KR20000038040A - 전립선 암을 치료하기 위한 ｔｎｆ-베타-형 단백질, 및 관련 핵산 분자, 약제학적 조성물 및 방법 - Google Patents

전립선 암을 치료하기 위한 ｔｎｆ-베타-형 단백질, 및 관련 핵산 분자, 약제학적 조성물 및 방법 Download PDF

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prostate cancer
nucleic acid
leu
protein
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마크 애를랜더
샤오밍 후앙
미카엘 잭슨
퍼 피터슨
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Abstract

본 발명은 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하는 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 유전자 치료요법에 사용하기에 적합한 핵산 분자를 포함하여, 본 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 나아가 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 선택적으로 살해하고, 본 단백질과 그에 결합된 독성 부위를 포함하는 물질 조성물을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 안드로겐-비의존성 전립선 암을 치료하기 위한 관련 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

전립선 암을 치료하기 위한 ＴＮＦ-베타-형 단백질, 및 관련 핵산 분자, 약제학적 조성물 및 방법{TNF-beta-like protein for treating prostate cancer, and related nucleic acid molecules, pharmaceutical compositions and methods}
DNA SEQUENCE
＜110＞ Steven P. Berman;Ortho-McNeil, Pharm, Inc.
＜120＞ TNF-beta-like protein for treating prostate cancer,
＜130＞ PC99-0063-J＆J
＜150＞ US 60/025923
＜151＞ 1996-09-11
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＜170＞ KOPATIN 1.0
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본 출원을 통하여, 다양한 문헌이 인용된다. 이 문헌들의 개시는 이로써 본 발명이 속한 기술상태를 더욱 상세하게 기술하기 위하여 본 출원에 참조로써 인용된다.
전립선의 암종("전립선 암")은 악성종양의 가장 일반적인 유형의 하나이다. 50세 이상의 남성 가운데, 30%가 전립선내에 암 병소를 갖고 있다. 매년 이들 고통받는 남성의 단 1%만이 전립선 암으로 적절하게 진단됨으로써, 부검시 밝혀지는 높은 발병율과 임상시 밝혀지는 극히 낮은 발병율간의 차이가 강조된다. 1992년에, 미합중국에서 134,000명의 남성이 전립선 암으로 진단되었으며, 32,000명이 이 질병으로 사망하였다. 전립선 암으로 임상 진단받은 모든 남성중의 절반 이상이 10년 이내에 사망하고, ⅔ 이상이 치료에도 불구하고 국부 또는 전신적 진행으로 고통받는다. 최근에, 혈청 전립선-특이적 항원(PSA)이 조기 검출을 가능하게 하였으나, 환자에서 질병의 자연적 진행이 증가된 PSA를 갖는 한편 대형 종양 적재를 갖지 않는지에 대해서는 불명확하다.
전립선에 한정된 암에 대하여, 일차적 방사선 또는 래디칼 전립선 절제술이 거의 동등한 효능을 갖는다. 재발은 일차적 수술용 방사선 및 어렵지만, 일차적 방사선치료요법용 수술로 치료될 수 있다. 전이성 전립선 병소는 다수 뼈로 이동하며 개체에서 안드로겐 수준을 감소시킴으로써 치료될 수 있다. 이것은 약물로 부신 및 생식선 안드로겐을 차단함으로써 화학적으로, 또는 거세에 의해 외과술적으로(부신 생성을 실제적으로는 차단하지 않음으로써) 행해진다. 환자들이 단지 6개월동안 그러한 호르몬 조작에 대해 반응한후 악화되는 관찰은 전이성 전립선 병소가 안드로겐-비의존성으로 될 수 있음을 암시한다. 이 암시는 전립선 암종으로부터의 배양 세포주가 혼합 클론(mixed clones)을 함유한다는 발견에 의해 뒷받침된다. 이들 혼합 클론은 세가지 유형이다: 외생성 안드로겐 존재하에서만 생존하는 안드로겐-의존성, 안드로겐 부재하에서 생존하며 그 존재하에서 증식하는 안드로겐-감수성, 안드로겐 부재하에서 생존하고 증식할 수 있는 안드로겐-비의존성.
전립선 암을 앓는 개체중, 상당한 군집이 임상적으로 안드로겐-비의존성, 즉 안드로겐의 치료적 제거후에도 증식을 계속하는 전립선 암 세포의 존재를 나타낸다. 전립선 암괴를 제거하는 수술은 종종 다른 유형의 세포와 함께 안드로겐-비의존성 세포의 제거를 초래한다. 그러나, 이것에 관하여 적어도 일부의 안드로겐-비의존성 세포가 잔존하므로 수술만으로는 덜 효과적이다. 따라서, 안드로겐-비의존성 암세포의 증식을 특이적으로 저해하는 약제를 사용하는 전립선 암의 치료방법에 대한 강렬하고도 충족되지 않은 필요성이 존재하여왔다.
발명의 요약
본 발명은 각각 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하고, 그 아미노산 서열이 도 2에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 유도체를 포함하는, 재조합 단백질 및 단리(isolated) 단백질을 제공한다.
본 발명은 나아가 본 단백질의 하나 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 나아가 도 4의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 또는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 유전자 치료요법에서 사용하기에 적합한 핵산 분자를 포함하지만, 제한되는 것은 아닌, 그의 기능성 유도체를 필수성분으로 하여 구성되는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 나아가 유전자 치료요법 벡터로 사용하기 위한 본 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암을 선택적으로 살해하고, 본 단백질과 그에 기능적으로 결합된 독성 부위를 포함하는 물질 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 물질 조성물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
최종적으로, 본 발명은 치료학적 유효용량의 본 약제학적 조성물중 하나를 개체에 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 안드로겐-비의존성(androgen-independent) 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는데 유용한 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 질환을 가진 개체를 치료하기 위한 핵산 분자, 약제학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 GF-2H의 DNA 서열을 나타낸다.
도 2A는 성숙 GF-2H 단백질("ACTIVE2H2"로 확인됨)과 TGF-베타 훼밀리의 다른 구성원의 아미노산 서열간의 비교를 나타낸다.
도 2B는 미성숙 GF-2H 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3A는 GF-2H 정제 계획을 나타낸다.
도 3B는 rGF-2H의 정제 계획을 나타낸다.
도 4는 성숙 GF-2H의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5는 상이한 조직에서 GF-2H-암호화 mRNA의 발현을 나타낸다.
도 6은 성숙 GF-2H에 의한 전립선 암 세포주 PC-3의 조절을 나타낸다.
도 7은 성숙 TGF-베타에 의한 전립선 암 세포주 PC-3의 조절을 나타낸다.
형질전환 성장인자(TGF-베타)는 다양한 활성을 갖는 다기능성 인자의 대형 훼밀리를 나타낸다. TGF-베타는 인히빈(inhibins), 액티빈(activins), 뮬레리아 저해물질(Mulleria inhibiting substance), 데카펜타플레직(decapentaplegic) 산물, 및 TGF-베타2와 같은 성장, 분화, 및 형태형성 인자의 슈퍼훼밀리의 원형이다. 이들 인자는 모두 TGF-베타와 구조적으로 연관되어 있다. 부가적으로, 이들 및 TGF-베타 관련 기타 인자는 조직 발생 및 수복의 많은 과정에 관여하는 것으로 보인다(J. Massague, Ann. Rev. Cell. Biol., 1990, 6: 597-641).
이 다양한 효과로 인하여, 일 그룹으로서 TGF-베타-형 단백질은 특히 증식성 질환을 치료하기 위한 치료제로 사용될 가능성을 가질 수 있다. 그러나, 공지된 아미노산 서열을 갖는 TGF-베타-형 단백질이 더 이상의 실험적 정보 부재하에서 임상적으로 허용불가능한 부작용을 유발하지 않는 한편 특정 질병을 유발하는 증식성 세포에 대해 저해 효과를 갖는지 여부를 예측하는 것은 불가능하다.
본 발명의 단백질은 그들의 일차 구조를 기초로 하여 TGF-베타-형이며, 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 특이적으로 저해할 수 있다. 그러나, 부가적인 실험적 정보의 부재하에서 이 특이성은 아미노산 서열만에 기초하여 예측될 수는 없었다. 따라서 본 TGF-베타-형 단백질의 특이적 항-전립선 암 활성은 저혀 예측불가능한 것이었다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하고, 그 아미노산 서열이 도 4에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 유도체인 재조합 단백질("제1 단백질")을 제공한다. 일례에서, 제1 단백질은 이하 언급되는 "rGF-2H", "재조합 GF-2H", 또는 "재조합 성숙 GF-2H"로 지정된 단백질로부터 선택된다. 바람직한 예에서, 제1 단백질은 성숙 GF-2H이다.
본 발명은 또한 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하고, 그 아미노산 서열이 도 4에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 유도체인 단리(isolated) 단백질("제2 단백질")을 제공한다. 일례에서, 제2 단백질은 이하 언급되는 "GF-2H" 및 "성숙 GF-2H"로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 예에서, 제2 단백질은 성숙 GF-2H이다.
여기에서 사용되는, 재조합 단백질은 재조합 핵산 기술을 사용함으로써 수득되는 단백질이다. 그러한 재조합 단백질의 일차구조는 그의 자연적으로 발생하는 상대와 동일하거나 부가적인 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 부가적인 잔기는 예를 들면 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 존재할 수 있다. 단리 단백질은 50% 미만의 단백질 불순물을 갖는, 바람직한 예에서는 1% 미만의 단백질 불순물을 갖는 화학 환경(chemical milieu)을 갖는다.
여기에서 사용되는, 도 4에 도시된 서열을 갖는 단백질의 "기능성 유도체"인 단백질은 그와 구조적(즉, 아미노산 서열) 및 기능적(즉, 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하는) 유사성을 갖는 단백질이다. 구조적으로 유사한 단백질은 예로써, 도 4의 단백질과 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하는 단백질의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 또는 보존적 치환으로 상이해진 단백질을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 예는 이소로이신 잔기 대신 로이신 잔기의 치환이다.
여기에서 사용되는, "안드로겐-비의존성" 전립선 암세포는 안드로겐 부재하에서 생존할 수 있을 (즉, 살아남을 수 있을) 뿐만 아니라 증식할 수 있는 전립선 암세포이다. 여기에서 사용되는, "증식"은 세포분열을 통한 세포 군집의 성장을 의미하며, 안드로겐-비의존성 세포 증식을 "선택적으로 저해한다"라 함은 만족스러운 조건하에 적절한 시점에서(예를 들면, 본 단백질과 최초 접촉한지 72시간후) 측정된 바로 HeLa 세포 증식의 인 비트로 속도를 20% 초과 만큼 감소시키지 않고 안드로겐-비의존성 세포 증식의 인 비트로 속도를 적어도 50% 만큼 감소시키는 것을 의미한다. 바람직한 예에서, HeLa 세포 증식의 인 비트로 속도는 10% 초과 만큼 감소되지 않으면서 안드로겐-비의존성 세포 증식의 인 비트로 속도는 적어도 90% 만큼 감소된다. 세포 증식속도는 이하에서 언급되는 표지된 티미딘 도입방법과 같은 공지된 방법으로 용이하게 측정될 수 있다.
제1 및 제2 단백질이 접촉시 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하는 적당한 조건은 안드로겐-비의존성 전립선 암세포 표면 수용체의 그의 상응하는 자연 발생 리간드에 대한 결합을 허용하는 인 시튜에서 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 둘러싼 생리학적 조건, 즉 화학적 환경을 의미한다. 그러한 조건은 공지의 방법에 따라 인 비트로에서 용이하게 복제될 수 있다.
본 발명은 나아가 제1 또는 제2 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물("제1 약제학적 조성물")을 제공한다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 당해기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며 0.01-0.1M, 바람직하게는 0.05M 인산 완충액 또는 0.8% 식염수를 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 그러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 유액이 될 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 알콜/수성 용액, 유액 또는 현탁액, 식염수 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 운반체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 운반체는 유체 및 영양 공급제, 링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은 전해질 공급제 등을 포함한다. 예를 들면, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트 시약, 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다.
여기에서 사용되는, "개체"는 전립선 암을 발생시키거나 유지할 수 있는 모든 동물 또는 인위적으로 변형된 동물을 의미한다. 인위적으로 변형된 동물은 마우스, 랫트, 개, 기니아 피그, 흰족제비, 토끼, 및 영장목을 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 일례에서, 인위적으로 변형된 동물은 유도된 전립선 암으로 고통받는 마우스이다. 그러한 동물의 예는 당해기술분야에 공지되어 있다(N.M. Greenberg, et al., P.N.A.S. U.S.A., 92:3439-3443 (1995); T.C. Tompson et al., Cancer 71: 1165-1171 (1993)). 바람직한 예에서, 개체는 인간이다.
본 발명은 나아가 치료학적 유효용량의 제1 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는, 투여는 당해기술분야의 당업자에게 공지된 다양한 모든 방법을 사용하여 영향받거나 수행될 수 있다. 투여는 정맥내, 근육내, 및 피하로 투여될 수 있다.
제1 약제학적 조성물의 치료학적 유효용량은 고통받는 개체에서 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 선택적으로 저해하기에 충분한 용량이다. 바람직한 예에서, 고통받는 개체의 치료는 일정 기간에 걸쳐 복수의 치료학적 유효용량을 투여하는 것을 포함할 것이다. 용량 및 기간은 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 일례에서, 치료학적 유효용량은 0.1㎍/kg 내지 1mg/kg이며, 바람직한 예에서, 치료학적 유효용량은 1㎍/kg 내지 100㎍/kg이다.
본 발명은 나아가 도 4의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 기능성 유도체를 필수성분으로 하여 구성되는 핵산 분자를 제공한다.
일례에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 또다른 예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA). DNA 분자는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
부가적인 예에서, 핵산 분자는 발현 벡터이다. 수많은 발현 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 기타 바이러스를 포함하는, 그러한 벡터는 당해기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 한 클래스의 벡터는 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 래트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MoMLV), 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용한다. 바람직한 예에서, 벡터는 pCI이다. 부가적으로, 본 발명과 결합되어 사용되기에 적당한 숙주세포, 조절요소, 및 형질감염 방법이 당해기술분야에서 잘 알려져 있다.
또다른 예에서, 핵산 분자는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위하여 유전자 치료요법에서 사용하기에 적당한 벡터이다. 유전자 치료요법 벡터 및 상기의 것을 전달하는 방법은 당해기술분야에 잘 알려져 있다. 그러한 전달방법은 있는 그대로의 DNA를 통하거나, 아데노바이러스 및 양이온성 리포좀을 통한 전달을 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 본 벡터는 엑스 비보에서 적당한 세포로 도입되어(예를 들면, 말초 혈액 단핵성 세포(PBMNC's)), 고통받는 개체에 재도입될 수 있다, 그러한 엑스 비보 방법을 위한 방법은 당해기술분야에서 공지이다.
본 발명은 나아가 유전자 치료요법에서 사용하기에 적당한 본 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물("제2 조성물")을 제공한다.
본 발명은 나아가 치료학적 유효용량의 제2 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
치료학적 유효용량의 제2 약제학적 조성물은 개체에서 세포가 그 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질을 생산하고 분비할 수 있도록 하여, 단백질이 개체에서 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하는데 유효한 용량이다. 일례에서, 고통받는 개체의 치료는 일정기간에 걸쳐 복수의 치료학적 유효용량을 투여하는 것을 포함할 것이다. 용량 및 기간은 공지된 방법을 통하여 결정될 수 있다. 일례에서, 치료학적 유효용량의 제2 약제학적 조성물은 개체당 104내지 1011DNA 분자이며, 바람직한 예에서는 개체당 105내지 1010DNA 분자이다.
본 발명은 또한 적합한 조건하에서 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 선택적으로 살해하고, 제1 또는 제2 단백질 및 그에 기능적으로 결합된 독성 부위를 포함하는 물질 조성물을 제공한다.
독성 부위는 단백질성 독소일 수 있다. 일례에서, 단백질성 독소는 리신(ricin), 테타누스 독소, 디프테리아 독소, 및 그의 서브유닛 및 절편으로부터 선택된다. 독성 부위는 또한 방사성핵종일 수 있다. 또다른 예에서, 독성 부위는125I,131I,90Y,212Bi를 포함하지만, 그에 제한되지는 않는, α- 또는 β-발산 방사성핵종이다. 독성 부위를 단백질에 결합시키는 방법은 당해기술에서 공지이다.
본 발명은 또한 본 물질 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 약제학적 조성물("제3 약제학적 조성물")을 제공한다.
여기에서 사용되는, 안드로겐-비의존성 세포를 "선택적으로 살해한다"는 것은 만족스러운 조건하에 적합한 시점에서(즉, 본 조성물과 최초 접촉한지 72시간 후) 측정된 바로 인 비트로에서 20% 초과의 HeLa 세포를 살해하지 않으면서 인 비트로에서 적어도 50%의 안드로겐-비의존성 세포를 살해하는 것을 의미한다. 바람직한 예에서, 본 조성물은 인 비트로에서 10% 초과의 HeLa 세포를 살해하지 않으면서 인 비트로에서 적어도 90%의 안드로겐-비의존성 세포를 살해한다. 세포 사멸은 예를 들면 트립판 블루 배제 분석(Trypan Blue exclusion assay)를 포함하는, 공지의 방법을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다.
제3 약제학적 조성물의 치료학적 유효용량은 고통받는 개체에서 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 선택적으로 살해하기에 충분한 용량이다. 바람직한 예에서, 고통받는 개체의 치료는 일정 기간에 걸쳐 복수의 치료학적 유효용량을 투여하는 것을 포함한다. 용량 및 투여기간은 공지의 방법을 통하여 결정될 수 있다. 일례에서, 치료학적 유효용량은 0.1㎍/kg 내지 1mg/kg이며, 바람직한 예에서 치료학적 유효용량은 1㎍/kg 내지 100㎍/kg이다.
본 발명은 하기 실험적 세목을 참조로 하여 더 잘 이해될 것이지만,당업자는 상세화하는 특정 실험들이 그에 뒷따르는 청구항을 더욱 완벽하게 기술하고자 하는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐임을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
재료 및 방법
rIFN-γ를 베링거 앤드 만하임(Boehringer and Mannheim)으로부터 구입하였다(＞2×107유닛/mg). 발현벡터 pCI, pcDNA3, 및 pSV2-dhfr을 프로메가(Promega), 인비트로겐(Invitrogen), 및 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC))으로부터 각각 수득하였다. 세포 배양배지는 집코(GIBCO) 및 바이오휘태커(BioWhittaker)로부터 수득하고, 우태아혈청은 하이클론(Hyclone)으로부터 수득하였다. 재조합 인간 TGF-베타는 R＆D 시스템즈로부터였다. [3H]티미딘은 듀퐁 NEN으로부터였다. S100 사토바인드(SartoBind) 양이온성 막 흡착제는 사토리우스(Sartorius)로부터였다. 크로마토그래피 칼럼 및 레진은 파마시아로부터였다. 화학물질은 피쉬 및 시그마로부터였다.
세포주 및 세포배양
모든 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. HeLa 세포를 5% FBS가 공급된 MEM 배지에서, PC-3 및 LNCap 세포를 5% FBS가 공급된 RPMI-1640에서, DU145를 10% FBS가 공급된 EMEM 배지에서, HEL 세포를 10% FBS가 공급된 RPMI에서, HepG2 세포를 10% FBS 및 1×비필수 아미노산이 공급된 MEM 배지에서, BHK 세포를 5% FBS가 공급된 DMEM 배지에서 유지하였다. 항생제(최종농도 50㎍/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신)를 모든 세포주에 대하여 배양배지에 첨가하였다).
공제 cDNA 라이브러리의 제작 및 스크리닝
HeLa 세포(ATCC CCL185)를 10% 송아지 태아 혈청, 2mM 글루타민, 50㎍/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 공급된 둘베코즈 모디파이드 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM; GobcoBRL)에서 성장시켰다. HeLa 세포를 재조합 인간 인터페론-γ(IFN-γ)(Boehringer Mannheim)로 48시간동안 2500유닛/㎖의 농도로 처리하였다. 총 RNA(RNAzol; Tell-Test) 및 폴리(A)-선별된 RNA(FastTrack; Invitrogen)를 가짜로부터 분리하였고 IFN-γ-처리 HeLa 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 분리하였다.
동방향 cDNA 라이브러리 제작을 위하여, 미처리 및 IFN-γ-처리된 HeLa 세포(48시간 처리)로부터의 2㎍의 폴리(A) RNA로부터 합성된 cDNA를 플라스미드 pGEM11Zf(Promega) 및 pT7T3D18U(Pharmacia)로 각각 방향성을 갖도록 클로닝하였다.
공제 하이브리디제이션(substractive hybridization), 또는 더욱 구체적으로는, 센스-쇄 cRNA 및 안티센스 cDNA 합성, 하이브리디제이션, 하이드록시아파타이드 칼럼에 의한 2본쇄 cDNA/RNA 하이브리드로부터의 1본쇄 cDNA의 분리 및 공제 라이브러리 제작에 이은 PCR 증폭이 공지의 방법에 따라 수행되었다(Usei et. al, J. Neurosci., 14(8): 4915-4926, 1994). PCR-증폭된 공제 cDNA를 pT7T3D(Pharmacia)로 방향성을 갖도록 클로닝하였다.
공제 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 이 라이브러리로부터 1000개의 cDNA를 무작위로 뽑고 서열분석하였다(하기 참조). 클론 #15558(aka 2H)가 6회 발견되었으며(분석된 1000개의 cDNA당) 따라서 IFN-γ에 의해 차등 조절되는 것으로 추정되는 cDNA인 것으로 간주된다.
클로닝, DNA 서열분석, 및 컴퓨터 분석
모든 서열분석은 제조자의 프로토콜에 따라 T7 프라이머를 사용하여 단일 통과로 어플라이드 바이오시스템즈 373 또는 377 DNA 서열분석기상에서 행해졌다. 벡터 서열은 시퀀서 프로그램(Gene Codes Corporation)을 사용하여 분석전에 제거되었다. 20bp 초과의 삽입체는 유전자 동정을 위하여 진뱅크(Genbank, 버전 92)와 블라스트(Altschul et. al, J. Mol. Biol., 215:40, 1990)를 통하여 비교되었고 공제 cDNA 라이브러리에서 cDNA 출현의 빈도를 계산하기 위하여 FastA(Pearson ＆ Lipman, PNAS, 85:2444, 1988)를 통하여 서로 비교되었다. Alu 요소를 함유하는 서열은 분석에서 제외되었다. 2H(클론 #15558)의 블라스트 분석은 TGF-β 슈퍼훼밀리의 몇몇 구성원과 상당한 유사성을 나타내었다. 클론 #15558은 전체-길이는 아니었으며(즉, 전체 코딩 부위를 함유하지는 않았음) 따라서 앵커 PCR(Frohman et. al., PNAS 85:8998-9002; 1988)을 cDNA 주형 합성을 위한 출처로서 2㎍의 폴리(A) RNA(48시간동안 IFN-γ로 처리된 HeLa 세포로부터 추출됨)를 사용하여 실행하였다. 두개의 독립된 앵커 PCR을 완료하고 연속된 cDNA를 클로닝하고 서열분석하였다. 전체-길이 클론을 수득하였음을 가라키는 이 ATG의 종료 코돈 상부를 갖는 오픈 리딩 프레임이 발견되었다.
노던 블랏 분석
RNA 블랏을 위하여, HeLa 세포(가짜 대조군 및 48시간동안 IFN-γ로 처리된 HeLa 세포)로부터 추출된 2㎍의 폴리(A) RNA를 레인당 부하하고 이어서 1.2% 아가로스, 1.2M 포름알데히드 겔상에서 전기영동에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스막으로 전이시켜 전체-길이32P-표지된 2H cDNA 탐침으로 하이브리디제이션시켰다. 또한, 이32P-표지된 탐침을 인간 조직 RNA 블랏(Clontech)에 하이브리디제이션시켰다.
rGF-2H의 발현
GF-2H cDNA의 전체 코딩 부위를 포유류 발현벡터 pCI(Promega)의 EcoRⅠ 위치로 서브클로닝하여 개시 코돈 ATG의 바로 상부에 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)을 갖는 발현 플라스미드 pCI-2H를 생성시켰다. DNA 형질감염을 변형된 칼슘 포스페이트 침전 과정에 의해 수행하였다(Graham and van der Eb, Virology 52:456 (1973)). 메쏘트렉세이트(MTX) 내성을 위하여, 플라스미드 pSV2-dhfr(ATCC No. 37146; S. Subramani, et al., Mol. ＆ Cell. Biol., Sept. 1981, pg. 854-864) 또는 pZem229(유럽특허출원번호 제 0 319 944 A2 호, 1988. 7. 12 출원)을 1 대 4의 비율로 pCI-2H로 동시-형질감염시켰다. 형질감염으로부터 24시간후, MTX(최종농도 1μM) 또는 G418(최종 활성 농도 1mg/㎖)을 배양 배지에 첨가하였다. 내성 콜로니를 10일 경과후 무작위로 선별하였다. 혈청-결핍 조건 배양 배지 및 선별된 클론으로부터의 세포 용균물을 수획하고 rGF-2H의 발현 및 분비에 대한 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 생산 세포주를 확립하고 1μM MTX 및 1mg/㎖ G418에서 유지하였다. 일부 MTX-내성 세포주를 20μM MTX에 노출시키고 형질감염된 유전자를 더욱 증폭하였다. 최고의 분리된 생산 클론을 BHK-GF-2H #17로 지정하고 rGF-2H의 생산에 사용하였다.
재조합 성숙 GF-2H의 정제
BHK-GF-2H #17로부터의 혈청-결핍 조건 배지를 수획하고 프로테아제 저해제를 아래 농도로 첨가하였다: 1mM PMSF, 1㎍/㎖ 루펩틴, 2㎍/㎖ 펩스타틴, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 및 1mM EDTA. 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 20분동안 4℃에서 9000rpm으로 원심분리한 후, 4℃에서 밤새 상등액을 아세트산(0.2M 최종농도)으로 산성화시켰다.
그런다음 상등액을 25mM 인산나트륨 pH 4.0(완충액 A)으로 예비-평형화시킨 S100 사토바인드 양이온성 막 흡착제(Sartorius, #S100X)상에 부하시켰다. 막 흡착제를 완충액 A와 이어서 300mM NaCl을 갖는 완충액 A로 세척하였다. rGF-2H를 500mM NaCl 및 프로테아제 저해제(1mM PMSF, 1㎍/㎖ 루펩틴, 2㎍/㎖ 펩스타틴, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 및 1mM EDTA)를 함유하는 pH 4.0의 25mM 인산나트륨을 갖는 막 흡착제로부터 용출하였다.
포화 (NH4)2SO4를 최종농도 1M로 첨가한 후, 풀을 1M NaCl 및 1M (NH4)2SO4를 함유하는 pH 7.0, 25mM NaPO4로 예비-평형화시킨 8㎖ 부틸 세파로스 칼럼에 적용하였다. 그런 다음 칼럼을 동일한 완충액으로 세척하고 pH 7.0의 25mM NaPO4에서 NaCl 및 (NH4)2SO4의 선형 1-0M 경사로 용출하였다. rGF-2H를 함유하는 분획을 센트리프랩-10(Millipore)을 사용하여 풀시키고 농축하였다.
농축된 풀을 슈퍼덱스-75 FPLC 칼럼(Pharmacia)에 적용하였다. 칼럼을 평형화하고 20mM 트리스-HCl, pH 7.0, 100mM KCl로 용출하였다.
rGF-2H를 함유하는 분획을 90% 용매 A 및 10% 용매 B(용매 A는 물중의 0.1% 트리플루오로아세트산에 함유되고 용매 B는 아세토니트릴에서 0.1% 트리플루오로아세트산으로 구성됨)에서 평형화된 바이댁(Vydac) C18 HPLC 칼럼(10㎛ 입자크기, 4.6×250mm)에 가하였다. 칼럼을 용매 B의 10% 내지 90% 선형 경사로 용출하였다. 순수 rGF-2H를 함유하는 분획을 동결건조하여 건조하고 25mM NaPO4, pH 7.0에서 재현탁하고 소적으로 -70℃에서 저장하였다.
GF-2H에 대한 폴리클로날 항체
프리-프로-GF-2H의 잔기 253 내지 273에 상응하는, 펩티드 MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPC를 합성하고 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 커플링시켜 프로인트 애쥬번트에서 유화시키고 래빗에 주사하였다. 래빗 항혈청을 ELISA에 의해 펩티드에 대해 적정하였다.
겔 전기영동 및 웨스턴 블랏 분석
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 램리, U.K., Nature, 227:680(1970)에 따라 수행하였으며, 겔을 은염색 또는 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250에 의해 염색하였다. 웨스턴 전이를 기재된 바와 같이 수행하였다(Towbin et al., PNAS, 76, 4350(1979). 면역염색을 GF-2H 펩티드에 대한 래빗 항체 및 호스래디쉬 퍼옥시다아제-포접 항-래빗 항체(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다.
N-말단 아미노산 및 질량 분광측정법 분석
N-말단 서열 분석을 온-라인 페닐티오하이단토인 분석기(모델 120A)가 장착된 어플라이드 바이오시스템 470A 단백질 서열분석기를 사용하여 수행하였다. 질량 분광측정을 355nm로 조율된 루모닉스(Lumonics) NAG 레이저를 이용하는 베스텍(Vestec) 2000 MALDI-TOF-MS상에서 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광측정기(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry(MALDI-MS)를 사용하여 수행하였다.
세포 증식 분석
세포를 5,000 내지 10,000 세포/웰의 밀도로 100㎕의 상응하는 완전 배지에서 96-웰 평저 플레이트상으로 접종하였다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 5% CO2, 배양배지를 표시된 농도의 rGF-2H 또는 TGF-베타를 함유하는 1% 또는 5% FBS가 공급된 100㎕의 신선한 배지로 교체하였다. 지정된 기간동안 37℃, 5% CO2에서 더 배양한 후, 세포를 37℃, 5% CO2에서 5시간동안 [3H]티미딘(1μCi/웰)으로 표지하였다. 배양완료후, 표지 배지를 제거하여 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 10분동안 100㎕ 트립신-EDTA로 배양하였다. 세포를 배양 플레이트로부터 96-웰 유리섬유 플레이트(Unifilter plate, Parkard)상으로 전이시켰다. 필터 플레이트를 세척하고 30분동안 55℃에서 건조하고, 각 웰을 40㎕의 섬광계수 유체(MicroScin-20, Parkard)로 적시고 96-웰 플레이트 계수기(TopCount, Parkard)로 계수하였다.
결과
HeLa 세포로부터의 IFN-γ-유도성 유전자의 복제
GF-2H-암호화 DNA의 전체-길이 클론은 1122 염기쌍에 걸쳐있다(도 1). 개시 메티오닌(염기쌍 35-37)은 아래 표준에 의해 확인되었다: (a) 이 메티오닌의 인-프레임 종료 코돈(염기쌍 14-16) 상부가 있었다; (b) 아미노산 서열이 코작 컨센서스 서열과 일치하였다(Kozak, J. Biol. Chem., Vol. 266., No. 30, 19867-19870(1991); 및 (c) 이 메티오닌 다음에 추정되는 신호 펩티드가 존재하였다.
오픈 리딩 프레임의 끝을 가리키는 종료 코돈이 염기쌍 959-961에서 발견되었다(도 1). 이것은 927 염기쌍의 오픈 리딩 프레임에 해당한다. 3' 비코딩 부위는 폴리 아데닐화 신호, AATAAA(염기쌍 1100-1105)를 함유하고, 두개의 불안정성 모티프, ATTTA(염기쌍 1075-1079)가 단명한 mRNA의 3'-비코딩 부위에서 발견된다.
GF-2H mRNA의 발현
GF-2H 전사체의 대략적인 길이를 결정하고 mRNA 조직 발현을 나타내기 위하여 노던 블랏 분석이 수행되었다. 노던 블랏을 탐침으로 1.2kb 절편을 사용하여 수행하였다. 하이브리디제이션이 비처리된 HeLa 세포는 아니고 IFN-γ로 처리된 HeLa 세포에서만 약 1.4kb에서 주요 전사체를 나타내었다(도 3A). 상이한 조직의 스크리닝이 GF-2H mRNA가 태반, 전립선, 간, 신장, 태아 폐, 및 태아 신장에서 검출가능한 것으로 나타났다(도 3B). 태반 및 전립선에서 mRNA의 상대적 량은 기타 조직의 것 보다 컸다(도 3B).
추정 GF-2H 단백질의 분석
추정되는 GF-2H 유전자 산물은 34.1kDa의 계산된 분자량을 갖는 308 아미노산 잔기 길이이다. GF-2H의 뉴클레오티드 및 추정된 단백질 서열을 서열 데이터 뱅크의 것과 비교하였다. 단백질 서열 데이터베이스의 블라스트 검색이 추정 GF-2H 단백질 및 TGF-베타 슈퍼훼밀리간에 상당한 정도의 유사성을 밝혀내었다. 전체 GF-2H 단백질은 GF-2H 단백질의 C-말단 ⅓이 성숙 형태의 드로조필라 dpp 단백질에 대해 30.4%의 동일성을 나타내는 반면, 전구체 형태의 인간 Gdf1에 대해 28.2%의 동일성을 나타낸다. GF-2H 단백질의 C-말단 ⅓ 서열을 PILEUP 프로그램을 사용하여 최대 유사성에 대한 슈퍼훼밀리 구성원의 것과 배열하였을 때, TGF-베타 단백질에서 일부의 기타 보존된 잔기뿐만 아니라 9개의 보존된 시스테인이 GF-2H 단백질의 C-말단 ⅓에 존재하는 것으로 나타났다(Hosaka, et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, pp12127-12130 (1991)).
TGF-베타 슈퍼훼밀리의 대부분의 구성원과 같이, GF-2H 단백질은 N-말단 신호서열 및 N-연결 및 O-연결 글리코실화에 대한 잠재적인 위치를 함유한다. 전구체로부터 성숙 형태를 생성할 수 있는 잠재적인 절단 위치를 제공하는 염기성 잔기의 클러스터가 존재한다(Hosaka, et al. (1991)). 도 2A는 미성숙 GF-2H 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2B는 성숙 GF-2H 단백질과 TGF-베타 훼밀리의 기타 구성원의 아미노산 서열간의 비교를 나타낸다.
재조합 GF-2H 단백질의 발현
재조합 GF-2H를 발현시키기 위하여, GF-2H cDNA의 전체 코딩 부위를 포유류 발현벡터 pCI로 삽입하여 pCI-2H를 생성하였다. 마우스 DHFR에 대한 발현 단위를 함유하는 플라스미드 pCI-2H 및 pSV2-dhfr 또는 pZem229를 갖는 BHK tk-ts13 세포를 동시-감염시킴으로써, MTX를 이용하여 형질감염체의 선별을 가능케하여, 안정한 형질감염된 BHK 세포주를 수득하였다. 이들 세포주의 GF-2H의 발현을 항-GF-2H 펩티드 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석에 의해 조사하였다(결과 미도시). 이들 세포주의 하나인, BHK-2H-#17을 rGF-2H의 발현 특성을 더욱 밝히는데 사용하였다.
조절된 배지를 환원조건하에서 SDS-PAGE상에서 분획화하고 항-GF-2H 펩티드로 블랏팅할 경우, 정확하게 13kd의 분자량을 갖는 밴드가 BHK-2H-#17 세포에서 관찰되었다(도 4, 레인 5). 이 밴드는 대조군 BHK 세포에서는 나타나지 않았다(도 4, 레인 4). 일부의 경우, 정확하게 39kd의 분자량을 갖는 또다른 밴드가 대조군 BHK 세포는 아니지만 BHK-2H-#17 세포에서 관찰되었다(결과 미도시). 조정된 배지를 비환원 조건하에서 SDS-PAGE상에서 분획화하고 항-GF-2H 펩티드 항체를 이용하여 블랏팅할 때, 정확히 25kd의 분자량을 갖는 밴드가 대조군 BHK 세포에서는 아니지만(도 4, 레인 2) BHK-2H-#17 세포에서 관찰되었다(도 4, 레인 3). 이들 결과는 BHK-2H-#17 세포에 의해 GF-2H가 발현되고, 소형태로 가공되어, 배양배지로 분비됨을 암시한다. 분비된 GF-2H는 13kd 단백질의 디설파이드-연결된 이합체(25kDa)일 가능성이 가장 크다. 39kd 형태는 전체-길이 GF-2H의 예상 분자량이 34kd이므로, 글리코실화와 같은 일부 번역후 변형을 거친 전체-길이 GF-2H일 가능성이 가장 크다.
재조합 GF-2H의 정제 및 특성분석
BHK-2H-#17로부터의 조정된 배지를 rGF-2H를 위해 특수하게 개발된(위의 설명 참조) 4-단계의 정제 프로토콜에 의해 가공된 성숙 형태의 rGF-2H를 정제하는데 사용하였다. 이 프로토콜을 사용하여, 성숙 rGF-2H를 SDS-PAGE 및 은염색 분석에 의해 측정되는 바로 95% 초과까지 정제하였다(결과 미도시).
환원조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석할 경우, 정제된 재조합 성숙 GF-2H는 13kd 밴드로 검출되는 반면, 비환원 조건하에서는 25kd 밴드로 검출되었다(도 5). 성숙 rGF-2H의 분자량은 또한 질량 분광분석에 의해 25kd으로 결정되었다(결과 미도시). 정제된 재조합 성숙 GF-2H의 N-말단 아미노산 서열 분석은 성숙 rGF-2H 서열이 전체-길이 GF-2H의 잔기 197에서 시작함을 나타내었다(도 6). 전체-길이 rGF-2H의 잔기 197 내지 308의 폴리펩티드의 계산된 분자량은 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 전체-길이 rGF-2H의 C-말단 부분, 잔기 197 내지 308을 함유한다.
세포 증식에 대한 rGF-2H의 영향
정제된 rGF-2H를 세포증식에 대한 그의 영향을 조사하기 위하여 다양한 인간 세포주상에서 시험하였다. 세포를 플레이트하고 다양한 농도의 rGF-2H로 24 내지 96시간동안 배양하고, 상기한 바와 같이 [3H]티미딘으로 표지하였다. 인간 TGF-베타2 또한 그의 영향을 rGF-2H의 것과 비교하기 위하여 rGF-2H와 병행하여 이들 세포주상에서 시험하였다.
재조합 GF-2H가 안드로겐-비의존성 전립선 암세포주인, PC-3 세포에 의한 [3H]티미딘 도입의 용량- 및 시간-의존적 저해를 나타내었다. 이 저해 효과는 48시간 배양 기간후 최초로 관찰되었고(도 6) 상당한 세포 사멸이 일어나기 시작할 시간인 96-시간 배양기간후까지 계속하여 나타났다. 대조군(rGF-2H가 없는)과 비교하여 약 90%인, 최대 저해가 1.4×10-11M rGF-2H에서 72-시간 배양후에 관찰되었다(도 6). 동일한 조건하에서 TGF-베타를 PC-3 세포에 대해 시험하였을 때, rGF-2H와 유사한 용량- 및 시간-의존적 저해가 역시 관찰되었다. 그러나, TGF-베타를 이용하여 나타난 최대 저해는 대조군과 비교하여 단지 52%에 불과하였다(도 7). PC-3 세포와 유사하게, rGF-2H 및 TGF-베타에 의한 [3H]티미딘 도입의 용량- 및 시간-의존적 저해가 또다른 안드로겐-비의존성 전립선 암세포주인 DU145 세포에서 나타났다(표 1). rGF-2H 및 TGF-베타의 최대 저해는 대조군의 것과 비교하여 각각 60% 및 80%였다(결과 미도시).
선택된 인간 세포주의 증식에 대한 GF-2H의 영향
세포주 rGF-2H TGF-베타
PC-3(안드로겐-비의존성 전립선 암종) 저해 저해
DU145(안드로겐-비의존성 전립성 암종) 저해 저해
LNCaP(안드로겐-의존성 전립선 암종) 무영향 저해
HepG2(헤파토마) 무영향 저해
HEL(에리쓰로류케미아) 무영향 저해
HeLa(경부 상피 암종) 무영향 약간 저해
Caov-3(난소 아데노-카시노마) 무영향 무영향
표 1에 요약된 바와 같이, rGF-2H는 LNCaP, Hep G2, 또는 HEL 세포에 의한 [3H]티미딘 도입에 영향을 미치지 않았다. 반면에, TGF-베타는 이들 세포에 의한 [3H]티미딘 도입을 저해하였다. rGF-2H나 TGF-베타 어느것도 HeLa 및 Caov-3 세포에 의한 [3H]티미딘 도입에 대해 심각한 영향을 나타내지 않았다. 간략하게 말하면, rGF-2H는 부가적인 세포주에 대해 저해 행동을 나타내는 TGF-베타와 달리, 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 특이적으로 저해하는 것으로 나타났다.

Claims (21)

  1. 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하고, 그 아미노산 서열이 도 4에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 유도체를 포함하는 재조합 단백질.
  2. 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포의 증식을 선택적으로 저해하고, 그 아미노산 서열이 도 4에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 기능성 유도체로 구성되는 단리 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  4. 치료학적 유효용량의 제 3 항의 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
  6. 도 4의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 기능성 유도체를 필수성분으로 하여 구성되는 핵산 분자.
  7. 제 6 항에 있어서, 핵산 분자가 RNA 분자인 핵산 분자.
  8. 제 6 항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 핵산 분자.
  9. 제 8 항에 있어서, DNA 분자가 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  10. 제 7 항에 있어서, 핵산 분자가 발현 벡터인 핵산 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, 발현 벡터가 pCI 벡터인 발현 벡터.
  12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 분자가 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 유전자 치료요법에서 사용하기에 적합한 벡터인 핵산 분자.
  13. 제 12 항의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  14. 치료학적 유효용량의 제 13 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
  16. 적합한 조건하에서 접촉할때 안드로겐-비의존성 전립선 암세포를 선택적으로 살해하고, 제 1 항의 단백질과 그에 기능적으로 결합되는 독성 부위를 포함하는 물질 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 독성 부위가 리신, 테타누스 독소, 디프테리아 독소, 및 그의 서브유닛 및 절편으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질성 독소인 물질 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 독성 부위가125I,131I,90Y 및212Bi로 구성된 군으로부터 선택되는 방사성핵종인 물질 조성물.
  19. 제 16 항의 물질 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물
  20. 치료학적 유효용량의 제 19 항의 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 안드로겐-비의존성 전립선 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
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