KR20230046264A - Line-1의 dna 메틸화 변이를 이용한 면역항암치료 반응성 예측방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 LINE-1 서브 패밀리는, L1PA12_5end, L1HS_5end, L1PA10_3end, L1P2_5end, L1PA11_3end, L1P2_5end, L1PA13_3end, L1PA11_3end 및 L1P1_orf2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

Description

LINE-1의 DNA 메틸화 변이를 이용한 면역항암치료 반응성 예측방법{METHOD FOR PREDICTING THE RESPONSE TO ANTICANCER IMMUNOTHERAPY USING DNA METHYLATION ABERRATION OF LINE-1}
본 발명은 암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 이용하여, 암 환자의 면역치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
암은 전 세계에서 가장 높은 사망원인 중 하나로서, 조기진단 여부에 따라 완치율이 결정되는 경우가 많아 건강검진 등을 통한 암의 조기진단이 중요하게 여겨지고 있다. 일반적으로 건강검진 시 많이 이용되는 암 검사는 혈액 내 단백질 종양 표지자(marker) 검사이며, 그 밖에 내시경, 조직검사 등을 통해 암 발생 여부를 확인할 수 있다.
암을 일으키는 유전체의 비정상적인 변이에는 3 종류가 알려져 있는데, 염색체의 일부분이 통째로 바뀌거나, 염기서열이 1-2 군데 바뀌는 염색체의 순서나 염기서열의 변화 외에 염색질의 변화(chromatin modification)인 후성적 변화가 그 원인일 수 있다(Sticker T, Catenacci DV, Seiwert TY. Molecular profiling of cancer - the future of personalized cancer medicine: a primer on cancer biology and the tools necessary to bring molecular testing to the clinic. Semin Oncol 2011 38(2): 173-85). 일반적으로 염색체의 일부 또는 몇 군데가 바뀌는 변이는 유전적(genetic) 원인일 수 있으며, 방사선과 같은 돌연변이 유발요인에 의해 체세포에서 국소적으로 일어날 수도 있다. 후성적 유전체 변화 중에서 가장 대표적인 암 세포에서의 DNA 메틸화 변화는 정확한 원인이 밝혀져 있지는 않지만 식생활이나 환경적 요인이 그 원인일 것으로 생각되고 있다. 특히 이러한 후성적 유전체 변화는 암이 발생한 조직의 유전체에서 많이 발견되고 있어 이를 이용한 진단법 개발 등의 임상적용에 대한 관심이 높아지고 있다.
DNA 메틸화(DNA methylation)는 시토신 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기(-CH3)가 공유결합으로 첨가되는 현상으로, DNA 메틸화는 정상적인 개체의 발생에서도 유전체 각인, X 염색체 불활성화 등 다양한 생명현상에서 중요한 역할을 하고 있다.
암 조직에서는 정상 세포와는 다른 두 종류의 DNA 메틸화 현상이 나타나는데, 유전체 전반에 걸친 글로벌 저메틸화(hypomethylation) 현상과 유전자 발현 조절부위에 위치한 CpG island의 고메틸화(hypermethylation) 현상이 그것이다. 저메틸화 현상은 주로 유전자와 유전자 사이의 지역(intergenic region)에서 나타나며, 이는 염색체를 불안정하게 만들어 세포분열 과정에서 염색체의 재조합, 전이, 결실, 재배열 등을 일으키는 것으로 추측되고 있다. 특히 LINE-1과 같은 전위인자(transposon)들이 정상적으로는 메틸화되어 발현이 저해되어 있다가 암에서의 저메틸화 현상에 의해 발현이 되어 유전체 곳곳으로 전이되어 염색체 불안정성의 한 가지 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 여기서, 암 조직에서의 DNA 메틸화 변화는 후성적(epigenetic)인 것으로 여겨지고 있는데, 이러한 후성적인 변화는 세포 분열 이후에도 유지되기 때문에 저메틸화 및 고메틸화는 전위인자 및 CpG island 주변에 위치한 유전자의 발현에 지속적인 영향을 주게 된다. 실제로 암 억제 유전자(tumor suppressor), 세포주기조절 유전자, DNA 수리 관련 유전자, 세포 접착 관련 유전자 등이 암 조직에서 DNA 메틸화에 의해 발현이 억제됨으로써 이들 유전자가 고장 난 것과 같은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(McCabe MT, Brandes JC, Vertino PM. Cancer DNA methylation: molecular mechanisms and clinical implications. Clin Cancer Res. 2009 15(12): 3927-37). 이들 유전자의 발현이 억제됨으로써 세포는 비정상적으로 증식하며, 유전적 안정성을 유지하지 못하게 되어 추가적인 돌연변이를 유발하여 암을 진행시키는데 중요한 역할을 하게 된다.
한편, CTLA-4, PD-1/PD-L1 면역관문 억제제 등의 면역항암제는 암세포나 암 관련 유전자를 표적으로 작용하는 기존 항암제와 달리 체내 면역체계를 활성화해 면역세포가 암세포를 공격하도록 돕는다. 면역항암제는 높은 가격에 비해 완치에 가까운 효과를 보는 환자는 소수에 불과해 면역치료에 적합한 환자군을 선별하는 것이 중요하나, 치료 반응성을 예측하는 인자에 대한 지식은 매우 제한적이며, 면역 치료 반응성과 DNA 메틸화 변이의 상관관계에 대한 연구는 전무한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0054867호
본 발명의 목적은 분리된 환자의 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 이용하여 환자의 암 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법은, 암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계를 포함한다.
여기서, LINE-1 서브 패밀리는, L1PA12_5end, L1HS_5end, L1PA10_3end, L1P2_5end, L1PA11_3end, L1P2_5end, L1PA13_3end, L1PA11_3end 및 L1P1_orf2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계는, 상기 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리한 DNA의 사이토신 염기를 변형시키는 화합물을 처리하는 단계; 변형된 DNA 서열에 결합하는 프라이머를 이용하여 LINE-1 서브 패밀리를 증폭하는 단계; LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 및 비메틸화 DNA를 검출하는 단계; 메틸화 및 비메틸화 DNA 사이의 비율을 이용하여 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 수준의 추정치를 계산하는 단계;를 포함한다.
상기 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 수준의 추정치는 베타값으로 표시될 수 있으며, 상기 베타값은 메틸화 정도를 0 내지 1 범위의 값으로 표시할 수 있다. 예컨대, 0은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화되지 않은 것을 의미하며, 1은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화된 것을 의미한다.
일 실시예에 따르면, 상기 LINE-1 서브 패밀리가 여러 개일 경우, 각 메틸화 수준의 추정치에 가중치 계수 값을 곱한 뒤 이들을 합산하여 스코어를 계산하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, DNA의 사이토신 염기를 변형시키는 화합물을 처리하는 단계는 바이설파이트를 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 메틸화 및 비메틸화 DNA를 검출하는 단계는 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)을 수행하는 단계를 포함한다
일 실시예에 따르면, 암 치료는 면역항암요법이다.
일 실시예에 따르면, 시료는 세포 유리 DNA(cell free DNA)이다.
일 실시예에 따르면, 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암 또는 폐암이다.
본 개시에서 용어 '암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공방법'은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 개시에서, '메틸화(methylation)'는 DNA를 구성하는 시토신 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기(-CH3)가 공유결합으로 부착되는 현상을 의미한다.
본 개시에서, '프라이머'는 표적 핵산 분자(예컨대, 표적 유전자)의 적어도 6개 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
본 개시에서, '차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)'은 유전체의 염기서열의 고속 분석 방법으로서, 기존의 염기서열 분석법들과 달리 많은 수의 DNA조각을 병렬로 처리하는 것을 특징으로 하며 대용량의 유전체 데이터를 빠른 시간내에 해독할 수 있다.
본 개시에서, '세포 유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)'는, 혈류 또는 소변 등의 체액을 타고 돌아다니는 핵산으로 정의되며, 순환종양세포 (circulating tumor cell, CTC)로부터 유래된 ctDNA (circulating tumor DNA)를 포함할 수 있다.
상기 메틸화 수준은, 제한효소 절단 후 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 파이로시퀀싱, MS-HRM (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis, 메틸화 특이- 고해상도 융해곡선 분석과 메틸화 민감성 제한 효소를 사용한 메틸화 여부 측정, DNA 칩 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료는, 환자 DNA를 포함하는 세포 유리(cell free DNA)일 수 있다. 또한, 상기 환자 DNA는 환자의 혈액이나 조직, FFPE 등에서 추출한 gDNA 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 암 치료는 면역항암요법으로서, 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody) 등을 포함할 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서, CTLA-4, PD-1, PD-L1 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법은 높은 정확도로 환자의 암 치료에 대한 반응성에 관련된 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법은 암 치료를 진행하기 전에 치료 효과 및 예후가 좋을 것으로 예측되는 환자군을 선별하여 불필요한 치료를 줄이고, 부작용과 치료 비용을 경감시킬 수 있다.
그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 값(methylation value)에 대한 생존 분석 결과이다.
도 2는 면역항암요법에 대한 반응 환자군(responder)과 비반응 환자군(non-responder)에서, 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 값이 높은 환자와 낮은 환자의 비율을 나타낸다.
도 3은 임의로 선정된 LINE-1 내 10개 타겟의 메틸화 값에 대한 생존 분석 결과이다.
도 4는 면역항암요법에 대한 반응 환자군(responder)과 미반응 환자군(non-responder)에서, 임의로 선정된 LINE-1 내 10개 타겟의 메틸화 값이 높은 환자와 낮은 환자의 비율을 나타낸다.
도 5는 임의로 선정된 LINE-1 내 10개 타겟과 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리 각각의 생존 분석 및 면역항암요법에 대한 반응성 예측에 대한 p-value를 나타낸다.
도 6은 반응 환자군과 미반응 환자군 간의 메틸화 값 분포를 나타낸다. 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대해 좌측은 Infinium Methylation 450k microarray 방법으로 구한 메틸화 값이고, 우측은 NGS 방법으로 구한 iMethyl 스코어를 확인한 결과이다.
도 7은 폐암 환자에서 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대하여 각각 Infinium Methylation 450k microarray 방법으로 구한 메틸화 값(좌측)과 NGS 방법(우측)으로 구한 iMethyl 스코어로 면역항암요법 반응 환자군과 미반응 환자군 간의 생존율 차이를 분석한 결과이다.
도 8은 폐암 환자에서 면역 치료 반응성을 예측하는 다양한 인자로 예측된 면역항암요법 반응 환자군과 미반응 환자군 간의 생존율 차이를 비교한 결과이다.
도 9는 폐암 환자의 시료에서 추출한 DNA로부터 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 iMethyl 스코어를 통해 예측된 면역항암요법 반응 환자군과 미반응 환자군 간의 생존율 차이를 분석한 결과(좌측) 및 면역항암요법 반응성 예측 성능을 평가하기 위한 ROC 커브(우측)를 나타낸다.
도 10은 유방암 환자의 혈액(PBMC), 세포 유리 DNA(cfDNA), 종양 조직의 FFPE 검체(Tissue)에 대한 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 값 분포를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 본 개시의 일 실시예에 따른 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대한 혈액과 종양 조직의 FFPE 검체 간 상관성 결과(도 11a) 및 cfDNA와 종양 조직의 FFPE 검체 간 상관성 결과(도 11b)이다.
도 12은 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 주성분분석(Principal Component Analysis, PCA) 결과이다.
도 13는 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 계층적 군집 분석(Hierarchical Clustering) 결과이다.
도 14는 폐암 또는 유방암 환자의 시료에서 추출한 cfDNA로부터 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 iMethyl 스코어를 통해 예측된 면역항암요법 반응 환자군과 미반응 환자군 간의 생존율 차이를 분석한 결과를 나타낸다.
도 15는 폐암 또는 유방암 환자의 시료에서 추출한 cfDNA와 종양 조직 사이 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 생존 분석 p-value 분포를 비교한 결과이다.
도 16은 폐암 또는 유방암 환자의 시료에서 추출한 cfDNA로부터 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리에 대한 iMethyl 스코어에 가중치를 주어 생존 분석 p-value 분포를 비교한 결과이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. LINE-1 서브 패밀리의 선정
LINE-1 인자 내 메틸화 정도를 확인하기 위하여 LINE-1 인자 내에 10개의 타겟을 아래 표 1과 같이 선정하였다. 하기 표 1에서 Array ID는 Infinium Methylation 450k microarray 내의 프로브 ID이고, RepeatMasker는 RepeatMasker 데이터베이스(www.repeatmasker.org)에서 제공하는 young LINE-1 서브 패밀리에서 맵핑되는 정보이다. 이하의 실시예에서는, 표 1에 기재되어 있는 순서대로 LINE-1 서브 패밀리를 T1 내지 T10으로 명명하여 사용하였다.
ID Array ID Repeat Masker
T1 cg00789198 L1PA12_5end
T2 cg12678329 L1HS_5end
T3 cg17952114 L1PA10_3end
T4 ch.11.24196551F L1P2_5end
T5 cg08925882 L1PA11_3end
T6 cg05128056 L1PA11_3end
T7 ch.2.195648145F L1P2_5end
T8 cg11996397 L1PA13_3end
T9 cg01291593 L1PA11_3end
T10 ch.11.41625527F L1P1_orf2
선정된 10개의 서브 패밀리가 실제로 면역항암요법의 예후를 예측하는데 유의한 효과를 갖는지 확인하기 위해 먼저 폐암 환자 141명에 대해 생존 분석(Survival Analysis)을 진행했다. 우선 10개의 서브 패밀리에 대한 메틸화 값(methylation value)으로 하나의 대표값을 구하였다. 구체적으로, 각 서브 패밀리마다 스케일의 차이를 최소한으로 하기 위하여 전체 환자들의 메틸화 값에 대해 최소-최대 정규화(Min-Max Normalization)를 진행하였다. 그리고 각 환자마다 정규화된 10개의 메틸화 값의 평균을 계산하여 대표값으로 하였다. 이후, 전체 환자군의 대표값에 대한 평균을 기준으로 각 환자를 high methylation(대표값이 평균 이상) 또는 low methylation(대표값이 평균 미만) 그룹으로 나누어 분석했다. 생존 분석은 Kaplan-Meier 모델을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 메틸화 값이 높은 그룹(high methylation)이 낮은 그룹(low methylation)보다 생존율이 높은 것으로 확인되었으며, p-value가 0.0096으로 통계적 유의성이 입증되었다. 선정된 타겟 프로브 세트만으로도 면역항암치료의 예후가 잘 예측됨을 확인했다.
다음으로, 면역항암요법의 치료 반응성에 대한 예측 능력을 평가하기 위해 상기 환자 그룹을 다시 반응 환자(responder)(DCB, durable clinical benefit)와 미반응 환자(non-responder)(NCB, no clinical benefit)로 나누었다. 그리고 반응 환자와 미반응 환자 그룹 각각에서 메틸화 값이 높은 환자(methylation high)와 메틸화 값이 낮은 환자(methylation low)의 비율을 구하여 비교했다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 반응 환자(responder) 그룹에서는 메틸화 값이 높은 환자 비율이 더 높은 반면(0.683 vs 0.480), 미반응 환자(non-responder) 그룹에서는 메틸화 값이 높은 환자의 비율이 더 낮았고(0.317 vs 0.520), 통계적 유의성 역시 확인되었다(p-value=0.026).
상기 결과를 통해, 본 개시의 일 실시예에 따른 LINE-1 서브 패밀리는 실제 면역항암요법의 치료 반응성을 예측할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2. LINE-1 서브 패밀리와 임의(random) 타겟의 치료 반응성 예측 성능 비교
상기 실시예 1에서 선정된 LINE-1 서브 패밀리가 다른 임의의 타겟에 비해 면역항암요법 치료 반응성에 대한 예측 성능이 우수한지 검증하기 위해 임의로 LINE-1 내 10개의 타겟을 추출하여 상기 실시예 1에 기재된 실험을 반복했다.
그 결과, 도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 임의로 타겟을 정했을 때에는 생존 분석과 면역항암요법 치료 반응성 예측 능력 분석에서 유의한 결과가 나타나지 않았다. 즉, 상기 실시예 1에서 선정된 LINE-1 서브 패밀리는 LINE-1 내 다른 타겟들과 비교하여 더 우수한 치료 반응성 예측력을 가지고 있다.
다음으로, 상기 실시예 1에서 선정된 LINE-1 서브 패밀리가 LINE-1 내 다른 타겟들과 비교하여 더 우수한 예측력을 가지고 있음을 명확히 확인하기 위해 1,000번 반복하여 LINE-1 내 10개의 타겟을 랜덤으로 샘플링한 후 생존 분석의 p-value 분포와 면역항암요법 치료 반응성 예측 능력 분석의 p-value 분포를 구하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 좌측의 생존 분석에 대한 p-value 분포(p-value 평균 0.418, 중앙값 0.383)와 우측의 면역항암요법 치료 반응성 예측 분석에 대한 p-value 분포(p-value 평균 0.502, 중앙값 0.506) 모두에서, 상기 실시예 1에서 선정된 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 값을 이용했을 경우 현저히 낮은 p-value를 가지며(빨간색 별 표시, 생존 분석의 p-value=0.0096, 면역항암요법 치료 반응성 예측 분석의 p-value=0.026), 분석 결과가 유의한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. LINE-1 서브 패밀리 검출 PCR 프라이머 설계
상기 실시예 1에서 선정된 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대한 PCR 프라이머 서열을 설계하였다. Amplicon size를 100-125 bp 범위로 하여 LINE-1 서브 패밀리가 포함될 수 있도록 순방향과 역방향의 프라이머 세트를 설계하였다. 인간 유전체 참고서열로는 GRCh37 (Genome Reference Consortium Human Build 37; hg19)를 사용하였으며, 하기 표 2에 10개의 LINE-1 서브 패밀리가 참고서열에 맵핑되는 대표 위치에 대한 정보를 기재하였다.
ID CHR TARGET_POSITION MUTI -HITS
T1 19 42,007,378 　
T2 3 28,100,733 　
T3 19 55,039,730 　
T4 11 24,239,977 yes
T5 11 67,350,491 　
T6 15 100,911,974 　
T7 2 195,939,902 yes
T8 8 12,206,841 yes
T9 3 94,226,489 　
T10 11 41,668,953 yes
선정된 10개의 타겟에 대해 PCR 증폭을 수행하기 위한 프라이머를 디자인하였다. 프라이머는, 레퍼런스 게놈 서열에 바이설파이트를 처리함에 따라 CT 치환된 것으로 가정하여 만들어진 converted sequence에 대해 타겟을 포함하는 PCR 프라이머로 디자인하였다. 선정된 프라이머 서열은 다음 표와 같다.타겟 주위의 염기서열에 따라 왓슨 또는 크릭 가닥에 대하여 프라이머를 설계하였다.
타겟 서열번호 Prime ID 서열 (5'->3')
T1 1 T1_10F ATTGTAAGTTTTGTTTTTCGAAGTTCGGGGAT
2 T1_12F ATTGTAAGTTTTGTTTTTCGAAGTTTGGGGAT
3 T1_14F ATTGTAAGTTTTGTTTTTTGAAGTTCGGGGAT
4 T1_16F ATTGTAAGTTTTGTTTTTTGAAGTTTGGGGAT
5 T1_2F ATTGTAAGTTTCGTTTTTCGAAGTTCGGGGAT
6 T1_4F ATTGTAAGTTTCGTTTTTCGAAGTTTGGGGAT
7 T1_6F ATTGTAAGTTTCGTTTTTTGAAGTTCGGGGAT
8 T1_8F ATTGTAAGTTTCGTTTTTTGAAGTTTGGGGAT
9 T1_15R TCCCTCTTTTCTTTATTCTCCCGAATCAAA
10 T1_16R TCCCTCTTTTCTTTATTCTCCCAAATCAAA
T1 11 T1R_10F CTACAAACTCCACCTCCCGAAACCCGAAA
12 T1R_12F CTACAAACTCCACCTCCCGAAACCCAAAA
13 T1R_14F CTACAAACTCCACCTCCCAAAACCCGAAA
14 T1R_16F CTACAAACTCCACCTCCCAAAACCCAAAA
15 T1R_2F CTACAAACTCCGCCTCCCGAAACCCGAAA
16 T1R_4F CTACAAACTCCGCCTCCCGAAACCCAAAA
17 T1R_6F CTACAAACTCCGCCTCCCAAAACCCGAAA
18 T1R_8F CTACAAACTCCGCCTCCCAAAACCCAAAA
19 T1R_15R TTTGTTTTTTCGGGTTAAGTTGTTTGTTTAGTT
20 T1R_16R TTTGTTTTTTTGGGTTAAGTTGTTTGTTTAGTT
T2 21 T2_1R CTCACGCTAAAAACTATAAACCGAAACTATACC
22 T2_2R CTCACGCTAAAAACTATAAACCAAAACTATACC
23 T2_3R CTCACACTAAAAACTATAAACCGAAACTATACC
24 T2_4R CTCACACTAAAAACTATAAACCAAAACTATACC
25 T2_4F GGTGATTATTAAAAAATTAGGAAATAATAGATGTTGGA
T3 26 T3_1R AACGTACAAATTTACCACATAAATAAACTTATACCC
27 T3_2R AACATACAAATTTACCACATAAATAAACTTATACCC
28 T3_2F TAAATGGGAGAAATTATTTAAAGTTAAGGGGTT
T3 29 T3R_1R GGACGTGTAGGTTTGTTATATAAGTAAATTTGTGTTT
30 T3R_2R GGATGTGTAGGTTTGTTATATAAGTAAATTTGTGTTT
31 T3R_2F TTCCATTCCAAATAAAAAAAATTATCCAAAACC
T4 32 T4_1F AATTTTTAAATGATTTGATGGAGTTGAAAATTATGGG
33 T4_1R ATACTTTCTTCCAATTAATTAAATCCACTACTAAAAC
T5 34 T5R_1R TAGGTGATTTGTACGTTTCGGTTTTTTAAAGTGTTGGG
35 T5R_2R TAGGTGATTTGTACGTTTTGGTTTTTTAAAGTGTTGGG
36 T5R_3R TAGGTGATTTGTATGTTTCGGTTTTTTAAAGTGTTGGG
37 T5R_4R TAGGTGATTTGTATGTTTTGGTTTTTTAAAGTGTTGGG
38 T5R_4F ATATAACAAACCTACACATCCTCTACATATACCC
T6 39 T6_1F AGTAGGGGAAGTTAGATTGAAGGAA
40 T6_1R AAATCAACCTAAATACCCATCAACAATAAATTAAATA
T7 41 T7_1R CCCGTCACTTTCTAATACACCAATCAAATATAC
42 T7_2R CCCATCACTTTCTAATACACCAATCAAATATAC
43 T7_2F GAAGATAAGAGAAAAAAGTGAAAAGAAATGAATAAAG
T8 44 T8_1F ATTGTAATATTGATGGGTATTTAGGTTGATTTTATG
45 T8_1R TAAAAAATACAATAAACTTATCTACCTTCCAAAACAA
T9 46 T9_1F ATTTAGTTCGCGTTTCGGGGGTTATTTATGTTGT
47 T9_2F ATTTAGTTCGCGTTTTGGGGGTTATTTATGTTGT
48 T9_3F ATTTAGTTCGTGTTTCGGGGGTTATTTATGTTGT
49 T9_4F ATTTAGTTCGTGTTTTGGGGGTTATTTATGTTGT
50 T9_5F ATTTAGTTTGCGTTTCGGGGGTTATTTATGTTGT
51 T9_6F ATTTAGTTTGCGTTTTGGGGGTTATTTATGTTGT
52 T9_7F ATTTAGTTTGTGTTTCGGGGGTTATTTATGTTGT
53 T9_8F ATTTAGTTTGTGTTTTGGGGGTTATTTATGTTGT
54 T9_8R AATTACTTTTCCTCCACAACCATACTAACAC
T10 55 T10_1F TGGTTTTGTTATTGGATTTGTTTATGTGATGGATTATA
56 T10_1R CAACACATTAAAAAACTTATCCACAATAATCAAATTAA
실시예 4. NGS 라이브러리의 제조
먼저, 환자의 검체로부터 추출한 DNA에서 비메틸화된 사이토신을 우라실로 변화시키기 위하여 바이설파이트를 처리하였다. 바이설파이트 처리는 EZ DNA Methylation-Gold 키트 (Zymo Research)를 사용하여 제조사의 지시방법에 따라 진행하였다.
바이설파이트 처리한 DNA에 대해 상기 실시예 1에서 선정된 10개의 LINE-1 서브 패밀리를 증폭하기 위해 상기 실시예 3에서 제작한 프라이머를 이용하여 표적 PCR을 수행하였다. 본 실시예에서는 10개의 서브 패밀리 타겟을 2개의 그룹(1그룹: T4, T6, T7, T8, T10, 2그룹: T1, T2, T3, T5, T9로 구성)으로 나누어 다중 PCR 방법으로 증폭하였다.
구체적으로, PCR 프라이머들은 NGS 어댑터 라이게이션을 위해서 5' 말단을 인산화 수식하여 합성하였고, 각 200 nM 농도로 사용하였다. PCR 시약은 EpiTect MethyLight PCR 키트(Qiagen)를 사용하였다. 바이설파이트를 처리한 DNA 1-100 ng를 이용하여 95℃에서 5분간 1회, 95℃에서 15초, 60℃에서 2분으로 이루어진 PCR 사이클을 총 23회~29회 실시하여 타겟 영역을 증폭하였다.
PCR 산물은 두 그룹의 PCR 반응액을 혼합한 후 1.8x 부피의 AMPure XP (Beckman Coulter) 비즈를 이용하여 정제하였다. 마그네틱 비즈를 이용한 정제는 제조사의 사용방법에 따라 진행하였다. 정제한 PCR 산물에 NGS 어댑터를 라이게이션 하였다. 정제한 PCR 산물(10-100ng)에 NGS 어댑터를 1uM 농도가 되도록 첨가하고, Quick Ligase 키트(NEB)를 이용하여 라이게이션 하였다. 25℃에서 30분간 반응하고, 이후 1x 부피의 AMPure XP (Beckman Coulter) 비즈를 첨가하여 정제하였다. 어댑터가 라이게이션 된 라이브러리는 KAPA HiFi HotStart ReadyMix를 사용하여 증폭시켰다. 정제한 샘플에 하기의 라이브러리 증폭용 프라이머 각 200 nM과 KAPA HiFi HotStart ReadyMix를 첨가하고, 98℃에서 45초간 1회, 98℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 이루어진 PCR 사이클을 총 7회, 72℃에서 5분간 1회 실시하여 라이브러리를 증폭하였다. 증폭 후 AMPure XP (Beckman Coulter) 비즈를 이용하여 1x-0.5x (left-right)로 double side 정제하였다.
<라이브러리 증폭용 프라이머>
P5: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC (서열번호 57)
P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (서열번호 58)
한편, NGS 분석을 위한 라이브러리는 앞서 설명한 방법 외에 기성화된 AmpliSeq 라이브러리 제작 시약(Illumina AmpliSeq Library PLUS 등)을 사용하여 제작할 수 있다. AmpliSeq Library PLUS (Illumina) 라이브러리 제작 시약을 사용할 경우 FuPa 처리에 의한 부분 절단(partial digestion)을 위하여 상기 표 3의 프라이머 서열에서 일부 T를 U로 치환하였다(표 4). 라이브러리 제작 방법은 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
타겟 서열번호 Prime ID 서열 (5'->3')
T1 59 T1_10F-U ATTGTAAGTTTUGTTTTTCGAAGTUCGGGGAT
60 T1_12F-U ATTGTAAGTTTTGUTTTTCGAAGTTUGGGGAT
61 T1_14F-U ATTGTAAGTTTUGTTTTTTGAAGTUCGGGGAT
62 T1_16F-U ATTGTAAGTTTUGTTTTTTGAAGTTUGGGGAT
63 T1_2F-U ATTGTAAGTTTCGUTTTTCGAAGTUCGGGGAT
64 T1_4F-U ATTGTAAGTTTCGUTTTTCGAAGTTUGGGGAT
65 T1_6F-U ATTGTAAGTTUCGTTTTTTGAAGTUCGGGGAT
66 T1_8F-U ATTGTAAGTTTCGUTTTTTGAAGTTUGGGGAT
67 T1_15R-U TCCCTCTTTTCTUTATTCTCCCGAAUCAAA
68 T1_16R-U TCCCTCTTTTCUTTATTCTCCCAAAUCAAA
T1 69 T1R_10F-U CUACAAACTCCACCUCCCGAAACCCGAAA
70 T1R_12F-U CUACAAACTCCACCUCCCGAAACCCAAAA
71 T1R_14F-U CUACAAACTCCACCUCCCAAAACCCGAAA
72 T1R_16F-U CUACAAACTCCACCUCCCAAAACCCAAAA
73 T1R_2F-U CUACAAACTCCGCCUCCCGAAACCCGAAA
74 T1R_4F-U CUACAAACTCCGCCUCCCGAAACCCAAAA
75 T1R_6F-U CUACAAACTCCGCCUCCCAAAACCCGAAA
76 T1R_8F-U CUACAAACTCCGCCUCCCAAAACCCAAAA
77 T1R_15R-U TTTGTTTTTTCGGGUTAAGTTGTTTGTTTAGUT
78 T1R_16R-U TTTGTTTTTTTGGGTUAAGTTGTTTGTTTAGUT
T2 79 T2_1R-U CTCACGCTAAAAACUATAAACCGAAACTAUACC
80 T2_2R-U CTCACGCTAAAAACUATAAACCAAAACTAUACC
81 T2_3R-U CTCACACTAAAAACUATAAACCGAAACTAUACC
82 T2_4R-U CTCACACTAAAAACUATAAACCAAAACTAUACC
83 T2_4F-U GGTGATTATTAAAAAATUAGGAAATAATAGATGTUGGA
T3 84 T3_1R-U AACGTACAAATTUACCACATAAATAAACTTAUACCC
85 T3_2R-U AACATACAAATTUACCACATAAATAAACTTAUACCC
86 T3_2F-U TAAATGGGAGAAATTAUTTAAAGTTAAGGGGUT
T3 87 T3R_1R-U GGACGTGTAGGTTTGUTATATAAGTAAATTTGTGTUT
88 T3R_2R-U GGATGTGTAGGTTTGUTATATAAGTAAATTTGTGTUT
89 T3R_2F-U TTCCATTCCAAAUAAAAAAAATTAUCCAAAACC
T4 90 T4_1F-U AATTTTTAAATGATTTGAUGGAGTTGAAAATTAUGGG
91 T4_1R-U ATACTTTCTTCCAATUAATTAAATCCACTACUAAAAC
T5 92 T5R_1R-U TAGGTGATTTGTACGTUTCGGTTTTTTAAAGTGTUGGG
93 T5R_2R-U TAGGTGATTTGTACGUTTTGGTTTTTTAAAGTGTUGGG
94 T5R_3R-U TAGGTGATTTGTATGTUTCGGTTTTTTAAAGTGTUGGG
95 T5R_4R-U TAGGTGATTTGTATGTUTTGGTTTTTTAAAGTGTUGGG
96 T5R_4F-U ATATAACAAACCUACACATCCTCTACATAUACCC
T6 97 T6_1F-U AGTAGGGGAAGUTAGATUGAAGGAA
98 T6_1R-U AAATCAACCTAAATACCCAUCAACAATAAATTAAAUA
T7 99 T7_1R-U CCCGTCACTTTCUAATACACCAATCAAATAUAC
100 T7_2R-U CCCATCACTTTCUAATACACCAATCAAATAUAC
101 T7_2F-U GAAGATAAGAGAAAAAAGUGAAAAGAAATGAAUAAAG
T8 102 T8_1F-U ATTGTAATATTGATGGGUATTTAGGTTGATTTTAUG
103 T8_1R-U TAAAAAATACAAUAAACTTATCTACCTUCCAAAACAA
T9 104 T9_1F-U ATTTAGTTCGCGTTUCGGGGGTTATTTATGTUGT
105 T9_2F-U ATTTAGTTCGCGTTTUGGGGGTTATTTATGTUGT
106 T9_3F-U ATTTAGTTCGTGTTUCGGGGGTTATTTATGTUGT
107 T9_4F-U ATTTAGTTCGTGTTTUGGGGGTTATTTATGTUGT
108 T9_5F-U ATTTAGTTTGCGTTUCGGGGGTTATTTATGTUGT
109 T9_6F-U ATTTAGTTTGCGTTTUGGGGGTTATTTATGTUGT
110 T9_7F-U ATTTAGTTTGTGTTUCGGGGGTTATTTATGTUGT
111 T9_8F-U ATTTAGTTTGTGTTTUGGGGGTTATTTATGTUGT
112 T9_8R-U AATTACTTTTCCUCCACAACCATACUAACAC
T10 113 T10_1F-U TGGTTTTGTTATTGGATUTGTTTATGTGATGGATTAUA
114 T10_1R-U CAACACATTAAAAAACTUATCCACAATAATCAAATUAA
시판되는 키트(Illumina AmpliSeq Library PLUS)를 사용하여 라이브러리를 제작하는 방법은 다음과 같다. 먼저, 상기 표 4의 프라이머들을 사용하여 다중 PCR을 진행하였다. 이때 프라이머 농도는 각각 200 nM로 하였고 10개의 타겟에 대하여 1개 또는 2개의 그룹으로 나누어 다중 PCR 방법으로 증폭하였다. 바이설파이트 처리한 DNA 1-100 ng에 PCR 프라이머 세트와 AmpliSeq HiFi Mix를 첨가하고, 99℃에서 2분간 1회, 99℃에서 15초, 60℃에서 2분으로 이루어진 PCR 사이클을 총 26회~32회 실시하여 타겟 영역을 증폭하였다.
PCR 산물에 1/10 vol의 FuPa Reagent를 첨가하고 50℃에서 10분, 55℃에서 10분, 60℃에서 20분 반응하였다. 이후, Switch solution을 넣어 잘 혼합하고, 어댑터와 DNA ligase를 넣은 후, 22℃에서 30분, 68℃ 5분, 72℃ 5분 반응하여 PCR 산물에 어댑터를 부착하였다.
라이게이션 산물은 1x AMPure XP (Beckman Coulter) 비즈를 첨가하여 정제하였다. 정제 마지막 단계에서 세척 후 건조된 비즈에 elution을 위한 용액 대신 1x Lib Amp Mix 45 uL과 10x Library Amp Primers 5uL를 첨가하였다. 98℃에서 2분간 1회, 98℃에서 15초, 64℃에서 1분으로 이루어진 사이클을 총 7회 수행하여 라이브러리를 증폭하였다. 증폭 후 AMPure XP (Beckman Coulter) 비즈를 이용하여 1.2x-0.5x (left-right)로 double side 정제하였다.
위 과정을 통하여 제작한 라이브러리는 KAPA library quantification 키트 (Kapa Biosystems)를 이용하여 real-time PCR로 정량한 후 NGS 반응을 진행하였다.
실시예 5. NGS 분석
NGS 기계에서 생산된 BCL 파일로부터 Bcl2fastq 프로그램 (ver2.20.0.422)을 이용하여 각 검체 별로 생산된 NGS 서열을 fastq 파일 형태로 분리(디멀티플렉싱) 하였다. 공용 데이터베이스에서 다운로드 받은 UCSC hg19 인간 게놈 표준 서열을 바탕으로 bismark 프로그램 (ver 0.22.3)을 적용하여 바이설파이트 처리로 인해 발생할 수 있는 C-to-T (시토신 베이스가 티민 베이스로 변경) 혹은 G-to-A (구아닌 베이스가 아데닌 베이스로 변경) 변경을 반영한 바이설파이트 표준 게놈 서열과 서열 맵핑을 위한 인덱스 파일을 미리 준비하였다. 각 검체별 fastq 파일로부터 일루미나 범용 아답터 서열을 트리밍한 후 준비된 상기 바이설파이트 표준 게놈 서열에 bismark 프로그램을 이용하여 정렬(alignment)하였다. SAM (서열 정렬맵, Sequence alignment map) 파일에서 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand)에 정렬된 서열을 분리하고 bam-readcount 프로그램 (ver 0.8.0)을 이용하여 각 LINE-1 서브 패밀리 타겟 위치에서의 A, T, G, C 염기의 개수 정보를 담고 있는 bam-count-table을 얻었다. 이 count-table로부터 10개의 서브 패밀리 각각의 위치 별 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준을 계산하였다.
상기 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 수준의 추정치는 베타값으로 표시될 수 있으며, 상기 베타값은 메틸화 정도를 0 내지 1 범위의 값으로 표시할 수 있다. 예컨대, 0은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화되지 않은 것을 의미하며, 1은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화된 것을 의미한다.
실시예 1에서 선정된 10개의 LINE-1 서브 패밀리 타겟 위치에서의 베타 값을 통합하여 검체 별 하나의 iMethyl 스코어로 취하였다. iMethyl 스코어 계산 및 컷오프(cut-off) 값은 면역항암제 치료 폐암 코호트에서의 베타 값과 치료 반응성 데이터로부터 머신러닝을 적용한 선행 연구를 바탕으로 로지스틱 회귀분석법으로 선정하였고, 폐암 코호트에서의 치료 반응성 예측에 대한 iMethyl 스코어 컷오프(cut-off) 값은 0.37이었다. 면역항암제 반응성 데이터와 T1~T10의 베타값 데이터를 확보한 90명 환자에 대해 로지스틱 회귀분석법을 적용한 3-fold validation을 통해 최적의 프로브와 변수 조합을 찾았고, 각 프로브의 베타값으로부터 최종 iMethyl 스코어를 구하는 수식은 다음과 같다.
Figure pat00001

Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Ti beta 는 각 프로브 위치에서의 베타값, a i 및 b는 머신러닝을 통해 얻어진 변수값이다.
실시예 6. Infinium Methylation 450k microarray와 NGS에 대한 메틸화 값 비교
다음으로 면역관문억제제 치료 이력이 있는 폐암 환자들에 대하여 실시예 1에서 선정한 LINE-1 서브 패밀리의 치료 반응성에 대한 예측 능력을 평가하기 위해 반응 환자군과 비반응 환자군 사이 메틸화 값의 분포 차이를 확인하였다. 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, Infinium Methylation 450k microarray로 구한 메틸화 값은 p-value=0.047인 반면, 상기 실시예 5에서 기술한 방법으로 구한 iMethyl 스코어는 p-value=0.039로 보다 더 우수한 예측 능력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, Infinium Methylation 450k microarray로 구한 메틸화 값 또는 상기 실시예 5에서 기술한 방법으로 구한 iMethyl 스코어에 기반한 면역관문억제제 반응 예측군(치료 반응성이 높을 것으로 예측된 환자군)과 미반응 예측군(치료 반응성이 낮을 것으로 예측된 환자군) 간의 생존률 차이를 Kaplan-Meier 추정 기법을 사용하여 분석하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 5에서 기술한 방법으로 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대한 iMethyl 스코어(p-value=0.012)가 Infinium Methylation 450k microarray 방법에 대한 값(p-value=0.098)보다 우수한 예측력을 보이는 것을 확인하였다.
기존에 널리 알려진 면역관문억제제에 대한 반응을 예측하는 인자로 종양 조직 변이 부담(Tumor mutation burden, TMB), 신생항원 부담(Neoantigen load, NeoAg), PD-L1(SP263) 발현 유무가 있다. 각 예측 인자들에 기반하여 동일하게 Kaplan-Meier 추정 기법을 사용해 면역관문억제제 반응 예측군과 미반응 예측군으로 나누어 생존률 차이를 분석하였고, 로그 순위법(Log-Rank test)을 통해 반응 예측군과 미반응 예측군 간 생존 곡선 차이의 통계적 유의성을 P-value로 도출하였다. 면역관문억제제 반응성 예측 인자들 간에 더 유의한 비교를 위하여 각 인자마다 1,000번 반복하여 환자 샘플을 랜덤으로 샘플링을 진행하였고, 생존 분석의 p-value 분포를 비교하였다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이 LINE-1 서브 패밀리에 대한 iMethyl 스코어가 다른 기존의 인자들보다 면역관문억제제에 대해 더 우수하게 예측하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 실시예 5에서 기술한 방법으로 계산한 iMethyl 스코어가 가장 높은 예측력을 보였다.
실시예 7. 폐암 환자에서의 치료 반응성 예측 성능 검증
총 123명의 anti-PD1 혹은 anti-PD-L1 면역관문억제제 치료 이력이 있는 폐암 환자들에 대하여 환자들의 조직 또는 FFPE 검체에서 추출한 DNA를 이용하여 상기 실시예 5에서 기술한 방법(iMethyl)으로 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대한 메틸화 수준, 즉 베타 값을 분석하였다.
Kaplan-Meier 추정 기법을 사용하여 iMethyl 스코어에 기반한 면역관문억제제 반응 예측군(치료 반응성이 높을 것으로 예측된 환자군)과 미반응 예측군(치료 반응성이 낮을 것으로 예측된 환자군) 간의 생존률 차이를 분석하였다. 생존률은 기본적으로 무진행생존(Progression free survival, PFS)을 기준으로 하였다. 로그 순위법(Log-Rank test)을 통해 반응 예측군과 미반응 예측군 간 생존 곡선 차이의 통계적 유의성을 P-value로 도출하였고, 콕스 비례위험모형(Cox's proportional hazard model)을 통해 위험비(HR, Hazard ratio)를 도출하였다. 민감도와 위 양성률을 이용한 ROC(Receiver Operating Characteristic) 커브의 곡선 하 면적(AUC, Area Under a Curve)값을 통해 최종적인 예측 성능을 평가하였다. 범주형 변수의 그룹간 차이의 통계적 유의성은 Fisher's exact test (2개 그룹 비교)로 분석하였다. 연속변수의 평균값 혹은 중간값 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test로 분석하였다.
예측된 iMethyl 스코어가 높은 그룹(반응 예측군, high, 39명) 과 낮은 그룹(미반응 예측군, low, 84명)으로 나누어 두 그룹의 생존율을 비교한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, p-value=0.0103의 통계적으로 유의한 수준에서 미반응 예측군의 생존 확률이 반응 예측군보다 HR=0.684배 가량 낮았고, AUC는 0.789로 확인되어 준수한 예측 성능을 보였다.
실시예 8. LINE-1 서브 패밀리 메틸화 값에 대한 시료 별 상관 관계
먼저, 유방암 환자 50명에 대해 혈액세포(PBMC), 세포 유리 DNA(cfDNA) 및 종양 조직의 FFPE 검체(Tissue)에 대한 메틸화 값(methylation value) 분포를, 상기 실시예 1에서 선정한 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대해 확인하였다. 메틸화 값은 상기 실시예에서 기술한 NGS 방법으로 구하였다.
그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 위 그림과 같이 각 서브 패밀리에서 전반적으로 혈액세포(PBMC)보다 세포 유리 DNA(cfDNA)가 종양 조직과 더 비슷한 경향의 메틸화 값 분포를 가지며, 혈액 대비 cfDNA와 종양 조직에서 메틸화 값이 더 낮은 분포를 보였다.
다음으로 10개의 LINE-1 서브 패밀리마다 혈액과 종양 조직의 FFPE 검체 간, 그리고 cfDNA와 종양 조직의 FFPE 검체 간 상관성을 확인했다. 도 11a 및 도 11b에서 확인할 수 있는 바와 같이. 전반적으로 혈액은 종양 조직과 상관성이 크게 유의하지 않은 반면, cfDNA와 종양 조직은 대부분 강하게 양의 상관관계를 보임을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 전체 LINE-1 서브 패밀리에서, cfDNA와 종양 조직의 상관 관계를 더 분명하게 시각화하기 주성분분석(Principal Component Analysis, PCA)으로 차원을 축소하여 도 12에 나타냈다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 혈액은 종양 조직과 분리되어 분포한 반면, cfDNA는 종양 조직과 매우 유사하게 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, cfDNA와 종양 조직의 상관 관계가 더 분명함을 확인할 수 있었다.
또한, LINE-1 서브 패밀리 간의 군집 경향성 및 연관성을 확인하기 위해 혈액세포(PBMC), cfDNA, 종양 조직(Tissue) 각각에서 LINE-1 서브 패밀리에 대한 계층적 군집 분석(Hierarchical Clustering)을 진행하였다. 그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 종양 조직(Tissue)과 cfDNA는 [ {T5, T1, T3} / {T2, T9, T6, T7} / {T4} / {T8, T10} ]로, 동일하게 클러스터링 되었다. 각 클러스터를 group 1부터 group 4로 표시하였다. 이에 반면, 혈액(PBMC)은 [ {T4} / {T6, T7, T2, T9} / {T10} / {T5, T1, T3, T8} ]로 클러스터링 되면서 종양 조직과 다른 패턴을 보였다.
실시예 9. 폐암 및 유방암 환자에서의 cfDNA를 이용한 치료 반응성 예측 성능 검증
면역관문억제제 치료 이력이 있는 총 167명의 폐암 환자들과 90명의 유방암 환자들에 대하여 환자들의 세포유리 DNA (cfDNA)를 이용하여 상기 실시예 5에서 기술한 방법(iMethyl)으로 10개의 LINE-1 서브 패밀리에 대한 메틸화 수준, 즉 베타 값을 분석하였다.
실시예 7에서 기술한 방법과 동일하게 Kaplan-Meier 추정 기법을 사용해 iMethyl 스코어에 기반한 면역관문억제제 반응 예측군(치료 반응성이 높을 것으로 예측된 환자군)과 미반응 예측군(치료 반응성이 낮을 것으로 예측된 환자군) 간의 생존률 차이를 분석하였다.
예측된 iMethyl 스코어가 높은 그룹(반응 예측군, high) 과 낮은 그룹(미반응 예측군, low)으로 나누어 두 그룹의 생존율을 비교한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 폐암에서 p-value=0.003, 유방암에서 p-value=0.0017의 통계적으로 유의한 수준에서 미반응 예측군의 생존 확률이 반응 예측군보다 낮게 예측되었다.
다음으로, cfDNA로부터 얻은 메틸화 값과 종양 조직으로부터 얻은 메틸화 값에 따른 면역관문억제제 반응성 예측력을 비교하였다. 통계적인 유의성을 위하여 각 1,000번 반복하여 환자 샘플을 랜덤하게 샘플링하여 생존 분석 p-value를 구하였다. 도 15에서 확인할 수 있듯이, 폐암 환자들과 유방암 환자들에서 모두 cfDNA를 이용한 생존 분석이 종양 조직을 이용한 생존 분석에서보다 더 우수한 예측력을 보였다.
추가적으로, 면역관문억제제 반응성 예측을 더 유의하게 하기 위해 상기 실시예 1에서 선정한 각 10개의 LINE-1 서브 패밀리마다 가중치를 다르게 주어 iMethyl 스코어를 계산하였다(Weighting). 각 167명 cfDNA 폐암 환자 그룹과 90명 cfDNA 유방암 환자 그룹에서 가장 우수한 예측력을 보이는 가중치를 적용하거나(Self weighting), 다른 환자 그룹에서 가장 우수한 예측력을 보이는 가중치를 교차 적용(Cross weighting)하였다. 그 결과, 도 16에서 나타낸 바와 같이, 기존의 iMethyl 스코어보다 가중치를 두어 계산한 iMethyl 스코어가 더 유의한 예측력을 보였다. 특히, 종양 조직에서의 가중치를 교차 적용하거나 다른 종양 cfDNA에서의 가중치를 교차 적용하여도 마찬가지로 예측력이 더 우수해지는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 종합하면, cfDNA로부터 얻어진 메틸화 값은 종양 조직의 메틸화 값과 높은 상관 관계를 보이므로, cfDNA를 이용하면 보다 높은 정확도로 면역항암요법 치료 반응성을 예측할 수 있음을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (7)

  1. 암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계를 포함하고,
    상기 LINE-1 서브 패밀리는, L1PA12_5end, L1HS_5end, L1PA10_3end, L1P2_5end, L1PA11_3end, L1P2_5end, L1PA13_3end, L1PA11_3end 및 L1P1_orf2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인,
    암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    암 환자의 분리된 시료로부터 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 서브 패밀리의 DNA 메틸화 수준에 관한 정보를 획득하는 단계는,
    LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 및 비메틸화 DNA를 검출하는 단계;
    메틸화 및 비메틸화 DNA 사이의 비율을 이용하여 LINE-1 서브 패밀리의 메틸화 수준의 추정치를 계산하는 단계;
    를 포함하는, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법
  3. 제2항에 있어서,
    상기 LINE-1 서브 패밀리가 여러 개일 경우, 각 메틸화 수준의 추정치에 가중치 계수 값을 곱한 뒤 이들을 합산하여 스코어를 계산하는 단계를 포함하는, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법
  4. 제2항에 있어서,
    상기 메틸화 및 비메틸화 DNA를 검출하는 단계는 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)을 수행하는 단계를 포함하는, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법/
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암 치료는 면역항암요법인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 세포 유리 DNA(cell free DNA)인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암 및 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 암인 것인, 암 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
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