KR102238912B1

KR102238912B1 - Dna 메틸화 변이 및 종양 변이 부담을 이용한 면역항암치료 반응성 예측방법

Info

Publication number: KR102238912B1
Application number: KR1020200063883A
Authority: KR
Inventors: 최정균; 정현철; 조대연
Original assignee: 한국과학기술원; (주)펜타메딕스
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2021-04-12
Also published as: KR20210033402A

Abstract

본 발명은 암 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계; 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하는 단계; 및 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계;를 포함하는, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

Description

DNA 메틸화 변이 및 종양 변이 부담을 이용한 면역항암치료 반응성 예측방법{METHOD FOR PREDICTING THE RESPONSE TO ANTICANCER IMMUNOTHERAPY USING DNA METHYLATION ABERRATION AND TUMOR MUTATIONAL BURDEN}

본 발명은 DNA 메틸화 변이 및 종양 변이 부담을 이용한 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법 및 예측장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 LINE-1 인자(Long Interspersed Nuclear Element-1) 기반으로 측정되는 글로벌 DNA 메틸화 수준 정보 및 종양 변이 부담을 이용한 암 환자의 면역치료에 대한 반응성 예측을 위한 정보제공 방법 및 예측장치에 관한 것이다.

암은 전 세계에서 가장 높은 사망원인 중 하나로서, 조기진단 여부에 따라 완치율이 결정되는 경우가 많아 건강검진 등을 통한 암의 조기진단이 중요하게 여겨지고 있다. 일반적으로 건강검진 시 많이 이용되는 암 검사는 혈액 내 단백질 종양 표지자(marker) 검사이며, 그 밖에 내시경, 조직검사 등을 통해 암 발생 여부를 확인할 수 있다.

암을 일으키는 유전체의 비정상적인 변이에는 3 종류가 알려져 있는데, 염색체의 일부분이 통째로 바뀌거나, 염기서열이 1-2 군데 바뀌는 염색체의 순서나 염기서열의 변화 외에 염색질의 변화(chromatin modification)인 후성적 변화가 그 원인일 수 있다(Sticker T, Catenacci DV, Seiwert TY. Molecular profiling of cancer - the future of personalized cancer medicine: a primer on cancer biology and the tools necessary to bring molecular testing to the clinic. Semin Oncol 2011 38(2): 173-85). 일반적으로 염색체의 일부 또는 몇 군데가 바뀌는 변이는 유전적(genetic) 원인일 수 있으며, 방사선과 같은 돌연변이 유발요인에 의해 체세포에서 국소적으로 일어날 수도 있다. 후성적 유전체 변화 중에서 가장 대표적인 암 세포에서의 DNA 메틸화 변화는 정확한 원인이 밝혀져 있지는 않지만 식생활이나 환경적 요인이 그 원인일 것으로 생각되고 있다. 특히 이러한 후성적 유전체 변화는 암이 발생한 조직의 유전체에서 많이 발견되고 있어 이를 이용한 진단법 개발 등의 임상적용에 대한 관심이 높아지고 있다.

DNA 메틸화(DNA methylation)는 시토신 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기(-CH3)가 공유결합으로 첨가되는 현상으로, DNA 메틸화는 정상적인 개체의 발생에서도 유전체 각인, X 염색체 불활성화 등 다양한 생명현상에서 중요한 역할을 하고 있다.

암 조직에서는 정상 세포와는 다른 두 종류의 DNA 메틸화 현상이 나타나는데, 유전체 전반에 걸친 글로벌 저메틸화(hypomethylation) 현상과 유전자 발현 조절부위에 위치한 CpG island의 고메틸화(hypermethylation) 현상이 그것이다. 저메틸화 현상은 주로 유전자와 유전자 사이의 지역(intergenic region)에서 나타나며, 이는 염색체를 불안정하게 만들어 세포분열 과정에서 염색체의 재조합, 전이, 결실, 재배열 등을 일으키는 것으로 추측되고 있다. 특히 LINE-1과 같은 전위인자(transposon)들이 정상적으로는 메틸화되어 발현이 저해되어 있다가 암에서의 저메틸화 현상에 의해 발현이 되어 유전체 곳곳으로 전이되어 염색체 불안정성의 한 가지 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 여기서, 암 조직에서의 DNA 메틸화 변화는 후성적(epigenetic)인 것으로 여겨지고 있는데, 이러한 후성적인 변화는 세포 분열 이후에도 유지되기 때문에 저메틸화 및 고메틸화는 전위인자 및 CpG island 주변에 위치한 유전자의 발현에 지속적인 영향을 주게 된다. 실제로 암 억제 유전자(tumor suppressor), 세포주기조절 유전자, DNA 수리 관련 유전자, 세포 접착 관련 유전자 등이 암 조직에서 DNA 메틸화에 의해 발현이 억제됨으로써 이들 유전자가 고장 난 것과 같은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(McCabe MT, Brandes JC, Vertino PM. Cancer DNA methylation: molecular mechanisms and clinical implications. Clin Cancer Res. 2009 15(12): 3927-37). 이들 유전자의 발현이 억제됨으로써 세포는 비정상적으로 증식하며, 유전적 안정성을 유지하지 못하게 되어 추가적인 돌연변이를 유발하여 암을 진행시키는데 중요한 역할을 하게 된다.

한편, CTLA-4, PD-1/PD-L1 면역관문 억제제 등의 면역항암제는 암세포나 암 관련 유전자를 표적으로 작용하는 기존 항암제와 달리 체내 면역체계를 활성화해 면역세포가 암세포를 공격하도록 돕는다. 면역항암제는 높은 가격에 비해 완치에 가까운 효과를 보는 환자는 소수에 불과해 면역치료에 적합한 환자군을 선별하는 것이 중요하나, 치료 반응성을 예측하는 인자에 대한 지식은 매우 제한적이며, 면역 치료 반응성과 DNA 메틸화 변이의 상관관계에 대한 연구는 전무한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0054867호

본 발명의 목적은 암 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계, 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하는 단계 및 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계, 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하는 단계 및 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 수많은 LINE-1 인자들에 일어나는 메틸화의 평균값을 이용하여 측정되는 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 LINE-1 인자는 L1HS 또는 L1PA일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 LINE-1 인자는 진화적 신생 LINE-1 family에 해당하며, 진화적 신생 LINE-1 family를 선별하는 기준으로는 RepeatMasker 데이터베이스(http://www.repeatmasker.org)에서 제공되는 DNA 서열을 사용할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 경우 면역항암 치료에 대한 저항성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 샘플은 암 조직, 전혈, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암 또는 폐암일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 면역항암 치료 반응성 예측 장치에 있어서, 프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는, 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하고, 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하고, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는, 면역항암 치료 반응성 예측 장치가 제공된다.

본 발명에 따른 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법 및 예측 장치는 암 환자의 글로벌 DNA 메틸화 정보, 종양 변이 부담 정보, 염색체 이수성 정보 또는 이들의 조합을 기반으로 하여 환자의 면역항암 치료에 대한 저항성을 예측할 수 있으며, 높은 신뢰도로 신속하고 간단하게 면역항암 치료 반응성에 관련된 정보를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법 및 예측 장치를 이용하는 경우 암 치료, 특히 면역치료를 진행하기 전에 치료 효과 및 예후가 좋을 것으로 예측되는 환자군을 선별하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 21종의 암에 대한 세포 증식 마커(a), 종양 변이 부담(b), 염색체 이수성 수준(c) 및 종양 침투 CD8+ T 세포 마커(d)와 글로벌 DNA 메틸화 수준의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 글로벌 저메틸화가 종양 변이 부담이나 염색체 이수성 과의 연관성과는 상관없이 암의 면역성 저하와 연관된다는 것으로서, 도 2a는 글로벌 메틸화 수준이 암 조직에 침투해 있는 다양한 면역세포의 활성과 양의 상관관계 (빨간색 히트맵)를 보임을 나타내며, 도 2b는 글로벌 메틸화 수준이 암세포 내에서 발현되는 면역 유전자 (hallmark immune gene set)들과는 양의 상관관계 (빨간색 히트맵), 세포분열 유전자 (hallmark proliferation gene set)들과는 음의 상관관계 (파란색 히트맵)를 가짐을 보여준다.
도 3a는 DNA 복제가 늦게 일어나는 지역 (late-replicating region)에 있는 유전자들의 발현량이 글로벌 메틸화가 높은 환자 샘플과 낮은 환자 샘플 사이에서 어떻게 차이나는지를 각 암종에 따라 보여주는 것으로서 여러 암종에서 글로벌 메틸화가 낮은 환자에서 유전자의 발현이 낮음을 확인할 수 있다.
도 3b는 DNA 복제가 늦게 일어나는 지역에 있는 유전자들의 프로모터에 존재하는 CpG island들 중 정상세포에 비해 과메틸화 (hypermethylation)된 것들의 개수를 글로벌 메틸화가 높은 환자 샘플과 낮은 환자 샘플 사이에서 각 암종에 따라 비교한 것으로서 여러 암종에서 글로벌 메틸화가 낮은 환자에서 CpG island 과메틸화가 더 많이 일어남을 확인할 수 있다.
도 3c는 세포분열에 해당하는 유전자들은 일찍 복제되는 지역 (early replication)에 더 밀집되어 있으며 반대로 면역반응에 관련하는 유전자들은 늦게 복제되는 지역에 밀집되어 있음을 통계적으로 보여주고 있다.
도 4a는 폐암 코호트 샘플 (n = 141)의 글로벌 메틸화 수준에 따른 DNA 메틸화 양상을 CpG island (CGI), shore, shelf 및 open sea 부위로 나누어 살펴본 것이다.
도 4b는 상기 샘플들에서 글로벌 메틸화 수준에 따라 CGI 및 open sea 지역의 메틸화, 종양 변이 부담, 염색체 이수성 수준이 각각 정량적으로 어떻게 차이나는지를 보여준다.
도 5a는 폐암 코호트 샘플에서 Cox 비례 위험 모형을 이용하여 분석한 글로벌 메틸화 수준에 따른 생존율로서 두 코호트를 합한 경우(combined cohort), IDIBELL 코호트, SMC 코호트 각각에 대한 결과를 보여준다.
도 5b는 폐암 코호트 샘플에서 Cox 비례 위험 모형을 이용하여 분석한 종양 변이 부담에 따른 생존율로서 두 코호트를 합한 경우(combined cohort), IDIBELL 코호트, SMC 코호트 각각에 대한 결과를 보여준다.
도 6은 흑색종 코호트 샘플에서 Cox 비례 위험 모형을 이용하여 분석한 글로벌 메틸화 수준 및 종양 변이 부담에 따른 생존율을 비교하여 나타내고 있다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 글로벌 DNA 메틸화가 변이된 종양의 면역 회피 반응 및 면역치료에 대한 저항성과 관련되는 것을 발견하여 완성된 것으로, 면역항암 치료 반응성 및 예후를 예측하는 데 활용할 수 있는 새로운 마커로서 글로벌 DNA 메틸화의 용도를 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계, 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하는 단계 및 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 제공된다.

본 발명에서 용어 "면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 면역항암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

본 발명에서 용어, "메틸화(methylation)"는 DNA를 구성하는 시토신 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기(-CH3)가 공유결합으로 부착되는 현상을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 "글로벌 DNA 메틸화"는 LINE-1 CpG 부위의 시토신에서 일어나는 메틸화를 의미한다. 메틸화가 일어나는 경우 그에 따라 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자 발현이 억제되고, 반대로 탈메틸화(demethylation) 또는 저메틸화(hypomethylation)가 일어나는 경우에는 특정 유전자 발현이 증가할 수 있다.

본 발명에서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 복수의 LINE-1 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정되는 것을 의미하며, 상기 LINE-1 인자는 진화적 신생 LINE-1 family에 해당하는 L1HS 또는 L1PA일 수 있다.

한편, 상기 메틸화의 평균값은 마이크로 어레이, 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 파이로시퀀싱, MS-HRM (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis, 메틸화 특이- 고해상도 융해곡선 분석과 메틸화 민감성 제한 효소를 사용한 메틸화 여부 측정, DNA 칩 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 메틸화 부위는 CGI를 기준으로 떨어진 거리에 따라 shelf, shore, open sea로 분류할 수 있는데, CGI로부터 2 kb 내에 있는 경우 shore, shore 로부터 2 kb 까지를 shelf라 하며, CGI로부터 4 kb 이상 떨어진 지역을 open sea로 나타낸다.

본 발명에서, 상기 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 경우 면역항암 치료에 대한 저항성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 낮은 글로벌 DNA 메틸화 수준을 가질수록 암 조직에 침투한 면역세포의 활성이 저해되어 있고, 암세포 내에서 발현되는 면역반응 유전자의 발현량이 감소되기 때문이다. 또한, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 면역치료 코호트 암 환자의 생존률이 통계학적으로 유의하게 감소하고, 이는 종양 변이 부담 및 염색체 이수성 정보와는 독립적으로 작용하는 변수로 나타나며, 실제로 많이 사용되고 있는 예측 인자인 종양 변이 부담보다 높은 정확도를 여러 코호트에서 일관적으로 보임을 확인하였는 바, 본 발명의 방법을 통해 방 매우 효과적으로 암 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있다.

상기 면역항암치료는, 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody) 등을 포함할 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서, CTLA-4, PD-1, PD-L1 억제제 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 샘플은 조직, 전혈, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서 용어, "종양 변이 부담(Tumor Mutation Burden, TMB)"은 돌연변이의 개수를 정량적으로 표현하는 수치로서, 암 조직의 시퀀싱 결과에서 mega base 당 관찰되는 돌연변이의 개수를 의미한다.

본 발명에서 용어, "염색체 이수성(Aneuploidy)"은 세포, 개체 또는 계통에서 하나의 세포당 염색체 수가 기본수의 정수배가 되지 않고, 정수배에 대하여 1 내지 여러 개가 많거나 혹은 적은 상태인 것, 즉 불완전한 구성을 한 유전체를 포함한 상태를 의미한다. 본 발명에서 염색체 이수성 수치는 CNV(Copy number variations)로부터 도출할 수 있는데, 이는 임계값±0.2(LUAD 및 LUSC의 평균값)을 log2 비율(종상 대 정상)에 적용하여 염색체 팔의 적어도 10% 또는 염색체의 5%에 영향을 미치는 중복/결실을 검출하여 절대 세그먼트 log2 비율의 총 합으로 구한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 면역항암 치료 반응성 예측 장치에 있어서, 프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는, 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하고, 상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하고, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 면역항암 치료 반응성 예측 장치가 제공된다.

상기 암 치료 반응성 예측 장치에서, 글로벌 DNA 메틸화 수준의 측정, LINE-1 인자, 암 치료, 샘플 및 암종에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 글로벌 DNA 메틸화와 면역 회피의 상관관계 도출

1-1. 대상 데이터의 선정

분석을 위해 The Cancer Genome Atlas (TCGA)에서 생성된 DNA 메틸화(Infinium Methylation 450k technology 기반), mRNA 발현 및 유전자 돌연변이 데이터를 내려 받았다(https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas). 모든 분자 데이터와 연령 정보가 포함된 100 이상의 환자 샘플이 있는 암 유형으로서 방광암(BLCA), 유방 선암(BRCA), 자궁 경부암, 편평 상피 세포암, 자궁 경부 선암(CESC), 결장직장암(CRC), 식도암(ESCA), 두경부 편평 상피세포암(HNSC), 투명 세포형 신세포암(KIRC), 유두상 신세포암(KIRP), 저등급 신경교종(LGG), 간세포암(LIHC), 폐 선암(LUAD), 폐 편평 상피 세포암(LUSC), 췌장암(PAAD), 부신암(PCPG), 전립선암(PRAD), 육종(SARC), 피부 흑색종(SKCM), 위 선암(STAD), 고환암(TGCT), 갑상선암(THCA) 및 자궁내막암(UCEC)의 21가지 종류의 암을 선정하였고, 이는 6968개의 샘플이 포함되었다. 염색체 이수성 수준은 Taylor et al.(Cancer Cell 33, 676-689.e3 (2018))의 도표로부터 얻었다.

1-2. 글로벌 메틸화 수준의 측정

글로벌 메틸화 수준을 측정하기 위해, Infinium Methylation 450k microarray의 각 프로브(probe) 서열의 90% (45 bp) 이상이 RepeatMasker 데이터베이스(www.repeatmasker.org)에서 제공하는 young LINE-1 서브 패밀리(L1HS 및 L1PA)에 맵핑되는 프로브를 선정하였다. 각 종양 샘플에서 선택된 프로브의 평균 베타 값을 평균화하여 글로벌 메틸화 수준의 추정치로 이용하였다.

실시예 2. 글로벌 DNA 메틸화 수준 상관관계 도출

상기 실시예 1에서 얻어진 값을 이용하여, 21종류의 암에 대해 글로벌 DNA 메틸화 수준과 세포 증식 마커, 종양 변이 부담, 염색체 이수성 및 종양 침투 CD8+ T 세포 마커의 상관관계를 도출하여 그 결과를 도 1에 나타냈다. 세포 증식 마커란 세포분열 및 cell cycle에 관여하는 유전자들을, CD8+ T 세포 마커란 CD8+ T cell에서 특이적으로 발현되는 유전자들을 의미하여, 주어진 암 조직 전사체 데이터에서 이들 유전자의 발현량을 마커의 활성으로 사용하였다. 각 마커들의 정의는 기존 문헌 (Immunity 48, 812-830.e14 (2018))을 따랐다. 암 종류별로 각각의 중앙값을 구하고, 통계학적 유의성은 스피어만 상관(Separman's correlation)을 이용하여 검증되었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, DNA 메틸화 수준이 증가함에 따라 세포 증식 마커 발현, 종양 변이 부담 및 염색체 이수성은 감소하는 경향, 종양 침투 CD8+ T 세포 마커 발현은 증가하는 경향을 나타냈다. 이를 통해, 세포 분열이 일어남에 따라 점진적으로 DNA 메틸화 수준이 감소하고 (demethylation 혹은 methylation loss), 종양 변이 부담과 염색체 이수성 등 DNA 상의 변이도 증가하는 양의 상관관계가 존재한다는 기존 사실을 확인할 수 있었다. 그러나, 본 발명에서 확인한 새로운 사실은 이러한 지표들과 면역 반응 간에 상관관계가 존재한다는 것이다.

상기 얽혀 있는 상관관계를 풀기 위해, 암 종류별로 각 유전자에 대한 mRNA 발현 수준을 반응 변수로 이용하고, 글로벌 메틸화, 종양 변이 부담, 염색체 이수성, 종양 순도, 나이 및 종양 기수를 예측 변수로 하여 선형 회귀 모델을 적용하였다.

다음의 공식을 이용한 회귀모델은 R의 lm 함수를 이용하여 작성되었다:

유전자 Y의 mRNA 발현 ~ β₁*글로벌 메틸화 수준+β₂*종양 변이 부담+β₃*염색체 이수성 수준+β₄*종양 순도+β₅*나이+β₆*종양 기수

암 종류별로 세 가지 예측 변수(글로벌 메틸화 수준, 종양 변이 부담 및 염색체 이수성)에 대해 유의한 회귀 계수를 갖는 유전자들 (Benjamini and Hochberg FDR<0.05)의 기능을 파악하기 위해 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA; Subramanian, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 15545-15550 (2005)))를 수행하여 유의한 NES(Normalized Enrichment Scores)(FER<0.25)를 갖는 셀은 색조를 조정하여 GSEA NESs 히트맵을 도 2a, 2b에 나타냈다.

그 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 글로벌 메틸화 수준이 낮을수록, 종양 변이 부담과 염색체 이수성과는 상관없이 독립적으로, 암 조직에 침투해 있는 다양한 면역세포의 활성도 떨어져 있고, 암세포 내에서 발현되는 면역 유전자들의 발현량도 낮아져 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 글로벌 DNA 메틸화와 면역 유전자의 발현 관계

상기 실시예 2에서 나타난 바와 같이, 세포 분열이 일어남에 따라 점진적으로 DNA 메틸화 수준이 감소하고 이에 따라 암세포 내에서 발현되는 면역 유전자들의 발현량이 낮아지는데, 세포 분열에 따른 메틸의 감소는 주로 DNA 복제가 늦게 일어나는 지역 (late-replicating region)에서 일어난다는 것이 알려져 있다. 실제로 글로벌 메틸화가 높은 환자 샘플과 낮은 환자 샘플 사이에서 DNA 복제가 늦게 일어나는 지역의 유전자 발현량에 어떠한 차이가 있는지 암종에 따라 비교하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 여러 암종에서 글로벌 메틸화가 낮은 환자의 유전자 발현이 낮은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 암의 전반적인 메틸화의 변화는 LINE과 같은 전위인자에서는 저메틸화가 일어나는 반면, 유전자 프로모터에 존재하는 CpG island들에서는 반대로 과메틸화가 동반된다는 것이 알려져 있다. 실제로 글로벌 메틸화가 높은 환자 샘플과 낮은 환자 샘플 사이에서 DNA 복제가 늦게 일어나는 지역에 있는 유전자들의 프로모터에 존재하는 CpG island들의 과메틸화되는 정도를 암종에 따라 비교하였다. 그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 여러 암종에서 글로벌 메틸화가 낮은 환자에서 CpG island 과메틸화가 더 많이 일어남을 확인할 수 있었다.

상기 실시예 2의 결과로 나타난 글로벌 메틸화 감소에 따른 면역 유전자의 발현량 감소는, 늦게 복제되는 지역에서의 상기 변화와 일치해야 함을 추론할 수 있는데, 실제로 도 3c에서 보여지는 바와 같이 세포분열에 관여하는 유전자들은 일찍 복제되는 지역에 더 밀집되어 있는 반면, 면역반응에 관련하는 유전자들은 늦게 복제되는 지역에 밀집되어 있음을 통계적으로 확인할 수 있었다.

실시예 4. 글로벌 DNA 메틸화와 면역치료 반응성의 상관관계

4-1. 폐암 체크포인트 억제제에 대한 환자 코호트

Samsung Medical Center (SMC)에서 2014년부터 2017년까지 항PD-1/PD-L1으로 치료받은 60명의 진행성 비소세포 폐암 환자를 대상으로 본 연구에 등록하였다.

Sample ID	Mutation burden	Global methylation level	Aneuploidy level	PFS	PD_Event.1_Censoring.0	Clinical benefit
3	241	0.462218282	9963319.531	28.1	1	DCB
20	119	0.497886714	0	1.133333333	1	NDB
258	78	0.414770954	141952144.3	3.966666667	1	NDB
325	289	0.357762176	373215792.9	3.866666667	0	na
378	169	0.414296576	102187138.2	13.73333333	0	DCB
488	493	0.434316952	535751134.6	1.6	1	NDB
541	240	0.362546225	349091677.2	1.2	1	NDB
573	478	0.410597593	114018200.9	1.5	1	NDB
618	194	0.349218209	263496773.3	1.366666667	1	NDB
658	156	0.403780292	141510150.7	1.066666667	1	NDB
678	731	0.396234214	191366708.2	22.43333333	0	DCB
700	102	0.428694023	17433991.68	1.366666667	1	NDB
720	461	0.294703592	307380376.1	4.066666667	1	NDB
756	831	0.280030877	658988768.2	1.5	1	NDB
825	284	0.251712972	784194239.2	1.433333333	1	NDB
830	307	0.479584284	0	2.933333333	1	NDB
947	548	0.387089023	58799436.69	20.6	0	DCB
990	59	0.325908608	285011126.5	3.166666667	1	NDB
1017	122	0.417538488	286678444.4	1.266666667	1	NDB
1066	62	0.395929718	48979857.76	0.766666667	1	NDB
1079	154	0.392672276	128159753.6	5.8	1	NDB
1104	1756	0.293149031	895819215	0.966666667	1	NDB
1145	238	0.421131362	5860926.472	2.433333333	1	NDB
1155	362	0.335438797	443235770.9	1.133333333	1	NDB
1164	236	0.293888515	520968472.1	0.366666667	1	NDB
1203	193	0.35971363	437223965.6	0.833333333	1	NDB
1208	351	0.349741738	927702954.8	0.933333333	1	NDB
1250	511	0.327435945	861780460	0.933333333	1	NDB
1297	584	0.416016984	68793176.27	10.5	1	DCB
1322	263	0.443427473	227632642	1.1	1	NDB
1327	585	0.42678156	99766614.32	6.833333333	0	DCB
1337	578	0.329661704	436129375.2	2.166666667	1	NDB
1352	1858	0.22054474	553574113.5	8.333333333	0	DCB
1358	439	0.377759517	649708156.1	8.566666667	1	DCB
1401	58	0.436672231	17494258.78	0.933333333	1	NDB
1412	294	0.264443355	545902993.4	0.1	1	NDB
1425	341	0.303500801	346192818.8	1.966666667	1	NDB
1443	423	0.270158864	836459992.2	1.766666667	1	NDB
1456	237	0.407939594	76492185.01	7.5	0	DCB
1490	248	0.315326936	403292217.7	0.9	1	NDB
1508	22	0.415487136	7542228.411	2.166666667	1	NDB
1510	364	0.377090295	465391056.4	10.8	0	DCB
1528	190	0.364790201	374128096.1	9.3	0	DCB
1554	49	0.400425652	5947504.686	1.233333333	1	NDB
1589	681	0.328377787	297587719.9	3.966666667	1	NDB
1619	15	0.455254226	7041421.973	2.733333333	1	NDB
1637	344	0.394335199	265842882.3	2.6	1	NDB
1708	365	0.450911862	2076055.089	5.6	1	DCB
1711	440	0.421240392	401532642.4	na	na	na
1751	448	0.390149399	225455169.6	4.833333333	1	NDB
1778	473	0.371084292	128523671.2	0.766666667	1	NDB
1809	214	0.324772186	400743320.7	1.466666667	1	NDB
1873	503	0.307758327	486476347.6	1.233333333	1	NDB
1883	335	0.413997537	199412472	4.366666667	1	DCB
1960	7030	0.413389522	349177478.5	1.166666667	1	NDB
2107	796	0.312709532	716225322	6.466666667	0	DCB
2126	392	0.415388193	145048834.8	2.1	1	NDB
2132	285	0.377043232	235992924.3	1.233333333	1	NDB
2133	706	0.381138966	93298957.65	3.766666667	1	NDB
2317	795	0.323139645	495812412.5	0.766666667	1	NDB

임상 반응은 Solid Tumors(RECIST) 버전 1.1의 응답 평가 기준에 의해 최소 6 개월간의 추적 관찰을 통해 평가되었다. 면역치료에 대한 반응은 durable clinical benefit(DCB, responder) 또는 non-durable benefit (NDB, non-responder)으로 분류되었다. 6개월 이상 지속된 부분적 반응(PR) 또는 안정적 질병(SD)은 DCB/responder로 간주되었다. 6개월 미만 지속된 진행성 질환(PD) 또는 SD는 NDB/non-responder로 간주되었다. 무진행 생존율 (PFS)은 치료 시작일부터 진행 날짜 또는 사망일 중 빠른 날짜까지 계산하여 구했다. 환자가 진행 없이 살아 있는 경우 PFS에 대한 마지막 추적 관찰 날짜에 검열되었다.

IDIBELL 코호트라고 명명한, 동일한 종류의 폐암 샘플 81개에 대한 메틸화 데이터는 다음 문헌에서 제공되는 것을 사용하였다. Davalos, V. et al. Epigenetic prediction of response to anti-PD-1 treatment in non-small-cell lung cancer: a multicentre, retrospective analysis. Lancet Respir. Med. 6, 771-781 (2018).

4-2. SMC 샘플에 대한 메틸화 및 종양 변이 부담 분석

종양 샘플은 항 PD1/PD-L1 치료 전에 얻고, 포르말린 고정 후 파라핀에 내장하거나 신선한 상태로 보관했다. 전체 exome 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비를 위해 AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, 80204), AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, 80284) 또는 QlAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, 56404)를 이용하여 DNA를 준비하였다. 라이브러리 준비는 지침에 따라 SureSelectXT Human All Exon V5 (Agilent, 5190-6209)를 사용하여 수행했다. 연결된 DNA는 SureSelectXT Human All Exon V5의 whole exome baits를 사용하여 혼성화한 다음, 라이브러리를 Qubit 및 2200 Tapestation에 의해 정량하고, 2X100 bp의 짝지어진 단부를 Illumina HiSeq 2500 플랫폼에서 시퀀싱하였다.

정상 샘플의 대상 범위는 50X, 종양 샘플은 100X으로 하고, 체세포 변이체를 도출하기 위해 Strelka2 54를 사용하고, 종양에서 적어도 10 및 5 회의 판독에 의해 커버되는 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV) 및 indel을 각각 선택하였다. 또한, dbSNP 150에 존재하는 일반적인 생식세포 변이체를 추가로 필터링하고, ANNOVAR를 사용하여 체세포 변이체에 주석을 달았다.

다음으로, 메틸화 분석은 Infinium Methylation EPlC BeadChIP Kit (Illumina, WG-317-1002)의 지침에 따라 수행되었다. 미가공 메틸화 값은 베타값으로 사전처리한 다음, 상기 실시예 1-2의 "글로벌 메틸화 수준의 측정"에서 설명한대로 처리하였다.

4-3. 글로벌 DNA 메틸화 수준의 체크포인트 억제제에 대한 영향 평가

상기와 같은 과정을 통해 측정된 글로벌 DNA 메틸화 수준의 중앙값을 기준으로 high, low group으로 나누어 체크포인트 억제제에 대한 영향을 평가하였다.

그 결과, low group에서 주로 open sea 지역에 저메틸화가 나타나고 반면 CpG island 및 그 주변 지역에서는 고메틸화 현상이 나타남을 알 수 있었으며(도 4a 및 4b), 상기 TCGA 실시예의 도 1에서 관찰한 바와 같이 low group에서 종양 변이 부담과 염색체 이수성 역시 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.

중요한 것은 체크포인트 치료 후의 생존율이 변이 그룹에서 더 낮은 것을 알 수 있었다. 도 5의 a, b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 종양 변이 부담은 생존율에 유의미한 상관관계를 나타내지 않았으나, 글로벌 DNA 메틸화를 예측 변수로 이용하는 경우에는 낮은 그룹에서 생존율이 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 결과는 암 환자의 면역치료에 대한 반응성, 나아가 예후 예측에 글로벌 DNA 메틸화 수준이 유의미한 마커로 이용될 수 있고, 기존에 알려진 종양 변이 부담 보다도 암 치료 반응성의 예측 인자로서의 정확도가 더 높다는 것을 시사한다.

실시예 5. 글로벌 DNA 메틸화와 흑색종에 대한 면역치료 반응성의 상관관계

추가로, 면역 체크포인트 억제제(lpilimumab, Yervoy, 또는 Pembrolizumab)를 투여 받은 흑색종 환자 15명의 무진행 생존 데이터를 Ock et.al(Nat. Commun. 8, 1050 (2017))로부터 얻었다. 또한 다른 종류의 면역치료를 받은 25명의 환자 데이터를 GDC legacy archive (https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive)로부터 획득하였다. 이들의 메틸화 및 돌연변이 데이터는 상기 실시예 1-1에서와 같이 TCGA로부터 획득하였다. 상기 실시예 3에 기재된 것과 마찬가지의 방법으로 글로벌 DNA 메틸화 환자 생존 간의 상관관계를 평가하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 경우 무진행 생존율이 감소하는 양상이 나타났으나, 종양 변이 부담의 경우 무진행 생존율에 대한 유의한 상관관계가 확인되지 않았다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

암 환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계;
상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하는 단계; 및
상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계;를 포함하며,
상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 복수의 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정되는 것인, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 LNIE-1 인자는 L1HS 또는 L1PA인, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는, 측정된 글로벌 DNA 메틸화 수준의 중앙값을 기준으로 상기 중앙값 이하인 경우 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 것으로 평가하여 면역항암 치료에 대한 저항성이 높은 것으로 판단하는, 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 샘플은 조직, 전혈, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 소변인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암 또는 폐암인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
삭제
면역항암 치료 반응성 예측 장치에 있어서,
프로세서를 포함하고, 상기 프로세서는,
환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하고,
상기 샘플로부터 종양 변이 부담(mutation burden)에 관한 정보를 획득하고,
상기 글로벌 DNA 메틸화 수준 및 종양 변이 부담에 관한 정보를 기반으로 글로벌 DNA 메틸화 수준의 중앙값을 기준으로 상기 중앙값 이하인 경우 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 것으로 평가하는 방법으로 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하며, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 복수의 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정되는 것인, 면역항암 치료 반응성 예측 장치.