CN104853775A

CN104853775A - 针对生长和分化因子15(gdf-15)的单克隆抗体

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Publication number: CN104853775A
Application number: CN201380061148.XA
Authority: CN
Inventors: 约尔格·维施胡森; 马库斯·容克尔; 托马斯·穆勒; 斯特凡·萨雷姆巴
Original assignee: Julius Maximilian University Of Wuerzburg
Current assignee: Julius Maximilian University Of Wuerzburg
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-09-26
Also published as: TR201910744T4; AU2017203523A1; JP7270522B2; HRP20191326T1; US11891436B2; AU2013322628A1; HUE044363T2; SI2900263T1; US20240239882A1; US20180305447A1; JP2015532271A; JP2018019690A; JP2022017219A; NZ706189A; SG11201502279YA; BR112015006829A2; IL237828B; LT2900263T; JP6670275B2; IL237828A0

Abstract

本发明涉及新的单克隆抗-人-GDF-15抗体，药物组合物，试剂盒，方法和用途以及能够产生本文所述单克隆抗体的细胞系。本发明还涉及针对人GDF-15的新抗体，所述抗体能够抑制癌生长。

Description

针对生长和分化因子15(GDF-15)的单克隆抗体

发明领域

本发明涉及新的单克隆抗-人-GDF-15抗体、药物组合物、试剂盒、方法和用途以及能够产生本文所述的单克隆抗体的细胞系。本发明还涉及针对人GDF-15的新抗体，所述抗体能够抑制癌生长。

背景技术

至今，很多癌症仍然是未满足的医疗需求的领域，并且因此，意味着需要更有效地抑制癌生长，并且在更宽的癌症范围内抑制癌生长。

已知很多类型的癌症表达生长因子，包括因子比如VEGF、PDGF、TGF-β和GDF-15。

GDF-15，生长和分化因子-15，是TGF-β超家族的不同成员。其是在细胞内表达为前体，随后加工并最终从细胞分泌到环境中的蛋白。活性的、完全加工(成熟)形式的和前体GDF-15二者都可以在细胞外部找到。前体通过其COOH-末端氨基酸序列共价结合于细胞外基质(Bauskin AR等人，Cancer Research 2005)并且因此存在于细胞外部。活性的、完全加工(成熟)形式的GDF-15是可溶的并在血清中发现。因此，如果潜在的靶细胞表达可溶GDF-15配体的受体，则加工形式的GDF-15可能潜在地作用于与血液循环相关的体内任何靶细胞上。

在妊娠过程中，在生理条件下在胎盘中发现GDF-15。然而，很多恶性癌症(特别是侵袭性脑癌、黑素瘤、肺癌、胃肠道肿瘤、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌(Mimeault M和Batra SK，J.Cell Physiol 2010))在肿瘤以及在血清中呈现增加的GDF-15水平。同样已经分别描述了在高GDF-15表达和化学抗性之间(Huang CY等人，Clin.Cancer Res.2009)以及在高GDF-15表达和不良预后之间(Brown DA等人，Clin.Cancer Res.2009)的关联。

GDF-15表达在通过免疫组化评定的不同WHO分级的神经胶质瘤中(Roth等人，Clin.Cancer Res.2010)。此外，Roth等人稳定表达了表达短发夹RNA的DNA构建体，所述构建体靶向SMA560神经胶质瘤细胞中的内源性GDF-15或对照构建体。当使用这些预先建立的稳定细胞系时，他们观察到，与荷有对照构建体的小鼠相比，在荷有GDF-15敲减SMA560细胞的小鼠中的肿瘤形成延迟。

专利申请WO 2005/099746和WO 2009/021293涉及抗-人-GDF-15抗体(Mab26)，所述抗体能够在小鼠中体内对抗人GDF-15在肿瘤诱导的重量减轻方面的效应：在这些文献中，给免疫缺陷小鼠施用转染有过表达人GDF-15的质粒的人肿瘤细胞(前列腺癌细胞DU145)。携带缺少GDF-15序列的质粒的肿瘤细胞用作阴性对照。表达异种移植物GDF-15的那些小鼠呈现肿瘤-诱导的重量减轻(临床术语：恶病质)和厌食。单次腹膜内施用1mg来自WO 2005/099746的Mab26导致肿瘤-诱导的重量减轻的完全逆转。WO 2005/099746和WO 2009/021293未公开抗-人-GDF-15抗体对肿瘤生长的影响。

类似地，Johnen H等人(Nature Medicine，2007)报道了抗-人-GDF-15单克隆抗体对癌症-引起的厌食和重量减轻的影响，但甚至当以1mg的高剂量施用抗体时，也未观察到抗-人-GDF-15抗体对由于癌症而形成的肿瘤的大小的任何影响，并且因此所述抗体不抑制癌生长。

因此，至今，在本领域中仍然存在对有效抑制癌生长的方法，和对在更宽的癌症范围内抑制癌生长的方法的需求。

因此，本发明的目的是获得有效抑制癌生长的方法，和可以在更宽的癌症范围内用于抑制癌生长的方法。

在发现新的抑制癌生长的方法的尝试中，本发明人出人意料地发现一种针对人GDF-15的新单克隆抗体能够在小鼠中抑制人异种移植肿瘤的癌生长。

此外，并且与本领域中已知的治疗性抗体相比，即使在没有另外的亲和力成熟的情况下，根据本发明的针对人GDF-15的抗体对重组GDF-15也具有约790pM的平衡解离常数，与大多数治疗性抗体相比，其是更高的亲和力。

因此，与本领域已知的抗体相比，根据本发明的针对人GDF-15的抗体具有优越的性质，并且尤其用于抑制癌生长。因此，完成本发明。

发明简述

本发明通过提供单克隆抗体、药物组合物、试剂盒、用途和能够产生本文所述单克隆抗体的细胞系来解决上文提及的目标。

尤其是，本发明人出人意料地表明，根据本发明的针对人GDF-15的新单克隆抗体及其抗原结合部分能够抑制癌生长。这是意料之外的，因为已知本领域之前已知的那些针对GDF-15的单克隆抗体(WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007)引起癌症-引起的重量减轻的逆转(即由癌症表达的GDF-15引起的继发性症状的逆转)，但显示未能抑制癌生长。

通过表明根据本发明的针对人GDF-15的新单克隆抗体能够抑制癌生长，本发明人还出人意料地表明，人GDF-15蛋白可以被本发明的抗体以癌生长被抑制的方式靶向。预期相同的癌生长抑制机制可应用于大量过表达人GDF-15的癌症，包括以下列出的癌症。

因此，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。

此外，本发明涉及根据本发明的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分或所述药物组合物。

此外，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒含有根据本发明的药物组合物。

本发明还涉及表达载体，所述表达载体包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。

此外，本发明涉及细胞系，所述细胞系能够产生根据本发明的抗体或其抗原结合部分。

因此，通过提供针对人GDF-15的新单克隆抗体，本发明提供新的癌生长抑制剂，所述抑制剂满足本领域中的上述需求。

附图简述

图1：用或不用GDF-15处理之后，NK细胞上的NKG2D表达。在抗-GDF-15抗体mAb B1-23存在或缺失下用指定细胞因子处理后，确定在NK细胞上NKG2D的细胞表面表达。该图显示通过流式细胞术确定的特异荧光强度，相对于非特异对照抗体来定量。

图2：卵巢癌细胞系SK-OV-3中的Akt磷酸化。为了定量对于卵巢癌细胞系SK-OV-3的蛋白质印迹，计算磷酸化的Akt与Akt总量的比例并相对于未处理对照标准化。

图3：免疫细胞中的JNK1/2磷酸化。为了定量蛋白质印迹，计算磷酸化的JNK1/2与JNK总量的比例，相对于未处理对照标准化。

图4：B1-23在体内的抗-肿瘤效果。Balb/c^nu/^nu裸鼠用于使用黑素瘤细胞系UACC-257的异种移植物设置中。与PBS对照组(填充的实心圆)相比，用B1-23处理的动物群体(空心正方形)的肿瘤尺寸显著减小。显著性定义为通过Wilcoxon′s对数秩检验评价，p<0.05。

发明详述

定义

除非下文另有定义，本发明中使用的术语应该根据本领域技术人员已知的其通常意义来理解。

本文使用的术语“抗体”是指能够特异结合研究的抗原的任何功能抗体，如Paul，W.E.(编辑).：Fundamental Immunology第2版.Raven Press，Ltd.，New York 1989的第7章一般性概述的，其通过引用并入本文。无特别限制，术语“抗体”包括来自任何适当的来源物种的抗体，所述物种包括鸡和哺乳动物，比如小鼠、山羊、非人灵长类和人。优选地，所述抗体是人源化抗体。所述抗体优选为单克隆抗体，其可以通过本领域公知的方法制备。术语“抗体”包括IgG-1，-2，-3，或-4，IgE，IgA，IgM，或IgD同种型抗体。术语“抗体”包括单体抗体(比如IgD，IgE，IgG)或低聚抗体(比如IgA或IgM)。术语“抗体”还包括–无特别限制-分离的抗体和改造的抗体比如遗传改造的抗体，例如嵌合抗体。

抗体结构域的命名按照本领域已知的术语。如本领域通常已知的，抗体的每个单体包含两条重链和两条轻链。这些中，各个重链和轻链包含可变区(对于重链称为V_H并且对于轻链称为V_L)，其对于抗原结合是重要的。这些重链和轻链可变结构域包含(以N-末端到C-末端的顺序)区域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4(FR，框架区；CDR，互补决定区，也称为高变区)。抗体序列内的上述抗体区域的鉴定和分配通常根据Kabat等人(Sequences of proteins of immunological interest，U.S.卫生和人类服务部，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.1983)，或Chothia等人(Conformations of immunoglobulin hypervariableregions.Nature.1989Dec 21-28；342(6252):877-83.)，或可以通过使用Giudicelli等人(IMGT/V-QUEST，an integrated software program forimmunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleic Acids Res.2004Jul 1；32(Web Server issue):W435-40.)中描述的软件IMGT/V-QUEST进行，其通过引用并入本文。优选地，通过使用IMGT/V-QUEST软件鉴定和分配上文指出的抗体区域。

“单克隆抗体”是来自抗体的基本同源群体的抗体，其中所述抗体在序列上基本相同(例如相同，除了含有天然存在的序列修饰比如在其N-和C-末端的氨基酸修饰的小部分抗体)。不同于多克隆抗体(其含有针对许多表位的不同抗体的混合物)，单克隆抗体针对相同表位并且因此高度特异。术语“单克隆抗体”包括(但不限于)从源自单个细胞克隆的单克隆细胞群体获得的抗体，如例如通过和Milstein(Nature，1975Aug7；256(5517):495-7)或Harlow和Lane(“Antibodies：A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1988)中描述的杂交瘤方法产生的抗体。单克隆抗体还可以从其它合适的方法获得，包括噬菌体展示技术比如在Clackson等人(Nature.1991Aug15；352(6336):624-8)或Marks等人(J Mol Biol.1991Dec 5；222(3):581-97)中描述的那些。单克隆抗体可以是已经通过本领域已知方法优化了抗原结合性质比如减小的Kd值、优化的缔合和解离动力学的抗体。例如，Kd值可以通过展示方法包括噬菌体展示来优化，产生亲和力成熟的单克隆抗体。术语“单克隆抗体”不限于来自特别物种来源或来自一个单一物种来源的抗体序列。因此，术语“单克隆抗体”的意思包括嵌合单克隆抗体比如人源化单克隆抗体。

“人源化抗体”是含有人序列和小部分非-人序列的抗体，所述非-人序列赋予对研究的抗原(例如人GDF-15)的结合特异性。典型地，人源化抗体通过由来自结合研究的抗原(例如人GDF-15)的非-人供体抗体(例如小鼠、兔、大鼠供体抗体)的高变区序列替代来自人受体抗体的高变区序列而产生。在一些情况中，受体抗体的框架区序列还可以由供体抗体的相应序列替代。除了源自供体和受体抗体的序列之外，“人源化抗体”也可以含有或不含有其它(另外或替代)残基或序列。这种其它残基或序列可以用于进一步改善抗体性质比如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人中抗原性)。产生人源化抗体的方法的非限制性实例是本领域中已知的，例如来自Riechmann等人(Nature.1988Mar 24；332(6162):323-7)或Jones等人(Nature.1986May 29-Jun 4；321(6069):522-5)。

术语“人抗体”涉及含有人可变和恒定结构域序列的抗体。该定义包括具有携带可能用于进一步改善抗体性质比如结合性质(例如降低Kd值)和/或免疫原性(例如降低人中抗原性)的单个氨基酸取代或修饰的人序列的抗体。术语“人抗体”不包括人源化抗体，所述人源化抗体中，部分非-人序列赋予对于研究的抗原的结合特异性。

本文使用的抗体的“抗原结合部分”是指保留抗体特异结合抗原(例如GDF-15)能力的抗体部分，即“抗原结合部分”能够与抗体竞争特异结合抗原。“抗原结合部分”可以含有抗体的一个或多个片段。无特别限制，其可以通过任何本领域已知的合适方法产生，包括重组DNA方法和通过化学或酶片段化抗体制备。抗原结合部分可以是Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、双抗体(diabodies)或允许保持结合抗原的任何其它抗体部分。

“抗体”(例如单克隆抗体)或“抗原结合部分”可以衍生或连接于不同分子。例如，可以连接于抗体的分子是其它蛋白(例如其它抗体)、分子标记(例如荧光、发光、有色或放射性分子)、药剂和/或毒剂。抗体或抗原结合部分可以直接连接(例如以两种蛋白中间融合的方式)，或通过接头分子连接(例如本领域中已知的任何适当类型的化学接头)。

如本文使用的，术语“结合(binding)”或“结合(bind)”是指特异结合研究的抗原(例如人GDF-15)。优选地，Kd值小于100nM，更优选小于50nM，还更优选小于10nM，还更优选小于5nM并且最优选小于2nM。

本文使用的术语“表位”是指形成抗体的结合位点的小的抗原部分。

在本发明的情况下，通过使用表面等离子共振测量作为参考标准测定，来测量抗体或其抗原结合部分对研究的抗原(例如人GDF-15)的结合或竞争结合，如下文所述。

术语“K_D”或“K_D值”涉及本领域中已知的平衡解离常数。在本发明的情况下，这些术语涉及抗体关于研究的特定抗原(例如人GDF-15)的平衡解离常数。所述平衡解离常数是复合体(例如抗原-抗体复合体)可逆解离为其组分(例如抗原和抗体)的倾向的测量值。对于根据本发明的抗体，K_D值(比如对于抗原人GDF-15的那些)通常通过使用下文描述的表面等离子共振测量确定。

本文使用的术语“癌生长”是指任何可测量的癌生长。对于形成实体瘤的癌，“癌生长”是指肿瘤体积随时间的可测量的增加。如果癌症仅形成单个肿瘤，则“癌生长”是仅指单个肿瘤的体积的增加。如果癌症形成多个肿瘤比如转移，则“癌生长”是指所有可测量肿瘤体积的增加。对于实体瘤，肿瘤体积可以通过本领域中已知的任意方法测量，包括磁共振成像和计算机断层扫描(CT扫描)。

对于特征为在血液中存在血液系统的癌细胞的白血病，“癌生长”是指每血液体积癌细胞数量的可测量的增加。为了进行这种测量，可以通过使用本领域中已知的任意方法从血液样品鉴定癌细胞，所述方法包括细胞形态学测量，或对肿瘤细胞标志物蛋白比如肿瘤标志物细胞表面蛋白染色，例如通过用特异抗体染色，并且可以计数癌细胞。

本文使用的术语比如“抑制癌生长”是指用抗体治疗的患者中可测量的癌生长抑制。优选地，所述抑制是统计学显著的。癌生长的抑制可以通过将根据本发明治疗的患者组的癌生长与未治疗患者的对照组相比较来评价，或通过将接受本领域的标准癌症治疗加上根据本发明的治疗的患者组与仅接受本领域标准癌症治疗的患者对照组相比较来评价。根据接受的临床研究标准，例如双盲、以足够的统计学强度随机研究，设计这种评价癌生长抑制的研究。术语“抑制癌生长”包括癌生长被部分抑制的癌生长抑制(即与对照组的患者相比，患者中的癌生长延迟)，癌生长被完全抑制的抑制(即患者中的癌生长终止)，和癌生长被反转的抑制(即癌缩小)。

本文使用的“分离的抗体”是从其来源环境的主要组分(以重量计)，例如从杂交瘤培养物或用于其生产的不同细胞培养物(例如重组表达抗体的生产细胞比如CHO细胞)的组分鉴定和分离的抗体。这样进行分离：其充分去除否则可以干扰抗体用于所需应用的适合性(例如根据本发明的抗-人GDF-15抗体的治疗性用途)的组分。制备分离的抗体的方法是本领域已知的并且包括蛋白A层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、病毒保留性过滤和超滤。优选地，如通过使用Lowry蛋白测定测量的，分离的抗体制备物至少70％纯度(w/w)，更优选至少80％纯度(w/w)，还更优选至少90％纯度(w/w)，还更优选至少95％纯度(w/w)，并且最优选至少99％纯度(w/w)。

本文使用的“双抗体”是小的双价抗原-结合抗体部分，其包含在相同多肽链上通过肽接头(其太短从而不允许相同链上的两个结构域配对)连接轻链可变结构域的重链可变结构域。这导致与其它链的互补结构域配对并且导致二聚分子与两个抗原结合位点的组装。双抗体可以是双价并且单特异性的(比如具有两个对人GDF-15的抗原结合位点的双抗体)，或可以是双价并且双特异的(例如具有两个抗原结合位点的双抗体(一个是对人GDF-15的结合位点，并且另一个是对不同抗原的结合位点))。双抗体的详细描述可以在Holliger P等人(“"Diabodies"：small bivalent and bispecificantibody fragments.”Proc Natl Acad Sci U S A.1993Jul 15；90(14):6444-8.)中找到。

本文使用的“单结构域抗体”(也被称为“纳米抗体(Nanobody)^TM”)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的结构和产生单结构域抗体的方法是本领域已知的，例如来自Holt LJ等人(“Domainantibodies：proteins for therapy.”Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90.)，Saerens D等人(“Single-domain antibodies as buildingblocks for novel therapeutics.”Curr Opin Pharmacol.2008Oct；8(5):600-8.Epub 2008Aug 22.)，和Arbabi Ghahroudi M等人(“Selection andidentification of single domain antibody fragments from camel heavy-chainantibodies.”FEBS Lett.1997Sep 15；414(3):521-6.)。

本文使用的术语“更高”意为患者样品中的值(例如GDF-15水平)高于相应对照样品中或对照样品组中的值。优选地，差异是统计学显著的。

本文使用的术语“升高的GDF-15水平”意为当与作为参考的健康人对照个体的血清中的中值GDF-15水平相比时，在施用根据本发明的抗体或其抗原结合部分或药物组合物之前，人患者血清中具有更高的GDF-15水平。

健康人对照个体的血清中GDF-15水平的优选的中值参考值为<0.8ng/ml。在健康人对照中预期的范围在0.2ng/ml和1.2ng/ml之间(参考文献：Tanno T等人：“Growth differentiation factor 15in erythroid health anddisease.”Curr Opin Hematol.2010May；17(3)：184–190.)。

优选地，所述水平是1.2-倍高，更优选1.5-倍高，还更优选2-倍高并且最优选5-倍高。

本文使用的术语“施用之前”意为施用根据本发明的抗体、其片段或药物组合物之前的时期。优选地，术语“施用之前”意为施用之前30天的时期；最优选施用之前一周的时期。

本文使用的术语“显著的”，“显著地”，等是值之间的统计学显著差异。

术语“癌症”和“癌细胞”在本文根据其在本领域中常见意义使用(参见例如Weinberg R.等人：The Biology of Cancer.Garland Science：New York2006.850p.)。

根据本发明，术语“包含”的每次出现可以任选地被术语“由…组成”替代。

方法和技术

除非在本文中另有定义，通常，本发明中使用的方法(例如克隆方法或与抗体相关的方法)根据本领域中已知的步骤，例如在Sambrook等人(“Molecular Cloning：A Laboratory Manual.”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 1989)，Ausubel等人(“Current Protocols in Molecular Biology.”Greene Publishing Associates andWiley Interscience；New York 1992)，和Harlow and Lane(“Antibodies：ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York 1988)中描述的步骤进行，其全部通过参考并入本文。

根据本发明的单克隆抗-人-GDF-15抗体的结合通常通过使用BioradProteOn XPR36系统和Biorad GLC传感器芯片，应用表面等离子共振测量评价，如在实施例1中关于抗-人GDF-15mAb-B1-23所述。

根据本发明序列的序列比对通过使用BLAST算法进行(参见Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool.”Journal of Molecular Biology215.p.403-410.；Altschul等人：(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST：anew generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25:3389-3402.)。优选地，使用以下参数：最大靶序列10；字长3；BLOSUM62矩阵；缺口成本(gap costs)：存在性11，延伸1；有条件的组合评分矩阵调整。因此，当与序列连同使用时，术语比如“同一性”或“同一的”是指通过使用BLAST算法获得的同一性值。

根据本发明的单克隆抗体可以通过本领域已知的任意方法生产，包括但不限于Siegel DL(“Recombinant monoclonal antibody technology.”Transfus Clin Biol.2002Jan；9(1):15-22.)中涉及的方法。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体是由根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH)(DSMZ)的杂交瘤细胞系B1-23产生。保藏在2011年9月29日提交。

细胞增殖可以通过本领域已知的适当方法测量，包括(但不限于)目视显微镜、代谢测定比如测量线粒体氧化还原电位的那些(例如MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物)测定；刃天青染色，也被称为Alamar测定)，对已知的内源性增殖生物标志物(例如Ki-67)染色、和测量细胞DNA合成的方法(例如BrdU和[³H]-胸苷掺入实验)。

免疫抑制可以通过本领域中已知的适当方法测量，包括(但不限于)免疫细胞增殖、细胞因子分泌、通过流式细胞术的细胞内细胞因子染色、通过qRT-PCR的细胞因子测量、重定向的靶细胞裂解、进一步的细胞毒性或脱颗粒测定、激活的免疫细胞受体(如NKG2D)的下调、抑制剂性免疫细胞受体的上调、免疫突触的形成、免疫细胞浸润。对于要应用的术语免疫抑制，效果应该可以以这些中的至少一个或以任何其他的适当测定测量。在具体测试中缺乏效果不意味着免疫抑制的总体缺乏。

人GDF-15水平可以通过本领域中已知的任何方法测量，包括通过以下方法测量GDF-15mRNA水平：所述方法包括(但不限于)使用特异于人GDF-15的引物定量实时PCR(qRT-PCR)人GDF-15mRNA，使用特异于人GDF-15的探针的mRNA原位杂交，mRNA深度测序方法；并且包括通过以下方法测量GDF-15蛋白水平：所述方法包括(但不限于)源自人GDF-15的蛋白或肽的质谱，使用特异于人GDF-15的抗体的蛋白质印迹，使用特异于人GDF-15的抗体的流式细胞术，使用特异于人GDF-15的抗体的试纸检验，或特异于人GDF-15的抗体的免疫细胞化学。对于这种使用特异于人GDF-15的抗体的方法，优选本发明的抗-人GDF-15抗体，并且由以保藏号DSM ACC3142于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)保藏的杂交瘤细胞系B1-23产生的本发明的抗体是最优选的。

具体实施方案

如上文所述，本发明人表明，人GDF-15蛋白可以被本发明的抗体以癌生长被抑制的方式被靶向。

鉴于本领域教导了仅癌症-引起的重量减轻可以由抗-GDF-15抗体逆转，并且教导了癌生长不能被抑制(WO 2005/099746，WO 2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007)，这是出人意料的发现。

当考虑到本发明时，变得明显的是，已知来自WO 2005/099746，WO2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007的抗-GDF-15抗体仅抑制人GDF-15的效果之一(即癌症-诱导的重量减轻)，但未能抑制人GDF-15的其它效果比如与癌生长相关的那些。基于本发明，对于该失败的一个可能的解释是，已知来自以上文献的抗体仅可以干涉人GDF-15跨血脑屏障的转运(通过形成不能跨越血脑屏障转运的大的复合体)，但不能够以使其通常不能与其受体(例如脑外部的细胞上存在的受体)相互作用的方式结合人GDF-15。

预期本发明抗体的以下性质更完全地增进其抑制人GDF-15的效应的能力，包括抑制癌生长：

对人GDF-15形式的广泛的结合特异性

本发明的抗体能够结合成熟的重组人GDF-15(由SEQ ID No：8表示)并且因此能够结合活性的、完全加工的(成熟)人GDF-15。

此外，通过用根据本发明的mAb-B1-23抗体在人细胞上进行染色实验，本发明人表明，根据本发明的mAb-B1-23抗体能够结合人细胞上的人GDF-15前体。

因此，预期的是，本发明抗体的结合和效果(例如抑制癌生长)不限于对特定形式的人GDF-15的效应。

高结合亲和力

如由根据本发明的mAb-B1-23抗体显示的，根据本发明的抗体及其抗原结合部分具有高结合亲和力，其对重组人GDF-15具有约790pM的平衡解离常数。尤其是，这种亲和力值好于大多数已有的治疗性抗体，例如好于具有约8nM的平衡解离常数的治疗性抗体利妥昔单抗(Rituximab)。

高结合亲和力将保证根据本发明的针对人GDF-15的抗体稳定结合人GDF-15，从而人GDF-15的效应(包括对癌生长的影响)被有效抑制。

结合不连续的或构象表位

如下文对于根据本发明的mAb-B1-23抗体所显示的，根据本发明的抗体及其抗原结合部分结合不连续的或构象表位。

根据本发明的抗体及其抗原结合部分对不连续或构象GDF-15表位的结合可以帮助保持人GDF-15在特定构象并且从而促进对人GDF-15效应(包括对癌生长的效应)的有效抑制。

因此，本发明涉及以下实施方案：

A)抗体、载体和细胞系

具体地，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。

备选地，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与SEQ ID NO：5的氨基酸序列相差不超过一个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相差不超过一个氨基酸的氨基酸序列的CDR3区。

在根据以上实施方案的第二个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，或轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。

在根据以上实施方案的第三个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。

在根据以上实施方案的另一个实施方案，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的区域。

在根据以上实施方案的优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域。

在根据以上实施方案的更优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域。

在根据以上实施方案的更优选的实施方案中，重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的区域，并且轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的区域。

本发明还涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2区。在本实施方案的优选的方面，抗体可以具有上文所述本发明的任意实施方案中限定的CDR3序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分能够抑制哺乳动物，优选人患者中的癌生长。

在根据上述实施方案的另一个实施方案中，本发明涉及能够结合人GDF-15的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是单结构域抗体(也称为“纳米抗体^TM”)。在该实施方案的一个方面，所述单结构域抗体分别包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5的CDR1、CDR2、和CDR3氨基酸序列。在该实施方案的另一个方面，所述单结构域抗体分别包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：7的CDR1、CDR2、和CDR3氨基酸序列。在该实施方案的优选的方面，单结构域抗体是人源化抗体。

优选地，能够结合人GDF-15的本发明的抗体或其抗原结合部分具有等于或小于100nM，小于20nM，优选小于10nM，更优选小于5nM并且最优选在0.1nM和2nM之间的对人GDF-15的平衡解离常数。

在本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分结合与可从以保藏号DSM ACC3142保藏在德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位。如本文所述，根据实施例1中所述步骤，通过作为参考标准方法的表面等离子共振测量评价根据本发明的结合人GDF-15的抗体。通过可从细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体和预期结合与可从细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位的抗体的表面等离子共振竞争性结合实验，可以类似地评价对人GDF-15上相同表位的结合。

在非常优选的实施方案中，本发明的抗体是可获自以保藏号DSMACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分。

在优选的实施方案中，根据本发明的能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是人源化单克隆抗体或其抗原结合部分。对于根据本发明的任何给定的非人抗体序列(即供体抗体序列)，本发明的人源化单克隆抗-人-GDF-15抗体或其抗原结合部分可以根据本领域中已知的技术产生，如上文所述。

在非常优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分是源自可从以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23获得的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分的人源化抗体。在该实施方案的非限制性方面，人源化抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且人源化抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。在该实施方案的进一步的非限制性方面，所述人源化抗体或其抗原结合部分的重链可变结构域包含或还包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的CDR2区，并且所述人源化抗体或其抗原结合部分的轻链可变结构域包含或还包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1区和含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2区。

本发明还涉及能够结合人GDF-15的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其中所述结合是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的人GDF-15上的构象或不连续表位。在该实施方案的优选的方面，所述抗体或其抗原结合部分是上述实施方案任一个中限定的抗体或其抗原结合部分。

根据以上实施方案的本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分是双抗体。在该实施方案的一个方面，所述双抗体是双价和单特异的，具有两个相同的对人GDF-15的抗原结合位点。在该实施方案的第二个、替代的方面，所述双抗体是二价和双特异的，其中一个抗原结合位点是针对人GDF-15的结合位点，并且另一个抗原结合位点是针对不同抗原的结合位点。根据该实施方案的该第二个方面的不同抗原的非限制性实例是i)在相同癌症上以高水平(例如以与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比更高的水平)与GDF-15共表达的细胞表面抗原，并且ii)已知用于将免疫系统细胞募集至肿瘤的有用抗原的免疫系统细胞上的细胞表面抗原。

在根据以上实施方案的本发明的另一个实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分连接于药物。在该实施方案的非限制性方面，所述药物可以是已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。已知的抗癌药剂包括烷化剂比如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)，氮芥(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，和异环磷酰胺(ifosfamide)；抗-代谢物比如硫唑嘌呤(azathioprine)和巯基嘌呤(mercaptopurine)；生物碱比如长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，长春瑞滨(vinorelbine)，和长春地辛(vindesine))，紫杉烷(例如紫杉醇(paclitaxel)，多西他赛(docetaxel))依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；拓扑异构酶抑制剂比如喜树碱(camptothecins)(例如依立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan))；细胞毒性抗生素比如放线菌素(actinomycin)，蒽环类抗生素(anthracyclines)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，戊柔比星(valrubicin)，伊达比星(idarubicin)，表柔比星(epirubicin)，博来霉素(bleomycin)，光辉霉素(plicamycin)和丝裂霉素(mitomycin)；和放射性同位素。预期本发明的抗体或其抗原结合部分与抗癌剂的连接导致与没有抗癌剂的抗体相比更强的肿瘤生长抑制，因为由于肿瘤中GDF-15的存在，产生的缀合物将积累在肿瘤位点，导致抗癌剂在肿瘤位点的积累并导致抗癌剂对肿瘤的增强的效果。

在根据以上实施方案的进一步实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分被氨基酸标签修饰。此种标签的非限制性实例包括多聚组氨酸(His-)标签，FLAG-标签，血凝素(HA)标签，糖蛋白D(gD)标签，和c-myc标签。标签可以用于不同目的。例如，它们可以用于帮助纯化能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分，或它们可以用于检测抗体或其抗原结合部分(例如当用于诊断测定时)。优选地，这种标签存在于能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分的C-末端或N-末端。

在根据以上实施方案的本发明的优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分能够抑制哺乳动物，优选人患者中癌生长。

在根据以上实施方案的本发明的另一个优选的实施方案中，所述人GDF-15是具有由SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。

根据以上实施方案的本发明的另一个优选的实施方案中，能够结合人GDF-15的抗体或其抗原结合部分的结合是结合人GDF-15上的构象或不连续表位。

优选，本发明的能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分是分离的抗体。

本发明还涉及表达载体，所述表达载体包含编码上文所定义的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。

此外，本发明还提供细胞系，所述细胞系能够产生根据本发明的抗体或其抗原结合部分。

在一个实施方案中，所述细胞系可以源自本领域中已知的并且适于产生抗体或其抗原结合部分的任何细胞系。

在优选的实施方案中，所述细胞系是以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23。

在另一个优选的实施方案中，所述细胞系含有上文定义的根据本发明的表达载体。

B)药物组合物

在进一步的实施方案中，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含上文定义的任意抗体或其抗原结合部分。

根据已知的用于制备含有抗体及其部分的药物组合物的标准制备根据本发明的药物组合物。

例如，所述组合物以它们可以被适当地储存和施用的方式，例如通过使用药用组分比如载体、赋形剂或稳定剂制备。

这种药用组分以当将药物组合物施用于患者时使用的量是无毒的。加至药物组合物的药用组分可以取决于药物组合物的特定预期用途和施用途径。

通常，根据本领域中可获得的，例如从Remington's PharmaceuticalSciences，Ed.AR Gennaro，第20版，2000，Williams&Wilkins，PA，USA获得的知识使用与本发明相关使用的药用组分。

C)治疗方法和用于这些方法的产品

本发明还涉及治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括将上文所定义的抗体或其抗原结合部分，或上文定义的药物组合物施用于所述哺乳动物。备选地，本发明涉及上文定义的抗体或其抗原结合部分，或上文定义药物组合物，其用于这些方法中。在这些实施方案的非常优选的方面，所述哺乳动物是人患者。

根据本发明治疗癌症的所有方法不包括根据WO 2005/099746，WO2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007的治疗癌症-引起的重量减轻。这反映了这样的事实：根据这些技术教导，仅癌症-引起的重量减轻可以由抗-GDF-15抗体逆转，并且，癌生长不能被抑制。

当考虑本发明时，变得明显的是，已知来自WO 2005/099746，WO2009/021293和Johnen H等人，Nature Medicine，2007的抗-GDF-15抗体仅抑制人GDF-15的一个作用(即癌症-引起的重量减轻)，但不能抑制其它人GDF-15效果比如与癌生长相关的那些。

根据本发明的癌生长抑制不排除患者中还存在的另外的或次要的治疗益处。例如，另外的或次要益处可以是对癌症引起的重量减轻的影响。然而，要理解的是，寻求保护的主要治疗是抑制癌生长，任何次要或额外效果仅反映癌生长的治疗的任选的、额外的益处。

在上述方法，或用于这些方法中的抗体其抗原结合部分或药物组合物的优选的实施方案中，施用前所述人患者在血清中具有升高的GDF-15水平。在血清中具有升高的GDF-15水平的患者亚组中，预期根据本发明的治疗方法在抑制癌生长方面特别有效。在本实施方案的最优选的方面，GDF-15水平是使用可获自以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DSMZ)的杂交瘤细胞系B1-23的根据本发明的抗体测量的，优选通过免疫化学测量的GDF-15蛋白水平。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分是用于所述方法的针对癌症有药物活性的唯一成分。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的备选实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分与一种或多种对癌症有药物活性的其它成分联合使用。在该实施方案的一个方面，所述一种或多种对癌症有药物活性的其它成分是如上文定义的已知的抗癌剂和/或免疫刺激分子。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的优选实施方案中，所述癌症选自由以下各项组成的组：脑癌(包括神经胶质瘤)，神经系统癌症，黑素瘤，肺癌，唇和口腔癌，肝癌，白血病，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)，膀胱癌，子宫颈癌，子宫体癌，睾丸癌，甲状腺癌，肾癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，喉癌，咽癌，食道癌，胃肠道肿瘤(包括胃和结直肠癌)，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌，优选选自由以下各项组成的组：黑素瘤，前列腺癌，乳腺癌，脑癌(包括神经胶质瘤)，结直肠癌，胃癌，食道癌和卵巢癌，并且最优选为黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自上述组，所述组还包含子宫内膜癌(endometrial cancer)(比如子宫内膜癌(endometrial carcinoma))，乳腺癌(包括乳腺癌的亚型，尤其是三阴性乳腺癌)和膀胱癌比如尿路上皮细胞癌。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的另一个优选的实施方案中，与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比，由于癌症而形成的肿瘤或多种肿瘤在施用之前具有更高的人GDF-15水平，优选1.2-倍高水平，更优选1.5-倍高水平，还更优选2-倍高水平并且最优选5-倍高水平。与上述对照样品相比，在由于癌症而形成的肿瘤或多种肿瘤中具有更高GDF-15水平的患者亚群中，预期根据本发明的治疗方法在抑制癌生长方面特别有效。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的非常优选的实施方案中，所述方法包括抑制癌生长。在该实施方案的优选的方面，癌生长被终止。在更优选的方面，癌缩小。

在上述方法，或用于这些方法的抗体、其抗原结合部分或药物组合物的优选的实施方案中，所述方法包括通过人患者中的NK细胞和CD8+T细胞诱导杀伤癌细胞。除了抗体或其抗原结合部分独立于免疫系统的效果之外，由于其阻止GDF-15介导的已知的免疫监视调节剂NKG2D的下调的能力，预期根据本发明的抗体或其抗原结合部分修复免疫监视并且通过NK细胞和CD8+T细胞诱导杀灭癌细胞。

D)试剂盒

本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含上文定义的药物组合物。

在一个实施方案中，所述试剂盒是如上文定义的用于根据本发明的方法的试剂盒。

在进一步的实施方案中，本发明还提供诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含根据本发明的任意抗体或其抗原结合部分。

在一个实施方案中，所述诊断试剂盒可以用于检测与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比，癌症患者的由于癌症而形成的肿瘤或多种肿瘤是否具有更高的人GDF-15水平。

在另一个实施方案中，所述诊断试剂盒可以用于检测人癌症患者是否在血清中具有升高的GDF-15水平。

E)序列

本申请中涉及的氨基酸序列如下(以N-末端到C-末端的顺序；以单字母氨基酸编码表示)：

SEQ ID No：1(包含FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区的重链可变结构域区，来自单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的多肽序列)：

QVKLQQSGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPTLKSRLTISKDPSRNQVFLKITSVDTADTATYYC

SEQ ID No：2(包含FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区的轻链可变结构域区，来自单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的多肽序列)：

DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFLQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC

SEQ ID No：3(单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的重链CDR1区肽序列)：

GFSLSTSCMG

SEQ ID No：4(单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的重链CDR2区肽序列)：

IYWDDDK

SEQ ID No：5(单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的重链CDR3区肽序列)：

ARSSYGAMDY

SEQ ID No：6(单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的轻链CDR1区肽序列)：

QNVGTN

单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的轻链CDR2区肽序列

SAS

SEQ ID No：7(单克隆抗-人GDF-15mAb-B1-23的轻链CDR3区肽序列)：

QQYNNFPYT

SEQ ID No：8(重组成熟人GDF-15蛋白)：

GSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

SEQ ID No：9(人GDF-15前体蛋白)：

MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

SEQ ID No：10(人GDF-15前体蛋白+N-末端和C-末端GSGS接头)：

GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG

SEQ ID No：11(Flag肽)：DYKDDDDKGG

SEQ ID No：12(HA肽)：YPYDVPDYAG

SEQ ID No：13(源自人GDF-15的肽)：ELHLRPQAARGRR

SEQ ID No：14(源自人GDF-15的肽)：LHLRPQAARGRRR

SEQ ID No：15(源自人GDF-15的肽)：HLRPQAARGRRRA

SEQ ID No：16(源自人GDF-15的肽)：LRPQAARGRRRAR

SEQ ID No：17(源自人GDF-15的肽)：RPQAARGRRRARA

SEQ ID No：18(源自人GDF-15的肽)：PQAARGRRRARAR

SEQ ID No：19(源自人GDF-15的肽)：QAARGRRRARARN

SEQ ID No：20(源自人GDF-15的肽)：MHAQIKTSLHRLK

SEQ ID No：25(包含结合B1-23的GDF-15表位部分的GDF-15肽)：

EVQVTMCIGACPSQFR

SEQ ID No：26(包含结合B1-23的GDF-15表位部分的GDF-15肽)：

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

本申请中涉及的核酸序列如下(以5’至3’的顺序；根据标准核酸编码表示)：

SEQ ID No：21(SEQ ID No：1中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：CAAGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGTACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAACCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATCCCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGT

SEQ ID No：22(编码SEQ ID No：2中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：

GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTTTCTACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTTATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT

SEQ ID No：23(编码SEQ ID No：5中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：

GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC

SEQ ID No：24(编码SEQ ID No：7中限定的氨基酸序列的DNA核苷酸序列)：

CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG

F)实施例

通过以下非限制性实施例说明本发明：

实施例1：GDF-15抗体B1-23的产生和表征

在GDF-15敲除小鼠中产生抗体B1-23。使用重组人GDF-15(SEQ IDNo：8)作为免疫原。

根据布达佩斯条约，将产生mAb-B1-23的杂交瘤细胞系B1-23以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)。

通过可市购试纸系统的方式，鉴定B1-23为IgG2a(κ链)同种型。使用表面等离子共振测量，如下确定解离常数(Kd)：

通过使用表面等离子共振测量，用Biorad ProteOn XPR36系统和Biorad GLC传感器芯片测量根据本发明的单克隆抗-人-GDF-15抗体，抗-人GDF-15mAb-B1-23的结合：

为了制备生物传感器，将重组成熟人GDF-15蛋白固定在流通池(flowcell)1和2上。在一个流通池上，使用源自杆状病毒感染的昆虫细胞(HighFive昆虫细胞)的重组GDF-15并且在另一个上使用源自大肠杆菌表达的重组蛋白。根据制造商的建议使用磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)(Biorad ProteOnAmine偶联试剂盒)活化GLC传感器芯片，接着将传感器表面加载蛋白至高达约600RU(1Ru＝1pg mm^-2)的密度。然后通过灌注1M乙醇胺pH 8.5猝灭未反应的偶联基团，并且通过用运行缓冲液(10M HEPES，150mMNaCl，3.4mM EDTA，0.005％吐温-20，pH 7.4，也称为HBS150)灌注芯片来平衡生物传感器。作为对照，使用两个流通池，一个空的无蛋白偶联并且一个用非生理学蛋白伴侣(人白细胞介素-5)偶联，使用相同的偶联化学和相同的偶联密度将其固定。对于相互作用测量，将抗-人GDF-15mAb-B1-23溶解在HBS150中并且以六个不同浓度用作被分析物(浓度：0.4，0.8，3，12，49和98nM)。使用一次性动力学(one-shot kinetics)设置将被分析物灌注通过生物传感器，以避免间歇性再生，所有测量在25℃进行并且使用100μl min^-1的流速。为了处理主体面效应(bulk face effect)和非特异结合，通过从所有其他SPR数据中减去空的流通池(流通池3)的SPR数据来去除传感器背景。使用软件ProteOn Manager版本3.0分析产生的传感图(sensogram)。为了分析结合动力学，假设1:1Langmuir-型相互作用。可以确定结合速率常数值为5.4±0.06x10⁵M^-1s^-1(k_on)和确定解离速率常数值为4.3±0.03x10^-4s^-1(k_off)(值是对于抗-人GDF-15mAb-B1-23与源自昆虫细胞表达的GDF-15的相互作用)。使用方程式K_D＝k_off/k_on计算平衡解离常数，获得约790pM的值。源自大肠杆菌表达的GDF-15和抗-人GDF-15mAb-B1-23相互作用的亲和力值差异小于2倍，源自昆虫细胞和大肠杆菌的GDF-15的速率常数偏差约45％并且因此在SPR测量值的精确度内并且可能不反映亲和力的真实差异。在使用的条件下，抗-人GDF-15mAb-B1-23显示不结合人白细胞介素-5并且因此确认相互作用数据和抗-人GDF-15mAb-B1-23的特异性。

重组人GDF-15的氨基酸序列(在杆状病毒转染的昆虫细胞中表达)是：

(SEQ ID No：8)

因此，使用表面等离子共振测量，确定解离常数(Kd)为790pM。作为比较：治疗使用的抗体利妥昔单抗具有显著更低的亲和力(Kd＝8nM)。

实施例2：使用mAB B1-23对GDF-15介导的效果的拮抗作用

a)已知表达在NK细胞和CD8+T细胞上的NKG2D(自然杀伤组(Natural Killer Group)2D)受体在针对肿瘤的免疫监视中发挥重要作用。转化的以及病毒感染的细胞表达配体(其结合NKG2D受体)，从而激活所描述的免疫细胞的细胞毒效应功能。以该方式，可以检测转化的细胞并通过免疫系统消除。在用重组人GDF-15或肿瘤细胞分泌的GDF-15在体外处理免疫细胞72小时后，淋巴细胞的细胞表面NKG2D的表达水平下调(图1)。72小时的孵育之后，用以下FACS-抗体将免疫细胞染色：抗CD3，抗CD56，抗-NKG2D。使用该抗体组合，实验集中于NK细胞及其NKG2D表面表达。免疫细胞上低NKG2D水平导致受损的肿瘤/靶细胞裂解。GDF-15介导的NKG2D下调被mAb B1-23阻止。

因此得出结论：人GDF-15下调淋巴细胞细胞表面上的NKG2D表达并且因此下调针对肿瘤的免疫监视。通过结合人GDF-15，本发明的抗体能够阻止GDF-15介导的NKG2D下调并且应该能够修复免疫监视并通过NK细胞和CD8+T细胞诱导杀伤癌细胞。

b)用重组GDF-15处理卵巢癌细胞系SK-OV-3导致AKT的磷酸化。AKT是作为PI3K-通路的部分的分子并且促进细胞的激活和增殖。在该实验中，在37℃，5％CO2，将SK-OV-3细胞用10ng/ml重组GDF-15处理10min。2μg mAb-B1-23与10ng/ml GDF-15在37℃的5分钟预孵育阻断了GDF-15介导的AKT-磷酸化(图2)。这表明mAb-B1-23的中和效应。

c)用重组GDF-15处理免疫细胞导致JNK(激酶，其被细胞因子或被应激激活)的磷酸化。10ng/ml GDF-15与2μg mAb-B1-23的拮抗作用(在37°预孵育5分钟)阻断GDF-15介导的JNK1/2-磷酸化(图3)。

实施例3：使用mAb B1-23抑制癌细胞增殖

以B1-23产生的数据表明抗体在体外对癌细胞的抗增殖效应。使用前列腺癌细胞系LnCap(其产生许多GDF-15)观察到最强的抗增殖效应。与不使用抗体的对照组相比，当存在mAb-B1-23时，代谢测定(Alamar Blue测定)显示在72hrs后增殖减少30％。因为在不同测定中抗体的细胞毒效应已经被排除，所以该效应证明GDF-15的阻断后显著减少的细胞分裂。

实施例4：mAb B1-23抑制体内肿瘤生长

在一个实验研究设定中，在免疫缺陷的NMRI小鼠的SK-Mel28人黑素瘤细胞模型中研究肿瘤生长。将7.5x 10⁶个黑素瘤细胞皮下移植入各个小鼠中。在接种后第23天(即在黑素瘤的指数生长期间)，首次施用mAbB1-23抗体。注射mAb B1-23(30mg/kg体重，腹膜内注射)后，在mAbB1-23-处理的小鼠中未观察到进一步肿瘤生长达一周，然而阴性对照样品中的肿瘤继续生长。

该实施例证明，本发明的mAb B1-23抗体抑制携带源自人细胞的肿瘤的小鼠中的癌生长。

因为该实施例使用人黑素瘤细胞，所以本发明的抗-人GDF-15抗体应当还抑制人患者中的癌生长。如果患者在施用前在血清中具有升高的GDF-15水平，或如果与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比，由癌症所导致的肿瘤或多种肿瘤具有更高的人GDF-15水平，则对癌生长的抑制应该尤其有效。

本实施例使用免疫缺陷小鼠。因此得出结论，本发明的抗体能够以独立于完整免疫系统的方式抑制癌生长。

此外，以上在实施例2中表明，本发明的抗-人GDF-15抗体能够阻止GDF-15介导的NKG2D下调并且应该能够通过NK细胞和CD8+T细胞诱导杀灭癌细胞。因此预期的是，通过抗-人GDF-15抗体的癌生长抑制在患者中比在免疫缺陷小鼠中更强，因为患者不具有用于本实施例的小鼠的免疫缺陷。

在备选的实验研究设定中，进行以下体内研究：

为了评估B1-23在体内的抗-肿瘤效果，在黑素瘤细胞系UACC-257的异种移植物设置中使用Balb/c^nu/^nu裸鼠。将所述小鼠用抗体B1-23或PBS处理。各个处理群组含有10只Balb/c^nu/^nu裸鼠。

在注射前，将UACC-257黑素瘤细胞在完全培养基中培养，排除任何污染。当在细胞培养瓶中达到70-80％汇合(confluence)时收获细胞。然后将细胞用PBS洗涤并计数。将1x10⁷个活细胞悬浮在PBS中。

在6周龄Balb/c^nu/^nu裸鼠中进行首次注射/处理。将小鼠接种区域用乙醇清洁。为了避免对肿瘤细胞的负压，将UACC 257细胞混合并吸入无针头的注射器中。将在PBS中含有1x10⁷个细胞的细胞悬浮液皮下(s.c.)注射入小鼠的下侧面(lower flank)。

在肿瘤细胞接种(定义为第1天)之后立即开始B1-23(25mg/kg体重)或相同体积的PBS的腹膜内(i.p.)注射并且一周施用两次。让肿瘤生长48天。用卡尺测量肿瘤直径并且以mm3计的肿瘤体积通过下式计算：

体积＝(宽度)²x长度/2

从该研究获得结果显示在图4中。

如图中所示，与PBS对照组相比，用B1-23处理的动物群组的肿瘤尺寸显著减小。

实施例5：mAb B1-23识别人GDF-15的构象或不连续表位

表位制图：针对源自GDF-15的13链节(mer)线性肽的单克隆小鼠抗体GDF-15

抗原：GDF-15：

GSGSGSGMPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCIGSGSGSG(具有接头的322个氨基酸)(SEQ ID No：10)

蛋白序列被翻译为具有一个氨基酸移码的13链节肽。通过中性GSGS接头延长C-和N-末端以避免截短了的肽(粗体字母)。

对照肽：

标记(Flag)：DYKDDDDKGG(SEQ ID No：13)，78个点；HA：YPYDVPDYAG(SEQ ID No：14)，78个点(每个阵列复制)

肽芯片编号：

000264_01(10/90，Ala2Asp接头)

染色条件：

标准缓冲液：PBS，pH 7.4+0.05％吐温20

封闭缓冲液：Rockland封闭缓冲液MB-070

孵育缓冲液：具有10％Rockland封闭缓冲液MB-070的标准缓冲液

初级样品：单克隆小鼠抗体GDF-15(1μg/μl)：在4℃以1:100的稀释度在孵育缓冲液中染色16h并且以500rpm缓慢震荡

二抗：山羊抗-小鼠IgG(H+L)IRDye680，以1:5000的稀释度在孵育缓冲液中在室温(RT)染色30min

对照抗体：单克隆抗-HA(12CA5)-LL-Atto 680(1:1000)，单克隆抗-FLAG(M2)-FluoProbes752(1:1000)；在RT在孵育缓冲液中染色1h

扫描仪：

Odyssey成像系统，LI-COR Biosciences

设置：补偿：1mm；分辨率：21μm；强度绿/红：7/7

结果：

在标准缓冲液中30min预膨胀和封闭缓冲液中30min之后，将具有10，12和15链节的B7H3-衍生的线性肽的肽阵列与仅1:5000的稀释度的第二山羊抗-小鼠IgG(H+L)IRDye680抗体在室温孵育1h，以分析二抗的背景相互作用。用标准缓冲液洗涤2x1min，用蒸馏水冲洗并且在空气流中干燥。用Odyssey成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿/红强度进行读值：由于与带电抗体染料的离子相互作用，我们观察到已知为常见结合物(binder)的富精氨酸肽(ELHLRPQAARGRR(SEQ ID No:15)，LHLRPQAARGRRR(SEQ ID No:16)，HLRPQAARGRRRA(SEQ ID No:17)，LRPQAARGRRRAR(SEQ ID No:18)，RPQAARGRRRARA(SEQ IDNo:19)，PQAARGRRRARAR(SEQ ID No:20)和QAARGRRRARARN(SEQ IDNo:21))，和碱性肽MHAQIKTSLHRLK(SEQ ID No:22)的弱相互作用。

在标准缓冲液中预膨胀10min后，将肽微阵列在4℃与1:100稀释的单克隆小鼠抗体GDF-15孵育过夜。在标准缓冲液中重复洗涤(2x1min)，接着用1:5000稀释的二抗在室温孵育30min。在标准缓冲液中2x10秒洗涤和用蒸馏水短暂冲洗之后，在空气流中干燥在通过抗-HA和抗-FLAG(M2)抗体将对照肽染色之前和之后，用Odyssey成像系统以21μm的分辨率和7/7的绿/红强度进行读值。

表明的是，源自GDF-15的线性13链节肽中没有一个与单克隆小鼠抗体GDF-15相互作用(甚至在过调节的强度下)。然而，构成所述阵列的标记和HA对照肽的染色，导致好的和均匀的点强度。

总结：

针对GDF-15的单克隆小鼠GDF-15抗体的表位制图未揭示任何源自所述抗原的13链节肽的线性表位。根据该发现，很可能单克隆小鼠抗体GDF-15识别具有低亲和力的部分表位的构象或不连续表位。由于明显缺少超过仅二抗的背景染色的任何GDF-15信号，所以未进行用分析仪的点强度定量和随后的肽注释。

实施例6：通过质谱表位切除和表位提取的肽配体表位结构鉴定

通过表位切除方法和表位提取方法(Suckau等人Proc Natl Acad Sci US A.1990年12月；87(24)：9848–9852.；R.Stefanescu等人，Eur.J.MassSpectrom.13，69-75(2007))的方式鉴定结合抗体B1-23的重组人GDF-15表位。

为了制备抗体柱，将抗体B1-23加至NHS-活化的6-氨基己酸偶联的琼脂糖。然后将琼脂糖偶联的抗体B1-23加载在0,8ml微柱中并用封闭和洗涤缓冲液洗涤。

表位提取实验：

将重组人GDF-15在37℃用胰蛋白酶消化2h(在溶液中)，根据胰蛋白酶在蛋白中的切割位点，产生不同肽。完全消化后，将肽加载在含有固定化的抗体B1-23的亲和柱上。GDF-15的未结合的以及可能结合的肽用于质谱分析。通过质谱的方式鉴定肽是不可能的。这是免疫复合体B1-23中GDF-15的结合区包含不连续的或构象的表位的进一步指征。在连续线性表位的情况中，除非在表位肽中存在胰蛋白酶切割位点，消化的肽应该结合其相互作用伴侣。可以通过以下部分描述的表位切除方法确认不连续或构象表位。

表位切除实验

然后将亲和柱上固定化的抗体B1-23与重组GDF-15孵育2h。亲和柱上形成的免疫复合体随后在37℃与胰蛋白酶孵育2h。切割导致源自重组GDF-15的不同肽。固定化的抗体本身是蛋白水解稳定的。产生的消化的GDF-15蛋白的肽(其被抗体遮蔽并且因此被保护免受蛋白水解切割)在酸性条件下(TFA，pH2)被洗脱，收集并通过质谱鉴定。

使用MS/MS鉴定的表位切除方法产生以下肽：

结合抗体B1-23的人GDF-15的部分，包含不连续或构象表位。质谱鉴定了GDF-15蛋白中的2个肽，其负责免疫复合体的形成。这些肽限制在GDF-15氨基酸序列中的位置40-55(EVQVTMCIGACPSQFR)和94-114(TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI)。因此，这两个肽包含结合抗体B1-23的GDF-15蛋白的表位。

G)工业实用性

根据本发明的抗体、其抗原结合部分、药物组合物和试剂盒可以作为产品根据制造药品的已知标准工业化生产和销售，用于权利要求所要求的方法和用途(例如用于治疗癌症)。因此，本发明可在工业上应用。

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WO 2005/099746

WO 2009/021293

优选的实施方案

1.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。

2.根据第1项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，或其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列CDR3区。

3.根据第1或2项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR3区。

4.根据第1至3项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域，并且其中轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其95％相同的序列的区域。

5.根据第1至4项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域，并且其中轻链可变结构域包含含有FR1，CDR1，FR2，CDR2和FR3区并且含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其98％相同的序列的区域。

6.根据第1至5项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分对人GDF-15具有等于或小于20nM，优选小于10nM，更优选小于5nM和最优选在0.1nM和2nM之间的平衡解离常数。

7.根据第1至6项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合与可从以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体相同的人GDF-15表位。

8.根据第1至7项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是可从以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体或其抗原结合部分。

9.第1-8项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体能够抑制哺乳动物，优选人患者中癌生长。

10.第1-9项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述人GDF-15是重组人GDF-15，其具有由SEQ ID No：8表示的氨基酸序列。

11.第1-10项任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合人GDF-15上的构象或不连续表位。

12.第11项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中结合人GDF-15上的构象或不连续表位是结合SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的构象或不连续表位。

13.能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合人GDF-15上SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的构象或不连续表位。

14.第13项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是第1-10项任一项所定义的抗体或其抗原结合部分。

15.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据第1至14项任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

16.根据第1至14项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据第15项所述的药物组合物，其用于治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分或所述药物组合物。

17.根据第16项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第16项所述的用途，其中所述哺乳动物是人患者。

18.根据第17项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第17项所述的用途，其中在施用前所述人患者在血清中具有升高的GDF-15水平。

19.根据第16至18项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第16至18项任一项所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分是

A)用于所述方法的对癌症有药学活性的唯一成分，或

B)与对癌症有药学活性的一种或多种另外的成分联合使用。

20.根据第16至19项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第16至19项任一项所述的用途，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：脑癌(包括神经胶质瘤)，神经系统癌症，黑素瘤，肺癌，唇和口腔癌，肝癌，白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，膀胱癌，子宫颈癌，子宫体癌，睾丸癌，甲状腺癌，肾癌，胆囊癌，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，喉癌，咽癌，食道癌，胃肠道肿瘤(包括胃和结直肠癌)，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌，优选选自由以下各项组成的组：黑素瘤，前列腺癌，乳腺癌，脑癌(包括神经胶质瘤)，结直肠癌，胃癌，食道癌和卵巢癌，并且最优选为黑素瘤。

21.根据第17至20项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第17至20项任一项所述的用途，其中，与相同患者的获自癌症来源组织的组织非癌部分的对照样品相比，在施用前，由癌症所形成的肿瘤或多种肿瘤具有更高的人GDF-15水平，优选1.2-倍高的水平，更优选1.5-倍高的水平，还更优选2-倍高的水平并且最优选5-倍高的水平。

22.根据第16至21项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第16至21项任一项所述的用途，其中所述方法包括抑制癌生长。

23.根据第17至22项任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其用于根据第17至22项任一项所述的用途，其中所述方法包括在人患者中通过NK细胞和CD8+T细胞诱导杀灭癌细胞。

24.一种试剂盒，所述试剂盒包含第15项所述的药物组合物。

25.第24项所述的试剂盒，所述试剂盒用于根据第16至23项任一项所述的用途。

26.一种表达载体，所述表达载体包含编码根据第1-14任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。

27.一种细胞系，所述细胞系能够产生根据第1至14项任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

28.根据第27项所述的细胞系，其中所述细胞系是以保藏号DSMACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23。

29.根据第27项所述的细胞系，其中所述细胞系含有根据第26项所述的表达载体。

由受理局填写

由国际局填写

PCT/RO/134表

Claims

1.一种能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变结构域包含：含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列或与其至少90％相同的氨基酸序列的CDR3区，并且其中轻链可变结构域包含：含有SEQ IDNO：7的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列的CDR3区。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是可从细胞系B1-23获得的针对人GDF-15的抗体或其抗原结合部分，其中所述细胞系B1-23以保藏号DSM ACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)。

3.根据权利要求1-2任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体能够在哺乳动物、优选人患者中抑制癌生长。

4.根据权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述人GDF-15是具有由SEQ ID No：8表示的氨基酸序列的重组人GDF-15。

5.根据权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合于人GDF-15上的构象或不连续表位。

6.权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中对人GDF-15上的构象或不连续表位的结合是结合于被SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含的构象或不连续表位。

7.一种能够结合人GDF-15的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述结合是结合于人GDF-15上的构象或不连续表位，所述人GDF-15上的构象或不连续表位被SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的氨基酸序列包含。

8.权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是权利要求1-4任一项中所定义的抗体或其抗原结合部分。

9.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至8任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

10.根据权利要求1至8任一项所述的抗体或其抗原结合部分或根据权利要求9所述的药物组合物，其在治疗哺乳动物癌症的方法中应用，所述方法包括向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其根据权利要求10所述应用，其中所述哺乳动物是人患者。

12.根据权利要求10至11任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其根据权利要求10至11任一项所述应用，其中所述方法包括抑制癌生长。

13.根据权利要求11至12任一项所述的抗体或其抗原结合部分或药物组合物，其根据权利要求11至12任一项所述应用，其中所述方法包括在所述人患者中通过NK细胞和CD8+T细胞诱导杀伤癌细胞。

14.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求9所述的药物组合物。

15.权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒根据权利要求10至13任一项所述应用。

16.一种表达载体，所述表达载体包含编码根据权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。

17.一种细胞系，所述细胞系能够产生根据权利要求1至8任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

18.根据权利要求17所述的细胞系，其中所述细胞系是以保藏号DSMACC3142保藏于德国微生物和菌种保藏中心(DMSZ)的细胞系B1-23。