JP6069663B2

JP6069663B2 - 抗炎症医薬製品

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Publication number: JP6069663B2
Application number: JP2014516041A
Authority: JP
Inventors: アンジェロ・ピー・コンサルボ; ノーザー・エム・メータ; マウロ・ペレッティ; ジェスモンド・ダリ
Original assignee: Resother Pharma Aps
Current assignee: Resother Pharma Aps
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: BR112013032088B1; CA2839298A1; EP3533457B1; EP3533457A1; DK2720707T3; CN103764669A; ES2712805T3; CN103764669B; JP2014519526A; CA2839298C; AU2012271453B2; EP2720707A2; US20150315256A1; PL2720707T3; BR112013032088A2; US10072055B2; AU2012271453A1; US20130072446A1; WO2012174397A3; US9102753B2

Description

関連出願
本出願は、２０１１年６月１５日出願の米国仮出願番号６１／４９７，２７０および２０１２年６月１５日出願の米国出願番号１３／５２４，３８１の優先権およびその利益を主張し、これらの出願の全体が説明のために出典明示により本明細書に組み込まれる。

分野
本明細書に開示される実施形態は、ヒトアネキシン１と決定された構造的な相同性を有する抗炎症化合物、それらの医薬組成物、および薬物療法およびそれらの化合物および組成物の抗炎症剤としての使用に関する。

背景
アネキシンスーパーファミリーは有意な生物学的および構造的相同性をもつ１３のリン脂質結合タンパク質で構成される。アネキシンは高く保存されたコアドメインおよび可変Ｎ−末端ドメインに構造的に分割される。アネキシン１（ＡＮＸＡ１、３７ｋＤａ）は、末梢血多形核白血球（ＰＭＮ）の周囲の組織への溢出を抑制する抗炎症剤タンパク質である。該タンパク質は、シグナル伝達事象のカスケードを開始するＦＰＲ２（または、ＦＰＲ−Ｌ１）受容体に結合する。炎症性刺激に続いて、周囲の組織への末梢血多形核白血球（ＰＭＮ）の移動が起こる。ＰＭＮの移動または溢出は、炎症促進および抗炎症過程を制御する、接着分子、サイトカインおよび蛋白酵素などのメディエーターによって調節される。ＰＭＮの破壊的な可能性は、高いおよび潜在的な自己損傷である。したがって、ＰＭＮの溢出および炎症反応を制御することは重要である。

抗炎症剤としての治療目的では、完全アネキシン１タンパク質は、機能性断片およびその改変バージョンと比較して多数の欠点を有する。大きいサイズのタンパク質は、より小さいポリペプチドで可能な技術（例えば、経皮または粘膜）で送達することがより難しくなる。目の炎症を治療するための使用では、より小さい分子は角膜上皮によりよく浸透することができると予想される。また、タンパク質分解への感受性は、全てのペプチド医薬品、特に大きいもの、および特に経口送達（多くの患者によって好まれる）を考慮する場合に特に重要となる。

ポリペプチドのＮ−末端側の重要な領域を欠くいくつかのアネキシン１誘導体は、炎症およびメディエーター放出のいくつかのアッセイにおいて顕著な活性を欠くことを示したが、完全長Ｎ−末端Ｎ−アセチルアネキシン１（２−２６）は、いくつかの系で生物学的に活性であると考えられた。アネキシン１タンパク質のユニークなＮ−末端部分に主に由来する多数のペプチドが抗炎症作用を有することを示した。

最もよく研究されたアネキシンＡ１ペプチドの１つはペプチドＡｃ２−２６であり、それは５４アミノ酸Ｎ−末端領域の２番目から２６番目のアミノ酸を模倣する。Ａｃ１−１８８断片（および天然のタンパク質）のように、それは、その安定性および可能性としてその半減期を増加させるＮ−端末アセチル化を有する。アネキシン１およびそのＮ−末端ペプチド（Ａｃ２−２６）は、ＦＰＲ２／リポキシンＡ４（ＦＰＲ２／Ａｌｘ）受容体を通したそれらの抗炎症作用の主要な部分を発揮することを示した。生体内で、Ａｃ２−２６ペプチドは、乏血の心筋の再潅流（Ｉ／Ｒ）、腸間膜Ｉ／Ｒ、グリコーゲン腹膜炎、およびＩＬ１空気嚢（ａｉｒｐｏｕｃｈ）モデルにおける抗炎症剤効果を発揮することが示され、それが負傷／炎症部位への好中球の動員を有意に減少させると報告された。このペプチドの抗炎症特性は、炎症の急性モデルに限定されない。関節炎モデルで、Ａｃ２−２６ペプチドの関節内注射による投与は、好中球動員の減少で疾病重症度を減少させることを示した。

また、Ａｃ２−１２およびＡｃ２−６ペプチドなどの、Ａｃ２−２６ペプチドのより短いバージョンは、炎症の急性モデルにおいていくらかの抗炎症剤効果を引き出すことが示されている。多数の研究機関によって行われた研究は、アネキシンＡ１タンパク質のＮ−末端から完全に独立した領域由来のペプチド、より正確には、アンチフラミン−２（ＡＦ２）と称される、タンパク質のコア領域の３番目の反復における２４７−２５３アミノ酸もまた、抗炎症特性を有することを示した。

概要
本明細書に開示された実施形態は、抗炎症医薬製品、より具体的にはポリペプチド、ポリペプチドを含む医薬組成物、炎症の処置または予防方法に関する。本明細書の開示による抗炎症医薬製品は、本明細書に詳細に説明されるように、良好な抗炎症効能、安定性および／または投与の簡便性を含むが、これらに限定されない品質を有する。

本明細書に例示される態様によると、配列番号４で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号５で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号６で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号７で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号８で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号９で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１０で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１１で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１２で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１３で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１４で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１５で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１６で示されるポリペプチドが提供される。

本明細書に例示される態様によると、４７〜５０アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜４８の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドの残基２４が配列番号１の残基２５に相当し、ポリペプチドの残基２４がバリンではない、ポリペプチドを提供する。一の実施形態において、ポリペプチドの相同性領域は、配列番号１の２〜４８の残基と少なくとも９４パーセントの同一性を有する。一の実施形態において、ポリペプチドの相同性領域は、配列番号１の２〜４８の残基と少なくとも１００パーセントの同一性を有する。

本明細書に例示される態様によると、２５〜２６アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜２６の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドの残基１０が配列番号１の残基１１に相当し、ポリペプチドの残基１０がアラニンを除くいずれかのアミノ酸であり、ペプチドの残基２１がバリンを除くいずれかのアミノ酸である、ポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、３７〜４５アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の１２〜２４の残基と１００パーセントの同一性を有し、配列番号１の２６〜４８の残基と１００パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドの残基１４が配列番号１の残基２５に相当し、かつバリンではないか、ポリペプチドの残基２１が配列番号１の残基２５に相当し、かつバリンではない、のいずれかである、ポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、４７〜５０アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜４８残基と１００パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドがそのＣ−末端でアミド化されている、ポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、３７〜５１アミノ酸残基を有し、その分子構造内に配列番号２と少なくとも９０パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドの相同性領域が以下の特性：（ａ）配列番号２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアラニンではない、（ｂ）配列番号２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、（ｃ）配列番号２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、または（ｄ）配列番号２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、の少なくとも１つを有するポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、４７〜４８アミノ酸を有し、配列番号１の１〜４８の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有するポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、４７〜５１アミノ酸残基を有し、その分子構造内にヒトアネキシン１の２〜４８残基と１００パーセント同一の４７アミノ酸残基の領域を含むポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、４９〜５１アミノ酸残基を有し、その分子構造内にヒトアネキシン１の２〜４８残基と１００パーセント同一の４７アミノ酸残基の領域を含むポリペプチドを提供する。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１１と少なくとも９６パーセントの同一性を有するポリペプチドであって、残基１０がアラニンではないか、残基２１がバリンではない、のいずれかである、ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、残基１０はアラニンでなく、かつ残基２１はバリンではない。

本明細書に例示される態様によると、配列番号１１に示される配列を有するポリペプチドであって、残基１０がアラニンではないか、残基２１がバリンではない、のいずれかである、ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、残基１０はアラニンでなく、かつ残基２１はバリンではない。

本明細書に例示される態様によると、治療上有効量の、本明細書に開示の抗炎症ポリペプチドを、そのような治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、炎症の治療または予防方法を提供する。

本明細書に例示される態様によると、本明細書に開示のポリペプチドは、炎症の治療または予防のための薬剤の製造に使用できる。一の実施形態において、薬剤は１つ以上の医薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む。

一の実施形態において、本明細書に開示の医薬組成物は、少なくとも１つの医薬上許容される酸を含む錠剤（ｔａｂｌｅｔ）またはカプセルの形態の組成物であって、酸が、錠剤またはカプセルが１０ミリリットルの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液に添加された場合に溶液のｐＨを５．５より高くないように低下させるのに十分な量で錠剤またはカプセルに存在する、組成物を含むがこれらに限定されない。剤形のための他の好ましい例は以下に詳しく説明される。

獣医およびヒトの両方への使用が本明細書の開示の範囲内にあるとみなされる。本明細書で議論した用量が、本明細書に開示の医薬が投与される動物の相対的な重量を基にしてなされるであろう比例調整（ｐｒｏｒａｔａａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を除いて、ヒトおよび獣医の用途で同じであると予想される。

図面の簡単な説明
本明細書に開示の実施形態は添付の図面を参照してより詳細に説明されるであろう。そこでは、同様の構造がいくつかの視点を通じて同様の数字で示される。示された図面は、必ずしも実寸ではなく、代わりに強調が、一般的に本明細書に開示の実施形態の原則を示す際になされる。

図１Ａおよび図１Ｂは、Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨに対する、本開示の５つのポリペプチドのＦＲＰ受容体を通じたｐ−ＥＲＫ受容体活性を比較するウエスタンブロット分析を示す。図１Ａはｐ−ＥＲＫおよびｔ−ＥＲＫの代表的なブロットである。図１Ｂはｐ−ＥＲＫとｐ−ＥＲＫレベルに関する密度計測結果を示す。

図２Ａ〜図２Ｃは、本開示の５つのポリペプチドおよびＡｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨの、活性ＨＵＶＥＣ単分子層へのＰＭＮ相互作用を減少させる抑制能力を決定するフローチャンバー分析からの一連の図を示す。図２Ａは、ＰＭＮ捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）としてのＨＵＶＥＣとのＰＭＮ相互作用の程度の定量化を示す。図２Ｂは、ＰＭＮ付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）としてのＨＵＶＥＣとのＰＭＮ相互作用の程度の定量化を示す。図２Ｃは回転（ｒｏｌｌｉｎｇ）としてのＨＵＶＥＣとのＰＭＮ相互作用の程度の定量化を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、ビヒクルのみの対照に対する本開示の３つのポリペプチドの抗炎症効果を比較した一連の棒グラフである。図３Ａは細胞数を示し、図３ＢはＧＲ１＋ｖｅ細胞が考慮された際の効果を示す。

図４Ａ〜４Ｃは、３種の異なるパラメータで、異なる濃度での本開示の３つのポリペプチドにより提供された阻害パーセントを報告する一連の棒グラフである（捕獲−図４Ａ、回転−図４Ｂ、付着−図４Ｃ）。

図５は、本開示の３つのポリペプチドの、異なる濃度での、アポトーシスを起こした細胞の食作用を引き起こすアネキシンＡ１の特性を模倣する能力を報告する一連の棒グラフである。

図６は、ビヒクルのみの対照に対する、異なる濃度での、本開示のポリペプチドの、再かん流傷害の危険を減少させる能力を示す一連の棒グラフである。

図７は、ビヒクルのみの対照に対する、異なる濃度での、本開示の２つのポリペプチドの、再かん流傷害の危険を減少させる能力を示す一連の棒グラフである。

図８は、アネキシン１のｉｎｖｉｖｏでの切断に関与するプロテアーゼ、ＰＲ３の存在下での本開示の３つのポリペプチド、ＵＧＰ０２２（配列番号：５）、ＵＧＰ０２５（配列番号：７）およびＵＧＰ０２６（配列番号：８）の時間に伴う分解の対数グラフである。

図９は、アネキシン１のｉｎｖｉｖｏでの切断に関与するプロテアーゼ、ＨＮＥの存在下での本開示の３つのポリペプチド、ＵＧＰ０２２（配列番号：５）、ＵＧＰ０２５（配列番号：７）およびＵＧＰ０２６（配列番号：８）の時間に伴う分解の対数グラフである。

詳細な説明
添付の配列表において、

配列番号：１は、ヒトアネキシン１の最初の５０アミノ酸である。

配列番号：２は、配列番号：２において１、１２、１５および２６位置と同等の、（アネキシン１での）１１、２２、２５および３６位置のアミノ酸で自然に起こる変異で改変された、ヒトアネキシン１の１１〜４８アミノ酸である。

配列番号：３は、ほとんど配列番号：２と同じであり、配列番号：３が配列番号：２の最初の残基を省略している点のみが異なる。

配列番号：４は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２１の実施形態である。ＵＧＰ０２１は５０アミノ酸長である。ＵＧＰ０２１はポリペプチドの位置５０がグリシンである、ヒトアネキシン１の２〜５０アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２１はＡＮＸＡ１（２−５０）Ｇｌｙ５１−ＯＨと称される。

配列番号：５は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２２の実施形態である。ＵＧＰ０２２は４９アミノ酸長である。ＵＧＰ０２２はポリペプチドのＣ−末端がアミド化された、ヒトアネキシン１の２〜５０アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２２はＡＮＸＡ１（２−５０）−ＮＨ_２と称される。

配列番号：６は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２４の実施形態である。ＵＧＰ０２４は４９アミノ酸長である。ＵＧＰ０２４は、ヒトアネキシン１の２〜５０アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２４はＡＮＸＡ１（２−５０）−ＯＨと称される。

配列番号：７は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２５の実施形態である。ＵＧＰ０２５は４７アミノ酸長である。ＵＧＰ０２５はポリペプチドのＣ−末端がアミド化され、ポリペプチドの残基２４が、対応する配列番号：１の残基２５のバリンの代わりに、ロイシンである、ヒトアネキシン１の２〜４８アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２５はＬｅｕ２５−ＡＮＸＡ１（２−４８）−ＮＨ_２と称される。

配列番号：８は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２６の実施形態である。ＵＧＰ０２６は４９アミノ酸長である。ＵＧＰ０２６はポリペプチドのＣ−末端がアミド化され、ポリペプチドの残基２４が、対応する配列番号：１の残基２５のバリンの代わりに、ロイシンである、ヒトアネキシン１の２〜５０アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２６はＬｅｕ２５−ＡＮＸＡ１（２−５０）−ＮＨ_２と称される。

配列番号：９は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２７の実施形態である。ＵＧＰ０２７は４４アミノ酸長である。ＵＧＰ０２７はポリペプチドのＣ−末端がアミド化され、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２５のバリンの代わりに、ロイシンである、ヒトアネキシン１の５〜４８アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２７はＬｅｕ２５−ＡＮＸＡ１（５−４８）−ＮＨ_２と称される。

配列番号：１０は、本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２８の実施形態である。ＵＧＰ０２８は３７アミノ酸長である。ＵＧＰ０２８はポリペプチドのＣ−末端がアミド化され、ポリペプチドの残基１４が、対応する配列番号：１の残基２５のバリンの代わりに、ロイシンである、ヒトアネキシン１の１２〜４８アミノ酸である。実施形態において、ＵＧＰ０２８はＬｅｕ２５−ＡＮＸＡ１（１２−４８）−ＮＨ_２と称される。

配列番号：１１は、本開示のポリペプチドの実施形態である。配列番号：１１は２５アミノ酸長である。配列番号：１１はポリペプチドの残基１０および２１（配列番号：１の１１および２２位置に等しい）で自然に起こるいかなる変異によって改変された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。

配列番号：１２は、本開示のポリペプチド、Ｐｅｐ５７の実施形態である。Ｐｅｐ５７は２５アミノ酸長である。Ｐｅｐ５７は、ポリペプチドの残基１０が、対応する配列番号：１の残基１１のアラニンの代わりに、ロイシンであり、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２２のバリンの代わりに、ロイシンであり、ポリペプチドの残基１がアセチル化された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。実施形態において、Ｐｅｐ５７はＬｅｕ１１，２２−Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨと称される。

配列番号：１３は、本開示のポリペプチド、Ｐｅｐ５９の実施形態である。Ｐｅｐ５９は２５アミノ酸長である。Ｐｅｐ５９は、ポリペプチドの残基１０が、対応する配列番号：１の残基１１のアラニンの代わりに、アスパラギン酸であり、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２２のバリンの代わりに、アスパラギン酸であり、ポリペプチドの残基１がアセチル化された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。実施形態において、Ｐｅｐ５９はＡｓｐ１１，２２−Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨと称される。

配列番号：１４は、本開示のポリペプチド、Ｐｅｐ８４の実施形態である。Ｐｅｐ８４は２５アミノ酸長である。Ｐｅｐ８４は、ポリペプチドの残基１０が、対応する配列番号：１の残基１１のアラニンの代わりに、メチオニンであり、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２２のバリンの代わりに、メチオニンであり、ポリペプチドの残基１がアセチル化された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。実施形態において、Ｐｅｐ８４はＭｅｔ１１，２２−Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨと称される。

配列番号：１５は、本開示のポリペプチド、Ｐｅｐ６０の実施形態である。Ｐｅｐ６０は２５アミノ酸長である。Ｐｅｐ６０は、ポリペプチドの残基１０が、対応する配列番号：１の残基１１のアラニンの代わりに、グルタミン酸であり、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２２のバリンの代わりに、グルタミン酸であり、ポリペプチドの残基１がアセチル化された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。実施形態において、Ｐｅｐ６０はＧｌｕ１１，２２−Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨと称される。

配列番号：１６は、本開示のポリペプチド、Ｐｅｐ８３の実施形態である。Ｐｅｐ８３は２５アミノ酸長である。Ｐｅｐ８３は、ポリペプチドの残基１０が、対応する配列番号：１の残基１１のアラニンの代わりに、イソロイシンであり、ポリペプチドの残基２１が、対応する配列番号：１の残基２２のバリンの代わりに、イソロイシンであり、ポリペプチドの残基１がアセチル化された、ヒトアネキシン１の２〜２６アミノ酸である。実施形態において、Ｐｅｐ８４はＩｌｅ１１，２２−Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨと称される。

別記する場合または文脈から明らかな場合を除き、本明細書中で、投与量は、医薬賦形剤、希釈剤、担体または他の成分によって影響されない活性化合物の重量を示すが、下記でより詳細に論じられるとおり、かかる付加的な成分が、所望により含まれる。ペプチド活性剤の送達のために製薬産業において一般に使用されるいずれの投与形態（カプセル、錠剤、注射など）も、本明細書中での使用に適当であり、「賦形剤」、「希釈剤」または「担体」なる語は、該産業において、典型的に、かかる投与形態において活性成分と一緒に含まれるような非活性成分を包含する。好ましい経口投与形態は、下記でより詳細に論じるが、本発明の活性剤を投与する排他的な様式とみなされるべきではない。いくつかの実施形態において、本開示の２つ以上のポリペプチド活発剤の混合物が、同じ医薬組成物または投与形態で利用され得る。

本明細書で使用される「ポリペプチド」なる用語は、アミノ酸のポリマーを意味し、特定の分子長に限定されない。用語はペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。用語「ポリペプチド」はポリペプチドの改変、例えばアミド化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、環状化等を含む。定義に含まれるものとして、例えば、天然に起こるまたは天然に起こらない、１つ以上のアミノ酸の類似物（例えば、非天然のアミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、結合の置換ならびに当分野で知られた他の改変を含むポリペプチド等が挙げられる。ポリペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術を含むがこれに限定されない、当分野で既知のいかなるポリペプチド合成により作製され得る。

本明細書で使用される、「パーセント同一性」なる用語は、所定のアミノ酸が付加的な置換（付加的なアミノ酸以外）で修飾されるか否かを問わない、アミノ酸配列を意味する。例えば、システインは、この目的において、アセチルシステインと同一とみなされる。同様に、この目的において、別のシステインとジスルフィド架橋を形成したシステインは、かかる架橋を形成していないシステインと同一とみなされる。当業者に知られているように、複数のシステイン残基を有するペプチドは、２個のそのようなシステイン残基とすぐにジスルフィド架橋を形成する。本明細書で言及されるすべてのそのようなペプチドは、１個以上のそのようなジスルフィド架橋を任意に含むものとして定義される。本明細書で使用される「パーセント同一性」なる用語は、また、ペプチドサイズにおける相違を意図する。例えば、３３残基のペプチドと（その１つの付加的なアミノ酸を除き）同一である３４残基のペプチドは、本明細書中で、該３３残基のペプチドと９７パーセント同一であるとみなされる。

本明細書で使用される「炎症」または「炎症反応／疾病」なる参照は、目の炎症、痛風、痛風性関節炎、リウマチ様関節炎、ぜんそく、再かん流傷害または損傷、卒中、心筋梗塞、敗血症ショックまたは乾癬または湿疹のような炎症性皮膚疾患を含むがこれらに限られないあらゆる炎症反応または疾病を意味する。

本明細書で述べられたいかなる選択も、矛盾が結果として生じることが、文脈から明らかである場合を除き、ここに述べられたいかなる他の選択と組み合わせて使用され得る。

本出願人は、ヒトアネキシン１の残基２〜４８または２〜５０と実質的な相同性をもつより長い相同体、特に、３７〜５１残基を有し、ヒトアネキシン１の残基１１〜４８と実質的に相同な領域、特に配列番号：２と実質的に相同な領域を含むポリペプチドにおける、いくらかの有意な利点を発見した。

実施形態において、配列番号：２に相当する本開示のポリペプチドの相同領域は、以下の特性の少なくとも１つ（いくつかの実施形態ではそれ以上）を有する：（ａ）配列番号：２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアルギニンである、（ｂ）配列番号：２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がリジンである、（ｃ）配列番号：２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がロイシンである、（ｄ）配列番号：２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がリジンである。実施形態において、相同領域は配列番号：２と少なくとも９４パーセント同一性であり、いくつかの実施形態において１００パーセント同一性である。

実施形態において、配列番号：２に相当する本開示のポリペプチドの相同領域は、配列番号：２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンでない点で配列番号：２と異なり、いくつかの実施形態において、それはロイシンである。

実施形態において、本開示のポリペプチドが４７〜４８アミノ酸を有し、配列番号：１の残基１〜４８と少なくとも９０パーセント同一性を有する場合、ポリペプチドは以下の特性の少なくとも１つ（いくつかの実施形態ではそれ以上）を有する：（ａ）配列番号：１の残基１１に相当するポリペプチドの残基がアラニンでない（いくつかの実施形態においてアルギニンである）、（ｂ）配列番号：１の残基２２に相当するポリペプチドの残基がバリンでない（いくつかの実施形態においてリジンである）、（ｃ）配列番号：１の残基２５に相当するポリペプチドの残基がバリンでない（いくつかの実施形態においてロイシンである）、（ｄ）配列番号：１の残基３６に相当するポリペプチドの残基がバリンでない（いくつかの実施例でリジンである）。

本開示のペプチドが遊離酸形態で存在し得る一方で、本開示のいくつかのポリペプチドにおいてＣ−末端がアミド化される。実施形態において、そのようなアミド化はペプチドの有効性および／または生物学的利用に寄与する。実施形態において、配列番号：５などの本開示のＣ−末端アミド化ポリペプチドは、配列番号：４などの遊離酸前駆体よりもよりよいｉｎｖｉｔｒｏでの結果を示す。理論に拘泥されることなく、そのようなポリペプチドが、アミド基がカルボキシペプチダーゼ作用に対していくらかの抵抗力を与えることにより、より安定である可能性がある。

本開示のペプチドは、特に、配列番号：１１のポリペプチドなどのアネキシン１（２−２６）の類似体に関して、Ｎ−末端でアセチル化できる。実施形態において、配列番号：１１の残基１０および２１は独立してアスパラギン酸、リジン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。実施形態において、配列番号：１１の残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸、メチオニン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。実施形態において、配列番号：１１の残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸およびメチオニンから選択される。実施形態において、配列番号：１１の位置１０および２１のアミノ酸は同一である。

本明細書に記載のとおり、本開示のＵＧＰ０２１ペプチド（配列番号：４）および本開示のＵＧＰ０２４ペプチド（配列番号：６）は、Ａｃ−ＡＮＸＡ１（２−２６）−ＯＨおよび完全長ＡＮＸＡ１よりも強力であることが見出されている。これらのペプチド、ＵＧＰ０２１およびＵＧＰ０２４、は、それらの好中球内皮相互作用を抑制する能力がフローチャンバーアッセイを使用することで評価され、マウス空気嚢炎症モデルを使用することでｉｎｖｉｖｏで試験された。予期しないことに、本開示のＵＧＰ０２２ペプチド（配列番号：５）（Ｃ−末端アミド）は、これらのアッセイにおいて本開示のＵＧＰ０２１ペプチド（配列番号：４）または本開示のＵＧＰ０２４ペプチド（配列番号：６）のいずれかよりも強力であることが見出された。

本開示のＵＧＰ０２２ペプチド（配列番号：５）の効力および半減期を増加させる試みにおいて、一連のｉｎｖｉｔｒｏでのＰＲ３およびＨＮＥ消化が行われた。両方のセリンプロテアーゼの主要な切断部位はＡｌａ１０（アネキシン１に対してＡｌａ１１）およびＶａｌ２１（アネキシン１に対してＶａｌ２２）であるが、Ｖａｌ３５（アネキシン１に対してＶａｌ３６）はＨＮＥによってのみ切断される。予期しないことに、両方のプロテアーゼがＶａｌ２４（アネキシン１に対してＶａｌ２５）で本開示のＵＧＰ０２２ペプチドを切断した。この切断部位は文献で特定されていないもと考えられる。

２つのＬｅｕ２４（アネキシン１に対してＬｅｕ２５）類似体、本開示のＵＧＰ０２５ペプチド（配列番号：７）および本開示のＵＧＰ０２６ペプチド（配列番号：８）、が調製された。両方のペプチド、ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６、は、本開示のＵＧＰ０２２ペプチド（配列番号：５）よりもＰＲ３およびＨＮＥに対してより抵抗性であった。

３つの本開示のポリペプチド、ＵＧＰ０２２（配列番号：５）、ＵＧＰ０２５（配列番号：７）およびＵＧＰ０２６（配列番号：８）の、アネキシン１のｉｎｖｉｖｏ切断に関連するプロテアーゼ、ＰＲ３の存在下での分解試験において、位置２４でのロイシン置換をもつポリペプチドが、その特徴を欠くポリペプチドに対してよりよい安定性を示した。全ての試験されたポリペプチドは天然アネキシンの位置１のメチオニンを欠くので、位置２４はアネキシン１の位置２５に相当する。４７残基ポリペプチドは、他が同一の４９残基ポリペプチドより優れていた。同様の結果が、ＨＮＥ存在下での分解試験で得られた。

試験されたＡｃ２−２６ペプチド変異体では、３つの本開示のペプチド、すなわち本開示のＰｅｐ５７ペプチド、本開示のＰｅｐ５９ペプチドおよび本開示のＰｅｐ８４ペプチドが、受容体のＦＲＰファミリーを通して下流シグナル伝達を導くことが観察された。Ｐｅｐ５７およびＰｅｐ８４が、１０ｐＭまで下げられた活動でのフローチャンバー分析においてＰＭＮ−ＨＵＶＥＣ相互作用を有意に阻害したことが示された。ｉｎｖｉｖｏ試験の場合、空気嚢モデルにおいて、両方のペプチドは白血球を有意に阻害することにより、抗炎症特性を示し、Ｐｅｐ８４はこの炎症読み取り（ｒｅａｄｏｕｔ）をより大きい範囲で阻害した。

図１Ａおよび図１Ｂで結果が報告された試験は、試験された５つのポリペプチドのうちどれが親ペプチド、Ａｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨのようにＦＰＲ２受容体を通じてｐ−ＥＲＫを活性化する最もよいものであるかを決定することを対象とした。ＨＥＫ−ＦＰＲ２細胞は、１０μＭの新規なＡｃ２−２６ペプチドとともに８分間共培養され、次いで細胞が溶解されて細胞溶解液に再懸濁された。その後、１００ｎｇの総タンパク質が１０％ポリアクリルアミドゲルにロードされた。電気泳動、転送およびブロッキングに続いて、膜がまず抗ｐ−ＥＲＫ抗体にプルーブされ、次いで剥がされて抗全ｐ−ＥＲＫ抗体に再プローブされた。ｔ−ＥＲＫブロットが全ての試料で同じ量を示すのに対して、ｐ−ＥＲＫ活性化は親Ａｃ２−２６で引き起こされる活性と同様に、Ｐｅｐ５７、５９および８４で最も高く、且つ第二対照、Ｗ−ペプチドよりも低いことが観察された。図１Ａはｐ−ＥＲＫおよびｔ−ＥＲＫの代表的なブロットであり、図１Ｂはｐ−ＥＲＫからｔ−ＥＲＫレベルに関連する密度計測結果を示す。データは、統計分析で用いられる一元ＡＮＯＶＡでの３つの異なった実験の平均値およびＳＥＭとして示された（＊＝Ｐ＜０．０５、対ＣＴ）。

図２Ａ〜２Ｃは、活性ＨＵＶＥＣ単分子層へのＰＭＮ相互作用を減少させる本開示の５つのポリペプチドおよびＡｃ−ＡＮＡＸ１（２−２６）−ＯＨの阻害能力を決定するフローチャンバー分析からのデータを報告する一連の図であるＰＭＮは１０μＭの様々なペプチドと１０分間３７℃にて培養された。ＰＭＮはその後、ＰＭＮ捕獲（図２Ａ）、付着（図２Ｂ）および回転（図２Ｃ）として、ＨＵＶＥＸとのＰＭＮ相互作用の程度を定量化する前に、８分間、１ｄｙｎｅ／ｃｍ^２で流された。結果は、Ｐｅｐ５７、６０および８４のみが本アッセイで阻害特性を示すという事実を際立たせる。データは３つの独立している実験（異なったＰＭＮとＨＵＶＥＣ調製物での）の平均±ＳＥＭであり、＊＝Ｐ＜０．０５、対ＣＴ群、データは一元ＡＮＯＶＡを用いて分析された。ｐ−ＥＲＫデータに沿って、Ｐｅｐ５７およびＰｅｐ８４は親Ａｃ２−２６ペプチドで観測されたものと同様の阻害特性を示した。非常に高いｐ−ＥＲＫ活性化可能性を示したＰｅｐ５９は、本アッセイではいかなる阻害特性も示さなかったが、他方で、リン酸ＥＲＫにそれほど有効でなかったＰｅｐ６０は、親Ａｃ２−２６ペプチドにより示されたものと同様の強力な阻害特性を示した。

図３Ａおよび図３Ｂは、ビヒクルのみの対照に対して本開示の３つのポリペプチドの抗炎症効果を比較する一連の棒グラフである。マウスは、６日齢の空気嚢モデルへのマウスＩＬ−１βの局所注射の直前に、生理食塩水＋ＤＭＳＯを２００μｌ、ｉ．ｖ．でまたは３つのＡｃ２−２６由来ペプチドの動物あたり５０μｇ投与を受けた。細胞移動の範囲は４時間後に決定され、空気嚢の洗浄およびＧｒ１マーカーでの移動細胞の染色が続いた。細胞数を計測すると、Ｐｅｐ５７および８４が抗炎症作用を示すことが観察され（図３Ａ）、ＧＲ１＋ｖｅ細胞が考慮されると、Ｐｅｐ５７のこの観察された効果が失われる（図３Ｂ）。データは１群あたり５匹のマウスの平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、対ビヒクル群（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｐｅｐ５７およびＰｅｐ８４はモデルにおいて阻害可能性を示した。Ｐｅｐ８４はより強力であった。

図４Ａ〜図４Ｃは、分析下での３つのパラメータ（捕獲（図４Ａ）；回転（図４ｂ）および付着（図４Ｃ））上での阻害の度合いを示す、フローチャンバーアッセイにおけるＵＧＰ０２２、ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６の活性の直接比較を行う。全ての３つのＵＧＰペプチドが、特にＲＰＲ２受容体を通して作用して、活性化内皮と相互作用するヒトＰＭＮの数を減少できる。ＵＧＰ０２５は試験された高い濃度ではそれほど活性ではないが、ＵＧＰ０２２ペプチドと比較した場合、１００ｆＭ濃度でわずかにより活性のようである。

近年、重要な分解促進特性（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｙ）はアネキシンＡ１、すなわち、マクロファージおよび同様の細胞によるアポトーシスを起こした細胞の食作用の誘導、によるものとされてきた。この効果は、ＦＰＲ２にもまた依存しており、リポキシンおよびレゾルビンを含む他の重要な分解促進メディエーターと共有される。実験は、ＵＧＰ０２２とその派生物が、様々な生物学的アッセイで示された有効性の観点において、アネキシンＡ１のこの効果を模倣することができたかどうかを決定するために行われた。

図５は、アポトーシスを起こした細胞の食作用を引き起こすアネキシンＡ１の特性を模倣する、異なる濃度での、本開示の３つのポリペプチドの能力を報告する一連の棒グラフである。図５から、すべての３つのペプチド（ＵＧＰ０２２、ＵＧＰ０２５、およびＵＧＰ０２６）がアポトーシスに関するＰＭＮの食作用を促進し、ＵＧＰ０２２がこの過程を誘導するより高い能力を示すことがわかる。いくつかの、より長いアネキシンＡ１Ｎ−末端ペプチド（例えば４９および４７残基ポリペプチド）に関して、ＵＧＰ０２１、ＵＧＰ０２２、およびＵＧＰ０２４の各々は、ＥＲＫリン酸化および細胞内カルシウム流出をもたらすことにより、ＦＰＲ１とＦＰＲ２の両方を活性化することができた。ＵＧＰ０２１およびＵＧＰ０２２の両方がナノモル範囲でＦＰＲ２への結合親和力を有し、ＵＧＰ０２２が最も高い親和性を示すことが観察された。すべての３つのペプチドはまた、白血球動員のｉｎｖｉｖｏアッセイにおける抗炎症活性を有すること、やはり、ＵＧＰ０２２が、より強力に炎症を起こした空気嚢への白血球動員を阻害することが観察された。

ＵＧＰ０２２は、ヒトＰＭＮに対して、１ｐＭまで下げる有意性で、抗炎症特性を発揮した。ＦＰＲ２は、ＵＧＰ０２２のヒトＰＭＮに対するこれらの効果を仲介することが観察された。ｉｎｖｉｖｏで、ＵＧＰ０２２は、炎症を起こした微小循環系でヒト組換えアネキシンＡ１と同等の強度の強力な抗炎症特性を生じた。これらの効果はＦＰＲ２のマウスオルソログによって仲介された。ＵＧＰ０２２は急性心筋障害のマウスモデルに強力な組織保護特性を示す。

ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６はＦＰＲ１よりＦＰＲ２により高い親和性を有する。ＵＧＰ２５は、ＵＧＰ０２６よりさらに高い親和性をＦＰＲ２に有するように見える。ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で抗炎症特性を有し、やはり、ＵＧＰ０２５がより強力に見える。これらのペプチドの新規な特性が発見されており、それはエフェロサイトーシス（ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ）（アポトーシスを起こした細胞の食作用）での分解促進効果である。ＵＧＰ０２２、ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６のそのような分解促進効果はＦｐｒ２依存様態（Ｆｐｒ２ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ）で起こる。ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６の簡潔な生物学的プロフィールに沿って、両方のペプチドは、心保護を与えるＵＧＰ０２２の組織保護特性を保有できる。

図６は、本開示のポリペプチドの、異なった濃度での、ビヒクルのみの対照に対する、再かん流傷害の危険を減少させる能力を示す一連の棒グラフである。２５分間の虚血（左前下降枝動脈の閉塞；［ＬＡＤＣＡ］）および１２０分間の再かん流に続くＣ５７／Ｂｌ６マウス（〜３０ｇ体重）の梗塞面積。ビヒクルまたはＵＧＰ０２２は再かん流の始めにｉ．ｖ．（５秒間のボーラス投与）で投与された。リスク領域は再閉塞およびエバンスブルーの注入に続いて計測された。梗塞面積はリスク領域のＮＢＴ染色に続いて決定された。結果は１群あたり４匹のマウスの平均±ＳＥＭである；＊＊Ｐ＜０．０１。

図７は、本開示のポリペプチドの、異なった濃度での、ビヒクルのみの対照に対する、再かん流傷害の危険を減少させる能力を示す一連の棒グラフである。２５分間の虚血（ＬＡＤＣＡ閉塞）および１２０分間の再かん流に続くＣ５７／Ｂｌ６マウス（〜３０ｇ体重）の梗塞面積。ビヒクル、ＵＧＰ０２５（５μｇ）またはＵＧＰ０２６（５μｇ）は再かん流の始めにｉ．ｖ．（５秒間のボーラス投与）で投与された。リスク領域は再閉塞およびエバンスブルーの注入に続いて計測された。梗塞面積はリスク領域のＮＢＴ染色に続いて決定された。結果は１群あたり４匹のマウスの平均±ＳＥＭである；＊＊Ｐ＜０．０１。

図８は、アネキシン１のｉｎｖｉｖｏでの切断に関与するプロテアーゼ、ＰＲ３の存在下での本開示の３つのポリペプチド、ＵＧＰ０２２、ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６の時間に伴う分解の対数グラフである。位置２４（全ての試験されたポリペプチドは天然アネキシンの位置１のメチオニンを欠くので、アネキシン１の位置２５に相当する）でロイシン置換したポリペプチドで、そのような特性を欠くポリペプチドに対して、よりよい安定性が観察された。また、Ｃ−末端でアミド化された４７残基ポリペプチドは、同じＣ−末端でアミド化された４９残基のポリペプチドより優れていた。

図９は、アネキシン１のｉｎｖｉｖｏでの切断に関与するプロテアーゼ、ＨＮＥの存在下での本開示の３つのポリペプチド、ＵＧＰ０２２、ＵＧＰ０２５およびＵＧＰ０２６（の時間に伴う分解の対数グラフである。位置２４（全ての試験されたポリペプチドは天然アネキシンの位置１のメチオニンを欠くので、アネキシン１の位置２５に相当する）でロイシン置換したポリペプチドで、そのような特性を欠くポリペプチドに対して、よりよい安定性が観察された。また、Ｃ−末端でアミド化された４７残基ポリペプチドは、同じＣ−末端でアミド化された４９残基のポリペプチドより優れていた。

本開示のペプチドの組換え型の調製が、当分野で知られている他の技術より費用対効果に優れると考えられているが、これらの他の技術もまた使用され得る。遊離酸形態も考慮されるが、好ましくは、本開示のペプチドはそれらのＣ−末端でアミド化される。本発明のアミド化されたペプチドを製造するための技術は、周知の技術に従ったペプチジルグリシンアルファ−アミド化モノオキシゲナーゼの存在下で、前駆体（所望のアミド化品のＣ−末端アミド基に代わりグリシンを有する）を反応させることであり、前駆体は、例えば、米国特許第４，７０８，９３４および欧州特許公報第０３０８０６７および０３８２４０３に記載される反応で、アミド化品に変換される。組換え型の調製は、前駆体および前駆体のサケカルシトニンへの変換を触媒する酵素の両方のために好ましい。そのような組換え型の調製はＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１（１９９３）ｐｐ．６４−７０で議論され、それはさらに前駆体のアミド化品への変換についても記載する。アミド化品の調製はまた、Ｃｏｎｓａｌｖｏ他による米国特許第７，４４５，９１１；Ｍｉｌｌｅｒらによる米国特許公開第２００６／０２９２６７２；Ｒａｙらの２００２，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６：２４９−２５９（「Ｒａｙ」）；およびＭｅｔｈａらの２００４，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．４４−４６（「Ｍｅｈｔａ」）で詳しく説明された工程とアミド化酵素を使用することでも実行され得る。

本開示のアミド化ペプチドの調製は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼで、可溶性融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中でグリシン伸長前駆体を生産することにより、または、米国特許第６，１０３，４９５に記載された技術に従った前駆体の直接発現により、進行され得るそのようなグリシン伸長前駆体はＣ−末端を除いて、所望のアミド化品と同一（アミド化品の末端が−Ｘ−ＮＨ２である一方で、前駆体の末端は−Ｘ−ｇｌｙ、Ｘは製品のＣ−末端アミノ酸残基である）である。上述した公報に記載されるアルファ−アミド化酵素は、前駆体の製品への変換を触媒する。その酵素は好ましくは組換えにより、上記の生命工学および生物薬剤学の文献に記載のように、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において生産される。

遊離酸形態の本開示のペプチド活性剤は、「前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」がＣ−末端グリシンを含まないことを除いて、前駆体が代わりに最終ペプチド生成物であり、アミド化を必要としない、同様の方法で生産され得る。

以下の記載は、本開示のＡＮＸＡペプチドおよび類似体のクローニングおよび発現の方法の実施形態を提供する。本開示のＡＮＸＡ１ペプチドおよび類似体は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞外発現のためのベクターを用いてクローニングおよび発現のために設計された。設計された遺伝子はＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）により、そのコドン最適化アルゴリズムを用いて、次いで記載された構築物のＰＣＲを用いる他に所望の酸修飾により合成された。これらの構造物のためのベクター設計は、対象の遺伝子が、各々のカセットが対象の遺伝子に先行する二重プロモーターおよびシグナル配列、および対象の遺伝子に続く二重の転写種子配列を含む二重カセットでコード化されるように、Ｒａｙに提示されたベクターに基づいた。

各々の類似体の二遺伝子（ｄｉｇｅｎｉｃ）プラスミド構築物は、受託番号ＰＴＡ−５５００を有する、出願人の独占Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株、ＢＬＭ６Ｌを形質転換するために用いられ、各々の類似体遺伝子構築物のための発現株をもたらした。これらの組換え細胞株はカナマイシン耐性およびＲａｙに記載される準規定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）培地中で３７℃で増殖され、プラスミドは診断制限酵素マッピングで確認され、最終分離物が、他で記載された、ＡＥＸ−ＨＰＬＣアッセイを用いる、対象のペプチドの細胞外生産の実験のために、振盪フラスコ内でスクリーニングされた。選択された分離物はベンチスケール発酵でさらに評価された。各々の発酵は、供給物に組み込まれた化学誘導物質ＩＰＴＧを用いて達成された組換えタンパク質の誘導と共に実行された、基質律速（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｌｉｍｉｔｅｄ）、流加培養として実行された。発酵は、３２℃、ｐＨ６．６の標準条件下で、Ｒａｙに記載のように、培地へのＯ_２の補足による８０％の溶存酸素で実行された。これらの発酵はアッセイされ、いくつかの場合、誘導後２３から３１時間の間に回収された。精製のために、発酵は酸性化され冷却され、馴化培地は下流の処理のために遠心分離により回収された。

本開示の実施形態において、組換えペプチドは１Ｌの馴化発酵培地から精製された。各ペプチドは、２ＮＨ_２ＳＯ_４でのおよそｐＨ２への酸性化により馴化培地から沈殿した。１時間、１０，０００ｒｐｍの遠心分離によりペレットが集められた。ペレットは、２５ｍＭＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．８中に、２〜８℃で一晩再懸濁された。再懸濁液は３０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離された。上清のｐＨは２ＮＮａＯＨで８．５に調整された。各々のｐＨ調整上清は２５ｍＭＴＲＩＳ、ｐＨ８．５で平衡化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＢｉｇＢｅａｄｓ（ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）陰イオン交換カラム（４．４×１３．５ｃｍ）にロードされた。カラムは流速３０ｍＬ／分で操作され、カラム溶出液のＵＶ吸収は２８０ｎｍでモニターされた。ＡＮＸＡ１ペプチドは２５ｍＭＴＲＩＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．５でカラムから溶出した。回収された画分はＡＥＸ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣでスクリーニングされた。

Ｃ−末端αアミド化（必要であれば）は、組換えペプチジルグリシンアルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ｒＰＡＭ）を用いて実施された。グリシン伸長ＡＮＸＡ１ペプチドのαアミド化は、２５ｍＭＴＲＩＳ、ｐＨ７．０（ＪＴＢａｋｅｒ）、０．５μＭＣｕＳＯ_４（ＪＴＢａｋｅｒ）、１％エタノール、１２５Ｕ／ｍＬアスペルギルス・ニガー（ａｓｐｅｒｇｉｕｓｎｉｇｅｒ）カタラーゼ（ＢＢＩＥｎｚｙｍｅｓ）、３ｍＭアスコルビン酸塩および２０，０００Ｕ／ｍＬｒＰＡＭの存在下０．５ｍｇ／ｍＬで実施された。反応物は３７℃で２〜３時間培養された。反応物は瞬間冷凍により終了された。

αアミド化結果物は０．１％ＴＦＡ、２％ＭｅＣＮで平衡化されたＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ３００（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ）ＲＰカラム（１．１×１３．７ｃｍ）にロードされた。カラムは流速２．８５ｍＬ／分で操作され、カラム溶出液のＵＶ吸収は２８０ｎｍでモニターされた。カラムは不純物の除去のため、０．１％ＴＦＡ、１６％ＭｅＣＮおよび０．１％ＴＦＡ、２４％ＭｅＣＮでのステップグラジエントに供された。ＡＮＸＡ１ペプチドは０．１％ＴＦＡ、４０％ＭｅＣＮでカラムから溶出した。回収された画分はＡＥＸ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣでスクリーニングされた。

ＡＮＡＸ１ペプチドは、真空調節および外部ドライアイス／アセトン凝縮器を備えたＶｉｒＴｉｓＦｒｅｅｓｅＭｏｂｉｌｅＣｏｎｓｏｌ１．５（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）で凍結乾燥で乾燥された。ＡＥＸ／ＲＰ−ＨＰＬＣで評価されたＡＮＸＡ１ペプチドの最終純度は＞９５％であった。

ＡＮＡＸ１ペプチドの純度および発酵生産力（力価）は、ＡＥＸ−ＨＰＬＣにより決定された。クロマトグラフィーは、１０ｍＭＴＲＩＳ、２５％ＭｅＣＮ、ｐＨ８．５で平衡化されたＨｙｄｒｏｃｅｌｌＱＡ１５００カラム（ＢｉｏＣｈｒｏｍＬａｂｓ）、４．６×２５０ｍｍで実施された。分離は、２０分間での０％Ａ（１０ｍＭＴＲＩＳ、２５％ＭｅＣＮ、ｐＨ８．０）から２０％Ｂ（１０ｍＭＴＲＩＳ、０．５ＭＮａＣｌ、２５％ＭｅＣＮ、ｐＨ８．０）のリニアグラジエントを用いて達成された。カラムは大気温度で１．２ｍＬ／分の流速で操作された。カラム溶出液のＵＶ吸収は２２０ｎｍでモニターされた。生産力値は各ペプチドの標準曲線に基づいて決定した。

ＡＮＡＸ１ペプチドの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定された。クロマトグラフィーは、０．１％ＴＦＡ、１８％ＭｅＣＮで平衡化された、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎＢＤＳＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１２０オングストロームで実施された。分離は、２０分間での２０％Ｂから７０％Ｂ（移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：０．０８％ＴＦＡ、９０％ＭｅＣＮ）のリニアグラジエントを用いて達成された。カラムは大気温度で１．２ｍＬ／分の流速で操作された。カラム溶出液のＵＶ吸収は２２０ｎｍでモニターされた。

本開示のペプチドが１ミリリットルあたり０．１〜１００ナノグラム、好ましくは１ミリリットルあたり５〜５０ナノグラムに患者のペプチドの血清レベルを維持するために適正な用量で投与されるべきであると見積もられる。血清レベルは当分野で知られているラジオイムノアッセイ法で測定され得る。担当医は、患者の応答をモニターし得、次に個々の患者の代謝および応答の評価のために投与量をいくらか変更し得る。

本開示で用いられる化合物は、好ましくは医薬品としての使用のために調製される。ポリペプチドは、製薬業で一般的に使用される、経口、非経口、筋肉内、経皮または経粘膜送達を含むが、これらに限定されない、いかなる適当な投与経路でも投与され得る。静脈注入もいくつかの実施形態で利用され得る。眼球滴下剤（Ｏｃｕｌａｒｄｒｏｐ）は目の治療に使用され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは他の抗炎症剤と同時に投与され得る。

他の送達方法が使用され得る一方で、本開示のペプチドは、例えば米国特許第６，０８６，０１８または米国特許公開２００９／０３１７４６２に詳細に記載されるように、第経口送達のために製剤化され得る。本開示に従う一つの経口剤形を下記の表１に説明する（例示としてであり、限定するものではない）。

配列番号：７のペプチドが例示として提供される一方で、本明細書で議論された如何なるペプチド活性剤も活性剤として代用され得る。そのような剤の２個以上の組み合わせもまた代用され得る。

本開示の錠剤は、本開示のポリペプチドおよび少なくとも１つの医薬上許容される酸を含み、酸は錠剤中に、錠剤が１０ミリリットルの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液に添加された場合に、溶液のｐＨを５．５以下まで低下させるのに十分な量で存在する。好ましくは、酸は、非酸性で、室温で１００ミリリットルの水当たり１ｇの溶解度を有する医薬上許容される保護コートで被覆された酸粒子を含む。いくつかの実施形態において、錠剤の外表面は、活性ポリペプチドと胃のプロテアーゼとの接触を防ぎながら、錠剤を患者の胃を通過させて輸送するのに有効な酸耐性保護ビヒクル（例えば、一般的な医薬上の腸溶コーティング）である。そのような錠剤は、保護ビヒクルから被覆された酸を分離する水溶性バリア層を有することが好ましい。現在のところ、水溶性バリア層は、（ａ）いかなる酸保護ビヒクルを除いて、医薬組成物の重量の少なくとも３％添加する、および／または、（ｂ）室温で１００ミリリットルの水あたり１１グラムを超える水溶性を有する材料を含む。好ましくは、ペプチド剤および酸は同じまたは組成物中の有一の層にある。従来技術のペプチドの経口送達のこれまでの経験は、本明細書に記載される経口送達が、１〜５％程度の生物学的利用を提供し得ることを示唆する。

投与は、一日一回用量か、複数用量のいずれかであり得る。投与される活性剤にかかわらず、単一のカプセルまたは錠剤がペプチド活性剤、酸（プロテアーゼ阻害剤として使用される）、および吸収エンハンサーの同時放出を最もよく提供するので、単一用量形態（例えば、経口投与が利用されている場合の、単一のカプセルまたは錠剤）が各投与で使用されるのが好ましい。酸が活性剤の放出とかなり近接した時間で放出される場合、酸がペプチド活性剤に対する望ましくないタンパク質分解の攻撃を最もよく抑えることができるので、これは非常に望ましい。

単一の丸薬（ｐｉｌｌ）またはカプセルとして開示の全ての成分を投与することにより、近い同時放出が最もよく達成される。しかしながら、開示はまた、例えば、一緒に投与され得る２個以上の錠剤またはカプセルに、全ての成分の必要量を提供するように、必要量の活性剤を分割することを含む。本明細書で使用される「医薬組成物」は、１個以上の錠剤またはカプセル（または他の投与形態）が提供される投与において推奨されているかに関係なく、患者に対する特定の投与に適切な、完全な投与量を含むものであるが、これに限られない。

本開示によるペプチドは、また、投与様式間で通常の投与量変更を用いて、当該産業における他の一般的な技術によって送達されてもよい。例えば、注射による投与の場合、１日あたり１〜１００マイクログラムの間の投与量範囲（好ましくは、１日あたり５〜５０マイクログラムの間）の投与量範囲が好ましい。当然、担当者は個々の患者の応答をモニターして、それに従って用量を調整するであろう。

注射用医薬組成物において、本開示のペプチド活性剤は、好ましくは、１０マイクログラム／ｍＬ〜１０００マイクログラム／ｍＬの濃度で配合される。

本開示の医薬組成物は、水、生理食塩水、グリセリン、エタノールなどの典型的な医薬上の賦形剤、希釈剤または担体を含み得る。さらに、または代わりに、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助的な物質がそのようなビヒクルに存在し得る。賦形剤の他の非限定的な例として、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．２ＭＮａＨＣＯ_３または他の医薬上許容される流体などの医薬上許容される賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、溶液または懸濁物として注射可能な物質として調製され得る。固体状で、注射の前に溶液、懸濁液の液状ビヒクルとするのに好適なものも調製し得る。調製物もまた、例えば、リポソーム中に乳化またはカプセル化し得る。

医薬品として使用される組成物は、有効量の化合物、ならびに必要に応じて他のいかなる上記の成分を含む。「有効量」による、とは、単回投与かまたは一連の投与の一部のいずれかの、その量の個体への投与が、炎症の処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康、年齢および物理的な状態、処置されるべき個体の分類群（たとえば、非ヒト霊長類、霊長類など）、および関与する医師の必要用量の評価に影響する他の要素により、変化する。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、４７〜５０アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜４８の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有する相同性領域を含み、ポリペプチドの残基２４が配列番号１の残基２５に相当し、ポリペプチドの残基２４がバリンではない。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、２５〜２６アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜２６の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有する相同性領域を含み、ポリペプチドの残基１０が配列番号１の残基１１に相当し、ポリペプチドの残基１０がアラニンを除くいずれかのアミノ酸であり、ポリペプチドの残基２１がバリンを除くいずれかのアミノ酸である。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、３７〜４５アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の１２〜２４の残基と１００パーセントの同一性を有し、配列番号１の２６〜４８の残基と１００パーセントの同一性を有する相同性領域を含むポリペプチドであって、ポリペプチドの残基１４が配列番号１の残基２５に相当し、かつバリンではないか、ポリペプチドの残基２１が配列番号１の残基２５に相当し、かつバリンではない、のいずれかである。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、４７〜５０アミノ酸を有し、その分子構造内に配列番号１の２〜４８の残基と１００パーセントの同一性を有する相同性領域を含み、ポリペプチドがそのＣ−末端でアミド化されている。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、３７〜５１アミノ酸残基を有し、その分子構造内に配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する相同性領域を含み、ポリペプチドの相同性領域が以下の特性：（ａ）配列番号２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアラニンではない、（ｂ）配列番号２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、（ｃ）配列番号２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、または（ｄ）配列番号２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、の少なくとも１つを有する。一の実施形態において、ポリペプチドの相同性領域が以下の特性：（ａ）配列番号２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアラニンではない、（ｂ）配列番号２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、（ｃ）配列番号２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、または（ｄ）配列番号２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、の少なくとも２つを有する。一の実施形態において、ポリペプチドの相同性領域が以下の特性：（ａ）配列番号２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアラニンではない、（ｂ）配列番号２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、（ｃ）配列番号２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、または（ｄ）配列番号２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、の少なくとも３つを有する。一の実施形態において、ポリペプチドの相同性領域が以下の特性：（ａ）配列番号２の残基１に相当するポリペプチドの残基がアラニンではない、（ｂ）配列番号２の残基１２に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、（ｃ）配列番号２の残基１５に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、または（ｄ）配列番号２の残基２６に相当するポリペプチドの残基がバリンではない、の各々を有する。一の実施形態において、配列番号：２の残基１５に相当するポリペプチドの残基２４がバリンでない。一の実施形態において、配列番号：２の残基１５に相当するポリペプチドの残基２４がロイシンである。一の実施形態において、ポリペプチドの相同領域は配列番号：２と少なくとも９４パーセント同一性である。一の実施形態において、ポリペプチドの相同領域は配列番号：２と１００パーセント同一性である。一の実施形態において、ポリペプチドはそのＣ−末端でアミド化される。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、４７〜４８アミノ酸を有し、配列番号１の１〜４８の残基と少なくとも９０パーセントの同一性を有する。一の実施形態において、ポリペプチドは以下の特性：（ａ）配列番号１の残基１１に相当するポリペプチドの残基１０がアラニンではない、（ｂ）配列番号１の残基２１に相当するポリペプチドの残基２２がバリンではない、（ｃ）配列番号１の残基２５に相当するポリペプチドの残基２６がバリンではない、または（ｄ）配列番号１の残基３６に相当するポリペプチドの残基３５がバリンではない、の少なくとも１つを有する。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９６％の同一性を有し、残基１０がアラニンではないか、残基２１がバリンではない、のいずれかである。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してアスパラギン酸、リジン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸、メチオニン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸およびメチオニンから選択される。一の実施形態において、ポリペプチドは位置１０および２１で同一のアミノ酸を有する。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１はアセチル化される。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、残基１０がアラニンではないか、残基２１がバリンではない、のいずれかである。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してアスパラギン酸、リジン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸、メチオニン、イソロイシンおよびグルタミン酸から選択される。一の実施形態において、ポリペプチドの残基１０および２１は独立してロイシン、アスパラギン酸およびメチオニンから選択される。一の実施形態において、ポリペプチドは位置１０および２１で同一のアミノ酸を有する。一の実施形態において、ポリペプチドはそのＣ−末端でアミド化される。

一の実施形態において、本開示のポリペプチドは、４７〜５１アミノ酸残基を有し、その分子構造内にヒトアネキシン１の２〜４８残基と１００パーセント同一の４７アミノ酸残基の領域を含む。一の実施形態において、ポリペプチドは４９〜５１アミノ酸残基を有する。し、その分子構造内にヒトアネキシン１の２〜４８残基と１００パーセント同一の４７アミノ酸残基の領域を含むポリペプチドを提供する。一の実施形態において、ポリペプチドはそのＣ−末端でアミド化される。

一の実施形態において、本開示の医薬組成物は本開示のペプチドを含む。一の実施形態において、医薬組成物は錠剤またはカプセルである。一の実施形態において、錠剤またはカプセルは少なくとも一つの医薬上許容される酸を含む。一の実施形態において、酸は、錠剤またはカプセルが１０ミリリットルの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液に添加された場合に溶液のｐＨを５．５以下まで低下させるのに十分な量で錠剤またはカプセルに存在する。一の実施形態において、酸は、医薬上許容される保護コートで被覆された酸粒子を含む。一の実施形態において、保護コートは非酸性である。一の実施形態において、保護コートは室温で１００ミリリットルの水当たり１ｇの溶解度を有する。一の実施形態において、錠剤の外表面は、活性ポリペプチドと胃のプロテアーゼとの接触を防ぎながら、錠剤を患者の胃を通過させて輸送するのに有効な酸耐性保護ビヒクル（例えば、一般的な医薬上の腸溶コーティング）である。一の実施形態において、本開示の錠剤またはカプセルは、保護ビヒクルから、錠剤またはカプセル中の被覆された酸を分離する水溶性バリア層を含み、水溶性バリア層は、（ｉ）いかなる酸保護ビヒクルを除いて、医薬組成物の重量の少なくとも３％添加する、かまたは、（ｉｉ）室温で１００ミリリットルの水あたり１１グラムを超える水溶性を有する材料を含む。

本明細書に引用された全ての特許、特許出願および公開された文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上述の開示のいくつかおよび他の特性、機能、またはその代替は、所望により他の多くの異なる系または応用へと組み合わせられることが理解されるであろう。当業者によって続けてなされるであろう、様々な現在、予期しないか思いがけない代替手段、改変、変更、または改良もまた、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims

配列番号：７または配列番号：８の一つから選択される、ポリペプチド。
残基１がアセチル化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
さらに残基１の前の位置にメチオニンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドを含む、炎症の処置または予防のための医薬組成物。