JP7013390B2 - Mic-1化合物及びその使用 - Google Patents
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Description
「配列表」という表題の配列表は142,554バイトであり、2017年5月24日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
「MIC-1」という語は、本明細書で使用される場合、増殖分化因子15(GDF-15)、胎盤骨形成タンパク質(PLAB)及び非ステロイド性抗炎症薬活性化遺伝子(NAG-1)としても知られる、マクロファージ阻害性サイトカイン-1(MIC-1)を意味する。MIC-1は、62kDaの細胞内ホモダイマー前駆体タンパク質として合成され、次いでフューリン様プロテアーゼにより24.5kDaのホモダイマーに切断される。全長野生型ヒトMIC-1の配列は、UNIPROTデータベースより受託番号Q99988で入手可能である。308個のアミノ酸の前駆体配列は、シグナルペプチド(アミノ酸1~29)、プロペプチド(アミノ酸30~196)及びMIC-1モノマー配列(アミノ酸197~308)を含む。112個のアミノ酸のMIC-1モノマー配列は、本明細書に配列番号1として含まれる。MIC-1モノマーは9個のシステイン残基を含み、それにより鎖内ジスルフィド結合4つ及び鎖間ジスルフィド結合1つの形成が生じ、共有結合した24.5kDaホモダイマーが作り出される。MIC-1モノマー配列(配列番号1)におけるH6Dに相当する、天然に存在する突然変異について記載されている。
グリシン:G及びGly;プロリン:P及びPro;アラニン:A及びAla;バリン:V及びVal;ロイシン:L及びLeu;イソロイシン:I及びIle;メチオニン:M及びMet;システイン:C及びCys;フェニルアラニン:F及びPhe;チロシン:Y及びTyr;トリプトファン:W及びTrp;ヒスチジン:H及びHis;リジン:K及びLys;アルギニン:R及びArg;グルタミン:Q及びGln;アスパラギン:N及びAsn;グルタミン酸:E及びGlu;アスパラギン酸:D及びAsp;セリン:S及びSer;並びにスレオニン:T及びThr。
本発明の一部の実施形態において、MIC-1化合物はN末端アミノ酸伸長部を含む。
MIC-1化合物の計算されたpIは、化合物の正味の計算された電荷がゼロとなるpHとして定義される。pHに応じたMIC-1化合物の計算された電荷は、Table1(表1)に記載されるアミノ酸残基のpKa値、並びにB. Skoog及びA. Wichman (Trends in Analytical Chemistry、1986、vol. 5、82~83頁)に記載される方法を使用して得られる。システイン(Cys)の側鎖pKaは、遊離スルフヒドリル基を有するシステインについての電荷の計算にのみ含まれる。例として、ヒトwtMIC-1の計算されたpI値はホモダイマーとして8.8である。
ヒト野生型MIC-1は、ホモダイマーに基づくと計算されたpI8.8を有する疎水性タンパク質である。その結果、野生型MIC-1は中性pHの水性緩衝液系に約0.5mg/mlしか可溶化されない。MIC-1の溶解性が小さいことでその製剤特性及び治療上の使用が著しく妨害されるため、溶解性を操作したMIC-1化合物を開発することがMIC-1分子工学において重要である。
ヒト野生型MIC-1配列は化学的に不安定であり、アミノ酸配列のいくつかの残基について、保存中に、3位のアスパラギン(N3)の脱アミド、並びにメチオニンM43、M57及びM86の酸化などの改変を行うことができる。特定の残基が化学的に不安定であることは製薬特性に影響を及ぼしうるため、化学的に安定なMIC-1化合物を開発することは、MIC-1治療用化合物を作製することにおける別の重要な一部となるはずである。
一態様において、本発明の化合物は、配列番号1のMIC-1と比較して、pH8.0での結晶形成傾向の低下を示す。
一態様において、本発明の化合物は低い免疫原性リスクを有する。
一態様において、本発明の化合物は、ヒトMIC-1(配列番号1)と比較してMIC-1受容体効力を維持していた。受容体効力及び有効性は、ヒトMIC-1受容体(hGFRAL、GDNFファミリー受容体アルファ様)及びそのシグナル伝達共受容体hRET51(癌原遺伝子チロシン-タンパク質キナーゼ受容体Retアイソフォーム51)をトランスフェクトされた哺乳動物細胞において測定することができる。MIC-1化合物による受容体複合体の活性化は、実施例6に記載されるように、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)のリン酸化により測定される。
一態様において、本発明の化合物はin vivoで強力であり、このことは、任意の適切な動物モデルにおいて当技術分野で既知であるように決定可能である。
本発明のMIC-1化合物は、当業者に既知の組換えタンパク質技術を用いて産生可能である。概して、目的のタンパク質又はその機能性バリアントをコードする核酸配列が、望ましいMIC-1化合物をコードするように改変される。次いで、この改変された配列が発現ベクターに挿入され、発現ベクターが発現宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされる。
MIC-1化合物は、大腸菌等の細菌で発現させることができる。本発明の状況において、N-伸長部を有する前記MIC-1ポリペプチドの大規模タンパク質産生では、プロセス回収率、タンパク質純度、プロテアーゼ分解及び全体的なタンパク質安定性を制御するための有利な手法の代表例であることから、封入体(IB)を利用することができる。これは、大規模タンパク質産生において特に重要となりつつある。IBの質にとってきわめて重要なのは、N-伸長部を有するMIC-1ポリペプチドの、計算されたpIにより部分的に制御される溶解性と、IB形成とのバランスである。
「治療」という語は、言及される疾患、障害、又は状態を予防すること及び最小限に抑えることの両方を含むことを意図される(すなわち、「治療」は、文脈で別途示されるか明らかに否定されない限り、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む組成物の予防的及び治療的投与の両方を指す)。
本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物は、当技術分野で既知であるように調製可能である。
本発明による化合物での治療は、例えば抗肥満剤、食欲調節剤、並びに肥満から生じる又は肥満に関連する合併症及び障害の治療及び/又は予防のための薬剤から選択される1つ又は複数の薬理学的に活性な物質と組み合わせてもよい。
一態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物に関する。
(i)例えば食物摂取量を減少させること、体重を減少させること、食欲を抑制すること、及び満腹を誘導することによる、肥満等の摂食障害の予防及び/又は治療
(ii)高血糖、インスリン抵抗性及び/又は耐糖能障害の予防及び/又は治療
(iii)脂質異常症の予防及び/又は治療。
本発明を、以下の本発明の非限定的な実施形態により更に説明する:
1. MIC-1ポリペプチド及びN末端アミノ酸伸長部を含むMIC-1化合物であって、前記伸長部は3~200個のアミノ酸残基からなり、化合物は6.5未満の計算されたpIを有する、MIC-1化合物。
2. MIC-1ポリペプチド及びアミノ酸伸長部が、109~312個、112~312個、115~312個、112~148個又は115~148個のアミノ酸残基からなる、実施形態1に記載の化合物。
3. ホモダイマーである、実施形態1に記載の化合物。
4. ホモダイマーとしての化合物が、218~296個、224~296個、230~296個、218~310個、224~310個、230~310個、218~360個、224~360個、230~360個、218~624個、224~624個、230~296個又は230~296個のアミノ酸残基からなる、実施形態1に記載の化合物。
5. N末端アミノ酸伸長部を有するMIC-1ポリペプチドからなる化合物であって、前記伸長部は3~200個のアミノ酸残基からなり、化合物は6.5未満の計算されたpIを有する、化合物。
6. 計算されたpIが6.1未満である、実施形態1から5に記載の化合物。
7. 計算されたpIが6.0未満である、実施形態1から5に記載の化合物。
8. 計算されたpIが、6.4未満、6.3未満、6.2未満、6.1未満、6.0未満、5.9未満、5.8未満、5.7未満、5.6未満、5.5未満、5.4未満、5.3未満、又は5.2未満、5.1未満、又は5.0未満、4.9未満、4.8未満、4.7未満、4.6未満、4.5未満、4.4未満、4.3未満、4.2未満、4.1未満又は4.0未満である、実施形態1から5のいずれか一項に記載の化合物。
9. 計算されたpIが4.7超である、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
10. 計算されたpIが4.8超である、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
11. 計算されたpIが4.9超である、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
12. 計算されたpIが5.0超である、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
13. 計算されたpIが5.1超である、実施形態1から7のいずれか一項に記載の化合物。
14. 計算されたpIが、6.5~3.0、6.5~3.5、6.5~4.0、6.1~3.0、6.1~3.5、6.1~4.0、6.1~4.7、6.1~4.9、6.1~5.0、6.1~5.1、6.0~3.0、6.0~3.5、6.0~4.0、5.9~3.0、5.9~3.5、5.9~4.0、5.9~5.0、5.9~5.1、5.8~3.0、5.8~3.5、5.8~4.0、5.8~5.1、5.8~5.2、5.5~3.0、5.5~3.5、5.5~4.0、又は5.0~4.0の範囲にある、実施形態1から5のいずれか一項に記載の化合物。
15. 計算されたpIが5.8~5.2の範囲にある、実施形態1から14のいずれか一項に記載の化合物。
16. 前記伸長部の長さが、3~100、3~50、3~40、3~30、5~100、5~50、5~40、5~30、10~100、10~50、10~40、10~30、3~36、3~30、3~25、3~24、3~12、4~36、4~30、4~24、4~12、5~36、5~30、5~24、5~12、6~36、6~30、6~24、6~12、7~36、7~30、7~24、7~12、8~36、8~30、8~24、8~12、30~36、32~36、30~34、又は30~32アミノ酸残基の範囲である、実施形態1から15のいずれか一項に記載の化合物。
17. 前記伸長部がアミノ酸長3~36である、実施形態1から16のいずれか一項に記載の化合物。
18. 前記伸長部の長さが30~32アミノ酸残基の範囲である、実施形態1から17のいずれか一項に記載の化合物。
19. 伸長部が、塩基性アミノ酸残基(リジン、アルギニン又はヒスチジン)数と比較して、少なくとも3、4、5、6、7、8、9又は10個の過剰な酸性アミノ酸残基(アスパラギン酸又はグルタミン酸)を有する、実施形態1から18のいずれか一項に記載の化合物。
20. 伸長部が、塩基性アミノ酸残基(リジン又はアルギニン又はヒスチジン)数と比較して、少なくとも15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%又は75%過剰な酸性アミノ酸残基(アスパラギン酸又はグルタミン酸)を含む、実施形態1から18のいずれか一項に記載の化合物。
21. 伸長部が、酸性アミノ酸残基を少なくとも15%含む、実施形態1から20のいずれか一項に記載の化合物。
22. 伸長部が、酸性アミノ酸残基を少なくとも25%含む、実施形態21に記載の化合物。
23. 伸長部が、A、E、G、P、S、T、D、N、及びQからなる群から選択されるアミノ酸残基から構成され、前記伸長部が少なくとも3個のE及び/又はDアミノ酸残基を含む、実施形態1から22のいずれか一項に記載の化合物。
24. 伸長部が、A、E、G、P、S、T、Q及びDからなる群から選択されるアミノ酸残基から構成され、前記伸長部が少なくとも3個のE及び/又はDアミノ酸残基を含む、実施形態1から23のいずれか一項に記載の化合物。
25. 伸長部が、少なくとも3個のE、及び少なくとも1個のPを含む、実施形態23又は24に記載の化合物。
26. 伸長部がS、G、T及びAを更に含む、実施形態25に記載の化合物。
27. 伸長部が、6個のSer、4個のPro、4個のGly、4個のThr、4個のGlu及び2個のAlaを含む、実施形態26に記載の化合物。
28. 伸長部が、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG及びSEPATSGSETPGからなる群から選択される配列のうち2つを含む、実施形態27に記載の化合物。
29. 伸長部が、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG又はSEPATSGSETPGのうち、最初の6~8アミノ酸残基、最後の6~8残基又は内部の6~8残基等の連続した6~8つのアミノ酸を更に含む、実施形態28に記載の化合物。
30. 伸長部がSで始まる、実施形態23から29のいずれか一項に記載の化合物。
31. 伸長部がSEで始まる、実施形態30に記載の化合物。
32. 伸長部がSEPで始まる、実施形態31に記載の化合物。
33. 伸長部が、以下の配列SPAGSP(配列番号4)、TSESAT(配列番号5)、TSTEPE(配列番号6)、SEPATS(配列番号7)、TSTEEG(配列番号8)、PESGPG(配列番号9)、SGSAPG(配列番号10)、GSETPG(配列番号11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号14)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(配列番号15)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(配列番号16)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(配列番号17)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(配列番号18)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(配列番号19)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(配列番号20)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(配列番号21)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(配列番号22)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(配列番号23)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(配列番号24)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(配列番号25)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(配列番号26)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(配列番号27)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(配列番号28)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(配列番号29)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(配列番号30)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(配列番号31)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(配列番号32)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(配列番号33)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(配列番号34)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(配列番号35)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(配列番号36)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(配列番号37)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(配列番号38)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号70)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号71)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(配列番号39)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(配列番号40)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(配列番号41)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(配列番号42)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(配列番号43)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(配列番号44)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(配列番号45)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(配列番号46)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(配列番号47)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(配列番号48)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(配列番号49)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号50)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号51)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号52)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(配列番号53)、GEPS(配列番号118)、GPSE(配列番号119)、GPES(配列番号120)、GSPE(配列番号121)、GSEP(配列番号122)、GEPQ(配列番号123)、GEQP(配列番号124)、GPEQ(配列番号125)、GPQE(配列番号126)、GQEP(配列番号127)又はGQPE(配列番号128)、PEDEETPEQE(配列番号129)、PDEGTEEETE(配列番号130)、PAAEEEDDPD(配列番号131)、AEPDEDPQSED(配列番号132)、AEPDEDPQSE(配列番号133)、AEPEEQEED(配列番号134)、AEPEEQEE(配列番号135)、GGGS(配列番号136)、GSGS(配列番号137)、GGSS(配列番号138)及びSSSG(配列番号139)のうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
34. 伸長部が、以下の配列SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG、
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SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
35. 伸長部が、以下の配列SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち任意の2~6つの任意の組合せを含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
36. 伸長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
37. 伸長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち2~9つの任意の組合せを含む、実施形態36に記載の化合物。
38. 伸長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
39. 伸長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち2~9つの任意の組合せを含む、実施形態38に記載の化合物。
40. 伸長部が、以下の配列GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(配列番号140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(配列番号141)、GPESGPESGPESGPESGPES(配列番号142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(配列番号143)、及びGSEPGSEPGSEPGSEPGSEP(配列番号144)のうち1つ又は複数を含む、実施形態39に記載の化合物。
41. 伸長部が、以下の配列GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
42. 伸長部が、以下の配列GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、及びSSSGのうち2~9つの任意の組合せを含む、実施形態41に記載の化合物。
43. 伸長部が、以下の配列GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(配列番号145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(配列番号146)、GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(配列番号147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(配列番号148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(配列番号149)、及びGQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(配列番号150)のうち1つ又は複数を含む、実施形態42に記載の化合物。
44. 伸長部が、以下の配列PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、及びAEPEEQEE、GGGS、GSGS、GGSS及びSSSGのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
45. 伸長部が、以下の配列PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、AEPEEQEE及びAEEAEEAEEAEEAEEのうち2~3つの任意の組合せを含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
46. 伸長部が、以下の配列配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号161、配列番号162、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194及び配列番号195のうち1つ又は複数を含む、実施形態1から24のいずれか一項に記載の化合物。
47. 伸長部が、N末端に1~3個のアラニンアミノ酸残基を含む、実施形態1から46のいずれか一項に記載の化合物。
48. 伸長部が、C末端に1~4個のグリシン及びセリンアミノ酸残基を含む、実施形態1から47のいずれか一項に記載の化合物。
49. 伸長部が、C末端に(Gly-Ser)n又は(Ser-Gly)n配列を含み、nが1~8の整数である、実施形態1から48のいずれか一項に記載の化合物。
50. 伸長部が、C末端にGGGS、GSGS、GGSS又はSSSGを含む、実施形態1から49のいずれか一項に記載の化合物。
51. MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示す、実施形態1から50のいずれか一項に記載の化合物。
52. MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と少なくとも95%の配列同一性を示す、実施形態51に記載の化合物。
53. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して最大10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸改変を有する、実施形態1から51のいずれか一項に記載の化合物。
54. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して最大7、6、5、4、3又は2個のアミノ酸改変を有する、実施形態1から53のいずれか一項に記載の化合物。
55. 6.5未満の計算されたpIを有する、MIC-1ポリペプチドを含む化合物。
56. MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と比較して、以下の置換P11E、H18E、R21E、A30E、M43L、M43E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86F、M86L、Q90E、T92E、L105E、K107Eのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から55のいずれか一項に記載の化合物。
57. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、以下の置換R2S、R2A、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y又はN3Qのうち1つ又は複数を含む、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
58. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してN3の欠失(des-N3)を含む、実施形態1から57のいずれか一項に記載の化合物。
59. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してM57E又はM57L置換を含む、実施形態1から58のいずれか一項に記載の化合物。
60. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してM86L又はM86F置換を含む、実施形態1から59のいずれか一項に記載の化合物。
61. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してQ90E又はT92E置換を更に含む、実施形態60に記載の化合物。
62. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してH66E置換を含む、実施形態1から61のいずれか一項に記載の化合物。
63. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してR67E置換を含む、実施形態1から62のいずれか一項に記載の化合物。
64. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して最初の3、4、5又は6残基の欠失を含む、実施形態1から63のいずれか一項に記載の化合物。
65. MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して最初の3残基の欠失を含む、実施形態1から64のいずれか一項に記載の化合物。
66. MIC-1ポリペプチドが配列番号154による配列(M43L/des-N3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
67. MIC-1ポリペプチドが配列番号155による配列(M43L/Δ1~3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
68. MIC-1ポリペプチドが配列番号156による配列(M57E/H66E/des-N3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
69. MIC-1ポリペプチドが配列番号157による配列(M57L/Δ1~3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
70. MIC-1ポリペプチドが配列番号158による配列(M57L/des-N3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
71. MIC-1ポリペプチドが配列番号159による配列(M86L/Δ1~3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
72. MIC-1ポリペプチドが配列番号160による配列(M86L/des-N3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
73. MIC-1ポリペプチドが配列番号222による配列(M57L、M86L/des-N3)を有する、実施形態1から56のいずれか一項に記載の化合物。
74. MIC-1ポリペプチドが配列番号1による配列を有する、実施形態1から55のいずれか一項に記載の化合物。
75. MIC-1ポリペプチド及びN末端アミノ酸伸長部を含むMIC-1化合物であって、配列番号89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117又は164によるアミノ酸配列を含む、MIC-1化合物。
76. MIC-1ポリペプチド及びN末端アミノ酸伸長部を含むMIC-1化合物であって、配列番号100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117又は164によるアミノ酸配列を含む、MIC-1化合物。
77. 配列番号1のMIC-1と比較して改善された溶解性を示す、実施形態1から76のいずれか一項に記載の化合物。
78. pH8.0のトリス緩衝液系に対する、配列番号1のMIC-1と比較して改善された溶解性を示す、実施形態1から77のいずれか一項に記載の化合物。
79. pH8.0のトリス緩衝液系に対する、配列番号1のMIC-1と比較して2倍超、5倍超、10倍超、50倍超、最大100倍超の溶解性の改善を有する、実施形態1から78のいずれか一項に記載の化合物。
80. トリス緩衝液系中、pH8.0で、0.5、1.0、5.0、10、30又は50mg/mlの溶解度を有する、実施形態1から79のいずれか一項に記載の化合物。
81. トリス緩衝液系中、pH8.0で、30mg/mlの溶解度を有する、実施形態80に記載の化合物。
82. MIC-1化合物が、配列番号1のMIC-1と比較して、pH8.0での結晶形成傾向の低下を示す、実施形態1から81のいずれか一項に記載の化合物。
83. 結晶形成傾向が、pH8.0のトリス緩衝液系において測定される、実施形態82に記載の化合物。
84. 低い免疫原性リスクを有する、実施形態1から83のいずれか一項に記載の化合物。
85. 配列番号1のMIC-1と比較して、食物摂取量を減少させること及び/又は体重を減少させることについて改善されたin vivo有効性を有する、実施形態1から84のいずれか一項に記載の化合物。
86. 医薬として使用するための、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物。
87. 代謝障害の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物。
88. 代謝障害の予防及び/又は治療において使用するためであり、代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、又は糖尿病性腎症である、実施形態87に記載の化合物。
89. 肥満等の摂食障害の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物。
90. 食物摂取量を減少させること、体重を減少させること、食欲を抑制すること、及び/又は満腹を誘導することによる肥満の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態89に記載の化合物。
91. 心血管疾患の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物。
92. 脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、又は糖尿病性腎症の予防及び/又は治療において使用するための、実施形態91に記載の化合物。
93. 実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル、及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
94. 代謝障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用であって、代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、又は糖尿病性腎症である、使用。
95. 摂食障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用。
96. 肥満の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用。
97. 食物摂取量を減少させること、体重を減少させること、食欲を抑制すること、及び/又は満腹を誘導することによる肥満の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用。
98. 心血管疾患の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用。
99. 脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、又は糖尿病性腎症の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物の使用。
100. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することにより代謝障害を治療及び/又は予防する方法であって、代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、又は糖尿病性腎症である、方法。
101. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することにより、摂食障害を治療及び/又は予防する方法。
102. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することにより、肥満を治療及び/又は予防する方法。
103. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することによって、食物摂取量を減少させること、体重を減少させること、食欲を抑制すること、及び/又は満腹を誘導することで肥満を治療及び/又は予防する方法。
104. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することにより、心血管疾患を治療及び/又は予防する方法。
105. 薬学的に活性な量の、実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物を投与することにより、脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、又は糖尿病性腎症を治療及び/又は予防する方法。
106. 実施形態1から85のいずれか一項に記載の化合物をコードするポリヌクレオチド分子。
「主ピーク」は、ミリ吸光度単位で最大のUV強度を有し融合タンパク質を含む、精製クロマトグラムにおけるピークを指す。
本発明の一態様において、増大した溶解性を有するようにMIC-1化合物を設計した。本発明の一態様において、MIC-1ポリペプチドにN末端「酸性」伸長部を付加することによりこれを実現した。本発明の一態様において、MIC-1ポリペプチドのアミノ酸配列の改変によって、溶解性が増強され安定性が改善された。例えば、MIC-1ポリペプチドのN末端に伸長部を付加し、かつ/又はMIC-1ポリペプチドのアミノ酸配列内で改変を行った(配列内突然変異)。
N末端アミノ酸伸長部の設計では、タンパク質凝集に寄与するおそれがあるためF、I、L、M、V、W及びYを除外した。細胞膜への望ましくない結合を引き起こすおそれがあるためH、K、及びRも除外した。N-伸長部配列にはA、E、G、P、S、T、D、N、及びQが好ましい。化合物のpI値を減少させることによって溶解性を増大させるため、E及びDが特に好ましい。特に、一部のN-伸長部では、MIC-1化合物が大腸菌で発現される際に最初のメチオニンが除去される効率を増大させるため、ちょうどN末端に1つ又は2つの更なるアラニンを付加した。
MIC-1(配列番号1)の特定の内部残基を、例えば置換により改変した。例えば、MIC-1化合物の溶解性を増大させるため、例えばMIC-1の疎水性残基を親水性残基、好ましくは酸性残基で置換することができ、正に荷電した残基を酸性残基で置換することができる。酸化を減少させるため、メチオニンをその他のアミノ酸、例えばE、F又はLで置換することができる。
MIC-1化合物の計算されたpIは、化合物の正味の計算された電荷がゼロとなるpHとして定義される。pHに応じたMIC-1化合物の計算された電荷は、Table1(表1)に記載されるアミノ酸残基のpKa値、並びにB. Skoog及びA. Wichman (Trends in Analytical Chemistry、1986、vol. 5、82~83頁)に記載される方法を使用して得られる。システイン(Cys)の側鎖pKaは、遊離スルフヒドリル基を有するシステインについての電荷の計算にのみ含まれる。例として、ヒトwtMIC-1の計算されたpI値はホモダイマーとして8.8である。
一般的な調製方法
(実施例1):MIC-1化合物の発現及び発酵
pET11b由来のベクターにMIC-1化合物のcDNAをサブクローニングした。大腸菌において、細胞密度がOD600 1.0に達すると、0.5mMイソプロピルβ-d-チオガラクトシド(IPTG)により、封入体としてのMIC-1化合物の過剰発現を誘導した。TBにおいて37℃で20h継続的に増殖させた後細胞を採取し、LC/MS及びUPLC両方のための試料を調製して分子量を確認した。
MIC-1化合物を更に以下の通り精製した:
10mMトリス緩衝液pH8.0中の大腸菌スラリー(20%w/v)をソニケーションし(オン/オフ間隔3秒、氷上で5分間)、MIC-1化合物を遠心処理(10,000xg、30分間)によりペレットにした。20mMトリスpH8.0中の8M尿素により封入体を再可溶化し、遠心処理(10,000xg、30分間)により残骸を除去した。生じた上清中のMIC-1化合物を収集し、最終濃度0.1mg/mlになるまでリフォールディング緩衝液(50mMトリス、pH8.5及び10%DMF又は10%DMSO)で希釈した。リフォールディングプロセスを低温室で48時間継続させた。生じた溶液を、概してProtein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes、Robert K. 第3版、1994(6章及び8章)に記載されるように、0.4μmフィルターで濾過し、疎水性相互作用カラム、又はQ Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare社)を使用するアニオン交換クロマトグラフィー(50mMトリスpH8.0、0~500mM NaCl)にローディングした。一部の例では、50mMトリスpH8.0及び200mM NaClを用いて作動させるHiLoad 26/60 Superdex pg 75カラム(GE Healthcare社)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより、更なる精製を行った。保存のため、MIC-1化合物をDPBSに移し、凍結保存した。
本実験の目的は、改善された溶解性を有するMIC-1化合物をスクリーニングし、製剤において最適なpH域を決定することであった。
最大溶解度を試験するため、水及びエタノールの混合物(水60%及びエタノール40%)中にMIC-1化合物を濃度範囲3mg/ml~10mg/mlで溶解させた。次いで、溶液(各ウェル150μL)を96ウェルプレート(Corning社)に等分した。SpeedVac(Concentrator Plus、Eppendorf社)で6時間溶媒を蒸発させ、MIC-1化合物のペレットを得た。96ウェルプレートの各ウェルにトリス緩衝液(pH8.0、賦形剤不含)を添加した。最大濃度が実現されるように、ウェルに添加される緩衝液の量を、ウェル中のペレット全体を溶解させるのに必要な量未満とした。プレート振とう機で、800rpm(MixMate、Eppendorf社)で2時間プレートを振とうした。ペレットを3600gで5分間遠沈させた。上清を96-ディープウェルプレートに移し、40%エタノールで20倍に希釈した。次いで、試料を全てUPLC(Acquity、Waters社)、プレートリーダー(Infinite M200 pro、Tecan社)及びUV分光計(NanoDrop 8000、Thermo Scientific社)にかけ、濃度を決定した(Table7(表7))。
(実施例5):BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞株の樹立
本実施例の目的は、MIC-1活性を試験するための、細胞ベースのin vitroアッセイを確立することであった。哺乳動物細胞にトランスフェクトを行い、全長MIC-1受容体(hGFRAL)及びその全長シグナル伝達共受容体hRET51を安定に発現させた。
wtMIC-1及びMIC-1化合物は、BHK21-hGFRAL-IRES-hRET安定細胞においてERK1/2両方のリン酸化を誘導した(Table8(表8))。結果から、MIC-1、GFRAL及びRETの三元複合体がRETタンパク質チロシンキナーゼをリン酸化し、ERK1/2のリン酸化により、ERK/MAPK経路を含むシグナル経路を介してMIC-1のin vivo活性を誘導すると結論付けられる。
(実施例7):痩せたSprague Dawleyラットにおける、食物摂取量に対するMIC-1化合物の効果
本発明のMIC-1化合物のin vivo有効性を、9~11週齢の痩せたオスのSprague Dawleyラットで測定した。用量8nmol/kg体重(HSA-MIC-1融合タンパク質2種については4nmol/kg)で1日1回、暗期開始1~2時間前に動物に注射した。化合物は適切な緩衝溶液として皮下に投与した(1~4ml/kg)。食物摂取量の変化を自動食物モニタリングシステム(ラット用BioDAQシステム及びHM2システム)で測定した。BioDAQシステムでは動物を単独で収容した。HM2システムでは動物を群で、ケージあたり動物最大3匹で収容した。各化合物を動物n=4~8匹で試験した。実験前の少なくとも7日間、動物を順化させた。収集されたデータは、毎日12時間の暗期開始から翌日の暗期まで測定された1日食物摂取量(24時間食物摂取量)として表される。投与された化合物に応答しての毎日の食物摂取量変化を、治療群の平均1日食物摂取量から溶媒群の平均1日食物摂取量を差し引いて計算した。studentの両側t検定()を使用し、pが0.1未満であれば変化を有意であるとみなした。結果は、研究期間中記録された、溶媒と比較した食物摂取量の「最大減少」(パーセンテージ)として表される。データは、研究期間中の、食物摂取量の有意な(p<0.1)1日の減少(パーセンテージ)の合計としての、食物摂取量の「累積減少」としても表される。
人体では、N-ホルミル-メチオニンが、外来性の物質又は損傷細胞により放出される警告シグナルとして免疫系に認識され、可能性のある感染症に対して戦うよう体を刺激する(Pathologic Basis of Veterinary Disease5: Pathologic Basis of Veterinary Disease、By James F. Zachary、M. Donald McGavin)。更に、メチオニンは容易に酸化されうる不安定な残基である。したがって、N-Met切断効率はMIC-1発現にとって非常に重要である。
(1)2.5*12mer N-伸長部を有するMIC-1化合物の発現
タンパク質産生方法については実施例8を参照のこと。結果をTable13(表13)、図3及び図4に示す。
大規模タンパク質産生において、封入体は通常、主にそのより良好なスケールアップ特性のため良好な選択肢と考えられ、スケールアップ特性には主に、高い発現レベル、簡便な回収工程及び高い純度、プロテアーゼ抵抗性及び良好なプロセス安定性が含まれる。
Claims (15)
- MIC-1ポリペプチド及びN末端アミノ酸伸長部を含むMIC-1化合物であって、前記伸長部は3~36個のアミノ酸残基からなり、前記化合物は6.5未満の計算されたpIを有する、MIC-1化合物。
- ホモダイマーであり、218~296個、224~296個又は230~296個のアミノ酸残基からなる、請求項1に記載の化合物。
- 前記伸長部の長さが、3~36、3~30、3~24、3~12、4~36、4~30、4~24、4~12、5~36、5~30、5~24、5~12、6~36、6~30、6~24、6~12、7~36、7~30、7~24、7~12、8~36、8~30、8~24、8~12、30~36、32~36、30~34、又は30~32アミノ酸残基の範囲である、請求項1又は2に記載の化合物。
- 前記伸長部が、塩基性アミノ酸残基(リジン、アルギニン及びヒスチジン)数と比較して、少なくとも3、4、5又は6個の過剰な酸性アミノ酸残基(アスパラギン酸及びグルタミン酸)を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記伸長部がA、E、G、P、S、T、Q、及びDからなる群から選択されるアミノ酸残基から構成され、前記伸長部が少なくとも3個のE及び/又はDアミノ酸残基を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記伸長部が、6個のSer、4個のPro、4個のGly、4個のThr、4個のGlu及び2個のAlaを含む、請求項5に記載の化合物。
- 前記伸長部が、以下の配列
SPAGSP(配列番号4)、
TSESAT(配列番号5)、
TSTEPE(配列番号6)、
SEPATS(配列番号7)、
TSTEEG(配列番号8)、
PESGPG(配列番号9)、
SGSAPG(配列番号10)、
GSETPG(配列番号11)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号12)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号13)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号14)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(配列番号15)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(配列番号16)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(配列番号17)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(配列番号18)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(配列番号19)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(配列番号20)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(配列番号21)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(配列番号22)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(配列番号23)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(配列番号24)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(配列番号25)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(配列番号26)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(配列番号27)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(配列番号28)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(配列番号29)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(配列番号30)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(配列番号31)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(配列番号32)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(配列番号33)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(配列番号34)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(配列番号35)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(配列番号36)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(配列番号37)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(配列番号38)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号70)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号71)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(配列番号39)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(配列番号40)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(配列番号41)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(配列番号42)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(配列番号43)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(配列番号44)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(配列番号45)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(配列番号46)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(配列番号47)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(配列番号48)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(配列番号49)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号50)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号51)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号52)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(配列番号53)、
GGGS(配列番号136)、
GSGS(配列番号137)、
GGSS(配列番号138)及び
SSSG(配列番号139)
のうち1つ又は複数を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記伸長部が、以下の配列
GEPS(配列番号118)、
GPSE(配列番号119)、
GPES(配列番号120)、
GSPE(配列番号121)、
GSEP(配列番号122)、
GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(配列番号140)、
GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(配列番号141)、
GPESGPESGPESGPESGPES(配列番号142)、
GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(配列番号143)、
GSEPGSEPGSEPGSEPGSE(配列番号144)、
GEPQ(配列番号123)、GEQP(配列番号124)、
GPEQ(配列番号125)、GPQE(配列番号126)、
GQEP(配列番号127)、GQPE(配列番号128)、
GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(配列番号145)、
GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(配列番号146)、
GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(配列番号147)、
GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(配列番号148)、
GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(配列番号149)、
GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(配列番号150)、
GGGS(配列番号136)、
GSGS(配列番号137)、
GGSS(配列番号138)及び
SSSG(配列番号139)
のうち1つ又は複数を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記伸長部が、以下の配列
PEDEETPEQE(配列番号129)、
PDEGTEEETE(配列番号130)、
PAAEEEDDPD(配列番号131)、
AEPDEDPQSED(配列番号132)、
AEPDEDPQSE(配列番号133)、
AEPEEQEED(配列番号134)、
AEPEEQEE(配列番号135)、
AEEAEEAEEAEEAEE(配列番号151)、
GGGS(配列番号136)、
GSGS(配列番号137)、
GGSS(配列番号138)及び
SSSG(配列番号139)
のうち1つ又は複数を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と少なくとも90%、95%又は98%の配列同一性を示す、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、以下の置換N3E、P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86L、Q90E、T92E、L105E及びK107Eのうち1つ又は複数を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、最初の3残基の欠失(MIC-1-Δ1~3)又はN3の欠失(des-N3)を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物。
- MIC-1ポリペプチド及びN末端アミノ酸伸長部を含むMIC-1化合物であって、配列番号100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117又は164によるアミノ酸配列を含む、MIC-1化合物。
- トリス緩衝液系中、pH8.0で、0.5、1.0、5.0、10、30又は50mg/mlの溶解度を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の化合物。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物を含む、代謝障害の予防及び/又は治療用組成物であり、前記代謝障害が、肥満、糖尿病、心血管疾患、脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、又は糖尿病性腎症である、組成物。
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Citations (5)
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US20030232385A1 (en) | 2002-06-17 | 2003-12-18 | Breit Samuel N. | Methods of diagnoisis, prognosis and treatment of cardiovascular disease |
US20110172146A1 (en) | 2009-02-03 | 2011-07-14 | Amunix Operating, Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
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