KR102621034B1 - 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료의 임상적인 경과를 예측하기 위한 진단 마커로서의 gdf-15 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 체크포인트 차단제 치료, 예를 들어 항-PD-1에 대한 인간 암 환자의 치료 반응의 확률을 예측하는 방법, 면역 체크포인트 차단제 치료 이후에 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하는 방법, 및 이들 방법에 사용될 수 있는 장치 및 키트에 관한 것이다.

Description

면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료의 임상적인 경과를 예측하기 위한 진단 마커로서의 GDF-15
본 발명은 면역 체크포인트 차단제 치료에 대한 인간 암의 치료 반응의 확률을 예측하기 위한 방법, 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 방법, 및 이들 방법에 사용될 수 있는 장치 및 키트에 관한 것이다.
지금까지 수많은 암들이 여전히 의학적인 요구가 충족되지 않은 영역으로 남아있다. 또한, 몇몇 암들의 경우, 환자의 일부 집단은 암 요법에 반응을 나타내는 반면, 다른 집단은 반응하지 않는다. 다수 사례들에서, 환자가 특정 암 치료에 반응할 것인지의 여부를 결정하는 인자는 여전히 알려져 있지 않다.
암의 많은 유형들이 VEGF, PDGF, TGF-β 및 GDF-15와 같은 인자 등의 성장 인자들을 발현하는 것으로 알려져 있다. GDF-15, 즉 성장 및 분화 인자-15은 TGF-β 슈퍼패밀리의 또 다른 구성원이다. 이는 세포내에서 전구체로 발현되어 가공된 다음, 최종적으로 세포에서 주위 환경으로 방출되는 단백질이다. GDF-15의 활성형의 완전히 가공된 (성숙) 형태와 전구체 둘다 세포 외부에서 발견될 수 있다. 전구체는 자신의 COOH-말단 아미노산 서열을 통해 세포외 기질 (matrix)에 공유 결합함으로써 (Bauskin AR et al., Cancer Research 2005), 세포 외부에 놓이게 된다. GDF-15의 활성형의 완전히 가공된 (성숙) 형태는 가용성이며, 혈액의 혈청에서 발견된다. 즉, GDF-15의 가공된 형태는, 잠재적인 타겟 세포가 가용성 GDF-15 리간드에 대한 수용체를 발현한다면, 혈액 순환과 연결된 체내 모든 타겟 세포에 잠재적으로 작용할 수 있다.
임신 중에 GDF-15은 태반의 생리학적 환경에서 발견된다. 그러나, 다수 악성 암 (특히 공격적인 뇌암, 흑색종, 폐암, 위장 종양, 대장암, 췌장암, 전립선암 및 유방암 (Mimeault M and Batra SK, J. Cell Physiol 2010))에서, 종양 뿐만 아니라 혈액 혈청에서도 증가된 GDF-15 수준을 나타낸다. 마찬가지로, GDF-15의 높은 발현과 화학내성 간에 (Huang CY et al., Clin. Cancer Res. 2009), 그리고 GDF-15의 높은 발현과 예후 불량 (Brown DA et al., Clin. Cancer Res. 2009) 간에 각각 상관관계가 언급된 바 있다. Wallentin L 등의 논문 (PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e78797)에서는 남성에서 심혈관 및 암의 이환율과 사망율을 예측하는데 GDF-15을 이용하였다.
GDF-15은 면역조직화학에 의해 분석된 바와 같이 여러 WHO 등급의 신경교종들에서 발현된다 (Roth et al., Clin. Cancer Res. 2010). 나아가, Roth 등은 내인성 GDF-15을 타겟으로 하는 짧은 헤어핀 RNA-발현성 DNA 구조체 또는 대조군 구조체를 SMA56 신경교종 세포에서 안정적으로 발현시켰다. 이러한 사전-확립된 안정적인 세포주를 이용하였을 때, GDF-15 넉다운 SMA560 세포를 가진 마우스에서 종양 형성이 대조군 구조체를 가진 마우스와 비교해 지연되는 것으로 관찰되었다.
국제 특허 출원 공개 WO 2005/099746 및 WO 2009/021293은 마우스에서 종양-유발성 체중 감소에 대한 인간 GDF-15 (hGDF-15)의 효과를 길항할 수 있는 항-인간-GDF-15 항체 (Mab26)에 관한 것이다. 마찬가지로, Johnen H 등 (Nature Medicine, 2007)은 암-유발성 식욕부진 및 체중 감소에 대한 항-인간-GDF-15 단일클론 항체의 효과를 발표하였지만, 암에 의해 형성된 종양 크기에 대해서는 항-인간-GDF-15 항체의 어떠한 효과도 관찰하지 못하였다.
WO 2014/049087 및 PCT/EP2015/056654는 hGDF-15에 대한 단일클론 항체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
최근 개발되는 암 요법의 방식은 인간 PD-1의 저해제 및 인간 PD-L1의 저해제 등의 면역 체크포인트 차단제를 사용하는 것이다. 이들 면역 체크포인트 차단제의 사용을 뒷받침하는 근거는, 면역 시스템이 암 항원 및 해당 암 세포를 타겟으로 하여 작용하는 것을 막는 면역 체크포인트를 차단함으로써, 암에 대한 면역 반응이 보다 효과적으로 될 수 있다는 것이다. 면역 체크포인트 차단제 뿐만 아니라 면역 체크포인트 차단제들의 특정 조합이 흑색종 환자에서 환자의 생존을 개선하는 것으로 입증된 바 있지만 (Cully M, "Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy.", Nat Rev Drug Discov. 2015 Jun;14(6):374-5.), 흑색종 환자들이 모두 완전 반응 (complete response)을 나타낸 것은 아니며, 그외의 다수 암들에 대한 결과는 아직 공개된 바 없으며, 다른 징후에서의 결과도 좋지 않을 것임을 시사하는 근거들 (돌연변이 부하 (mutational burden) 등)이 여전히 존재한다. 현재 랜드마크는 KEYNOTE-006 (ClinicalTrials.gov number, NCT01866319) 시험으로, 반응율은 34% 미만에 불과하다. Robert et al. Pembrolizumab versus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532.
암 환자가 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 반응할 것인지의 여부를 예측하는 예후 인자에 대한 현재의 지식은 여전히 상당히 제한적이다. PD-1 저해제 치료를 받은 비-소 세포성 폐암 환자에서 객관적인 반응 개선, 지속적인 임상 효과 및 암의 진행이 없는 생존과 관련있는 것으로 입증된 한가지 구체적인 인자는 종양에서의 높은 비유사 돌연변이 부하 (nonsynonymous mutation burden)이다 (Rizvi NA et al.: "Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer." Science 2015 Apr 3; 348(6230):124-8.). 그러나, 전체 엑솜 (whole exome) 수준에서 이러한 돌연변이 부하를 확인하기 위해서는 힘든 전체-엑솜 서열분석이 필수적이다.
흑색종 및 비-소 세포성 폐암 등의 수종의 종양들에서 항-PD-1 요법에 대한 객관적인 반응과 상관성을 나타내는 또 다른 특이적인 예후 인자는 종양 세포의 PD-L1 발현이다 (Taube et al., "Association of PD-1, PD-1 ligands, and other features of the tumor immune microenvironment with response to anti-PD-1 therapy.", Clin Cancer Res. 2014 Oct 1;20(19):5064-74). 그러나, 이와는 대조적으로, 항-PD-1 요법 치료를 받지 않은 비-소 세포성 폐암 환자를 포함하는 환자 집단에서는, PD-L1의 높은 발현이 양호한 예후 보다는 불량한 예후와 상관성을 보이는 것이, 메타-분석을 통해 밝혀졌다 (Wang A et al.: "The prognostic value of PD-L1 expression for non-small cell lung cancer patients: a meta-analysis." Eur J Surg Oncol. 2015 Apr; 41(4):450-6). 아울러, 적출된 종양 단편에서 PD-L1 발현이 인지가능한 수준으로 염색되지 않은 환자들에서도 항-PD-1 치료에 대한 반응이 관찰되었다. 또한, 진행된 신장 세포 암종에 대한 최근 실험에서는, 환자들에서 PD-L1의 발현과 항-PD-1 항체인 니볼루맵에 대한 반응성 간에 유의한 상관관계가 없는 것으로 밝혀졌다 (Motzer RJ et al., Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 2015 Sep 25). 부가적으로, PD-L1의 발현을 검출하기 위해서는 조직 샘플이 필요한데 이것은 항상 이용가능한 것은 아니다. 그래서, PD-L1 발현의 검출은 잠재적인 진단 마커로서의 이것의 용도와 관련하여 여러가지 문제점을 가지고 있다.
다른 환자군과 비교해 항-PD-L1-치료 환자군에서의 높은 PD-L1 발현의 예측 가치에 대한 전술한 상반된 결과들로부터, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료가, 다른 암 치료와 구별되고, 여러가지 예후 인자 세트를 따르는 특수한 암 치료 형태라는 것이, 명확하게 드러난다.
기존의 암 요법과 면역 체크포인트 차단제를 이용한 요법 간의 이러한 차이에 대한 한가지 근거는 면역 체크포인트 차단제에 의한 면역 세포의 활성화이며, 이는 다른 암 요법에서 일반적으로 관찰되지 않는 기전이다.
부가적으로, 전술한 진단 방법들은 전체-엑솜 서열분석 또는 종양 샘플과 이에 대한 분석이 필요하다는 점에서 유용하지 않다. 다른 마커에 대한 검색으로, KK Tsai 등은 약한 예측인자만을 발견하였는데, 이러한 인자들 중에서 전이 패턴 (폐 전이는 있으나 간 전이는 없음), 이필리무맵의 사전 비-사용 (no prior ipilimumab: 즉, 항-PD-1을 이용한 초기 치료) 및 정상적인 LDH 수준인 경우가 최상이었다 (KK Tsai et al., JCO 33, 2015 (suppl. abstr. 9031). 그러나, 전체 반응율은 40%였으며, 최상의 환자군 (폐 전이는 있으나 간 전이는 없음)은 62.2%의 반응율을 나타내었다. LDH가 낮거나 정상적인 환자들에서의 반응율은 52.2%이었다.
이러한 이유로, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 이러한 새로운 치료제의 임상 경과 (clinical outcome)의 확률을 예측하기 위해 사용될 수 있는 예후 예측 인자를 동정하는 것이 당해 기술 분야에서 요구되고 있다. 또한, 힘들지 않게 용이한 방식으로 이러한 치료제의 임상 경과의 확률을 예측할 수 있는 예후 예측 인자가 요구된다.
WO 2005/099746 WO 2009/021293 WO 2014/049087 WO 2014/100689 PCT/EP2015/056654
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본 발명은 후술한 구현예들을 제공함으로써 당해 기술 분야에의 상기한 요구를 충족시키고, 전술한 문제들을 해결한다:
특히, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있는 인자를 동정하던 중에, 본 발명자들은, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 긍정적인 임상 경과의 확률이 환자 혈청에서 hGDF-15 수준 증가에 따라 현저하게 감소한다는 것을, 그리고 그 반대도 발견하게 되었다. 즉, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 긍정적인 임상 경과의 확률은 hGDF-15 수준과 역 상관관계이다. 이러한 임상 경과는, 예를 들어, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 반응 또는 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 후 환자의 생존성일 수 있다.
예를 들어, 흑색종 환자에서 혈청내 hGDF-15 수준이 1 ng/ml 증가하면, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 반응 확률은 약 60% 감소한다. 역으로, 만일, 흑색종 환자에서 혈청내 hGDF-15 수준이 1 ng/ml 감소하면, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 반응 확률은 약 60% 증가한다. 마찬가지로, 혈청내 hGDF-15 수준이 1 ng/ml 증가하면, 환자의 사망 확률은 1.27배 증가한다.
hGDF-15 발현은 흑색종으로 제한되지 않으며, 다수의 다른 고형 암들에도 존재한다. 마찬가지로, 흑색종 이외의 고형 종양은 또한 면역 체크포인트 차단제로 치료할 수 있다. 이에, 본 발명에서, 환자의 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준은, 흑색종 뿐만 아니라 본원에 언급된 모든 고형 암에서 면역 체크포인트 차단제로 치료한 후, 환자의 긍정적인 임상 경과의 확률을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 전체-엑솜의 서열분석 또는 기존 종양 샘플 (항상 입수가능한 것은 아님) 없이, 혈액 샘플에 대한 간단한 분석에 기반할 수 있어, 유익하다.
이에, 본 발명은 후술한 바람직한 구현예들을 제공함으로써 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료의 임상 경과를 예측하기 위한 개선된 수단을 제공한다:
1. 인간 암 환자의 면역 체크포인트 차단제 치료에 대한 치료 반응의 확률을 예측하는 방법으로서,
a) 환자에서 수득한 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준을 측정하는 단계; 및
b) 인간 혈액 샘플에서 측정된 hGDF-15 수준을 토대로 치료 반응의 확률을 예측하는 단계를 포함하며; 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 감소는 치료 반응의 확률 증가를 의미하는 것이고, 상기 암이 고형 암인, 방법.
2. 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하는 방법으로서,
a) 환자에서 수득한 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준을 측정하는 단계; 및
b) 인간 혈액 샘플에서 측정된 hGSD-15의 수준을 토대로 생존 확률을 예측하는 단계를 포함하며; 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 감소는 생존 확률 증가를 의미하는 것이고, 상기 암이 고형 암인, 방법.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 단계 b)가 단계 a)에서 측정된 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교하는 것을 포함하며, 상기 확률은 단계 a)에서 측정된 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교한 결과를 토대로 예측하며; 상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준이 hGDF-15 역치 수준과 비교해 낮은 경우는, 상기 확률이 상기 hGDF-15 역치 수준 이상에서의 확률 보다 높은 것을 의미하는, 방법.
4. 항목 1, 2 또는 3에 있어서, 상기 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플인, 방법.
5. 항목 4에 있어서, 상기 hGDF-15 역치 수준이 1.2 ng/ml 내지 8.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 1.5 ng/ml 내지 7.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 hGDF-15 역치 수준 2.0 ng/ml 내지 6.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 hGDF-15 역치 수준이 2.5 ng/ml 내지 5.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 hGDF-15 역치 수준이 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준인, 방법.
6. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 hGDF-15 역치 수준 대비 인간 혈액 샘플내 hGDF-15 수준의 감소는, 상기 확률의 증가 수준이 > 5%, > 10%, > 20%, > 30%, > 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80% 또는 > 90%임을 의미하는, 방법.
7. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 고형 암이 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 위암 (gastric cancer), 신장암, 유잉 육종, 비-소 세포성 폐암 및 소 세포성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 암이 바람직하게는 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 암이 더 바람직하게는 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암 및 위암 (stomach cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
8. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 암이 흑색종, 구강 편평 세포암, 결장직장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 암이 흑색종인, 방법.
10. 항목 9에 있어서, 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 상기 hGDF-15 역치 수준이 바람직하게는 3.2 ng/ml 내지 3.7 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 상기 hGDF-15 역치 수준이 가장 바람직하게는 3.4 ng/ml의 hGDF-15 수준인, 방법.
11. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 a)가 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 이용함으로써 hGDF-15의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
12. 항목 11에 있어서, 상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 hGDF-15와 복합체를 형성하는, 방법.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, 상기 하나 이상의 항체가 하나 이상의 다클론 항체를 포함하는, 방법.
14. 항목 11, 12 또는 13에 있어서, 상기 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 영역이 하나 이상의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는, 방법.
15. 항목 14에 있어서, 상기 결합이 hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이며, 상기 입체형태적 또는 불연속 에피토프가 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성되는, 방법.
16. 항목 14 또는 15에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 아미노산 서열 ser-ala-ser을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 방법.
17. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역 체크포인트 차단제가 하기 저해제로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는, 방법:
i) 인간 PD-1의 저해제로서, 바람직하게는 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및
ii) 인간 PD-L1의 저해제로서, 바람직하게는 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
18. 항목 17에 있어서, 상기 면역 체크포인트 차단제가 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는, 방법.
19. 항목 17 또는 18에 있어서, 상기 면역 체크포인트 차단제가 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하는, 방법.
20. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 상기 면역 체크포인트 차단제 처리를 받았던 환자의 샘플인, 방법.
21. 항목 20에 있어서, 상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 면역 체크포인트 차단제 및/또는 이의 생물학적 대사산물을 함유하는, 방법.
22. 전술한 1-19 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 어떠한 면역 체크포인트 차단제 치료도 제공받지 않았던 환자의 샘플인, 방법.
23. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법인, 방법.
24. 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 a)에서, 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 효소 연계된 면역흡착 분석에 의해 측정되는, 방법.
25. 항목 1-23 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 a)에서, 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 전기화학발광 분석에 의해 측정되는, 방법.
26. 항목 25에 있어서, 상기 전기화학발광 분석이 하기 (A), (B), (C) 및 (D) 간의 검출 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 샌드위치 검출 방법이고:
(A) 스트렙타비딘-코팅된 비드 또는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 나노입자;
(B) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
(C) 샘플 유래의 hGDF-15; 및
(D) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
상기 검출 복합체가 구조 (A)-(B)-(C)-(D)를 가지며, 상기 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프에 결합하고, 루테늄 복합체가 표지된 상기 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합하며,
상기 방법이 전기화학발광을 측정함으로써 검출 복합체를 검출하는 단계를 더 포함하고,
상기 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 전기화학발광 측정치를 토대로 결정되는, 방법.
27. 항목 1 및 3-26 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플이고, 상기 치료 반응의 확률은 연속형 예측인자 (continuous predictor)로서 혈청내 ng/ml 단위의 hGDF-15 수준에 대한 오즈비 (odds ratio) 0.389를 이용해 예측되며, 95% 신뢰 구간이 0.159 - 0.698인, 방법.
28. 항목 1 및 3-27 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 치료 반응이 버전 1.1의 RECIST 기준에 따른 반응인, 방법.
29. 항목 2-26 중 어느 한 항목에 있어서, 생존 확률은 경과 변수 (outcome variable)로서 전체 생존의 위험비 (hazard ratio)와 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용해 예측하며, 혈청내 GDF-15 수준 1 ng/ml 증가 당 95% 신뢰 구간 1.10 - 1.47에서 사망 위험도 1.27배 증가로 예측되는, 방법.
30. 항목 11-29 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 a)에서, 항목 14-16 중 어느 한 항목에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로 hGDF-15을 포획하고, 다클론 항체를 사용해 hGDF-15을 검출하거나, 또는 hGDF-15을 포획하는 항체와 다른 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 사용해 hGDF-15을 검출함으로써, hGDF-15의 수준을 측정하는, 방법.
31. 항목 1-30 중 어느 한 항목에 따라 수행하도록 구성된 장치.
32. 항목 28에 있어서, 상기 장치가 항목 25 또는 26에 따른 방법을 수행하도록 구성된 전기화학발광 분석기인, 장치.
33. 검출 키트로서,
(i) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
(ii) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
(iii) 재조합 hGDF-15;
(iv) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및 선택적으로
(v) 사용 설명서, 바람직하게는 항목 1-30에 따른 방법에 이용하기 위한 사용 설명서를 포함하며,
상기 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있으며, 루테늄 복합체가 표지된 상기 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있는, 키트.
34. 항목 33에 있어서, 상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역 및 hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역 중 하나가 항목 15-16에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 영역인, 키트.
35. 암이 고형 암인 인간 암 환자의 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응을 예측하기 위한 시험관내 방법에 있어서의 항목 33-34에 따른 키트의 용도.
36. 암이 고형 암인 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 시험관내 방법에서의 항목 33-34에 따른 키트의 용도.
37. 항목 33-36 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 면역 체크포인트 차단제가 항목 17-19 중 어느 한 항목에 따라 정의되는 것인, 용도.
도 1: 치료 용법에 대한 반응자 및 비-반응자에서의 혈청내 GDF-15의 수준을 도시한다.
도 2: 혈청내 hGDF-15 수준이 각각 <1.8 ng/ml, 1.8-4.2 ng/ml 및 >4.2 ng/ml인 환자 그룹들에서 반응자 및 비-반응자의 수를 도시한다.
도 3: 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용한 일반화 선형 모델에 의해 예측된 치료 반응 확률 (반응자 1). 원 표시는 데이타이고, 곡선은 모델을 표시한다. 수직 선은 치료 반응의 확률이 0.5일 때의 GDF-15 농도를 표시한다.
도 4: 혈청내 GDF-15 수준에 따른 3개의 그룹 (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml)에서의 카플란-마이어 생존 그래프.
도 5: 도 5A: 연속형 예측인자로서 LDH를 이용한 일반화 선형 모델에 의해 예측된 치료 반응의 확률 (반응자 1). 원은 데이타를 나타내고, 곡선은 모델을 나타낸다. 수직 선은 치료 반응의 확률이 0.5일 때의 LDH 농도를 표시한다. 환자 코호트는 동일하였다. 그러나, 환자 4명은 용혈 반응으로 인해 LDH 수치에 대한 신뢰성 있는 측정에 실패하였다. 도 5B: 반응자 및 비-반응자와 이들 각각의 hGDF-15 및 LDH 수준을 나타낸 그래프. 전체 반응자들을 커버하도록 컷-오프 값을 선정한 경우, GDF-15에 기반한 검사는 (9명 중) 6명의 비-반응자를 동정할 수 있지만, LDH 수준에 기반한 분석에서는 비-반응자 (9명 중) 4명만 식별할 수 있었다. LDH 검사에서, 용혈 샘플 4개를 제외시켜야 하였으며, 그래서 데이타의 손실이 발생하였다.
도 6: 도에 나타낸 바와 같이 GDF-15 및 T 세포 마커 단백질인 CD3 및 CD8 각각을 면역조직화학법으로 염색한, GDF-15 면역반응성이 없거나 (상단 패널) 또는 높은 (하단 패널) 흑색종 뇌 전이에서 수득된 조직 단편의 예를 도시한 것이다. CD3 및 CD8-양성 세포는 GDF-15 수준이 높은 샘플에 화살표로 표시된다. CD3 및 CD8 염색은 일련의 단편들에서 동일한 부위를 대상으로 수행되었다 (그러나, 동일한 섹션은 아님).
도 7: 여러가지 흑색종 뇌 전이에서 GDF-15 스코어에 따른 CD3+ 세포의 %를 나타낸 그래프 (7A)와 여러가지 흑색종 뇌 전이에서 GDF-15 스코어에 따른 CD8+ 세포의 %를 나타낸 그래프 (7B)이다.
도 8: 여러가지 종양 (흑색종, CRC, RCC, NSCLC 및 SCLC)에서 기원한 뇌 전이에서 CD8+ T 세포% 및 CD3+ T 세포% 각각에 따른 GDF-15 스코어를 도시한 그래프이다.
도 9: 도 9A는 초당 시계 (field of view) 당 롤링 T 세포 (rolling T 세포)의 수를 나타낸 것이다. 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")에서 입수하였다. 도 9B는 (픽셀 수/0.2초로 측정한) T 세포의 롤링 속도를 나타낸 것이다. 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")에서 입수하였다. 도 9C는 시계 당 부착 세포의 수를 나타낸 것이다. 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")에서 입수하였다. 도 9D는 시계 당 부착 세포의 수를 나타낸 것이다. 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")에서 입수하였다.
도 10: 롤링 T 세포 수/시계/s를 도시한 것이다. 데이타는 채널 # 1 ("음성 대조군"으로서 무자극 HUVEC 상의 대조군 T 세포), 채널 # 2 ("양성 대조군"으로서 자극된 HUVEC 상의 대조군 T 세포), 채널 # 3 ("GDF-15"), 채널 # 4 ("UACC 257": 분비된 GDF-15을 함유한 UACC 257 흑색종 세포의 상층액 중에 배양한 T 세포) 및 채널 # 5 ("UACC257 + anti-hGDF-15": hGDF-15 저해제로서 항-hGDF-15 항체 B1-23를 사용해 분비된 GDF-15을 고갈시킨 UACC 257 흑색종 세포의 상층액 중에 배양한 T 세포).
도 11: GDF-15 수준이 각각 <1.5 ng/ml 및 ≥1.5 ng/ml인 환자 그룹에서의 누적 생존율.
도 12: GDF-15 수준이 높은 환자 그룹 (즉, GDF-15 수준이 가장 높은 환자 50명) 및 GDF-15 수준이 낮은 환자 그룹 (즉, GDF-15 수준이 가장 낮은 환자 49명) 각각에서의 누적 생존율 (전체 실험 코호트의 중앙값 분할 (median split)).
도 13: hGDF-15 혈청 수준은 종양의 돌연변이 부담과 유의한 상관관계가 성립되지 않는다. 암 환자의 샘플내 hGDF-15 mRNA 수준을 암에서 동정된 체세포 돌연변이의 수에 대해 그래프로 작성하였다. 체세포 돌연변이는 엑솜 서열분석을 이용해 확인하였다. 데이타는 취리히 대학 병원의 UZH 웹툴을 사용해 분석하였다 (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). 도 13A는 고 등급의 악성 흑색종 환자만을 고려한 암 게놈 아틀라스 (TGCA)로부터 입수한 암 환자 데이타 그래프를 도시한다 (암 게놈 아틀라스는 Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183 문헌에 기술됨). GDF-15 발현은 RSEM ("RNA Seq by expectation maximization") 소프트웨어 패키지를 이용한 정규화에 의해 분석하였다 (Li B and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). 도 13B는 각각 분석한 취리히 대학 병원에서 입수한 추가적인 전이 악성 흑색종 환자 40명의 암 환자 데이타를 그래프로 도시한다.
도 14: 야생형 종양 또는 형질전환 (tg) hGDF-15을 과발현하는 종양을 가진 마우스에서 CD8a에 대한 면역조직화학 사진을 도시한다. 조직 단편은 anti-CD8a (1:100 희석; 4SM15 항체, eBioscience)로 염색하였다.
정의 및 일반 기법
하기에서 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 용어들은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 일반적인 의미로 이해될 것이다.
본원에서, 용어 "항체"는 Paul, W.E. (Ed.).: Fundamental Immunology 2nd Ed. Raven Press, Ltd., New York 1989의 제7장에 전체적으로 기술된 바와 같이, 대상 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 기능성 항체를 지칭하며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어 "항체"는, 특별히 제한되지 않으며, 닭 및 포유류 등의 임의의 적절한 공급 종들, 예를 들어 마우스, 염소, 인간을 제외한 영장류 및 인간 유래의 항체들을 망라한다. 바람직하게는, 항체는 인간화 항체이다. 항체는 바람직하게는 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는 단일클론 항체이다. 용어 "항체"는 IgG-1, -2, -3, 또는 -4, IgE, IgA, IgM 또는 IgD 이소형 항체를 포괄한다. 용어 "항체"는 모노머 항체 (예, IgD, IgE, IgG) 또는 올리고머 항체 (예, IgA 또는 IgM)를 포함한다. 또한, 용어 "항체"는, 특별히 제한되지 않으며, 유전자 조작된 항체, 예를 들어, 키메라 항체 등의 변형 항체 및 단리된 항체를 포함한다.
항체의 도메인에 대한 명명은 당해 기술 분야에 공지된 용어에 따른다. 항체의 각 단량체는 당해 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함한다. 이 중, 각 중쇄 및 경쇄는 항원 결합에 중요한 가변성 도메인 (중쇄의 경우 VH로 지칭되고, 경쇄의 경우 VL로 지칭됨)을 포함한다. 이들 중쇄 가변성 도메인과 경쇄 가변성 도메인은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 (FR, 프래임워크 영역; CDR, 과가변성 영역이라고도 하는 상보성 결정부)를 포함한다. 항체 서열에서 전술한 항체 영역들의 동정 및 지정은 일반적으로 Kabat 등 (Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1983) 또는 Chothia 등 (Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989 Dec 21-28;342(6252):877-83)에 따르거나, 또는 Giudicelli 등 (IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32(Web Server issue):W435-40)에 기술된 IMGT/V-QUEST 소프트웨어를 사용해 수행될 수 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 바람직하게는, 상기에 언급된 항체 영역들은 IMGT/V-QUEST 소프트웨어를 이용함으로써 동정 및 지정된다.
"단일클론 항체"는 서열 상 실질적으로 동일한 항체들로 된 기본적으로 균일한 집단으로부터 유래되는 항체이다 (즉, N-말단 및 C-말단에 아미노산 변형 등의 자연적으로 발생하는 서열 변형을 포함하는 최소 일부 항체를 제외하고는 동일함). 하나의 에피토프 또는 복수의 여러가지 에피토프에 대한 다양한 항체들로 된 혼합물을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론 항체는 동일한 에피토프에 관한 것으로, 즉 특이성이 높다. 용어 "단일클론 항체"는, Kohler and Milstein (Nature, 1975 Aug 7;256(5517):495-7) 또는 Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)에 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조된 항체에서와 같이, (비-제한적으로) 하나의 세포 클론으로부터 파생되는 단일클론 세포 집단으로부터 수득되는 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 또한 Clackson et al. (Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8) 또는 Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97)에 기술된 방법과 같은 파지 디스플레이 기법 등의 다른 적절한 방법으로부터 수득할 수 있다. 단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해 Kd 수치 감소, 최적화된 결합 및 해리 카이네틱스 등의 항원 결합성 측면에서 최적화된 항체일 수 있다. 예를 들어, Kd 수치는 친화성-성숙화된 단일클론 항체를 만드는, 파지 디스플레이 등의 디스플레이 방법을 통해 최적화될 수 있다. 용어 "단일클론 항체"가 오리진의 하나의 단일 종 또는 오리진의 특정 종으로부터 유래되는 항체 서열로 제한되는 것은 아니다. 즉, 용어 "단일클론 항체"의 의미는 인간화된 단일클론 항체 등의 키메라 단일클론 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 인간 서열과 대상 항원에 대한 결합 특이성을 부여하는 최소한의 비-인간성 서열 영역을 포함하는 항체이다 (예, 인간 GDF-15). 전형적으로, 인간화 항체는 인간 어셉터 항체로부터 유래된 과가변성 영역 서열을 대상 항원 (예, 인간 GDF-15)에 결합하는 비-인간성 도너 항체 (예, 마우스, 토끼, 랫 도너 항체)로부터 유래된 과가변성 영역 서열로 치환함으로써 제조된다. 일부 경우에, 어셉터 항체의 프래임워크 영역 서열 역시 도너 항체의 대응되는 서열로 치환될 수 있다. "인간화 항체"는, 도너 및 어셉터 항체로부터 유래되는 서열 외에도, 다른 (부가적인 또는 치환) 잔기 또는 서열을 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 이러한 다른 잔기 또는 서열은 결합성과 같은 항체 특성 (예, Kd 수치 감소) 및/또는 면역원성 (예, 인간에서 항원성 감소)을 추가로 개선하도록 제공될 수 있다. 인간화 항체를 제조하는 방법에 대한 비-제한적인 예들은 당해 기술 분야에, 예를 들어, Riechmann et al. (Nature. 1988 Mar 24; 332(6162):323-7) 또는 Jones et al. (Nature. 1986 May 29-Jun 4; 321(6069):522-5)에 공지되어 있다.
용어 "인간 항체"는 인간 가변성 도메인 서열과 불변 도메인 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 이 정의는 결합성 (예, Kd 수치 감소) 및/또는 면역원성 (예, 인간에서 항원성 감소)와 같은 항체 특성을 추가로 개선시키기 위해 이용할 수 있는, 하나의 아미노산 치환 또는 변형을 보유한 인간 서열을 가진 항체를 포함한다. 용어 "인간 항체"는 비-인간 서열의 일부가 대상 항원에 대한 결합 특이성을 부여하는 인간화 항체를 배제한다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역"은 항원 (예 hGDF-15, PD-1 또는 PD-L1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 능력을 보유한 항체의 영역을 의미한다. 이런 능력은, 예를 들어, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해 항원에 대한 특이적인 결합에 대해 항체와 경쟁하는 항원-결합 영역의 능력을 측정함으로써, 결정할 수 있다. 항원-결합 영역은 항체의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 항원-결합 영역은, 특별히 제한되지 않으나, 재조합 DNA 방법 및 항체의 화학적 또는 효소적 단편화에 의한 제조 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 제조할 수 있다. 항원-결합 영역은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 항체 (scFv), 단일-도메인 항체, 다이아바디 (diabody) 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력을 보유한 항체의 임의의 다른 영역(들)일 수 있다.
"항체" (예, 단일클론 항체) 또는 "항원-결합 영역"은 유도체화될 수 있거나, 또는 다른 분자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체에 연결될 수 있는 분자로는 다른 단백질 (예, 다른 항체), 분자 표지 (예, 형광 분자, 발광 분자, 착색 분자 또는 방사성 분자), 약제학적 물질 및/또는 독성 물질이 있다. 항체 또는 항원-결합 영역은 직접 연결되거나 (예, 2개의 단백질 간의 융합 형태) 또는 링커 분자 (예, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 화학적 링커 타입)를 통해 연결될 수 있다.
본원에서, 용어 "결합" 또는 "결합한다"는 대상 항원 (예, 인간 GDF-15)에의 특이적인 결합을 의미한다. 바람직하게는, Kd 수치는 100 nM 미만, 더 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 5 nM 미만, 가장 바람직하게는 2 nM 미만이다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 항체에 대한 결합부를 형성하는 항원의 작은 일부를 지칭한다.
본원의 맥락에서, 항체의 결합성을 규명할 목적으로, 대상 항원 (예, 인간 GDF-15)에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 결합 또는 경쟁적인 결합은 바람직하게는 후술한 바와 같이 참조 표준 방법으로서 표면 플라스몬 공명 측정을 이용해 측정한다.
용어 "KD" 또는 "KD 수치"는 당해 기술 분야에 공지된 평형 해리 상수이다. 본원의 맥락에서, 이들 용어는 특정 대상 항원 (예, 인간 GDF-15)에 대한 항체의 평형 해리 상수를 지칭한다. 평형 해리 상수는 복합체 (예, 항원-항체 복합체)가 구성 요소들 (예, 항원 및 항체)로 가역적으로 해리되는 경향을 나타내는 척도이다. 본 발명에 따른 항체에서, KD 수치 (예, 항원 인간 GDF-15에 대한 KD 수치)는 바람직하게는 후술한 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 측정된다.
본원에서, "단리된 항체"는 공급 환경의 구성 요소들 대부분으로부터, 예를 들어 제조에 사용된 (예, 항체를 재조합으로 발현하는 생산 세포, 예를 들어 CHO 세포) 하이브리도마 세포 배양물 또는 다른 세포 배양물의 구성 요소들로부터 단리 및 분리된 항체이다. 분리는 바람직한 용도 (본 발명에 따른 anti-인간 GDF-15 항체의 치료학적 용도)에 대한 항체의 적합성을 방해할 수 있는 성분들을 충분히 제거하도록 수행된다. 단리된 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 단백질 A 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 체류 여과 및 한외여과 등이 있다. 바람직하게는, 단리된 항체 제제는 라우리 단백질 분석을 이용한 측정에 따르면 순도가 70 % (w/w) 이상, 더 바람직하게는 80 % (w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 90 % (w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 95 % (w/w) 이상, 가장 바람직하게는 99 % (w/w) 이상이다.
본원에서, "다이아바디"는 동일 체인 상에서 2개의 도메인들 간에 쌍 형성을 허용하기에는 매우 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결된 동일한 폴리펩타이드 체인 상에 중쇄 가변성 도메인과 이와 연결된 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 작은 2가 항원-결합성 항체 영역이다. 이로써, 다른 체인의 상보성 도메인들과의 쌍 형성과, 2개의 항원 결합부를 가진 이량체 분자의 조립이 이루어진다. 다이아바디는 2가의 단일 특이성 (예, 인간 GDF-15에 대해 2개의 항원 결합부를 가진 다이아바디)일 수 있거나, 또는 이가의 2중 특이성 (예, 하나는 인간 GDF-15에 대한 결합부이고 다른 하나는 다른 항원의 결합부인, 2개의 항원 결합부를 가진 다이아바디)일 수 있다. 다이아바디에 대한 상세한 설명은 Holliger P et al. ("Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments." Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8)에서 찾아 볼 수 있다.
"단일-도메인 항체" ("NanobodyTM"로도 지칭됨)는 본원에서 단일한 모노머 형태의 가변적인 항체 도메인으로 구성되는 항체 단편이다. 단일-도메인 항체의 구조 및 제조 방법은 당해 기술 분야에, 예를 들어 Holt LJ et al. ("Domain antibodies: proteins for therapy." Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90.), Saerens D et al. ("Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics." Curr Opin Pharmacol. 2008 Oct;8(5):600-8. Epub 2008 Aug 22.) 및 Arbabi Ghahroudi M et al. ("Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies." FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3):521-6)에 공지되어 있다.
본원에서, 용어 "유의한", "유의하게" 등은 본원에 언급된 방법에 의해 측정된 바와 같이, 당해 기술 분야에 잘 알려진 적절한 방법에 의해 측정되는 바와 같이 값들 간의 통계학적으로 유의한 차이를 지칭한다.
본원에서, 용어 "포함하는"은 각각 선택적으로 용어 "구성되는"으로 치환될 수 있다.
용어 "암" 및 "암 세포"는 본원에서 당해 기술 분야에서 통상적인 의미로 사용된다 (예, Weinberg R. et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: New York 2006. 850p., 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명에 따른 임상적인 경과를 예측하고자 하는 암은 고형 암이다. "고형 암"은 한가지 이상의 고형 종양을 형성하는 암이다. 고형 종양을 형성하는 이러한 고형 암은 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 용어 "고형 암"은 암에 의해 형성된 원발성 종양과 또한 전이라고도 하는 잠재적인 이차 종양을 둘다 포괄한다. 바람직한 고형 암은 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 위암 (gastric cancer), 신장암, 유잉 육종, 비-소 세포성 폐암 및 소 세포성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암 및 위암 (stomach cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 흑색종, 결장직장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 언급되는 바와 같이, 용어 "뇌암"은 당해 기술 분야에 공지된 모든 뇌암을 지칭한다. 이는, 신경교종 (WHO 등급 I-IV), 성상세포종, 수막종 및 수모세포종 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, "두경부암"은 당해 기술 분야에 공지된 모든 두경부암을 지칭한다. 이러한 것으로는, 식도암, 구강 편평 세포암 및 하인두암 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 특히 바람직한 두경부암은 구강 편평 세포암이다.
본원에서, "암의 치료" 또는 "암을 치료하는" 등의 용어들은 치료학적 처치 (therapeutic treatment)를 의미한다.
본원에서, 암의 치료는 1차 요법 (first-line therapy), 2차 요법 또는 3차 요법이거나, 또는 3차 이후의 요법일 수 있다. 이들 용어의 의미는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 미국 국립 암 기관에서 통상적으로 사용되는 용어 명명에 따른다.
암의 치료는 부가적인 또는 이차적인 치료학적 이점들이 환자들에서 나타나는 것 역시 배제하지 않는다. 예를 들어, 부가적인 또는 이차적인 이점은 암으로 인한 체중 감소에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 본원에 언급된 "암의 치료"가 암 자체를 치료하기 위한 것으로 이해되며, 임의의 이차적인 또는 부가적인 작용이 암의 치료의 선택적이고, 부가적인 이점을 반영하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따라 언급되는 암의 치료는 바람직하게는 암 면역요법이다. 용어 "암 면역요법"은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 환자의 면역 시스템을 이용해 암을 치료하는 암의 치료를 의미한다. 암 세포는 암 세포에 특이적이며 비-암성 세포의 항원과는 상이한 암 세포 항원을 만드는 게놈 돌연변이를 보유한다. 즉, 본 발명에서 언급되는 암 면역요법은, 바람직하게는, 이러한 암 세포 항원이 면역 시스템에 의해 인지되고, 이들 항원을 발현하는 암 세포가 면역 시스템에 의해 사멸되는, 암 면역요법이다. 암 면역요법은 당해 기술 분야에 공지된 면역모니터링 방법에 의해, 예를 들어, 세포내 (예, CD8+ T-세포 및/또는 NK 세포에서) IFN-γ 발현을 혈액 샘플에서 측정하여, 혈액 샘플에서 (예, CD8+ T-세포 및/또는 NK 세포 상의) CD107a 세포 표면 발현을 측정하여, 혈액 샘플에서 (예, 백혈구 상의) 세포내 TNF-α 발현, 혈액 샘플에서 (예, CD8+ T-세포 및/또는 CD4+ T-세포에서) 세포내 인터루킨-2 발현, 혈액 샘플에서 (예, CD8+ T-세포 및/또는 CD4+ T-세포에서) CD154 세포 표면 발현, 혈액 샘플에서 종양 항원-특이적인 T 세포에 대한 테트라머 또는 덱스트라머 염색, 종양 특이 돌연변이로부터 유래되는 신생 항원 (neoantigen)에 대한 T 세포의 존재 또는 자가 종양 세포에 대한 CTL 활성을 측정함으로써, 평가할 수 있다. 암 면역요법을 평가하기 위한 바람직한 방법은 Gouttefangeas C et al.: "Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future." (2015) In: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Chapter 25: pages 471-486에 따른 방법; Van der Burg SH, et al.: "Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer." (2014) In Cancer Immunotherapy meets oncology (CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds). Springer International Publishing Switzerland p37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1에 따른 방법이다.
본원에서, "암 면역요법"은, 선택적으로, 암을 치료하기 위해 사용되는 면역 시스템 이외에, 암 치료의 부가적인 기전들이 사용되는 치료를 포괄한다. 부가적인 암 치료 기전이 사용될 수 있는 암 면역요법의 일 예는, 공지된 화학치료제(들)과의 병용 요법이다. 공지된 화학치료제(들)와의 상기한 병용 요법은, 예를 들어, 면역 시스템을 이용해 암을 치료하는 암 치료 뿐만 아니라 암 세포를 직접 화학치료제(들)에 의해 사멸시키는 암 치료를 포함할 수 있다.
본원에서, "면역 체크포인트 차단제 치료"는 후술한 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료이다.
본 발명에 따른 예측 방법은 바람직하게는 면역 체크포인트 차단제 치료를 개시하기 전에 수행된다.
다른 예로, 본 발명에 따른 예측 방법은 또한 면역 체크포인트 차단제 치료가 이미 개시된 어느 한 시점에 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 예측 방법은 고형 암의 면역 체크포인트 차단제 치료 또는 고형 암의 또 다른 치료 (예, 암에 대해 약제학적으로 활성인 다른 제제를 이용한 치료)를 받는 환자에게 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 면역 체크포인트 차단제 치료 단계도 임의의 다른 치료 단계도 본 발명에 따른 예측 방법의 일부를 구성하지 않는 것으로 이해된다.
본원에서, 암에 대해 약제학적으로 활성인 제제는, 예를 들어, 기존의 항암제 및/또는 면역-자극 분자일 수 있다. 기존의 항암제로는, 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 클로람부실 (chlorambucil) 및 이포스파미드 (ifosfamide)와 같은 알킬화제; 아자티오프린 (azathioprine) 및 머캅토푸린과 같은 항-대사산물제; 빈카 알카로이드 (예, 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine) 및 빈데신 (vindesine)), 탁산 (예, 파클리탁셀, 도세탁셀 (docetaxel)), 에토포시드 (etoposide) 및 테니포시드 (teniposide)와 같은 알카로이드; 캄프토테신 (camptothecin) (예, 이리노테칸 (irinotecan) 및 토포테칸 (topotecan))과 같은 토포이소머라제 저해제; 액티노마이신 (actinomycin), 안트라사이클린 (anthracycline), 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 발루비신 (valrubicin), 이다루비신 (idarubicin), 에피루비신 (epirubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리카마이신 (plicamycin) 및 미토마이신 (mitomycin)과 같은 세포독성 항생제; 및 방사성동위원소 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
혈액 샘플:
본원에서, 용어 "혈액 샘플"은 전혈, 혈청 및 혈장 샘플을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 혈청 및 혈장 이외의 혈액 분획 (blood fraction)과 같은 다른 동일한 유형들도 포함된다. 이러한 샘플 및 분획들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 혈액 샘플은 hGDF-15을 함유하는 임의 혈액 샘플 타입일 수 있다. hGDF-15을 함유한 적합한 혈액 샘플 타입들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 혈청 샘플 및 혈장 샘플을 포함한다. 다른 구현예에서, hGDF-15을 함유하는 또 다른 타입의 혈액 샘플은, 또한, 예를 들어, hGDF-15이 이들 샘플에 함유되었는지, 이들 샘플에 함유된 hGDF-15의 수준을 본원에 기술된 방법을 이용해 측정함으로써, 당업자에 의해 쉽게 식별될 수 있다.
인간 환자에서 수득되는 인간 혈액 샘플이 상기한 면역 체크포인트 차단제를 제공받은 환자의 샘플인 경우, 인간 환자에서 수득되는 혈액 샘플은 면역 체크포인트 차단제 및/또는 이의 생물학적 대사산물을 함유할 수 있다.
면역 체크포인트 차단제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이의 존재는 당업자에 의해 확인될 수 있다. 치료학적 항체의 대사산물 등의 약물의 대사산물 역시 공지되어 있으며, 예를 들어 적절한 이차 항체를 이용함으로써 검출할 수 있다.
임상 경과:
본 발명에서, 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준을 이용해, 인간 암 환자에서 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료의 긍정적인 임상 경과의 확률을 예측할 수 있다.
본원에서, "긍정적인 임상 경과"는 치료학적 처치 이점에 대한 임의의 치료학적 지표일 수 있다. 이들 지표는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
즉, 본 발명에 따르면, 바람직한 구현예에서, 긍정적인 임상 경과는 면역 체크포인트 차단제 치료에 대한 인간 암 환자의 치료 반응일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 측면에서, 치료 반응의 존재 또는 부재는, 치료가 치료받은 환자 또는 환자들에서 암 증식을 저해하는지를 평가함으로써, 조사한다. 바람직하게는, 저해는 당해 기술 분야에 공지된 적절한 통계학적 검사에 의해 분석한 바와 같이 통계학적으로 유의하다. 암 증식의 저해는 본 발명에 따라 치료받는 환자 군에서의 암 증식을 무처리 환자인 대조군과 비교하거나, 또는 최신 표준 암 치료 + 본 발명에 따른 치료를 제공받은 환자 군을 최신 표준 암 치료만 제공받은 대조군 환자와 비교함으로써, 평가할 수 있다. 이러한 암 증식의 저해를 평가하기 위한 실험들은 임상 실험에서 허용되는 표준에 따라, 예를 들어 충분한 통계적 검정력을 갖춘 이중 맹검의 무작위 실험으로 설계된다.
본원에서, 용어 "암 증식"은 암의 임의의 측정가능한 증식을 의미한다. 고형 종양을 형성하는 암의 경우, "암 증식"은 시간 경과에 따른 종양 부피의 측정가능한 수준의 증가를 의미한다. 암이 오직 하나의 종양만 형성한 경우에는, "종양 증식"은 오직 하나의 종양의 부피 증가를 의미한다. 암이 전이와 같이 여러개의 종양을 형성한다면, "암 증식"은 모든 측정가능한 종양들의 부피 증가를 의미한다. 고형 종양의 경우, 종양의 부피는 자기 공명 영상화 및 컴퓨터 단층촬영 (CT 스캔) 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해 측정할 수 있다.
이러한 구현예에 대한 매우 바람직한 측면에서, 치료에 대한 반응 평가는 고형 종양, 버전 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp. 228-47)에서 반응 평가 기준을 이용한 반응자와 비-반응자의 분류에 기초한다. 마찬가지로, 이러한 척도는 본 발명에 따른 예측 방법에 특히 바람직하다.
반응을 평가하는데 적절한 시간은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 구체적인 고형 암 및 상기한 암의 중증도 및 암 질환의 해당 단계 등의 공지된 인자에 따라 당업자에 의해 선택될 것이다. 예를 들어, 치료 반응은, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 및/또는 24개월 중 어느 한 시기에 평가할 수 있다. 바람직하게는, 치료 반응은 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후 12주, 4개월 또는 6개월 후 평가한다. 반대로, 본 발명에 따른 치료 반응의 확률 예측은 상기한 시점 중 어느 한가지 이상의 시점에 제공될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 긍정적인 반응 경과는 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존율일 수 있다. 환자 군의 생존율은 당해 기술에 공지된 방법, 예를 들어 카플란-마이어 곡선에 의해 분석할 수 있다.
생존성을 평가하기 위한 적절한 시간은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 구체적인 고형 암 및 상기한 암의 중증도 및 암 질환의 해당 단계 등의 공지된 인자에 따라 당업자에 의해 선택될 것이다. 예를 들어, 생존율, 바람직하게는 단기 생존율은, 예를 들어, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후, 1개월, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 및/또는 18개월 시점에 평가할 수 있다. 단기 생존율은 바람직하게는 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 이후에 평가한다. 다른 구현예에서, 생존율, 바람직하게는 장기 생존율은 예를 들어 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월, 60개월, 6년, 7년, 8년, 9년 및/또는 10년 시점에 평가할 수 있다. 흑색종의 경우, 장기 생존율은 바람직하게는 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료 개시 후 36개월 시기에 평가한다. 역으로, 본 발명에 따른 생존 확률의 예측은 이러한 시기들 중 한가지 이상의 시기에 제공될 수 있다.
본 발명에서, 추가적인 구현예에서, "긍정적인 임상 경과"는 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 질병이 진행되지 않는 것일 수 있다. 질병의 진행 유무의 지표는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 해당 고형 암 및 암 질병의 해당 단계에 따라 당업자들에 의해 선택될 것이다.
본 발명에 따른 긍정적인 임상 경과의 확률 예측
hGDF-15 수준을 토대로 본 발명에 따라 긍정적인 임상 경과의 확률을 예측하기 위해, 전술한 예측 방법이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 통계 방법들이 적용될 수 있다.
이러한 방법에서, 면역 체크포인트 차단제를 이용해 고형 암을 앓고 있는 환자를 치료한 한가지 이상의 임상 실험에서 나온 환자 데이타는, 통계 모델을 구축하기 위한 토대로서 사용될 수 있다. 이러한 모델을 이용해, 긍정적인 임상 경과의 확률을 예측하기 위한 적절한 hGDF-15 역치 수준을 결정할 수 있다.
예를 들어, 생존율은 콕스 비례 위험 생존 모델에 의해, 예를 들어 이 모델에 GDF-15 수준 (ng/ml)을 연속형 예측인자로서 대입함으로써, 분석할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 생존 확률은 경과 변수로서 전체 생존 기간 (사망하기 까지의 기간)과 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용한 위험비 (HR)로 예측하며, 혈청내 GDF-15 수준이 1 ng/mL 증가하면, 사망 위험도는 1.27배 증가하는 것으로 예측된다 (95% 신뢰 구간 1.10 - 1.47, P=0.00109).
다른 구현예에서, 생존 확률은 범주형 예측인자로서 GDF-15을 토대로 하는 그룹핑 변수 (grouping variable), 예를 들어, <1.8 ng/ml, 1.8 - 4.2 ng/ml, >4.2 ng/ml 그룹들을 이용해 예측한다.
본 발명에 따라 임상 실험으로부터 환자 데이타의 통계 모델을 구축하기 위해 사용될 수 있는 바람직한 통계학적 방법을 실시예 1에 기술한다. 효과가 매우 유의하다는 것을 고려하면, 정확성이 낮은 통계학적 모델 역시 적합하다. 실시예 1에 기술된 통계 방법은 암의 유형 (흑색종), 면역 체크포인트 차단제의 타입 및 실시예에서 달성되는 구체적인 통계학적 수치 등의 실시예 1의 구체적인 특징들로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 오히려, 실시예 1에 언급된 이러한 방법들은 본 발명의 임의의 구현예와 연계하여 일반적으로 사용할 수 있다.
hGDF-15 수준
본 발명에 따르면, 면역 체크포인트 차단제로 치료받은 인간 암 환자에서 hGDF-15 수준과 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 처리 반응 확률) 간에 역 상관관계가 존재한다. 즉, 본 발명에서, 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 감소는, 인간 암 환자에서 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 치료 반응의 확률) 증가를 의미한다
이에, 본원에서, "인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 저하는 확률 증가를 의미한다"는 것은, 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준과 면역 체크포인트 차단제로 치료받은 인간 암 환자에서 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 치료 반응의 확률)이 역 상관관계를 따른다는 것을 의미한다. 즉, 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준이 증가할수록, 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 치료 반응의 확률)은 감소한다.
예를 들어, 본원에 정의된 본 발명에 따른 예측 방법과 연계하여, hGDF-15 역치 수준이 이용될 수 있다.
본 발명에서, hGDF-15 수준과 긍정적인 임상 경과 간의 역 상관관계는 임의의 역치 값에 적용되며, 그래서 본 발명은 특정 역치 값에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 hGDF-15 역치 수준은 바람직한 구현예에서 상기에 정의되는 hGDF-15 혈청 수준이다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 hGDF-15 역치 수준은, 긍정적인 임상 경과의 확률을 예측하기 위해 전술한 통계학적 방법을 이용함으로써, 수득하거나 및/또는 추가로 조정할 수 있다.
hGDF-15 역치 수준은 하나의 GDF-15 역치 수준일 수 있다. 또한, 본 발명은 한가지 hGDF-15 역치 수준일 수 있다. 또한, 본 발명은 2 이상의 hGDF-15 역치 수준, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 이상의 GDF-15 역치 수준의 사용을 포함한다. 또한, 본 발명은 연속선의 hGDF-15 역치 수준의 사용을 포함한다. 이러한 연속선의 hGDF-15 역치 수준에 대한 예는 도 3에 제시된다.
하나 이상의 GDF-15 역치 수준들 중 각각 하나의 GDF-15 역치 수준으로, 대응되는 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 치료 반응의 확률)을 예측할 수 있다. 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준이 본 발명에 따른 hGDF-15 역치 수준과 비교해 낮다면, 이는 긍정적인 임상 경과의 확률 (예, 생존 확률 또는 치료 반응의 확률)이 높아지는, 즉 상기한 hGDF-15 역치 수준에서 예측될 수 있는 긍정적인 임상 경과의 확률과 비교해 높아지는 것을 의미한다. 비-제한적인 예로, 실시예 1의 도 3은 hGDF-15 역치 수준의 연속선을 예시하며, 이는 치료 반응에 대응되는 예측 확률 곡선이다.
다른 비-제한적인 예에서, 치료 반응의 확률은 표 2에 나타낸 오즈비와 같은 오즈비를 토대로 예측할 수 있다. 즉, 치료 반응의 확률은 신뢰 구간 0.159 - 0.698에서 연속형 예측인자로서 혈청내 hGDF-15 수준 ng/ml에 오즈비 0.389를 적용해 예측할 수 있다.
혈액 샘플내 hGDF-15 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 혈청내 수준을 비롯하여 혈액 샘플내 hGDF-15 수준을 측정하는 바람직한 방법은 GDF-15에 대한 항체를 이용한 면역-연계된 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 GDF-15에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 (예, 농축 혈청으로부터 웨스턴 블롯팅)에 의한 hGDF-15 수준의 측정이다. 이러한 ELISA 방법은 실시예 1에 예시되지만, 루미넥스 기법 등과 같은 비드-기반의 방법도 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 혈청 수준을 비롯한 혈액 샘플내 hGDF-15 수준은 GDF-15에 대한 항체를 이용한 공지된 전기화학발광 면역분석으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기한 전기화학발광 면역분석에 Roche Elecsys® 기법이 사용될 수 있다. 다른 가능한 방법은 전기장에서 단백질을 분리한 후 신체 체액으로부터 항원-기반의 검출을 포함한다.
건강한 인간 대조군 개체의 혈청내 hGDF-15 수준의 중앙값은 < 0.8 ng/ml이다. 예상 범위는 건강한 인간 대조군에서 0.2 ng/ml 내지 1.2 ng/ml이다 (참조: Tanno T et al.: "Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease." Curr Opin Hematol. 2010 May; 17(3): 184-190).
본 발명에서, 바람직한 hGDF-15 역치 수준은 1.2 ng/ml 내지 8.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 혈청내 hGDF-15 수준, 또는 1.5 ng/ml 내지 7.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 또는 2.0 ng/ml 내지 6.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 또는 2.5 ng/ml 내지 5.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 또는 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이다.
바람직한 구현예에서, 환자의 암은 흑색종이다. 이 구현예에 대한 바람직한 측면에서, hGDF-15 역치 수준은 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 바람직하게는 3.2 ng/ml 내지 3.7 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준, 가장 바람직하게는 hGDF-15 수준 3.4 ng/ml이다.
이들 hGDF-15 혈청 수준의 경우, 본원에 제공되는 내용을 토대로, 다른 혈액 샘플에서 대응되는 hGDF-15 수준은 (예, 혈청내 hGDF-15의 상대적인 수준을 다른 혈액 샘플내 해당 수준과 비교함으로써) 당업자가 일반적으로 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 이에, 본 발명은 또한 바람직한 hGDF-15 혈청 수준 각각과 전술한 범위에 대응되는, 혈장, 전혈 및 기타 혈액 샘플에서의 바람직한 hGDF-15 수준을 포괄한다.
본 발명에 따라 사용가능한 hGDF -15에 결합할 수 있는 항체
본 발명의 방법, 장치 및 키트는 전술한 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 이용할 수 있다.
인간 GDF-15 단백질은 단일클론 항체에 의해 유익하게 타겟팅될 수 있으며 (WO2014/049087, 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 이러한 항체는, 재조합 인간 GDF-15에서 평형 해리 상수 약 790pM (참조예 1)으로 확인된 바와 같이, 인간 GDF-15에 대한 높은 결합 친화성 등의 유익한 특성을 가진 것으로, 기존에 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 사용한다. 바람직하게는, 항체는 hGDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다.
이에, 더 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하고; 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역과 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는, 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역과 아미노산 서열 ser-ala-ser을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
이에, 보다 더 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역; 아미노산 서열 ser-ala-ser을 포함하는 CDR2 영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역에 대한 전술한 구현예들에 대한 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변성 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하고; 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 영역을 포함하며, 경쇄 가변성 도메인은 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하고; 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 영역을 포함한다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역에 대한 전술한 구현예들의 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변성 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역과 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하며, 경쇄 가변성 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역과 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함한다. 이러한 구현예에 대한 바람직한 측면에서, 항체는 전술한 본 발명의 임의의 구현예들에 정의된 CDR3 서열을 가질 수 있다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역에 대한 또 다른 구현예에서, 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체 ("NanobodyTM"라고도 함)이다. 이 구현예에 대한 일 측면에서, 단일-도메인 항체는 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 이 구현예에 대한 다른 측면에서, 단일-도메인 항체는 각각 서열번호 6, ser-ala-ser 및 서열번호 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. 이 구현예에 대한 바람직한 측면에서, 단일-도메인 항체는 인간화 항체 (humanized antibody)이다.
바람직하게는, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 100 nM 이하, 20 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 더 바람직하게는 5 nM 이하, 가장 바람직하게는 0.1 nM - 2 nM의 인간 GDF-15에 대한 평형 해리 상수를 가진다.
인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역에 대한 상기 구현예들에 대한 또 다른 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ)에 기탁번호 DSM ACC3142로 기탁된 세포주 B1-23에서 수득가능한 인간 GDF-15에 대한 항체와 동일한 인간 GDF-15 에피토프에 결합한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 GDF-15에 대한 항체의 결합은 바람직하게는 참조예 1에 언급된 공정에 따라 기준 표준 방법으로서 표면 플라스몬 공명 측정법에 의해 측정한다. 인간 GDF-15 상의 동일 에피토프에 대한 결합은 세포주 B1-23으로부터 수득가능한 인간 GDF-15에 대한 항체 및 세포주 B1-23으로부터 수득가능한 인간 GDF-15에 대한 항체와 동일한 인간 GDF-15 에피토프에 결합할 것으로 예상되는 항체의 표면 플라스몬 공명 경쟁적인 결합 실험에 의해 마찬가지로 분석할 수 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성된 인간 GDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합인, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다. 이 구현예에 대한 바람직한 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 전술한 임의 구현예들 중 하나의 구현예에 따른 서열에 의해 정의되는 항체 또는 이의 항원-결합 영역이다.
전술한 구현예들에 따른 추가적인 구현예에서, 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체를 비롯한 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 예를 들어, 테그 또는 표지에 의해 변형될 수 있다.
테그는, 예를 들어, 바이오틴 테그 또는 아미노산 테그일 수 있다. 이러한 산 테그에 대한 비-제한적인 예로는 폴리히스티딘 (His-) 테그, FLAG-테그, 헴어글루티닌 (HA) 테그, 당단백질 D (gD) 테그 및 c-myc 테그 등이 있다. 테그는 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 테그는 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 정제를 보조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기한 테그는 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역의 C-말단 또는 N-말단에 존재한다.
본원에서, 용어 "표지"는 항체의 검출을 용이하게 할 수 있는 임의의 분자 또는 분자들의 군이다. 예를 들어, 표지는 HRP (horseradish peroxidase), AP (alkaline phosphatase) 또는 글루코스 옥시다제와 같이 효소일 수 있다. 효소 표지된 항체는, 예를 들어, 효소-연계된 면역흡착 분석에 사용될 수 있다. 표지는 또한 방사성 동위원소, DNA 서열 (예, 이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 항체 검출을 위해 사용될 수 있음), 형광 리포터 (fluorogenic reporter) 및 전기화학발광 그룹 (예, 루테늄 착물)일 수 있다. 표지의 대안으로서, 본 발명에 따라 사용되는 항체, 특히 인간 GDF-15에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 영역은, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 직접 검출할 수 있다.
면역 체크포인트 차단제
본 발명은 인간 암 환자에서 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료의 긍정적인 임상 경과의 확률 예측, 특히 면역 체크포인트 차단제 치료에 대한 인간 암 환자의 치료 반응의 확률 예측, 및 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존 확률 예측에 관한 것이다.
암 세포는, 암 세포에 특이적이며 비-암성 세포의 항원과 상이한, 암 세포 항원을 만드는, 게놈 돌연변이를 가진다. 따라서, 저해되지 않는 무손상 면역 시스템은, 이들 항원에 대한 면역 반응이 형성되도록, 이들 암 세포 항원을 인지하여야 한다. 그러나, 대부분의 암은 이들 항원에 대해 면역 허용 기전을 발생시킨다. 암 세포가 이러한 면역 허용을 달성하는 한가지 유형의 기전은 면역 체크포인트를 활용하는 것이다.
본원에서 "면역 체크포인트"는 일반적으로 면역 반응을 저해할 수 있는 면역 기전을 의미한다. 보다 구체적으로, 면역 체크포인트는 면역 시스템의 분자 (또는 면역 시스템의 분자 그룹)가 면역계 세포의 활성화를 저해함으로써 면역 반응을 저해하는 것을 특징으로 하는 기전이다. 면역계 세포의 활성화를 저해함으로써 면역 반응을 저해하는 면역계의 분자 (또는 분자 그룹) 역시 체크포인트 분자(들)로 알려져 있다.
본원에서, "면역 체크포인트 차단제"는 면역 체크포인트를 차단할 수 있는 분자이다. 본원에서, 용어 "면역 체크포인트 차단제"는 hGDF-15에 결합할 수 있는 항체와 같은 hGDF-15 저해제를 의미하는 것이 아니고, hGDF-15 저해제와는 다른 분자를 의미한다.
지금까지 공지된 대부분의 공통적인 면역 체크포인트 차단제는 인간 PD-1의 저해제 및 인간 PD-L1의 저해제 등의 면역 체크포인트 분자의 저해제이다. 추가적인 면역 체크포인트 차단제는 anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti-CD27, anti-CD137 뿐만 아니라 IDO의 저해제이다. 따라서, 본 발명에서 언급되는 바와 같이, 면역 체크포인트 차단제의 바람직한 형태는 면역 체크포인트 분자의 저해제이다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 차단제는 면역 체크포인트를 무시하는 공동-자극 신호의 활성인자일 수 있다.
바람직한 면역 체크포인트 차단제는 인간 PD-1의 저해제 및 인간 PD-L1의 저해제이다. 본 발명의 모든 구현예들에 대한 바람직한 일 구현예에서, 면역 체크포인트 차단제는 인간 CTLA4의 저해제가 아니다.
본원에서, "인간 PD-1의 저해제"는 인간 PD-1의 기능을 특이적으로 저해할 수 있는 임의 분자일 수 있다. 이러한 분자에 대한 비-제한적인 예로는 인간 PD-1에 결합할 수 있는 항체 및 인간 PD-1에 결합할 수 있는 DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein)이 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 언급되는 PD-1의 저해제는 인간 PD-1에 결합할 수 있는 항체이며, 더 바람직하게는 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체이다. 가장 바람직하게는, 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체는 니볼루맵 (nivolumab), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab), 피딜리주맵 (pidilizumab) 및 AMP-224로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서, "인간 PD-L1의 저해제"는 인간 PD-L1의 기능을 특이적으로 저해할 수 있는 임의 분자일 수 있다. 이러한 분자에 대한 비-제한적인 예는 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 항체 및 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein)이 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 언급되는 PD-L1의 저해제는 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 항체이며, 더 바람직하게는 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체이다. 가장 바람직하게는, 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체는 BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 및 MSB0010718C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법 및 기법
일반적으로, 본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용되는 방법 (예, 클로닝 방법 또는 항체와 관련된 방법)은 당해 기술 분야에 공지된 공정에 따라, 예를 들어, Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), 및 Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)에 기재된 공정에 따라 수행되며, 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
해당 타겟 단백질에 항체의 결합은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 해당 타겟에 대한 단일클론 항체의 결합은 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 측정으로 측정한다. 이러한 측정은 바람직하게는 참조예 1에서 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23에 대해 예시된 바와 같이 Biorad ProteOn XPR36 시스템 및 Biorad GLC 센서 칩을 이용해 수행된다.
본 발명에 따른 서열 정렬은 BLAST 알고리즘 (Altschul et al.(1990) "Basic local alignment search tool." Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402., 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용해 수행된다. 바람직하게는, 다음과 같은 파라미터들이 사용된다: 최고 타겟 서열 10; 문자 크기 3; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 코스트 (gap cost): 존재 (existence) 11, 연장 (extension) 1; 조건 구성 스코어 매트릭스 조정 (conditional compositional score matrix adjustment). 따라서, 서열과 관련하여 사용되는 경우, "동일성" 또는 "동일한" 등의 용어는 BLAST 알고리즘을 이용해 수득되는 동일성 값을 의미한다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는, 비-제한적인 예로, Siegel DL ("Recombinant monoclonal antibody technology." Transfus Clin Biol. 2002 Jan;9(1):15-22, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 언급된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ)에 기탁번호 DSM ACC3142로 기탁된 하이브리도마 세포주 B1-23에 의해 생산된다. 기탁은 2011년 9월 29일자에 행해졌다.
인간 GDF-15 (hGDF-15)의 수준은 (비-제한적인 예로) 인간 GDF-15로부터 유래된 단백질 또는 펩타이드에 대한 질량 분광측정, 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅, 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 이용한 스트립 검사 또는 인간 GDF-15에 특이적인 항체를 이용한 면역세포화학법 등의 방법에 의한 hGDF-15 단백질 수준 측정을 비롯하여 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. hGDF-15 혈청 수준을 측정하는 다른 방법은 GDF-15에 대한 항체를 이용한 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의한 hGDF-15 혈청 수준의 측정이다. 이러한 ELISA 방법은 실시예 1에서 예시된다. 다른 구현예로, hGDF-15 혈청 수준은 GDF-15에 대한 항체를 이용한 공지된 전기화학발광 면역분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, Roche Elecsys® 기법이 이러한 전기화학발광 면역분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 장치
본 발명은 또한 전술한 장치에 관한 것이다.
본 발명의 장치는 본 발명의 방법을 수행하도록 구성된 임의의 장치일 수 있다.
본원에서, 용어 "수행하도록 구성된"은 장치가 언급된 방법 단계들을 위해 구체적으로 구성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 역치 수준을 이용하는 방법을 수행하도록 구성된 장치는 상기한 특정 역치를 이용하도록 구체적으로 구성될 것이다. ELISA 측정의 경우, 흡수를 측정할 수 있는 임의의 판독기가 적합할 것이다. 비드-기반의 분석의 경우, 루미넥스 분석기 또는 유세포 측정기가 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 장치는, 비-제한적인 예로 Cobas® 4000, Cobas® 6000, Cobas® 8000, Cobas c 111 및 Cobas INTEGRA® 400 플러스 시리즈 등의 Cobas® 분석기와 같은 전기화학발광 분석기 (Elecsys®)이다.
본 발명의 키트
본 발명은 또한 전술한 키트에 관한 것이다.
키트에 포함되는 재조합 hGDF-15은 보정 (calibration) 목적으로 편리하게 사용될 수 있는 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 0 - 15 ng/ml 범위의 여러 농도를 포괄하는, 예컨대 0-1 ng/ml 범위 중 한가지 이상의 농도, 1-3 ng/ml 범위 중 한가지 이상의 농도, 3-6 ng/ml 범위 중 한가지 이상의 농도, 바람직하게는 6-10 ng/ml 범위 중 한가지 이상의 또 다른 농도, 더 바람직하게는 10-15 ng/ml 범위 중 한가지 이상의 또 다른 농도를 더 포함하는 스톡 용액의 형태로 존재할 수 있다.
이들 농도에서 복수의 hGDF-15 용액을 이용한 보정은, 예측되는 임상 경과가 불량한 환자의 혈청에서 관찰되는 hGDF-15의 높은 농도로 인해, 정확한 측정에 특히 유익할 것이다.
서열
본 발명에서 언급되는 아미노산 서열은 다음과 같다 (N-말단에서 C-말단 방향; 단문자 아미노산 코드로 표시됨):
서열번호 1 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 폴리펩타이드 서열로부터 유래되는 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인 영역):
QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC
서열번호 2 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 폴리펩타이드 서열로부터 유래되는 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3 영역을 포함하는 경쇄 가변성 도메인 영역):
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
서열번호 3 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR1 영역 펩타이드 서열):
GFSLSTSGMG
서열번호 4 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR2 영역 펩타이드 서열):
IYWDDDK
서열번호 5 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 중쇄 CDR3 영역 펩타이드 서열):
ARSSYGAMDY
서열번호 6 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR1 영역 펩타이드 서열):
QNVGTN
단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR2 영역 펩타이드 서열:
SAS
서열번호 7 (단일클론 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 경쇄 CDR3 영역 펩타이드 서열):
QQYNNFPYT
서열번호 8 (재조합 성숙 인간 GDF-15 단백질):
GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
서열번호 9 (인간 GDF-15 전구체 단백질):
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
서열번호 10 (인간 GDF-15 전구체 단백질 + N-말단 및 C-말단 GSGS 링커):
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG
서열번호 11 (Flag 펩타이드): DYKDDDDKGG
서열번호 12 (HA 펩타이드): YPYDVPDYAG
서열번호 13 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): ELHLRPQAARGRR
서열번호 14 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): LHLRPQAARGRRR
서열번호 15 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): HLRPQAARGRRRA
서열번호 16 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): LRPQAARGRRRAR
서열번호 17 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): RPQAARGRRRARA
서열번호 18 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): PQAARGRRRARAR
서열번호 19 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): QAARGRRRARARN
서열번호 20 (인간 GDF-15로부터 유래된 펩타이드): MHAQIKTSLHRLK
서열번호 25 (B1-23에 결합하는 GDF-15 에피토프의 일부를 포함하는 GDF-15 펩타이드):
EVQVTMCIGACPSQFR
서열번호 26 (B1-23에 결합하는 GDF-15 에피토프의 일부를 포함하는 GDF-15 펩타이드):
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
본 발명에 언급된 핵산 서열은 다음과 같다 (5'에서 3' 방향; 표준 핵산 코드에 따라 표시됨):
서열번호 21 (서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT
서열번호 22 (서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT
서열번호 23 (서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC
서열번호 24 (서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 뉴클레오티드 서열):
CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG
실시예
참조예 1 - 3은 본 발명에 따른 방법, 키트 및 장치에 사용될 수 있는 hGDF-15에 대한 항체를 예시한다. 이 hGDF-15 항체는 WO 2014/049087에 공지된 단일클론 항체이며, 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
참조예 1 : GDF-15 항체 B1-23 제조 및 특징 규명
항체 B1-23를 GDF-15 넉아웃 마우스에서 구축하였다. 재조합 인간 GDF-15 (서열번호 8)을 면역원으로 사용하였다.
mAb-B1-23를 생산하는 하이브리도마 세포주 B1-23는, 독일 97070 뷔츠부르크 산데링 2 율리우스-막시밀리안스-유니버시티트 뷔츠부르크에 의해, 부다페스트 조약 하에 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMSZ)에 기탁번호 DSM ACC3142로 기탁되었다.
상업적으로 이용가능한 검사 스트립 시스템을 사용해, B1-23를 IgG2a (kappa 체인) 이소형으로서 동정하였다. 표면 플라스몬 공명 측정을 이용해, 해리 상수 (Kd)를 다음과 같이 측정하였다:
본 발명에 따른 단일클론 anti-인간-GDF-15 항체 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 결합성을, Biorad ProteOn XPR36 시스템 및 Biorad GLC 센서 칩을 이용한 표면 플라스몬 공명 측정을 이용하여 측정하였다:
바이오센서를 제조하기 위해, 재조합 성숙형 인간 GDF-15 단백질을 플로우 셀 1 및 2에 고정하였다. 하나의 플로우 셀에는, 베큘로바이러스-형질감염된 곤충 세포 (HighFive 곤충 세포)로부터 유래된 재조합 GDF-15을, 다른 셀에는 E. coli에서의 발현으로부터 유래된 재조합 단백질을 사용하였다. Sulfo-NHS (N-하이드록시설포숙신이미드) 및 EDC (1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카르보디이미드하이드로클로라이드) (Biorad ProteOn Amine Coupling Kit)를 제조사의 권고에 따라 사용하여 GLC 센서 칩을 활성화한 다음 센서 표면에 약 600RU (1Ru = 1pg mm-2) 이하의 밀도로 단백질을 로딩하였다. 1M 에탄올아민 pH8.5를 관류하여 반응하지 않은 커플링 기들을 퀀칭시키고, 칩에 런닝 완충제 (10M HEPES, 150mM NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4, HBS150로 지칭됨)를 관류시켜 바이오센서를 평형화하였다. 대조군으로서 2개의 플로우 셀을 사용하였으며, 하나는 단백질 커플링을 하지 않은 빈 것이며, 다른 하나는 동일한 커플링 화학 및 동일한 커플링 밀도를 이용해 고정시킨 비-생리학적 단백질 파트너 (인간 인터루킨-5)의 커플링이다. 상호작용을 측정하기 위해, anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23를 HBS150에 용해하고, 분석물로서 6가지 다른 농도로 사용하였다 (농도: 0.4, 0.8, 3, 12, 49 및 98 nM). 분석물을, 간헐적인 재생을 방지하기 위해 원-샷 카이네틱스 셋업을 이용해 바이오센서 상에 분석물을 관류시켰으며, 모든 측정은 25℃에서 유속 100㎕ min-1에서 수행하였다. 프로세싱을 위해, 모든 다른 SPR 데이타에서 빈 플루오 셀 (플루오 셀 3)의 SPR 데이타를 제하여, 센서 매트릭스에 대한 벌크 페이스 효과 및 비-특이적인 결합을 제거하였다. 입수한 센소그램을 소프트웨어 ProteOn Manager version 3.0을 사용해 분석하였다. 결합 카이네틱스를 분석하기 위해, 1:1 Langmuir-타입의 상호작용을 추정하였다. 결합 속도 상수 값 5.4+0.06x105 M-1s-1 (kon) 및 해리 속도 상수 값 4.3+0.03x10-4 s-1 (koff)을 측정할 수 있었다 (이들 값들은 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23과 곤충 세포 발현으로부터 유래된 GDF-15와의 상호작용에 대한 것임). 평형 해리 상수를 등식 KD = koff/kon으로 계산하여, 약 790pM 값을 산출하였다. E. coli 발현으로부터 유래된 GDF-15와 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 상호작용에 대한 친화성들은 2배 미만의 차이가 있으며, 곤충 세포 유래 GDF-15와 E.coli 유래 GDF-15 간의 속도 상수는 약 45% 차이를 보이며, 즉 SPR 측정의 정확도 범위내이며, 친화성에 실제 차이를 반영하지 않을 가능성이 있다. 사용 조건에서는, anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23는 인간 인터루킨-5에 결합하지 않는 것으로 보이며, 즉 상호작용 데이타와 anti-인간 GDF-15 mAb-B1-23의 특이도가 검증된다.
(베큘로바이러스-형질감염된 곤충 세포에서 발현된) 재조합 인간 GDF-15의 아미노산 서열은 다음과 같다:
GSARNGDHCP LGPGRCCRLH TVRASLEDLG WADWVLSPRE VQVTMCIGAC PSQFRAANMH AQIKTSLHRL KPDTVPAPCC VPASYNPMVL IQKTDTGVSL QTYDDLLAKD CHCI (서열번호 8)
이에, 표면 플라스몬 공명 측정법을 이용하여, 해리 상수 (Kd) 790pM을 측정하였다. 비교로서: 치료학적으로 사용되는 항체인 리툭시맵은 유의하게 낮은 친화도를 가진다 (Kd = 8 nM).
mAb B1-23가 암 세포의 증식을 시험관내에서 저해하고, mAb B1-23가 종양의 증식을 생체내에서 저해한다는 것은 종래에 입증되었다 (WO2014/049087).
참조예 2 : mAb B1-23는 인간 GDF-15의 입체형태적 또는 불연속 에피토프를 인지한다.
에피토프 맵핑: GDF-15로부터 유래된 13mer 선형 펩타이드에 대한 단일클론 마우스 항체 GDF-15
항원: GDF-15:
GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG (링커를 가진 322개의 아미노산)(서열번호 10)
단백질 서열을 아미노산 하나가 쉬프트된 13mer 펩타이드로 번역하였다. 절단형 펩타이드를 방지하기 위해 C-말단 및 N-말단을 중성 GSGS 링커를 사용해 연장하였다 (진한 글자).
대조군 펩타이드:
Flag: DYKDDDDKGG (서열번호 13), 78 spots; HA: YPYDVPDYAG (서열번호 14), 78 spots (각 어레이 카피)
펩타이드 칩 식별인자:
000264_01 (10/90, Ala2Asp linker)
염색 조건:
표준 완충제: PBS, pH 7.4 + 0.05% Tween 20
차단 완충제: 록클랜드 차단 완충제 MB-070
인큐베이션 완충제: 표준 완충제 + 10% 록클랜드 차단 완충제 MB-070
1차 샘플: 단일클론 마우스 항체 GDF-15 (1 ㎍/㎕): 인큐베이션 완충제내에서 1:100 희석율로 16시간 동안 4℃에서 500 rpm으로 약하게 교반하면서, 염색.
2차 항체: 염소 anti-mouse IgG (H+L) IRDye680, 30분간 실온 (RT)에서 1:5000 희석하여 인큐베이션 완충제내에서 염색.
대조군 항체: 단일클론 anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), 단일클론 anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); 1시간 동안 RT에서 인큐베이션 완충제내에서 염색.
스캐너:
Odyssey Imaging System, LI-COR Biosciences
설정: 오프셋: 1mm; 해상도: 21 ㎛; 강도 녹색/적색: 7/7
결과:
표준 완충제내에서 30분간 및 차단 완충제내에서 30분간 사전-팽윤 후, 10, 12 및 15mer B7H3-유래된 선형 펩타이드가 탑재된 펩타이드 어레이를 실온에서 1시간 동안 1:5000 희석 비율로 2차 염소 anti-mouse IgG (H+L) IRDye680 항체 단독과 함께 인큐베이션하여, 2차 항체의 백그라운드 상호작용을 분석하였다. PEPperCHIP®을 표준 완충제로 2x1분 세척하고, 증류수로 헹군 다음 공기 중에 건조하였다. 리드-아웃은 Odyssey Imaging System을 해상도 21 ㎛ 및 청색/적색 강도 7/7의 조건에서 수행하였다: 탑재된 항체 염료와의 이온성 상호작용으로 인해, 일반적인 결합제 (frequent binder)로서 알려진 아르기닌-리치 펩타이드 (ELHLRPQAARGRR (서열번호 15), LHLRPQAARGRRR (서열번호 16), HLRPQAARGRRRA (서열번호 17), LRPQAARGRRRAR (서열번호 18), RPQAARGRRRARA (서열번호 19), PQAARGRRRARAR (서열번호 20) 및 QAARGRRRARARN (서열번호 21))와 베이직 펩타이드 MHAQIKTSLHRLK (서열번호 22)와의 약한 상호작용이 관찰되었다.
표준 완충제내에서 10분간 사전-팽윤시킨 후, 펩타이드 마이크로어레이를 단일클론 마우스 항체 GDF-15와 1:100 비율로 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 표준 완충제에서 반복 세척 (2x1분)한 다음 2차 항체를 1:5000 비율로 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 표준 완충제로 2x10초 세척하고, 증류수로 간단하게 헹군 후, PEPperCHIP®을 공기 중에 건조하였다. 대조군 펩타이드의 anti-HA 및 anti-FLAG(M2) 항체에 의한 염색 전과 염색 후, Odyssey Imaging System을 사용해 리드-아웃을 해상도 21 ㎛ 및 청색/적색 강도 7/7의 조건에서 수행하였다.
GDF-15에서 유래된 선형 13mer 펩타이드들 모두 과조절된 강도에서도 단일클론 마우스 항체 GDF-15와 상호작용하지 않는 것으로 확인되었다. 그러나, 어레이에 탑재된 Flag 및 HA 대조군 펩타이드의 염색에서는 양호하고, 균질한 스폿 세기가 나타났다.
종합:
항원으로부터 유래된 13mer 펩타이드들을 이용한 GDF-15에 대한 단일클론 마우스 GDF-15 항체의 에피토프 맵핑에서, 어떠한 선형 에피토프도 밝혀지지 않았다. 이 결과에 따르면, 단일클론 마우스 항체 GDF-15은 입체형태적 또는 불연속 에피토프를 인지하며 부분 에피토프에 대한 친화성이 낮을 가능성이 높다. 2차 항체 단독의 백그라운드 염색 보다 강한 임의의 GDF-15 신호가 명확하게 없어, PepSlide® 분석기를 이용한 스폿의 세기 정량과 후속적인 펩타이드 주석은 생략하였다.
참조예 3 : 질량 분광측정 에피토프 적출 (epitope excision) 및 에피토프 추출 (epitope extraction)에 의한 펩타이드 리간드 에피토프의 구조적 동정
항체 B1-23에 결합하는 재조합 인간 GDF-15의 에피토프를 에피토프 적출 방법 및 에피토프 추출 방법을 이용하여 동정하였다 (Suckau et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 December; 87(24): 9848-9852.; R.Stefanescu et al., Eur.J.Mass Spectrom. 13, 69-75 (2007)).
항체 컬럼을 제조하기 위해, 항체 B1-23를 NHS-활성화된 6-아미노헥사노익산 커플링된 세파로스에 첨가하였다. 세파로스-커플링된 항체 B1-23를 이후 0.8 ml 마이크로컬럼에 로딩하고, 차단 완충제와 세척 완충제로 헹구었다.
에피토프 추출 실험:
재조합 인간 GDF-15을 (용액 중에) 37℃에서 2시간 동안 트립신 처리하여 절단하여, 단백질내 트립신 절단부에 따라 여러가지 펩타이드를 수득하였다. 절단 완료 후, 펩타이드를 항체 B1-23가 고정된 친화성 컬럼에 로딩하였다. GDF-15의 비-결합 펩타이드와 잠재적으로 결합 펩타이드를 질량 분광측정 분석으로 분석하였다. 질량 분광측정을 이용한 펩타이드 동정은 가능하지 않았다. 이는, 면역 복합체 B1-23에서 GDF-15의 결합부가 불연속 또는 입체형태적 에피토프를 포함한다는 또 다른 지표이었다. 연속적인 선형 에피토프일 경우, 에피토프 펩타이드에 트립신 절단부가 존재하지 않는다면 절단된 펩타이드는 이의 상호작용 파트너와 결합하여야 한다. 불연속 또는 입체형태적 에피토프는, 아래에 기술된 에피토프 적출 방법에 의해 검증할 수 있었다.
에피토프 적출 실험:
친화성 컬럼 상에 고정된 항체 B1-23를 2시간 동안 재조합 GDF-15와 인큐베이션하였다. 이후, 친화성 컬럼 상에서 형성된 면역 복합체를 트립신과 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 절단 결과 재조합 GDF-15에서 파생된 여러가지 펩타이드가 생성되었다. 고정된 항체 자체는 단백질 분해에 안정적이다. 항체에 의해 차폐되어 단백질 분해로부터 보호된 절단된 GDF-15 단백질의 수득한 펩타이드를 산성 조건 (TFA, pH2)에서 용출시켜, 수집하고, 질량 분광측정에 의해 동정하였다.
MS/MS 동정을 이용한 에피토프 적출 방법으로 하기 펩타이드들을 수득하였다:
펩타이드 서열내 위치 질량 이온/전하
EVQVTMCIGACPSQFR 40-55 1769.91 590.50(3+)
(서열번호 25)
TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 94-114 2310,96 771:33(3+)
(서열번호 26)
항체 B1-23에 결합하는 인간 GDF-15의 영역은 불연속 또는 입체형태적 에피토프를 포함한다. 질량 분광측정에서 GDF-15 단백질에서 면역 복합체 형성에 기여하는, 2개의 펩타이드가 동정되었다. 이 펩타이드는 GDF-15 아미노산 서열에서 위치 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) 및 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI)으로 한정된다. 즉, 이들 2종의 펩타이드는 항체 B1-23에 결합하는 GDF-15 단백질의 에피토프를 포함한다.
본 발명은 비-제한적인 하기 실시예들에 의해 예시된다:
실시예 1 : 이필리무맵 (단일클론 anti-CTLA4 항체)으로 기존에 치료를 받았지만 완전 관해엔 실패하고, 펨브롤리주맵 (단일클론 anti-PD-1 항체)으로 치료받은, 인간 흑색종 환자에서, hGDF-15 혈청 수준은 펨브롤리주맵을 이용한 치료 개시 후 4개월간 어느 시점의 치료 반응 불량과 연관되어 있다.
본 발명자들은, 면역 체크포인트 차단제를 복용 중인 암 환자에게 hGDF-15의 저해가 유익할 수 있는지를 조사하기 위해 착수하였다. 그럴 가능성을 조사하기 위해, 이필리무맵 (단일클론 anti-CTLA4 항체)으로 기존에 치료받았었으며 임상 실험에서 펨브롤리주맵 (단일클론 anti-PD-1 항체)으로 치료받는 흑색종 환자의 혈청에서 hGDF-15 혈청 수준을 분석하였다. hGDF-15이 면역 체크포인트 차단제에 대한 환자의 반응에 영향을 미치는 지를 조사하기 위해, 수득한 hGDF-15 혈청 수준을 환자의 반응과 연관시켰다. 펨브롤리주맵을 이용한 치료 전에 환자에서 혈청을 취하였다.
본 실험과 이후의 분석을 다음과 같이 수행하였다:
임상 실험의 포함 기준:
자격 요건이 되는 환자는 18세 이상으로, 국소 요법에 불응성의 적출불가한 III기 또는 IV기 흑색종으로 조직학적으로 또는 세포학적으로 검증되었으며; 마지막 이필리무맵 투약 (최소 2회 투약, 3주 당 1회 3 mg/kg) 24주 이내에 질병 진행이 검증되었으며; 기존에 BRAF 또는 MEK 저해제 요법 또는 둘다 (BRAFV600 돌연변이 양성인 경우)을 받았으며; 필립리무맵-관련 부작용의 해소 또는 등급 0-1로 개선 및 실험 약물의 1차 투여 전 적어도 2주간 프레드니손을 10 mg/일 미만으로 투여받았으며; ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 퍼포먼스 상태가 0 또는 1이고; RECIST v1.1 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1)에 따른 측정가능한 수준의 질병을 앓고 있으며; 절대 호중구 수치 (≥1500 세포/mL), 혈소판 (≥100,000 세포/mL), 헤모글로빈 (≥90 g/L), 혈청 크레아티닌 (≤1·5 정상 상한 [ULN]), 혈청 총 빌리루빈 (≤1·5 ULN 또는 총 빌리루빈 농도가 >1·5 ULN인 환자의 경우, 다이렉트 빌리루빈 ≤ ULN), 아스파르테이트 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (≤2·5 ULN 또는 간 전이 환자의 경우 ≤5 ULN), 국제 표준 비율 또는 프로트롬빈 시간 (항응고제를 사용하지 않을 경우 ≤1·5 ULN), 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (항응고제를 사용하지 않을 경우 ≤1·5 ULN)에 대해 사전에 명시된 범위내 수치를 가진다. 환자들은 가장 최근 요법의 마지막 투여 시기와 펨브롤리주맵 1차 투여 사이에 4주 이상의 워시아웃 기간 (washout period)을 가졌다. 공지된 활성 뇌 전이 또는 암종 수막염, 활성 자가면역 질환, 전신 요법이 필요한 활성 감염, 기존의 HIV 감염 병력, 활성형 B형 간염바이러스 또는 C형 간염바이러스 감염, 12주 보다 길게 지속되는 4등급 이필리무맵-관련 부작용 또는 3등급 이필리무맵-관련 부작용 병력, 또는 임의의 다른 anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 요법을 이용한 이전 치료 병력이 있는 환자는 실험에서 제외시켰다.
환자 치료:
상기한 포함 기준을 충족시키는 인간 흑색종 환자들은 이미 (2가지 예외 사항을 가짐) 이필리무맵 (단일클론 anti-CTLA4 항체)으로 치료받은 적이 있으며, 완전 반응을 나타내는데 실패하였다. 펨브롤리주맵 (단일클론 anti-PD-1 항체)은 2 mg/(체중) 또는 10 mg/(체중)kg으로 제공되었다. 2가지 치료군들 간에 용량-의존적인 차이가 관찰되지 않아, 치료받은 환자들을 함께 평가하였다.
반응 척도:
치료에 대한 반응자 및 무-반응자 뿐만 아니라 진행성 반응 (ongoing response)을 RECIST v1.1 (response evaluation criteria in solid tumours, version 1.1)을 이용해 분류하였다 (Eisenhauer et al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). In: Eur. J. Cancer. 45, No. 2, January 2009, pp 228-47).
효소-연계된 면역흡착 분석에 의한 (ELISA) hGDF -15 혈청 수준 분석:
인간 GDF-15 혈청 수준을 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정하였다.
완충제 및 시약:
완충화된 차단 용액: 1% BSA (fraction V pH 7.0, PAA)/PBS
세척 용액: PBS-Tween (0.05%)
표준: 인간 GDF-15 (원액 농도 120 ㎍/ml, R&D Systems)
포획 항체: 인간 GDF-15 MAb (클론 147627), R&D Systems, Mouse IgG2B (catalog #MAB957, R&D Systems, 원액 농도 360 ㎍/ml)
검출 항체: 인간 GDF-15 바이오틴화된 친화성 정제한 PAb, Goat IgG (catalog #BAF940, R&D Systems, 원액 농도 9 ㎕/ml)
스트렙타비딘-HRP (Catalog #DY998, R&D Systems)
기질 용액: 10 ml 0.1 M NaOAc pH6.0 + 100 ㎕ TMB + 2 ㎕ H2O2
정지 용액: 1 M H2SO4
분석 절차:
1. 혈소판 준비:
a. 포획 항체를 PBS 중에 워킹 농도 2 ㎍/ml로 희석하였다. 96웰 마이크로플레이트 (Nunc maxisorp®)를 양쪽 끝 열 (A 및 H)을 제외하고는 희석한 포획 항체를 웰 당 50 ㎕로 첨가하여 즉각적으로 코팅하였다. A 및 H 열에는 완충제를 넣어 실험 중에 샘플이 증발되지 않게 하였다. 각 웰의 바닥부가 완전히 덮이도록 플레이트를 가볍게 두들겼다. 플레이트를 가습 챔버에 넣어, 실온 (RT)에서 밤새 인큐베이션하였다.
b. 각 웰에서 흡입하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 헹구었다.
c. 차단 용액 150 ㎕을 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
d. 각 웰에서 흡입하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 헹구었다.
2. 분석 절차:
a. 표준 물질을 준비하였다. GDF-15을 완충화된 차단 용액에 최종 농도 1 ng/ml (4.17 ㎕ GDF + 496 ㎕ 완충화된 차단 용액)로 희석하였다. 1:2 연속 희석물을 제조하였다.
b. 두플리케이트 샘플 1:20 (6 ㎕ + 114 ㎕ 완충화된 차단 용액)을 제조하였다.
c. 희석 샘플 또는 표준 물질 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음, RT에서 1시간 인큐베이션하였다.
a. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
b. 검출 항체를 최종 농도 50 ng/ml (56 ㎕ + 10 ml 차단 완충제)로 희석하였다. 각 웰에 검출 항체 희석액 50 ㎕을 첨가한 다음 RT에서 1시간 인큐베이션하였다.
c. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
d. 스트렙타비딘-HRP를 1:200 (50 ㎕ + 10 ml 차단 완충제)으로 희석하였다. 스트렙타비딘-HRP 작업 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 20분간 인큐베이션하였다.
e. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
f. 기질 용액을 제조하였다. 기질 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 20분간 인큐베이션하였다.
g. 정지 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다.
h. 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용해 즉시 각 웰의 광학 밀도를 측정하였다.
3. GDF-15 혈청 역가 계산:
a. 각 샘플/GDF-15 표준 희석액을 2세트로 사용하였다. GDF-15 역가를 측정하기 위해, 두플리케이트의 평균을 계산하고, 백그라운드 (GDF-15 무첨가 샘플)를 제하였다.
b. 표준 곡선을 작성하기 위해, 선형 범위의 값들을 X-Y-다이아그램에 피팅하고 (X 축: GDF-15 농도, Y 축: OD450), 선형 곡선 피트를 적용하였다. 농도를 알고있는 표준 희석액들의 OD450 값으로부터 보간함으로써 테스트 샘플의 GDF-15 혈청 역가를 계산하였다.
c. 샘플의 최종 GDF-15 농도를 계산하기 위해, 개별 희석 인수를 고려하였다. 표준 범위 보다 낮거나 또는 높은 OD 값을 나타낸 샘플들은 적절한 희석 비율에서 재분석하였다.
hGDF -15 혈청 수준과 환자 데이타의 비교:
다음으로, 측정된 hGDF-15 혈청 수준을 실험에서 수득한 환자 반응 데이타와 비교하였다.
도 1은 치료 용법에 대한 반응자 및 비-반응자에서의 GDF-15 혈청 수준을 도시한다. 모든 혈청 샘플을 항 PD-1 항체로 치료하기 전에 수득하였다. 도에서 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 비-반응자들은 모든 반응자들에 비해 높은 GDF-15 혈청 수준을 가진다.
이 결과는 또한 hGDF-15 혈청 수준이 각각 <1.8 ng/ml, 1.8-4.2 ng/ml 및 >4.2 ng/ml인 환자들에서 반응자와 비-반응자의 수를 도시한 도 2에도 반영된다.
이러한 사실들은, 높은 GDF-15 수준이 치료 반응 불량과 관련 있음을 시사한다. 이에, 이들 결과의 통계학적 유의성을 검사하였다:
hGDF -15 혈청 수준과 환자 데이타의 통계학적 상관관계:
데이타:
데이타 분석은 컬럼 (변수) 샘플 명, GDF-15 (ng/ml), 반응자/비-반응자, 일수 (사망에 이르기까지의 소요 일 또는 검열시까지의 일수) 및 진행중 (지속되는 수명에 대한 색인 변수)을 포함하여 환자 35명에서 수득한 샘플의 데이타가 포함된 데이타 파일을 토대로 하였다. 이들 데이타의 반응자/비-반응자 분류는 펨브롤리주맵을 이용한 치료 개시 후 4달 중 어느 한 시점에 행하였다. 일부 혈청 샘플들은 분석 직전에서 수득하였기에, 환자 29명에서만 반응을 분석할 수 있었다. 부분 반응 (종양 크기 감소율 >30%)을 반응자로 분류하였다. LDH 측정의 경우, 샘플 4개는 용혈 반응로 인해 제외하여야 하였다.
경과 변수 (엔드포인트):
a. 전체 생존율 (사망 소요 시간). 엔드포인트는 사망 파일에서 유래된 사망 이벤트 지표 (1=사망/0=생존) 및 변수 "일수"에 해당되는 사망 또는 검열시까지의 소요 시간 (환자가 생존한 것으로 인지된 마지막 시기)으로 구성된다.
b. 치료에 대한 반응, 예를 들어, 환자가 반응자인지 또는 아닌지 (1=반응자, 0=비-반응자로 코드화됨). 부분 반응자는 반응자로 간주하였다.
데이타 분석:
콕스 비례 위험 생존 모델로 전체 생존율을 분석하였다. 한 모델에는 연속형 예측인자로서 GDF-15 (ng/ml)를 피팅하고, 다른 모델에는 범주형 예측인자로서 GDF-15에 기초한 그룹핑 변수를 피팅하였다 (그룹: GDF-15 <1.8 ng/ml, 1.8-4.2 ng/ml, >4.2 ng/ml). 전체적으로, 환자 35명으로부터 생존 데이타를 입수할 수 있었다.
이항 에러 분포 및 로짓 연결 함수 (로지스틱 회귀)를 이용한 일반화 선형 모델 (GLM)에 의해 치료 반응 (이항 변수)을 분석하였다. 4달 후 RECIST1.1 기준에 의해 평가된 치료 반응의 경우, 한 모델에는 연속형 예측인자로서 GDF-15 (ng/ml)를 피팅하였다. GDF-15 >4.2 ng/ml인 그룹에서는 환자들이 반응하지 않아, 이 그룹 대 GDF-15 <1.8 ng/ml인 그룹에서의 오즈비 추정은 차이가 매우 크고, 신뢰 구간이 매우 넓었다. 범주형 예측인자로서 GDF-15에 기초한 그룹핑 변수를 다른 모델에 피팅시키는 것 대신, 카이제곱 (χ2) 검정을 사용해 그룹들을 비교하였다 (반응자의 비율의 균등성 검정). 반응자/비-반응자의 수가 때때로 매우 작아 (< 5), 피셔의 정확도 검정을 이용한 민감도 분석을 또한 수행하였다. 최종 4달 이내에 anti PD-1을 투여받은 환자들은 아직까지 반응자 또는 비-반응자로서 분류할 수 없었다. 그래서, 환자 29명에서만 치료 반응을 평가할 수 있었다.
통계학적 소프트웨어 패지키 R (R Core Team, 2014, version 3.1.0)을 사용해 데이타 분석을 수행하였다.
결과:
표 1-2는 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용하여 모델에서 수득한 결과를 보여준다. 사망 위험은 GDF-15의 농도가 높은 경우에 유의하게 증가 (HR > 1, 표 1)한 반면, 오즈비 (OR) (OR < 1, 표 2)로 표시된 바와 같이 치료 반응의 확률은 유의하게 감소하였다. 도 3은 모델에 의해 예측된 치료 반응의 확률 뿐만 아니라 반응자/비-반응자에 대한 해당 데이타를 도시한다.
표 3은 범주형 예측인자로서 GDF-15에 기반한 그룹을 이용한 콕스 비례 위험 모델의 결과를 보여준다. GDF-15 <1.8 ng/ml인 그룹을 참조군으로 사용한다 (표에 도시 안됨). 표 3에서 2종의 위험비는 GDF-15이 1.8 - 4.2인 그룹과 GDF-15 >4.2인 그룹을 참조군과 비교한 것이다. 사망 위험도는 이들 그룹 둘다에서 (참조군 대비) 증가하지만, GDF-15 >4.2인 그룹에서는 그 정도가 더 크다. 도 4A는 3가지 그룹들의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다.
그룹들 간에 반응자 비율은 유의하게 차이가 있었다 (반응자 1: χ2 df =2= 16.04, P = 0.0003). 이 결과는 피셔의 정확 검정의 결과에 의해 검증되었다 (P=0.0003). 그룹에서 사망자 수와 반응자 수를 표 4에 나타낸다. 또한, 표 5는 각 그룹에서 GDF-15에 대한 기술 통계량 (descriptive statistic)을 나타낸다.
표 1:
표 1은 경과 변수로서 전체 생존율 (사망에 이르기까지의 소요 시간) 및 연속형 예측인자로서 GDF-15을 사용해 콕스 비례 위험 모델에서 수득된 위험비 (HR) 추정치를 나타낸다. 분석에는 환자 35명으로부터 수득한 샘플이 포함되었다.
표 2:
표 2는 경과 변수로서 치료 반응 (반응자 1) 및 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용한 일반화 선형 모델에서 수득된 오즈비 (OR) 추정치를 나타낸다. 분석에는 환자 29명으로부터 수득한 샘플이 포함되었다.
표 3:
표 3은 경과 변수로서 전체 생존율 (사망에 이르기까지의 소요 시간) 및 범주형 예측인자로서 GDF-15을 사용해 콕스 비례 위험 모델에서 수득한 위험비 (HR) 추정치를 나타낸다. 분석에는 환자 35명으로부터 수득한 샘플이 포함되었다.
표 4:
표 4는 GDF-15에 의해 규정된 3가지 그룹들 (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml)에서 사망자 수와 반응자 수 ("반응자 1")를 나타낸다.
표 5:
표 5: GDF-15에 의해 규정된 3가지 그룹들 (<1.8, 1.8-4.2, >4.2 ng/ml)에서 연속형 예측인자 변수 GDF-15 (ng/ml). 환자 수 (n), 중앙값 (), 평균 (), 표준 편차 (s), 최저 (Min) 및 최대 (Max)가 열거된다.
락테이트 데하이드로게나제 (LDH)는 고형 종양의 예후를 예측하는 마커인 것으로 간주된다. 이는 최근 들어 대규모 임상 실험 풀에 기반한 포괄적인 메타-분석에 의해 검증된 바 있다 (환자 수 31,857명). OS에서 증가된 LDH의 일관된 효과가 모든 질병 서브그룹과 등급들 전체에서 발견되었다 (HR = 1.48, 95% CI = 1.43 - 1.53). 또한, 전이 질환에서 LDH의 예후 예측 가치가 비-전이성 질환에 비해 더 강력한 경향이 있었으며, 이는 보다 높은 종양 부담 (tumor burden)을 반영하는 것으로 생각되었다. 실제 기전은 아직 미정이며, 또한 워버그 효과를 통한 저산소증 및 대사 리프로그래밍과 관련있을 수 있으나, LDH는 높은 종양 부담 또는 종양 공격성을 반영하는 것으로 해석될 수도 있다 (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., and Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). 혈청내 LDH 수준이 흑색종의 등급 평가 체계에 통합되었기에, 이 파라미터는 대학 표준 실험실에서 임상 진단시 일반적으로 측정된다.
표 6:
표 6: 반응자 대 비-반응자에서 GDF-15 및 LDH.
용혈 반응으로 인해 혈액 샘플 4개에서는 LDH 측정에 실패하였다.
표 7은, 치료 반응 (반응자 1)의 연속형 예측 인자로서 GDF-15 대신 LDH를 사용한 것을 제외하고는, 표 2와 유사하다. 치료 반응의 확률은 LDH 수치 증가에 따라 약간 유의하게 감소하였다 (OR < 1, p < 0.1). 도 5는 반응자/비-반응자에서 해당 데이타와 모델에 의해 예측된 치료 반응의 확률을 보여준다.
GDF-15이 LDH 보다 더 좋은 치료 반응의 예측인자인지를 (반응자1) 확인하기 위해, 2종의 추가적인 모델들을 피팅하였다: 예측인자로서 양쪽 마커들을 포함하는 모델 (이는 자동적으로 양쪽 마커에 대한 측정값을 가진 환자만 포함함)과 예측인자로서 GDF-15을 이용하고 LDH 측정값을 가진 환자만 이용한 모델. 그런 후, 아카이케 정보 기준 (Akaike's information criterion, AIC)을 3가지 모델 모두에서 계산하였다 (표 8). AIC가 작을수록 효과적인 모델이라는 것을 의미한다. 실제, GDF-15을 이용한 모델의 AIC는 예측인자로서 LDH를 이용한 모델의 AIC 보다 낮았다. 심지어 GDF-15만 사용하는 모델은 이들 2종의 예측인자를 이용한 모델 보다 작은 AIC를 가지는데, 이는 부가적인 예측인자로서 LDH가 모델을 개선시키지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이들 2종의 예측인자를 이용한 모델은 불량한 치료 반응을 설명할 수 없지만, "모델 효율성 (model efficiency)"의 척도로서, AIC는 모델을 상당하게 개선시키지 않는 모델에 패널티를 부가하며, 단순한 모델을 선호한다. 편차 (deviance) 분석 (일반화 선형 모델이 아닌 경우 분산 분석과 유사)을 통해, 즉 이들 2종의 예측 인자를 이용한 보다 복잡한 모델과 (LDH 또는 GDF-15 중 어느 하나에 의한 모델의 축소에 해당되는) 오직 한가지 예측인자를 이용한 2가지의 단순 모델 간에 편차 차이를 비교함으로써, 대안적인 모델 비교 (alternative model comparison)를 행하였다. 복잡한 모델에서 GDF-15을 제거한 결과, 표시된 편차가 유의하게 감소 (P =0.02)된 반면, LDH를 제거한 경우에는 그렇지 않았다 (P =0.41).
표 7:
표 7: 경과 변수로서 치료 반응 (반응자 1, 파일 A에서 정의됨) 및 연속형 예측인자로서 LDH를 이용한 일반화 선형 모델에서의 오즈비 (OR) 추정치. 이 분석에는 환자 25명의 샘플이 포함되었다.
표 8:
표 8: 값이 낮을수록 보다 효과적인 모델임을 의미하는 아카이케 정보 기준 (AIC)에 기반한 모델 비교. df: 자유도. 모델 모두 환자 25명의 샘플을 포함하였다.
도 5A는 연속 예측인자로서 LDH를 이용한 일반화 선형 모델에 의해 예측된 치료 반응의 확률 (반응자 1)을 보여준다. 원형 마크는 데이타이고, 곡선을 모델을 나타낸다. 수직선은 치료 반응의 확률이 0.5일 때의 LDH 농도를 표시한다. 환자 코호트는 동일하였다. 그러나, 환자 4명은 용혈 반응으로 인해 LDH 수준에 대한 신뢰성있는 측정에 실패하였다. 도 5B는 반응자 및 비-반응자와 이들 각각의 hGDF-15 수준과 LDH 수준을 표시한 그래프이다. 모든 반응자들을 커버하도록 컷-오프 값을 선정하였을 때, GDF-15에 기반한 검사에서 (9명 중) 6명의 비-반응자를 동정할 수 있는 반면, LDH 수준에 기반한 분석은 오직 (9명 중) 4명의 비-반응자만 식별할 수 있다. LDH 검사에서는, 용혈성 샘플 4종을 제외시켜야 하였으며, 그래서 데이타에 손실이 발생하였다.
따라서, 본 발명에 따른 hGDF-15 수준에 기반한 임상 경과를 예측하는 방법은 고형 종양에 대한 진단 표준 마커인 LDH 보다 우수한 다음과 같은 이점을 가진다:
· GDF-15 수준과 긍정적인 임상 경과 간에는, LDH 수준과 긍정적인 임상 경과 간에 비해 보다 강력한 통계적 역 상관관계가 존재하며, 그래서, hGDF-15 수준이 LDH 수준과 비교해 예측에 보다 우수하다. 또한, 전술한 아카이케 정보 기준에 의해 나타난 바와 같이, hGDF-15 수준 단독이 hGDF-15 수준을 LDH 수준과 조합한 경우 보다 심지어 우수한 예측인자이다.
· hGDF-15 측정은 LDH 측정에 비해 용혈 민감성이 낮아, 임상 실무에 유용하다.
· hGDF-15 수준은 LDH 수준에 비해 비-반응자를 더 많이 식별할 수 있다.
이러한 이점들은, LDH가 현재 고형 종양에 최선의 이용가능한 임상 마커로 간주된다는 점에서, 특히 주목할만한 일이다.
종합:
요컨대, 상기 실시예 1의 통계학적 결과들은, 치료 반응의 확률이 환자 혈청에서 hGDF-15 수준이 증가할수록 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 표 2에 표시된 오즈비 0.389는, hGDF-15 혈청 수준이 1 ng/ml 증가한다면, 치료 반응의 확률이 오리지날 값에서 0.389배 감소, 즉 약 60% 감소한다는 것을 의미한다. 만일, hGDF-15 혈청 수준이 2 ng/ml 증가하면, 치료 반응의 확률은 오리지날 값의 0.389 x 0.389배 = 0.151배 값으로 감소하며, 즉, 약 85% 감소한다.
마찬가지로, 표 1에서 위험비 1.27은, hGDF-15 혈청 수준이 1 ng/ml 증가하면, 환자의 사망 확률이 1.27배 증가하는 것을 의미한다.
실시예 1의 결과는, hGDF-15의 혈청 수준과 환자에서 예를 들어 anti PD-1에 기반한 면역요법의 환자 반응 및 환자 생존 등의 긍정적인 임상 경과 확률 간에 강력한 역 상관관계가 존재한다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 따르면, 환자의 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 anti PD-1와 같은 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대해 환자의 반응 확률을 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 실시예에서는 고형 종양의 예로서 흑색종에 대한 결과를 보여주지만, hGDF-15 발현은 흑색종 뿐만 아니라 다수의 다른 고형 암들에도 존재한다. 마찬가지로, 흑색종 이외의 고형 종양 역시 면역 체크포인트 차단제를 사용해 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 환자의 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 흑색종 뿐만 아니라 본원에 언급된 모든 고형 암들에서 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 환자의 반응 확률을 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 2 : GDF-15 수준은 여러가지 종양들의 전이에서 CD8+ 종양 침윤성 림프구 (TIL)와 역 상관관계이다.
환자의 반응에 대한 hGDF-15의 네거티브 효과에 기여하는 hGDF-15의 기전을 규명하기 위해, 여러가지 고형 종양에서 기인한 뇌 전이에서 hGDF-15의 발현과 면역계 세포의 존재에 대해 분석하였다:
조직 생검 및 조직 가공 처리:
포르말린-고정 및 파라핀-포매 (FFPE) 처리된 보관된 뇌 전이 조직을 분석하였으며, 이를 수집하여 조직 마이크로 어레이 (TMA)로서 가공 처리하였다. 모든 생검은 UCT 종양 은행 (독일 프랑크푸르트 암 마인 괴테 대학, 독일 암 컨소시엄의 멤버 (DKTK), 독일 하이델베르그 및 독일 암 연구 센터 (DKFZ), 독일 하이델베르그) 또는 암 등록 종양 은행 "Blut-und Gewebebank zur Erforschung des malignen Melanoms" (독일 튀빙겐 대학 병원 피부-암 분과)로부터 입수하였다. 본 실험에 대한 허가는 2곳의 독립적인 윤리 위원회 (UCT 프랑크푸르트 윤리 위원회 / 독일 프랑크푸르트 암 마인 괴테 대학: 프로젝트 번호: GS 4/09; SNO_01-12; 튀빙겐 대학 윤리 위원회 프로젝트 번호: 408/2013BO2)로부터 부여받았다. 뇌 전이 환자 총 190명을 조사하였다: 흑색종 (n=98), NSCLC (n=33), 유방암 (n=18), RCC (n=10), SCLC (n=7), 결장직장암 (n=7), 특정되지 않은 암 (암종 NOS n=11) 및 기타로 요약되는 희귀 종양의 생검 (n=6). 환자 155명의 생존 데이타 (종양 절제 후 생존 시간)를 수집하였으며, 부가적으로 환자 169명에서는 뇌 전이 사례 수 및 55명의 흑색종 환자의 서브코호트에서는 뇌 전이 크기를 분석하였다.
면역조직화학:
모든 항체에 대한 면역조직화학은 3 ㎛ 두께의 슬라이드와 표준 프로토콜을 사용해 자동 IHC 염색 시스템 디스커버리 XT (Roche/Ventana, Tucson, Arizona, USA)에서 수행하였다. 다음과 같은 항체들이 사용되었다: anti GDF-15 (HPA011191, 희석율 1:50, Sigma/Atlas, protocol #730), CD3 (클론 A0452, 희석율 1:500, DAKO, Glostrup, Denmark), CD8 (클론 C8/144B, 희석율 1:100, DAKO, Glostrup, Denmark), PD-1 (클론 NAT105; 희석율 1:50; Abcam, Cambridge, United Kingdom), PD-L1 (E1L3N; 희석율 1:200; Cell Signaling, Boston, U.S.A.), FOXP3 (클론 236A/E7; 희석율 1:100; eBioscience, San Diego, U.S.A.). 슬라이드는 헤마톡실린으로 대조염색하여, 탑재하였다.
통계학적 분석:
모든 샘플은 전체 세포에 대한 양성 세포의 빈도 (%)에 따라 염색된 TMA 스코어로 점수를 매겼다. hGDF-15 발현의 경우, 기존에 구체적으로 기술된 [21, 22] 스코어를 사용하였다: 빈도 0-1% 스코어 0; 1-10% 스코어 1; 10-25% 스코어 2; 25-50% 스코어 3; >50% 스코어 4; 부가적으로, 빈도 스코어를 염색 강도로 곱하고 (1 염색 약, 2 염색 보통, 3 염색 강), 최종적으로 hGDF-15 스코어의 순서 척도를 구하였다 (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12). 순서 척도 변수를 비-모수적인 윌콕손/크루스칼-왈리스-검정 및 둔의 방법으로 비교하여 다중 검정 (multiple testing)을 교정하였다. 연속 변수의 경우, ANOVA와 후속적으로 터키-크레이머 HSD 사후 검정을 수행하여 여러가지 뇌 전이들 간에 평균을 비교하였다. 뇌 전이 크기 및 마커 발현의 상관관계 분석을 위해, 선형 피트를 수행한 다음 ANOVA를 수행하였으며, 순서 척도 변수의 경우에는 스피어만의 rho 상관관계 분석 (Spearman's rho correlation analysis)을 사용하였다. 모든 통계 분석에서 p<0.05를 유의 수준으로 설정하였다.
모든 통계 분석들은 JMP8 및 JMP11 (SAS, Cary, U.S.A.)를 사용하여 수행하였으며, 추가적인 그래프는 Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, U.S.A.)를 사용해 작성하였다.
결과:
도 6은, 도에 나타낸 바와 같이 GDF-15와 T-세포 마커 단백질 CD3 및 CD8 각각에 대해 면역조직화학으로 염색한, GDF-15 면역반응성이 높지 않거나 (상단 패널) 또는 높은 (하단 패널) 흑색종 뇌 전이 조직 단편의 예들을 보여준다. GDF-15이 발현되지 않은 단편에서, 다수의 침윤성 면역 세포들이 진한 점으로 관찰된다. GDF-15을 높은 수준으로 발현하는 전이 사진에서는, 극소수의 침윤성 면역 세포들이 화살 표시로 표시된다 (CD3 및 CD8-양성 세포들이 화살 표시로 표시됨). 도에서 알 수 있는 바와 같이, hGDF-15 면역반응성이 높은 조직 단편 (하단 패널)에서는, hGDF-15 면역반응성이 없는 조직 단편 (상단 패널)과 비교해 CD3+ 및 CD8+ 세포의 수가 크게 감소되었다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 특히, PD-L1, PD-1 등의 염색한 다른 마커들, 모두 종양-침윤성 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 수와 양의 상관관계를 나타내었다.
이에, 다음으로, 여러가지 흑색종 뇌 전이에서 hGDF-15 수준과 CD3+ T 세포의 % 간에 역 상관관계가 존재하는지를 분석하였다. 도 7A는 ("통계학적 분석" 섹션에서 기술된 바와 같이 수득한) GDF-15 스코어에 따른 CD3+ 세포의 %를 도시한 그래프를 보여준다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, hGDF-15 수준과 CD3+ T 세포의 % 간에 통계학적으로 유의한 역 상관관계가 존재하였다 (p=0.0015).
마찬가지로, 여러가지 흑색종 뇌 전이에서 hGDF-15 수준과 CD8+ T 세포의 % 간에 역 상관관계가 존재하는지를 분석하였다. 도 7B는 ("통계학적 분석" 섹션에서 기술된 바와 같이 수득한) GDF-15 스코어에 따른 CD8+ 세포의 %를 도시한 그래프를 보여준다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, hGDF-15 수준과 CD8+ T 세포의 % 간에 통계학적으로 유의한 역 상관관계가 존재하였다 (p=0.0038).
대조적으로, GDF-15와 FOXP3의 상관관계에서는, 스피어만의 순위 상관 계수 (rho) 검정에 따라 통계학적으로 유의한 결과를 수득할 수 없었다 (여러가지 종양들에 대한 경우 p=0.8495; 오직 흑색종 전이를 분석한 경우 p=0.2455).
마지막으로, 여러가지 종양에서 유래된 뇌 전이에서 hGDF-15 수준과 CD8+ 및 CD3+ T 세포의 % 간에 역 상관관계가 존재하는지를 분석하였다. 도 8은 여러가지 종양 (흑색종, CRC, RCC, 유방암, NSCLC 및 SCLC)에서 기원한 뇌 전이 163건 (CD3) 또는 169건 (CD8) 각각에서 CD8+ 및 CD3+ T 세포의 %에 대한 GDF-15 스코어 그래프를 보여준다. 이 그래프는 "통계학적 분석" 섹션에 전술한 바와 같이 구하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, hGDF-15 스코어와 CD8+ 세포의 % 간에 통계학적으로 유의한 역 상관관계가 존재하였으며 (p=0.0311), 또한 hGDF-15 스코어와 CD3+ 세포의 % 간에 통계학적으로 유의한 역 상관관계가 존재하였다 (p=0.0093). 그외 마커들 (PD-L1, PD-1, FOXP3)은 CD3 및 CD8 T 세포 침윤과 양의 상관관계를 나타내었다.
종합:
상기한 결과들은, hGDF-15이, 전이에서 일반적인 T 세포 마커 단백질을 발현하는 T 세포의 %와 역 상관관계가 성립할 뿐만 아니라 전이에서 CD8+ T 림프구의 %와도 역 상관관계가 성립한다는 것을 보여준다. CD8+ T 림프구의 존재가 anti-PD-1 항체를 이용한 면역 체크포인트 저해 후 종양 퇴화 (tumor regression)에 특이적으로 필요한 것으로 입증되어 있어 (Tumeh et al., Nature. 2014 Nov. 27; 515(7528):568-71), 상기한 점은 주목할만하다.
이에, 본 발명에서, hGDF-15 수준과 우호적인 임상 경과 (예, 환자 생존 또는 치료 반응의 존재) 간의 역 상관관계에 대한 바람직한 비-제한적인 설명은, hGDF-15이 종양 전이를 비롯한 고형 종양에서 CD8+ T 림프구의 %를 떨어뜨림으로써, 우호적인 임상 경과 (예, 환자 생존 또는 치료 반응의 존재)의 확률을 줄인다는 것이다. 이러한 상관관계는 다양한 고형 종양들에서 관찰되므로, 본 발명은 흑색종과 같은 특정 고형 암으로 한정되지 않는다.
이에, 본 발명은 바람직한 구현예에서 언급된 바와 같이 모든 고형 종양들에 적용될 수 있다.
실시예 3 : GDF-15은 내피 세포에 T 세포의 부착을 감소시킨다.
본 발명자들은 다음으로 고형 종양에서 hGDF-15이 T 세포의 %에 작용하는 방식을 확인하고자 착수하였다.
T 세포가 혈류에서 종양 조직으로 침범하는데 필요한 단계는, T 세포가 종양에 들어갈 수 있기 전에 내피에 붙어야 한다는 것이다. 이 단계를 시뮬레이션하고, 이 단계가 hGDF-15에 의해 영향을 받을 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 인간 제대혈 내피세포 (HUVEC)에의 T 세포 부착을 측정하는 모델 시스템을 이용하였다:
T 세포 흐름/부착 실험( HUVEC에서 ):
1일:
a. μ-슬라이드 VI 0.4 (ibidi GmbH, Germany)를 파이브로넥틴 (100 ㎍/mL)으로 코팅하였다: 로딩 포트 당 30 ㎕. 이를 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다 (또는 미리 코팅된 슬라이드를 사용함).
b. 파이브로넥틴을 흡입 제거한 다음 HUVEC 배지로 헹구었다.
c. HUVEC를 6웰 플레이트에서 트립신 처리하였다 (카운트: 2x105/mL (총 2mL))
d. 이를 세척하고, 1x106 세포/mL로 희석하였다.
e. HUVEC 30 ㎕를 μ-슬라이드 VI의 로딩 포트에 적용하고, 현미경으로 체크하였다.
f. μ-슬라이드 VI에 뚜껑을 덮고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
2일:
a. HUVEC를 TNFα (10 ng/mL) 및 IFNγ (10 ng/mL)를 사용해 채널 2-5 (하기 표 참조)에서 활성화하였다: 모든 배지는 채널에서 흡입 제거하고, 사이토카인이 함유된 미리-데운 배지로 교체하였다.
3일:
a. T 세포를 분리하였다 (pan T 세포의 네거티브 분리).
b. T 세포를 웰 1 (1x106 세포/mL)에서 GDF-15을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 (100 ng/mL) 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다.
c. HUVEC를 채널 4 및 5에서 GDF-15 (100 ng/mL)와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다: 로딩 포트내 모든 배지를 흡입 제거하고, 로딩 포트 둘다에 미리 데운 GDF-15함유 배지를 충진하였다.
d. 현미경 바로 옆 A 스테이지 탑 인큐베이터를 미리 데우고, 가스-믹스를 연결하였다 (5% CO2, 16% O2, 79% N2).
e. 3x 50mL 시린지를 준비하였다:
i. T 세포 (1x106 세포/mL): 1mL
ii. T 세포 GDF15 (1x106 세포/mL): 1mL
iii. 배지
f. 시린지 1을 채널 1과 연결하고 (하기 표 참조), 흐름을 개시하였다 (0.5 dyn/cm2: 0.38 mL/min = 22.8 mL/h).
g. T 세포를 3분간 흐르게 하고, 그 동안 현미경에서 10개의 시야각을 미리 설정하였다.
h. 각 시야각에서 5초간 비디오 이미지를 촬영하였다.
i. 나머지 채널도 하기 표에 나타낸 T 세포 샘플을 사용하여 채널 1 (f-h)과 유사한 방식으로 분석하였다.
재조합 GDF-15은 독일 예나에 위치한 Invigate GmbH 사에서 입수하였다.
통계학적 분석:
모든 데이타는 비-정규 분포된 데이타를 검정하기 위한 만-휘트니 검정을 사용해 비교하였다. p<0.05인 결과는 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과:
실험 결과를 도 9에 나타낸다. 도는 몇가지 부착 파라미터의 분석 결과들을 도시한다, 즉,
a. 내피 세포에의 T 세포의 일반적인 부착 형태를 반영하는, 초 당 시계 당 롤링 T 세포의 수 (9A; 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")로부터 수득됨),
b. T 세포와 내피 세포 간의 부착 감소에 따라 증가하는, T 세포의 롤링 속도 (0.2초당 픽셀 수로 측정) (9B; 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")로부터 수득됨), 및
c. 시계 당 부착 세포의 수 (9C; 데이타는 채널 # 3 ("GDF-15") 및 채널 #2 ("대조군")로부터 수득됨; 및 9D).
도 9C에서 알 수 있는 바와 같이, T 세포에 hGDF-15 처리는 시계 당 부착 세포의 수로 나타난 바와 같이, 내피 세포에의 부착을 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 유사한 결과는 롤링 T 세포의 수를 카운팅하여 부착을 분석하였을 때에도 수득되었다 (도 9A). 또한, 상기한 결과와 일관되게, T 세포에 hGDF-15의 처리는 롤링 속도를 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이는 T 세포와 내피 세포 간의 상호작용 시간의 감소를 의미하며, 또한 T 세포와 내피 세포 간의 부착 감소를 의미한다 (도 9B).
본 발명자들은, 다음으로, hGDF-15에 의해 타겟팅되는 세포를 분석하였다 (도 9D). HUVEC에만 hGDF-15을 처리한 샘플에서는, T 세포의 내피 세포 (HUVEC)에의 부착이 적당히 감소하는 것으로 관찰되었다. 이와는 대조적으로, T 세포에만 hGDF-15을 처리하거나 또는 T 세포와 내피 세포 (HUVEC) 둘다에 hGDF-15을 처리한 경우에는, T 세포의 내피 세포 (HUVEC)에의 부착이 크게 감소하는 것으로 관찰되었다. 이들 결과는, hGDF-15이 T 세포 및 내피 세포 둘다에 작용한다는 것을 의미하며, 또한 hGDF-15의 주된 부착 작용은 T 세포에 대한 작용이라는 것을 의미한다.
다음으로, 본 발명자들은 종양 세포에 의해 분비되는 hGDF-15이 T 세포에 부착하는 작용이 hGDF-15 저해제에 의해 저해될 수 있는 지를 조사하였다. 이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 hGDF-15을 분비하는 흑색종 세포주 UACC257을 사용하였다:
종양 세포 상층액내 GDF -15의 존재 또는 부재 조건에서의 T 세포 흐름/부착 실험 ( HUVEC에서 ):
1일:
a. μ-슬라이드 VI 0.4 (ibidi GmbH, Germany; 이하 μ-슬라이드로 언급됨)를 파이브로넥틴 (100 ㎍/mL)으로 코팅하였다: 로딩 포트 당 30 ㎕. 이를 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다 (또는 미리 코팅된 슬라이드를 사용함).
b. 파이브로넥틴을 흡입 제거한 다음 HUVEC 배지로 헹구었다.
c. HUVEC를 6웰 플레이트에서 트립신 처리하였다 (카운트: 2x105/mL (총 2mL))
d. 이를 세척하고, 1x106 세포/mL로 희석하였다.
e. HUVEC 30 ㎕를 μ-슬라이드의 로딩 포트에 적용하고, 현미경으로 체크하였다.
f. μ-슬라이드에 뚜껑을 덮고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
2일:
a. HUVEC를 TNFα (10 ng/mL) 및 IFNγ (10 ng/mL)를 사용해 μ-슬라이드의 채널 2-5 (하기 표 참조)에서 활성화하였다: 모든 배지는 채널에서 흡입 제거하고, 사이토카인이 함유된 미리-데운 배지로 교체하였다.
3일:
a. T 세포를 분리하였다 (pan T 세포의 네거티브 분리).
b. 병행하여, 96웰 ELISA 플레이트 (Nunc maxisorb)의 24개의 웰을 anti-GDF-15 (PBS 중에 10 ㎍/mL로 희석됨) 200 ㎕로 코팅하고, 45분간 인큐베이션한 다음 PBS로 헹구었다.
c. GDF-15을 분비하는 (데이타 도시 안함) 흑색종 세포주 UACC257의 상층액으로부터 GDF-15을 고갈시키기 위해, 상층액을 anti-GDF-15로 사전 코팅된 ELISA 플레이트 (상기 b 참조)의 웰에서 인큐베이션하였다.
d. 대조군으로서 흑색종 세포주 UACC257의 상층액을 anti-GDF-15로 사전 코팅하지 않은 ELISA 플레이트 (상기 b 참조)의 웰에서 인큐베이션하였다.
e. T 세포를 12웰 세포 배양 플레이트 1 (1x106 세포/mL)에서 GDF-15을 첨가하거나 (100 ng/mL) 또는 첨가하지 않고, GDF-15이 고갈된 흑색종 세포주 UACC257의 상층액 (c. 참조) 중에 또는 GDF-15을 함유한 흑색종 세포주 UACC257의 상층액 (d. 참조) 중에서 1시간 동안 예비-인큐베이션하였다.
f. 현미경 바로 옆 A 스테이지 탑 인큐베이터를 미리 데우고, 가스-믹스를 연결하였다 (5% CO2, 16% O2, 79% N2).
g. 미세유체 흐름 시스템의 4x 2mL 튜브들을 준비하였다:
i. T 세포 (1x106 세포/mL): 1mL
ii. T 세포 GDF15 (1x106 세포/mL): 1mL
iii. T 세포 UACC 257 (GDF-15 함유)
iv. GDF-15 고갈된 T 세포 UACC 257
h. 튜브 1을 채널 1과 연결하고 (하기 표 참조), 흐름을 개시하였다 (0.4 mL/min = 24 mL/h).
i. T 세포를 3분간 흘려주면서, 시야각 5개를 현미경에서 미리 정하였다.
j. 각 시야각에서 5초간 비디오로 영상을 촬영하였다.
k. 나머지 채널도 하기 표에 나타낸 T 세포 샘플을 사용하여 채널 1 (f-h)과 유사한 방식으로 분석하였다.
재조합 GDF-15은 독일 예나에 위치한 Invigate GmbH 사에서 입수하였다.
결과:
실험 결과는 도 10에 나타낸다. 도는 초당 시계 당 롤링 T 세포의 수에 대한 분석 결과를 보여준다. 데이타는 채널 # 1 (대조군, 비-자극 HUVEC 상의 T 세포, "음성 대조군"), 채널 # 2 (대조군, 자극된 HUVEC 상의 T 세포, "양성 대조군"), 채널 # 3 ("GDF-15"), 채널 # 4 ("UACC 257": 분비된 GDF-15을 함유한 UACC 257 흑색종 세포주의 상층액에서 배양된 T 세포) 및 채널 # 5 ("UACC257 + anti-hGDF-15": anti hGDF-15 B1-23를 사용해 분비된 GDF-15을 고갈시킨 UACC 257 흑색종 세포주의 상층액에서 배양된 T 세포)에서 입수하였다.
비-자극된 HUVEC 상에서의 T 세포 흐름 ("음성 대조군"; 중앙값 = 초 당 시계 당 롤링 세포 수 28)과 비교하여, 자극된 HUVEC 상에서의 T 세포 흐름 ("양성 대조군")시 초 당 시계 당 롤링 세포의 수가 증가하였다 (중앙값 = 46). T 세포에 hGDF-15을 처리하면 초 당 시계 당 롤링 세포의 수가 실질적으로 감소한다 (중앙값 = 29). 또한, T 세포를 GDF-15을 분비하는 흑색종 세포주 UACC257의 상층액과 함께 예비-인큐베이션하면, 자극된 HUVEC 상에서의 T 세포 흐름 ("양성 대조군")의 경우와 비교해, 초 당 시계 당 롤링 세포의 수가 실질적으로 감소한다 (중앙값 = 36). 이와는 대조적으로, T 세포를 anti GDF-15을 사용해 분비된 GDF-15을 고갈시킨 흑색종 세포주 UACC257의 상층액과 예비-인큐베이션하면, 초 당 시계 당 롤링 세포의 수가 자극된 HUVEC 상에서의 T 세포 흐름 ("양성 대조군")과 비슷한 수준으로 관찰된다 (중앙값 = 45).
종합:
본 실시예에서는, 종양 세포에 의해 분비되는 GDF-15을 비롯한 hGDF-15이 T 세포의 내피세포로의 부착을 감소시킨다는 것을 입증해준다. CD8+ T 세포의 고형 암내 유입 및 고형 암내 이들 CD8+ T 세포의 존재가 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료학적 방식에 특히 유리하기 때문에, hGDF-15의 수준을 이용해, 면역 체크포인트 차단제를 이용한 암 환자의 치료 반응의 확률을 예측할 수 있다.
실시예 4 : GDF -15 혈청 수준이 anti PD-1로 치료받은 흑색종 환자의 생존성 을 규정한다.
본 실시예의 실험은 실시예 1의 실험에서 수득한 결과, 예를 들어, 환자의 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응에 hGDF-15이 영향을 미친다는 사실을 추가로 검증하기 위해, 부가적인 독립 실험을 통해 수행하였다.
본 실험과 관련하여 하기 용어들이 사용되었다:
"검열됨" = 추가적인 추적 데이타를 이용할 수 없을 때에는 그 환자는 실험에서 제외시켰다.
"이벤트" = 환자가 사망함.
"생존" = 환자가 추적시 살아있음.
조직학적으로 흑색종이 검증된 독일 튀빙겐 대학의 피부과 환자들은 독일 피부과 센터 60곳 이상에서의 환자들을 선행적으로 기록한 CMMR (Central Malignant Melanoma Registry)에서 동정되었다. (a) 보관된 혈청 샘플이 있고, (b) 이용가능한 추적 데이타가 있으며, (c) 채혈 시점에 국소 영역 또는 원거리 전이 병력이 존재하며, (d) anti PD-1 항체를 이용한 실험 치료를 받은 환자 99명을 선별하였다. CMMR에 의한 데이타 수집 목적 및 방법은 기존에 구체적으로 발표된 바 있다 (Lasithiotakis, KG et al., Cancer / 107 / 1331-9. 2006). 각 환자에서 수득한 데이타는 이용가능할 경우 연령, 성별, 최종 추적일 및 사망일과 사망 요인이다. 환자들 모두에서 CMMT 레지스트리의 임상 데이타 기록에 대해 서면으로 사전 동의를 구하였다. 튀빙겐 윤리 위원회는 본 실험을 허가하였다 (ethic vote 125/2015BO2). 자격 요건이 되는 환자는 18세 이상으로, 국소 요법에 불응성의 적출불가한 III기 또는 IV기 흑색종으로 조직학적으로 또는 세포학적으로 검증되었으며; 현행 가이드라인에 따라 종래에 요법을 수행하였음에도 불구하고 질병 진행을 나타내는 환자이다. BRAFV600 돌연변이 종양을 가진 환자는 BRAF 또는 MEK 저해제 요법 또는 둘다를 비롯한 실험 치료 또는 권고되는 제1선 요법을 실시받은 바 있다. 이필리무맵을 이용한 종래의 치료는, 적용가능할 경우, 환자가 최소 2회 투여, 3주에 1회로 3 mg/kg을 투여받았지만 마지막 이필리무맵 투여 후 24주 이내에 질병의 진행이 검증된 경우에는 실패한 것으로 간주되었다. anti PD-1의 투여 전, 이필리무맵-관련 부작용 해소 또는 등급 0-1로의 개선 및 프레드니손 투여량 10 mg/day 이하가 실험 약물의 1차 투여 전 적어도 2주간 요구되었다. 자격 요건이 되는 환자는 ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 퍼포먼스 상태가 0 또는 1이고; RECIST v1.1 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1)에 따른 측정가능한 질병을 앓고 있으며; 절대 호중구 수치 (≥1500 세포/mL), 혈소판 (≥100,000 세포/mL), 헤모글로빈 (≥90 g/L), 혈청 크레아티닌 (≤1·5 정상 상한 [ULN]), 혈청 총 빌리루빈 (≤1·5 ULN 또는 총 빌리루빈 농도가 >1·5 ULN인 환자 경우 다이렉트 빌리루빈 ≤ ULN), 아스파르테이트 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (≤2·5 ULN 또는 간 전이 환자의 경우 ≤5 ULN), 국제 표준 비율 또는 프로트롬빈 시간 (항응고제를 사용하지 않을 경우 ≤1·5 ULN), 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (항응고제를 사용하지 않을 경우 ≤1·5 ULN)을 나타내었다. 환자들은 가장 최근 용법의 마지막 투여 시기와 펨브롤리주맵 또는 니볼루맵의 1차 투여 사이에 4주 이상의 워시아웃 기간 (washout period)을 가졌다.
효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)을 통한 hGDF -15 혈청 수준 분석:
인간 GDF-15 혈청 수준을 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)으로 측정하였다.
완충제 및 시약:
완충화된 차단 용액: 1% BSA (fraction V pH 7.0, PAA, Pasching, Austria)/PBS
세척 용액: PBS-Tween (0.05%)
표준: 인간 GDF-15 (원액 농도 120 ㎍/ml, R&D Systems)
포획 항체: 인간 GDF-15 MAb (클론 147627), R&D Systems, Mouse IgG2B (catalog #MAB957, R&D Systems, 원액 농도 360 ㎍/ml)
검출 항체: 인간 GDF-15 바이오틴화된 친화성 정제한 PAb, Goat IgG (catalog #BAF940, R&D Systems, 원액 농도 9 ㎕/ml)
스트렙타비딘-HRP (Catalog #DY998, R&D Systems)
기질 용액: 10 ml 0.1 M NaOAc pH6.0 + 100 ㎕ TMB + 2 ㎕ H2O2
정지 용액: 1 M H2SO4
분석 절차:
1. 혈소판 준비:
e. 포획 항체를 PBS 중에 워킹 농도 2 ㎍/ml로 희석하였다. 96웰 마이크로플레이트 (Nunc maxisorp®)를 양쪽 끝 열 (A 및 H)을 제외하고는 희석한 포획 항체를 웰 당 50 ㎕로 첨가하여 즉각적으로 코팅하였다. A 및 H 열에는 완충제를 넣어 실험 중에 샘플이 증발되지 않게 하였다. 각 웰의 바닥부가 완전히 덮이도록 플레이트를 가볍게 두들겼다. 플레이트를 가습 챔버에 넣어, 실온 (RT)에서 밤새 인큐베이션하였다.
f. 각 웰에서 흡입하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 헹구었다.
g. 차단 용액 150 ㎕을 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
h. 각 웰에서 흡입하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 헹구었다.
2. 분석 절차:
d. 표준 물질을 준비하였다. GDF-15을 완충화된 차단 용액에 최종 농도 1 ng/ml (4.17 ㎕ GDF + 496 ㎕ 완충화된 차단 용액)로 희석하였다. 1:2 연속 희석물을 제조하였다.
e. 두플리케이트 샘플 1:20 (6 ㎕ + 114 ㎕ 완충화된 차단 용액)을 제조하였다.
f. 희석 샘플 또는 표준 물질 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음, RT에서 1시간 인큐베이션하였다.
i. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
j. 검출 항체를 최종 농도 50 ng/ml (56 ㎕ + 10 ml 차단 완충제)로 희석하였다. 각 웰에 검출 항체 희석액 50 ㎕을 첨가한 다음 RT에서 1시간 인큐베이션하였다.
k. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
l. 스트렙타비딘-HRP를 1:200 (50 ㎕ + 10 ml 차단 완충제)으로 희석하였다. 스트렙타비딘-HRP 작업 희석액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 20분간 인큐베이션하였다.
m. 각 웰에서 흡인하고, PBS-Tween (0.05%)으로 3번 세척하였다.
n. 기질 용액을 제조하였다. 기질 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 RT에서 20분간 인큐베이션하였다.
o. 정지 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다.
p. 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용해 즉시 각 웰의 광학 밀도를 측정하였다.
3. GDF-15 혈청 역가 계산:
d. 각 샘플/GDF-15 표준 희석액을 2세트로 사용하였다. GDF-15 역가를 측정하기 위해, 두플리케이트의 평균을 계산하고, 백그라운드 (GDF-15 무첨가 샘플)를 제하였다.
e. 표준 곡선을 작성하기 위해, 선형 범위의 값들을 X-Y-다이아그램에 피팅하고 (X 축: GDF-15 농도, Y 축: OD450), 선형 곡선 피트를 적용하였다. 농도를 알고있는 표준 희석액들의 OD450 값으로부터 보간함으로써 테스트 샘플의 GDF-15 혈청 역가를 계산하였다.
f. 샘플의 최종 GDF-15 농도를 계산하기 위해, 개별 희석 인수를 고려하였다. 표준 범위 보다 낮거나 또는 높은 OD 값을 나타낸 샘플들은 적절한 희석 비율에서 재분석하였다.
hGDF -15 혈청 수준과 환자 데이타의 비교:
다음으로, 측정된 hGDF-15 혈청 수준을 실험에서 수득한 환자 반응 데이타와 비교하였다.
hGDF -15 혈청 수준과 환자 데이타의 통계학적 상관관계:
데이타:
데이타 분석은 컬럼 (변수) 샘플 명, GDF-15 (ng/ml), 일수 (사망에 이르기까지의 소요 일 또는 배제될 때까지의 일수) 및 진행중 (지속되는 수명에 대한 색인 변수)을 포함하여 환자 99명에서 수득한 샘플의 데이타가 저장된 데이타 파일을 토대로 하였다.
경과 변수 (엔드포인트):
a. 전체 생존율 (사망 소요 시간). 엔드포인트는 데이타 파일에서 유래된 사망에 대한 이벤트 지표 (1=사망/0=생존) 및 변수 "일수"에 해당되는 사망 또는 검열까지의 소요 시간 (환자가 생존한 것으로 인지된 마지막 시기)으로 구성된다.
치료에 대한 반응, 예를 들어, 환자가 반응자인지 또는 아닌지 (1=반응자, 0=비-반응자로 코드화됨).
데이타 분석:
생존을 분석하기 위한 추적 기간은 채혈일부터 마지막 추적 (즉, 환자로부터 마지막 정보를 수득한 시점) 또는 사망까지로 정해졌다. 모든 혈액 샘플을 anti-PD1 항체를 처리하기 전 수일내에 취하였다. OS를 분석하기 위해, 마지막 추적시까지 살아있는 환자를 검열하였으며, 사망한 환자는 "이벤트"로 간주하였다. 카플란-마이어에 따른 누적 생존 확률을 95% 신뢰 구간 (CI)으로 계산하였으며, 양측 로그-순위 검정 통계 방법을 사용해 비교하였다. 전체 생존에 대한 p-값은 양측 로그 순위 통계 방법으로 계산하였다. 한가지 모델은 범주형 예측인자로서 GDF-15에 기초하여 그룹핑 변수를 피팅하였다 (그룹은 다음과 같다: <1.5 ng/ml (n=62), ≥1.5 ng/ml (n=37) 또는 GDF-15low (n=49), GDF-15high (n=50), 중앙값 스플릿 (median split)에 기초함). 수득한 카플란-마이어 곡선을 도 11 및 12에 나타내며, 여기서 검열은 수직선으로 표시된다. 부가적으로, 아래 표들은 사례 요약 (표 9), GDF-15 수준이 각각 <1.5 ng/ml 및 ≥1.5 ng/ml인 환자 그룹들에서의 환자 생존 데이타 (표 10 및 11), 그리고 GDF-15 수준이 각각 <1.5 ng/ml 및 ≥1.5 ng/ml인 환자 그룹들의 전체 통계 비교 (표 12)를 포함한다.
표 9: 사례들의 요약
*H = 이벤트 없음
표 10: 생존율 (생존 일수)의 평균 및 중앙값
a. 검열 후, 추정치는 가장 긴 생존 기간으로 제한됨.
n/d: 그룹에서 생존자가 >50%이므로, 생존 중앙값 데이타를 계산할 수 없음.
표 11: 생존 기간 (생존 일수)의 평균 및 중앙값
a. 검열 후, 추정치는 가장 긴 생존 기간으로 제한됨.
n/d: 그룹에서 생존자가 >50%이므로, 생존 중앙값 데이타를 계산할 수 없음.
표 12: 전체적인 비교
*df = 자유도
GDF-15의 수준 차이 (<1.5 ng/ml, ≥1.5 ng/ml)에 따른 생존율의 균등 분포 검정
결과 및 결론:
본 실시예의 상기한 통계 결과들은 실시예 1의 결과를 추가로 검증해주었다. 예를 들어, 환자의 생존으로 나타난 바와 같이, 치료에 대한 긍정적인 임상 경과 확률이, 환자 혈청내 hGDF-15 수준이 증가함에 따라 유의하게 감소되는 것으로 검증되었다. 예를 들어, 표 12는, GDF-15 수준이 <1.5 ng/ml인 환자 그룹과 ≥1.5 ng/ml인 환자 그룹 간의 생존율이, 유의 수준 0.004로 입증된 바와 같이, 유의한 차이가 있다는 것을 보여준다. 마찬가지로, 표 9는 GDF-15 수준이 <1.5 ng/ml인 그룹에서 환자 생존율 (82.3%)이 더 높다는 것을 입증해주며, 표 10 및 11과 도 11 및 12는, GDF-15 수준이 <1.5 ng/ml인 환자들이 생존 기간이 GDF-15 수준이 ≥1.5 ng/ml인 환자에 비해 현저하게 더 길다는 것을 입증해준다.
즉, 본 실시예의 결과는, hGDF-15의 혈청 수준과, 예를 들어 환자에서 anti PD-1계 면역요법의 환자 반응 및 환자 생존 등의 긍정적인 임상 경과의 확률 간에 강력한 역 상관관계가 존재한다는 것을 추가로 입증해준다. 따라서, 본 발명에 따라, 환자의 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 anti PD-1과 같은 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 환자의 반응 확률을 예측하는데 유익하게 이용할 수 있다.
실시예 5 : anti-PD1 항체로 치료받은 인간 비-소 세포성 폐암 ( NSCLC ) 환자에서, 진행성 질환을 앓고 있는 환자에서의 hGDF -15 혈청 수준 중앙값이 부분 반응을 보이는 환자에서 보다 더 높다.
본 실시예는 실시예 1의 실험에서 수득한 결과, 예를 들어, 환자의 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응을 hGDF-15로 예측할 수 있다는 사실을 추가로 검증하기 위해, 다른 고형 암을 대상으로 부가적인 독립 실험을 통해 수행하였다.
환자:
NSCLC 환자들은 anti-PD1 항체의 허가된 약물 표지에 따라 anti-PD1 항체로 치료받았다. 이들 환자에는 다른 암 요법으로 사전-치료받았던 환자들도 포함된다. 완전 반응은 NSCLC 환자들에서 관찰하기 어렵기 때문에, 환자 그룹에 진행성 질환을 나타내는 환자와 PD-1 치료시 부분 반응을 보이는 환자를 포함시켰지만, PD-1 치료시 완전 반응을 나타낸 환자는 포함시키지 않았다.
혈청 샘플:
혈청 샘플은 anti-PD1 항체를 이용한 치료 전에 환자들로부터 취하였다.
효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의한 hGDF -15 혈청 수준 분석:
혈청 샘플내 hGDF-15 혈청 수준은 실시예 1에 기술된 바와 같이 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)을 통해 분석하였다.
결과:
anti-PD-1으로 치료시 부분 반응을 보인 환자 5명과, anti-PD-1으로 치료시 진행성 질환을 나타낸 환자 5명에서 hGDF-15 혈청 수준을 수득하였다. 놀랍게도, 부분 반응을 나타낸 환자에서 hGDF-15 혈청 수준의 중앙값이 0.55 ng/ml인데 반해, 진행성 질환을 나타낸 환자에서의 hGDF-15 혈청 수준의 중앙값은 1.56 ng/ml이었다. 즉, 진행성 질환을 나타낸 환자에서 hGDF-15 혈청 수준의 중앙값이 부분 반응을 나타낸 환자의 약 2.8배였다.
결론:
본 실시예의 결과는, hGDF-15의 수준이 환자의 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응과 음의 상관관계이라는 것을 추가로 검증해준다. 즉, 본 발명에 따르면, 환자의 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준은 anti PD-1과 같은 면역 체크포인트 차단제를 이용한 치료에 대한 환자의 반응 확률을 예측하는데 유익하게 이용할 수 있다. 이러한 예측은 흑색종 뿐만 아니라 NSCLC와 같은 폐암 및 본원에 언급된 그외 고형 암들 모두에 적용될 수 있다.
실시예 6 : hGDF -15 혈청 수준은 종양의 돌연변이 부담과 유의한 상관관계를 나타내지 않는다.
돌연변이 부담 (mutational burden)은 암 환자의 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응을 예측하는 공지된 긍정적인 예후 인자이다. 일반적으로, 암 세포는 암 세포에 특이적이며 비-암성 세포의 항원과는 다른 암 세포 항원을 발생시키는 게놈 돌연변이를 가지고 있다. 높은 돌연변이 부담은 이러한 암 세포-특이적인 항원의 많은 수로 이어진다. 이러한 다수의 암 세포-특이 항원을 가진 암의 경우, 면역 체크포인트 차단제에 의한 면역 반응의 자극이 특히 효과적인 것으로 간주되는데, 그 이유는 더 많은 암 세포-특이적인 항원을 면역 반응을 위한 타겟 항원으로서 이용가능하기 때문이다.
hGDF-15이 단지 종양의 돌연변이 부담에 대한 대리 마커 (surrogate marker)가 아니라는 것을 추가로 검증하고, hGDF-15 저해제를 이용한 치료가 종양의 돌연변이 부담과는 독립적으로 기전을 통해 작용한다는 것을 또한 검증하기 위해, 암 환자의 암 샘플내 hGDF-15 mRNA 수준을 암에서 동종된 체세포 돌연변이의 수에 대한 그래프로 작성하였다. 체세포 돌연변이는 엑솜 서열분석을 사용해 확인되었다. 데이타는 취리히 대학 병원의 UZH 웹툴을 사용해 분석하였다 (Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183). 결과는 도 13에 나타낸다. 도 13A는 높은 등급의 악성 흑색종 환자만을 고려한 암 게놈 아틀라스 (TGCA)로부터 입수한 암 환자 데이타 그래프를 도시한다 (암 게놈 아틀라스는 Cheng PF et al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 2015 Sep 16;145:w14183 문헌에 기술됨). GDF-15 발현은 RSEM ("RNA Seq by expectation maximization") 소프트웨어 패키지를 이용한 정규화에 의해 분석하였다 (Li B and Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 2011 Aug 4;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). 도 13B는 개별적으로 분석된 취리히 대학 병원으로부터 입수한 추가적인 전이 악성 흑색종 환자 40명의 암 환자 데이타 그래프를 도시한다.
특히, 도 13A 및 13B 둘다 p-값이 0.5로, 이는 암의 돌연변이 부담과 hGDF-15 수준 간에 유의한 상관관계가 없다는 것을 의미한다. 이러한 결과는, hGDF-15이 단지 종양의 돌연변이 부담을 표시하는 대리 마커가 아니며, hGDF-15 수준은 종양의 돌연변이 부담과는 독립적인 방식으로 면역체크포인트 차단제에 대한 환자의 반응을 예측할 수 있게 한다는 것을, 추가로 검증해준다.
실시예 7 : 야생형 종양 또는 인간 GDF -15 (과) 발현성 종양에서의 CD8 + T-세포 침윤
면역적격성 동계 마우스 C57BL/6의 우측 옆구리에 이식된 야생형 종양 또는 인간 GDF-15 (과)발현성 MC38 대장암 세포를 이용한 파일롯 실험에서, GDF-15 과발현은 면역 세포의 침윤 감소와 관련 있었다. 야생형 종양 또는 hGDF-15을 과다발현하는 형질전환 (tg) 종양을 보유한 지 29일 이후에 희생시킨 마우스에서 CD8a의 면역세포화학 사진을 도 14에 도시한다. 도에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 종양이 hGDF-15을 과다발현하는 형질전환 (tg) 종양에 비해 CD8a-양성 세포를 더 많이 함유하였다.
이들 결과는, 본 발명에 따르면, hGDF-15이 고형 암에서 CD8+ T 세포의 %를 감소시킨다는 발견 사실을 추가로 뒷받침해준다. 즉, 본 발명에 따르면, hGDF-15 수준과 우호적인 임상 경과 (예, 환자 생존 또는 치료 반응의 존재) 간의 역 상관관계에 대한 바람직한 비-제한적인 설명은, hGDF-15이 종양 전이를 비롯한 고형 종양에서 CD8+ T 림프구의 %를 떨어뜨림으로써, 우호적인 임상 경과 (예, 환자 생존 또는 치료 반응의 존재)의 확률을 줄인다는 것이다. 이러한 상관관계는 다양한 고형 종양들에서 관찰되므로, 본 발명은 흑색종과 같은 특정 고형 암으로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 장치 및 키트는 진단 제품의 제조를 위한 공지의 표준에 따라 청구된 예측 방법을 위한 제품으로서 산업적으로 제조 및 판매될 수 있다. 즉, 본 발명은 산업상 이용가능하다.
DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMACC3142 20110929
SEQUENCE LISTING <110> Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg <120> GDF-15 as a diagnostic marker to predict the clinical outcome of a treatment with immune checkpoint blockers <130> 192307 <150> GB 1517527.6 <151> 2015-10-02 <150> GB 1607800.8 <151> 2016-04-29 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Pro Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 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195 200 205 His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg 210 215 220 Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg 225 230 235 240 Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg 245 250 255 Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys 260 265 270 Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro 275 280 285 Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr 290 295 300 Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ser Gly <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag peptide <400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA peptide <400> 12 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 13 Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 14 Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 15 His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 16 Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 17 Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 18 Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 19 Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from human GDF-15 <400> 20 Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 caagtgaagc tgcagcagtc aggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagt acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180 tataacccaa ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atccctccag aaaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg t 291 <210> 22 <211> 264 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 gacattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtgg cctggtttct acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaagcact tatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cgtgcagtct 240 gaagacttgg cagagtattt ctgt 264 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 gctcgaagtt cctacggggc aatggactac 30 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 cagcaatata acaactttcc gtacacg 27 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg 1 5 10 15 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys 1 5 10 15 Asp Cys His Cys Ile 20

Claims (37)

  1. 면역 체크포인트 차단제 치료에 대한 인간 암 환자의 치료 반응의 확률을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 방법이
    a) 환자에서 수득한 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 인간 혈액 샘플에서 측정된 hGDF-15 수준을 토대로 치료 반응의 확률을 예측하는 단계를 포함하며;
    인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 감소는 치료 반응의 확률 증가를 의미하며,
    상기 암이 고형 암인, 방법.
  2. 면역 체크포인트 차단제 치료 후 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 방법이
    a) 환자에서 수득한 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 측정된 수준을 토대로 생존 확률을 예측하는 단계를 포함하며,
    인간 혈액 샘플에서 hGDF-15의 수준 감소는 생존 확률의 증가를 의미하며,
    상기 암이 고형 암인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 b)가 단계 a)에서 측정된 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 확률은 단계 a)에서 측정된 hGDF-15의 수준을 hGDF-15 역치 수준과 비교한 결과를 토대로 예측되며;
    상기 인간 혈액 샘플내 hGDF-15의 수준이 hGDF-15 역치 수준과 비교해 낮은 경우는, 상기 확률이 상기 hGDF-15 역치 수준 이상에서의 확률 보다 높은 것을 의미하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플인, 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 hGDF-15 역치 수준이 1.2 ng/ml 내지 8.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 1.5 ng/ml 내지 7.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 2.0 ng/ml 내지 6.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 2.5 ng/ml 내지 5.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준인, 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 hGDF-15 역치 수준 대비 인간 혈액 샘플내 hGDF-15 수준의 감소는, 상기 확률의 증가 수준이 > 5%, > 10%, > 20%, > 30%, > 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80% 또는 > 90%임을 의미하는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 고형 암이 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 위암 (gastric cancer), 신장암, 유잉 육종, 비-소 세포성 폐암 및 소 세포성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 상기 암이 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암 (stomach cancer), 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 상기 암이 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암 및 위암 (stomach cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 및/또는
    상기 암이 흑색종, 구강 편평 세포암, 결장직장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 암이 흑색종이고 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.0 ng/ml 내지 4.0 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.2 ng/ml 내지 3.7 ng/ml 범위로부터 선택되는 hGDF-15 수준이거나, 또는 상기 hGDF-15 역치 수준이 3.4 ng/ml의 hGDF-15 수준인, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a)는 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 이용함으로써 hGDF-15의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 hGDF-15와 복합체를 형성하거나, 및/또는
    상기 하나 이상의 항체가 하나 이상의 다클론 항체를 포함하거나, 및/또는
    상기 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 영역이 하나 이상의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역을 포함하고, 상기 결합이 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열에 포함되는, hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이거나, 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 영역이, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 아미노산 서열 ser-ala-ser을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 차단제가 하기 저해제로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는, 방법:
    i) 인간 PD-1의 저해제로서, 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및
    ii) 인간 PD-L1의 저해제로서, 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 상기 면역 체크포인트 차단제 처리를 받았던 환자로부터 유래된 샘플이고, 상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 면역 체크포인트 차단제 및/또는 이의 생물학적 대사 산물을 함유하거나, 또는
    상기 인간 환자로부터 수득되는 인간 혈액 샘플이 어떠한 면역 체크포인트 차단제를 치료도 제공받지 않았던 환자로부터 유래된 샘플이거나, 또는
    상기 방법이 고형 암의 면역 체크포인트 차단제 치료를 받는 환자에게 사용되는 것인, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법이 시험관내 방법인, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a)에서, 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 효소 연계된 면역흡착 방법(ELISA) 에 의해 측정되는, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a)에서, 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 전기화학발광 분석에 의해 측정되는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 전기화학발광 분석이 하기 물질들 간의 검출 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 샌드위치 검출 방법이고:
    (A) 스트렙타비딘-코팅된 비드 또는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 나노입자;
    (B) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    (C) 샘플 유래의 hGDF-15; 및
    (D) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역,
    상기 검출 복합체가 구조 (A)-(B)-(C)-(D)를 가지며, 상기 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프에 결합하고, 루테늄 복합체가 표지된 상기 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합하고, 상기 방법이 전기화학발광을 측정함으로써 검출 복합체를 검출하는 단계를 더 포함하며, 상기 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준이 전기화학발광 측정치를 토대로 결정되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 인간 혈액 샘플이 인간 혈청 샘플이고,
    상기 치료 반응의 확률이, 연속형 예측인자로서 ng/ml의 hGDF-15 혈청 수준에 대한 오즈비(odds ratio) 0.389를 이용해 예측되며, 95% 신뢰 구간이 0.159 - 0.698인, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 치료 반응이 버전 1.1의 RECIST 기준에 따른 반응인, 방법.
  18. 제2항에 있어서,
    상기 생존 확률이 경과 변수 (outcome variable)로서 전체 생존율과 연속형 예측인자로서 GDF-15을 이용한 위험비 (hazard ratio)를 이용해 예측되며, GDF-15 혈청 수준의 1 ng/ml 증가 당 사망 위험성이 1.27배 증가하는 것으로 예측되며, 95% 신뢰 구간이 1.10 - 1.47인, 방법.
  19. 제9항에 있어서,
    상기 단계 a)에서, hGDF-15의 수준은, hGDF-15을 제9항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역으로 포획하는 단계, 및 다클론 항체로 hGDF-15을 검출하거나 또는 hGDF-15을 포획하는 항체와는 다른 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 hGDF-15을 검출하는 단계에 의해 측정되는, 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 수행하도록 구성된 장치.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 장치는 인간 혈액 샘플의 hGDF-15 수준을 전기화학발광분석에 의해 측정하도록 구성된 전기화학발광 분석기인, 장치.
  22. 검출 키트로서,
    (i) 스트렙타비딘-코팅된 비드;
    (ii) hGDF-15에 결합할 수 있는 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역;
    (iii) 재조합 hGDF-15;
    (iv) 루테늄 복합체가 표지(labelling)된, hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및
    (v) 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 이용하기 위한 사용 설명서를 포함하며,
    상기 바이오틴화된 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있으며, 루테늄 복합체가 표지된 상기 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역이 제1 hGDF-15 에피토프와는 상이한 제2 hGDF-15 에피토프에 결합할 수 있는 것인, 검출 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 1차 항체 또는 이의 항원-결합 영역 및 상기 hGDF-15에 결합할 수 있는 2차 항체 또는 이의 항원-결합 영역 중 하나가 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이거나,
    상기 결합이 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열에 포함되는, hGDF-15 상의 입체형태적 또는 불연속 에피토프에 대한 결합이거나, 및/또는
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역이, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 아미노산 서열 ser-ala-ser을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 검출 키트.
  24. 인간 암 환자에서 면역 체크포인트 차단제에 대한 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 시험관내 방법으로서,
    상기 암이 고형 암이고,
    상기 면역 체크포인트 차단제가 하기 저해제로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것이고:
    i) 인간 PD-1의 저해제로서, 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및
    ii) 인간 PD-L1의 저해제로서, 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역,
    상기 방법이 제23항에 따른 키트를 사용하는 것인, 방법.
  25. 면역 체크포인트 차단제 치료 이후에 인간 암 환자의 생존 확률을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 시험관내 방법으로서,
    상기 암이 고형 암이고,
    상기 면역 체크포인트 차단제가 하기 저해제로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것이고:
    i) 인간 PD-1의 저해제로서, 인간 PD-1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역; 및
    ii) 인간 PD-L1의 저해제로서, 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 영역,
    상기 방법이 제23항에 따른 키트를 사용하는 것인, 방법.
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