NO324815B1 - Anvendelse av et TNF-beta-lignende protein, eller et DNA- eller RNA molekyl som koder for det samme, for fremstilling av et preparat for behandling av androgen-uavhengig prostatacancer - Google Patents

Abstract

Denne oppfinnelsen tilveiebringer proteiner som selektivt inhiberer prolifereringen av androgen-uavhengige prostata-cancerceller. Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et nukleinsyremolekyl som koder for disse proteinene, inklusive et nukleinsyremolekyl passende for bruk i genterapi for behandling av et individ rammet av androgen-uavhengig prostata-cancer. Denne oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere en sammensetning som selektivt dreper androgen-uavhengige prostata-cancerceller, og omfatter disse proteinene og en toksisk del funksjonelt heftet dertil. Til slutt tilveiebringer denne oppfinnelsen relaterte farmasøytiske sammensentinger og metoder for behandling av androgen-uavhengig prostata-cancer.

Description

Foreliggende opprinnelse vedrører anverndelse av et TNF-lignende protein for

fremstilling av et preparat for behandling av androgen-uavhengig prostatacancer. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av nukleinsyremolekyler, slik som DNA og

RNA, som koder for nevnte TNF-lignende protein for fremstilling av et preparat for behandling av androgen-uavhengig prostatacancer.

Karcinoma i prostata ("prostatacancer") er en av de mest vanlige typer for malignitet.

Blant menn som er 50 år eller eldre, bærer 30% foci av cancer i prostata. Bare 1% av

disse rammede menn vil bli riktig diagnostisert med prostatacancer hvert år, som kaster lys over en forskjell mellom høy insidens av sykdom, som avsløres ved autopsi og mye lavere insidens avslørt klinisk. 11992 ble 134.000 menn i USA diagnostisert med prostatacancer, og 32.000 døde av denne sykdommen. Av alle menn som ble klinisk diagnostisert med prostatacancer, døde mer enn halvparten innen 10 år, og mer enn to tredeler fikk lokal eller systemisk progresjon til tross for terapi. I det senere har testing for serum-prostataspesifikke angitgen (PSDA) gjort det mulig med en tidligere detek-

sjon, men det er uklart hva den naturlige progresjon av sykdommen er i pasienter med forhøyet PSA men uten store tumorbyrder.

For cancer som er begrenset til prostata, har primærstråling eller radikal prostatektomi

vært omtrent like effektivt. Tilbakefall kan bli behandlet med stråling for primær kirur-

gi, og med vanskelighet, kirurgi for primær radioterapi.

Metastatiske prostatalesjoner går hovedsakelig til ben, og kan bli behandlet ved å minke androgen-nivået i individet. Dette kan bli gjort kjemisk ved å blokkere adrenal- og gona-

dal androgenproduksjon med medikamenter, eller kirurgisk ved kastrering (som ikke blokkerer adrenalproduksjon). Observasjonen av at pasientene vil respondere til slik hormonmanipulering i bare 6 måneder, eller der omkring, for deretter bli værre,

indikerer at metastatiske prostatalesjoner kan bli androgenuavhengig. Denne antydningen er støttet av funnet at dyrkede cellelinjer fra prostatakarcinomer inneholder blandede kloner. Disse blandede kloner er av tre typer: Androgen-avhengighet som overlever bare med tilstedeværelse av eksogent androgen, androgen-sensitiv som forblir levende ved fravær av androgen og proliferativ i dens tilstedeværelse; og androgen-uavhengig som kan overleve såvel som proliferere i fraværet av androgener.

Blant indidvider som lider av prostatacancer, utviser en signifikant populasjon klinisk androgen-uavhengighet, dvs. tilstedeværelsen av prostatacancerceller som fortsetter å prolifere selv etter terapeutisk eliminering av androgener. Kirkurgi for å fjerne en pros-tatatumor resulterer ofte i fjerning av androgen-uavhenige celler sammen med andre typer celler. Imidlertid er kirurgi alene sjeldent effektivt i denne sammenheng, siden minst noen androgen-uavhengige celler blir igjen. Følgelig eksisterer det et sterkt - og ikke oppfylt - behov for metoder for behandling av prostatacancer ved å bruke farma-søytiske midler som spesifikt inhiberer prolifereringen av androgenuavhengige cancerceller.

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelsen av et isolert eller rekombinant protein omfattende aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat, for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

I en utførelsesform ifølge det første aspekt av oppfinnelsen er en toksisk del funksjonelt heftet til nevnte isolerte eller rekombinante protein.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform ifølge det første aspekt av oppfinnelsen er nevnte individ et menneske.

Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelsen av et DNA- eller RNA-nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for, aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, hvori molekylet er en vektor passende for bruk i genterapi, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

I en foretrukket utførelsesform ifølge det andre aspekt av oppfinnelsen er nevnte individ et menneske.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser DNA-sekvensen av GF-2H.

Figur 2A viser en sammenligning mellom aminosyresekvensen av modent GF-2H-protein (identifisert som "ACTIVE2H2") og de fra andre medlemmer av TGF-beta-familien.

Figur 2B viser aminosyresekvensen av det umodne GF-2H-proteinet.

Figur 3A viser et rensningsskjema av rGF-2H.

Figur 3B viser et rensningsskjema av rGF-2H.

Figur 4 viser aminosyresekvensen av modent GF-2H.

Figur 5 viser ekspresjonen av GF-2H-kodende mRNA i forskjellig vev.

Figur 6 viser moduleringen av prostatacancercellelinje PC-3 av modent GF-2H. Figur 7 viser modulering av prostatacancercellelinje PC-3 av modent TGF-beta.

Transformeringsvekstfaktor type-beta (TGF-beta) representerer en stor familie av multi-funksjonelle faktorer som har forskjellige aktiviteter, TGF-beta er prototypiske for en superfamilie av vekst, differensering og morfogenesefaktorer, slike som inhibiner, akti-viner, Mulleria inhiberingssubstans, "decapentaplegic"-produkt og TGF-beta2. Disse faktorene er alle strukturelt beslektet med TGF-beta. I tillegg synes disse faktorene og andre beslektede med TGF-beta å være involvert i mange prosesser i vevsutvikling og reparasjon. (J. Massague, Ann. Rev. Cell. Biol., 1990,6:597-641; WPI Abstract nr. 95-380074 og JP-A-07.258.293; WO-A-96/18730). På grunn av disse forskjellige effekte-ne, kan TGF-beta-lignende proteiner som en gruppe ha potensiale for bruk som terapeut-iske midler for, inter alia. behandling av proliferative sykdommer. Imidlertid er det u-mulig å predikere hvorvidt et TGF-beta-lingende protein som har en kjent aminosyresekvens vil ha en inhiberende effekt på proliferering av celler som skyldes en spesiell sykdom uten også å forårsake klinisk uakseptable bieffekter, med fravær av ytterligere empirisk informasjon. Proteinene fra denne oppfinnelsen er TGF-beta-lignende basert på deres primære strukturer, og er istand til spesifikt å inhibere prolifereringen av androgenuavhengig prostatacancerceller. Imidlerid, ved fravær av ytterligere empirisk informasjon, kan denne spesifisiteten ikke ha blitt predikert basert på aminosyresekvensen alene. Følgelig er den spesifikke anti-prostatacanceraktiviteten til disse TGF-proteinlignende proteinene svært uventet.

Proteinet som omfatter aminosyresekvensen vist i SEQ JD NO 8, eller et funksjonelt derivat derav ("første protein"), inhiberer selektivt prolifereringen av androgenuavhengige prostatacancerceller når det blir kontaktet dermed under egnede betingelser.

Som brukt heri, er et rekombinant protein et protein som er ervervet gjennom bruken av rekombinant nukleinsyreteknologi. Et slikt rekombinant protein's primære struktur kan være identisk til den av dets naturlige forekommende motstykke, eller kan inneholde til-leggsaminosyreresidier. Ytterligere residier kan være tilstede for eksempel i proteinets N-terminale og/eller C-terminale ende. Med et isolert protein menes ethvert protein som har et kjemisk miljø inneholdende mindre enn 50% proteinforurensninger. Foretrukket har det isolerte proteinet et kjemisk miljø som inneholder mindre enn 10% pro-teinurenheter, og mer foretrukket mindre enn 1% urenheter.

Som benyttet heri er et protein som er et "funksjonelt derivat" av proteinet, hvis sekvens er vist i SEQ ID NO 8 i sekvenslisten, et protein som besitter strukturell (dvs. aminosyresekvens) og funksjonell (dvs. seleltivt inhiberer prolifereringen av androgen-uavhengige prostatacancerceller) likhet dertil. Strukturelt like proteiner inkluderer for eksempel proteiner som er forskjellige fra proteinet vist i SEQ ID NO 8 ved aminosyreresidiedelesjoner, insersjoner eller konservative substitusjoner som ikke i vesentlig grad mister proteinets evne til selektivt å inhibere proliferering av androgenuavhengig prostatacancerceller. Et eksempel på en konservativ aminosyresubstitusjon er substitusjonen av en leucinresidie for en isoleucinresidie.

Som brukt her, er en "androgen-uavhengig" prostatacancercelle en prostatacancercelle

som kan overleve (dvs. forbli levende) såvel som proliferere ved fravær av androgener. Som brukt heri betyr "proliferering" veksten av cellepopulasjon gjennom celledeling, og "selektiv inhibering" av androgenuavhengig celleproliferering betyr å redusere in vitro-raten av androgenuavhengig celleproliferasjon ved minst 50% uten å redusere in vitro-raten av HeLa-celle-proliferering med mer enn 20% ved mettede betingelser og, som målt ved et passende tidspunkt (f.eks. 72 timer etter initiell kontakt med dette proteinet). Foretrukket er in vitro-raten av androgen-uavhengig celleproliferering redusert med minst 90%, uten at in vitro-raten hos HeLa-celleproliferering er redusert med mer enn 10%. Raten av celleproliferering kan lett bli målt ved bruk av kjente metoder, slik som merket tymidininkorporeringsmetode beskrevet heri nedenfor.

Passende betingelser under hvilke det første protein selektivt inhiberer prolifereringen av androgenuavhengige prostatacancerceller når de blir kontaktet dermed, betyr fysiologiske betingelser, dvs. det kjemiske miljø som omgir androgenuavhenige prostatcancerceller in situ som kan tillate bindingen av en androgenuavhengig prostata-cancercelleoverflatereseptor til dens korresponderende naturlig forekommende ligand. Slike betingelser kan lett bli duplikert in vitro ifølge kjente metoder.

Som nevnt ovenfor, vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelse av et isolert eller rekombinant protein omfattende aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat, for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

I en mulig utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en toksisk del er funksjonelt heftet til nevnte isolerte eller rekombinante protein.

Den toksiske delen kan være et proteinøst toksin. I en utførelsesform er det proteinøse toksinet selektert fra gruppen bestående av ricin, tetanustoksin, difteritoksin og suben-heter og fragmenter derav. Toksindelen kan også være et radionukleid. I en annen utfør-elsesform er den toksiske delen et a- eller 6-emitterende radionukleotid inklusive - men ikke begrenset til 1251, 1311, 90Y, 2,<2>Bi. Metoder for funksjonell tilhefting av toksiske deler til proteiner, er vel kjent innen fagfeltet.

Farmasøytisk akseptable bærere er velkjente for de som kjenner fagfeltet og inkluderer - men er ikke begrenset til - 0,01-0,1M og fortrinnsvis 0,05M fosfatbuffer eller 0,8% saltlake. I tillegg kan slike farmasøytisk akseptable bærere være vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsninger er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer slike som olivenolje og injiserbare, organiske estere slik som etyloleat. Vandige bærer inkluderer vann, alkoholiske/vandige oppløsninger, emulsjoner eller suspensjoner, inklusive saltlake og buffrede medier. Pa-renterale bindemidler inkluderer natriumkloridoppløsninger, Ringer's dekstrose, dekstrose og natriumklorid, laktert Tinger's eller fikserte oljer. Intravenøse bindemidler inkluderer flytende- og næringssupplementer, slik som de som er basert på Ringer's dekstrose og dets like. Konserveringsmidler og andre tilsetninger kan også være tilstede, slike som for eksempel antimikrobieller, oksydanter, gelaterende midler og uvirksomme gasser o.l.

Som brukt her betyr "individ" ethver dyr eller kunstig modifisert dyr istand til å utvikle eller vedlikeholde prostatacancer. Kunstig modifiserte dyr inkluderer - men er ikke begrenset til - mus, rotter, hunder, marsvin, "ferrets", kaniner og primater. I en utførelses-form er det kunstig modifiserte dyret en mus som lider av indusert prostatacancer. Eksempler på slike dyr er kjent innen fagfeltet (N.M. Greenberg, et al., P.N.A.S. U.S.A., 92:3439-3443 (1995); T. C. Thompson, et al., Cancer 71:; 1165-1171 (1993). I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er individet et menneske.

Preparatet som blir fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan foretrukket bli administrert til individet i en terapeutisk effektiv dose.

Som brukt heri, kan administrering bli iverksatt eller utført ved å bruke enhver av de forskjellige metodene kjent for den som kjenner fagfeltet. Administreringen kan omfatte intravenøs, intramuskulær og subkutan administrering.

i

En terapeutisk effektiv dose av preparatet, omfattende et protein vist i SEQ DD NO 8 eller en funksjonelt derivat derav, som fremstilles ifølge oppfinnelsen er en dose tilstrekkelig for selektivt å inhibere prolifereringen av androgenuavhengig prostatacancerceller hos et rammet individ. Nevnte terapeutisk effektive dose kan administreres iform av en rekke terapeutisk effektive doser over en periode. Dosen og tidsperioden kan bli bestemt gjennom kjente metoder. Den terapeutisk effektive dosen kan være fra 0,1 ug/kg til 1 mg/kg, og foretrukket er den terapeutisk effektive dosen fra l|ig/kg til 100 Hg/kg.

Som nevnt ovenfor, vedrører oppfinnelsen også anvendelse av et DNA- eller RNA-nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for, aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, hvori molekylet er en vektor passende for bruk i genterapi, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

Tallrike ekspresjonsvektorer kan bli anvendt. Slike vektorer, inklusive plasmidvektorer, kosmidvektorer, bakteriofagvektorer og andre virus, er vel kjent innen fagfeltet. For eksempel utnytter en klasse av vektorer DNA-elementer som er avledet fra dyrevirus slike som bovint papillomavirus, polyomavirus, adenovirus, vaccinavirus, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV eller MoMLV), Semliki Forest-virus eller SV40-virus. I den foretrukne utførelsesformen er vektoren pCI. I tillegg er vertsceller, regulatoriske elementer og transfeksjonsmetoder passende for bruk i sammenheng med denne oppfinnelsen, vel kjent innen fagfeltet.

Genterapi vektorer og metoder for avlevering av samme, er vel kjent innen fagfeltet. Slike avleveringsmetoder inkluderer - men er ikke begrenset til - avlevering via adenovirus og kationiske liposomer, såvel som via nakent DNA. I tillegg kan disse vektorene bli introdusert inn i passende celler ex vivo (f.eks. perifere blodmononukleære celler (PBMNC)), som deretter blir reintrodusert inn i et individ som er rammet. Metoder for slike ex vivo-metoder er kjent innen fagfeltet.

En terapeutisk effektiv dose av preparatet, omfattende et DNA- eller RNA-nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, hvori molekylet er en vektor passende for bruk i genterapi, som fremstilles ifølge oppfinnelsen er en dose som er effektiv nok til å forårsake at celler i individet kan produsere og sekretere proteinet kodet for av nukleinsyremolekylet deri, hvis protein deretter selektivt inhiberer prolifereringen av androgen-uavhengig prostatacancerceller i individet. Nevnte terapeutisk effektive dose kan administreres iform av en rekke terapeutisk effektive doser over en periode. Dosen og tidsperioden kan bli bestemt gjennom kjente metoder. I en utførelsesform er den terapeutisk effektive dosen av den andre farmasøytiske sammensetningen fra IO<4> til IO11 DNA-molekyler pr. individ, og i den foretrukne utførelsesformen er den fra IO<5> til IO10 DNA-molekyler pr. individ.

Som brukt heri, å "selektivt drepe" androgen-uavhengige celler, menes å drepe minst

50% androgen-uavhengige celler in vitro uten å drepe mer enn 20% HeLa-celler in vitro under mettede betingelser som målt ved et passende punkt i tid (f.eks. 72 timer etter initiell kontakt med denne sammensetningen). Foretrukket dreper denne sammensetningen minst 90% av androgen-uavhengige celler in vitro uten å drepe mer enn 10% av HeLa-celler in vitro. Celledød kan lett bli målt ved å bruke kjente metoder, inklusive for eksempel Trypan Blue-eksklusjonsanalysen.

Denne oppfinnelsen vil bli lettere forstått ved referanse til de eksperimentelle detaljene som følger, men de som kjenner fagfeltet vil lett forstå at spesifikke detaljerte eksperi-menter bare er illustrative for oppfinnelsen som beskrevet mer fullstendig i kravene som følger deretter.

Eksperimentelle detaljer

Materialer og metoder

rIFN-Y ble innkjøpt fra Boehringer og Mannheim (> 2 x IO<7> enheter/mg). Ekspresjonsvektorer pCI, pcDNA3 og pSV2-dhfr ble ervervet fra henholdsvis Promega, Invitrogen,

og the American Type Culture Collection (ATCC). Cellekulturmedia ble ervervet fra GIBCO og BioWhittaker, og fetalt bovint serum ble ervervet fra Hyclone. Rekombinant human TGF-beta var fra R&D Systems. [<3>H] tymidin var fra DuPond NEN. Sl00 SartoBind kationmembranadsorber var fra Sartorius. Kromatografikolonner og resiner var fra Pharmacia. Kjemikalier var fra Fish og Sigma.

Cellelinjer og cellekultur

Alle celelinjene ble ervervet fra ATCC. HeLa-celler ble holdt i MEM-medium supplert med 5% FBS, PC-3 og LNCaP-celler i RPMI-1640 supplert med 5% FBS, DU145 i EMEM supplert med 10% FBS, HEL-celler i RPMI supplert med 10% FBS, HepG2-

celler i MEM supplert med 10% FBS og lx ikke-essensielle aminosyrer, og BHK-celler i DMEM supplert med 5% FBS. Antibiotika (sluttkonsentrasjon 50 ug/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin) ble tilsatt til kulturmediumet for alle cellelinjene.

Konstruksjon og screening av et subrahert cDNA- bibliotek

HeLa-celler ATCC CCL185 ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eågle-medium (DMEMM GibcoBRL supplert med 10% fetalt kalveserum, 2 mM glutamin, 50 u/ml penicillin og 50 |ig/ml streptomycin. HeLa-celler ble behandlet med rekombinant hu-

mant interferon-y (IFN-y) (Boehringer Mannheim) i 48 timer i en konsentrasjon på 2500 enheter/ml. Totalt RNA (RNAzol; Tell-Test) og poly (A)-selektert RNA (FastTrack;

Invitrogen) ble isolert fra mock og IFN-y-behandlede HeLa-celler ved å følge forhandlerens protokoller.

For unidireksjonell cDNA-bibliotek-konstruksjon ble cDNA syntetisert fra 2 \ ig av poly

(A) RNA fra ubehandlet og IFN-y-behandlede HeLa-celler (48 timers behandling) og direksjonelt klonet inn i plasmidene pGEMl lZf (Promega) og pT7T3D18U (Pharmacia), respektivt. Subtraktiv hybridisering eller, mer spesifikt, sense-tråd cRNA og anti-sens-cDNA-synteser, hybridisering, separering av enkelt-trådet cDNA fra dobbeltrådet cDNA /RNA-hybrider ved hydroksyapatittkolonne og PCR-amplifikasjon etterfulgt av subtraktiv bibliotekskonstruksjon, ble utført ifølge kjente metoder (Usui et. al., J. Neu-

rosci., 14(8):4915-4926,1994). PCR-amplifisert, subtrahert cDNA ble direksjonelt klonet inn i pT7T3D (Pharmacia).

For å screene det subtraherte cDNA-biblioteket, ble 1000 cDNA fra dette biblioteket tilfeldig plukket og sekvensert (se nedenfor). Klone #15558 (aka 2H) ble funnet 6 ganger (pr. 1000 cDNA analysert) og derfor betraktet som et cDNA som antas å bli differensielt regulert av IFN-y.

Kloning. DNA- sekvensering og computer- analvser

All sekvensering ble gjort på Applied Biosystems 373 eller 377 DNA-sekvenser i en enkel passasje ved å bruke T7-primer i henhold til forhandlerens protokoll. Vektorsek-venser ble fjernet før analyse ved bruk av sekvenseringsprogram (Gene Codes Corpora-tion). Inserts større enn 20 bp ble sammenlignet via Blast (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:40,1990, med GenBank (versjon 92) for gen-identifikasjon, og ble sammenlignet med hver andre via FastA (Pearson & Lipman, PNAS, 85:2444,1988) for å beregne frekvensen av cDNA-opptreden i subtrahert cDNA-bibliotek. Sekvenser inneholdende y4/M-elementer ble ekskludert fra analysene. Blast-analyse av 2H (klon #15558) indikerte en signifikant homologi til flere medlemmer av TGF-fl-superfamilien. Klon #15558 var ikke full-lengde (dvs. den inneholdt ikke den hele kodende regionen) og derfor ble anker PCR (Frohman et al., PNAS 85:8998-9002; 1988) implementert ved å bruke 2 ug av poly (A) RNA (ekstrahert fra HeLa-celler behandlet i 48 timer med IFN-y) som en kilde for cDNA-templatsyntese. To uavhengige anker-PCR ble fullført, og deretter ble cDNA klonet og sekvensert. En åpen leseramme ble funnet med et stoppkodon oppstrøms for dette ATG som indikerer at et full-lengdeklon er blitt oppnådd.

Nothern Blot- analvse

For RNA-blots, ble 2 u.g av poly (A) RNA-ekstrahert fra HeLa-celler (både mock-kontroll og HeLa-celler behandlet med IFN-y i 48 timer) ladet pr. spor og deretter oppløst ved elektroforese på en 1,2% agarose, 1,2 M formaldehydgel, overført til en nitrocellulosemembran og hybridisert til en full-lengde <32>P-merket 2H cDNA-probe. I tillegg ble denne <32>P-merkede proben hybridisert til et humant vev RNA blot (Clontech).

Ekspresjon av rGF- 2H

Hele den kodende regionen til GF-2H cDNA ble subklonet inn i EcoRI-setet til mammalsk ekspresjonsvektor pCI (Promega) for å danne ekspresjonsplasmidet pCI-2H, som har en Kozak-konsensus-sekvens umiddelbart oppstrøms for initieringskodonet ATG. DNA-transfeksjonene ble utført ved en modifisert kalsiumfosfatpresipiteringsmetode

(Graham og van der Eb, Virology 52:456 (1973)). For metotreksat (MTX) resistens, ble plasmid pSV2-dhfr (ATCC nr. 37146; S. Subramani, et al., Mol. & Cell. Biol., sept. 1981, s. 854-864)) eller pZem229 (europeisk patentsøknad nr. 0.319.944 A2, utstedt 12. juli, 1988) kotransfektert med pCI-2H ved et 1 til 4 forhold, og for G418 resistens ble plasmid pcDNA3 (Invitrogen, #V790-20) kotransfektert med pCI-2H ved et 1 til 4 forhold. 24 timer etter transfeksjon ble MTX (sluttkorisentrasjon 1 uM) eller G418 (aktiv sluttkonsentrasjon 1 mg/ml) tilsatt til kulturmediet. Resistente kolonier ble tilfeldig selektert 10 dager etter. Serumfritt vilkår kulturmedia og cellelysåter fra selekterte kloner ble samlet og utsatt for Western blot-analyse for ekspresjon og sekresjon av rGF-2H. Produserende cellelinjer ble etalert og opprettholdt i 1 uM MTX eller lmg/ml G418. Noen av de MTX-resistente cellelinjene ble utsatt for 20 uM MTX for ytterligere å amplifisere transfekterte gener. De høyest produserende klonene som ble isolert, ble kalt BHK-GF2H #17 og brukt for produksjonen av rGF-2H.

Rensing og rekombinant modent GF- 2H

Serumfritt kondisjonert medium fra BHK-GF-2H #17 ble samlet, og proteaseinhibitorer ble tilsatt med de følgende konsentrasjoner: ImM PMSF, 1 ug/ml leupeptin, 2 Hg/ml pepstatin, 1 \ ig/ ml aprotinin og 1 mM EDTA. Etter sentrifugering ved 9000 rmp ved 4°C i 20 minutter for å fjerne celledebrier, ble supernatanten forsuret med eddiksyre (0,2 M sluttkonsentrasjon) ved 4 °C overnatt.

Supernatanten ble deretter satt på en Sl00 SartoBind kationmembranadsorber (Sartorius, #S100X) pre-ekvilibrert med 25 mM natriumfosfat pH 4,0 (buffer A). Membranadsorberen ble vasket med buffer A, etterfulgt av buffer A med 300 mM NaCl. rGF-2H ble eluert fra membranadsorberen med 25 mM natriumfosfat pH 4,0 inneholdende 500 mM NaCl og proteaseinhibitorer (1 mM PMSF, 1 ug/ml leupeptin, 2 ug/ml pepstatin, 1 ug/ml aprotinin og 1 mM EDTA).

Etter tilsetningen av mettet (NH^SCh til en sluttkonsentrasjon på 1 M, ble den samlede mengden satt på en 8 ml Butyl Sepharose-kolonne pre-ekvilibrert med 25 mM NaPC«4, pH 7,0 inneholdende 1 M NaCl og 1 M (NrL^SCv. Kolonnen ble deretter vasket med den samme bufferen og eluert med en lineær 1-0 M gradient av både NaCl og (NH4)2S04 i 25 mM NaP04, pH 7,0. Fraksjoner inneholdende rGF-2H ble samlet opp og konsentrert ved å bruke Centriprep-10 (Millipore).

Den konsentrerte oppsamlingen ble satt på en Superdex-75 FPLC-kolonne (Pharmacia). Kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 20 mM Tris-HCl, pH 7,0,100 mM KC1. Fraksjonene inneholdende rGF-2H ble satt på en Vydac C18 HPLC-kolonne (10-um partikkelstørrelse, 4,6 x 250 mm) ekvilibrert i 90% løsningsmiddel A og 10% løsnings-middel B (løsningsmiddel A inneholdt 0,1% trifluoreddiksyre i vann, og løsning B var sammensatt av 0,1% trifluoreddiksyre i acetonitril). Kolonnen ble eluert med en 10% til 90% lineær gradient av oppløsningsmiddel B. Fraksjonene inneholdende rent rGF-2H ble lyofilisert til tørrhet og resuspendert i 25 mM NaP04, pH 7,0 og lagret ved -70°C i små alikvoter.

Polvklonalt antistoff til GF- 2H

Peptid MHAQDCTSLHRLKPDTVPAPC, korresponderende til residier 253 til 273 fra pre-pro-GF-2H, ble syntetisert, koblet til "keyhole limpet" hemocyanin, emulgert i Freund's adjuvant og injisert inn i kaniner. Kanin-antiserumet ble titrert mot peptidet ved ELISA.

Gel- elektroforese og Western Blot- analvse

SDS-polyakrylamidgelelektroforese ble utført ifølge Laemmli, U.K. Nature, 227:680

(1970), og gelene ble farvet med enten sølvfarve eller Coomassie Brilliant Blue R-250. Western-overføring ble utført som beskrevet (Towbin et al., PNAS, 76,4350 (1979)). Im-munofarving ble utført ved å bruke kanin-antistoff mot GF-2H-peptid og horseradish peroksidasekonjugert antikaninantistoff (Bio-Rad).

N- terminal aminosyre og massespektrometri- analvse

N-terminal sekvensanalyse ble utført ved å bruke et Applied Biosystems 470A-protein-sekvenseirngsmaskin utstyrt med en on-line fenyltiohydantoin-analyseringsdel (modell 120A). Massespektrometri-analyse ble utført ved å bruke matriksassistert laserdesorp-sjons-ioniserings-massesepktrometri (MALDI-MS) på en Vestec 2000 MALDI-TOF-MS med en Lumonics NAG-laser innstilt på 355 nm.

Celle- prolifeirngs- analvse

Cellene ble sådd ut på 96 brønns flatbunnsplater i 100 ul av korresponderende, fullstendig kultur ved en tetthet på 5.000 til 10.000 celler/brønn. Etter inkubasjon overnatt ved 37°C, 5% CO2, ble kulturmediumet erstattet med 100 ul av nytt medium supplert med enten 1% eller 5% FBS inneholdende en indikert konsentrasjon av rGF-2H eller TGF-beta. Etter ytterligere inkubasjon ved 37°C, 5% CO2 for en bestemt tidsperiode, ble celler merket med [<3>H] tymidin (1 uCi/brønn) i 5 timer ved 37°C, 5% C02. På slutten av inkubasjonen ble det merkede mediumet fjernet, cellene ble vasket med PBS og inkubert med 100 ul trypsin-EDTA ved 37°C i 10 minutter. Cellene ble deretter overført fra kulturplaten til en 96-brønns glassfiberplate (Unifilter-plate, Parkard) ved å bruke en cellehøster. Filterplaten ble vasket, tørket ved 55°C i 30 min., og hver brønn ble fuktet med 40 ul av scintillasjonsvæske (MicroScin-20, Parkard) og tellet ved bruk av en 96-brønns plateteller (TopCount, Parkard).

Resultater

Kloning av IFN- y- induserbare gener fra HeLa- celler

Full-lengdeklon fra GF-2H-kodende DNA strekker seg over 1122 basepar (figur 1). En initiatormetionin (baseparene 35-37) ble identifisert ved de følgende kriterier: (a) Det var en leseramme-stoppkodon (basepar 14-16) oppstrøms for denne metioninen: (b) aminosyresekvensen var konstant med Kozak's konsensus-sekvens (Kozak, J. Biol. Chem., Vol. 266., nr. 30,19867-19870 (1991); og (c) denne metioninen ble etterfulgt av et antatt signalpeptid.

Et stopp-kodon ble funnet ved baseparene 959-961, som indikerer enden av en åpen

leseramme (figur 1). Dette korresponderer til en åpen leseramme på 927 basepar. Den 3' ikke-kodende regionen inneholder et polyadenyleringssignal, AATAAA (basepar 1100-1105) og to usikkerhetsmotiver, ATTTA (basepar 1075-1079), funnet i de 3'-ikke-kodende regionene til kortlivet mRNA.

Ekspresejon av GF- 2H mRNA

Northern blot-analyse ble utført for å bestemme den omtrentlige lengden av GF-2H-transkriptet og for å vise mønsteret av mRNA-vevsekspresjon. Northern blofene ble utført ved å bruke et 1,2 kb fragment som en probe. Hybridiseringen viste et hoved-transkript på omtrent 1,4 kg bare i HeLa-celler behandlet med IFN-y, og ikke i ubehand-lede HeLa-celler (figur 2A). Screening av forskjellig vev viste at GF-2H mRNA er de-tekterbart i placenta, prostata, lever, nyre, fetal lunge og fetal nyre (fgur 3B). De relative mengder av mRNA i placenta og prostata var større enn de i andre vev (figur 3B).

Analyse av det antatte GF- 2H- proteinet

Det predikerte GF-2H-genproduktet er 308 aminosyreresidier langt, med en kalkulert

molekylærmasse på 34,1 kDa. Både nukletid og predikerte proteinsekvenser fra GF-2H har blitt sammenlignet med de som finnes i sekvensdatabankene. Et blast-søk på prote-insekvens-databaser ga et signifikant nivå på homologi mellom antatt GF-2H-protein og TGF-beta-superfamilien. Hele GF-2H-proteinet viser 28,2% identitet til forløperformen av humant Gdfl, mens C-terminalen en tredjedel av GF-2H-protein viser 30,4% identi-

tet til den modne formen av Drosophila dpp-protein. Når sekvensen til den C-terminale ene tredjedel av GF-2H-proteinet ble satt opp med de fra TGF-beta superfamiliemed-lemmene for maksimum likhet ved å bruke PILEUP-programmet, ble det observert at alle av de ni konserverte cysteinene såvel som noen andre konserverte residier i TGF-beta-proteinene (Hosaka, et al., J. Biol. Chem., vol. 266, s. 12127-12130 (1991)) var tilstede i den C-terminale ene tredjedelen av GF-2H-protein.

Som de fleste medlemmer av TGF-beta-superfamilien, inneholder GF-2H-proteinet en N-terminal signalsekvens og potensielle seter for N-koblet og O-koblet glykosylering (fig. 2). Det er en samling av basiske residier som tilveiebringer potensielle kuttings-seter, fra hvilke det kan dannes den modne formen fra forløperen (Hosaka, et al.

(1991)). Figur 2B viser aminosyresekvensen fra umodent GF-2H-protein. Figur 2 A viser en sammenligning mellom aminosyresekvensen til modent GF-2H-protein og de fra andre medlemmer av TGF-beta-familien.

Ekspresjon av rekombinant GF- 2H- proteiner

For å uttrykke rekombinant GF-2H, ble hele den kodende regionen av GF-2H cDNA insertert inn i mammalsk ekspresjons-vektor pCI for å danne pCI-2H. Stabile transfekterte BHK-cellelinjer ble ervervet ved å kotransfektere BHK tk"tsl3-celler med plasmi-der pCI-2H og pSV2-dhfr eller pZem229 som inneholder en ekspresjonsenhet for muse-DHFR, som tillot seleksjon av transfektanter med MTX. Ekspresejon av GF-2H ved disse cellelinjene, ble undersøkt ved Western blot-analyse ved å bruke anti-GF-2H-peptid-antistoff (data ikke vist). Én av disse cellelinjene, BHK-2H-#17, ble brukt for ytterligere å karakterisere ekspresjon av rGF-2H.

Når det kondisjonerte mediet ble fraksjonert på SDS-PAGE under reduserende betingelser og blottet med anti-GF-2H-peptidantistoff, ble et bånd med en tydelig molekylvekt på 13 kd observert i BHK-2H-#17-celler (figur 4, spor 5). Dette bandet ble ikke sett i kontroll-BHK-cellene (figur 4, spor 4). Ved noen anledninger ble også andre bånd med en tydelig molekylvekt på 39 kd også observert i BHK-2H-#17-celler, men ikke i kontroll-BHK-cellene (data ikke vist). Når det kondisjonerte mediumet ble fraksjonert på SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og blottet med anti-GF-2H-peptidanti-stoff, ble et bånd med en tydelig molekylvekt på 25 kd observert i BHK-2H-#17-celler (figur 4, spor 3), men ikke i kontroll-BHK-cellene (figur 4, spor 2). Disse resultatene viser at GF-2H blir uttrykt, prosessert til en mindre form og sekretert inn i kulturmediumet av BHK-2H-#17-celler. Det sekreterte GF-2H er mest sannsynlig en disulfidbun-det dimer (25 kDa) av 13 kd-proteinet. 39 kd-formen er mest sannsynlig full-lengde GF-

2H med noe post-translasjonell modifikasjon, slik som glykosylering, siden den predi-

kerte molekylvekten for full-lengde GF-2H er 34 kd.

Rensing og karakterisering av rekombinant GF- 2H

Kondisjonert medium fra BHK-2H-#17 ble brukt for å rense prosessert moden form av rGF-2H ved en firetrinns-rensningsprotokoll utviklet spesielt for rGF-2H (se diskusjon ovenfor). Ved å bruke denne protokollen, ble modent rGF-2H renset til større enn 95%

ved bedømmelse på SDS-PAGE og sølvfarvingsanalyse (data ikke vist).

Når SDS-PAGE ble analysert under reduserende betingelser, ble renset rekombinant

modent GF-2H detektert som et bånd på 13 kd, mens under ikke-reduserende betingelser ble det detektert som et 25 kd bånd (figur 5). Molekylmassen av modent rGF-2H ble også bestemt til å være 25 kd ved massespektrumanalyse (data ikke vist). N-terminal aminosyresekvens-analyse av renset rekombinant modent GF-2H, viste at den modne rGF-2H-sekvensen begynner ved residie 197 av full-lengde GF-2H (fig. 4). Den kalku-

lerte molekylvekten av polypeptidet fra residie 197 til 308 av full-lengde rGF-2H, er 12,3 kd. Disse resultatene viser at det modne rGF-2H inneholder den C-terminale delen av full-lengde rGF-2H, residier 197 til 308, koblet sammen ved disulfidbinding(er).

Effekten av rGF- 2H på celleproliferering

Renset rGF-2H ble testet på mange forskjellige humane cellelinjer for å undersøke dens effekter på celleproliferering. Celler ble platet ut, inkubert med forskjellige konsentra-

sjoner av rGF-2H i 24 til 96 timer og merket med [<3>H]tymidin, som beskrevet ovenfor. Humant TGF-beta2 ble også testet på disse cellelinjene parallelt med rGF-2H for å sam-menligne dets effekter med den for rGF-2H.

Rekombinant GF-2H viste en dose- og tidsavhengig inhibering av [<3>H] tymidin inkor-

porert ved PC-3-celler, en androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinje. Denne inhiber-ingseffekten ble først observert etter en 48 timers inkubasjonsperiode (fig. 6) og kunne fortsatt sees etter en 96-timers inkuberingsperiode, ved hvilket tidspunkt signifikant cel-ledød startet. Maksimal inhibering, omtrent 90% sammenlignet med den fra kontrollen (uten rGF-2h) ble observert etter en 72 timers inkubering ved 1,4 x 10"<11> M rGF-2H (fig.

6). Når TGF-beta ble testet på PC-3-celler under de samme betingelsene, ble en lignende dose- og tidsavhengig inhibering fra rGF-2H, også observert. Imidlertid var maksimum inhibering sett med TGF-beta å være 52% ved sammenligning med kontrollen (fig. 7). I likhet med PC-3-celler, ble dose- og tidsavhengig inhibering av [<3>H]tymidin-

inkorporering av rGF-2H og TGF-beta, observert med DU145-celler, en annen andro-

gen-uavhengig prostatacancer-celleline (tabell 1). Maksimum inhibering av rGF-2H og TGF-beta var 60% og 80%, respektivt, sammenlignet med den fra kontroller (data ikke vist).

Som vist i tabell 1, har rGF-2H ingen effekt på [<3>H]tymidininkorporering av LNCaP,

Hep G2 eller HEL-celler, i motsetning til TGF-beta-inhibert [<3>H]tymidininkorporering av disse celler. Hverken rGF-2H eller TGF-beta viste signifikante effekter på [<3>H]tymidin-inkorporering av HeLa og Caov-3-celler. I korthet ble rGF-2H vist å spesielt inhibere prolifereringen av androgen-uavhengige prostata-cancerceller, i motsetning til TGF-beta som viser inhiberende oppførsel på ytterligere cellelinjer.

Claims (6)

1. Anvendelse av et isolert eller rekombinant protein omfattende aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat, for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte individ er et menneske.

3. Anvendelse av et DNA- eller RNA-nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for, aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO 8 eller et derivat derav med tilsvarende biologisk aktivitet, hvori molekylet er en vektor passende for bruk i genterapi, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et preparat for behandling av et individ som er rammet av androgen-uavhengig prostatacancer.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor nevnte individ er et menneske.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor en toksisk del er funksjonelt heftet til nevnte isolerte eller rekombinante protein.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte individ er et menneske.