23的轻链CDR3区的多肽序列)：
QQYNNFPYT
SEQ ID No:8(重组成熟的人GDF-15蛋白)：
GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
SEQ ID No:9(人GDF-15前体蛋白)：
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
SEQ ID No:10(人GDF-15前体蛋白+GSGS连接子的N端和C端)：
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG
SEQ ID No:11(Flag肽)：DYKDDDDKGG
SEQ ID No:12(HA肽)：YPYDVPDYAG
SEQ ID No:13(衍生自人GDF-15的肽)：ELHLRPQAARGRR
SEQ ID No:14(衍生自人GDF-15的肽)：LHLRPQAARGRRR
SEQ ID No:15(衍生自人GDF-15的肽)：HLRPQAARGRRRA
SEQ ID No:16(衍生自人GDF-15的肽)：LRPQAARGRRRAR
SEQ ID No:17(衍生自人GDF-15的肽)：RPQAARGRRRARA
SEQ ID No:18(衍生自人GDF-15的肽)：PQAARGRRRARAR
SEQ ID No:19(衍生自人GDF-15的肽)：QAARGRRRARARN
SEQ ID No:20(衍生自人GDF-15的肽)：MHAQIKTSLHRLK
SEQ ID No:25(包含结合B1-23的GDF-15部分表位的GDF-15肽)：
EVQVTMCIGACPSQFR
SEQ ID No:26(包含结合B1-23的GDF-15部分表位的GDF-15肽)：
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
本申请中提及的核酸序列如下(以5'至3'的顺序；根据标准的核酸编码表示)：
SEQ ID No:21(编码SEQ ID No：1中定义的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT
SEQ ID No:22(编码SEQ ID No：2中定义的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT
SEQ ID No:23(编码SEQ ID No：5中定义的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC
SEQ ID No:24(编码SEQ ID No：7中定义的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
其他的氨基酸序列如下(以N端至C端的顺序；以单字母氨基酸密码表示)：
SEQ ID No:27(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链的氨基酸序列)：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No:28(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTITKDPSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSSYGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No:29(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链恒定区的氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No:30(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No:31(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWFQQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAAYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID No:32(H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链恒定区的氨基酸序列)：
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No:33(嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链的氨基酸序列)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No:34(嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSSYGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No:35(嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链恒定区的氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No:36(嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链的氨基酸序列)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No:37(嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNFPYTFGGGTKLEIKRTVA
SEQ ID No:38(嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链恒定区的氨基酸序列)：
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID No:39(01G06抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQSLEWMGQINPNNGLIFFNQKFQGRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No:40(01G06抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENLHNYLAWYQQKPGKSPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSDPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID No:41(03G05抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVNQRPGQGLEWIGDINPSNGRSKYNEKFKNKATMTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVLDGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No:42(03G05抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGSKLEIK
SEQ ID No:43(04F08抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVTWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCAQTGYSNLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID No:44(04F08抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKLGQSPKTLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID No:45(06C11抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDASNNRVFLKITSVDTADTATYYCAQRGYDDYWGYWGQGTLVTISA
SEQ ID No:46(06C11抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFILTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID No:47(08G01抗体重链可变区的氨基酸序列)：
EVLLQQSGPEVVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGEINPNNGGTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCAREAITTVGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No:48(08G01抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSSPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID No:49(14F11抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLADIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSSNEVFLKIAIVDTADTATYYCARRGHYSAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID No:50(14F11抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSPSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPHTFGGGTKLEMK
SEQ ID No:51(17B11抗体重链可变区的氨基酸序列)：
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHNDWDDDKRYKSSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRVGGLEGYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID No:52(17B11抗体轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSRFSYMHWFQQKPGQAPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK
参考实施例1至3举例说明可用于本发明所述的组合物、试剂盒、方法和用途的hGDF-15抑制剂。该hGDF-15抑制剂是从WO 2014/049087中已知的单克隆抗体，在此通过引用整体并入本文：
参考实施例1：GDF-15抗体B1-23的产生和表征
抗体B1-23在GDF-15敲除小鼠中产生。使用重组人GDF-15(SEQ ID No：8)作为免疫原。
产生mAb-B1-23的杂交瘤细胞系B1-23根据布达佩斯条约，由地址在德国维尔茨堡桑德灵路2号，邮编为97070的德国尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学在德国微生物菌种保藏中心(DMSZ)保藏，保藏号DSM ACC3142。
通过市售测试条系统，B1-23被鉴定为IgG2a(κ链)同种型。使用表面等离子体共振测量，如下确定解离常数(Kd)：
根据本发明的单克隆抗人GDF-15抗体抗人GDF-15mAb-B1-23的结合，通过使用Biorad ProteOn XPR36系统和Biorad GLC传感器芯片采用表面等离子共振测量来测量：
为制备生物传感器，将重组成熟人GDF-15蛋白质固定在流动池1和2上。在一个流动池中使用了来自杆状病毒转染的昆虫细胞(HighFive昆虫细胞)的重组GDF-15，另一流动池中使用了来源于大肠杆菌表达的重组蛋白。根据制造商的推荐，使用Sulfo-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)(BioradProteOn胺偶联试剂盒)活化GLC传感器芯片，随后传感器表面装载蛋白质至密度约为600RU(1Ru＝1pg mm-2)。然后通过用1M乙醇胺pH 8.5灌注猝灭未反应的偶联基团，并通过用流动缓冲液(10M HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween-20，pH 7.4，称为HBS150)灌注芯片来平衡生物传感器。两个流动池作为对照使用，一个是空的，没有偶联蛋白质，一个偶联有非生理蛋白质伴侣(人白细胞介素-5)，其使用相同的偶联化学和相同的偶联密度固定化。对于相互作用测量，将抗人GDF-15mAb-B1-23溶解于HBS150中并配成六种不同浓度作为分析物(浓度：0.4、0.8、3、12、49和98nM)。使用一次性动力学设置，将分析物灌注在生物传感器上以避免间歇再生，所有测量均在25℃下进行并使用100μl min-1的流速进行。通过从所有其他SPR数据中减去空流动池(流动池3)的SPR数据，来去除大量的表面效应(bulkface effect)和对传感器矩阵的非特异性结合。使用软件ProteOn Manager版本3.0分析得到的传感图。为了分析结合动力学，假定了1:1Langmuir型相互作用。对于结合速率常数，可以确定5.4±0.06×105M-1s-1(kon)的值，并且对于解离速率常数，可以确定4.3±0.03×10- 4s-1(koff)的值(这些值为衍生自昆虫细胞表达的GDF-15与抗人GDF-15mAb-B1-23的相互作用)。使用公式KD＝koff/kon计算平衡解离常数，得到约790pM的值。衍生自大肠杆菌表达的GDF-15与抗人GDF-15mAb-B1-23的相互作用的亲和力值相差小于2倍，衍生自昆虫细胞和大肠杆菌的GDF-15的速率常数偏离约45％，因此在SPR测量的准确度内，并且可能不会反映亲和力的实际差异。在使用抗人GDF-15mAb-B1-23时，显示其不与人白细胞介素-5结合，从而证实了相互作用数据和抗人GDF-15mAb-B1-23的特异性。
重组人GDF-15(如在杆状病毒转染的昆虫细胞中表达的)的氨基酸序列是：
GSARNGDHCP LGPGRCCRLH TVRASLEDLG WADWVLSPRE VQVTMCIGAC PSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCC VPASYNPMVL IQKTDTGVSL QTYDDLLAKD CHCI
(SEQ ID No：8)
因此，使用表面等离子体共振测量，测得了790pM的解离常数(Kd)。作为比较：治疗性使用的抗体利妥昔单抗具有显着较低的亲和力(Kd＝8nM)。
先前显示mAb B1-23体外抑制癌细胞增殖，并且mAb B1-23体内抑制肿瘤的生长(WO2014/049087)。
参考实施例2：mAb B1-23识别人GDF-15的构象表位或不连续表位
表位作图：针对来自GDF-15的13聚线性多肽的单克隆小鼠抗体GDF-15
抗原：GDF-15：
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG(322个氨基酸，包括接头)(SEQ ID NO：10)
该蛋白质序列被翻译成具有一个氨基酸位移的13聚多肽。通过中性GSGS连接子(粗体字母所示)延长C-和N-末端以避免截短的肽。
对照肽：
Flag：DYKDDDDKGG(SEQ ID No：13)，78个点；HA：YPYDVPDYAG(SEQ ID No：14)，78个点(每个阵列拷贝)
肽芯片标识符：
000264_01(10/90，Ala2Asp接头)
染色条件：
标准缓冲液：PBS，pH 7.4+0.05％吐温20
阻断缓冲液：Rockland阻断缓冲液MB-070
培养缓冲液：含10％Rockland阻断缓冲液MB-070的标准缓冲液
初始样品：小鼠单克隆抗体GDF-15(1μg/μl)：在孵育缓冲液中于4℃以1：100的稀释度染色16小时并以500rpm轻微振荡
第二抗体：山羊抗小鼠IgG(H+L)IRDye680，在1:5000稀释的孵育缓冲液中在室温(RT)下染色30分钟，
对照抗体：单克隆抗HA(12CA5)-LL-Atto 680(1：1000)，单克隆抗FLAG(M2)-FluoProbes752(1：1000)；在室温下培养缓冲液中孵育1小时
扫描器：
奥德赛(Odyssey)成像系统，LI-COR生物科学
设置：偏移量：1mm；分辨率：21微米；强度绿色/红色：7/7
结果：
在标准缓冲液中预溶胀30分钟并在封闭缓冲液中预溶胀30分钟后，将含有10、12和15聚体B7H3衍生的线性肽的肽阵列与二级山羊抗小鼠IgG(H+L)IRDye680抗体仅以1:5000稀释度在室温下孵育1小时以分析二抗的背景相互作用。用标准缓冲液将洗涤2×1分钟，用蒸馏水冲洗并在空气流中干燥。用奥德赛成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿色/红色强度读出数值：我们观察到，由于与带电抗体染料的离子相互作用，在已知的电荷结合剂即富含精氨酸的肽(ELHLRPQAARGRR(SEQ ID No:15)，LHLRPQAARGRRR(SEQ ID No:16)，HLRPQAARGRRRA(SEQ ID No:17)，LRPQAARGRRRAR(SEQ IDNo:18)，RPQAARGRRRARA(SEQ ID No:19)，PQAARGRRRARAR(SEQ ID No:20)以及QAARGRRRARARN(SEQ ID No:21))与碱性肽MHAQIKTSLHRLK(SEQ ID No：22)之间有弱的结合。
在标准缓冲液中预溶胀10分钟后，将肽微阵列在4℃与小鼠单克隆抗体GDF-15以1:100稀释度温育过夜。在标准缓冲液中重复洗涤(2×1分钟)，然后在室温下用稀释1:5000的二抗温育30分钟。2×10秒后，用标准缓冲液清洗并用蒸馏水冲洗，在空气流中干燥。用抗HA和抗FLAG(M2)抗体染色对照肽之前和之后，用奥德赛成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿/红色强度读出数值。
结果表明，即使在过度调节的强度下，衍生自GDF-15的13聚线性多肽也不与小鼠单克隆抗体GDF-15相互作用。然而，Flag和HA对照肽的染色构成阵列，产生良好且均匀的斑点强度。
总结：
抗GDF-15的单克隆小鼠GDF-15抗体的表位作图没有显示衍生自抗原的13聚多肽的任何线性表位。根据这一发现，小鼠单克隆抗体GDF-15很可能识别具有低亲和力的部分表位的构象或不连续表位。由于在二次抗体背景染色之上明显不存在任何GDF-15信号，所以省略了用PepSlide分析仪和随后的肽注释来量化斑点强度。
参考实施例3：通过质谱表位切除和表位提取对肽配体表位进行结构鉴定
通过表位切除法和表位提取法(Suckau等，Proc Natl Acad Sci U SA.1990December；87(24)：9848-9852；R.Stefanescu等，Eur.J.Mass Spectrom.13,69-75(2007))鉴定与抗体B1-23结合的重组人GDF-15的表位。
为了制备抗体柱，将抗体B1-23加入到NHS活化的6-氨基己酸偶联的琼脂糖凝胶中。然后将琼脂糖偶联抗体B1-23加载到0.8ml微柱中并用封闭和洗涤缓冲液洗涤。
表位提取实验：
用胰蛋白酶在37℃(溶液)中将重组人GDF-15消化2小时，根据蛋白质中的胰蛋白酶切割位点产生不同的肽。完全消化后，将肽加载到含有固定化抗体B1-23的亲和柱上。未结合以及可能结合的GDF-15肽用于质谱分析。通过质谱鉴定肽是不可能的。这进一步表明免疫复合物B1-23中GDF-15的结合区域包含不连续或构象表位。在连续的线性表位的情况下，除非在表位肽中存在胰蛋白酶切割位点，否则消化的肽应该结合其相互作用伴侣。不连续或构象表位可以通过下面描述的表位切除方法证实。
表位切除实验：
接着将亲和柱上的固定化抗体B1-23与重组GDF-15孵育2小时。然后将亲和柱上形成的免疫复合物与胰蛋白酶在37℃下孵育2小时。切割产生来自重组GDF-15的不同肽。固定化的抗体本身是蛋白水解稳定的。在酸性条件下(TFA，pH2)洗脱得到经消化的GDF-15蛋白的肽，所述肽由抗体屏蔽并因此被保护免受蛋白水解切割，收集并通过质谱鉴定。
使用MS/MS鉴定的表位切除方法产生以下肽：
结合抗体B1-23的人GDF-15的部分包含不连续或构象表位。质谱法鉴定了GDF-15蛋白质中的2个肽，其负责形成免疫复合物。这些肽限于GDF-15氨基酸序列中的位置40-55(EVQVTMCIGACPSQFR)和94-114(TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI)。因此，这两种肽包含结合抗体B1-23的GDF-15蛋白的表位。
通过以下非限制性实施例说明本发明：
实施例1：在先前接受用伊匹单抗(Ipilimumab，单克隆抗-CTLA4抗体)治疗并且未显示完全应答的人黑素瘤患者中，采用派姆单抗(Pembrolizumab，单克隆抗PD-1抗体)继续治疗，在开始用派姆单抗治疗后4个月的时间点，hGDF-15血清水平与不良治
疗反应相关。
本发明人着手研究接受免疫检查点阻断剂的癌症患者是否可受益于hGDF-15的抑制。为了测试这种可能性，在临床研究中，用黑素瘤患者的血清分析了hGDF-15的血清水平，所述黑素瘤患者先前接受了伊匹单抗(单克隆抗-CTLA4抗体)治疗，且又接受了派姆单抗(单克隆抗PD-1抗体)治疗。为了研究hGDF-15是否影响患者对免疫检查点阻滞剂的反应，将获得的hGDF-15血清水平与患者的反应相关联。在用派姆单抗治疗之前从患者中取血清。
该研究和随后的分析如下进行：
临床研究的纳入标准：
符合条件的患者年龄在18岁或以上，并且组织学或细胞学证实为不可切除的III期或IV期黑素瘤，不适合进行局部治疗；在最后一次伊匹单抗剂量(最少两次剂量，每3周一次3mg/kg)的24周内确定疾病进展；以前用BRAF或MEK抑制剂或两者同时进行治疗(如果BRAFV600突变阳性)；将伊匹单抗相关不良事件缓解或改善为0-1级，在施用第一剂研究药物前施用泼尼松龙至少2周，剂量为10mg/天或更少；东部肿瘤协作组(ECOG)的表现状态为0或1；根据实体肿瘤应答评估标准1.1版(RECIST v1.1)的可测量疾病；中性粒细胞绝对值在预先规定的数值范围内(≥1500个细胞/mL)，血小板(≥100000个细胞/mL)，血红蛋白(≥90g/L)，血清肌酐(≤1.5正常上限[ULN])，血清总胆红素(≤1.5ULN或直接胆红素≤ULN，用于总胆红素浓度>1.5ULN的患者)，天门冬氨酸和丙氨酸转氨酶(肝转移患者≤2.5ULN或≤5ULN)，国际标准化比值或凝血酶原时间(如果不使用抗凝剂，≤1.5ULN)和活化部分凝血活酶时间(如果不使用抗凝剂，≤1.5ULN)。患者在最近一次治疗的最后一次剂量与第一剂派姆单抗的剂量之间有至少4周的清洗期。具有已知活动性脑转移或癌性脑膜炎、活动性自身免疫性疾病、需要全身治疗的活动性感染、已知的HIV感染史、活动性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，持续时间超过12周的4级伊匹单抗相关不良事件史或3级伊匹单抗相关不良事件史或先前使用任何其他抗PD-1或抗PD-L1治疗的治疗被排除在研究之外。
患者的治疗：
符合上述定义的纳入标准的人类黑色素瘤患者已经(除两例外)接受了伊匹单抗(一种单克隆抗CTLA4抗体)的治疗，但未能显示完全应答。派姆单抗(单克隆抗PD-1抗体)以2mg/kg体重或10mg/kg体重施用。由于在两个治疗组之间未观察到剂量依赖性差异，因此对治疗后的患者进行了联合评估。
应答的标准：
通过使用实体瘤中的反应评估标准版本1.1(RECIST v1.1)(Eisenhauer等：Newresponse evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1.1).In:Eur.J.Cancer.45,No.2,January 2009,pp 228–47)对治疗的应答者和非应答者以及正在进行的应答进行分类。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析hGDF-15血清水平：
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量人GDF-15血清水平。
缓冲液和试剂：
缓冲封闭溶液：在PBS中的1％BSA(级分V pH 7.0，PAA)
洗涤液：PBS-Tween(0.05％)
标准：人GDF-15(储存浓度120μg/ml，来自R&D Systems)
捕获抗体：来自R&D Systems的人GDF-15MAb(克隆147627)，小鼠IgG2B(来自R&DSystems，目录号MAB957，库存浓度360μg/ml)
检测抗体：人GDF-15生物素化亲和纯化PAb山羊IgG(来自R&D Systems，目录号BAF940，库存浓度9μl/ml)
链霉抗生物素蛋白-HRP(来自R&D Systems，目录号DY998)
底物溶液：10ml 0.1M NaOAc pH6.0+100μlTMB+2μl H2O2
终止溶液：1M H2SO4
分析程序：
1.板的准备：
a.将捕获抗体稀释至PBS中2μg/ml的工作浓度。立即用每孔50μl除外排(A和H)的稀释捕获抗体包被96孔微量培养板(Nunc maxisorp)。A和H行填充缓冲液以防止实验期间样品的蒸发。轻轻敲击板以确保每个孔的底部被完全覆盖。将板置于潮湿的室中并在室温(RT)温育过夜。
b.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
c.向每个孔中加入150μl封闭溶液，然后在RT下温育1小时。
d.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
2、测定程序：
a.准备标准品。将GDF-15在缓冲封闭溶液中稀释至终浓度为1ng/ml(4.17μlGDF+496μl缓冲封闭液)。进行1:2连续稀释。
b.制备1:20重复样品(6μl+114μl缓冲封闭液)。
c.每孔加入50μl稀释的样品或标准品，然后在室温孵育1小时。
a.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
b.将检测抗体稀释至终浓度为50ng/ml(56μl+10ml封闭缓冲液)。向每个孔中加入50μl稀释的检测抗体，随后在室温孵育1小时。
c.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
d.链霉亲和素-HRP按1：200稀释(50μl+10ml封闭缓冲液)。将50μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液加入到每个孔中，然后在室温孵育20分钟。
e.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
f.制备底物溶液。向每个孔中加入50μL底物溶液，随后在室温孵育20分钟。
g.每孔加入50μL终止液。
h.使用设置为450nm的酶标仪立即测定每个孔中的光密度。
3、GDF-15血清效价的计算：
a.每个样品/GDF-15标准稀释液均一式两份制备。为了确定GDF-15的效价，计算重复的平均值并减去背景(不含GDF-15的样品)。
b.为了创建标准曲线，在X-Y图上绘制线性范围内的值(X轴：GDF-15浓度，Y轴：OD450)，并且进行线性曲线拟合。通过内插算法从已知浓度的标准稀释液的OD450值来计算测试样品中GDF-15的血清效价。
c.为了计算样品中最终的GDF-15浓度，考虑了不同的稀释因子。在适当的稀释度下重新分析产生低于或高于标准范围的OD值的样品。
hGDF-15血清水平与患者数据的比较：
接着，将测量的hGDF-15血清水平与从研究中获得的患者应答数据进行比较。
图1显示治疗方案的应答者和无应答者中GDF-15血清水平。从图中可以看出，大多数无应答者中GDF-15的血清水平高于所有的应答者。
该结果也反映在图2中，其显示了患者中hGDF-15的血清水平分别<1.8ng/ml、1.8-4.2ng/ml和>4.2ng/ml的应答者和无应答者的数目。
这些发现表明了高的GDF-15水平与治疗应答低下有关。因此，对这些发现进行了统计学检验：
hGDF-15血清水平与患者数据的统计学相关性：
数据：
数据分析基于一个包含来自35名患者样本的数据文件，其包含列(变量)、样本名称、GDF-15(ng/ml)、应答者/无应答者、天数(死亡或被删减的[censoring])和持续时间(持续生活时间的指数变量)。这些数据的应答者/无应答者分类是在派姆单抗治疗开始后四个月的时间点进行的。由于一些血清样品仅在分析前不久获得，所以只能对29名患者进行应答的评估。一名部分应答者(肿瘤大小减少>30％)被评为应答者。对于LDH的测定，4个样品由于溶血而被排除。
结果变量(终点)：
a.总体生存(死亡时间)。该终点由来自所述数据文件的死亡事件指标(1＝死亡/0＝存活)，和对应于变量“天”的死亡或被删减的时间(上次知道患者还活着)组成。
b.对治疗的应答，例如无论患者是否为应答者(编码为1＝应答者，0＝无应答者)。部分应答者被视为应答者。
数据分析：
总体生存率通过使用Cox比例风险生存模型进行分析。其中一个模型使用GDF-15(ng/ml)作为连续预测因子，另一个模型使用基于GDF-15的分组变量作为分类预测因子(组别分别为<1.8ng/ml、1.8-4.2ng/ml、>4.2ng/ml的GDF-15)。总而言之，从35名患者获得了存活数据。
通过广义线性模型(GLM)中的二项误差分布和对数连接函数(逻辑回归)对治疗的应答(二元变量)进行分析。对于用RECIST1.1标准评价的治疗应答，4个月后，用GDF-15(ng/ml)作为连续预测因子拟合出了一个模型。由于患者的应答没有落在GDF-15>4.2ng/ml组，所以该组与GDF-15<1.8ng/ml组的比值比估计非常大，置信区间非常宽。不用基于GDF-15的分组变量作为分类预测因子拟合另一个模型，而是用卡方检验(χ2)对各组进行比较(测试应答者比例的相等)。由于应答者/无应答者的数量有时相当小(<5)，因此还使用Fisher精确检验进行灵敏度分析。在过去4个月内仅接受过抗PD-1治疗的患者尚不能归类为应答者或无应答者。因此，只有29名患者可以用来评估对治疗的应答。
通过使用统计软件包R(R Core Team,2014,version 3.1.0)进行数据分析。
结果：
表1-2显示以了GDF-15作为连续预测因子的模型结果。如比值比(OR)所示(OR<1，表2)，对于较高浓度的GDF-15，死亡危险显著增加(HR>1，表1)，而对治疗应答的可能性显著降低。图3显示了应答者/无应答者的相应数据以及模型预测的对治疗应答的或然性。
表3显示了基于GDF-15作为分类预测因子的Cox比例风险模型的结果。使用GDF-15<1.8ng/ml的组作为参考组(未在表中示出)。表3中的两个风险比代表GDF-15在1.8和4.2之间的组和参照组的比较，以及GDF-15>4.2的组和参照组之间的比较。这两组患者的死亡风险均有所增加(与参照组相比)，但GDF-15>4.2组的风险更大。图4显示了三组中存活率的Kaplan-Meier曲线。
应答者在各组间差异显著(应答者1：χ2 df＝2＝16.04，P＝0.0003)。Fisher精确检验的结果证实(P＝0.0003)了这一结果。表4给出了每组的死亡人数和应答人数。此外，表5显示了每组GDF-15的一些描述性统计数据。
表1：
表1显示了来自Cox比例风险模型的风险比(HR)估计值，其中总体存活(死亡时间)作为结果变量和GDF-15作为连续预测因子。该分析包括35名患者的样本。
表2：
表2显示了广义线性模型的比值比(OR)估计值，其中对治疗的应答(反应者1)作为结果变量和GDF-15作为连续预测因子。该分析包括29名患者的样本。
表3：
表3显示了来自Cox比例风险模型的风险比(HR)估计，其中总体存活(死亡时间)作为结果变量以及基于GDF-15的组作为分类预测因子。该分析包括35名患者的样本。
表4：
表4显示了由GDF-15定义的三组中死亡者和应答者(应答者1)的数量(<1.8、1.8-4.2、>4.2ng/ml)。
表5
表5：由GDF-15定义的三组中的连续预测变量GDF-15(ng/ml)(<1.8、1.8-4.2、>4.2ng/ml)。表中显示了患者数量(n)、中位数(x～)、平均值(x-)、标准差(s)、最小值(Min)和最大值(Max)。
接下来，为了比较获得的GDF-15水平的统计结果，进一步对患者血清中已知的预后因子乳酸脱氢酶(LDH)的水平进行了统计学分析：
乳酸脱氢酶被认为是实体瘤的预后相关标志物。最近的一项基于大量临床研究(31,857例患者)的综合元分析(comprehensive meta-analysis)证实了这一点。在所有疾病亚组和阶段中发现LDH升高对OS的一致作用(HR＝1.48，95％CI＝1.43-1.53)。此外，与非转移性疾病相比，LDH在转移性疾病中具有更强的预后价值，这被认为反映出更大的肿瘤负荷。虽然确切的机制仍然未知，并且还可能与通过沃伯格效应(Warburg effect)的缺氧和代谢重编程有关，但LDH可被解释为反映了高肿瘤负荷或肿瘤侵袭性(Zhang,J.,Yao,Y.-H.,Li,B.-G.,Yang,Q.,Zhang,P.-Y.,and Wang,H.-T.(2015).Prognostic value ofpretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors:a systematic review and meta-analysis.Scientific Reports 5,9800)。由于血清LDH水平已被纳入黑色素瘤的分期计划，该参数在大学参考实验室的临床诊断过程中是常规测量。
表6：
表6：应答者与无应答者中的GDF-15和LDH
由于溶血，4种血液样品中的LDH测定失败。
除了使用LDH作为对治疗(应答者1)的应答的连续预测因子，而不是GDF-15以外，表7与表2类似。随着LDH值的增加，对治疗应答的可能性略微地显著下降(OR<1，p<0.1)。图5显示了应答者/无应答者的相应数据以及模型预测的对治疗应答的可能性。
为了确定GDF-15是否是比LDH更好地对治疗应答(应答者1)的预测因子，我们拟合了另外两个模型：一个模型包含两个标记物作为预测因子(自动只包括测量两个标记物的患者)和以GDF-15作为唯一预测因子的模型，但也仅使用LDH测量的患者。然后，计算所有三个模型的赤池信息准则(Akaike’s information criterion,AIC)(表8)。较小的AIC表示更高效的模型。事实上，GDF-15模型的AIC小于以LDH为预测因子的模型的AIC。具有GDF-15模型的AIC甚至比具有两种预测因子的模型的AIC更小，表明LDH作为附加预测因子的无法改进模型。当然，这两种预测模型都不能解释对治疗的应答变得更差的原因，但作为“模型效率”的一种度量，AIC惩罚这些预测因子没有对模型做出明显的改进的模型，并倾向于较简单的模型。通过分析偏差(类似于方差分析，但用于广义线性模型)来完成替代模型的比较，即比较在具有两个预测因子的更复杂模型与仅具有一个预测因子的更简单模型之间解释的偏差的差异(相当于模型中LDH或GDF-15的减少)。从更复杂的模型中去除GDF-15导致了解释的偏差的显著降低(P＝0.02)，而去除LDH却没有此现象(P＝0.41)。
表7
表7：广义线性模型的比值比(OR)估计值，其中对治疗的应答(应答者1，如文件A中定义)作为结果变量和LDH作为连续预测因子。该分析包括来自25名患者的样品。
表8
表8：基于赤池信息准则(AIC)的模型比较，其中较小的值表示更有效的模型。df：自由度。所有模型均包括来自25位患者的样本
图5A显示了使用LDH作为连续预测因子的广义线性模型模型预测的对治疗应答(应答者1)的概率。圆圈显示数据，曲线显示模型。垂直线表示对治疗应答的概率为0.5时的LDH浓度。患者群体相同。然而，四名患者由于溶血导致LDH水平的可靠测定失败。图5B显示了应答者和无应答者及其各自的hGDF-15和LDH水平的示意图。选择截止值来覆盖所有应答者时，基于GDF-15的测试可以识别6个(共9个)无应答者，而基于LDH水平的分析只能区分4个(共9个)无应答者。对于LDH检测，必须排除4个导致数据丢失的溶血样本。
总结：
总而言之，实施例1的上述统计结果显示，随着患者血清中hGDF-15水平的增加，对治疗应答的可能性显著降低。例如，表2中显示的比值比0.389表明，如果hGDF-15血清水平增加1ng/ml，则对治疗应答的可能性降低至原始值的0.389倍，即减少约60％。如果hGDF-15血清水平增加2ng/ml，则对治疗应答的可能性降低至原始值的0.389×0.389倍＝0.151倍，即减少约85％。
实施例1的结果表明，hGDF-15对患者对用免疫检查点阻断剂治疗的应答有负面影响。因此，根据本发明，不仅在黑素瘤中，而且在本发明提及的所有实体癌症中，hGDF-15抑制剂可用于抑制hGDF-15对患者对用免疫关卡阻断剂治疗的应答的负面影响，并改善患者对用免疫检查点阻断剂治疗的应答。
实施例2：在不同肿瘤实体的转移中，GDF-15水平与CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)呈逆相关。
为了鉴定促成hGDF-15对患者应答的负面影响的hGDF-15的机制，分析来自不同实体肿瘤的脑转移中hGDF-15的表达和免疫系统中细胞的存在：
组织标本和组织处理：
分析福尔马林固定的和石蜡包埋(FFPE)的来自存档的脑转移瘤的组织，将其收集并处理作为组织微阵列(TMA)。所有标本均来自UCT肿瘤库(德国美因河畔法兰克福歌德大学、德国海德堡德国癌症协会(DKTK)会员、和德国海德堡德国癌症研究中心(DKFZ))或者癌症登记处肿瘤库“Blut-und Gewebebank zur Erforschung des malignen Melanoms”(德国蒂宾根大学医院皮肤肿瘤部门)。这项研究的批准由两个独立的道德委员会(德国美因河畔法兰克福歌德大学伦理委员会；项目编号：GS 4/09；SNO_01-12；蒂宾根大学伦理委员会项目编号：408/2013BO2)授予。研究共纳入190例脑转移瘤患者，包括：黑色素瘤(n＝98)、非小细胞肺癌(n＝33)、乳腺癌(n＝18)、肾细胞癌(RCC)(n＝10)、小细胞肺癌(n＝7)、结直肠癌(n＝7)、未另作说明的癌(NOS癌n＝11)和总结为其他的罕见肿瘤标本(n＝6)。收集155例患者的生存资料(肿瘤切除后的生存时间)，另外分析169例患者的脑转移瘤数目和55例黑色素瘤患者亚组的脑转移瘤大小。
免疫组化：
在自动IHC染色系统Discovery XT(Roche/Ventana，Tucson，Arizona，USA)上使用3μm厚的载玻片和标准方案进行所有抗体的免疫组织化学测定。使用以下抗体：抗GDF-15(HPA011191，1:50稀释，Sigma/Atlas，protocol#730)，CD3(克隆A0452，1:500稀释，DAKO，Glostrup，Denmark)，CD8(克隆C8/144B，1：100稀释，DAKO，Glostrup，Denmark)，PD-1(克隆NAT105；1:50稀释；Abcam，Cambridge，United Kingdom)，PD-L1(E1L3N；1:200稀释；CellSignaling，Boston，USA)，FOXP3(克隆236A/E7；1：100稀释；eBioscience，San Diego，USA)。载玻片用苏木精复染并安装。
统计分析：
根据染色TMA核心上与所有细胞相关的阳性细胞频率(以百分比)对所有样品进行评分。对于hGDF-15的表达，使用之前详细描述[21，22]的评分：频率0-1％得分0；1-10％得分1；10-25％得分2；25-50％得分3；>50％得分4；此外，将频率得分乘以染色强度(1弱染色，2中等染色，3强染色)，最终得到有序标度的hGDF-15得分(0、1、2、3、4、6、8、9、12)。有序标度的变量与非参数Wilcoxon/Kruskal-Wallis-Test和Dunn方法进行比较以校正多重检验。对于连续变量，使用ANOVA比较不同脑转移实体之间的平均值，然后进行Tukey-Kramer HSD事后检验。对于脑转移瘤大小和标记物表达的相关性分析，先进行线性拟合，然后进行ANOVA方差分析，对于有序标度的变量，使用Spearman's rho相关分析。所有统计分析均设置了p<0.05的显著性水平。
使用JMP8和JMP11(SAS，Cary，U.S.A)进行所有的统计分析，使用Prism 6(GraphPad Software，La Jolla，U.S.A)创建另外的图形。
结果：
图6显示了来自具有高无(上图)或高(下图)GDF-15免疫反应性的黑素瘤脑转移瘤的示例性组织切片，如图所示，其通过分别对GDF-15和T-细胞标记蛋白CD3和CD8进行免疫组织化学染色。在没有GDF-15表达的部分中，许多浸润的免疫细胞被视为黑斑。在显示表达高水平GDF-15转移的图中，鲜有浸润的免疫细胞，图中用箭头表示(CD3和CD8阳性细胞用箭头表示)。从图中可以看出，出乎意料地发现在具有高hGDF-15免疫反应性的组织切片中(下图)，与不具有hGDF-15免疫反应性的组织切片相比(上图)，CD3+和CD8+细胞的数量大大减少。值得注意的是，其他标志物如PD-L1、PD-1染色均与肿瘤浸润性CD3+和CD8+T细胞的数量呈正相关。
因此，接下来分析hGDF-15的水平与不同黑色素瘤脑转移灶中CD3+T细胞的百分比之间是否存在负相关。图7A显示了CD3+细胞百分比与GDF-15得分的关系曲线(如上文“统计分析”部分所述获得)。如图7A所示，CD3+细胞百分比和GDF-15得分之间存在统计学显著的负相关(p＝0.0015)。
同样，还分析了hGDF-15的水平与不同黑色素瘤脑转移瘤间CD8+T细胞的百分比之间是否存在负相关。图7B显示了CD8+细胞的百分比与GDF-15得分的曲线图(如上文“统计分析”部分所述获得)。如图7B所示，CD8+细胞百分比和GDF-15得分之间存在统计学显著的负相关(p＝0.0038)。
相比之下，根据Spearman秩相关系数(rho)检验(不同肿瘤实体中p＝0.8495；仅评估黑素瘤转移时p＝0.2455)，GDF-15与FOXP3的相关性没有给出统计学显著的结果。
最后，还分析了不同肿瘤实体的脑转移瘤中hGDF-15水平与CD8+和CD3+T细胞的百分比之间是否存在负相关。图8分别显示了来自不同肿瘤实体(黑素瘤、CRC、RCC，乳腺癌，NSCLC和SCLC)的168个(对于CD3)或169个(对于CD8)脑转移瘤的GDF-15评分与CD8+和CD3+T细胞百分比的曲线图。该图在按照如上所述的“统计分析”部分获得。如图8所示，CD8+细胞百分比和GDF-15得分(p＝0.0311)之间存在统计学显著的负相关，并且CD3+细胞百分比和GDF-15得分之间存在统计学显著的负相关(p值＝0.0093)。其他标志物(PD-L1、PD-1、FOXP3)也与CD3和CD8T细胞浸润显示出正相关性。
总结：
上述结果显示hGDF-15不仅与转移瘤中表达常规T细胞标记蛋白CD3的T细胞百分比之间有逆相关性，而且与转移瘤中CD8+T淋巴细胞的百分比呈逆相关性。这是值得注意的，因为先前已证明出CD8+T淋巴细胞的存在是用免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体治疗后肿瘤消退所特别需要的(Tumeh et al.,Nature.2014Nov.27；515(7528):568-71.)。
因此，根据本发明，hGDF-15的治疗性抑制可以用于增加实体瘤包括肿瘤转移瘤中CD8+T淋巴细胞的百分比。实体瘤中CD8+T淋巴细胞的这种增加可用于治疗实体瘤。在本发明的非限制性方面，特别有利的治疗组合是hGDF-15抑制剂与免疫检查点阻断剂的组合使用。该组合的有利作用是hGDF-15的抑制将增加实体瘤中CD8+T淋巴细胞的百分比，从而导致与免疫检查点抑制的协同治疗效果。因此，本发明可以应用于在较佳实施例中提及的所有实体瘤。
实施例3：GDF-15降低T细胞对内皮细胞的粘附。
接下来发明人着手确定hGDF-15如何影响实体瘤中T细胞的百分比。
T细胞从血流入侵肿瘤组织所需的步骤是T细胞在其能够进入肿瘤之前必须首先粘附到内皮细胞上。为了模拟该步骤并评估该步骤是否可能受hGDF-15影响，发明人使用了测量T细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附的模型系统：
T细胞流动/粘附实验(在HUVEC上)：
第1天：
a.用纤连蛋白(100μg/mL)包被μ-slide VI 0.4(ibidi GmbH，Germany)：每个装载口30μL。将其在37℃下孵育1h(或使用预包被的载玻片)；
b.吸出纤连蛋白，然后用HUVEC培养基洗涤载玻片；
c.将6孔板中的HUVEC用胰蛋白酶进行消化(计数：2×105/mL(总共2mL))；
d.将它们洗涤并稀释至1×106个细胞/mL；
e.将30μL的HUVEC应用于μ-slide VI的装载口并在显微镜下进行检查；
f.将μ-slide VI盖上盖子并在37℃、5％CO2中孵育。
第2天：
a.在通道2-5中用TNFα(10ng/mL)和IFNγ(10ng/mL)活化HUVEC(参见下表)：从通道中吸出所有培养基并用含有细胞因子的预热后的培养基代替。
第3天：
a.分离T细胞(泛T细胞的阴性分离)。
b.将T细胞在含有或不含GDF-15(100ng/mL)的孔1(1×106个细胞/mL)中预孵育1小时。
c.将HUVEC在通道4和5中与GDF-15(100ng/mL)预孵育1小时：吸出在装载口中的所有培养基，并且用含有GDF15的预热培养基填充两个装载口。
d.预热显微镜旁边的显微镜用培养装置(Stage Top Incubator)，并连接气体混合物(5％CO2，16％O2，79％N2)。
e.制备3×50mL注射器：
i.T细胞(1×106个细胞/mL)：1mL
ii.T细胞GDF15(1×106个细胞/mL)：1mL
iii.培养基
f.将注射器1连接至通道1(参见下表)并开始流动(0.5dyn/cm2：0.38mL/min＝22.8mL/h)。
g.T细胞流动3分钟，同时在显微镜上预定义10个视场。
h.每个视场都进行5秒的视频成像。
i.其余通道类似于通道1(f-h)用如下表所示的T细胞样本评估。
重组GDF-15购自Invite GmbH，Jena，Germany。
统计分析：
使用曼-惠特尼检验比较所有数据，以测试非正态分布的数据。p<0.05的值被认为是统计学显著的。
结果：
实验结果如图9所示。该图显示了几种粘附参数的分析，即
a.每个视场中每秒滚动的T细胞数(9A；数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照组”)中获得)，其反映了T细胞适度的粘附到内皮细胞的一种形式，
b.T细胞的滚动速度(以每0.2秒的像素为单位测量)(9B；数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照组”)中获得)，其随着T细胞和内皮细胞之间的粘附下降而有所上升，和
c.每个视场中粘附的细胞数(9C；数据从通道#3(“GDF-15”)和通道#2(“对照组”)和9D获得)。
从图9C可以看出，发现hGDF-15处理的T细胞显著降低了其与内皮细胞的粘附，主要反映在每个视场中粘附细胞的数量。通过计数滚动T细胞的数量分析粘附时，获得了类似的结果(图9A)。此外，与上述结果一致的是，用hGDF-15处理T细胞显著增加了其滚动速度，表明了T细胞和内皮细胞之间相互作用的时间减少，并表明了T细胞和内皮细胞之间的粘附力降低(图9B)。
发明人接下来分析了hGDF-15靶向的细胞群体(图9D)。在用hGDF-15仅处理HUVEC的样品中，观察到T细胞对内皮细胞(HUVEC)粘附的适度降低。相反，当用hGDF-15只处理T细胞时，或用hGDF-15同时处理T细胞和内皮细胞(HUVEC)时，观察到T细胞对内皮细胞(HUVEC)的粘附急剧降低。这些结果表明hGDF-15在T细胞和内皮细胞上都能够起作用，但也表明hGDF-15的主要粘附作用是对T细胞的作用。
接下来，发明人测试了hGDF-15抑制剂是否可以抑制肿瘤细胞分泌的hGDF-15对T细胞粘附的影响。为了测试这一点，发明人使用了分泌hGDF-15的黑色素瘤细胞系UACC257：
在肿瘤细胞上清液中存在或不存在GDF-15时的T细胞流动/粘附实验(在HUVEC上)：
第1天：
a.用纤连蛋白(100μg/mL)包被一个μ-slide VI 0.4(ibidi GmbH，德国；即可简称为μ-载玻片)：每个装载口30μL。将其在37℃孵育1h(或使用预包被的载玻片)。
b.吸出纤连蛋白，然后用HUVEC培养基洗涤。
c.将6孔板中的HUVEC用胰蛋白酶进行消化(数量：2×105/mL(总共2mL))。
d.将它们洗涤并稀释至1×106个细胞/mL。
e.将30μL的HUVEC应用于μ-载玻片的装载口并在显微镜下检查。
f.将μ-载玻片盖上盖子并在37℃、5％CO2进行孵育。
第2天：
a.在μ-载玻片的通道2-5中用TNFα(10ng/mL)和IFNβ(10ng/mL)活化HUVEC(参见下表)：从通道中吸出所有培养基，并用含细胞因子的预热过的培养基替换。
第3天：
a.分离T细胞(泛T细胞的阴性分离)。
b.将96孔ELISA板(Nunc maxisorb)的平行的24孔用200μL抗GDF-15(在PBS中稀释为10μg/mL)包被，孵育45分钟，然后用PBS洗涤。
c.为了从分泌GDF-15(数据未显示)的黑素瘤细胞系UACC257的上清液中去除GDF-15，将上清液在预先用抗GDF-15包被的ELISA板(参见b)的孔中进行孵育。
d.黑素瘤细胞系UACC257的对照上清液在没有预先用抗GDF-15包被的ELISA平板(参见b)的孔中进行孵育。
e.在去除GDF-15的黑素瘤细胞系UACC257的上清液中(参见c)，或在含有GDF-15(参见d)的黑素瘤细胞系UACC257的上清液中，将T细胞在含有GDF-15(100ng/mL)和不含有GDF-15的12孔细胞培养板(1×106细胞/mL)中预孵育1小时。
f.预热显微镜旁边的显微镜用培养装置，并连接气体混合物(5％CO2，16％O2，79％N2)。
g.制备4×2mL微流体流动系统管：
i.T细胞(1×106个细胞/mL)：1mL
ii.T细胞GDF15(1×106个细胞/mL)：1mL
iii.T细胞UACC 257(含有GDF-15)
iv.去除GDF-15的T细胞UACC 257
h.将管1连接到通道1(参见下表)并开始流动(0.4mL/min＝24mL/h)。
i.T细胞流动3分钟，同时在显微镜上预定义5个视场。
j.每个视场都进行5秒的视频成像。
k.其余通道类似于通道1(f-h)，用如下表所示的T细胞样本评估。
重组GDF-15从Invite GmbH，Jena，Germany获得。
结果：
实验结果如图10A所示。该图显示了每秒每个视场的滚动T细胞数量的分析。数据获自通道#1(未刺激的HUVEC上的对照T细胞作为“阴性对照”)、通道#2(刺激后的HUVEC上的对照T细胞作为“阳性对照”)、通道#3(“GDF-15”)、通道#4(“UACC257”：在含有分泌的GDF-15的黑素瘤细胞系UACC 257上清液中培养的T细胞)和通道#5(“UACC257+抗hGDF-15”：在使用抗GDF-15B1-23去除了分泌的GDF-15的UACC 257黑素瘤细胞上清液中培养的T细胞)。
与T细胞流经未刺激的HUVEC(“阴性对照”，中位数＝每秒每个视场有28个滚动细胞)相比，T细胞在受刺激的HUVEC(“阳性对照”)上的流动增加了每秒每个视场中滚动细胞的数量(中位数＝46)。用hGDF-15处理T细胞显著减少了每秒每个视场中滚动细胞的数量(中位数＝29)。此外，与流经受刺激的HUVEC(“pos.control”)的T细胞相比，T细胞与分泌GDF-15的黑素瘤细胞系UACC257的上清液进行的预孵育显著降低了每秒每个视场中滚动的细胞数量(中位数＝36)。与此形成对比的是，用抗GDF-15B1-23去除分泌的GDF-15的黑素瘤细胞系UACC257上清液中预孵育T细胞，导致每秒每个视场中滚动的细胞数目(中位数＝45)与受刺激的HUVEC上流动的T细胞(“阳性对照”)相当。
因此，根据本发明，hGDF-15抑制剂可用于例如在治疗实体癌症方面，增加包括CD8+细胞在内的T细胞与内皮细胞的粘附。
此外，上述测定提供了一种简单的体外系统，其可用于确定感兴趣的物质是否为hGDF-15抑制剂。
总结：
本实施例显示GDF-15，包括由肿瘤细胞分泌的GDF-15，能够降低T细胞对内皮细胞的粘附。因此，根据本发明，使用hGDF-15抑制剂的治疗可以增加T细胞(包括CD8+T细胞)与内皮细胞的粘附。这种治疗将增加来自血流的包括CD8+T细胞在内的T细胞进入实体癌症。由hGDF-15抑制剂的这种治疗引起的实体癌症中CD8+T细胞百分比的增加对于癌症治疗(例如癌症免疫治疗)是有利的。由于CD8+T细胞进入实体癌并且实体癌中存在这些CD8+T细胞对于使用免疫检查点阻断剂的治疗方法特别有利，因此本发明的hGDF-15抑制剂特别有利的用途是其与免疫检查点阻断剂组合使用。
使用抗体H1L5(人源化B1-23)和01G06和03G05(根据WO 2014/100689序列进行工 程化改造的人源化抗GDF-15抗体)进行抗体中和的流动粘附测定法
进行该实验是为了进一步证实上述观察到的效果，包括发现了hGDF-15抑制剂可用于增加T细胞与内皮细胞的粘附或T细胞的滚动。
实验步骤：
按照本实施例中的上述内容进行流动/粘附测定。将T细胞与100ng/ml GDF-15预孵育1小时，或将T细胞与10μg/ml抗体预孵育1小时后，再与100ng/ml GDF-15预孵育。使用以下抗GDF-15抗体：H1L5(人源化B1-23)，01G06和03G05(根据WO2014/100689的序列进行工程化改造的人源化抗GDF-15抗体)。
结果：
结果如图10B所示。与在未受刺激的HUVEC(阴性对照)上流动的T细胞相比，T细胞在受刺激的HUVEC(阳性对照)上的流动增加了每20秒每个视场中滚动的细胞数量。用hGDF-15处理T细胞显著减少了每20秒每个视场中滚动细胞的数量。与此相反，将抗GDF-15抗体H1L5(人源化B1-23)、01G06或03G05与hGDF-15进行预孵育，之后将hGDF-15与T细胞进行预孵育，导致了与未添加抗GDF-15抗体的样品相比时，每20秒每个视场中滚动的细胞数目显著地增加。对于所有测试的抗GDF-15抗体均存在该效应，并且对于H1L5(人源化B1-23)抗体最为显著，其几乎完全恢复了hGDF-15对T细胞滚动的作用。
结论
因此，根据本发明，hGDF-15抑制剂可以用于增加T细胞的粘附，包括CD8+细胞对内皮细胞的粘附，或者增加所述T细胞包括CD8+细胞的滚动。根据本发明，hGDF-15抑制剂将增加实体癌中CD8+细胞的百分比，并可用于治疗这些癌症。这些hGDF-15抑制剂可以是但不限于任何已知的抗GDF-15抗体，例如抗体H1L5(人源化B1-23)、01G06和03G05。
实施例4：评估测试抗体与佐剂免疫的组合在同源MC38tg hGDF-15+荷瘤小鼠中的抗肿瘤功效。
为了评估对人生长和分化因子(GDF)-15的抑制是否可以改善对免疫疗法的应答，并且特别是对肿瘤中需要CD8+T细胞的免疫疗法的应答，转染鼠MC38结肠癌细胞以表达人GDF-15，其表达水平与人癌细胞系中发现的水平相当。如通过酶联免疫吸附测定(ELISA，R&D Systems，Mouse GDF-15DuoSet ELISA)所评估的，MC38细胞不表达可检测水平的鼠GDF-15(检测极限：7.81pg/ml)。
在第0天，将9周龄雌性C57BL/6J小鼠(由Charles River Laboratories，BP 0109，F 69592L'Arbresle，Cedex提供)麻醉并皮下接种2×105个结肠MC38tg hGDF-15细胞。在第0天(肿瘤细胞接种后约6小时)开始用抗GDF-15抗体进行治疗(20mg/kg体重，即400μg/每只小鼠，在100μl磷酸盐缓冲盐中含有0.5％牛血清白蛋白)，并在第3、7、10、14、17和21天重复。在第13天，当肿瘤达到100至150mm3之间的体积时，将动物随机分配到不同的治疗组，并且将各动物腹膜内注射总体积为50μl磷酸盐缓冲盐的佐剂(100μg聚肌苷酸：聚胞苷酸(Poly-ICLC(Oncovir，Washington DC，USA))和50μg InVivoMAb抗鼠(m)CD40抗体(克隆FGK4.5/FGK45)。
双链RNA存在于一些病毒中并能刺激TLR3，由于Poly-ICLC与这些双链RNA结构的相似性，可用其来模拟感染。激动性抗CD40抗体为抗原呈递细胞提供额外的信号。通过CD40的刺激来“授权”树突细胞，为抗原特异性CD8+T细胞的激活提供了支持。因此，在保持在特定无病原体条件下的小鼠中，佐剂的治疗可用于诱导肿瘤特异性免疫细胞(Yadav M等.,Nature.2014Nov 27；515(7528):572-6)。
因此，这种辅助治疗代表了癌症免疫疗法的模型系统，其需要肿瘤中有免疫细胞，特别是肿瘤中需要有CD8+T细胞。因此，其是一个适合进一步证实用hGDF-15抑制剂例如抗hGDF-15抗体的治疗与癌症免疫疗法协同作用的模型系统，所述癌症免疫疗法包括肿瘤中需要CD8+T细胞的癌症免疫疗法。
总而言之，本发明研究了以下动物组(每组10只小鼠)：
无辅助免疫的空白对照组
无辅助免疫的用抗hGDF-15抗体B1-23的治疗组
有辅助免疫的空白对照组
有辅助免疫的用抗hGDF-15抗体B1-23的治疗组
通过卡尺测量肿瘤长度和宽度，每周测量肿瘤大小3次。
按公式V＝长度×宽度2/2计算，一旦小鼠的肿瘤体积超过2,000mm3时即将其处死。同样，当发现小鼠的状况恶化超出动物福利通常接受的限度(体重减轻≥15％，活动性丧失，匍匐行为，皮毛状况不佳)时，也将小鼠处死。
对于存活的小鼠，通过体检确定肿瘤的存在，直至肿瘤接种后第57天。结果如图11所示。
在发明人先前进行的研究中，已经表明单独使用抗GDF-15抗体的治疗可以有利地用于治疗癌症，但不能完全根除肿瘤，即不能治愈癌症。类似地，在图11中，空白对照处理的小鼠和单独用抗hGDF-15处理的小鼠均未治愈。佐剂的治疗(即用多聚ICLC和抗CD40抗体)治愈了10只小鼠中的3只。值得注意的是，当使用佐剂的治疗与抗hGDF-15抗体的治疗进行组合时，10只小鼠中的8只得到了治愈。因此，用抗hGDF-15抗体治疗与佐剂的治疗有强烈的协同作用。
结论：
在该模型系统中获得的结果进一步证实了hGDF-15抑制剂与癌症免疫疗法的协同作用，特别是与需要活化随后在肿瘤组织中发挥细胞毒活性的免疫细胞如CD8+T细胞的癌症免疫疗法的协同作用。该结果还进一步证实，由于使用本发明的hGDF-15抑制剂引起的癌症中CD8+T细胞百分比的增加可有利地用于癌症治疗。
在选定的实验条件下，鼠免疫模型系统几乎没有时间来建立抗原特异性的CD8+T细胞对快速增长的癌症的应答。因此，使用佐剂来进一步支持鼠系统中的自发免疫应答。相反，在癌症发展更长时间段(例如数年)的人类患者中，针对癌症抗原的抗原特异性T细胞通常在诊断时就已经存在，即通常甚至在癌症被诊断之前就发生了免疫应答的启动。这些癌症抗原特异性的CD8+T细胞已经存在于人类中，但在鼠模型系统中存在的程度要小得多。因此，根据本发明，本发明的hGDF-15抑制剂的用途在人类中比在本发明的鼠模型系统中更有效。因此，根据本发明，hGDF-15抑制剂可以有效地用于治疗人类癌症患者，例如，增加实体癌中CD8+T细胞的百分比，并且它们将与人类中的其他癌症免疫疗法协同作用，特别是与癌症中需要CD8+T细胞的癌症免疫疗法，包括使用免疫检查点阻断剂例如抗PD-1和抗PD-L1抗体的协同作用。
实施例5：GDF-15血清水平定义了用抗PD-1治疗的黑色素瘤患者的存活率
本实施例的研究是为了通过另外的独立研究进一步验证在实施例1的研究中获得的结果，例如发现hGDF-15可以影响患者对免疫检查点阻断剂的应答。
本研究使用以下术语：
“被删减的”＝当没有进一步的后续数据时，患者从研究队列中被移除。
“事件”＝病人已经死亡。
“生存”＝患者在随访时还活着。
在中央恶性黑色素瘤登记处(CMMR)的数据库中鉴定出具有组织学证实的黑色素瘤的来自德国蒂宾根大学皮肤科的患者，该数据库前瞻性地记录了来自德国60多个皮肤病中心的患者。选择出99位具有(a)存档的血清样品，(b)可用的随访数据，(c)抽血时存在局部或远处的转移，或有局部或远处转移的病史和(d)使用抗PD-1抗体的实验性治疗的患者。先前已经详细公布了CMMR收集数据的目的和方法(Lasithiotakis,KG et al.,Cancer/107/1331-9.2006)。每位患者获得的数据包括年龄、性别、最后一次随访的日期以及死亡日期和原因(如果适用)。所有患者都已经书面知情同意CMMR注册处记录其临床数据。机构伦理委员会蒂宾根已经批准了这项研究(伦理投票125/2015BO2)。符合条件的患者年龄在18岁或以上，并且经组织学或细胞学证实具有不可切除的III期或IV期黑色素瘤，不适合局部治疗，尽管根据现行指南接受过先前的治疗，但仍表现出疾病进展。具有BRAFV600突变肿瘤的患者接受了推荐的一线治疗或实验治疗，包括BRAF或MEK的抑制剂治疗或同时使用两者进行治疗。如果适用，先前用伊匹单抗进行治疗，当患者接受每3周一次，每次3mg/kg的至少两次剂量时，，但在最后的伊匹单抗剂量的24周内显示确定的疾病进展，则认为先前的治疗是失败的。在施用抗PD-1之前，在第一剂研究药物的施用之前，要求解决或改善伊匹单抗相关的不良事件降至0-1级，并且要求施用至少2周，剂量10mg/天或更低的泼尼松龙。符合条件的患者具有东部肿瘤协作组(ECOG)的表现状态为0或1；根据实体瘤疗效评价标准1.1版(RECIST v1.1)的可测量疾病；并且中性粒细胞绝对值在预先设定的数值范围内(≥1500个细胞/mL)，血小板(≥100 000个细胞/mL)，血红蛋白(≥90g/L)，血清肌酐(≤1.5正常上限[ULN])，血清总胆红素(≤1.5ULN或直接胆红素≤ULN，用于总胆红素浓度>1.5ULN的患者)，天门冬氨酸和丙氨酸转氨酶(肝转移患者≤2.5ULN或≤5ULN)，国际标准化比值或凝血酶原时间(如果不使用抗凝剂，≤1.5ULN)和活化部分凝血活酶时间(如果不使用抗凝剂，≤1.5ULN)。患者在最近一次治疗的最后一次剂量与第一剂派姆单抗或纳武单抗的剂量之间有至少4周的清洗期。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析hGDF-15的血清水平：
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量人GDF-15的血清水平。
缓冲液和试剂：
缓冲封闭溶液：在PBS中的1％BSA(级分V pH 7.0，PAA，Pasching，Austria)
洗涤液：PBS-Tween(0.05％)
标准品：人GDF-15(储存浓度120μg/ml，购自R&D Systems)
捕获抗体：人GDF-15MAb(克隆号147627)，购自R&D Systems，小鼠IgG2B(目录号MAB957，购自R&D Systems，储存浓度360μg/ml)
检测抗体：人GDF-15生物素化亲和纯化Pab，山羊IgG(目录号BAF940，购自R&DSystems，储存浓度9μl/ml)
链霉亲和素-HRP(目录号DY998，购自R&D Systems)
底物溶液：10ml 0.1M NaOAc pH6.0+100μl TMB+2μl H2O2
终止溶液：1M H2SO4
分析程序：
1.平板的准备：
e.将捕获抗体稀释至PBS中2μg/ml的工作浓度。立即用每孔50μl稀释的捕获抗体包被除外面两行(A和H)以外的96孔微量培养板(Nunc)。A和H行填充缓冲液以防止实验期间样品的蒸发。轻轻敲击板以确保每个孔的底部被完全覆盖。将板置于潮湿的室内并在室温(RT)孵育过夜。
f.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
g.向每个孔中加入150μl封闭溶液，然后在RT下孵育1小时。
h.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
2.测定程序：
d.制备标准品。将GDF-15在缓冲封闭溶液中稀释至终浓度为1ng/ml(4.17μlGDF+496μl缓冲封闭溶液)。进行1:2连续稀释。
e.制备1:20重复样品(6μl+114μl缓冲封闭溶液)。
f.每孔加入50μl稀释的样品或标准品，然后在室温孵育1小时。
i.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
j.将检测抗体稀释至终浓度为50ng/ml(56μl+10ml封闭缓冲液)。向每个孔中加入50μl稀释的检测抗体，随后在室温孵育1小时。
k.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
l.链霉亲和素-HRP按1:200稀释(50μl+10ml封闭缓冲液)。将50μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液加入到每个孔中，然后在室温孵育20分钟。
m.吸出每个孔中的液体，并用PBS-Tween(0.05％)洗涤三次。
n.制备底物溶液。向每个孔中加入50μL底物溶液，随后在室温孵育20分钟。
o.每孔加入50μL终止液。
p.使用设置为450nm的酶标仪立即测定每个孔的光密度。
3.GDF-15血清效价的计算：
d.每个样品/GDF-15标准稀释液均稀释一式两份。为了确定GDF-15效价，计算复孔平均值并减去背景数值(不含GDF-15的样品)。
e.为了创建标准曲线，将线性范围内的值绘制在X-Y图(X轴：GDF-15浓度，Y轴：OD450)上，并且应用线性曲线拟合。通过从已知浓度的标准稀释液的OD450值插值，来计算测试样品的GDF-15血清效价。
f.为了计算样品的最终GDF-15浓度，考虑了不同的稀释因子。在适当的稀释度下重新分析产生低于或高于标准范围的OD值的样品。
hGDF-15血清水平与患者数据的比较：
接下来，将测量的hGDF-15血清水平与从研究中获得的患者应答数据进行比较。
hGDF-15血清水平与患者数据的统计学相关性：
数据：
数据分析基于一个包含99个患者样本的数据文件，该数据文件包含列(变量)、样本名称、GDF-15(ng/ml)、天数(死亡或删减的)和持续时间(持续生活的指数变量)。
结果变量(终点)：
a.总体生存(死亡时间)。该终点由来自数据文件的死亡事件指标(1＝死亡/0＝存活)和对应于变量“天”的死亡或被删减的时间(上次知道患者还活着)组成。
对治疗的应答，例如无论患者是否为应答者(编码为1＝r)
数据分析：
生存分析的随访时间从血液采样日期到最后一次随访(即从患者处获得的最后信息)或到死亡时间。在用抗PD1抗体治疗之前的几天内采集所有血液样品。对于OS分析，在最后一次随访中存活的患者被删减，而患者死亡被认为是“事件”。根据Kaplan-Meier的累积生存概率与95％置信区间(CI)一起计算，并使用双侧对数秩检验统计进行比较。总生存率的p值通过双侧对数秩统计计算。一个模型使用基于GDF-15的分组变量作为分类预测因子(组：<1.5ng/ml(n＝62)，≥1.5ng/ml(n＝37)或GDF-15low(n＝49)，GDF-15high(n＝50)，基于中位值分割)。得到的Kaplan-Meier曲线如图12和13中显示，其中被删减的由垂直线表示。此外，下表包含病例总结(表9)、GDF-15水平<1.5ng/ml和≥1.5ng ml(表10和11)的患者组的患者生存数据以及GDF-15水平<1.5ng/ml和≥1.5ng/ml的患者组的总体统计学比较(表12)。
表9：案例总结
*H＝非事件
表10：生存的平均值和中位值(生存天数)
a.在被删减后，评估值限于已知最长的生存率。
n/d：由于该组中存在>50％的存活者，因此无法计算中位值生存数据。
表11：存活持续时间的平均值和中位值(存活天数)
a.在被删减后，评估值限于已知最长的生存率。
n/d：由于该组中存在>50％的存活者，因此无法计算中值生存数据。
表12：总体对比
*df＝自由度
对不同水平的GDF-15(<1.5ng/ml，≥1.5ng/ml)的平均存活分布进行测试
结果和总结：
本实施例的上述统计结果进一步证实了实施例1的结果。例如，证实了由患者的存活率指示的那样，对治疗应答的可能性随着患者血清中hGDF-15水平的增加而显著降低。例如，正如显著水平为0.004所示的，表12显示了GDF-15水平分别<1.5ng/ml和≥1.5ng/ml的两个患者组之间的存活率显著不同。类似地，表9显示在具有<1.5ng/ml的GDF-15水平的组中患者(82.3％)的存活率较高，并且表10和11以及图12和13表明对于GDF-15水平<1.5ng/ml的患者，其存活时间显著长于GDF-15水平≥1.5ng/ml的患者。
因此，本实施例的结果进一步证实了hGDF-15对患者对于免疫检查点阻断剂治疗的应答有负面影响。因此，根据本发明，hGDF-15抑制剂可不仅在黑色素瘤中，而且在本发明提及的所有实体癌症中抑制hGDF-15对患者对用免疫检查点阻断剂治疗的应答的负面影响，并改善患者对用免疫检查点阻断剂的治疗的应答。
实施例6：在用抗PD1抗体治疗的人类非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，进展性疾病患者中hGDF-15血清水平的中位值高于显示部分应答的患者。
进行该实施例是为了在另外一项针对不同实体癌的独立研究中，进一步验证实施例1，例如，hGDF-15可以影响患者对免疫检查点阻断剂的应答的研究中获得的结果。
患者：
根据批准的抗PD1抗体的药物标签，用抗PD1抗体治疗NSCLC患者。患者包括用其他癌症治疗手段预先治疗的患者。由于在NSCLC患者中很少观察到完全应答，所以患者组包括患有进展性疾病和在PD-1治疗后显示部分应答的患者，但是没有患者在PD-1治疗后显示出完全应答。
血清样品：
在用抗PD1抗体治疗之前，从患者中取血清样品。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析hGDF-15的血清水平：
如实施例1中所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血清样品中的hGDF-15血清水平。
结果：
从用抗PD-1治疗后表现出部分应答的5名患者中获得其hGDF-15血清水平，并且从用抗PD-1治疗后表现出进行性疾病的5名患者中获得其血清水平。值得注意的是，显示部分应答的患者中hGDF-15血清水平的中位值为0.55ng/ml，而显示进行性疾病的患者中hGDF-15血清水平的中位值为1.56ng/ml。因此，显示进行性疾病的患者中hGDF-15血清水平的中位值比显示部分应答的患者高约2.8倍。
总结：
本实施例的结果进一步证实了hGDF-15水平与患者对免疫检查点阻断剂的应答呈负相关。本实施例的结果还进一步证实了hGDF-15对患者对用免疫检查点阻断剂如PD-1治疗的应答有负面影响。因此，根据本发明，hGDF-15的抑制剂不仅在黑色素瘤中，而且在肺癌如NSCLC以及本发明提及的所有其他实体癌中可用于抑制hGDF-15对患者对免疫检查点阻断剂治疗的应答的负面影响，并改善患者对用免疫检查点阻断剂进行免疫治疗的应答。
实施例7：hGDF-15血清水平与肿瘤的突变负荷无显著相关性
突变负担是癌症患者对免疫检查点阻断剂应答的已知的阳性预后因子。通常，癌细胞具有基因组突变，其产生对癌细胞特异的癌细胞抗原并且与非癌细胞的抗原不同。高突变负荷导致大量的此类癌症细胞特异性的抗原。因为更多的癌细胞特异性抗原可用作免疫应答的靶抗原，在含有如此大量的癌细胞特异性抗原的癌症中，用免疫检查点阻断剂进行刺激的免疫应答是特别有效的。
为了进一步证实hGDF-15不仅仅是肿瘤突变负荷的替代标记，并且为了进一步证实hGDF-15抑制剂的治疗通过独立于肿瘤突变负荷的机制发挥作用，将肿瘤患者的癌症样品中hGDF-15mRNA水平与癌症中鉴定出的体细胞突变数量进行作图。通过使用外显子组测序确定体细胞突变。使用来自苏黎世大学医院的UZH网络工具对数据进行分析(Cheng PFet al.:Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancermedicine.Swiss Med Wkly.2015Sep 16；145:w14183.)。结果显示在图14中。图14A显示仅考虑患有高度恶性黑色素瘤的患者的情况下，从癌症基因组图谱(TGCA)获得的癌症患者数据的图(癌症基因组图谱在Cheng PF等人的Data mining The Cancer Genome Atlas inthe era of precision cancer medicine.Swiss Med Wkly.2015Sep 16；145:w14183.文献中有所描述)。使用RSEM(“RNA Seq by expectation maximization”)软件包(Li B andDewey CN:RSEM:accurate transcript quantification from RNA-Seq data with orwithout a reference genome.BMC Bioinformatics.2011Aug 4；12:323.doi:10.1186/1471-2105-12-323.)评估GDF-15的表达。图14B显示了来自苏黎世大学医院的另外40名转移性恶性黑色素瘤患者的单独分析的癌症患者数据的示意图。
值得注意的是，图14A和14B均显示p值为0.5，表明癌症中的突变负荷与hGDF-15水平之间不存在显著的相关性。这些结果进一步证实了hGDF-15不仅仅是肿瘤突变负荷的替代标志，而且证实了hGDF-15抑制剂的治疗通过独立于肿瘤突变负荷的机制起作用。
实施例8：野生型肿瘤或人GDF-15(过度)表达的肿瘤中的CD8+T细胞浸润
使用野生型或人GDF-15(过度)表达的MC38结肠癌细胞植入免疫活性同源小鼠C57BL/6右侧的初步研究中，GDF-15过表达与免疫细胞浸润的减少相关。图15中显示了在携带野生型肿瘤或过表达转基因(tg)hGDF15的肿瘤并29天后处死的小鼠中CD8a的免疫细胞化学照片。从图中可以看出，野生型肿瘤比过表达转基因(tg)hGDF15的肿瘤含有更多的CD8a阳性细胞。
这些结果进一步支持了这样的发现，即根据本发明，hGDF-15降低了实体癌中CD8+T细胞的百分比，相反，hGDF-15抑制剂如抗GDF-15抗体可用来增加人类患者的实体癌中的CD8+T细胞的百分比。
工业适用性
本发明的抑制剂、组合物和试剂盒的组合可以根据药物产品的已知生产标准将要求保护的方法和用途以产品的形式用于工业生产和销售(例如用于治疗如本发明所定义的癌症)。因此，本发明在工业上是可应用的。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys
<210> 2
<211> 88
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
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1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
85
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys
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<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
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<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 重组的成熟人GDF-15蛋白（recombinant mature human GDF-15 protein）
<400> 8
Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
1 5 10 15
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
20 25 30
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
35 40 45
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
50 55 60
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
100 105 110
Cys Ile
<210> 9
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser
35 40 45
Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
225 230 235 240
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
245 250 255
Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
260 265 270
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Ile
305
<210> 10
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人GDF-15前体蛋白 + GSGS连接体的N-端和C-端（human GDF-15 precursorprotein + N-terminal and C-terminal GSGS linker）
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val
1 5 10 15
Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro
20 25 30
His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro
35 40 45
Gly Pro Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg
50 55 60
Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp
65 70 75 80
Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu
85 90 95
Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile
100 105 110
Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His
115 120 125
Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val
130 135 140
Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro
145 150 155 160
Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu
165 170 175
Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg
180 185 190
Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp
195 200 205
His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg
210 215 220
Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
260 265 270
Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro
275 280 285
Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr
290 295 300
Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ser Gly
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flag肽（Flag peptide）
<400> 11
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA肽（HA peptide）
<400> 12
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 13
Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 14
Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 15
His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 16
Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 17
Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 18
Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 19
Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 衍生自人GDF-15的肽（peptide derived from human GDF-15）
<400> 20
Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 291
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21
caagtgaagc tgcagcagtc aggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagt acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120
cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180
tataacccaa ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atccctccag aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg t 291
<210> 22
<211> 264
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22
gacattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtgg cctggtttct acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact tatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgt 264
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 23
gctcgaagtt cctacggggc aatggactac 30
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 24
cagcaatata acaactttcc gtacacg 27
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys
1 5 10 15
Asp Cys His Cys Ile
20
<210> 27
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe heavy chain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 27
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Pro Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acidsequence of the heavy chain variable domain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 28
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Pro Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体重链恒定区的氨基酸序列（amino acidsequence of the heavy chain constant domain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe light chain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acidsequence of the light chain variable domain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 32
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1L5人源化B1-23抗GDF-15抗体轻链恒定区的氨基酸序列（amino acidsequence of the light chain constant domain of the H1L5 humanized B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 32
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
20 25 30
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
35 40 45
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
85 90 95
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
<210> 33
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链的氨基酸序列（amino acid sequence of theheavy chain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 33
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe heavy chain variable domain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 34
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体重链恒定区的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe heavy chain constant domain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链的氨基酸序列（amino acid sequence of thelight chain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe light chain variable domain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
<210> 38
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合B1-23抗GDF-15抗体轻链恒定区的氨基酸序列（amino acid sequence ofthe light chain constant domain of the chimeric B1-23 anti-GDF-15 antibody）
<400> 38
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
20 25 30
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
35 40 45
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
65 70 75 80
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
85 90 95
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 01G06抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 01G06 antibody）
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Ile Phe Phe Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 01G06抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 01G06 antibody）
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Leu His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Asp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 03G05抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 03G05 antibody）
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Leu Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 03G05抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 03G05 antibody）
<400> 42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 04F08抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 04F08 antibody）
<400> 43
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Thr Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Thr Gly Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 04F08抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 04F08 antibody）
<400> 44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 06C11抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 06C11 antibody）
<400> 45
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Asn Asn Arg Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala
115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 06C11抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 06C11 antibody）
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 08G01抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 08G01 antibody）
<400> 47
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 08G01抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 08G01 antibody）
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14F11抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 14F11 antibody）
<400> 49
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Glu Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ile Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14F11抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 14F11 antibody）
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17B11抗体重链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the heavychain variable domain of the 17B11 antibody）
<400> 51
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Asn Asp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Lys Ser Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Val Gly Gly Leu Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 17B11抗体轻链可变区的氨基酸序列（amino acid sequence of the lightchain variable domain of the 17B11 antibody）
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Arg Phe Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Gly Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (65)

1.一种人GDF-15抑制剂的应用，所述应用为在增加人类患者实体癌中CD8+T细胞百分比的方法中的应用，其特征在于，将所述人GDF-15抑制剂施用于所述人类患者。
2.如权利要求1所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.2ng/ml的人GDF-15血清水平的患者；优选地，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.5ng/ml的人GDF-15血清水平的患者；更优选地，所述患者是在开始施用所述人GDF-15抑制剂之前具有至少1.8ng/ml的人GDF-15血清水平的患者。
3.如权利要求1或2所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、脑癌、乳腺癌、胃癌、肾细胞癌、尤文氏肉瘤、非小细胞肺癌和小细胞肺癌组成的组；较佳地，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌组成的组；更佳地，所述癌症选自由黑色素瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、尿路上皮癌和胃癌组成的组。
4.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述癌症选自由黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、结肠直肠癌和前列腺癌组成的组。
5.如前述权利要求中任一项所使用的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述癌症是黑色素瘤。
6.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述抑制剂是能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分。
7.如权利要求6所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述结合是与人GDF-15上的构象表位或不连续的表位结合，并且所述构象表位或不连续的表位由SEQ ID No：25和SEQ ID No：26所示的氨基酸序列组成。
8.如权利要求6或7所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变域，所述重链可变域包括含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的CDR1区、含有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的CDR2和含有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的CDR3区，并且所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包括含有如SEQID NO：6所示氨基酸序列的CDR1区、含有如氨基酸序列ser-ala-ser的CDR2区和含有如SEQID NO：7所示氨基酸序列的CDR3区。
9.如权利要求1～5任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述抑制剂是短干扰RNA或siRNA发夹构建体。
10.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述方法是用于治疗癌症的方法。
11.如权利要求10所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述用于治疗癌症的方法是通过癌症免疫疗法治疗癌症的方法。
12.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述方法是用于治疗癌症转移的方法。
13.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中的。
14.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述应用是与免疫检查点阻断剂联合使用。
15.如前述权利要求中任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂选自以下组中的一个或多个：
iii)人PD-1抑制剂，所述抑制剂优选为能够结合人PD-1的单克隆抗体或其抗原结合部分；和
iv)人PD-L1抑制剂，所述抑制剂优选为能够结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
16.如权利要求15所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂包含能够结合人PD-1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
17.如权利要求15或16所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂包含能够结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合部分。
18.一种包含人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合物。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂是如权利要求6～9任一项所定义的抑制剂。
20.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂如权利要求15～17任一项所定义的阻断剂。
21.如权利要求18～20任一项所述的组合物，其特征在于，其应用于药物中。
22.一种试剂盒，其包含人GDF-15抑制剂和至少一种免疫检查点阻断剂。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂是如权利要求6～9任一项所定义的抑制剂。
24.如权利要求22或23所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂是如权利要求15～17任一项所定义的阻断剂。
25.如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂和一种或多种或全部所述免疫检查点阻断剂收纳在分开的容器中或单个容器中。
26.如权利要求21～25任一项所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，所述应用为在治疗实体癌的方法中的应用。
27.如权利要求26所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，其特征在于，所述方法是用于癌症免疫疗法的方法。
28.如权利要求27所述的试剂盒或应用于药物中的组合物的应用，其特征在于，所述癌症是如权利要求3、4或5中所定义的癌症。
29.一种人GDF-15抑制剂的应用，所述应用为在人类患者体内通过免疫检查点阻断剂治疗实体癌的方法中的应用，其特征在于，将所述人GDF-15抑制剂施用于所述人类患者。
30.如权利要求29所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述方法是用于癌症免疫治疗的方法。
31.如权利要求29或30所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述患者是如权利要求2中所定义的患者。
32.如权利要求29～31任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述癌症是如权利要求3、4或5中所定义的癌症。
33.如权利要求29～32任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂是如权利要求6～9任一项所定义的抑制剂。
34.如权利要求29～33任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂是如权利要求15～17任一项所定义的阻断剂。
35.如权利要求29～34任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂增加癌中CD8+T细胞的百分比。
36.如权利要求35所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中的。
37.人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，所述应用为在治疗人类患者实体癌的方法中的应用，其特征在于，将人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂施用于所述人类患者。
38.如权利要求36所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述方法是用于癌症免疫治疗的方法。
39.如前述任一项权利要求中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述患者是如权利要求2中所定义的患者。
40.如前述任一项权利要求中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述癌症是如权利要求3、4或5中所定义的癌症。
41.如前述任一项权利要求中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述hGDF-15抑制剂是如权利要求6～9任一项所定义的抑制剂。
42.如前述任一项权利要求中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂是如权利要求15～17任一项所定义的阻断剂。
43.如前述任一项权利要求中所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂增加癌中CD8+T细胞的百分比。
44.如权利要求43所述的人GDF-15抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合的应用，其特征在于，所述人GDF-15抑制剂增加了癌中CD8+T细胞的百分比，所述增加是通过增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附，从而增加CD8+T细胞从血流进入到癌中；
较佳地，所述增加CD8+T细胞对内皮细胞的粘附增加了CD8+T细胞在内皮细胞上的滚动，使得从血流进入实体癌中的所述CD8+T细胞增加。
45.一种用于确定感兴趣物质是否是人GDF-15抑制剂的体外方法，其特征在于，所述方法包括：
a)活化内皮细胞；
b)在存在含有人GDF-15的溶液情况下和存在感兴趣物质的情况下，孵育包含T细胞的第一样品；或在含有人GDF-15的溶液的存在下孵育包含T细胞的第一样品，所述含有人GDF-15的溶液在感兴趣物质的存在下进行过预孵育；
c)测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自所述第一样品的所述T细胞的粘附以获得第一次粘附测量结果；和
d)基于步骤c)的第一次粘附测量结果，确定感兴趣物质是否是人GDF-15抑制剂。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人内皮细胞。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞被TNF-α和IFN-γ活化，并且在所述活化步骤中；所述TNF-α和IFN-γ较佳地以终浓度为5-20ng/ml的TNF-α和5-20ng/ml的IFN-γ存在在培养基中；更佳地，以终浓度为10ng/ml的TNF-α和10ng/ml的IFN-γ存在在培养基中。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述感兴趣物质是能够结合人GDF-15的物质，较佳地，是能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合片段。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所述内皮细胞和所述T细胞以1:2至2:1的数值比进行使用；较佳地，所述数值比为1:1。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在进行步骤c)期间，所述内皮细胞存在于包被的细胞培养表面；较佳地，所述内皮细胞存在于包被纤连蛋白的细胞培养表面。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在进行步骤b)期间，人GDF-15以50-200ng/ml的浓度存在；较佳地，以100ng/ml的浓度存在。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过计算滚动的T细胞的数量来测量粘附。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过计算粘附的T细胞的数量来测量粘附。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过测量所述T细胞的滚动速度来测量粘附。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)中，如果所述感兴趣物质增加所述粘附，则其被确定为人GDF-15抑制剂。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)中，如果所述感兴趣物质不增加所述粘附，则其被确定为不是人GDF-15抑制剂。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
在步骤b)中，将第二样品在存在包含人GDF-15的所述溶液和不存在所述感兴趣物质的情况下进行孵育，所述第二样品包含T细胞，
在步骤c)中还包括测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自所述第二样品的所述T细胞的粘附以获得第二次粘附测量结果，和
在步骤d)中，如果与所述第二次粘附测量结果相比，所述第一次粘附测量结果增加，则所述感兴趣物质被确定为人GDF-15抑制剂。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
在步骤b)中，将第三样品在不存在包含人GDF-15的所述溶液的情况下和在不存在所述感兴趣物质的情况下进行孵育，所述第三样品包含T细胞，
在步骤c)中还包括测量步骤a)中活化的内皮细胞与来自第三第二样品的所述T细胞的粘附以获得第三次粘附测量结果，和
在步骤d)中，使用第三次粘附测量结果作为指示完全人GDF-15抑制的参考粘附测量结果。
60.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞是CD8+T细胞。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞是pan T细胞。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞是人T细胞。
63.如权利要求1～17任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述应用是与聚肌苷酸:聚胞苷酸的组合的应用；或如权利要求37～44任一项所述的人GDF-15抑制剂与免疫检查点阻断剂的组合的应用，其中所述组合是与聚肌苷酸：聚胞苷酸的组合。
64.如权利要求1～17和63任一项所述的人GDF-15抑制剂的应用，其特征在于，所述应用是与抗人CD40抗体的组合的应用；较佳地，是与单克隆抗人CD40抗体的组合的应用；或如权利要求37～44和63中任一项所述的组合的应用，其中所述组合是与抗人CD40抗体的组合；较佳地，是与单克隆抗人CD40抗体的组合。
65.一种人GDF-15抑制剂与选自以下任何一组的组合在人类患者体内治疗实体癌的方法中的应用，所述组包括：
a)聚肌苷酸:聚胞苷酸；
b)抗人CD40抗体；较佳地为单克隆抗人CD40抗体；或
c)聚肌苷酸:聚胞苷酸和抗人CD40抗体；较佳地为单克隆抗人CD40抗体，其特征在于，所述组合任选地包含一种免疫检查点阻断剂。
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