JP2003513660A - ヘッジホッグ融合タンパク質及び利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘッジホッグのアミノ酸配列(Ｘ)を含むアミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｚ又はその部分を有する融合ポリペプチドを記載し；Ｙは、随意のリンカー部分であり；Ｚは、ヘッジホッグ以外のポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチドである。Ｘは、ヒトのヘッジホッグであることが好ましい。ヘッジホッグの変異体も又記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 一つのペプチドファミリーであって、その投与及びバイオアベイラビリティー
を改善するために多くの研究と努力が集中されてきたのは、タンパク質のヘッジ
ホッグファミリーである。これらのヘッジホッグタンパク質は、脊椎動物及び無
脊椎動物の胚発生の様々な面を調節する細胞外シグナリングタンパク質のファミ
リーである(総説としては、Perrimon,N.(1995)Cell 81,313-316を参照されたい)
。最もよく特性決定されたヘッジホッグタンパク質は、前後パターン形成、先端
外胚葉隆起、後腸中胚葉、脊柱、遠位肢、肋骨発生及び肺発生並びに脊髄、後脳
及び前脳中の腹側細胞型の誘導に関与するソニックヘッジホッグ(Shh)である(Ri
ddle,R.D.等(1993)Cell 75,1401-1416；Echelard,Y.等(1993)Cell 75,1417-1471
；Roelink,H.等(1994)Cell 76,761-775；及びRoelink,H.等(1995)Cell 81,445-4
55を参照されたい)。

【０００２】 ヘッジホッグタンパク質の作用機構は完全には分かっていないが、最も最近の
生化学的及び遺伝学的データは、Ｓｈｈのレセプターが腫瘍抑制遺伝子パッチト
の産物であるということ(Marigo,V.等(1996)Nature 384,176-179；Stone,D.M.等
(1996)Nature 384,129-134)及び他のタンパク質；スムースンド(Alcedo,J.等(19
96)Cell 86,221-232)、Cubitus interruptus又はその哺乳動物対応物のｇｌｉ(D
ominguez,M.(1996)Science 272,1621-1625；Alexandre,C.等(1996)Genes ＆ Dev
.10,2003-2013)及びfused(Therond,P.P.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,42
24-4228)がヘッジホッグシグナリング経路に含まれるということを示唆している
。

【０００３】 ヒトのＳｈｈは、４５ｋＤａの前駆体タンパク質として合成され、これは、自
己触媒的に開裂されて：(Ｉ)すべての公知のヘッジホッグシグナリング活性の原
因である２０ｋＤａのＮ末端断片(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及び２４)と；(ＩＩ)
自己プロセッシング活性を含む２５ｋＤａのＣ末端断片(Lee,J.J.等(1994)Scien
ce 266,1528-1536；Bumcrot,D.A.等(1995)Mol.Cell Biol.15,2294-2303；Porter
,J.A.等(1995)Nature 374,363-366)を生じる。天然のヘッジホッグのＮ末端断片
は、完全長前駆体配列のアミノ酸残基２４〜１９７よりなり、そのＮ末端アミノ
酸は、システインである。

【０００４】 このＮ末端断片は、そのＣ末端のコレステロール付加(Porter,J.A.等(1996)Sc
ience 274,255-258：Porter,J.A.等(1995)Cell 86,21-34)及びＮ末端の脂肪酸付
加(Pepinsky等(1998)J.Biol.Chem.273,14037-14045)の間中、膜に結合したまま
でいる。これらの修飾は、ヘッジホッグシグナルの組織配置の限定にとって非常
に重要である。コレステロールの付加は、プロセッシング過程において、Ｃ末端
ドメインにより触媒される。

【０００５】 ヘッジホッグのようなタンパク質様基質のそれらの意図される応用についての
有用性を制限する主な因子は、非経口的に投与された場合に、それらが短時間で
身体から排除されることである。これは、プロテアーゼによる代謝、又はタンパ
ク質排除のための正常な経路を利用する例えば腎臓での濾過によるクリアランス
の代謝の結果として起こりうる。これらの物質の経口経路での投与は、胃におけ
るタンパク質分解に加えて、胃の高い酸性は、それらを意図する標的組織に到達
する前に不活性化しうるので、一層問題がある。これらの投与経路に関係する問
題は、製薬産業では周知であり、それらを解決する試みにおいて様々な戦略が用
いられている。

【０００６】 タンパク質安定化を扱った多くの仕事が発表されてきた。広く用いられてきた
一つの安定化方法は、不活性ポリマーのタンパク質への添加である。タンパク質
の選択したアミノ酸残基(例えば、システイン、リジン、Ｎ末端残基)を高分子物
質と結合させる多くの方法(デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプ
チド、ポリエチレングリコール及びポリアミノ酸の利用を含む)が知られている
。生成した結合ポリペプチドは、非経口適用につき、それらの生物学的活性及び
水溶性を保持していると報告されている。

【０００７】 ヘッジホッグの場合には、我々は、以前に、ある種の細胞においては、タンパ
ク質がそのＮ末端ドメインの様々な部位においてタンパク質分解性の切り取り（
クリッピング）を受けるということを発見した。その上、これらのＮ末端を切り
取られた形態のヘッジホッグは、１０Ｔ１／２アッセイにおいて不活性である(
該アッセイにおいては、１０Ｔ１／２細胞株が、活性なソニックヘッジホッグタ
ンパク質の存在下で５日間培養した際に、アルカリホスファターゼのアップレギ
ュレーションを示す)。特に、Ｎ末端の最初の１０アミノ酸を欠くソニックヘッ
ジホッグは、不活性であり、このアッセイで野生型のＳＨＨと共存した場合には
該野生型と拮抗しもする。(Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／１０６，７０３)。従って、もし
、完全に活性で、ポリマーなどの非ヘッジホッグ部分を用いて更に安定化するこ
とのできるタンパク質を生成することを希望するならば、Ｎ末端のタンパク質分
解性の切り取りを防止する必要がある。

【０００８】 発明の要約 この発明は、部分的に、ある細胞型における発現中のヘッジホッグのＮ末端切
り取りが細胞内で起き、ＫＥＸ２ゴルジプロテアーゼ又は類似のＫＥＸ２様細胞
内プロテアーゼによって触媒されるらしいという我々の発見に基づいている。

【０００９】 ヘッジホッグ中のＫＥＸ２認識部位を、細胞内タンパク質分解性の切り取りを
排除し、そうして、非ヘッジホッグ部分(例えば、免疫グロブリン部分)に結合す
ることのできるヘッジホッグタンパク質部分を与えるために変異させた。これら
の変異型タンパク質をＮ末端ドメイン(単一の配列開裂後の成熟タンパク質の残
基Ｃｙｓ１〜Ｇｌｙ１７４に対応するソニックヘッジホッグコード配列のコドン
Ｃｙｓ２４〜Ｇｌｙ１９７)として発現させた。ここに、我々は、これらの変異
体の安定性及びヘッジホッグ活性につき並びにヘッジホッグ−Ｆｃ融合タンパク
質の活性型の製造について報告する。

【００１０】 更に、我々は、免疫グロブリンヘッジホッグ融合タンパク質の非融合型と比べ
ての利点を利用することができる(ヘッジホッグタンパク質がＮ末端でタンパク
質分解性の切り取りを受けていてもいなくても)。しかしながら、特に、我々は
、Ｉｇ部分を欠くヘッジホッグと比べて増大したバイオアベイラビリティーを有
し且つ更に細胞内プロテアーゼにより切り取られ得ないという有益な特性を有す
るヘッジホッグ−Ｉｇ融合物を開発した。従って、ヘッジホッグ部分に修飾を施
して、生成物(ヘッジホッグ免疫グロブリン融合タンパク質)がアゴニスト又はア
ンタゴニストであるが、それらの生物学的活性のすべて又は殆どを保持している
ようにすることができる。次の特性が生じうる：増大した半減期及び組織分布の
変化へと導く改変した薬物速度論及び薬力学(例えば、脈管構造に一層長時間留
まっている能力)。かかる配合物は、製薬及び医療技術における実質的な進歩で
あり、ヘッジホッグが幾らかの有用性を有する様々な疾病例えば末梢神経障害及
び神経退行性疾患の取り扱いに有意の貢献をなすであろう。特に、脈管構造中に
一層長時間留まる能力は、潜在的に、ヘッジホッグ融合タンパク質が血液脳関門
を通過することを可能にする。

【００１１】 特に、この発明は、アミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｚを有する単離されたポリペプチド
に関係する(式中、Ｘは、ヘッジホッグのアミノ酸配列よりなるアミノ酸配列又
はその部分を有するポリペプチドであり；Ｙは、随意のリンカー部分であり；そ
してＺは、ヘッジホッグ以外のポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプ
チドである)。好ましくは、Ｘは、ヒトのソニック、インディアン又はデザート
ヘッジホッグである。好適具体例において、Ｚは、免疫グロブリンの定常領域の
少なくとも一部分であり、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥから選択
するクラスの免疫グロブリンから誘導することができる。このクラスがＩｇＧで
あれば、それを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の一つから選択す
る。ヒトのＩｇＭ及びＩｇＥの定常領域は、４つの定常領域(ＣＨ１、(ヒンジ)
、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４)を含んでいるが、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇ
Ｄの定常領域は、３つの定常領域(ＣＨ１、(ヒンジ)、ＣＨ２及びＣＨ３)を含ん
でいる。この発明の最も好適な融合タンパク質において、定常領域は、少なくと
もヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。

【００１２】 この発明の他の具体例は、ヘッジホッグ又はその部分のアミノ酸配列よりなる
アミノ末端領域とヘッジホッグ以外のタンパク質の少なくとも一部分を含むカル
ボキシ末端領域を有する融合タンパク質である。このカルボキシ部分は、好まし
くは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥから選択するクラスの免疫グ
ロブリンに由来する免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分である。最も
好適な融合タンパク質において、定常領域は、少なくともヒンジ、ＣＨ２及びＣ
Ｈ３ドメインを含む。

【００１３】 この発明の他の具体例は、ヘッジホッグ部分(例えば、上記の式中のＸ)が変化
したＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位を有する突然変異タンパク質を与えるように
変異した融合タンパク質である。

【００１４】 この発明の更に別の具体例は、上記の融合タンパク質をコードする単離された
ＤＮＡである。この発明は又、上記の融合タンパク質をコードする単離されたＤ
ＮＡと発現制御配列を含む組換えＤＮＡ(該発現制御配列は、該ＤＮＡに機能的
に結合されている)にも関係する。この発明の範囲は又、この発明の組換えＤＮ
Ａ配列でトランスフォームされた宿主細胞をも包含する。

【００１５】 この発明は、更に、組換えポリペプチドの製造方法であって、この発明による
宿主細胞の集団を用意し；その細胞集団を条件下で増殖させ、それにより、組換
えＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させ；そして発現されたポリペ
プチドを単離することを含む当該組換えポリペプチドの製造方法にも関係する。

【００１６】 この発明の更なる面は、ヘッジホッグと天然においては結合していない付加的
ポリペプチドを含む実質的に純粋な形態のヘッジホッグ融合タンパク質であり、
この融合物は、付加的ポリペプチドを欠くヘッジホッグのバイオアベイラビリテ
ィーと少なくとも等しい、好ましくは一層大きいバイオアベイラビリティーを有
する。

【００１７】 この発明の更に別の面は、有効量のヘッジホッグ融合タンパク質を含む医薬組
成物である。

【００１８】 詳細な説明 この詳細な説明で引用するすべての参考文献を、別途明記しない限り、参考とし
て本明細書中に援用する。本明細書においては、以下の用語を用いる：

【００１９】 Ｉ．定義 この発明を、今から、以下の定義を含む以下の詳細な説明を参照しながら説明
する：

【００２０】 ここで用いる場合、用語ヘッジホッグ「アンタゴニスト」は、ヘッジホッグが
そのレセプターに結合するのを阻害する任意の化合物を包含する。この発明の目
的に関して、ヘッジホッグアンタゴニストは又、ヘッジホッグ及び/又はパッチ
ト媒介の結合を阻害若しくはブロックすることができ或はヘッジホッグ及び／又
はパッチト機能を例えばヘッジホッグリガンド媒介のヘッジホッグシグナル変換
を阻害し又はブロックすることにより調節することのできる抗ヘッジホッグ又は
抗パッチト抗体などの剤例えばポリペプチドをもいう。かかるヘッジホッグ／パ
ッチト相互作用のアンタゴニストは、次の特性の一つ以上を有する剤である：(
１)それは、ヘッジホッグを有し又は分泌する細胞の表面のヘッジホッグを十分
な特異性で被覆し又はそれに結合して、ヘッジホッグリガンド／ヘッジホッグ相
互作用例えばヘッジホッグ／パッチト相互作用を阻害し；(２)それは、ヘッジホ
ッグを有し又は分泌する細胞の表面上のヘッジホッグを十分な特異性で被覆し又
はそれに結合して、ヘッジホッグ媒介のシグナルの変換例えばヘッジホッグ／パ
ッチト媒介のシグナリングを改変し好ましくは阻害し；(３)それは、細胞内又は
細胞上のヘッジホッグレセプター(例えば、パッチト)を十分な特異性で被覆し又
はそれに結合して、ヘッジホッグ／パッチト相互作用を阻害し；(４)それは、細
胞内又は細胞上のヘッジホッグレセプター(例えば、パッチト)を十分な特異性で
被覆し又はそれに結合して、ヘッジホッグ媒介のヘッジホッグシグナリング例え
ばパッチト媒介のヘッジホッグシグナリングの変換を改変し好ましくは阻害する
。

【００２１】 好適具体例において、このアンタゴニストは、特性１及び２の一方又は両方を
有している。他の好適具体例において、このアンタゴニストは、特性３及び４の
一方又は両方を有している。その上、２以上のアンタゴニスト例えばヘッジホッ
グに結合する薬剤を患者に投与することができる(ヘッジホッグは、パッチトに
結合する薬剤と組み合わせることができる)。

【００２２】 例えば、抗体又は抗体同族体を含むヘッジホッグタンパク質(下記で論じる)並
びに他の分子例えばヘッジホッグに対する天然の可溶性形態の結合性タンパク質
は、有用である。ヘッジホッグに対する天然の可溶性形態の結合性タンパク質に
は、可溶性のパッチトペプチド、パッチト融合タンパク質又は二官能性パッチト
／Ｉｇ融合タンパク質が含まれる。例えば、可溶性形態のパッチト又はその断片
を投与してヘッジホッグに結合させ、好ましくは細胞上のヘッジホッグ結合部位
について競争させ、それにより、抗ヘッジホッグ抗体などのアンタゴニストの投
与と似た効果を導くことができる。特に、パッチトに結合するがヘッジホッグ依
存性シグナリングを誘出しない可溶性ヘッジホッグ変異体は、この発明の範囲内
に含まれる。かかるヘッジホッグ変異体は、野生型ヘッジホッグタンパク質の競
争阻害剤として作用しうるものであり、「アンタゴニスト」と考えられる。

【００２３】 ここで論じるように、例えば免疫グロブリン又はその断片などの抗体同族体と
融合させ或は結合させることのできるヘッジホッグアンタゴニストは、ヘッジホ
ッグ若しくはパッチト又は他の分子の特定の種類又は構造に限られず、それで、
この発明の目的に関して、ヘッジホッグ抗原と融合タンパク質を形成することの
できる及びヘッジホッグ抗原に結合することのできる任意の薬剤であって、ヘッ
ジホッグを効果的にブロックし又は被覆する任意の薬剤は、本明細書の実施例に
おいて用いられるアンタゴニストと同等であると考えられる。

【００２４】 ここで用いる場合、用語「抗体同族体」は、ジスルフィド結合により繋がれた
免疫グロブリン軽鎖と重鎖からなる完全な抗体を含む。用語「抗体同族体」は、
少なくとも一の抗原(即ち、ヘッジホッグ又はパッチト)に結合することのできる
免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖及びこれらの抗原結合性断片から選択
する少なくとも一のポリペプチドを含むタンパク質を包含することも意図してい
る。２以上のポリペプチドからなる抗体同族体の成分ポリペプチドは、適宜、ジ
スルフィド結合或は共有結合により架橋されていてよい。従って、「抗体同族体
」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型(並びに、これらのサブタイ
プ)の完全な免疫グロブリンを包含し、ここに、免疫グロブリンの軽鎖は、カッ
パ又はラムダ型のものであってよい。この発明の好適な融合タンパク質は、抗原
結合特異性を保持している完全な抗体の部分例えばＦab断片、Ｆab'断片、Ｆ(ab
')₂断片、Ｆ(ｖ)断片、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー
、一の重鎖と一の軽鎖からなるダイマーなどを含むことができる。

【００２５】 最も好適な融合タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖又はこれらの両者の
ヒンジ及び定常領域の全部又は一部に融合或は結合されたヘッジホッグ部分を含
むものである。従って、この発明は、(１)ヒンジ部分、(２)第二のペプチド例え
ばヘッジホッグ部分の溶解度又はイン・ビボでの寿命を増大させるペプチド例え
ば免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー又はその断片若しくは部分例え
ばＩｇＧの一部分又は断片例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域例えばＣＨ２、ＣＨ
３及びヒンジ領域；及び毒素部分を含む分子を特徴とする。

【００２６】 ここで用いる場合、「ヒト化抗体同族体」は、組換えＤＮＡ技術により生成さ
れる抗体同族体であって、ヒト免疫グロブリンの抗原結合に必要でない軽鎖又は
重鎖のアミノ酸配列の幾つか又は前部が非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖又は
重鎖由来の対応アミノ酸の代わりに用いられている抗体同族体である。「ヒト抗
体同族体」は、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖のすべてのアミノ酸が(それらが抗
原結合に必要であるか否かに関係なく)ヒト起源に由来する抗体同族体である。

【００２７】 ここで用いる場合、用語ヘッジホッグ「アゴニスト」は、ヘッジホッグレセプ
ターを活性化する任意の化合物を包含する。

【００２８】 「アミノ酸」 − ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のモノマーユニット
。天然のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質においては、２０アミノ酸が見
出されており、それらのすべてはＬ異性体である。この用語は又、これらのアミ
ノ酸の類似体及びタンパク質アミノ酸のＤ異性体及びそれらの類似体をも包含す
る。

【００２９】 ヘッジホッグタンパク質は、もしそれが、次の特性の少なくとも一つを有する
ならば、「生物学的活性」を有する：(ｉ)それは、そのレセプター、パッチトに
結合する能力を有し、若しくはそれは、この特徴を有するポリペプチドを発現に
際してコードし；及び／又は(ii)それは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてアル
カリホスファターゼ活性を誘導することができる。この「生物学的活性」の機能
試験に適合するヘッジホッグタンパク質は、本願で図２で規定するヘッジホッグ
共通基準(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６)に適合しうるが、それは、ヘッジホッグの
変異型であってもよい。この用語「生物学的活性」は、ここに規定するアンタゴ
ニスト及びアゴニストを包含する。

【００３０】 用語「バイオアベイラビリティー」は、化合物の、投与後に身体により吸収さ
れる能力をいう。例えば、第一の化合物と第二の化合物の両者を等量投与した場
合に、第一の化合物が第二の化合物よりも多量に血液中に吸収されるならば、第
一の化合物は、第二の化合物よりも大きいバイオアベイラビリティーを有する。

【００３１】 ここで用いる場合、用語「共有結合された」は、この発明(例えば、免疫グロ
ブリン断片／ヘッジホッグタンパク質)の特定の部分が、互いに共有結合で直接
結合されるか、或は互いにブリッジ、スペーサー若しくは結合部分などの介在部
分を介して間接的に結合されることを意味する。この介在部分は、「カップリン
グ基」と呼ばれる。用語「結合された」は、「共有結合された」と浩瀚可能に用
いる。

【００３２】 「発現制御配列」 − 遺伝子の発現をそれらの遺伝子に機能的に結合された場
合に、制御し、調節するポリヌクレオチド配列。

【００３３】 「発現ベクター」 − 宿主細胞に導入した場合に、少なくとも一つの遺伝子の
発現を可能にするＤＮＡプラスミド又はファージなど(他の共通の例の内で)のポ
リヌクレオチド。このベクターは、細胞内で複製できてもできなくてもよい。

【００３４】 語句「細胞外シグナリングタンパク質」は、細胞から分泌され又は細胞膜に結
合しており、標的細胞上のそのタンパク質のレセプターへの結合に際してその標
的細胞における応答を開始させる任意のタンパク質を意味する。

【００３５】 この発明の薬剤の「有効量」は、処理される特定の条件につき、結果を生じ又
は作用を発揮する量である。

【００３６】 アミノ酸残基の「機能的同等物」は、(ｉ)機能的同等物により置換されたアミ
ノ酸残基と類似の反応特性を有するアミノ酸；(ii)この発明のポリペプチドのリ
ガンドのアミノ酸、機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似の特性を
有するアミノ酸；(iii)機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似の特
性を有する非アミノ酸分子である。

【００３７】 ヘッジホッグタンパク質をコードする第一のポリペプチドは、下記の条件の少
なくとも一つを満足するならば、ヘッジホッグタンパク質をコードする第二のポ
リペプチドと比較して「機能的同等物」である： (ａ)：「機能的同等物」は、第二のポリペプチドと標準的ハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズし及び／又は第一のポリヌクレオチドに対する縮重
である第一のポリヌクレオチドである。最も好ましくは、それは、ヘッジホッグ
タンパク質活性を有する変異型ヘッジホッグをコードする； (ｂ)「機能的同等物」は、第二のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸配列を発現に際してコードする第一のポリヌクレオチドである。

【００３８】 用語「ヘッジホッグ」は、ここに列記した薬剤並びにそれらの機能的同等物を
含むが、それらに限らない。それ故、ここで用いる場合、用語「機能的同等物」
は、ヘッジホッグタンパク質又はヘッジホッグタンパク質をコードするポリヌク
レオチドをいい、それは、哺乳動物レシピエントに対してヘッジホッグと同じか
又は改善された有益な効果を有する。当業者は認めるであろうが、機能的に同等
なタンパク質は、組換え技術により、例えば「機能的に同等なＤＮＡ」を発現さ
せることよって作成することができる。従って、本発明は、天然のＤＮＡにより
コードされる並びに天然のＤＮＡにコードされるのと同じタンパク質をコードす
る非天然ＤＮＡによりコードされるヘッジホッグタンパク質を包含する。ヌクレ
オチドコード配列の縮重のために、他のポリヌクレオチドを用いてヘッジホッグ
タンパク質をコードすることができる。これらは、配列内の同じアミノ酸残基を
コードする別のコドンでの置換(サイレントな変化を生じる)により変更された上
記の配列のすべて又は部分を包含する。かかる変更された配列は、これらの配列
の同等物と考えられる。例えば、Ｐｈｅ(Ｆ)は、２つのコドンＴＴＣ又はＴＴＴ
によりコードされ、Ｔｙｒ(Ｙ)は、ＴＡＣ又はＴＡＴによりコードされ、そして
Ｈｉｓ(Ｈ)は、ＣＡＣ又はＣＡＴによりコードされる。他方、Ｔｒｐ(Ｗ)は、単
一のコドンＴＧＧによりコードされる。従って、特定のヘッジホッグをコードす
る所定のＤＮＡ配列には、該ヘッジホッグをコードする多くのＤＮＡ縮重配列が
あるということは認められよう。これらの縮重ＤＮＡ配列は、この発明の範囲内
にあると考えられる。

【００３９】 「融合」は、２つ以上のタンパク質又はそれらの断片の、それらの個々のペプ
チド主鎖による共直線性の結合をいう(それらのタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド分子の遺伝子発現による)。タンパク質又はその断片が異なる起源で
あることは好ましい。従って、好適な融合タンパク質は、ヘッジホッグでない第
二の部分に共有結合されたヘッジホッグタンパク質又は断片を含む。特に、「ヘ
ッジホッグタンパク質／Ｉｇ融合物」は、この発明のヘッジホッグタンパク質又
はその断片を免疫グロブリン鎖のＮ末端に結合して含むタンパク質であり、ここ
に、その免疫グロブリンのＮ末端の一部は、ヘッジホッグタンパク質により置換
されている。

【００４０】 用語「融合物」又は「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質又はそれら
の断片の、それらの個々のペプチド主鎖による共直線性の共有結合をいい、最も
好ましくは、それらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発
現による。これらのタンパク質又はそれらの断片が異なる起源に由来するという
ことは好ましい。従って、好適な融合タンパク質は、ヘッジホッグタンパク質又
は断片をヘッジホッグタンパク質でない第二の部分に共有結合させて含む。特に
、「ヘッジホッグ／Ｉｇ融合物」は、この発明の生物学的に活性なヘッジホッグ
分子(即ち、ソニックヘッジホッグ)又は生物学的に活性なその断片を免疫グロブ
リン鎖のＮ末端に結合して含むタンパク質であり、ここに、この免疫グロブリン
のＮ末端の一部はヘッジホッグにより置換されている。ヘッジホッグ／Ｉｇ融合
物の一の種は、この発明のヘッジホッグ分子(即ち、ヘッジホッグ−)を免疫グロ
ブリンの定常ドメインの少なくとも一部に結合して含むタンパク質である「ヘッ
ジホッグ／Ｆｃ融合物」である。好適なＦｃ融合物は、この発明のヘッジホッグ
変異体を、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを含む抗体の断片に結合して含
む。用語「融合タンパク質」は又、ヘッジホッグタンパク質でない第二の部分に
モノ又はヘテロ官能性分子を介して化学的に結合された、下記のように精製タン
パク質からデ・ノボで生成されるヘッジホッグタンパク質をも意味する。

【００４１】 「異種プロモーター」は、ここで用いる場合、天然において、遺伝子又は精製
核酸と結合していないプロモーターである。

【００４２】 「相同性」は、ここで用いる場合、用語「同一性」と同義語であり、２つのポ
リペプチド分子間の又は２つの核酸の間の配列類似性をいう。２つの比較される
配列の両者のある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーで占められるならば(例
えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められ、又は２つのポ
リペプチドの各々のある位置がリジンで占められているならば)、これら各分子
は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセンテージは、それら２
つの配列に共通の一致するか又は相同な位置の数を比較される位置の数で除した
ものを１００倍したものの関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置の内
の６つが一致し又は相同であれば、これらの２つの配列は、６０％相同である。
例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％相同性を共有してい
る(６つの全位置の内の３つが一致)。一般に、比較は、２つの配列を最大の相同
性を与えるように整列させて行う。かかるアラインメントは、例えばNeedleman
等、J.Mol Biol.48:443-453(1970)の方法(以下に、一層詳細に記すように、コン
ピュータープログラムによって便利に実行される)を用いて与えることができる
。相同配列は、同一の又は類似のアミノ酸残基を共有し、ここに、類似の残基と
は、整列させた基準配列中の対応アミノ酸残基について保存的置換を受けた残基
又は該対応アミノ酸残基の「許された点突然変異体」である。この点に関して、
基準配列中の残基の「保存的置換」は、対応基準残基に物理的又は機能的に類似
する置換であり、例えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性(共有結合又
は水素結合を形成する能力を含む)などを有するものである。特に好適な保存的
置換は、Dayhoff等、5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:補遺3,
第22章:354-352, Nat.Biomed.Res.Foundation, Washington,D.C.(1978)中の「許
容される点突然変異」について規定された基準を満たすものである。

【００４３】 「相同性」及び「同一性」は、各々、２つのポリペプチド配列間の配列類似性
をいうが、同一性は一層厳格な比較である。相同性及び同一性は、比較目的で整
列させうる各配列中の一つの位置を比較することにより測定される。比較する配
列中のある位置が同じアミノ酸残基で占められていれば、それらのポリペプチド
は、その位置で同一であるということができ；相当する位置が同じアミノ酸(例
えば、同一)又は類似するアミノ酸(例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似
)で占められていれば、それらの分子は、その位置で相同であるということがで
きる。配列間の相同性又は同一性のパーセンテージは、それらの配列に共有され
る一致し又は相同な位置の数の関数である。「無関係の」又は「非相同な」配列
は、本発明のＡＲ配列と、４０パーセント未満の同一性を共有するが、好ましく
は２５パーセント未満の同一性を共有する。

【００４４】 ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴ
リズム及び／又はプログラムを利用することができる。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳ
Ｔは、ＧＣＧ配列分析パッケージ(ウィスコンシン大学、ウィスコンシン、Madis
on在)の一部として利用可能であり、例えば、デフォルトセッティングを用いて
利用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、National Center for Biotechnology
Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health
(メリーランド、Bethesda在)から入手可能である。一具体例において、２つの配
列の同一性パーセントを、ギャップウェイト１で(例えば、各アミノ酸ギャップ
を、それが２つの配列間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチであるか
のように重み付けして)ＧＣＧプログラムによって決定することができる。

【００４５】 この発明の「ヘッジホッグタンパク質」は、少なくとも図２のコンセンサスア
ミノ酸配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６)よりなる部分を有することによって定義
される。この用語は又、ヘッジホッグポリペプチド、又はヘッジホッグポリペプ
チドの機能的変異体、又はヘッジホッグポリペプチド若しくは機能的変異体の同
族体(生物学的活性を有するもの)をも意味する。

【００４６】 用語「ヘッジホッグＮ末端断片」は、「ヘッジホッグ」と交換可能に用い且つ
ヘッジホッグ前駆体からタンパク質分解によって開裂された活性な成熟配列をい
う。

【００４７】 用語「疎水性」は、無極性原子を有する化学的部分が水その他の極性原子とよ
りも互いに相互作用する傾向をいう。「疎水性」の物質は、たいてい、水に不溶
性である。疎水性を有する天然の生成物には、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィ
ンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、テルペン、プロスタグ
ランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レチノイド、ビ
オチン、及び疎水性アミノ酸例えばトリプトファン、フェニルアラニン、イソロ
イシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン及びチロシンが含まれる。化
学的部分は又、物理的特性が無極性原子の存在により測定されるならば、疎水性
でもあり又は疎水性を有する。

【００４８】 語句「内部アミノ酸」は、ペプチド配列内のＮ末端アミノ酸でもＣ末端アミノ
酸でもない任意のアミノ酸を意味する。

【００４９】 「単離された」(「実質的に純粋」と交換可能に用いる)は、ポリペプチドをコ
ードする核酸即ちポリヌクレオチド配列に適用する場合には、起源又は操作によ
り、(ｉ)天然において結合しているすべてのポリヌクレオチドと結合しておらず
(例えば、宿主細胞内に、発現ベクター又はその一部として存在し)；又は(ii)天
然において結合しているもの意外の核酸又は他の化学部分と結合しており；又は
(iii)天然に存在しないＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレ
オチドの部分、ｃＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドを意味する。「単離された」
とは、更に、(ｉ)例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によってイン・ビトロで
増幅され；(ii)化学的に合成され；(iii)クローニングにより組換えによって生
成され；又は(iv)開裂及びゲル分離により精製されたポリヌクレオチド配列を意
味する。

【００５０】 「単離された」(「実質的に純粋」と交換可能に用いる)は、ポリペプチドに適
用する場合には、その起源又は操作により、(ｉ)発現ベクターの一部の発現産物
として宿主細胞中に存在し；又は(ii)天然において結合しているもの以外のタン
パク質又は他の化学部分に結合し；又は(iii)天然に存在しないポリペプチド又
はその一部分を意味する(例えば、天然において見出されない形態になるように
少なくとも一つの疎水性部分を付加することにより化学的に操作されたタンパク
質)。「単離された」とは、更に、(ｉ)化学的に合成され；又は(ii)宿主細胞内
で発現されて、結合し及び夾雑しているタンパク質から精製されたタンパク質を
意味する。この用語は、一般に、天然において共存している他のタンパク質及び
核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドは
、それを精製するために用いた抗体又はゲルマトリクス(ポリアクリルアミド)な
どの物質からも分離される。

【００５１】 「多価タンパク質複合体」は、複数(即ち、一種以上)のヘッジホッグタンパク
質をいう。抗体同族体又は断片を、複数のヘッジホッグタンパク質の少なくとも
一つに結合させる。このヘッジホッグタンパク質又は抗体同族体若しくは断片は
、他の抗体同族体又は断片に架橋し又は結合させることができる。各タンパク質
は、同じであっても異なってもよく、各抗体同族体又は断片は、同じであっても
異なってもよい。

【００５２】 「突然変異体」 − 生物の遺伝物質の任意の変化、特に、野生型ポリヌクレオ
チド配列における任意の変化(即ち、欠失、置換、付加又は変更)又は野生型タン
パク質における任意の変化。用語「突然変異タンパク質」は、「突然変異体」と
交換可能に用いられる。

【００５３】 「Ｎ末端」は、タンパク質の成熟型の最初のアミノ酸残基(アミノ酸番号１)を
いう。

【００５４】 「Ｎ末端システイン」は、図１及び２(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６)に示
したアミノ酸番号１をいう。ヘッジホッグタンパク質のある具体例において、Ｎ
末端システインは、「改変」されている。用語「改変」は、この点に関して、Ｎ
末端システインの化学的改変例えば他の部分例えば疎水性基への結合及び／又は
Ｎ末端システインの他の部分例えば疎水性機での置換をいう。

【００５５】 「機能的に結合された」 − ポリヌクレオチド配列(ＤＮＡ、ＲＮＡ)は、発現
制御用配列がそのポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を制御し及び調節するな
らば、機能的に発現制御用配列に結合されている。用語「機能的に結合された」
は、適当な開始シグナル(例えば、ＡＴＧ)を発現すべきポリヌクレオチド配列の
前に有すること及び正しい読み枠を維持して、その発現制御用配列の制御下での
ポリヌクレオチド配列の発現及びそのポリヌクレオチド配列にコードされる所望
のポリペプチドの生成を可能にすることを包含する。

【００５６】 「タンパク質」 − 本質的に２０種類のアミノ酸の何れかからなる任意のポリ
マー。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドを参照する際
に用いられ、「ペプチド」は、しばしば、小さいポリペプチドを参照する際に用
いられるが、これらの用い方は、当分野においては、重複し、又、変化する。用
語「タンパク質」は、ここで用いる場合、別途指示しない限り、ペプチド、タン
パク質及びポリペプチドをいう。

【００５７】 用語「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ここでは、交換
可能に用いる。用語「ポリヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列」も又、
ここでは、交換可能に用いる。

【００５８】 「組換え」は、ここで用いる場合、組換え哺乳動物発現系に由来するタンパク
質を意味する。ヘッジホッグはグリコシル化されてもおらずジスルフィド結合も
含まないので、それは、殆どの原核生物及び真核生物発現系において発現させる
ことができる。

【００５９】 「スペーサー」配列は、抗体同族体又は断片により改変すべきアミノ酸とタン
パク質の残りの部分との間に挿入されうる部分をいう。スペーサーは、改変がタ
ンパク質機能を邪魔するのを阻止するように及び／又は改変が抗体同族体部分若
しくは任意の他の部分と結合するのを容易にするように、改変とタンパク質の残
りとの間の分離を与えるようにデザインする。

【００６０】 従って、「実質的に純粋な核酸」は、その核酸が由来した生物の天然のゲノム
中で通常隣接しているコード配列の一方又は両方と直接隣接しない核酸である。
実質的に純粋なＤＮＡは又、付加的ヘッジホッグ配列をコードするハイブリッド
遺伝子の部分である組換えＤＮＡをも包含する。

【００６１】 語句「表面アミノ酸」は、タンパク質が天然形態で折り畳まったときに、溶媒
にさらされている任意のアミノ酸を意味する。

【００６２】 「標準的ハイブリダイゼーション条件」 − ハイブリダイゼーションと洗浄の
両方について、０．５×ＳＳＣ〜５×ＳＳＣ及び６５℃と実質的に等しい塩及び
温度条件。それ故、用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」は、ここで用い
る場合、操作限定であり、ある範囲のハイブリダイゼーション条件を包含する。
例えば、高緊縮条件は、プラークスクリーニング緩衝液(０．２％ ポリビニルピ
ロリドン、０．２％ フィコール４００；０．２％ ウシ血清アルブミン、５０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％ ピロリン酸ナトリ
ウム；１％ ＳＤＳ)；１０％ デキストランサルフェート及び１００μｇ／ｍｌ
変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、６５℃で１２〜２０時間ハイブリダイ
ズさせ、７５ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム(０．５×ＳＳＣ)
／１％ ＳＤＳで６５℃で洗浄することを含むことができる。一層低緊縮の条件
は、例えば、プラークスクリーニング緩衝液、１０％ デキストランサルフェー
ト及び１１０μｇ／ｍｌ 変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて５５℃で１２
〜２０時間ハイブリダイズさせ、３００ｍＭ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナト
リウム(２．０×ＳＳＣ)／１％ ＳＤＳで５５℃で洗浄する。Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. New York, 第6.3.1-6.3.6
節(1989)も参照されたい。

【００６３】 「治療用組成物」は、ここで用いる場合、この発明のタンパク質と他の生物学
的に適合性の成分を含むとして定義される。この治療用組成物は、水、ミネラル
及びキャリアー例えばタンパク質などの賦形剤を含むことができる。

【００６４】 「野生型」 − イン・ビボで正常に存在する通りのタンパク質のエキソン若し
くはその一部分の天然のポリヌクレオチド配列、又はタンパク質配列若しくはそ
の部分。

【００６５】 本発明の実施は、別途指示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学及び免疫学の慣用の技術を用いる(こ
れらは、当業者の技術の内にある)。かかる技術は、文献に記載されている。別
途明記しない限り、詳細な説明において引用したすべての参考文献を、参考とし
て本明細書中に援用する。

【００６６】 ＩＩ．単離されたヘッジホッグタンパク質の一般的特性 主題のタンパク質を誘導することのできる様々な天然のヘッジホッグタンパク
質は、シグナルペプチド、高度に保存されたＮ末端領域(図１参照)及び一層分岐
したＣ末端ドメインによって特性表示される。分泌経路におけるシグナル配列開
裂(Lee,J.J.等(1992)Cell 71:33-50；Tabata,T.等(1992)Genes Dev.2633-2645；
Chang,D.E.等(1994)Development 120:3339-3353)に加えて、ヘッジホッグ前駆体
タンパク質は、天然において、Ｃ末端部分の保存された配列に依存する内部自己
タンパク質分解性の開裂を受ける(Lee等(1994)Science 266:1528-1537；Porter
等(1995)Nature 374:363-366)。この自己開裂は、１９ｋＤのＮ末端ペプチドと
２６〜２８ｋＤのＣ末端ペプチドへと導く。このＮ末端ペプチドは、それが合成
された細胞の表面にきつく結合したままでいるが、Ｃ末端ペプチドは、イン・ビ
トロでもイン・ビボでも自由に拡散することができる。Ｎ末端ペプチドの細胞表
面保持は、内部開裂の正常位置で正確に終端するＲＮＡによりコードされた、切
り詰められた形態のヘッジホッグはイン・ビトロ(Porter等(1995)前出)及びイン
・ビボ(Porter,J.A.等(1996)Cell 86,21-34)で拡散しうるので、自己開裂に依存
している。生化学的研究は、ヘッジホッグ前駆体タンパク質の自己タンパク質分
解性開裂が内部チオエステル中間体を経て進行し、その後これが親核置換により
買い列されることを示した。

【００６７】 ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物のファミリーには、少なくとも４つのメンバー
例えば単一のショウジョウバエのヘッジホッグ遺伝子(基準)のパラログが含まれ
る。これらのメンバーの内の３者を、ここでは、デザートヘッジホッグ(Ｄｈｈ)
、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)及びインディアンヘッジホッグ(Ｉｈｈ)と呼ぶ
が、これらは、明らかに、魚類、鳥類及び哺乳類を含むすべての脊椎動物に存在
している。ここではtiggie-winkleヘッジホッグ(Ｔｈｈ)と呼ぶ第４のメンバー
は、魚類に特異的であるようである。この発明の方法で用いる単離されたヘッジ
ホッグタンパク質は、天然の又は組換えのヘッジホッグファミリーのタンパク質
であり、無脊椎動物又は脊椎動物起源から得ることができる(下記を参照された
い)。脊椎動物ヘッジホッグタンパク質ファミリーのメンバーは、ショウジョウ
バエのヘッジホッグ(ｈｈ)遺伝子により個脅されるタンパク質と相同性を共有し
ている(Mohler 及び Vani,(1992)Development 115,957-971)。他のメンバーは、
まだ同定されていない。

【００６８】 マウス及びニワトリのＳｈｈ並びにマウスのＩｈｈ遺伝子(例えば、米国特許
第５，７８９，５４３号参照)は、糖タンパク質をコードしており、それらは開
裂を受けて約２０ｋＤａのアミノ末端断片と約２５ｋＤａのカルボキシ末端断片
を生成する。最も好ましい２０ｋＤａ断片は、コンセンサス配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２６を有し、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２５のアミノ酸配列を
含む。この２０ｋＤａ部分を含む様々な他の断片は、現在クレームしている発明
に入ると考えられる。これらの配列並びにそれらの化学的及び物理的特性を開示
する刊行物には、Hall等(1995)Nature 378,212-216；Ekker等(1995)Curent Biol
ogy 5,944-955；Fan等(1995)Cell 81,457-465, Chang等(1994)Development 120,
3339-3353；Echelard等(1993)Cell 75,1414-1430 34-38)；ＰＣＴ特許出願ＷＯ
９５／２３２２３(Jessel, Dodd, Roelink及びEdlund；ＰＣＴ特許公開ＷＯ９５
／１８８５６(Ingham, McMahon及びTabin)が含まれる。米国特許第５，７５９，
８１１号は、ヒトのソニックヘッジホッグをコードする完全なｍＲＮＡ配列；ヒ
トインディアンヘッジホッグｍＲＮＡの５’末端部分配列；及びヒトデザートヘ
ッジホッグｍＲＮＡの部分配列のGenbank受入番号を列記している。主題の方法
のヘッジホッグ治療用組成物は、天然タンパク質、組換えにより生成したタンパ
ク質の精製及び合成化学を含む様々な技術の何れかによって生成することができ
る。これらのポリペプチド形態のヘッジホッグ治療剤は、好ましくは、脊椎動物
ヘッジホッグタンパク質に由来し、例えば脊椎動物起源由来の天然のヘッジホッ
グタンパク質又はその断片に対応する配列を有するものである。しかしながら、
ヘッジホッグポリペプチドが、任意の後生動物起源に生じるヘッジホッグタンパ
ク質(又はその断片)に対応しうるということは明らかである。

【００６９】 脊椎動物のヘッジホッグ遺伝子ファミリーには、少なくとも４つのメンバー、
例えば単一のショウジョウバエヘッジホッグ遺伝子(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９)
のパラログが含まれる。これらのメンバーの内の３つを、ここでは、デザートヘ
ッジホッグ(Ｄｈｈ)、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)及びインディアンヘッジホ
ッグ(Ｉｈｈ)と呼ぶが、これらは、魚類、鳥類及び哺乳類を含むすべての脊椎動
物に存在する。ここでtiggie-winkleヘッジホッグ(Ｔｈｈ)と呼ぶ第４のメンバ
ーは、魚類に特異的であるようである。添付の配列表によれば(図１も参照され
たい)、ニワトリＳｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によりコード
され；マウスＤｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によりコードされ
；マウスＩｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によりコードされ；マ
ウスＳｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４によりコードされ；ゼブラ
フィッシュＳｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５によりコードされ;
ヒトＳｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６によりコードされ；ヒトＩ
ｈｈポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７によりコードされ;ヒトＤｈｈポ
リペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８によりコードされ;そしてゼブラフィッ
シュＴｈｈは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９によりコードされる。

【００７０】

【表１】

【００７１】 様々なヘッジホッグ同族体間の配列変異に加えて、これらのヘッジホッグタン
パク質は、明らかに、プロ型、完全長の天然型及びそれらの幾つかのプロセッシ
ングを受けた断片を含む多くの異なる形態で天然に存在している。プロ型は、細
胞外ドメインの方向付けられた分泌のためのＮ末端シグナルペプチドを含むが、
完全長の天然型は、このシグナル配列を欠いている。

【００７２】 上記のように、幾つかの場合には、成熟型の更なるプロセッシングが起きて、
このタンパク質の生物学的に活性な断片が生じる。例えば、ソニックヘッジホッ
グは、更なるタンパク質分解性プロセッシングを受けて約１９ｋＤａ及び２７ｋ
Ｄａの２つのペプチドを生じ、この１９ｋＤａの断片は成熟タンパク質のタンパ
ク質分解によるＮ末端部分に対応している。

【００７３】 種々のヘッジホッグ同族体間の配列変異体に加えて、これらのタンパク質は、
明らかに、プロ型、完全長の天然型、及びそれらの幾つかのプロセッシングを受
けた断片を含む多くの異なる形態で存在している。プロ型は、細胞外ドメインの
方向付けられた分泌のためのＮ末端シグナルペプチドを含むが、完全長の成熟型
は、このシグナル配列を欠いている。

【００７４】 この発明の方法で有用なファミリーメンバーには、アレル対応物、系統発生的
対応物を含む任意の天然のネイティブなヘッジホッグタンパク質又はそれらの他
の天然起源の若しくは化学的に生成された変異体(ヘッジホッグファミリーのム
テイン即ち突然変異タンパク質並びに組換え型及び新規な活性なメンバーを含む
)が含まれる。特に有用なヘッジホッグポリペプチドは、図１及び２(ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２３〜２６)の全部又は部分を含む部分を有する。

【００７５】 この発明の方法において用いられる単離されたヘッジホッグポリペプチドは、
生物学的活性を有する。これらのポリペプチドは、図１及び／又は２のアミノ酸
配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６)に少なくとも６０％、８０％、９０％、
９５％、９８％又は９９％相同なアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは又、
図１及び／又は２のアミノ酸配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６)と本質的に
同じアミノ酸配列を含むこともできる。このポリペプチドは、少なくとも、５、
１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり、図１及び／又は２から
の、少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、一層好ましくは少なくとも
２０の、最も好ましくは少なくとも５０、１００又は１５０の隣接アミノ酸を含
む。

【００７６】 この発明のポリペプチドは、同義遺伝子、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプ
ライシング事象、並びに選択的翻訳及び翻訳後事象の存在の結果として上昇する
ものを包含する。このポリペプチドは、完全に合成的手段により生成してもよい
し、又はネイティブな細胞において発現されたときに実質的に同じ翻訳後修飾を
生じる系例えば培養細胞若しくはネイティブな細胞において発現されたときに翻
訳後修飾の省略を生じる系において発現させてもよい。

【００７７】 一具体例において、単離されたヘッジホッグは、下記の特徴の少なくとも一つ
を有するヘッジホッグポリペプチドである： (ｉ)それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６のアミノ酸と少なくとも３０、
４０、４２、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％の配列同一性を有する； (ii)それは、Ｎ末端としてシステイン又は機能的同等物を有する; (iii)それは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、アルカリホスファターゼ活
性を誘導することができる； (iv)それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６のポリペプチドと、少なくとも
５０％の、好ましくは少なくとも６０％の、一層好ましくは、少なくとも７０、
８０、９０又は９５％の全体的配列同一性を有する； (ｖ)それは、哺乳動物細胞などの天然起源から単離することができる; (vi)それは、パッチトと結合し又は相互作用することができる；そして (vii)それは、少なくとも一つのアミノ酸残基において、適宜、該アミノ酸残
基へのリンカー分子を介して、該残基に結合したポリアルキレングリコールポリ
マーにより修飾されている。

【００７８】 好適な核酸は、図１及び２よりなる群(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６)から
選択するアミノ酸配列と少なくとも６０％相同又は同一の、一層好ましくは７０
％相同又は同一の、最も好ましくは８０％相同又は同一のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６の一つに表されたア
ミノ酸配列と少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも約９５％、最も好
ましくは少なくとも約９８〜９９％相同又は同一のポリペプチドをコードする核
酸も又、この発明の範囲内にある。

【００７９】 他の具体例において、このヘッジホッグタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１〜９又は１９の少なくとも一つに表されたヘッジホッグコード配列と緊縮条件
下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされうるポリペプチドで
ある。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させる適当な緊縮条件は、例えば、
６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)(約４５℃)とそれに続く
２．０×ＳＳＣ(５０℃)での洗浄であり、これは、当業者に公知であって、Curr
ent Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y.(1989),6.3.1
-6.3.6中に見出すことができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、約２
．０×ＳＳＣ(５０℃)の低緊縮から約０．２×ＳＳＣ(５０℃)の高緊縮までから
選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温(約２２℃)
の低緊縮条件から約６５℃の高緊縮条件まで増大させることができる。

【００８０】 好適な核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１４よりなる群から選択するアミノ
酸配列と少なくとも６０％相同の、一層好ましくは７０％相同の、最も好ましく
は８０％相同のアミノ酸配列を含むヘッジホッグポリペプチドをコードするもの
である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０〜１８又は２０の一つに表されたアミノ酸配
列と少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは
少なくとも約９８〜９９％相同のポリペプチドをコードする核酸も又、この発明
の範囲内にある。

【００８１】 本発明に好適なヘッジホッグポリペプチドは、天然のヘッジホッグタンパク質
に加えて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０〜１８又は２０の何れかにより表されるア
ミノ酸配列と少なくとも６０％相同の、一層好ましくは７０％相同の、最も好ま
しくは８０％相同のものである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０〜１８又は２０より
なる群から選択する配列と少なくとも９０％、一層好ましくは少なくとも９５％
、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％相同なポリペプチドも又、この発明
の範囲内にある。

【００８２】 ヘッジホッグポリペプチドの断片に関して、好適なヘッジホッグ部分は、ヘッ
ジホッグポリペプチドの少なくとも５０アミノ酸残基、一層好ましくは少なくと
も１００、尚一層好ましくは少なくとも１５０アミノ酸残基を含む。

【００８３】 ヘッジホッグ治療剤に含有させることのできる他の好適なヘッジホッグポリペ
プチドは、約１９ｋＤａの分子量を有する成熟タンパク質のＮ末端断片である。

【００８４】 好適なヒトのヘッジホッグタンパク質には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の残基
２４〜１９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の２８〜２０２、及びＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１７の２３〜１９８にほぼ対応するＮ末端断片が含まれる。「ほぼ対応す
る」とは、関心ある配列が基準配列と最大で２０アミノ酸残基長異なることを意
味するが、一層好ましくは最大で５、１０又は１５アミノ酸長異なる。

【００８５】 更に別の好適なヘッジホッグポリペプチドには、式Ａ−Ｂにより表されるアミ
ノ酸配列が含まれる{式中、(ｉ)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の残基１〜１
６８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の残基１〜１６７により示されるアミノ酸配
列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の残基１６９〜
２２１により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を表し；(i
i)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の残基２４〜１９３により示されるアミノ酸
配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の残基１９４
〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を表し；
(iii)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の残基２５〜１９３により示されるアミ
ノ酸配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の残基１
９４〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を表
し；(iv)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基２３〜１９３により示されるア
ミノ酸配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基
１９４〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を
表し；(ｖ)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基２８〜１９７により示される
アミノ酸配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残
基１９８〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基
を表し；(vi)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の残基２９〜１９７により示され
るアミノ酸配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の
残基１９８〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残
基を表し；(vii)Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の残基２３〜１９３により示
されるアミノ酸配列の全部又は部分を表し；且つＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
７の残基１９７〜２５０により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ
酸残基を表す}。ある好適な具体例において、Ａ及びＢは、示された配列一緒に
隣接するポリペプチド配列を表し、Ａは、示された配列の少なくとも２５、５０
、７５、１００又は１５０アミノ酸を表し、Ｂは、配列表中の対応項目により示
されたアミノ酸配列の少なくとも５、１０又は２０アミノ酸残基を表し、そして
Ａ及びＢは、一緒に、好ましくは配列表の項目に対応する隣接配列を表す。他の
ヘッジホッグに由来する類似の断片例えば、上に列記した配列表の項目に由来す
る好適な断片に対応する断片も又、企図される。

【００８６】 一般に、この発明の好適な結合体化ヘッジホッグタンパク質の構造は、一般式
：Ｘ−Ｙ−Ｚを有する(式中、Ｘは、ヘッジホッグのアミノ酸配列よりなるアミ
ノ酸配列又はその部分を有するポリペプチドであり；Ｙは、付加的リンカー部分
であり；Ｚは、ヘッジホッグ以外のポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリ
ペプチドである)。好ましくは、Ｘは、ヒトのソニック、インディアン又はデザ
ートヘッジホッグである。好適具体例において、Ｚは、免疫グロブリンの定常領
域の少なくとも一部分であり、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥから
選択するクラスの免疫グロブリンから誘導することができる。もしこのクラスが
ＩｇＧであるならば、それは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の一
つから選択される。ヒトのＩｇＭ及びＩｇＥの定常領域は、４つの定常領域(Ｃ
Ｈ１、(ヒンジ)、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４)を含むが、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ
及びＩｇＤの定常領域は、３つの定常領域(ＣＨ１、(ヒンジ)、ＣＨ２及びＣＨ
３)を含む。この発明の最も好適な融合タンパク質において、定常領域は、少な
くともヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。

【００８７】 他の具体例Ａ−[Ｓｐ]−Ｂ−[Ｓｐ]−Ｘ{式中、Ａは、非ヘッジホッグ部分例
えば免疫グロブリン又はその断片であり；[Ｓｐ]は、随意のスペーサーペプチド
配列であり；Ｂは、ヘッジホッグタンパク質であり(適宜、ここに記載のような
ムテインであってよい);そしてＸは、ヘッジホッグタンパク質Ｂ又は他の残基例
えばタンパク質の表面部位に(適宜、スペーサーペプチドにより)結合された随意
の疎水性部分である}。

【００８８】 ＩＩＩ．組換えポリペプチドの生成 ここに記載の単離されたヘッジホッグポリペプチドは、当分野で公知の任意の
適当な方法によって生成することができる。かかる方法は、直接的タンパク質合
成法から単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築してそれら
の配列を適当なトランスフォームされた宿主中で発現させることまで及ぶ。

【００８９】 組換え法の一具体例においては、ＤＮＡ配列を、関心ある野生型タンパク質を
コードするＤＮＡ配列を単離し又は合成することにより構築する。適宜、この配
列を、部位特異的突然変異誘発により変異させて、その機能的類似体を与えるこ
とができる。例えば、米国特許第４，５８８，５８５号を参照されたい。関心あ
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築する他の方法は、オリゴヌクレオ
チドシンセサイザーを用いる化学合成によるものである。かかるオリゴヌクレオ
チドは、好ましくは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてデザインす
ることができ、好ましくは、関心ある組換えポリペプチドが生成される宿主細胞
中で優先されるコドンを選択する。

【００９０】 標準的方法を適用して、単離された関心あるポリペプチドをコードする単離さ
れたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配
列を用いて、逆翻訳遺伝子を構築することができる。Maniatis等、前出を参照さ
れたい。更に、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの
部分をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成して連結することが
できる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補性によるアセンブリの
ための５’又は３’オーバーハングを含んでいる。

【００９１】 一度アセンブルされれば(合成、部位指定突然変異により、又は他の方法によ
り)、関心ある特定の単離されたポリペプチドをコードする変異型ＤＮＡ配列は
、発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現
制御配列に機能的に結合される。適当なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、
制限酵素マッピング及び生物学的に活性なポリペプチドの適当な宿主での発現に
より確認することができる。当分野で周知のように、トランスフェクトされた遺
伝子の宿主における高い発現レベルを得るためには、その遺伝子を、選択した発
現用宿主において機能的である転写及び翻訳発現制御用配列に機能的に結合しな
ければならない。

【００９２】 発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。様々な発現
用宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核生物宿主用の有用な発現
ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及
びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿
主用の有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド例えば大腸菌由来のプラ
スミド(ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体を含む)、広宿主
域プラスミド例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが含まれる。好適な
大腸菌ベクターには、ラムダファージｐＬプロモーターを含むｐＬベクター(米
国特許第４，８７４，７０２号)、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含むｐＥＴ
ベクター(Studier等、Methods in Enzymology 185:60-89,1990 １)及びｐＳＰ７
２ベクター(Kaelin等、前出)が含まれる。酵母細胞用の有用な発現ベクターには
、例えば、２Ｔ及びセントロメアプラスミドが含まれる。各々の特定の発現ベク
ター内で、これらのＤＮＡ配列の挿入のために様々な部位を選択することができ
る。これらの部位は、通常、それらを切断する制限エンドヌクレアーゼによって
示される。この発明で有用な所定の発現ベクターは、選択したＤＮＡ断片の挿入
のために制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要がないということは認められ
よう。それよりも、このベクターは、その断片と別の手段によって結合されうる
。

【００９３】 発現ベクター、並びに選択したＤＮＡ断片の挿入及び発現制御配列への機能的
結合のために選択する部位は、特定の制限酵素に感受性の部位の数、ポリぺプチ
ドの大きさ、ポリペプチドがどれくらい容易にタンパク質分解によって分解され
るかなどの様々な因子によって決定される。所定のＤＮＡについてのベクター及
び挿入部位の選択は、これらの因子のバランスにより決定される。

【００９４】 この発明の組換え構築物の十分な転写を与えるためには、好ましくは、適当な
プロモーター／エンハンサー配列を組換えベクターに組み込むことができる(但
し、このプロモーター／発現制御配列は、ヘッジホッグタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列の転写を駆動することができるものである)。様々な発現制御
配列の何れかをこれらのベクター中で利用することができる。かかる有用な発現
制御配列には、前述の発現ベクターの構造遺伝子と結合された発現制御配列が含
まれる。有用な発現制御配列の例には、例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの
初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲ
Ｃシステム、ラムダファージの主オペレーター及びプロモーター領域例えばｐＬ
、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼその他の
糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター例えばＰｈｏ５
、酵母のアルファ交配系のプロモーター及び他の真核又は原核細胞及びこれらの
ウイルスの遺伝子の発現を制御するための配列並びにこれらの様々な組合せが含
まれる。

【００９５】 免疫グロブリンベースの融合タンパク質の発現を制御するために利用すること
のできるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Benoist及びChambo
n, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリ
ピートに含まれるプロモーター(Yamamoto等、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーター(Wagner等、1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78
:144-1445)、メタロチオネイン遺伝子(Brinster等、1982, Natutre 296:39-42)
；ノパリン合成プロモーター領域(Herrera-Estrella等、Nature 303:290-213)又
はカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター(Gardner等、1981,
Nucl.Acids Res.9:2871)を含む植物発現ベクターの調節配列、及び光合成酵素リ
ブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella等、1984,
Nature 310:115-120)；酵母その他の真菌類由来のプロモーターエレメント例え
ばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣプロモーター(アルコールデヒドロゲナーゼ)、
ＰＧＫ(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプ
ロモーター及び下記の動物の転写制御用領域(これらは、組織特異性を示し、ト
ランスジェニック動物で利用されている)：膵臓細胞で活性なエラスターゼＩ遺
伝子制御領域(Swift等、1984, Cell 38:639-646；Ornitz等、1986, Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-51
5)；膵臓細胞で活性なインスリン遺伝子エンハンサー又はプロモーター(Hanahan
, 1985, Nature 315:115-122)；リンパ様細胞において活性な免疫グロブリン遺
伝子エンハンサー又はプロモーター(Grosschedl等、1984, Cell 38:647-658；Ad
ames等、1985, Nature 318:533-538；Alexander等、1987, Mol.Cell.Biol.7:143
6-1444)；サイトメガロウイルス初期プロモーター及びエンハンサー領域(Boshar
t等、1985, Cell 41:521-530);精巣、乳房、リンパ様細胞及びマスト細胞におい
て活性なマウス乳癌ウイルス制御領域(Leder等、1986, Cell 45:485-495)；肝臓
で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert等、1987, Genes and Devel.1:268-
276)；肝臓で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf等、198
5, Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等、1987, Science 235:53-58)；肝臓で
活性なアルファアンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey等、1987, Genes and D
evel.1:161-171)；骨髄性細胞で活性なグロビン遺伝子制御領域(Mogram等、1985
, Nature 315:338-340；Kollias等、1986, Cell 46:89-94)；脳の乏突起神経膠
細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead等、1987, Cel
l 48:703-712)；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Sani, 1985,
Nature 314:283-286)；及び視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺
伝子制御領域(Mason等、1986, Science 234:1372-1378)が含まれるが、これらに
限らない。

【００９６】 細菌、真菌類(酵母を含む)、植物、昆虫、哺乳類その他の適当な動物細胞又は
細胞株並びにトランスジェニック動物又は植物を含む任意の適当な宿主を用いて
、ここに記載の単離されたヘッジホッグポリペプチドを生成することができる。
一層詳細には、これらの宿主は、周知の真核及び原核生物宿主例えば大腸菌、シ
ュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、カビ、酵母(例えば、Hansenula)
、昆虫細胞例えばSpodoptera frugiperda(ＳＦ９)及びＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ(商標)
(実施例１参照)、動物細胞例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、マウス
細胞例えばＮＳ／Ｏ細胞、アフリカミドリザル細胞ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ
１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０及びヒト細胞並びに植物細胞株を包含することが
できる。

【００９７】 すべてのベクター及び発現制御配列が、所定の単離されたポリペプチドを発現
させるために等しく十分に機能する訳ではないということは理解されるべきであ
る。同じ発現系を用いても、すべての宿主が等しく十分に機能する訳ではない。
しかしながら、当業者は、これらのベクター、発現制御システム及び宿主の内か
ら、過度の実験をすることなく選択することができる。例えば、関心ある単離さ
れたポリペプチドを、大規模な動物培養で生成するためには、発現ベクターのコ
ピー数を制御しなければならない。増幅可能なベクターは、当分野で周知である
。例えば、Kaufman及びSharp,(1982)Mol.Cell.Biol.,2,1304-1319及び米国特許
第４，４７０，４６１号及び５，１２２，４６４号を参照されたい。

【００９８】 かかるＤＮＡ配列の発現制御配列への機能的結合には、そのＤＮＡ配列の上流
の正しいリーディングフレームにおける翻訳開始シグナルの供給が含まれる。も
し発現される特定のＤＮＡ配列がメチオニンで始まるのでないならば、この開始
シグナルが、生成物のＮ末端に位置される追加のアミノ酸(メチオニン)を生じる
であろう。もし疎水性部分がＮ末端メチオニル含有タンパク質に結合されるべき
であれば、そのタンパク質を直接この発明の組成物において用いることができる
。それにもかかわらず、このタンパク質の好適なＮ末端はシステイン(又は機能
的同等物)からなるべきであるので、メチオニンは、使用前に除去されなければ
ならない。かかるＮ末端メチオニンをそれらにより発現されたポリペプチドから
除去するための方法は、当分野において利用可能である。例えば、ある宿主及び
発酵条件は、実質的にすべてのＮ末端メチオニンをイン・ビボで除去することを
可能にする。他の宿主は、Ｎ末端メチオニンのイン・ビトロでの除去を必要とす
る。かかるイン・ビトロ及びイン・ビボでの方法は、当分野で周知である。

【００９９】 これらのポリヌクレオチド構築物の所定の発現ベクター中への上首尾の組み込
みは、次の３つの一般的なアプローチにより同定することができる：(ａ)ＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリダイゼーション、(ｂ)「マーカー」遺伝子機能の存否、及び(
ｃ)挿入した配列の発現。第一のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入した
ヘッジホッグ遺伝子の存在を、挿入した融合タンパク質遺伝子と相同な配列を含
むプローブを用いるＤＮＡ―ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出すること
ができる。第二のアプローチにおいては、組換えベクター／宿主系を、外来遺伝
子のベクター中への挿入により引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能
(例えば、チミジンキナーゼ活性、Ｇ４１８などの抗生物質に対する耐性、トラ
ンスフォーメーション表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体の形成)の存否
に基づいて同定して選択することができる。例えば、もしポリヌクレオチドがこ
のベクターのマーカー遺伝子配列を分断するように挿入されれば、その挿入を含
む組換え体は、そのマーカー遺伝子機能の非存在によって同定することができる
。第三のアプローチにおいては、組換え発現ベクターを、その組換えベクターに
より発現された外来遺伝子産物をアッセイすることにより同定することができる
。かかるアッセイは、例えば、バイオアッセイ系における遺伝子産物の物理的又
は機能的特性に基づくものであってよい。

【０１００】 この発明の好適具体例は、融合タンパク質及びそれらをコードするＤＮＡ配列
を企図する。これらの融合タンパク質は、ヘッジホッグのアミノ酸配列により特
徴付けられるアミノ末端領域とヘッジホッグ以外のタンパク質のドメインを含む
カルボキシ末端領域を有する。かかるタンパク質の好適な包括的な式は、一次ア
ミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｚを有するタンパク質である(式中、Ｘは、ヒトのヘッジホ
ッグのアミノ酸配列よりなるアミノ酸配列又はその部分を有するポリペプチドで
あり；Ｙは、随意的リンカー部分であり；そしてＺは、ヒトヘッジホッグ以外の
ポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチドである)。

【０１０１】 Ｚ部分は、例えば、免疫グロブリンの複数のヒスチジン残基又はＦｃ領域を含
むことができ、ここで抗体の断片として規定される「Ｆｃ」は、免疫グロブリン
重鎖のＣ末端ドメインを含む。

【０１０２】 最も好適な融合タンパク質において、ヘッジホッグポリペプチドは、免疫グロ
ブリンのＦｃ領域の少なくとも一部分に融合される。このヘッジホッグはアミノ
末端部分を形成し、Ｆｃ領域はカルボキシ末端部分を形成する。これらの融合タ
ンパク質において、Ｆｃ領域は、好ましくは、定常ドメインヒンジ領域及びＣＨ
２及びＣＨ３ドメインに限られる。これらの融合物中のＦｃ領域は、ヒンジ領域
(この領域は、分子間ジスルフィドブリッジを形成することができる)の一部分、
及びＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はそれらの機能的同等物を形成することができ
る。これらの定常領域は、任意の哺乳動物起源(好ましくはヒト)から誘導するこ
とができ、任意の適当なクラス及び／又はイソ型(ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＥ及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４)から誘導することができ
る。

【０１０３】 Ｉｇ融合物をコードする組換え核酸分子は、当分野で公知の任意の方法(Mania
tis等、1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)によって得ることができ、又は一般に
入手可能なクローンから得ることができる。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖定常
領域をコードする遺伝子の調製方法は、例えば、Robinson,R.等、ＰＣＴ出願、
公開Ｎｏ．ＷＯ８７−０２６７１により教示されている。ヘッジホッグ分子又は
断片をコードするｃＤＮＡ配列を、Ｉｇ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡに直
接又はリンカー配列を介して結合させることができる。この発明の更なる具体例
において、組換えベクターシステムを造って、ヘッジホッグをコードする配列を
合成ヒンジ領域と正しいリーディングフレームで収容することができる。加えて
、ＲＮＡ開裂／ポリアデニル化部位及び下流の配列を含む免疫グロブリン遺伝子
の３’フランキング領域に対応する核酸をこの組換えベクターシステムの部分と
して含むことは望ましいであろう。その上、免疫グロブリン融合タンパク質をコ
ードする配列の上流にシグナル配列を工作して、この組換えベクターでトランス
フォームした細胞からの融合分子の分泌を容易にすることは望ましいであろう。

【０１０４】 本発明は、二量体の融合分子並びに融合分子を含む単量体又は多量体分子を提
供する。かかる多量体は、ＩｇＭ五量体又はＩｇＡ二量体のように通常多価であ
るＩｇ分子のＦｃ領域又はその部分を用いることにより生成することができる。
ＩｇＭ五量体及びＩｇＡ二量体を形成して安定化させるにはＪ鎖ポリペプチドが
必要であろうことは理解される。或は、ヘッジホッグ融合タンパク質の多量体は
、Ｉｇ分子のＦｃ領域に対する親和性を有するタンパク質例えばプロテインＡを
用いて形成することができる。例えば、複数のヘッジホッグ／免疫グロブリン融
合タンパク質をプロテインＡ−アガロースビーズに結合させることができる。

【０１０５】 これらの多価形態は、それらが多数のヘッジホッグレセプター結合部位を有す
るので有用である。例えば、二価の可溶性ヘッジホッグは、リンカー領域(Ｙ部
分)により分離されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸(又は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６の核酸によりコードされるもの)(包括的な式におけるＸ部分)の２つ
の直列反復からなってよく、これらの反復が免疫グロブリン定常ドメインの少な
くとも一部分(Ｚ部分)に結合されている。別の多価形態は、例えば、ヘッジホッ
グ−／Ｉｇ融合物を任意の臨床的に許容しうるキャリアー分子(フィコール、ポ
リエチレングリコール又はデキストランよりなる群から選択するポリマー)に慣
用のカップリング技術を用いて化学結合させることによって構築してもよい。或
は、ヘッジホッグをビオチンに化学結合させ、次いで、そのビオチン−ヘッジホ
ッグＦｃ結合体をアビジンに結合させて、四価のアビジン／ビオチン／ヘッジホ
ッグ分子を生成することができる。ヘッジホッグ／Ｉｇ融合物をジニトロフェノ
ール(ＤＮＰ)又はトリニトロフェノール(ＴＮＰ)に共有結合させ、生成した結合
体を抗ＤＮＰ又は抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈降させて、ヘッジホッグレセプター結合
部位について１０の結合価を有する十量体の結合体を形成することもできる。

【０１０６】 トランスフォームされた宿主により生成されたタンパク質は、任意の適当な方
法によって精製することができる。かかる標準的方法には、クロマトグラフィー
(例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングクロマトグラフィー)、
遠心分離、示差的溶解度、又はタンパク質精製のための任意の他の標準的技術が
含まれる。イムノアフィニティークロマトグラフィー(実施例１参照)のために、
ソニックヘッジホッグなどのタンパク質は、それを、ソニックヘッジホッグ又は
関連タンパク質に対して高めて固定支持体に付着させた抗体より構成されるアフ
ィニティーカラムに結合させることにより単離することができる。例えば、これ
らのヘッジホッグタンパク質及び断片は、その溶液を、ヘッジホッグレセプター
を固定化して有するカラムを通すことにより精製することができる(米国特許第
４，７２５，６６９号)。結合したヘッジホッグ分子を、次いで、カオトロピッ
ク塩で処理するか水性酢酸での溶出により溶出させることができる。免疫グロブ
リン融合タンパク質を、その融合タンパク質を含む溶液を、その融合タンパク質
のＦｃ部分に選択的に結合する固定化プロテインＡ又はプロテインＧを含むカラ
ムを通すことにより精製することができる。例えば、Reis,K.J.等、J.Immunol.1
32:3098-3102(1984)；ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ８７／００３２９を参照された
い。次いで、キメラ抗体を、カオトロピック塩で処理することにより又は水性酢
酸での溶出により溶出させることができる。或は、ヘッジホッグタンパク質と免
疫グロブリンの融合分子を、抗ヘッジホッグ抗体カラム上で又は抗免疫グロブリ
ン抗体カラム上で精製して実質的に純粋なタンパク質を与えることができる。用
語「実質的に純粋な」は、タンパク質が天然において結合している不純物を含ま
ないことを意図している。実質的純粋は、電気泳動による単一バンドにより示す
ことができる。或は、アフィニティータグ例えばヘキサヒスチジン、マルトース
結合ドメイン、インフルエンザコート配列、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼをこのタンパク質に付着させて、適当なアフィニティーカラムを通過さ
せることによる容易な精製を可能にすることができる。単離されたタンパク質は
又、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶構造解析などの技術を用いて物理
的に特性決定することもできる。

【０１０７】 この発明の有用なヘッジホッグ／Ｉｇ融合タンパク質の例は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８３のものであり、これは、発現プラスミドＰＵＢ１１６を含む真核細胞
によって細胞培養物中に分泌される(実施例参照)。このタンパク質は、マウスの
Ｉｇのヒンジ領域並びにＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインの一部分と融合された成
熟ヒトヘッジホッグよりなる。これは、Ｆｃ結合タンパク質、プロテインＡによ
り認識されるのに十分なマウス免疫グロブリンの部分を含んでいる。

【０１０８】 ヒトヘッジホッグを組み込んだこの発明の他の融合タンパク質を、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：８０〜８２に示してある。

【０１０９】 この発明の好適なヘッジホッグタンパク質は、１１のトリプレットコドンを両
側に表す新規な「ジャンクション」ＤＮＡ配列を、ヘッジホッグＤＮＡと非ヘッ
ジホッグ部分をコードするＤＮＡとの間に含む。

【０１１０】 このＤＮＡ「ジャンクション」配列は、ＤＮＡプローブとして用いることがで
き、任意のヘッジホッグ−／Ｉｇ融合タンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列
への標準的条件下でのハイブリダイゼーションに必要な最小ＤＮＡであってよい
。それにもかかわらず、全プローブがこのジャンクションの両側にハイブリダイ
ズし且つヘッジホッグ／定常領域ジャンクションの両側がハイブリダイゼーショ
ンに参加するならば、一層小さい配列が存在しうる。更に、当業者は、これらよ
り大きいＤＮＡ配列もハイブリダイゼーションに適しているということを理解す
るであろう。当業者は、特定のプローブがこのジャンクションの両側にハイブリ
ダイズすることができるかどうかを、一本鎖センスオリゴヌクレオチド又は一本
鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端をポリヌクレオチドキナーゼを用
いてＡＴＰの適当に標識したホスフェートで標識することにより試験することが
できる。この発明の配列は、両オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし
、それ故、それらによって標識されるに違いない。更に、この発明は、ジャンク
ション配列をコードする完全に縮重した配列を包含するということは、理解され
る。

【０１１１】 最も好適なヘッジホッグ融合タンパク質は、推定のＫＥＸ２認識部位に変異を
含んでいる(表５参照)。

【０１１２】 Ａ．断片及び類似体の生成 単離されたタンパク質の断片(例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６の断
片)は、当業者に公知の方法を用いる組換え法により、タンパク質分解性消化に
より、又は化学合成によって効率的に生成することもできる。組換え法において
は、ポリペプチドの内部又は末端断片を、単離されたヘッジホッグポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列の一端(末端断片の場合)又は両端(内部断片の場合)から
少なくとも一つのヌクレオチドを除去することにより生成することができる。突
然変異したＤＮＡの発現は、ポリペプチド断片を生成する。「末端を切り取る」
エンドヌクレアーゼによる消化も、断片の配列をコードするＤＮＡを生成するこ
とができる。タンパク質の断片をコードするＤＮＡは又、ランダムシェアリング
、制限消化、又は組合せ若しくは両方によって生成することもできる。タンパク
質断片は、無傷のタンパク質から直接生成することができる。ペプチドは、プラ
スミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンを含むタンパ
ク質分解酵素(これらに限らない)によって特異的に開裂させることができる。こ
れらの酵素の各々は、それが攻撃するペプチド結合の種類に関して特異的である
。トリプシンは、カルボキシル基が塩基性アミノ酸(通常、アルギニン又はリジ
ン)に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシン及びキモトリプシ
ンは、芳香族アミノ酸例えばトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンに
由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。タンパク質分解酵素に感受性の部
位の開裂を阻害することによって、開裂タンパク質断片の別のセットが生成され
る。例えば、リジンのε−アミノ酸基のエチルトリフルオロチオアセテートとの
弱塩基性の溶液における反応は、隣接ペプチド結合がもはやトリプシンによる加
水分解に感受性でないブロックされたアミノ酸残基を生じる。タンパク質を改変
して、タンパク質分解酵素に感受性のペプチド結合を造ることができる。例えば
、システイン残基のβ−ハロエチルアミンによるアルキル化は、トリプシンによ
って加水分解されるペプチド結合を生じる(Lindley,(1956)Nature 178,647)。加
えて、ペプチド鎖を特異的残基で開裂させる化学試薬を利用することができる。
例えば、シアノゲンブロミドは、ペプチドをメチオニン残基で開裂させる(Gross
及びWitkip,(1961)J.Am.Chem.Soc.83,1510)。こうして、タンパク質を改質剤、
タンパク質分解酵素及び／又は化学剤の様々な組合せによって処理することによ
り、それらのタンパク質を、所望の長さの重複しない断片又は所望の長さの重複
する断片に分割することができる。

【０１１３】 断片は又、当業者に公知の技術、例えばメリフィールド固相Ｆｍｏｃ又はｔ−
Ｂｏｃ化学を用いて化学合成することもできる。Merrifield, Recent Progress
in Hormone Research 23:451(1967)

【０１１４】 断片及び類似体の生成及び試験を可能にする従来技術の方法の例を、以下で議
論する。これら(又は類似の方法)を用いて、生物学的活性を有することを示しう
る単離されたポリペプチド(例えば、ヘッジホッグ)の断片及び類似体を作成して
スクリーニングすることができる。ヘッジホッグの断片及び類似体が生物学的活
性を有するかどうかを試験する典型的な方法は、実施例３において見出される。

【０１１５】 Ｂ．変化されたＤＮＡ及びペプチド配列の生成：ランダム法 タンパク質のアミノ酸配列変異体を、そのタンパク質又はその特定の部分をコ
ードするＤＮＡのランダム突然変異導入法によって調製することができる。有用
な方法には、ＰＣＲ突然変異導入法及び飽和突然変異導入法が含まれる。ランダ
ムアミノ酸配列変異体のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド配列のセット
の合成により生成することもできる。所定のタンパク質のアミノ酸配列変異体を
変化させたＤＮＡ及びペプチドを用いて生成する方法は、当分野で周知である。
かかる方法の下記の例は、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく
、単に代表的な技術を説明する働きをするだけである。当業者は、この点におい
て他の方法も有用であることを認めるであろう。ＰＣＲ突然変異導入法 ：例えば、Leung等、(1989)Technique 1,11-15参照。飽和突然変異導入法 ：他の方法は、一般に、Mayers等、(1989)Science 229,242
に記載されている。縮重オリゴヌクレオチド突然変異導入法 ：例えば、Harang,S.A.(1983)Tetrahedr
on 39,3；Itakura等(1984)Ann.Rev.Biochem.53,323及びItakura等、Recombinant
DNA, Proc.3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, p.273-289(A.G.Walt
on編), Elsevier, Amsterdam, 1981参照。

【０１１６】 Ｃ．変化されたＤＮＡ及びペプチド配列の生成：指定法 非ランダムな又は指定された突然変異導入法は、単離されたポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列の特異的部分に特異的な配列又は突然変異を与えて
、単離されたポリペプチドの公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入又は置換を
含む変異体を与える。これらの突然変異部位は、例えば、(１)先ず保存的アミノ
酸で置換し次いで達成された結果に依って一層過激な選択物により置換し；(２)
標的残基を欠失させ；又は(３)設定部位の隣に同じ若しくは異なるクラスの残基
を挿入することにより、或は選択肢１〜３の組合せよって個別に又はシリーズで
改変することができる。

【０１１７】 明らかに、かかる位置指定法は、Ｎ末端システイン(又は機能的同等物)を所定
ポリペプチド配列に導入して、疎水性部分のための結合部位を与える一つの方法
である。アラニンスキャニング突然変異導入法 ：Cunningham及びWells,(1989)Science 24
4,1081-1085参照。オリゴヌクレオチド媒介突然変異導入法 ：例えば、Adelman等(1983)DNA 2,183参
照。我々は、機能的アンタゴニストを、Ｎ末端システインの他のアミノ酸残基(
好ましくはセリン残基)への突然変異を有する機能的アンタゴニストをコードす
る単離されたＤＮＡ配列を処理することによりオリゴヌクレオチド指定突然変異
導入法を用いて造った(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：実施例７)。カセット突然変異導入法 ：Wells等(1985)Gene 34,315参照。コンビナトリアル突然変異導入法 ：例えば、Ladner等、ＷＯ８８／０６６３０参
照。

【０１１８】 Ｄ．単離されたポリペプチドの他の変異体 この発明に含まれるのは、単離された分子であり、それは、アレル変異体、天然
の変異体、誘導された変異体、及び高緊縮又は低緊縮条件下でソニックヘッジホ
ッグのＮ末端断片(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４)及びヘッジホッグペプチドに対す
る抗血清により特異的に結合され、特にヘッジホッグの活性部位又は結合部位に
対する抗血清により特異的に結合されるポリペプチドなどのポリペプチドをコー
ドする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質である。
すべてのここに記載の変異体は、(ｉ)元のタンパク質の生物学的機能を保持し且
つ(ii)少なくとも一つの非ヘッジホッグ部分(例えば、Iｇ)に結合する能力を保
持していることが予想される。

【０１１９】 この発明の方法は又、ヘッジホッグなどの単離されたペプチドの断片好ましく
は生物学的に活性な断片の利用をも特徴とする。特に、生物学的に活性な断片又
は類似体は、SEQ ID NO:１０〜２０若しくは２３〜２６に示したペプチド又は他
の天然の単離されたヘッジホッグに特徴的な任意のイン・ビボ又はイン・ビトロ
活性を有するものである。最も好ましくは、疎水性に改変された断片又は類似体
は、任意のイン・ビボ又はイン・ビトロアッセイにおいて、ソニックヘッジホッ
グの活性の少なくとも１０％、好ましくは４０％以上、最も好ましくは少なくと
も９０％を有する。

【０１２０】 類似体は、天然の単離されたタンパク質とアミノ酸配列において若しくは配列
に関与しない仕方で又は両方で異なっていてよい。この発明の最も好適なポリペ
プチドは、好適な配列以外の改変を有し、それは、イン・ビボ又はイン・ビトロ
の化学的誘導体化(例えば、Ｎ末端の)並びにアシル化、メチル化、リン酸化、ア
ミド化、カルボキシル化又はグリコシル化における可能な変化を含む。

【０１２１】 他の類似体は、タンパク質例えばソニックヘッジホッグ又はその生物学的に活
性な断片であって、その配列が、単離されたタンパク質の生物学的活性を完全に
破壊しない少なくなくとも一つの保存的アミノ酸置換又は少なくとも一つの非保
存的アミノ酸置換により、又は欠失若しくは挿入によって、野生型コンセンサス
配列(例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６)と異なっているものを包含する。保存
的置換は、典型的には、一つのアミノ酸を他の類似した特徴を有するアミノ酸で
置換すること例えば次のグループ内での置換を含む：バリン、アラニン及びグリ
シン;ロイシン及びイソロイシン;アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギ
ン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェ
ニルアラニン及びチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチ
オニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、シ
ステイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に帯電してい
る(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に
帯電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。他
の保存的置換は、当業者は、容易に知ることができる。例えば、アミノ酸アラニ
ンについては、保存的置換を、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−シ
ステイン及びＤ−システインの何れか一つから取ることができる。リジンについ
ては、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、
メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、又はＤ−オルニチンの何れか一つで
あってよい。

【０１２２】 この発明の方法の中で用いる他の類似体は、ペプチドの安定性を増大させる改
変を有するものである。かかる類似体は、例えば、一つ以上の非ペプチド結合を
(ペプチド結合の代りに)ペプチド配列中に含むことができる。やはり含まれるの
は、天然のＬ−アミノ酸以外の例えばＤ−アミノ酸の残基又は非天然アミノ酸若
しくは合成アミノ酸例えばβ若しくはγアミノ酸及び環状類似体を含む類似体で
ある。Ｄ−アミノ酸をＬ−アミノ酸の代りに単離されたヘッジホッグポリペプチ
ドに組み込むことは、プロテアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。
米国特許第５，２１９，９９０号(前出)参照。

【０１２３】 用語「断片」は、単離されたヘッジホッグ類似体に適用する場合には、生物学
的活性を保持していれば、単一アミノ酸程に小さくてよい。それは、長さにおい
て、少なくとも約２０残基、一層典型的には少なくとも約４０残基、好ましくは
少なくとも約６０残基であってよい。断片は、当業者に公知の方法によって生成
することができる。候補の断片の単離されたヘッジホッグの生物学的活性を示す
能力は、ここに記載の当業者に公知の方法によって評価することもできる。

【０１２４】アンタゴニストとしてのヘッジホッグタンパク質 本発明において有用な単離されたヘッジホッグタンパク質は、アンタゴニスト
例えばヘッジホッグと無関係の付加的配列を含む組換え融合タンパク質であって
よい。従って、このアンタゴニストポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
〜２０又は２３〜２６に由来するアミノ酸配列の全部又は断片を付加的アミノ酸
残基に読み枠を合わせて融合させて含むことができる。この発明のポリペプチド
の一つのバージョンは、第一のポリペプチド部分とヘッジホッグアンタゴニスト
部分を有するタンパク質であり、アンタゴニスト部分は、第一のポリペプチド部
分の５’側又は３’側に融合或は結合されている。従って、第一の付加的ポリペ
プチド部分は、アンタゴニストポリペプチドに無関係のアミノ酸配列を有する。
この付加的ポリペプチド部分は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、又はポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグの
何れかであってよい。それは、最も好ましくは、アンタゴニスト部分のＮ又はＣ
末端に融合或は結合された免疫グロブリン又はその部分である。

【０１２５】 好適なアンタゴニストは、少なくとも次の特性を有する：(ｉ)単離されたタン
パク質は、レセプターパッチト−１と、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチト
−１への結合より小さい親和性で(好ましくは、少なくとも同じ親和性で)結合し
；及び(ii)単離されたタンパク質は、イン・ビトロのＣＨ３１０Ｔ１／２細胞ベ
ースのＡＰ誘導アッセイで試験したときに、成熟ヘッジホッグタンパク質による
アルカリホスファターゼ(ＡＰ)誘導をブロックする。この発明のアンタゴニスト
は、(iii)ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現を誘導することができないという更な
る特性を有することもできる。

【０１２６】 当業者は、これらの特性について、如何なる推定のヘッジホッグアンタゴニス
トでも容易に試験することができる。特に、マウス胎児繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０
Ｔ１／２は、ヘッジホッグ応答性の間充織幹細胞株である(下記に一層詳細に記
載)。これらの細胞のヘッジホッグ処理は、ｇｌｉ−１及びパッチト−１(公知の
ヘッジホッグ依存性シグナリングの指標)のアップレギュレーションを引き起こ
し、アルカリホスファターゼ活性(軟骨細胞／骨芽細胞系統に分化した細胞の指
標)の誘導をも引き起こす。幾つかのヘッジホッグ変異体は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／
２細胞においてヘッジホッグ依存性応答を誘出することができないが、それらは
、成熟ヘッジホッグと機能につき競争し、それ故、機能的アンタゴニストとして
役立つ。これらの機能的アンタゴニストは、非ヘッジホッグ(例えば、免疫グロ
ブリン)部分を結合するヘッジホッグとして好適である。かかる状況においては
、ＫＥＸ２様細胞内プロテアーゼ認識部位が無力化されたムテインを用意する必
要はない。かかるヘッジホッグアンタゴニスト部分の合成及び利用を、以下に簡
単に記載する。

【０１２７】 Ａ．アンタゴニストとしてのＮ−改変ヘッジホッグポリペプチド Ｎ末端改変を含むあるヘッジホッグ変異体は、ヘッジホッグ依存性応答を誘出
する能力を欠くが、ヘッジホッグレセプター、パッチト−１に結合する能力は保
持しているので、ヘッジホッグ機能をブロックすることができる。ヘッジホッグ
ポリペプチド(即ち、ソニック、インディアン又はデザートヘッジホッグ)が機能
的ヘッジホッグアンタゴニストであるかどうかを規定する決定的一次アミノ酸配
列は、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システイン残基である。
ヘッジホッグポリペプチドがこのＮ末端システインを完全に欠くか又はこのＮ末
端システインを改変された形態で含む(例えば、化学的に改変され又はＮ末端延
長部分の一部として含まれる)ならば、その結果生成するポリペプチドは、機能
的ヘッジホッグアンタゴニストとして作用しうる。この点において、Ｎ末端シス
テインが「Ｃｙｓ−１に対応する」という事実は、(ａ)Ｎ末端システインが成熟
ソニック、インディアン若しくはデザートヘッジホッグのＣｙｓ−１であること
；又は(ｂ)Ｎ末端システインが成熟ソニック、インディアン若しくはデザートヘ
ッジホッグのＣｙｓ−１と同じ位置を占めることを意味する。例えば、ソニック
ヘッジホッグがここに記載のように変更され或は改変されたＣｙｓ−１に対応す
るＮ末端システインを有するならば、それは、ヘッジホッグファミリーの任意の
他のメンバーの作用と拮抗することができる。それ故、当業者は、インディアン
ヘッジホッグタンパク質がソニック、デザート又はインディアンヘッジホッグの
活性と拮抗することは可能であるということを理解するであろう。

【０１２８】 これらのＮ末端改変を有するアンタゴニストの例は、以下に含まれ、当業者は
、このアンタゴニストの開示された構造を例えば断片又は類似体を生成すること
により変化させることができ、新たに生成された構造をアンタゴニスト活性につ
いて試験することができる。これらの例は、如何なる関連ヘッジホッグアンタゴ
ニストの構造を制限するものではなく、単に、更なる説明のために用意したもの
である。これらの又は同様の方法を用いて、アンタゴニストポリペプチドの断片
及び類似体を生成してスクリーニングすることができる。これらは、アンタゴニ
ストとして機能しうる幾つかの変異体である。

【０１２９】 １．Ｎ末端伸長 この発明のアンタゴニストポリペプチドは、Ｎ末端システインがＮ末端伸長部
分に結合されたヘッジホッグポリペプチド配列を含むことができる。それ故、こ
の単離されたアンタゴニストポリペプチドは、一例として、(ａ)ヘッジホッグポ
リペプチド自身の５’側であってよく且つヘッジホッグに無関係の少なくとも一
のエレメント(例えば、アミノ酸残基)を含む第一のＮ末端ポリペプチド部分を、
(ｂ)この発明のヘッジホッグアンタゴニストの部分であるソニックヘッジホッグ
又はその一部分のＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインに結合させて有する組
換え融合タンパク質であってよい。このＮ末端伸長部分(例えば、第一のＮ末端
ポリペプチド部分)は、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン又はポリメラーゼ活性化ド
メインであってよい。この機能的アンタゴニストは、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ
−１又は成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインに
置き換わるエレメントを含むＮ末端伸長部分を含むことができる。

【０１３０】 ２．Ｎ末端欠失 機能的アンタゴニストの他の変異体は、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応
するＮ末端システインから始まる約１２アミノ酸より多くを失ったヘッジホッグ
タンパク質である。最初の約１２の隣接アミノ酸残基より多くの欠失は、機能的
アンタゴニストを生成しない。好ましくは、約１０の隣接アミノ酸の欠失は、適
当な機能的アンタゴニストを与えるであろう。しかしながら、１０より少ない隣
接残基を除去して尚アンタゴニスト機能を保持することができる。その上、全部
で少なくとも約３つの欠失残基があれば、隣接しない残基の様々な組み合わせを
欠失させることができる。

【０１３１】 これらの構造は、機能について、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端の重要性を
目立たせ、実際、ヘッジホッグタンパク質をＮ末端システイン以外の部位に結合
する必要性を強調する。Ｎ末端欠失変異体は、すべて、パッチト−１に結合する
能力において成熟ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)から識別可能であったが、イン
・ビトロのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２ＡＰ誘導アッセイにおいて不活性であった。これ
らのすべてのＮ末端変異体は、ヘッジホッグ依存性シグナリングを促進すること
ができない。

【０１３２】 ３．Ｎ末端変異 更に別の機能的アンタゴニストは、Ｎ末端システインの他のアミノ酸残基への
突然変異である。任意の疎水性でないアミノ酸残基が許容でき、ここに記載の教
示に従う当業者は、これらの突然変異を実施してその効果を試験することができ
るであろう。一例は、Ｎ末端システインがセリン残基で置換されたＳｈｈである
。この変異型は、パッチト−１に結合する能力において成熟Ｓｈｈと区別できな
いが、それは、機能についてＣ３Ｈ１０Ｔ１／２ＡＰ誘導アッセイで試験したと
きに成熟ＳｈｈによるＡＰ誘導をブロックする。アスパラギン酸、アルギニン及
びヒスチジンでの置換も、アンタゴニストとして働くことが示されている。

【０１３３】 ４．Ｎ末端システイン改変 ヘッジホッグの一次アミノ酸配列は生物学的活性に重要なＣｙｓ−１を含むの
で、ある別の改変は、ヘッジホッグタンパク質の不活性なアンタゴニスト変異体
を生じるであろう。他のアンタゴニストは、ヘッジホッグポリペプチドの単離さ
れた機能的アンタゴニストであり、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対
応するＮ末端システインを含むヘッジホッグポリペプチドを含む(但し、このシ
ステインは、改変型である)。ヘッジホッグのアンタゴニストポリペプチドは、
配列以外の改変を有することができ、これは、Ｎ末端システインのイン・ビボ又
はイン・ビトロの化学的誘導体化並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、アミ
ド化又はカルボキシル化の可能な変化を包含する。一例として、この機能的アン
タゴニストは、酸化型のＮ末端システインを有することができる。従って、機能
的アンタゴニストは、Ｎ末端伸長部分の一部として含まれることにより効果的に
改変されるＮ末端システインを有することができる。

【０１３４】 Ｂ．他の具体例 これらの機能的アンタゴニストポリペプチドは、ヘッジホッグタンパク質に対
して少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を含むことができる。このアンタ
ゴニストは、少なくとも下記の機能的アンタゴニストの特性を示さなければなら
ない：(ｉ)この単離されたタンパク質は、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチ
ト−１への結合より小さい(好ましくは、少なくとも同じ)親和性でレセプターパ
ッチト−１に結合し；及び(ii)この単離されたタンパク質は、イン・ビトロのＣ
Ｈ３１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイで試験したときに成熟ヘッジホ
ッグタンパク質によるアルカリホスファターゼ(ＡＰ)誘導をブロックする。

【０１３５】 本発明で有用なアンタゴニストは又、同義遺伝子、選択的転写事象、選択的Ｒ
ＮＡスプライシング事象、及び選択的翻訳及び翻訳後事象の存在の結果として生
じるものをも包含する。このポリペプチドは、合成手段によって完全に作ること
ができ、又はこのタンパク質が天然の細胞で発現されたときに存在するのと実質
的に同じ翻訳後修飾を生じる系例えば培養細胞において、又は天然の細胞におい
て発現させたときに存在する翻訳後修飾の省略を生じる系において発現させるこ
とができる。

【０１３６】 好適具体例において、単離されたアンタゴニストは、下記の特性の少なくとも
一つを有するポリペプチドである： (ｉ)それは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２６のアミノ酸と少なくとも６０、
一層好ましくは９０、最も好ましくは９５％の配列同一性を有し; (ii)それは、改変Ｎ末端システインを有し又はＮ末端システインを欠き又はＮ
末端システインを、ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインと異
なる位置に有し； (iii)それは、ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞における成熟ヘッジホッグによるアル
カリホスファターゼ誘導をブロックし; (iv)それは、レセプターパッチト−１と、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッ
チト−１への結合より小さい(好ましくは、少なくとも同じ)親和性で結合し又は
相互作用し； (ｖ)それは、イン・ビトロでＣＨ３１０Ｔ１／２細胞においてｐｔｃ−１及び
ｇｌｉ−１発現を誘導することができず；又は (vi)それは、ＣＨ３１０Ｔ１／２アッセイにおいてＡＰを誘導することができ
ない。

【０１３７】ヘッジホッグ生物学的活性のアゴニスト この発明の他の好適ヘッジホッグポリペプチドは、ヘッジホッグタンパク質の
幾つかの起源から誘導されるアゴニストである。一具体例において、このアゴニ
ストは、Ｎ末端を切り取られたものではなく(上記)、ＫＥＸ２様認識部位に突然
変異を含んでいる。融合タンパク質部分における利用に適したヘッジホッグアゴ
ニストの他の具体例は、部分的に、昆虫細胞又は哺乳動物細胞において完全長構
築物として発現されたヒトソニックヘッジホッグは疎水性のパルミトイル基をＮ
末端システインのαアミンに結合して有するという米国特許出願Ｎｏ．６０／０
６７，４２３号(１２／３／９７)に開示された発見に基づいている。これは、か
かる仕方で修飾された細胞外シグナリングタンパク質の最初の例であり、チオー
ル結合したパルミチン酸修飾(この結合は容易に可逆的である)と対照的に、この
新規なＮ結合パルミトイル部分が非常に安定であるということは、ミリスチン酸
修飾からの類推からありそうなことである。

【０１３８】 この初期の発見の直接的結果として、ヘッジホッグシグナリングタンパク質の
疎水性を増大させることは、そのタンパク質の生物学的活性を増大させることが
できるということが知られている。従って、改変されたヘッジホッグは、自身の
アンタゴニストとして作用する。特に、ヘッジホッグタンパク質などのシグナリ
ングタンパク質への追加の疎水性部分は、そのタンパク質の活性を増強すること
ができ、それ故、アゴニストとして作用することができる。生物学的に活性なタ
ンパク質のＮ末端システインは、疎水性部分を追加するのに便利な部位を提供し
て、それにより、そのタンパク質の物理化学的特性を改変するだけでなく、この
Ｎ末端システインの改変は、そのタンパク質の安定性を増大させることができる
。加えて、このタンパク質構造の表面の内部アミノ酸残基への疎水性部分の付加
は、そのタンパク質の活性を増強させる。これらのアゴニストを一種以上の非ヘ
ッジホッグ結合体(例えば、免疫グロブリン又はその断片)と共に用いることは、
治療的状況におけるヘッジホッグアゴニストの増大されたバイオアベイラビリテ
ィーを与えるであろう。

【０１３９】 従って、本発明の方法及び組成物は、結合体化ヘッジホッグアゴニストの利用
を、それらの増大された生物学的活性及び一層高いパッチト−１結合親和性の故
に含む。その上、主題の方法は、培養物にて与えられる細胞(イン・ビトロ)にお
いても、全動物の細胞(イン・ビボ)においても実施することができる。

【０１４０】 これらのアゴニストは、次の特性の少なくとも一つを有する：(ｉ)この単離さ
れたタンパク質は、レセプターパッチト−１と、成熟ヘッジホッグタンパク質の
パッチト−１への結合より小さい(好ましくは、一層高い)親和性で結合し；又は
(ii)この単離されたタンパク質は、ヘッジホッグタンパク質と、それらのタンパ
ク質のパッチト−１への結合親和性を、イン・ビトロのＣＨ３１０Ｔ１／２細胞
ベースのＡＰ誘導アッセイで試験したときに増大させるような仕方で結合する。
この発明のアゴニストは又、(iii)単独でｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現を誘導
することができるという更なる特性をも有する。

【０１４１】 Ａ．アゴニストとして作用する単離されたヘッジホッグタンパク質の一般的特性 主題の方法のヘッジホッグ組成物のポリペプチド部分は、天然のタンパク質、
組換えにより生成されたタンパク質の精製及び合成化学を含む様々な技術の何れ
かによって生成することができる。これらのヘッジホッグタンパク質のポリペプ
チド形態は、好ましくは、脊椎動物ヘッジホッグタンパク質に由来し、例えば、
脊椎動物に由来する天然のヘッジホッグタンパク質又はその断片に対応する配列
を有する。しかしながら、このヘッジホッグポリペプチドは、任意の後生動物に
存在するヘッジホッグタンパク質(又はその断片)に対応することができるという
ことは認められよう。

【０１４２】 この発明の方法において有用なファミリーメンバーには、アレル変異体、系統
発生的対応物又は他の変異体を含む天然のネイティブなヘッジホッグタンパク質
(ムテイン即ち変異タンパク質を含み、天然起源又は化学的に生成)、並びにヘッ
ジホッグファミリーの組換え型及び新規な活性メンバーの何れかが含まれる。

【０１４３】 非ヘッジホッグ結合体(例えば、免疫グロブリン又はその断片)と共に用いるた
めの好適なアゴニストには、誘導体化ヘッジホッグポリペプチド配列並びに他の
Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸配列が含まれ、又はそれは、ヘッジホッグアミ
ノ酸配列の全部又は断片を含むことができる。この発明のアゴニストポリペプチ
ドは、同義遺伝子、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象、及び選
択的翻訳及び翻訳後事象の存在の結果として生じるものを包含する。このポリペ
プチドは、合成手段によって完全に生成することができ又はタンパク質がネイテ
ィブな細胞で発現されたときに存在するのと実質的に同じ翻訳後修飾を生じる系
例えば培養細胞において発現させることができ、又はネイティブな細胞において
発現されたときに存在する翻訳後修飾の省略を生じる系において発現させること
ができる。

【０１４４】 好適具体例において、結合体化すべきアゴニストは、下記の特性の少なくとも
一つを有するヘッジホッグポリペプチドである： (ｉ)それは、ヘッジホッグ配列と少なくとも３０、４０、４２、５０、６０、
７０、８０、９０又は９５％の配列同一性を有し; (ii)それは、Ｎ末端として、システイン又は機能的同等物を有し; (iii)それは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてアルカリホスファターゼ活性
を誘導することができ； (iv)それは、ヘッジホッグ配列のポリペプチドと少なくとも５０％の、好まし
くは少なくとも６０％の、一層好ましくは少なくとも７０、８０、９０又は９５
％の全体的配列同一性を有し; (ｖ)それは、哺乳動物細胞などの天然起源から単離することができ； (vi)それは、パッチトと結合し又は相互作用することができ；そして (vii)それは、疎水性に改変される(即ち、それは、そのポリペプチドに結合さ
れた少なくとも一つの疎水性部分を有する)。

【０１４５】 ヘッジホッグタンパク質の全体的疎水性を増大させることは、そのタンパク質
の生物学的活性を増大させる。ヘッジホッグなどのシグナリングタンパク質の効
力は、(ａ)疎水性部分をＮ末端システインのスルフヒドリル及び／又はαアミン
に付加することなどによって化学的に改変し(Ｕ.Ｓ.６０／０６７，４２３参照)
；(ｂ)Ｎ末端システインを疎水性アミノ酸で置換し(Ｕ.Ｓ.６０／０６７，４２
３参照)；又は(ｃ)Ｎ末端システインを異なるアミノ酸で置換し、次いで、置換
された残基を置換部位に疎水性部分を付加するように化学的に改変することによ
って増大されうる。

【０１４６】 更に、ヘッジホッグタンパク質を、タンパク質表面の内部残基において、(ａ)
その内部残基を疎水性アミノ酸で置換し；又は(ｂ)内部残基を異なるアミノ酸で
置換してから、その置換された残基を置換部位に疎水性部分を付加するように化
学的に改変することにより、疎水性部分によって改変することは、そのタンパク
質の生物学的活性を保持し又は増強するであろう。

【０１４７】 加えて、ヘッジホッグタンパク質などのタンパク質を、Ｃ末端において、(ａ)
そのＣ末端残基を疎水性アミノ酸で置換し；又は(ｂ)Ｃ末端残基を異なるアミノ
酸で置換してから、その置換された残基を置換部位に疎水性部分を付加するよう
に化学的に改変することにより、疎水性部分によって改変することは、そのタン
パク質の生物学的活性を保持し又は増強するであろう。

【０１４８】 可溶性の未改変タンパク質を化学的に改変することにより得られた疎水性に改
変されたヘッジホッグ関して、パルミチン酸及び他の脂質を可溶性Ｓｈｈに付加
して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて増大された効力を有する脂質改変型
を造ることができる。この発明に包含される他の形態のタンパク質は、様々な脂
質部分により誘導体化されたタンパク質である。この発明に包含される脂質の主
要なクラスは、脂肪酸及びステロール(例えば、コレステロール)である。この発
明の誘導体化タンパク質は、環式、非環式(即ち、直鎖)の、飽和又は不飽和のモ
ノカルボン酸である脂肪酸を含む。典型的な飽和脂肪酸は、包括的な式：ＣＨ３
(ＣＨ２)ｎＣＯＯＨを有する。下記の表２には、慣用の化学的方法を用いて便利
に誘導体化されうる幾つかの脂肪酸の例を列記してある。

【０１４９】

【表２】

【０１５０】 このタンパク質に結合しうる他の脂質には、分岐鎖脂肪酸及びリン脂質群例え
ばホスファチジルイノシトール(即ち、ホスファチジルイノシトール４−モノホ
スフェート及びホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート)、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及び
イソプレノイド例えばファルネシル又はゲラニル群のものが含まれる。脂質で改
変されたヘッジホッグタンパク質は、天然起源から精製するか又は可溶性の未改
変タンパク質を化学的に改変することにより得ることができる。

【０１５１】 天然起源から精製したタンパク質について、我々は、完全長ヒトソニックヘッ
ジホッグ(Ｓｈｈ)を昆虫細胞で発現させて、膜結合したＳｈｈを洗剤処理した細
胞からＳＰ−セファロースクロマトグラフィー及びイムノアフィニティークロマ
トグラフィーの組合せを用いて精製した場合に、精製されたタンパク質が、還元
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で２０ｋＤａの見かけマスの単一の鋭いバンドとして移
動することを示した。これらの可溶性及び膜結合Ｓｈｈタンパク質は、係留型が
アセトニトリル勾配中で一層遅く溶出される場合には、逆相ＨＰＬＣによって容
易に区別することができた。次いで、我々は、ヒトソニックヘッジホッグが細胞
膜に２つの形態(コレステロールを含みそれ故ショウジョウバエヘッジホッグに
ついて以前に報告されたデータと類似する一つの形態と、コレステロールとパル
ミチン酸の修飾の両方を含む第二の新規な形態)で係留されることを示した。可
溶性と係留された形態のＳｈｈを、エレクトロスプレーイオン源を備えた三重の
四重極質量分析計を用いるエレクトロスプレー質量分析法により並びに液体クロ
マトグラフィー−質量分析法によって分析した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−
Ｃ消化して疎水性に修飾したＳｈｈからのＮ末端ペプチドの正体を、ＭＡＬＤＩ
飛行時間質量分析計におけるＭＡＬＤＩＰＳＤ質量分析測定により確認した。パ
ルミトイル化部位を、ペプチドマッピングと配列分析の組合せによって同定し、
それは、タンパク質のＮ末端であった。両改変型は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アルカ
リホスファターゼアッセイにおいて等しく活性であったが、興味深いことに、両
方とも係留を欠く可溶性ヒトＳｈｈの凡そ３０倍よりも強力であった。これらの
疎水性改変は、Ｓｈｈのレセプター、パッチトに対する見かけの結合親和性に有
意の影響を与えなかった。

【０１５２】 可溶性の未改変のタンパク質を改変することによって得られる特定の脂質改変
を受けたヘッジホッグについては、パルミチン酸及び他の脂質を可溶性Ｓｈｈに
加えて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて増大した効力を有する脂質改変型
を造ることができる。それ故、一般に、反応性脂質部分は、飽和又は不飽和のカ
ルボン酸のチオエステル例えば補酵素Ａチオエステルの形態であってよい。かか
る物質及びそれらの誘導体は、例えば、市販の補酵素Ａ誘導体例えばパルミトオ
レオイル補酵素Ａ、アラキドイル補酵素Ａ、アラキドノイル補酵素Ａ、ラウロイ
ル補酵素Ａなどを含んでよい。これらの物質は、Sigma Chemical社(ミズーリ、S
t. Louis, １９９８年度カタログ３０３〜３０６頁)から容易に入手することが
できる。

【０１５３】 ヘッジホッグポリペプチドを誘導体化しうる広範囲の疎水性部分がある。疎水
性の基は、例えば、約７〜３０炭素を有する比較的長鎖のアルキル又はシクロア
ルキル(好ましくは、ｎ−アルキル)基であってよい。このアルキル基は、水酸基
又は第一アミン「テイル」で終端していてよい。更なる説明のために、かかる分
子は、天然の及び合成の芳香族及び非芳香族部分例えば脂肪酸、エステル及びア
ルコール、他の脂質分子、かご型構造例えばアダマンタン及びバックミンスター
フラーレン、並びに芳香族炭化水素例えばベンゼン、ペリレン、フェナントレン
、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン及びナフタセンを包含する。

【０１５４】 疎水性分子として特に有用なのは、脂環式炭化水素、飽和又は不飽和の脂肪酸
及び他の脂質及びリン脂質部分、ワックス、コレステロール、イソプレノイド、
テルペン並びにアダマンタン及びバックミンスターフラーレンを含む多環式脂環
式炭水化物、ビタミン、ポリエチレングリコール又はオリゴエチレングリコール
、(Ｃ１〜Ｃ１８)アルキルホスフェートジエステル、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)
−Ｏ−(Ｃ１２−Ｃ１８)アルキル及び特にピレン誘導体との結合体である。この
疎水性部分は、この発明での利用に適した親油性染料であってよく、ジフェニル
ヘキサトリエン、ナイルレッド、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン、プロダン
、ローロダン、ピレン、ペリレン、ローダミン、ローダミンＢ、テトラメチルロ
ーダミン、テキサスレッド、スルホローダミン、１，１’−ジドデシル−３，３
，３’，３’テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート、オクタデシル
ローダミンＢ及び及びＢＯＤＩＰＹ染料(Molecular Probes Inc.)を包含するが
これらに限らない。

【０１５５】 他の典型的な親油性部分は、脂肪族カルボニル遊離基を含み、１−若しくは２
−アダマンチルアセチル、３−メチルアダマント−１−イルアセチル、３−メチ
ル−３−ブロモ−１−アダマンチルアセチル、１−デカリンアセチル、カンフル
アセチル、カンファンアセチル、ノルアダマンチルアセチル、ノルボルナンアセ
チル、ビシクロ[２.２.２.]−オクト−５−エンアセチル、１−メトキシビシク
ロ[２.２.２.]−オクト−５−エン−２−カルボニル、シス−５−ノルボルネン
−エンド−２，３−ジカルボニル、５−ノルボルネン−２−イルアセチル、(１
Ｒ)−(−)−ミルテンタンアセチル、２−ノルボルナンアセチル、アンチ−３−
オキソ−トリシクロ[２.２.１.０＜２，６＞]−ヘプタン−７−カルボニル、デ
カノイル、ドデカノイル、ドデセノイル、テトラデカジエノイル、デシノイル、
又はドデシノイルを包含する。

【０１５６】 １．ヘッジホッグのＮ末端システインの化学的修飾 もし適当なアミノ酸が特定の位置で利用可能でないならば、位置指定突然変異
導入法を用いて、反応性アミノ酸をその位置に位置させることができる。反応性
アミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸
、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニン、メチオニン及びトリプトファン
を包含する。突然変異導入法を用いて、反応性アミノ酸をＮ若しくはＣ末端又は
内部位置に位置させることもできる。

【０１５７】 例えば、生物学的に活性なタンパク質例えばヘッジホッグタンパク質のＮ末端
システインを化学的に改変し又はＮ末端システインを完全に除去して、しかもそ
のタンパク質の生物学的活性を保持することができる。ヘッジホッグのＮ末端シ
ステインの疎水性アミノ酸による置換又は修飾は、細胞ベースのシグナリングア
ッセイにおける増大した効力を生じる。システインの置換により、このアプロー
チは、このタンパク質の生成、精製、配合及び貯蔵中に生じうるシステインの他
の望ましくない改変の抑制の問題を排除する。このアプローチの一般性は、３つ
の異なる疎水性アミノ酸フェニルアラニン、イソロイシン及びメチオニンが、各
々、一層活性な形態のヘッジホッグを与え、従ってアゴニストを与えるという発
見に支持されている。

【０１５８】 これは又、下記のように、非ヘッジホッグ部分(例えば、免疫グロブリン)との
結合にも重要であり、我々は、２つのイソロイシン残基をソニック及びデザート
ヘッジホッグのＮ末端システインに導入する。これは、我々がＣ末端システイン
のチオールを共有結合のための反応性部位として利用することを効果的に可能に
する。従って、Ｎ末端システインの任意の他の疎水性アミノ酸での置換は、活性
なタンパク質を生じるであろう。その上、我々は、アミノ酸の疎水性又は化学的
改変と対応する改変タンパク質のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおける効力との
間の相関関係を見出したので(例えば、Ｐｈｅ＞Ｍｅｔ、長鎖脂肪酸＞短鎖)、２
以上の疎水性アミノ酸をヘッジホッグ配列に加えることは、アゴニストの効力を
単一のアミノ酸付加により達成されるものを超えて増大させるであろうというこ
とが想像できる。実際、２つの連続するイソロイシン残基のソニックヘッジホッ
グのＮ末端への付加は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて、唯一のイソロイ
シンが付加された変異体と比較しての効力の増大を生じる。こうして、ヘッジホ
ッグタンパク質のＮ又はＣ末端への疎水性アミノ酸の付加は、表面ループ又は幾
つかの位置の組合せにおいて、そのタンパク質の一層活性な形態を与えることが
予想される。置換されるアミノ酸は、一般的な２０アミノ酸の一つである必要は
ない。タンパク質の特定の部位を非天然アミノ酸で置換する方法は報告されてお
り、これは、アミノ酸が一層疎水性で、タンパク質分解性の攻撃に抵抗性あれば
有利であろうし、又は更に、ヘッジホッグタンパク質をイン・ビボで特定の部位
に向けるのに利用することができ、それは、その活性を一層強力にし又は特異的
にするであろう。非天然アミノ酸は、イン・ビトロ翻訳において、タンパク質の
特定の部位に組み込むことができ、かかる改変タンパク質の大規模生産を可能に
するイン・ビボシステムの作成における進歩が報告されている。

【０１５９】 チオールを保護して、疎水性部分を追加するＮ末端システインの多くの改変が
ある。当業者は、何れの改変が特定の治療用途に最も適当であるかを測定するこ
とができる。かかる測定に影響する因子には、生成、精製及び配合のコスト及び
容易さ、溶解度、安定性、効力、薬力学及び薬物速度論、安全性、免疫原性及び
組織標的が含まれる。

【０１６０】 ２ 他のアミノ酸の化学的改変 多くの他のアミノ酸の改変のための特定の化学的方法がある。従って、一層活
性な形態のヘッジホッグを合成するための他の経路は、疎水性部分をヘッジホッ
グ中のＮ末端システイン以外のアミノ酸に化学的に結合させることであろう。も
し適当なアミノ酸が所望の位置で利用可能でないならば、位置指定突然変異導入
法を用いて、反応性アミノ酸をヘッジホッグ構造中のその部位に位置させること
ができよう(Ｎ若しくはＣ末端又は他の位置に)。反応性アミノ酸には、システイ
ン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン
、チロシン、アルギニン、メチオニン、及びトリプトファンが含まれよう。こう
して、一層優れたヘッジホッグアゴニストを造るゴールは、多くの化学的手段に
よって達成することができ、我々は、我々の結果がこのアプローチの一般性を支
持するので、改変の特定の化学又は部位により制限されることを臨まない。

【０１６１】 このヘッジホッグポリペプチドは、多くの方法で疎水性部分に結合させること
ができる(化学カップリング手段によるか遺伝子工学による方法を含む)。説明す
るために、当業者に公知の多数の化学的架橋剤がある。本発明に関して、好適な
架橋剤は、ヘテロ二官能性架橋用リンカーであり、ヘッジホッグポリペプチドと
疎水性部分を段階的様式で結合させるのに利用できるものである。ヘテロ二官能
性架橋用リンカーは、タンパク質に結合するための一層特異的なカップリング法
をデザインし、それにより、望ましくない副反応物例えばホモタンパク質ポリマ
ーの出現を低減させる能力を与える。様々なヘテロ二官能性架橋用リンカーが、
当分野では知られている。これらは、スクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメ
チル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)；Ｎ−スクシンイミジ
ル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ)、スクシンイミジル４−
(ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ)、１−エチル−３−(３−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(ＥＤＣ)；４−スクシンイ
ミジルオキシカルボニル−ａ―メチル−ａ−(２−ピリジルジチオ)−トルエン(
ＳＭＰＴ)、Ｎ−スクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(Ｓ
ＰＤＰ)、スクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート]ヘ
キサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)を包含する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分
を有する架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ること
ができ、これらは、一般に、一層大きい水溶性を有する。加えて、結合鎖内にジ
スルフィドブリッジを有する架橋剤は、それよりも、イン・ビボでのリンカー開
裂の量を減じるようにアルキル誘導体として合成することができる。

【０１６２】 一つの特に有用なクラスのヘテロ二官能性架橋用リンカーは、第一アミンの反
応性の基を含むものであり、上記の、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)、
又はその水溶性類似体のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−ＮＨＳ)
を含んだ。アルカリ性ｐＨでは、第一アミン(リジンイプシロン基)は、プロトン
化しておらず、ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳエステルへの親核攻撃により反応する
。この反応は、アミド結合の形成を生じ、副生物としてのＮＨＳ又はスルホ−Ｎ
ＨＳの放出を生じる。

【０１６３】 ヘテロ二官能性架橋用リンカーの部分として有用な他の反応性の基は、チオー
ル反応性の基である。一般的なチオール反応性の基には、マレイミド、ハロゲン
及びピリジルジスルフィドが含まれる。マレイミドは、遊離のスルフヒドリル(
システイン残基)と数分で弱酸性から中性(ｐＨ６．５〜７．５)条件下で特異的
に反応する。ハロゲン(ヨードアセチル官能基)は、−ＳＨ基と生理的ｐＨで反応
する。これらの両方の反応性の基は、安定なチオエーテル結合の形成を生じる。

【０１６４】生物学的活性の試験 多くのバイオアッセイが、ヘッジホッグ活性を示すために用いられてきたが、
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は、ヘッジホッグ機能を、初代細胞培養や器官外植を
しなければならないという複雑さを伴わずに評価するための簡単な系を与える。
このマウス胎児繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、規定された条件下で含脂肪
細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞に分化することのできる間充織幹細胞株である(Tay
lor, S.M.及びJones, P.A., Cell 17:771-779(1979)及びWang, E.A.等、Growth
Factors 9:57-71(1993))。骨形態形成タンパク質は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の
骨細胞系統への分化を駆動し、アルカリホスファターゼ誘導がこの過程のマーカ
ーとして用いられてきた(Wang等、前出)。Ｓｈｈは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に
対して類似の効果を有し(Kinto, N.等、FEBS Letts.404:319-323(1997))、我々
は、Ｓｈｈによるアルカリホスファターゼ誘導を、そのイン・ビトロでの効力の
定量的測定として日常的に利用している。Ｓｈｈ処理は又、ｇｌｉ−１及びｐｔ
ｃ−１発現の投与量依存性の増大をも生じ、これは、ＰＣＲベースの分析により
容易に検出することができる。

【０１６５】 この発明の好適なムテイン ヒトのソニックヘッジホッグタンパク質の活性なＮ末端シグナリングドメイン
(残基Ｃｙｓ２４〜１９７)は、多くの細胞型(ＣＯＳ、昆虫細胞、大腸菌、酵母)
において発現させることができる。バキュロウイルス及び酵母において、このタ
ンパク質は、Ｇｌｙ９とＡｒｇ１４の間の様々な部位でタンパク質分解性クリッ
ピングを受ける(ソニックヘッジホッグのＮ末端配列についてのクリップ部位を
示した図３を参照されたい)。メチロトロピック酵母ピチア・パストリス、ＧＳ
１１５株(Invitrogen)において、このＮ末端クリッピングは、専らＡｒｇ３３〜
Ａｒｇ３４結合で起きてＮ−１０ソニックヘッジホッグタンパク質(残基Ａｒｇ
３４〜Ｇｌｙ１９７)を生じる。このクリッピングは、細胞内で起き、ＫＥＸ２
ゴルジプロテアーゼ又は類似のＫＥＸ２様細胞内プロテアーゼにより触媒される
ようである。

【０１６６】 Ｎ末端をクリップされた形態のＳＨＨは、１０Ｔ１／２アッセイにおいて不活
性である(実施例１参照)。Ｎ−１０ＳＨＨは、このアッセイで不活性であり且つ
野生型と共存した場合にはそれと拮抗しもする。従って、ある状況において、Ｎ
末端タンパク質分解性クリッピングの阻止は、完全に活性なタンパク質の生成に
必要である。

【０１６７】 Ｎ末端クリッピングの故に、モノマー形態のＳＨＨは、２つのタンパク質種(
無傷のＳＨＨ及びＮ−１０ＳＨＨ)を含むことが予想される。

【０１６８】 対照的に、ダイマーの融合タンパク質例えばＳＨＨ−Ｆｃ(免疫グロブリン)タ
ンパク質は、３つの種(２つの無傷のＳＨＨドメインを有する種、２つのクリッ
プされたドメインを有する種及び１つの無傷のＳＨＨドメインと１つのクリップ
されたＳＨＨドメインを有する種)を含むことが予想される。

【０１６９】 モノマーのＳＨＨは、Ｎ末端をクリップされたＳＨＨから標準的タンパク質精
製技術によって分離することができた。しかしながら、ダイマーの融合タンパク
質は、一層困難な精製問題である。加えて、相当の割合のＮ末端クリッピングが
２つの無傷のＳＨＨドメインを含むダイマー分子の生成を一層激しく低減させる
であろう。従って、ダイマー融合タンパク質の効率的生成は、Ｎ末端クリッピン
グの阻止に特に依存する。

【０１７０】 ＫＥＸ２プロテアーゼは、下記の形式の少なくとも３アミノ酸残基長の認識配
列を有する：

【化１】 [Ａｒｇ又はＬｙｓ]−Ａｒｇ−[Ｘ] (式中、ＸはＰｒｏ)。

【０１７１】 この認識配列は、ソニックヘッジホッグのＮ末端領域に２回出現し、その一つ
は、Ｌｙｓ９Ａｒｇ１０Ａｒｇ１１であり、これら２つのＡｒｇ残基の間には開
裂があり(この部位での開裂は観察された)、もう一つは、Ａｒｇ１０Ａｒｇ１１
Ｈｉｓ１２であり、ＡｒｇとＨｉｓの間での開裂が予想される(この部位での開
裂は観察されていない)。我々は、このＬｙｓ９Ａｒｇ１０Ａｒｇ１１部位が優
先されて、Ａｒｇ１０Ａｒｇ１１での開裂がＡｒｇ１０Ａｒｇ１１Ｈｉｓ１２部
位を破壊するものと推定している。

【０１７２】 ソニックヘッジホッグ中のＫＥＸ２認識部位を、この細胞内タンパク質分解性
クリッピングを排除するために突然変異させた(実施例１、図３及び表３を参照
されたい)。これらの変異型タンパク質は、Ｎ末端ドメインとして発現された(ソ
ニックヘッジホッグコード配列のコドンＣｙｓ２４〜Ｇｌｙ１９７、これは、シ
グナル配列開裂後の成熟タンパク質の残基Ｃｙｓ１〜Ｇｌｙ１７４に対応する)
。

【０１７３】

【表３】

【０１７４】 ＩＶ．この発明の有用性 この発明の好適な免疫グロブリン融合タンパク質の本発明の治療適用のための
ユニークな特性は、それらの全体的な生体適合性である。この発明の融合タンパ
ク質は、毒性でないと考えられ、それらは、非免疫原性で且つ非抗原性であると
考えられ、そしてここに記載の条件下で結合体化した場合にヘッジホッグタンパ
ク質部分の生物学的活性を邪魔しない。それらは、長期の血中循環を有し、且つ
容易に生物体から排出される。

【０１７５】 本発明の治療用融合物は、ヘッジホッグ又はパッチトタンパク質成分が効き目
のある任意の病気又は疾病状態の予防又は治療のために利用することができる。
加えて、本発明の構築物は、生物学的系又は試料において、成分、病気又は疾病
状態の診断に利用し、並びに、診断目的のために、非生理学的系において利用す
ることができる。

【０１７６】 治療的用法において、本発明は、かかる病気又は疾病状態を有し又は潜伏的に
感受性であって、かかる治療を必要とする動物患者の治療方法を企図しており、
それは、かかる動物への有効量の本発明の融合タンパク質(該病気又は疾病状態
に対して治療上有効なもの)の投与を含む。本発明の融合タンパク質により治療
されるべき患者には、哺乳動物患者及び最も好ましくはヒトの患者が含まれる。
闘うべき特定の病気又は疾病状態に依って、動物患者に、この発明の構築物を、
任意の適当な治療上有効で且つ安全な投薬量で投与するが、該量は、当業者によ
って過度の実験をすることなく容易に決定することができる。

【０１７７】 一般に、ここに記載の改変タンパク質は、それらの未改変型タンパク質を用い
て治療することのできる同じ医学的病気を治療するのに有用である。しかし、こ
の発明のタンパク質の治療状況での適用の一例のように、この発明の改変ヘッジ
ホッグタンパク質は、様々な神経病を患っている患者に投与することができる。
神経系の発生中及びおそらくは成体においてもニューロンの分化を調節するヘッ
ジホッグタンパク質の能力は、ポリマー結合体化ヘッジホッグが、正常細胞の維
持、機能性能及び加齢に関する成体のニューロンの制御；病変細胞における修復
及び再生過程；並びにある種の病理的状態での分化の喪失から生じる退行及び時
期尚早の死の阻止を促進すると期待することができることを示している。これに
照らして、本発明の改変ヘッジホッグ組成物は、局所的注入による治療により、
(ｉ)神経系に対する外傷、化学的傷害、血管傷害及び欠乏(卒中に由来する虚血
など)並びに感染及び腫瘍に誘導された傷害を含む急性、亜急性又は慢性の傷害
；(ii)アルツハイマー病を含む神経系の加齢；(iii)パーキンソン病、ハンチン
トン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症などを含む神経系の慢性神経退行性疾患；及び
(iv) 多発性硬化症を含む神経系の慢性免疫病に由来する神経病の発病を防止し
且つ／又は低減させることができる。これらの改変ヘッジホッグタンパク質は又
、例えば、脳細胞の欠乏を扱うために脳脊髄液中に注入し、又はリンパ系若しく
は血流中に、他の組織又は器官系特異的な異常を標的とすることが必要ならば注
入することができる。

【０１７８】 この発明のヘッジホッグ組成物を用いて、例えば、様々なニューロンを、傷害
により誘導される死から救済し、並びにかかるダメージの後にこれらのニューロ
ンの再計画を誘導することができる。かかるダメージは、ＣＮＳ外傷性梗塞、感
染症、代謝性疾患、栄養不足及び毒剤(例えばシスプラチン処理)を包含する状況
(但し、これらに限らない)に帰することができる。ある種のヘッジホッグタンパ
ク質は、新生物細胞又は過形成性のトランスフォームされた細胞を有糸分裂後に
し又はアポトーシスを引き起こす。それ故、かかる組成物は、例えば、悪性のグ
リオーマ、髄芽細胞腫及び神経外胚葉性腫瘍の治療において利用することができ
る。

【０１７９】 この発明の改変タンパク質を用いて、医学的治療剤を、特異的に、そのタンパ
ク質のレセプターを発現している癌及び腫瘍を標的とすることができる。かかる
物質は、それらを抗新生物剤、毒素及び殺細胞性放射性核種例えばイットリウム
９０の送達用ビヒクルとして利用することにより、癌治療剤として一層効果的に
することができる。

【０１８０】 毒素をこの改変ヘッジホッグに結合させて、ヘッジホッグ応答性細胞例えばヘ
ッジホッグレセプターを発現している腫瘍を選択的に標的にして殺すこともでき
る。他の毒素は、当業者に公知のように、同様に有用である。かかる毒素には、
シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、及びサポリンが含まれるが、これらに
限らない。このアプローチは、ヘッジホッグが非常に限られた数の組織で発現さ
れるので上首尾であることが分かるであろう。かかる医学的治療剤への別のアプ
ローチは、放射性同位元素標識された改変タンパク質を利用することである。か
かる放射性標識された化合物は、優先的に、放射能を、正常組織を回避して、こ
れらのタンパク質レセプターを発現する細胞内の部位を標的として送達する。用
いた放射性同位元素に依って、腫瘍細胞に結合した放射性標識されたタンパク質
から放射される放射線は又、このタンパク質レセプターを発現していない近くの
悪性腫瘍細胞を殺すこともできる。様々な放射性核種を利用することができる。

【０１８１】 皮下送達がこの発明のタンパク質の治療用投与のための第一の経路であるとい
うことが構想される。局所的、静脈内送達、又はカテーテル若しくは他の外科用
チューブによる送達も又構想されうる。他の経路には、錠剤など、液体配合物用
の市販の噴霧器、及び凍結乾燥又はエーロゾル化した配合物の吸入が含まれる。
液体配合物は、粉末配合物からの再構成後に利用することができる。

【０１８２】 神経退行性疾患について、幾らかの臨床的な断定的価値を有すると考えられて
いる幾つかのモデル動物が利用可能である。パーキンソン病について、モデルは
、黒質−線条体ドーパミン作動性経路に、ＭＰＴＰの全身投与又は６−ヒドロキ
シドーパミン[６−ＯＨＤＡ]、２種の選択的ドーパミン作動性毒素の局所(頭蓋
内)投与によって損傷を有するゲッ歯類又は霊長類における防護又は回復を含む
。特異的モデルは、ＭＰＴＰ処理マウスモデル(Tomac等、(1995)Nature 373,335
-339)；ＭＰＴＰ処理霊長類(キヌザル又はアカゲザル)モデル(Gash等、(1996)Na
ture 380,252-255)及び片側性６−ＯＨＤＡ傷害ラットモデル(Hoffer等、(1994)
Neuroscience Lett.182,107-111)である。ＡＬＳ(筋萎縮性側索硬化症)について
は、モデルは、ウォブラー(Duchen, L.W.及びStrich, S.J.,(1968),J.Neurol.Ne
urosurg.Psychiatry 31,535-542)及びｐｍｎマウス(Kennel等、(1996)Neurobiol
ogy of Disease 3,138-147)を含む自発的運動ニューロン退行を示す幾つかのマ
ウス系統、並びに家族性ＡＬＳにリンクされてきたヒトの変異型スーパーオキシ
ダーゼジスムターゼ(ｈＳＯＤ)遺伝子を発現するトランスジェニックマウス(Rip
ps等、(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:689-693)の処理を含む。脊髄損傷につ
いては、最も一般的なモデルは、較正重量液滴又は流体(流体力学的)傷害による
ラットへの挫傷を含む。ハンチントンについては、モデルは、ラットの線条体へ
の刺激毒素(ＮＭＤＡ、キノリン酸、カイニン酸、３−ニトロ−プロピオン酸、
ＡＰＭＡ)傷害からの防護を含む(Nicholson, L.等、(1995)Neuroscience 66,507
-521；Beal, M.F.等、(1993)J.Neuroscience 13,4181-4192)。最近、ヒトのハン
チントン遺伝子中のトリヌクレオチド伸長反復を過剰発現するトランスジェニッ
クマウスモデルも記載された(Davies, S.等、(1997)Cell 90,537-548)。多発性
硬化症については、マウス及びラットのＥＡＥが、ＭＢＰ(ミエリン塩基性タン
パク質)による免疫化により、又はＭＢＰで活性化されたＴ細胞の受動的トラン
スファーによって誘導される(Hebr-Katz, R.(1993)Int.Rev.Immunol.9,237-285)
。アルツハイマーについては、関連マウスモデルは、ラットの房状縁脳弓の傷害
(隔膜傷害)に対する防護の測定であり、主神経束は、海馬のコリン作動性神経支
配を与え(Borg等、(1990)Brain Res.,518,295-298)、トランスジェニックマウス
の利用は、ヒトβ−アミロイド遺伝子を過剰発現する。抹消神経障害については
、関連モデルは、化学療法剤例えばタキソール、ビンクリスチン及びシスプラチ
ンによりマウス及びラットで引き起こされる末梢神経コンダクタンスの喪失に対
する防護である(Apfel等、(1991)Ann.Neuro.,29,87-90)。

【０１８３】 本発明の生成物は、ヘッジホッグの半減期を持続させるのに有用であることが
見出されており、例えば、水又は許容しうる液体媒質に溶解させることにより、
治療投与のために調製することができる。投与は、非経口経路、エアゾール又は
経口経路の何れかによる。微細なコロイド懸濁液を、非経口投与用に調製して、
蓄積効果を生じることができる(又は、エアゾール配合物は液体又は乾燥粉末で
あってよいが、経口経路による)。乾燥した、凍結乾燥状態又は溶液配合物にお
いて、本発明のヘッジホッグタンパク質−ポリマー結合体は、優れた貯蔵安定性
を有するはずである。結合体化ヘッジホッグタンパク質の熱安定性(データは示
してない)は、脱水肯定を有する粉末配合物プロセスにおいて有利である。

【０１８４】 この発明のヘッジホッグタンパク質は、それ自体で並びに製薬上許容しうるそ
のエステル、塩及び他の生物学的に機能的な誘導体の形態で投与することができ
る。かかる製薬及び医薬配合物において、このヘッジホッグタンパク質は、好ま
しくは、少なくとも一種の製薬上許容しうるキャリアーと共にそして適宜他の治
療用成分と共に用いる。この(これらの)キャリアーは、配合物の他の成分と適合
性であって、レシピエントに対して過度に有害でないという意味において、製薬
上許容されるものでなければならない。このヘッジホッグタンパク質は、上記の
ように所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量で及び所望の日々の投与量を
達成するのに適した量で与えられる。

【０１８５】 これらの配合物には、非経口の並びに非経口でない投与に適したものが含まれ
、特定の投与様式には、経口投与、直腸投与、口内投与、局所投与、鼻投与、眼
投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈投与、経皮投与、髄腔内投与、関節内投与、
動脈投与、くも膜下投与、気管支投与、リンパ投与、膣内投与及び子宮内投与が
含まれる。経口投与、鼻投与及び非経口投与に適した配合物が、好適である。

【０１８６】 このヘッジホッグタンパク質を液体溶液を含む配合物で用いる場合は、その配
合物は、有利には、経口又は非経口投与することができる。このヘッジホッグタ
ンパク質を液体懸濁配合物中で又は粉末として生体適合性キャリアー配合物中で
用いる場合は、その配合物は、有利には、経口投与、直腸投与又は気管支投与す
ることができる。

【０１８７】 このヘッジホッグタンパク質を直接粉末化固体の形態で利用する場合は、この
ヘッジホッグタンパク質を、有利には、経口投与することができる。或は、それ
を、キャリアーガスにその粉末を噴霧化させることにより、その粉末のガス状分
散を形成して、鼻投与し又は気管支投与することができ、該分散は適当な噴霧器
を含む呼吸サイクルから患者により吸い込まれる。

【０１８８】 本発明を構成する配合物は、便利に、投薬形態で与えられ、製薬業界で周知の
何れかの方法によって調製することができる。かかる方法は、一般に、活性成分
を、少なくとも一種の付随的成分を構成するキャリアーと結合させるステップを
含む。典型的には、これらの配合物を、活性成分を一様且つ均質に液体キャリア
ー、微粉固体キャリアー及び必要ならば両者と結合させることにより調製して、
この製品を所望の配合物の投薬形態に形作る。

【０１８９】 経口投与に適した本発明の配合物は、別々のユニット例えばカプセル、カシェ
剤、錠剤、菓子錠剤として与えることができ、各々は、予め決めた量の活性成分
を粉末又は顆粒として；又は水性液体若しくは非水性液体中の懸濁液例えばシロ
ップ、エリキシル、乳濁液若しくはドラフトとして含む。

【０１９０】 錠剤は、加圧若しくは型込めにより作成することができ、適宜、一種以上の付
随的成分を伴う。加圧錠剤は、適当な機械で加圧することにより製造することが
でき、活性な化合物は、粉末又は顆粒などの易流動性形態であって、これは、適
宜、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤又は崩壊剤と混合され
る。粉末ポリマー結合体と適当なキャリアーの混合物よりなる型込め錠剤は、適
当な機械で型込めすることにより作成することができる。

【０１９１】 シロップは、活性な化合物を糖(例えば、ショ糖)の濃縮水溶液に加えることに
より作成することができ、該濃縮水溶液には、任意の付随的成分も加えることが
できる。かかる付随的成分には、香味料、適当な防腐剤、糖の結晶化を遅らせる
薬剤、及び任意の他の成分の溶解度を増大させる薬剤例えばポリヒドロキシアル
コール例えばグリセロール又はソルビトールが含まれうる。

【０１９２】 非経口投与に適した配合物は、便利に、活性な結合体の無菌の水性調製物を含
み、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張である(例えば、生理的塩溶
液)。かかる配合物は、沈殿防止剤及び増粘剤又は他の微粒子系(血液成分又は少
なくとも一つの器官を化合物の標的とするようにデザインされたもの)を含むこ
とができる。これらの配合物は、単一投与形態で与えることも複数投与形態で与
えることもできる。

【０１９３】 鼻スプレー配合物は、活性成分と防腐剤及び等張剤の精製水溶液を含む。

【０１９４】 直腸投与用の配合物は、適当なキャリアー例えばカカオ脂、水素化脂肪、又は
水素化脂肪カルボン酸と共に坐剤として与えることができる。

【０１９５】 目薬などの眼用配合物は、鼻スプレーと類似の方法で調製されるが、ｐＨ及び
等張因子は、好ましくは、眼のそれに一致するように調整する。

【０１９６】 局所用配合物は、この発明の結合体を、少なくとも一種の媒質例えば鉱油、石
油、ポリヒドロキシアルコールに、又は他の局所用医薬配合物に用いられるベー
スに溶解又は懸濁させて含む。

【０１９７】 前述の成分に加えて、この発明の配合物は、更に、希釈剤、緩衝剤、香味剤、
崩壊剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤(抗酸化剤を含む)などから選択す
る少なくとも一種の付随的成分を含むことができる。

【０１９８】 下記の実施例を、本発明の説明のために与えるが、それを限定するものと解釈
すべきではない。特に、ここに記載のイン・ビボの動物実験は、基本的方法論の
他の改変及び変形が可能であるように変えることができるということは理解され
よう。これらの実施例の改変及び変形は、この発明の精神及び範囲内にあると考
えるべきである。

【０１９９】 実施例１：材料と方法 ソニックヘッジホッグのピチア・パストリスでの発現用プラスミドｐＵＢ５５の
構築：ｐＵＢ５５(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０)は、ヒトのソニックヘッジホッグ
のＮ末端ドメイン(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、表４)とアルファ因子プレプロ領
域(分泌シグナル)を含む。ｐＵＢ５５を、ｐＰＩＣ９の誘導体ｐＣＣＭ７３(Inv
itrogen, カリフォルニア、San Diego)中に、ｐＰＩＣ９のＳｐｈ１部位に挿入
したｐＵＣ−Ｋのカナマイシン遺伝子(ＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片)を用い
て構築した。Ｅａｒ１−Ｎｏｔ１由来のヒトソニックヘッジホッグコード配列を
、コード配列中のＧｌｙ１９７の後ろに停止コドンを有し且つＮｏｔ１部位を工
作したｐＥＡＧ５４３から得た。プラスミドｐＣＣＭ７３をＸｈｏＩ及びＮｏｔ
Ｉで切断し、ｐＥＡＧ５４３のＥａｒ１−Ｎｏｔ１断片(ソニックヘッジホッグ
コード配列を含む、図４)及びオリゴヌクレオチド[5'TCG AGA AAA GAT GCG GAC
CGG GCA GGG GGT 3'：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５及び5'CGA ACC CCC TGC CCG GT
C CGC ATC TTT TC 3'](ＸｈｏＩ−ＥａｒＩ断片を形成し、ソニックヘッジホッ
グをアルファ因子のリーダー配列とイン・フレームで隣接させるための適当なコ
ード配列を作る)と連結した。

【０２００】 ソニックヘッジホッグ中のＫＥＸ２開裂部位変異の構築：ｐＵＢ５５をＸｈｏＩ
＋Ｂｂｓ１で消化し、合成オリゴヌクレオチド(各変異のために利用するオリゴ
ヌクレオチドについては、表５を参照されたい)(ソニックヘッジホッグのＮ末端
コード配列を含むＸｈｏＩ−ＢｂｓＩ断片を置き換える)と連結した。[注：ｐＵ
Ｂ５５は、複数のＢｂｓＩ部位を有するが、各々は、異なる４塩基対オーバーハ
ングを有するので、その混合物の再連結は、ｐＵＢ５５配列を、各連結反応に含
まれる新規なオリゴヌクレオチドの外側に造る。] 新規な制限部位は、各新規な
変異体のＸｈｏＩ−ＢｂｓＩ断片中に組み込まれた。

【０２０１】 デザートヘッジホッグのピチア・パストリスでの発現及びＫＥＸ２部位変異の構
築：プラスミドｐＥＡＧ６８０中のデザートヘッジホッグコード領域を改変して
、Stratagene 社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異導入キットを用いて、Ｂｓｒ
ＧＩ及びＸｍａＩ部位を組み込んだ。ＢｓｒＧＩ用のオリゴＨＯＧ−７１１及び
ＨＯＧ−７１２を用いて、ｐＥＡＧ６８０を変異させて、ｐＭＭＣ１１を生成し
た。ＸｍａＩ用のオリゴヌクレオチドＨＯＧ−７２０及びＨＯＧ−７２１を用い
て、ｐＭＭＣ１１を変異させて、ｐＭＭＣ１３を生成した。野生型デザートヘッ
ジホッグＮ末端ドメインのための発現用プラスミドを、ｐＭＭＣ１３のＸｍａＩ
−Ｎｏｔ１断片をｐＫＳ３１４中の同じ部位にサブクローン化することにより作
成した。[ｐＫＳ３１４は、ｐＫＳ３１０のソニックヘッジホッグＱＲＲＰＰ変
異体コード配列を含む(表５)。ｐＫＳ３１０のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、Ｎｃ
ｏＩ部位を突然変異導入により破壊されたＨＩＳ４領域に有するｐＰｉｃ９(Inv
itrogen)の誘導体、ｐＷＳ１０６にサブクローン化した。ｐＫＳ３１４中のＸｍ
ａＩ部位は、ソニックヘッジホッグのコドン３及び４(ＰｒｏＧｌｙ)配列内にあ
る。ソニック及びデザートヘッジホッグの最初の４残基は同じであるので、ソニ
ックコード配列は、デザートヘッジホッグ構築物のために用いることができる。
ｐＫＳ３１０は、第二のＸｍａＩ部位をＫａｎ遺伝子内に含み、それ故、デザー
トヘッジホッグ構築物のこのシリーズには適さなかった。] デザートヘッジホッグのＫＥＸ２部位内の変異を、 (１)ｐＭＭＣ１３からのＤ
ＨＨコード領域を含むＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ断片、(２)ＤＨＨのＸｍａＩ−Ｂｓ
ｒＧＩ領域を含むオリゴヌクレオチド(表Ｋ−２及びＫ−３に示したオリゴヌク
レオチド)及び(３)ｐＫＳ３１４からのプラスミド主鎖(ＮｏｔＩ−ＸｍａＩ断片
)を用いる３部分連結により構築した。

【０２０２】 インディアンヘッジホッグのピチア・パストリスでの発現及びＫＥＸ２部位変異
の構築：プラスミドｐＥＡＧ６５７(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４)は、イディアン
ヘッジホッグコード配列とＧｌｙＸＸＸコドンの後ろに停止コドンを有するｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔである。ｐＥＡＧ６５８(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５)は、イ
ンディアンヘッジホッグコード配列及び、インディアンヘッジホッグコード配列
とＦｃ免疫グロブリンコード配列との免疫グロブリンのヒンジ領域での融合に適
した残基内に工作したＳａｌＩ部位を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔである。そ
の後の操作を容易にするために、ＳｐｅＩ及びＸｍａＩ部位を位置指定突然変異
導入法によってｐＥＡＧ６５８に導入した。ｐＥＡＧ６５８をオリゴヌクレオチ
ドＨＯＧ−７０９及びＨｏｇ−７１０を用いて突然変異させて、ＳｐｅＩを導入
してｐＭＭＣ１０を生成した。次いで、ｐＭＭＣ１０を、オリゴヌクレオチドＨ
ＯＧ−７２２及びＨＯＧ−７２３を用いて変異させて、Ｘｍ１部位を導入して、
ｐＭＭＣ１２を生成した。次いで、新規なＳｐｅＩ及びＸｍａＩ部位を、ｐＥＡ
Ｇ６５７の小さいＢｂｓＩ−ＤｒａＩＩＩ断片とｐＭＭＣ１２の大きいＢｂｓＩ
−ＤｒａＩＩＩ断片を連結することによりｐＥＡＧ６５７にサブクローン化した
。野生型インディアンヘッジホッグのピチア・パストリスでの発現のための発現
用プラスミド(ｐＭＭＣ１８)を、ｐＭＭＣ１４のＸｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＫ
Ｓ３１４の同じ部位にサブクローン化することによって構築した。ＫＥＸ２部位
変異体のための発現ベクター(ｐＭＭＣ１９、ＲＫＲＰＰ；及びｐＭＭＣ２０、
ＱＲＲＰＰ)を、ｐＭＭＣ１４のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ断片、ｐＫＳ３１４のＸｍ
ａＩ−ＮｏｔＩ主鎖、及びＫＥＸ２部位変異を含むＸｍａＩ−ＳｐｅＩ断片を形
成するオリゴヌクレオチドを連結することによって構築した(表５及び６に列記)
。

【０２０３】

【表４】

【０２０４】

【表５】

【０２０５】

【表６】

【０２０６】

【表７】

【０２０７】 ヘッジホッグ−Ｉｇ融合タンパク質の構築 １０Ｔ１／２アッセイにおいて活性を有する変異を、ＳＨＨ−Ｆｃ(ｍｕＩｇ
Ｇ１)プラスミドｐＵＢ１１４(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１)にサブクローン化し
たが、これは、マウスＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域に融合された野生型ＳＨ
Ｈドメインを有する。

【０２０８】 ｐＵＢ１１４中のＦｃ領域は、グリコシル化部位変異を含み[Ａｓｎ２９７Ｇ
ｌｎ、ＰＵＢ５５及びｐＵＢ１１４プラスミドは、ＳＨＨに融合されたＦｃドメ
インをコードする領域の外側で同一である。ｐＵＢ１１４と同一であるが、ヒト
ＩｇＧ １又はマウスＩｇＧ２ａＦｃ領域を含むプラスミドが、それぞれ、ｐＵＢ１１５
(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２)及びｐＵＢ１１６(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３)であ
る。(表４も参照されたい)

【０２０９】 従って、ＳＨＨ中の変異は、ｐＵＢ１１４のＡＯＸ１プロモーター中のＳＨＨ
の上流のＳａｃ１部位からＡｖｒ２部位又はＳｐｈ１部位(両方ともＳＨＨ変異
の下流にあるが、ＳＨＨ−Ｆｃ融合部位よりは上流)までにサブクローン化され
た。

【０２１０】 タンパク質を発現する酵母株の構築のために、プラスミドをＳｔｕ１で消化し
て、ピチア・パストリスＧＳ１１５中に、１Ｍ ソルビトール(Invitrogen)中で
のエレクトロポレーションにより又はＬｉ塩トランスフォーメーション手順(Ｆ
ｒｏｚｅｎ ＥＺ酵母トランスフォーメーションキット、カリフォルニア、Orang
e, Zymo Research)によってトランスフォームした。Ｈｉｓ＋トランスフォーマ
ントをＭＤ寒天上で選択した。コロニーをＹＰＤ寒天上で精製し、５ｍｌ ＢＭ
ＭＹ(２％ メタノール)培地中でのタンパク質発現のために培養した。ＢＭＭＹ
培養上清を１又は２日目に集めて(１日の収集物をＴＣＡ沈殿により濃縮した)、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により分析して、クリップされたＳ
ＨＨとクリップされてないＳＨＨを識別した。

【０２１１】 タンパク質精製 精製のためのタンパク質の大規模な調製物を、下記のようにして調製した： ＢＭＧＹ中の接種物(後期対数増殖期〜定常期)をフェルンバッハフラスコ中の１
Ｌ ＢＭＧＹに加えて、１５０ｒｐｍで２〜３日間インキュベートした。定常期
のＢＭＧＹ培養物を遠心分離して、１Ｌからの細胞ペレットをＢＭＭＹ(２％メ
タノール)に再懸濁し、フェルンバッハフラスコ中で、３０℃で２〜３日間イン
キュベートした。ペプスタチンＡ(４４μＭ)を、ＳＨＨ−Ｆｃ融合タンパク質の
発現のために、ＢＭＭＹ培地に加えた。

【０２１２】 Ａ．ヘッジホッグＮ末端ドメイン塩基性領域変異体の精製 ピチア細胞を遠心分離により除去した後に、調整培地を水で１０倍に希釈して
塩濃度を下げてから、３Ｋカットオフスパイラルフィルター(Amicon)を用いて再
濃縮した。この濃縮物を、５０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ６．０)で平衡化し
たＣＭ−Ｐｏｒｏｓ(登録商標)カラム(Perseptive Biosystems)に加えた。０〜
０．８Ｍ ＮａＣｌの勾配による溶出は、２つのヘッジホッグピークを分離した
。

【０２１３】 第一のピークは、完全長ヘッジホッグ(システイン又はグルタチオンのジスル
フィドとして)とクリップされたヘッジホッグ(ＫＥＸ２タンパク質分解部位が存
在する場合)の混合物を含んだ。第二のピークは、完全長ジスルフィド結合した
ヘッジホッグホモダイマーであった。このタンパク質の第二のピークを用いて、
第一のピークが有意の量のクリップされた物質を含む場合に、生物活性を評価し
た。

【０２１４】 これらのピークを別々にプールして、１０ｍＭ ＤＴＴで還元して、５ｍＭ リ
ン酸ナトリウム(ｐＨ５．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ ＤＴＴに対
して透析した。このタンパク質のＮ末端システインが他のアミノ酸で置換された
場合には、ＤＴＴは用いなかった。この単一の精製ステップは、この調整培地中
の低レベルの夾雑タンパク質のために、＞９５％の純度を達成するのに十分であ
る。純度は、４〜２０％勾配ゲル(Novex)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定し
て、クーマシーブルーにより染色した。正体を質量分析により確認し、効力は、
細胞ベースの生物活性アッセイ(下記参照)を用いて分析した。

【０２１５】 Ｂ．ヘッジホッグ−Ｉｇ融合タンパク質構築物の精製 ピチア細胞を、調整培地から遠心分離により除去してから、プロテインＡファ
ーストフロー(登録商標)(Pharmacia)に加えた。ヒトＩｇＧ１(ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４０)又はマウスＩｇＧ２Ａ配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２)を利用する構
築物からのタンパク質を、プロテインＡに直接加えた。マウスＩｇＧ１配列を利
用する構築物を、水で１０倍に希釈して塩濃度を下げ、３Ｋカットオフスパイラ
ルフィルター(Amicon)を用いて再濃縮し、ｐＨを、ホウ酸ナトリウム緩衝剤(ｐ
Ｈ８．５)を５０ｍＭの終濃度まで加えて調整した。

【０２１６】 ＨＨＩｇを、２５ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ２．８)を用いて溶出させ、そ
れらの画分を、０．１容の０．５Ｍ リン酸ナトリウム(ｐＨ６)を含む管に集め
てｐＨを再調整した。次いで、プロテインＡ溶離液を、０．５ｍＭ リン酸ナト
リウム(ｐＨ６)で８倍に希釈して、５０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ６．０)で
平衡化したＣＭ−Ｐｏｒｏｓ(登録商標)カラム(Perseptive Biosystems)に加え
た。０〜０．８Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いる溶出は、２つのＨＨＩｇピークを分
離した。

【０２１７】 第一のピークは、ダイマーのＨＨＩｇポリペプチドの一つがヒンジ近くの配列
でタンパク質分解により開裂されており、それ故、このダイマーが唯一つのＨＨ
Ｎ末端ドメインを含む「１アーム」タンパク質である。第二のピークは、２つの
完全長ＨＨＩｇ鎖を有するダイマーである。これらのピークを別々にプールして
、１０ｍＭ ＤＴＴで還元して、５ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ５．５)、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ ＤＴＴに対して透析した。このタンパク質のＮ末
端システインが他のアミノ酸で置換されている場合には、ＤＴＴを用いなかった
。これらの２つの精製ステップは、＞９５％の純度を達成する。純度は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥを４〜２０％勾配ゲル(Novex)上で行ってクーマシーブルーで染色す
ることにより測定した。正体を質量分析により確認して、効力は、細胞ベースの
生物活性アッセイ(下記参照)を用いて分析した。

【０２１８】 質量分析法 精製したタンパク質の分子質量を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法(
ＥＳＩ−ＭＳ)により、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ三重四重極質
量分析計で測定した。試料を、Ｒｅｌｉａｓｉｌ(登録商標)Ｃ４カラム(１ｍｍ
×５ｃｍ)を有するｏｎ−ｌｉｎｅ Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｍｉｃ
ｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｚｅｒシステムを用いて脱塩した。すべてのエ
レクトロスプレーマススペクトルデータをＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎ
ｘデータシステムを用いて処理した。

【０２１９】 実施例２：薬物速度論及び薬力学生物活性のアッセイ ヘッジホッグタンパク質を、生物活性について、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞にお
けるアルカリホスファターゼ誘導を測定する細胞ベースのアッセイ(Pepinsky等
、JBC 273,14037-14045(1998))で試験した。

【０２２０】薬物速度論 表３に示したヘッジホッグ−Ｉｇ融合タンパク質を、以下に例示するように、
マウスにおけるスクリーニング薬物速度論において、ｗｔ ｓｈｈ Ｎ末端ドメイ
ンと比較する。この研究において、２匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスに、５０μｇ
の各タンパク質を静脈注射した。全タンパク質の注射後、５分及び５時間又は７
時間で、眼からの採血を行った。最後の採血を注射の２４時間後に行った。

【０２２１】 すべての採血から調製した血清を、直ちにドライアイス上で凍結して、−７０
℃に保存した。血清中のヘッジホッグレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによっ
て測定した。該ＥＬＩＳＡでは、このタンパク質を、被覆した抗ヘッジホッグｍ
Ａｂ５Ｅ１により及び、その後、第二抗体(ヘッジホッグの１５Ｎ末端アミノ酸
に対するウサギポリクローナル抗体)により捕捉して、ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合
体により検出する。血清試料の様々な希釈物についての値を、試験する特定のタ
ンパク質について作成した標準曲線からバックフィットさせた。これらの標準曲
線は、血清に加えた既知のレベルのタンパク質の濃度を測定することにより確認
した。

【０２２２】 結果 ＲＫＲＨＰ変異：この変異は、「Ｎ−１１」クリップ部位が、Ｎ−１０クリップ
が起きないときに、ＫＥＸ２により認識されうるかどうかを試験するために構築
した。予想されるように、この変異体は、無傷のＳＨＨとクリップされたＳＨＨ
の両者の混合物として発現される。我々は、正確なクリップ部位を決定しなかっ
たが(質量分析によるＮ末端配列決定により)、Ａｒｇ１１−Ｈｉｓ１２結合の開
裂により生じると推定している。このタンパク質は、野生型のＳＨＨ程には広く
クリップされない。それ故、我々は、このＮ−１１部位は、実際、Ｎ−１０部位
より劣ったＫＥＸ２部位であると結論している。このＮ−１１ＫＥＸ２部位は、
ソニックヘッジホッグタンパク質のＫＥＸ２クリッピングを阻止するために突然
変異によって除去されなければならない。

【０２２３】 ＲＫＲＰＰ変異：この変異は、ＳＨＨの塩基性領域内の両ＫＥＸ２部位を破壊す
る。我々は、一の塩基性残基による他のものの保存的置換[Ｌｙｓ９Ａｒｇ及び
Ａｒｇ１０Ｌｙｓ]は、活性に対して有害ではないと推定している。ソニックヘ
ッジホッグのインディアンヘッジホッグはＰｒｏをこの部位に有しているので、
Ｈｉｓ１２Ｐｒｏ置換を選択した。このタンパク質を構築したとき、それは、予
想されたように、クリッピングを示さなかった。１０Ｔ１／２アッセイで試験し
た場合、ＲＫＲＰＰ変異型タンパク質は、活性を示さなかった。この変異は、３
つのアミノ酸置換[Ｌｙｓ９Ａｒｇ、Ａｒｇ１０Ｌｙｓ及びＨｉｓ１２Ｐｒｏ]を
有するので、我々は、何れの置換が活性を破壊したのかをいうことはできない。
しかしながら、Ｌｙｓ９は、他のソニックヘッジホッグ同族体においてはＡｒｇ
残基であるので、これが不活性の原因であることは、ありそうにない。我々は、
Ｈｉｓ１２Ｐｒｏ変異がこのタンパク質の不活性の原因であると仮定している。

【０２２４】 ＧＳＲＫＲＰＰＲＫ(「インディアン様」ソニックヘッジホッグ)。このインディ
アンソニックヘッジホッグ配列は、２つのＫＥＸ２部位を有するソニックヘッジ
ホッグと比較して、塩基性領域内にただ一つのＫＥＸ２部位しか有していない。
ＨｉｓのＰｒｏでの置換が、第二のＫＥＸ２部位の排除の原因である。この領域
におけるソニックとインディアンの他の違いは、インディアンヘッジホッグの３
塩基性モチーフの直ぐ上流のＳｅｒ残基の挿入である。我々は、このＳｅｒ付加
が、ソニックヘッジホッグと比べてインディアンヘッジホッグ中の余分なＰｒｏ
残基を補正することができるものと仮定している。従って、Ｓｅｒ挿入とＨｉｓ
からＰｒｏへの変異の両方を含む変異体を構築した。配列ＧＳＲＫＲＰＰＲＫが
、ソニックヘッジホッグ中のＧＫＲＲＨＰＫＫ配列に置き換わった。ＧＳＲＫＲ
ＰＰＲＫは、ソニックと、５つの位置(ＧＳＲＫＲＰＰＲＫ)で異なるが、インデ
ィアン配列とは、唯一つの位置(ＧＳＲＫＲＰＰＲＫ)で異なるだけであることに
注意されたい。この変異体は、ＫＥＸ２クリッピング示さず、１０Ｔ１／２アッ
セイにおいて測定可能な活性を有した(もっとも、それは、野生型ソニックヘッ
ジホッグより少し活性が低いが)。

【０２２５】 ＫＫＫＨＰ、ＲＫＫＨＰ、ＲＱＲＨＰ変異体：これらの変異体は、Ｈｉｓ１２残
基を保持し且つＫＥＸ２認識部位を除去すると同時に、可能な限りの陽性電荷を
保持するようにデザインした。これらの変異体の３つすべては不活性であり、従
って、ＳＨＨ中の３つの残基Ｌｙｓ９Ａｒｇ１０Ａｒｇ１１配列が活性に必須の
特徴を含んでいるということを示している。このデータは又、ＲＫＲＰＰ変異体
中のＨｉｓ１２Ｐｒｏ変異が、このタンパク質により示された活性の喪失と無関
係であるという可能性をも高めた。ＲＫＲＰＰ及びＲＫＲＨＰ変異体は、Ｈｉｓ
１２位置でのみ異なるので、我々は、クリップされてないＲＫＲＨＰ変異型タン
パク質の活性を試験した。

【０２２６】 このクリップされてないＲＫＲＨＰ変異型タンパク質を、クリップされた種か
ら精製して、１０Ｔ１／２アッセイで試験したが、それは、検出可能な活性を有
しなかった。ＲＫＲＨＰタンパク質は、不活性なＲＫＲＰＰ変異体中に存在する
３つの置換の内の２つを有するので、それは、見かけの保存的Ｌｙｓ９Ａｒｇ及
び／又はＡｒｇ１０Ｌｙｓ置換が１０Ｔ１／２アッセイにおいてＳＨＨ活性を除
去するのに十分であることを示している。 ＱＲＲＰＰ及びＱＲＫＨＰ変異体：これらの変異体は、Ａｒｇ１０残基を維持し
て、正に帯電した残基の数を最大にすると同時にＫＥＸ２部位を破壊するために
構築した。両変異体は、野生型タンパク質と同じ高さの活性を有した。我々は、
Ａｒｇ１０残基を維持することがソニックヘッジホッグ活性に決定的に重要であ
ると結論している。

【０２２７】 結論 野生型ソニックヘッジホッグ配列を有する最初のＨＨＩｇ融合構築物を発現させ
て精製した際に、それは、Ｒ１０−Ｒ１１結合でクリップされてＮ−１０タンパ
ク質を与えることが見出された。それ故、このタンパク質は、以前の仕事が、切
り詰められたＮ末端を有するヘッジホッグタンパク質はアンタゴニストとして作
用する(上記参照)ということを確立しているので、アゴニストとしての開発に適
さなかった。Ｎ−１０部位の配列は、それが、３つの残基Ｋ／Ｒ−Ｒ−Ｘ(ここ
に、Ｘはプロリンでない)を必要とするＫＥＸ２様プロテアーゼによるタンパク
質分解の標的たりうることを示唆した。この仮説は、発現されて精製されたとき
に無傷のタンパク質を生成するこの開裂部位の配列の変異体の構築により確認さ
れた(表７)。しかしながら、殆どの変異体は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにお
いて不活性であり、活性を保持するためには、アルギニン残基が配列中の決定的
位置に存在しなければならないということが見出された。最も強力で且つタンパ
ク質分解に耐性の配列を、ＨＨＩｇ融合タンパク質の他のシリーズの構築のため
に選択したが、その幾つかは、効力を増して酸化の問題を低減させるためにＮ末
端システインのイソロイシンでの置換を含んだ。これらの融合タンパク質を発現
させて精製し、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて一層強力であることを示し
た(表８)。マウスにおける薬物速度論的データは、これらの融合タンパク質が、
ソニックヘッジホッグＮ末端ドメインと比較して相当増大された血清中での半減
期を有することを示している。

【０２２８】

【表８】

【０２２９】

【表９】

【０２３０】

【表１０】

【０２３１】 実施例３：霊長類における比較用薬物速度論及び薬力学 ヘッジホッグ融合物と天然のヘッジホッグを用いて、比較用の研究を行って、
それらの霊長類における相対的安定性及び活性を測定する。これらの研究におい
て、霊長類におけるヘッジホッグ融合物の薬物速度論及び薬力学を、天然のヘッ
ジホッグのそれと比較し、合理的な推論をヒトに拡張することができる。

【０２３２】 動物及び方法 研究のデザイン これは、ヘッジホッグ融合タンパク質と非融合ヘッジホッグの、比較のための
薬物速度論及び薬力学を評価する、並行するグループ、反復投与量による研究で
ある。

【０２３３】 健康な霊長類(好ましくは、アカゲザル)をこの研究に用いる。投薬する前に、
すべての動物を、病気の徴候について、試験する製品の投与の前の１４日間に２
回、Lab Animal Veterinaryにより評価し；一回の評価は、試験する製品の最初
の投与前２４時間以内でなければならない。健康な動物のみに、試験する製品を
投与する。評価には、臨床病理学ベースライン及びヘッジホッグに対する抗体レ
ベルのベースラインのための一般的な物理的検査及び投与前採血が含まれる。す
べての動物の体重を測定し、試験製品の投与前２４時間以内に体温を記録する。

【０２３４】 １２匹の被験動物を記録して、ヘッジホッグ(融合しているか又はしていない
もので、他の点では同一のヘッジホッグ)を受ける３つのグループに割り振る。
投与は、皮下(ＳＣ)又は静脈(ＩＶ)経路の何れかによる。６匹の雄動物に、ＩＶ
経路で試験製品を投与し(３／治療)、他の６匹の雄動物には、ＳＣ経路で投与す
る(３／治療)。すべての動物は、ヘッジホッグ処理未経験でなければならない。
各動物に、２回投与し；投与量を４週間で分割投与する。この投与量は、１．０
ｍＬ／ｋｇである。

【０２３５】 薬物速度論的試験のために、各注射の後０、０．０８３、０．２５、０．５、
１、１．５、２、４、６、８、１２、２４、４８、７２及び９６時間で採血をす
る。血液試料を、ヘッジホッグの測定のために、研究する薬物の投与の後、０、
２４、４８、７２、９６、１６８、３３６、５０４時間で採血する。

【０２３６】 研究期間中の評価には、毒性の徴候について、投与の３０分後及び１時間後に
行う臨床的観察が含まれる。毎日のケージサイドでの観察を行って、全体的外観
、毒性の徴候、不快、及び行動の変化を記録する。体重及び体温を、投与後２１
日間、一定の間隔で記録する。

【０２３７】 アッセイ方法 血清中のヘッジホッグのレベルを、上記のように、ＥＬＩＳＡを用いて定量す
る。

【０２３８】 薬物速度論及び統計的方法 ＲｓｔｒｉｐＴＭソフトウェア(MicroMath, Inc., ユタ、Salt Lake City)を
用いて、データを、薬物速度論的モデルに適合させる。各グループにつき、幾何
平均濃度を時間に関してプロットする。アッセイ結果は希釈度で表されているの
で、幾何平均が、算術平均より適当であると考えられる。血清のヘッジホッグレ
ベルを、ベースラインの値に調整し、検出可能でない血清濃度を５Ｕ／ｍｌに設
定するが、これは、検出の下限の１／２を表している。

【０２３９】 ＩＶ注入データに関して、２コンパートメントＩＶ注入モデルは、検出可能な
血清濃度に適合し、ＳＣデータは、２コンパートメント注入モデルに適合する。

【０２４０】 下記の薬物速度論的パラメーターを計算し： (ｉ)観察されたピーク濃度、Ｃ_max(Ｕ／ｍｌ)； (ii)０〜４８時間の曲線下面積ＡＵＣ(台形公式使用)； (iii)排除半減期； そして、ＩＶ注入データから下記を計算する(ＩＶを用いた場合)： (iv)分布半減期(ｈ)； (ｖ)クリアランス(ｍｌ／ｈ) (vi)見かけの分布容積、Ｖｄ(Ｌ)。

【０２４１】 ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ(バージョン１．０、Scientific Consulting Inc., ノー
スカロライナ、Apex)ソフトウェアを用いて、ＳＣ及びＩＭ注射後の排除半減期
を計算する。ヘッジホッグについては、時間に関する算術平均が、各グループに
ついて与えられる。Ｅ_max、ベースラインからの最大変化を計算する。Ｃ_max、Ａ
ＵＣ及びＥ_maxを、変動の一方向分析にかけて、投与グループの比較を行う。Ｃ_{m ax} 及びＡＵＣは、対数をとってから分析し；幾何平均を報告する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ソニック、インディアン及びデザートヘッジホッグのＮ末端配列を示した図で
ある。

【図２】 コンセンサスヘッジホッグ配列を示した図である。

【図３】 切り取り（クリップ）部位を示したソニックヘッジホッグのＮ末端配列を示し
た図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/435 １１１ 16/46 Ｃ０７Ｋ 14/435 19/00 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エレン エイ．ガーバー アメリカ合衆国 02138 マサチューセッ ツ、ケンブリッジ、ドネル ストリート 14 (72)発明者 フレデリック アール．テイラー アメリカ合衆国 02186 マサチューセッ ツ、ミルトン、ガリバー ストリート 98 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 HA01 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA25 BA02 BA08 BA22 BA23 BA41 CA18 DA27 DA40 NA13 NA14 ZA021 ZA151 ZA161 ZA221 ZB212 ZB261 ZC412 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 CA50 EA21 EA28

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｚを有する単離されたポリペプチド (式中、Ｘは、ヘッジホッグタンパク質のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列又は
   その部分を有するポリペプチドであり； Ｙは、随意のリンカー部分であり；そして Ｚは、ヘッジホッグ以外のポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチド
   である)。
2. 【請求項２】 Ｘが、ソニックヘッジホッグタンパク質、インディアンヘッ
   ジホッグタンパク質及びデザートヘッジホッグタンパク質よりなる群から選択す
   るアミノ酸配列又は部分を有するヘッジホッグタンパク質である、請求項１に記
   載の単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 Ｘが、下記の特性の少なくとも一つを有するヘッジホッグア
   ンタゴニストである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド：
4. 【請求項４】 Ｘが、下記の特性の少なくとも一つを有するヘッジホッグア
   ゴニストである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド：
5. 【請求項５】 ヘッジホッグが、疎水性部分と結合体化された、請求項３又
   は４に記載の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 Ｚが、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分である
   、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 前記の定常領域の少なくとも一部分が、クラスＩｇＭ、Ｉｇ
   Ｇ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥから選択するクラスの免疫グロブリンに由来する
   、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 クラスがＩｇＧである、請求項７に記載の単離されたポリペ
   プチド。
9. 【請求項９】 定常領域の少なくとも一部分が、少なくともヒンジ、ＣＨ２
   及びＣＨ３ドメインを含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 ヘッジホッグタンパク質のアミノ酸配列又はその一部分よ
    りなるアミノ末端領域を有し且つヘッジホッグ以外のタンパク質の少なくとも一
    部分を含むカルボキシ末端領域を有する融合タンパク質。
11. 【請求項１１】 Ｘが、ソニック、インディアン又はデザートヘッジホッグ
    よりなる群から選択するヘッジホッグである、請求項１０に記載の単離されたタ
    ンパク質。
12. 【請求項１２】 Ｘが、変異したＫＥＸ２プロテアーゼ認識配列を有するヘ
    ッジホッグであり、その配列が[Ａｒｇ又はＬｙｓ]−Ａｒｇ−[Ｘ](式中、Ｘは
    Ｐｒｏでない)を含む、請求項１０に記載の単離されたタンパク質。
13. 【請求項１３】 ヘッジホッグが、誘導体化されている、請求項１１に記載
    の単離されたタンパク質。
14. 【請求項１４】 誘導体を、疎水性部分及びポリアルキレングリコールポリ
    マーから選択する、請求項１３に記載の単離されたタンパク質。
15. 【請求項１５】 ヘッジホッグ以外のタンパク質の少なくとも一部分が、免
    疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分である、請求項１０に記載の単離さ
    れたタンパク質。
16. 【請求項１６】 前記の定常領域の少なくとも一部分が、クラスＩｇＭ、Ｉ
    ｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥから選択するクラスの免疫グロブリンに由来す
    る、請求項１５に記載の単離されたタンパク質。
17. 【請求項１７】 クラスがＩｇＧである、請求項１６に記載の単離されたタ
    ンパク質。
18. 【請求項１８】 定常領域の少なくとも一部分が、少なくともヒンジ、ＣＨ
    ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１５に記載の単離されたタンパク質。
19. 【請求項１９】 表５の配列から選択する変異したＫＥＸ２プロテアーゼ認
    識配列を有する、請求項１２に記載の単離されたタンパク質。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１０のタンパク質をコードする単離されたＤＮ
    Ａ配列。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載のＤＮＡ配列及び発現制御配列を含み、
    該発現制御配列が該ＤＮＡに機能的に結合されている組換えＤＮＡ。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の組換えＤＮＡ配列によりトランスフォ
    ームされた宿主細胞。
23. 【請求項２３】 下記を含む組換えポリペプチドを生成する方法： (ａ)請求項２２に記載の宿主細胞の集団を用意し；(ｂ)該細胞集団を、前記の組
    換えＤＮＡによりコードされるポリペプチドが発現される条件下で増殖させ；そ
    して(ｃ)発現されたポリペプチドを単離する。
24. 【請求項２４】 請求項１〜１０に記載のヘッジホッグ融合タンパク質の有
    効量を含む医薬組成物。