KR101590959B1 - 육량체 형성 도메인과 결합된 trail 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착증 치료용 조성물 - Google Patents
육량체 형성 도메인과 결합된 trail 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착증 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 육량체 형성 도메인을 TRAIL 단백질에 결합시킨 TRAIL 융합단백질, 이를 코딩하는 핵산분자, 이 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 융합단백질 또는 재조합 벡터의 혈관 재협착 치료 및 예방 용도에 관한 것이다. 본 발명의 TRAIL 융합단백질은 육량체화가 용이하게 유도되며, 육량체 형성 도메인이 결합되지 않은 TRAIL 단백질에 비해 세포사 유도활성이 뛰어나고, 혈관 손상 자극에 의해 유도되는 혈관 내막 세포의 증식을 억제하며 이미 증식된 혈관내막세포를 제거하는 효과를 갖는다. 본 발명의 TRAIL 융합 단백질은 혈관 재협착증의 치료 및 예방제로 개발될 수 있다.
Description
본 발명은 육량체 형성 도메인과 결합된 재조합 TRAIL 융합 단백질, 이를 코딩하는 핵산분자, 이 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 융합단백질 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착증 치료용 조성물에 관한 것이다.
TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)은 TNF (Tumor Necrosis Factor) 패밀리(family)의 일종으로 여러 암세포를 선택적으로 세포사멸로 죽이는 단백질로 처음 보고되었다(Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690, 1996; Wiley et al., Immunity, 3:673-682, 1995). TRAIL이 암세포에서 강력하게 세포사멸을 유도하는 분자기전으로 제시된 것은 TRAIL의 수용체인 DR4 (TRAILR1), DR5 (TRAILR2)를 통해서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 활성을 갖는 TRAIL 단백질은 삼량체를 이루어야 하고 삼량체 TRAIL이 DR4, DR5 단백질의 삼량체를 유도한다. 이렇게 유도된 DR4, DR5 삼량체 수용체는 다시 FADD, Caspase-8 등과 같은 단백질을 수용체로 이동시키고 DISC(death-inducing complex)를 형성하여 세포사멸 신호를 전달한다(Chaudhary et al., Immunity, 7:821-830, 1997; Schneider et al., Immunity 7: 831-836, 1997; Sheridan et al., Science 277: 818-821, 1997). 원래 TRAIL은 제2형 막단백질이나 세포내에 존재하는 단백질 절단 효소 또는 단백질 재조합 기술을 이용하여 TRAIL의 세포막 바깥 부위만 갖는 가용성(soluble) TRAIL을 제조할 수 있다. 원래 가용성 TRAIL 단백질이 삼량체로 존재하는 것으로 증명되어 있으나 TRAIL의 삼량체 형성을 촉진시키는 여러 도메인 즉, Isoleucine zipper trimerization domain, tenascin-C 유도 삼량체 형성 도메인 등을 이용하여 세포사멸 활성이 증가된 삼량체 TRAIL을 제조하였다(Jeong et al., PLoS One 4: e4545 2009; Walczak et al., Nat Med 5: 157-163, 1999; Berg et al., Febs J 276: 6912-6927. 2009).
심혈관 확장술 시술(Percutaneous coronary intervention, PCI)을 받은 환자의 20-30％가 혈관이 다시 협착된다(restenosis)(Laube et al., J Thorac Cardiovasc Surg 120: 134-141, 2000; Mitchell et al., Int J Surg 10: 124-128, 2012). 이러한 혈관 재협착은 주로 혈관 내막에 존재하는 혈관 평활근 세포가 증식하여 발생하는 것으로 PCI 시술의 가장 큰 장애 요인으로 작용하고 있다. 이 과정을 혈관 재협착이라 하고 그 주된 이유는 혈관내막 증식(neo-intima hyperplasia)이다. 혈관 내막 재협착은 혈관 평활근 세포가 정상적인 수축형 상태(contractile state)에서 변형된 합성/증식형 상태(synthetic/proliferative state)으로 변형되어 증식하는 과정에 의해서 발생하는 것으로 알려져 있다(Beamish et al., Tissue Eng Part B Rev 16: 467-491, 2010). 한편, TRAIL이 혈관 내막 증식에 관여하는지에 대해서는 알려져 있지 않으나, 혈관 평활근 세포에서 TRAIL, DR5가 발현되는 것으로 보아 혈관 평활근 세포의 세포사멸에 관여할 것으로 추측이 되기도 한다. 이러한 관점은 급성관동맥 증후군(ASC, acute coronary syndrome)을 갖는 환자로부터 얻어진 CD4+ T 세포가 심장 동맥에서 얻어진 평활근 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 것으로 보아 그 가능성을 높이고 있다(Kavurma et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 28: 1694-1702, 2008b; Sato et al., J Exp Med 203; 239-250, 2006). 다른 연구 결과에 의하면, TRAIL이 혈관 평활근 세포의 증식을 유도하여 혈관 내막 증식을 촉진하는 것으로 보고하고 있어 위의 관점과 대치되는 것으로 생각된다(Chan et al., Circ Res 106: 1061-1071, 2010). Apo-E 유전자가 제거된 생쥐에서 재조합 TRAIL 단백질을 주사해 주면 혈관 평활근 세포의 증식을 관찰할 수 있다는 보고도 있다 (Secchiero et al., Circulation 114: 1522-1530, 2006).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Aikawa, M., et al., (1993). Circ Res 73, 1000-1012.
Beamish, J.A., et al., (2010). Tissue Eng Part B Rev 16, 467-491.
Berg, D., et al., (2009). Febs J 276, 6912-6927.
Chan, J., et al., (2010). Circ Res 106, 1061-1071.
Chaudhary, P.M., et al., (1997). Immunity 7, 821-830.
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Gochuico, B.R., et al., (2000). Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 278, L1045-1050.
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Secchiero, P., et al., (2006). Circulation 114, 1522-1530.
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Wiley, S.R., et al., (1995). Immunity 3, 673-682.
본 발명자들은 육량체 형성 도메인을 TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질에 결합시켜 육량체화가 용이하게 유도될 수 있는 TRAIL 융합 단백질을 제조하였고, 이 융합 단백질의 세포사멸 유도 활성이 크게 향상되었으며, 혈관 내막 세포의 증식을 억제하는 활성을 통해 혈관 재협착증을 치료할 수 있는 가능성을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 육량체 형성 도메인 및 TRAIL 단백질이 결합된 TRAIL 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 분비신호서열, 퓨린절단자리(furin cleavage site), 육량체 형성 도메인 및 TRAIL 단백질이 순차적으로 결합된 TRAIL 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 TRAIL 융합단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 TRAIL 융합단백질 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 육량체 형성 도메인[ILz(6)] 및 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질이 결합된 TRAIL 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 TRAIL 융합단백질은 육량체 형성 도메인을 TRAIL 단백질 단편에 결합시켜 제조된다.
본 명세서에서 상기 용어 "육량체 형성 도메인"은 TRAIL 단백질의 육량체화를 촉진시키는 도메인을 의미하며, 종래에 알려진 삼량체 형성 도메인에 시스테인 아미노산 잔기가 추가된 도메인이다. 본 명세서에서 상기 육량체 형성 도메인은 ILz(6)으로도 지칭하여 기재한다. 보다 구체적으로 상기 육량체 형성 도메인은 "이소루신 지퍼 육량체화 도메인(isoleucine zipper hexamerization domain)"이며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "TRAIL 단백질 단편" 은 TRAIL 단백질에서 114-281 아미노산 서열 부분으로 이루어지는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 상기 육량체 형성 도메인이 결합되어 제조되는 TRAIL 융합단백질은 "ILz(6):TRAIL" 으로도 지칭하여 기재한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 분비신호서열, 퓨린절단자리(furin cleavage site), 육량체 형성 도메인 및 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질이 순차적으로 결합된 TRAIL 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 상기 용어 "분비신호서열"은 분비형 재조합 TRAIL 단백질을 소포체로 이동시키도록 하는 신호서열을 의미하며, 보다 구체적으로는 인간성장호르몬(human growth hormone)에서 유래된 분비신호서열을 사용한다.
본 명세서에서 상기 용어 "퓨린절단자리(furin cleavage site)"는 퓨린(furin) 효소에 의해 인식되어 절단되는 아미노산 서열을 의미한다.
본 명세서에서 상기 용어 "육량체 형성 도메인" 및 "TRAIL 단백질"에 관한 내용을 상기 TRAIL 융합단백질[ILz(6):TRAIL]에서 설명된 내용과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명에서 상기 분비신호서열, 퓨린절단자리, 육량체 형성 도메인 및 TRAIL 단백질이 순차적으로 결합된 TRAIL 융합단백질은, TRAIL 융합단백질을 세포외 분비를 촉진시키기 위한 형태로서 분비형 TRAIL 융합단백질이다. 상기 분비형 TRAIL 융합단백질은 본 명세서에서 "SS-ILz(6):TRAIL" 또는 "분비형 ILz(6):TRAIL" 으로도 지칭하여 기재한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 TRAIL 융합단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 핵산 분자는 "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열"과 동일한 의미로 사용된다. 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드 분자는 뉴클레오타이드 모노머(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 폴리머(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 TRAIL 융합단백질을 코딩하는 핵산 분자는 이의 복제 또는 발현을 위한 원핵 또는 진핵세포에 형질전환시키기 위한 벡터에 클로닝될 수 있다.
본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀(shuttle) 벡터, 박테리아 발현용 또는 클로닝용의 원핵성 벡터일 수 있으며, 효모세포용 벡터, 곤충세포용 벡터, 식물세포용, 동물세포용 벡터와 같은 진핵성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 이에 관한 내용은 예를 들어 선행 문헌 "Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)" 및 "Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990)"에 설명되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 벡터에서 TRAIL 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현조절서열(예컨대 프로모터 서열)에 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 발현조절서열이 TRAIL 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사(transcription) 및 번역(translation)을 조절하도록 연결된 것을 의미하며, 발현 조절 서열의 조절하에 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 TRAIL 융합단백질이 생성되도록 번역 프레임(translation frame)이 정확히 유지되는 것을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하여 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축되는 경우, 본 발명의 벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 번역의 개시를 위한 라이보좀 결합 서열 및 전사/번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 본 발명의 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 본 발명의 원핵 세포용 벡터는 원핵 숙주세포, 특히 대장균(E. coli)에서 증식이 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함하며, 예컨대 colE1 또는 p15A의 박테리아의 복제원점 또는 f1 origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함한다.
본 발명의 벡터가 진핵 세포를 숙주로 하여 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축되는 경우, 본 발명 벡터의 프로모터는 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 서브유니트 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터는 진핵성 숙주세포에서 핵산을 발현시키는 데에 요구되는 모든 추가적인 요소를 함유하는 발현 카세트 또는 전사 단위를 포함한다. 본 발명의 벡터는 프로모터 이외에, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화 서열, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 번역 종결에 요구되는 신호서열을 포함하며, 부가적 요소로서, 증강요소(enhancer element), 이종 스플라이싱 신호 또는 핵 국재화 신호(NLS) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 및 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 미즐스 바이러스, 폭스 바이러스, 샘리키 포리스터 바이러스, 백시니아 바이러스 유래 재조합 벡터를 포함한다.
본 발명의 벡터는 보다 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스(Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications andRegulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, (1999)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 리오바이러스, 미즐스 바이러스, 샘리키 포리스터 바이러스를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 본 발명의 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 포유동물세포, 식물세포, 곤충세포, 효모를 포함하며, 예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) TRAIL 단백질 또는 상술한 TRAIL 융합단백질 또는 재조합 벡터의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관 재협착증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 육량체 형성 도메인이 결합된 TRAIL 융합단백질은 혈관내막 세포의 증식을 억제하고, 이미 증식된 혈관내막 세포를 제거함으로써, 혈관 재협착증의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 본 발명의 TRAIL 융합단백질의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 통상적인 무독성 담체, 보조제 및 부형제를 함유하는 용량 단위 제제로서 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 직장 내로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "비경구적 투여" 는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 약물 제제는 예컨대 문헌 (Hoover, John E.,Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975)에 게시되어 있다. 약물 제제에 대한 내용은 또한 문헌 [Liberman, H.A. 및 Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]에서 확인할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎍/kg (체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 이점 및 효과를 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 육량체 형성 도메인을 TRAIL 단백질에 결합시킨 TRAIL 융합단백질, 이를 코딩하는 핵산분자, 이 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 융합단백질 또는 재조합 벡터의 혈관 재협착 치료 및 예방 용도에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 TRAIL 융합단백질은 육량체화가 용이하게 유도되며, 육량체 형성 도메인이 결합되지 않은 TRAIL 단백질에 비해 세포사 유도활성이 뛰어나고, 혈관 손상 자극에 의해 유도되는 혈관 내막 세포의 증식을 억제하며 이미 증식된 혈관내막세포를 제거하는 효과를 갖는다.
(ⅲ) 본 발명의 TRAIL 융합 단백질은 혈관 재협착증의 치료 및 예방제로 개발될 수 있다.
도 1은 육량체 형성 도메인이 결합된 TRAIL 융합 단백질 ILz(6):TRAIL의 제작 및 활성을 확인한 결과를 보여준다. 패널 A는 ILz(6):TRAIL의 모식도이다. 6xHis는 Ni-NTA 친화 컬럼을 사용한 정제를 위한 것이며, ILz(6)는 이소루신 지퍼 육량체화 도메인(isoleucine zipper hexamerization domain)이고; TRAIL(114-281)은 인간 TRAIL의 세포외 부위인 아미노산 114-281 영역이다. 패널 B는 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL의 정제 결과를 보여준다. 세균 발현 벡터 pET23a(+):ILz(6):TRAIL을 BL21(DE3)에 형질전환시키고, IPTG를 처리하여 단백질 발현을 유도하였다. 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL을 Ni-NTA His-결합 친화성 컬럼을 사용하여 정제하였다. 패널 C는 HCT116 세포를 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL으로 밤샘 처리하여 광학현미경으로 관찰한 사진이다. 패널 D는 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL의 활성을 측정한 결과이다. BJAB 세포들을 각 지정한 농도로 정제한 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL으로 2 시간 동안 처리하고, 세포 사멸을 XTT 분석을 통해 측정하였다. 패널 E는 TRAIL 및 ILz(6):TRAIL의 세포사 유도 활성을 비교한 결과를 보여준다. TRAIL은 ILz(6) 도메인이 없는 것을 제외하고 ILz(6):TRAIL와 동일하다. BJAB 세포들을 재조합 TRAIL 또는 ILz(6):TRAIL으로 18 시간 동안 처리하고, 세포 사멸을 XTT 분석을 통해 측정하였다. 패널 F는 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL의 다량체화를 측정한 결과이다. TRAIL 및 ILz(6):TRAIL의 재조합 단백질을 E. coli BL21(DE3)에서 발현시키고, 가교제(bismaleimidohexanem BMH)의 존재 또는 부존재하에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 패널 G는 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL의 젤 여과(gel filtration) 프로파일을 보여준다. 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL의 삼량체, 육량체 및 다량체를 표시하였다.
도 2는 정맥-동맥 봉합 수술(AAV)로 인한 혈관 내막증식(neo-intimal hyperplasia) 유도과정을 보여준다. 패널 A는 경동맥과 경정맥의 봉합(Anastomosis of a carotid artery and a jugular vein, AAV)과정을 보여준다. 경동맥(carotid artery)와 경정맥(jugular vein)을 가위로 세로로 길게 자르고 자른 부위를 따라 외과적으로 서로 연결하였다. 패널 B는 AAV를 시행한 후 AAV 시행 혈관 부위를 적출하여 VVG(Verhoeff-Van Gieson)으로 염색한 결과이다. 위쪽 패널은 혈관 내막증식(neo-intimal hyperplasia, NH) 영역과 봉합된 동맥 및 정맥(A/V)의 중간 영역을 보여주고, 아래쪽 패널은 더 상세한 내벽을 보여준다. 패널 C는 AAV-시행한 혈관에서 혈관내막증식을 보여준다. AAV 시술 후 각 시점에서 혈관을 적출하고 VVG로 염색하였다. 40x 확대한 사진을 광학현미경하에서 얻고 여러 장의 사진을 Photoshop CS5 를 사용하여 사진을 합성하였다. 패널 D는 AAV 시행한 랫트에서 혈관내막증식의 두께 정도를 보여준다. 혈관(n=3 또는 n=4)를 AAV 시술후 2주 또는 3주 후에 적출하고 VVG로 염색하였다. AAV 시행으로 봉합한 동맥과 정맥에서 중간 부위에 대해 혈관내막증식 부위의 비율을 측정하였다.
도 3은 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의한 AAV-시술한 랫트에서 혈관 내막증식이 억제되는 효과를 보여준다. 패널 A는 AAV-시술한 랫트에 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL 투여 스케줄을 보여준다. AAV-시술한 랫트는 지정된 양의 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 2일 마다 5회 i.v로 주입하고, 14일째 희생시켰다. 패널 B-I는 혈관 내막 두께에 미치는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL의 영향을 측정한 결과이다. AAV-시행한 랫트를 다음의 물질들을 i.v. 투여하였다: PBS (패널 B-C; 대조군)을 투여하고, 재조합 융합 단백질 ILz(6):TRAIL을 각각, 1 유닛(패널 D-E), 5 유닛(패널 F-G), 10 유닛(패널 H-I) 투여하였다. 주입 후에 14일 시점에서 AAV 영역의 혈관을 회수하고 VVG 염색을 행하였다. 대표적인 절단면 사진을 보여준다. B, D, F, 및 H의 확대 사진은 각각 C, E, G, 및 I에 나타내엇다. 패널 J는 NH/AV 영역 비율을 측정한 결과이다(n=7).
도 4는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL의 간 및 신장에 대한 무독성 효과를 보여준다. PBS (대조군, A 및 E), 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 B 및 F), 5 유닛(패널 C 및 G), 또는 10 유닛(패널 D 및 H)으로 주입한 랫트에서 신장 조직(패널 A-D) 및 간 조직(E-H)의 H&E 염색 대표 사진을 보여준다.
도 5는 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식 원인 세포인 평활근세포의 바이오마커 단백질 SMemb 발현이 AAV-시술된 랫트에서 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL 처리에 의해 감소되는 효과를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 경정맥(C-D)의 SMemb 면역염색결과를 보여준다. A 및 C의 확대 사진은 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS (패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 SMemb 면역염색 사진이다. E, G, I, 및 K에서의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. 패널 M은 혈관(n=4)에서 SMemb-양성 면역염색의 상대 영역을 Image J program을 사용하여 측정한 결과이다.
도 6은 AAV 시행한 랫트를 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL으로 처리한 경우 혈관에서의 DR5의 발현 수준 변화를 조사한 결과를 보여준다. A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)의 DR5 면역염색의 결과이다. A 및 C의 확대 이미지는 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS(패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L) 처리한 후 혈관으로부터 얻은 DR5 면역 염색 사진이다. E, G, I 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. M은 혈관(n=5)에서 DR5-양성 면역염색의 상대면적을 Image J Program으로 측정한 결과이다.
도 7은 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식에서 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL 처리에 따른 활성 caspase-3 발현이 증가하는 변화를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)에서 활성 caspase-3 면역염색 결과를 보여준다. 패널 A 및 C의 확대 이미지는 각각 패널 B 및 D에 나타내었다. E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS (패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 활성 caspase-3의 면역염색 사진을 보여준다. E, G, I 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. M은 혈관(n=4)에서 활성 caspase-3 양성 면역염색의 상대 면적을 Image J program으로 측정한 결과를 보여준다.
도 8은 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식 원인 세포인 평활근세포의 바이오마커 단백질 CRBP-1 발현이 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의해 감소하는 효과를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)의 CRBP-1 면역염색의 결과를 보여준다. 패널 A 및 C의 확대 이미지는 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시술한 랫트를 PBS (E-F 패널, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 1 유닛 (패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 CRBP-1 면역염색 사진이다. E, G, I, 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. 패널 M은 혈관(n=5)에서 CRBP-1 양성 면역염색의 상대 면적을 Image J Program을 사용하여 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 풍선확장술에 의한 혈관내막증식에 미치는 ILz(6):TRAIL 발현 아데노바이러스(Ad:SS-ILz(6):TRAIL)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 패널 A는 분비형 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 발현하는 아데노바이러스 컨스트럭트 구조의 모식도이다. LTR; long-term repeat, ψ; 캡슐화 신호(encapsidation signal), Pcmv; 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터, hGH:SS; 인간 성장호르몬 유래 신호서열, FCS; 퓨린절단자리(furin-cleavage site), ILz(6); 이소루신 지퍼 육량체화 도메인(isoleucine zipper hexamerization domain), TRAIL (114-281); 인간 TRAIL의 세포외 부위(a.a. 114-281). 패널 B는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL의 세포사멸(apoptosis) 유도 활성을 보여준다. Ad:control 및 Ad:SS-ILz(6):TRAIL 바이러스를 A549 세포에 감염시키고 HCT116 세포를 이들 배지로 처리하였다. 패널 C는 분비된 ILz(6):TRAIL의 웨스턴 블로팅 분석결과를 보여준다. 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL(1μg) 및 10μl의 Ad:SS-ILz(6):TRAIL-감염된 A549 세포의 배지를 SDS-PAGE를 수행하고 항-TRAIL 항체를 사용하여 면역염색한 결과이다. 패널 D는 풍선확장술에 의해 손상된 대퇴동맥 또는 손상되지 않은 대퇴동맥의 대표적 염색(x100) 결과를 보여준다. PBS (No Ad), Ad:control, 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL (1.24 x 107 Pfu/rat) (각 그룹당 n=5)를 왼쪽 대퇴동맥을 풍선확장 손상을 가한 랫트에 풍선확장술 직후 감염시켰고, 오른쪽 대퇴동맥은 비손상 동맥으로 사용하였다. 대퇴동맥을 처리 후 15일 시점에서 회수하고 H&E로 염색하였다. 패널 E는 간 조직에 대해 재조합 융합단백질 Ad:SS-ILz(6):TRAIL이 독성을 나타내지 않는다는 점을 보여준다. Ad:control 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL (1.24 x 107 Pfu/rat)으로 감염된 랫트의 간 조직을 H&E으로 염색을 행하였다. 패널 F는 간 조직내에서 ILz(6):TRAIL에 대한 RT-PCR 결과를 보여준다. Ad:control 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL 감염된 랫트의 간 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 ILz(6):TRAIL 및 GAPDH의 RT-PCR으로 사용하였다. PCR 반응은 P1 프라이머(ATGTGCGGAGGAAAGCAAATC: 서열번호 10, ILz(6)를 타겟팅하기 위한 프라이머) 및 P2 프라이머(GGGGATATCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCGC: 서열번호 11, 인간 TRAIL를 타겟팅하기 위한 프라이머)를 사용하여 수행하였다. pcDNA6ASS-ILz(6):TRAIL의 플라스미드 DNA는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 10은 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의한 혈관 내막증식 치료 효과를 보여준다. 패널 A는 실험 프로토콜의 계획을 보여준다. AAV-시술을 O일째에 수행하고, 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL (10 유닛/g)을 8일째부터 매 2일 마다 총 5회 주입하였고, 랫트를 18일 시점에서 희생시켰다. 패널 B는 AAV 시술한 혈관의 대표적 VVG-염색 사진이다. 패널 C는 AAV-시술한 랫트에서 혈관내막의 두께 정도를 나타낸다. AAV에서 동맥 및 정맥의 봉합 영역(AV)에 대해 혈관내막 증식 영역(NH)의 비율을 산출하였다.
도 2는 정맥-동맥 봉합 수술(AAV)로 인한 혈관 내막증식(neo-intimal hyperplasia) 유도과정을 보여준다. 패널 A는 경동맥과 경정맥의 봉합(Anastomosis of a carotid artery and a jugular vein, AAV)과정을 보여준다. 경동맥(carotid artery)와 경정맥(jugular vein)을 가위로 세로로 길게 자르고 자른 부위를 따라 외과적으로 서로 연결하였다. 패널 B는 AAV를 시행한 후 AAV 시행 혈관 부위를 적출하여 VVG(Verhoeff-Van Gieson)으로 염색한 결과이다. 위쪽 패널은 혈관 내막증식(neo-intimal hyperplasia, NH) 영역과 봉합된 동맥 및 정맥(A/V)의 중간 영역을 보여주고, 아래쪽 패널은 더 상세한 내벽을 보여준다. 패널 C는 AAV-시행한 혈관에서 혈관내막증식을 보여준다. AAV 시술 후 각 시점에서 혈관을 적출하고 VVG로 염색하였다. 40x 확대한 사진을 광학현미경하에서 얻고 여러 장의 사진을 Photoshop CS5 를 사용하여 사진을 합성하였다. 패널 D는 AAV 시행한 랫트에서 혈관내막증식의 두께 정도를 보여준다. 혈관(n=3 또는 n=4)를 AAV 시술후 2주 또는 3주 후에 적출하고 VVG로 염색하였다. AAV 시행으로 봉합한 동맥과 정맥에서 중간 부위에 대해 혈관내막증식 부위의 비율을 측정하였다.
도 3은 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의한 AAV-시술한 랫트에서 혈관 내막증식이 억제되는 효과를 보여준다. 패널 A는 AAV-시술한 랫트에 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL 투여 스케줄을 보여준다. AAV-시술한 랫트는 지정된 양의 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 2일 마다 5회 i.v로 주입하고, 14일째 희생시켰다. 패널 B-I는 혈관 내막 두께에 미치는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL의 영향을 측정한 결과이다. AAV-시행한 랫트를 다음의 물질들을 i.v. 투여하였다: PBS (패널 B-C; 대조군)을 투여하고, 재조합 융합 단백질 ILz(6):TRAIL을 각각, 1 유닛(패널 D-E), 5 유닛(패널 F-G), 10 유닛(패널 H-I) 투여하였다. 주입 후에 14일 시점에서 AAV 영역의 혈관을 회수하고 VVG 염색을 행하였다. 대표적인 절단면 사진을 보여준다. B, D, F, 및 H의 확대 사진은 각각 C, E, G, 및 I에 나타내엇다. 패널 J는 NH/AV 영역 비율을 측정한 결과이다(n=7).
도 4는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL의 간 및 신장에 대한 무독성 효과를 보여준다. PBS (대조군, A 및 E), 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 B 및 F), 5 유닛(패널 C 및 G), 또는 10 유닛(패널 D 및 H)으로 주입한 랫트에서 신장 조직(패널 A-D) 및 간 조직(E-H)의 H&E 염색 대표 사진을 보여준다.
도 5는 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식 원인 세포인 평활근세포의 바이오마커 단백질 SMemb 발현이 AAV-시술된 랫트에서 재조합 단백질 ILz(6):TRAIL 처리에 의해 감소되는 효과를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 경정맥(C-D)의 SMemb 면역염색결과를 보여준다. A 및 C의 확대 사진은 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS (패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 SMemb 면역염색 사진이다. E, G, I, 및 K에서의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. 패널 M은 혈관(n=4)에서 SMemb-양성 면역염색의 상대 영역을 Image J program을 사용하여 측정한 결과이다.
도 6은 AAV 시행한 랫트를 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL으로 처리한 경우 혈관에서의 DR5의 발현 수준 변화를 조사한 결과를 보여준다. A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)의 DR5 면역염색의 결과이다. A 및 C의 확대 이미지는 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS(패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L) 처리한 후 혈관으로부터 얻은 DR5 면역 염색 사진이다. E, G, I 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. M은 혈관(n=5)에서 DR5-양성 면역염색의 상대면적을 Image J Program으로 측정한 결과이다.
도 7은 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식에서 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL 처리에 따른 활성 caspase-3 발현이 증가하는 변화를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)에서 활성 caspase-3 면역염색 결과를 보여준다. 패널 A 및 C의 확대 이미지는 각각 패널 B 및 D에 나타내었다. E-L은 AAV-시행한 랫트를 PBS (패널 E-F, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 각각 1 유닛(패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 활성 caspase-3의 면역염색 사진을 보여준다. E, G, I 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. M은 혈관(n=4)에서 활성 caspase-3 양성 면역염색의 상대 면적을 Image J program으로 측정한 결과를 보여준다.
도 8은 AAV에 의해 유도된 혈관 내막증식 원인 세포인 평활근세포의 바이오마커 단백질 CRBP-1 발현이 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의해 감소하는 효과를 보여준다. 패널 A-D는 정상 경동맥(A-B) 및 정상 경정맥(C-D)의 CRBP-1 면역염색의 결과를 보여준다. 패널 A 및 C의 확대 이미지는 각각 B 및 D에 나타내었다. 패널 E-L은 AAV-시술한 랫트를 PBS (E-F 패널, 대조군) 또는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 1 유닛 (패널 G-H), 5 유닛(패널 I-J), 또는 10 유닛(패널 K-L)으로 처리한 후에 혈관으로부터 얻은 CRBP-1 면역염색 사진이다. E, G, I, 및 K의 확대 이미지는 각각 F, H, J, 및 L에 나타내었다. 패널 M은 혈관(n=5)에서 CRBP-1 양성 면역염색의 상대 면적을 Image J Program을 사용하여 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 풍선확장술에 의한 혈관내막증식에 미치는 ILz(6):TRAIL 발현 아데노바이러스(Ad:SS-ILz(6):TRAIL)의 영향을 측정한 결과를 보여준다. 패널 A는 분비형 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 발현하는 아데노바이러스 컨스트럭트 구조의 모식도이다. LTR; long-term repeat, ψ; 캡슐화 신호(encapsidation signal), Pcmv; 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터, hGH:SS; 인간 성장호르몬 유래 신호서열, FCS; 퓨린절단자리(furin-cleavage site), ILz(6); 이소루신 지퍼 육량체화 도메인(isoleucine zipper hexamerization domain), TRAIL (114-281); 인간 TRAIL의 세포외 부위(a.a. 114-281). 패널 B는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL의 세포사멸(apoptosis) 유도 활성을 보여준다. Ad:control 및 Ad:SS-ILz(6):TRAIL 바이러스를 A549 세포에 감염시키고 HCT116 세포를 이들 배지로 처리하였다. 패널 C는 분비된 ILz(6):TRAIL의 웨스턴 블로팅 분석결과를 보여준다. 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL(1μg) 및 10μl의 Ad:SS-ILz(6):TRAIL-감염된 A549 세포의 배지를 SDS-PAGE를 수행하고 항-TRAIL 항체를 사용하여 면역염색한 결과이다. 패널 D는 풍선확장술에 의해 손상된 대퇴동맥 또는 손상되지 않은 대퇴동맥의 대표적 염색(x100) 결과를 보여준다. PBS (No Ad), Ad:control, 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL (1.24 x 107 Pfu/rat) (각 그룹당 n=5)를 왼쪽 대퇴동맥을 풍선확장 손상을 가한 랫트에 풍선확장술 직후 감염시켰고, 오른쪽 대퇴동맥은 비손상 동맥으로 사용하였다. 대퇴동맥을 처리 후 15일 시점에서 회수하고 H&E로 염색하였다. 패널 E는 간 조직에 대해 재조합 융합단백질 Ad:SS-ILz(6):TRAIL이 독성을 나타내지 않는다는 점을 보여준다. Ad:control 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL (1.24 x 107 Pfu/rat)으로 감염된 랫트의 간 조직을 H&E으로 염색을 행하였다. 패널 F는 간 조직내에서 ILz(6):TRAIL에 대한 RT-PCR 결과를 보여준다. Ad:control 또는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL 감염된 랫트의 간 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 ILz(6):TRAIL 및 GAPDH의 RT-PCR으로 사용하였다. PCR 반응은 P1 프라이머(ATGTGCGGAGGAAAGCAAATC: 서열번호 10, ILz(6)를 타겟팅하기 위한 프라이머) 및 P2 프라이머(GGGGATATCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCGC: 서열번호 11, 인간 TRAIL를 타겟팅하기 위한 프라이머)를 사용하여 수행하였다. pcDNA6ASS-ILz(6):TRAIL의 플라스미드 DNA는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 10은 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의한 혈관 내막증식 치료 효과를 보여준다. 패널 A는 실험 프로토콜의 계획을 보여준다. AAV-시술을 O일째에 수행하고, 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL (10 유닛/g)을 8일째부터 매 2일 마다 총 5회 주입하였고, 랫트를 18일 시점에서 희생시켰다. 패널 B는 AAV 시술한 혈관의 대표적 VVG-염색 사진이다. 패널 C는 AAV-시술한 랫트에서 혈관내막의 두께 정도를 나타낸다. AAV에서 동맥 및 정맥의 봉합 영역(AV)에 대해 혈관내막 증식 영역(NH)의 비율을 산출하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: ILz(6):TRAIL의 제작
1. 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL의 제작
인간 TRAIL 단백질의 아미노산 114부터 281를 포함하는 상보적 유전자(complementary DNA, cDNA)를 HeLa 세포주에서 얻은 총 RNA로부터 RT-PCR를 수행하여 얻었다. 이 때 사용한 PCR 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타내었다. 이렇게 증폭된 TRAIL cDNA를 6xHis를 5′-말단에 포함하고 있는 pET23a(+) 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터를 TRAIL 재조합 단백질을 생산하기 위해 사용하였다. ILz(6)(이소루신 육량체화 도메인, isoleucine hexamerization domain)의 아미노산 서열(서열번호 3)을 암호화하는 cDNA 서열(서열번호 4)를 포함하는 올리고뉴클리오타이드를 합성하였다. 합성한 ILz(6) cDNA를 pET23a(+)에 클로닝하고 이 벡터에 인간 TRAIL cDNA 114-281를 클로닝하였다. 이 벡터를 pET23a(+):ILz(6):TRAIL로 명명하였다. 이 벡터는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 생산하기 위해 사용하였다. 이 단백질의 cDNA 서열(서열번호 5)은 6xHis-ILz(6)-TRAIL(114-281)을 포함한다(도 1의 A).
본 발명에서 사용한 재조합 융합단백질 TRAIL 및 ILz(6):TRAIL을 생산하기 위해 pET23a(+):TRAIL 또는 pET23a(+):ILz(6):TRAIIL 벡터를 각각 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 다음 IPTG 존재하에 28℃에서 2일간 배양하였다. 배양액을 5,000 x g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 대장균 세포 침전물(pellet)을 얻었다. 이 후 단백질 정제 과정은 Ni-NTA His binding 컬럼(Novagen, Carlsbad, CA, US)을 이용한 표준 실험과정을 따라 행하였다.
2. 분비 가능한 ILz(6):TRAIL 발현 아데노바이러스(Ad:SS-ILz(6):TRAIL) 제작
분비가 가능한 ILz(6):TRAIL을 발현하는 아데노바이러스(Ad:SS-ILz(6):TRAIL)를 제작하였다(도 9의 A). 이를 위해 우선 인간 성장 호르몬에 있는 분비 신호 서열(signal sequence of human growth hormone, 서열번호 6)와 소포체에 존재하는 효소 퓨린에 의해 절단되는 자리(furin-cleavage site, 서열번호 7)를 포함하는 cDNA 서열을 코딩하는 올리고뉴클리오타이드(서열번호 8)를 합성하였다. 이 합성 뉴클fp오타이드를 pcDNA6A1에 클로닝하였고 이 벡터를 pcDNA6ASS로 명명하였다. ILz(6):TRAIL cDNA를 pET23a(+):ILz(6):TRAIL 벡터에서 PCR로 증폭하여 pcDNA6ASS에 클로닝하였다. 이 벡터를 pcDNA6ASS-ILz(6):TRAIL로 명명하였다. SS-ILz(6):TRAIL 서열(서열번호 9)은 분비 신호 서열(인간 성장 호르몬 유래)-퓨린 절단 자리(furin cleavage site)-ILz(6)도메인-TRAIL(114-281)을 포함하는 선형 서열(linear sequence)이다(도 9의 A). SS-ILz(6):TRAIL를 포함하는 부위를 PCR로 증폭한 후 이를 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pAvCMV3.0에 클로닝하였고, 이를 pAvCMV3.0:SS-ILz(6):TRAIL로 명명하였다. 이 pAvCMV3.0:SS-ILz(6):TRAIL을 293 세포주에 도입하여 아데노바이러스 Ad:SS-ILz(6):TRAIL를 제조하였다.
실시예 2: 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질의 세포사 유도 효과
상기 실시예 1에서 제조한 벡터를 대장균에 도입하여 재조합 ILz(6):TRAIL을 대장균에서 발현시켜 Ni-NTA His affinity column을 이용하여 정제하였고 이를 유도하지 않은 박테리아 샘플(uninduced), 유도된 샘플(induced), 정제된 단백질(purified) 샘플을 SDS-PAGE로 전기영동 한 후 쿠마시 염색하였다(도 1의 B). 이 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질(0 ng/ml, 100 ng/ml)을 대장암 세포주 HCT116에 처리하였을 때 세포사멸이 효과적으로 일어남을 관찰하였다(도 1의 C; 광학 현미경으로 관찰). 또한 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질을 BJAB 세포주에 처리하였을 때 일어나는 세포사멸이 재조합 TRAIL(114-281) 단백질 보다 현저하게 증가됨을 관찰하였다(도 1의 D; XTT 분석법으로 세포사 조사). 이렇게 증가된 세포사멸 유도 활성은 단위 삼량체 TRAIL 두개가 모여 육량체를 형성하고, 단위 삼량체가 수용체 단백질 DR5, DR4에 결합하여 이들 수용체 단백질이 복합체를 안정적으로 잘 형성되었기 때문에 세포사멸 유도 신호가 효과적으로 전달되는 것으로 생각된다. 왜냐하면 ILz(6):TRAIL이 TRAIL(114-281) 보다 쉽게 BMH에 의해 가교결합(cross-linking) 되기 때문이다(도 1의 E; 정제된 재조합 TRAIL 단백질 또는 재조합 ILz(6):TRAIL을 BMH에 1시간 동안 처리 후 SDS-PAGE로 전기영동 수행, 단백질은 쿠마시로 염색하여 관찰). 더욱이 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질을 겔-여과(gel-filtration)으로 조사한 결과 이 단백질이 삼량체, 육량체, 구량체를 모두 포함하고 있음을 잘 보여주고 있다(도 1의 F). 본 발명의 육량체화 도메인[ILz(6)]은 삼량체화 도메인(ILz(3))에 시스테인 아미노산 잔기를 더 추가한 것으로서, ILz(6):TRAIL 단백질이 단위 삼량체를 형성하고, 이 단위 삼량체에 존재하는 3개의 시스테인 잔기가 다른 단위 삼량체 존재하는 시스테인 잔기와 이황화결합(disulfide bond, S-S bond)을 만들어 육량체가 된다. 이 육량체에 다른 단위 삼량체가 이황화결합으로 결합하면 구량체가 될 수 있다.
실시예 3: 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질에 의한 AAV 모델에서 유도된 혈관 내막증식 억제 효과
풍선 혈관 확장시술 또는 혈류에 의한 혈관 내피 세포의 상처로 인해 혈관 평활근세포가 증식하고 이로 인해 혈관 내막이 막히는 혈관내막 증식의 원인이 된다(Beamish et. al. Tissue Eng Part B Rev 16, 467-491. 2010). 따라서, 실시예의 실험에서 혈관내막 증식을 유도하기 위해 경동맥과 경정맥을 봉합(Anastomosis of a carotid artery and a jugular vein, AAV)하여 혈류의 소용돌이를 유도하였고 이 모델에서 유도된 혈관내막 증식에 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL이 혈관내막 증식을 억제하는지 조사하였다. 도 2의 A에서 수술적으로 어떻게 AAV를 시행했는지 보여주었다. 수술 2 주 또는 3 주 경과한 후 AAV 부위를 적출하여 동맥의 일래스틴 층을 염색하는 Verhoeff-Van Gieson (VVG) 염색을 시행하였다. VVG 염색은 조직 시료를 3 mm 두께로 자른 후 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 실시하고 VVG 염색액(Polysciences, Warrington, PA, USA)을 이용하여 제조사에서 추천하는 방식으로 염색하였다. 그 결과 AAV 부위의 혈관 내부가 거의 완벽하게 막혀있음을 관찰하였다(도 2의 B 및 C). 경동맥(carotid artery)과 경정맥(jugular vein)의 연결되는 내막의 주변길이는 NIH freeware Image J program을 이용하여 측정하였다. 이 주변길이는 봉합된 동맥과 정맥의 면적을 계산하는데 사용하였다. 봉합된 혈관의 내막과 중막의 부위, 혈관 내막증식 부위는 VVG 염색에 의해 구분이 가능하다(도 2의 B). 내막과 중막에서 관찰되는 측정된 주변길이는 "지름(D) = 주변길이/3.14" 공식을 이용하여 계산하였다. 원의 면적은 "원의 면적 = 3.14 x R2, R = 반지름" 공식을 이용하여 계산하였다. 이 방법을 이용하여 중막의 면적, 내막의 면적, 내막증식 면적을 계산할 수 있다. 혈관 내막과 중간막의 비율이 AAV 수술 후 2-3 주에 정점에 도달하는 것을 관찰하였다(도 2의 C; VVG 염색, 도 2의 D; 내막/중막 비율 그래프).
AAV 수술후 형성되는 혈관내막 증식을 ILz(6):TRAIL 재조합 융합단백질이 억제하는지를 관찰하기 위해 도 3의 A에서 표시한 것처럼 수술 후 2일에 한 번씩 총 5회 정맥 주사하였다. ILz(6):TRAIL 재조합 단백질이 BJAB 세포를 2시간에 50％의 세포를 세포사멸로 죽일 수 있는 농도를 1 유닛(Unit)으로 정하였다(1 Unit = 8 ng ILz(6):TRAIL 단백질). 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL(1 Unit, 5 Unit, 10 Unit)을 처리하지 않은 대조군 그룹에서는 혈관 내부가 대부분 막혀있는데 반해 ILz(6):TRAIL 재조합 융합단백질을 처리한 실험군에서는 ILz(6):TRAIL 단백질의 농도에 따라 혈관 내부가 막히는 정도가 감소하고 있음을 볼 수 있었다(도 3의 B-I; VVG 염색). 혈관의 내막과 중간막의 비율(intimal-to-medial ratios)로 나타낸 혈관 내부 지름이 증가하며 이는 혈관 내막증식이 ILz(6):TRAIL 단백질에 의해 억제 또는 예방되고 있음을 보여주는 결과이다(도 3의 J; 내막/중막 비율 그래프). 그러나, 상기 실험에 사용한 양의 ILz(6):TRAIL 단백질(1 Unit, 5 Unit, 10 Unit)에 의해서는 간 또는 신장 독성이 전혀 나타나지 않았다(도 4의 A-H; H&E 염색).
실시예 4: 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질에 의한 합성형 평활근세포 사멸 효과
신호전달물질 혹은 물리적인 자극에 의해 혈관에 있는 평활근세포의 표현형이 수축형(contractile) 표현형에서 합성형(synthetic) 표현형으로 변형이 일어난다(Beamish et. al. Tissue Eng Part B Rev 16, 467-491, 2010). 합성형 표현형 평활근세포의 마커로 SMemb, CRBP-1 등이 알려져 있고(Aikawa et. al. Circ Res 73, 1000-1012, 1993; Neuville et. al. Am J Pathol 150, 509-521, 1997), 이들 마커를 조사함으로써 평활근세포의 표현형을 조사할 수 있다(Beamish et. al. Tissue Eng Part B Rev 16, 467-491, 2010). 정상 동맥과 정맥 조직은 SMemb 단백질을 거의 발현하지 않으나(도 5의 A-D; SMemb 항체를 이용한 면역염색, 도 5의 M; 염색된 부위의 강도를 Image J 프로그램으로 변환하여 전체 면적에서 차지하는 백분율) 반면에 AAV 수술한 혈관 내막세포들은 SMemb 단백질을 다량 발현하고 있음을 보여준다(도 5의 E-F; SMemb 항체를 이용한 면역염색, 도 5의 M). 이 결과는 AAV에 의해 유도되어 증식된 세포가 증식형 평활근세포이고 반면에 정상 동맥 또는 정맥 조직에 존재하는 평활근세포는 수축형임을 알 수 있다. 이러한 결과는 다른 증식형 평활근세포 마커인 CRBP-1에 발현을 조사에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다(도 6의 A-D; CRBP-1 항체를 이용한 면역염색, 도 6의 M; 염색된 부위의 강도를 Image J 프로그램으로 변환하여 전체 면적에서 차지하는 백분율). 흥미롭게도 SMemb, CRBP-1를 발현하는 평활근세포가 ILz(6):TRAIL 단백질의 농도에 따라 감소하고 있음을 관찰하였다(도 5의 G-L; SMemb 항체를 이용한 면역염색, 도 5의 M, 도 6의 G-L; CRBP-1 항체를 이용한 면역염색, 도 6의 M). 종합해 보면, 이 결과는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL이 효과적으로 혈관 평활근세포의 증식을 억제함으로써 내막증식을 억제하고 있음을 보여주고 있다.
재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL이 어떤 분자 기전을 통하여 합성형 평활근세포의 증식을 억제하는지에 대해 조사하기 위해 합성형 평활근세포에서 발현되는 활성 caspase-3의 발현 정도를 조사하였다. 정상 동맥과 정맥 조직에서는 활성 caspase-3의 발현이 거의 없음을 관찰하였다(도 7의 A-D; 활성 caspase-3에 대한 항체를 이용한 면역염색). 또한 AAV 수술부위의 혈관 내부에 존재하는 증식형 평활근세포에서도 활성 caspase-3가 거의 발현되지 않고 있음을 관찰하였다(도 7의 E-F; 활성 caspase-3에 대한 항체를 이용한 면역염색, 도 7의 M; 염색된 부위의 강도를 Image J 프로그램으로 변환하여 전체 면적에서 차지하는 백분율). 그러나 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 처리한 AAV 혈관 조직에서 관찰되는 합성형 평활근세포은 단백질 농도 의존적으로 활성 caspase-3가 증가하고 있음을 관찰하였다(도 7의 G-L 활성 caspase-3에 대한 항체를 이용한 면역염색, 도 7의 M).
한편, 활성 caspase-3의 증가가 TRAIL 수용체인 DR5를 매개로 하는지 조사하기 위해 각 조직의 DR5 발현을 조사하였다. 정상 동맥 및 정맥 조직에서 DR5가 발현되고 있으나(도 8의 A-D; DR5에 대한 항체를 이용한 면역염색, 도 8의 M; 염색된 부위의 강도를 Image J 프로그램으로 변환하여 전체 면적에서 차지하는 백분율) AAV 조직 혈관 내부에서 관찰되는 합성형 평활근세포에서 DR5의 발현이 증가되어 있음을 관찰하였다(도 8의 E-L; DR5에 대한 항체를 이용한 면역염색). 종합적으로 이들 결과로 볼 때 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL이 합성형 평활근세포에서 발현되는 DR5를 자극하여 caspase-3를 활성화시키고 그로 인해 혈관 내막증식이 억제되는 것으로 생각된다.
실시예 5: 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질에 의한 풍선확장 모델에서 유도된 혈관 내막증식 억제 효과
재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의해 억제되는 혈관 내막증식이 AAV 모델에서만 보이는 현상인지를 관찰하기 위해 혈관 내막증식의 또 다른 동물모델인 풍선 확장에 의해서 유도되는 내막 세포 손상 모델에서 실험하였다. 이번 실험에서는 분비형 ILz(6):TRAIL를 발현하는 아데노바이러스를 이용하였다. 상기 실시예 1에서 상세히 설명된 방법으로 분비형 ILz(6):TRAIL를 발현하는 아데노바이러스를 제작하였다. 이 아데노바이러스는 분비형 ILz(6):TRAIL, 즉, hGH:SS(인간 성장 호르몬에서 유래된 분비신호서열):FCS(Furin cleavage site):ILz(6):TRAIL(도 9의 A)를 발현하는 카세트를 포함하고 있다. hGH:SS 부위가 ILz(6):TRAIL을 소포체로 이동하도록 하고 소포체에 존재하는 퓨린(furin) 효소에 의해 FCS 자리에서 절단된 후 ILz(6):TRAIL 단백질은 세포밖으로 분비하도록 조작되어 있다. 이 아데노바이러스를 Ad:SS-ILz(6):TRAIL로 명명하였다(도 9의 A). Ad:SS-ILz(6):TRAIL를 A549 세포에 감염시킨 후 얻어진 배양액을 HCT116 세포주에 처리하면 세포사가 일어남을 관찰하였고 반면 Ad:control를 감염시킨 후 얻어진 배양액은 세포사를 일으키지 못함을 관찰하였다(도 9의 B; 광학현미경 사진). 이는 Ad:SS-ILz(6):TRAIL가 ILz(6):TRAIL 단백질을 잘 분비하고 있음을 보여주는 결과이다. 분비된 ILz(6):TRAIL 단백질이 배양액에 존재하는 것을 웨스턴 블롯(western blot)으로 분석하여 확인하였다(도 9의 C; TRAIL에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석).
풍선확장술에 의해 유도된 대퇴부 동맥(femoral artery) 혈관 내막증식이 Ad:control에 의해서는 전혀 억제되지 않으나, Ad:SS-ILz(6):TRAIL에서는 현저하게 억제되는 것을 관찰하였다(도 9의 D; H&E 염색). Ad:SS-ILz(6):TRAIL 또는 Ad:control에 의한 간독성은 전혀 관찰할 수 없었다(도 9의 E; H&E 염색). SS-ILz(6):TRAIL가 간세포에서 잘 발현되고 있음을 RT-PCR로 확인하였다(도 9의 F; 프라이머 P1(서열번호 10), 프라이머 P2(서열번호 11)을 이용하여 RT-PCR). ILz(6):TRAIL에 의한 혈관 내막증식은 AAV 모델에서 관찰하였던 것과 거의 같은 결과를 풍선확장 모델에서도 보이고 있다. 따라서, ILz(6):TRAIL 단백질이 여러 원인에 의한 혈관 내막증식에 억제 효과가 있는 것을 말해주고 있다.
실시예 6: 재조합 ILz(6):TRAIL 단백질의 내막증식으로 막힌 혈관을 뚫는 효과
지금까지 관찰한 것은 여러 혈관 손상 모델에서 융합단백질 ILz(6):TRAIL에 의한 혈관 내막증식 효과를 관찰하였다. 이는 ILz(6):TRAIL에 의한 혈관 내막증식 예방효과를 관찰하였다고 생각할 수 있다. ILz(6):TRAIL 융합단백질이 이미 형성된 혈관 내막증식을 제거할 수 있는지에 대한 효과, 즉, ILz(6):TRAIL 융합단백질에 의한 혈관 내막증식에 의해 막힌 혈관을 뚫어 주는 치료 효과에 대해 관찰하였다. 이를 위해 먼저 AAV 수술 후 1주를 방치하여 혈관 내막증식을 유도하고 난 후(도 10의 A) 혈관 내막증식을 관찰하였다. 도 10의 B(VVG 염색)에서 보는 것처럼, AAV 수술 후 혈관이 거의 막혀 있는 것을 관찰하였다. 이렇게 혈관이 막힌 상태에서 2일에 한 번씩 5회 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 정맥 주사하였고, AAV 수술 후 18일째 AAV 부위의 혈관을 관찰하였다. 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 처리한 그룹에서는 막혀있던 혈관 내부가 부분적으로 뚫려있는 것을 관찰하였으나 PBS 대조군에서는 완벽하게 혈관이 막혀있는 것을 관찰하였다(도 10의 B). 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL을 처리한 실험군에서 혈관 내막과 중막의 비율이 감소하고 있음을 관찰하였다(도 10의 C; 내막/중막 비율 그래프). 이 결과는 재조합 융합단백질 ILz(6):TRAIL이 제한적이기는 하지만 막힌 혈관에 치료효과가 있음을 말해주는 결과이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Chosun University
<120> Recombinant TRAIL Fusion Protein Linked to Hexamerization Domain
and Composition for Treating Restenosis Comprising the Same
Protein
<130> PN130706
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
gggcccgggg tgagagaaag aggtcctcag 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
cccgaattct tagccaacta aaaaggccc 29
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Isoleucine zipper hexamerization domain
<400> 3
Met Cys Gly Gly Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser
1 5 10 15
Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile
20 25 30
Gly Glu
<210> 4
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of ILz(6)
<400> 4
atgtgcggag gaaagcaaat cgaagacaag atagaagaaa tcctatcaaa gatctaccac 60
atcgaaaacg agatcgcacg aatcaagaag ctaatcggag aa 102
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of 6xHis-ILz(6)-TRAIL
<400> 5
atggggcatc atcatcatca tcatcccggg atgtgcggag gaaagcaaat cgaagacaag 60
atagaagaaa tcctatcaaa gatctaccac atcgaaaacg agatcgcacg aatcaagaag 120
ctaatcggag aagatatcgt gagagaaaga ggtcctcgtc gcgtagcagc tcacataact 180
gggacccgta aacgcagcaa cacattgtct tctccaaact ccaagaatcg aaaggctctg 240
ggccgcaaaa taaaatcctg gcgaaaatca aggagtgggc attcattcct gagcaaattg 300
cacttgcgca agggtgaact ggtcatccat cgaaaagggt tttactacat ctattcccaa 360
acatactttc gatttcagga gcgaagaaaa cgaaacacaa agaacgacaa acaaatggtc 420
caatatattt acaaatacac aagttatcct gaccctatat tgttgatgaa aagtgctaga 480
aatagttgtt ggtctaaaga tgcagaatat ggactctatt ccatctatca agggggaata 540
tttgagctta agcgaaagga cagaattttt gtttctgtaa caaatcgtca cttgatagac 600
atggaccatg aagccagttt tttcggggcc tttttagttg gctaa 645
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence of human growth hormone
<400> 6
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gcagtgcc 78
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> furin-cleavage site
<400> 7
agtgcccgca accgacagaa gagg 24
<210> 8
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence of human growth hormone and furin-cleavage site
<400> 8
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gcagtgccag tgcccgcaac cgacagaaga ggccc 105
<210> 9
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of SS-ILz(6):TRAIL
<400> 9
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gcagtgccag tgcccgcaac cgacagaaga gggatgggat gtgcggagga 120
aagcaaatcg aagacaagat agaagaaatc ctatcaaaga tctaccacat cgaaaacgag 180
atcgcacgaa tcaagaagct aatcggagaa gatggggtga gagaaagagg tcctcagaga 240
gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc 300
aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat 360
tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt 420
tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag 480
aacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctga ccctatattg 540
ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc 600
atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca 660
aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt tcggggcctt tttagttggc 720
taa 723
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer P1
<400> 10
atgtgcggag gaaagcaaat c 21
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer P2
<400> 11
ggggatatcg tgagagaaag aggtcctcgc 30
<210> 12
<211> 206
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of ILz(6):TRAIL(114-281)
<400> 12
Pro Gly Met Cys Gly Gly Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys
20 25 30
Leu Ile Gly Glu Asp Ile Val Arg Glu Arg Gly Pro Arg Arg Val Ala
35 40 45
Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Lys Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro
50 55 60
Asn Ser Lys Asn Arg Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Arg
65 70 75 80
Lys Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Lys Leu His Leu Arg Lys
85 90 95
Gly Glu Leu Val Ile His Arg Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln
100 105 110
Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Arg Arg Lys Arg Asn Thr Lys Asn Asp
115 120 125
Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro
130 135 140
Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala
145 150 155 160
Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys
165 170 175
Arg Lys Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Arg His Leu Ile Asp
180 185 190
Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
195 200 205
<210> 13
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of SS-ILz(6)-TRAIL(114-281)
<400> 13
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ala Arg Asn Arg Gln
20 25 30
Lys Arg Pro Gly Met Cys Gly Gly Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu
35 40 45
Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Lys Leu Ile Gly Glu Asp Gly Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg
65 70 75 80
Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser
85 90 95
Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser
100 105 110
Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
115 120 125
Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr
130 135 140
Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys
145 150 155 160
Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro
165 170 175
Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys
180 185 190
Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu
195 200 205
Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu
210 215 220
Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
225 230 235 240
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of 6His:ILz(6):TRAIL(114-281)
<400> 14
Met Gly His His His His His His Pro Gly Met Cys Gly Gly Lys Gln
1 5 10 15
Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu
20 25 30
Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Asp Ile Val Arg
35 40 45
Glu Arg Gly Pro Arg Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Lys
50 55 60
Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Arg Lys Ala Leu
65 70 75 80
Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Arg Lys Ser Arg Ser Gly His Ser Phe
85 90 95
Leu Ser Lys Leu His Leu Arg Lys Gly Glu Leu Val Ile His Arg Lys
100 105 110
Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Arg
115 120 125
Arg Lys Arg Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr
130 135 140
Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg
145 150 155 160
Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr
165 170 175
Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Arg Lys Asp Arg Ile Phe Val Ser
180 185 190
Val Thr Asn Arg His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe
195 200 205
Gly Ala Phe Leu Val Gly
210
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 이소루신 지퍼 육량체화 도메인(isoleucine zipper hexamerization domain) 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질이 결합된 TRAIL 융합단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관 재협착증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
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