KR20150128944A - IL-22 폴리펩티드 및 IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법 - Google Patents

IL-22 폴리펩티드 및 IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제; 이를 포함하는 조성물; 질환을 치료하기 위한 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, IL-22 수용체 관련 시약 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

IL-22 폴리펩티드 및 IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법 {IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 FC FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE}
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 61/800,148, 61/800,795 및 61/801,144; 2013년 5월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 61/821,062; 및 2013년 7월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 61/860,176을 우선권 주장하며, 이들 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통하여 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유하고 있다. 2014년 3월 14일에 창출된 상기 ASCII 카피는 P5580R1-WO_Seq_Listing.txt로 명명되고, 그 크기가 106,763 바이트이다.
본 발명은 IL-22 및 IL-22 Fc 융합 단백질, IL-22 효능제, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
인터루킨-22 (IL-22)는 Th22 세포, NK 세포, 림프계 조직 유도인자 (LTi) 세포, 수지상 세포 및 Th17 세포에 의해 생성되는, IL-10 계열의 시토카인의 구성원이다. IL-22는 선천 세포, 예컨대 상피 세포, 간세포 및 각질 세포에서 발현되고 진피, 췌장, 장 및 호흡기계를 포함한 몇 가지 장기의 장벽 상피 조직에서 발현되는 IL-22R1/IL-10R2 수용체 복합체와 결합된다.
IL-22는 점막 면역에 있어서 중요한 역할을 하여, 박테리아성 병원체를 부착시키고 말소시키는 것에 대항한 조기 숙주 방어를 매개한다 (문헌 [Zheng et al., 2008, Nat. Med. 14:282-89] 참조). IL-22는 상피 세포로부터의 항-미생물성 펩티드와 염증 유발성 시토카인의 생성을 증진시키고, 소화관에서 결장 상피 세포의 증식과 이동을 자극한다 (문헌 [Kumar et al., 2013, J. Cancer, 4:57-65] 참조). 박테리아 감염시, IL-22 녹아웃(knock-out) 마우스는 손상된 소화관 상피 재생, 고 박테리아 부하 및 증가된 사망률을 나타내었다 (상기 문헌 [Kumar et al.] 참조). 유사하게, IL-22 녹아웃 마우스를 인플루엔자 바이러스로 감염시키면, 심각한 체중 감소가 발생하고, 기관 및 기관지 상피 세포의 재생이 손상되었다. 따라서, IL-22는 미생물 감염을 억제하는 데 있어서 염증 유발성 역할을 할 뿐만 아니라 염증 반응에서 상피 재생에 있어서 항염증성 보호 역할을 한다. 병리학적 염증과 조직 복구를 증진시키는 IL-22의 생물학적 활동의 대부분은 여전히 결정되어야 한다. 상피 세포에 대한 IL-22의 효과에 관한 외견상 상반되는 보고서는 아직 완전히 이해되고 있지 않다 (상기 문헌 [Kumar et al.] 참조).
박테리아 복제와 전파를 제한하는 항미생물성 데펜신(defensin)을 조절하는 것이, 후속 LPS 생성을 감소시키고 점막 완전성을 보존함으로써 장 미생물무리를 안정화시키는 데 도움을 줄 것이다. IL-22는 급성 기 단백질 (SAA 포함)의 발현을 상향 조절하고, 급성 염증 반응과 연관된 특정 범위의 유전자 (IL-6, G-CSF, 및 IL-1a 포함)의 발현에 기여한다. IL-22를 건강한 마우스에게 전신 투여하는 것이 또한, 박테리아성 감염에 반응하여 LPS를 중화시키기 위하여 생리학상 관련된 농도로 LPS 결합성 단백질을 상향 조절한다.
IL-22의 발현 증가는 염증성 장 장애 (IBD) 환자에서 검출된다 (예를 들어, 문헌 [Wolk et al., 2007, J. Immunology, 178:5973]; [Andoh et al., 2005, Gastroenterology, 129:969] 참조). IBD, 예컨대 크론병(Crohn's disease) (CD) 및 궤양성 결장염 (UC)은 소화관에 존재하는 공생 미소생물에 대한 조절이상 면역 반응으로부터 비롯되는 것으로 여겨진다 (Cox et al., 2012, Mucosal Immunol. 5:99-109). UC와 CD 둘 다는, 아직까지 제대로 규정되지 않은 환경 자극에 노출된, 유전적으로 감수성인 개개인에서 발생하는 복잡한 질환이다. CD와 UC는 공통 기전과 별개의 기전 둘 다에 의해 매개되고, 별개의 임상 특징을 나타낸다 (문헌 [Sugimoto et al. 2008, J. Clinical Investigation, 118:534-544] 참조).
UC에서는, 염증이 주로 결장과 직장의 점막에서 발생하여, 설사, 직장 출혈 및 체중 감소를 포함한 쇠약 상태를 초래한다. US는 대개, 손상된 상피 장벽을 통하여 침투되는 장 미생물에 대한 숙주에 의한 부적절한 염증 반응에 의해 유발된다 (Xavier and Podolsky, 2007, Nature 448:427-434). 크론병은 활성화된 면역 세포의 장 침윤과 장 구조의 왜곡을 특징으로 한다 (상기 문헌 [Wolk et al.] 참조).
최근 수년간, 면역 반응을 조절하기 위한 각종 전략에 근거한 수많은 약물 (스테로이드, 면역조정제, 및 염증성 시토카인에 대항한 항체 포함)이 IBD를 치료하기 위해 시험되어 왔는데, 이는 불확정된 성공을 가져왔다 (Pastorelli et al., Expert opinion on emerging drugs, 2009, 14:505-521). 복잡한 각종 위장관 상재균 (gut flora)이 상기 질환의 이질성에 기여한다. 따라서, IBD에 대한 보다 우수한 치료제를 개발할 필요가 있다.
심혈관계 질환 (CVD)은 부분적으로는, 큰 혈관의 아테롬성 경화성 질환으로부터 비롯되는 사망률의 주요 원인이다. 아테롬성 경화증은 CVD 현상에 있어서 주요 원인이고, 고콜레스테롤혈증과 만성 염증성 혈관으로부터 비롯되는, 서서히 진행되는 질환이다. 아테롬성 경화성 병변은 면역 세포, 특히 대식 세포 및 T 세포의 침윤을 많이 가진 지질로서 명확히 규명된다. 선천 면역 기전과 적응 면역 기전 둘 다가 아테롬 발생성 플라크의 진행과 최종 혈전증에 기여하는 것으로 지금 인식되고 있다 (Ross, Am Heart J. 1999 Nov;138 (5 Pt 2):S419-20; Hansson 2005 N Engl J Med 352(16):1685-95; Hansson and Hermansson 2011 Nature Immunology 12(3):204-12).
급성 췌장염 (AP)은 췌장의 급성 염증성 과정이다. 급성 신장 손상 (AKI)은 신장 기능의 갑작스런 손실인데, 이로써 우레아 및 기타 질소 폐기물이 잔류하게 되고 세포외 용적과 전해질의 조절이상이 생긴다. AKI는 기존에 급성 신부전증으로서 공지되었다. 이러한 변화는 명백한 장기 부전증을 초래하지 않는 신장 기능에 있어서의 훨씬 더 작은 감소라도, 상당한 임상 관련성이 있고 발병률과 사망률 증가와 연관이 있다는 최근의 인식을 반영한 것이다. AP와 AKI에 대한 더 우수한 치료법을 개발한 필요가 있다.
대사 증후군은 혈전증, 고혈압, 이상지질혈증 및 염증에 기여하는 일련의 위험 요인을 특징으로 하는 복잡한 상태이다. 인슐린 저항성과 비만이 대사 증후군의 근원적인 주요 병원성 기전이다.
인슐린 저항성은 CVD 위험을 증가시키는데, 이는 인슐린 저항성이 아테롬 발생성 이상지질혈증, 염증 및 고혈압과 함께, 관상 동맥 질환 (CAD)으로부터의 사망률에 기여하는 내피 기능 장애를 유도시키기 때문이다. 영속적인 인슐린 저항성은 또한, 진성 당뇨병 유형 2 (T2DM)의 발병 기회를 증가시키지만, T2DM이 발병하기 수년 전부터 아테롬을 발생시키는 상태로 존재한다. 따라서, CAD의 자연 병력은 T2DM과 동일한 경로에 있긴 하지만, 무증상 형태로 삶의 훨씬 더 초기에 시작하고, 임상적으로 징후가 나타나는 데 더 긴시간이 소요되며, 당뇨병의 존재를 수반하거나 수반하지 않는 것으로 예상된다.
용어 대사 내독소증은, 예를 들어 고 지방 고 칼로리 식이 (HFD)에 의해 유도된 증가된 혈장 LPS의 상태를 설명하기 위해 만들었다 (Cani et al. 2007. Diabetes 56(7):1761-72). HFD가 공급된 마우스는 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS)의 혈장 수준이 증가되었고, 이러한 상승은 식이성 지방 증가에 따른 직접적인 결과인 것으로 여겨진다 (Cani et al. 2007 상기 참조; Cani et al. 2008 Diabetes 57(6):1470-81; Ghoshal et al. 2009, J Lipid Res 50(1):90-7). 소화관 미생물무리가 소화관 점막 상피 세포 기능의 조정을 통하여, 숙주의 에너지 밸런스와 식이 영양분의 수거 및 탄수화물 대사에 있어서 중요한 역할을 한다는 설득력있는 증거가 있다 (Turnbaugh et al. 2009, J Physiol (Lond) 587(Pt 17): 4153-8; Manco et al. 2010, Endocr Rev 31(6): 817-44). 불균형 식이 지방 조성 또는 과잉 식이 칼로리 소비를 통하여 발생되는, 소화관 미생물무리에 있어서의 변경이 심혈관계 질환의 확립된 후유증인 비만과 인슐린 저항성의 개시인자로 인식된다. 리포폴리사카라이드는 그램-음성 박테리아의 외부 막에서 발견되고, 강력한 면역 반응을 유발시킬 수 있는 내독소의 공급원으로서 작용한다 (Barcia et al. Clin Infect Dis 41 Suppl 7: S498-503). 장 미생물무리의 집단, 종 및 영역별 분포 상의 변경으로 인해, LPS의 이화에 있어서의 변화가 초래될 수 있고, 고 지방 식이는 장내 장벽을 가로지르는 LPS의 흡수를 촉진시킬 것이다. 이들 조건 하에서는, 전신 순환에 있어 증가된 LPS는 저 등급 만성 염증을 유발시켜, 만성 상태에서 식이 유도성 비만, 인슐린 저항성과 아테롬성 경화증, 및 최종 CVD 현상에 기여하는 혈장 지질을 상승시키는 내인성 보호 숙주 반응을 활성화시킬 것이다.
진성 당뇨병은 만성적으로 상승된 수준의 혈당 (고혈당증)이 존재하는 것으로써 정의되는 심각한 대사 질환이다. 이러한 상태의 고혈당증은 펩티드 호르몬인 인슐린의 활성이 상대적 또는 절대적으로 결여된 결과이다. 인슐린은 췌장의 β 세포에 의해 생성 및 분비된다. 인슐린은 글루코스 활용, 단백질 합성, 및 글리코겐으로서의 탄수화물 에너지의 형성과 저장을 증진시키는 것으로 보고된다. 글루코스는 중합된 글루코스의 형태인 글리코겐으로서 체내에 저장되는데, 이는 글루코스로 다시 전환되어 대사 요건을 충족시킬 수 있다. 정상적인 상태 하에서는, 인슐린이 글루코스 자극 후 기본적인 속도와 증강된 속도 둘 다로 분비되어, 글루코스를 글리코겐으로 전환시킴으로써 대사 생체 항상성을 유지시킨다. 아테롬성 경화증에 대한 새로운 치료 패러다임과, CVD 현상, 대사 증후군, 급성 내독소증과 패혈증, 및 인슐린 관련 장애의 예방에 대한 필요성이 여전히 있다.
상처 치유는 염증 기, 과립화 조직 형성 기, 및 조직 재형성 기를 포함한 복잡한 과정이다 (예를 들어, 문헌 [Singer and Clark, Cutaneous Wound Healing, N. Engl. J. Med . 341:738-46 (1999)] 참조). 이들 현상은 손상 부위에서 방출되는 시토카인과 성장 인자에 의해 촉발된다. 많은 요인들이 정상적인 적당한 상처 치유를 복잡하게 하거나 방해할 수 있다. 예를 들어, 이러한 요인들은 연령, 감염, 영양 불량, 면역억제, 의약, 방사선, 당뇨병, 말초 혈관 질환, 전신 질병, 흡연 및 스트레스를 포함한다.
만성 쇠약 질환인 당뇨병에 걸린 대상체의 경우에, 당뇨병성 족부 궤양 (상처로서 지칭되기도 함)은 흔한 합병증이다. 만성 궤양은 해부학적 및 기능적 완전성을 창조하기 위해 질서 정연하고 적시에 복구 과정을 진행하지 않는 상처로서 정의된다 (예를 들어, 문헌 [Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol . 130:489-93 (1994)] 참조). 그것의 특성상, 당뇨병성 족부 궤양은 만성 상처이다 [American Diabetes Association, Consensus development conference on diabetic foot wound care, Diabetes Care, 22(8):1354-60 (1999)]. 피부는 환경에 대항한 일차 장벽으로서 제공되기 때문에, 난치성 개방 상처는 치명적일 수 있고; 주요 장애 (사지 손실 포함)가 발생할 수 있고 심지어 사망할 수 있다. 족부 궤양은 당뇨병이 있는 사람의 하체 절단의 약 85%에서 나타나는 전조 현상이다 (예를 들어, 문헌 [Apelqvist, et al., What is the most effective way to reduce incidence of amputation in the diabetic foot? Diabetes Metab Res. Rev., 16(1 Suppl.):S75-S83 (2000)] 참조). 따라서, 당뇨병성 상처 치유를 포함한 상처 치유를 촉진 또는 개선시킬 필요가 있다.
한 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 IL-22 수용체와 결합하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하는데, 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 상기 Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 바람직하게 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인의 N297 잔기는 글리신 또는 알라닌으로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, N297 잔기는 Gly으로 변화되는 반면, 다른 실시양태에서, N297 잔기는 Ala로 변화된다. 특정 실시양태에서, IL-22 수용체와의 결합으로, IL-22 수용체 하류 신호 전달이 촉발되는데, 이는 STAT3을 활성화시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열과 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 12의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 기능 및/또는 활성은 시험관내 또는 생체내 방법, 예를 들어 IL-22 수용체 결합 검정, Stat3 루시퍼라제 리포터 활성 검정 등에 의해 검정할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포인 반면; 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 (E. coli) 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 IgG Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하는데, 상기 Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 CPPCP (서열 31)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 상기 Fc 영역 내의 N297 잔기가 변화되고/되거나 Fc 영역 내의 T299 잔기가 변화된다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인 내의 N297 잔기가, 바람직하게 글리신 또는 알라닌으로 변화된다. 특정의 특별한 실시양태에서, 이러한 N297 잔기는 글리신으로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, 상기 N297 잔기는 알라닌으로 변화된다. 또한 다른 실시양태에서, 상기 T299 잔기는 Ala, Gly 또는 Val으로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, 상기 링커는 8개 내지 20개 아미노산 길이, 8개 내지 16개 아미노산 길이, 또는 10개 내지 16개 아미노산 길이이다.
특정 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 DKTHT (서열 32)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGDKTHT (서열 41)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 11개 이상의 아미노산 길이이고 아미노산 서열 EPKSCDKTHT (서열 33)를 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 VEPKSCDKTHT (서열 34), KVEPKSCDKTHT (서열 35), KKVEPKSCDKTHT (서열 36), DKKVEPKSCDKTHT (서열 37), VDKKVEPKSCDKTHT (서열 38), 또는 KVDKKVEPKSCDKTHT (서열 39)를 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 EPKSSDKTHT (서열 40)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 VEPKSSDKTHT (서열 67), KVEPKSSDKTHT (서열 68), KKVEPKSSDKTHT (서열 66), DKKVEPKSSDKTHT (서열 64), VDKKVEPKSSDKTHT (서열 69), 또는 KVDKKVEPKSSDKTHT (서열 65)를 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGS (서열 45), GGGS (서열 46) 또는 GGGGS (서열 47)를 포함하지 않는다. 별개의 실시양태에서, IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질은 GGGSTHT (서열 63)의 링커 서열을 포함한다. 다른 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 12 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 12의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SKYGPP (서열 43)를 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP (서열 44)를 포함한다. 특정의 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGS (서열 45), GGGS (서열 46) 또는 GGGGS (서열 47)를 포함하지 않는다. 다른 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8 또는 서열 10의 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 생성된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 특정의 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 상기 Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하며, 상기 조성물은 CH2 도메인 내에 5% 이하의 아푸코실화(afucosylation) 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 아푸코실화 수준은 2% 이하, 보다 바람직하게 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 아푸코실화 수준은 질량 분광측정법에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 힌지 영역은 CPPCP (서열 31)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 24의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는데, 이러한 조성물은 Fc 영역의 CH2 도메인 내에 5% 이하의 아푸코실화 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 아푸코실화 수준은 2% 이하, 보다 바람직하게 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 정제에 의해, 바람직하게는 푸코실화 종을 아푸코실화 종으로부터 분리 정제함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포인 반면; 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물 또는 제약 조성물은 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 상기 조성물 또는 제약 조성물은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 이. 콜라이에 의해 생성된다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정의 추가 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 최적 이하 양의 치료제, 예컨대 덱사메타손(dexamethasone)을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드는 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다.
추가로, 본 발명의 각각 및 모든 측면에 따라서, 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질 (IL-22를 기준으로 함)일 수 있는 반면; 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 단량체성 Fc 융합 단백질 (IL-22를 기준으로 함)일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 이러한 단량체성 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 아암(arm) 및 Fc 아암을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 아암 및 Fc 아암은 Fc 영역 내에 놉(knob) 또는 홀(hole)을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 아암 (단량체 IL-22 Fc 융합)의 Fc 영역은 놉을 포함하고, Fc 아암 (IL-22와 연결되지 않은 단량체 Fc)의 Fc 영역은 홀을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 아암 (단량체 IL-22 Fc 융합)의 Fc 영역은 홀을 포함하고, Fc 아암 (IL-22와 연결되지 않은 단량체 Fc)의 Fc 영역은 놉을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 61 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 양 암의 Fc 영역은 N297G 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단량체성 IL-22 Fc는 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드와 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 발현할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 특정의 다른 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 관련 측면에서, 본 발명은 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 핵산은 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 24 또는 서열 26, 바람직하게 서열 8 또는 서열 12, 보다 바람직하게 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩한다. 특정의 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 23 또는 서열 25의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 핵산은 서열 7 또는 서열 11, 바람직하게 서열 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단리된 핵산은 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13; 서열 23 또는 서열 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13; 서열 23 또는 서열 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이러한 단리된 핵산은 IL-22R과 결합할 수 있고/있거나 IL-22R 활성을 촉발시킬 수 있는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩할 수 있고, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13; 서열 23 또는 서열 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이러한 단리된 핵산은 서열 8, 10, 12, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 관련 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 핵산을 포함하는 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 특정의 특별한 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 원핵 세포이다. 특정의 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
추가의 관련 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. IL-22 Fc 융합 단백질은 배양 배지 수집, 냉동/해동, 원심분리, 세포 용해, 균질화, 황산암모늄 침전, HPLC 및 친화, 겔 여과, 및 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 모든 단백질 단리 또는 정제 방법에 의해 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 아푸코실화 IL-22 Fc 융합 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 아푸코실화 IL-22 Fc 융합 단백질은 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 24, 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는 반면, IL-22 폴리펩티드는 글리코실화된다. 특정의 상기 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 CHO 세포에서 생성된다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 항체 의존성 세포성 세포독성을 유도시키지 않는다. 또한 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 덱사메타손 또는 TNF 길항제를 추가로 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 덱사메타손 또는 TNF 길항제는 최적 이하 양으로 존재한다.
특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 CH2 도메인 내에 5% 이하, 바람직하게 2% 이하, 보다 바람직하게 1% 미만의 아푸코실화 수준을 갖는다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 24 또는 서열 26, 바람직하게 서열 24의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 CHO 세포에서 생성된다. 특정의 특별한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 전신 또는 국소 투여된다. 특정의 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 겔화제이다. 특정 실시양태에서, 겔화제는 폴리사카라이드이다. 일부 실시양태에서, 겔화제는 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, POE-POP 블록 중합체, 알기네이트, 히알루론산, 폴리아크릴산, 히드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스이지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 셀룰로스성 작용제, 예컨대 히드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스이지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 겔화제는 히드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 국소 투여용이다. 특정 실시양태에서, 국소 투여용 제약 조성물은 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 투여용 제약 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 국소 투여용 제약 조성물은 Fc 융합을 수반하지 않은 IL-22 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 IBD를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, IBD는 궤양성 결장염이다. 특정의 다른 실시양태에서, IBD는 크론병이다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, Fc 영역의 N297 잔기 및/또는 T299 잔기가 변화된다. 특정 실시양태에서, Fc 영역의 N297 잔기가 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, N297 잔기가 Gly 또는 Ala, 바람직하게 Gly로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, T299 잔기가 변화되는데, 바람직하게 Val, Gly 또는 Ala로 변화된다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14, 바람직하게 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 이. 콜라이 또는 CHO 세포에서 생성된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정의 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 이용하여 다음 질환 중 어느 한 가지 또는 질환의 조합을 치료하는 방법을 제공한다: 유형 II 당뇨병, 병적 비만을 수반한 유형 II 당뇨병, 상처 (당뇨병성 상처 및 당뇨병성 궤양 포함), 화상, 궤양 (욕창과 정맥 궤양 포함), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 아테롬성 경화증, 심혈관계 질환, 대사 증후군, 내독소증 (급성 및 경증), 패혈증, 급성 관상 동맥 심장 질환, 고혈압, 이상지질혈증, 비만, 고혈당증, 지질 대사 장애, 간염, 급성 간염, 신부전증, 급성 신부전증, 급성 신장 손상, 신장 이식 실패, 사체 신장 이식 지연 이식편 기능, 조영제 유발 신장병, 췌장염, 급성 췌장염, 간 섬유증 및 폐 섬유증. 특정 실시양태에서, 급성 췌장염은 경증 내지 중간 증상 내지 중증 질환일 수 있다. 특정 실시양태에서, 급성 췌장염은 ERCP (내시경 역행 췌담관 조영술) 후의 질환을 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 상기 질환에 대해 치료하고자 하는 환자는 자신의 HDL/LDL 지질 프로파일 상의 변화를 필요로 하는데, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 이러한 환자에서 HDL은 증가시키고 LDL은 감소시키도록 변경시킬 수 있다. 관련 측면에서, 본 발명은 상기 질환 중 어느 한 가지 또는 질환의 조합을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 장에서의 미생물 감염의 억제 또는 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포의 보존을 필요로 하는 대상체에게, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 장에서의 미생물 감염을 억제하거나 또는 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포를 보존하는 방법을 제공한다. 다른 관련 측면에서, 본 발명은 장에서의 상피 세포 완전성, 점막 치유, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 증강을 필요로 하는 대상체에게, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 장에서의 상피 세포 완전성, 점막 치유, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 증강시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상피 세포는 장 상피 세포이다.
또 다른 측면에서, 아테롬성 경화성 플라크 형성의 병리상태를 포함하는 심혈관계 상태를 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 심혈관계 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 심혈관계 상태는, 예를 들어 관상 동맥 질환, 관상 미소혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 및 만성 신장 질환을 포함한다. 상기 방법은 아테롬성 경화성 플라크 형성의 진행을 추가로 느리게 하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 심혈관계 상태를 예방 또는 치료하기 위하여 상기 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 대사 증후군을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 대사 증후군과 연관된 한 가지 이상의 위험 요인 (이는 복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증 및 고혈압 중 한 가지 이상을 포함한다)을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체에서 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS)의 수준을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 대사 증후군을 예방 또는 치료하기 위하여 상기 대상체에게 한 가지 이상의 부가 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 아테롬성 경화증의 진행을 지연시키거나 느리게 하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 아테롬성 경화증의 진행의 지연 또는 느리게 하는 것을 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 아테롬성 경화증의 진행을 지연시키거나 느리게 하기 위하여 상기 대상체에게 한 가지 이상의 부가 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 아테롬성 경화증의 징후를 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법은 아테롬성 경화증에 걸릴 위험이 있는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는데, 이러한 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 아테롬성 경화증의 징후의 발생에 대항하여 유효하다. 특정 실시양태에서, 대상체는 심혈관계 상태의 발생 위험이 있는 것으로 확인되었다. 특정 실시양태에서, 대상체는 유전적으로, 심혈관계 상태의 발생 위험이 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 아테롬성 경화증의 징후는 플라크 축적을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아테롬성 경화증의 징후는 혈관 염증을 포함한다. 상기 방법은 아테롬성 경화증의 징후를 예방하기 위하여 상기 대상체에게 한 가지 이상의 부가 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한 또 다른 측면에서, 급성 내독소증 및 패혈증 중 한 가지 이상을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 급성 내독소증 및 패혈증 중 한 가지 이상의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 급성 내독소증 및 패혈증 중 한 가지 이상을 치료하기 위하여 상기 대상체에게 한 가지 이상의 부가 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 다른 측면에서, 특정 대상체에서 상처 치유를 촉진 또는 개선시키거나, 또는 상처 치유를 촉진 및 개선시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 상처 치유의 촉진 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상처는 만성 상처이다. 특정의 다른 실시양태에서, 상처는 감염된 상처이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 유형 II 당뇨병에 걸린 대상체를 포함한, 당뇨병 환자이다. 하나 이상의 실시양태에서, 상처는 당뇨병성 족부 궤양이다. 특정 실시양태에서, 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 완전한 상처 봉합이 될 때까지 투여한다. 일부 실시양태에서, 투여는 전신이고; 다른 실시양태에서, 투여는 국소이다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 국소 투여용 제제 내에 있다. 특정 실시양태에서, 국소 제제는 Fc 융합을 수반하지 않은 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, IL-22 효능제, IL-19 폴리펩티드, IL-19 Fc 융합 단백질, IL-19 효능제, IL-20 폴리펩티드, IL-20 Fc 융합 단백질, IL-20 효능제, IL-24 폴리펩티드, IL-24 Fc 융합 단백질, IL-24 효능제, IL-26 폴리펩티드, IL-26 Fc 융합 단백질, IL-26 효능제, 및 IL-22R1 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, IL-22 효능제, IL-20 폴리펩티드, IL-20 Fc 융합 단백질, IL-20 효능제, IL-24 폴리펩티드, IL-24 Fc 융합 단백질, IL-24 효능제 및 IL-22R1 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, IL-22R1 효능제는 항-IL-22R1 작동성 항체이다.
추가 측면에서, 본 발명은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 치료 유효량의 하나 이상의 IL-22 효능제를 투여하는 단계를 포함하는, 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, IL-22 효능제, IL-19 폴리펩티드, IL-19 Fc 융합 단백질, IL-19 효능제, IL-20 폴리펩티드, IL-20 Fc 융합 단백질, IL-20 효능제, IL-24 폴리펩티드, IL-24 Fc 융합 단백질, IL-24 효능제, IL-26 폴리펩티드, IL-26 Fc 융합 단백질, IL-26 효능제, 및 IL-22R1 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, IL-22 효능제, IL-20 폴리펩티드, IL-20 Fc 융합 단백질, IL-20 효능제, IL-24 폴리펩티드, IL-24 Fc 융합 단백질, IL-24 효능제 및 IL-22R1 효능제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, IL-22R1 효능제는 항-IL-22R1 작동성 항체이다. 특정의 다른 실시양태에서, 대사 증후군은 당뇨병이다. 특정의 특별한 실시양태에서, 대사 증후군은 유형 II 당뇨병이다.
또 다른 실시양태에 따라서, 대상체에게 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 정맥내, 피하, 복강내, 전신 또는 국소 투여한다.
이들 측면의 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정 실시양태에서, Fc 영역의 N297 잔기 및/또는 T299 잔기는 변화된다. 특정 실시양태에서, Fc 영역의 N297 잔기는 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, N297 잔기는 Gly 또는 Ala, 바람직하게 Gly로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, T299 잔기가 변화되는데, 바람직하게 Val, Gly 또는 Ala로 변화된다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14, 바람직하게 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 이. 콜라이에서 생성된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정의 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내, 피하 또는 국소 투여된다.
특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 CH2 도메인 내에 5% 이하, 바람직하게 2% 이하, 보다 바람직하게 1% 미만의 아푸코실화 수준을 갖는다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 24 또는 서열 26, 바람직하게 서열 24의 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 CHO 세포에서 생성된다. 특정의 특별한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정의 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내, 피하 또는 국소 투여된다.
상기 측면의 또한 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 부착된 N-글리칸은 당분해 효소에 의해 효소적으로 제거된다. 특정 실시양태에서, 당분해 효소는 펩티드-N-글리코시다제 (PNGase)이다. 특정의 특별한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또한 추가 측면에서, 본 발명은 또한, IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에서, IBD (UC 및 CD 포함)를 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 장에서의 미생물 감염의 억제 또는 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포의 보존을 필요로 하는 대상체에서, 장에서의 미생물 감염을 억제하거나 또는 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포를 보존하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다. 또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 장에서의 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 증강을 필요로 하는 대상체에서, 장에서의 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 증강시키기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다. 다른 관련 측면에서, 본 발명은 다음에 언급된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 심혈관계 상태, 대사 증후군, 아테롬성 경화증, 급성 신장 손상, 급성 췌장염을 치료하고; 상처 치유 (만성 상처, 당뇨병성 상처, 감염된 상처, 욕창 또는 당뇨병성 족부 궤양의 치유를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)를 촉진, 증진 또는 개선시키기 위한 의약을 제조하는 데 있어서의, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다.
각각 및 모든 실시양태는 문맥상 분명하게 달리 제안되지 않는 한 조합될 수 있다. 각각 및 모든 실시양태는 문맥상 분명하게 달리 제안되지 않는 한 본 발명의 각각 및 모든 측면에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시양태는 특정의 바람직한 실시양태에 관한 다음의 보다 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 상이한 포유류 종으로부터의 성숙한 IL-22의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다: 인간 (유전자은행 수탁 번호 Q9GZX6, 서열 4), 침팬지 (유전자은행 수탁 번호 XP_003313906, 서열 48), 오랑우탄 (유전자은행 수탁 번호 XP_002823544, 서열 49), 마우스 (유전자은행 수탁 번호 Q9JJY9, 서열 50) 및 개 (유전자은행 수탁 번호 XP_538274, 서열 51).
도 2는 전형적인 인간 모노클로날 IgG1 Fc (패널 a); 링커 서열 EPKSCDKTHT (서열 33, 패널 b), EPKSSDKTHT (서열 40, 패널 c), 및 GGGDKTHT (서열 41, 패널 d)를 함유하는 IL-22 IgG1 Fc 융합; 및 N297G 돌연변이를 수반하거나 수반하지 않는, 링커 서열 RVESKYGPP (서열 44, 각각 패널 e 및 f)를 함유하는 IL-22 IgG4 Fc 융합; 및 N297G 돌연변이를 수반하는 링커 서열 EPKSSDKTHT (서열 40) (패널 g)를 함유하는 IL-22 IgG1 Fc 융합의 Fc 영역의 글리코실화 상태의 질량 분광측정법 결과를 도시한 것이다.
도 3은 인간 IL-22 IgG4 Fc 융합 [N297G, C-말단 Lys를 수반한 (서열 16), Lys를 수반하지 않은 (서열 8) 완전한 길이의 Fc 서열], IL-22 IgG1 Fc 융합 [N297G, C-말단 Lys를 수반한 (서열 20), Lys를 수반하지 않은 (서열 12) 완전한 길이의 Fc 서열] 및 IL-22 (서열 4)의 서열 정렬을 도시한 것이다. 도시된 IL-22 서열은 리더 서열을 수반하지 않은 성숙된 형태이다. 힌지 서열 CPPCP (서열 31)이 박스 내에 제시되고, 그 다음 CH2 및 CH3 도메인이 제시된다. N297G 치환 및 임의의 C-말단 Lys 잔기가 표시된다.
도 4는 STAT3 루시퍼라제 검정의 결과를 나타내는 그래프를 제시한다. IL-22 IgG4 Fc 융합 또는 IL-22 IgG1 Fc 융합에 의해 자극된 루시퍼라제 활성은 인간 IL-22R을 발현하는 293 세포에서 측정하였다. 그 결과는 IL-22 IgG4 및 IL-22 IgG1 Fc 융합이 유사한 시험관내 활성을 나타냈다는 것을 보여준다.
도 5는 덱스트란 황산나트륨 (DSS)-유도된 마우스 IBD 모델에서 마우스 IL-22 Fc 융합 단백질의 치료 효과를 도시한 것이다. 마우스 IL-22 Fc 융합 단백질은 DSS-유도된 IBD 마우스에서 결장 조직학을 개선시켰고 (도 5b), 이러한 개선은 결장 조직학 스코어 감소로 해석되었다 (도 5c). IL-22 Fc 융합 단백질로 치료하면,상기 모델에서 현재 가장 우수한 표준 치료인 덱사메타손과 비교해서, 치료 동안 마우스의 체중 손실이 감소되었다 (도 5a).
도 6은 0일 및 7일째에 0.15 mg/kg 및 1.5 mg/kg의 용량이 투여된 시노몰구스 원숭이에서 인간 IL-22 IgG4 및 IgG1 Fc 융합 단백질의 혈청 청소율을 도시한 것이다.
도 7은 1일 및 8일째에 0.15 mg/kg 및 1.5 mg/kg의 용량 (도 6에서 0일 및 7일째와 동일한 투여량 요법)을 투여한 후 시노몰구스 원숭이에서 3가지 IL-22R 하류 유전자의 혈청 수준을 도시한 것이다. hIL-22 Fc 투여 후, 도 7a는 혈청 아밀로이드 A (SAA) 상의 용량-의존적 증가를 도시한 것이고, 도 7b는 리포폴리사카라이드 결합성 단백질 (LPS-BP) 상의 용량-의존적 증가를 도시한 것이며, 도 7c는 RegIII/췌장염 관련 단백질 (PAP 또는 PancrePAP) 상의 용량-의존적 증가를 도시한 것이다.
도 8은 고 지방 식이 중인 8개월생 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스의 대동맥 아치와 팔머리 동맥에서의 아테롬성 경화성 플라크 조직량을 명확하게 보여주는 고 해상도 마이크로CT를 도시한 것이다.
도 9는 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스가 식이 챌린지에 대해 감수성이고, 마이크로CT로부터 측정된 바와 같이 실질적으로 증가된 수준의 아테롬성 경화증을 나타내지만 (a), 혈청 LDL 수준은 단지 중간 수준으로 증가하였다는 것을 보여준다 (b).
도 10은 급성 저 등급의 염증 자극에 대한 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스의 반응을 도시한 것인데, 이는 wt C57 마우스에서 관찰된 것 보다 더 큰 혈청 MCP-1 (a) 및 IL-6 (b) 상의 증가를 명확히 보여주었고, 니트로글리세린의 주입 및 유동 매개된 팽창에 의해 평가된 바와 같이 혈관 기능의 상실을 수반하였다 (c).
도 11은 만성 내독소 노출로 인해, 이상지질혈증 (a) 및 보다 많은 플라크 조직량 (b)과 불안정성 (c)이 초래된다는 것을 나타낸다.
도 12는 공복 혈당이 대조군 (a)과 비교해서 IL-22-Fc 처리된 군에서 감소되었고, 글루코스 청소율이 글루코스 내성 시험으로부터 알 수 있는 바와 같이 IL-22-Fc 처리를 이용하여 개선되었다는 것을 보여준다 (b,c).
도 13은 IL-22-Fc로의 처리 후에 총 콜레스테롤 상의 감소가 발생한다는 것을 보여준다. Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스에서는, 총 콜레스테롤이 공복 상태와 먹이가 공급된 상태 둘 다에서 상승하였고, 처리 기간이 끝날 무렵에 측정된 바와 같이, 대조군과 비교해서 IL-22-Fc 군에서 감소하였다 (a). 먹이가 공급된 상태에서 현저한 감소를 나타내는 IL-22-Fc 처리시, 혈장 트리글리세리드 수준이 또한 감소되었다 (b).
도 14는 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스에서 관찰된 고지질혈증이 IL-22-Fc 처리 후에 저하되었다는 것을 보여준다. LDL은 공복 상태와 먹이가 공급된 상태 둘 다에서 감소되었고 (a), HDL은 상승하였으며 (b), LDL/HDL 비는 공복 상태와 먹이가 공급된 상태 둘 다에서 감소되었다 (c). vLDL은 먹이가 공급된 상태 하에 감소되었다 (d). HDL (e), LDL (f) 및 LDL/HDL 비 (g)의 결과가 2회 용량이 투여된 마우스에서 5일 후에 도시되었다.
도 15는 혈장 LPS 수준이 IL-22-Fc 처리 후에 감소되었다는 것을 보여준다.
도 16은 IL-22-Fc 처리 후 혈관 반응성에 의해 측정된 개선된 내피 기능을 보여준다.
도 17은 해부된 대동맥 아치, 상행 및 하행 대동맥 (a), 팔머리 동맥 (b) 및 대동맥 판막 (c)의 사후 샘플 상에서 조영 증강된 마이크로CT를 이용하여 수행된 플라크 조직량의 정량적 분석을 도시한 것이다.
도 18은 IL-22-Fc 처리후 체중 (a)과 음식 섭취량 (b)을 보여준다.
도 19는 당뇨병 마우스 모델 치료 요법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 20a-cdb/db 마우스에서의 체중과 혈청 글루코스 수준을 나타내는데, 이는 IL-22-Fc가 상기 비만 마우스에서 글루코스를 상당히 감소시켰다는 것을 입증해준다.
도 21은 IL-22 Fc 처리가 글루코스 내성 시험 (GTT) (p < 0.05)에 근거하여 글루코스 내성과 인슐린 감수성을 개선시킨다는 것을 보여준다.
도 22a-b는 IL-22 Fc 처리가 mg/dL 글루코스 수준 (a) 및 % 글루코스 감소 (b)를 통하여 측정된 바와 같은 인슐린 내성 시험 (ITT)을 근거로 하여 인슐린 감수성을 개선시켰다는 것을 보여준다.
도 23은 IL-22 Fc가 섬(islet)에서 인슐린 발현을 증가시켰다는 것을 보여준다. (a) 녹색은 글루카곤을 나타내고, 적색은 인슐린을 나타낸다. 적색 라인에 의해 둘러싸여진 원형 지역은 섬 지역을 나타낸다. 바, 50 ㎛. (b) 평균 인슐린 염색 세기. (c) 평균 글루카곤 염색 세기. (d) HFD-공급된 마우스에서 공급된 인슐린 수준. (e) HFD-공급된 마우스에서 공복 인슐린 수준. (f) IL-22 Fc는 HFD-공급된 마우스에서 인슐린 감수성을 역전시켰다. **P<0.01, ***P<0.001. 오차 막대, s.e.m.
도 24a-b는 IL-22-Fc 치료된 동물에서 인슐린-신호 세기의 정량적 분석을 도시한 것이다.
도 25a-b는 대조군과 비교해서 IL-22-Fc 처리된 동물에서 인슐린-양성 면적이 증가하였다는 것을 보여준다.
도 26은 대조군 (a)과 비교해서 IL-22-Fc 처리 (b)의 경우에 간 문맥주위 지방증이 감소되었다는 것을 입증해주는 조직학적 박편을 나타낸다.
도 27a-b는 HFD 유도된 글루코스 내성에서 IL-22R의 평가를 도시한 것이다. (a) 글루코스를 복강내 (ip) 주사한 후 일정 시간에 걸친 글루코스 수준 (mg/dL). (b) 곡선 하의 총 면적 (AUC)의 계산.
도 28은 한배 새끼 대조군과 비교한 IL-22 수용체 KO 마우스의 체중을 나타낸다.
도 29a- d. Ldlr -/-, Apobec1 -/- (dko) 마우스를 48시간 동안 50 ㎍ IL-22Fc 또는 50 ㎍ 항-두드러기쑥(ragweed)으로 처리하였다 (군당 n=6). IL-22Fc 처리된 마우스에서, 혈청 LPS는 50% 정도 감소하였고 (p=0.0052) 혈청 LDL/HDL은 30% 정도 감소하였다 (p=0.049).
도 30은 천연 인간 IL-22를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 70)을 나타낸다.
도 31은 도 30에 나타낸 코딩 서열로부터 유래된 아미노산 서열 (서열 71)을 나타낸다.
도 32a는 마우스 IL-22-마우스-IgG2a 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 73)을 나타낸다. 도 32b는 마우스 IL-22-마우스 IgG2a 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 72)을 나타낸다.
도 33은 IL-22R을 통한 신호 전달이 결여되면, 상처 치유가 지연된다는 것을 보여준다. IL-22R KO 마우스 상처는 WT 한배 새끼 대조군 마우스와 비교해서 치유에 있어서 상당히 지연되었다 (10일째 p=0.0018 & 12일째 p=0.005).
도 34a-c는 10일, 12일 및 15일째 개개 마우스 (n=10) 상처 갭을 나타낸다. 14일째 IL-22R KO 마우스와 WT 마우스 둘 다에 대한 상처의 대표적인 사진 영상이 도시된다 (d).
도 35는 대조군 WT 마우스 (BKS)와 당뇨병 db/db 마우스 간의 상처 치유 비교를 예시한 것이다. (a) db/db 마우스에서의 상처 치유는 연구 기간 내내 상당히 지연되었고, 심지어 28일째에도 완전히 치유되지 못하였다. (b)에서의 막대 그래프는 상처 절제 후 일수에서 야생형 또는 db/db 마우스 내에서의 변화 배수로서의 IL-22 발현 수준을 나타낸다.
도 36은 총 3개 군 (n=7)의 db/db 마우스에서 IL-22-Fc를 시험하기 위한 연구 설계를 개략적으로 나타낸 것이다. 항-두드러기쑥을 대조군 Fc 단백질용으로 사용하였고, 항-FGFR1 항체를 글루코스 조절을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 37은 IL-22 Fc가, 4일째부터 27일째까지 대조군과 비교한 바와 같이, 처리된 마우스의 공급된 글루코스 수준을 정상화시켰다는 것을 보여준다. 글루코스 수준은 원터치(Onetouch®) 혈당 측정기를 이용하여 기록하였다.
도 38은 2개의 대조군 항체인 항-두드러기쑥 및 항-FGFR1과 비교한 IL-22-Fc의 비교되는 상처 갭 측정을 그래프로 나타낸다. 각 데이터 점은 군당 7마리 마우스의 평균을 나타낸다.
도 39a-d는 15일, 19일, 21일 및 27일째 개개 상처 갭 측정을 나타낸다. 27일째 대표적인 마우스의 사진이 도시된다 (e).
도 40db/db 마우스에서 대조군 항체 처리와 비교한 IL-22-Fc의 국소 투여 대 전신 투여를 시험하기 위한 연구 설계를 개략적으로 나타낸 것이다; 총 3개 군 (n=7).
도 41a-b는 대조군 Fc 국소 처리와 비교되는, IL-22-Fc 국소 투여 대 전신 투여의 상처 갭 측정을 그래프로 나타낸 것이다. 항-두드러기쑥 항체를 Fc 대조군 항체로서 사용하였다. 각 데이터 점은 군당 7마리 마우스의 평균을 나타낸다.
도 42는 IL-22-Fc (b) 및 대조군 항체 (a)로부터 22일째 상면도 뿐만 아니라 배면도 둘 다를 보여주는 대표적인 마우스로부터 외과적으로 제거된 상처 조직을 사진으로 보여준다.
도 43a는 IL-22R KO 마우스의 생성을 위한 전략을 보여준다. 43b는 IL-22R KO 및 WT 마우스로부터의 결장에서의 IL-22Ra1 mRNA 발현의 RT-PCR 결과를 보여준다. 도 43c는 IL-22 Fc 또는 대조군 IgG의 단일 용량 주사 후 2일째에 IL-22R KO 및 WT 마우스로부터의 결장에서의 Reg3b mRNA 발현의 RT-PCR 결과를 보여준다. ***P<0.001. 오차 막대, s.e.m.
도 44는 비만 마우스가 결함있는 IL-22 반응을 증가시켰다는 것을 입증하는 결과를 나타낸다. (a-d) db/db의 림프절 배수에 있어서의 림프구 (a-b), DIO (c-d), 및 OVA/CFA로 면역시킨 대조군 마우스를 대상으로 하여, 7일째에 유동 세포계수법에 의해 IL-22 발현에 관하여 분석하였다. (a, c)에서 FACS 플롯 상의 수는 CD4+ T 세포 내의 IL-22+ 세포의 비율 (%)이다. (e-f) db/db, 마른 대조군, HFD 및 차우(chow) 식이-공급된 정상 마우스에게 플라겔린(flagellin) 또는 PBS를 주사하였다. 2시간 후에 혈청을 수거하였다. db /db 및 마른 대조군 (e), 및 HFD 및 차우 식이-공급된 마우스 (f)로부터의 IL-22의 ELISA. 도시된 데이터는 3가지 (a-b) 또는 2가지 (c-f) 독립적인 실험의 대표 값이다. 모든 실험에서 N=4이다. * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 45는 렙틴 신호-결핍성 마우스에서 IL-17 및 IL-22 생성의 결함을 보여준다. (a-b) IL-17A 및 IL-22 발현을, OVA/CFA로 면역시킨 db/dbob/ob 마우스에서 CD4+ 세포 내의 비율로서 7일째에 분석하였다. (c) 재조합 마우스 렙틴 (1 ㎍/ml)을 수반하거나 수반하지 않은 IL-22 생성 조건 하에 자극시킨, 정제된 타고난 본래의 WT CD4+ T 세포의 배양 상등액으로부터의 IL-22 ELISA. (d) 재조합 마우스 렙틴 (1 ㎍/ml)을 수반하거나 수반하지 않은 IL-23으로 자극시킨 Rag2 KO 비장세포의 배양 상등액으로부터의 IL-22 ELISA. (e) 플라겔린 자극 후 2시간째에 ob/ob 또는 마른 대조군으로부터의 혈청 IL-22의 ELISA. * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 46은 씨. 로덴튬 (C. rodentium) 감염에 대한 db/db (ob/ob) 마우스의 감수성이 결함있는 IL-22 생성과 연관이 있었고, 외인성 IL-22-Fc에 의해 구제되었다는 것을 입증하는 결과를 보여준다. (a) 씨. 로덴튬 감염 후 WT, db/dbob/ob 마우스 (n=5)로부터의 결장에서의 IL-22 mRNA 발현. 씨. 로덴튬으로 감염된 db/db 및 마른 대조군 마우스 (n=10)의 (b) 체중 및 (c) 생존율. (d-e) 상피 과형성, 소화관 내강 내로의 장세포 발산, 박테리아성 집락 (화살표) 및 점막하 부종 (수직 막대)을 보여주는, 10일째 마른 대조군 (d) 및 db/db (e) 마우스의 결장 조직학. 수평 막대, 200 ㎛. (f) 결장 조직학에 의해 결정된 임상 스코어 (n=5). (g-h) 10일째 간 (g) 및 비장 (h)에서 db/db 및 마른 대조군 마우스 (n=5)의 박테리아성 조직량. (i) 10일째 마른 대조군 및 db/db 마우스 (n=5)에서 항-씨. 로덴튬 IgG의 ELISA. (j) 감염 후 IL-22-Fc 또는 대조군 IgG로 처리된 마른 대조군 또는 db/db 마우스 (n=10)의 생존율. 도시된 데이터는 3가지 독립적인 실험의 대표 값이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 47은 당뇨병 장애가 IL-22-Fc 처리에 의해 저하되었다는 것을 입증해주는 결과를 나타낸다. (a-d) HFD-공급된 마우스를 IL-22-Fc로 매주 2회 처리하였다 (n=10). (a) 20일째 (먹이 공급됨) 및 21일째 (16시간 공복) 혈당. (b) 30일째 체중. (c) 21일째 글루코스 내성 시험. (d) 28일째 인슐린 내성 시험. 도시된 데이터는 2가지 독립적인 실험의 대표 값이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 48은 IL-22가 HFD가 공급된 마우스의 당뇨병 장애를 예방한다는 것을 입증해주는 결과를 보여준다. (a) 체중, (b) 혈당, (c) 23일째 글루코스 내성 시험, (d) 16시간 공복 후 23일째 혈당, 및 (e) 25일째 복부 지방체. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 49는 IL-22가 다중 기전을 통하여 대사 증후군을 조절한다는 것을 입증해 주는 결과를 보여준다. (a-c) db/db 마우스 (n=8)의 2개 군에게 음식물을 무제한으로 공급하였고, 대조군 IgG 또는 IL-22-Fc로 매주 2회 처리하였다. db /db 마우스 (n=8)의 1개 군에게, IL-22-Fc 처리된 군의 음식 섭취량과 부합된 제한된 음식물을 공급하고, 대조군 IgG로 처리하였다. 무제한으로 공급된 마우스의 첫 번째 8일의 누적 음식 섭취량은 (a)에 도시되고, 혈당은 (b)에 도시되며, 25일째 글루코스 내성 시험은 (c)에 도시된다. (d-e)는 0일째 및 2일째 IL-22-Fc 또는 대조군 IgG로 처리된 db/db (d) 및 HFD (e) 마우스에서의 PYY 수준을 보여준다. 두 번째 처리하기 전 2일째, 및 5일째에 혈청을 수집하였고, PYY에 관하여 분석하였다. (f)는 3주 동안 IL-22-Fc 또는 대조군 IgG로 처리된 db/db 마우스의 혈청 LPS를 보여준다. (g-i) IL-22R KO (n=9) 및 WT 마우스 (n=6)에게, 6주생부터 HFD를 공급하기 시작하였다. 체중 결과가 (g)에 도시되고, HFD를 공급한지 3개월째의 글루코스 내성 시험 결과가 (h)에 도시되며, HFD를 공급한지 4개월째의 인슐린 내성 시험 결과가 (i)에 도시된다. 도시된 데이터는 2가지 (a-c) 또는 3가지 (d-i) 독립적인 실험의 대표 값이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m.
도 50은 짝지워 먹인 제한된 음식 섭취량의 결과를 도시한 것이다. db /db 마우스의 3개 군에게 도 49a에서와 같이 공급하고 처리하였다. 누적 음식 섭취량을 측정하였다.
도 51은 IL-22가 간 기능을 개선시켰고 지방체를 감소시켰다는 것을 입증해 주는 결과를 보여준다. (a) 도 20A에서와 같이 IL-22 Fc 또는 대조군 IgG로 처리된 db/db 마우스. 간 효소를 1개월째에 측정하였다. (b-c) HFD-공급된 마우스를 도 47a에서와 같이 IL-22 Fc 또는 대조군 IgG로 처리하였다. 간 효소 (b) 및 복부 지방체 (c)를 1개월째에 측정하였다. **P<0.01, ***P<0.001, 오차 막대, s.e.m. (d-h) 10주 동안 마우스에게 HFD를 공급한 다음, 6주 동안 매주 2회 IL-22 Fc 또는 대조군으로 처리하였다. (d) 백색 지방 조직으로부터의 지질 대사 유전자 발현. (e) 혈청 트리글리세리드, 글리세롤 및 유리 지방산. (f) 간 트리글리세리드. (g) 간 콜레스테롤. (h) 백색 지방 조직 트리글리세리드. (i-j) 4주 동안 IL-22 Fc 또는 대조군 IgG로 처리된 db/db 마우스. (i) 간 트리글리세리드. (j) 백색 지방 조직 트리글리세리드. *P<0.05. 오차 막대, s.e.m.
도 52는 IL-22가 β 세포의 인슐린 분비를 증가시켰다는 것을 입증해 주는 결과를 보여준다. db /db 마우스를 도 20a에서와 같이 IL-22 Fc로 처리하였고, 30일째에 췌장을 수거하며, 인슐린 및 글루카곤을 알아보기 위하여 염색하였다. (a) 총 췌장 면적 내에서의 섬 면적의 비율 (%). (b) 총 섬 면적 내에서의 β 세포 면적의 비율 (%). (c) 총 섬 면적 내에서의 α 세포 면적의 비율 (%).
도 53: IL-22 KO 마우스는 HFD로 글루코스 불내성을 발생하지 못하였다. IL-22 KO 마우스에게, 6주생부터 HFD를 공급하기 시작하였다. HFD 후 3개월째에 글루코스 내성 시험을 수행하였다. 오차 막대, s.e.m.
도 54는 씨. 로덴튬 감염에 대한 ob/ob 마우스의 감수성을 입증해 주는 결과를 보여준다: 씨. 로덴튬으로 감염된 ob/ob 및 마른 마우스 (n=10)의 (a) 체중 및 (b) 생존율; (c-d) 상피 과형성, 소화관 내강 내로의 장세포 발산, 박테리아성 집락 (화살표) 및 점막하 부종 (수직 막대) (수평 막대, 200 ㎛)을 보여주는, 8일째 마른 대조군 (c) 및 ob/ob 마우스 (d)의 결장 조직학; (e) 결장 조직학에 의해 결정된 임상 스코어 (n=5); 및 (f-g) 8일째 간 (f) 및 비장 (g)에서 ob/ob 및 마른 대조군 마우스 (n=5)의 박테리아성 조직량. *P < 0.05, ** P<0.01, ***P<0.001. 오차 막대, s.e.m.
도 55는 처리 20일째 (a) 체중, (b) 혈청 글루코스 및 (c) 글루코스 내성 시험에 있어서 IL-22 Fc, IL-20 Fc 또는 IL-24 Fc로 처리된 db/db 마우스의 결과를 보여준다.
도 56a 및 b는 VEGF 또는 IL-22 Fc로 처리된 db/db 마우스에서 상처 치유 효능을 비교한 결과를 보여준다.
도 57a-e는 재구성된 표피에서 IL-22 Fc에 의한 시토카인 또는 케모카인 유도를 보여준다.
도 58은 에스. 아우레우스 (S. aureus) 감염을 수반하거나 수반하지 않은 야생형 마우스 및 db/db 마우스에서 부목을 댄 상처 모델을 이용하여 상처 봉합을 비교한 결과를 보여준다.
도 59a 및 b는 부목을 댄 감염된 상처 모델에서 VEGF와 IL-22 Fc 간의 상처 치유 효능을 비교한 결과를 보여준다.
도 60은 부목을 댄 감염된 상처 모델에서 상이한 농도 하의 VEGF와 IL-22 Fc 간의 상처 치유 효능을 비교한 결과를 보여준다.
도 61은 부목을 댄 감염된 상처 모델에서 상이한 농도 하의 VEGF, PDGF 및 IL-22 Fc 간의 상처 치유 효능을 비교한 결과를 보여준다.
도 62는 IL-22 Fc가 부목을 댄 상처 모델에서 용제뿐만 아니라 겔 제제에서 상처 치유를 촉진시켰다는 것을 보여준다.
본원에 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상 확실하게 본원에 참조로 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 IL-22 단백질 또는 IL-22 Fc 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IBD, 아테롬성 경화증, 아테롬성 경화성 플라크 형성을 특징으로 하는 심혈관계 질환 및 상태, 대사 증후군, 경증 및 급성 내독소증 및 패혈증, 급성 신장 손상, 급성 췌장염, 중간 증상의 급성 췌장염, 및 인슐린 관련 장애의 예방 및 치료에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 폴리펩티드를 사용하는 것에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 당뇨병성 족부 궤양을 예방 및 치료하고; 상처 치유 및 특히 당뇨병성 상처 치유를 촉진시키는 데 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 폴리펩티드를 사용하는 것에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 심혈관계 질환 자체를 치료하는 IL-22 폴리펩티드를 처음으로 밝혀낸 개시내용인 것으로 여겨진다. 본원의 데이터는 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질이 아테롬성 경화성 플라크의 성장을 저하시킬 수 있고, 아테롬성 경화성 플라크의 파열 빈도를 감소시킬 수 있으며 내독소증을 저하시킬 수 있다는 개념을 뒷받침해준다. 본 발명은 의사 또는 임상의에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 자신의 HDL/LDL 지질 프로파일을 변화시킬 필요가 있는, 대사 증후군, 경증 또는 급성 내독소증, 패혈증 및 인슐린 관련 장애, 예컨대 인슐린 저항성 (인슐린에 대한 반응성이 없음)으로 인해 고통받고 있는 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다. 본 출원은 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질이 대사 증후군으로 인해 고통받고 있는 대상체에서 고밀도 지단백질 (HDL)을 증가시킬 수 있고 저밀도 지단백질 (LDL)을 감소시킬 수 있다는 것을 표시하는 데이터를 보여준다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 상기 데이터는 또한, 내독소증 및 아테롬성 경화증 배후에 있는 구동제인 소화관-유래 LPS를 표시한다. mIL-22 Fc 융합 단백질로 처리된 마우스는 저하된 고지질혈증을 나타내었고, 복원된 혈관 기능을 수반한 개선된 글루코스 내성을 나타냈으며, 이들 변화로 인해 아테롬성 경화성 플라크가 감소되었다. IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 심혈관계 질환의 진행을 약화시킬 수 있다.
추가로, 당뇨병은 동물에서 탄수화물, 지방 및 단백질 대사에 영향을 미치는 만성 장애이다. 당뇨병은 성인에서 실명, 신부전증 및 하지 절단의 주요 원인이고, 심혈관계 질환과 뇌졸증에 대한 주요 위험 요인이다. 유형 I 진성 당뇨병 [또는 인슐린-의존성 진성 당뇨병 ("IDDM") 또는 유년 발병 당뇨병]은 모든 당뇨병 증례의 대략 10%를 차지한다. 상기 질환은 췌장의 베타 세포에 의한 인슐린 분비 기능의 진행성 손실을 특징으로 한다. 이러한 특징은 또한, 그의 기원이 췌장 질환에 있는 비-특발성 또는 "이차" 당뇨병에 의해 공유된다. 유형 I 진성 당뇨병은 다음 임상 징후 또는 증상, 예를 들어 지속적으로 상승된 혈장 글루코스 농도 또는 고혈당증; 다뇨; 조갈증 및/또는 과식증; 만성 미세혈관 합병증, 예컨대 망막증, 신병증 및 신경병증; 및 미세혈관 합병증, 예컨대 실명, 말기 신장 질환, 사지 절단 및 심근 경색으로 이어질 수 있는 고혈압 및 고지질혈증과 연관이 있다.
유형 II 진성 당뇨병 (비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM; 유형 II 당뇨병으로서 지칭되기도 함)은 글루코스 대사의 조절이상과 손상된 인슐린 감수성을 포함한 대사 장애 (또는 대사 증후군)이다. 유형 II 진성 당뇨병은 통상적으로, 성인에서 발병하고, 신체가 인슐린을 충분히 활용할 수 없거나 만들 수 없는 것과 연관이 있다. 표적 조직에서 관찰된 인슐린 저항성 이외에도, 유형 II 진성 당뇨병으로 인해 고통받고 있는 환자는 상대적인 인슐린 결핍을 지니고 있는데, 즉 환자는 소정의 혈장 글루코스 농도에 대해 예측된 인슐린 수준 보다 더 낮은 수준을 갖는다. 유형 II 진성 당뇨병은 다음 임상 징후 또는 증상, 예를 들어 지속적으로 상승된 혈장 글루코스 농도 또는 고혈당증; 다뇨; 조갈증 및/또는 과식증; 만성 미세혈관 합병증, 예컨대 망막증, 신병증 및 신경병증; 및 미세혈관 합병증, 예컨대 실명, 말기 신장 질환, 사지 절단 및 심근 경색으로 이어질 수 있는 고혈압 및 고지질혈증과 연관이 있다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 분야, 표기법 및 다른 과학 용어의 모든 용어는 본 발명이 속하는 분야에서의 통상의 기술자가 흔히 이해하고 있는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 흔히 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료하게 하고/하거나 즉시 참조하기 위하여 본원에서 정의되고, 이러한 본원에서의 정의를 포함하는 것이 반드시, 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실재적인 차이를 나타내는 것으로 추론되지 말아야 한다.
본 출원 내에서, 달리 언급되지 않는 한, 활용된 기술은 몇 가지 널리 공지된 참고 문헌, 예컨대 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), and Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 중 어느 것에서 찾을 수 있다.
적당히, 시판용 키트 및 시약의 사용을 포함하는 과정은 일반적으로, 달리 언급되지 않는 한은 제조업자가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라서 수행한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 용도를 기재하기 전에, 본 발명이 기재된 특별한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구조물 및 시약으로 제한되지 않고, 물론 그 자체로 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특별한 실시양태를 단지 기재할 목적이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "단리된 펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 단리된 펩티드를 의미한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하는", 또는 "포함"과 같은 변동은 언급된 정수 또는 정수 군의 포함을 암시하지만, 다른 정수 또는 정수 군의 배제를 암시하지 않는다는 것을 이해해야 할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IL-22 Fc 융합 단백질" 또는 "IL-22 융합 단백질" 또는 "IL-22 Ig 융합 단백질"은 IL-22 단백질 또는 폴리펩티드가 IgG Fc 영역과 직접 또는 간접적으로 연결되는 융합 단백질을 지칭한다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 인간 IgG Fc 영역과 연결된 인간 IL-22 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IL-22 단백질은 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, IL-22 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 IL-22 또는 Fc의 삽입, 결실, 치환, 특히 보존적 아미노산 치환과 같은 사소한 서열 변이가 또한, 본 발명에 의해 고려되는 것으로 이해된다. 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체와 결합할 수 있는데, 이로써 IL-22 수용체 하류 신호 전달이 초래될 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체와 결합할 수 있고/있거나 IL-22 수용체 하류 신호 전달을 초래할 수 있다. IL-22 Fc 융합 단백질의 기능 및/또는 활성은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 검정할 수 있는데, 이러한 방법은 ELISA, 리간드-수용체 결합 검정 및 Stat3 루시퍼라제 검정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 IL-22 수용체와 결합하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하는데, 이러한 결합으로 IL-22 수용체 하류 신호 전달이 초래될 수 있고, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정의 특별한 실시양태에서, IL-22 융합 단백질의 Fc 영역은 효과기 활성을 보유하고 있지 않거나 (예를 들어, FcγIIIR과 결합하지 않는다) 또는 전체 (예를 들어, 야생형) IgG 항체 보다 실질적으로 더 낮은 효과기 활성을 나타낸다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 세포독성, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 촉발시키지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, "IL-22 융합 단백질", "IL-22 Fc 융합", "IL-22 Ig 융합 단백질", "IL-22 Fc 융합 단백질" 또는 "IL-22 Fc"는 본 출원 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IL-22" 또는 "IL-22 폴리펩티드" 또는 "IL-22 단백질"은 달리 표시되지 않는 한, 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한 모든 포유류 공급원으로부터의 모든 천연 IL-22를 광범위하게 지칭한다. 상기 용어는 "완전한 길이"의 프로세싱되지 않은 IL-22 뿐만 아니라 세포 내에서의 프로세싱으로부터 비롯되는 IL-22의 모든 형태를 포괄한다. 예를 들어, N-말단 리더 서열을 함유하는 완전한 길이의 IL-22와 성숙한 형태 IL-22 둘 다가 본 발명에 의해 포괄된다. 리더 서열 (또는 신호 펩티드)은 내인성 IL-22 리더 서열이거나 또는 또 다른 포유류 분비 단백질의 외인성 리더 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 리더 서열은 진핵 또는 원핵 분비 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 용어는 또한, IL-22의 자연 발생적 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립 유전자성 변이체를 포괄한다. 예시되는 인간 IL-22의 아미노산 서열은 서열 4 (신호 펩티드를 수반하지 않은 성숙한 형태)에 제시된다. 특정 실시양태에서, 내인성 리더 서열을 수반한 완전한 길이의 IL-22 단백질의 아미노산 서열이 서열 71에 제공되는 반면; 다른 실시양태에서, 외인성 리더 서열을 수반한 성숙한 IL-22 단백질의 아미노산 서열은 서열 2에 제공된다. IL-22의 기능 및/또는 활성 (예를 들어, IL-22 수용체에 대한 결합성)에 영향을 미치지 않는 사소한 서열 변이, 특히 보존적 아미노산 치환이 또한, 본 발명에 의해 고려된다. 도 1은 몇 가지 예시되는 포유류 종으로부터의 성숙한 IL-22의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 별표는 IL-22의 기능 및/또는 활성에 중요한 것으로 예상되는, 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 아미노산 잔기를 표시한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 4와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 단백질은 서열 71과 95% 이상의 서열 동일성, 서열 71과 96% 이상의 서열 동일성, 서열 71과 97% 이상의 서열 동일성; 서열 71과 98% 이상의 서열 동일성; 서열 71과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드는 각종 공급원으로부터, 예컨대 인간 조직 또는 또 다른 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "IL-22 수용체" 또는 "IL-22R"은 IL-22R1 및 IL-10R2로 이루어진 이종-이량체, 또는 그의 자연 발생적 대립유전자성 변이체를 지칭한다 (문헌 [Ouyang et al., 2011, Annu. Rev. Immunol. 29:159-63] 참조). IL-10R2는 많은 세포 유형에 의해 편재해서 발현되고, IL-22R1은 선천 세포, 예컨대 상피 세포, 간세포 및 각질세포에서만 발현된다. IL-22R1은 IL-22Ra1 또는 IL-22Rα1로서 공지되기도 한다. IL-22R1은 다른 폴리펩티드와 쌍을 이루어 다른 IL-10 계열 구성원, 예를 들어 IL-20 또는 IL-24에 대한 이종-이량체성 수용체를 형성할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ouyang et al., 2011] 참조).
"천연 서열 IL-22 폴리펩티드" 또는 "천연 서열 IL-22R 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 상기 용어는 구체적으로, 특이적 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드의 자연 발생적 절단된 또는 분비된 형태 (예를 들어, 신호 펩티드가 그와 연합되지 않은 IL-22), 자연 발생적 변이체 형태 (예를 들어, 대체 스플라이싱된 형태), 및 상기 폴리펩티드의 자연 발생적 대립 유전자성 변이체를 포괄한다. 본 발명의 각종 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드는 성숙하거나 완전한 길이의 천연 서열 폴리펩티드이다. 예시되는 완전한 길이의 천연 인간 IL-22는 도 30 (DNA, 서열 70) 및 도 31 (단백질, 서열 71)에 제시되어 있다. 출발 코돈 및 정지 코돈은 도 30에서 볼드체로 제시되고 밑줄이 그어져 있다. 수반되는 도면에 개시된 IL-22 및 IL-22R 폴리펩티드 서열이 아미노산 위치 1로서 본원에 지명된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 제시되긴 하지만, 본 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드에 대한 출발 아미노산 잔기로서 이용될 수 있는 것으로 생각할 수 있고 또한 가능하다.
"IL-22 변이체", "IL-22R 변이체", "IL-22 변이체 폴리펩티드" 또는 "IL-22R 변이체 폴리펩티드"는 완전한 길이의 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 상기 정의된 바와 같은 활성 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 변이체는 완전한 길이 또는 성숙한 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 81% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 82% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 83% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 84% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 86% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 87% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 88% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 89% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 91% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 92% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 93% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 94% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 96% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 97% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또 다른 한편으론 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성, 및 또 다른 한편으론 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 비-항원 결합성 영역을 지칭한다. 상기 용어는 천연 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터 카르복시-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 Fc 영역의 구조 또는 안정성에 영향을 미치지 않으면서, 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, IgG 또는 Fc 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이, 항체에 대한 EU 넘버링 시스템 (EU 지수로 불리우기도 함)에 따른다.
특정 실시양태에서, Fc 영역은 힌지 영역 (Cys226에서 출발함), IgG CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 IgG 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역" 또는 "힌지 서열"은 링커와 CH2 도메인 사이에 위치한 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 CPPCP (서열 31)를 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질에 대한 힌지 영역은 이량체화를 촉진시키기 위해, 천연 IgG1 힌지 영역에서 발견된 서열인 CPPCP 서열 (서열 31)을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, Fc 영역은 힌지 영역에서 출발하여 IgG 중쇄의 C-말단까지 연장된다. 특정의 특별한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정의 다른 특별한 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 실시예 섹션에 기재되는 바와 같이, 예상치 못하게도, IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질이 IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질 보다 훨씬 탁월한 약동학적 특성을 나타냈다는 사실이 본 출원인에 의해 밝혀졌다.
특정 실시양태에서, IgG CH2 도메인은 Ala 231에서 출발한다. 특정의 다른 실시양태에서, CH3 도메인은 Gly 341에서 출발한다. 인간 IgG의 C-말단 Lys 잔기는 임의로 부재할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, Fc의 목적하는 구조 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는 Fc 영역의 보존적 아미노산 치환이 본 발명의 범위 내에 고려되는 것으로 이해된다.
특정 실시양태에서, IL-22은 링커를 통하여 Fc 영역에 연결된다. 특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 IL-22의 C-말단을 본원에 기재된 바와 같은 Fc 영역에 연결시켜주는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 천연 IgG 서열이 링커 및/또는 힌지 영역에 존재하여, 면역원성의 위험을 최소화하고/하거나 회피시켜 준다. 다른 실시양태에서, 사소한 서열 변이를 천연 서열 내로 도입하여 제조를 촉진시킬 수 있다. 고 활성을 나타내는 (예를 들어, 루시퍼라제 검정에 의해 측정된 바와 같음) 외인성 링커 또는 힌지 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 구조물이 또한, 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 8개 내지 20개 아미노산, 8개 내지 16개, 8개 내지 15개, 8개 내지 14개, 8개 내지 13개, 8개 내지 12개, 8개 내지 11개, 8개 내지 10개, 8개 내지 9개, 10개 내지 11개, 10개 내지 12개, 10개 내지 13개, 10개 내지 14개, 10개 내지 15개, 10개 내지 16개, 11개 내지 16개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개 아미노산 길이인 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 DKTHT (서열 32)를 포함한다.
특정의 특별한 실시양태에서, 링커는 서열 Gly-Gly-Ser (서열 45), Gly-Gly-Gly-Ser (서열 46) 또는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 47)을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "연결된" 또는 "융합된"은 두 부분 사이에 형성된 공유 결합, 예를 들어 펩티드 결합을 지칭한다.
용어 "아푸코실화", "아푸코실화된", "탈푸코실화" 또는 "탈푸코실화된"은 Fc의 CH2 도메인에 부착된 N-글리칸으로부터 코어-푸코스를 제거하거나 이것이 부재하는 것을 지칭한다.
예상치 못하게도, IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질이 다른 Fc 융합 단백질 또는 Fc를 포함하는 항체와 달리, Fc 영역에 부착된 N-글리칸에서 고 수준 (예를 들어, 30%)의 아푸코실화를 나타냈다는 사실이 본 출원인에 의해 밝혀졌다. Fc의 CH2 도메인에 부착된 N-글리칸은 이종이다. CHO 세포에서 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질은 푸코실트랜스퍼라제 활성에 의해 푸코실화된다 (문헌 [Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 2006, 140:777-83] 참조). 정상적으로, 적은 비율의 자연 발생적 아푸코실화된 IgG가 인간 혈청에서 검출될 수 있다. Fc의 N-글리코실화는 FcγR과의 결합에 중요하고; N-글리칸의 아푸코실화는 FcγRIIIa에 대한 Fc의 결합 능력을 증가시킨다. 증가된 FcγRIIIa 결합성은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증강시킬 수 있는데, 이는 세포독성이 바람직한 특정의 항체 치료 적용에 있어서 유리할 수 있다 (상기 문헌 [Shoji-Hosaka et al.] 참조). 그러나, 이와 같이 증강된 효과기 기능은 Fc-매개된 세포독성이 바람직하지 않는 경우, 예컨대 IL-22 Fc 융합의 경우에 유해할 수 있다.
IgG4 Fc는 IgG1 Fc 보다 적은 효과기 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 출원인은 예상치 못하게도, IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질이 또한, Fc 영역에서 고 수준의 아푸코실화를 나타냈다는 사실을 밝혀내었다. IgG4의 Fc에 부착된 고 수준의 아푸코실화된 N-글리칸은 바람직하지 못한 효과기 활성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 Fc 영역 또는 CH2 도메인이 글리코실화되지 않은 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인 내의 N-글리코실화 부위는 글리코실화되지 못하도록 돌연변이된다.
특정의 다른 실시양태에서, Fc 영역의 CH2 도메인 내에서의 글리코실화는 글리코실화 컨센서스 부위, 즉 위치 297에서의 Asn을 변경시킨 다음, 어느 아미노산 잔기 (인간 IgG의 경우에는, Ser) 및 Thr을 변경시킴으로써 제거할 수 있다 (도 3 참조). 이러한 글리코실화 부위는 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 Asn과 Ser의 사이 또는 Ser과 Thr 사이에 삽입하여 본래의 글리코실화 부위를 변경시킬 수 있는데, 이러한 삽입은 N-글리코실화 부위를 재생시키지 못한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 인간 IgG Fc의 CH2 도메인 내의 N297 잔기 (예를 들어, Fc 내의 N-글리코실화된 부위, 도 3 참조)는 글리코실화 부위를 폐지하도록 돌연변이된다. 특정의 특별한 실시양태에서, N297 잔기는 Gly, Ala, Gln, Asp 또는 Glu로 변화된다. 일부 특별한 실시양태에서, N297 잔기는 Gly 또는 Ala로 변화된다. 다른 특별한 실시양태에서, N297 잔기는 Gly로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, T299 잔기는 또 다른 아미노산, 예를 들어 Ala, Val 또는 Gly로 치환될 수 있다. 특정의 특별한 실시양태에서, 아글리코실화된 Fc를 생성시키는 돌연변이는 IL-22 Fc 융합 단백질의 구조 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는다.
관련 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 방법을 필요로 하는 환자에게, IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물 (여기서, Fc 영역은 글리코실화되지 않는다)을 투여하는 것을 포함하는, IBD (UC 및 CD 포함)를 치료하는 방법, 장에서의 박테리아성 감염을 억제하는 방법, 및 장에서의 상피 완전성, 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 개선시키는 방법, 및 대사 장애 또는 대사 증후군, 유형 II 당뇨병, 아테롬성 경화증을 치료하고 당뇨병성 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 Fc 영역 내에 저 수준의 아푸코실화를 나타내거나 아푸코실화를 전혀 나타내지 않는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 Fc 영역 내의 전반적인 아푸코실화 수준이 10% 이하, 바람직하게 5% 이하, 보다 바람직하게 2% 이하, 가장 바람직하게 1% 미만인 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 방법을 필요로 하는 환자에게, Fc 영역 내의 아푸코실화 수준이 10% 이하, 바람직하게 5% 이하, 보다 바람직하게 2% 이하, 가장 바람직하게 1% 미만인 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, IBD (UC 및 CD 포함)를 치료하는 방법, 장에서의 박테리아성 감염을 억제하는 방법, 및 장에서의 상피 완전성, 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 개선시키는 방법, 및 대사 장애, 유형 II 당뇨병, 병적 비만을 수반한 유형 II 당뇨병, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 아테롬성 경화증, 심혈관계 질환, 대사 증후군, 내독소증 (급성 및 경증), 패혈증, 급성 관상 동맥 심장 질환, 고혈압, 이상지질혈증, 비만, 고혈당증, 지질 대사 장애, 간염, 급성 간염, 신부전증, 급성 신부전증, 급성 신장 손상, 신장 이식 실패, 췌장염, 급성 췌장염, 간 섬유증 및 폐 섬유증, 상처, 감염된 상처를 치료하고 상처 치유 (당뇨병성 상처 치유 포함)를 촉진하는 방법을 제공한다.
용어 "% 아푸코실화"는 IL-22 Fc 융합 단백질의 조성물 중의 Fc 영역 내에서의 아푸코실화 수준을 지칭한다. % 아푸코실화는 질량 분광측정법 (MS)에 의해 측정되고 IL-22 Fc 융합 단백질의 전체 집단에 걸쳐 아푸코실화된 글리칸 종 [1개의 Fc 도메인 상 (마이너스 1) 및 합한 양 Fc 도메인 (마이너스 2) 상에 푸코스를 수반하지 않는 종]의 비율 (%)로서 제시될 수 있다. 예를 들어, % 아푸코실화는 MS에 의해 분석된, 예컨대 도 2 및 다음에 제시된 실시예에 기재된 바와 같은 애질런트(Agilent) 6520B TOF 질량 분석기에 의해 결정된 모든 글리칸 종의 총 면역에 걸쳐 마이너스 1 푸코스 피크 및 마이너스 2 푸코스 피크 하에 합한 면적의 비율 (%)로서 계산될 수 있다. 아푸코실화의 수준은 HPLC-칩 큐브 MS (애질런트) 및 역상-HPLC를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 다른 적합한 방법에 의해 측정할 수 있다. IL-22 Fc 조성물의 % 아푸코실화는 이러한 조성물이 의도한 목적에 적합하지 않는, 허용되지 않는 수준의 ADCC를 촉발시킬 것으로 예상되는 지를 결정하기 위한 지표로서 사용될 수 있다. 따라서, 특정의 특별한 실시양태에서, 조성물은 10% 이하, 바람직하게 5% 이하, 보다 바람직하게 3% 이하, 가장 바람직하게 1% 이하의 아푸코실화 수준을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 아푸코실화 수준을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다.
특정 실시양태에서, IL-22 Fc 조성물의 목적하는 아푸코실화 수준은 정제를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 조성물 내의 푸코실화된 종은 푸코스, 특히 1-6 연쇄에 존재하는 푸코스에 대해 특이적인 렉틴 또는 항체와 같은 푸코스 결합성 부분과 접합된 수지를 갖는 친화성 크로마토그래피에 의해 강화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kobayashi et al., 2012, J. Biol. Chem. 287:33973-82] 참조). 특정의 다른 실시양태에서, 푸코실화된 종은 친화 칼럼 내의 항-푸코스 특이적 항체를 이용하여 아푸코실화된 종으로부터 강화 및 분리시킬 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 아푸코실화된 종은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 FcγRIIIa에 대한 차별적 결합 친화도에 근거하여 푸코실화된 종으로부터 분리시킬 수 있다.
특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은, CH2 도메인 내의 N297 잔기를 돌연변이시킨 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, N297 잔기는 Gly 또는 Ala, 바람직하게 Gly로 변화된다. 특정의 다른 실시양태에서, N297 잔기는 결실된다. 특정 실시양태에서, N297에 아미노산 치환을 갖는 Fc를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질은 아글리코실화되거나 글리코실화되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아글리코실화된"은 글리코실화되지 않은 관심 단백질 또는 관심 단백질의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 아글리코실화된 Fc 영역을 수반하는 IL-22 Fc 융합 단백질은 Fc 영역의 CH2 도메인 내의 N297 잔기를 돌연변이 유발시킴으로써 제조할 수 있다.
다른 실시양태에서, 야생형 N297 잔기에 부착된 N-글리칸은 효소적으로, 예를 들어 탈글리코실화에 의해 제거할 수 있다. 적합한 당분해 효소는 펩티드-N-글리코시다제 (PNGase)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질"은 각 단량체가 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 이량체를 지칭한다. 용어 "단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질"은 하나의 단량체가 IL-22 Fc 융합 단백질 (IL-22 Fc 아암)을 포함하는 반면, 다른 단량체는 IL-22 폴리펩티드를 수반하지 않는 Fc 영역 (Fc 아암)을 포함하는 이량체를 지칭한다. 따라서, 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22R 결합성에 대하여 2가인 반면, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22R 결합성에 대하여 1가이다. 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 이종-이량체화는 놉에서 홀로의 전환 기술에 의한 이종-이량체화를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 촉진될 수 있다. 놉에서 홀로의 전환 기술의 구조 및 어셈블리 방법은, 예를 들어 US 5,821,333, US 7,642,228, US 2011/0287009 및 PCT/US2012/059810 (그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 찾을 수 있다. 상기 기술은 하나의 Fc의 CH3 도메인 내의 작은 아미노산 잔기를 큰 아미노산 잔기로 대체함으로써 "놉" (또는 돌기)을 도입하고; 하나 이상의 큰 아미노산 잔기를 보다 작은 아미노산 잔기로 대체함으로써 다른 Fc의 CH3 도메인 내에 "홀" (또는 공동)을 도입함으로써 개발되었다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 아암은 놉을 포함하고, Fc 단독 암은 홀을 포함한다.
놉의 형성에 바람직한 잔기는 일반적으로, 자연 발생적 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 트립토판 및 티로신이다. 한 실시양태에서, 놉의 형성을 위한 본래의 잔기는 작은 측쇄 용적을 갖는데, 예컨대 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린이다. 놉을 형성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시되는 아미노산 치환은 T366W, T366Y 또는 F405W 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
홀의 형성에 바람직한 잔기는 통상적으로, 자연 발생적 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 홀의 형성을 위한 본래의 잔기는 큰 측쇄 용적을 갖는데, 예컨대 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판이다. 홀을 생성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시되는 아미노산 치환은 T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T 및 Y407V 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 놉은 T366W 치환을 포함하고, 홀은 T366S/L368A/Y407V 치환을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 단량체성 IL-22 IgG1 Fc 융합은 IL-22 Fc 놉 암과 Fc 홀 암을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 놉 암은 T366W 치환을 포함하고 (서열 61), Fc 홀 암은 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다 (서열 62). 특정의 다른 실시양태에서, 양 암의 Fc 영역은 N297G 또는 N297A 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 이. 콜라이 세포에서 발현된다. 이종-이량체화를 촉진시켜 주는, 당해 분야에 공지된 Fc 영역에 대한 다른 변형이 또한 고려되고 본 출원에 의해 포괄되는 것으로 이해된다.
용어 "상처"는 손상, 특히 피부 또는 또 다른 외부 표면이 찢어지거나, 구멍이 나거나, 절단되거나 또는 달리 깨지는 것을 지칭한다.
용어 "궤양"은 종종 고름이 형성되고 조직이 사멸되는 것을 특징으로 하는 피부 또는 점막에 대한 손상 부위이고, 자주 염증 반응을 수반한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "장" 또는 "소화관"은 광범위하게, 소장과 대장을 포괄한다.
용어 "상처 치유를 촉진하는" 또는 "상처 치유의 촉진"은 치유 속도를 증가시키는 것을 지칭하는데, 예를 들어 완전한 상처 봉합이 이루어질 때까지의 시간을 단축하거나 또는 상처 부위의 % 감소가 이루어질 때까지의 시간을 단축하는 것을 지칭한다.
"당뇨병성 상처"는 당뇨병과 연관되는 상처이다.
"당뇨병성 궤양"은 당뇨병과 연관되는 궤양이다.
"만성 상처"는 치유되지 않은 상처를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol . 130:489-93 (1994)] 참조). 만성 상처는, 예를 들어 동맥 궤양, 당뇨병성 궤양, 욕창, 정맥 궤양 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 급성 상처는 만성 상처로 발전할 수 있다. 급성 상처는, 예를 들어 열 손상 (예를 들어, 화상), 외상, 수술, 광범위한 피부암의 절제, 깊은 진균성 및 박테리아성 감염, 혈관염, 피부 경화증, 천포창, 독성 표피 괴사 등에 의해 유발된 상처를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 2001년 10월 24일자로 공개된 Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell .com 참조). 따라서, 특정 실시양태에서, 만성 상처는 감염된 상처이다. "정상 상처"는 정상적인 상처 치유 복구를 진행하는 상처를 지칭한다.
본원에서의 목적을 위한 "수용자 인간 골격"은 다음에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 "유래된" 수용자 인간 골격은 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이는 아미노산 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열 면에서 동일하다.
"친화도"는 특정 분자 (예를 들어, 리간드 또는 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 수용체 또는 항원) 간의 비-공유적 상호 작용의 총 합의 세기를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은, "결합 친화도"는 결합 쌍 구성원들 (예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질과 IL-22 수용체) 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로, 해리 상수 (Kd)로써 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함한, 당해 분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적이고도 예시적인 실시양태가 다음에 기재되어 있다.
본원에서의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고 각종 항체 구조를 포괄하는데, 이는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체), 및 항체 단편 (이는 목적하는 항원-결합 활성을 나타내야 한다)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"항체 단편"은 온전한 항체와 결합하는 항원과 결합하는, 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아보디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프와 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체가 그의 항원과 결합하는 것을 50% 이상 차단시키는 항체를 지칭하고, 역으로 참조 항체는 경쟁 검정에서 상기 항체가 그의 항원과 결합하는 것을 50% 이상 차단시킨다. 예시되는 경쟁 검정은 본원에 제공되어 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특별한 공급원 또는 종으로부터 유래되지만, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있고, 이들 중의 몇 가지는 아부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포성 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 [예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제]; 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산 분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아성, 진균성, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 다음에 개시된 각종 항종양 또는 항암제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"효과기 기능" 또는 "효과기 활성"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는데, 이는 항체 이소형에 따라서 다양하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합성 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 어떠한 효과기 기능이나 어떠한 검출 가능한 효과기 기능도 나타내지 않는다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 실질적으로 감소된 효과기 기능, 예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다.
예를 들어, 심혈관계 질환 또는 상태의 경우, IL-22 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 효능제의 치료 유효량은 아테롬성 경화성 플라크 형성의 정도를 감소시킬 수 있고/있거나; 아테롬성 경화성 플라크(들)의 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; 아테롬성 경화성 플라크를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지)할 수 있고/있거나; 혈전증, 또는 아테롬성 경화성 플라크의 파열을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지)할 수 있고/있거나; 상기 질환 또는 상태와 연관된 증상들 중 한 가지 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다.
"감소 또는 억제한다"는 것은 바람직하게 20% 이상, 보다 바람직하게 50% 이상, 가장 바람직하게 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전반적인 감소를 유발시킬 수 있는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제한다는 것은 치료하고자 하는 장애의 증상, 아테롬성 경화성 플라크의 존재 또는 크기, 또는 아테롬성 경화성 플라크(들)의 수를 지칭할 수 있다.
"최적 이하 양"은 특정의 치료를 위해 전형적으로 사용된 치료제의 최적 양 보다 적은 양을 지칭한다. 2가지 치료제가 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 제공되는 경우, 각 치료제를 단독으로 제공하는 경우의 치료와 비교해서 이러한 각 치료제를 최적 이하 양으로 제공할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, IBD 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물과, 최적 이하 양의 덱사메타손을 투여한다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로, 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로, VH (또는 VL) 내에서 다음 순서로 보여진다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "완전한 길이의 항체", "온전한 항체" 및 "완전 항체"는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수에 상관없이 그로부터 유래된 자손을 포함하는, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 형질전환된 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 형질전환된 세포를 포함한다. 자손은 핵산 성분 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 또는 이에 대해 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 외인성 핵산으로 일시적으로 형질감염된다. 특정의 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 외인성 핵산으로 안정적으로 형질감염된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 활용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고 있는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의에는 구체적으로, 비-인간 항원 결합성 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다.
"인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아군으로부터이다. 일반적으로, 이러한 서열의 아군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 아군이다. 한 실시양태에서, VL에 대한 아군은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH에 대한 아군은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 아군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기와 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것인데, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화 항체는 임의로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. "인간화 형태"의 항체, 예를 들어 비-인간 항체는 인간화가 진행된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변적이고/이거나 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 구조상 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉성 잔기 ("항원 접촉물")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함하는데, VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 본원에 예시되는 HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 초가변 루프 [Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)];
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)];
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉물 [MacCallum et al. J. Mol . Biol. 262: 732-745 (1996)]; 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함한, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
달리 표시되지 않는 한, 가변 도메인 내의 HVR 잔기 및 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에 따라서 본원에서 넘버링된다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들) (세포독성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)와 접합된 항체 또는 항체의 단편이다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 포유류이다. 포유류는 가축 (예를 들어, 암소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체, 대상체 또는 환자는 인간이다.
"단리된" IL-22 융합 단백질은 이러한 융합 단백질을 재조합적으로 생성하는 숙주 세포의 환경으로부터 분리시킨 것이다. 일부 실시양태에서, IL-22 융합 단백질은, 예를 들어 전기영동 [예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동법 (IEF), 모세관 전기영동] 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이, 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 구성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 이러한 핵산 분자는 염색체외적으로 존재하거나 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산"은 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하는데, 이는 단일 벡터 또는 별개의 벡터 내의 상기 핵산 분자(들)를 포함하고, 상기 핵산 분자(들)는 일시적으로 또는 안정적으로 숙주 세포 내로 형질감염되며, 상기 핵산 분자(들)는 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재한다.
용어 "제어 서열"은 특별한 숙주 유기체 내에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 전구 서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 특정 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구 단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 증강인자는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더의 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 결찰시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 예를 들어 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생되는 가능한 변이체 항체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프와 결합되는 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 어떠한 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉(transgenic) 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 각종 기술에 의해 제조될 수 있다 (모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법, 및 기타 예시되는 방법은 본원에 기재되어 있다).
"있는 그대로의 항체"는 이종 부분 (예를 들어, 세포독성 부분) 또는 방사성 표지와 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 있는 그대로의 항체가 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 지닌 자연 발생적 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 영역 (VH) (가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 불리우기도 함) 다음에 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서부터 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 영역 (VL) (가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리우기도 함) 다음에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 2가지 유형 [카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭됨] 중 하나로 지정될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 그의 자연 발생적 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형, 바람직하게 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 보유하고 있고, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 보유하고 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다.
용어 "염증성 장 장애", "염증성 장 질환" 또는 IBD는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 그의 발병 기전이 소장 및 결장을 포함한 장에서의 재발성 염증과 관련이 있는 모든 질환 및 병리학적 상태를 포함한다. 흔히 관찰되는 IBD는 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. IBD는 UC 및 CD로 제한되지 않는다. 이러한 질환의 징후는 염증, 및 장에서의 상피 완전성의 감소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "심혈관계 질환" 또는 "심혈관계 장애"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 그의 발병 기전이 혈관 이상과 관련이 있는 모든 질환과 병리학적 상태, 예컨대 예를 들어, 아테롬성 경화성 플라크 형성 (안정한 또는 불안정한/취약한 플라크 포함), 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 동맥 경화증, 및 상승된 전신 리포폴리사카라이드 (LPS) 노출을 포함한다. 상기 용어는 부가적으로, 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 억제하는 것으로부터 이득을 얻는 질환 및 병리학적 상태를 포함한다. 심혈관계 질환은 관상 동맥 아테롬성 경화증, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 허혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 급성 관상 증후군 (ACS), 관상 심장 질환 (CHD), CAD 및 CHD와 연관된 상태, 뇌혈관계 질환, 말초 혈관 질환, 동맥류, 혈관염, 정맥 혈전증, 진성 당뇨병, 및 대사 증후군, 만성 신장 질환, 허혈과 재관류 및 심폐 바이패스(bypass) 후 원격 조직 손상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 군 내에 구체적으로 포함되는 것은, 그의 발생, 발병 또는 진행이 아테롬성 경화성 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는 것과 연관된 모든 심혈관계 질환이다.
용어 "심혈관계 상태"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 그의 병리학이 아테롬성 경화성 플라크 형성 (안정한 또는 불안정한/취약한 플라크 포함), 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 동맥 경화증, 및 상승된 전신 리포폴리사카라이드 (LPS) 노출과 관련이 있는 모든 심혈관계 상태 및 질환을 포함한다. 이러한 군 내에 구체적으로 포함되는 것은, 그의 발생, 발병 또는 진행이 아테롬성 경화성 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는, 아테롬성 경화성 플라크 형성과 연관된 모든 심혈관계 상태 및 질환이다. 상기 용어는 구체적으로, 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 억제하는 것으로부터 이득을 얻는 질환 및 병리학적 상태를 포함한다. 심혈관계 상태는 관상 동맥 아테롬성 경화증, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 허혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 관상 심장 질환 (CHD), CAD 및 CHD와 연관된 상태, 뇌혈관계 질환 및 뇌혈관계 질환과 연관된 상태, 말초 혈관 질환 및 말초 혈관 질환과 연관된 상태, 동맥류, 혈관염, 정맥 혈전증, 진성 당뇨병, 및 대사 증후군, 만성 신장 질환, 허혈과 재관류 및 심폐 바이패스 후 원격 조직 손상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 "뇌혈관계 질환과 연관된 상태"는, 예를 들어 일시적 허혈 발작 (TIA) 및 뇌졸증을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "말초 혈관 질환과 연관된 상태"는, 예를 들어 파행증(claudication)을 포함한다. 이러한 군 내에 구체적으로 포함되는 것은, 그의 발생, 발병 또는 진행이 아테롬성 경화성 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는 것과 연관된 모든 심혈관계 질환 및 상태이다.
아테롬성 경화성 플라크 형성은 위장관 미생물무리로부터 유래되는 전신 리포폴리사카라이드 (LPS)의 상승된 수준을 특징으로 하는 대사 내독소증에 대한 선천 면역 반응과, 위장관 점막 장벽에서의 기능적 완전성의 상실에 따른 결과로서 발생할 수 있다. 내독소증에 대한 선천 면역 반응으로 인해, 플라크 형성에 대해 책임이 있는 저 등급의 만성 염증이 생긴다.
용어 "대사 증후군"은 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용된다. 대사 증후군은 다음 5가지 성향 중 적어도 3가지를 포함한, 몇 가지 대사 위험 요인의 성인 대상체에게 동시에 존재하는 것을 포함한다: 예를 들어, 남성의 경우에는 허리 둘레가 90 cm 이상일 수 있고, 여성의 경우에는 80 cm 이상일 수 있는 복부 비만; 예를 들어, 150 mg/dL 이상일 수 있는 상승된 혈청 트리글리세리드, 또는 상승된 트리글리세리드에 대한 약물 치료; 예를 들어, 남성의 경우에는 40 mg/dL 이하일 수 있고, 여성의 경우에는 50 mg/dL일 수 있는 감소된 혈청 HDL 콜레스테롤 수준, 또는 저 HDL 콜레스테롤에 대한 약물 치료; 예를 들어, 수축기 혈압이 130 mmHg 초과이고 확장기 혈압이 85 mmHg 초과일 수 있는 고혈압, 또는 고혈압에 대한 약물 치료; 및 예를 들어, 100 mg/dL 이상일 수 있는 상승된 공복 혈장 글루코스, 상승된 글루코스에 대한 약물 치료, 또는 기존에 진단된 유형 2 당뇨병 (또한, 문헌 [Meigs, the Metabolic Syndrome (Insulin Resistance Syndrome or Syndrome X), http://www.uptodate.com/contents/the-metabolic-syndrome-insulin-resistance-syndrome-or-syndrome-x] 참조; 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다).
16세 이상 어린이의 경우에는, 성인에 대한 상기 기준을 사용할 수 있다. 10세 내지 16세 어린이의 경우, 대사 증후군은 다음 5가지 성향 중 적어도 3가지를 포함한, 몇 가지 대사 위험 요인이 대상체에게 동시에 존재하는 것을 포함한다: 예를 들어, 허리 둘레가 90번째 백분위수 (percentile)일 수 있는 복부 비만; 예를 들어, 110 mg/dL 이상, 95번째 백분위수 초과일 수 있는 상승된 혈청 트리글리세리드, 또는 상승된 트리글리세리드에 대한 약물 치료; 예를 들어, 40 mg/dL 이하, 5번째 백분위수 미만일 수 있는 감소된 혈청 HDL 콜레스테롤 수준, 또는 저 HDL 콜레스테롤에 대한 약물 치료; 예를 들어, 수축기 혈압이 130 mmHg 초과이고 확장기 혈압이 85 mmHg 초과이며, 90번째 백분위수 초과일 수 있는 고혈압, 또는 고혈압에 대한 약물 치료; 및 예를 들어, 100 mg/dL 이상일 수 있는 상승된 공복 혈장 글루코스, 장애 글루코스 내성, 상승된 글루코스에 대한 약물 치료, 또는 기존에 진단된 유형 2 당뇨병.
일반적으로 언급하면, 대사 증후군에 동시에 존재하는 위험 요인은 비만 (예컨대, 복부 비만), 고혈당증, 이상지질혈증, 인슐린 저항성 및/또는 고혈압을 포함한다. 이들 모든 위험 요인은 아테롬성 경화성 심혈관계 질환, 당뇨병, 또는 둘 다의 발병을 증진시킨다. 대사 증후군은 또한, 만성 지방 조직 염증의 특색일 수 있다.
대사 증후군은 염증 유발성, 혈전증 유발성 상태로서 인식될 수 있고, C-반응성 단백질, IL-6, LPS, 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 중 하나 이상의 상승된 수준과 연관될 수 있는데; 이러한 마커는 아테롬성 경화성 심혈관계 질환, 당뇨병, 또는 둘 다의 후속 발병에 대한 위험 증가와 연관될 수 있다.
대사 증후군은 지방증, 섬유증 및 간경변을 수반한 지방 간 질환, 간세포성 및 간내 담관암종, 만성 신장 질환, 다낭성 난소 증후군, 폐쇄성 수면 무호흡증을 포함한 수면 장애 호흡, 및 고요산혈증 및 통풍 중 한 가지 이상을 포함한, 몇 가지 비만 관련 장애와 연관될 수 있다.
용어 "인슐린 관련 장애"는 글루코스 내성 장애를 특징으로 하는 질환 또는 상태를 포괄한다. 한 실시양태에서, 인슐린 관련 장애는 유형 I (인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 IDDM), 유형 II (비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM) 당뇨병, 임신성 당뇨병, 및 인슐린 분비를 자극하는 작용제에 의해 이득을 얻을 수 있는 다른 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 진성 당뇨병이다. 또 다른 실시양태에서, 인슐린 관련 장애는 인슐린 저항성을 특징으로 한다.
용어 "패혈증"은 그의 가장 광범위한 의미로 사용되고, 중증 감염에 의해 유발된 전신 염증 상태를 포괄할 수 있다. 패혈증은 혈액, 요로, 폐, 피부 또는 기타 조직에서의 중증 감염에 대한 면역계의 반응, 가장 흔하게는 박테리아이지만, 또한 진균, 바이러스 및 기생충에 대한 면역계의 반응에 의해 야기될 수 있다.
용어 "급성 내독소증"은 그의 가장 광범위한 의미로 사용되고, 증가된 혈장 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS)의 상태를 포괄할 수 있다. 급성 내독소증으로 인해, 결국 패혈증이 발생될 수 있었다. 전신 순환에 있어 증가된 LPS는 저 등급의 만성 염증을 유도시켜, 만성 상태에서 식이 유도성 비만, 인슐린 저항성과 아테롬성 경화증, 및 최종 CVD 현상에 기여하는 혈장 지질을 상승시키는 내인성 보호 숙주 반응을 활성화시킬 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료" (및 그의 문법적 변화, 예컨대 "치료하는")는 치료하고자 하는 개체의 자연 과정을 변경시키기 위한 시도로 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 예방을 위해 수행하거나 임상 병리 상태 과정 동안에 수행할 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하고, 증상을 경감시키며, 질환의 모든 직접적 또는 간접적 병리학적 결과를 감소시키며, 전이를 방지하고, 질환 진행 속도를 감소시키며, 질환 상태를 완화시키거나 또는 일시적으로 완화시키며, 차도시키거나 또는 예후를 개선시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, IBD와 관련하여 "치료"는 IBD의 발병 가능성의 감소, IBD의 발병 속도 저하, 및 상기 질환의 중증도 감소를 지칭할 수 있다. 또 다른 예로서, 아테롬성 경화성 플라크 형성과 관련하여 "치료"는 아테롬성 경화성 플라크 침착물의 발생 가능성의 감소, 이러한 침착물의 발생 속도의 감소, 기존의 침착물의 수 또는 크기의 감소, 또는 플라크 안정성의 개선을 지칭할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 이러한 장애가 있는 대상체뿐만 아니라 이러한 장애를 예방해야 하는 대상체를 포함한다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하고, 증상을 경감시키며, 질환의 모든 직접적 또는 간접적 병리학적 결과를 감소시키며, 전이를 방지하고, 질환 진행 속도를 감소시키며, 질환 상태를 완화시키거나 또는 일시적으로 완화시키며, 차도를 유발시키거나 또는 예후를 개선시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 이용하여, 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 한다.
특정 실시양태에서, 심혈관계 상태를 예방 또는 치료하는 맥락에서 "이를 필요로 하는 대상체"는 심혈관계 질환 또는 심혈관계 상태 (CVD) 또는 대사 증후군으로 진단되거나 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 한 가지 이상의 상태를 나타내는 대상체; 과거에 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 한 가지 이상의 상태로 진단되었거나 또는 이러한 상태를 나타내었던 대상체; 또는 유전적 또는 환경 요인으로 인해 미래에 CVD 또는 대사 증후군의 발생 위험이 있거나 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 한 가지 이상의 상태의 발생 위험이 있는 것으로 간주된 대상체를 지칭한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 CVD 또는 대사 증후군, 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 상태를 나타내는 대상체; 과거에 CVD 또는 대사 증후군, 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 상태를 나타내었던 대상체; 또는 미래에 CVD 또는 대사 증후군, 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 상태의 발생 위험이 있는 것으로 간주된 대상체일 수 있다.
심혈관계 질환 또는 상태를 치료하는 데 있어서, 치료제는 면역 반응의 한 구성분의 반응 규모를 직접적으로 변경시킬 수 있거나, 또는 상기 질환이 다른 치료제, 예를 들어 항생제, 항진균제, 소염제, 화학요법제 등에 의한 치료에 대해 보다 감수성이 되도록 할 수 있다. 동맥 질환을 치료하는 데 있어서, 치료는, 예를 들어 질환의 진행을 방지하거나 또는 느리게 하는 것일 수 있다. 따라서, 동맥 질환의 치료는 구체적으로, 상태의 발생, 또는 상태의 한 병기로부터 또 다른 보다 진행된 병기 또는 보다 중증의 관련 상태로 진행되는 것을 방지, 억제 또는 느리게 하는 것을 포함한다.
질환 또는 상태의 "병리상태"는 대상체의 웰빙을 위협하는 모든 현상을 포함한다. 심혈관계 질환 또는 상태의 경우, 이는 아테롬성 경화성 플라크 형성 (안정하거나 불안정한/취약한 플라크 포함), 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 동맥 경화증, 및 상승된 전신 리포폴리사카라이드 (LPS) 노출을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"경감", "경감하는" 또는 그의 등가는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭하는데, 그 목적은 특정 질환 또는 상태, 예를 들어 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 완화, 방지, 느리게 함 (줄임), 감소 또는 억제하는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 이러한 질환 또는 상태가 있는 대상체뿐만 아니라 상기 질환 또는 상태에 걸리기 쉬운 대상체, 또는 이러한 질환 또는 상태를 예방해야만 하는 대상체를 포함한다.
"만성" 투여는 작용제(들)를 급성 방식과는 달리 지속적인 방식으로 투여하여, 초기 치료 효과가 장기간 유지되도록 하는 것을 지칭한다.
"간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 수행하지는 않지만, 사실상 순환식인 치료이다.
용어 "패키지 삽입물"은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시사항을 지칭하기 위해 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일률 (%)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일률을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환물도 고려하지 않은 후에, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일률 (%)을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 메갈라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 수준 내에 있는 각종 방식으로 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 서열을 정렬하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이는 비교하고자 하는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데에 필요한 모든 알고리즘을 포함한다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일률 (%) 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 원시 코드는 미국 저작권국 (미국 워싱턴 D.C., 20559)에 사용자 문서로 출원되었는데, 이는 미국 저작 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공개적으로 입수 가능하거나, 또는 원시 코드로부터 편집할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템 (디지털 UNIX V4.0D 포함) 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터가 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 이는 달라지지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2를 이용하는 상황 하에서는, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일률 (%) (달리 언급하면, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 특정의 아미노산 서열 동일률 (%)을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 계산한다:
100 x 분율 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭물(match)로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고; Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우에는, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일률 (%)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일률 (%)과 동등하지 않다는 것을 인지해야 할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일률 (%) 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기재된 바와 같이 수득한다.
상기 방법을 이용한 아미노산 서열 동일률 (%) 계산의 추가 예로서, "IL-22"로 명명된 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질" 또는 "참조 단백질"로 명명된 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일률 (%)을 계산하는 방법이 다음에 명확히 제시되는데, 여기서 "IL-22"는 관심 IL-22 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 비교되는 관심 "IL-22" 폴리펩티드에 대항한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각, 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다.
상기 방법을 이용한 아미노산 서열 동일률 (%) 계산의 예로서, "IL-22"로 명명된 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 명명된 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일률 (%)을 계산하는 방법이 표 1 미 2에 명확히 제시되는데, 여기서 "IL-22"는 관심 IL-22 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 비교되는 관심 "IL-22" 폴리펩티드에 대항한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각, 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다.
IL-22 XXXXXXXXXXXXXXX (길이 = 15개 아미노산)
참조 단백질 XXXXXYYYYYYY (길이 = 12개 아미노산)
아미노산 서열 동일률 (%) =
(두 폴리펩티드 서열 간에 동일하게 매칭되는 아미노산 잔기의 수)/(IL-22 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) =
5/15 = 33.3%
IL-22 XXXXXXXXXX (길이 = 10개 아미노산)
참조 단백질 XXXXXYYYYYYZZYZ (길이 = 15개 아미노산)
아미노산 서열 동일률 (%) =
(두 폴리펩티드 서열 간에 동일하게 매칭되는 아미노산 잔기의 수)/(IL-22 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) =
5/10 = 50%.
혼성화 반응의 "엄격도"는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있는데, 이는 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라서 실험적으로 계산한다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 보다 고온을 필요로 하는 반면, 보다 짧은 프로브는 보다 저온을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보적 가닥이 그들의 융점 아래 환경에 존재하는 경우에 변성 DNA가 재어닐링될 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동률이 보다 높을 수록, 보다 높은 상대적 온도를 사용할 수 있다. 그 결과, 보다 고온의 상대적 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 하는 경향이 있는 반면, 보다 저온은 이러한 경향을 감소시킨다는 결론이 나온다. 혼성화 반응의 엄격도에 관한 부가의 상세 내역과 설명은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)].
본원에서 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 소듐 시트레이트를 수반한 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 수반한 50% (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 이용하는 용액 중에서 밤새 혼성화하고, 42℃ 하에 0.2 x SSC (염화나트륨/소듐 시트레이트)에서 10분간 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 고도로 엄격한 10분 세척을 수행하는 조건에 의해 확인될 수 있다.
"중간 수준으로 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 이는 상기 언급된 것 보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 % SDS)을 사용하는 것을 포함한다. 중간 수준으로 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르츠 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 인큐베이션한 다음, 약 37 내지 50℃ 하에 1 x SSC 중에서 필터를 세척하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하는 데 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식하고 있을 것이다.
용어 "효능제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 IL-22 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 모든 분자를 포함한다. 또한, "효능제"에는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 전사 또는 해독을 자극하는 분자가 포괄된다.
적합한 효능제 분자는, 예를 들어 효능제 항체 또는 항체 단편; 천연 폴리펩티드; 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체; 펩티드; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 유기 소분자; 및 폴리펩티드 효능제 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. "효능제"에 대한 언급은 단일 효능제 또는 2개 이상의 상이한 효능제의 조합물을 포괄한다.
용어 "IL-22 효능제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 천연 서열 IL-22 폴리펩티드의 정성적 생물학적 활성 (상기 본원에 정의된 바와 같음)을 모방하는 모든 분자를 포함한다. IL-22 효능제는 구체적으로, IL-22-Fc 또는 IL-22 Ig 폴리펩티드 (면역부착인자) 뿐만 아니라 한 가지 이상의 IL-22 생물학적 활성을 모방하는 소분자를 포함한다. 바람직하게, 이러한 생물학적 활성은 IL-22 수용체의 결합성, IL-22BP와의 상호 작용성, 선천 면역 반응 경로의 촉진, 또는 심혈관계 질환 또는 상태의 경우에는, 아테롬성 경화성 플라크의 형성에 영향을 미치는 것, 특히 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 억제하는 것이다. 플라크 형성의 억제는 통상의 기술자에게 공지된 어떠한 적합한 영상화 방법에 의해서도 평가할 수 있다.
IL-22R1은 특정의 IL-10 계열 구성원에 대한 수용체로서 이종-이량체를 형성하기 위하여 다른 단백질과 쌍을 형성한다 (상기 문헌 [Quyang et al., 2011] 참조). 따라서, 특정 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22 수용체 효능제를 포함할 수 있는데, 이는 IL-22 R1과 결합하여 그의 하류 신호 전달을 촉발시키는 시토카인 (또는 그의 융합 단백질 또는 효능제)을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22R1 효능제 (이는 항-IL-22R1 효능제 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다); IL-20 효능제 (이는 IL-20 폴리펩티드 또는 IL-20 Fc 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다); 및 IL-24 효능제 (이는 IL-24 폴리펩티드 또는 IL-24 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)를 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22R1 효능제는 IL-19 효능제 (이는 IL-19 폴리펩티드 또는 IL-19 Fc 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다); 및 IL-26 효능제 (이는 IL-26 폴리펩티드 또는 IL-26 Fc 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)를 포함한다. IL-19에 대한 예시 서열 (유전자은행 수탁 번호 AAG16755.1, 서열 77), IL-20에 대한 예시 서열 (유전자은행 수탁 번호 AAH69311.1, 서열 78), IL-24에 대한 예시 서열 (유전자은행 수탁 번호 AAH09681.1, 서열 79) 및 IL-26에 대한 예시 서열 (유전자은행 수탁 번호 NP_060872.1, 서열 80)이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, IL-19 폴리펩티드는 서열 77의 아미노산 서열, 또는 신호 펩티드를 수반하지 않는 성숙한 단백질을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-20 폴리펩티드는 서열 78의 아미노산 서열, 또는 신호 펩티드를 수반하지 않는 성숙한 단백질을 포함한다. 또한 다른 실시양태에서, IL-24 폴리펩티드는 서열 79의 아미노산 서열, 또는 신호 펩티드를 수반하지 않는 성숙한 단백질을 포함한다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-26 폴리펩티드는 서열 80의 아미노산 서열, 또는 신호 펩티드를 수반하지 않는 성숙한 단백질을 포함한다.
"소분자"는 약 600 달톤 이하, 바람직하게 약 1,000 달톤 이하의 분자량을 갖는 것으로 본원에서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 "효능제 항체"는 IL-22 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.
용어 "제약 제제" 또는 "제약 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 해줄 수 있는 형태로 존재하고, 상기 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용 가능하지 않은 수준으로 독성인 부가의 성분을 전혀 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 희석제, 안정화제 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로, 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인은 4개의 보존된 골격 영역 (FR)과 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특별한 항원과 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 상기 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; [Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이와 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제성 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정의 벡터는 그와 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로, IL-22 활성 또는 신호 전달을 증가시킴으로써 IL-22 관련 질환 또는 장애를 완화시키는 치료제를 포함하는 조성물에 근거한다. 특정 실시양태에서, IL-22 수용체와 결합하여 이를 활성화시키는 IL-22 폴리펩티드 및 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은, 예를 들어 IL-22 관련 질환, 예컨대 염증성 장 질환의 진단 또는 치료에 유용하고, 상처 치유를 촉진시키는 데 유용하다. 또한, 다른 IL-22 관련 질환, 예를 들어 심혈관계 상태, 대사 증후군을 치료하고 당뇨병성 상처 치유를 촉진시키기 위한 IL-22 폴리펩티드 및 IL-22 Fc 융합 단백질이 또한 제공된다.
A. 예시되는 IL-22 폴리펩티드
본원에 사용된 바와 같은 IL-22 폴리펩티드는 서열 71 (내인성 IL-22 리더 서열을 수반하는 인간 IL-22)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (도 31 참조), 또는 서열 71과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드는 서열 4 (리더 서열을 수반하지 않는 인간 IL-22)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드는 서열 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드는 Fc 융합을 포함하지 않는다.
천연 IL-22 분자를 그들의 핵산 및 폴리펩티드 서열과 함께 제조하는 것은 통상의 기술자에게 공지된 방법을 통하여 달성할 수 있다. 예를 들어, IL-22 폴리펩티드는 IL-22 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 물론, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 또 다른 방법을 이용하여 IL-22를 제조할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, IL-22 서열, 또는 그의 일부는 고체 상 기술 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149-2154] 참조)을 이용하여 직접적으로 펩티드 합성함으로써 생성될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하거나 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 제조업자의 지시 사항을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기 (Applied Biosystems Peptide Synthesizer; 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 달성할 수 있다. IL-22의 각종 부분은 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여, 별개로 화학적으로 합성하고 합하여 완전한 길이의 IL-22를 생성할 수 있다.
IL-22 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를, 천연 서열 IL-22 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 도입하거나, 또는 목적하는 IL-22 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 통상의 기술자는 아미노산 변화가 IL-22의 해독 후 프로세스를 변경시킬 수 있다는 것, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나 또는 막 정착 특징을 변경시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본원에 기재된 천연 서열 IL-22 폴리펩티드 내에서의 변이는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,364,934에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 지침과 기술 중 어느 것을 이용하여 이루어질 수 있다. 변이는 상응하는 천연 서열 또는 변이체 IL-22와 비교해서 그의 아미노산 서열 상의 변화를 초래하는, 천연 서열 또는 변이체 IL-22를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 이러한 변이는 1개 이상의 아미노산을, 천연 서열 IL-22 폴리펩티드의 도메인 중 하나 이상에서의 다른 아미노산으로 치환시키는 것이다. 목적 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기를 결정하는 데 있어서의 지침은 IL-22의 서열을 동종의 공지된 단백질 분자의 서열과 비교하고, 고 상동성 영역 내에 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 발견할 수 있다. 아미노산 치환은 1개의 아미노산을, 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 지닌 또 다른 아미노산으로 대체시킨 결과일 수 있는데, 예컨대 류신을 세린, 즉 보존적 아미노산 대체물로 대체시킨 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로, 1개 내지 5개 아미노산의 범위 내일 수 있다. 허용된 변이는 서열 내의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 이로써 생성된 변이체를 대상으로 하여 다음 실시예에 기재된 시험관내 검정에서 활성에 관하여 시험함으로써 결정할 수 있다.
특별한 실시양태에서, 관심 보존적 치환물은 바람직한 치환물의 표제 하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 상의 변화가 초래한다면, 표 1에서 예시되는 치환물로 표시되거나 또는 아미노산 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고, 그 생성물을 스크리닝한다.
변이는 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개된 (부위-지시된) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이 유발을 이용하여 이루어질 수 있다. 부위-지시된 돌연변이 유발 (문헌 [Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res, 13:4331]; [Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res., 10:6487]), 카세트 돌연변이 유발 (문헌 [Wells et al., 1985, Gene, 34:315]), 제한 선택 돌연변이 유발 (문헌 [Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415]) 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에서 수행하여 IL-22 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
본 발명의 IL-22 폴리펩티드의 단편이 또한 본원에 제공된다. 이러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있거나, 또는 예를 들어, 완전한 길이의 천연 단백질과 비교한 경우에, 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정의 단편은 본 발명의 IL-22 폴리펩티드의 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드의 단편은 생물학적으로 활성이다. 특정 실시양태에서, 완전한 길이의 IL-22의 단편은 N-말단 신호 펩티드 서열이 결여되어 있다.
천연 서열 및 변이체 IL-22 폴리펩티드의 공유적 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 가지 유형의 공유적 변형은 IL-22의 표적화 아미노산 잔기를, IL-22 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제로의 유도체화는, 예를 들어 항-IL-22 항체를 정제하는 방법에 사용하기 위하여, 예를 들어 IL-22를 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면과 가교 결합시키는 데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교 결합제는, 예를 들어 1,1-비스(디아조-아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종-이관능성 이미도에스테르 [디숙신이미딜 에스테르, 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜-프로피오네이트), 이관능성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 포함], 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제를 포함한다.
기타 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화시키는 것; 프롤린 및 리신을 히드록실화시키는 것; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기를 인산화시키는 것; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노 기를 메틸화시키는 것 (문헌 [T. E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86i]); N-말단 아민을 아세틸화시키는 것; 및 어느 C-말단 카르복실 기를 아미드화시키는 것을 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함된 IL-22 폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유적 변형은 이러한 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것"은 본원의 목적상, 천연 서열 IL-22에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분이 결실되고/되거나, 천연 서열 IL-22에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위가 부가되고/되거나 글리코실화 부위(들)에 부착된 당 잔기의 비 및/또는 조성이 변경되는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로, N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된 글리코실화는 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시키는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 O-연결된 글리코실화에 관여할 수도 있다. 글리코실화 부위를 IL-22 폴리펩티드에 부가하는 것은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 IL-22에 부가하거나 이에 의해 치환시키거나 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우), 또는 O-연결된 글리코실화에 대한 인식 서열을 부가함으로써 이루어질 수 있다. IL-22 아미노산 서열은 임의로, 특히 미리 선택된 염기에서 IL-22 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 목적하는 아미노산으로 해독될 코돈을 생성시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통하여 변경될 수 있다.
IL-22 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 수를 증가시키기 위한 또 다른 수단은 이러한 폴리펩티드를 글리코시드와 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 당해 분야, 예를 들어 WO 87/05330 (1987년 9월 11일자로 공개됨) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
IL-22 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 부분을 제거하는 것은 화학적 또는 효소적으로 달성할 수 있거나, 또는 글리코실화에 대한 표적으로서 제공되는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈을 돌연변이적으로 치환시킴으로써 달성할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 ([Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)])에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같은 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 이용함으로써 달성할 수 있다.
IL-22의 또 다른 유형의 공유적 변형은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로, IL-22 폴리펩티드를 각종 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나와 연결시키는 것을 포함한다. 천연 서열 및 변이체 IL-22는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 IL-22 (IL-22의 단편 포함)를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형시킬 수도 있다.
한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 IL-22의 융합물을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로, IL-22 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그화 형태의 IL-22 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대항한 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공하면, 이러한 에피토프 태그와 결합되는 항-태그 항체 또는 또 다른 유형의 친화 매트릭스를 이용하여 친화 정제함으로써 IL-22 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있게 된다. 각종 태그 폴리펩티드 및 그들의 각각의 항체는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 그의 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165]); c-myc 태그, 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., 1985, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616]); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., 1990, Protein Engineering, 3(6):547-553])를 포함한다. 기타 태그 폴리펩티드는 플래그(Flag)-펩티드 (문헌 [Hopp et al., 1988, BioTechnology, 6:1204-1210]); KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., 1992, Science, 255:192-194]); 쿼드러처(quadrature)-투불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:15163-15166]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397])를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 키메라 분자는 IL-22 폴리펩티드 또는 그의 단편과, 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특별한 영역과의 융합물을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자의 경우에는, 이러한 융합물이 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 이들 융합 폴리펩티드는 이종 단백질 ("부착인자")의 결합 특이성과 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능을 합한 항체-유사 분자이고, 종종 면역부착인자로서 지칭된다. 구조상, 면역부착인자는 IL-22의 아미노산 서열 또는 그의 변이체와 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 면역부착인자 분자의 부착인자 부분은 전형적으로, 수용체 또는 리간드의 적어도 결합 부위를 포함하는 연속되는 아미노산 서열이다. 면역부착인자 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 어떠한 면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아유형, IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터도 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 변형된 효과기 활성을 나타낸다.
IL-22 폴리펩티드, 또는 그의 단편은, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 융합되어 IL-22-Ig 융합 단백질 (예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질)을 생성할 수 있다. IL-22 폴리펩티드는 인간 또는 뮤린 IL-22일 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 인간 또는 뮤린 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열일 수 있다.
B. 예시되는 IL-22 Fc 융합 단백질
한 측면에서, 본 발명은 단리된 IL-22 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, IL-22 융합 단백질은 IL-22 수용체와 결합하여 IL-22 수용체 활성 또는 신호 전달을 유도시키고/시키거나 IL-22 수용체 활성의 효능제이다.
또 다른 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 참조 서열을 기준으로 하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하는, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하지만, 상기 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 특정 실시양태에서, 서열 8, 10, 12, 14, 24 또는 26 내의 총 1개 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, IL-22의 외부 영역 (즉, Fc)에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어난다. 특정의 특별한 실시양태에서, Fc의 C-말단 Lys 잔기가 결실된다. 특정의 다른 실시양태에서, Fc의 C-말단 Gly 및 Lys 잔기 둘 다가 결실된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 변이체가 제공된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환물"이란 표제 하에 표 1에 제시된다. "예시되는 치환물"의 표제 하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 보다 실재적인 변화가 표 1에 제공된다. 아미노산 치환을 IL-22 Fc 융합 단백질 내로 도입하고, 생성물을 대상으로 하여, 목적 활성, 예를 들면 보유된/개선된 IL-22 수용체 결합성, 저하된 면역원성, 또는 개선된 IL-22 수용체 신호 전달에 관하여 스크리닝할 수 있다.
[표 1]
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아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라서 다음 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
돌연변이 유발을 목표로 할 수 있는 단백질의 잔기 또는 영역을 확인하는 데에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같은 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"이다. 이러한 방법에서는, 특정 잔기, 또는 표적 잔기 군을 확인하고 (예를 들어, 전하를 띤 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시켜, 상기 단백질과 그의 결합 파트너 간의 상호 작용에 영향을 미치는 지를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감도를 입증하는 아미노산 위치에 추가 치환을 도입할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 단백질 복합체 (예를 들어, 시토카인-수용체 복합체)의 결정 구조를 이용하여, 단백질과 그의 결합 파트너 간의 접촉 점을 확인할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 대상으로 하여, 이들이 목적하는 특성을 함유하고 있는 지를 결정하기 위해 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입물은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물 뿐만 아니라 1개 잔기에서부터 수 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 길이의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물을 포함한다.
a) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 Fc 융합 단백질은 이러한 융합 단백질, 특히 융합 단백질의 Fc 부분이 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 글리코실화 부위를 단백질에 부가 또는 결실하는 것은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
융합 단백질이 Fc 영역을 포함하는 경우에는, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 이분지의 올리고사카라이드를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 이러한 올리고사카라이드는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이분지의 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체의 Fc 영역 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 개선된 특성을 지닌 Fc 변이체를 창출시키기 위해 이루어질 수 있다.
Fc 영역의 CH2 도메인에 부착된 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297 또는 N297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복잡한, 혼성체의 고 만노스 구조물)의 합을 기준으로 하여, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정할 수 있다. Asn297은 Fc 영역 내의 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한, 항체 내에서의 사소한 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ±3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 지닐 수 있다 [예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조]. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍성" 항체 변이체에 관한 공개 공보의 예는 다음 문헌을 포함한다 [US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화에 있어 결핍성인 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 수반한 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지의 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 저하된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean- Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
b) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본원에 제공된 Fc 융합 단백질의 Fc 영역 내로 도입함으로써 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 효과기 기능은 아니지만, 일부 효과기 기능을 보유하고 있으므로, 생체 내에서 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 또는 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 효과기 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 Fc 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 저하/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체 또는 Fc에게 FcγR 결합성은 결여되지만 (이로써 ADCC 활성이 결여되는 것으로 추정됨), FcRn 결합 능력은 보유하도록 할 수 있다. ADCC를 매개하는 데에 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom, I et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp . Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 또 다른 한편, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 계수법을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 [셀테크놀로지, 인크. (CellTechnology, Inc.; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)]; 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 [프로메가 (Promega; 미국 위스콘신주 매디슨)]을 참조할 수 있다). 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 검정을 또한 수행하여 항체 또는 Fc가 C1q와 결합할 수 없으므로 CDC 활성이 결여된다는 사실을 확인할 수 있다 (예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 내에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조할 수 있다). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합성 및 생체내 청소율/반감기 결정은 또한, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l . Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
저하된 효과기 기능을 지닌 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 수반한 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297을 알라닌으로 치환시킨 것을 수반한 소위 ""DANA" Fc 돌연변이체를 포함한, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서의 치환을 수반한 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 개선되거나 감소된 결합성을 지닌 특정의 항체 또는 Fc 변이체가 보고되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 ADCC를 저하시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 N-글리코실화 부위는 제거하지만 FcRn 결합 활성은 보유하기 위한 Fc 영역의 위치 297 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 수반한 Fc 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 감소된 C1q 결합성 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 Fc 영역 내에서 이루어진다.
모계 IgG를 태아에게 전이시키는 데에 책임이 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합성과 증가된 반감기를 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합성을 개선시켜 주는 하나 이상의 치환을 내부에 수반한 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 수반한 변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
또한, Fc 영역 변이체의 기타 예에 관한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조할 수 있다.
c) 시스테인 조작된 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 Fc 영역의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨, 시스테인 조작된 Fc 융합 단백질을 창출시키는 것이 바람직할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 Fc의 접근 가능한 부위에 존재한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올 기가 Fc의 접근 가능한 부위에 위치 설정되고, 이를 이용하여 Fc를 다른 부분, 예컨대 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 창출시킬 수 있다. 예를 들어, 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링)을 시스테인으로 치환시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541 참조).
C. 재조합 방법 및 조성물
IL-22 폴리펩티드는 통상의 재조합 방법, 예를 들어 IL-22 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 그의 단편 또는 변이체, 또는 이를 함유하는 융합 단백질을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 세포를 배양함으로써 제조할 수 있다. 이러한 어느 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 한 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이, 또는 효모일 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 중 어느 것을 생성하는 방법이 추가로 제공되고, 이는 목적 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 목적 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
숙주 세포는 IL-22 폴리펩티드 생성을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 데 적당한 바대로 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험 없이 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제적 기술은 문헌 ([Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 참조])에서 발견할 수 있다.
형질감염 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 CaPO4 및 전기천공법이 있다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 형질전환은 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 문헌 [Sambrook et al. 상기 참고]에 기재된 바와 같이, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공이 일반적으로, 원핵생물, 또는 실재적인 세포벽 장벽을 함유하는 기타 세포에 사용된다. 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로의 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일자로 공개됨)에 기재된 바와 같이, 특정의 식물 세포를 형질전환시키는 데 사용한다. 상기 세포 벽을 수반하지 않은 포유류 세포의 경우에는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면이 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되었다. 효모 내로의 형질전환은 전형적으로, 문헌 ([Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)])의 방법에 따라서 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 기타 방법, 예컨대 핵 미세주사, 전기천공, 온전한 세포와의 박테리아성 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴을 사용할 수도 있다. 포유류 세포를 형질전환시키기 위한 각종 기술에 관해서는, 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)].
본 발명의 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 다음 과정은 적합한 정제 과정의 예들이다: 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토분획 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-태그화 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트화 칼럼. 각종 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]. 선택된 정제 단계(들)는, 예를 들어 사용된 생성 방법의 종류 및 생성된 특별한 폴리펩티드에 좌우될 것이다.
당해 분야에 널리 공지되어 있는 대체 방법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 그의 일부는 고체 상 기술 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA]; [Merrifield, J. 1963, Am. Chem. Soc ., 85:2149-2154] 참조)을 이용하는 직접적인 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하거나 자동화에 의해 수행할 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 제조업자의 지시 사항을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 달성할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 일부의 각종 부분은 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여, 별개로 화학적으로 합성하고 합하여 완전한 길이의 폴리펩티드 또는 그의 일부를 생성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 본원에 기재된 폴리펩티드 중 어느 것을 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예는 면역글로불린의 Fc 영역 또는 에피토프 태그 서열과 융합된 본원에 기재된 폴리펩티드 중 어느 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는 데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 유박테리아 (eubacteria), 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 각종 이. 콜라이 균주가 공개적으로 입수 가능한데, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예컨대 섬유상 진균 또는 효모가 IL-22-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 흔히 사용되는 저급 진핵성 숙주 미생물이다.
글리코실화된 IL-22를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9 뿐만 아니라 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포 (현탁 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL51)를 포함한다. 적당한 숙주 세포의 선택은 당해 분야의 기술 수준 내에 있는 것으로 추정된다.
IL-22를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 발현시킬 수 있다. 각종 벡터가 공개적으로 입수 가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스성 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적당한 핵산 서열을 각종 과정에 의해 상기 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, DNA를 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로, 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 통상의 기술자에게 공지되어 있는 표준 결찰 기술을 이용한다.
IL-22 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드 (이는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드일 수 있다)와의 융합 폴리펩티드로서, 및 IL-22 Fc 융합 단백질로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 IL-22 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 1 pp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵성 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우에는, 신호 서열이, 예를 들어 효모 전화효소 리더, 알파 인자 리더 [삭카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함; 후자는 미국 특허 번호 5,010,182에 기재되어 있다], 또는 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 [EP 362,179 (1990년 4월 4일자로 공개됨)], 또는 WO 90/13646 (1990년 11월 15일자로 공개됨)에 기재된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열, 예를 들어 동일한 종 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 벡터와 클로닝 벡터 둘 다는 이러한 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 각종 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그램-음성 박테리아에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스성 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로, 선택 마커로 명명되기도 하는 선택 유전자를 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 코딩한다.
포유류 세포에 적합한 선택 마커의 특정 예는 IL-22 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인시켜 줄 수 있는 것인데, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR을 이용하는 경우의 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이고, 이는 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (예를 들어, 문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)] 참조). 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, mRNA 합성을 지시하는 IL-22 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 각종 잠재적 숙주 세포에 의해 인식된 프로모터는 널리 공지되어 있다. 원핵성 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터는 쿼드러처-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (예를 들어, 문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)] 참조), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (예를 들어, 문헌 [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776 참조), 및 혼성체 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (예를 들어, 문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] 참조)를 포함한다. 박테리아성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, IL-22를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (예를 들어, 문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem, 255:2073 (1980)] 참조) 또는 기타 당분해 효소 (예를 들어, 문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)] 참조), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 부가 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 대해 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 있어 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 IL-22 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스 (1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터; 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터; 및 열-쇽 프로모터에 의해 제어되는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다.
고등 진핵생물에 의해 IL-22 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 증강인자 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 증강인자는 그의 전사를 증가시키는 프로모터 상에서 작용하는, 통상적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용성 요소이다. 많은 증강인자 서열이 현재 포유류 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는, 진핵성 세포 바이러스로부터의 증강인자가 사용될 것이다. 이의 예는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 증강인자, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강인자, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 증강인자, 및 아데노바이러스 증강인자를 포함한다. 증강인자는 IL-22 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵성 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역의 5', 및 종종 3'로부터 통상 이용 가능하다. 이들 영역은 IL-22를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다.
또한, 재조합 척추동물 세포 배양물에서 IL-22를 합성하도록 적응시키기에 적합한 기타 방법, 벡터 및 숙주 세포가 문헌 ([Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058)에 기재되어 있다.
유전자 증폭 및/또는 발현은 본원에 제공된 서열에 근거하여, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅 (예를 들어, 문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)] 참조), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적당하게 표지된 프로브를 이용하는 계내 혼성화에 의해, 샘플에서 직접적으로 측정할 수 있다. 또 다른 한편으론, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 혼성체 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 이러한 항체는 결국, 표지시킬 수 있고; 상기 이중체를 특정 표면과 결합시켜 이러한 표면 상에 이중체가 형성되면, 이러한 이중체와 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록 해주는 검정을 수행할 수 있다.
또 다른 한편, 유전자 발현은 면역학적 방법에 의해 측정할 수 있는데, 예컨대 세포 또는 조직 박편을 면역조직화학적으로 염색하고, 세포 배양물 또는 체액을 검정하여 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화함으로써 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플 유체의 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 어떠한 동물에서도 제조할 수 있다. 편리하게, 이 항체는 천연 서열 IL-22 폴리펩티드에 대항하여, 본원에 제공된 DNA 서열에 근거한 합성 펩티드에 대항하여, 또는 IL-22 DNA와 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대항하여 제조될 수 있다.
IL-22의 형태를 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막-결합된 경우, 이는 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤-X 100)을 이용하거나 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. IL-22의 발현에 이용된 세포를 각종 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 붕괴 또는 세포 용해제에 의해 붕괴시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 IL-22를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 다음 과정은 적합한 정제 과정의 예들이다: 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토분획; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 IL-22 폴리펩티드의 에피토프-태그화 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트화 칼럼. 각종 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]. 선택된 정제 단계(들)는, 예를 들어 사용된 생성 방법의 종류 및 생성된 특별한 IL-22에 좌우될 것이다. 상기 언급된 일반적 방법을 또한, IL-22 Fc 융합 단백질의 제조에 적용할 수 있다.
유사하게, IL-22 Fc 융합 단백질은, 예를 들어 문헌 ([Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 및 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)])에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 추가 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 베터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이러한 벡터로 형질전환시켰다). 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프계 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에, 상기 제공된 바와 같은 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 임의로, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 Fc 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 방법이 제공된다.
IL-22 Fc 융합 단백질의 재조합 생성을 위하여, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 단리하고, 이를 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 과정 (예를 들어, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다)을 이용하여 용이하게 단리 및 서열 분석할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 경우, IL-22 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을, 면역글로불린 불변 도메인 상의 명시된 위치에서 이러한 불변 도메인을 코딩하는 핵산과 결찰시켜, IL-22의 C-말단에 Fc 융합을 초래할 수 있지만; N-말단 융합 또한 가능하다.
IL-22 Fc 융합 단백질을 구축하는 한 예로서, IL-22를 코딩하는 DNA를, IL-22를 코딩하는 DNA의 3' 말단에서 또는 3' 말단에 근접한 위치, 및 성숙한 폴리펩티드의 N-말단 끝을 코딩하는 DNA에서 또는 그 근처의 지점에서 (상이한 리더의 사용이 고려되는 경우), 또는 IL-22 완전한 길이의 단백질에 대한 N-말단 코딩 영역에서 또는 그와 근접한 위치에서 (천연 신호가 이용되는 경우) 제한 효소에 의해 절단된다. 이어서, 이러한 DNA 단편을, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA 내로 용이하게 삽입하고, 필요한 경우 결실적 돌연변이 유발에 의해 맞춘다. 바람직하게, 이는, 상기 융합 단백질이 인간에 대한 생체내 요법을 위한 것인 경우에는 인간 면역글로불린이다.
일부 실시양태에서, IL-22-면역글로불린 키메라는 단량체, 이종-다량체 또는 동종-다량체, 또는 이량체 또는 사량체로서 어셈블리된다. 일반적으로, 이들 어셈블리된 면역글로불린은 다음 도식으로써 나타낸 바와 같은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4가지 쇄 구조 단위는 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4개 쇄 단위는 보다 고분자량 면역글로불린에서 반복되는데; IgM은 일반적으로, 디술피드 결합에 의해 결합된 기본 4개-쇄 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린은 또한, 혈청 중에 다량체성 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개 쇄 단위는 동일하거나 상이할 수 있다 [또한, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,116,964 (Capon et al.)를 참조할 수 있다].
본원의 도식에서, "A"는 그의 리간드 또는 수용체 (예컨대, IL-22 R)와 결합할 수 있는 결합 부위를 함유하는 결합 파트너 (예컨대, IL-22)의 적어도 일부를 의미하고; X는 또 다른 기능적 결합 파트너 (A와 동일하거나 상이함)일 수 있는 부가 작용제, 상기 정의된 바와 같은 다중 소단위 (쇄) 폴리펩티드 (예를 들어, 인테그린), 면역글로불린 초분자군 구성원의 일부, 예컨대 가변 영역 또는 가변 영역-유사 도메인 (천연 또는 키메라 면역글로불린 가변 영역 포함), 독소, 예컨대 슈도모나스 엑소톡신 (pseudomonas exotoxin) 또는 리신(ricin), 또는 달리 불변 도메인과 정상적으로 연합되지 않은 폴리펩티드 치료제이며; VL, VH, CL 및 CH는 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄 가변 또는 불변 도메인을 나타낸다. 이들 도식은 일반적으로 어셈블리된 면역글로불린 구조를 단지 예시하는 것으로 이해되고, 모든 가능성을 포괄하지 않는다. 예를 들어, 이들 구조물 중 어느 것에서도 몇 가지 상이한 "A" 또는 "X"인 것이 바람직할 수도 있는 것으로 이해될 것이다.
Figure pct00002
이들 도식은 단지 예시적이고, 다량체의 쇄는 천연 면역글로불린과 동일한 방식으로 디술피드 결합되는 것으로 여겨진다고 이해될 것이다. 본 발명에 따라서, 혼성체 면역글로불린은 적당한 핵산으로 형질전환된 포유류 세포로부터 용이하게 분비된다. 이와 같이 분비된 형태는 결합 파트너 에피토프가 중쇄 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 및 중쇄 및 경쇄 이종-사량체에 존재하는 것을 포함하는데, 이러한 결합 파트너 에피토프는 하나 이상의 경쇄 또는 중쇄와 융합 존재하고, 이는 4개의 가변 영역 유사체 모두가 치환되는 이종-사량체를 포함한다. 경쇄-중쇄 비-결합 파트너 가변-유사 도메인이 존재하는 경우에는, 따라서 이종-관능성 항체가 제공된다.
다양한 구조의 쇄 또는 기분 단위를 활용하여, 본 발명의 단량체 및 이종-다량체 및 동종-다량체 및 면역글로불린을 어셈블리할 수 있다. 이들 기본 단위의 구체적인 예가 다음에 도식화되고, 그들의 등가물 (하기 약화된 화학식의 목적상)이 표시된다.
Figure pct00003
본 발명에 따라서 생성된 각종의 예시되고 어셈블리된 신규 면역글로불린이 다음에 개략적으로 도식화된다. 상기 정의된 부호 이외에도, n은 정수이고, Y는 공유 가교 결합성 부분을 지명한다.
Figure pct00004
A, X, V 또는 C는 (A-Y)n, (X-Y)n 등이 되도록 공유 가교 결합성 부분 (Y)으로 변형될 수 있다.
결합 파트너 A (예컨대, IL-22)는 또한, 예를 들어 임의로 Aα 및 Aβ로서 나타낸 쇄를 갖는 다중-쇄 분자일 수 있다. 한 단위로서의 이들 쇄는 상기 단일 쇄 "A"에 대해 언급된 부위에 위치한다. 다중 쇄 중 하나는 하나의 면역글로불린 쇄와 융합되거나 (나머지 쇄는 정상적인 방식으로 융합된 쇄와 공유적 또는 비공유적으로 연합된다), 또는 리간드 결합 파트너가 2개 쇄를 함유하는 경우, 1개 쇄는 면역글로불린 경쇄와 별개로 융합되고 다른 쇄는 면역글로불린 중쇄와 별개로 융합된다.
다음에 도식화된 바와 같은 구조를 갖는 기본 단위는 단량체, 및 이종-다량체 및 동종-다량체, 특히 이량체 및 삼량체 (다중-쇄 리간드 결합 파트너를 수반함)를 창출하기 위해 사용된 것의 예이다:
Figure pct00005
상기와 같은 단위 구조에 활용된 2개-쇄 리간드 결합 파트너 ("Aα 및 Aβ")를 갖는 각종의 예시되는 신규 어셈블리된 항체가 다음에 개략적으로 도식화된다:
Figure pct00006
상기 표에 제시된 구조는 단지 주요 특색을 나타내는데, 예를 들어 이들 구조는 면역글로불린의 결합성 (J) 또는 기타 도메인을 나타내지 않거나 또는 제시된 디술피드 결합을 나타내지 않는다. 이들은 간결의 이익에서 제외된다. 그러나, 상기 도메인이 결합 활성에 요구되는 경우, 이들은 경우에 따라서 면역글로불린 분자 또는 결합 파트너 내에서 점유되는 통상의 위치에 존재하는 것으로 추론되어야 한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA는 공지되어 있거나 또는 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 입수 가능하거나, 또는 합성된다 (예를 들어, 문헌 [Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980)]; [Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980)]; [Dolby et al., P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980)]; [Rice et al. P.N.A.S USA 79:7862-7865 (1982)]; [Falkner et al., Nature 298:286-288 (1982)]; 및 [Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984)] 참조). 내인성 리더 서열을 수반한 인간 IL-22를 코딩하는 DNA 서열이 본원에 제공된다 (서열 70). 공지되어 있거나 또는 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 입수 가능한 기타 목적 결합 파트너를 코딩하는 DNA 서열이 본 발명의 실시에 적합하다.
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다량체가 요망되는 경우에는, 숙주 세포를, 이러한 다량체를 구성하게 될 각 쇄를 코딩하는 DNA로 형질전환시키는데, 상기 숙주 세포는 다량체의 쇄를 목적하는 방식으로 어셈블리할 수 있도록 최적으로 선택된다. 숙주 세포가 형질감염 이전에 면역글로불린을 생산하는 경우에는, 이종-항체를 생성하도록 경쇄 또는 중쇄와 융합된 결합 파트너로 형질감염시키는 것 만이 필요하다. 결합 파트너 도메인을 보유하고 있는 하나 이상의 암과, 동반자 가변 영역을 보유하고 있는 하나 이상의 암을 갖는 전술된 면역글로불린으로 인해, 결합 파트너 리간드와 항원 또는 치료적 부분에 대한 이중 특이성이 초래된다. 상기 언급된 재조합 방법을 이용하여 크게 증가되고 공동-형질전환된 세포를 사용하여, 다중 특이성을 지닌 폴리펩티드, 예컨대 상기 논의된 이종-사량체성 면역글로불린을 생성한다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착인자에 요구되지는 않지만, 면역글로불린 경쇄는 IL-22-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드와 공유적으로 연합되어 존재할 수도 있다. 이러한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 전형적으로, IL-22-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동-발현된다. 분비 시, 혼성체 중쇄와 경쇄는 공유적으로 연합되어, 2개의 디술피드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조를 제조하는 데 적합한 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567 (1989년 3월 28일자로 허여됨)에 개시되어 있다. 표적 단백질-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, IL-22 융합 단백질은, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않거나 또는 불리한 경우에, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 폴리펩티드를 발현하기 위해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조할 수 있다 (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하고 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조할 수 있다). 발현 후, 상기 Fc 융합 단백질을 박테리아성 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다. 실시예 섹션에서 예시된 바와 같이, 추가의 정제 방법은 단백질 A 칼럼을 이용하는 정제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예컨대 섬유상 진균 또는 효모가 적합한 클로닝 또는 발현 숙주인데, 이는 글리코실화 경로를 "인간화"시킴으로써, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 지닌 항체를 생성시키는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)], 및 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] 참조).
글리코실화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체 (무척추 동물 및 척추 동물)로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키기 위하여, 곤충 세포와 연계해서 사용될 수 있는 수많은 바쿨로바이러스성 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물을 또한, 숙주로서 활용할 수 있다 [예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 PLANTIBODIES™ 기술이 기재되어 있다) 참조].
척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수도 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 기타 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol . Reprod ., 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개의 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 [Mather et al., Annals N. Y. Acad . Sci . 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 [DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]) 포함]; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정의 포유류 숙주 세포주에 관한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조할 수 있다.
D. IL-22 효능제
한 측면에서, 본 발명은 방법 실시양태를 위한 IL-22 효능제를 제공한다. IL-22 효능제는 본원에 정의된 바와 같은 IL-22 생물학적 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, IL-22 효능제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-IL-22 항체는 IL-22와 IL-22R의 상호 작용을 증진시키는 작동성 항체이다. 특별한 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22BP와 결합하여 IL-22에 대한 IL-22BP의 결합을 차단 또는 억제함으로써 IL-22 활성 (예를 들어, IL-22R에 대한 결합성)을 유도 또는 증가시키는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22와 결합하는 올리고펩티드이다. 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법론을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있거나 또는 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제할 수 있다. 이러한 올리고펩티드는 통상적으로, 약 5개 이상의 아미노산 길이이고, 또 다른 한편으론 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 이상의 아미노산 길이이다. 상기 올리고펩티드는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적과 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드를 알아보기 위하여 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 것으로 언급된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 IL-22 효능제는 본원에 기재된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의, IL-22와 결합하는 유기 분자이다. 유기 분자는, 예를 들어 소분자일 수 있다. IL-22와 결합하는 유기 분자는 공지된 방법론을 이용하여 확인하고 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 이러한 유기 분자는 통상적으로, 크기가 약 2000 달톤 미만, 또 다른 한편으론 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만인데, 본 발명의 IL-22와 결합할 수 있는 상기 유기 분자는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적과 결합할 수 있는 분자를 알아보기 위하여 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 것으로 언급된다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 특별한 실시양태에서, IL-22 효능제는 IL-22BP와 결합하여 IL-22에 대한 IL-22BP의 결합을 차단 또는 억제함으로써 IL-22 활성 (예를 들어, IL-22R에 대한 결합성)을 유도 또는 증가시키는 유기 분자이다. 또한 또 다른 실시양태에서, IL-22의 효능제가 제공된다. 예시되는 효능제는 천연 IL-22 또는 IL-22R; 천연 폴리펩티드의 한 가지 이상의 활성을 보유하고 있는 IL-22 또는 IL-22R의 단편, 변이체 또는 변형된 형태; IL-22R과 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 작용제; 및 IL-22 또는 IL-22R의 과발현, 또는 IL-22 또는 IL-22R을 코딩하는 핵산의 과발현을 유도시키는 작용제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
E. 검정
본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질을 대상으로 하여, 당해 분야에 공지된 각종 검정에 의해 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 관하여 확인하거나, 스크리닝하거나 또는 성상 확인할 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 대상으로 하여, 예를 들어 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯팅 분석, 스캐차드(Scatchard)에 의한 세포 표면 결합, 표면 플라스몬 공명에 의해, 그의 수용체 결합 활성에 관하여 시험한다. 또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 이용하여, IL-22 수용체와 결합을 놓고 IL-22 Fc 융합 단백질과 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은, 특정 생물학적 샘플에 존재하는 IL-22 수용체 또는 IL22-결합성 단백질 (가용성 수용체)의 존재 또는 양을 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 특정 생물학적 샘플에 존재하는 IL-22 수용체의 존재 또는 양을 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 생물학적 샘플은 먼저, 샘플 중의 어떠한 Fc 수용체도 포화시키기 위하여 비-특이적 이소형 대조군 항체로 차단시킨다.
2. 활성 검정
한 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성을 확인하기 위한 검정이 제공된다. IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성은, 예를 들어 IL-22 수용체에 대한 결합성, IL-22 신호 전달의 자극, 및 STAT3, RegIII 및/또는 PancrePAP 발현의 유도를 포함할 수 있다. 추가로, 심혈관계 질환 또는 상태의 경우, 생물학적 활성은, 특히 아테롬성 경화성 플라크의 형성을 억제하기 위하여 아테롬성 경화성 플라크의 형성에 영향을 미치는 것을 포함할 수 있다. 플라크 형성의 억제는 통상의 기술자에게 공지된 적합한 어떠한 영상화 방법에 의해서도 평가할 수 있다.
F. 접합체
본 발명은 또한, 검출, 제제화, 반감기 연장, 면역원성의 경감 또는 조직 침투를 위한 한 가지 이상의 작용제와 접합된, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 접합체를 제공한다. 예시되는 접합은 PEG화 및 방사성 동위원소와의 부착을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 접합체는 방사성 접합체를 형성하기 위하여 방사성 원자와 접합된, 본원에 기재된 바와 같은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 각종 방사성 동위원소가 방사성 접합체의 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 접합체를 검출용으로 사용하는 경우에는, 이러한 접합체가 섬광조영 연구를 위해서는 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로서 공지되기도 함)를 위해서는 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
G. 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 중 어떠한 것도 특정 생물학적 샘플 중에서 IL-22 수용체의 존재를 검출하는 데 유용하다. 특정 실시양태에서, 방법은 상기 샘플 중의 어느 Fc 수용체를 비-특이적 이소형 대조군 항체로 차단시키는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 상피 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 검출 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플 중에서 IL-22 수용체의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 IL-22 수용체에 대한 IL-22 Fc 융합 단백질의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 IL-22 Fc 융합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 IL-22 Fc 융합 단백질과 IL-22 수용체 간에 복합체가 형성되는 지를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 샘플 중의 어느 Fc 수용체를 비-특이적 이소형 대조군 항체로 차단시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 이용하여, IL-22 Fc 융합 단백질로의 요법에 적격한 대상체를 선택하는데, 예를 들어 여기서는 IL-22 수용체가 환자의 선택을 위한 바이오마커(biomarker)이다.
특정 실시양태에서, 표지된 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분 (예컨대, 형광성, 발색, 고전자밀도, 화학발광성 및 방사성 표지) 뿐만 아니라, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통하여 간접적으로 검출되는 부분, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시되는 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트제 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아성 루시퍼라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제 (염료 전구체, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 효소와 커플링됨), 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
H. 제약 제제
본원에서의 IL-22-기반 조성물 (이는 특정 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질, 및 IL-22 폴리펩티드 또는 효능제를 포함한다)은 좋은 의료 행위에 일치하는 방식으로 제제화, 용량화 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려되는 요인들은 치료하고자 하는 특별한 장애, 치료하고자 하는 특별한 포유류, 개개의 대상체의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 기타 요인을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 질환 또는 상태에 걸리기 쉽거나 또는 이러한 질환 또는 상태로 진단된 인간 대상체의 생존 기간을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 생존 기간은 약물의 첫 번째 투여부터 사망까지의 시간으로서 정의된다.
제약 제제는 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여, 목적하는 순도를 갖는 활성 성분을 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences 20th edition, ed. A. FGennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa])와 혼합하여, 동결건조된 제제 또는 수성 용제의 형태로 제조된다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로, 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이는 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 예시되는 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 [HYLENEX®, 박스터 인터내셔날, 인크. (Baxter International, Inc.)]을 추가로 포함한다. 특정의 예시되는 sHASEGP 및 사용 방법 (rHuPH20 포함)이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 부가 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 병용된다.
임의로, 그러나 바람직하게, 상기 제제는 제약상 허용되는 염, 바람직하게 염화나트륨을, 바람직하게 약 생리학적 농도로 함유한다.
임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0%, 전형적으로 v/v의 범위이다. 적합한 보존제는 제약 분야에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
본원에서의 제제는 또한, 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대하여 필요에 따라 둘 이상의 활성 화합물, 바람직하게 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
예시되는 동결 건조된 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하는데, 후자 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서의 제제는 또한, 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대하여 필요에 따라 둘 이상의 활성 성분, 바람직하게 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 스테로이드, TNF 길항제 또는 기타 소염 치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐; 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 IL-22 Fc 융합 단백질을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸친 분자 방출을 가능하게 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 피막화된 항체가 체내에 장시간 동안 잔존할 경우, 이들은 37℃ 하 수분에 대한 노출의 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
국소 투여용 제약 조성물은, 예를 들어 국소 겔의 형태의 제제화할 수 있다 (예를 들어, US 4,717,717, US 5,130,298, US 5,427,778, US 5,457,093, US 5,705,485, US 6,331,309 및 WO2006/138,468 참조). 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 셀룰로스 유도체의 존재 하에 제제화할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 국소용 제제는 투여 전에 충분한 완충제 또는 희석제와 함께 동결건조된 제제로부터 재구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 상피 상처 치유에 있어서 결함이 있는 대상체에 대한 국소 투여용으로 제제화한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 상피 상처 치유는 피부에서 일어난다. 특정의 다른 특별한 실시양태에서, 대상체는 상처 치유에 있어서 결함이 있는 인간이다. 특정의 다른 실시양태에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 국소 제제를 이용하여, 내부 또는 외부 외과적 절제 후의 상처 치유를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상처 치유를 촉진, 증진 또는 개선시키는 데 사용하기 위한 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 국소용 겔의 제제, 예를 들어 미리-충진된 주사기 또는 용기 내에 있거나, 또는 또 다른 한편으론, 본 발명의 화합물을 환자에게 국소 투여하기 직전에 겔 매트릭스와 혼합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 부가의 치료제가 또한, 동시에 또는 순차적으로 국소 투여된다. 기타 투여 경로가 또한, 임의로 사용될 수 있는데, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구 및 비내 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 어떠한 수단에 의해서도 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
전형적으로 상처 치유의 경우에는, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 부위-특이적 전달용으로 제제화한다. 국소적으로 적용되는 경우, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 다른 성분, 예컨대 담체 및/또는 아주반트와 조합하는 것이 적합하다. 이러한 다른 성분의 종류에 대한 제한은 없는데, 단 이들은 제약상 허용되어야 하고 그들의 의도된 투여에 대해 효능이 있어야만 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 분해할 수 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐을 수반하거나 수반하지 않는, 연고, 크림, 젤, 스프레이 또는 현탁제를 포함한다. 상기 조성물은 또한, 멸균성 드레싱, 경피 패치, 석고, 및 밴드 내로, 예를 들어 액상 또는 반액상 형태로 함침될 수 있다. 산화 재생된 셀룰로스/콜라겐 매트릭스, 예를 들어 PROMOGRAN 매트릭스 상처 드레싱 또는 PROMOGRAN PRISMA MATRIX를 사용할 수도 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)], 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 폴리-락트산-공-글리콜산 (PLGA) 중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸친 분자 방출을 가능하게 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 피막화된 폴리펩티드가 체내에 장시간 동안 잔존할 경우, 이들은 37℃ 하 수분에 대한 노출의 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
겔 제제를 수득하기 위하여, 액상 조성물 내에서 제제화된 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 유효량의 수용성 폴리사카라이드 또는 합성 중합체와 혼합하여 겔 (예를 들어, 겔화제), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 형성하여, 국소적으로 적용될 적당한 점도의 제제를 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 폴리사카라이드 또는 겔화제는, 예를 들어 셀룰로스 유도체, 예컨대 에테르화된 셀룰로스 유도체 (알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스 및 알킬히드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 셀룰로스 포함); 소듐 카르복시메틸 셀룰로스; POE-POP 블록 중합체: 각종 등급의 폴옥사머(poloxamer) USP; 히알루론산; 폴리아크릴산, 예컨대 카르보폴 940; 전분 및 분획화된 전분; 한천; 알진산 및 알기네이트; 아라비아 검; 풀룰란(pullullan); 아가로스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프럭탄스; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체 중합체뿐만 아니라 검, 예컨대 크산탄 검; 구아 검; 로커스트 콩(locust bean) 검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검; 및 그의 유도체, 조합물 및 혼합물을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에서의 겔화제는, 예를 들어 생물학적 시스템에 대해 불활성이고, 무독성이며, 제조하기가 간단하고/하거나 너무 묽거나 점성이 아닌 것이고, 그 내부에 보유된 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 탈안정화시키지 않을 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리사카라이드는 에테르화된 셀룰로스 유도체이고, 또 다른 실시양태에서는 USP에 널리 정의되고, 정제되며 열거된 것인데, 예를 들어 메틸셀룰로스 및 히드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스이다 (모두 셀룰로스성 작용제로서 지칭된다). 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 히드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스이다.
겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로, 적당한 점도를 수득하기 위한 저분자량 폴리에틸렌 글리콜과 고분자량 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400 내지 600의 폴리에틸렌 글리콜과 분자량 1,500의 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이, 적당한 비로 혼합되어 페이스트를 수득하는 경우에, 본 목적에 유효할 것이다.
폴리사카라이드 및 폴리에틸렌 글리콜에 적용되는 바와 같은 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르 기의 치환도에 의해 결정되고, 본원에 유용한 안정화 유도체는 셀룰로스 쇄 내의 안히드로글루코스(anhydroglucose) 단위당, 상기 유도체를 수용성으로 만드는 데 충분한 양의 상기 에테르 기를 가져야 한다. 안히드로글루코스 단위당 적어도 0.35개 에테르 기의 에테르 치환도가 일반적으로 충분하다. 부가적으로, 상기 셀룰로스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어 Li, Na, K, 또는 Cs 염의 형태로 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 메틸셀룰로스가 겔에 이용되는데, 예를 들어 이는 겔의 약 1 내지 5%, 또는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 또는 약 5%를 차지하고, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 겔 1 ml당 약 50 내지 2,000 ㎍, 100 내지 2,000 ㎍, 또는 100 내지 1,000 ㎍의 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 국소 투여에 의한 상처 치유에 유효한 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 양은 상처 면적 (㎠) 당 약 25 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 75 ㎍, 약 100 ㎍, 약 125 ㎍, 약 150 ㎍, 약 175 ㎍, 약 200 ㎍, 약 225 ㎍, 약 250 ㎍, 약 300 ㎍, 또는 약 350 ㎍일 수 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어 멸균성 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명은 IL-22-기반 치료제에 대한 투여량을 제공한다. 예를 들어, 질환의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여에 의해서든지 아니면 연속적인 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)의 폴리펩티드가 대상체에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서, 약 1 ㎍//kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 상태에 따라서 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 목적하는 질환 증상의 억제가 이루어질 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
질환을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 폴리펩티드의 적당한 투여량 (단독으로 사용되거나 또는 한 가지 이상의 기타 부가 치료제와 병용해서 사용되는 경우)은 치료하고자 하는 질환의 유형, 폴리펩티드의 유형, 폴리펩티드가 예방 목적으로 투여되든지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질환의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 대상체의 임상 병력 및 폴리펩티드에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 상기 폴리펩티드는 대상체에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여에 의해서든지 아니면 연속되는 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg)의 폴리펩티드가 대상체에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 상태에 따라서 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 목적하는 질환 증상의 억제가 이루어질 때까지 치료를 일반적으로 지속할 것이다. 한 가지 예시되는 폴리펩티드의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg (또는 그의 모든 조합)의 1회 이상의 용량을 대상체에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg (또는 그의 모든 조합)을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주, 2주 마다, 또는 3주 마다 투여할 수 있다 (예를 들어, 이로써 대상체에게 약 2 내지 약 20회 용량, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 폴리펩티드가 투여된다). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 다음, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시되는 투여량 요법은 상기 폴리펩티드 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 투여량 요법도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
심혈관계 질환 또는 상태, 대사 증후군, 급성 내독소증 또는 패혈증, 또는 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 화합물은 전형적으로, 정맥내 주사에 의해 투여된다.
국소, 비경구, 예컨대 정맥내, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 안과, 안내, 유리질내, 병변내, 뇌척수내, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구 또는 흡입 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기타 투여 방법을 사용할 수도 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 화합물은 공지된 방법에 따라서, 예컨대 거환으로서 정맥내 투여하거나 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적으로 주입함으로써, 인간 대상체에게 투여한다.
I. 치료적 방법 및 조성물
본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 효능제 중 어떠한 것도 치료적 방법에 사용할 수 있다.
a) 염증성 장 질환
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 추가 측면에서, IBD (UC 및 CD 포함)를 치료하는 데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 UC 또는 CD가 있는 개체에게 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게, 예를 들어 다음에 기재되는 바와 같은 한 가지 이상의 부가 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정의 특별한 실시양태에서, 상피 조직은 장 상피 조직이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 개체에게, 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 데 유효한 양의 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 또한 다른 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병, 특히 유형 II 당뇨병, 당뇨병성 상처 치유, 대사 증후군 및 아테롬성 경화증을 치료하는 데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 특정 개체에게 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 개체에서 당뇨병, 특히 유형 II 당뇨병, 당뇨병성 상처 치유, 대사 증후군 및 아테롬성 경화증을 치료하는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다 ["상처 치유를 위한 IL-22 폴리펩티드의 사용"이란 발명의 명칭으로 출원된 출원 번호 61/800795인 제넨테크 출원 사건 번호 PR5586; 및 "IL-22 폴리펩티드를 이용하는 심혈관계 상태 및 대사 증후군의 치료 방법"이란 발명의 명칭으로 출원된 출원 번호 61/801144인 사건 번호 PR5590 (둘 다 2013년 3월 15일에 출원되었다) 참조]. 이들 출원 둘 다의 개시내용은 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 "개체" 또는 "대상체" 또는 "환자"는 바람직하게, 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어서의, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 의약은 IBD의 치료 및 상처 치유를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 IBD가 있는 개체에게 유효량의 상기 의약을 투여하는 것을 포함하는, IBD를 치료하고 상처를 치유하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게, 예를 들어 다음에 기재되는 바와 같은 한 가지 이상의 부가 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 의약은 소화관 상피 세포에서의 염증 반응을 억제하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 특정 개체에게 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 데 유효한 양의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 IBD (UC 및 CD 포함)를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 IBD가 있는 개체에게 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게, 다음에 기재되는 바와 같은 한 가지 이상의 부가 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 것에 따르는 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 특정 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게, 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 증강시키는 데 유효한 양의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
b) 기타 치료적 적응증
본 발명은 심혈관계 질환 및 상태, 대사 증후군, 급성 내독소증 및 패혈증, 및 당뇨병에 대한 IL-22-기반 치료제를 제공한다. 소정의 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하고 이러한 질환 또는 상태의 중증도를 감소시키기 위하여, 본 발명의 화합물의 적당한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료하고자 하는 질환 또는 상태의 유형, 작용제가 예방 목적으로 투여되든지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질환 또는 상태의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 대상체의 임상 병력 및 화합물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 상기 화합물은 대상체에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게, 본 발명의 제약 조성물 및 용량-반응 곡선을 먼저, 시험관 내에서 결정한 다음, 인간에게 시험하기에 앞서 유용한 동물 모델에서 결정하는 것이 바람직하다.
한 측면에서, 본 발명은 심혈관계 질환 또는 장애, 대사 증후군, 급성 내독소증 및 패혈증, 및 인슐린 관련 장애에 대한 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 효능제를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관계 질환 또는 장애, 대사 증후군, 및 인슐린 관련 장애의 진행을 지연시키거나 느리게 하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 질환, 상태 또는 장애가 있는 것으로 진단된 대상체에게 유효량의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 효능제를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관계 질환 또는 장애, 및 인슐린 관련 장애의 징후를 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 질환, 상태 또는 장애에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 유효량의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 효능제를 투여하는 것을 포함하는데, 이러한 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 효능제는 상기 질환, 상태 또는 장애의 징후 발생에 대항하여 유효하다.
심혈관계 질환 및 상태
한 측면에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제는 특정 대상체에서 심혈관계 질환 또는 상태의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후 (증상과 징후 둘 다 포함)의 발생 또는 그의 진행에 대항한 예방적 효과를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 질환 또는 상태는 아테롬성 경화증이다. 한 실시양태에서, 상기 징후는 아테롬성 경화성 플라크 형성 및/또는 혈관 염증을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 심혈관계 질환에 걸릴 위험이 있다. 일반적으로, 위험이 있는 대상체는 기존에, 본원에 기재된 바와 같은 심혈관계 질환 또는 상태에 걸린 적이 있었거나, 또는 심혈관계 질환 또는 상태에 대한 유전적 소인이 있을 것이다.
심혈관계 질환 및 상태의 치료 효능은 심혈관계 질환을 평가하는 데 흔히 사용되는 각종 평가 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 심혈관계 건강을 평가할 수 있다. 심혈관계 건강은, 예를 들어 혈액 시험 (예를 들어, 총 콜레스테롤, LDL-C, HDL-C, 트리글리세리드, C-반응성 단백질, 피브리노겐, 호모시스테인, 공복 인슐린, 페리틴, 지단백질, LPS), 혈압, 청진, 심전도, 심장 스트레스 시험, 심장 영상 (예를 들어, 관상 동맥 카테터, 심 초음파, 혈관내 초음파, 양전자 방출 단층 촬영, 컴퓨터 단층 촬영 혈관 조영술, 및 자기 공명 영상)에 의해 (이에 제한되지 않는다) 평가할 수 있다.
대사 증후군
한 측면에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제는 특정 대상체에서 대사 증후군 (또는 대사 장애 또는 질환)의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후 (증상과 징후 둘 다 포함)의 발생 또는 그의 진행에 대항한 치료적 또는 예방적 효과를 제공한다. 하나 이상의 실시양태에서, 상기 대상체는 대사 증후군에 걸릴 위험이 있다.
대사 증후군의 치료 효능은 대사 증후군을 평가하는 데 흔히 사용되는 각종 평가 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 비만을 측정할 수 있다. 추가 예로서, 고혈당증, 이상 지질 혈증, 인슐린 저항성, 만성 지방 조직 염증, 및/또는 고혈압을 측정할 수 있다. C-반응성 단백질, IL-6, LPS, 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 중 하나 이상의 수준 감소를 측정할 수 있다. 이들 측정은 당해 분야에 널리 공지된 모든 방법에 의해 수행될 수 있다.
인슐린 관련 장애
인슐린 관련 장애의 경우, 용어 "치료"는 상기 장애에 대한 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭하는데, 여기서 그 목적은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애를 예방하거나 또는 느리게 하는 (줄이는) 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 인슐린 관련 장애에 걸린 대상체뿐만 아니라 이러한 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 이 장애를 예방시켜야 하는 대상체를 포함한다.
한 측면에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제는 특정 대상체에서 인슐린 관련 장애의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후 (증상과 징후 둘 다 포함)의 발생 또는 그의 진행에 대항한 예방적 효과를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 장애는 유형 I 당뇨병, 유형 II 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병이다. 한 실시양태에서, 병리상태 또는 병리학적 징후는 췌장 (예를 들어, 섬 세포)에 의한 인슐린 생성이 거의 없거나 전혀 없음, 인슐린 저항성 및 고혈당증 중 한 가지 이상을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 인슐린 관련 장애에 걸릴 위험이 있다. 일반적으로, 위험이 있는 대상체는 인슐린 관련 장애에 대한 유전적 소인을 갖고 있거나, 섬 세포의 자가면역 파괴를 촉발시키는 바이러스 [예를 들어, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 콕사키바이러스(coxsackievirus), 유행성 이하선염 바이러스 또는 시토메갈로바이러스]에 노출된 것이 있거나, 비만이거나, 전-당뇨병이거나 (정상 혈당 수준 보다 높음), 또는 임신성 당뇨병이 있다.
인슐린 관련 장애의 치료 효능은 이러한 장애를 평가하는 데 흔히 사용되는 각종 평가 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 유형 I 당뇨병과 유형 II 당뇨병 둘 다는 다음 중 한 가지 이상으로 평가할 수 있다: 당화 혈색소 검사 (A1C), 정규 혈당 시험 및 공복시 혈당 시험. 유형 I은 또한, 혈중 자가항체 및/또는 뇨중 케톤에 관하여 시험함으로써 평가할 수 있다. 유형 II는 또한, 경구 글루코스 내성에 관하여 시험함으로써 평가할 수 있다.
급성 내독소증 및 패혈증
한 측면에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제는 특정 대상체에서 급성 내독소증, 패혈증 또는 둘 다의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후 (증상과 징후 둘 다 포함)의 발생 또는 그의 진행에 대항한 치료적 또는 예방적 효과를 제공한다. 하나 이상의 실시양태에서, 상기 대상체는 급성 내독소증, 패혈증 또는 둘 다에 걸릴 위험이 있다.
급성 내독소증, 패혈증 또는 둘 다의 치료 효능은 급성 내독소증, 패혈증 또는 둘 다를 평가하는 데 흔히 사용되는 각종 평가 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, LPS 또는 염증성 마커의 수준 감소를 측정할 수 있다. 이들 측정은 당해 분야에 널리 공지된 모든 방법에 의해 수행될 수 있다.
상처 치유
상처 치유를 측정하는 각종 방식이 있다. 종종, 선형 치수, 경계 및 면적을 계산하기 위해 영상을 찍는다. NIH는 자유 프로그램, 영상 J를 갖는데, 이로써 특정 영상으로부터 상처 면적을 측정할 수 있다. 최종 치유 예후는 중심을 향한 주변의 이동을 근거로 한 초기 치유 속도로부터 외삽될 수 있다. 이는 수많은 수학 방정식 [가장 흔히 사용되는 것이 변형된 길만(Gilman) 방정식이다]을 이용하여 수행한다. 육안 검사 이외에도, 상처 치유 측정은 또한, 분광법 또는 MRI에 의해 도움을 받을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dargaville et al., Biosensors Bioelectronics, 2013, 41:30-42], [Tan et al., 2007, British J. Radiol. 80:939-48] 참조). 치유가 느리고/부적절한 경우, 상처 가장자리의 생검을 취하여 감염과 악성 종양을 배제시키거나 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상처 치유의 촉진 또는 개선은 IL-22-처리된 상처에서의 상처 봉합과 대조군 상처에서의 상처 봉합을 비교함으로써 평가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상처 치유의 촉진 또는 개선은 대조군 보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 신속하거나 우수하다.
특정 측면에서, 본 발명은 활성 감염, 미생물성 오염 또는 상처 내에서의 집락 형성을 수반하거나 수반하지 않으면서 상처의 치유를 증진/촉진/개선시키는 방법을 제공한다. IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 감염된 상처를 치료하거나 또는 감염된 상처 치유를 증진/촉진/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 감염의 존재 하에, 상처를 치료하거나 또는 상처 치유를 증진/촉진/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 감염에 대한 위험을 수반한 미생물성 오염 또는 집락 형성의 존재 하에, 상처를 치료하거나 또는 상처 치유를 증진/촉진/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 상처 치유 치료를 필요로 하는 환자는 당뇨병성 환자일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상처는 당뇨병성 상처, 예를 들어 당뇨병성 족부 궤양이다. 일부 추가 실시양태에서, 상처는 감염된 당뇨병성 상처, 예를 들어 감염된 당뇨병성 족부 궤양이다.
추가 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 상기 치료적 방법 중 어느 것에 사용하기 위한, 본원에 제공된 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제, 및 예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 한 가지 이상의 부가 치료제를 포함한다.
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 단독으로 사용되거나 또는 특정 요법에서 다른 작용제와 병용해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-22 폴리펩티드, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제는 한 가지 이상의 부가 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 부가 치료제는 염증 반응을 저하시키는 면역 억제제인데, 이는 메토트렉세이트, TNF 억제제, TNF 길항제, 메살라진, 스테로이드, 덱사메타손 및 아자티오프린, 및 그의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염증 반응을 저하시키는 데 적합한 부가 치료제는 5-아미노살리실산 (5-ASA), 머캅토퓨린 (또한, 6-머캅토퓨린 또는 6-MP로 지칭됨) 또는 그의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 IBD를 치료하기 위하여, 염증 반응을 저하시키는 한 가지 이상의 부가 치료제 (예를 들어, 5-ASA, 6-MP, 또는 TNF 길항제)와 공-투여될 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 IBD를 치료하기 위하여, 인테그린 길항제, 예컨대 에트롤리주맙(etrolizumab)과 공-투여될 수 있다. 한 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 효능제와 병용해서 사용된다.
만성 상처 치유를 촉진시키기 위하여, 예컨대 당뇨병성 족부 궤양을 치료하기 위하여, IL-22 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제의 투여를 한 가지 이상의 부가 상처 치유제와 병용할 수 있다. 적합한 부가 상처 치유제는 성장 인자 (예를 들어, EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF, 및 VEGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈관형성 인자 (예를 들어, HGF, TNF-α, 안지오게닌, IL-8, 안지오포이에틴 1 및 2, Tie-2, 인테그린 α5, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 산화질소, COX-2), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 계열의 구성원 (예를 들어, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, 및 PDGF-D), 인슐린 성장 인자 (IGF) 계열의 구성원 (예를 들어, IGF-I, IGF-II), 전환 성장 인자 (TGF) 계열의 구성원 (예를 들어, TGF-α, TGF-β) 및 동화 산소 (진공 요법)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 국소 투여에 사용하기 적합한, 본원에 기재된 한 가지 이상의 부가 상처 치유제 및/또는 한 가지 이상의 항균제 또는 항생제와 공-투여될 수 있다 (WO2006/138468 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 상기 실시양태에서, 항생제는 황 항생제일 수 있는데, 이는 은 술파디아진, 즉 실바덴(silvadeen)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 공-투여된 한 가지 이상의 부가 작용제는 IL-22 폴리펩티드, IL-22 융합 단백질 또는 IL-22 효능제와 동시에, 교대로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
추가의 예시되는 실시양태에서, 목표가 심혈관계 질환 또는 상태 또는 대사 증후군의 예방 또는 치료인 경우, IL-22 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제의 투여를 콜레스테롤-강하제, 예컨대 스타틴 (예를 들어, 로바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴), 담즙산 결합성 수지 (콜레스티폴, 콜레스티라민 슈크로스, 및 콜레세벨람), 에제티미베, 또는 에제티미베-심바스타틴 병용물; 항-혈소판제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제 (아스피린), 아데노신 디포스페이트 (ADP) 수용체 억제제 (클로피도그렐, 프라수그렐, 티카그렐로르, 티클로피딘), 포스포디에스테라제 억제제 (실로스타졸), 당단백질 IIB/IIIA 억제제 (압식시맙, 엡티피바티드, 티로피반), 아데노신 재흡수 억제제 (디피리다몰), 트롬복산 억제제 (트롬복산 신타제 억제제, 트롬복산 수용체 길항제, 테루트로반); 베타 차단제, 예컨대 알프레놀롤, 부신돌롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 라베탈롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 티몰롤, 에우콤미아 껍질 (eucommia bark), 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 셀리프롤롤, 에스몰롤, 메토프롤롤, 네비볼롤, 부탁사민, ICI-118,551, 및 SR 59230A; 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 예컨대 캅토프릴, 조페노프릴, 디카르복실레이트-함유 작용제 (에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 이미다프릴, 조페노프릴), 포스포네이트-함유 작용제 (포시노프릴), 카소키닌, 락토키닌, 락토트리펩티드 [프로바이오틱 락토바실루스 헬베티쿠스 (probiotic Lactobacillus helveticus)에 의해 생성되거나 또는 카제인으로부터 유래된 Val-Pro-Pro, 및 Ile-Pro-Pro]; 칼슘 채널 차단제, 예컨대 디히드로피리딘 (예를 들어, 암로디핀, 아라니디핀, 아젤니디핀, 바르니디핀, 베니디핀, 실니디핀, 클레비디핀, 이스라디핀, 에포니디핀, 펠로디핀, 라시디핀, 레르카니디핀, 만니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 닐바디핀, 니모디핀, 니솔디핀, 니트렌디핀, 및 프라니디핀), 페닐알킬아민 (예를 들어, 베라파밀), 벤조티아제핀 (예를 들어, 딜티아젬), 미베프라딜, 베프리딜, 플루스피릴렌 및 펜딜린; 이뇨제, 예컨대 고효능 고리 이뇨제 (예를 들어, 푸로세미드, 에타크린산, 토르세미드 및 부메타니드), 티아지드 (예를 들어, 히드로클로로티아지드 산), 카르본산 안히드라제 억제제 (예를 들어, 아세타졸라미드 및 메타졸라미드), 칼륨 유지성 이뇨제 (예를 들어, 알도스테론 길항제; 스피로놀락톤, 및 상피 나트륨 채널 차단제; 아밀로리드 및 트리암테렌), 및 칼슘 유지성 이뇨제, 및 상기 중 어느 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체의 투여와 병용할 수 있거나 또는 이의 투여로 보충시킬 수 있다.
인슐린 관련 장애 또는 대사 증후군의 경우, IL-22 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체, 또는 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 효능제의 투여를 각종 치료제의 투여와 병용할 수 있거나 또는 이의 투여로 보충시킬 수 있다. 유형 I 당뇨병 (인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 IDDM)의 경우에는, 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드, Fc 융합 단백질 또는 효능제를 레귤러 인슐린 (regular insulin) 대체 요법 (신속 작용성 및 지속 작용성 인슐린 포함), 면역억제 치료, 섬 이식 및 줄기 세포 요법 중 한 가지 이상과 병용한다. 한 실시양태에서, 레귤러 인슐린 대체 요법은 레귤러 인슐린 [예를 들어, 휴물린(Humulin) R, 노볼린(Novolin) R], 인슐린 이소판 (예를 들어, 휴물린 N, 노볼린 N), 인슐린 리스프로 [예를 들어, 휴말로그(Humalog)], 인슐린 아스파르트 [예를 들어, 노보로그(NovoLog)], 인슐린 글라르긴 [예를 들어, 란투스(Lantus)] 및 인슐린 데테미르 [예를 들어, 레베미르(Levemir)]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 인슐린 대체 요법은 추가로, 프람린티드 [심린(Symlin)]를 포함한다.
유형 II 당뇨병 (비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM) 또는 대사 증후군의 경우에는, 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드, Fc 융합 단백질 및 효능제를 인슐린 대체 요법 (상기 논의된 바와 같음), 간에 의한 글루코스 생성을 저하시키는 작용제, 인슐린의 췌장 생성과 방출을 자극하는 작용제, 탄수화물의 효소적 붕괴를 차단시키거나 또는 인슐린 감수성을 증가시키는 작용제 중 한 가지 이상과 병용할 수 있다. 한 실시양태에서, 글루코스 생성을 저하시키는 작용제는 메트포르민(metformin) [예를 들어, 글루코파지(Glucophage), 글루메트자(Glumetza)]이다. 또 다른 실시양태에서, 인슐린의 췌장 생성과 방출을 자극하는 작용제는 글리피지드(glipizide) [예를 들어, 글루코트롤(Glucotrol), 글루코트롤 XL], 글리부리드(glyburide) [예를 들어, 디아베타(DiaBeta), 글리나제(Glynase)] 및 글리메피리드(glimepiride) [예를 들어, 아마릴(Amaryl)]이다. 하나의 다른 실시양태에서, 탄수화물의 효소적 붕괴를 차단시키거나 또는 인슐린 감수성을 증가시키는 작용제는 피오글리타존(pioglitazone) [예를 들어, 악토스(Actos)]이다. 또 다른 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드, Fc 융합 단백질 및 효능제를 메트포르민에 대한 다음 대체물 중 하나와 병용할 수 있다: 시타글립틴(sitagliptin) [예를 들어, 자누비아(Januvia)], 삭사글립틴(saxagliptin) [예를 들어, 온글리자(Onglyza)], 레파글리니드(repaglinide) [예를 들어, 프란딘(Prandin)] 및 나테글리니드(nateglinide) [예를 들어, 스타르릭스(Starlix)], 엑세나티드(Exenatide) [예를 들어, 비에타(Byetta)] 및 리라글루티드(liraglutide) [예를 들어, 빅토자(Victoza)]. 또 다른 실시양태에서, IL-22 폴리펩티드, Fc 융합 단백질 및 효능제를 경구 혈당강하제, 예를 들어 술포닐우레아와 병용한다.
임신성 당뇨병 또는 대사 증후군의 경우에는, 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드, Fc 융합 단백질 및 효능제를 경구 혈당 조절 의약과 병용한다. 한 실시양태에서, 상기 의약은 글리부리드이다.
병용 요법은 "상승 효과"를 제공하고 "상승적"인 것으로 입증될 수 있는데, 즉 활성 성분들을 함께 사용한 경우에 달성된 효과가, 이들 화합물을 별개로 사용한 경우에 비롯되는 효과들의 합 보다 더 크다. 상승적 효과는 활성 성분들을 (1) 조합된 단위 투여 제제로 공동-제제화하고 동시에 투여 또는 전달하는 경우; (2) 별개의 제제로서 교대로 또는 나란히 전달하는 경우; 또는 (3) 일부 다른 요법에 의한 경우에 획득될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우, 상승적 효과는 이들 화합물을, 예를 들어 별개의 주사기에 상이한 주사제로써 순차적으로 투여 또는 전달하는 경우에 획득될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는, 각 활성 성분의 유효 투여량을 순차적으로, 즉 일련으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는, 둘 이상의 활성 성분의 유효 투여량을 함께 투여한다.
상기 언급된 바와 같은 병용 요법은 병용 투여 (2가지 이상의 치료제가 동일한 제제 또는 별개의 제제 내에 포함된다), 및 별개 투여를 포괄하는데, 이러한 경우에는, 본 발명의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 투여가, 부가 치료제(들)의 투여 이전, 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다. 한 실시양태에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 투여와 부가 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내, 또는 약 1주, 2주 또는 3주 이내, 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이내에 일어날 수 있다.
본 발명의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질 (및 어느 부가 치료제)은 비경구, 폐내, 국소 및 비내를 포함한 적합한 어떠한 수단에 의해서도 투여할 수 있고, 국부 치료의 경우에는 필요에 따라, 병변내 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로는 투여가 단기인지 만성인지에 따라서, 예를 들어 주사에 의한 적합한 모든 경로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다. 단일 투여, 또는 각종 시점 전반에 걸친 수회 투여, 거환 투여 및 펄스 주입을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 좋은 의료 행위에 일치하는 방식으로 제제화, 용량화 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려되는 요인들은 치료하고자 하는 특별한 장애, 치료하고자 하는 특별한 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 기타 요인을 포함한다. IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 해당 장애를 예방 또는 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 한 가지 이상의 작용제와 반드시 제제화될 필요는 없지만, 임의로 제제화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 융합 단백질의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 좌우된다. 이들은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용되거나, 또는 실험적/임상적으로 적당한 것으로 결정되는 모든 투여량 및 모든 경로에 의해 사용된다.
질환을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질의 적당한 투여량 (단독으로 사용되거나 또는 한 가지 이상의 기타 부가 치료제와 병용해서 사용되는 경우)은 치료하고자 하는 질환의 유형, Fc 영역의 유형, 상기 융합 단백질이 예방 목적으로 투여되든지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질환의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 IL-22 Fc 융합 단백질에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여에 의해서든지 아니면 연속되는 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg) 또는 약 0.1 ㎍/kg 내지 1.5 mg/kg (예를 들어, 0.01 mg/kg 내지 1 mg/kg)의 IL-22 Fc 융합 단백질이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 상태에 따라서 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 일반적으로 목적하는 질환 증상의 억제가 이루어질 때까지 치료를 지속할 것이다. IL-22 Fc 융합 단백질의 한 가지 예시되는 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 특정의 기타 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 및 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위를 포함한다. 따라서, 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 모든 조합) 중 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 국소 상처 치유의 경우에는, 상처 면적 1 ㎠당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg, 상처 면적 1 ㎠당 약 0.05 mg 내지 5 mg, 상처 면적 1 ㎠당 약 0.01 mg 내지 약 1 mg, 상처 면적 1 ㎠당 약 0.05 mg 내지 약 0.5 mg, 상처 면적 1㎠당 약 0.01 mg 내지 약 0.5 mg, 상처 면적 1 ㎠당 약 0.05 mg 내지 약 0.2 mg, 또는 상처 면적 1 ㎠당 약 0.1 mg 내지 약 0.5 mg (또는 그의 모든 조합) 중 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 0.01 mg/상처 면적 ㎠, 0.02 mg/㎠, 0.03 mg/㎠, 0.04 mg/㎠, 0.05 mg/㎠, 0.06 mg/㎠, 0.07 mg/㎠, 0.08 mg/㎠, 0.09 mg/㎠, 0.1 mg/㎠, 0.15 mg/㎠, 0.2 mg/㎠, 0.25 mg/㎠, 0.3 mg/㎠, 0.4 mg/㎠, 또는 0.5 mg/㎠ 중 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주 마다 투여할 수 있다 (예를 들어, 이로써 환자에게 약 2회 내지 약 20회 용량, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 IL-22 Fc 융합 단백질이 투여된다). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 다음, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 기타 투여량 요법도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 유사한 투여량 범위가 IL-22 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
상기 제제 또는 치료적 방법 중 어느 것도 IL-22 Fc 융합 단백질 대신 또는 IL-22 Fc 융합 단백질에 덧붙여, 본 발명의 접합체를 이용하여 수행할 수 있는 것으로 이해된다.
J. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 이러한 제조품은 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용제 봉지 등을 포함한다. 용기는 각종 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데에 유효한 조성물 만을 보유하고 있거나, 또는 이러한 조성물을 또 다른 조성물과 병용해서 보유하고 있고, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태를 치료하는 데에 사용된다는 것을 표시한다. 더욱이, 제조품은 (a) 그 내부에 특정 조성물을 함유하고 있는 제1 용기 (이 조성물은 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다); 및 (b) 그 내부에 특정 조성물을 함유하고 있는 제2 용기 (이 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제조품은 상기 조성물을 사용하여 특별한 상태를 치료할 수 있다는 것을 표시한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예컨대 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조품 중 어느 것도 IL-22 Fc 융합 단백질 대신 또는 IL-22 Fc 융합 단백질에 덧붙여, 본 발명의 접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
K. 스크리닝 검정 및 동물 모델
실시예 섹션에 예시된 바와 같이, IL-22, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 효능제는 IBD, 심혈관계 질환 또는 상태 및 대사 증후군의 각종 세포-기반 검정 및 동물 모델에서 평가할 수 있다.
재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 관심 유전자의 코딩 부분을, 트랜스제닉 동물을 생성하기 위한 표준 기술을 이용하여 관심 동물의 게놈 내로 도입함으로써 조작할 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로서 제공될 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지, 및 비-인간 영장류, 예를 들어 비비, 침팬지 및 기타 원숭이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 트랜스유전자를 상기 동물 내로 도입하는 것으로 당해 분야에 공지된 기술은 전핵 미소주사 (Hoppe and Wanger, 미국 특허 번호 4,873,191); 생식세포계 내로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전이 (예를 들어, 문헌 [Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]]); 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화 (문헌 [Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]]); 배아의 전기천공 (문헌 [Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814 [1983]]); 정자-매개된 유전자 전이 (문헌 [Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]])를 포함한다. 고찰을 위해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,736,866을 참조할 수 있다.
본 발명의 목적상, 트랜스제닉 동물은 그들의 세포의 일부에서만 트랜스유전자를 수반하는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 이러한 트랜스유전자는 단일 트랜스유전자로서 통합될 수 있거나, 또는 콘카타머(concatamer), 예를 들어 두부-대-두부 또는 두부-대-미부 직렬로 통합시킬 수 있다. 트랜스유전자를 특별한 세포 유형 내로 선택적으로 도입하는 것은 또한, 예를 들어 문헌 [Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 623-636 (1992)]의 기술에 따라서 가능하다.
트랜스유전자를 트랜스제닉 동물에서 발현시키는 것은 표준 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 상기 트랜스유전자의 통합을 검증할 수 있다. 이어서, 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 mRNA 발현 수준을 분석할 수 있다.
상기 동물을 대상으로 하여 적당한 병리상태, 예컨대 심혈관계 질환 병리상태에 관한 징후를 알아보기 위하여, 예를 들어 아테롬성 경화성 플라크 조직량 및 혈관 기능을 결정하기 위한 조직학적 조사 및/또는 영상화 또는 초음파 분석에 의해 추가로 조사할 수 있다 (다음 실시예 참조). 차단 실험을 수행할 수도 있는데, 여기서는 트랜스제닉 동물을 IL-22, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 후보 효능제로 처리하여 아테롬성 경화성 플라크 형성에 대한 효과의 정도 (플라크 형성의 크기, 수 및 정도 포함)를 결정한다. 이들 실험에서는, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 차단 항체를 상기 동물에게 투여하고, 관심 생물학적 효과를 모니터링한다.
또 다른 한편으론, IL-22 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와, 녹아웃 동물의 배아 세포 내로 도입된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 간의 상동 재조합의 결과로서, IL-22를 코딩하는 결함있거나 변경된 유전자를 갖는 "녹아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, IL-22를 코딩하는 cDNA를 이용하여, 확립된 기술에 따라서 IL-22를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. IL-22를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 또는 또 다른 유전자, 예컨대 통합을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 선택 마커를 코딩하는 유전자로 대체시킬 수 있다. 전형적으로, 변경되지 않은 플랭킹 DNA (5' 말단과 3' 말단 둘 다에서)의 수 킬로염기가 벡터 내에 포함된다 (예를 들어, 상동 재조합 벡터의 설명을 위해서는, 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)]을 참조할 수 있다). 벡터를 배아 줄기 세포주 내로 도입하고 (예를 들어, 전기천공에 의함), 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 이어서, 이와 같이 선택된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포 내로 주사하여 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아를 적합한 거짓 임신된 암컷 양육 동물 내로 이식하고, 상기 배아를 출산시켜 "녹아웃" 동물을 창출시켰다. 그들의 생식 세포계 내에 상기 상동 재조합된 DNA를 정착시킨 자손을 표준 기술에 의해 확인하고 이를 이용하여, 동물의 모든 세포가 상기 상동 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시킬 수 있다. 녹아웃 동물을 대상으로 하여, 예를 들어 특정의 병리학적 상태에 대항하여 방어할 수 있는 그들의 능력, 및 IL-22 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 상태의 발생에 관하여 명확히 규명할 수 있다.
따라서, IL-22 또는 그의 잠재적 효능제의 생물학적 활성을 뮤린 IL-22 녹아웃 마우스에서 추가로 연구할 수 있다.
전술된 서면 설명은 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 다음 실시예는 단지 예시 목적으로 제공된 것이고, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외에도, 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 통상의 기술자에게는 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려해 볼때, 각종의 기타 실시양태을 실시할 수 있고, 이 실시예는 청구범위의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다.
실시예 1 - IL-22 Fc 융합 단백질의 클로닝 , 발현 및 정제
일반적인 분자 클로닝 및 단백질 정제 기술이 다음 실험에 적용될 수 있다.
i. 클로닝
완전한 길이의 인간 IL-22를 인간 결장 cDNA 라이브러리 (제넨테크)로부터 클로닝하였다. 다음 프라이머를 이용하고 중복 PCR 기술을 사용하여, 인간 IgG1 또는 IgG4 IL-22Fc 융합 단백질을 발현하는 구조물을 본 실험에 대해 생성시켰다:
IL-22 Fc 융합 IgG1 정배향 프라이머:
TTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGC (서열 52),
IL-22 Fc 융합 IgG1 역배향 프라이머:
AGGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG (서열 53),
IL-22 Fc 융합 IgG4 정배향 프라이머:
TTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGC (서열 54),
IL-22 Fc 융합 IgG4 역배향 프라이머:
AGGTCGACTTATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG (서열 55). PCR 생성물을 발현 벡터 pRK5.sm (제넨테크) 내로 클로닝하였다. 리더 서열 (또는 신호 펩티드)을 세포에서 절단시켰는데, 성숙한 IL-22 Fc 융합은 리더 서열을 함유하지 않았다. 인공 링커를 수반하는 클론을, 상기 링커 서열을 함유하는 프라이머를 이용하여 클로닝하였다. 다음 프라이머를 이용하여 돌연변이 유발 PCR에 의해 N297G 돌연변이를 추가로 도입하였다: IgG1 N297G 정배향 프라이머: GCG GGA GGA GCA GTA CGG AAG CAC GTA CCG TGT GG (서열 56), IgG1 N297G 역배향 프라이머: CCA CAC GGT ACG TGC TTC CGT ACT GCT CCT CCC GC (서열 57), IgG4 N297G 정배향 프라이머: ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC GGA AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC (서열 58), 및 IgG4 N297G 역배향 프라이머: GAC GCT GAC CAC ACG GTA CGT GCT TCC GAA CTG CTC CTC CCG CGG CTT TGT (서열 59). 모든 IL-22Fc 구조물의 서열은 DNA 서열 분석함으로써 확인하였다.
ii. 세포 배양
CHO 세포를 37℃ 및 5% CO2 하에 설정된 인큐베이터에서 배양물을 매주 2회 0.3 x 106개 세포/ml로 분할시킴으로써 현탁액에서 성장시켰다.
iii. IL-22 Fc 융합 단백질의 CHO 세포 내로의 형질감염 및 단백질 발현
CHO 세포를 720 mL 배양 배지에서 1.23 x106개 세포/ml로 시딩하였다. 형질감염 복합체 (80 mL 혈청 무함유 배지 중의 1.6 mL PEI + 800 ㎍ DNA)를 10분 동안 인큐베이션한 후 상기 세포에 가하였다. 이 배양물을 33℃, 5% CO2 하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 14일 동안 추가로 배양한 후, 배양물의 현탁액을 원심분리를 통하여 수거하였다. 일시적 CHO 적응용 배지 (상기로부터의 상등액)를, Mab 선택 슈어 [MabSelect Sure (GE 헬스케어 (Healthcare))] 단백질 A 친화 칼럼을 이용하여 정제하였다. 낮은 pH 하에서의 용출액을 pH 5.0으로 중화시키고, 겔 여과 칼럼 (GE 헬스케어)을 통하여 추가로 정제하였다. 용출된 피크를 모으고, 공식화한 다음, 멸균성 여과하였다. 상기 융합 단백질의 Fc 영역의 글리코실화 상태를 다음에 논의된 바와 같은 질량 분광측정법에 의해 분석하였다.
iv. IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하는 안정한 클론의 확립
IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를, 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 CD [인비트로젠(Invitrogen)]를 이용하여 형질감염시킴으로써 CHO 세포 내로 도입하였다. 형질감염 후, 세포를 원심분리시키고, 혈청 무함유 선택 배지 내로 재도말하였다. IL-22 Fc의 분비를 알아보기 위하여 단리물을 선택하였다. 이어서, ELISA에 의해 확인된 바와 같은 가장 높은 역가를 나타내는 클론을 모으고, 생산을 위해 그 크기를 조정하였다.
v. 이. 콜라이에서의 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현
이. 콜라이 발효 공급 원료를 균질화시키고, 0.4% w/w PEI pH 6.7로 적응시킨 다음, 원심분리하였다. Mab 선택 슈어 (GE 헬스케어) 단백질 A 친화 칼럼을 이용하여 농축물을 정제하였다. 낮은 pH 하에서의 용출액을 pH 5.0으로 중화시키고, 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 추가로 정제하였다. 분획을 모으고, 공식화한 다음, 멸균성 여과하였다.
실시예 2 - IL-22 Fc 융합 단백질은 Fc 영역에서 고 비율 ( % )의 아푸코실화 를 나타내었다
본 연구에서는, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 부분의 글리코실화 상태를 조사하였다. 일시적으로 형질감염된 세포로부터 정제된 IL-22 Fc 융합 단백질의 샘플을 37℃ 하에 2시간 동안 트립신 (1:25 트립신:IL-22 Fc, w/w)으로 분해하였다. 샘플을 트리플루오로아세트산으로 산성화하여 0.1%의 최종 농도가 되도록 하였고, 이를 수중 0.05% TFA로 평형시킨 가열된 C18 칼럼 (PLRP-S, 1000A 8 ㎛, 애질런트)상으로 주사하였다. 이 분해 생성물을 20분에 걸쳐 선형 아세토니트릴 구배 (5 내지 60%)에 의해 분리시켰다. 칼럼을 애질런트 6520B TOF 질량 분광측정기의 전기분무 오리피스에 직접 연결시키고, 용출된 분획의 질량을 양성 이온 모드로 결정하였다. 이들 융합 구조물의 Fc 부분은 이들 분해 조건 하에 트립신에서 안정적이기 때문에, 각종 IL-22 융합물의 탄수화물 상태를 직접적으로 비교할 수 있었다.
도 2에 도시된 바와 같이, IL-22 IgG1 및 IgG4 Fc 융합 단백질 둘 다는 비정상적으로 고 수준의 아푸코실화를 나타내었다. 전형적인 모노클로날 IgG1 항체의 글리코실화된 Fc에 대해 예상된 질량은 도 2에서 패널 a의 53296, 53458 및 53620 Da로서 표지된 것들일 것이다. 전형적으로, Fc의 각 암 상의 코어 탄수화물 종은 각각 다음 탄수화물 조성으로 이루어질 것이다: 4 N-아세틸 글루코사민, 3 만노스 및 1 푸코스 당 종 (패널 a 중에 53296로 표지된 피크). 1개 또는 2개의 갈락토스 당을 부가하면, 53458 및 53620 Da로 각각 표지된 피크가 생성될 것이다 (패널 a). Fc의 한 암 상에 푸코스가 누락된 당 부분을 함유하는 무시할만한 양의 분자를 검출하였다 ("-1 푸코스").
놀랍게도, Fc의 한 암 상에 푸코스가 누락된 ("-1 푸코스") 당 잔기 및 Fc의 양 암 상에 푸코스가 누락된 ("-2 푸코스") 당 잔기를 포함한, CH2 도메인이 글리코실화되는 상이한 구조물의 인간 IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질이 모두 고 수준의 아푸코실화를 나타냈다 (도 2, 패널 b-d 참조). 이들 아푸코실화된 분자는 관찰된 총 종의 약 30% 정도로 높게 차지하였다. 아푸코실화는 IL-22 IgG1 Fc 융합의 바람직하지 못한 효과기 활성을 증가시킬 수 있다.
IgG4는 IgG1과 비교해서 덜한 효과기 기능을 지닌 것으로 공지되어 있다. 예상치 못하게도, 질량 분광측정 분석 결과 또한, 인간 IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질의 트립신-분해된 Fc 영역에서 "-1 푸코스" 및 "-2 푸코스" 글리코실화된 종이 나타났다. 이들 아푸코실화된 분자는 관찰된 총 종의 50% 초과를 차지하였다 (도 2, 패널 e 참조). 아푸코실화된 항체는 이들 IL-22 Fc 융합 단백질에 바람직하지 못한 특성인 ADCC 또는 CDC 세포독성 활성을 많이 증강시켰다.
연속해서, 정상적으로 글리코실화될 것인 Fc 내의 잔기 (N297)를 글리신으로 돌연변이시킴으로써 (N297G), 정상 코어 당의 부착을 방지시킨 2개의 부가 IL-22 Fc 분자 (1개는 IgG1 Fc를 함유하고, 다른 1개는 IgG4 Fc를 함유한다)를 구축하였다. 이들은 그들의 Fc 부분 상에 어떠한 당도 결여된 것으로 밝혀졌고, 둘 다는 그들의 아미노산 서열에 근거하여 예상된 Fc 분자량을 갖고 있었다 (도 2, 패널 f 및 g).
요약하면, IgG1 또는 IgG4 Fc 융합인 인간 IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 고 수준의 아푸코실화를 나타냈는데, 이로써 IL-22 치료제로서 사용하기에 바람직하지 못한 특성인 ADCC 또는 CDC 활성이 증가될 수 있다. 따라서, 비-글리코실화된 변이체가 추가의 연구에서 시험되었다.
실시예 3 - IL -22 IgG1 IgG4 Fc 융합 단백질 시험관내 활성 검정
IL-22는 IL-22 수용체 복합체와 맞물려서 Jak-Stat 신호 전달 경로를 활성화시킨다. STAT3 활성화는 IL-22 매개된 신호 전달 경로에서 우세한 현상이다. 본 실험에서는, 루시퍼라제 리포터 검정을 이용하여 IL-22 Fc 융합 단백질의 시험관내 활성을 측정하였다. 인간 IL-22 수용체 복합체 IL22R1 및 IL10R2를 과발현하도록 HEK 293 세포를 조작하였다. 1일째에, 1x105개 293 세포를 0.4 ml 둘벡코(Dulbecco) 변형된 이글 배지 (DMEM) + 10% 태아 소 혈청 (FBS) 중의 24-웰 판에 시딩하였다. 2일째에는, 0.1 ml 감소된 혈청 배지 [감소된 혈청을 수반한 깁코(Gibco) 포티-MEM은 50% 이상 감소되었다]에서 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 이용하여 STAT3-구동된 루시퍼라제 리포터 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 대조군으로 세포를 형질감염시켰다. 이러한 STAT3 루시퍼라제 리포터 구조물은 시스-유도성 요소 (SIE) 및 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자의 직렬식 반복 서열을 함유하는 STAT3-반응성 루시퍼라제 리포터 구조물을 함유한다. 3일째에, 일시적 또는 안정한 CHO 클론에 의해 생성된 IL-22 Fc 융합 단백질을 0.5 ml 배지에서 상이한 농도로 적정하였고, 형질감염된 세포의 상단에 가하였다. 4일째에는, 배지를 꺼내고, 세포를 100 ㎕ 수동 용해 완충액 (이중-루시퍼라제 리포터 1000 검정 시스템에 의해 제공됨)으로 용해시켰다. 20 마이크로리터의 세포 용해물을 96-웰 판으로 옮기고, 광도계 [프로메가(Promega)] 상에서 이중-루시퍼라제 리포터 1000 검정 시스템으로 분석하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 라졸라)에서 용량-의존적 활성에 근거하여 EC50을 계산하였다. 상이한 IL-22 Fc 융합 구조물에 대한 EC50 값이 다음 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
Figure pct00007
각 설계의 활성, 안정성 및 수율을 조사하기 위하여 상이한 길이와 서열의 링커를 이용하여 다수의 IL-22 Fc 융합 단백질을 구축하였다. 천연 IgG 서열을 수반한 링커가 면역원성의 잠재적 위험을 최소화하는 데 바람직하지만, 우수한 시험관내 활성을 나타낸 외인성 서열을 수반한 링커가 본 발명에 고려되고 포괄되었다.
DKTHT 링커 (서열 32)를 함유하는 IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질을 STAT3 루시퍼라제 검정에서 시험하였다 (표 2 참조). 상기 융합 단백질의 EC50을 개선하기 위하여, 링커 길이를 5개 아미노산에서 천연 IgG1 서열 EPKSCDKTHT (서열 33)을 함유하는 10개 아미노산으로 증가시켰다. 그러나, 이로써 생성되는 IL-22 Fc 융합 단백질은 저하된 시험관내 활성을 나타내었다 (표 2 참조). 놀랍게도, 심지어 1개 아미노산 정도의 아미노산 길이를 증가시킨 것 [VEPKSCDKTHT (서열 34)]이 IL-22 융합 단백질의 활성을 개선시켰다. 링커 길이를 추가로 증가시키면, 활성이 추가로 개선되었다 (표 2 참조).
별개의 실험에서는, EPKSCDKTHT 내의 Cys를 Ser으로 변화시켜 디술피드 결합 형성의 잠재성을 제거하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, 링커 EPKSSDKTHT (서열 40)를 수반한 IL-22 Fc 융합이 Cys 잔기를 수반한 모 링커 서열과 비교해서 개선된 활성을 나타내었다. 상류 서열을 IgG1의 CH1 도메인 내로 혼입시킨 보다 긴 링커 서열이 활성을 추가로 개선시켰다. N297G 돌연변이를 수반한 구조물은 야생형 대응물과 비교해서 유사한 EC50 값을 나타내었다. IL-22 IgG1 (N297G) Fc 융합 단백질 (서열 12) 및 IL-22 IgG4 (N297G) Fc 융합 단백질 (서열 8)이 추가 연구를 위해 선택되었다.
안정한 클론으로부터 발현된 인간 IL-22 IgG1 (N297G) Fc 융합 단백질 (서열 12) 또는 IL-22 IgG4 (N297G) Fc 융합 단백질 (서열 8)의 시험관내 활성을 동일한 검정에서 시험하였다. 도 4에서의 데이터는 대표적인 결과를 보여준다. IL-22 IgG1과 IgG4 Fc 융합 단백질 둘 다는 용량-의존적 방식으로 STAT3 활성을 유도시켰다. 양 IL-22 Fc 융합 단백질은 유사한 효력을 나타내었다. 일시적으로 형질감염된 세포로부터 발현된 IL-22 Fc 융합 단백질은 유사한 결과를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 대조군으로서, CHO 세포에서 생성된 천연 IL-22 단백질을 동일한 검정에서 시험하였는데, IL-22 Fc 융합 단백질 보다 2배 내지 3배 더 높은 효력이 나타났다.
요약하면, IgG1과 IgG4 IL-22 Fc 융합 단백질 둘 다는 STAT3 루시퍼라제 검정에 의해 입증된 시험관내 활성을 나타내었다. 추가로, 상이한 길이와 서열의 링커를 수반한 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22R 매개된 루시퍼라제 활성을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 - IL -22 Fc 융합 단백질은 마우스에서 DSS-유도된 결장염의 증상을 저하시켰다
덱스트란 황산나트륨 (DSS)-유도된 결장염은 통상적으로 허용된 마우스 결장염 모델이다. DSS-함유 물을 경구 투여하면, 결장 상피 세포가 신속하게 손상되고, 병리학자에 의한 면역조직화학적 (IHC) 염색 또는 조직학 임상 스코어에 의해 명확히 규명된 실질적인 체중 손실과 결장 상피 구조 붕괴가 유발된다. 이러한 개념 증명 연구에서, DSS-유도된 결장염에 대한 IL-22 Fc 융합 단백질의 효과를 시험하였다.
C57BL/6 마우스에서, 0일째부터 시작하여 연속 5일 동안 3.5% DSS를 함유하는 음료수로 결장염을 유도시켰다. 인간 IL-22 Fc 융합 단백질의 대용물인 마우스 IL-22 IgG2a Fc (서열 60)를 -1일, 1일, 4일 및 6일째에 복강내 경로를 통하여 5 mg/Kg 투여하였다. 상기 동물의 체중을 매일 측정하였다. 8일째에, 모든 동물을 희생시키고, IHC 염색과 수동 조직학적 스코어 둘 다를 통하여 결장 조직학을 연구하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, DSS 유도된 결장염은 현저한 체중 손실 (도 5a), 결장 상피 손상 및 결장 염증 (도 5b) 및 고 조직학 스코어 (도 5c)와 연관이 있다. IL-22 Fc 처리는 체중 손실을 상당히 방지하였고, 상피 완전성을 복원하였으며, 염증을 감소시켰고 조직학 스코어를 감소시켰다 (도 5 참조). IL-22 Fc의 효능은, 본 연구에서 상당한 체중 손실을 유발시켰던 스테로이드 표준 치료 (SOC)인 덱사메타손의 효과를 능가하였다.
실시예 5 - IL -22 Fc 융합 단백질 약동학 연구
시노몰구스 원숭이에서 시험적인 안전성 및 PKPD 연구가 기관내 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 이러한 연구는 찰스 리버 라보라토리즈 [Charles River Laboratories (CRL)] 전임상 서비스 (미국 네바다주 레노)에서 수행하였다. CRL 스톡으로부터의 총 15마리의 수컷 시노몰구스 원숭이 (4 내지 5 kg)를 무작위로 5개 군 (군당 n=3)으로 할당하였다. 군 1에서의 동물에게는 1일 및 8일째에 대조군 비히클의 정맥내 용량을 투여하였다. 군 2 및 3에서의 동물에게는 1일 및 8일째에 IL-22-Fc IgG1 0.15 및 1.5 mg/kg의 단일 정맥내 거환 용량을 각각 투여하였다. 군 4 및 5에서의 동물에게는 1일 및 8일째에 IL-22-Fc IgG4 0.15 및 1.5 mg/kg의 단일 정맥내 거환 용량을 각각 투여하였다. 43일까지 PK 및 PD 분석하기 위하여 각 시점에서 혈청 샘플을 수집하고, IL-22-Fc의 농도를 ELISA에 의해 평가하였다.
시노몰구스 원숭이 혈청 중의 인간 IL-22-Fc를 분석하기 위하여, ELISA 검정에서 포획 항체로서 마우스 항-인간 IL-22 mAb (제넨테크)를 사용하였다. 재조합 IL-22 Fc 융합 단백질을 사용하여 표준 곡선을 발생시켰다. 검정 완충액에서 500 ng/mL로 희석된 HRP-접합된 항-인간-Fcγ-팬 뮤린 mAb (제넨테크)와 함께 1시간 인큐베이션하는 동안 판-결합된 IL-22-Fc를 검출하였다. 최종 세척 후, 테트라메틸 벤지딘 퍼옥시다제 기질 [모스, 인크. (Moss, Inc.; 미국 메릴랜드주 패서디나)]을 가하고, 15분 동안 색상을 전개하며, 1 M 인산을 이용하여 상기 반응을 중지시켰다. 미세판 판독기를 이용하여 620 nm 참조로 450 nm 하에 상기 판을 판독하였다. IL-22 Fc 융합 표준 곡선의 4-파라미터 피트로부터 IL-22 Fc 융합의 농도를 계산하였다.
PK 데이터 계산을 위하여, 연구 1일째를 PK 0일째로 전환시켜 용량 투여의 시작을 표시하였다. 살아있는 동안의 투여 일 이후의 모든 시점은 연구일-1로서 계산한다. 윈놀린(WinNonlin®), 버전 5.2.1 [파르사이트 (Pharsight; 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)]로의 2 구획 분석을 이용하여, 각 동물에 대한 혈청 농도 데이터를 분석하였다.
IL-22-Fc의 혈장 농도는 짧은 분포기와 긴 말단 소실기를 수반하는 정맥내 투여 (0.15 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 후 이중-지수 감소를 나타내었다 (도 6 참조). 중앙 구획으로부터의 IL-22 Fc의 선형 제거를 나타내는 2-구획 모델은 상기 용량 둘 다에 대한 약동학적 프로파일을 잘 설명하였는데, 이는 이들 용량 범위에서 무시할만한 수준의 표적 매개된 경향을 제안한다.
상기 2-구획 분석에 의해 평가된 최대 혈청 농도 (Cmax)와 혈청-농도-시간 곡선 하의 면적 (AUC)은 대략 선형이고 용량 비례적이었다 (표 3 참조). 이러한 용량 비례적 역학은 시험된 용량에서의 IL-22R 포화를 제안하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, IL-22 IgG4 Fc 융합은 예상치 못하게도, IgG1 Fc 융합과 비교해서 2배 더 느린 CL과 2배 초과하여 더 높은 노출을 나타내었다. 특별한 기전에 제한되는 것은 아니지만, IgG1 융합의 더 신속한 청소율 (CL)은 IgG1 융합 구조물의 덜한 안정성에 기인될 수 있는데, 이는 IL-22 IgG1 Fc 융합의 2배 초과하여 더 신속한 CL이 주로, 더 많은 용적의 분포에 의해 구동되는 것으로 여겨지기 때문이다. IgG1 융합과 IgG4 융합의 베타 반감기는 4 내지 5일로 유사하였다.
[표 3]
Figure pct00008
실시예 6 - 시노몰구스 원숭이에서 IL- 22Fc의 생체내 활성의 평가
시노몰구스 원숭이 [마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)]에게, 0.15 mg/kg 또는 1.5 mg/kg의 용량 하에 표시된 바와 같이 이소형 IgG1 또는 IgG4의 IL-22 Fc 융합을 정맥내 투여하였다. IL-22 수용체에 대한 IL-22 결합으로 인해, 혈청 아밀로이드 A (SAA), RegIII/췌장염 관련 단백질 (PAP; PancrePAP로 불리우기도 함), 및 리포폴리사카라이드 결합성 단백질 (LPS-BP)을 포함한, 몇 가지 유전자의 발현이 촉발된다. 이러한 연구에서는, SAA, PancrePAP, 및 LPS-BP의 발현을 측정함으로써, IL-22 Fc 융합 단백질 생체내 활성을 분석하였다. 그래프에 표시된 바와 같이, 투여 전 및 투여 후의 특정 시간 과정에 걸쳐 혈청 샘플을 수득하였다. 라이프 디아그노스틱스 (Life Diagnostics; 미국 펜실베니아주 웨스트체스터)로부터 입수 가능한 상업적 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 키트 (카탈로그 # 3400-2)를 이용하여, 원숭이 SAA의 순환성 수준을 혈청에서 정량화하였다. 디나바이오 (Dynabio; 프랑스 마르세유)에 의해 생산된 상업적 ELISA 키트 (카탈로그 PancrePAP)를 이용하여, RegIII/PAP의 순환성 수준을 혈청에서 정량화하였다.
공인된 ELISA를 이용함으로써, 혈청 샘플 중의 지단백질 결합성 단백질 (LBP)의 수준을 결정하였다. 바이오티닐화-지단백질 [엔조 라이프 사이언스 (Enzo Life Sciences; 미국 뉴욕주 파밍데일)]을 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 판 [더모 (Thermo; 미국 일리노이주 록랜드)] 상에 코팅하였다. 재조합 인간 LBP [알앤디 시스템즈, 인크. (R&D Systems, Inc.; 미국 미네소타주 미니애폴리스)]를 본 검정에서 표준물로서 사용하였다. 항-LBP 마우스 모노클로날 항체 (더모; 미국 일리노이주 록랜드)를 이용하여 결합된 LBP 분석물을 검출하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, Fc [잭슨 임뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)]를 검출에 사용하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 [커크가드 앤 페리 라보라토리즈 (Kirkegaard & Perry Laboratories; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)]을 부가한 후, 비색 신호를 가시화하였다. 1 M 인산을 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 판 판독기 [몰레큘라 디바이스 (Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일)] 상에서 참조로서 650 nm를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 ELISA 샘플을 제조업자의 명세서에 따라서 수행하였고, 단일 희석을 두 번 되풀이하여 제조하거나 또는 4가지 일련의 희석을 단독으로 제조하였으며, 표준 곡선으로부터 농도를 외삽하였다. 각 샘플의 평균 값을 기록하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, SAA, LPS-BP, 및 RegIII/PAP 혈청 단백질 수준이 생체 내에서 IL-22Fc에 의해 유도되었다. 용량-의존적 반응이 비-인간 영장류에서 생체내 관찰되었는데, 이는 IL-22R 맞물림을 표시하고 IL-22Fc에 의한 포화를 제안한다. 대부분의 경우에, 두 번째 용량을 투여한지 24시간 후에는 혈청 단백질 수준 상의 증가가 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 혈청 SAA, LPS-BP, 및 RegIII/PAP 단백질이 최대 수준에 도달하였다는 것을 제안한다. 3가지 모든 단백질의 혈청 수준은 35일 회복 기간에 걸쳐 서서히 감소되었는데, 이는 대부분의 동물에서 기준선으로 돌아왔다. IgG4 고 용량 군에서의 RegIII/PAP 수준은 예외인데, 이는 42일 과정 전반에 걸쳐 상승된 채로 있는 것으로 여겨진다. 이는 IL-22 IgG1 Fc 융합 단백질과 비교해서 IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질에 대한 AUC에 의한 증가된 노출과 개선된 PK를 반영할 수 있다.
실시예 7 - 아테롬을 발생시키기 쉬운 마우스 ( Ldlr -/- Apobec1 -/-)의 IL-22 치료
최근 연구 결과, 병원성 미생물에 대항한 숙주 방어에 있어서의 IL-22의 역할이 밝혀졌다. 점막 조직 생체 항상성과 면역에 대한 그의 유리한 효과로 인해, 본 발명자들은 IL-22 치료가 내독소증 및 그의 병리학적 결과 (아테롬 발생성 이상지질혈증, 전신 염증 포함)를 경감시킬 수 있고, 궁극적으로는 아테롬성 경화성 질환 및 관련 장애 (당뇨병 포함)의 진행을 느리게할 수 있었다고 추측하였다.
이러한 가설을 시험하기 위하여, 아테롬을 발생시키기 쉬운 마우스 (Ldlr-/-Apobec1-/-)를 IL-22-Fc 구조물로 처리하였다. 이들 마우스에게는 LDL 수용체 및 합성 독점적 아포B100이 결여된다. 이 모델은 인간 가족성 고콜레스테롤혈증과 연관된 병리생리학을 훨씬 많이 반복 발생한다는 점에서 독특하다. 구체적으로 언급하면, 차우 식이시, 이들 마우스에게 상승된 LDL 콜레스테롤, 인간과 유사한 콜레스테롤의 분포를 나타내는 지질 프로파일, 및 진행성 플라크 형성이 발생된다. 추가로, Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스는 인슐린 저항성, 전신 염증, 진행성 플라크 조직량, 및 내피 세포 기능이상을 포함한, 그의 심혈관계 질환에 기여하는 측정 가능한 위험 요인을 갖고 있다. 본 실시예에서 본 발명자들은 IL-22-Fc 융합 단백질로 3개월 치료하면, 이들 동물의 심혈관계 건강이 현저하게 개선될 수 있고 아테롬성 경화성 진행이 저하될 수 있다는 것을 입증하였다.
재료 및 방법
마우스 IL-22- Fc 구조물. 본 실시예에서 사용된 IL-22-Fc 구조물 및 폴리펩티드는 전형적으로, 도 32a에 도시된 바와 같은 마우스 IL-22-마우스-Fc 융합 단백질 (서열 73) (및 도 32b에 도시된 바와 같은, 그를 코딩하는 DNA 서열, 서열 72)이었다. 플라스미드 DNA를 일시적으로 형질감염시킴으로써 CHO 세포에서 단백질을 생성하였다. 상기 융합 단백질을, 단백질 A 칼럼 상에서 세포 상등액을 수행한 다음, 이온 교환 크로마토그래피하여 응집체를 제거함으로써 정제하였다. C57B6 마우스에 10 mg/kg IL-22-Fc의 단일 용량을 주사한 다음, 명시된 시간 간격으로 상기 마우스로부터 혈청을 수득함으로써, 혈청 반감기를 평가하였다. 항-IL-22 mAb를 이용하여 샌드위치 ELISA함으로써 IL-22-Fc의 혈청 수준을 결정하였다. Lrlr-/-Apobec1-/- 이중 KO 마우스를 이용하여 생체내 연구하기 위하여, 마우스 IL-22-Fc 구조물을 활용하였다. 마우스 서열이 실시예에 제시되고 사용되어 왔지만, 각종 실시양태에서는 인간 서열이 이러한 마우스 서열을 대체할 수 있는 것으로 예상된다.
마우스 연구. Ldlr-/-Apobec1-/- 이중 KO 마우스를 제넨테크 사육 시설에서 사육하였고, WT C57BL/6 마우스는 잭슨 라보라토리 (Jackson Laboratory)로부터 구입하였다. 마우스는 다음 차우에 접근할 수 있으면서 12시간 조명/12시간 암실의 표준 주기 하의 21℃에서 병원체-무함유 동물 시설에 유지시켰다: 표준 설치류 차우 [랩다이어트(Labdiet) 5010, 지방으로부터 12.7% 칼로리] 또는 고 지방, 고 탄수화물 식이 [하를란 텍래드(Harlan Teklad) TD.03584, 지방으로부터 58.4% 칼로리] 및 무제한으로 공급되는 물. C57BLKS/J 배경 내의 db/db 마우스는 암컷이었고, 본 연구에 사용된 다른 마우스는 모든 수컷이었다. 마우스 IL-22-Fc 또는 대조군 IgG 항체를 6개월 생부터 시작하여 3개월 동안 매주 50 ㎍을 복강내 경로로 투여하였다 (총 12주 용량).
아테롬성 경화성 조직량의 분석. 고 해상도 X선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영술을 이용하여, 아테롬성 경화성 병변 용적과 아테롬성 경화성 플라크 조성을 정량화하였다. 이산화탄소를 흡입시킴으로써 동물을 안락사시킨 다음, 심장 좌심실 내로 10 밀리리터의 인산염 완충 식염수를 관류시킨 다음, 10 밀리리터의 10% 중성 완충된 포르말린을 관류시켰다. 대동맥을 해부하고, 이를 최소 24시간 동안 10% 중성 완충된 포르말린에 침지시키며, 10% 중성 완충된 프로말린 중의 20% 요오드 기반 X선 조영제인 이소뷔(Isovue) 370 [브라코 디아그노스틱스 인크. (Bracco Diagnostics Inc.; 미국 뉴저지주 프린스턴)]의 용액에 최소 12시간 동안 옮겼다. 블로팅 드라이 후, 대동맥을 관류시키고, 저 X선 세기 배경 영상화 배지인 대두 오일 [시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스)]에 침지시켰다. 45 kV의 영상 포착 에너지, 160 μA의 전류, 3개 평균을 수반한 300 밀리초의 통합 시간, 및 12 마이크로미터의 영상 해상도를 나타내는 μCT40 [산코 메디칼 (Sanco Medical; 스위스 바제르도르프)]를 이용하여, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영술 영상을 획득하였다. 이로써 생성된 영상은, 반-자동화 형태학적 필터링과 사용자 규정된 영역을 이용하여 대상 용적과 대상 조성을 결정함으로써 애널라이즈(Analyze) [애널라이즈다이렉트 인크. (AnalyzeDirect Inc.; 미국 캔자스주 르넥사)]로 분석하였다.
혈관 기능의 평가. 유동 매개된 팽창과 니트로글리세린 매개된 팽창에 대한 대퇴 동맥의 초음파 조사에 의해 혈관 기능을 결정하였다. 2% 이소플루란으로 동물을 마취시키고, 20분 초음파 조사 동안 37℃ 하에 유지시켰다. 나이르(Nair)를 사용하여 뒷다리의 복부 표면으로부터의 모발을 제거하였고, 55 메가헤르츠 영상화 프로브 [비주얼소닉스 (VisualSonics; 캐나다 토론토)]을 수반한 베보(Vevo)770을 이용하여 초음파 영상화를 허용하였다. 유동 매개된 팽창을 위하여, 대퇴 동맥의 기준선 영상을 수집한 다음, 고무 밴드를 임시 피막물로서 사용하여 대퇴 동맥 혈류를 4분 동안 폐쇄시켰다. 이어서, 상기 고무 밴드를 풀어서 대퇴 동맥이 다시 흐르도록 하고, 4분 동안 매분 영상을 포착하였으며, 제조업자가 공급한 소프트웨어 도구를 이용하여 대퇴 동맥 최대 직경에 관하여 분석하였다. 니트로글리세린 매개된 팽창을 위해서는, 대퇴 동맥의 기준선 영상을 수집한 다음, 20 마이크로그램의 니트로글리세린 [박스터 (Baxter; 미국 일리노이주 디어필드)]의 복강내 주사제를 투여하고, 4분 동안 매분 영상을 포착하였으며, 제조업자가 공급한 소프트웨어 도구를 이용하여 대퇴 동맥 최대 직경에 관하여 분석하였다.
총 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 지단백질 결정. 신선한 혈청 샘플을 사용하여, 콜레스테크(Cholestech) LDX 분석 시스템 [인베르니스 메디탈 (Inverness Medical; 미국 뉴저지주 프린스턴)]을 이용하여 제조업자의 지시에 따라서 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 및 지단백질 분포를 결정하였다.
혈청 리포폴리사카라이드 측정. 동결된 혈청 샘플을 해동시키고, 내독소 무함유 물에서 100배 희석시키며, 온수 욕에서 10분 동안 90℃ 하에 인큐베이션하였다. 이어서, 엔도세이프(Endosafe)-PTS 시스템 [찰스 리버 라보라토리즈; 미국 매사추세츠주 윌밍턴)] 상에서 제조업자의 지시에 따라서 샘플을 수행하였다.
GTT : 글루코스 내성 시험. 밤새 단식시킨 후 (14시간) 1 g/kg 글루코스를 복강내 주사하는 투여 기간이 끝날 무렵 글루코스 내성 시험 (GTT)을 수행하였다. 원 터치 울트라 혈당측정기를 이용하여 글루코스 수준을 측정하였다. 4일간의 새환경 순응 기간 동안 마우스를 개별적으로 사육한 다음, 1주 동안 측정함으로써 본 연구 동안 음식 소비량을 계산하였다.
혈청 시토카인 수준의 측정. 자동화 방법을 통하여 루미넥스(Luminex) 23 멀티플렉스 패널 [바이오래드(BioRad)]을 이용하여 혈청 시토카인 수준을 측정하였다. 그 결과 중 일부는 개개의 ELISA 키트 (알앤디)에 의해 독립적으로 확인하였다. 총 콜레스테롤과 유리 지방산 (FFA) [로슈(Roche)]은 효소적 반응을 이용함으로써 결정하였다.
결과:
Ldlr -/- Apobec1 -/- 마우스는 아테롬 발생성 이상지질혈증을 정확하게 모델링 하였고, 이는 염증성 시험감염에 대해 감수성이었다. Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스 모델은 인간에서 아테롬성 경화성 질환의 특징인 광범위한 아테롬성 경화성 병변과 지단백질 수준을 나타낸다 [Powell-Braxton et al. (1998). Nat Med 4(8):934-8]. Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스의 대동맥 아치를 마이크로CT 분석한 결과, 상행 대동맥, 대동맥의 아치, 하행 대동맥, 및 팔다리 동맥의 일부를 포함한, 준비된 샘플 상에서 자동화 영상 처리 기술을 이용하여 결정된 바와 같은 아테롬성 경화성 질환의 징후가 나타났다. 이러한 기술은 또한, 지질 코어, 파열된 플라크 및 석회화의 영역을 포함한 아테롬성 경화증 조직량의 중증도와 진행에 있어서의 영역별 변동을 반영하는 고도의 이질성을 명확히 보여주었다 (도 8). CT 신호의 이질성은 상기 인간 질환의 복잡한 플라크 병리상태와 일치하는 병변의 근원적인 병리상태를 반영한다. 이러한 모델을 명확히 규명하고 식이 유도성 아테롬 발생에 대한 그의 감수성을 입증하기 위하여, 마우스 코호트를 2개월 동안 고 지방 식이로 처리하거나 또는 그들의 음료수에 프럭토스를 부가하여 처리하였다 (8% w/v). Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스는 이들 식이 변경에 대해서 감수성인 것으로 입증되었는데, 단지 적당한 수준으로 증가된 혈청 LDL를 나타냈지만, 표준 차우 식이 중인 마우스와 비교해서 총 아테롬성 경화증 조직량의 상당한 증가가 나타났다 (도 9). 이는 아테롬성 경화증 조직량의 증가가 LDL 증가 보다는 오히려 염증에 기인하는 것으로 예상된다는 것을 입증해준다. 추가로, LPS 시험감염 (0.025 mg/Kg)으로 급성 저 등급 염증 자극시키면, wt 대조군과 비교해서 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스에서 염증 유발성 마커가 현저하게 상승되었다 (도 10). 이러한 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스를 또한, 8주 동안 만성 LPS 투여 (750 ng, 복강내)에 노출시키고, 혈청 지질 프로파일과 플라크 조직량에 대하여 평가하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 만성 내독소 노출로 인해, 이상지질혈증이 발생하고 플라크 불안정성이 더 커진다.
IL-22-Fc로의 처리시, 아테롬 발생성 이상지질혈증과 대사 증후군 증상에 있어서의 개선이 Ldlr-/-Apobec1-/- 마우스에서 관찰되었다. 이들 마우스에서 차우 식이시 인슐린 저항성을 포함한, 대사 증후군의 특징이 발생한다. IL-22-Fc 처리를 이용하면, 공복 혈당이 대조군과 비교해서 감소하였고, 글루코스 청소율이 대조군과 비교해서 처리군에서 개선되었다 (도 12). 따라서, 글루코스 내성 (GTT)을 정상화시키고 공복 글루코스를 개선시키면 글루코스 생체 항상성이 개선되었다 (도 12). 공복 고콜레스테롤혈증과 먹이가 공급된 고콜레스테롤혈증 둘 다가 감소되었는데 (도 13a), 이는 먹이가 공급된 TRG 수준의 경우와 같으며 (도 13b), 지질 프로파일이 개선되었다 (도 14). 혈장 LPS 수준은 IL-22-Fc 처리 후에 감소되었다 (도 15). 이상지질혈증과 인슐린 감작의 감소 이외에도, 혈관 반응성에 의해 측정된 내피 기능 상의 개선이 관찰되었다 (도 16). 이상지질혈증에 있어서의 개선과 일치하여, 플라크 용적을 CT 분석한 결과, 대동맥 아치 및 팔머리 동맥과 대동맥 판막에 있어서의 총 아테롬성 경화성 조직량이 감소된 것으로 나타났다 (도 17a-c). 지질 프로파일과 인슐린 저항성에 있어서의 개선은 칼로리 섭취 상의 감소에 기인하지 않았는데, 이는 7일 기간에 걸쳐 측정된 음식 섭취량이 증가함에도 불구하고, 3개월 처리 동안 보통 수준이긴 하지만 통계상 유의적인 체중 감소가 발생하였기 때문이다 (도 18). 대조군의 체중은 3개월 처리 프로토콜 동안 변화되지 않았고, IL-22-Fc 처리군은 연구 시작과 종결 사이의 체중이 상당히 감소되었다 (도 18a). 처리 연구 과정 동안 7일 기간에 걸쳐 측정된 평균 1일 음식 섭취량은 대조군과 비교해서 IL-22-Fc 처리군에서 상승하였다 (도 18b).
실시예 8 - 말초 동맥 질환 모델
아테롬성 경화성 진행을 저하시키기 위하여 IL-22-Fc에 의해 IL-22 조절된 경로를 자극하는 것은 심혈관계 질환 및 관련 장애 (당뇨병 및 만성 신장 질환 포함)가 있는 대상체에 대한 잠재적으로 신규 형태의 요법이다. 심혈관계 질환은 전형적으로, 대상체의 혈관계의 한 영역에만 제한되지 않기 때문에, 관상 동맥 질환이 있는 것으로 진단되거나 또는 이러한 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 진단된 대상체가 또한, 다른 형태의 CVD, 예컨대 뇌혈관계 질환, 대동맥-장골 질환, 및 말초 동맥 질환을 발생할 위험이 있거나 또는 이러한 질환을 갖고 있는 것으로 간주된다. 상기 언급된 바와 동일한 전략을 이용하여, 마우스 말초 동맥 질환 모델을 사용하여 표적으로서 IL-22를 검증할 수 있다. IL-22-Fc 구조물을 제조하고, 상기 언급된 바와 같이 평가한다. 필요한 모든 대조군을 또한 사용한다. IL-22 효능제/길항제를 평가하는데, 그 결과는 약물 발견과 개발을 위한 표적으로서 IL-22 경로를 검증해줄 것이다.
허혈성 손상을 창출하기 위하여 대퇴 동맥 결찰에 근거한 말초 동맥 질환 (PAD) 모델을 사용한다. IL-22-Fc 구조물의 효능은 기존에 보고된 과정과 유사하게 평가한다 [Couffinhal et al., Am. J. Pathol. 152:1667 (1998); Takeshita et al., Lab. Invst. 75:487 (1996); Isner et al., Human Gene Therapy 7:959(1996)]. 이러한 말초 동맥 질환을 조정할 수 있는 IL-22-Fc의 능력을 시험하기 위하여, 다음 실험 프로토콜을 사용한다: a) (상기 언급된 방법에서와 같은) 설치류를 이용하여, 대퇴 동맥의 한쪽을 결찰시켜 뒷다리 근육에 대한 허혈성 손상을 창출시키고 (손상되지 않은 다른 뒷다리는 대조군으로서 기능한다); b) IL-22-Fc 폴리펩티드 (또는 그의 단편)를, 특정 범위의 투여량에서 2 내지 3주 동안 매주 3회 이상 상기 동물에게 정맥내 및/또는 근육내 (손상된 다리에) 전달하며; c) 바이오마커 및 조직학을 분석하기 위하여, 결찰 후 1주, 2주 및 3주째에 허혈성 근육 조직을 수집한다. 일반적으로, 평가하기 위한 파라미터 (상기와 같음)는 상기 허혈증 주변 조직의 혈관화 및 생육성을 결정하는 것을 포함하지만, 보다 구체적인 평가 파라미터, 예를 들어 피부 혈류, 피부 온도 및 인자 VIII 면역조직화학을 측정하고/하거나 내피 알칼리성 포스파타제 반응을 포함할 수 있다. 허혈증 동안의 폴리펩티드 발현은 당해 분야에 공지된 어느 계내 혼성화 기술을 이용하여 연구한다. 대조군으로서 분석하기 위하여 반대측 뒷다리의 정상 근육의 다른쪽에서 생검을 또한 수행한다.
또 다른 한편, 기타 마우스 모델을 사용한다 (Pownall et al. US 2011/0118173 A1). 아테롬성 경화증의 형성에 대항한 보호를 시험하기 위하여 사용하게 몇 가지 아테롬성 경화증 마우스 모델이 있다. 이들은 아포(apo) A-I KO, 아포 E KO, 시스타티오닌(cystathionine) 베타-신타제 및 아포지단백질 E, 및 아포 A-I/SR-BI 이중 KO를 포함한다. 이들 아테롬성 경화증의 마우스 모델은 주사, 경구 투여, 또는 생체외 처리에 의해 IL-22-Fc로 처리될 것이다. IL-22-Fc로의 처리 후 혈중 콜레스테롤 수준을 측정하면, 총 혈장 콜레스테롤이 즉시 감소하고, 네오 HDL의 양이 증가하며, 연속해서 성숙한 형태의 HDL이 출현될 것인데, 이는 적당한 시간에 걸쳐 말초 조직으로부터 배출된 콜레스테롤을 함유하고 있다.
실시예 9 - 당뇨병 마우스 모델에서 재조합 IL-22 Fc의 효과
대사 증후군에 있어서의 IL-22-Fc의 효과를 알아보기 위한 본 발명자들의 초기 연구에서, 본 발명자들은 IL-22R KO 마우스가 식이 유도성 비만과 인슐린 저항성에 더 감수성이라는 사실에 주목하였다. 후속 실험에서, 본 발명자들은 재조합 IL-22-Fc로의 처리 후 체지방 손실을 관찰하였다. 이러한 데이터의 관점에서, 본 발명자들은 당뇨병 마우스 모델에서 재조합 IL-22-Fc의 역할을 시험하기로 선택하였다. 효능 말단점, 예컨대 먹이가 공급된 및 공복 글루코스, 체중 및 글루코스 및 인슐린 내성을 본 연구에서 평가하였다.
마우스 (군당 10마리 동물)에게 재조합 IL-22-Fc, 또는 이소형 IgG 대조군으로서의 항-두드러기쑥 항체를 3주 동안 매주 2회 용량으로 투여하면서 이들로 처리하였다 (도 19):
군 1: db/db 마우스 (BKS.Cg-Dock7(m)+/+ Lepr(db)/J FAT): 항-두드러기쑥 항체 (50 ㎍)
군 2: db/db 마우스: 재조합 IL-22-Fc (50 ㎍)
군 3: 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스: 항-두드러기쑥 항체 (50 ㎍)
군 4: 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스: 재조합 IL-22-Fc (50 ㎍).
12주생 암컷 db/db를 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하고 본 실험에 사용하였다. 연구하기에 앞서, 도착 후 7 내지 10일 동안 마우스를 새환경에 순응시키고 (매일 핸들링한다), 실험을 시작하기 전에 단독 사육하였다. -5일 내지 -1일에 걸쳐 매일 기준선 글루코스 측정을 위하여, 칼자국을 낸 꼬리를 통하여 혈액을 수집하였다 (3 내지 5 ㎕). 0일째에, 단백질을 PBS 중의 복강내 주사제 (150 ㎕)로 투여한 다음, 3주 동안 매주 2회 용량을 투여하였다. 2일, 4일, 8일, 10일, 14일, 18일 및 21일째에 글루코스 측정을 위하여, 칼자국을 낸 꼬리를 통하여 혈액 (3 내지 5 ㎕)을 다시 수집하였다. pK를 측정하기 위하여, 2일, 7일, 13일 및 20일째에 마취 하에 궤도 출혈을 통하여 30 ㎕의 혈액을 수집하였다.
재조합 IL-22-Fc 또는 이소형 IgG 대조군 항체를 3주 동안 복강내 경로를 통하여 매주 2회 투여하였다. 23일째 연구가 끝날 때까지 2일마다 체중과 먹이 공급된 글루코스를 측정하였고, 칼자국을 낸 꼬리를 통하여 글루코스 측정을 수행하며, 혈당계를 이용하여 측정하였다 (도 20a-b). 먹이가 공급된 및 공복 글루코스 수준에 접근하기 위하여, 10일째에 먹이가 공급된 글루코스 측정을 아침에 수행하였고, 양 군으로부터의 마우스를 4시간 동안 단식시키고 혈당계를 이용하여 글루코스 측정치를 취하였다 (도 20c). IL-22-Fc 노출시키면, db/db 마우스에서 상당한 글루코스 저하 효과가 발생하였다.
IL-22-Fc 또는 IgG 대조군을 매주 2회씩 50 ㎍/용량으로 처리한지 2주 후에 글루코스 내성 시험 (GTT)을 수행하였다. 이 마우스를 밤새 단식시켰다 (14시간). 공복 글루코스 수준을 아침에 측정하였고, 이를 기준선으로서 제공하였다. 체중을 측정하고, 글루코스 측정을 위하여 칼자국을 낸 꼬리를 통하여 혈액을 수집하였다 (3 내지 5 ㎕). 1.5 mg/체중 kg의 글루코스 용액을 복강내 투여하고, 30분마다 글루코스 측정치를 취하였다. 글루코스 수치는 30분, 120분, 180분 및 220분에 대해 그래프에 나타내었다. 20일째에 밤새 단식시킨 후 21일째에 1회 이상의 GTT를 수행하였다. 마우스의 체중을 매일 쟀다. 모든 군은 23일째에 안락사시키고, 조직학을 알아보기 위하여 조직을 수집하였다. IL-22-Fc 처리 결과, 글루코스 내성과 인슐린 감수성이 상당히 개선된 것으로 입증되었다 (도 21).
20일째 마우스를 IL-22-Fc 또는 IgG 대조군으로 매주 2회씩 50 ㎍/용량으로 처리한 후 인슐린 내성 시험 (ITT)을 수행하였다. 이 마우스를 4시간 동안 단식시키고, 기준선 글루코스 수준을 취하였다. 1 mU/체중 Kg을 복강내 투여하고, 30분마다 칼자국을 낸 꼬리에 의해 혈당 수준을 모니터링하였다. % 글루코스 감소를 계산하기 위하여, 4시간 단식시킨 후 기준선 글루코스 수준을 100%로 표준화한다. IL-22-Fc 처리하면, 인슐린 내성 시험을 통하여 측정된 인슐린 감수성이 상당히 개선된 것으로 밝혀졌다 (도 22a-b).
IL-22R은 췌장, 특히 선방 세포에서 고도로 발현되지만, 그의 β 섬 세포에서의 발현 상태는 여전히 명확하지 않다. IL-22 Fc 또는 대조군 단백질 처리된 db/db 마우스로부터의 췌장에서의 인슐린 신호를 조사하였다. 당뇨병 마우스의 조직학적 평가를 또한 수행하여, 섬 세포에서의 인슐린 발현을 평가하고 IL-22-Fc 처리된 동물에서 간 문맥 주위 지방증의 수준을 평가하였다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 555-접합된 염소 항-토끼 2차 항체와 함께 토끼 항-글루카곤 [셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technologies) #2760]을 이용하거나 또는 알렉사 플루오르 647-접합된 염소 항-기니아 피그 2차 항체와 함께 기니아 피그 항-인슐린 (DAKO A0564)을 이용하여, 인슐린 및 글루카곤에 대한 면역조직화학을 기존에 보고된 바와 같이 (문헌 [Wu et al. 2011, Science translational medicine 3, 113ra126, doi:10.1126/scitranslmed.3002669]) 포르말린 고정 파라핀 봉매된 췌장 조직 상에서 수행하였다. 섬 면적당 인슐린 면적 %는 인슐린 양성 면적을 (섬 면적 - 핵 면적)으로 나눔으로써 계산하였다.
IL-22-Fc는 db/db 마우스의 섬에서의 인슐린 발현을 증가시키는 것으로 여겨지고 (도 23a), 정량적으로 분석한 결과, IL-22-Fc 처리된 동물에서 인슐린-신호 세기 (도 23b 및 도 24)와 인슐린 양성 면적 (도 25) 둘 다가 상당히 증가한 것으로 밝혀졌지만, IL-22 Fc가 글루카곤-신호 세기를 증가시키지는 못하였다 (도 23c). 인슐린 양성 면적은 헤르셉틴(Herceptin) 대조군으로의 처리와 비교해서 IL-22-Fc 처리시 2.16배 증가한 것으로 밝혀졌다 (95% 신뢰 구간 1.25 내지 3.72). 섬의 수 및 면적은 IL-22 Fc 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 1개 섬당 β 세포 면적과 IL-22 Fc 처리된 췌장으로부터의 인슐린 염색 세기는 상당히 상승되었다 (도 23 및 52).
비만 마우스의 췌장 베타 세포는 탈과립화 및 변성의 징후를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 통계상 유의적으로 더 높은 인슐린 염색이, 처리되지 않은 비만 마우스와 비교해서 IL-22로 처리된 비만 마우스의 베타 세포에서 관찰되었다 (도 23a, b). 이러한 증가는 IL-22 처리군에서 증가된 인슐린 저장에 기인하는 것으로 추정되었다. 보다 고 수준의 췌장 인슐린이 IL-22 처리된 비만 세포에서 관찰됨에도 불구하고, 이들 마우스에서의 혈청 인슐린 수준은, 먹이가 공급된 조건 또는 공복 조건 하에서 IL-22 처리를 수반하지 않은 비만 마우스와 비교해서 실제적으로 감소되었다 (도 23d, e). 그러나, IL-22 처리된 비만 마우스는, 처리되지 않은 비만 마우스와 비교해서 차우 식이시 야생형 마우스와 더 유사한 패턴으로 인슐린을 방출시킴으로써 글루코스에 반응하였다 (도 23f). 따라서, IL-22는 비만 마우스에서 인슐린 방출의 제어 기전을 개선시키고 과립화를 증가시킴으로써 잠재적으로 비만 마우스에서의 글루코스 생체 항상성을 개선시켰다.
그 다음, 인슐린 생체 항상성에 대한 IL-22 Fc의 효과를 조사하였다. HFD-공급된 마우스를 8주 동안 매주 2회씩 IL-22 Fc로 처리하였다. 그 결과가 도 23d 및 e에 도시되어 있다. 도 23f에 제시된 데이터는 글루코스 주사 후 0분 또는 30분에서 인슐린 수준을 나타낸다. IL-22 Fc로 처리된 HFD-공급된 마우스는 차우 식이 (표준 식이)시의 야생형 마우스와 유사하게, 혈청 인슐린 수준을 증가시킴으로써 글루코스 주사에 반응하였지만, 대조군 HFD 마우스는 그렇지 못하였다 (도 23f 참조). 따라서, IL-22는 비만 마우스에서 글루코스 생체 항상성을 개선시켰고, 글루코스에 반응하여 인슐린 분비를 개선시켰다.
비교로서, 본 발명자들은 IL-22 수용체 KO 마우스를 관찰하고, 식이 유도성 비만 (DIO)과 인슐린 저항성에 대한 그의 감수성을 검토하였다. IL-22 R KO 마우스는 도 43 및 다음에 기재되어 있다. IL-22 수용체 KO 마우스와 한배 새끼 대조군 마우스를 7주생부터 10주 동안 60% 고 지방 식이 상에 놓아두었다. 고 지방 식이 (HFD) 유도성 글루코스 내성을 평가하기 위하여, 마우스를 밤새 단식시키고, 그 다음날 아침에 글루코스 내성 시험을 수행하였다. 이 실험을 위해, 7주생 IL-22 R KO 마우스와 한배 새끼 연령 일치 대조군 동물 (WT: 야생형으로서 제공됨)을 10주 동안 60% HFD에 놓아두었다. 마우스에게 1.5 mg/체중 kg의 글루코스를 복강내 주사하고, 2시간 동안 30분 마다 혈당 수준을 모니터링하였다. 개개의 마우스에 대한 곡선 하의 총 면적을 계산하고 그래프로 나타내었다. 이 데이터는 글루코스 수준이 곡선 하의 총 면적을 근거로 하여 IL-22R KO 마우스에서 상당히 더 높다는 것을 명확히 보여주는데 (도 27a-b), 이는 IL-22 수용체가 HFD 유도된 글루코스 내성에 있어서 일정 역할을 한다는 것을 제안한다. IL-22 수용체 KO 마우스는 사실상, 한배 새끼 WT 대조군 마우스와 비교해서 HFD 공급 후 더 많은 체중을 갖게 되었다 (도 28).
실시예10 - 아테롬을 발생시키기 쉬운 마우스 ( Ldlr -/- Apobec1 -/-)를 IL-22로 처리하면, 혈청 LPS와 혈청 LDL/HDL이 감소된다
9개월생 Ldlr -/-, Apobec1 -/- (dko) 마우스에게 50 ㎍의 융합 단백질 IL-22Fc 또는 50 ㎍의 항-두드러기쑥 대조군 항체를 복강내 주사하였다 (군당 n=6). 48시간 후에, 상기 동물을 안락사시키고, 혈청을 수거하였다. 콜레스테크 LDX 검정을 이용하여 지질 프로파일을 분석하였고, 리물루스(Limulus) 변형 세포 용해물 검정을 이용하여 내독소를 분석하였다. IL-22-Fc를 이용한 경우에 항-두드러기쑥 Fc 대조군 항체와 비교해서 혈청 LPS가 50% 정도 감소되었고 (p=0.0052), 혈청 LDL/HDL이 30% 정도 감소되었다 (p=0.049) (도 29).
요약하면, IL-22 Fc 융합 단백질로 처리된 마우스는 지질 프로파일에 있어서 신속한 양성 변화를 나타내었고 순환성 내독소를 감소시켰다.
실시예 11 - IL- 22Fc는 전신 또는 국소 투여에 의해, 뮤린 당뇨병성 상처 치유 모델에서 상처 봉합을 촉진시켰다
프로토콜
IL-22-Fc 구조물은 전형적으로, 도 32a-b에 도시된 바와 같은 마우스 IL-22-마우스-IgG2a 융합 단백질 (서열 72 및 73)이었다.
본 연구에 사용된 마우스: IL-22R KO 마우스와 한배 새끼 대조군 야생형 (WT) 마우스를 제넨테크 동물 시설에서 사육하였다. IL-22R KO 마우스는 도 43 및 다음에 기재되어 있다. 9주생 당뇨병 암컷 마우스 BKS.Cg-Dock7(m)+/+ Lepr(db)/J FAT (db/db) 및 BKS.Cg-Dock7(m)+/- Lepr(db)/J 마른 (대조군 BKS)을 사용하였다. 체중과 먹이 공급된 글루코스 수준을 근거로 하여 마우스를 본 연구에서 무작위로 나누었다.
IACUC 설치류 생존 수술 지침에 따라서 상처 치유 프로토콜을 엄격하게 수행하였다. 과정 내내 멸균 기술을 사용하였다 (멸균 장갑, 마스크, 가운 및 드레이프 포함). 수술면의 마취를 유도한 후, 동물 등의 배측 부분 (견갑골 영역에서부터 요추 영역까지)을 면도하고, 모발 제거 로션 (나이르 또는 등가물)으로 까칠하게 자란 수염을 제거하며, 멸균수로 세정시키고, 베타딘 스크럽에 이어 알콜 세정으로 수술 준비시켰다. 이어서, 상기 동물을 배 쪽으로 드러눕게한 다음, 제거하고자 하는 피부 부위를 표시하기 위하여 6 mm 펀치를 이용한다 (이러한 펀치의 팁 상에 멸균 마커를 수반한 다음, 피부와 접촉시킨다). 6 mm 직경의 1개 전층 피부 상처를 정중선의 좌측과 우측에 1 cm 만들었다. 골막 분리기와 미세 가위를 이용하여 하층 연골막을 제거하였다.
이를 수행한 후, 0.5 mm 두께 실리콘 프레임 (10-12 mm 내부 직경)을 초강력 접착제와 함께 원형 상처 주변에 놓아두었다. 이어서, 2 ㎠의 테가덤(Tegaderm™) (3M; 미국 미네소타주 세인트 폴) 또는 옵사이트(Opsite®) [스미스 앤 네퓨, 인크. (Smith & Nephew, Inc.; 미국 플로리다주 세인트 페데르스부르크)] 접착제를 상기 상처와 프레임 위에 올려 놓고, 동물을 마취로부터 회복시켰다.
옵사이트® 드레싱을 격일로 제거하고, 상처를 검사하며, 국소적으로 치료하고 (20 ㎕의 시험 재료 또는 식염수), 신선한 드레싱을 적용하였다. 0일째부터 연구가 끝날 때까지 상처 직경을 측정함으로써 상처 갭을 계산하였다.
일부 연구에서는, 상업적 원터치(Onetouch®) 혈당계 [라이프스캔, 인크. (lifeScan, Inc.; 미국 캘리포니아주 밀피타스)]를 이용하고 꼬리에 칼자국을 낸 후에 먹이 공급된 글루코스 수준을 기록하였다.
결과
IL-22R-/- 마우스는 피부 상처 치유 반응에서 결함을 나타내었다
피부 상처 치유 반응에 있어서의 IL-22 신호 전달의 역할을 IL-22R KO (IL-22 및 그의 계열 구성원 IL-20과 IL-24의 신호 전달이 결여됨)에서 연구하였다. 도 33은 14일에 걸친 IL-22R KO 마우스 (n=10)와 IL-22R WT 대조군 마우스 (n=10) 둘 다의 상처 갭 곡선을 도시한 것이다. 6 mm 직경 상처는 0일째에 생성시켰고, 4일째부터 시작하여 2일마다 그 갭을 측정하였다. IL-22R KO 마우스의 상처 갭은 8일부터 14일째까지 WT 한배 새끼 대조군과 비교해서 봉합에 있어서 상당한 지연을 나타내었다. 연구가 끝날 무렵에는 (14일), WT 마우스 상처의 100%가 봉합되었는데, 이는 IL-22R KO 마우스에서의 단지 30% (p=0.005)와 비교된다. IL-22R KO 마우스와 WT 대조군 마우스 간의 상처 갭 상의 차이는 P ≤0.05에서 통계상 유의적인 것으로 간주된다.
비만 당뇨병 마우스에서의 상처 치유 결함
당뇨병 상태에서의 피부 상처 치유 반응은 렙틴 수용체 KO 당뇨병 마우스 (BKS.Cg-Dock7(m)+/+ Lepr(db)/J FAT) (db/db)와 WT 대조군 마른 마우스를 이용하여 전임상 연구에서 모델링하였다. 마우스의 등에 원형 상처 (6 mm)를 생성시키고, 4일째부터 시작하여 2일마다 상처 갭 봉합을 기록하였다. 도 34는 0일부터 27일째까지 측정된 상처 갭 봉합 (mm)을 도시한 것이다. 연구 기간 내내, 당뇨병에 걸린 비만 db/db 마우스 상처는 마른 마우스와 비교해서 상처 봉합에 있어서 통계상 (P ≤ 0.0001) 유의적인 지연을 나타내었다. 14일째까지는 WT 마우스 상처의 100%가 봉합된 반면, db/db 마우스 상처 중 어느 것도 심지어 27일째에도 봉합되지 못하였다 (도 35a). 상처 절제 후에는 야생형 마우스에서 RNA 수준에 의해 측정된 바와 같이 IL-22 발현이 유도되었지만, db/db 마우스에서는 그렇지 못하였다 (도 35b 참조).
IL- 22Fc는 당뇨병성 상처 치유 모델에서 상처 봉합을 촉진시켰다
IL-22R-/- 마우스는 상처 봉합에 있어서 결함을 나타내기 때문에, IL-22가 상처 봉합에 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 도 36은 연구 설계를 개략적으로 나타내었다. 9주생 암컷 비만 db/db 마우스를 사용하여 당뇨병성 상처 치유를 모델링하였다. IL-22Fc (뮤린) 이외에도, 항-두드러기쑥 항체를 Fc 대조군 단백질로서 사용하고 항-FGFR1 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 항-FGFR1 항체는 상기 전임상 모델에서 혈당 수준을 정상화시키는 것으로 입증되었기 때문에, 이를 대조군 항체로서 사용하였다. 도 36은 연구 설계를 개략적으로 나타낸 것이다. 처리군은 다음과 같다:
● 항-두드러기쑥 항체 (복강내 50 ㎍/용량, 8회 용량)
● IL-22Fc (복강내 50 ㎍/용량, 8회 용량)
● 항-FGFR1 항체 (0일 및 14일째 복강내 0.5 mg/kg).
IL-22Fc와 항-FGFR1 둘 다는 항-두드러기쑥 처리와 비교해서 당뇨병 마우스에서 글루코스 수준을 저하시키는 데 있어서 통계상 유의적인 (P ≤ 0.001) 효과를 나타내었다 (도 37). 그 데이터 (도 38)는 IL-22 Fc를 전신 투여하는 것이 항-두드러기쑥 항체 처리와 비교해서 상처 봉합 속도에 있어서 현저한 효과를 나타냈다는 것을 보여준다. 상처 갭 상의 차이는 16일째부터 시작하여 유의적이었고 (P ≤ 0.05) IL-22 Fc 처리된 마우스에서의 상처는 27일째에 완전히 커버되었다. Fc 대조군 항체뿐만 아니라 항-FGFR1 처리된 마우스는 27일째에도 상처가 완전히 봉합되지 못하였다. 도 39는 19일, 21일 및 27일째 개개 마우스의 상처 갭 측정치를 보여주는데, 다른 2개 군과 비교한 IL-22 Fc 처리군들 간의 상처 갭 상의 차이는 통계상 매우 유의적이다 (P ≤ 0.001).
IL-22 Fc 국소 처리 대 전신 처리의 비교
도 40은 연구 설계를 개략적으로 나타낸 것이다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 2가지 처리 방식, 즉 국소 처리 대 전신 처리를 비교하였다. 그 군은 다음과 같다:
● 항-두드러기쑥 항체 (국소 50 ㎍/용량, 8회 용량)
● IL-22Fc (국소 50 ㎍/용량, 8회 용량)
● IL-22Fc (복강내 50 ㎍/용량, 8회 용량).
도 41의 그래프는 IL-22-Fc 국소 투여뿐만 아니라 IL-22-Fc 전신 투여 둘 다가 대조군 항체 처리와 비교해서 상처 봉합을 촉진시켰다는 것을 보여준다. 상처 갭 측정치는 16일째부터 22일째에 걸쳐 통계상 유의적으로 상이하였다 (P ≤ 0.001). Il-22 Fc 국소 처리군과 Il-22 Fc 전신 처리 군 간의 상처 봉합 속도의 경우에는 유의차가 전혀 관찰되지 않았다 (도 42 참조).
실시예 12 - 비만 마우스는 감소된 IL-22 유도를 나타내었다
다음 실험에서는, 비만 마우스에서 면역 반응 동안 IL-22의 조절을 조사하였다. IL-22의 주요 백혈구 공급원은 선천 림프계 세포 (ILC) 및 T 헬퍼 서브세트, 특히 Th17 및 Th22 세포이다. 렙틴 수용체 결핍성 db/db 마우스에서의 항원 시험감염시 CD4+ T 세포로부터의 IL-22 생성을 조사하였다.
프로토콜
OVA 및 플라겔린으로의 생체내 처리. CD4 T 세포를 생체 내에서 활성화시키기 위하여, 완전 프로인트(Freund) 아주반트 (CFA)에서 유화시킨 100 ㎍ OVA를 상기 동물의 하부 등에 피하 주사하였고, 7일째에 서혜부 림프절을 수거하였다. TLR5를 활성화시키기 위하여, 3 ㎍ 초순수 플라겔린 [인비보젠(InvivoGen)]을 정맥내 주사하고, 2시간째에 혈청 샘플을 수거하였다.
마우스. 렙틴 수용체 결핍성 마우스 (db/db; BKS.Cg-Dock7 m +/+ Lepr db /J 또는 B6.BKS(D)-Lepr db /J), 렙틴 결핍성 마우스 (ob/ob; B6.Cg-Lep ob /J), 및 그들의 각각의 마른 대조군 마우스 뿐만 아니라 고 지방 식이 마우스 (C57BL/6J 60%DIO) 및 차우-식이 대조군 마우스는 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하였다. IL-22 결핍성 마우스 (문헌 [Zheng et al., 2007, Nature 445, 648-651]) 및 IL-22Rα1 결핍성 마우스 (도 43 및 다음에 기재됨)는 렉시콘 파마슈티칼즈(Lexicon Pharmaceuticals)에 의해 생성하였고, C57BL/6 균주와 10회 초과하여 역교배하였다. 표시된 경우, 마우스에게 4주생 내지 6주생부터 칼로리 조정된 식이 [60% 지방을 함유하는 HFD; 하를란(Harlan)]를 공급하기 시작하였다. 대사 연구를 위해, 12주 내지 18주생 마우스를 사용한 반면, 씨. 로덴튬 감염 연구를 위해서는 5 내지 6주생 마우스를 사용하였다. 모든 동물 실험은 제넨테크 기관내 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
타고난 본래의 CD4 T 세포 정제 및 분화. 타고난 본래의 CD4 T 세포를 기존에 보고된 바와 같이 (문헌 [Rutz, et al. 2011, Nature Immunol. 12:1238-45]) 분류 및 자극하고, 기존에 보고된 바와 같은 방식 (상기 문헌)과 유사하게 각 서브세트에 대한 특이적 조건 하에 배양하였다. IL-22 유도를 위하여, 항-IL-4 (10 ㎍/ml), 항-IFN-γ (10 ㎍/ml), 및 재조합 IL-6 (20 ng/ml)을 사용하였고; 표시되는 경우에는, 재조합 마우스 렙틴 (1 ㎍/ml, 알앤디 시스템즈)을 가하였다.
세포내 염색 및 IL-22 ELISA. 피코에리트린 (PE)-항-IL-22 [1H8PWSR, 이바이오사이언스(eBioscience)] 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-항-IL-17A (17B7, 이바이오사이언스)를 이용하여 기존에 보고된 바와 같이 (상기 문헌 [Zheng et al.] 참조), 배출성 림프절로부터 정제된 림프구를 대상으로 하여 IL-22 및 IL-17A에 대하여 염색하였다. 모노클로날 항-IL-22 항체 (20E5 및 14B7, 제넨테크)를 이용하여 기존에 보고된 바와 같이 (상기 문헌 [Zheng et al.] 참조), IL-22 ELISA를 수행하였다.
RNA 단리 및 실시간 PCR. 결장을 수거하고 처리하였으며, RNeasy 미니 플러스 키트 [퀴아젠(Qiagen)]를 이용하여 mRNA를 단리하였다. 기존에 보고된 바와 같이 (문헌 [Ota et al. 2011, Nature immunol . 12, 941-948]) 실시간 PCR 분석을 이용하여, Il22, Il22ra1, 및 Reg3b mRNA 수준을 평가하였다. 그 결과를 대조군 하우스키핑 유전자 Rpl19 (리보솜 단백질 L19를 코딩함)의 결과에 대해 표준화시켰고, 2ΔCT로서 보고된다. Il22Reg3b에 대한 프라이머 및 프로브 서열은 기존에 보고되었다 (상기 문헌 참조). Il22ra1의 경우에는, 5'-AGG TCC ATT CAG ATG CTG GT-3' (서열 74), 5'-TAG GTG TGG TTG ACG TGG AG-3' (서열 75) 및 5'-FAM-CCA CCC CAC ACT CAC ACC GG-TAMRA-3' (서열 76)을 사용하였다.
통계학적 분석. 모든 통계학적 분석은 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트(Student) t-시험을 이용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.
결과
마우스를 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 중의 오브알부민 (OVA)으로 면역시킨 후, IL-22 발현성 CD4 T 세포를 세포내 시토카인 염색으로 생체외에서 검출하였다. IL-22+ T 세포는 db/db 마우스에서 상당히 감소되었다 (도 44a-b). 앞서의 보고서와 일치하게, IL-17+ CD4 T 세포 또한, db/db 마우스에서 상당히 감소되었다 (도 45a). 유사한 결과가 렙틴 결핍성 ob/ob 마우스에서 또한 관찰되었다 (도 45b). 렙틴은 Th 세포, 예컨대 Th1 세포 및 Treg 세포를 조절할 수 있다. 그러나, 시험관내 분화된 Th22 세포로부터의 IL-22 생성에 대한 렙틴의 직접적인 효과는 관찰되지 않았다 (도 45c). 더욱이, IL-22 생산 T 세포의 유사한 감소가 또한, 면역된 DIO (식이 유도성 비만, 또는 HFD-공급된) C57BL/6에서 관찰되었는데 (도 44c 및 d), 이는 렙틴 신호 전달의 결여가 아닌 비만이 CD4+ T 세포에서 감소된 IL-22 생성에 대해 책임이 있을 수 있다는 것을 제안한다. 플라겔린에 의한 활성화 TLR5 경로는 ILC로부터의 IL-22 생성을 자극할 수 있었다.
db/db 마우스 (도 44e), ob/ob 마우스 (도 45e), 및 DIO 마우스 (도 44f)에서는, 혈청 IL-22 수준이 플라겔린으로의 생체내 시험감염시 WT 마우스의 수준 보다 상당히 더 낮았다. T 세포로부터의 결과와 일치하게, 렙틴 그 자체는 시험관 내에서 ILC로부터의 IL-22 생성을 증강시키지 못하였다 (도 45d). 취합해 보면, 이들 데이터는 비만 마우스에서는 ILC와 T 세포 둘 다로부터의 IL-22 생성에 있어서 일반적인 결함이 있다는 것을 제안하였다.
실시예 13 - 점막 방어는 렙틴 결핍성 마우스에서 기능 저하되었고 IL-22 Fc 융합 단백질에 의해 복원되었다
ILC 및 T 세포에 의해 생성된 IL-22는 결장 내에서의 시트로벡터 로덴튬 (Citrobecter rodentium) 감염에 대항한 숙주 방어에 필수적이다. 씨. 로덴튬으로 감염된 db/dbob/ob 마우스로부터의 결장에서의 IL-22 유도를 분석하였다. 씨. 로덴튬을 밤새 배양하고, 마우스에게 기존에 보고된 바와 같이 (문헌 [Zheng et al. 2008, Nature medicine 14, 282-289, doi:10.1038/nm1720]) 2x109 CFU의 박테리아를 경구 접종하였다. 박테리아 조직량을 다음과 같이 분석하였다: 감염된 마우스의 비장과 간을 수거하고, 칭량하며, 젠틀MACS(gentleMACS)를 수반한 C-튜브 [밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)]에서 0.1% NP40/PBS 하에 균질화시켰다. 일련으로 희석시킨 균질화물을 맥콘키(MacConkey) 한천 [레멜(Remel)] 상에 도말하고, 37℃ 하에 밤새 인큐베이션한 후에 씨. 로덴튬 집락을 핑크색 집락으로서 확인하였다. 표시되는 경우, 상기 마우스에게 IL-22-Fc (150 ㎍/용량) 또는 등가량의 마우스 이소형 대조군을 매주 3회 근육내 주사하였다. 기존에 보고된 바와 같이 (문헌 [Ota et al. 2011, Nature immunology 12, 941-948, doi:10.1038/ni.2089), 씨. 로덴튬으로 감염된 마우스로부터의 결장의 조직학 분석을 수행하였고, 상피 변화 (증식, 수포 형성, 장세포 발산), 염증 및 점막 비후에 관하여 스코어링하였다. 4개의 해부 영역, 즉 근위부, 중간 및 원위 결장과 직장에 대한 임상 스코어를 0 내지 5의 등급 (0은 정상 결장이고, 5는 중증 질환이다)으로 결정하였다. 영역별 스코어를 합하여, 각 동물에 대한 최종 결장 질환 중증도 스코어를 획득하였다.
상기 결과로 보강하면, db/dbob/ob 마우스의 결장에서 4일째에 IL-22의 피크 유도가 또한, 상당히 저하되었지만, 완전히 없어지지는 않았다 (도 46a). db/db 마우스에서는 씨. 로덴튬을 경구 접종한 후에, 상당한 체중 손실이 없었다 (도 46b). 놀랍게도, 상기 감염된 db/db 마우스는 박테리아 접종 후 10일째부터 사망하기 시작하였고, 반복된 실험에서 감염 2주차에 약 60% 내지 100% db/db 마우스가 굴복하였다 (도 46c). db /db 마우스로부터의 결장 박편을 조직학적으로 분석한 결과, 염증 세포 침윤이 증가하였고 심각한 상피 손상 (점막 표면에서의 상피 발산 포함)이 일어난 것으로 밝혀졌다 (도 46d-f). 또한, 이들 마우스는 드문드문 있는 점막하 부종과 다병소성 박테리아 집락을 나타냈는데, 이는 종종 국한성 괴사와 연관이 있었다. db /db 마우스의 간과 비장 둘 다에서 상당히 상승된 박테리아 조직량이 또한 검출되었다 (도 46g-h). 점막 방어에 있어서의 유사한 결함이 또한, ob/ob 마우스에서 관찰되었다 (도 54). 특히 씨. 로덴튬 감염에 의한 IL-22 유도가 db/db 마우스에서 부분적으로만 결함이 있었다는 것을 고려해 볼때, 이러한 db/db 마우스가 씨. 로덴튬 감염을 제어하는 데 있어서 상당한 결함을 지니고 있었다는 것은 예상치 못한 일이었다 (도 46a 참조).
렙틴 결핍성 마우스가 또한, B 세포 기능에 있어서 결함을 지니고 있고, 씨. 로덴튬에 대항한 항체가 감염 말기 동안 숙주로부터 박테리아를 궁극적으로 제거하는 데 요구된다고 보고되었다. 따라서, 이들 마우스에서 항-씨. 로덴튬 항체의 생성을 조사하였다. 감염 후 10일째에 하학선 정맥으로부터 출혈시킴으로써 혈청 샘플을 수거하였다. ELISA 판을 열-사멸된 씨. 로덴튬 또는 염소 항-마우스 Ig 포획 항체로 코팅하였다. 코팅된 판을 세척 완충액 [PBS 중 0.05% 트윈(Tween) 20]으로 세척하고, 차단 완충액 [PBS 중 0.5% BSA, 15 ppm 프로클린(Proclin)]으로 2시간 동안 차단시키며, 일련으로 희석된 표준 마우스 모노클로날 IgG [서던바이오텍(SouthernBiotech)] 또는 혈청 샘플을 부가하기에 앞서 세척하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 판을 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소 항-마우스 IgG (서던바이오텍)로 Ig를 검출하고, 검정 희석제 (PBS 중 0.5% BSA, 0.05% 트윈 20, 15 ppm 프로클린)에서 1/4,000로 희석하며, 실온 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, TMB 퍼옥시다제 기질 [시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)]을 각 웰에 가하였다. 판 판독기 [몰레큘라 디바이스(Molecular Devices)]에서 650 nm 하에 흡광도를 판독하였다.
항-씨. 로덴튬 IgG 항체의 역가는 감염 후 14일째에 생존한 db/db 마우스에서 상당히 감소되었다 (도 46i). 그러나, 이로써 감소된 항-씨. 로덴튬 IgG 생성 하나만으로는 또한, 관찰된 조기 사망률을 초래하지 않아야 하는데, 이는 B 세포와 항체 생성이 거의 결여된 Rag2 결핍성 마우스가 감염 후에 훨씬 더 오래 생존할 수 있기 때문이다 (Zheng et al. 2008, Nature medicine 14, 282-289). 따라서, db/db 마우스에서 씨. 로덴튬에 대항하여 실패한 숙주 방어는 적응 항체 반응과 ILC로부터의 IL-22의 유도 둘 다에 있어서의 결함에 의해 유발되는 것으로 예상되었다. 이어서, 외인성 IL-22-Fc를 투여하여, IL-22가 씨. 로덴튬 감염 동안 db/db 마우스에서 점막 면역을 복원시킬 수 있었는지를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 도 46j에 도시된 바와 같이, 대다수의 대조군 IgG-처리된 db/db 마우스가 사망하였지만, 거의 모든 IL-22 Fc 처리된 db/db 마우스는 감염에 살아남았는데 (도 46j), 이는 IL-22 Fc가 db/db 마우스에서 점막 면역 결함을 치료상 복원시킬 수 있었다는 것을 뒷받침해준다.
실시예 14 - IL-22 Fc는 비만 마우스와 고 지방 식이-공급된 정상 마우스에서 글루코스 수준을 감소시켰다
상기 실시예 9에 기재된 바와 같이, IL-22 Fc는 이미 고혈당증이 발병한 db/db 마우스에서 글루코스 수준을 감소시켰다 (도 20a). 이러한 치료적 이득은 IL-22-Fc 투여 과정 동안 지속되었다. 치료 3주 후, 이들 마우스에서의 글루코스 수준은 WT 마우스에서의 정상 글루코스 수준에 근접하게 200 mg/dl 아래로 떨어졌지만, 대조군 단백질 처리된 db/db 마우스는 그들의 고 글루코스 수준을 유지하였다. IL-22 Fc 처리된 마우스에서의 글루코스 감소는, 이러한 마우스를 단식시킨 경우에 보다 명백하였다 (도 20c). IL-22 Fc 처리는 또한, 대조군 처리와 비교해서 체중 감소 또는 지연 체중 증가의 경향을 가져다 주었다. 그러나, 본 연구가 끝날 무렵, 두 군 간의 체중 차이는 이들 마우스에서 통계상 유의적이지 못하였다 (도 20b). 이들 데이터로 보강하면, IL-22 Fc 처리는 글루코스 내성 시험과 인슐린 내성 시험에서 글루코스 내성과 인슐린 감수성을 상당히 개선시켰다 (각각 도 21 및 22).
대사 장애를 조정하는 데 있어서 외인성 IL-22의 일반적인 유리한 기능을 확인하기 위하여, 글루코스 불내성을 유도시키기 위해 8주 이상 동안 HFD를 공급한 C57BL/6 마우스에게 4주 동안 IL-22 Fc를 투여하였다. 글루코스 내성 시험 (GTT)의 경우에는, 마우스를 밤새 단식시키고, 글루코스 용액을 1.5 mg/kg으로 복강내 주사하였다. 인슐린 내성 시험 (ITT)의 경우에는, 마우스에게 인슐린 용액을 1.0 단위/kg으로 복강내 주사하였다. 주사하기 전 및 후에 혈당을 측정하였다. 혈당을 칸투어(Contour) [바이엘(Bayer)]에 의해 측정하였다.
db/db 마우스로부터의 결과와 일치하게, IL-22-Fc 처리는, 특히 단식시킨 후에 혈청 글루코스 수준을 상당히 감소시켰다 (도 47a). 또한, 연구가 끝날 무렵에는 IL-22 Fc 처리군에서 체중이 감소되었다 (또한 체중 증가가 지연되었다) (도 47b). 또한, IL-22 Fc는 HFD-공급된 C57BL/6 마우스에서 글루코스 불내성과 인슐린 저항성을 저하시켰다 (도 47c 및 d). HFD를 공급하기 시작할 때 마우스에게 IL-22 Fc를 동시에 투여하는 경우에 유사한 결과가 수득되었다 (도 48). 취합해 보면, 이 데이터는 IL-22 Fc가 비만 마우스에서 혈청 글루코스 농도를 정상화시키고 글루코스 불내성과 인슐린 저항성을 경감시키는 잠재적 요법이었다는 것을 입증하였다.
실시예 15 - IL-22 Fc는 비만 마우스와 HFD -공급된 마우스에서 음식 소비량을 감소시키고 PYY의 발현을 증가시켰다
음식 소비량을 감소시키면, 당뇨병 마우스에서 고혈당증과 인슐린 저항성을 역전시킬 수 있었다. 실제로, IL-22 Fc로 처리된 db/db 마우스는 대조군과 비교해서 음식 섭취량이 상당히 감소되었다 (도 49a). 짝지워 먹이는 실험을 수행하여, IL-22 Fc 처리된 마우스와 대조군 처리된 마우스에서 동일한 음식 섭취량을 보장하였다 (도 50). 본 연구 동안 매일 무제한으로 공급된 군에 대한 음식 소비량을 측정하였다. 짝지워 먹인 군에 공급된 음식은 그 전날 무제한으로 공급된 군의 음식 소비량에 맞도록 제한하였다. 상응하게, 무제한으로 공급된 군을 처리하고 측정한 그 다음날에, 짝지워 먹인 군을 처리하고 측정하였다.
심지어 이러한 조건 하에서도, IL-22 Fc는 나중 시점이긴 하지만 혈청 글루코스를 상당히 감소시켰고 (도 49b), db/db 마우스에서 글루코스 내성을 역전시켰는데 (도 49c), 이는 IL-22에 의해 음식 소비량을 조정하는 것이 대사 질환에 있어서의 그의 치료 효과를 위한 유일한 기전이 아니었다는 사실을 제안한다. 유사한 결과가 HFD-공급된 마우스에서 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). IL-22가 음식 소비량과 대사를 어떻게 조절하였는지를 추가로 이해하기 위하여, 음식 섭취량을 억제하는 것으로 공지되어 있는 장 호르몬인 PYY의 발현을 조사하였다.
0일 및 2일째에 마우스에게 50 ㎍ IL-22-Fc를 복강내 주사하였다. 4일째에 마우스를 밤새 단식시키고, 5일째에 1시간 동안 재공급하였다. 처리하기 2일 전과 먹이 공급 후 5일째에 혈액 샘플을 수집하였다. 수집한 직후에, 모든 혈청 샘플을 프로테아제 억제제 (시그마), DPPIV 억제제 [밀리포어(Millipore)] 및 페파블록(Pefabloc) (로슈)과 혼합하였다. 제조업자의 지시에 따라서 PYY ELISA 키트 [압노바(Abnova)]로 PYY를 측정하였다. 그 결과, IL-22 Fc 처리가 db/db 및 HFD-공급된 마우스의 혈청 중의 PYY 농도를 상당히 증가시킨 것으로 나타났다 (도 49d 및 e). 음식 섭취량에 대한 IL-22의 효과가 PYY 생성을 증진시키는 것을 통하여 매개되었다는 것을 입증하기 위하여, PYY 억제제 BIIE0246으로 처리된 마우스에서의 음식 섭취량을 조사하였다. 정상 식이 중인 C57BL/6 마우스는 처리하지 않거나 또는 2일과 4일째에 IL-22 Fc로 처리하였다. 밤새 단식시킨 후, 4시간 먹이 공급 동안의 음식 섭취량을 측정하였다. 그 결과, IL-22 Fc 처리된 마우스에서의 음식 섭취량 감소가 BIIE0246에 의해 역전된 것으로 나타났는데 (데이터는 제시되지 않음), 이는 감소된 음식 섭취량에 대한 IL-22 Fc의 효과가 PYY의 유도를 통하여 매개되었다는 것을 표시한다.
실시예 16 - IL-22 Fc는 비만 마우스에서 혈청 LPS와 간 ALT 및 AST를 감소시키고 지질 대사를 증가시켰다
IL-22 수용체는 대사를 조절하는 많은 장기 (간과 췌장 포함)에서 발현되기 때문에, 대사 질환에 있어서의 IL-22의 치료적 이득은 각종 기전에 의해 매개되는 것으로 예상된다. 대사 내독소증은 염증 상태와 인슐린 저항성에 기여하고, 소화관 미생물무리를 조정하는 것이 글루코스 내성을 증강시킨다. 혈청 내독소는 제조업자의 지시에 따라서 리물루스 변형 세포 용해물 검정 키트인 QCL-1000 [론자(Lonza)]에 의해 측정하였다. ALT 및 AST는 콜레스테크 LDX [알레레(Alere)]에 의해 측정하였다. 도 49f에 도시된 결과는 IL-22 Fc 처리로 인해, db/db 마우스로부터의 혈청 중의 LPS 양이 상당히 감소되었다는 것을 입증해준다.
IL-22는 지질생성에 관여한 유전자를 억제할 수 있고 간 지방증을 완화시킬 수 있다. 그 다음, 혈청 ALT 및 AST 수준을 조사하였다. 칸투어 (바이엘)에 의해 혈당을 측정하였다. 콜레스테크 LDX (알레레)에 의해 ALT 및 AST를 측정하였다. 도 51a 및 b에 도시된 바와 같이, IL-22 Fc 처리는 db/db (도 51a) 및 HFD-공급된 (도 51b) 마우스 내의 혈청 중의 ALT 및 AST 수준을 저하시켰다. HFD-공급된 마우스에서 IL-22 Fc 처리하면, 복부 지방이 또한 상당히 감소되었다 (도 51c). 또한, 지질 대사에 책임이 있는 유전자는 일차 지방세포에서 IL-22에 의해 유도되었다 (도 51d). 그 다음, 간 및 지방 조직 내에서 트리글리세리드 및 콜레스테롤에 대한 IL-22의 효과를 조사하였다. 그 결과, IL-22 Fc가 HFD-공급된 마우스에서 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 유리 지방산 (FFA) (도 51e) 뿐만 아니라 간 트리글리세리드 (도 51f), 간 콜레스테롤 (도 51g), 및 백색 지방 조직 내의 트리글리세리드 (도 51h)를 감소시킨 것으로 나타났다. 유사하게, IL-22는 db/db 마우스에서 간과 백색 지방 조직 내의 트리글리세리드를 감소시켰다 (도 51i 및 도 51j). 추가 실험은 IL-22 Fc 처리가 비만 마우스에서 처리시키지 않은 것과 비교해서 염증성 시토카인, 예컨대 TNFα 및 IL-1β를 감소시켰다는 것을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음). 간 박편을 H&E 염색한 결과, IL-22 Fc 융합 단백질로 처리한 경우에 간 문맥 주위 지방증이 저하된 것으로 나타났다 (도 26).
IL-22는 IL-22R1 및 IL-10R2 쇄를 통하여 신호를 전달한다. IL-22R1은 또한, IL-20R2 쇄와 쌍을 형성할 수 있고, IL-20 및 IL-24에 의해 활용될 수 있다. 이들 모든 리간드가 피부 표피로부터 매우 유사한 하류 생물학적 효과를 유도시킨 것으로 밝혀졌다 (Sa et al., 2007, J Immunol 178, 2229-2240). 따라서, IL-22 결핍성 마우스와 IL-22R1 결핍성 마우스 둘 다를 조사하여, HFD 유도된 당뇨병에서 기타 시토카인의 잠재적 중복을 피하였다. IL-22R 녹아웃 마우스의 생성이 도 43a에 예시되어 있다. 이러한 KO 마우스에서의 IL-22R1의 결실은 IL-22R KO 마우스에서의 IL-22R1 mRNA의 부재, 및 IL-22R KO 마우스에서 IL-22 Fc에 반응하는 RegIIIb mRNA 발현의 결여에 의해 확인되었다 (도 43b 및 c 참조). 또한, IL-22-Fc를 IL-22R KO 마우스에 투여하는 것이 pStat3을 유도시키지 못하였다 (데이터는 제시되지 않음).
IL-22 결핍성 마우스에서의 글루코스 내성과 체중은 WT 한배 새끼 대조군에서의 것과 차이가 없는 것으로 관찰되었다 (도 53). 그러나, IL-22R1 결핍성 마우스를 3개월 동안 고 지방 식이로 처리한 경우에는, 이들 마우스에서 상당히 더 심각한 글루코스 내성이 발생하였고 체중이 더 증가하였는데 (도 49g, h 및 i), 이는 대사를 제어하는 데 있어서의 IL-22R 경로의 결정적 역할을 뒷받침해준다. 대사 증후군을 저하시키는 데 있어서의 IL-20 및 IL-24 중복 가능성을 조사하였다. 이 실험에서는, db/db 마우스를 IL-20 Fc, IL-22 Fc 또는 IL-24 Fc로 처리하였다. 그 결과는 IL-22 Fc만이 db/db 마우스에서 20일째에 혈청 글루코스 수준을 감소시켰고 (도 55b), GTT 검정에서 글루코스 내성을 증가시켰지만 (도 55c), db/db 마우스를 IL-20 Fc 또는 IL-24 Fc로 처리하면 그렇지 못하였다고 표시하고 있다. 체중 감소는 통계상 유의적이지 않았다. 추가 실험 결과, IL-20 Fc 및 IL-24가 일차 지방세포에서 pStat3을 유도시키긴 하였지만, 이들 시토카인은 인슐린에 대해 감수성이지 않은 db/db 마우스로부터의 간 조직에서는 pStat3을 유도시키지 못한 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). IL-22R KO 마우스에서의 IL-22 Fc의 처리는 글루코스 내성 시험에서 어떠한 효과도 나타내지 않았는데, 이는 IL-22 Fc의 효과가 IL-22 R 신호 전달을 통하여 발휘되었다는 것을 확인시켜 준다 (데이터는 제시되지 않음).
본 실시예에 제시된 연구는 대사 과정을 조절하는 데 있어서의 IL-22의 중요한 기능을 표시한다. IL-22R1 결핍성 마우스에게 대사 증후군의 발병 소인이 있었다. 외인성 IL-22는 전임상 당뇨병 모델에서 점막 면역 결함을 복원시킬 수 있었을 뿐만 아니라 글루코스와 지질 대사를 정상화시키는 데 도움을 주었다. 따라서, IL-22는 인간 대사 장애를 치료하기 위한 신규 치료적 접근법을 제공할 수 있다.
실시예 17 - db/db 마우스에서 상처 치유를 증진시키는 데 있어서의 VGEF와 IL-22의 비교
본 실험에서는, 상처 치유를 증진 또는 개선시키는 것에 대한 IL-22의 효과를 분석하였고, 그것을 VEGF의 효과와 비교하였다. 11주생의 암컷 BKS.Cg-Dock7 m +/+ Lepr db /J db/db 마우스는 잭슨 라보라토리즈 (미국 메인주 바 하버)로부터 구입하였다. 모든 실험적 동물 연구는 제넨테크 실험 동물 연구의 기관내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 하에 수행하였다. 이소플루란 마취 하에 등쪽 피부를 면도한 다음, 제모 크림을 도포하여 남아있는 까칠하게 자란 수염을 제거하였다. 포비돈-요오드를 이용한 다음 알콜 면봉을 이용하여 피부를 깨끗하게 하고 수술 준비를 한 후, 1회용 6 mm 생검 펀치 [밀텍스, 인크.(Miltex, Inc.)]를 사용하여 각 마우스의 등쪽 피부 상에 원형의 전층 상처를 창출시켰다. 이러한 상처는 처리 전 및 후에 테가덤 필름으로 커버하였다.
도 56에서의 결과는 VEGF가 IL-22와 비교해서 더 신속한 표면 봉합을 달성한 것처럼 보이지만, 피부의 진피쪽을 조사한 결과, VEGF로 처리된 상처는 21일째에도 여전히 개방된 상태로 있었다 (도 56b). 상처 부위에서의 혈관형성을 증진시키는 데 있어서의 VEGF와 IL-22 Fc의 능력을 또한 분석하였다. 이러한 실험에서는, 0일째에 db/db 마우스에서 2개의 6 mm 상처를 절개하였다. 2일, 4일, 6일, 8일, 10일 및 12일째에는, 식염수 중의 대조군 항-두드러기쑥 항체 또는 IL-22 Fc (50 ㎍) 또는 VEGF (20 ㎍)를 상기 상처 상으로 국소 투여하였다. 6일 및 12일째에는, 조직학 및 면역조직화학 분석과 BrdU 염색을 위하여 각 군으로부터 3마리 마우스를 꺼냈다. 16일째에는, BrdU 염색을 위하여 1마리 마우스를 꺼냈다. 18일, 20일 및 22일째에는, 면역조직화학 분석과 CD31 완전 조직 염색을 위한 각 시점마다 각 군으로부터 1마리 마우스를 꺼냈다. 그 결과, VEGF와 IL22-Fc 둘 다는 CD31 조직 면역염색에 의해 분석된 바와 같이 상처 부위에서 혈관 형성을 증진시켰지만, 대조군 항-두드러기쑥 항체는 그렇지 못한 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
그 다음, 본 발명자들은 재구성된 표피에서 IL-22-유도된 및 기타 IL-10 계열 구성원-유도된 시토카인 및 케모카인 발현을 분석하였다. 상기 재구성된 표피는 매트텍(MatTek)으로부터 구입한 EPI-100-NMM 배지에 유지시킨 에피덤(EpiDerm) RHE 조직 모델이었다 (문헌 [Sa et al. 2007, J. Immunol . 178:2229-2240] 참조). 그 결과는 IL-22가 재구성된 인간 표피에서 IL-8, CXCL-1, MIP 3a, DMC, 및 MCP-1의 발현을 현저하게 유도시켰지만, IL-19, IL-20 또는 IL-24에 의한 유도 또한 관찰되었다는 것을 보여준다 (도 57). 본원에 기재된 상처 치유에 대한 IL-22의 효과의 관점에서, IL-19, IL-20, 및 IL-24는 상처 치유를 촉진시키는 데 일정 역할을 할 수도 있다.
실시예 18 - IL-22는 db/db 마우스의 부목을 댄 상처 모델에서 감염된 상처를 치료하는 데 있어서 VEGF PDGF 보다 탁월한 효능을 제공한다
마우스 상처 치유 모델에서, 수축은 마우스의 상처 봉합의 큰 부분을 차지하는데, 이는 마우스 피부의 움직임이 자유롭기 때문이다. 인간에서의 상처 치유 과정과 더 밀접하게 닮기 위해서는, 실리콘 링을 피부에 붙이고 국소 피부 수축을 방지하기 위하여 피부 주변을 봉합사로 고정시킨, 부목을 댄 상처 마우스 모델을 확립하였다 (도 59b에서의 대표적 영상 참조) (예를 들어, 문헌 [Zhao et al., 2012, Wound Rep. Reg. 20:342-352] 및 [Brubaker et al., 2013, J. Immunol., 190:1746-57] 참조). 이 모델에서는, 인간에서의 상처 치유 과정과 유사한 과립화 및 재상피화 과정을 통하여 상처를 치유하였다. 상처에 부목을 대기 위하여, 크래지(Krazy) 접착제 [엘머스 프로덕츠, 인크.(Elmer's Products, Inc.)]를 멸균성 실리콘 부목 [그레이스 바이오-랩, 인크.(Grace Bio-Labs, Inc.)]의 한쪽에 적용하고, 접착제면 아래에 있는 상처 주변에 부목을 조심스럽게 놓아두어 상처가 이러한 부목 내의 중앙에 있게 하였다. 접착제는 접촉되는 피부에 접착되고, 본 연구의 전체 과정 동안 부목으로서 제공되었다. 4개의 비연속성 6.0 나노필라멘트 나일론 봉합사 [에티콘, 인크.(Ethicon, Inc.)]를 이용하여 상기 부목을 추가로 피부에 고정시켰다. 상처를 테가덤 투명 필름으로 커버하기 전에, 상처의 디지털 영상을 찍었다. 추가로, 개방 상처에 대한 미생물 감염은 상처 치유를 지연시킬 수 있고, 만성 상처, 예컨대 당뇨병 환자에게 관찰된 만성 상처가 종종 감염된 상처이다.
부목을 댄 상처 모델을 이용하여, 감염된 상처에 대한 IL-22 Fc의 효과를 db/db 마우스에서 조사하였다. 야생형 또는 db/db 마우스에서 상기 언급된 바와 같이 절개된 상처에, 0.5 x 106 CFU, 1 x 106 CFU (플라크 형성 단위) 또는 2 x 106 CFU의 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 상처 절개 후 2일째에 국소 접종하였다. 도 58에 도시된 바와 같이, db/db 마우스는 야생형 마우스와 비교해서 지연된 상처 치유를 나타내었고, 대조군과 비교해서 이들 마우스에서 상처가 박테리아에 의해 감염된 경우에는 상처 치유가 추가로 지연되었다.
별도의 실험에서는, 부목을 댄 감염된 상처 모델에서 IL-22의 상처 치유 효과를 다른 작용제와 비교하였다. 상처 절개 후 2일째에, 30 ㎕ 식염수 중의 1 x 106 CFU의 메티실린-저항성 에스. 아우레우스 (S. aureus) 균주 USA300 NRS 384 (NARSA)를 상처 표면 상에 접종하고, 테가덤 필름으로 다시 커버하였다. 에스. 아우레우스 감염 후 48시간부터, 30 ㎕ 식염수 중의 30 ㎍의 IL22-Fc 또는 VEGF (로트 #110308, 제넨테크) 또는 PDGF [로트 #0507CY420, 페프로테크, 인크.(PeproTech, Inc.)]로 국소 처리를 시작하였는데, 그 후로는 매주 3회 투여하였다. 처리하기 전 및 상처가 봉합될 때까지 처리 후 매주 2회씩 상처의 디지털 영상을 기록하였다. NIH에서 개발된 자바-기반 영상 처리 프로그램인 이미지J(ImageJ)를 이용하여 상처 영상으로부터 상처 봉합 비율 (%)을 계산하였다.
도 59에 도시된 바와 같이, IL-22 Fc는 인간에서의 상처 치유와 더 밀접하게 닮은, 상기 부목을 댄 상처 모델에서 감염된 상처에 동일한 양의 화합물을 적용한 경우에 VEGF 보다 더 신속한 상처 치유를 증진시켰다. 그 다음, 상이한 용량의 VEGF 및 IL-22 Fc를 감염된 상처 상에서 시험하였다. 이 실험에서는, 혈당 > 300 mg/dl을 나타낸 db/db 마우스에서, 6 mm 직경의 부목을 댄 1개의 절개 상처를 창출시켰다. 각 상처에 1 x 106 CFU의 에스. 아우레우스 USA 300을 접종하였다. 식염수 중의 다양한 용량의 VEGF 또는 IL-22 Fc를 상처 봉합때까지 매주 3회씩 국소 투여하였다. 식염수를 대조군으로서 사용하였다. 상처 봉합시, 마우스를 희생시키고, 샘플을 대상으로 하여 조직학, 면역조직화학 및 PCR 분석 및 CFU 계수를 수행하였다. 도 60에서의 결과는 30 ㎍ 양의 IL-22 Fc가 60 ㎍ VEGF 보다 더 우수한 감염 상처 치유 효능을 입증하였다는 것을 나타낸다. 따라서, 부목을 대지 않은 상처 모델에서 관찰된 VEGF에 의한 더 신속한 표면 봉합은 마우스 피부 수축에 기인한 것으로 예상되었고, 각질세포 증식과 재상피화 증진에 대한 IL-22 Fc의 효과는 마우스 피부 수축에 의해 은폐되는 것으로 예상되었다.
유사한 결과가 도 61에 도시되는데, 여기서는 동일한 양 (30 ㎍)의 각 화합물을 상처에 적용한 경우에 IL-22 Fc가 VEGF 및 PDGF 보다 탁월한 효능을 지니고 있는 것으로 입증되었다. IL-22 Fc 처리된, 감염되고 부목을 댄 상처에서의 완전한 상처 봉합은 15일째에 관찰되었다. 그러나, VEGF- 또는 PDGF-처리된 마우스에서는, 감염되고 부목을 댄 상처의 완전한 봉합이 25일까지도 관찰되지 않았는데, 이는 감염되지 않고 처리되지 않은 상처와 동일하였다. 대조군, 즉 처리되지 않은 감염된 상처에서의 상처 봉합은 29일까지도 관찰되지 않았다. 특이적 기전(들)에 제한되는 것은 아니지만, IL-22 Fc가 상처 치유를 증진시키는 데 있어서 VEGF 또는 PDGF 보다 탁월한 것은 재상피화, 각질세포 증식 증진, 신생혈관증식의 유도, 조직 리모델링과 복구를 촉진시키기 위한 프로테아제의 유도, 및 항미생물 활성에 대한 그의 효과에 기인할 수 있다.
그 다음, 본 발명자들은 IL-22 Fc를 상처 치유를 위한 겔 제제로 투여할 수 있는지를 시험하였다. 이러한 실험에 사용되는 것으로 예시되는 겔 제제는 1 mg/g IL-22 Fc을 수반하거나 수반하지 않으면서, 0.5 mg/g 메티오닌 및 3% 히드록시프로필 메틸셀룰로스 [다우 케미탈(Dow Chemicals)로부터의 HPMC E4M 프리미엄]를 수반한 10 mM 인산나트륨 (pH 7.1)을 함유하였다. 부목을 댄 상처에 국소 적용하기에 앞서, 겔 용액과 IL-22 Fc 용액을 혼합하였다. IL-22 Fc를 함유하는 제제는 또한, 본래의 단백질 제제로부터 전달된 소량의 슈크로스 (< 20 mM) 및 P20 (< 0.002%)을 함유하였다. 도 62에 도시된 결과는 양 용액과 겔 제제 내의 IL-22 Fc가, 감염되지 않고 부목을 댄 상처에서 상처 치유를 증진시켰다는 것을 입증해 준다.
본 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 전술된 발명이 명확한 이해를 목적으로 예시 및 실시예를 통하여 일부 상세히 기재되긴 하였지만, 본 설명과 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 추론되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 이는 첨부된 청구범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc.et al. <120> IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 FC FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE <130> P5580R1-WO <140> To be assigned <141> Herewith <150> US 61/800148 <151> 2013-03-15 <150> US 61/800795 <151> 2013-03-15 <150> US 61/801144 <151> 2013-03-15 <150> US 61/821062 <151> 2013-05-08 <150> US 61/860176 <151> 2013-07-30 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human IL-22 <400> 1 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagcg 60 cccatcagct cccactgcag gcttgacaag tccaacttcc agcagcccta tatcaccaac 120 cgcaccttca tgctggctaa ggaggctagc ttggctgata acaacacaga cgttcgtctc 180 attggggaga aactgttcca cggagtcagt atgagtgagc gctgctatct gatgaagcag 240 gtgctgaact tcacccttga agaagtgctg ttccctcaat ctgataggtt ccagccttat 300 atgcaggagg tggtgccctt cctggccagg ctcagcaaca ggctaagcac atgtcatatt 360 gaaggtgatg acctgcatat ccagaggaat gtgcaaaagc tgaaggacac agtgaaaaag 420 cttggagaga gtggagagat caaagcaatt ggagaactgg 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tctgatgaag 180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cggaagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg t 1131 <210> 12 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (minus C-terminal Lys) N297G <400> 12 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 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tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cgctagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg t 1131 <210> 14 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (minus C-terminal Lys) N297A <400> 14 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp 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tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1131 <210> 16 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (full) N297G <400> 16 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 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ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcgc tagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1131 <210> 18 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (full) N297A <400> 18 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg 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180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cggaagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg 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caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattcg cgttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 480 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca 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gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1134 <210> 30 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (N297 wt) <400> 30 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val 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linker peptide <400> 33 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 34 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 35 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 36 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 37 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 38 Val Asp Lys Lys Val 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 44 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 45 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 45 Gly Gly Ser 1 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 46 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 47 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 48 <211> 146 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 48 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Ser Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe 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Synthetic IgG4 N297G forward primer <400> 58 acaaagccgc gggaggagca gttcggaagc acgtaccgtg tggtcagcgt c 51 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG4 N297G reverse primer <400> 59 gacgctgacc acacggtacg tgcttccgaa ctgctcctcc cgcggctttg t 51 <210> 60 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG2a <400> 60 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn 20 25 30 Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 63 Gly Gly Gly Ser Thr His Thr 1 5 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 64 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 65 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 15 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 66 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 67 Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 68 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 69 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 15 <210> 70 <211> 1152 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (58)..(597) <400> 70 cttcagaaca ggttctcctt ccccagtcac cagttgctcg agttagaatt gtctgca 57 atg gcc gcc ctg cag aaa tct gtg agc tct ttc ctt atg ggg acc ctg 105 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 gcc acc agc tgc ctc ctt ctc ttg gcc ctc ttg gta cag gga gga gca 153 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 gct gcg ccc atc agc tcc cac tgc agg ctt gac aag tcc aac ttc cag 201 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 cag ccc tat atc acc aac cgc acc ttc atg ctg gct aag gag gct agc 249 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 ttg gct gat aac aac aca gac gtt cgt ctc att ggg gag aaa ctg ttc 297 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 cac gga gtc agt atg agt gag cgc tgc tat ctg atg aag cag gtg ctg 345 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 aac ttc acc ctt gaa gaa gtg ctg ttc cct caa tct gat agg ttc cag 393 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 cct tat atg cag gag gtg gtg ccc ttc ctg gcc agg ctc agc aac agg 441 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 cta agc aca tgt cat att gaa ggt gat gac ctg cat atc cag agg aat 489 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 gtg caa aag ctg aag gac aca gtg aaa aag ctt gga gag agt gga gag 537 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 atc aaa gca att gga gaa ctg gat ttg ctg ttt atg tct ctg aga aat 585 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 gcc tgc att tga ccagagcaaa gctgaaaaat gaataactaa ccccctttcc 637 Ala Cys Ile ctgctagaaa taacaattag atgccccaaa gcgatttttt ttaaccaaaa ggaagatggg 697 aagccaaact ccatcatgat gggtggattc caaatgaacc cctgcgttag ttacaaagga 757 aaccaatgcc acttttgttt ataagaccag aaggtagact ttctaagcat agatatttat 817 tgataacatt tcattgtaac tggtgttcta tacacagaaa acaatttatt ttttaaataa 877 ttgtcttttt ccataaaaaa gattactttc cattccttta ggggaaaaaa cccctaaata 937 gcttcatgtt tccataatca gtactttata tttataaatg tatttattat tattataaga 997 ctgcatttta tttatatcat tttattaata tggatttatt tatagaaaca tcattcgata 1057 ttgctacttg agtgtaaggc taatattgat atttatgaca ataattatag agctataaca 1117 tgtttatttg acctcaataa acacttggat atccc 1152 <210> 71 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Ile <210> 72 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 72 atggctgtcc tgcagaaatc tatgagtttt tcccttatgg ggactttggc cgccagctgc 60 ctgcttctca ttgccctgtg ggcccaggag gcaaatgcgc tgcccgtcaa cacccggtgc 120 aagcttgagg tgtccaactt ccagcagcca tacatcgtca accgcacctt tatgctggcc 180 aaggaggcca gccttgcaga taacaacaca gatgtccggc tcatcgggga gaaactgttc 240 cgaggagtca gtgctaagga tcagtgctac ctgatgaagc aggtgctcaa cttcaccctg 300 gaagacgttc tgctccccca gtcagacagg ttccagccct acatgcagga ggtggtgcct 360 ttcctgacca aactcagcaa tcagctcagc tcctgtcaca tcagcggtga cgaccagaac 420 atccagaaga atgtcagaag gctgaaggag acagtgaaaa agcttggaga gagtggagag 480 atcaaggcga ttggggaact ggacctgctg tttatgtctc tgagaaatgc ttgcgtcgct 540 cgaggaccca caatcaagcc ctgtcctcca tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt 600 ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc 660 cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc 720 tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca gctcagacac aaacccatag agaggattac 780 aacagtactc tacgcgtggt cagtgccctc cccatccagc accaggactg gatgagtggc 840 aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc 900 tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa 960 gagatgacta agaaacaggt cactctgacc tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac 1020 atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa acagagctaa actacaagaa cactgaacca 1080 gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac 1140 tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca gtggtccacg agggtctgca caatcaccac 1200 acgactaaga gcttctcccg gactccgggt aaatga 1236 <210> 73 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 73 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn 20 25 30 Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln 115 120 125 Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn 130 135 140 Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Val Ala Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys 180 185 190 Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 195 200 205 Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr 210 215 220 Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser 225 230 235 240 Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His 245 250 255 Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile 260 265 270 Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 275 280 285 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 290 295 300 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 305 310 315 320 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 325 330 335 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 340 345 350 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 355 360 365 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 370 375 380 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 385 390 395 400 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 405 410 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 74 aggtccattc agatgctggt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 75 taggtgtggt tgacgtggag 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 76 ccaccccaca ctcacaccgg 20 <210> 77 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Lys Leu Gln Cys Val Ser Leu Trp Leu Leu Gly Thr Ile Leu Ile 1 5 10 15 Leu Cys Ser Val Asp Asn His Gly Leu Arg Arg Cys Leu Ile Ser Thr 20 25 30 Asp Met His His Ile Glu Glu Ser Phe Gln Glu Ile Lys Arg Ala Ile 35 40 45 Gln Ala Lys Asp Thr Phe Pro Asn Val Thr Ile Leu Ser Thr Leu Glu 50 55 60 Thr Leu Gln Ile Ile Lys Pro Leu Asp Val Cys Cys Val Thr Lys Asn 65 70 75 80 Leu Leu Ala Phe Tyr Val Asp Arg Val Phe Lys Asp His Gln Glu Pro 85 90 95 Asn Pro Lys Ile Leu Arg Lys Ile Ser Ser Ile Ala Asn Ser Phe Leu 100 105 110 Tyr Met Gln Lys Thr Leu Arg Gln Cys Gln Glu Gln Arg Gln Cys His 115 120 125 Cys Arg Gln Glu Ala Thr Asn Ala Thr Arg Val Ile His Asp Asn Tyr 130 135 140 Asp Gln Leu Glu Val His Ala Ala Ala Ile Lys Ser Leu Gly Glu Leu 145 150 155 160 Asp Val Phe Leu Ala Trp Ile Asn Lys Asn His Glu Val Met Ser Ser 165 170 175 Ala <210> 78 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Glu 35 40 45 Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys 65 70 75 80 Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125 His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln 130 135 140 Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 79 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val 20 25 30 Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser 35 40 45 Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 50 55 60 Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 65 70 75 80 Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 85 90 95 Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 100 105 110 Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 115 120 125 Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn 130 135 140 Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met 145 150 155 160 Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg 165 170 175 Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly 180 185 190 Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 195 200 205 <210> 80 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Met Leu Val Asn Phe Ile Leu Arg Cys Gly Leu Leu Leu Val Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Ile Ala Lys His Lys Gln Ser Ser Phe Thr Lys Ser Cys 20 25 30 Tyr Pro Arg Gly Thr Leu Ser Gln Ala Val Asp Ala Leu Tyr Ile Lys 35 40 45 Ala Ala Trp Leu Lys Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Lys Gln Phe Met Lys Asn Cys Gln 65 70 75 80 Phe Gln Glu Gln Leu Leu Ser Phe Phe Met Glu Asp Val Phe Gly Gln 85 90 95 Leu Gln Leu Gln Gly Cys Lys Lys Ile Arg Phe Val Glu Asp Phe His 100 105 110 Ser Leu Arg Gln Lys Leu Ser His Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala 115 120 125 Arg Glu Met Lys Ser Ile Thr Arg Met Lys Arg Ile Phe Tyr Arg Ile 130 135 140 Gly Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu 145 150 155 160 Ser Trp Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ser Gln 165 170

Claims (157)

  1. IL-22 수용체와 결합하는 IL-22 Fc 융합 단백질이며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 Fc 영역은 글리코실화되지 않은 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 8의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법이 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  11. 링커에 의해 IgG Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, Fc 영역은 글리코실화되지 않은 것인, IL-22 Fc 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 힌지 영역이 CPPCP의 아미노산 서열 (서열 31)을 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, Fc 영역 내의 N297 잔기가 변화되고/되거나 T299 잔기가 변화되는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, N297 잔기가 Gly 또는 Ala로 변화되는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, N297 잔기가 Gly로 변화되는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, T299 잔기가 Ala, Gly 또는 Val로 변화되는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 8개 내지 20개 아미노산 길이인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 링커가 8개 내지 16개 아미노산 길이인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 링커가 10개 내지 16개 아미노산 길이인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 DKTHT (서열 32)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 링커가 11개 이상의 아미노산 길이이고, 아미노산 서열 EPKSCDKTHT (서열 33)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 VEPKSCDKTHT (서열 34), KVEPKSCDKTHT (서열 35), KKVEPKSCDKTHT (서열 36), DKKVEPKSCDKTHT (서열 37), VDKKVEPKSCDKTHT (서열 38), 또는 KVDKKVEPKSCDKTHT (서열 39)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  24. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 EPKSSDKTHT (서열 40)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 VEPKSSDKTHT (서열 67), KVEPKSSDKTHT (서열 68), KKVEPKSSDKTHT (서열 66), DKKVEPKSSDKTHT (서열 64), VDKKVEPKSSDKTHT (서열 69), 또는 KVDKKVEPKSSDKTHT (서열 65)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  26. 제11항 또는 제21항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 GGS (서열 45)를 포함하지 않는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  27. 제11항 내지 제21항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 12 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  29. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 SKYGPP (서열 43)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 링커가 아미노산 서열 RVESKYGPP (서열 44)를 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  32. 제11항 내지 제19항 및 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 8 또는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  33. 제32항에 있어서, 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질.
  34. 제11항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 IL-22 Fc 융합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 상기 방법이 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 폴리펩티드가 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-22 Fc 융합 단백질.
  40. 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 아암 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 아암을 포함하는 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 아암과 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 아암을 발현할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 상기 방법이 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 하나 이상의 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli) 세포 또는 CHO 세포인 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질.
  44. 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 아암과 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 아암을 발현할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  45. 제44항에 있어서, 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제47항 또는 제48항에 있어서, 하나 이상의 숙주 세포가 이. 콜라이 세포인 방법.
  47. IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역과 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, Fc 영역은 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 IgG CH3 도메인을 포함하고, 조성물은 CH2 도메인 내에 5% 이하의 아푸코실화 수준을 갖는 것인 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 아푸코실화 수준이 2% 이하인 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 아푸코실화 수준이 1% 미만인 조성물.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 아푸코실화 수준이 질량 분광측정법에 의해 측정되는 것인 조성물.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, Fc 영역이 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  53. 제51항에 있어서, Fc 영역이 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 영역이 CPPCP의 아미노산 서열 (서열 31)을 포함하는 것인 조성물.
  55. 제51항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  56. 제55항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  57. 제55항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  58. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 이러한 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되고; Fc 영역의 CH2 도메인 내에 5% 이하의 아푸코실화 수준을 갖는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 아푸코실화 수준이 2% 이하인 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 아푸코실화 수준이 1% 미만인 조성물.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 정제에 의해 수득되는 것인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 것인 조성물.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 조성물.
  64. 제47항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 폴리펩티드가 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  65. 제1항 내지 제43항 및 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  66. 제65항에 있어서, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  68. 제67항에 있어서, 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 23 또는 서열 25의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  70. 제69항에 있어서, 서열 7 또는 서열 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  71. 제70항에 있어서, 서열 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  72. 제65항 내지 제71항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  73. 제72항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  74. 제73항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
  75. 제74항에 있어서, 이. 콜라이 세포 또는 CHO 세포인 숙주 세포.
  76. IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  77. 제76항에 있어서, 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 아푸코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 아푸코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질이 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거되는 것인 방법.
  80. 제76항 또는 제77항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이 세포인 방법.
  81. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
  82. 치료 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 IL-22 Fc 융합 단백질 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  83. 제82항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 24, 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  85. 제84항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 CHO 세포에서 생성되는 것인 제약 조성물.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역이 글리코실화되지 않은 것인 제약 조성물.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 부가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  89. 제1항 내지 제43항 및 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 폴리펩티드, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 여기서 제약상 허용되는 담체는 겔화제인 제약 조성물.
  90. 제89항에 있어서, 겔화제가 폴리사카라이드인 제약 조성물.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 겔화제가 셀룰로스성 작용제인 제약 조성물.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 겔화제가 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, POE-POP 블록 중합체, 알기네이트, 히알루론산, 폴리아크릴산, 히드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스인 제약 조성물.
  93. 제92항에 있어서, 겔화제가 히드록시프로필 메틸셀룰로스인 제약 조성물.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 투여용인 제약 조성물.
  95. 염증성 장 질환 (IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 염증성 장 질환 (IBD)을 치료하는 방법.
  96. IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 IBD를 치료하는 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, IBD가 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.
  98. 제97항에 있어서, IBD가 궤양성 결장염인 방법.
  99. 제97항에 있어서, IBD가 크론병인 방법.
  100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8, 서열 10, 서열 12, 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  103. 제95항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  104. 제95항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하는 방법.
  105. 장에서의 미생물 감염의 억제, 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포의 보존, 및 장에서의 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 증강을 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 장에서의 미생물 감염을 억제하고, 미생물 감염 동안 장에서의 배상 세포를 보존하며, 장에서의 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 증강시키는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상피 세포가 장 상피 세포인 방법.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8, 서열 10, 서열 12, 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  110. 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  111. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 복강내 또는 피하 투여하는 방법.
  112. 급성 신장 손상 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 급성 신장 손상 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법.
  113. 급성 신장 손상 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 급성 신장 손상 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8, 서열 10, 서열 12, 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8 또는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 제약 조성물이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  117. 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  118. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하는 방법.
  119. 상처 치유의 촉진 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상처 치유를 촉진 또는 개선하는 방법.
  120. 상처 치유의 촉진 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질, 또는 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상처 치유를 촉진 또는 개선하는 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상처가 만성 상처 또는 감염된 상처인 방법.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병이 있는 것인 방법.
  123. 제122항에 있어서, 당뇨병이 있는 대상체가 유형 II 당뇨병을 갖는 것인 방법.
  124. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 당뇨병성 족부 궤양인 방법.
  125. 제119항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 완전히 상처 봉합될 때까지 투여하는 방법.
  126. 제119항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  128. 제119항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 상처 치유를 촉진 또는 개선시키기 위한 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  129. 제119항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소 투여하는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 제약 조성물을 국소 투여하는 방법.
  131. 아테롬성 경화성 플라크 형성의 병리상태를 포함하는 심혈관계 상태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 심혈관계 상태를 예방 또는 치료하는 방법.
  132. 아테롬성 경화성 플라크 형성의 병리상태를 포함하는 심혈관계 상태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 심혈관계 상태를 예방 또는 치료하는 방법.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 심혈관계 상태가 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  134. 제131항 또는 제132항에 있어서, 아테롬성 경화성 플라크 형성의 진행을 느리게 하거나 또는 아테롬성 경화증의 징후를 예방하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  135. 제134항에 있어서, 아테롬성 경화증의 징후가 플라크 축적 또는 혈관 염증을 포함하는 것인 방법.
  136. 제131항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  137. 제136항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  138. 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  139. 제131항 또는 제132항에 있어서, 대상체가 심혈관계 상태의 발생 위험이 있는 것으로 확인된 방법.
  140. 제131항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여되하는 방법.
  141. 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대사 증후군을 치료하는 방법.
  142. 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대사 증후군을 치료하는 방법.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, 복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증 및 고혈압 중 한 가지 이상을 포함하는 대사 증후군과 연관된 한 가지 이상의 위험 요인을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS)의 수준을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  145. 제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 HDL/LDL 지질 프로파일 상의 변화를 필요로 하는 것인 방법.
  146. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  147. 제146항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  148. 제141항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  149. 제141항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하는 방법.
  150. 급성 내독소증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 급성 내독소증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법.
  151. 급성 내독소증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에게, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 또는 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 급성 내독소증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 대상체가 HDL/LDL 지질 프로파일 상의 변화를 필요로 하는 것인 방법.
  153. 제150항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  154. 제153항에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  155. 제150항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 급성 내독소증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하기 위한 한 가지 이상의 부가 치료제를 공-투여하는 방법.
  156. 제150항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하는 방법.
  157. 제95항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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