TW201809011A - 結合蛋白質及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供結合蛋白質，諸如抗體，其結合於GDNF家族受體α類(GFRAL)蛋白質，包括人類GFRAL蛋白質，及其使用方法。

Description

結合蛋白質及其使用方法
本申請案主張2016年3月31日申請之美國臨時申請案第62/316,516號之權利，其全部內容以引用的方式併入。
本發明大體上係關於結合蛋白質，諸如抗體，其結合於GDNF家族受體α類(GFRAL)蛋白質，包括人類GFRAL蛋白質，及其使用方法。
生長分化因子15(GDF15)為屬於轉型生長因子β(TGF-β)超家族之蛋白質。GDF15亦稱為TGF-PL、MIC-1、PDF、PLAB、NAG-1及PTGFB。據報導，GDF15 mRNA在肝臟中最豐富，且在一些其他組織中之發現量較低。在諸如肝臟、腎臟、心臟及肺之器官受損時，其在肝臟中之表現可顯著上調。
據報導，GDF15在受損組織中及在疾病過程期間起調節發炎性及凋亡路徑之作用。已報導GDF15為多種疾病中惡病體質之介體。然而，惡病體質為複雜且未完全理解的症候群。此外，至少一些腫瘤過表現及分泌GDF15，且升高的血清GDF15含量與多種癌症相關聯。已描述GDF-15為藉由抑制TNF-α、IL-1、IL-2及MCS-F之釋放來起作用之巨噬細胞活化之負調節劑，由此與TGF-β之作用類似地抑制局部發炎性信號傳導之陽性反饋。已揭示針對GDF15之單株抗體為治療惡病體質及癌症之潛在治療 劑。GDF15之受體為未知的。
存在對可有效治療與多種疾病和病狀相關之體重減輕之治療劑的顯著未滿足的需要，包括消耗性疾病(諸如惡病體質或肌肉減少症)及發炎性病狀(諸如全身性炎症或急性發炎反應)。亦存在對可有效治療慢性疾病(包括癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、全身性炎症及肌肉萎縮疾病，包括涉及非自主性體重減輕及/或肌肉質量損失之疾病)之治療劑的顯著未滿足的需要。
本發明提供一種蛋白質，其結合於GDNF家族受體α類(GFRAL)蛋白質，包括結合蛋白質，諸如結合於GFRAL蛋白質之抗體。包括抗體之此類結合蛋白質可結合於GFRAL多肽、GFRAL片段及/或GFRAL抗原決定基。此類結合蛋白質(包括抗體)可為拮抗劑(例如抑制GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之結合、抑制RET蛋白質與GFRAL蛋白質之結合、抑制GDF15蛋白質誘導之信號傳導及/或抑制GDF15/GFRAL或GDF15/GFRAL/RET受體複合物之形成)。
本發明亦提供結合蛋白質，包括抗體(例如單株抗體)或其片段，其(i)結合於蛋白質，(ii)抑制GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之結合，及/或(iii)抑制RET蛋白質與GFRAL蛋白質之結合。
在一些實施例中，抗GFRAL抗體為人類化抗體，其結合於GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL抗原決定基。在某些實施例中，抗GFRAL抗體包含如本文中所描述之名為1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4之單株抗 體或其人類化變異體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在某些實施例中，抗GFRAL抗體可進一步包含人類免疫球蛋白胺基酸序列或其變異體之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3及/或VL FR4。
在一些實施例中，結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)包含六個CDR或小於六個CDR。在一些實施例中，結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)包含選自VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR。在一些實施例中，結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自如本文中所描述之名為1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4之單株抗體或其人類化變異體之VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3的CDR。在一些實施例中，結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)進一步包含骨架區或構架區，其包括人類免疫球蛋白胺基酸序列或其變異體之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3及/或VL FR4。
在一些實施例中，抗體為人類化抗體\單株抗體\重組型抗體\抗原結合片段或其任何組合。在一些實施例中，抗體為人類化單株抗體或其抗原結合片段，其結合於GFRAL多肽(例如細胞表面表現或可溶性GFRAL)、GFRAL片段或抗原決定基。
本發明亦提供結合蛋白質，諸如抗GFRAL抗體，其(i)競爭性阻斷(例如以劑量依賴性方式)本文所提供之抗GFRAL抗體結合於GFRAL多肽(例 如細胞表面表現或可溶性GFRAL)、GFRAL片段或GFRAL抗原決定基及/或(ii)結合於由本文所提供之抗GFRAL抗體結合之GFRAL抗原決定基。在其他實施例中，結合蛋白質，諸如抗GFRAL抗體，競爭性阻斷(例如以劑量依賴性方式)本文中所描述之單株抗體25M22、3P10、8D8或5F12或其人類化變異體結合於GFRAL多肽(例如細胞表面表現或可溶性GFRAL蛋白質)、GFRAL片段或GFRAL抗原決定基。在其他實施例中，結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)結合於由本文中所描述之單株抗體25M22、3P10、8D8或5F12或其人類化變異體結合(例如識別)之GFRAL抗原決定基。
本發明亦提供結合蛋白質，包括抗體或其片段，其(i)結合於由分別包含以下之抗體識別的GFRAL蛋白質之抗原決定基：具有SEQ ID NO：3、7、11或15之胺基酸序列的重鏈可變區及具有SEQ ID NO：4、8、12或16之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(ii)與分別包含以下之抗體競爭結合於GFRAL蛋白質：具有SEQ ID NO：3、7、11或15之胺基酸序列的重鏈可變區及具有SEQ ID NO：4、8、12或16之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文中提供結合蛋白質，包括抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質(例如人類GFRAL蛋白質)之一或多個胺基酸之區域，包括抗原決定基。在一些實施例中，結合蛋白質(包括抗體或其片段)結合於GFRAL蛋白質(例如細胞外結構域之一或多個胺基酸殘基)之區域，包含例如結合於以下之結合蛋白質：(i)GFRAL蛋白質之結構域1(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基Q20至S130)；(ii)GFRAL蛋白質之結構域2(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基C131至C210)；(iii)GFRAL蛋白質之結構域3(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基C220至C316)；或(iv)GFRAL蛋 白質之細胞外結構域(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基Q20至E351)。
在一些實施例中，本文中提供結合蛋白質，包括抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之特異性抗原決定基(例如一或多個胺基酸殘基)，包含例如結合於以下之結合蛋白質：(i)包含GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之胺基酸殘基SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134或ALA135中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(ii)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188或CYS189中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(iii)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、 CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316或PHE317中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(iv)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315或CYS316中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(v)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197或GLN200中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(vi)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182或 MET185中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；(vii)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLN298或GLU301中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基；或(viii)包含SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261或LEU262中之至少一者(例如一或多者)的GFRAL蛋白質之抗原決定基。在一些實施例中，上文提供之此類抗體可抑制GDF15誘導之信號傳導及/或GFRAL/GDF15或RET/GFRAL/GDF15受體複合物之信號傳導或活化，例如在表現GFRAL蛋白質之細胞中。此外，在一些實施例中，抗體係單株抗體，例如人類化、人類或嵌合抗體。
在一些實施例中，結合蛋白質(諸如本文所提供之抗GFRAL抗體)結合或以重組方式連接至診斷劑、可檢測試劑(例如放射性同位素、酶、螢光化合物、生物發光化合物或化學發光化合物)。在一些實施例中，結合蛋白質(諸如本文所提供之抗GFRAL抗體)與治療劑一起使用(例如投與)。在一些態樣中，治療劑係藥物，包括一或多種藥物，諸如活化素-A抑制劑、ActRIIB抑制劑、IL-6抑制劑或IL-6R抑制劑、胃內激素、胃內激素模擬劑或GHS-R1a促效劑、SARM、TNFα抑制劑、IL-1a抑制劑、肌肉抑制素抑制劑、β-阻斷劑、黑皮質素肽抑制劑、黑皮質素受體抑制劑或抗癌劑。
在某些實施例中，提供組合物，其包含結合蛋白質，諸如本文中所描述之抗GFRAL抗體。本文中亦提供醫藥組合物，其包含結合蛋白質，諸如本文中所描述之GFRAL抗體。
本發明亦編碼結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)之免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈、VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3的經分離之核酸分子，該等結合蛋白質結合於GFRAL多肽、GFRAL多肽片段或GFRAL抗原決定基(例如GFRAL蛋白質之一或多個胺基酸，包括GFRAL蛋白質之細胞外結構域)。在一些實施例中，核酸分子編碼如本文中所描述之稱為1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4之單株抗體或其人類化變異體之VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在一些實施例中，核酸分子進一步編碼骨架區或構架區，包括人類免疫球蛋白胺基酸序列或其變異體之VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3及/或VL FR4。本文亦提供載體及宿主細胞，其包含編碼結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)之核酸分子，以及藉由在促進結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)產生之條件下培養本文中提供之宿主細胞來製備結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)之方法。
本發明亦提供治療、預防或緩解GFRAL介導之疾病、病症或病狀(包括GDF15介導之疾病、病症或病狀(例如一或多種症狀))之方法，其包含向個體投與治療有效量之結合蛋白質，諸如本文所提供之抗GFRAL抗體，包括有需要之個體，藉此治療、預防或緩解疾病、病症或病狀。在一些實施例中，疾病、病症或病狀係由GDF15蛋白質(例如人類GDF15蛋白質)及/或GFRAL蛋白質(例如人類GFRAL蛋白質)引起或以其他方式與其相關，諸如個體中與GDF15誘導之信號傳導相關之疾病、病症或病狀。 在某些實施例中，可藉由減少惡病體質、肌肉減少症或肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕之發生、出現頻率或嚴重度來治療疾病、病症或病狀。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係惡病體質。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係癌症。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係心血管疾病。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係慢性發炎疾病(例如慢性腎病、慢性阻塞性肺病)。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係對化學治療劑(例如抗腫瘤抗體，諸如曲妥珠單抗(trastuzumab))之敏感性(例如耐受性)降低之癌症，其係由GDF15蛋白質(包括升高之GDF15含量)誘導或與其相關。
在一些實施例中，疾病、病症或病狀係惡病體質、肌肉減少症、肌肉萎縮或肌肉質量損失、骨萎縮、非自主體重減輕(例如與疾病、病症或病狀相關或由其引起之體重減輕)或與其相關。在一些實施例中，疾病、病症或病狀選自與惡病體質相關之潛在疾病之群，包括(但不限於)癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症及全身性炎症之其他形式、肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症)及稱為神經性厭食症之進食障礙。
在一些實施例中，治療、預防或改善方法包括改良體重增加或降低體重減輕或改良肌肉質量增加或降低肌肉質量損失之方法。在一些實施例中，治療、預防或改善方法藉由預防、最小化或減少惡病體質、肌肉減少症或肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕之發生、出現頻率或嚴重度來引起經改良之治療癌症之方法。
本發明亦提供用於檢測樣品中之GFRAL的方法，其包含使樣品與包含可檢測試劑之結合蛋白質(諸如本文中所描述之抗GFRAL抗體)接觸。 在某些實施例中，樣品包含在表面上表現GFRAL之細胞。
本發明亦提供套組，其包含如本文中所描述之結合於GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL抗原決定基之結合蛋白質，諸如抗GFRAL抗體。
圖1 展示多種GFRAL蛋白質之間的序列比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖2 展示多種GDF15蛋白質之間的序列比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖3 描繪實驗結果，其展示例示性抗GFRAL抗體1C1及3P10對GFRAL蛋白質之結合親和力。
圖4A-4B 展示例示性抗GFRAL抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖5A-5F 展示結合於GFRAL之結構域1(圖5A-5B )、結構域2(圖5C-5D )或結構域3(圖5E-5F )之例示性抗GFRAL抗體之VH及VL序列的比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖6A-6B 展示人類化1C1抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖7A-7B 展示人類化25M22抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖8A-8B 展示人類化17J16抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖9A-9B 展示人類化5F12抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖10A-10B 展示人類化3P10抗體之VH及VL序列之比對。SEQ ID NO在括弧中且以粗體文字表示。
圖11 描繪使用人類化GFRAL抗體之受體拮抗劑分析之結果。
圖12 描繪展示人類化抗體之Elk1報導子分析之結果。
圖13A-13C 描繪展示例示性人類化抗GFRAL抗體之特異性之實驗結果。
圖14A-14B描繪展示DIO小鼠中GDF15誘導之體重減輕之抗GFRAL抗體抑制的實驗結果。對於圖14A ，圖中自左至右，所投與之治療劑分別為PBS、3P10、1C1、17J16、5A20、25M22、5F12及1MO3(分別對於d1、d2及d3)。對於圖14B ，圖中自左至右，所投與之治療劑分別為PBS、8D8及12A3(分別對於d1、d2及d3)。
圖15 描繪展示GDF15誘導之體重減輕模型中抗GFRAL抗體之實驗結果。
圖16 描繪展示抗GFRAL抗體對食物攝入之作用的實驗結果。
圖17 描繪展示DIO小鼠中抗GFRAL抗體對體重之作用的實驗結果。
圖18 描繪展示DIO小鼠中抗GFRAL抗體對食物攝入之作用的實驗結果。
圖19 描繪展示抗GFRAL抗體對脂肪量之作用的實驗結果。
圖20 描繪展示DIO小鼠中抗GFRAL抗體對GDF15誘導之體重減輕以及脂肪量及肌肉量減少之作用的實驗結果。
圖21 描繪展示DIO小鼠中抗GFRAL抗體對GDF15誘導之能量消耗增加及GDF15誘導之食物攝入減少之作用的實驗結果。
圖22 描繪展示偏瘦小鼠中抗GFRAL抗體對GDF15誘導之體重減輕以 及脂肪量及肌肉量減少之作用的實驗結果。
圖23 描繪展示偏瘦小鼠中抗GFRAL抗體對GDF15誘導之RER變化及GDF15誘導之食物攝入減少之作用的實驗結果。
圖24 描繪展示偏瘦小鼠中抗GFRAL抗體(3P10)對體重之作用的實驗結果。
圖25 描繪展示偏瘦小鼠中抗GFRAL抗體之投藥對食物攝入之作用的實驗結果。
圖26A-26C 描繪展示膳食腺嘌呤之作用的實驗結果。
圖27A 描繪展示膳食腺嘌呤之作用的實驗結果。
圖27B 描繪展示例示性抗GFRAL抗體(3P10)對患有慢性腎臟受損之小鼠之作用的實驗結果。
圖28 描繪展示例示性抗GFRAL抗體(3P10)對患有慢性腎臟受損之小鼠之作用的實驗結果。
圖29 描繪展示例示性人類化抗GFRAL抗體(h3P10)對GDF15誘導之體重減輕之作用的實驗結果。
圖30 展示GFRAL蛋白質及GDF15之複合物之例示性晶體。
圖31 說明例示性GFRAL電子密度圖。
圖32 展示在不對稱GFRAL/GDF15晶體單元中形成之GFRAL/GDF15複合物之例示性帶狀圖。GFRAL蛋白質結構域D2及D3指示為GFRAL D2及GFRAL D3。
圖33 展示兩個GFRAL/GDF15複合物之二聚體之例示性帶狀圖。GFRAL蛋白質結構域D2及D3指示為GFRAL D2及GFRAL D3。
圖34A-34B 展示兩個GFRAL/GDF15複合物之二聚體的不同表面表 示。
圖35 說明與GDF15胺基殘基相互作用之GFRAL胺基酸殘基。
圖36A-36D 說明GFRAL/GDF15界面。GFRAL蛋白質結構域D2及D3指示為GFRAL D2及GFRAL D3。
圖37A-37B 展示描繪為帶狀圖之GFRAL蛋白質及GFRα1之疊加的不同態樣。
圖38A-38D 說明RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白質與RET蛋白質之相互作用的不同態樣。
圖39A-39B 說明GFRAL蛋白質之RET蛋白質界面上的胺基酸殘基。
圖40 說明在結晶條件B11、D11及H8下產生之具有GFRAL蛋白質、3P10 Fab及25M22 Fab之複合物的例示性晶體。
圖41 說明在結晶條件C6、E11及C2下產生之具有GFRAL蛋白質、8D8 Fab及5F12 Fab之複合物的例示性晶體。
圖42 說明GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之晶體結構中3P10 Fab及25M22 Fab CDR區域之例示性電子密度圖。
圖43 說明GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物之例示性電子密度。
圖44 展示在不對稱GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物晶體單元中形成之GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之例示性帶狀圖。
圖45 展示與3P10 Fab及25M22 Fab有關之3P10 Fab及25M22 Fab CDR序列(上部各行)與GFRAL胺基酸殘基(下部各行)之比對。涉及GFRAL-Fab相互作用之殘基加框。對於3P10 Fab，關於Hc展示SEQ ID NO：1824之胺基酸殘基Q1至S120且關於Lc展示SEQ ID NO：1825之胺基酸殘基D1至F120。對於25M22 Fab，關於Hc展示SEQ ID NO：1826之胺 基酸殘基Q1至S120。
圖46 展示說明GFRAL 3P10 Fab抗原決定基與3P10Fab重鏈CDR區域之相互作用的帶狀圖。
圖47 展示說明GFRAL 3P10 Fab抗原決定基與3P10輕鏈CDR區域之相互作用的帶狀圖。
圖48 展示說明GFRAL 25M22抗原決定基與25M22 Fab重鏈CDR區域之相互作用的帶狀圖。
圖49 展示GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797之殘基S130至N318)以及SEQ ID NO：1826之25M22 Fab重鏈(HC)殘基Q1至P138及G146至P225及SEQ ID NO：1827之輕鏈(LC)殘基D1至E218的胺基酸序列。具有灰色背景及白色文字之殘基表示GFRAL蛋白質及25M22 Fab之核心相互作用界面胺基酸。具有灰色背景及黑色或白色字母之Fab HC或LC上之殘基表示25M22 Fab之例示性CDR序列。
圖50A-50B 說明GFRAL蛋白質上及涉及GFRAL/25M22 Fab相互作用之25M22 Fab上的核心相互作用界面胺基酸殘基。
圖51 說明涉及GFRAL/25M22 Fab相互作用之GFRAL蛋白質上的邊界相互作用界面胺基酸殘基。
圖52 展示帶狀圖之例示性側視圖，其說明作為空間填充表面模型(核心相互作用界面胺基酸)之GFRAL蛋白質上的重疊25M22 Fab及GDF15抗原決定基。
圖53 展示帶狀圖之俯視圖，其說明作為空間填充表面模型(核心相互作用界面胺基酸)之GFRAL蛋白質上的重疊25M22 Fab及GDF15抗原決定基。
圖54 展示GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797之殘基S130至N318)以及SEQ ID NO：1824之3P10 Fab重鏈(HC)殘基Q1至A130及G138至C221及SEQ ID NO：1825之輕鏈(LC)殘基D1至C218的胺基酸序列。具有灰色背景及白色文字之殘基表示GFRAL蛋白質及3P10 Fab之核心相互作用界面胺基酸。具有灰色背景及黑色或白色字母之Fab HC或LC上之殘基表示3P10 Fab之例示性CDR序列。
圖55A-55B 展示說明GFRAL/3P10 Fab複合物之晶體結構的帶狀圖。相互作用界面殘基展示為骨架模型(stick model)(圖55A )或空間填充表面模型(圖55B )。
圖56A-56B 以帶狀圖中之空間填充表面模型形式說明GFRAL之GFRAL 3P10 Fab抗原決定基之界面殘基。圖56A 展示核心相互作用界面殘基且圖56B 展示邊界相互作用界面殘基。
圖57 以GFRAL蛋白質之帶狀圖上的空間填充表面模型形式說明結合於3P10 Fab之GFRAL蛋白質之重疊殘基及結合於RET蛋白質之GFRAL蛋白質之殘基。
圖58 說明結合於3P10 Fab及25M22 Fab之GFRAL蛋白質之邊界相互作用界面殘基的組合覆蓋度。
圖59 展示在不對稱GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物晶體單元中形成之GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物之例示性帶狀圖。
圖60 展示GFRAL蛋白質上8D8 Fab及5F12 Fab結合位點之例示性帶狀圖。GFRAL蛋白質上對Fab結合重要之殘基展示為骨架模型。
圖61 展示GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797之殘基S130至N318)以及SEQ ID NO：1828之8D8 Fab重鏈(HC)殘基Q1至K217及SEQ ID NO：1829 之輕鏈(LC)殘基D1至R211的胺基酸序列。具有灰色背景及白色文字之殘基表示GFRAL蛋白質及8D8 Fab之核心相互作用界面胺基酸。具有灰色背景及黑色或白色字母之Fab HC或LC上之殘基表示8D8 Fab之例示性CDR序列。
圖62A、62B、62C及62D 說明GFRAL/8D8 Fab相互作用界面中之核心及邊界胺基酸殘基。
圖63A、63B、63C及63D 說明GFRAL/5F12 Fab相互作用界面中之核心及邊界胺基酸殘基。
圖64 展示GFRAL(SEQ ID NO：1797之殘基S130至N318)以及SEQ ID NO：1830之5F12 Fab重鏈(HC)殘基Q1至K223及SEQ ID NO：1831之輕鏈(LC)殘基N1至E217的胺基酸序列。
具有灰色背景及白色文字之殘基表示GFRAL蛋白質及5F12 Fab之核心相互作用界面胺基酸。具有灰色背景及黑色或白色字母之Fab HC或LC上之殘基表示5F12 Fab之例示性CDR序列。
本文中提供結合蛋白質，諸如結合GFRAL蛋白質(包括人類GFRAL蛋白質)之抗體。此類結合蛋白質(包括本文所揭示之抗體)之獨特性質為其拮抗性，包括抑制GDF15蛋白質之作用及/或抑制GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之結合或抑制RET蛋白質與GFRAL蛋白質的能力，包括其中結合之抑制可降低(例如阻斷)GDF15信號傳導。
顯然且特定言之，此類本文所揭示之針對GFRAL蛋白質之抗體之結合蛋白質(i)結合於GFRAL蛋白質，(ii)抑制GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之結合，及/或(iii)抑制RET蛋白質與GFRAL蛋白質之結合，包括阻斷 GDF15/GFRAL蛋白質複合物或GDF15/GFRAL/RET蛋白質複合物之形成或GDF15信號傳導，包含例如藉由若干活體外分析細胞之基於所量測。此類分析可包括(1)ELK1-螢光素酶報導子分析(參見例如實例3)；及/或(2)U2OS細胞中之ERK-磷酸化分析(參見例如實例4)。因此，預期如本文中所描述之結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)活體內抑制GDF15活性(例如與GDF15之信號傳導功能相關之活性)。此性質使得所揭示之結合蛋白質(包括抗GFRAL抗體)成為用於治療個體中由GDF15蛋白質(例如人類GDF15蛋白質)及/或GFRAL蛋白質(例如人類GFRAL蛋白質)引起或以其他方式與其相關之疾病、病症或病狀(諸如與GDF15誘導之信號傳導相關之疾病、病症或病狀)的可用治療劑。
本文中所提供之結合蛋白質(諸如結合GFRAL蛋白質之抗體)共有拮抗以下之結合之共同特徵：(i)aGDF15蛋白質與GFRAL蛋白質及/或(ii)RET蛋白質與GFRAL蛋白質。本文所提供之抗GFRAL抗體包括人類化抗GFRAL抗體，包括來源於或基於具有如表1-24或圖4-10 中所描述之CDR序列之1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8及/或P8G4的人類化抗GFRAL抗體。此類抗GFRAL抗體(包括人類化抗GFRAL抗體)結合於GFRAL蛋白質之特異性結構域，包含例如結合於以下之抗體：(i)GFRAL蛋白質之結構域1(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基Q20至S130)；(ii)GFRAL蛋白質之結構域2(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基C131至C210)；(iii)GFRAL蛋白質之結構域3(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基C220至C316)；或(iv)GFRAL蛋白質之細胞外結構域(例如SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基 Q20至E351)。
在本發明之一些實施例中，結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)可包含免疫球蛋白可變區，其包含一或多個如表1-24中所描述之互補決定區(CDR)。在此類結合蛋白質(例如抗GFRAL抗體)中，CDR可與一或多個骨架區或構架區接合，其使CDR定向使得獲得CDR之適當抗原結合特性。此類結合蛋白質(包括如本文中所描述之抗GFRAL抗體)可抑制(例如阻斷)(i)GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之間及/或(ii)RET蛋白質與GFRAL蛋白質之間的相互作用。此類結合蛋白質(包括如本文中所描述之抗GFRAL抗體)可抑制(例如阻斷)GDF15信號傳導。
在本發明之一些實施例中，結合蛋白質(諸如抗GFRAL抗體)結合於：(i)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質的抗原決定基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之胺基酸殘基SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134或ALA135；(ii)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、 CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR251、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188或CYS189；(iii)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316或PHE317；(iv)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315或CYS316；(v)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL 蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197或GLN200；(vi)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182或MET185；(vii)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基GLN298或GLU301；或(viii)包含以下中之至少一者(例如一或多者)之GFRAL蛋白質之抗原決定基：SEQ ID NO：1797之胺基酸殘基ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261或LEU262。在一些實施例中，上文提供之此類抗體可抑制GDF15誘導之信號傳導及/或GFRAL/GDF15或RET/GFRAL/GDF15受體複合物之信號傳導或活化，例如在表現GFRAL蛋白質之細胞中。此外，在本發明之一些實施例中，抗體係單株抗體，例如人類化抗體。
一般技術
本文中描述或參考之技術及程序包括熟習此項技術者使用常規方法通常良好理解及/或常用的技術及程序，諸如以下文獻中描述之廣泛使用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，(2003))；Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,Z.An編，Wiley,Hoboken N.J.(2009)；Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols,M.Albitar,ed.,Humana Press,Totawa,N.J.(2010)；及Antibody Engineering，第2版，第1及2卷，Kontermann及Dubel編，Springer-Verlag,Heidelberg,2010。
術語
除非另外描述，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有如一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語說明且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。所有專利案、申請案、公開申請案及其他公開案以全文引用之方式併入。在所闡述之術語之任何說明與以引用之方式併入本文中之任何文獻存在衝突之情況下，以下文闡述之術語說明為準。
除非另有指示，否則術語「GDNF家族受體α類」、「生長分化因子15受體」、「GFRAL」或「GFRAL蛋白質」及類似術語係指多肽(「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用)或來自任何脊椎動物來源之任何原生GFRAL，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類、食蟹獼猴(cynomolgus monkey/cyno))、犬及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)且在某些實施例中，包括相關GFRAL、多肽，包括其SNP變異體。GFRAL在此項技術中亦稱為「C6orf144」、「染色體6開放閱讀框架144」、「BA360D14.1」、「IVFI9356」及「UNQ9356」。
全長前驅體人類GFRAL之胺基酸序列提供於下文中，其包括信號肽序列(帶下劃線且小寫字母殘基)：
(SEQ ID NO：1797)。
成熟人類GFRAL多肽之胺其酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1798)。
在一些實施例中，GFRAL指與成熟人類GFRAL之胺基酸序列(SEQ ID NO：1798)具有至少55%一致性的蛋白質。如本文中所描述，結合蛋白質(諸如本文中所揭示之抗GFRAL抗體)可結合GFRAL及/或調節信號傳導。在某些實施例中，本文中所描述之抗體結合於人類GFRAL。
人類GFRAL具有細胞外結構域(例如SEQ ID NO：1797之殘基20-351)、跨膜域(例如SEQ ID NO：1797之殘基352-371)及細胞質域(例如SEQ ID NO：1797之殘基372-394)。
編碼前驅體GFRAL多肽之核酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1799)。
如本文所使用，「GFRAL」涵蓋人類GFRAL及其變異體，包括(但不限於)其直系同源物，諸如鼠類GFRAL、大鼠GFRAL、食蟹獼猴GFRAL及其類似物。GFRAL不為TGFβ RII(NCBI參考序列：NM_001024847.2(GI：133908632)；NM_003242.5(GI：133908633))或其直系同源物。GFRAL與TGFβRI(NCBI參考序列：NP_001124388.1(GI：195963412)；NP_004603.1(GI：4759226))或其直系同源物不同。在某些實施例中，GFRAL可為具有與SEQ ID NO：1797具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列的蛋白質。此類例示性GFRAL蛋白質包括黑猩猩(99%)、食蟹獼猴(92%)、大熊貓(82%)、犬(81%)、貓(80%)、豬(77%)、牛(75%)、小鼠(70%)、大鼠(70%)、中國倉鼠(Chinese hamster)(65%)及鴨嘴獸(59%)，如圖1 中所展示。
來自食蟹獼猴(科學名稱食蟹猴(Macaca fascicularis))之GFRAL蛋白質之胺基酸序列提供於下文中，其包括信號肽序列(帶下劃線的殘基)： (SEQ ID NO：1800)。
食蟹獼猴GFRAL蛋白質之編碼核酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1801)。
來自小鼠(科學名稱小家鼠(Mus musculus))之GFRAL蛋白質之胺基酸序列提供於下文中，其包括信號肽序列(帶下劃線的殘基)： (SEQ ID NO：1802)。
小鼠GFRAL蛋白質之編碼核酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1803)。
來自大鼠(科學名稱褐鼠(Rattus norvegicus))之GFRAL蛋白質之胺基酸序列提供於下文中，其包括信號肽序列(帶下劃線的殘基)： (SEQ ID NO：1804)。
大鼠GFRAL蛋白質之編碼核酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1805)。
GFRAL蛋白質或GFRAL亦指在胺基酸殘基(例如在變異體及/或物種中之非保守性位置)具有一或多個變化，同時保持保守性結構域且具有與天然存在之GFRAL類似的生物活性的蛋白質。GFRAL可由在一或多個鹼基方面與天然存在之DNA序列不同但歸因於遺傳密碼簡併仍轉譯成與天然存在之蛋白質對應的胺基酸序列之核酸序列編碼。GFRAL蛋白質亦指在一或多個保守性取代及/或標籤及/或結合物方面與天然存在之GFRAL序列不同的蛋白質。
術語「GFRAL」或「GFRAL蛋白質」涵蓋「全長」未經處理之GFRAL以及由細胞中之處理產生之GFRAL之任何形式。術語GFRAL或「GFRAL蛋白質」亦包括：對偶基因變異體(例如SNP變異體)；剪接變異體；同功異型物；片段；衍生物；取代、缺失及插入變異體；融合多肽；及種間同系物，其較佳保留GFRAL活性及/或足以產生抗GFRAL免疫反應。如熟習此項技術者將瞭解，本文所提供之抗GFRAL抗體可結合於GFRAL蛋白質，包括GFRAL多肽片段、GFRAL抗原及/或GFRAL抗原決定基。抗原決定基可為較大GFRAL抗原之一部分，較大GFRAL抗原可為較大GFRAL多肽片段之一部分，較大GFRAL多肽片段又可為較大GFRAL蛋白質之一部分。GFRAL蛋白質可以原生或變性形式存在。本文中所描述之GFRAL蛋白質可自多種來源(諸如自人類組織型或自另一來 源)分離，或藉由重組或合成方法製備。GFRAL蛋白質可包含與來源於自然界之相應GFRAL多肽具有相同胺基酸序列的多肽。GFRAL蛋白質涵蓋GFRAL多肽(例如細胞外結構域序列)之截短或分泌形式。多肽之變異體形式(例如交替剪接形式)及對偶基因變異體。本文中所描述之GFRAL多肽(例如人類GFRAL)可自多種來源分離，諸如自人類組織型或自另一來源，或藉由重組或合成方法製備。
與天然存在之全長GFRAL多肽相比，GFRAL蛋白質可缺少至少5個、至少10個、至多至少50個或更多個胺基酸。舉例而言，GFRAL蛋白質可不含基於天然存在之GFRAL多肽之胺基酸序列的信號序列。GFRAL蛋白質亦可含有與天然存在之GFRAL多肽相同或類似的轉譯後修飾或可不含轉譯後修飾。舉例而言，蛋白質可與天然存在之GFRAL多肽具有相同或類似的糖基化模式，或可不含糖基化。在其他實施例中，與天然存在之GFRAL蛋白質之序列相比，GFRL蛋白質包括突變，其在某一位置引入天然存在之GFRAL蛋白質中不存在的糖基化位點。
在某些實施例中，GFRAL蛋白質可表示為經遺傳修飾以在其細胞表面上表現GFRAL蛋白質之重組細胞。細胞可存在於包括經分離之GDF15蛋白質的組合物中。在某些情況下，細胞亦可表現RET蛋白質，例如細胞可在不經遺傳修飾以包括編碼RET蛋白質之外源性序列的情況下內源性表現RET蛋白質。在其他實施例中，細胞可不表現可偵測含量之RET蛋白質，且可經遺傳修飾以表現來自外源序列之RET蛋白質。
本文亦揭示GFRAL蛋白質之片段，諸如不含原生GFRAL蛋白質中之胞內域或原生GFRAL蛋白質(諸如圖1中描繪之原生GFRAL)中之胞內域及跨膜域的GFRAL片段。如上文所提及，GFRAL蛋白質之片段亦可不含原 生GFRAL中之信號序列且可包括或可不包括異源信號序列。片段可不含原生GFRAL蛋白質中之胞內域，但包括跨膜域。
術語「GFRAL細胞外結構域」(「GFRAL-ECD」)包括全長GFRALECD、GFRAL ECD片段及GFRAL ECD變異體。如本文所使用，術語「GFRAL ECD」指具有或不具有不含細胞內及/或跨膜結構域之信號肽的GFRAL多肽。在一些實施例中，GFRAL ECD係指具有與具有以下胺基酸序列之人類全長GFRAL ECD之胺基酸序列具有至少70%一致性的胺基酸序列的蛋白質： (SEQ ID NO：1806)。
如本文中所使用之術語「全長GFRAL ECD」係指擴展至細胞外結構域之最後一個胺基酸的GFRAL ECD，且可包括或可不包括N端信號肽。然而，應注意，「全長GFRAL ECD」亦涵蓋在C端上擴展1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸以包括跨膜域之胺基酸殘基的GFRAL-ECD(限制條件為多肽係可溶性)。換言之，此類GFRAL ECD不具有跨膜域之足夠長度，使得其不錨定至細胞膜中。片語「全長GFRAL ECD」亦涵蓋在N端上擴展1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸以包括信號肽之胺基酸殘基的GFRAL-ECD。在某些實施例中，GFRAL ECD係指與圖1 中描繪之相鄰胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性且不含圖1 中描繪之GFRAL 序列之C端處的至少30、33、35、40、45、50或55個或更多個胺基酸的相鄰胺基酸序列。
GFRAL ECD不為TGFβ RII(寄存編號：NM_001024847.2；NM_003242.5)或其直系同源物之ECD。GFRAL ECD與TGFβ RI(寄存編號：NP_001124388.1；NP_004603.1)或其直系同源物之ECD不同。在某些實施例中，GFRAL ECD可為具有與SEQ ID NO：1806具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列的蛋白質。
如本文所使用，術語「GFRAL ECD片段」指具有自全長ECD之N及/或C端之一或多個殘基缺失且保持結合於GDF15之能力的GFRAL ECD。在一些情況下，GFRAL ECD片段可包括或可不包括N端信號肽。在一些情況下，GFRAL ECD片段係不具有序列之N端處之1、5、10、15、16、17、18或19個殘基的人類GFRAL ECD片段： (SEQ ID NO：1807)
另一例示性GFRAL ECD片段包含以下胺基酸序列，其對應於全長人類前驅體GFRAL蛋白質之Q20至C316： (SEQ ID NO：1808)
另一例示性GFRAL ECD片段包含以下胺基酸序列，其對應於全長人類前驅體GFRAL蛋白質之W115至E351： (SEQ ID NO：1809)。
如實例中所描述，以上例示性GFRAL ECD片段用於多種方法中，包括用於產生包含GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質或GFRAL蛋白質及例示性抗GFRAL抗體之複合物的晶體。
在GFRAL蛋白質或GFRAL ECD內，存在三個結構域-結構域1(D1)、結構域2(D2)及結構域3(D3)。在一些實施例中，例示性D1結構域之胺基酸序列為SEQ ID NO：1797之殘基Q20至S130。在一些實施例中，例示性D2結構域之胺基酸序列為SEQ ID NO：1797之殘基C131至C210。 在一些實施例中，例示性D3結構域之胺基酸序列為SEQ ID NO：1797之殘基C220至C316。GFRAL蛋白質之某些特性可歸因於此等結構域之活性及/或結合，包括在ECD內。舉例而言，如本文中所描述，對於結合於GDF15蛋白質之GFRAL蛋白質，D2內之胺基酸殘基鑑別為核心相互作用界面胺基酸及/或邊界相互作用界面胺基酸。類似地，如本文中所描述，對於結合於RET蛋白質之GFRAL蛋白質，D3內之胺基酸殘基鑑別為核心相互作用界面胺基酸及/或邊界相互作用界面胺基酸。
術語「核心相互作用界面胺基酸」或其語法等效物係指既定蛋白質之胺基酸殘基，其具有至少一個與相互作用蛋白質相距小於或等於4.5Å的原子(例如與GDF15蛋白質或RET蛋白質相互作用之GFRAL蛋白質之胺 基酸)。4.5Å之距離使得凡得瓦爾力(van der Waals)半徑加可能的水介導之氫鍵內之原子可與相互作用蛋白質形成一個鍵。
術語「邊界相互作用界面胺基酸」或其語法等效物係指既定蛋白質之胺基酸殘基，其具有至少一個與既定蛋白質上之核心界面胺基酸相距小於或等於5Å之原子(例如在與GDF15蛋白質或RET蛋白質相互作用之GFRAL蛋白質之核心相互作用界面胺基酸相距5Å內的GFRAL蛋白質之胺基酸)。小於或等於5Å之距離使得結合於與既定蛋白質上之核心相互作用界面胺基酸相距小於5Å之殘基的蛋白質位於相互作用蛋白質之凡得瓦爾力半徑內。
如本文所使用，術語「GFRAL ECD變異體」係指含有胺基酸加成、缺失或取代且保留與GDF15之結合的能力的GFRAL ECD。此類變異體可與親本GFRAL ECD具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%一致性。
「生長分化因子15」「GDF15」(其在此項技術中亦稱為MIC-1(巨噬細胞抑制性細胞激素-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎盤骨形態生成蛋白質)、NAG-1(經非類固醇抗炎藥(NSAID)活化之基因)、TGF-PL及PTGFB)係轉型生長因子β(TGF-β)超家族之成員。GDF15(其以62kDa細胞內前驅蛋白形式合成，該前驅蛋白接著由弗林樣蛋白酶(furin-like protease)裂解)以25kDa二硫鍵連接之蛋白質形式分泌(參見例如Fairlie等人，J.Leukoc.Biol 65：2-5(1999))。在若干組織中發現GDF15 mRNA，包括肝臟、腎臟、胰腺、結腸及胎盤，且肝臟中之GDF15表現可在器官(諸如肝臟、腎臟、心臟及肺)受損期間顯著上調。
GDF15前驅體係含有29胺基酸型信號肽、167胺基酸型前結構域及 112胺基酸型成熟結構域(其藉由弗林樣蛋白酶自前結構域切除)之308胺基酸型多肽(NCBI參考序列NP_004855.2；GI：153792495)。
前驅體人類GDF15多肽之胺基酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1810)
此類308胺基酸型GDF15多肽稱為「全長」GDF15多肽；112胺基酸型GDF15多肽(「全長」GDF15之胺基酸197-308)係「成熟」GDF15多肽。
如本文中所使用之「GDF15」包括具有與成熟人類GDF15多肽之胺基酸序列具有至少65%一致性之胺基酸序列的蛋白質。成熟人類GDF15多肽之胺基酸序列提供於下文中： (SEQ ID NO：1811)
以上例示性成熟人類GDF15用於如實例中所描述之多種方法中，包括用於產生包含GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質之複合物的晶體。
除非另有指示，否則術語「GDF15」係指112胺基酸型成熟人類序列(例如SEQ ID NO：1811)。此外，對特定GDF15殘基之數值參考係指112胺基酸型成熟序列(例如殘基1為Ala(A)，且殘基112為SEQ ID NO：1811之Ile(I))。舉例而言，儘管GDF15前驅體胺基酸序列預測三個切除位點，產生「成熟」人類GDF15之三種假設形式(例如110、112及115個胺基酸)，但接受112胺基酸型成熟序列係正確的。
在本發明之情形中，「GDF15」或「GDF15蛋白質」包括來自其他哺乳動物物種之GDF15直系同源物及其經修飾形式以及其用途，包括小鼠(NP_035949；GI：170784848)、黑猩猩(XP_009433302.1；GI：694973734)、猩猩(XP_009251261.1；GI：686757768)、恆河猴(Rhesus monkey)(EHH29815；GI：355703324)、大熊貓(XP_002912774；GI：301753921)、長臂猿(XP_004089328.1；GI：441627981)、天竺鼠(XP_003465238；GI：348558868)、雪貂(AER98997；GI：355689945)、牛(NP_001193227；GI：329664989)、豬(NP_001167527；GI：291291599)、犬(XP_541938；GI：57101740)及鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)(AFV61279；GI：410111209)。此類例示性GDF15蛋白質展示於圖2 中，其包括多種例示性GDF15蛋白質之比對。人類GDF15之成熟形式與小鼠直系同源物具有約67%胺基酸一致性。
「RET」(其在此項技術中亦已知為Ret原癌基因、鈣黏素相關家族成員16、在轉染期間改組、RET受體酪胺酸激酶、鈣黏素家族成員12、原癌基因C-Ret、EC 2.7.10.1、CDHF12、CDHR16、RET51、PTC、羥基芳基-蛋白質激酶、RET轉型序列及受體酪胺酸激酶)為受體酪胺酸激酶之一，受體酪胺酸激酶係轉導用於細胞生長及分化之信號的細胞表面分子。RET充當共受體且已知在結合於GDNF受體α(GFRα)共受體之成員時為神經膠質細胞株衍生之神經營養因子(GDNF)配位體(在人類中，GDNF、青蒿琥酯、神經營養因子及珀瑟芬(persephin))之主要信號傳導受體。RET蛋白質(例如RET-ECD)包含4個連續鈣黏素樣結構域(CLD1-CLD4)，接著係細胞膜附近富含胱胺酸之結構域(CRD)。如本文中所揭示，RET蛋白質與GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質(例如與RET蛋白質充當共受體)係共受 體。如本文中所描述，受體複合物包括GFRAL蛋白質，諸如RET/GFRAL複合物、GFRAL/GDF15複合物及RET/GFRAL/GDF15複合物。
如本文中所使用，「Ret」或「RET」係指具有與SEQ ID NO：1813之胺基酸序列具有至少75%一致性(例如77%、79%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)之胺基酸序列的蛋白質。RET與TGFβ RI及TGFβ RII不同。SEQ ID NO：1812為不含信號肽之成熟人類RET9之序列： (SEQ ID NO：1812)
全長前驅體人類RET蛋白質之胺基酸序列提供於下文中，其包括信號肽序列(帶下劃線及小寫字母殘基)： (SEQ ID NO：1813)
因此，如本文中所使用之「RET」或「RET蛋白質」涵蓋人類RET及其變異體，包括(但不限於)其直系同源物，諸如鼠類RET、食蟹獼猴RET及其類似物。在某些實施例中，RET可為具有與SEQ ID NO：1813具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列的蛋白質。
在某些實施例中，提供經分離之RET細胞外結構域(RET-ECD)多肽。當存在於本發明之經分離之蛋白質複合物中時，RET-ECD可結合於配位體，諸如GFRAL蛋白質。術語「RET-細胞外結構域」(「RET-ECD」)包括全長RET ECD、RET ECD片段及RET ECD變異體。如本文 所使用，術語「RET ECD」係指具有或不具有不含細胞內及跨膜結構域之信號肽的RET多肽。在一些實施例中，RET ECD係指具有與具有以下胺基酸序列之人類全長RET ECD之胺基酸序列具有至少75%一致性之胺基酸序列的蛋白質： (SEQ ID NO：1814)
在另一例示性實施例中，RET ECD係指具有與具有以下胺基酸序列之人類全長RET ECD之胺基酸序列具有至少75%一致性之胺基酸序列的蛋白質：(SEQ ID NO：1815)
如本文中所使用，術語「全長RET ECD」係指擴展至細胞外結構域之最後一個胺基酸之RET ECD，且可包括或可不包括N端信號肽。然而，應注意，「全長RET ECD」亦涵蓋在C端上擴展1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸以包括跨膜域之胺基酸殘基的RET-ECD(限制條件為多肽係可溶的)。換言之，RET ECD不具有跨膜域之足夠長度，使得其不錨定至細胞膜中。片語「全長RET ECD」亦涵蓋在N端上擴展1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸以包括信號肽之胺基酸殘基的RET-ECD。在某些實施例中，RET片段係指與本文中所描述之RET之相鄰胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性且不含本文中所描述之RET序列之C端處的至少30、33、35、40、45、50或55個或更多個胺基酸的相鄰胺基酸序列。
如本文所使用，術語「RET ECD片段」係指具有自全長ECD之N及/或C端之一或多個殘基缺失且保留結合於GFRAL蛋白質之能力的RET ECD。在一些情況下，RET ECD片段可包括或可不包括N端信號肽。在 一些情況下，RET ECD片段係不含以下序列之N端處之1、5、10、15、16、17、18或19個殘基的人類RET ECD片段：(SEQ ID NO：1816)
以上例示性RET ECD片段用於實例中描述之多種方法中，包括用於產生包含RET蛋白質、GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質之複合物的模型。
在RET ECD之替代性實施例中，RET-ECD包含人類全長RET ECD SEQ ID NO：1814之RET ECD序列中之C64R、N75Q、N166Q或C183S突變。
當用於結合蛋白質(諸如結合於本發明之GFRAL的抗體)時，片語「調節活性及/或信號傳導」意謂結合蛋白質(例如抗體)模擬或調節由以下之結合誘導之活體外或活體內生物作用：(i)蛋白質；(ii)GDF15蛋白質及GFRAL蛋白質；或(iii)GDF15蛋白質、GFRAL蛋白質及RET蛋白質。在評估抗GFRAL抗體之結合及特異性時，舉例而言，當反應等於或小於野生型GFRAL標準(例如人類GFRAL蛋白質之成熟形式)之活性之95%且較佳等於或小於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%時，認為結合於GFRAL蛋白質(例如人類GFRAL蛋白質)之抗體或其片段誘導生物反應。亦認為結合於GFRAL(例如人類GFRAL)之抗體或其片段在其具有以下特性中之一或多者時誘導生物反應：呈現等於或小於GFRAL標準之95%之功效水準，其中在(1)ELK1-螢光素酶報導子分析(參見例如實例3)；或(2)U2OS細胞中之ERK-磷酸化分析(參見例如實例4)中之IC50等於或小於100nM，例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM。
術語「結合蛋白質」係指包含結合於GFRAL蛋白質(包括人類GFRAL蛋白質及視情況地，使結合部分具有可促進結合蛋白質與GFRAL多肽、片段或抗原決定基之結合之構形的骨架或構架部分(例如一或多個骨架或構架區))之部分(例如一或多個結合區，諸如CDR)的蛋白質。此類結合蛋白質之實例包括抗體，諸如人類抗體、人類化抗體；嵌合抗體；重組型抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；四功能抗體；Fab片段；F(ab')2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體，及其片段。結合蛋白質可包含例如具有接枝CDR或CDR衍生物之替代性蛋白質骨架或人工骨架。此類骨架包括(但不限於)抗體衍生骨架，其包含引入以例如使結合蛋白質之三維結構穩定的突變，以及完全合成骨架，其包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer等人，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,53(1)：121-129(2003)；Roque等人，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。此外，可使用肽抗體模擬物(「PAM」)以及基於使用纖維結合蛋白組分之抗體模擬物的骨架作為骨架。在本發明之情形中， 據稱結合蛋白質特異性結合或選擇性結合於GFRAL，例如在解離常數(KD )10-8 M時。當KD10-9 M或KD10-10 M時，結合蛋白質(例如抗體)可以高親和力特異性結合GFRAL。在一些實施例中，結合蛋白質(例如抗體)可結合於GFRAL，包括以約10-7 M與約10-12 M之間的KD ，且在其他實施例中，結合蛋白質(例如抗體)可以1-2×10-9 M之KD 結合。
如文下所描述，術語「抗體」及「免疫球蛋白」或「Ig」在本文中可互換地使用，且以最廣泛含義使用且尤其涵蓋例如個別抗GFRAL單株抗體(包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體)、具有多抗原決定基或單抗原決定基之抗GFRAL抗體組合物、多株或單價抗體、多價抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其呈現所需生物活性即可)、單鏈抗GFRAL抗體及抗GFRAL抗體之片段。抗體可為人類、人類化、嵌合及/或親和力成熟抗體以及來自其他物種(例如小鼠、兔等)之抗體。術語「抗體」意欲包括多肽之免疫球蛋白類別內B細胞之多肽產物，其能夠結合於特異性分子抗原且由兩對相同的多肽鏈組成，其中每對具有一個重鏈(約50-70kDa)及一個輕鏈(約25kDa)且各鏈之每個胺基端部分包括約100至約130個或更多個胺基酸之可變區且各鏈之每個羧基端部分包括恆定區(參見Borrebaeck(編)(1995)Antibody Engineering，第二版，Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology，第三版，W.H.Freeman and Company,New York)。在特定實施例中，可由本文所提供之抗體結合之特異性分子抗原包括GFRAL多肽、GFRAL片段或GFRAL抗原決定基。抗體亦包括(但不限於)合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、抗個 體基因型(抗Id)抗體及以上中之任一者的功能片段(例如抗原結合片段，諸如GFRAL結合片段)，其係指抗體重鏈或輕鏈多肽中保留產生片段之抗體之一些或全部結合活性之部分。功能片段(例如到結合片段，諸如GFRAL結合片段)之非限制性實例包括單鏈Fv(scFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。特定言之，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有結合於GFRAL抗原之抗原結合位點之抗原結合域或分子(例如抗GFRAL抗體之一或多個互補決定區(CDR))。可發現此類抗體片段描述於例如Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；Myers(編),Molec.Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,New York：VCH Publisher,Inc.；Huston等人，Cell Biophysics,22：189-224(1993)；Plückthun及Skerra,Meth.Enzymol .,178：497-515(1989)及Day,E.D.,Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)中。本文所提供之抗體可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或任何子類別(例如IgG2a及IgG2b)。抗GFRAL抗體可為促效性抗體或拮抗性抗體。本文所提供之抗體包括針對GFRAL之拮抗性抗體，例如抑制GFRAL信號傳導之抗體。例示性抗GFRAL抗體包括具有如表1-24中所示之CDR的抗體。
術語「約」或「大約」意謂與既定值或範圍相差20%以內、15%以內、10%以內、9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以 內、3%以內、2%以內、1%以內或更小。
「抗原」係抗體可選擇性結合之預定抗原。目標抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成化合物。在一些實施例中，目標抗原係多肽。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合結構域」、「抗原結合區」及類似術語係指抗體中包含與抗原相互作用之胺基酸殘基且賦予結合劑其針對抗原(例如互補決定區(CDR))之特異性及親和力的部分。
術語「結合(binds/binding)」係指分子之間的相互作用(例如共價或非共價)，包括例如形成複合物。複合物亦可包括由共價或非共價鍵、相互作用或力保持在一起的兩個或更多個分子的結合。相互作用可為例如非共價相互作用，包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用及/或凡得瓦爾相互作用。抗體上單個抗原結合位點與目標分子之單個抗原決定基(諸如GFRAL)之間的總非共價相互作用之強度係針對該抗原決定基之抗體或功能片段之親和力。抗體與單價抗原之締合(k1)與解離(k-1)之比率(k1/k-1)係締合常數K，其係親和力之量測值。抗體及抗原之不同複合物之K值不同且視k1及k-1而定。本文所提供之抗體之締合常數K可使用本文中提供之任何方法或熟習此項技術者熟知的任何其他方法測定。一個結合位點處之親和力並不始終反映抗體與抗原之間的相互作用的真實強度。當含有多個、重複抗原決定子之複雜抗原(諸如多價GFRAL)與含有多個結合位點之抗體接觸時，一個位點處抗體與抗原之相互作用將增加第二個位點處的反應機率。多價抗體與抗原之間的此類多重相互作用之強度稱為親合力。與抗體之個別結合位點之親和力相比，抗體之親合力可為其結合能力之更好量測值。舉例而言，高親合力可補償低親和力，如有時關於五聚IgM抗 體所發現，該等抗體之親和力可低於IgG，但具有由其多價引起之高IgM親合力，使得其能夠有效地結合抗原。
術語「特異性結合於GFRAL之抗體」、「特異性結合於GFRAL抗原決定基之抗體」及類似術語亦在本文中可互換地使用且係指特異性結合於GFRAL多肽(諸如GFRAL抗原或片段或抗原決定基(例如人類GFRAL，諸如人類GFRAL多肽、抗原或抗原決定基))之抗體。特異性結合於GFRAL(例如人類GFRAL)之抗體可結合於細胞外結構域或來源於GFRAL之細胞外結構域的肽。特異性結合於GFRAL抗原(例如人類GFRAL)之抗體可與相關抗原(例如食蟹獼猴GFRAL)交叉反應。在某些實施例中，特異性結合於GFRAL抗原之抗體不與其他抗原交叉反應。特異性結合於GFRAL抗原之抗體可例如藉由免疫分析、Biacore或熟習此項技術者已知的其他技術鑑別。當抗體與任何交叉反應性抗原相比以更高的親和力結合於GFRAL抗原時，其特異性結合GFRAL抗原，如使用實驗技術(諸如放射免疫分析(RIA)及酶連接免疫吸附劑分析(ELISA))測定。通常，特異性或選擇性反應將至少為兩倍背景信號或雜訊且可超過10倍背景。關於抗體特異性之論述，參見例如Paul編，1989,Fundamental Immunology Second Edition ,Raven Press,New York，第332 336頁。「結合」相關抗原(例如目標抗原，諸如GFRAL)之抗體係以足夠親和力結合抗原使得抗體適用作靶向表現抗原之細胞或組織的治療劑，且不與其他蛋白質顯著交叉反應。在此類實施例中，抗體與「非目標」蛋白質之結合程度將小於抗體與其特定目標蛋白質之結合的約10%，例如藉由所螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)測定。關於抗體與目標分子之結合，術語「特異性結合特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基」或「特異性結合於特定 多肽或特定多肽目標上之抗原決定基」或「對特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基具有特異性」意謂結合以可量測方式與非特異性相互作用不同。特異性結合可例如藉由與對照分子之結合相比測定分子之結合來量測，對照分子通常係不具有結合活性之具有類似結構的分子。舉例而言，特異性結合可藉由與目標類似的對照分子之競爭測定，例如過量的未經標記之目標。在此情況下，若經標記之目標與探針之結合由過量的未經標記之目標競爭性抑制，則表明特異性結合。如本文所使用，術語「特異性結合特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基」或「特異性結合於特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基」或「對特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基具有特異性」可例如由對目標具有以下Kd之分子呈現：至少約10-4 M，或至少約10-5 M，或至少約10-6 M，或至少約10-7 M，或至少約10-8 M，或至少約10-9 M，或至少約10-10 M，或至少約10-11 M，或至少約10-12 M或更大。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指其中分子結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而基本上不結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基的結合。在某些實施例中，結合於GFRAL之抗體具有小於或等於10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM之解離常數(Kd)。KD 越低，抗GFRAL抗體之親和力越高。在某些實施例中，抗GFRAL抗體結合於來自不同物種之GFRAL中(例如在人類與食蟹獼猴GFRAL之間)具有保守性之GFRAL之抗原決定基。
當在結合於目標上之相同抗原決定基或結合位點或關於其競爭之抗GFRAL抗體(例如結合於GFRAL之拮抗性抗體及結合蛋白質)之情形下使用時，術語「競爭」意謂相互之間的競爭，如藉由其中所研究之其抗體 (或結合片段)阻止或抑制參考分子(例如參考配位體，或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)與共同抗原(例如GFRAL或其片段)之特異性結合的分析所測定。若測試抗體與參考抗體競爭結合於GFRAL(例如人類GFRAL)，則多種競爭性結合分析可用於測定。可使用之分析之實例包括固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如Stahli等人，(1983),Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，(1986),J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見例如Harlow及Lane,(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，(1988),Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung等人，(1990),Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990),Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，此類分析涉及使用結合於攜有未經標記之測試抗原結合蛋白(例如測試抗GFRAL抗體)或經標記之參考抗原結合蛋白(例如參考抗GFRAL抗體)之固體表面或細胞的經純化之抗原(例如GFRAL，諸如人類GFRAL)。可藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測競爭性抑制。通常，存在過量的測試抗原結合蛋白。藉由競爭分析(競爭抗體)鑑別之抗體包括與參考抗體結合於相同抗原決定基之抗體及/或結合於足夠靠近由參考抗體所結合之抗原決定基之相鄰抗原決定基以發生位阻的抗體。本文中描述關於用於測定競爭性結合及/或與相同抗原決定基之結合之方法的其他細節。通常，當存在過量的競爭抗體蛋白質時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結 合達至少23%，例如40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，抑制結合達至少80%、85%、90%、95%、96%或97%、98%、99%或更高。
術語「抗GFRAL抗體」或「結合於GFRAL之抗體」包括能夠以足夠親和力結合GFRAL使得抗體適用作靶向GFRAL之診斷及/或治療劑的抗體。在某些實施例中，抗GFRAL抗體與非相關、非GFRAL蛋白質之結合程度小於抗體與GFRAL之結合的約10%，如例如藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析或免疫分析(諸如放射免疫分析(RIA))量測。本文中說明「特異性結合於GFRAL」或「對GFRAL具有特異性」之抗體。在某些實施例中，如本文中所描述之結合於GFRAL之抗體具有小於或等於10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM及/或大於或等於0.1nM之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗GFRAL抗體結合於來自不同物種之GFRAL中(例如在人類與食蟹獼猴GFRAL之間)具有保守性之GFRAL之抗原決定基。
如本文中所使用，術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在的一或多種蛋白質或其片段。晶體為物質之一種固態形式，其與諸如非晶形固態或液晶態之其他形式不同。晶體由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子組件(例如配位體/受體或抗原/抗體複合物)之常規、重複、三維陣列組成。此等三維陣列係根據本領域中充分理解之特定數學關係排列。在晶體中重複之基本單元或構築嵌段稱為不對稱單元。不對稱單元以符合既定、良好定義的晶體學對稱性之排列重複可提供晶體之「單位晶胞」。所有三個維度上單位晶胞藉由規則變換進行重複可提供晶體。參 見Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第2版，第201-16頁，Oxford University Press,New York,New York,(1999)。
「經分離之」抗體大體上不含來自衍生該抗體之細胞或組織來源及/或其他摻雜物組分之細胞材料或其他污染蛋白質，或在化學合成時大體上不含化學前驅體或其他化學物質。語言「大體上不含細胞材料」包括其中抗體與自其中分離或以重組方式產生該抗體之細胞的細胞組分分離的抗體製劑。因此，大體上不含細胞材料之抗體包括具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%(以乾重計)異源蛋白質(在本文中亦稱為「污染蛋白質」)之抗體製劑。在某些實施例中，當以重組方式產生抗體時，其大體上不含培養基，例如培養基占蛋白質製劑之體積之小於約20%、15%、10%、5%或1%。在某些實施例中，當藉由化學合成製備抗體時，其大體上不含化學前驅體或化學物質化學物質，例如其自涉及蛋白質合成之化學前驅體或其他化學物質分離。因此，此類抗體製劑具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%(以乾重計)除相關抗體以外的化學前驅體或化合物。摻雜物組分亦可包括(但不限於)將干擾抗體之治療性用途的材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶解物。在某些實施例中，抗體將經純化(1)達到大於95重量%抗體，如藉由勞立方法(Lowry method)(Lowry等人，J.Bio.Chem.193：265-275,1951)所測定，諸如96重量%、97重量%、98重量%或99重量%，(2)藉由使用旋轉杯測序儀達到足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(3)使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染料，藉由SDS-PAGE在還原或非還原性條件下達到均質性。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，因為 將不存在抗體之天然環境之至少一種組分。然而，通常，經分離之抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。在特定實施例中，本文所提供之抗體係經分離的。
4鏈抗體單元係由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈組成的雜四聚醣蛋白。在1gG的情況下，4鏈單元通常係約150,000道爾頓。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈視H鏈同型而藉由一或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有有規律間隔之鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著係各α及γ鏈之三個恆定域(CH)以及μ及ε同型之四個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，接著在其另一端為恆定域(CL)。VL與VH比對，且CL與重鏈(CH1)之第一恆定域比對。感信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH及VL對一起形成單一抗原結合位點。對於不同類別之抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr及Tristram G.Parslow(編),Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁及第6章。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體之輕鏈或重鏈之一部分，其通常位於輕鏈或重鏈之胺基端且在重鏈中長度為約120至130個胺基酸且在輕鏈中長度為約100至110個胺基酸，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈之可變區可稱為「VL」。術語「可變」係指可變區之某些區段在抗體中之序列方面廣泛不同之事實。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性不在可變區之110個胺基酸跨度內均勻分佈。實情為，V區由稱為構架區(FR)之可變性較低(例如相對恆定)之延伸子組成，構架區具有由稱為「高變區」之具有較大可變性(例如極端可變性)之較短區域分離 的約15-30胺基酸，每個高變區之長度係約9-12個胺基酸。重鏈及輕鏈之可變區各自包含由三個高變區連接之四個FR，該等FR大體上採用β片層組態，該等高變區形成連接β片層結構之環且在一些情況下形成β片層結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密接近結合在一起，且與來自另一個鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點之形成(參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恆定區不直接涉及抗體與抗原之結合，但呈現多種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。可變區在不同抗體之間的序列方面廣泛不同。序列中之可變性集中在CDR中，而可變區中可變性較低之部分稱為構架區(FR)。輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用。在特定實施例中，可變區係人類可變區。
術語「如Kabat中之可變區殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變體係指Kabat等人，Sequences of Proteins of lmmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中用於抗體編譯之重鏈可變區或輕鏈可變區之編號系統。使用此編號系統，實際線形胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52之後的單個胺基酸插入物(殘基52a，根據Kabat)，及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。通常在參考可變域中之殘基(約輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用Kabat編號系統(例如 Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。通常在參考免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用「EU編號系統」或「EU指數」(例如Kabat等人中報導之EU指數，見上文)。「如Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。已描述其他編號系統，包括例如由AbM、Chothia、Contact、IMGT及AHon所描述。各種編號系統說明於表1-24中。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及輕鏈恆定區CL及至少重鏈恆定區CH1、CH2及CH3的抗體。恆定區可包括人類恆定區或其胺基酸序列變異體。較佳完整抗體具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳為完整抗體之抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體及二雙功能抗體(參見例如Holliger,P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：6444-8；Lu,D.等人，(2005)J.Biol.Chem.280：19665-72；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；WO 93/11161；及美國專利案第5,837,242號及第6,492,123號)；單鏈抗體分子(參見例如美國專利案第4,946,778號；第5,260,203號；第5,482,858號及第5,476,786號)；雙可變域抗體(參見例如美國專利案第7,612,181號)；單可變域抗體(SdAb)(參見例如Woolven等人，Immunogenetics 50：98-101,1999；Streltsov等人，Proc Natl Acad Sci USA.101：12444-12449,2004)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
治療性抗體之「功能性片段」或「結合片段」或「抗原結合片段」將呈現至少一種(若非一些或全部)由完整抗體產生之生物功能，該功能包 含至少結合於目標抗原(例如GFRAL結合片段或結合於GFRAL之片段)。
如本文所使用，術語「融合蛋白」係指包含抗體之胺基酸序列及異源多肽或蛋白質(例如通常不為抗體(例如非抗GFRAL抗原結合抗體)之一部分的多肽或蛋白質)之胺基酸序列的多肽。當關於GFRAL或抗GFRAL抗體使用時，術語「融合」係指肽或多肽或其片段、變異體及/或衍生物與異源肽或多肽之接合。在某些實施例中，融合蛋白保持GFRAL或抗GFRAL抗體之生物活性。在某些實施例中，融合蛋白包含GFRAL抗體VH區、VL區、VH CDR(一個、兩個或三個VH CDR)及/或VL CDR(一個、兩個或三個VL CDR)，其中融合蛋白結合於GFRAL抗原決定基、GFRAL片段及/或GFRAL多肽。
當關於抗體使用時，術語「重鏈」係指具有約50-70kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括具有約120至130個或更多個胺基酸之可變區及包括恆定區(例如CH1、CH2、CH3、CH4)之羧基端部分。基於重鏈恆定區之胺基酸序列，恆定區可為五種不同類型中之一種(例如同型)，稱為α、δ、ε、γ及μ。不同重鏈之尺寸之不同：α、δ及γ含有約450個胺基酸，而μ及ε含有約550個胺基酸。當與輕鏈組合時，此等不同類型之重鏈產生抗體之五種熟知類別(例如同型)，分別為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG之四個子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。重鏈可為人類重鏈。
當關於抗體使用時，術語「輕鏈」係指具有約25kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括具有約100至約110個或更多個胺基酸之可變區及包括恆定區之羧基端部分。輕鏈之大致長度係211至217個胺基酸。基於恆定域之胺基酸序列，存在兩種不同類型，稱為κ或λ。輕鏈胺基酸序列在此項技術中已熟知。輕鏈可為人類輕鏈。
如本文所使用，術語「有效量」係指療法(例如本文中提供之抗GFRAL抗體或醫藥組合物；參見例如包含如表1-24中所示之CDR、VH及/或VL序列之抗體)之量，其足以降低症狀之嚴重度及/或出現頻率、消除症狀及/或潛在起因、預防症狀及/或其潛在起因出現及/或改良或修復由GDF15介導之疾病、病症或病狀引起或與其相關之損害，包括例如非自發性體重減輕、葡萄糖代謝病症或體重病症。此術語亦涵蓋減少或改善既定GDF15介導之疾病、病症或病狀之進展或進程、減少或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀之復發、發展或發作及/或改良或增強另一種療法(例如除本文所提供之抗GFRAL抗體以外的療法)之預防性或治療性作用所需的量。在一些實施例中，在一或多次給藥中投與有效量，包括間斷給藥，其中在一個治療期中進行一或多次給藥，接著在不投與抗體時進行休止期(例如一個治療期及休止期循環之後可為其他循環，其中一或多個治療期之後為一或多個休止期)。在一些實施例中，本文所提供之抗體之有效量係約0.1mg/kg(毫克抗體/公斤個體體重)至約100mg/kg。在某些實施例中其中提供之抗體之有效量係約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約60mg/kg、約70mg/kg、約80mg/kg、約90mg/kg或約100mg/kg(或其中的範圍)。在一些實施例中，如本文所使用之有效量亦指用於實現指定結果(例如模擬或調節由以下之結合誘導之活體外或活體內生物作用：(i)GFRAL；(ii)GDF15及GFRAL；或(iii)GDF15、GFRAL及RET)之本文所提供之抗體之量。舉例而言，有效量包括可有效實現以下結果之如本文中所描述之抗GFRAL抗體之量(例如在一或多次給藥中)： (i)增加體重；(ii)維持體重；(iii)減少體重減輕；(iv)增加體質(例如肌肉量或脂肪量)；(v)維持體質(例如肌肉量或脂肪量)；或(vi)減少體質損失(例如肌肉量或脂肪量)。
如本文所使用，術語「宿主細胞」係指可用核酸分子轉染之特定個體細胞及此類細胞之後代或潛在後代。歸因於繼代中可能存在突變或環境影響或核酸分子整合至宿主細胞基因體中，此類細胞之後代可不與用核酸分子轉染之母細胞一致。
術語「免疫調節劑」及其變化形式包括(但不限於)免疫調節劑，如本文所使用，其係指調節宿主之免疫系統的試劑。在某些實施例中，本文中提供之組合療法中使用之免疫調節劑不包括抗GFRAL抗體或抗原結合片段。免疫調節劑包括(但不限於)小分子、肽、多肽、蛋白質、融合蛋白、抗體、無機分子、模擬劑及有機分子。術語「小分子」及類似術語包括(但不限於)肽、肽模擬物、胺基酸、胺基酸類似物、聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、具有小於約10,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物(亦即包括異質性及/或有機金屬化合物)、具有小於約5,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物、具有小於約1,000公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物、具有小於約500公克/莫耳之分子量的有機或無機化合物以及此類化合物之鹽、酯及其他醫藥學上可接受之形式。在一些實施例中，免疫調節劑為免疫刺激劑。在一些實施例中，免疫調節劑係免疫抑制劑。在一些實施例中，免疫調節劑係稱為免疫核查點分子(例如共抑制性或共刺激性)之調節(例如抑制或刺激)蛋白質之試劑(例如抗體)，例如C10orf54、CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白、CD48、CD244、TIM- 3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、半乳糖凝集素9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113及TIGIT(例如共抑制性)及/或CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、細胞激素、光、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2及CD226(例如共刺激性)。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群獲得之抗體，例如包含除可能少量存在之可能的天然存在之突變以外在其他方面一致的群的個別抗體，且各單株抗體將通常識別抗原上之單個抗原決定基。在特定實施例中，如本文中所使用，「單株抗體」為藉由單個融合瘤或其他細胞製備之抗體，其中抗體僅結合於GFRAL抗原決定基，如例如藉由ELISA或此項技術中已知的其他抗原結合或競爭結合分析所測定。術語「單株」不限於任何用於製造抗體之特定方法。舉例而言，在本發明中適用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)描述之融合瘤方法製備，或可在細菌、真核動物或植物細胞中使用重組型DNA方法製得(參見例如美國專利案第4,816,567號)。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述之技術自噬菌體抗體文庫分離。藉此在此項技術中已熟知其他用於製備所表現之純系細胞株及單株抗體之方法(參見例如Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版，Ausubel等人編，John Wiley and Sons,New York中之第11章)。本文中之實例中提供製備單株抗體之例示性方法。
當與生物材料(諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及其類似物)結合使用時，術語「原生」係指在自然界中發現且未經人類操作、修飾及/或改變(例如分離、純化、選擇)之材料。
本文所提供之抗體可包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類別之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類別的抗體中的相應序列一致或同源；以及此類抗體之片段，只要其呈現所需生物活性即可(美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為嵌合抗體，其包括其中原生CDR殘基由來自非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力及能力之非人類靈長類動物)之相應CDR(例如供體抗體)之殘基置換的人類免疫球蛋白(例如受體抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個FR區殘基由相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供者抗體中未發現之殘基。可進行此等修飾以進一步改進抗體效能。人類化抗體重鏈或輕鏈可包含基本上所有至少一或多種可變區，其中所有或基本上所有CDR對應於非人類免疫球蛋白之CDR且所有或基本上所有FR係人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmarnn等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acd.Sci.USA 89：4285-4289(1992)；及美國專利案第6,800,738號(2004年10月5日頒 佈)、第6,719,971號(2005年9月27日頒佈)、第6,639,055號(2003年10月28日頒佈)、第6,407,213號(2002年6月18日頒佈)及第6,054,297號(2000年4月25日頒佈)。
「人類抗體」係擁有以下胺基酸序列者：對應於由人類所產生及/或已使用如本文所揭示之任一種製造人類抗體之技術所製造的抗體胺基酸序列。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的多種技術產生，包括噬菌體呈現文庫(Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991))及酵母呈現庫(Chao等人，Nature Protocols 1：755-768(2006))。亦可用於製備人類單株抗體的係Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner 等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)中描述之方法。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5：368-74(2001)。人類抗體可藉由向已經修飾以回應於抗原攻擊而產生此類抗體，但其內源性基因座經禁用之轉基因動物(例如小鼠)投與抗原來製備(參見例如Jakobovits,A.,Curr.Opin.Biotechnol.1995,6(5)：561-6；Br ü ggemann及Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.1997,8(4)：455-8；及美國專利案第6,075,181號及第6,150,584號，關於XENOMOUSETM 技術)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生人類抗體，亦參見例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。
「CDR」係指免疫球蛋白(Ig或抗體)VH β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(H1、H2或H3)之一，或抗體VL β-片狀構架之非構架區內的三個高變區(L1、L2或L3)之一。因此，CDR為構架區序列內穿插之可變 區序列。CDR區域為熟習此項技術者熟知且已由例如Kabat定義為抗體可變(V)域內高變性最高之區域(Kabat等人，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32：1-75(1978))。CDR區域序列亦在結構上由Chothia定義為不為保守性β-片狀構架之部分的殘基，且因此能夠適應不同構形(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。兩種術語在此項技術中皆良好識別。CDR區域序列亦由AbM、Contact及IMGT定義。CDR區域序列說明於表1-24中。已藉由大量結構之對比測定標準抗體可變區內CDR之位置(Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；Morea等人，Methods 20：267-279(2000))。因為不同抗體中高變區內之殘基數目不同，其他與標準位置有關之殘基習知地由標準可變區編號方案中之殘基編號後的a、b、c等編號(Al-Lazikani等人，見上文(1997))。此類命名法亦為熟習此項技術者熟知。
當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變區中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。通常，抗體包含六個高變區；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋多種高變區描述。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且為最常用的(參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。而Chothia係指結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-H1環末端在H32與H34之間變化，此視環的長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32； 若僅存在35A，則環末端位於33；若35A與35B皆存在，則環末端位於34)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的平衡，且由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用(參見例如Martin,Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag)。「接觸」高變區係基於可用複合晶體結構之分析。來自此等高變區或CDR中之每一者的殘基標示於下文中。
最近，已研發及廣泛採納一種通用編號系統，ImMunoGeneTics(IMGT)Information System®(Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(I)：55-77(2003))。IMGT為專用於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TR)及主要組織相容複合體(MHC)的整合式資訊系統。本文中，關於胺基酸序列及輕鏈或重鏈內的位置提及CDR。由於免疫球蛋白可變域之結構內CDR之「位置」在各物種之間為保守性且存在於稱為環之結構中，藉由使用根據結構特徵對準可變結構域序列之編號系統，可容易地鑑別CDR及構架殘基。此資訊可用於將來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基接枝及置換至通常來自人類抗體之受體架構中。Honegger及Plückthun,J.Mol.Biol. 309：657-670(2001)已研發另一種編號系統(AHon)。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的對應性為熟習此項技術者熟知的(參見例如Kabat，見上文；Chothia及Lesk,見上文；Martin，見上文；Lefranc等人，見上文)且亦說明於表1-24中。本文中展示之例示性案統與Kabat及Chothia組合。
高變區可包含如下「延伸高變區」：VL中24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)及VH中26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。如本文中所使用，術語「HVR」及「CDR」可互換地使用。
術語「恆定區」或「恆定域」係指輕鏈及重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體與抗原之結合，但呈現多種效應功能，諸如與Fc受體之相互作用。該等術語係指免疫球蛋白分子中相對於免疫球蛋白之其他部分(可變區，其含有抗原結合位點)具有保守性更高之胺基酸序列的部分。恆定區可含有重鏈之CH1、CH2及CH3區以及輕鏈之CL區。
術語「構架」或「FR」殘基為側接CDR之可變區殘基。FR殘基存在於例如嵌合、人類化、人類、結構域抗體、雙功能抗體、線形抗體及雙特異性抗體中。FR殘基係除高變區殘基或CDR殘基以外的可變域殘基。
「親和力成熟」抗體在其一或多個HVR中具有一或多種變化(例如胺基酸序列變異，包括改變、添加及/或缺失)之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，該等變化引起抗體對抗原之親和力改良。較佳親和力成熟抗體將對目標抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳之親和力。藉由此項技術中已知的程序產生親和力成熟抗體。關於綜述，參見Hudson及Souriau,Nature Medicine 9：129-134(2003)；Hoogenboom,Nature Biotechnol.23：1105-1116(2005)；Quiroz及Sinclair,Revista Ingeneria Biomedia 4：39-51(2010)。
「阻斷」抗體或「拮抗性」抗體係抑制或減少其所結合之抗原(例如GFRAL，如本文中所描述)之生物活性的抗體。舉例而言，阻斷抗體或拮抗性抗體可實質上或完全抑制抗原(例如GFRAL，如本文中所描述)之生 物活性。
「促效抗體」為觸發反應之抗體，例如模擬相關多肽之至少一種功能性活性之反應。促效抗體包括作為配位體模擬劑之抗體，舉例而言，其中配位體結合於細胞表面受體且該結合經由細胞間細胞信號傳導路徑誘導細胞信號傳導或活化且其中抗體誘導類似細胞信號傳導或活化。
GFRAL之「拮抗劑」係指能夠以可檢測方式抑制或以其他方式減少GFRAL之一或多種生物活性(諸如在表現GFRAL之細胞中)之分子(例如抗體)。在一些實施例中，GFRAL之拮抗劑(例如如本文中所描述之促效抗體)可例如藉由以可檢測方式抑制或以其他方式減少表現GFRAL之細胞之活化及/或細胞信號傳導路徑來起作用，藉此與在不存在拮抗劑之情況下GFRAL介導之生物活性相比，以可檢測方式減少細胞之GFRAL介導之生物活性。在一些實施例中，本文所提供之抗體係拮抗性抗GFRAL抗體，包括抑制包含GFRAL、GDF15及/或RET之複合物之信號傳導的抗體。由GFRAL拮抗劑引起之抑制或減少無需為澈底的，只要其可使用分析來偵測即可。舉例而言，以下實例中描述之基於細胞之分析可用於分析GFRAL之生物活性。
「結合親和力」通常指分子(例如結合蛋白質，諸如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所使用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1：1相互作用之固有結合親和力。結合分子X對其結合搭配物Y之親和力通常可由解離常數(KD )表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之方法)來量測親和力。低親和力抗體通常緩慢結合抗原且傾向於容易分解，而高親和力抗體通常較快結合抗原且傾向於 較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法，其中任一者可用於本發明之目的。特定說明性實施例包括以下。在一個實施例中，「KD 」或「KD 值」可藉由此項技術中已知的分析量測，例如藉由結合分析。可在放射性標記抗原結合分析(RIA)中量測KD ，例如用相關抗體之Fab版本及其抗原進行(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。KD 或KD 值亦可使用表面電漿子共振分析藉由Biacore量測，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，或使用例如OctetQK384系統(ForteBio,Menlo Park,CA)藉由生物層干涉法量測。亦可使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或OctetQK384系統(ForteBio,Menlo Park,CA)，藉由上述相同表面電漿子共振或生物層干涉法技術測定「締合率(on-rate/rate of association/association rate)」或「kon」。
片語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個數值(例如一個與本發明之抗體相關且另一個與參考抗體相關)之間的充分高度類似性，使得熟習此項技術者在藉由該等值(例如KD 值)量測生物特徵之情形中將認為兩個值之間的差具有極少或不具有生物及/或統計顯著性。舉例而言，根據參考抗體之值，兩個值之間的差可小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%。
如本文中所使用，片語「實質上減少」或「實質上不同」表示兩個數值(通常，一個與本發明之抗體相關且另一個與參考抗體相關)之間的差異程度足夠大，使得熟習此項技術者在藉由該等值量測生物特徵之情形中認為兩個值之間的差具有統計顯著性。舉例而言，根據參考抗體之值，該兩個值之間的差較佳可大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約 40%、大於約50%。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如原生序列Fc區或胺基酸序列變異型Fc區)之生物活性且隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
在本文中，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域，包括例如原生序列Fc區、重組型Fc區及變異型Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體之重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含移除所有K447殘基之抗體群、未移除K447殘基之抗體群及含有具有及不具有K447殘基之抗體之混合物的抗體群。
「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。此類效應功能通常需要Fc區與結合區或結合域(例如抗體可變區或可變域)組合且可評估，包括使用如本文中所揭示及/或此項技術中已知的多種分析。
「原生序列Fc區」包含與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致且未由人類操作、修飾及/或改變(例如分離、純化、選擇，包括其他序列(諸如可變區序列)或與其組合)之胺基酸序列。原生序列人類Fc區包括原 生序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；原生序列人類IgG2 Fc區；原生序列人類IgG3 Fc區；及原生序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。
「變異型Fc區」包含在至少一個胺基酸修飾(例如取代、添加或缺失，較佳為一或多個胺基酸取代)方面與原生序列Fc區之胺基酸序列不同的胺基酸序列。較佳地，相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區，變異型Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代；且在原生序列Fc區中或親本多肽之Fc區中較佳具有約一個至約五個胺基酸取代。本文中之變異型Fc區將較佳與原生序列Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，且更佳與其具有至少約90%同源性，例如與其具有至少約95%同源性。舉例而言，在下文中提供之胺基酸序列中以粗體展示在人類IgG1 Fc序列中之兩個位置具有兩個胺基酸變成丙胺酸之變異體： (SEQ ID NO：2001)
舉例而言，下文中提供之胺基酸序列中以粗體展示在經截短之人類IgG1 Fc序列中之兩個位置具有兩個胺基酸變成丙胺酸之變異體(其中不存在C端離胺酸殘基(IgG1△K Fc))： (SEQ ID NO：2002)
舉例而言，下文中提供之胺基酸序列中展示人類IgG1 Fc序列之經截短之變異體(其中不存在C端離胺酸殘基(IgG1△K Fc))： (SEQ ID NO：2003)
舉例而言，下文中提供之胺基酸序列中以粗體展示在人類IgG4 Fc序列中之一個位置具有胺基酸變成脯胺酸之變異體： (SEQ ID NO：2004)
舉例而言，下文中提供之胺基酸序列中以粗體展示在人類IgG4 Fc序列中之一個位置具有胺基酸變成脯胺酸之變異體，其中不存在C端離胺酸(IgG4△K Fc)：(SEQ ID NO：2005)
舉例而言，下文中提供之胺基酸序列中以粗體展示在人類IgG1 Fc序列中之一個位置具有胺基酸變成麩醯胺酸之變異體： (SEQ ID NO：2006)
表1-24以及圖4A、5A、5C、5E、6A、7A、8A、9A及10A之VH域中之任一者可與本文中所描述之變異型Fc區組合。包含變異型Fc區之例示性重鏈構築體可包括表示為下文所展示之以下構築體；可變區序列以粗體表示且CDR序列帶下劃線：
3P10 Fab Hc： (SEQ ID NO：1824)
25M22 Fab Hc： (SEQ ID NO：1826)
8D8 Fab Hc： (SEQ ID NO：1828)
5F12 Fab Hc： (SEQ ID NO：1830)
「輕鏈恆定區」包括κ及λ恆定區。表1-24以及圖4B、5B、5D、5F、6B、7B、8B、9B及10B之VL域中之任一者可與本文中所描述之κ或λ恆定區組合。
例示性κ恆定區提供於下文中： (SEQ ID NO：2007)
例示性λ恆定區提供於下文中： (SEQ ID NO：2008)
包含恆定區之例示性輕鏈構築體可包括表示為下文所展示之以下構築體；可變區序列以粗體表示且CDR序列帶下劃線：
3P10 Fab Lc： (SEQ ID NO：1825)
25M22 Fab Lc： (SEQ ID NO：1827)
8D8 Fab Lc： (SEQ ID NO：1829)
5F12 Fab Lc： (SEQ ID NO：1831)
當關於GFRAL或抗GFRAL抗體使用時，術語「變異體」可指與原生或未經修飾之GFRAL序列相比包含一或多個(例如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個)胺基酸序列取代、缺失及/或添加之肽或多肽。舉例而言，GFRAL變異體可由原生GFRAL之胺基酸序列之一或多個(例如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個)變化產生。亦作為實例，抗GFRAL抗體之變異體可由原生或先前未經修飾之抗GFRAL抗體之胺基酸序列之一或多個(例如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個) 變化產生。變異體可為天然存在，諸如對偶基因或剪接變異體，或可為人工構築。多肽變異體可由編碼變異體之相應核酸分子製備。在一些實施例中，GFRAL變異體或抗GFRAL抗體變異體分別至少保留GFRAL或抗GFRAL抗體功能性活性。在一些實施例中，抗GFRAL抗體變異體結合GFRAL及/或對GFRAL活性具有拮抗性。在一些實施例中，抗GFRAL抗體變異體結合GFRAL及/或對GFRAL活性具有促效性。在一些實施例中，變異體由編碼GFRAL或抗GFRAL抗體VH或VL區或子區(諸如一或多個CDR)之核酸分子之單核苷酸多形現象(SNP)變異體編碼。
術語「載體」係指用於運載或包括核酸序列(包括例如以將核酸序列引入宿主細胞)之物質。適用的載體包括例如表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工染色體，其可包括可操作以穩定整合至宿主細胞之染色體中的選擇序列或標記物。此外，載體可包括一或多個可選標記基因及適合的表現控制序列。可包括之可選標記基因例如提供對抗生素或毒素、補體營養缺陷型缺乏之抗性，或供應不在培養基中之關鍵營養素。表現控制序列可包括此項技術中熟知之組成性及可誘導啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子及其類似物。當共表現兩個或更多個核酸分子(例如抗體重鏈及輕鏈或抗體VH及VL)時，可將兩個核酸分子插入例如單個表現載體或單獨的表現載體中。對於單一載體表現，編碼核酸可以操作方式連接至一個共同表現控制序列，或連接至不同表現控制序列，諸如誘導型啟動子及一個組成性啟動子。可使用此項技術中熟知之方法證實將核酸分子引入宿主細胞。此類方法包括例如核酸分析，諸如北方墨點法(Northern blots)或mRNA之聚合酶鏈反應(PCR)擴增；或基因產物表現之免疫墨點法，或測試所引入之核酸序列或其相應基因產物之表現的其他適 合的分析方法。熟習此項技術者應理解，足量表現核酸分子以產生所需產物(例如本文中所描述之抗GFRAL抗體)，且亦應理解，可使用此項技術中熟知之方法最佳化表現量以獲得足夠的表現。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指某種形式之細胞毒性，其中所分泌的Ig結合於存在於某些細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)，使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於攜帶抗原之目標細胞且隨後用細胞毒素殺死目標細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且對於此類殺死為絕對需要的。用於調節ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現係已知的(參見例如表3，第464頁，Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991))。為了評估相關分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析(參見例如美國專利案第5,500,362號或第5,821,337號)。適用於此類分析之效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在例如動物模型中活體內評估相關分子之ADCC活性(參見例如Clynes等人，(USA)95：652-656(1998))。可選擇使用具有極少或不具有ADCC活性之抗體。
「Fc受體」或「FcR」描述結合於抗體之Fc區的受體。較佳FcR係原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體((例如γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的FcR。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有類似胺基酸序列，該等胺基酸序列主要在其細胞質結構域方面不同(參見例如綜述Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR為已知的(參見例如Ravetch及Kinet,Annu. Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995))。其他FcR包括將來鑑別之FcR，在本文中由術語「FcR」涵蓋。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中(參見例如Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。已描述具有改良或減弱的與FcR結合之抗體變異體(參見例如WO 2000/42072；美國專利案第7,183,387號、第7,332,581號及第7,335,742號；Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指目標細胞在補體存在下溶解。經典補體路徑之活化藉由補體系統(C1q)之第一組分結合於(適當子類之)抗體起始，該等抗體結合於其同源抗原。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996))。已描述具有改變之Fc區胺基酸序列(具有變異型Fc區之多肽)及增加或降低之C1q結合能力的多肽變異體(參見例如美國專利案第6,194,551號，WO 1999/51642，Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000))。可選擇使用具有極少或不具有CDC活性之抗體。
在計算一致性百分比時，可以提供序列之間的最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於測定一致性百分比之電腦程式係GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。使用電腦演算法GAP比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。可關於序列之各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如藉由演算法所測定)來比對序列。間隙開放罰分(其係按3×平均對角線計算，其中「平均對 角線」係所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」係由特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配之評分或數值)及空隙擴展罰分(gap extension penalty)(其通常為1/10×間隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
使用GAP程序測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的例示性參數如下：(i)演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.48：443-453；(ii)比較矩陣：來自Henikoff等人，1992，見上文之BLOSUM 62；(iii)間隙罰分：12(但末端間隔無罰分)；(iv)空位長度罰分：4；及(v)類似性之臨界值：0。
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可產生兩個序列之僅較短區域的匹配，且此較小比對區域可具有極高序列一致性，即使兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，可視需要調節所選擇的比對方法(例如GAP程式)以產生跨越許多胺基酸(例如目標多肽之至少50個相鄰胺基酸)之比對。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成， 例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
胺基酸殘基/位置之「修飾」係指與起始胺基酸序列相比主要胺基酸序列之改變，其中該改變由涉及該等胺基酸殘基/位置之序列變化引起。舉例而言，典型修飾包括用另一胺基酸進行之殘基之取代(例如保守性或非保守性取代)、與該殘基/位置相鄰之一或多個(例如通常少於5、4或3個)胺基酸之插入及/或該殘基/位置之缺失。
「抗原決定基」係抗原分子表面上單個抗體分子結合之位點，諸如抗原表面上之局部區域，諸如GFRAL多肽、GFRAL多肽片段或GFRAL抗原決定基，其能夠結合於抗體之一或多個抗原結合區，且具有動物(諸如哺乳動物(例如人類))中能夠引起免疫反應之抗原或免疫原性活性。具有免疫原性活性之抗原決定基係引起動物中抗體反應之多肽之一部分。具有抗原活性之抗原決定基係抗體結合之多肽之一部分，如藉由此項技術中之任何熟知方法所測定，包括例如藉由免疫分析測定。抗原抗原決定基無需必須為免疫原性。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。術語「抗原決定基」尤其包括線形抗原決定基及構形抗原決定基。有助於抗原決定基之多肽區域可為多肽之相鄰胺基酸，或抗原決定基可自多肽之兩個或更多個非相鄰區域聚集在一起。抗原決定基可為或可不為抗原之三維表面特徵。在某些實施例中，GFRAL抗原決定基係GFRAL多肽之三維表面特徵。在其他實施例中，GFRAL抗原決定基係GFRAL多肽之線形特徵。通常，抗原具有若干或多個不同抗原決定基且可與許多不同抗體反應。
當兩個抗體識別三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基時，抗體與參考抗體結合「抗原決定基」或「基本上相同的抗原決定基」或「相同抗原決定基」。用於測定兩個抗體是否結合於三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基之使用最廣泛及快速的方法為競爭分析，其可以許多不同格式組態，例如使用經標記之抗原或經標記之抗體。在一些分析中，抗原固定於96孔盤上，或表現於細胞表面上，且使用放射性、螢光或酶標記物量測未標記之抗體阻斷經標記之抗體之結合的能力。
「抗原決定基定位」為鑑別抗體在其目標抗原上之結合位點或抗原決定基的方法。抗體抗原決定基可為線形抗原決定基或構形抗原決定基。線形抗原決定基由蛋白質中胺基酸之連續序列形成。構形抗原決定基由在蛋白質序列中非連續，但在蛋白質摺疊成其三維結構時聚集在一起的胺基酸形成。所誘導之抗原決定基在蛋白質之三維結構呈改變的構形時形成，諸如在另一蛋白質或配位體之活化或結合後。
「抗原決定基分組」係基於抗體識別之抗原決定基來將抗體分組之方法。更特定言之，抗原決定基分組包含用於鑑別不同抗體之抗原決定基識別特性的方法及系統，使用競爭分析與用於基於抗體之抗原決定基識別特性聚集抗體及鑑別具有不同結合特異性之抗體的計算過程之組合。
「GFRAL介導之疾病」、「GFRAL介導之病症」及「GFRAL介導之病狀」可互換使用且係指任何完全或部分由GFRAL或GFRAL與GDF15之相互作用引起或作為其結果的疾病、病症或病狀，及/或其中需要抑制GDF15之活體內作用的任何疾病、病症或病狀。GFRAL介導之疾病、病症或病狀包括GDF15介導之疾病、病症或病狀。
「GDF15介導之疾病」、「GDF15介導之病症」及「GDF15介導之 病狀」可互換使用且係指滿足以下條件的任何疾病、病症或病狀：(i)完全或部分由GDF15蛋白質(例如GDF15蛋白質之活性，諸如GDF15信號傳導或升高之GDF15蛋白質含量)或GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質及/或RET蛋白質之相互作用引起；或(ii)為GDF15蛋白質或GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質及/或RET蛋白質之相互作用的結果，或者其中需要抑制GDF15之活體內作用的任何疾病、病症或病狀。GDF15介導之疾病、病症或病狀包括非自主體重減輕、惡病體質、肌肉減少症、肌肉萎縮、骨萎縮、心血管疾病、慢性發炎疾病(例如慢性腎病、慢性阻塞性肺病)及癌症，包括具有由GDF15蛋白質誘導或與其相關之降低之對化學治療劑(例如抗腫瘤抗體，諸如曲妥珠單抗)的敏感性(例如耐受性)的癌症。
如本文所使用，術語「治療有效量」係指足以降低及/或改善既定疾病、病症或病狀及/或與其相關之症狀的嚴重度及/或持續時間的藥劑(例如本文中所描述之抗體或本文中所描述之任何其他藥劑)的量。藥劑(包括治療劑)之治療有效量可為實現以下目的所需的量：(i)降低或改善既定疾病、病症或病狀之進展或進程，(ii)降低或改善既定疾病、病症或病狀之復發、發展或發作及/或(iii)改良或增強另一種療法(例如除本文所提供之抗體之投藥以外的療法)之預防性或治療性作用。本發明之物質/分子/藥劑(例如抗GFRAL抗體)之「治療有效量」可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重等因素及物質/分子/藥劑引發個體中所需反應之能力而變化。治療有效量涵蓋物質/分子/藥劑之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。在某些實施例中，術語「治療有效量」係指可有效「治療」個體或哺乳動物中之疾病、病症或病狀的抗體或其他藥劑(例如或藥物)的量。
「預防有效量」係指以必要的劑量及時間段有效達成所需預防結果之量。通常但未必，因為預防性劑量在疾病、病症或病狀之前或在疾病、病症或病狀之早期用於個體，因此預防有效量可小於治療有效量。
「慢性」投藥係指相對於急性模式，藥劑以連續模式(例如持續一段時間，諸如數天、數週、幾個月或幾年)投藥，以便在長時間段內維持初始治療作用(活性)。「間歇性」投藥為不在無間斷情況下連續進行，而實際上循環進行之治療。
與一或多種其他藥劑「組合」投藥包括同時(例如並行)及以任何順序連續投藥。在投與其他療法(例如其他藥劑)之情形下，術語「組合」包括使用超過一種療法(例如一種藥劑)。使用術語「組合」不限制向個體投與療法之次序。第一療法(例如藥劑)可在投與第二療法(例如藥劑)之前(例如1分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、8週、9週、10週、11週或12週)、同時或在投與第二療法之後(例如1分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週)投與曾經患有、患有GDF15介導之疾病、病症或病狀或對其敏感或具有罹患其之風險的個體。
任何其他療法(例如藥劑)可以任何順序與其他額外療法(例如藥劑)一起投與。在某些實施例中，抗體可與一或多種療法(諸如藥劑(例如並非當前投與之抗體的療法，包括藥劑))組合投與以預防、治療、管理及/或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀或其症狀。可與抗體組合投與之療法(例 如藥劑)之非限制性實例包括例如鎮痛劑、麻醉劑、抗生素或免疫調節劑或美國藥典(U.S.Pharmacopoeia) 及/或醫師案頭參考(Physician's Desk Reference) 中列舉之任何其他藥劑。適用於組合療法之藥劑之實例包括(但不限於)以下：非類固醇消炎藥(NSAID)，諸如阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)及其他丙酸衍生物(阿明洛芬(alminoprofen)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、布氯酸(bucloxic acid)、卡洛芬(carprofen)、芬布芬(fenbufen)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚洛芬(indoprofen)、酮基布洛芬、咪洛芬(miroprofen)、萘普生(naproxen)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、舒洛芬(suprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)及硫噁洛芬(tioxaprofen))、乙酸衍生物(引哚美辛(indomethacin)、阿西美辛(acemetacin)、阿氯芬酸(alclofenac)、環氯茚酸(clidanac)、雙氯芬酸(diclofenac)、芬氯酸(fenclofenac)、芬克洛酸(fenclozic acid)、芬替酸(fentiazac)、弗洛芬克(fuirofenac)、異丁芬酸(ibufenac)、伊索克酸(isoxepac)、噁平酸(oxpinac)、舒林酸(sulindac)、硫平酸(tiopinac)、托美丁(tolmetin)、齊多美辛(zidometacin)及佐美酸(zomepirac))、芬那酸(fenamic acid)衍生物(氟芬那酸(flufenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲芬那酸(mefenamic acid)、氟尼酸(niflumic acid)及托芬那酸(tolfenamic acid))、聯苯羧酸衍生物(二氟尼柳(diflunisal)及氟苯柳(flufenisal))、昔康(oxicam)(伊索昔康(isoxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、舒多昔康(sudoxicam)及替諾昔康(tenoxican))、水楊酸鹽(乙醯基水楊酸、柳氮磺胺吡啶)及吡唑啉酮(阿帕宗(apazone)、苯哌隆(bezpiperylon)、非普拉宗(feprazone)、莫非布宗(mofebutazone)、 羥布宗(oxyphenbutazone)、苯基丁氮酮)。其他組合包括環加氧酶-2(COX-2)抑制劑。其他用於組合之藥劑包括類固醇，諸如潑尼龍(prednisolone)、強的松(prednisone)、甲基潑尼龍、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)，或氫化可的松(hydrocortisone)。此類組合可尤其有利，因為在與本發明之抗體組合治療個體時，可藉由逐漸減少所需類固醇劑量來減少或甚至消除類固醇之一或多種副作用。用於組合之藥劑之其他實例包括細胞激素抑制性消炎藥(CSAID)；針對其他人類細胞介素或生長因子之抗體或拮抗劑，例如TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF。藥劑之組合可包括TNF拮抗劑，例如嵌合、人類化或人類TNF抗體、REMICADE、抗TNF抗體片段(例如CDP870)及可溶性p55或p75 TNF受體、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL®)或p55TNFR1gG(LENERCEPT®)、可溶性IL-13受體(sIL-13)以及TNFα轉化酶(TACE)抑制劑；IL-1抑制劑(例如介白素-1轉化酶抑制劑)亦可有效。其他組合包括介白素11、抗P7s及P-選擇素醣蛋白配位體(PSGL)。適用於組合療法之藥劑之其他實例包括干擾素-β1a(AVONEX)；干擾素-β1b(BETASERON®)；克帕松(copaxone)；高壓氧；靜脈內免疫球蛋白；克拉屈濱(clabribine)；及針對其他人類細胞介素或生長因子之抗體或拮抗劑(例如針對CD40配位體及CD80之抗體)。
如本文所使用，「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常生理學上可接受之載劑為水性pH值緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括 抗壞血酸；低分子量(例如小於約10個胺基酸殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM 。術語「載劑」亦可指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全或不完全))、賦形劑或媒劑。此類載劑(包括醫藥學上可接受之載劑)可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當靜脈內投與組合物(例如醫藥組合物)時，水係例示性載劑。亦可使用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的賦形劑(例如醫藥賦形劑)包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、粉末、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、丙三醇單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、無水脫脂牛奶、丙三醇、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。若需要，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH值緩衝劑。組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。口服組合物(包括調配物)可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素、碳酸鎂等。適合的醫藥學載劑之實例描述於Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA.中。組合物，包括醫藥學化合物，可含有預防或治療有效量之抗GFRAL抗體(例如呈分離或純化形式)及適量載劑以便提供用於適當投與個體(例如患者)之形式。調配物應適合投藥模式。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」意謂聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)、歐洲藥典(European Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於動物，且更特定言之用於人類。
術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其呈諸如允許活性成分(例如抗GFRAL抗體)之生物活性有效之形式，且其不含對接受調配物投藥之個體具有不可接受之毒性的其他組分。此類調配物可為無菌的。
「無菌」調配物為無菌的或不含所有活微生物及其孢子。
如本文所使用，「多株抗體」係指在對具有多個抗原決定基之蛋白質之免疫原性反應中產生的抗體群且因此包括針對蛋白質內相同及不同抗原決定基之多種不同抗體。用於製備多株抗體之方法為此項技術中已知的(參見例如Short Protocols in Molecular Biology ,(2002)第5版，Ausubel等人編，John Wiley and Sons,New York中之第11章)。
「經分離之核酸」係核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物，其實質上自天然伴有原生序列之其他基因體DNA序列以及蛋白質或複合物(諸如核糖體及聚合酶)分離。「經分離」之核酸分子為與存在於該核酸分子之天然來源中之其他核酸分子分離的核酸分子。此外，「經分離」之核酸分子(諸如cDNA分子)可實質上不含其他細胞材料或培養基(當藉由重組型技術製備時)，或實質上不含化學前驅體或其他化學物質(當化學合成時)。在特定實施例中，分離或純化一或多種編碼如本文中所描述之抗體之核酸分子。該術語涵蓋自天然存在之環境移出之核酸序列，且包括重組型或經選殖之DNA分離物及化學合成類似物或藉由異源系統生物合成之類似物。實質上純分子可包括分子之經分離之形式。
如本文中可互換使用，「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核 苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物、或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如本文中所使用，「寡核苷酸」通常指短的、通常為單股的、通常合成的聚核苷酸，其長度通常(但未必)小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」並非相互排斥。以上關於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。產生本發明之抗GFRAL抗體之細胞可包括親本融合瘤細胞，以及引入編碼抗體之核酸的細菌及真核宿主細胞。適合的宿主細胞揭示於下文中。
如本文中所使用，術語「治療」係指由一或多種療法之投藥(包括(但不限於)一或多種預防劑或治療劑(諸如本文所提供之抗體)之投藥)引起之GDF15介導之疾病、病症或病狀之進程、嚴重度及/或持續時間之減少或改善。在一些實施例中，藥劑係抗GFRAL抗體。如本文所使用，治療包括(但不限於)(i)增加體重；(ii)維持體重；(iii)減少體重減輕；(iv)增加體質(例如肌肉量或脂肪量)；(v)維持體質(例如肌肉量或脂肪量)；(vi)減少體質損失(例如肌肉量或脂肪量)，或其任何組合。
如本文所使用，術語「預防劑」係指任何可完全或部分抑制個體中GDF15介導之疾病、病症或病狀及/或其相關症狀之發展、復發、發作或傳播的藥劑。在一些實施例中，術語「預防劑」係指本文所提供之抗體。在一些實施例中，術語「預防劑」係指除本文所提供之抗體以外的藥劑。在一些實施例中，預防劑為已知適用於或已經用於或當前正用於預防GDF15介導之疾病、病症或病狀及/或與其相關的症狀或阻礙GDF15介導之疾病、病症或病狀及/或與其相關的症狀之發作、發展、進程及/或嚴重 度的藥劑。在一些實施例中，預防劑係完全人類抗GFRAL抗體，諸如完全人類抗GFRAL單株抗體。
術語「預防劑」係指任何可完全或部分抑制個體中GDF15介導之疾病、病症或病狀或其症狀之發展、復發、發作或傳播的藥劑。在某些實施例中，術語「預防劑」係指如本文中所描述之抗GFRAL抗體。在某些其他實施例中，術語「預防劑」係指除如本文中所描述之抗GFRAL抗體以外的藥劑。在某些實施例中，預防劑為已知適用於或已經用於或當前正用於預防GDF15介導之疾病、病症或病狀及/或與其相關的症狀或阻礙GDF15介導之疾病、病症或病狀及/或與其相關的症狀之發作、發展、進程及/或嚴重度的藥劑。在特定實施例中，預防劑係人類化抗GFRAL抗體，諸如人類化抗GFRAL單株抗體。
術語「藥品說明書」用於指治療產品之商業封裝中通常包括之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌及/或關於使用此類治療產品之警告的資訊。
術語「預防」係指由本文中提供之療法或療法組合(例如預防劑或治療劑(諸如本文所提供之抗體)之組合)引起的GDF15介導之疾病、病症或病狀或其症狀的發展、復發、發作或傳播的完全或部分抑制。
術語「重組型抗體」係指藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體。重組型抗體可為使用轉染至宿主細胞中之重組型表現載體表現之抗體、自重組型、組合性抗體文庫分離之抗體、自動物(例如小鼠或牛)分離之抗體(對於人類免疫球蛋白基因為轉基因及/或轉殖染色體)(參見例如Taylor,L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或藉由涉及免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列之編接的任何其他手段製備、表現、 產生或分離之抗體。此類重組型抗體可具有可變區及恆定區，包括來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(參見Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)。然而，在某些實施例中，此類重組型抗體可經歷活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉基因動物時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組型抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但活體內可不天然存在於人類抗體生殖系譜系內之序列。
術語「副作用」涵蓋療法(例如預防劑或治療劑)之不合需要及不良作用。不合需要之作用未必為不良的。來自療法(例如預防劑或治療劑)之不良作用可為有害或不適或有風險的。副作用之實例包括腹瀉、咳嗽、胃腸炎、哮喘、噁心、嘔吐、厭食、腹部痙攣、發熱、疼痛、體重減輕、脫水、禿髮症、呼吸困難、失眠、頭暈、黏膜炎、神經及肌肉作用、疲乏、口乾及食慾不振、在投藥位點處皮疹或腫脹、流感樣症狀(諸如發熱、發冷及疲乏)、消化道問題及過敏反應。患者經歷之其他不合需要的作用為眾多且在此項技術中已知的。許多不合需要的作用描述於Physician's DeskReference (第60版，2006)中。
術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用且在本文所揭示之方法之情形下，係指作為療法或預防性情況之受體的動物。如本文中所使用，在某些實施例中，個體係哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)。在特定實施例中，個體係人類。在一個實施例中，個體為患有GDF15介導之疾病、病症或病狀的哺乳動物(例如人類)。在另一實施例中，個體為具有產生 GDF15介導之疾病、病症或病狀之風險的哺乳動物(例如人類)。
「基本上所有」係指至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%。
術語「治療劑」係指可用於治療、預防或緩解疾病、病症或病狀之任何藥劑，包括用於治療、預防或緩解GDF15介導之疾病、病症或病狀之一或多種症狀，或其症狀。在某些實施例中，治療劑係指如本文中所描述之抗GFRAL抗體。在某些其他實施例中，治療劑係指除本文所提供之抗體以外的藥劑。在某些實施例中，治療劑係已知適用於或已用於或當前正用於治療、預防或緩解GDF15介導之疾病、病症或病狀之一或多種症狀或其症狀的藥劑。
療法(例如使用預防劑或治療劑)之組合比任兩種或更多種單一療法之加成作用更有效。舉例而言，預防劑及/或治療劑之組合之協同作用使得可對患有GDF15介導之疾病、病症或病狀的個體使用較低劑量之藥劑中之一或多者及/或不太頻繁地投與藥劑。使用較低劑量之預防性或治療性療法及/或不太頻繁地投與療法之能力降低與向個體投與療法相關之毒性而不降低療法預防、管理、治療或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀的功效。此外，協同作用可引起改良之療法預防或管理、治療或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀的功效。最終，療法(例如預防劑或治療劑)之組合之協同作用可避免或減少與使用任何單一療法相關之不良或不合需要之副作用。在一些實施例中，組合療法包含本文所提供之抗體及胰島素(例如胰島素補充物)。在一些實施例中，組合療法包含抗GFRAL抗體及胰島素，其中與單一胰島素療法中之正常日劑量相比，組合療法包含 較低日劑量之胰島素。在一些實施例中，組合療法包含例如小於90%、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於3%、或小於1%的單一胰島素療法中之正常胰島素日劑量。
術語「療法」係指任何可用於預防、管理、治療及/或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀(例如1型糖尿病或2型糖尿病)之方案、方法及/或藥劑。在一些實施例中，術語「療法」係指熟習此項技術者(諸如醫學人員)已知的適用於預防、管理、治療及/或改善GDF15介導之疾病、病症或病狀的生物療法、支援性療法及/或其他療法。
術語「可偵測探針」係指提供可偵測信號之組合物。該術語包括(但不限於)可經由其活性提供可偵測信號之任何螢光團、發色團、放射性標記、酶、抗體或抗體片段及其類似物。
術語「診斷劑」係指投與個體之可幫助診斷疾病、病症或病狀之物質。此類物質可用於揭示、識別及/或定義疾病引發過程之定位。在某些實施例中，診斷劑包括與如本文中所描述之抗GFRAL抗體結合之物質，其在投與個體或與來自個體之樣品接觸時幫助診斷GDF15介導之疾病、病症或病狀。
術語「可偵測試劑」係指可用於確定樣品或個體中出現或存在所需分子(諸如本文中所描述之抗GFRAL抗體)之物質。可偵測試劑可為能夠觀測之物質或能夠以其他方式測定及/或量測(例如藉由定量)之物質。
術語「編碼」或其語法等效物在其關於核酸分子使用時係指呈其原生狀態或在藉由熟習此項技術者熟知之方法操作時可經轉錄以產生mRNA(其接著轉譯成多肽及/或其片段)之核酸分子。反義股係此類核酸分子之補 體，且可由其推導編碼序列。
術語「賦形劑」係指通常用作稀釋劑、媒劑、防腐劑、結合劑或穩定劑之惰性物質且包括(但不限於)蛋白質(例如血清白蛋白等)、胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸等)、脂肪酸及磷脂(例如烷基磺酸酯、辛酸酯等)、界面活性劑(例如SDS、聚山梨醇酯、非離子性表面活性劑等)、醣(例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖等)及多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇等)。亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA，其以全文引用之方式併入本文中。
在肽或多肽之情形下，如本文所使用之術語「片段」係指占小於全長胺基酸序列之肽或多肽。此類片段可例如由胺基端處之截短、羧基端處之截短及/或來自胺基酸序列之殘基之內部缺失產生。片段可例如由替代性RNA編接或活體內蛋白酶活性產生。在某些實施例中，片段包括多肽，其包含具有GFRAL多肽或結合於GFRAL多肽之抗體之胺基酸序列之至少5個相鄰胺基酸殘基、至少10個相鄰胺基酸殘基、至少15個相鄰胺基酸殘基、至少20個相鄰胺基酸殘基、至少25個相鄰胺基酸殘基、至少40個相鄰胺基酸殘基、至少50個相鄰胺基酸殘基、至少60個相鄰胺基殘基、至少70個相鄰胺基酸殘基、至少80個相鄰胺基酸殘基、至少90個相鄰胺基酸殘基、至少100個相鄰胺基酸殘基、至少125個相鄰胺基酸殘基、至少150個相鄰胺基酸殘基、至少175個相鄰胺基酸殘基、至少200個相鄰胺基酸殘基、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個或至少950個相鄰胺 基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，結合於GFRAL多肽之抗體之片段保留抗體之至少1種、至少2種或至少3種或更多種功能。
術語「管理」係指個體由療法(例如預防劑或治療劑)獲得之有利作用，其不引起疾病治癒。在某些實施例中，向個體投與一或多種療法(例如預防劑或治療劑，諸如本文所提供之抗體)以「管理」GDF15介導之疾病、病症或病狀或其症狀，以便防止疾病之發展或惡化。
「投與」或「投藥」係指注射或以其他物理方式將存在於體外之物質(例如本文中所描述之抗GFRAL抗體)傳遞至個體中之操作，諸如藉由經黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內傳遞及/或本文中描述或此項技術中已知的任何其他物理傳遞方法。在治療疾病、病症或病狀或其症狀時，物質之投藥通常在疾病、病症或病狀或其症狀發作之後進行。在預防疾病、病症或病狀或其症狀時，物質之投藥通常在疾病、病症或病狀或其症狀發作之前進行。
在多肽之情形下，如本文所使用之術語「類似物」係指滿足以下條件之多肽：其與GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體具有類似或相同功能，但未必與GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體包含類似或相同胺基酸序列，或與GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體具有類似或相同結構。具有類似胺基酸序列之多肽係指滿足以下各者中之至少一者的多肽：(a)具有與GFRAL多肽之胺基酸序列(例如本文中所描述之SEQ ID NO：500、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體)具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的胺基酸序列的 多肽；(b)由在嚴格條件下與編碼本文中所描述之GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體(或其VH或VL區)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽，該GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體具有至少5個胺基酸殘基、至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60個胺基殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基、至少125個胺基酸殘基或至少150個胺基酸殘基(參見例如Sambrook等人，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)；及(c)由與編碼本文中所描述之GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體(或其VH或VL區)之核苷酸序列具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的核苷酸序列編碼的多肽。與本文中所描述之GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或抗GFRAL抗體具有類似結構之多肽係指具有本文中所描述之GFRAL多肽、GFRAL之片段或GFRAL抗體之類似二級、三級或四級結構的多肽。多肽之結構可藉由熟習此項技術者已知之方法測定，包括(但不限於)X射線結晶、核磁共振及結晶電子顯微法。
術語「組合物」意欲涵蓋含有視情況指定量之指定成分(例如本文所提供之抗體)的產物，以及由視情況指定量之指定成分之組合直接地或間 接產生的任何產物。
在多肽之情形下，如本文所使用，術語「衍生物」係指包含GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或結合於GFRAL多肽之抗體之胺基酸序列的多肽，其已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變。如本文所使用，術語「衍生物」亦指已經化學修飾(例如藉由任何類型的分子與多肽之共價連接)的GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或結合於GFRAL多肽之抗體。舉例而言但無限制性，GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或GFRAL抗體可例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/封端基團進行之衍生作用、蛋白水解分裂、與細胞配位體或其他蛋白質之連接等經化學修飾。可以與天然存在或起始肽或多肽不同(在所連接之分子之類型或位置方面)的方式修飾衍生物。衍生物進一步包括天然存在於肽或多肽上之一或多個化學基團之缺失。GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或GFRAL抗體之衍生物可使用熟習此項技術者已知的技術藉由化學修飾來化學修飾，包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、調配、衣黴素之代謝合成等。此外，GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或GFRAL抗體之衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。多肽衍生物具有與本文中所描述之GFRAL多肽、GFRAL多肽之片段或GFRAL抗體類似或相同的功能。
術語「非自主體重減輕」係指在多種病狀(諸如惡病體質、肝硬化、甲狀腺高能症、慢性腎病、帕金森氏病(Parkinson's disease)、癌症、進食障礙及肌肉減少症)中觀測到的非所欲的體重減輕。
術語「惡病體質」係指消耗性症候群，其特徵為未主動嘗試減重之某人之體重減輕、肌肉萎縮、疲乏、虛弱及顯著食慾不振。惡病體質可顯 著促進患有一些慢性疾病(例如癌症、慢性腎病、慢性發炎疾病、肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症)及神經性厭食症)之患者之發病率。舉例而言，在晚期癌症中，惡病體質係常見的(在大部分垂危癌症患者中發生)，且引起約四分之一的所有癌症相關死亡。
組合物及其製造方法
提供結合蛋白質，諸如結合於GFRAL(例如人類GFRAL)之抗體。本發明之抗體適用於例如診斷或治療GDF15介導之疾病、病症或病狀。在某些實施例中，本發明之抗體適用於診斷或治療疾病、病症或病狀，諸如非自主體重減輕，包括(但不限於)患有惡病體質或慢性疾病(例如肝硬化、甲狀腺高能症、帕金森氏病、癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症、肌肉萎縮及神經性厭食症)或其中需要抑制GDF15之活體內作用之大體上任何疾病、病症或病狀的個體中之非自主體重減輕。
本文中提供結合於GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基之抗體(例如單株抗體)。在一些實施例中，抗GFRAL抗體結合於GFRAL之細胞外結構域(ECD)。亦提供競爭性阻斷本文所提供之抗GFRAL抗體結合於GFRAL多肽之抗體。本文所提供之抗GFRAL抗體亦可與診斷劑、可偵測試劑或治療劑結合或以重組方式融合。亦提供包含抗GFRAL抗體之組合物。
本文亦提供經分離核酸之分子，其編碼結合於GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基之抗GFRAL抗體之免疫球蛋白重鏈、輕鏈、VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。亦提供載體及宿主細胞，其包含編碼 結合於GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基之抗GFRAL抗體之核酸分子。亦提供製備結合於GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基之抗體的方法。
本文中提供使用抗GFRAL抗體之方法。該等方法包括治療、預防或緩解GDF15介導之疾病、病症或病狀，包括治療、預防或緩解個體(例如患者)中GDF15介導之疾病、病症或病狀之一或多種症狀。GDF15介導之疾病、病症或病狀之非限制性實例包括非自主體重減輕、消耗性疾病、患有惡病體質或慢性疾病(例如肝硬化、甲狀腺高能症、帕金森氏病、癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症、肌肉萎縮及神經性厭食症)之個體中之非自主體重減輕。其中個體可患有非自主體重減輕之其他疾病、病症或病狀包括飲食障礙、肌肉萎縮症或多發性硬化。
抗GFRAL抗體
在一些實施例中，本發明提供在本文中可用作治療劑之抗GFRAL抗體。例示性抗體包括多株、單株、人類化、人類、雙特異性及異結合抗體，以及其具有改良之親和力或其他特性的變異體。
在一些實施例中，本文中提供結合於GFRAL(包括GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基)之抗體。在一些實施例中，抗GFRAL抗體為結合GFRAL(包括GFRAL多肽、GFRAL多肽片段、GFRAL肽或GFRAL抗原決定基)之人類化抗體(例如包含人類恆定區)。
在一些實施例中，抗GFRAL抗體包含本文中所描述之單株抗體(例如1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、 22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8或P8G4)中之任一者之VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3，諸如表1-24中描繪之胺基酸序列。因此，在一些實施例中，本文中提供之經分離之抗體或其功能片段包含來自以下之一個、兩個及/或三個重鏈CDR及/或一個、兩個及/或三個輕鏈CDR：(a)稱為1C1之抗體；(b)稱為3P10之抗體；(c)稱為12A3之抗體；(d)稱為5F12之抗體；(e)稱為5A20之抗體；(f)稱為8D8之抗體；(g)稱為17J16之抗體；(h)稱為25M22之抗體；(i)稱為2B8之抗體；(j)稱為22N5之抗體；(k)稱為2I23之抗體；(l)稱為6N16之抗體；(m)稱為1B3之抗體；(n)稱為19K19之抗體；(o)稱為2B3之抗體；(p)稱為8C10之抗體；(q)稱為2A9之抗體；(r)稱為24G2之抗體；(s)稱為6G9之抗體；(t)稱為2B11之抗體；(u)稱為1A3之抗體；(v)稱為P1B6之抗體；(w)稱為P1H8之抗體；(x)稱為P8G4之抗體；或稱為1C1至P8G4之抗體，如表1-24中所示。
稱為1C1之抗體包含VH序列SEQ ID NO：1及VL序列SEQ ID NO：2。
稱為3P10之抗體包含VH序列SEQ ID NO：3及VL序列SEQ ID NO：4。
稱為12A3之抗體包含VH序列SEQ ID NO：5及VL序列SEQ ID NO：6。
稱為5F12之抗體包含VH序列SEQ ID NO：7及VL序列SEQ ID NO：8。
稱為5A20之抗體包含VH序列SEQ ID NO：9及VL序列SEQ ID NO：10。
稱為8D8之抗體包含VH序列SEQ ID NO：11及VL序列SEQ ID NO：12。
稱為17J16之抗體包含VH序列SEQ ID NO：13及VL序列SEQ ID NO：14。
稱為25M22之抗體包含VH序列SEQ ID NO：15及VL序列SEQ ID NO：16。
稱為2B8之抗體包含VH序列SEQ ID NO：17及VL序列SEQ ID NO：18。
稱為22N5之抗體包含VH序列SEQ ID NO：19及VL序列SEQ ID NO：20。
稱為2I23之抗體包含VH序列SEQ ID NO：21及VL序列SEQ ID NO：22。
稱為6N16之抗體包含VH序列SEQ ID NO：23及VL序列SEQ ID NO：24。
稱為1B3之抗體包含VH序列SEQ ID NO：25及VL序列SEQ ID NO：26。
稱為19K19之抗體包含VH序列SEQ ID NO：27及VL序列SEQ ID NO：28。
稱為2B3之抗體包含VH序列SEQ ID NO：29及VL序列SEQ ID NO：30。
稱為8C10之抗體包含VH序列SEQ ID NO：31及VL序列SEQ ID NO：32。
稱為2A9之抗體包含VH序列SEQ ID NO：33及VL序列SEQ ID NO：34。
稱為24G2之抗體包含VH序列SEQ ID NO：35及VL序列SEQ ID NO：36。
稱為6G9之抗體包含VH序列SEQ ID NO：37及VL序列SEQ ID NO：38。
稱為2B11之抗體包含VH序列SEQ ID NO：39及VL序列SEQ ID NO：40。
稱為1A3之抗體包含VH序列SEQ ID NO：480及VL序列SEQ ID NO：481。
稱為P1B6之抗體包含VH序列SEQ ID NO：482及VL序列SEQ ID NO：483。
稱為P1H8之抗體包含VH序列SEQ ID NO：484及VL序列SEQ ID NO：485。
稱為P8G4之抗體包含VH序列SEQ ID NO：486及VL序列SEQ ID NO：487。
表23 ：抗體P1H8 CDR序列
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含VH區或VH域。在其他實施例中，本文所提供之抗體包含VL區或VL鏈。在一些實施例中，本文所提供之抗體具有以下之組合：(i)VH域或VH區；及/或(ii)VL域或VL區。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含由六個CDR(例如表1-24中鑑別之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3)組成。在一些實施例中，本文所提供之抗體可包含小於六個CDR。在一些實施例中，抗體包含一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的CDR或由其組成：表1-24中鑑別之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3。在一些實施例中，抗體包含一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的CDR或由其組成：鼠類單株抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3，該鼠類單株抗體選自由以下組成之群：本文中所描述之.(a)稱為1C1之抗體；(b)稱為3P10之抗體；(c)稱為12A3之抗體；(d)稱為5F12之抗體；(e)稱為5A20之抗體；(f)稱為8D8之抗體；(g)稱為17J16之抗體；(h)稱為25M22之抗體；(i)稱為2B8之抗體；(j)稱為22N5之抗體；(k)稱為2123之抗體；(l)稱為6N16之抗體；(m)稱為1B3之抗體；(n)稱為19K19之抗體；(o)稱為2B3之抗體；(p)稱為8C10之抗體；(q)稱為2A9之抗體；(r)稱為24G2之抗體；(s)稱為6G9之抗體；(t)稱為2B11之抗體；(u)稱為1A3之抗體；(v)稱為P1B6之抗體；(w)稱為P1H8之抗體；或(x)稱為P8G4之抗體。因此，在一些實施例中，抗體包含一個、兩個、三個、四個或五個表1-24中鑑別之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3中之任一者之CDR或由其組成。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含一或多個(例如一個、兩個或三個)表1-24中列舉之VH CDR或由其組成。在其他實施例中，本文所提供之抗體包含一或多個(例如一個、兩個或三個)表1-24中列舉之VL CDR。在其它實施例中，本文所提供之抗體包含一或多個(例如一個、兩個或三個)表1-24中列舉之VH CDR及一或多個表1-24中列舉之VL CDR。因此，在某些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：57、49、57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796、488-493、1795、1796中之任一者之胺基酸序列的VH CDR1。在另一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：132-220、497-514中之任一者之胺基酸序列的VH CDR2。在另一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：57、49、57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796、488-493、1795、1796中之任一者之胺基酸序列的VH CDR3。在某些實施例中，抗體包含獨立地選自如表1-24中描繪之胺基酸序列中之任一者中所描繪之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的VH CDR1及/或VH CDR2及/或VH CDR3。在某些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：297-372、531-546中之任一者之胺基酸序列的VL CDR1。在另一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：373-422中之任一這之胺基酸序列的VL CDR2。在另一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：423-479、558-569中之任一者之胺基酸序列的VL CDR3。在某些實施例中，抗體包含獨立地選自如表1-24中描繪之胺基酸序列中之任一者中所描繪的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的VL CDR1及/或VL CDR2及/或VL CDR3。
本文亦提供包含表1-24中列舉之一或多個(例如一個、兩個或三個)VH CDR及一或多個(例如一個、兩個或三個)VL CDR之抗體。特定言 之，本發明提供包含以下之抗體：VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、 515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)； VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR3 (SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VHCDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、 1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR1(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；VH CDR2(SEQ ID NO：132-220、497-514)、VH CDR3(SEQ ID NO：57、49、221-296、515-530、488-493、1795、1796)、VL CDR1(SEQ ID NO：297-372、531-546)、VL CDR2(SEQ ID NO：373-422)及VL CDR3(SEQ ID NO：423-479、558-569)；或表1-24中列舉之VH CDR(SEQ ID NO：41-296)及VL CDR(SEQ ID NO：297-477)之任何組合。
在某些實施例中，本文中所描述之抗體或其片段包含人類化構架區(FR)序列。在某些實施例中，本文中所描述之抗體或其片段包含有包含表25中描繪之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4胺基酸序列之VH區； 及/或(b)包含表25中描繪之VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4胺基酸序列之VL區。
在某些實施例中，本文中所描述之抗體或其片段包含VH區，其包含：(1)具有選自SEQ ID NO：570-578之胺基酸序列的VH FR1；(2)具有選自SEQ ID NO：579-602之胺基酸序列的VH FR2；(3)具有選自SEQ ID NO：603-1726之胺基酸序列的VH FR3；及/或(4)具有選自SEQ ID NO：1727-1728之胺基酸的VH FR4。因此，在一些態樣中，人類化抗體包含VH區，其包括具有選自SEQ ID NO：570-578之胺基酸序列的VH FR1。在一些態樣中，人類化抗體包含VH區，其包括具有選自SEQ ID NO：579-602之胺基酸序列的VH FR2。在一些態樣中，人類化抗體包含VH區，其包括具有選自SEQ ID NO：603-1726之胺基酸序列的VH FR3。在一些態樣中，人類化抗體包含VH區，其包括具有選自SEQ ID NO：1727-1728之胺基酸的VH FR4。
在某些實施例中，本文中所描述之抗體或其片段包含VL區，其包含：(1)具有選自SEQ ID NO：1729-1750之胺基酸序列的VL FR1；(2)具有選自SEQ ID NO：1751-1777之胺基酸序列的VL FR2；(3)具有選自SEQ ID NO：1778-1792之胺基酸序列的VL FR3；及/或(4)具有選自SEQ ID NO：1793-1794之胺基酸的VL FR4。因此，在一些態樣中，人類化抗體包含VL區，其包括具有選自SEQ ID NO：1729-1750之胺基酸序列的VL FR1。在一些態樣中，人類化抗體包含VL區，其包括具有選自SEQ ID NO：1751-1777之胺基酸序列的VL FR2。在一些態樣中，人類化抗體包含VL區，其包括具有選自SEQ ID NO：1778-1792之胺基酸序列的VL FR3。在一些態樣中，人類化抗體包含VL區，其包括具有選自SEQ ID NO：1793-1794之胺基酸的VL FR4。
在某些實施例中，本文中所描述之抗體或其片段包含VH區及VL區，其中VH區進一步包含：(1)具有選自SEQ ID NO：570-578之胺基酸序列的VH FR1；(2)具有選自SEQ ID NO：579-602之胺基酸序列的VH FR2；(3)具有選自SEQ ID NO：603-1726之胺基酸序列的VH FR3；及/或(4)具有SEQ ID NO：1727-1728之胺基酸序列的VH FR4；且其中VL區進一步包含：(1)具有選自SEQ ID NO：1729-1750之胺基酸序列的VL FR1；(2)具有選自SEQ ID NO：1751-1777之胺基酸序列的VL FR2；(3)具有選自SEQ ID NO：1778-1792之胺基酸序列的VL FR3；及/或(4)具有選自SEQ ID NO：1793-1794之胺基酸的VL FR4。
本文亦提供包含表25中列舉之一或多個(例如一個、二個、三個或四個)VH FR及一或多個(例如一個、二個、三個或四個)VL FR之抗體。特 定言之，本發明提供包含以下之抗體：VH FR1(SEQ ID NO：570-578)及VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)及VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)及VL FR3(SEQ ID NO：1778-1792)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)及VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)及VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)及VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)及VL FR3(SEQ ID NO：1778-1792)；VH FR2(SEQ ID NO：579-602)及VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)及VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)及VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)及VL FR3(SEQ ID NO：1778-1792)；VH FR3(SEQ ID NO：603-1726)及VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)及VL FR1(SEQ ID NO：1729-1750)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)及VL FR2(SEQ ID NO：1751-1777)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)及VL FR3(SEQ ID NO：1778-1792)；VH FR4(SEQ ID NO：1727-1728)及VL FR4(SEQ ID NO：1793-1794)；VH FR1(SEQ ID NO：570-578)、VH FR2(SEQ 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在另一態樣中，提供與例示抗體或功能片段中之一者競爭結合於GFRAL之抗體。此類抗體亦可與本文中例示抗體中之一者結合於相同抗原決定基或重疊抗原決定基。預期與例示抗體競爭或結合於相同抗原決定基之抗體及片段展示類似功能性特性。例示抗原結合蛋白及片段包括具有本文中提供之VH及VL區以及CDR(包括表1-24中之VH及VL區以及CDR)的抗原結合蛋白及片段。因此，作為特定實例，所提供之抗體包括與包含以下之抗體競爭的抗體：(a)關於表1-24中列舉之抗體所列舉的CDR中之1、2、3、4、5或所有6個；(b)選自於表1-24中列舉之抗體所列舉的VH及VL區之VH及VL；或(c)包含如關於表1-24中列舉之抗體指定之VH及VL的兩個輕鏈及兩個重鏈。
在某些實施例中，使用本文所提供之抗體之組合物及方法之抗體包括本文中所描述之抗GFRAL單株抗體，例如在實例章節中。任何抗GFRAL抗體可用於本文所提供之任何方法中。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含 VH區，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：480之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：482之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：484之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：486之胺基酸序列，或其人類化變異體。
在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方 法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一 些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：481之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：483之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：485之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VL區，其包含SEQ ID NO：487之胺基酸序列，或其人類化變異體。
在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之 多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列，或其人類 化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：480之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：481之胺 基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：482之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：483之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：484之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：485之胺基酸序列，或其人類化變異體。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含VH區，其包含SEQ ID NO：486之胺基酸序列，或其人類化變異體，及VL區，其包含SEQ ID NO：487之胺基酸序列，或其人類化變異體。
在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：4之VL區之胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含 SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：480之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：481之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：482之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：483之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：484之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：485之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在本文中提供之多種方法之一些實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：486之胺基酸序列之VH域的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及包含SEQ ID NO：487之胺基酸序列之VL區的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。亦預期本文中所描述之所列舉之其他VH域、VL域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3序列用於本文中提供之多種方法。
1.多株抗體
本發明之抗體可包含多株抗體。熟習此項技術者已知製備多株抗體之方法。多株抗體可在哺乳動物中產生，例如藉由免疫劑及(若需要)佐劑之一或多次注射。通常，將藉由多次皮下或腹膜內注射在哺乳動物中注射免疫劑及/或佐劑。免疫劑可包括GFRAL多肽或其融合蛋白。其可適用於使免疫劑與經免疫之哺乳動物中已知為免疫原性的蛋白質結合或藉由蛋白質及一或多種佐劑對哺乳動物進行免疫接種。此類免疫原性蛋白質之實例包括(但不限於)匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀球蛋白及大豆胰蛋 白酶抑制劑。可使用之佐劑之實例包括Ribi、CpG、Poly 1C、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二黴菌酸酯)。可由熟習此項技術者在無不當實驗情況下選擇免疫接種方案。接著可將哺乳動物抽血，且分析血清之GFRAL抗體效價。若需要，可對哺乳動物進行增強免疫直至抗體效價增加或平穩。或者或另外，可自經免疫之動物獲得淋巴細胞以用於如下文所述之單株抗體自融合瘤之融合及製備。
2.單株抗體
或者，本發明之抗體可為單株抗體。單株抗體可使用首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)描述之融合瘤方法製備，或可藉由重組型DNA方法製備(參見例如美國專利案第4,816,567號)。
在融合瘤方法中，如上文所描述使小鼠或其他適合的宿主動物(諸如倉鼠)免疫以引發淋巴細胞，其產生或能夠產生將特異性結合於用於免疫接種之蛋白質的抗體。或者，淋巴細胞可活體外免疫。在免疫接種之後，分離淋巴細胞且接著使用適合的融合劑(諸如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。
將由此製備之融合瘤細胞接種且在適合的培養基中生長，該培養基較佳含有一或多種可抑制未融合之親本骨髓瘤細胞(亦稱為融合搭配物)之生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞不含酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之選擇性培養基典型地包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT缺失型細胞之生長。
較佳融合搭配物骨髓瘤細胞係有效融合、支持所選擇之產抗體細胞之穩定高級抗體製備且對針對未融合之親本細胞選擇之選擇培養基敏感的細胞。較佳骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如SP-2及衍生物，例如可自American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA購得之X63-Ag8-653細胞，及來源於可自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA購得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之細胞。亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株用於製備人類單株抗體(Kozbor,J.,Immunol .,133：3001(1984)；及Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
分析融合瘤細胞生長於其中之培養基中針對抗原之單株抗體的產生情況。藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯結免疫吸附分析(ELISA))測定由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，Anal.Biochem. ,107：220(1980)之史卡查分析(Scatchard analysis)測定。
一旦鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞，純系可藉由限制稀釋程序次選殖及藉由標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice ，第59-103頁(Academic Press,1986))。用於此目的之適合的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，融合瘤細胞可在動物中以腹水腫瘤形式活體內生長，例如藉由將細胞腹膜內注射至小鼠中。
藉由習知抗體純化程序(諸如親和層析(例如使用蛋白質A或蛋白質G-瓊脂糖)或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析等)自培養基、 腹水流體或血清適合地分離由次純系分泌之單株抗體。
編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序分離及測序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。一旦分離，可將DNA置放於表現載體中，其接著轉染至不以其他方式產生抗體蛋白質之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary；CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以實現重組型宿主細胞中單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA之細菌中之重組表現的評述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol .,5：256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs .130：151-188(1992)。
在一些實施例中，結合GFRAL抗原決定基之抗體包含VH域之胺基酸序列及/或VL域之胺基酸序列，該VH域或VL域由與以下雜交之核苷酸序列編碼：(1)在嚴格條件(例如在約45℃下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與過濾器結合型DNA雜交，接著在約50-65℃下在0.2xSSC/0.1% SDS中進行一或多次洗滌)下、在高嚴格條件(例如在約45℃下在6xSSC中與過濾器結合型核酸雜交，接著在約68℃下在0.1xSSC/0.2% SDS中進行一或多次洗滌)下或在熟習此項技術者已知的其他嚴格雜交條件(參見例如Ausubel,F.M.等人編，1989,Current Protocols in Molecular Biology ，第I卷，Green Publishing Associates,Inc.及John Wiley & Sons,Inc.,New York，第6.3.1-6.3.6頁及第2.10.3頁)下編碼本文中所描述之VH及/或VL域中之任一者的核苷酸序列之補體。
在一些實施例中，結合GFRAL抗原決定基之抗體包含由核苷酸序列編碼之VH CDR之胺基酸序列或VL CDR之胺基酸序列，該核苷酸序列與 在嚴格條件(例如在約45℃下在6X SSC中與過濾器結合型DNA雜交，接著在約50-65℃下在0.2X SSC/0.1% SDS中進行一或多次洗滌)下、在高嚴格條件(例如在約45℃下在6X SSC中與過濾器結合型核酸雜交，接著在約68℃下在0.1X SSC/0.2% SDS中進行一或多次洗滌)下或在熟習此項技術者已知的其他嚴格雜交條件(參見例如Ausubel,F.M.等人編，1989,Current Protocols in Molecular Biology ，第I卷，Green Publishing Associates,Inc.及John Wiley & Sons,Inc.,New York，第6.3.1-6.3.6頁及第2.10.3頁)下編碼表1-24中描繪之VH CDR及/或VL CDR中之任一者的核苷酸序列之補體雜交。
在另一實施例中，可自使用例如Antibody Phage Display：Methods and Protocols ,P.M.O'Brien及R.Aitken編，Humana Press,Totawa N.J.,2002中描述之技術產生的抗體噬菌體文庫分離單株抗體或抗體片段。原則上，合成抗體純系藉由篩選噬菌體文庫來選擇，該等噬菌體文庫含有呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區(Fv)之各種片段的噬菌體。針對所需抗原篩選此類噬菌體文庫。能夠結合於所需抗原的表現Fv片段之純系吸附至抗原且因此與文庫中之非結合純系分離。結合純系接著自抗原溶離，且可藉由額外的抗原吸附/溶離循環進一步增濃。
可變域可功能性呈現於噬菌體上，以單鏈Fv(scFv)片段形式，其中VH及VL經由短、可撓性肽共價連接，或以Fab片段形式，其中其各自與恆定域融合且非共價相互作用，如例如Winter等人，Ann.Rev.Immunol .,12：433-455(1994)所描述。
VH及VL基因之譜系可藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖且在噬菌體文庫中隨機再組合，接著可如Winter等人，見上文中所描述針對抗原結合純系搜索噬菌體文庫。來自經免疫之來源的文庫在無需構築融合瘤之情況 下提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，可選殖原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一人類抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人，EMBO J, 12：725-734(1993)所描述。最終，亦可以合成方式如下製備原生文庫：自幹細胞選殖未改組V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼CDR3高度可變區及實現活體外改組，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol .,227：381-388(1992)所描述。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，GFRAL(例如GFRAL多肽、片段或抗原決定基)可用於塗佈吸附盤之孔，在附著於吸附盤或用於細胞分選之宿主細胞上表現，或與生物素結合以用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或在用於淘選呈現庫之任何其他方法中使用。具有緩慢解離動力學((例如良好結合親和力)之抗體選擇可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人，Proteins ,8：309-314(1990)及WO 92/09690中所述)以及低抗原塗佈密度(如Marks等人，Biotechnol .,10：779-783(1992)中所述)促進。
抗GFRAL抗體可藉由設計用於選擇相關噬菌體純系之適合的抗原篩選程序，接著使用VH及/或VL序列(例如Fv序列)構築全長抗GFRAL抗體純系，或來自VH及VL序列之各種CDR序列、自Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第五版，NIH公開案91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述之相關噬菌體純系及適合的恆定區(例如Fc)序列獲得。
3.抗體片段
本發明提供結合於GFRAL之抗體及抗體片段。在某些情形中，使用抗體片段有優勢，而完全抗體則無。較小尺寸之片段可實現快速清除率， 且可引起改良之對細胞、組織或器官之進入。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med. 9：129-134(2003)。
已開發出用於產生抗體片段的多種技術。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白分解消化而獲得(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992))；及Brennan等人，Science ,229：81(1985))。然而，此等片段現可藉由重組型宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌或酵母細胞中及由其分泌，因此實現大量的此等片段之便捷製備。抗體片段可自上文所論述之抗體噬菌體文庫分離。或者，Fab'-SH片段可自大腸桿菌直接回收且化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一種方法，可自重組型宿主細胞培養物直接分離F(ab')2 片段。包含救助受體結合抗原決定基殘基之具有增加之活體內半衰期的Fab及F(ab')2 片段描述於例如美國專利案第5,869,046號中。抗體片段之其他製備技術對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。在某些實施例中，抗體係單鏈Fv片段(scFv)(參見例如WO 93/16185；美國專利案第5,571,894號；及第5,587,458號)。Fv及scFv具有不含恆定區之完整組合位點；因此，其可適用於活體內使用期間降低之非特異性結合。可構築scFv融合蛋白以在scFv之胺基或羧基端產生效應子蛋白質之融合(參見例如Antibody Engineering,Borrebaeck編，見上文)。抗體片段亦可為「線形抗體」，例如上文所引用之參考文獻中所描述。此類線形抗體可為單特異性或多特異性，諸如雙特異性。
較小抗體衍生結合結構為單獨的可變域(V域)，亦稱為單可變域抗體(SdAb)。某些類型之生物體(駱駝及軟骨魚)具有安裝在Fc等效結構域結構 上之作為其免疫系統之一部分的高親和力單V類結構域(Woolven等人，Immunogenetics 50：98-101,1999；Streltsov等人，Proc Natl Acad Sci USA. 101：12444-12449,2004)。V類結構域(駱駝中稱為VhH且鯊魚中稱為V-NAR)通常呈現長表面環，其實現目標抗原之凹穴之滲透。其亦藉由遮罩疏水性表面貼片使經分離之VH域穩定。
此等VhH及V-NAR結構域已用於工程改造sdAb。已使用自噬菌體文庫之選擇及其他產生穩定、高結合VL及VH衍生結構域之方法設計人類V域變異體。
如本文所提供之結合於GFRAL之抗體包括(但不限於)合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、抗個體基因型(抗Id)抗體及以上各者中之任一者的功能片段(例如GFRAL結合片段)。功能片段(例如結合於GFRAL之片段)之非限制性實例包括單鏈Fv(scFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2 片段、F(ab')2 片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。
本文所提供之抗體包括(但不限於)免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如含有結合於GFRAL抗原決定基之抗原結合位點的分子。本文中提供之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。
抗體之變異體及衍生物包括保留結合於GFRAL抗原決定基之能力的抗體功能片段。例示性功能片段包括Fab片段(例如含有抗原結合域且包含 由雙硫鍵橋聯之輕鏈及重鏈之一部分的抗體片段)；Fab'(例如含有單一抗結合域之抗體片段，該單一抗結合域包含Fab及經由鉸鏈區之重鏈之額外部分)；F(ab')2 (例如藉由重鏈之鉸鏈區中之鏈間二硫鍵接合之兩個Fab'分子；Fab'分子可針對相同或不同抗原決定基)；雙特異性Fab(例如具有兩個抗原結合域之Fab分子，其中各抗原結合域可針對不同抗原決定基)；包含可變區之單鏈Fab鏈，亦稱為sFv(例如藉由具有10-25個胺基酸之鏈連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈之可變抗原結合決定區)；二硫鍵連接之Fv或dsFv(例如藉由雙硫鍵連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈之可變抗原結合決定區)；駱駝化VH(例如抗體之單一重鏈之可變抗原結合決定區，其中VH界面處之一些胺基酸係在天然存在之駱駝抗體之重鏈中發現的胺基酸)；雙特異性sFv(例如具有兩個抗原結合域之sFv或dsFv分子，其中各抗原結合域可針對不同抗原決定基)；雙功能抗體(例如在第一sFv之VH域與第二sFv之VL域組裝在一起及第一sFv之VL域與第二sFv所述VH域組裝在一起時形成的二聚sFv；雙功能抗體之兩個抗原結合區可針對相同或不同抗原決定基)；及三功能抗體(例如以與雙功能抗體類似之方式形成的三聚sFv，但其中在單一複合物中產生三個抗原結合域；三個抗原結合域可針對相同或不同抗原決定基)。抗體之衍生物亦包括抗體組合位點之一或多個CDR序列。當存在兩個或更多個CDR序列時，CDR序列可在骨架上連接在一起。在某些實施例中，抗體包含單鏈Fv(「scFv」)。scFv為包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等結構域以單一多肽鏈形式存在。scFv多肽可進一步包含VH與VL域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷， Rosenburg及Moore編Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
4.人類化抗體
本發明提供結合GFRAL(包括人類GFRAL)之人類化抗體。本發明之人類化抗體可包含一或多個如表1-24中所示之CDR。此項技術中已知用於人類化非人類抗體之各種方法。舉例而言，人類化抗體可具有自非人類來源引入其中之一或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變域。人類化可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人，(1988)Science 239：1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。
在一些情況下，藉由CDR接枝來構築人類化抗體，其中將親本非人類抗體(例如嚙齒動物)之六個互補決定區(CDR)之胺基酸序列接枝至人類抗體構架上。舉例而言，Padlan等人，(FASEB J .,9：133-139,1995)測定CDR中僅約三分之一的殘基實際上接觸抗原，且將此等殘基稱為「特異性決定殘基」或SDR。在SDR接枝技術中，僅將SDR殘基接枝至人類抗體構架上(參見例如Kashmiri等人，Methods 36：25-34,2005)。
選擇用於製備人類化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)對於減少抗原性而言非常重要。舉例而言，根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩選非人類(例如嚙齒動物)抗體之可變域之序列。可選擇與嚙齒動物序列最接近的人類序列作為人類化抗體之人類構架(Sims等人，(1993)J.Immunol. 151：2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol. 196：901)。另一方法使用來源於輕鏈或重鏈之特定子群的所有人類 抗體之共同序列的特定構架。若干不同人類化抗體可使用相同構架(Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,89：4285；Presta等人(1993)J.Immunol .,151：2623)。在一些情況下，構架來源於最充足的人類子類(VL 6子群I(VL 6I)及VH 子群III(VH III))之共同序列。在另一方法中，在構架區之來源使用人類生殖系基因。
在基於CDR之比較之替代性範例(稱為超人類化)中，FR同源性係無關的。該方法由比較非人類序列與功能性人類生殖系基因基因譜組成。接著選擇此等編碼與鼠類序列相同或緊密相關標準結構之基因。接著，在與非人類抗體共有標準結構之基因內，選擇在CDR內具有最高同源性之基因作為FR供體。最終，將非人類CDR接枝至此等FR上(參見例如Tan等人，J.Immunol. 169：1119-1125,2002)。
通常進一步需要抗體經人類化而保持其對抗原之親和力及其他有利生物特性。為了達成此目標，根據一種方法，人類化抗體係藉由一種使用親本及人類化序列的三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產品的方法製備。通常可獲得三維免疫球蛋白模型且為熟習此項技術者所熟悉。可使用說明且顯示所選擇之候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構之電腦程式。此等程式包括例如WAM(Whitelegg及Rees,Protein Eng. 13：819-824,2000)、Modeller(Sali及Blundell,J.Mol.Biol. 234：779-815,1993)及Swiss PDB Viewer(Guex及Peitsch,Electrophoresis 18：2714-2713,1997)。測試此等呈現使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以此方式，可自受體及輸入序列選擇FR殘基且組合使得獲得所需抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力增加。通常，高變區殘基直接且最實質 性涉及影響抗原結合。
另一種用於抗體人類化之方法係基於稱為人類鏈帶含量(HSC)之抗體人類化量度。此方法比較小鼠序列與人類生殖系基因之基因譜且對差異進行評分作為HSC。接著藉由最大化目標序列之HSC而非使用整體一致性量測值來人類化目標序列，以產生多個不同人類化變異體(Lazar等人，Mol.Immunol. 44：1986-1998,2007)。
除上述方法以外，可使用經驗方法產生及選擇人類化抗體。此等方法包括使用富集技術或高輸送量篩選技術之基於人類化變異體之大型文庫之產生及最佳純系之選擇的方法。抗體變異體可自噬菌體、核糖體及酵母呈現文庫以及藉由細菌群落篩選分離(參見例如Hoogenboom,Nat.Biotechnol. 23：1105-1116,2005；Dufner等人，Trends Biotechnol. 24：523-529,2006；Feldhaus等人，Nat.Biotechnol. 21：163-70,2003；Schlapschy等人，Protein Eng.Des.Sel. 17：847-60,2004)。
在FR文庫方法中，在FR中之特異性位置引入殘基變異體之集合，接著選擇文庫以選擇最佳支持接枝CDR之FR。待取代之殘基可包括鑑別為潛在促進CDR結構之「維尼爾(Vernier)」殘基中的一些或全部(參見例如Foote及Winter,J.Mol.Biol. 224：487-499,1992)，或來自由Baca等人(J.Biol.Chem. 272：10678-10684,1997)鑑別之目標殘基之更有限集合之殘基。
在FR改組中，全部FR與非人類CDR組合而非產生所選擇之殘基變異體之組合文庫(參見例如Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60,2005)。可在兩步驟選擇程序(首先人類化VL，接著VH)針對結合來篩選文庫。或者，可使用單步驟FR改組方法。已證實此類方法與兩步驟篩選相比更有 效，因為所得抗體呈現改良之生物化學及物理化學特性，包括增強之表現、增加之親和力及熱穩定性(參見例如Damschroder等人，Mol.Immunol. 44：3049-60,2007)。
「人類化」方法係基於基本最小特異性決定子(MSD)之實驗鑑別且係基於非人類片段依序置換至人類FR之文庫中且評估結合。其由非人類VH及VL鏈之CDR3之區域開始且將非人類抗體之其他區域逐漸置換至人類FR中，包括VH及VL之CDR1及CDR2。此方法通常引起抗原決定基滯留及自具有不同人類V區段CDR之多個子類鑑別抗體。人類化使得可分離與人類生殖系基因抗體具有91-96%同源性之抗體(參見例如Alfenito,Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS,The Protein Engineering Summit,2007)。
「人類工程改造」方法涉及藉由使抗體之胺基酸序列產生特異性變化以便產生在人類中具有降低之免疫原性，但仍保留所需原始非人類抗體之結合特性的經修飾之抗體來改變非人類抗體或抗體片段，諸如小鼠或嵌合抗體或抗體片段。通常，該技術涉及將非人類(例如小鼠)抗體之胺基酸殘基分類為「低風險」、「中等風險」或「高風險」殘基。使用整體風險/獎勵計算進行分類，其針對取代將影響所得抗體之摺疊及/或經人類殘基取代之風險來評估進行特定取代(例如人類中之免疫原性)之所預測的優勢。可藉由比對來自非人類抗體之可變區的胺基酸序列與特異性或共同人類抗體序列之對應區域來選擇非人類(例如小鼠)抗體序列之既定位置(例如低風險或中等風險)處待取代的特定人類胺基酸殘基。根據比對，非人類序列中低風險或中等風險位置處之胺基酸殘基可取代人類抗體序列中之相應殘基。用於製造人類經工程改造之蛋白質之技術更詳細地描述於 Studnicka等人，Protein Engineering,7：805-814(1994)、美國專利案5,766,886、5,770,196、5,821,123及5,869,619，以及PCT申請公開案WO 93/11794。
5.人類抗體
人類抗GFRAL抗體可藉由組合選自人類衍生之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列與已知的人類恆定域序列來構築。或者，本發明之人類單株GFRAL抗體可藉由融合瘤方法製得。用於製備人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株已例如由KozborJ.Immunol .,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol. ,147：86(1991)描述。
亦可產生在免疫接種時能夠在不存在內源性免疫球蛋白產生之情況下產生完全人類抗體基因譜的轉基因動物(例如小鼠)。已使用表現人類抗體譜系之轉基因小鼠產生針對多種潛在藥物目標之高親和力人類序列單株抗體(參見例如Jakobovits,A.,Curr.Opin.Biotechnol. 1995,6(5)：561-6；Brüggemann及Taussing,Curr.Opin.Biotechnol. 1997,8(4)：455-8；美國專利案第6,075,181號及第6,150,584號；以及Lonberg等人，Nature Biotechnol. 23：1117-1125,2005)。
或者，可經由產生針對目標抗原之抗體的人類B淋巴細胞(例如此類B淋巴細胞可自個體回收或可活體外經免疫)之永生化來製備人類抗體(參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol. ,147(1)：86-95(1991)；及美國專利案第5,750,373號)。
亦可以使用基因改組而自非人類(例如嚙齒動物)抗體衍生人類抗體，其中人類抗體與初始非人類抗體具有相似的親和力及特異性。根據此方法，其亦稱為「抗原決定基印跡」或「引導選擇」，用人類V域基因之基因譜置換藉由如本文中所描述之噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群。抗原選擇引起非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab之分離，其中人類鏈恢復在初始噬菌體呈現純系之相應非人類鏈移除後所毀壞的抗原結合位點(例如抗原決定基引導(印記)人類鏈搭配物之選擇)。當重複該過程以置換其餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參見例如PCT WO 93/06213；及Osbourn等人，Methods.,36,61-68,2005)。與藉由CDR移植進行非人類抗體之傳統人類化不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。用於人類化針對細胞表面抗原之小鼠抗體之引導選擇的實例包括卵巢癌細胞上之葉酸結合蛋白(參見例如Figini等人，Cancer Res .,58,991-996,1998)及CD147，其大量表現於肝細胞癌上(參見例如Bao等人，Cancer Biol.Ther .,4,1374-1380,2005)。
引導選擇方法之潛在缺點為改組一個抗體鏈同時保持另一個恆定區可引起抗原決定基偏移。為了保持由非人類抗體識別之抗原決定基，可應用CDR保留(參見例如Klimka等人，Br.J.Cancer .,83,252-260,2000；VH CDR2 Beiboer等人，J.Mol.Biol. ,296,833-49,2000)。在此方法中，通常保留非人類VH CDR3，因為此CDR可位於抗原結合位點之中心且可能係用於抗原識別之最重要的抗體區域。然而，在一些情況下，可保留非人類抗體之VH CDR3及VL CDR3，以及VH CDR3、VL CDR3及VL CFR1。
6.雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體係人類或人類化抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對GFRAL且另一種係針對任何其他抗原。在一些實施例中，雙特異性抗體可結合於GFRAL之兩個不同的抗原決定基。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。
用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知的，諸如藉由兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(參見例如Milstein及Cuello,Nature ,305：537(1983))。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Bispecific Antibodies ,Kontermann編，Springer-Verlag,Hiedelberg(2011)。
7.多價抗體
與二價抗體相比，多價抗體可由表現抗體所結合之抗原的細胞更快地內化(及/或分解代謝)。本發明之抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點之多價抗體(除IgM類別以外)(例如四價抗體)，其容易藉由編碼抗體之多肽鏈之核酸的重組表現來產生。多價抗體可包含二聚結構域及三個或更多個抗原結合位點。在某些實施例中，二聚結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由Fc區或鉸鏈區組成)。在此情況下，抗體將包含Fc區及在Fc區之胺基端的三個或更多個抗原結合位點。在某些實施例中，多價抗體包含三個至約八個抗原結合位點(或由三個至約八個抗原結合位點組成)。在一個此類實施例中，多價抗體包含四個抗原結合位點(或由四個抗原結合位點組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(例如兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多個可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其 中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中之多價抗體可進一步包含至少兩個(例如四個)輕鏈可變域多肽。本文中之多價抗體可(例如)包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含CL域。
8.Fc工程改造
可能需要經由Fc工程改造來修飾針對GFRAL之抗體，包括在效應功能方面，例如以便降低或移除抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。此可藉由將一或多個胺基酸取代引入抗體之Fc區來實現。舉例而言，證實位置233-236處使用IgG2殘基及位置327、330及331處使用IgG4殘基進行之人類IgG1中之取代可顯著降低ADCC及CDC(參見例如Armour等人，Eur.J.Immunol. 29：(8)：2613-24(1999)；Shields等人，J.Biol..Chem .276(9)：6591-604(2001))。
為了延長抗體之血清半衰期，可將救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其抗體片段)中，例如美國專利案5,739,277中所描述。術語「救助受體結合抗原決定基」係指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基，其負責延長IgG分子之活體內血清半衰期。
9.替代性結合劑
本發明涵蓋與本文所揭示之抗GFRAL抗體特異性結合於相同抗原決定基之非免疫球蛋白結合劑。在一些實施例中，非免疫球蛋白結合劑係在競爭性結合分析中鑑別為置換本發明之抗GFRAL或由本發明之抗GFRAL置換的試劑。此等替代性結合劑可包括例如此項技術中已知的經工程改造 之蛋白質骨架中之任一者。此類骨架可包含一或多個如表1-24中所示之CDR。此類骨架包括例如抗運載蛋白，其基於脂質運載蛋白骨架，脂質運載蛋白骨架為由支撐四個形成配位體結合位點之高變環之剛性β-筒管表徵之蛋白質結構。新穎的結合特異性可由環區域中之經靶向的隨機突變誘發工程改造，與功能性顯示及引導選擇組合(參見例如Skerra(2008)FEBS J. 275：2677-2683)。其他適合的骨架可包括例如纖連蛋白或單功能抗體，其基於人類纖維結合蛋白III之第十個細胞外域(參見例如Koide及Koide(2007)Methods Mol.Biol. 352：95-109)；親和抗體，其基於葡萄球菌蛋白質A之Z域(參見例如Nygren等人(2008)FEBS J. 275：2668-2676))；達爾潘蛋白(DARPins)，其基於錨蛋白重複蛋白質(參見例如Stumpp等人(2008)Drug.Discov.Today 13：695-701)；非諾莫(fynomers)，其基於人類Fyn蛋白質激酶之SH3域(Grabulovski等人(2007)J.Biol.Chem. 282：3196-3204)；阿非汀(affitins)，其基於來自極端嗜熱古細菌(Sulfolobus acidolarius)之Sac7d(參見例如Krehenbrink等人(2008)J.Mol.Biol. 383：1058-1068)；阿非林(affilins)，其基於人類y-B-晶狀體球蛋白(參見例如Ebersbach等人(2007)J.Mol.Biol. 372：172-185)；高親合性多聚體，其基於細胞膜受體蛋白質之A域(參見例如Silverman等人(2005)Biotechnol. 23：1556-1561)；富含半胱胺酸之打結素肽(參見例如Kolmar(2008)FEBS J. 275：2684-2690)；及經工程改造之昆尼茲型抑制劑(Kunitz-type inhibitors)(參見例如Nixon及Wood(2006)Curr.Opin.Drug.Discov.Dev. 9：261-268)。關於綜述，參見例如Gebauer及Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol. 13：245-255。
抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋結合於本文中所描述之GFRAL之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性，包括(但不限於)特異性、熱穩定性、表現量、效應功能、糖基化、降低之免疫原性或可溶性。除本文中所描述之抗GFRAL抗體以外，預期可製備抗GFRAL抗體變異體。舉例而言，可藉由將適合的核苷酸變化引入編碼DNA及/或藉由所需抗體或多肽之合成來製備抗GFRAL抗體變異體。熟習此項技術者將瞭解，胺基酸變化可改變抗GFRAL抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變細胞膜錨定特徵。
在一些實施例中，本文所提供之抗體經化學修飾，例如藉由與任何類型之具有抗體之分子締合，包括共價連接。抗體衍生物可包括經化學修飾之抗體，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/封端基團進行之衍生作用、蛋白水解分裂、與細胞配位體或其他蛋白質之連接等。可藉由已知技術進行許多化學修飾中之任一種，包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、調配、衣黴素之代謝合成等。此外，抗體可含有一或多個非經典胺基酸。
變化可為編碼抗體或多肽之一或多個密碼子之取代、缺失或插入，該抗體或多肽引起胺基酸序列與原生序列抗體或多肽相比發生變化。胺基酸取代可為一個胺基酸由具有類似結構及/或化學特性之另一個胺基酸置換之結果，諸如白胺酸由絲胺酸置換，例如保守性胺基酸置換。插入或缺失可視情況在約1至5個胺基酸範圍內。在某些實施例中，取代、缺失或插入包括與原始分子相比小於25個胺基酸取代、小於20個胺基酸取代、小於15個胺基酸取代、小於10個胺基酸取代、小於5個胺基酸取代、小於4個胺基酸取代、小於3個胺基酸取代或小於2個胺基酸取代。在特定實施例 中，取代係在一或多個所預測的非必需胺基酸殘基處進行之保守性胺基酸取代。可藉由在序列中系統地進行胺基酸之插入、缺失或取代且針對由全長或成熟原生序列呈現之活性測試所得變異體來測定所允許的變化。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括與針對酶(例如抗體引導之酶前藥療法)或延長抗體之血清半衰期之多肽的抗體之N端或C端之融合。
抗體之生物特性之實質性修飾藉由選擇取代來實現，該等取代在其維持以下之作用方面明顯不同：(a)取代之區域中之多肽主鏈的結構，例如呈層狀或螺旋狀構形；(b)目標位點處分子之帶電性或疏水性；或(c)側鏈之堆積。或者，可進行保守性(例如在具有類似特性及/或側鏈之胺基酸基團內)取代，以便保持或不顯著改變特性。可根據胺基酸側鏈之特性中之類似性來將胺基酸分組(參見例如A.L.Lehninger,Biochemistry ，第2版，第73-75頁，Worth Publishers,New York(1975))：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；及(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，可基於常見側鏈特性將天然存在之殘基分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。此類經取代之殘基亦可引入保守性取代位點中或引入其餘(非保守性)位點中。因此，在一個實施例中，結合於GFRAL抗原決定基之抗體或其片段包含與本文中所描述之鼠類單株抗體之胺基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的胺基酸序列。在一個實施例中，結合於GFRAL抗原決定基之抗體或其片段包含與表1-24中描繪之胺基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的胺基酸序列。在另一實施例中，結合於GFRAL抗原決定基之抗體或其片段包含與表1-24中描繪之VH CDR胺基酸序列及/或表1-24中描繪之VL CDR胺基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的VH CDR及/或VL CDR胺基酸序列。可使用此項技術中已知的方法進行變化，諸如寡核苷酸介導(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可對經選殖之DNA進行定點突變誘發(參見例如Carter等人，Nucl.Acids Res .,13：4331(1986)；Zoller等人，Nucl.Acids Res .,10：6487(1987))、卡匣突變誘發(參見例如Wells等人，Gene ,34：315(1985))、限制選擇突變誘發(參見例如Wells等人，Philos.Trans.R.Soc.London SerA ,317：415(1986))或其他已知技術以產生抗GFRAL抗體變異型DNA。
亦可例如用另一胺基酸(諸如丙胺酸或絲胺酸)取代任何不涉及保持抗 GFRAL抗體之適當構形的半胱胺酸殘基，以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反，可在抗GFRAL抗體中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(例如在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
在一些實施例中，本發明之抗GFRAL抗體分子係「去免疫」抗體。「去免疫」抗GFRAL抗體為來源於人類化或嵌合抗GFRAL抗體之抗體，其在其胺基酸序列中具有一或多個變化，該一或多個引起與各別原始非去免疫抗體相比，抗體之免疫原性降低。一種用於產生此類抗體變異體之程序涉及鑑別及移除抗體分子之T細胞抗原決定基。如此項技術中已知，在第一步驟中，可藉由若干方法測定抗體分子之免疫原性，例如藉由T細胞抗原決定基之活體外測定或此類抗原決定基之電子雜交預測。一旦鑑別對T細胞抗原決定基功能而言重要的殘基，可進行突變以移除免疫原性及保留抗體活性。關於綜述，參見例如Jones等人，Methods in Molecular Biology 525：405-423,2009。
1.活體外親和力成熟
在一些實施例中，可藉由活體外親和力成熟來製備與親本抗體相比具有改良之性質(諸如親和力、穩定性或表現量)之抗體變異體。與天然原型類似，活體外親和力成熟係基於突變及選擇之原理。抗體之文庫呈現為生物體(例如噬菌體、細菌、酵母或哺乳動物細胞)之表面上的Fab、scFv或V域片段或與其編碼mRNA或DNA締合(例如共價或非共價)。所呈現之抗體之親和力選擇可實現具有編碼抗體之基因資訊之生物體或複合物之分離。使用呈現方法(諸如噬菌體呈現)之兩或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳範圍內之抗體片段。較佳親和力成熟抗體將對目標抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳之親和力。
噬菌體呈現係用於抗體之呈現及選擇的廣泛傳播方法。抗體在Fd或M13噬菌體之表面上呈現為與噬菌體鞘蛋白之融合物。選擇涉及暴露於抗原以噬菌體呈現抗體結合其目標，一種稱為「淘選」之過程。回收結合於抗原之噬菌體且在細菌中感染以產生用於其他選擇輪之噬菌體。關於綜述，參見例如Hoogenboom,Methods.Mol.Biol. 178：1-37,2002；Bradbury及Marks,J.Immuno.Methods 290：29-49,2004)。
在酵母呈現系統中(參見例如Boder等人，Nat.Biotech. 15：553-57,1997；Chao等人，Nat.Protocols 1：755-768,2006)，抗體可呈現為單鏈可變融合物(scFv)，其中重鏈及輕鏈由可撓性連接子連接。scFv與酵母凝集素蛋白質Aga2p之連接子單元融合，該酵母凝集素蛋白質經由與Aga1p之二硫鍵連接至酵母細胞壁。經由Aga2p進行之蛋白質呈現使蛋白質自細胞表面凸出，最小化與酵母細胞壁上其他分子之潛在相互作用。使用磁性分離及流式細胞測量術篩檢文庫以選擇具有改良之親和力或穩定性的抗體。藉由用生物素化抗原標記酵母及第二試劑(諸如結合於螢光團之抗生蛋白鏈菌素)來測定與相關可溶性抗原之結合。可經由側接scFv之紅血球凝集素或c-Myc抗原決定基標籤之免疫螢光標記來量測抗體之表面表現之變化。已證實表現與所呈現之蛋白質之穩定性相關，且因此可針對改良之穩定性以及親和力來選擇抗體(參見例如Shusta等人，J.Mol.Biol. 292：949-956,1999)。酵母呈現之另一優勢在於所呈現之蛋白質在真核酵母細胞之內質網中摺疊，利用內質網伴隨蛋白及質量控制機器。一旦成熟完成，宜『滴定』抗體親和力，同時在酵母表面上呈現，消除對各純系之表現及純化的需要。酵母表面呈現之理論限制為與其他呈現方法相比之潛在較小功能性文庫尺寸；然而，當前方法使用酵母細胞配對系統以產生估計 尺寸為1014 之組合多樣性(參見例如美國專利公開案2003/0186,374；Blaise等人，Gene 342：211-218,2004)。
在核糖體呈現中，產生抗體-核糖體-mRNA(ARM)複合物以用於無細胞系統中之選擇。編碼抗體之特定文庫之DNA文庫以基因方式與不含終止密碼子之間隔基序列融合。在轉譯時，此間隔基序列仍連接至肽基tRNA且佔據核糖體通道，且因此使得相關蛋白質自核糖體凸出且摺疊。所得mRNA、核糖體及蛋白質之複合物可結合於表面結合配位體，經由用配位體進行之親和力捕捉實現抗體及其編碼mRNA之同時分離。接著核糖體結合mRNA逆向轉錄回cDNA中，其可接著經歷突變誘發且用於下一輪選擇(參見例如Fukuda等人，Nucleic Acids Res .34,e127,2006)。在mRNA呈現中，使用嘌呤黴素作為銜接子分子建立抗體與mRNA之間的共價鍵(Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755,2001)。
由於此等方法完全在活體外進行，故其與其他選擇技術相比提供兩個主要優點。第一，文庫之多樣性不受細菌細胞之轉型效率限制，而僅由核糖體數目及試管中存在之不同mRNA分子限制。第二，可在各選擇輪之後容易地引入隨機突變，例如藉由非校正聚合酶，因為無文庫必須在任何多樣化步驟之後轉型。
可以靶向方式或經由隨機引入將多樣性引入抗體文庫之CDR或完全V基因中。先前方法包括經由高級或低級突變誘發連續靶向抗體之所有CDR或靶向體細胞突變之經分離之熱點(參見例如Ho等人，J.Biol.Chem. 280：607-617,2005)或基於實驗或結構原因懷疑影響親和力之殘基。可使用大腸桿菌突變菌株、用DNA聚合酶進行之易錯複製(參見例如Hawkins等人，J.Mol.Biol. 226：889-896,1992)或RNA複製酶遍及整個V基因引入隨機 突變。亦可經由DNA改組或類似技術藉由置換天然不同之區域來引入多樣性(參見例如Lu等人，J.Biol.Chem. 278：43496-43507,2003；美國專利案第5,565,332號；美國專利案第6,989,250號)。替代性技術靶向擴展至構架區殘基中之高變環(參見例如Bond等人，J.Mol.Biol. 348：699-709,2005)，使用CDR中之環缺失及插入或使用基於雜交之多樣化(參見例如美國專利公開案第2004/0005709號)。在CDR中產生多樣性之其他方法揭示於例如美國專利案第7,985,840號中。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，可將GFRAL固定至固體載體、管柱、針或纖維素/聚(偏二氟乙烯)薄膜/其他過濾器上、在附著到吸附板或細胞分選中使用之宿主細胞上表現或結合於生物素以用於用經抗生蛋白鏈菌素塗佈之珠粒進行捕捉，或用於任何其他用於淘選呈現文庫之方法中。
關於活體外親和力成熟方法之綜述，參見例如Hoogenboom,Nature Biotechnology 23：1105-1116,2005及Quiroz及Sinclair,Revista Ingeneria Biomedia 4：39-51,2010及其中參考文獻。
2.抗GFRAL抗體之修飾
本發明之範疇內包括抗GFRAL抗體之共價修飾。共價修飾包括使抗GFRAL抗體之靶向胺基酸殘基與能夠與抗GFRAL抗體之所選擇的側鏈或N端或C端殘基反應的有機衍生試劑反應。其他修飾包括穀醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基之去醯胺分別形成相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或羥丁胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(參見例如T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties ,W.H.Freeman & Co.,San Francisco，第79-86頁(1983))、N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。
本發明之範疇內所包括之抗GFRAL抗體之其他類型之共價修飾包括改變抗體或多肽之原生糖基化模式(參見例如Beck等人，Curr.Pharm.Biotechnol. 9：482-501,2008；Walsh,Drug Discov.Today 15：773-780,2010)，及以例如美國專利案第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號或第4,179,337號中闡述之方式將抗體連接至多種非蛋白質聚合物中之一者，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。
本發明之抗GFRAL抗體亦可經修飾以形成嵌合分子，其包含與另一異源多肽或胺基酸序列，例如抗原決定基標籤(參見例如Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol. 60：523-533,2003)或IgG分子之Fc區(參見例如Aruffo,「Immunoglobulin fusion proteins」,Antibody Fusion Proteins,S.M.Chamow及A.Ashkenazi編，Wiley-Liss,New York,1999，第221-242頁)融合之抗GFRAL抗體。
本文亦提供融合蛋白，其包含結合於GFRAL抗原之本文所提供之抗體及異源多肽。在一些實施例中，抗體所融合之異源多肽適用於使抗體靶向具有細胞表面表現之GFRAL的細胞。
本文亦提供結合於GFRAL抗原之抗體板。在特定實施例中，抗體板具有不同締合速率常數、不同解離速率常數、對GFRAL抗原之不同親和力及/或對GFRAL抗原之不同特異性。在一些實施例中，板包含約10、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、 約750、約800、約850、約900、約950或約1000個或更多個抗體或由其組成。抗體板可用於例如96孔或384孔盤，諸如用於分析，諸如ELISA。
製備抗GFRAL抗體
可藉由培養用含有抗GFRAL抗體編碼核酸之載體轉型或轉染之細胞來製備抗GFRAL抗體。可使用標準重組技術獲得編碼本發明之抗體之多肽組分的聚核苷酸序列。所需聚核苷酸序列可自抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)分離及測序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得後，將編碼多肽之序列插入能夠在宿主細胞中複製及表現異源聚核苷酸的重組型載體中。許多可使用且此項技術中已知的載體可用於本發明之目的。適合的載體之選擇將主要取決於待插入載體中之核酸之尺寸及待經載體轉型之特定宿主細胞。適用於表現本發明之抗體之宿主細胞包括原核細胞，諸如太古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，包括革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物體、真核微生物(諸如絲狀真菌(filamentous fungi)或酵母)、無脊椎動物細胞(諸如昆蟲或植物細胞)及脊椎動物細胞(諸如哺乳動物宿主細胞株)。宿主細胞用上述表現載體轉型且在適當時經調節之習知營養物培養基中培養以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列的基因。使用如此項技術中已知的標準蛋白質純化方法純化由宿主細胞產生之抗體。
包括載體構築、表現及純化之抗體產生方法進一步描述於Plückthun等人，(1996),Antibody Engineering：Producing antibodies in Escherichia coli：From PCR to fermentation (McCafferty,J.,Hoogenboom,H.R.及Chiswell,D.J.編)，第1版，第203-252頁，IRL Press,Oxford；Kwong,K.及Rader,C.,E.coli expression and purification of Fab antibody fragments,Current protocols in protein science editorial board,John E Coligan等人，第6章，第6.10單元(2009)；Tachibana及Takekoshi,「Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli」,Antibody Expression and Production ,M.Al-Rubeai編，Springer,New York,2011；Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic (Z.An編)，John Wiley & Sons,Inc.,Hoboken,NJ,USA中。
當然，涵蓋在此項技術中已熟知的可用於製備抗GFRAL抗體之替代性方法。舉例而言，可使用固相技術藉由直接肽合成來製備適合的胺基酸序列或其部分(參見例如Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis ,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc. ,85：2149-2154(1963))。可使用手動技術或自動進行活體外蛋白質合成。抗GFRAL抗體之多種部分可單獨地化學合成且使用化學或酶促方法組合以產生所需抗GFRAL抗體。或者，可由經工程改造以表現抗體之轉基因動物之細胞或體液(諸如乳液)純化抗體，如例如美國專利案第5,545,807號及美國專利案第5,827,690號中所揭示。
免疫結合物
本發明亦提供結合物，其包含與一或多種非抗體試劑共價結合(包括藉由合成連接子)之本發明之抗GFRAL抗體中之任一者。
多種放射性同位素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括At211 、I4、I4、Y4、Re4、Re4、Sm4、Bi4、P4、Pb4及Lu之放射性同位素。當結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc4或I4，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之旋轉標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、 錳或鐵。放射性同位素可以已知方式併入結合物，如例如Reilly,「The radiochemistry of monoclonal antibodies and peptides」,Monoclonal Antibody and Peptide-Targeted Radiotherapy of Cancer,R.M.Reilly編，Wiley,Hoboken N.J.,2010中所描述。
在一些實施例中，本文所提供之抗體與診斷、可偵測或治療劑或任何其他分子結合或以重組方式融合。結合或以重組方式融合之抗體可適用於例如監測或預後β-細胞缺陷性疾病、病症或病狀之發作、發展、進程及/或嚴重度，作為臨床測試程序之一部分，諸如測定特定療法之功效。
此類診斷及偵測可例如藉由使抗體與可偵測物質偶合來實現，該等可偵測物質包括(但不限於)多種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、螢光素異硫氰酸、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，諸如(但不限於)流明諾(luminol)；生物發光材料，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及發光蛋白質；化學發光材料，諸如(但不限於)基於吖錠之化合物或HALOTAG；放射性材料，諸如(但不限於)碘(131 I、125 I、123 I及121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In及111 In)、鎝(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn及117 Sn；及使用多種正電子發射斷層攝影之正電子發射金屬，及非放射性順磁金屬離子。
本文亦提供與治療部分(或一或多個治療性部分)結合或以重組方式融合之抗體以及其用途。抗體可與治療部分結合或以重組方式融合，包括細胞毒素，諸如細胞生長抑制或殺細胞性試劑、治療劑或放射性金屬離子，諸如α-發射體。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何損害細胞之試劑。
此外，本文所提供之抗體可與調節既定生物反應之治療部分或藥物部分結合或以重組方式融合。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、γ-干擾素、α-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、凋亡劑，例如TNF-γ、TNF-γ、AIM I(參見例如國際公開案第WO 97/33899號)、AIM II(參見例如國際公開案第WO 97/34911號)、Fas配位體(參見例如Takahashi等人，1994,J.Immunol.,6：1567-1574)及VEGF(參見例如國際公開案第WO 99/23105號)、抗血管生成劑(包括例如血管生長抑素、內皮生長抑素或凝血路徑之組分(例如組織因子))；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素(例如干擾素γ、介白素-1(「IL-1」)、介白素-2(「IL-2」)、介白素-5(「IL-5」)、介白素-6(「IL-6」)、介白素-7(「IL-7」)、介白素9(「IL-9」)、介白素-10(「IL-10」)、介白素-12(「IL-12」)、介白素-15(「IL-15」)、介白素-23(「IL-23」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)及粒細胞群落刺激因子(「G-CSF」))或生長因子(例如生長激素(「GH」))，或凝血劑(例如鈣、維生素K(vitamin K)、組織因子，諸如(但不限於)哈格曼因子(Hageman factor)(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽釋放酶(PK)、凝血 蛋白質因子II(凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂及纖維蛋白單體)。
本文亦提供與異源蛋白質或多肽(或其片段，例如具有約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100個胺基酸之多肽)以重組方式融合或以化學方式結合(共價或非共價結合)以產生融合蛋白之抗體，以及其用途。特定言之，本文中提供融合蛋白，其包含本文所提供之抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2 片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。在一個實施例中，與抗體融合之異源蛋白質、多肽或肽適用於使抗體靶向特定細胞類型，諸如表現GFRAL之細胞。舉例而言，結合於由特定細胞類型(例如免疫細胞)表現之細胞表面受體之抗體可與本文所提供之經修飾之抗體融合或結合。
此外，本文所提供之抗體可結合於治療性部分，諸如放射性金屬離子，諸如α-發射體，諸如213 Bi，或適用於使放射金屬離子與多肽結合之巨環螯合劑，包括(但不限於)131 In、131 LU、131 Y、131 Ho、131 Sm。在某些實施例中，巨環螯合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接至抗體。此類連接子分子通常在此項技術中已知且描述於例如Denardo等人，1998,Clin Cancer Res. 4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem. 10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol. 26(8)：943-50中。
此外，本文所提供之抗體可與標記物或「標籤」序列(諸如肽)融合以促進純化。在特定實施例中，標記物或標籤胺基酸序列係六組胺酸肽，尤其諸如pQE載體中提供之標籤(參見例如QIAGEN,Inc.)，其中許多可商 購。舉例而言，如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所描述，六組胺酸為融合蛋白之純化提供方便。其他適用於純化之肽標籤包括(但不限於)紅血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白質之抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)，及「FLAG」標籤。
用於融合或使治療性部分(包括多肽)與抗體結合之方法為熟知的(參見例如Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985),Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58；美國專利案第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號、第5,723,125號、第5,783,181號、第5,908,626號、第5,844,095號及第5,112,946號；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公開案WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631及WO 99/04813；Ashkenazi等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA,88：10535-10539,1991；Traunecker等人，Nature,331：84-86,1988；Zheng等人，J.Immunol.,154：5590-5600,1995；Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：11337-11341,1992)。
可例如經由基因改組、主結構改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)技術產生融合蛋白。DNA改組可用於改變如本文所提供之抗GFRAL抗體之活性，包括例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體(參見例如美國專利案第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313)。在重組之前，抗體或經編碼之抗體可藉由經歷由易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法進行之隨機突變誘發來改變。編碼本文所提供之抗體之聚核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組分、主結構、區段、部分、結構域、片段等再組合。
本文所提供之抗體亦可與第二抗體結合以形成抗體異結合物，如例如美國專利案第4,676,980號中所描述。
應選擇與本文所提供之結合於GFRAL(例如GFRAL多肽、片段、抗原決定基)之抗體結合或以重組方式融合的治療部分或藥物以實現所需預防性或治療性作用。在某些實施例中，抗體係經修飾之抗體。舉例而言，當決定哪種治療部分或藥物與本文所提供之抗體結合或以重組方式融合時，臨床醫師或其他醫學人員可考慮以下因素：疾病之性質、疾病之嚴重度及個體之病狀。
如本文所提供之結合於GFRAL之抗體亦可連接至固體載體，其尤其 適用於目標抗原之免疫分析或純化。此類固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
連接子可為促進細胞中所結合之試劑之釋放的「可裂解連接子」，但本文中亦涵蓋不可裂解連接子。用於本發明之結合物之連接子包括(但不限於)酸不穩定連接子(例如腙連接子)、含有二硫鍵之連接子、肽酶敏感性連接子(例如包含胺基酸(例如纈胺酸及/或瓜胺酸)之肽連接子，諸如瓜胺酸-纈胺酸或苯丙氨酸-離胺酸)、光不穩定性連接子、二甲基連接子(參見例如Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利案第5,208,020號)、硫醚連接子或經設計以避免多藥轉運體介導之耐受性的親水性連接子(參見例如Kovtun等人，Cancer Res. 70：2528-2537,2010)。
可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製備抗體及藥劑之結合物，諸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。本發明亦涵蓋可使用如此項技術中所揭示之任何適合的方法製備的抗體及藥劑之結合物(參見例如Bioconjugate Techniques ，第2版，G.T.Hermanson編，Elsevier,San Francisco,2008)。
用於抗體及藥劑之習知結合策略已基於涉及Lys殘基或Cys殘基之硫醇基之ε-胺基的隨機結合化學方法，其產生異源結合物。新近研發之技術允許對抗體之位點特異性結合，產生均質負載且避免具有經改變之抗原結合或藥物動力學的結合物子群。此等技術包括「硫單抗(thiomabs)」之工 程改造，包含在提供反應性硫醇基之重鏈及輕鏈上之各位置處的半胱胺酸取代，且不破壞免疫球蛋白摺疊且組裝或改變抗原結合(參見例如Junutula等人，J.Immunol.Meth. 332：41-52(2008)；Junutula等人，Nat.Biotechnol. 26：925-932,2008)。在另一方法中，藉由將終止密碼子UGA自終止重新編碼成硒半胱胺酸插入來講硒半胱胺酸以轉譯方式插入抗體序列中，實現在其他天然胺基酸存在下硒半胱胺酸之親核硒醇基團處之位點特異性共價結合(參見例如Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：12451-12456(2008)；Hofer等人，Biochemistry 48(50)：12047-12057,2009)。
醫藥調配物
本發明之抗GFRAL抗體可藉由任何適於所治療之疾病、病症或病狀之途徑投與。通常將非經腸投與抗體，例如輸注、皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、鞘內及硬膜外。抗體劑量將變化，包括取決於疾病或病症之性質及/或嚴重度以及個體之病狀，可包括在1mg與100mg之間的劑量。劑量亦可包括1mg/kg與15mg/kg之間的劑量。在一些實施例中，劑量在約5mg/kg與約7.5mg/kg之間。在一些實施例中，劑量為約5mg/kg。在一些實施例中，劑量為約7.5mg/kg。均一劑量選自由以下組成之群：(a)每兩週375-400mg及(b)每三週550-600mg。在一些實施例中，均一劑量為每兩週375-400mg。在一些實施例中，均一劑量為每三週550-600mg。在一些實施例中，均一劑量為每兩週400mg。在一些實施例中，均一劑量為每三週600mg。在依序給藥之一些實施例中，第一劑量及第二劑量各自在1mg/kg與15mg/kg之間，其中第二劑量在第一劑量之後1至4週。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量各自在5mg/kg與7.5mg/kg之間且 第二劑量在第一劑量之後2至3週。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量各自為5mg/kg且第二劑量在第一劑量之後2週。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量各自為7.5mg/kg且第二劑量在第一劑量之後3週。
對於治療疾病、病症或病狀，在一些實施例中，經由靜脈內輸注來投與抗體。經由輸注投與之劑量在每劑量約1μg/m2 至約10,000μg/m2 範圍內，通常每週給藥一次持續總共一、二、三或四次給藥。或者，劑量範圍為約1μg/m2 至約1000μg/m2 、約1μg/m2 至約800μg/m2 、約1μg/m2 至約600μg/m2 、約1μg/m2 至約400μg/m2 ；或者，約10μg/m2 至約500μg/m2 、約10μg/m2 至約300μg/m2 、約10μg/m2 至約200μg/m2 及約1μg/m2 至約200μg/m2 。可每天一次、每週一次、每週多次但小於每天一次、每月多次但小於每天一次、每月多次但小於每週一次、每月一次或間歇地投與劑量以減緩或緩解疾病、病症或病狀之症狀。投藥可以所揭示之間隔中之任一者繼續直至改善疾病、病症或病狀，或改善所治療之疾病、病症或病狀之症狀。投藥可在實現症狀減緩或緩解之後繼續，其中此類減緩或緩解藉由此類持續投藥而延長。
在一個態樣中，本發明亦提供醫藥調配物，其包含至少一種本發明之抗GFRAL抗體。在一些實施例中，醫藥調配物包含1)抗GFRAL抗體，及2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含1)抗GFRAL抗體及/或其免疫結合物，及視情況選用之2)至少一種其他治療劑。
藉由以水性溶液或凍乾或其他乾燥調配物形式混合具有所需純度之抗體與視情況選用之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑來製備用於儲存之抗體(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版， Osol,A.編(1980))。本文中之調配物亦可視需要含有超過一種活性化合物以用於所治療之特定疾病、病症或病狀(例如特定適應症)，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的化合物。舉例而言，除抗GFRAL抗體以外，一種調配物中可能需要包括其他抗體，例如第二抗GFRAL抗體，其結合GFRAL多肽上之不同抗原決定基，或針對一些其他目標之抗體。或者或另外，組合物可進一步包含另一種藥劑，包括例如化學治療劑、細胞毒性劑、細胞激素、生長抑制劑、到激素劑及/或保心藥。在一些實施例中，調配物包括烷化劑(例如苯丁酸氮芥、鹽酸苯達莫司汀(bendamustine hydrochloride)或環磷醯胺)、核苷類似物(例如氟達拉濱(fludurabine)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)或阿糖胞苷(cytarabine))、皮質類固醇(例如強的松(prednisone)、潑尼龍(prednisolone)或甲基潑尼龍)、免疫調節劑(例如來那度胺(lenalidomide))、抗生素(例如多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin)或米托蒽醌(mitoxentrone))、合成黃酮(例如夫拉平度(flavopiridol))、Bcl2拮抗劑(例如奧利默森(oblimersen)或ABT-263)、低甲基化劑(例如氮雜胞苷或地西他濱(decitabine))、FLT3抑制劑(例如米哚妥林(midostaurin)、索拉非尼(sorafenib)及AC220)。此類分子適合地以對預期目的有效之量存在於組合中。
本發明之抗體可以任何適用於傳遞至目標細胞/組織之形式調配，例如微膠囊或巨乳液(Remington'sPharmaceutical Sciences ，第16版，Osol,A.編(1980)；Park等人，Molecules 10：146-161(2005)；Malik等人，Curr.Drug.Deliv. 4：141-151(2007))；持續釋放調配物(Putney及Burke,Nature Biotechnol. 16：153-157,(1998))或脂質體(Maclean等人，Int.J.Oncol. 11：235-332(1997)；Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther. 8：39-45(2006))。
亦可將本文所提供之抗體包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊))、膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中。此類技術揭示於例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA中。
已知多種傳遞系統且可用於投與預防劑或治療劑(例如結合於如本文中所描述之GFRAL之抗體)，包括(但不限於)能夠表現抗體、脂質體、微米粒子、微膠囊、重組細胞中之封裝、受體介導之內飲作用(參見例如Wu及Wu,J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、作為反轉錄病毒或其他載體之一部分的核酸之構築等。在另一實施例中，預防劑或治療劑或本文中提供之組合物可在控制釋放或持續釋放系統中傳遞。在一個實施例中，可使用泵來達成控制釋放或持續釋放(參見例如Langer，見上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980,Surgery 88：507；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一實施例中，聚合材料可用於實現預防劑或治療劑(例如結合於如本文中所描述之GFRAL抗體)或本發明組合物之控制或持續釋放(參見例如Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編)，CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編)，Wiley,New York(1984)；Ranger及Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev. Macromol.Chem.23：61；亦參見Levy 等人，1985,Science 228：190；During等人，1989,Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.7 1：105)；美國專利案第5,679,377號；美國專利案第5,916,597號；美國專利案第5,912,015號；美國專利案第5,989,463號；美國專利案第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號)。用於持續釋放調配物之聚合物之實例包括(但不限於)聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，用於持續釋放調配物之聚合物為惰性，不含可濾出雜質，儲存穩定，無菌及可生物降解的。
在另一實施例中，可將控制或持續釋放系統置放於治療性目標附近，舉例而言，鼻腔通道或肺，因此僅需要一部分全身性劑量(參見例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release，見上文第2卷，第115-138頁(1984))。控制釋放系統由例如Langer(1990,Science 249：1527-1533)論述。可使用熟習此項技術者已知的任何技術產生持續釋放調配物，包含結合於如本文中所描述之GFRAL之一或多種抗體(參見例如美國專利案第4,526,938號、PCT公開案WO 91/05548、PCT公開案WO 96/20698、Ning等人，1996,“Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel”,Radiotherapy & Oncology 39：179-189、Song等人，1995,“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions”,PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397、Cleek等人，1997,“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854及Lam等人，1997,“Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,”Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760)。
可使用其他傳遞系統投與預防劑或治療劑(例如結合於如本文中所描述之GFRAL之抗體)，包括(但不限於)可注射藥物傳遞裝置。用於抗GFRAL抗體之可注射藥物傳遞裝置包括例如手持式裝置或穿戴式裝置。適用於抗GFRAL抗體之手持式裝置包括自動注射器，諸如FLEXIQ-DV(Elcam Medical)或PRO-JECT(Aptar Pharma)自動注射器。適用於抗GFRAL抗體之穿戴式裝置包括例如貼身藥物傳遞系統，諸如NEULASTA藥物傳遞套組(Amgen)。用於抗GFRAL抗體之可注射藥物傳遞裝置可含有抗體作為預防劑或治療劑，例如在預填充針筒、濾筒或小瓶中。用於抗GFRAL抗體之可注射藥物傳遞裝置(例如自動注射器)及/或其容器(例如針筒、濾筒或小瓶)可為拋棄式。適用於抗GFRAL抗體之例示性可注射裝置描述於WO 2014/081780中。
在一些實施例中，可使用其他藥物傳遞系統投與預防劑或治療劑(例如結合於如本文中所描述之GFRAL之抗體)，包括(但不限於)滲透泵。可使用用於抗GFRAL抗體之不同類型的滲透泵系統，包括例如單隔室系統、雙隔室系統及多隔室系統。適用於抗GFRAL抗體之例示性滲透泵系統描述於例如Herrlich等人(2012)Advanced Drug Delivery Reviews 64,1617-1627中。在一些實施例中，用於抗GFRAL抗體之滲透泵可包括可植 入藥物分配滲透泵，諸如DUROS泵。
治療方法
本發明之抗GFRAL抗體可用於例如治療方法中。
在一些實施例中，本發明提供用於治療或預防GDF15介導之疾病、病症或病狀的方法，其中該方法包含投與患有GDF15介導之疾病、病症或病狀的個體本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段。此外，可投與個體包含本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明提供治療患有非自主體重減輕之個體的方法。適合的個體之實例可為診斷患有消耗病惡病體質惡病體質之個體。適合的患者包括患有肝硬化、甲狀腺高能症、慢性腎病、帕金森氏病、癌症、進食障礙(例如神經性厭食症)、慢性發炎疾病(例如類風濕性關節炎)、敗血症或其他全身性炎症形式、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病及肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症或多發性硬化)或肌肉減少症之個體。
在一些實施例中，本發明亦提供用於預防具有由慢性疾病(諸如肝硬化、甲狀腺高能症、慢性腎病、帕金森氏病、癌症、進食障礙，神經性厭食症)、慢性發炎疾病(例如類風濕性關節炎)、敗血症或全身性炎症之其他形式、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病及肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症或多發性硬化)或肌肉減少症)引起之非自主體重減輕之風險的個體中之非自主體重減輕的方法。此類個體可包括具有升高之GDF15含量、正在經歷癌症治療之個體及其類似個體。
在一些實施例中，本發明提供治療患有惡病體質之個體的方法。適合的個體之實例為診斷患有惡病體質之個體。本發明亦提供用於預防具有由惡病體質發作引起之非自主體重減輕之風險的個體中之非自主體重減輕 的方法。此類個體包括具有升高之GDF15含量、患有癌症、正在經歷癌症治療、患有進食障礙及其類似疾病之個體。
亦揭示用於調節具有升高之GDF15活性的患者中之GDF15活性的方法。如本文中所使用，“升高之GDF15活性”係指與正常個體相比，個體之生物流體中之GDF15之活性或量增加。許多病狀與增加之GDF15血清含量相關，其中增加之GDF15引起許多症狀，諸如食慾下降、體重減輕及其類似症狀。與增加之GDF15血清含量相關之病狀之實例包括癌症，例如黑素瘤、胃癌、胰臟癌、前列腺癌；自身免疫疾病，諸如關節炎及炎症；心血管疾病，如動脈粥樣硬化、心臟衰竭、高血壓、心肌梗塞、胸腔疼痛及心臟血管事件；代謝疾病，如貧血、惡病體質、食慾不振、腎病及地中海貧血等。
患有以上疾病、病症或病狀中之任一者之個體係用於接受本文中所描述之抗抗體或其片段或治療劑與抗GFRAL抗體或其片段之組合的適合的候選人。
投與個體抗GFRAL抗體或其片段可降低或預防與GDF15介導之疾病、病症或病狀相關之症狀中之一或多者。舉例而言，投與本發明之抗GFRAL抗體或其片段可增加個體之體重及/或食慾。作為另一實例，投與本發明之抗GFRAL抗體或其片段可維持個體體重或降低個體之體重減輕。
在一個態樣中，提供用於治療疾病、病症或病狀之方法，其包含投與個體有效量之抗GFRAL抗體或其片段。在某些實施例中，用於治療疾病、病症或病狀之方法包含投與個體有效量之醫藥調配物，其包含抗GFRAL抗體及視情況選用之至少一種其他治療劑，諸如本文中所描述之 治療劑。
可投與人類抗GFRAL抗體或其片段用於治療目的。此外，可向表現與抗體交叉反應之GFRAL之非人類哺乳動物(例如靈長類動物、豬、大鼠或小鼠)投與抗GFRAL抗體或其片段以用於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型。關於後者，此類動物模型可適用於評估本發明抗體之治療功效(例如，測試劑量及投藥時程)。
本發明之抗體可單獨或與其他組合物組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗GFRAL抗體可與至少一種其他治療劑及/或佐劑共同投與。在一些實施例中，其他化合物係除抗GFRAL抗體以外的治療性抗體。
上述此類組合療法涵蓋組合投藥(其中相同或單獨調配物中包括兩種或更多種治療劑)，及單獨投藥，在此情況下，本發明之抗GFRAL抗體或其片段之投藥可在其他治療劑及/或佐劑之投藥之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體亦可與其他治療方案組合使用，包括(但不限於)本文中所描述之治療方案。
本發明之抗GFRAL抗體(及任何其他治療劑或佐劑)可藉由任何適合的手段投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內以及(若需要用於局部治療)病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。此外，抗體或結合物藉由脈衝輸注適合地投與，尤其在抗體或其片段之遞減劑量下。部分視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
本發明之抗體將以與良好醫療實務一致之方式調配、給藥及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別個體之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞位點、投與方法、投藥時程及 醫學從業者已知之其他因素。抗GFRAL抗體並非必須，而視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體或免疫結合物之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且用如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。
對於疾病、病症或病狀之預防或治療，本發明之抗GFRAL抗體或其片段之適合劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑(諸如本文中所描述之藥劑)組合使用時)將取決於所治療之疾病、病症或病狀的類型、抗體類型、疾病、病症或病狀之嚴重度及病程、投與抗體用於預防性或治療性目的、先前療法、個體之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。宜一次性或在一系列治療中投與個體抗GFRAL抗體或其片段。取決於疾病之類型及嚴重度，約1μg/kg至100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg、1mg/kg-15mg/kg等)抗體或其片段可為用於投與個體之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一種典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更大之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病況而定持續至發生疾病症狀之所需抑制為止。抗體或其片段之例示性劑量可在約0.05mg/kg至約10.0mg/kg範圍內。因此，可投與個體約0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg或10.0mg/kg(或其任何組合)抗體之一或多種劑量。此類劑量可間歇投與，例如每週一次或每三週一次(例如使得個體接受抗體之約兩至約二十次，或例如約六次給藥)。亦可投與初始較高的起始劑 量，繼而一或多種較低劑量。例示性給藥方案包含投與抗體或其片段之初始起始劑量，接著投與保持劑量(例如每週一次)。初始起始劑量可大於保持劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監控。
在一些實施例中，本文中所描述之方法涉及投與向患有非自主體重減輕或具有產生非自主體重減輕之風險的患者個體抗GFRAL抗體或其片段。標的方法包括投與具有升高之GDF15血清含量之個體本文所揭示之抗GFRAL抗體或其片段。在某一實施例中，抗體或其片段為與GDF15競爭結合於GFRAL之細胞外域的抗GFRAL抗體。在某些實施例中，抗體或其片段結合於GFRAL蛋白質之細胞外域，但不活化RET。舉例而言，抗體或其片段為與GDF15競爭結合於GFRAL之細胞外域，但在結合於GFRAL時不活化RET的抗GFRAL抗體。此類抗體描述於本文中。
在本發明之方法中，可投與個體(例如人類患者)本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段或包含該等抗體或其片段之醫藥組合物以例如實現目標體重及/或維持體重；實現目標身體質量指數(BMI)及/或維持BMI；增加食慾；及其類似目的。正常人類成年人具有18.5-24.9Kg/m2 範圍內之BMI。標的治療方法可使患者之體重、BMI、肌肉重量及/或食物攝入增加達至少約5%，例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
本文中所描述之與治療或預防GDF15介導之疾病、病症或病狀(例如非自主體重減輕)相關之方法包括例如使用用於療法/預防之本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段(單獨或與其他類型之療法組合)。該方法涉及投與個體抗GFRAL抗體或其片段及另一種藥劑。
在一些實施例中，投與經歷肌肉量減少，例如與潛在疾病相關之肌肉量減少之患者藥劑。與惡病體質相關之潛在疾病包括(但不限於)癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症及全身性炎症之其他形式、肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症)及進食障礙(稱為神經性厭食症)。在一些實施例中，藥劑抑制肌肉量(例如肌肉質量)及脂肪量減少達至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
在一些實施例中，肌肉量(例如肌肉質量)減少伴隨脂肪量減少。在一些實施例中，藥劑可抑制脂肪量減少達至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
在一些實施例中，向經診斷患有體重減輕(例如非自主體重減輕)之患者投與藥劑。在一些實施例中，藥劑可使體重減輕(例如非自主體重減輕)恢復達至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%或35%。
在一些實施例中，向診斷患有器官質量減輕，例如與潛在疾病相關之器官質量減輕的患者投與藥劑。與惡病體質相關之潛在疾病包括(但不限於)癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症及全身性炎症之其他形式、肌肉萎縮(諸如肌肉萎縮症)及進食障礙(稱為神經性厭食症)。在一些實施例中，藥劑可抑制器官質量減輕達至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。在一些實施例中，在心臟、肝臟、腎臟及/或脾中觀測到器官質量減輕。在一些實施例中，器官質量減輕伴有肌肉量減輕、脂肪量減輕及/或非自主體重減輕。
肌肉減少症、肌肉萎縮症及顯著肌肉重量減輕可在不存在惡病體 質、食慾下降或體重減輕之情況下發生。在一些實施例中，藥劑可用於治療經診斷患有肌肉減少症、肌肉萎縮症及/或顯著肌肉體重減輕之個體，無論個體是否患有或已診斷具有惡病體質或食慾下降。此類方法包含向有需要的個體投與治療有效量之一或多種藥劑。
針對治療或預防惡病體質之多種療法中之任一種可在組合物或治療方法中與標的蛋白質組合。
當GFRAL-ECD蛋白質與一或多種其他療法組合投與時，組合可與標的蛋白質同時投與或在標的蛋白質之投藥之前或之後5小時或更長時間(例如10小時、15小時、20小時或更長時間)的任何時間投與。在某些實施例中，連續投與或施用標的蛋白質及其他治療性干預，例如當標的蛋白質在另一種治療性治療之前或之後投與時。在其他實施例中，同時投與標的蛋白質及其他療法，例如當標的蛋白質及第二療法同時投與時，例如當第二療法係藥物時，其可與標的蛋白質一起以兩種單獨的調配物或組合成投與個體之單一組合物之形式投與。與是否連續或同時投與無關，如上文所說明，在本發明中治療視為共同或組合投與。
與惡病體質有關之細胞介素包括活化素A及IL-6。活化素含量增加與癌症相關惡病體質及性腺腫瘤相關。參見例如Marino等人(2013)CYTOKINE & GROWTH FACTOR REV.24：477-484。活化素A係TGF-β家族之成員，且係2型活化素受體ActRIIB之配位體。參見例如Zhou等人(2010)CELL 142：531-543。已證實IL-6之循環量與癌症患者中之體重減輕以及縮短之存活期相關。參見例如Fearon等人(2012)CELL METABOLISM 16：153-166。
因此，在一些實施例中，活化素-A或活化素-A受體ActRIIB、IL-6或 IL-6受體(IL-6R)之一或多種抑制劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(舉例而言，同時投與、在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。活化素A或ActRIIB之例示性抑制劑包括例如抗活化素-A抗體或其抗原結合片段、抗ActRIIB抗體或其抗原結合片段、活化素-A之小分子抑制劑、ActRIIB之小分子抑制劑及ActRIIB之『誘餌』受體，諸如可溶性ActRIIB受體及可溶性ActRIIB受體與Fc分子之融合物(ActRIIB-Fc)。參見例如Zhou等人(2010)，見上文。適合的IL-6或IL-6R之抑制劑包括抗IL-6抗體或其抗原結合片段、抗IL-6R抗體或其抗原結合片段、IL-6之小分子抑制劑、IL-6R之小分子抑制劑及IL-6R之『誘餌』受體，諸如可溶性IL-6受體及可溶性IL-6受體與Fc分子之融合物(IL6R-Fc)。參見例如Enomoto等人(2004)BlOCHEM.AND BIOPHYS.RES.COMM.323：1096-1102；Argiles等人(2011)EUR.J.PHARMACOL.668：S81-S86；Tuca等人(2013)ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88：625-636。適合的IL-6或IL-6R之抑制劑可包括例如托西利單抗(Tocilizumab)(Actemra®，Hoffmann-LaRoche)、批准用於治療類風濕性關節炎之人類化抗IL-6R單株抗體及沙瑞盧單抗(Sarilumab)/REGN88(Regeneron)、處於用於治療類風濕性關節炎之臨床研究中之人類化抗IL6R抗體；及司美替尼(Selumetinib)/AZD6244(AstraZeneca)、MEK之異位抑制劑，已證實其抑制IL-6產生。Prado等人(2012)BRITISH J.CANCER 106：1583-1586。
TNFα及IL-1為已知涉及促炎性反應之介導的細胞介素，其亦涉及肌肉無力、食慾不振及惡病體質。增加之TNFα循環量似乎可抑制肌生成。 TNFα，亦稱為「惡病質素」，刺激介白素-1分泌且與誘導惡病體質相關。IL-1係急性階段發炎反應之強效觸發劑，且已證實輸注IL-1可引起顯著體重減輕及食慾下降。已證實IL-1可促進攜有鼠類結腸-26腺癌之小鼠中癌症惡病體質之起始(Strassmann等人(1993)J.IMMUNOL.150：2341)。亦參見Mathys及Billiau(1997)NUTRITION 13：763-770；Fong等人(1989)AM.J.PHYSIOL.-REGULATORY,INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOL.,256：R659-R665。因此，用於治療類風濕性關節炎之TNFα抑制劑及IL-1抑制劑亦可適用於治療惡病體質。
因此，在一些實施例中，TNFα或IL-1之一或多種抑制劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(例如同時投與、在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。適合的TNFα或IL-1之抑制劑包括抗TNFα抗體或其抗原結合片段、抗IL-1抗體或其抗原結合片段、TNFα或IL-1之小分子抑制劑及TNFα或IL-1之『誘餌』受體，諸如可溶性TNFα或IL-1受體及TNFα或IL-1之可溶性形式與Fc分子之融合物。適合的TNFα之抑制劑包括例如依那西普(etanercept)(Enbrel®，Pfizer/Amgen)、英利昔單抗(infliximab)(Remicade®，Janssen Biotech)、阿達木單抗(adalimumab)(Humira®，Abbvie)、戈利木單抗(golimumab)(Simponi®，Johnson and Johnson/Merck)及聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(Cimzia®，UCB)。適合的IL-1抑制劑包括例如靶向IL-1之Xilonix®抗體(XBiotech)、阿尼奇拉(anikinra)(Kinaret®，Amgen)、康納單抗(canakinumab)(Ilaris®，Novartis)及利納西普(rilonacept)(Arcalyst®，Regeneron)。在某些實施例中，TNFα抑制劑或 IL-1抑制劑(其通常全身性投與以用於治療類風濕性關節炎)可局部及直接投與腫瘤位點。
肌肉抑制素，亦稱為GDF-8，係肽之TGF-β家族之成員，其為肌肉質量之負調節劑，如由肌肉抑制素缺失型哺乳動物中之肌肉質量增加所示。肌肉抑制素係2型活化素受體ActRIIB之配位體。
因此，在一些實施例中，肌肉抑制素或其受體之一或多種抑制劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(舉例而言，同時投與，在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。適合的肌肉抑制素或ActRIIB之抑制劑包括抗肌肉抑制素抗體或其抗原結合片段、抗ActRIIB抗體或其抗原結合片段、肌肉抑制素之小分子抑制劑、ActRIIB之小分子抑制劑及GDF-8之『誘餌』受體，諸如可溶性ActRIIB及ActRIIB之可溶性形式與Fc分子之融合物。參見例如Lokireddy等人(2012)BlOCHEM.J.446(1)：23-26。可適用於本發明方法之肌肉抑制素抑制劑包括REGN1033(Regeneron)；參見Bauerlein等人(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE：Abstracts of the 7th Cachexia Conference,Kobe/Osaka,Japan,December 9-11,2013,Abstract 4-06；LY2495655(Lilly),a humanized anti-myostatin antibody in clinical development by Eli Lilly；亦參見“A PHASE 2 STUDY OF LY2495655 IN PARTICIPANTS WITH PANCREATIC CANCER”，可在萬維網自clinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530；NML標識符：NCT01505530；ACE-031(Acceleron Pharma)獲得及司他莫單抗(stamulumab)(Pfizer)。
能夠活化GHS受體(GHS-R1a，亦稱為胃內激素受體)之藥劑(諸如胃內激素或胃內激素模擬物，或其他生長激素促分泌物(GHS))可適用於增加人類之食物攝入及體重。參見Guillory等人(2013),VITAMINS AND HORMONES第92卷，第3章；及Steinman及DeBoer(2013)VITAMINS AND HORMONES第92卷，第8章。因此，在一些實施例中，一或多種胃內激素或胃內激素模擬物或其他生長激素促分泌物(GHS)可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(舉例而言，同時投與，在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。適合的胃內激素模擬物包括阿納莫林(anamorelin)(Helsinn,Lugano,CH)；參見Temel等人(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE：Abstracts of the 7th Cachexia Conference,Kobe/Osaka,Japan,December 9-11,2013，摘要5-01。其他適合的GHS分子可例如使用PCT公開案第WO 2011/117254及WO 2012/113103號中描述之生長激素促泌素受體胃內激素競爭分析鑑別。
雄激素受體(包括小分子及其他選擇性雄激素受體調節劑(SARM))之促效劑可適用於治療惡病體質及/或肌肉減少症。參見例如Mohler等人(2009)J.MED.CHEM.52：3597-3617；Nagata等人(2011)BlOORGANIC AND MED.CHEM.LETTERS 21：1744-1747；及Chen等人(2005)MOL.INTERV.5：173-188。理想的是，SARM應用作合成代謝目標組織(諸如肌肉及骨骼)中之完全促效劑，如睪固酮，但應對前列腺組織僅顯示部分或純雄激素受體拮抗性活性。參加例如Bovee等人(2010)J.STEROID BlOCHEM.& MOL.BIOL.118：85-92。適合的SARM可例如使用Zhang等人(2006)BlOORG.MED.CHEM.LETT. 16：5763-5766；及Zhang等人(2007)BlOORG.MED.CHEM.LETT.17：439-443中描述之方法及分析來鑑別。
因此，在一些實施例中，一或多種雄激素受體促效劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(舉例而言，同時投與，在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。適合的SARM包括例如GTx-024(恩博沙(enobosarm)，Ostarine®，GTx,Inc.)，一種由GTx,Inc.研發之臨床II期中之SARM。亦參見Dalton等人(2011)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2：153-161。其他適合的SARM包括2-(2,2,2)-三氟乙基-苯并咪唑(Ng等人(2007)BlOORG.MED.CHEM.LETT.17：1784-1787)及JNJ-26146900(Allan等人(2007)J.STEROID BlOCHEM.& MOL.BIOL.103：76-83)。
已研究β-腎上腺素激導性受體阻斷劑或β-阻斷劑對惡病體質個體之體重的作用，且已與充血性心臟衰竭患者中惡病體質之部分逆轉相關。參見例如Hryniewicz等人(2003)J.CARDIAC FAILURE 9：464-468。已在癌症惡病體質個體中之2期臨床試驗中評估β-阻斷劑MT-102(PsiOxus Therapeutics,Ltd.)。參見Coats等人(2011)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2：201-207。因此，在一些實施例中，一或多種β-腎上腺素激導性受體阻斷劑或β-阻斷劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(舉例而言，同時投與、在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。
具有黑皮質素信號傳導中之基因缺陷之黑皮質素受體基因剔除小鼠 呈現與惡病體質、食慾增加、瘦體質增加及代謝降低相對的表現型。因此，黑皮質素拮抗呈現為用於與慢性疾病相關之惡病體質的潛在治療(DeBoer及Marks(2006)TRENDS IN ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM 17：199-204)。
因此，在一些實施例中，黑皮質素肽或黑皮質素受體之一或多種抑制劑可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合投與(例如同時投與，在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。適合的黑皮質素或黑皮質素受體之抑制劑包括抗黑皮質素肽抗體或其抗原結合片段、抗黑皮質素受體抗體或其抗原結合片段、黑皮質素肽之小分子抑制劑、黑皮質素受體之小分子抑制劑及黑皮質素受體之『誘餌』受體，諸如可溶性黑皮質素受體及可溶性黑皮質素受體與Fc分子之融合物。適合的黑皮質素受體抑制劑包括例如黑皮質素受體拮抗劑阿格瑞(agouri)相關肽(AgRP(83-132))，已證明其可預防癌症相關惡病體質之小鼠模型中之惡病體質相關症狀(Joppa等人(2007)PEPTIDES 28：636-642)。
抗癌劑，尤其可引起惡病體質及GDF15含量上升之抗癌劑(諸如順鉑)可與本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段組合用於本發明之方法中(舉例而言，同時投與、在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之前投與或在本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段之後投與)。許多癌症患者由放射及/或化學療法之苛刻過程削弱，其可限制患者耐受此類療法之能力，且因此限制給藥方案。某些癌症藥劑本身(諸如氟尿嘧啶、阿德力黴素、甲胺喋呤及順鉑)可促進惡病體質，例如藉由誘導嚴重的胃腸道併發症。參見例如Inui(2002)CANCER J.FOR CLINICIANS 52：72-91。藉 由本發明之方法，其中抗癌劑與本發明之抗GFRAL抗體組合投與，有可能降低惡病體質之發病率及/或嚴重度，且最終增加此類抗癌劑之最大耐受劑量。因此，用可引起惡病體質之抗癌劑治療之功效可由降低惡病體質之發病率(如劑量限制性不良影響)及投與更高劑量之既定抗癌劑來改良。
因此，本文中提供醫藥組合物，其包含本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段與選自由以下組成之群的藥劑之組合：活化素-A之抑制劑、ActRIIB之抑制劑、IL-6之抑制劑或IL-6R之抑制劑、胃內激素、胃內激素模擬劑或GHS-R1a促效劑、SARM、TNFα抑制劑、IL-1α抑制劑、肌肉抑制素抑制劑、β-阻斷劑、黑皮質素肽抑制劑、黑皮質素受體抑制劑及抗癌劑。本發明亦包括治療、預防或最小化哺乳動物中之惡病體質及/或肌肉減少症的方法，其包含投與有需要之哺乳動物醫藥組合物或組合物，其包含有效量之本發明之抗GFRAL抗體與有效量之以下之組合：活化素-A之抑制劑、ActRIIB之抑制劑、IL-6之抑制劑或IL-6R之抑制劑、胃內激素、胃內激素模擬劑或GHS-R1a促效劑、SARM、TNFα抑制劑、IL-1α抑制劑、肌肉抑制素抑制劑、β-阻斷劑、黑皮質素肽抑制劑或黑皮質素受體抑制劑。
在另一態樣中，本發明提供抑制與潛在疾病相關之肌肉質量減輕之方法，其包含投與有需要之哺乳動物醫藥組合物或組合物，其包含有效量之本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段與有效量之以下之組合：活化素-A之抑制劑、ActRIIB之抑制劑、IL-6之抑制劑或IL-6R之抑制劑、胃內激素、胃內激素模擬劑或GHS-促效劑、SARM、TNFα抑制劑、IL-1α抑制劑、肌肉抑制素抑制劑、β-阻斷劑、黑皮質素肽抑制劑或黑皮質素受體抑制劑，以預防或減少肌肉質量減輕。潛在疾病可選自由以下組成之 群：癌症、慢性心臟衰竭、慢性腎病、慢性阻塞性肺疾病、AIDS、多發性硬化、類風濕性關節炎、敗血症及結核病。此外，在一些實施例中，肌肉質量減輕伴有脂肪量減輕。
在另一態樣中，本發明提供抑制或降低哺乳動物中之非自主體重減輕的方法，其包含投與有需要之哺乳動物醫藥組合物或醫藥組合物，其包含有效量之本發明之抗GFRAL抗體與有效量之以下之組合：活化素-A之抑制劑、ActRIIB之抑制劑、IL-6之抑制劑或IL-6R之抑制劑、胃內激素、胃內激素模擬劑或GHS-R1a促效劑、SARM、TNFα抑制劑、IL-1α抑制劑、肌肉抑制素抑制劑、β-阻斷劑、黑皮質素肽抑制劑或黑皮質素受體抑制劑。
某些抗癌劑(諸如順鉑)具有一或多種不合需要的副作用，其涉及引起或增加一或多種症候群，諸如惡病體質、肌肉減少症、肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕。因此，在另一態樣中，本發明提供治療哺乳動物中之癌症同時預防、最小化或降低惡病體質、肌肉減少症或肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕之出現、發生頻率或嚴重度的方法，其包含投與有需要之哺乳動物醫藥組合物，其包含有效量之本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段與一或多種抗癌劑之組合。在一些實施例中，治療哺乳動物中之癌症同時預防、最小化或降低惡病體質、肌肉減少症或肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕之出現、發生頻率或嚴重度的該方法包含投與有需要之哺乳動物醫藥組合物，其包含有效量之本文中所描述之抗GFRAL抗體或其片段與已知引起或增加哺乳動物中之惡病體質、肌肉減少症或肌肉萎縮、骨萎縮或非自主體重減輕之出現、發生頻率或嚴重度的一或多種抗癌劑的組合。
診斷方法及偵測方法
在一個態樣中，本發明之抗GFRAL抗體及其片段適用於偵測生物樣品中GFRAL之存在。此類抗GFRAL抗體可包括結合於人類GFRAL之抗體。如本文所使用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。
在一個態樣中，本發明提供偵測生物樣品中GFRAL之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與抗GFRAL抗體在允許抗GFRAL抗體與GFRAL結合之條件下接觸，且偵測抗GFRAL抗體與GFRAL之間是否形成複合物。
在一個態樣中，本發明提供診斷與GFRAL之表現相關之病症的方法。在某些實施例中，該方法包含使測試細胞與抗GFRAL抗體接觸；藉由偵測抗GFRAL抗體與GFRAL之結合來測定測試細胞之GFRAL表現量(定量或定性)；及比較測試細胞之GFRAL表現量與對照細胞(例如與測試細胞相同組織來源之正常細胞或以與此類正常細胞類似之量表現GFRAL之細胞)之GFRAL表現量，其中測試細胞與對照細胞相比之高GFRAL表現量指示存在與表現增加相關之病症。在某些實施例中，自懷疑患有與GDF15之表現相關之疾病、病症或病狀及/或需要抑制GDF15之活體內作用之疾病、病症或病狀的個體獲得測試細胞。在某些實施例中，疾病、病症或病狀係例如非自主體重減輕。此類例示性疾病、病症或病狀可使用本發明之抗GFRAL抗體診斷。
在某些實施例中，診斷或偵測方法(諸如上述方法)包含偵測抗GFRAL抗體與表現於細胞表面上或自在表面上表現GFRAL之細胞獲得之細胞膜製劑中之GFRAL的結合。在某些實施例中，該方法包含使細胞與 抗GFRAL抗體在允許抗GFRAL抗體與GFRAL結合之條件下接觸，且偵測抗GFRAL抗體與細胞表面上之GFRAL是否形成複合物。用於偵測抗GFRAL抗體與表現於細胞表面上之GFRAL之結合的例示性分析係“FACS”分析。
某些其他方法可用於偵測抗GFRAL抗體與GFRAL之結合。此類方法包括(但不限於)此項技術中熟知的抗原結合分析，諸如西方墨點法(western blots)、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析及免疫組織化學(IHC)。
在某些實施例中，抗GFRAL抗體經標記。標記物包括(但不限於)直接偵測之標記物或部分(諸如螢光、發色、電子密集型、化學發光及放射性標記物)，以及間接偵測(例如經由酶反應或分子相互作用)之部分，諸如酶或配位體。例示性標記物包括(但不限於)放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺醯基、傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(參見例如美國專利案第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖；澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似物。
在某些實施例中，抗GFRAL抗體固定在不可溶基質上。固定需要分離抗GFRAL抗體與任何在溶液中保持自由之GFRAL。此習知地由在分析 程序之前溶解抗GFRAL抗體(如藉由吸附至不溶於水的基質或表面(參見例如Bennich等人，U.S.3,720,760))或藉由共價偶合(例如使用戊二醛交聯)或藉由在抗GFRAL抗體與GFRAL之後形成複合物之後溶解抗GFRAL抗體(例如藉由免疫沈澱)來實現。
替代或除抗GFRAL抗體以外，可使用本發明之免疫結合物實施任一種上述診斷或偵測實施例。
分析
可藉由此項技術中已知的多種分析表徵本發明之抗GFRAL抗體之生理/化學特性及/或生物活性。
1.活性分析
在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗GFRAL抗體的分析。生物活性可包括例如量測對葡萄糖及/或脂質代謝之作用的分析。舉例而言，可使用血糖分析。可使用由ACCU-CHEK活性計(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)讀取之ACCU-CHEK活性測試帶根據製造商指令量測血糖(例如小鼠剪尾或人類血液樣品中)。此外，舉例而言，可使用脂質概況分析。可將全血(例如來自小鼠尾部或來自人類血液樣品)收集至平坦的毛細試管(BD Clay Adams SurePrep,Becton Dickenson and Co.Sparks,MD)中。血清及血球可藉由在Autocrit Ultra 3(Becton Dickinson and Co.Sparks,MD)中旋轉試管來分離。可使用Integra 400臨床分析器(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)根據製造商指令分析血清樣品之脂質概況(三酸甘油酯、總膽固醇、HDL及非HDL)。
2.結合分析及其他分析
在一個態樣中，測試抗GFRAL抗體之抗原結合活性。舉例而言，在 某些實施例中，測試抗GFRAL抗體結合於表現於細胞表面上之外源性或內源性GFRAL的能力。可使用FACS分析進行此類測試。
針對GFRAL產生之單株抗體板可基於其識別之抗原決定基來分組，一種稱為抗原決定基分組之過程。通常使用競爭分析來進行抗原決定基分組，該等分析評估抗體在另一種抗體存在下結合於抗原之能力。在例示性競爭分析中，在溶液中培育經固定之GFRAL，該溶液包含結合於GFRAL之第一經標記之抗體及第二未經標記之抗體，測試該第二未經標記之抗體與第一抗體競爭結合於GFRAL之能力。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，經固定之GFRAL在包含第一經標記之抗體、但無第二未經標記抗體之溶液中培育。在允許第一抗體結合於GFRAL之條件下培育之後，移除過量未結合之抗體，且量測與固定GFRAL締合之標記物之量。若與對照樣品相比，經固定之GFRAL締合之標記物之量在測試樣品中顯著降低，則表示第二抗體與第一抗體競爭結合於GFRAL。在某些實施例中，經固定之GFRAL在細胞表面上或在自在表面上表現GFRAL之細胞獲得之細胞膜製劑中。
此項技術中亦已知抗原決定基分組之高產量方法(參見例如Jia等人，J.Immunol.Methods 2004,288(1-2)：91-98，描述用於表徵單株抗體之多重競爭性抗體分組之方法；及Miller等人，J.Immunol.Methods 2011,365(1-2)：118-25，描述藉由多重配對分析進行鼠類單株抗體之抗原決定基分組)。
3.抗原決定基定位
抗原決定基定位係鑑別抗體在其目標蛋白質抗原上之結合位點或抗原決定基(例如GFRAL上抗GFRAL抗體之抗原決定基)的方法。抗體抗原 決定基可為線形抗原決定基或構形抗原決定基。線形抗原決定基由蛋白質中胺基酸之連續序列形成。構形抗原決定基由在蛋白質序列中非連續，但在蛋白質摺疊成其三維結構時聚集在一起的胺基酸形成。
此項技術中已知多種用於在目標蛋白質抗原上定位抗體抗原決定基之方法。此等方法包括突變誘發方法、肽掃描方法、顯示方法、涉及質譜之方法及結構測定。
定點突變誘發方法涉及靶向定點突變誘發，其中藉由沿蛋白質序列系統地引入取代且接著測定各取代對抗體結合之作用來鑑別關鍵胺基酸。此可藉由“丙胺酸掃描突變誘發”進行，如例如Cunningham及Wells(1989)Science 244：1081-1085所描述，或人類GFRAL中胺基酸殘基之點突變誘發之一些其他形式。然而，突變誘發研究亦可揭示對GFRAL之整個三維結構而言重要，但不直接涉及抗體-抗原接觸之胺基酸殘基，且因此可能需要其他方法確認使用此方法測定之功能性抗原決定基。
槍式突變誘發定位利用目標基因之綜合式質體突變文庫，其中文庫中之各純系具有獨特的胺基酸突變且整個文庫覆蓋目標蛋白質中之每個胺基酸。構成突變文庫之純系在微孔板中個別地配置、在活哺乳動物細胞內表現且測試與相關抗體之免疫反應性。藉由反應性損失鑑別對抗體抗原決定基而言重要之胺基酸且接著在蛋白質結構上定位以觀察抗原決定基。藉由使分析自動化，可在數天至數週內衍生新的抗原決定基定位。因為其使用哺乳動物細胞內蛋白質之原生結構，該技術使得線形及構形抗原決定基結構可定位於複雜蛋白質上(參見例如Paes等人，J.Am.Chem.Soc. 131(20)：6952-6954(2009)；Banik及Doranz,Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2)：25-28(2010))。
由抗GFRAL抗體結合之抗原決定基亦可使用肽掃描方法測定。在肽掃描中，測試來自目標蛋白質GFRAL之重疊區段之短肽序列之文庫結合相關抗體之能力。合成肽且針對結合進行篩選，例如使用ELISA或BIACORE，或在晶片上，藉由多種用於固相篩選之方法中之任一種(參見例如Reineke等人，Curr.Opin.Biotechnol. 12：59-64,2001)，如“肽掃描”方法中(參見例如WO 84/03564；WO 93/09872)。此類肽篩選方法可能不能偵測一些非連續功能性抗原決定基，亦即涉及沿GFRAL多肽鏈之一級序列不相鄰之胺基酸殘基的功能性抗原決定基。
稱為CLIPS之新近研發之技術(骨架上肽之化學鍵)可用於定位構形抗原決定基。肽之寬鬆端附連至合成骨架上，使得骨架肽能夠採用與完整蛋白質中之相應序列相同的空間結構。使用CLIPS技術將肽線形固定至環狀結構中(『單環』格式)，及使蛋白質結合位點之不同部分聚集在一起(『雙環』、『三環』等格式)，以便建立可分析抗體結合之構形抗原決定基(參見例如美國專利案第7,972,993號)。
如上文所描述，由本發明之抗GFRAL抗體結合之抗原決定基亦可使用呈現技術定位，包括例如噬菌體呈現、微生物呈現及核糖體/mRNA呈現。在此等方法中，肽片段之文庫在噬菌體或細胞表面上呈現。接著藉由使用選擇性結合分析針對此等片段篩選抗體來定位抗原決定基。已研發許多計算工具，其允許基於使用噬菌體呈現獲得之線形親和力選擇肽預測構形抗原決定基(參見例如Mayrose等人，Bioinformatics 23：3244-3246,2007)。亦可獲得用於藉由噬菌體呈現偵測構形抗原決定基之方法。亦可使用微生物呈現系統表現細胞表面上經適當摺疊之抗原片段以鑑別構形抗原決定基(參見例如Cochran等人，J.Immunol.Meth. 287：147-158, 2004；Rockberg等人，Nature Methods 5：1039-1045,2008)。
亦可使用涉及蛋白水解及質譜之方法測定抗體抗原決定基(參見例如Baerga-Ortiz等人，Protein Sci. 2002年6月；11(6)：1300-1308)。在有限蛋白水解中，在存在及不存在抗體之情況下，抗原由不同蛋白酶裂解，且藉由質譜鑑別片段。抗原決定基為抗原中在抗體結合時變成受保護免於蛋白水解之區域(參見例如Suckau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9848-9852,1990)。其他基於蛋白水解之方法包括例如選擇性化學修飾(參見例如Fiedler等人，Bioconjugate Chemistry 1998,9(2)：236-234,1998)、抗原決定基切除(參見例如Van de Water等人，Clin.Immunol.Immunopathol. 1997,85(3)：229-235,1997)及新近研發之氫-氘(H/D)互換方法(參見例如Flanagan,N.,Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2)：25-28,2010)。
由本發明之抗GFRAL抗體結合之抗原決定基亦可藉由結構方法測定，諸如X射線晶體結構測定(參見例如WO 2005/044853)、分子模型化及核磁共振(NMR)光譜學，包括在自由時及在複合物中與相關抗體結合時不穩定醯胺氫之H-D互換比率之NMR測定(參見例如Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31：11335-11347；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32：6884-6891)。
其他與本發明之抗GFRAL抗體結合於相同抗原決定基之抗體可例如藉由關於與抗原決定基之結合篩選針對GFRAL產生之抗體、用包含有包含抗原決定基序列之人類GFRAL之片段的肽對動物進行免疫接種或使用噬菌體呈現關於與抗原決定基序列之結合選擇抗體來獲得。預期結合於相同功能性抗原決定基之抗體可呈現類似生物活性，諸如阻斷GFRAL之生 物活性，且此類活性可藉由抗體之功能性分析來確認。
4.其他活性分析
在一個實施例中，本發明之抗GFRAL抗體係抑制GFRAL之生物活性的拮抗性抗體。可分析本發明之抗GFRAL抗體以測定其是否抑制GFRAL之生物活性。
在一個態樣中，經純化之抗GFRAL抗體可進一步一系列分析表徵，包括(但不限於)N端測序、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜離子交換層析法及番木瓜蛋白酶消化。
在一個實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之改變的抗體，此使得該抗體成為對於其中活體內抗體半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的多種應用合乎需要之候選物。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性以確保僅保持所需特性。可進行活體外及/或活體內細胞毒性以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體不具有FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於評估相關分子之ADCC活性的活體外分析描述於例如美國專利案第5,500,362號或第5,821,337號中。適用於此類分析之效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估相關分子在活體內(例如動物模型，諸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭示的動物模型)的ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。為評定補體活化，可進行CDC分析，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期。
儘管出於清楚理解之目的，本發明已藉助於說明及實例較詳細地加以描述，但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容以全文引用之方式明確併入本文中。
實例
以下為本發明之方法及組合物的實例。
實例1：產生抗體
藉由例如用表現GFRAL蛋白質之細胞使小鼠免疫、共表現RET蛋白質及GFRAL蛋白質或GDF15蛋白質在共表現RET蛋白質及GFRAL蛋白質之細胞上之交聯來產生針對GFRAL蛋白質之抗體。小鼠亦用GFRAL ECD、GDF15：GFRAL ECD複合物及/或GFRAL ECD Fc融合物：RET ECD Fc融合物免疫。
舉例而言，如下製備用於免疫之細胞。293EXPI(Invitrogen)細胞用編碼GFRAL蛋白質之核酸序列(SEQ ID NO：1797)短暫轉染或用編碼GFRAL蛋白質及RET蛋白質之核酸序列(SEQ ID NO：1797及1813)共轉染。藉由FACS針對各別特異性抗體之GFRAL及RET之表現分析細胞。細胞在PBS中洗滌2次，藉由離心球粒化且產生細胞膜製劑。129/B6或NZBW動物用具有佐劑之細胞膜製劑免疫。對動物進行增強免疫以誘導適合的效價。藉由ELISA及/或FACS測定效價。自具有適合的效價之動物之脾及引流淋巴結獲得淋巴細胞之單細胞懸浮液。細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以1：12之比率藉由電融合來融合。在HAT選擇存在下將融合細胞塗佈至培養盤中。在培養10-14天之後，收集上清液且經歷使用過表現GFRAL或GFRAL及RET之293EXPI細胞藉由CellnSight或使用GFRAL-Fc蛋白質或RET及GFRAL藉由ELISA，藉助於細胞成像進行之篩選。Fc-雜二聚體確 認結合。進一步選擇陽性純系且經歷次選殖。
在免疫及融合之多個活動中，篩選超過十萬個融合瘤純系且選擇超過兩千個純系用於GDF15結合、基於細胞之GDF15誘導之信號傳導及基於細胞之GDF15獨立信號傳導。選擇數百個純系(例如250個)用於其他研究，包括關於結合親和力、結構域定位及抗原決定基特異性之分析。亦在功能性分析中測試數千種融合瘤上清液，包括拮抗性及促效活性分析。純化數百個純系以用於其他測試。
實例2：篩選及選擇抗體
在培養2週之後，使用過表現GFRAL或GFRAL及RET之293EXPI細胞藉由CellnSight，或使用GFRAL-Fc蛋白質或RET及GFRAL Fc-雜二聚體藉由ELISA，借助於細胞成像針對結合於GFRAL蛋白質之單株抗體篩選融合瘤上清液。簡言之，藉由細胞成像進行篩選，293EXPI細胞用編碼GFRAL之核酸序列短暫轉染或用編碼GFRAL及RET之核酸序列共轉染。將經轉染之細胞塗佈於具有透明底部之384孔培養盤上。在轉染後24小時更換培養基。在48小時時，將培養基吸出培養盤，將融合瘤上清液添加至孔中且在室溫下培育30分鐘。接著，將A647抗小鼠Fc添加至孔中且在室溫下再培育30分鐘。關於A647通道中之信號分析Dapi陽性細胞且陽性A647信號指示GFRAL結合子。
簡言之，藉由ELISA進行篩選，藉由塗佈於ELISA盤上之抗人類Fc試劑捕獲GFRAL-Fc蛋白質或RET及GFRAL Fc-雜二聚體。使用PBS/1% BSA阻斷培養盤。將15μL融合瘤上清液添加至孔中且在室溫下培育1小時。在洗滌3次之後，將15μL HRP-二級抗小鼠Fc添加至孔中且在室溫下培育1小時。在洗滌3次之後，使用15μL TMB培養培養盤。陽性信號指 示GFRAL結合子。
由此等分析，鑑別數千抗體為GFRAL之結合子。此等抗體經歷進一步測試，其包括關於結合親和力、結構域定位、抗原決定基特異性以及促效及拮抗性功能之分析。純化數百個抗體以用於進一步測試。
此外，量測抗體對人類及小鼠GFRAL之結合親和力。舉例而言，藉由Biacore，藉助於低解析KD 量測，基於抗體對人類GFRAL及小鼠GFRAL之結合親和力將抗體分級。簡言之，使用胺偶合劑(GE Healthcare LifeSciences,Piscataway,NJ)將抗小鼠Fc抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固定於CM5晶片之所有四個流槽上。使用流動細胞1作為參考，在流槽2、3及4上捕獲經純化之抗體(約100RU)。接著以70微升/分鐘之流動速率注射人類或小鼠GFRAL(25nM於PBS-P緩衝液中)且在25℃下監測結合動力學。
亦在其他基於Biacore之分析進行結合親和力量測。舉例而言，用經純化之抗體進行平衡解離常數(KD )量測以評估其與人類GFRAL或小鼠GFRAL之結合。如上文所提及，使用胺偶合劑(GE Healthcare LifeSciences,Piscataway,NJ)將抗小鼠Fc抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固定於CM5晶片之所有四個流槽上。使用流動細胞1作為參考，在流槽2、3及4上捕獲經純化之抗體(約100RU)。接著在70微升/分鐘之流動速率下注射含人類或小鼠GFRAL之PBS-P緩衝液且在25℃下評估結合動力學。
對人類及小鼠GFRAL之結合親和力之代表性結果(例如KD (nM))展示於以下表26中。此外，例示性抗體之結合之解離速率之代表性結果(例如Koff (1/s))展示於以下表26中。
NA=不適用；ND=未偵測到結合
關於例示性抗體1C1及3P10，親和力主要由極緩慢解離速率驅動(參見例如圖3 )。如以上表26中所示之結合於GFRAL之抗體不識別(例如結合於)GNFR α1，GFRAL之最緊密相關同系物。
實例3：功能性分析
產生針對GFRAL之抗體，例如實例1中所描述，在基於細胞之報導子分析中測試其功能活性。
舉例而言，使用經短暫轉染之HEK293T進行ELK1-螢光素酶報導子分析，其量測人類GDF15(hGDF15)誘導之人類GFRAL/RET信號傳導。轉染質體由兩種報導子質體Gal4-Elk1及5×UAS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1反報導系統目錄號219005)以及編碼人類GFRAL(hGFRAL)、食蟹獼猴GFRAL(cynoGFRAL)、小鼠GFRAL(mGFRAL)或大鼠GFRAL(rGFRAL)及人類RET(hRET)、食蟹獼猴RET(cynoRET)、小鼠RET(mRET)或大鼠RET(rRET)之質體組成。在此等分析中，細胞中hGDF15誘導之以重組方式表現GFRAL/RET受體複合物之活化觸發細胞內信號傳導，其引起ERK且接著引起Elk1磷酸化。一旦Gal4-Elk1磷酸化，Gal4-Elk1結合於5×UAS啟動子區域且引起螢光素酶報導基因轉錄。接著在螢光素酶酶促分析中量測螢光素酶之活性。
抑制人類GFRAL/RET信號傳導之針對GFRAL之抗體之代表性結果展示於以下表27中。
ND=在分析中未偵測到阻斷
NP=未進行分析
WB=在分析中偵測到弱阻斷
對於一些實驗，使用FuGene6轉染劑(Promega)將上述四個質體(例如2個報導子質體GFRAL、RET)轉染至含新近收集之細胞之懸浮液中。針對來自所示物種之各對受體最佳化轉染中之GFRAL及RET DNA比率且在12：1至60：1之間變化。在正常生長培養基中，將經轉染之細胞接種至384孔盤(7500個細胞/25微升/孔)中。在37℃下培育隔夜之後，添加經連續稀釋之抗體與固定濃度之hGDF15之混合物。在37℃下與抗體一起培育6小時之後，添加相等體積之Bright-Glo試劑(Promega)且使用Enspire讀取器(Perkin Elmer)讀取螢光信號。
同時添加抗體，拮抗hGDF15作用，以劑量依賴性方式阻斷hGDF15信號傳導，阻止螢光素酶報導基因之表現。
實例4：其他功能性分析
在其他基於細胞之分析(諸如穩定表現hGFRAL及hRET之U2OS分析)中測試抗hGFRAL抗體之hGDF15拮抗活性。在分析之前一天，細胞在90μl DiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16試劑(DiscoveRx,Cat#93-0563R16B)中以20K塗佈於各96孔盤中。第二天，細胞用經連續稀釋之抗體與固定濃度之hGDF15之混合物在37℃下處理10分鐘。使用Cis-bio Cellul'erk分析套組(目錄號64ERKPEH)根據製造商方案分析ERK磷酸化程度。與Hek293T Elk1報導子分析類似，hGDF15拮抗抗體能夠以劑量依賴性方式阻止hGDF15誘導之磷酸化。
阻止hGDF15誘導之磷酸化之針對GFRAL的抗體之代表性結果展示 於以下表28中。
NP=未進行分析
實例5：配位體競爭、結構域定位及抗原決定基分組
在配位體競爭結合分析、結構域及抗原決定基分組實驗中關於與GFRAL之結合所選擇的抗體。
簡言之，藉由借助於抗人類Fc將GFRAL-Fc蛋白質或RET及GFRALFc-雜二聚體捕獲至ELISA盤上來進行配位體競爭結合分析。培養盤使用PBS/1% BSA阻斷。以10μg/mL起始將15μL抗體之劑量滴定添加至孔中(具有3x稀釋)且在室溫下培育30分鐘。不進行洗滌，將生物素化GDF15(GFRAL配位體)添加至各孔中再保持1小時。在洗滌3次之後，將15μL二 級HRP-抗生蛋白鏈菌素添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在洗滌3次之後，使用15μL TMB培育盤。陽性信號表明生物素化GDF15仍結合於盤上捕獲之GFRAL且抗體不為配位體競爭物。陰性信號表明生物素化GDF15不再結合於盤上捕獲之GFRAL且抗體係配位體競爭物。
簡言之，藉由用編碼GFRAL(SEQ，GFRAL結構域1、GFRAL結構域2、GFRAL結構域1+2、GFRAL結構域1+3、GFRAL結構域2+3或GFRAL結構域3)之核酸序列短暫轉染293EXPI細胞來進行結構域定位分析。
測試七個GFRAL缺失構築體(構築體1至7)，其包括連續自N端至C端之以下特徵：IgK信號序列(以下序列中由小寫字母及帶下劃線的字母描繪)、FLAG標籤序列(以下序列中由小寫字母及斜體字母描繪)及具有多種細胞外域組合之GFRAL蛋白質序列(以粗體大寫字母描繪結構域1；以帶下劃線的大寫字母描繪結構域2；以粗體及帶下劃線的字母描繪結構域3)。構築體1(IgK-2Flag-GFRAL；SEQ ID NO：1817)含有人類GDF15多肽(殘基Q20至L394)，其中存在結構域1、2及3。構築體2(IgK-2Flag-GFRAL結構域1；SEQ ID NO：1818)含有GFRAL-△D2、△D3(殘基Q20至S130及F317至L394)，其中缺失結構域2及3。構築體3(IgK-2Flag-GFRAL結構域2；SEQ ID NO：1819)含有GFRAL-△D1、△D3(殘基S121至C210及F317至L394)，其中缺失結構域1及3。構築體4(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+2；SEQ ID NO：1820)含有GFRAL-△D3(殘基Q20至C210及F317至L394)，其中缺失結構域3。構築體5(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+3；SEQ ID NO：1821)含有GFRAL-△D2(殘基Q20至S130及C220至L394)，其中缺失結構域2。構築體6(IgK-2Flag-GFRAL結構域2+3； SEQ ID NO：1822)含有GFRAL-△D1(殘基S121至L394)，其中缺失結構域1。構築體7(IgK-2Flag-GFRAL結構域3；SEQ ID NO：1823)含有GFRAL-△D1、△D2(殘基A211至L394)，其中缺失結構域2及3。
構築體1(IgK-2Flag-GFRAL；SEQ ID NO：1817)
構築體2(IgK-2Flag-GFRAL結構域1；SEQ ID NO：1818)
構築體3(IgK-2Flag-GFRAL結構域2；SEQ ID NO：1819)
構築體4(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+2；SEQ ID NO：1820)
構築體5(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+3；SEQ ID NO：1821)
構築體6(IgK-2Flag-GFRAL結構域2+3；SEQ ID NO：1822)
構築體7(IgK-2Flag-GFRAL結構域3；SEQ ID NO：1823)
細胞與1μg/mL抗體一起在4℃下培育30分鐘。在洗滌之後，細胞與經螢光染料標記之抗小鼠Fc二級抗體A488或A647一起在4℃下培育30分鐘。在洗滌之後，藉由FAC分析細胞。陽性信號表示抗體結合於由經轉染之293EXPI細胞過表現之結構域。陰性信號表示抗體不結合於由經轉染之293EXPI細胞過表現之結構域。
簡言之，藉由用2μg/mL抗體(mAb1)直接塗佈培養盤來進行抗原決定基分組分析。使用PBS/1% BSA阻斷培養盤。2μg/mL抗體(mAb2)與50ng/mL GFRAL-Fc蛋白質一起預先培育30分鐘，隨後在室溫下經1小時添 加至各孔中。在洗滌3次之後，將15μL HRP-二級抗人類Fc添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在洗滌3次之後，使用15μL TMB培育盤。陽性信號表示GFRAL-Fc蛋白質仍結合於盤上所捕獲之抗體(mAb1)且抗體(mAb2)不與所捕獲之抗體(mAb1)處於相同抗原決定基組中。陰性信號表示GFRAL-Fc蛋白質不再結合於盤上所捕獲之抗體(mAb1)且抗體(mAb2)與所捕獲之抗體(mAb1)處於相同抗原決定基組中。
結合於GFRAL之GDF15之抑制、GFRAL之結構域定位及抗原決定基分組之代表性結果展示於以下表29中。
NA=不適用；ND=未偵測到結合
如以上表29中所示，鑑別至少三種抗GFRAL抗體，包括阻斷GDF15結合之抗體(例如競爭性拮抗劑)、不阻斷GDF15結合之抗體(例如非競爭性拮抗劑)及GDF15結合之部分阻斷劑。抗體亦鑑別為結合於GFRAL之結構域1、結構域2或結構域3。發現結合於結構域2之抗體抑制結合於GFRAL之GDF15或至少部分抑制此結合。結合於結構域1或3之抗體不抑制結合於GFRAL之GDF15。
實例2-4中分析及上文所描述之例示性抗GFRAL抗體之比對展示於圖4A-4B 中。
發現結合結構域1、結構域2或結構域3之抗體之VH及VL域之比對分別展示於圖5A-5F 中。
實例6：人類化
產生人類化抗GFRAL抗體，包括由如實例1-5中所描述選擇之抗體。產生包含一或多個來自表1-24之CDR的例示性人類化抗體，包括例如稱為1C1之抗體(參見例如表1)、稱為25M22之抗體(參見例如表8)、稱為17J16之抗體(參見例如表7)、稱為5F12之抗體(參見例如表4)及稱為3P10之抗體(參見例如表2)之CDR。例示性人類化抗體1C1、25M22、17J16、5F12及3P10之VH及VL區之序列展示於圖6A-6B、7A-7B、8A-8B、9A-9B 及10A-10B 中。
選擇許多抗GFRAL抗體用於測序且接著用於人類化。進行NCBI免疫球蛋白(Ig)序列blastp檢索以鑑別與小鼠VH及VL序列具有顯著類似性之人類生殖系序列。潛在人類構架序列之實例提供於表30中。考慮序列類似性、生理學特性及潛在免疫原性，選擇IGH及IGK之生殖系序列作為人類構架序列。所選擇的生殖系序列在表30中以粗體突出顯示。為了鑑別最 佳匹配構架4序列，使用類似方法選擇JH及JK生殖系序列，且此等所選擇的序列亦在表30以粗體突出顯示。
接著將鼠類抗體之CDR序列轉移(例如移植)至人類IGH及IGK之相應位置且添加對應於構架四之J-區域殘基。將所得蛋白質序列反轉譯至DNA序列中，關於哺乳動物細胞中之表現進行密碼子最佳化且合成(GeneArt/LifeTechnologies)。接著，使用In-Fusion技術(Clontech)將合成之DNA片段選殖至pTT5載體(NRC Biotechnology Research Institute)中以建立準備好表現之構築體，其含有Kozak序列、hIgK信號肽，隨後為所需抗體之人類化可變區加抗體恆定區(hIgG1/hIgK)。同時，選擇構架區中之個別殘基回復突變成小鼠殘基以保留結合親和力。尤其考慮游標區殘基。此類變異體由側面引導突變誘發(QuickChange,Agilent)或去新DNA合成來產生。接著此類表現構築體用於Expi293細胞(Thermo Fischer)中之短暫蛋白質表現，由組織培養上清液純化所分泌之抗體且測試結合親和力。為了最佳化結合親和力及所需回復突變之最低數目，通常進行第二輪構築體設計，接著進行抗體表現、純化及量測結合親和力。
例示性人類化抗GFRAL抗體包括包含以下之抗體：VH，其為SEQ ID NO：1982(HC-344e)，及VL，其為SEQ ID NO：1997(LC-344h)，VH，其為SEQ ID NO：1978(HC-344a)，及VL，其為SEQ ID NO：1992(LC-344c)；VH，其為SEQ ID NO：1978(HC-344a)，及VL，其為SEQ ID NO：1997(LC-344h)；VH，其為SEQ ID NO：1985(HC-344h)，及VL，其為SEQ ID NO：1997(LC-344h)；VH，其為SEQ ID NO：1961(HC-375d)，及VL，其為SEQ ID NO：1976(LC-375j)；VH，其為SEQ ID NO：1962(HC-375e)，及VL，其為SEQ ID NO：1976(LC-375j)； VH，其為SEQ ID NO：1964(HC-375g)，及VL，其為SEQ ID NO：1967(LC-375a)；或VH，其為SEQ ID NO：1964(HC-375g)，及VL，其為SEQ ID NO：1976(LC-375j)。
實例7：選擇人類化抗體
分析實例6中鑑別之例示性人類化抗GFRAL抗體對人類GFRAL之結合親和力。在基於Biacore之分析中進行結合親和力量測。舉例而言，用經純化之抗體進行平衡解離常數(KD )量測以評估其與人類GFRAL之結合。使用實例II中描述之方法，使用胺偶合劑(GE Healthcare LifeSciences,Piscataway,NJ)將抗小鼠Fc抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固定在CM5晶片之所有四個流槽上。使用流動細胞1作為參考，在流槽2、3及4上捕獲經純化之人類化抗GFRAL抗體(約100RU)。接著以70微升/分鐘之流動速率注射含人類GFRAL之PBS-P緩衝液且在25℃下評估結合動力學。
例示性人類化抗GFRAL抗體(例如人類化3P10及人類化5F12)對人類GFRAL之結合親和力(例如KD (nM))之代表性結果展示於以下表31及32中。
實例8：人類化抗體之功能性分析
在與實例3中所描述類似之基於細胞之報導子分析中測試實例6及7中描述之例示性人類化抗GFRAL抗體之功能活性。
舉例而言，使用經轉染之U20S及HEK293T進行ELK1-螢光素酶報導子分析，其量測人類GDF15(hGDF15)誘導之人類GFRAL/RET信號傳導。轉染質體由兩個報導子質體Gal4-Elk1及5×UAS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1反報導系統目錄號219005)以及編碼人類GFRAL(hGFRAL)及人類RET(hRET)之質體組成。在此等分析中，細胞中以重組方式表現GFRAL/RET受體複合物之hGDF15誘導之活化觸發細胞內信號傳導，其引起ERK且接著引起Elk1磷酸化。一旦Gal4-Elk1磷酸化，Gal4-Elk1結合於5×UAS啟動子區域且引起螢光素酶報導基因轉錄。接著在螢光素酶酶促分析中量測螢光素酶之活性。
抑制人類GFRAL/RET信號傳導之針對GFRAL之例示性人類化抗體(例如3P10及5F12)之代表性結果展示於以下表33及34以及圖11 中。
對於一些實驗，使用FuGene6轉染劑(Promega)將上述四個質體(例如2個報導子質體GFRAL、RET)轉染至含新近收集之細胞之懸浮液中。最佳化來自所指示物種之各對受體在轉染中之GFRAL及RET DNA且在12：1至60：1之間變化。將經轉染之細胞在正常生長培養基中接種至384孔盤(7500個細胞/25微升/孔)中。在37℃下培育隔夜之後，添加經連續稀釋之抗體與固定濃度之hGDF15的混合物。在37℃下與抗體一起培育6小時之後，添加相等體積之Bright-Glo試劑(Promega)且使用Enspire讀取器(Perkin Elmer)讀取螢光信號。
同時添加人類化抗GFRAL抗體，拮抗hGDF15作用，以劑量依賴性方式阻斷hGDF15信號傳導，阻止螢光素酶報導基因之表現。
實例9：人類化抗體之其他功能性分析
如實例4中所描述，在其他基於細胞之分析(諸如穩定表現hGFRAL及hRET之U2OS分析)中測試例示性人類化抗hGFRAL抗體之hGDF15拮抗活性。在分析之前一天，細胞在90μl DiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16試劑(DiscoveRx，目錄號93-0563R16B)中以20K塗佈於各96孔 盤中。第二天，細胞用經連續稀釋之抗體與固定濃度之hGDF15之混合物在37℃下處理10分鐘。使用Cis-bio Cellul'erk分析套組(目錄號64ERKPEH)根據製造商方案分析ERK磷酸化程度。
與實例4中描述之Hek293T Elk1報導子分析類似，人類化抗hGFRAL抗體(例如人類化3P10)能夠以劑量依賴性方式阻止hGDF15誘導之磷酸化。
阻止hGDF15誘導之磷酸化之人類化抗GFRAL抗體之代表性結果展示於以下表35及圖12 中。
在對照實驗中，證實GFRα1(在晶片表面上結合)結合於其天然配位體GDNF(溶液中，50nM)(參見圖13C )。
例示性人類化抗GFRAL抗體(例如HC-344e+LC-344h)不結合於受體GFRα1，但展示與hGFRAL之高親和力結合(圖13A及13B )，表明對GFRAL之特異性。
實例10：動物研究
在多種動物研究中評估抗GFRAL抗體之作用。
A：抗GFRAL抗體抑制DIO小鼠中GDF15誘導之體重減輕(急性)
為了測定抗GFRAL抗體是否能夠中和飲食誘導之肥胖症(DIO)小鼠中GDF15誘導之體重減輕作用，使用17週齡雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。隨機指定小鼠(41.3g±0.4g)接收 例示性抗GFRAL抗體(例如1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8及12A3)或抗GDF15抗體(例如1MO3)。每組具有6隻小鼠/組。各處理組具有其自身PBS對照組。抗體劑量為20mg/kg。在注射PBS或抗體後第一天，小鼠接著接收3次以0.5mg/kg進行之GDF15蛋白質(例如具有SEQ ID NO：1811之胺基酸序列)之連續每天注射。記錄每天體重及食物攝入(第1-3天及第7天)。使用Sartorius天平LE5201進行稱重。使用自動稱重記錄程式(Sartorius YSW05 Software Wedge,Sartorius Mechatronics Corporation,5 Orville Drive,Suite 200 Bohemia,NY 11716)將體重資料自動傳輸至Microsoft Excel試算表。
藉由平均值±sem(關於原始體重)、δ體重變化及體重變化百分比(亦即與基線體重相比之δ體重%)呈現資料。使用史都登氏t測試(Student's t-test)(兩個尾部，兩個末端)。在此等實驗中，P<0.05視為統計顯著。
例示性抗GFRAL抗體1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8及12A3能夠逆轉GDF15誘導之體重減輕及食物攝入減少(圖14A及14B )。在此模型中，抗GDF15抗體亦逆轉GDF15誘導之體重減輕及食物攝入減少。
為了測定非競爭性抗GFRAL抗體或競爭性抗GFRAL抗體是否以劑量依賴性方式阻斷外源性GDF15誘導之重量減輕作用，使用19週齡雄性C57BL/6J DIO小鼠。最初將小鼠(43.1g±0.3g)隨機分配至PBS(8隻小鼠/組)或GDF15蛋白質(例如具有SEQ ID NO：1811之胺基酸序列)組(0.1mg/kg、1.0mg/kg或10mg/kg，24隻小鼠/組)。在第二天確認GDF15蛋白質以劑量依賴性方式降低體重及食物攝入。此外，隨機指定GDF15處理組(0.1mg/kg、1.0mg/kg或10mg/kg)接收PBS，或例示性抗GFRAL抗體 (例如1C1或3P10)(8隻小鼠/組)。記錄每天體重及食物攝入(第1-3天及第7天)。
例示性抗GFRAL抗體逆轉由GDF15誘導之體重減輕及食物攝入減少(圖15及16 )。
B：抗GFRAL抗體促進DIO小鼠中之體重增加(慢性)
為了測定在DIO模型中例示性抗GFRAL抗體是否能夠與外源性GDF15蛋白質無關地增加體重，使用14週齡雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。隨機指定小鼠(34.5g±0.8g)以每週10mg/kg接收PBS或例示性抗GFRAL抗體(例如1C1或3P10)。各組具有10隻小鼠/組。記錄每天體重及食物攝入持續28天。使用Sartorius天平LE5201進行稱重。使用自動稱重記錄程式(Sartorius YSW05 Software Wedge,Sartorius Mechatronics Corporation,5 Orville Drive,Suite 200 Bohemia,NY 11716)將體重資料自動傳輸至Microsoft Excel試算表。亦藉由EchoMRI評估身體組成。
例示性抗GFRAL抗體增加DIO小鼠之體重(分別達6%及)及食物攝入(分別達3.4%及3.7%)(圖17及18 )。由例示性抗GFRAL抗體引起之體重增加主要歸因於脂肪量增加(圖19 )。
C：抗GFRAL抗體逆轉DIO小鼠中之GDF-15誘導之體質減輕
為了測定例示性抗GFRAL抗體是否能夠中和DIO小鼠中GDF15誘導之體重減輕作用，使用17週齡雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)且構築表現GDF15之重組型腺相關病毒(rAAV)。
如下進行rAAV之構築：自New England BioLabs(F-530L,Ipswich,MA)購得具有Phusion®高保真性DNA聚合酶之聚合酶鏈反應(PCR)試劑 套組。根據製造商指令設置PCR反應。經擴增之含有Igk信號肽及隨後的GDF15編碼序列之DNA片段用限制酶Spe I及Not I消化(限制位點分別包括於5'或3' PCR引子中)，且接著與用相同限制酶消化之AAV轉基因載體接合。用於表現之載體含有可選標記及表現卡匣，該表現卡匣由用於插入經選殖之編碼序列之位點之強真核啟動子5'際隨後的3'非轉譯區及牛生長激素聚腺苷酸化尾區組成。
DIO小鼠經歷高脂肪飲食(Research Diets，目錄號D12492NI)。高脂肪飲食含有60kcal%脂肪、20kcal%蛋白質及20kcal%碳水化合物。向小鼠投與上述rAAV或對照性表現綠色螢光蛋白(GFP)之AAV載體之單次尾部靜脈注射。用表現GDF15之rAAV以1×1010 注射之後第42天，向小鼠以3mg/kg之劑量投與例示性抗GFRAL抗體(3P10)或對照抗體(抗KLH抗體)。每組具有20隻小鼠。監測小鼠體重、肌肉量及脂肪量、能量消耗及食物攝入持續12週。
如圖20 中所示，例示性抗GFRAL抗體(3P10)逆轉DIO小鼠中GDF15誘導之體重減輕以及脂肪量及肌肉量減少。此外，如圖21 中所示，例示性抗GFRAL抗體逆轉GDF15誘導之能量消耗增加及GDF15誘導之食物攝入減少。
D：抗GFRAL抗體逆轉偏瘦小鼠中GDF-15誘導之體質減輕(慢性)
為了測定例示性抗GFRAL抗體是否能夠中和偏瘦小鼠中GDF15誘導之體重減輕，使用15週齡雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。將小鼠置放於飼料上。如實例11部分c中所描述，向小鼠以1×1010 投與表現GDF15之rAAV之單次尾部靜脈注射或表現綠色螢光蛋白(GFP)之對照性AAV載體。在注射表現GDF15之rAAV之後第28天， 以3mg/kg之劑量向小鼠投與例示性抗GFRAL抗體(3P10)或對照抗體(抗KLH抗體)。每組具有20隻小鼠。監測小鼠體重、肌肉量及脂肪量、能量消耗及食物攝入持續12週。
如圖22 中所示，例示性抗GFRAL抗體逆轉偏瘦小鼠中GDF15誘導之體重減輕，其包括逆轉脂肪量減少及肌肉量減少。此外，如圖23 中所示，例示性抗GFRAL抗體逆轉偏瘦小鼠中GDF15誘導之呼吸交換率變化(RER)及GDF15誘導之食物攝入減少。
E：抗GFRAL抗體不與GDF15誘導之體重減輕無關地增加偏瘦小鼠之體重
為了測定例示性抗GFRAL抗體是否能夠與外源性GDF15蛋白質無關地增加偏瘦小鼠之體重，使用15週齡雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。隨機指定小鼠(26.1g±0.3g)以每週10mg/kg接收PBS或例示性抗GFRAL抗體(例如1C1或3P10)。每組具有10隻小鼠/組。在第一週記錄每天食物攝入及體重，且接著每週記錄一次再持續3週。使用Sartorius天平LE5201進行稱重。
重複劑量之例示性抗GFRAL抗體1C1及3P10不顯著改變偏瘦小鼠中之體重及食物攝入，但抗體3P10展示較弱的增加體重之趨勢(圖24及25 )。
F：抗GFRAL抗體在患有慢性腎臟損害之小鼠中逆轉體重減輕及增加之能量消耗
為了測定例示性抗GFRAL抗體是否能夠逆轉患有慢性腎臟損害之DIO小鼠中之體重減輕及增加之能量消耗，使用15週齡雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。在HFD+腺嘌呤飲食(在誘導階段下0.3%持續10天，接著在保持階段下降低至0.1%再持續3週)持續5週之 後，隨機指定DIO小鼠(26.1g±0.3g)以每週1mg/kg接收對照抗體(抗KLH)或例示性抗GFRAL抗體(例如3P10)。每組具有12隻小鼠/組。在第一週記錄每天體重，且接著每週記錄一次在持續8週。使用Sartorius天平LE5201進行稱重。
如圖26A 中所示，為了驗證腺嘌呤對腎功能之作用，證實在小鼠中用膳食腺嘌呤(含0.25%腺嘌呤之HFD)進行之10天處理誘導腎臟損害。膳食腺嘌呤亦增加血清GDF15含量(參見圖26B )及促進體重減輕(參見圖26C )。此外，膳食腺嘌呤增加小鼠中之能量消耗(參見圖27A )。
如圖27B 中所示，例示性抗GFRAL抗體逆轉患有慢性腎臟損害之小鼠中增加之能量消耗。此外，如圖28 中所示，例示性抗GFRAL抗體逆轉患有慢性腎臟損害之小鼠中之體重減輕以及脂肪量及肌肉量減少。
G：人類化抗GFRAL抗體以劑量依賴性方式抑制GDF15誘導之體重減輕
為了測定人類化抗GFRAL抗體是否能夠中和飲食誘導之肥胖症(DIO)小鼠中之GDF15誘導之體重減輕作用，使用17週齡雄性C57BL/6J DIO小鼠(Jackson Labs West,Sacramento,CA)。開始將小鼠(42g±0.4g)隨機分配至PBS(8隻小鼠/組)或GDF15蛋白質(56隻小鼠/組)。在第二天確認GDF15蛋白質以劑量依賴性方式降低體重及食物攝入。此外，隨機指定8隻小鼠/組以1.0mg/kg之劑量接收媒劑(抗KLH)或例示性小鼠抗GFRAL抗體(例如m3P10)，或以0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3mg/kg或10mg/kg之劑量接收例示性人類化抗GFRAL抗體(例如h3P10=HC-344e+LC-344h)。記錄每天體重(第1-7天)。使用Sartorius天平LE5201進行稱重。使用自動稱重記錄程式(Sartorius YSW05 Software Wedge,Sartorius Mechatronics Corporation,5 Orville Drive,Suite 200 Bohemia,NY 11716)將體重資料自動傳輸至Microsoft Excel試算表。
在δ體重變化變面，藉由平均值±sem呈現資料。使用史都登氏t測試(兩個尾部，兩個末端)。
例示性人類化抗GFRAL抗體HC-344e+LC-344h能夠以劑量依賴性方式抑制GDF15誘導之體重減輕(圖29 )。
實例11：GFRAL/GDF15複合物之晶體結構 A：複合物形成及結晶
藉由混合1.2莫耳過量之GFRAL(W115-E351)蛋白質與1莫耳GDF15蛋白質子單元(0.5莫耳GDF15，其係由一對二硫鍵連接之兩個GDF15子單元之均二聚體)來製備GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之複合物。藉由尺寸排阻層析純化複合物以移除過量GFRAL。藉由在一滴結晶液滴中混合1μL蛋白質(5mg/ml)與0.5μL儲備溶液及0.5μL種子來使GFRAL/GDF15複合物結晶，其中儲備溶液含有1.0mL 0.1M Bis-Tris(pH 6.0)、1.5M(NH4 )2 SO4 及10%乙二醇。自包括0.1M Bis-Tris(pH 6.0)及1.5M(NH4 )2 SO4 之儲備溶液之結晶條件獲得晶種。結晶設置保持在室溫下在Rigaku 24孔三葉盤中。在培育三天之後，結晶液滴展示小針型晶體。
GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之複合物之例示性小針型晶體展示於圖30 中。
分子模型不可用於GFRAL，因此使用NaBr浸泡測定晶體相。用含有0.5M NaBr及0.75M NaBr之儲備溶液浸沒如上文所描述獲得之GFRAL/GDF15晶體。在30分鐘後，經0.5M NaBr浸沒之晶體處於良好狀態，而0.75M NaBr浸泡產生碎裂晶體。安裝來自浸沒及未浸沒晶體之晶體，使用30% EG作為低溫保護。
本文中所描述之模型提供GFRAL蛋白質之第一結構資訊及GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
B：資料收集及結構測定
自0.1M Bis-Tris(pH 6.0)、1.5M(NH4 )2 SO4 及10%乙二醇儲備條件以浸沒及未浸沒晶體(0.5M及0.7M NaBr浸沒)形式獲得及收集GFRAL/GDF15複合物晶體。晶體用補充有20%乙二醇作為低溫保護劑之母液處理且在液氮中急驟冷凍。接著在同步加速器光束線IMCA-CAT，高級光子來源(Advanced Photon Source)，Argonne National Lab(ALS)在X射線繞射下檢驗此等晶體。晶體繞射至多2.28-2.20Å解析度。
例示性GFRAL/GDF15複合物晶體之X射線繞射統計展示於表36中。
† 括弧用於最高解析殼(Å)。
藉由使用按比例縮放資料集(其中預先溶解之GFRAL/GDF15複合物在3.2Å解析度下作為起始模型)及剛性主體改進來進行GFRAL/GDF15之分子置換(參見Vagin,A.A.等人，(2004)“REFMAC5 dictionary： Organization of prior chemical knowledge and guidelines for its use.”Acta Crystallogr.D 60：2284-2295)且如在CCP4中實施在REFMAC5中完成初始位置改進。若干輪模型重建產生GFRAL/GDF15複合物之結構。
GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之複合物之例示性結構展示於例如圖31-39B 中。
初始電子密度圖之測試展示GFRAL及GDF15之明確密度。在剛性主體改進之後，使用COOT進行若干輪模型建造及限制改進(參見Emsley,P.及Cowtan,K.(2004)“COOT：model-building tools for molecular graphics.”Acta Crystallogr.D 60：2126-2132)。在放置溶劑分子之後，完成最終改進。
GFRAL/GDF15複合物之來自x射線繞射圖案之原子座標見於表49中。
例示性晶體之改進統計展示於表37中。
例示性GFRAL/GDF15複合物晶體中GFRAL之透明電子密度說明於圖31 中。圖31 展示用2.20Å解析資料計算且在1σ含量下成形之GFRAL分子之電子密度圖(2fo-fc)。GFRAL殘基清晰可見。
C：GFRAL/GDF15複合物之晶體結構
測定GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之複合物之晶體結構。
測定核心相互作用界面胺基酸為具有至少一個距GFRAL相互作用蛋白質(諸如GDF15)小於或等於4.5Å之原子的胺基酸殘基(在蛋白質(諸如GFRAL)上)。選擇4.5Å作為允許原子在凡得瓦爾半徑(van der Waals radius)加上可能存在之水介導氫鍵之內的核心區域截止距離。
測定邊界相互作用界面胺基酸為具有至少一個距與GFRAL相互作用蛋白質(諸如GDF15)相互作用之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸小於或等於5Å之原子的胺基酸殘基(在蛋白質(諸如GFRAL)上)。選擇小於或等於5Å作為邊界區域截止距離，因為結合於距GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸小於5Å之殘基的蛋白質將屬於GFRAL相互作用蛋白質之凡得瓦爾半徑內。
用來自CCG(Chemical Computing Group)之Molecular Operating Environment(MOE)程式計算滿足此等距離準則之胺基酸。
圖32 展示如見於GFRAL/GDF15蛋白質晶體之不對稱單元中之雜二聚GFRAL/GDF15複合物之例示性說明。二聚分子GDF15具有分子間二硫鍵，認為其由於輻射損害而較弱。GDF15分子之一側可形成不對稱單元中之二聚體。圖33 展示GFRAL/GDF15晶體中GFRAL/GDF15雜二聚體之例示性二聚配置。
圖34A-34B 說明GFRAL-GDF15界面上蛋白質-蛋白質接觸程度。GFRAL上之接觸區域由淺灰色箭頭指示；GDF15上之接觸區域由黑色箭 頭指示。
圖35 展示GFRAL之三個α-螺旋涉及GFRAL/GDF15界面。多個二硫橋鍵似乎使三個GFRAL α-螺旋之結構配置穩定。
圖36A-36D 說明GFRAL/GDF15界面之不同態樣以及涉及形成GFRAL/GDF15界面之GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質之核心及邊界胺基酸殘基。GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質描繪為帶狀圖，其中GFRAL/GDF15界面中之殘基以空間填充表面表示法展示。圖36A-36C 展示GFRAL蛋白質及GDF15蛋白質之核心相互作用界面胺基酸。圖36D 展示邊界相互作用界面胺基酸。
全長前驅體人類GFRAL蛋白質之胺基酸序列展示如下：GFRAL序列 SEQ ID NO：1797
GFRAL/GDF15複合物之界面處的GFRAL胺基酸展示於表38中。
*根據SEQ ID NO：1797編號之GFRAL胺基酸
成熟人類GDF15之胺基酸序列展示如下： (SEQ ID NO：1811)
GFRAL/GDF15複合物之界面處的GDF15殘基展示於表39中。
*根據SEQ ID NO：1811編號之GDF15胺基酸
D：GFRAL/RET/GDF15複合物之模型
使用由Goodman等人(2014)CELL REPORTS 8,1894-1904(PDB 4UX8)描述之RET/GFRα1/GDNF三元複合物作為模板建造GFRAL/GDF15/RET(來自GFRAL/GDF15結構，參見例如實例11-13)之複合物之模型。RET/GFRα1/GDNF模板來自復原哺乳動物RET(ECD)-GDNF-GFRα1複合物之電子顯微重構(Goodman等人，見上文)。
為了比較來自實例12之GFRAL/GDF15晶體結構及RET/GFRα1/GDNF模板中GFRα1/GDNF之結構的結構類似性，使用來自CCG之MOE使GFRAL/GDF15晶體中之GFRAL結構與GFRα1/GDNF/RET模型(PDB 4UX8)中之GFRα1重疊。藉由GFRAL/GFRα1主鏈殘基之RMSD為2.21Å來表明高品質重疊，且因此GFRAL/GFRα1與GFRAL/GDF15複合物之結構類似性。使用此三元複合物模型(包括GFRAL/GDF15結構及RET結構)映射GFRAL與RET之間的相互作用。
圖37A-37B 說明4XU8中GFRAL及GFRα1之重疊之例示性態樣。主鏈殘基之RMSD為2.21Å。
圖38A-38D 說明RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白質與RET蛋白質之相互作用的例示性態樣。在圖38A 中，模型化GFRAL/GDF15界面處GFRAL及GDF15殘基相互作用由柱狀模型表示。在圖38B 中，在空間 填充表面模型中描繪GFRAL上之RET相互作用殘基。在圖38C 中，在GFRAL及RET上突出顯示核心相互作用殘基之空間填充表面模型。在圖38D 中，在GFRAL及RET上突出顯示邊界相互作用殘基之空間填充表面模型。
圖39A-39B 說明在模型化RET界面處，在空間填充表面模型中鑑別之GFRAL蛋白質上之核心及邊界胺基酸殘基。在圖39A 中，模型化GFRAL上之核心殘基在空間填充表面模型中以較深的灰色展示。在圖39B 中，模型化GFRAL上之邊界殘基在空間填充表面模型中以較淺的灰色展示。
基於此模型化，針對與RET殘基之相互作用鑑別許多GFRAL殘基，如表40A中所示。此外，針對與GFRAL殘基之相互作用鑑別許多RET殘基，如表40B中所示。
實例12：GFRAL/抗體複合物之晶體結構 A1：GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之複合物形成及結晶
藉由以GFRAL：3P10 Fab：25M22 Fab之1：1.2：1.2莫耳比混合GFRAL(W115-E351)與3P10及25M22之Fab來形成GFRAL蛋白質、3P10 Fab及25M22 Fab之複合物(GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物)。在尺寸排阻層析管柱上自過量的Fab分子純化複合物。如下濃縮及結晶 GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物。
使用10,000MWCO Centricon®濃縮器藉由離心至約6.6mg/mL來濃縮1.5mL體積3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物樣品。經濃縮之樣品立即經歷每次實驗使用1μL蛋白質加1μL儲集器進行之結晶篩選。設置第一組96種條件，其覆蓋關於儲集器內含物之基於分數之調配物取樣。在室溫下培育結晶設置。在初始結晶輪中使用Hampton指數及PegRx結晶篩選。Hampton指數篩選不產生任何潛在成功結果，而PegRx篩選在以下三種結晶條件B11、D11及H8下產生晶體：
˙B11 ：0.1M MES pH 6.0、20% PEGMME 2000
˙D11 ：0.1M咪唑(pH 7.0)、12% PEG 20,000
˙H8 ：0.1M TRIS pH 8.0、16%PEG 10,000、0.2M乙酸銨
在結晶條件B11、D11及H8下獲得之GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之例示性晶體展示於圖40 中。
為了進一步最佳化晶體以用於X射線繞射，GFRAL/3P10/25M22複合物濃縮至5.0mg/mL且針對結晶及其他最佳化(其產生改良之晶體)進行設置。一些改良之晶體具有梯形形式。收集一些改良之晶體，用相容的低溫保護劑處理且在液氮中急驟冷凍。鑑別及使用相容的低溫保護劑對維持樣品結晶度及收集高品質X射線繞射資料集而言係重要的。自包括0.1M咪唑pH 7.0、12% PEG 20,000(D11)之結晶條件獲得之經改良之晶體用35%乙二醇處理。多個晶體在液氮中急驟冷凍且用同步加速器(ALS)收集X射線繞射資料。一個晶體繞射至約2.9Å解析度。用此晶體收集完全X射線繞射資料集。
測定GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物晶體結構。基於與3P10及 25M22 Fab相比GRAL中之較高α-螺旋含量，藉由分子置換明確鑑別GFRAL組分之位置。在本文所描述之例示性晶體中，一個GFRAL及兩個Fab組分(一個3P10 Fab及一個25M22 Fab)形成不對稱晶體單元中之三元複合物。
使用分子置換鑑別GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物中之Fab。PDB 1F8T為可用於分子置換分析之最緊密GFRAL同系物(與GFRAL具有約54%一致性及約79%類似性)。結構解析明確展示所有Fab及GFRAL胺基酸位置。使用1F8T GFRAL同系物結構作為步進核以解析GFRAL/3P10/25M22三元複合物晶體結構之Fab及GFRAL組分。在此結構中，測定化學計量為1：1：1 3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab。
A2：GFRAL/8D8/5f12 Fab複合物之複合物形成及結晶
藉由以GFRAL：8D8 Fab：5F12 Fab之1：1.2：1.2莫耳比混合GFRAL(W115-E351)與8D8及5F12之Fab來形成GFRAL蛋白質、8D8 Fab及5F12 Fab之複合物(GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物)。在尺寸排阻層析管柱上自過量Fab分子純化複合物。如下濃縮及結晶GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物。
使用10,000MWCO Centricon®濃縮器藉由離心來濃縮GFRAL/5F12/8D8 Fab複合物。經濃縮之樣品立即經歷每次實驗使用1μL蛋白質加1μL儲集器進行之結晶篩選。初始設置一組96種條件，其涵蓋關於儲集器內含物之基於分數之調配物取樣。在室溫下培育結晶設置。進一步最佳化來自初始篩選之陽性引導物以得到能夠進行繞射分析之高品質晶體。使用10000MWCO Centricon濃縮器藉由離心至約7.8mg/mL來濃縮1.5mL體積5F12 Fab：：GFRAL：：8D8 Fab複合物樣品。在完成後，此樣 品立即經歷每次實驗使用1μL蛋白質加1μL儲集器進行之結晶篩選。初始設置一組96種條件，其涵蓋關於儲集器內含物之基於分數之調配物取樣。在室溫下培育此等設置。初始，使用Hampton指數及PegRx結晶篩選進行結晶，指數及PegRx在以下三種結晶條件C6、E11及C2下產生晶體：
˙C6 ：0.1M Bis-Tris pH 6.5、14% PEG 3350
˙E11 ：1.7M AmSO4、 0.1M Bis-Tris pH 6.5、3% PEG MME 550
˙C2 ：0.1M咪唑pH 7.0、20% Jeffamine 2001。
如圖41 中所示獲得初始晶體。
藉由微接種技術進行PegRx C6及C2結晶條件之最佳化，其產生適合的繞射單晶體。此等適合的繞射單晶體具有在具有0.1M咪唑pH 7.0、20% Jeffamine 2001 pH 7.0之10%乙二醇中獲得之六方雙錐形式。收集一些此等晶體；用相容的低溫保護劑處理；且在液氮中急驟冷凍。使用相容的低溫保護劑對保持樣品結晶度而言係重要的，其產生可操作資料集。晶體用自0.1M咪唑pH 7.0、20% Jeffamine 2001 pH 7.0獲得之20% MPD處理。
B1：GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之資料收集及結構測定
用同步加速器(ALS)收集GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之二十個晶體之X射線繞射資料。第一組十個晶體產生一種完全資料集，其中解析度為3.17Å。十個其他晶體進一步最佳化繞射至2.9Å，且此資料集為結構測定及改進用。使用DENZO將X射線繞射資料編索引且接著用來自程式套件HKL2000之SCALEPACK整合及按比例縮放。參見Otwinowski Z.及Minor W.“Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode”,METHODS IN ENZYMOLOGY，第276卷： Macromolecular Crystallography，部分A，第307-326頁，1997,C.W.Carter,Jr.及R.M.Sweet編，Academic Press(New York)。鑑別所選擇之晶體之X射線繞射具有斜方晶布拉韋(Bravais)晶格對稱性。沿(h，0，0 )、(0，k，0 )及(0，0，l )軸基於系統消光測定空間群為P 21 21 21 。對馬修係數(Matthew's coefficient)之分析表明晶體之不對稱單元可容納一個具有約124.4kDa且相應溶劑含量為56%之組件。
例示性GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物晶體之X射線繞射統計展示於表41中。
† 括弧用於最高解析殼(Å)。
用預先溶解之GFRAL(參見實例12，部分C)及1F8T之79%同源GFRAL結構作為程式PHASER內之起始模型，藉由使用按比例縮放資料集進行GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之分子置換。資料自40-3.5Å解析度擴展可產生一個GFRAL及一個Fab。Molrep在結構溶液中產生多一個Fab。溶液具有不對稱單元中一個GFRAL及兩個Fab之複合物。使用 REFMAC改進溶液。使用COOT進行模型建造。改進密度明確指示Fab及GFRAL中遺失環。在放置少數溶劑分子之後，最終改進完成。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之來自x射線繞射圖案之原子座標見於表50中。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物晶體結構之例示性改進統計展示於表42中。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物中3P10及25M22 Fab片段之各鏈中CDR區域之透明電子密度說明於圖42 中(電子密度2mFo-DFc稱重，1.0σ等高水準)。除3P10重鏈(鏈-H)中之區域131-137(其中電子密度中未鑑別少數末端殘基)以外，電子密度中明確鑑別3P10及25M22鏈。
B2：GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物之資料收集及結構測定
在APS下用同步加速器檢驗晶體。檢驗二十五個此類晶體之x射線繞 射。第一次傳送十六個晶體至同步加速器，其產生>5Å之繞射，且第二輪最佳化晶體繞射至3.5Å，其用於結構測定及改進。使用DENZO將X射線繞射資料編索引且用來自程式套件HKL2000(Otwinowski及Minor,1997)之SCALEPACK整合及按比例縮放。鑑別所選擇之晶體之X射線繞射具有斜方晶布拉韋晶格對稱性。沿(h，0，0 )軸基於系統消光測定空間群為P 65 22。對馬修係數之分析表明晶體之不對稱單元可容納一個具有約246.6kDa且相應溶劑含量為61%之組件。用對映異構空間群P61 22檢驗結構解析，其在剛性主體及限制改進期間產生極不良Rfactor及Rfree。
GFRAL/8D8/5F12複合物晶體之X射線繞射統計展示於表43中。
† 括弧用於最高解析殼(Å)。
藉由使用按比例縮放資料集進行Fab/受體之分子置換，其中使用預先溶解之fab pdb：3IU4用於8D8(89%同源)且pdb：4M7K用於5F12(84%同源)作為程式PHASER內之起始模型，使用自40-5.0Å解析度擴展之資料，產生一個受體及兩個Fab之兩個組件。溶液具有不對稱單元中之兩個 受體及四個Fab複合物。使用REFMAC改進溶液且使用Coot進行模型建造。
用對映異構空間群P61 22檢驗結構解析。Molrep產生兩個受體及四個Fab複合物。將Molrep模型進一步提供至Refmac以用於改進，消除在剛性主體及限制改進期間的極不良R factor 及R free ，其確認當前空間群為P 65 22。
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物之x射線繞射圖案之原子座標見於表51中。
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物晶體結構之例示性改進統計展示於表44中。
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物中一個具有8D8及5F12 Fab片段(兩個Fab鏈)之GFRAL蛋白質的透明電子密度說明於圖43 中(電子密度2mFo-DFc稱重，1.0σ等高水準)。改進密度明確指示Fab及受體分子中之大部分環。除鏈-I(5F12 vH)中之胺基酸139-142之間、鏈-R(8D8 vH)中之胺基酸132-136之間及鏈-U(8D8 vL)中之胺基酸131-136之間的區域以及密度中未鑑別少數末端殘基以外，在電子密度中明確鑑別5F12及8D8鏈。
C1：GFRAL/3P10/25M22 Fab複合物之晶體結構
測定3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物之晶體結構。
3P10 Fab及25M22 Fab胺基酸序列展示如下，其中VH及VL序列加 粗且CDR區域加粗且帶下劃線。
3P10 Fab Hc： (SEQ ID NO：1824)
3P10 Fab Lc： (SEQ ID NO：1825)
25M22 Fab Hc： (SEQ ID NO：1826)
25M22 Fab Lc： (SEQ ID NO：1827)
圖44 藉由帶狀圖說明3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物之一個態樣。Fab片段與3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物晶體中之GFRAL之不對稱單元相互作用。晶體結構亦展示GFRAL抗原決定基殘基290-312呈現至3P10抗體且GFRAL N端抗原決定基殘基130-157呈現至25M22抗體重鏈CDR區。
圖45 說明3P10及25M22 Fab之CDR區，其中相互作用GFRAL及Fab殘基以方框突出顯示。
圖46-48 以帶狀圖說明與3P10及25M22L Fab之GFRAL相互作用之態樣，其中選擇胺基酸殘基展示為柱狀模型。舉例而言，圖46 說明3P10重 鏈CDR區附近的GFRAL抗原決定基之態樣。3P10 Hc之CDR序列展示於圖45 中。作為另一實例，圖47 說明3P10輕鏈CDR區附近的GFRAL抗原決定基之態樣。3P10 Lc之CDR序列展示於圖45 中。作為另一實例，圖48 說明25M22重鏈CDR區附近的GFRAL抗原決定基之態樣。25M22 Lc之CDR序列展示於圖45 中。
對呈現至3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物晶體結構中之25M22 Fab之GFRAL抗原決定基之分析證實25M22之作用機制為競爭性GDF15抑制劑之作用機制且涉及阻斷GDF15與GFRAL之結合。關於重鏈及輕鏈之GFRAL蛋白質及25M22 Fab CDR上之例示性核心相互作用界面胺基酸展示於圖49 中。
圖50A 及50B 說明GFRAL/25M22 Fab相互作用界面中之核心胺基酸殘基。圖50A 說明GFRAL之結構，其中GFRAL上之核心25M22相互作用界面胺基酸(結合抗原決定基)在空間填充表面模型中突出顯示。關於GFRAL之25M22 CDR上之核心界面胺基酸亦在空間填充表面模型中突出顯示。圖50B 以帶狀圖說明GFRAL之結構，其中GFRAL(GFRAL抗原決定基殘基)上之核心25M22 Fab相互作用界面胺基酸在空間填充表面模型中突出顯示。
圖51 說明關於GFRAL/25M22 Fab結合之GFRAL上之邊界相互作用界面胺基酸。GFRAL上之相互作用界面胺基酸(關於25M22 Fab結合)之邊界以空間填充表面模型形式突出顯示。
圖52-53 說明關於GFRAL上25M22 Fab及GDF15結合之GFRAL抗原決定基之重疊。圖52 之左側圖及右側圖中展示GFRAL帶狀圖之兩個側視圖。圖53 展示關於25M22 Fab及GDF15結合之重疊GFRAL抗原決定基之 俯視圖。關於25M22 Fab及GDF15結合之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基在空間填充表面模型中突出顯示。淺灰色表面陰影表示由25M22 Fab覆蓋之GFRAL表面，而深灰色表面陰影(由黑色箭頭突出顯示)展示由GDF15覆蓋之GFRAL表面。
GFRAL/25M22 Fab複合物之界面處的GFRAL胺基酸展示於表45中。為了比較GFRAL/25M22 Fab及GFRAL/GDF15複合物中之相互作用界面胺基酸，表45進一步列舉GFRAL/GDF15複合物之界面處的GFRAL胺基酸，其亦展示於表38中。表45說明結合於GDF15之GFRAL上之所有核心相互作用界面胺基酸殘基亦為GFRAL/25M22 Fab相互作用中之相互作用界面胺基酸。
全長前驅體人類GFRAL蛋白質之胺基酸序列展示於下文中(亦參見實例12，部分C )：GFRAL序列 SEQ ID NO：1797
表45
*根據SEQ ID NO：1797編號之GFRAL胺基酸
對呈現至3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物晶體結構中之3P10 Fab之GFRAL抗原決定基之分析證實3P10之作用機制為非競爭性GDF15抑制劑之作用機制且不涉及阻斷GDF15與GFRAL之結合。關於重鏈及輕鏈之GFRAL蛋白質及3P10 Fab CDR上之例示性核心相互作用界面胺基酸展示於圖54 中。
圖55A-55B 以柱狀模型(圖55A )或空間填充表面模型(圖55B )說明GFRAL及3P10 Fab上之相互作用界面殘基。
圖56A-56B 說明空間填充表面模型中關於3P10 Fab結合(結合抗原決定基之GFRAL結構3P10)之GFRAL上的核心(圖56A )及邊界(圖56B )相互作用界面胺基酸。
圖57 說明關於GFRAL上之3P10 Fab及RET之GFRAL抗原決定基之部分重疊。圖57 之左側圖及右側圖中展示GFRAL帶狀圖之兩個側視圖。關於3P10 Fab及RET結合之GFRAL上之相互作用界面胺基酸殘基在空間填充表面模型中突出顯示。
圖58 說明關於GFRAL上之25M22 Fab及25M22 Fab結合之GFRAL抗原決定基之重疊。圖58 之左側圖(俯視圖)及右側圖(底視圖)上展示GFRAL帶狀圖之頂部圖及底部圖。涉及25M22 Fab及25M22 Fab結合之GFRAL上之邊界相互作用界面殘基展示為空間填充表面模型。
GFRAL/3P10 Fab複合物之界面處之GFRAL胺基酸展示於表46中。為了比較GFRAL/3P10 Fab及GFRAL/RET複合物中之相互作用界面胺基酸，表46進一步列舉GFRAL/複合物之界面處之GFRAL胺基酸，其亦展 示於表40A中。表46以粗體展示結合於RET及3P10 Fab之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基。
以粗體展示結合於RET及3P10 Fab之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基。
C1：GFRAL/8D8/5F12 Fab複合物之晶體結構
測定8D8 Fab：：GFRAL：：5F12 Fab複合物之晶體結構。
8D8 Fab及5F12 Fab胺基酸序列展示於下文中，其中VH及VL序列加粗且CDR區域加粗且帶下劃線。
8D8 Fab Hc： (SEQ ID NO：1828)
8D8 Fab Lc： (SEQ ID NO：1829)
5F12 Fab Hc： (SEQ ID NO：1830)
5F12 Fab Lc： (SEQ ID NO：1831)
圖59 藉由帶狀圖說明3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物之一個態樣。Fab片段與3P10 Fab：：GFRAL：：25M22 Fab複合物晶體中GFRAL之不對稱單元相互作用。晶體結構亦展示GFRAL抗原決定基殘基290-312呈現至3P10抗體且GFRAL N端抗原決定基殘基130-157呈現至25M22抗體重鏈CDR區域。
圖60 說明GFRAL蛋白質上之8D8 Fab及5F12 Fab結合位點。GFRAL蛋白質上對Fab結合重要之殘基展示為柱狀模型。
對呈現至8D8 Fab：：GFRAL：：5F12 Fab複合物晶體結構中之8D8 Fab之GFRAL抗原決定基之分析證實8D8之作用機制為競爭性GDF15抑制劑之作用機制且涉及阻斷GDF15與GFRAL之結合。關於重鏈及輕鏈之GFRAL蛋白質及8D8 Fab CDR上之例示性核心相互作用界面胺基酸展示於圖61 中。
圖62A、62B、62C及62D 說明GFRAL/8D8 Fab相互作用界面中之核心及邊界胺基酸殘基。圖62A 說明GFRAL之結構，其中GFRAL上之核心8D8相互作用界面胺基酸(GFRAL抗原決定基殘基)在空間填充表面模型中突出顯示。圖62B 亦說明空間填充表面模型中由8D8覆蓋之GFRAL上之核心界面胺基酸。圖62C 以帶狀圖說明GFRAL之結構，其中GFRAL上之邊界8D8 Fab相互作用界面胺基酸(GFRAL抗原決定基殘基)在空間填充表面模型中突出顯示。圖62D 亦說明空間填充表面模型中由8D8覆蓋之GFRAL上之邊界界面胺基酸。
圖63A、63B、63C及63D 說明GFRAL/5F12 Fab相互作用界面中之 核心及邊界胺基酸殘基。圖63A 說明GFRAL之結構，其中GFRAL上之核心5F12相互作用界面胺基酸(GFRAL抗原決定基殘基)在空間填充表面模型中突出顯示。圖63B 亦說明空間填充表面模型中由5F12覆蓋之GFRAL上之核心界面胺基酸。圖63C 以帶狀圖說明GFRAL之結構，其中GFRAL上之邊界5F12 Fab相互作用界面胺基酸(GFRAL抗原決定基殘基)在空間填充表面模型中突出顯示。圖63D 亦說明空間填充表面模型中由5F12覆蓋之GFRAL上之邊界界面胺基酸。
GFRAL/8D8 Fab複合物之界面處之GFRAL胺基酸展示於表47中。為了比較GFRAL/8D8 Fab及GFRAL/GDF15複合物中之相互作用界面胺基酸，表47進一步列舉GFRAL/GDF15複合物之界面處之GFRAL胺基酸，其亦展示於表38中。表47說明結合於GDF15之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基與GFRAL/8D8 Fab相互作用中之核心相互作用界面胺基酸重疊。
全長前驅體人類GFRAL蛋白質之胺基酸序列展示於下文中(亦參見實例12，部分C )：GFRAL序列 SEQ ID NO：1797
結合於GDF15及8D8 Fab之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基以粗體展示。
對呈現至5F12 Fab：：GFRAL：：8D8 Fab複合物晶體結構中之5F12 Fab之GFRAL抗原決定基的分析證實5F12之作用機制為非競爭性GDF15抑制劑之作用機制且不涉及阻斷GDF15與GFRAL之結合。關於重鏈及輕鏈之GFRAL蛋白質及5F12 Fab CDR上之例示性核心相互作用界面胺基酸展示於圖64 中。
GFRAL/5F12 Fab複合物之界面處之GFRAL胺基酸展示於表48中。為了比較GFRAL/5F12 Fab及GFRAL/RET複合物中之相互作用界面胺基酸，表48進一步列舉GFRAL/RET複合物之界面處之GFRAL胺基酸，其亦展示於表40A中。表48展示填充有藍色背景之細胞中結合於RET及5F12 Fab之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基。對GFRAL上之GFRAL/5F12相互作用：5F12結合抗原決定基重要的GFRAL上之殘基顯示阻斷GFRAL/RET相互作用之非競爭性抑制性作用機制。
結合於RET及5F12 Fab之GFRAL上之核心相互作用界面胺基酸殘基以粗體展示。GFRAL中之灰色背景彩色殘基係3P10結合抗原決定基與GFRAL上之RET結合抗原決定基之間的重疊殘基。
本文中所描述之所有參考文獻之內容以引用之方式併入本文中。
其他實施例在以下申請專利範圍內。
第1行-記錄名稱；第2行-原子系列編號；第3行-原子名稱；第4行-胺基酸殘基名稱；第5行-鏈標識符；第6行-胺基酸殘基序列號；第7行-X之正交座標(埃)；第8行-Y之正交座標(埃)；第9行-Z之正交座標(埃)；第10行-佔有率；第11行-溫度因子；第12行-區段標識符；第13行-元素符號。
表50
第1行-記錄名稱；第2行-原子系列編號；第3行-原子名稱；第4行-胺基酸殘基名稱；第5行-鏈標識符；第6行-胺基酸殘基序列號；第7行-X之正交座標(埃)；第8行-Y之正交座標(埃)；第9行-Z之正交座標(埃)；第10行-佔有率；第11行-溫度因子；第12行-區段標識符；第13行-元素符號。
表51
第1行-記錄名稱；第2行-原子系列編號；第3行-原子名稱；第4行-胺基酸殘基名稱；第5行-鏈標識符；第6行-胺基酸殘基序列號；第7行-X之正交座標(埃)；第8行-Y之正交座標(埃)；第9行-Z之正交座標(埃)；第10行-佔有率；第11行-溫度因子；第12行-元素符號。
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<212> PRT
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<220>
<223> CDR序列
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<220>
<223> CDR序列
<400> 123
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<212> PRT
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<220>
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
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<211> 6
<212> PRT
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<220>
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<211> 11
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<220>
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<223> VH構架4(FR4)
<400> 1727
<210> 1728
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH構架4(FR4)
<400> 1728
<210> 1729
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1729
<210> 1730
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1730
<210> 1731
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1731
<210> 1732
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1732
<210> 1733
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1733
<210> 1734
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1734
<210> 1735
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1735
<210> 1736
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1736
<210> 1737
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1737
<210> 1738
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1738
<210> 1739
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1739
<210> 1740
<211> 23
<213> 人工序列
<212> PRT
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1740
<210> 1741
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1741
<210> 1742
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1742
<210> 1743
<211> 23
<213> 人工序列
<212> PRT
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1743
<210> 1744
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1744
<210> 1745
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1745
<210> 1746
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1746
<210> 1747
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1747
<210> 1748
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1748
<210> 1749
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1749
<210> 1750
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架1(FR1)
<400> 1750
<210> 1751
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1751
<210> 1752
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1752
<210> 1753
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1753
<210> 1754
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1754
<210> 1755
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1755
<210> 1756
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1756
<210> 1757
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1757
<210> 1758
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1758
<210> 1759
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1759
<210> 1760
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1760
<210> 1761
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1761
<210> 1762
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1762
<210> 1763
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1763
<210> 1764
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1764
<210> 1765
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1765
<210> 1766
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1766
<210> 1767
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1767
<210> 1768
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1768
<210> 1769
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1769
<210> 1770
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1770
<210> 1771
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1771
<210> 1772
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1772
<210> 1773
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1773
<210> 1774
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1774
<210> 1775
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1775
<210> 1776
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1776
<210> 1777
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架2(FR2)
<400> 1777
<210> 1778
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1778
<210> 1779
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1779
<210> 1780
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1780
<210> 1781
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1781
<210> 1782
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1782
<210> 1783
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1783
<210> 1784
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1784
<210> 1785
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1785
<210> 1786
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1786
<210> 1787
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1787
<210> 1788
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1788
<210> 1789
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1789
<210> 1790
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1790
<210> 1791
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1791
<210> 1792
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架3(FR3)
<400> 1792
<210> 1793
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架4(FR4)
<400> 1793
<210> 1794
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL構架4(FR4)
<400> 1794
<210> 1795
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 1795
<210> 1796
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 1796
<210> 1797
<211> 394
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 具有信號肽序列之全長前驅體人類GFRAL
<400> 1797
<210> 1798
<211> 375
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類GFRAL多肽
<400> 1798
<210> 1799
<211> 1911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼前驅體GFRAL多肽之核酸序列
<400> 1799
<210> 1800
<211> 394
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<223> GFRAL蛋白質食蟹獼猴
<400> 1800
<210> 1801
<211> 1476
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<220>
<223> 食蟹獼猴GFRAL蛋白質之編碼核酸序列
<400> 1801
<210> 1802
<211> 393
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> GFRAL蛋白質-小鼠
<400> 1802
<210> 1803
<211> 2080
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠GFRAL蛋白質之編碼核酸序列
<400> 1803
<210> 1804
<211> 394
<212> PRT
<213> 褐鼠
<220>
<223> GFRAL蛋白質-大鼠
<400> 1804
<210> 1805
<211> 1125
<212> DNA
<213> 褐鼠
<220>
<223> 大鼠GFRAL蛋白質之編碼核酸序列
<400> 1805
<210> 1806
<211> 332
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 1806
<210> 1807
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 1807
<210> 1808
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 1808
<210> 1809
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 1809
<210> 1810
<211> 308
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 前驅體人類GDF15多肽
<400> 1810
<210> 1811
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類GDF15多肽
<400> 1811
<210> 1812
<211> 1049
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類RET9
<400> 1812
<210> 1813
<211> 1072
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 全長前驅體人類RET蛋白質
<400> 1813
<210> 1814
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD
<400> 1814
<210> 1815
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD
<400> 1815
<210> 1816
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD片段
<400> 1816
<210> 1817
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體1(IgK-2Flag-GFRAL)
<400> 1817
<210> 1818
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體2(IgK-2Flag-GFRAL結構域1)
<400> 1818
<210> 1819
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體3(IgK-2Flag-GFRAL結構域2)
<400> 1819
<210> 1820
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體4(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+2)
<400> 1820
<210> 1821
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體5(IgK-2Flag-GFRAL結構域1+3)
<400> 1821
<210> 1822
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體6(IgK-2Flag-GFRAL結構域2+3)
<400> 1822
<210> 1823
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體7(IgK-2Flag-GFRAL結構域3)
<400> 1823
<210> 1824
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3P10 Fab Hc
<400> 1824
<210> 1825
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3P10 Fab Lc
<400> 1825
<210> 1826
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 25M22 Fab Hc
<400> 1826
<210> 1827
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 25M22 Fab Lc
<400> 1827
<210> 1828
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8D8 Fab Hc
<400> 1828
<210> 1829
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 8D8 Fab Lc
<400> 1829
<210> 1830
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5F12 Fab Hc
<400> 1830
<210> 1831
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5F12 Fab Lc
<400> 1831
<210> 1832
<211> 394
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> GFRAL蛋白質-黑猩猩
<400> 1832
<210> 1833
<211> 395
<212> PRT
<213> 大熊貓
<220>
<223> GFRAL蛋白質-大熊貓
<400> 1833
<210> 1834
<211> 395
<212> PRT
<213> 犬
<220>
<223> GFRAL蛋白質-犬
<400> 1834
<210> 1835
<211> 395
<212> PRT
<213> 貓
<220>
<223> GFRAL蛋白質-貓
<400> 1835
<210> 1836
<211> 324
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> GFRAL蛋白質-牛
<400> 1836
<210> 1837
<211> 395
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<223> GFRAL蛋白質-豬
<400> 1837
<210> 1838
<211> 220
<212> PRT
<213> 灰倉鼠
<220>
<223> GFRAL蛋白質-中國倉鼠(胺基酸169-388)
<400> 1838
<210> 1839
<211> 319
<212> PRT
<213> 鴨嘴獸
<220>
<223> GFRAL蛋白質-鴨嘴獸
<400> 1839
<210> 1840
<211> 168
<212> PRT
<213> 灰倉鼠
<220>
<223> GFRAL蛋白質-中國倉鼠(胺基酸1-168)
<400> 1840
<210> 1841
<211> 308
<212> PRT
<213> 獼猴
<220>
<223> GDF15蛋白質-恆河猴
<400> 1841
<210> 1842
<211> 308
<212> PRT
<213> 長臂猿屬
<220>
<223> GDF15蛋白質-長臂猿
<400> 1842
<210> 1843
<211> 308
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> GDF15蛋白質-黑猩猩
<400> 1843
<210> 1844
<211> 308
<212> PRT
<213> 類人猿屬
<220>
<223> GDF15蛋白質-猩猩
<400> 1844
<210> 1845
<211> 308
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> GDF15蛋白質-牛
<400> 1845
<210> 1846
<211> 308
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<223> GDF15蛋白質-豬
<400> 1846
<210> 1847
<211> 307
<212> PRT
<213> 犬
<220>
<223> GDF15蛋白質-犬
<400> 1847
<210> 1848
<211> 308
<212> PRT
<213> 大熊貓
<220>
<223> GDF15蛋白質-大熊貓
<400> 1848
<210> 1849
<211> 298
<212> PRT
<213> 貂
<220>
<223> GDF15蛋白質-雪貂
<400> 1849
<210> 1850
<211> 303
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> GDF15蛋白質-小鼠
<400> 1850
<210> 1851
<211> 301
<212> PRT
<213> 豚鼠
<220>
<223> GDF15蛋白質-天竺鼠
<400> 1851
<210> 1852
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1C1)
<400> 1852
<210> 1853
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(3P10)
<400> 1853
<210> 1854
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(12A3)
<400> 1854
<210> 1855
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1B3)
<400> 1855
<210> 1856
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2B3)
<400> 1856
<210> 1857
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2B11)
<400> 1857
<210> 1858
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2B8)
<400> 1858
<210> 1859
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(22N5)
<400> 1859
<210> 1860
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P1B6)
<400> 1860
<210> 1861
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P8G4)
<400> 1861
<210> 1862
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(8D8)
<400> 1862
<210> 1863
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2A9)
<400> 1863
<210> 1864
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(8C10)
<400> 1864
<210> 1865
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(24G2)
<400> 1865
<210> 1866
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2J23)
<400> 1866
<210> 1867
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(6N16)
<400> 1867
<210> 1868
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(5A20)
<400> 1868
<210> 1869
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(17J16)
<400> 1869
<210> 1870
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1A3)
<400> 1870
<210> 1871
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P1H8)
<400> 1871
<210> 1872
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(25M22)
<400> 1872
<210> 1873
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(19K19)
<400> 1873
<210> 1874
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(5F12)
<400> 1874
<210> 1875
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL或(6G9)
<400> 1875
<210> 1876
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(1A3)
<400> 1876
<210> 1877
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(P1B6)
<400> 1877
<210> 1878
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(P1H8)
<400> 1878
<210> 1879
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(P8G4)
<400> 1879
<210> 1880
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1A3)
<400> 1880
<211> 106
<210> 1881
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P1B6)
<400> 1881
<210> 1882
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P1H8)
<400> 1882
<210> 1883
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(P8G4)
<400> 1883
<210> 1884
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(1C1)
<400> 1884
<210> 1885
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(2A9)
<400> 1885
<210> 1886
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(2J23)
<400> 1886
<210> 1887
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(5A20)
<400> 1887
<211> 122
<210> 1888
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(8C10)
<400> 1888
<210> 1889
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(8D8)
<400> 1889
<210> 1890
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(12A3)
<400> 1890
<210> 1891
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(17J16)
<400> 1891
<211> 125
<210> 1892
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(25M22)
<400> 1892
<210> 1893
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(19K19)
<400> 1893
<211> 114
<210> 1894
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(22N5)
<400> 1894
<210> 1895
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1C1)
<400> 1895
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2A9)
<400> 1896
<210> 1897
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2J23)
<400> 1897
<210> 1898
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(5A20)
<400> 1898
<210> 1899
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(8C10)
<400> 1899
<210> 1900
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(8D8)
<400> 1900
<210> 1901
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(12A3)
<400> 1901
<210> 1902
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(17J16)
<400> 1902
<210> 1903
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(25M22)
<400> 1903
<210> 1904
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(19K19)
<400> 1904
<210> 1905
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(22N5)
<400> 1905
<210> 1906
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(1B3)
<400> 1906
<210> 1907
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(2B11)
<400> 1907
<211> 118
<210> 1908
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(3P10)
<400> 1908
<210> 1909
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(5F12)
<400> 1909
<210> 1910
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(6G9)
<400> 1910
<211> 120
<210> 1911
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(6N16)
<400> 1911
<211> 106
<210> 1912
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(1B3)
<400> 1912
<210> 1913
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(2B11)
<400> 1913
<210> 1914
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(3P10)
<400> 1914
<210> 1915
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(5F12)
<400> 1915
<210> 1916
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(6G9)
<400> 1916
<210> 1917
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(6N16)
<400> 1917
<210> 1918
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(1C1)
<400> 1918
<210> 1919
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349a)
<400> 1919
<210> 1920
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349b)
<400> 1920
<210> 1921
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349c)
<400> 1921
<210> 1922
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349d)
<400> 1922
<210> 1923
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349e)
<400> 1923
<210> 1924
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-349f)
<400> 1924
<210> 1925
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-350a)
<400> 1925
<210> 1926
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-350b)
<400> 1926
<210> 1927
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-350c)
<400> 1927
<210> 1928
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域
<400> 1928
<210> 1929
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-349a)
<400> 1929
<210> 1930
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-349b)
<400> 1930
<210> 1931
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-349c)
<400> 1931
<210> 1932
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-349d)
<400> 1932
<210> 1933
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-350a)
<400> 1933
<211> 113
<210> 1934
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-350b)
<400> 1934
<210> 1935
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(25M22)
<400> 1935
<210> 1936
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-389a)
<400> 1936
<210> 1937
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-389b)
<400> 1937
<210> 1938
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-389c)
<400> 1938
<210> 1939
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-390a)
<400> 1939
<211> 125
<210> 1940
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-390b)
<400> 1940
<210> 1941
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-390c)
<400> 1941
<210> 1942
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(25M22)
<400> 1942
<210> 1943
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-389a)
<400> 1943
<210> 1944
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-389b)
<400> 1944
<210> 1945
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-389c)
<400> 1945
<210> 1946
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-390a)
<400> 1946
<210> 1947
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-390b)
<400> 1947
<210> 1948
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(17J16)
<400> 1948
<210> 1949
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-356a)
<400> 1949
<210> 1950
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-356b)
<400> 1950
<210> 1951
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-356c)
<400> 1951
<210> 1952
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-356d)
<400> 1952
<210> 1953
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(17J16)
<400> 1953
<211> 112
<210> 1954
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-356a)
<400> 1954
<210> 1955
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-356b)
<400> 1955
<210> 1956
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-356c)
<400> 1956
<210> 1957
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(5F12)
<400> 1957
<210> 1958
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375a)
<400> 1958
<210> 1959
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375b)
<400> 1959
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375c)
<400> 1960
<211> 122
<210> 1961
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375d)
<400> 1961
<210> 1962
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375e)
<400> 1962
<210> 1963
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375f)
<400> 1963
<210> 1964
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375g)
<400> 1964
<210> 1965
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-375h)
<400> 1965
<210> 1966
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(5F12)
<400> 1966
<210> 1967
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375a)
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<210> 1968
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375b)
<400> 1968
<210> 1969
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> VL域(LC-375g)
<400> 1969
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375c)
<400> 1970
<210> 1971
<211> 111
<213> 人工序列
<212> PRT
<220>
<223> VL域(LC-375d)
<400> 1971
<210> 1972
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375e)
<400> 1972
<210> 1973
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375f)
<400> 1973
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375h)
<400> 1974
<210> 1975
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375i)
<400> 1975
<210> 1976
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-375j)
<400> 1976
<210> 1977
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(3P10)
<400> 1977
<210> 1978
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344a)
<400> 1978
<210> 1979
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344b)
<400> 1979
<210> 1980
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344c)
<400> 1980
<210> 1981
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344d)
<400> 1981
<210> 1982
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344e)
<400> 1982
<210> 1983
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344f)
<400> 1983
<210> 1984
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344g)
<400> 1984
<210> 1985
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-344h)
<400> 1985
<210> 1986
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-345a)
<400> 1986
<210> 1987
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-345b)
<400> 1987
<210> 1988
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH域(HC-345c)
<400> 1988
<210> 1989
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(3P10)
<400> 1989
<210> 1990
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344a)
<400> 1990
<210> 1991
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344b)
<400> 1991
<210> 1992
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344c)
<400> 1992
<210> 1993
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344d)
<400> 1993
<210> 1994
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> VL域(LC-344e)
<220>
<400> 1994
<210> 1995
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344f)
<400> 1995
<210> 1996
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344g)
<400> 1996
<210> 1997
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344h)
<400> 1997
<210> 1998
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-344i)
<400> 1998
<210> 1999
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-345a)
<400> 1999
<210> 2000
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL域(LC-345b)
<400> 2000
<210> 2001
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2001
<210> 2002
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2002
<210> 2003
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2003
<210> 2004
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2004
<210> 2005
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2005
<210> 2006
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異型Fc序列
<400> 2006
<210> 2007
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> κ恆定區(例示性)
<400> 2007
<210> 2008
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> λ恆定區(例示性)
<400> 2008

Claims (106)

  1. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質且a. 抑制GDF15蛋白質與該GFRAL蛋白質之結合；及/或b. 抑制RET蛋白質與該GFRAL蛋白質之結合。
  2. 如請求項1之單株抗體或其片段，其結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域1內之一或多個胺基酸殘基。
  3. 如請求項1之單株抗體或其片段，其結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域2內之一或多個胺基酸殘基。
  4. 如請求項1之單株抗體或其片段，其結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域3內之一或多個胺基酸殘基。
  5. 如請求項1之單株抗體或其片段，其抑制包含該GDF15蛋白質、該GFRAL蛋白質及/或該RET蛋白質之複合物之形成。
  6. 如請求項1之單株抗體或其片段，其干擾該GDF15蛋白質與該GFRAL蛋白質之間的相互作用。
  7. 如請求項1之單株抗體或其片段，其干擾該RET蛋白質與該GFRAL蛋白質之間的相互作用。
  8. 如請求項1之單株抗體或其片段，其調節該GDF15蛋白質之活性或包含該GDF15蛋白質、該GFRAL蛋白質及/或該RET蛋白質之複合物之活性及/或信號傳導。
  9. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質且包含以下特徵中之一或多者：a. 結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域1內之一或多個胺基酸殘基；b. 結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域2內之一或多個胺基酸殘基；c. 結合於該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域3內之一或多個胺基酸殘基；d. 抑制GDF15蛋白質與該GFRAL蛋白質之結合；e. 抑制RET蛋白質與該GFRAL蛋白質之結合；f. 抑制包含GDF15蛋白質、GFRAL蛋白質及/或RET蛋白質之複合物之形成；g. 干擾GDF15蛋白質與該GFRAL蛋白質之間的相互作用；h. 干擾RET蛋白質與該GFRAL蛋白質之間的相互作用；i. 調節包含GDF15蛋白質、GFRAL蛋白質及/或RET蛋白質之複合物之活性及/或信號傳導。
  10. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該 GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基Q20至E351之間且包括殘基Q20及E351的胺基酸序列。
  11. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基Q20至S130之間且包括殘基Q20及S130的胺基酸序列。
  12. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基C131至C210之間且包括殘基C131及C210的胺基酸序列。
  13. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基C220至C316之間且包括殘基C220及C316的胺基酸序列。
  14. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795及1796；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513及514；及 iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529及530；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545及546；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：547、548、549、550、551、552、553、554、555、556及557；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568及569。
  15. 如請求項14之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795及1796；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513及514；及 iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529及530。
  16. 如請求項14之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545及546；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：547、548、549、550、551、552、553、554、555、556及557；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568及569。
  17. 如請求項14至16中任一項之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：570-578組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：579-602組成之群的胺基酸序列； iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：603-1726組成之群的胺基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列；及/或b. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729-1750組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751-1777組成之群的胺基酸序列；iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778-1792組成之群的胺基酸序列，及iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺基酸序列。
  18. 如請求項17之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：570-578組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：579-602組成之群的胺基酸序列；iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：603-1726組成之群的胺 基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列。
  19. 如請求項17之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729-1750組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751-1777組成之群的胺基酸序列；iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778-1792組成之群的胺基酸序列，及iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺基酸序列。
  20. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118及119； ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204及220；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283及284；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359及360；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414及415；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469及470。
  21. 如請求項20之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118及119；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204及220；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283及284。
  22. 如請求項20之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359及360；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414及415；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469及470。
  23. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：49、60、61、62、63、69、70及71；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：152、153、154、155、156、161、162、163、164及165；及 iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：237、238、239、240、245、246、247及248；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：313、314、315、316、321、322、323及324；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：385、386、387、391及392；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：435、436、437、441、442及443。
  24. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118及119；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204及220；及 iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283及284；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359及360；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414及415；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469及470。
  25. 如請求項24之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：72、73、74、75及76組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：166、167、168、169及 170組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：249、250、251及252組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：325、326、327及328組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：386、393及394組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：444、445及446組成之群的胺基酸序列。
  26. 如請求項24之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：64、65、66、67及68組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：157、158、159、160及220組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：241、242、243及244組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：317、318、319及320組 成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：388、389及390組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：438、439及440組成之群的胺基酸序列。
  27. 如請求項20至26中任一項之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：570-572及578組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：579-581、589、590、592、601及602組成之群的胺基酸序列；iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：603-1643、1679-1714、1723-1726組成之群的胺基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列；及/或b. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729-1732、1735-1740、1749及1750組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751-1773、1776及1777組成之群的胺基酸序列； iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778-1780及1792組成之群的胺基酸序列，及iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺基酸序列。
  28. 如請求項27之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：570-572及578組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：579-581、589、590、592、601及602組成之群的胺基酸序列；iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：603-1643、1679-1714、1723-1726組成之群的胺基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列。
  29. 如請求項27之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729-1732、1735-1740、1749及1750組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751-1773、1776及1777 組成之群的胺基酸序列；iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778-1780及1792組成之群的胺基酸序列，及iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺基酸序列。
  30. 如請求項9之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130及131；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295及296；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371及372；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421及422；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478及479。
  31. 如請求項30之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130及131；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、 294、295及296。
  32. 如請求項30之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371及372；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421及422；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478及479。
  33. 如請求項30之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：46、47、48、49及50組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：137、138、139、140及141組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：225、226、227及228組成之群的胺基酸序列； 及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：301、302、303及304組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：376、377及378組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：426、427及428組成之群的胺基酸序列。
  34. 如請求項30之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：49、56、57、58及59組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：147、148、149、150及151組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：233、234、235及236組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：309、310、311及312組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：382、383及384組成之群的胺基酸序列；及 iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：432、433及434組成之群的胺基酸序列。
  35. 如請求項30至34中任一項之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：572-577組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：581-600組成之群的胺基酸序列；iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1643-1685、1715-1722組成之群的胺基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列；及/或b. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729、1730、1733、1734、1741-1748組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751、1752、1755、1758、1774-1776組成之群的胺基酸序列；iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778、1780-1791組成之群的胺基酸序列，及iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺 基酸序列。
  36. 如請求項35之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VH區，其包含：i. VH FR1，其具有選自由SEQ ID NO：572-577組成之群的胺基酸序列；ii. VH FR2，其具有選自由SEQ ID NO：581-600組成之群的胺基酸序列；iii. VH FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1643-1685、1715-1722組成之群的胺基酸序列，及iv. VH FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1727及1728組成之群的胺基酸序列。
  37. 如請求項35之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段進一步包含：a. VL區，其包含：i. VL FR1，其具有選自由SEQ ID NO：1729、1730、1733、1734、1741-1748組成之群的胺基酸序列；ii. VL FR2，其具有選自由SEQ ID NO：1751、1752、1755、1758、1774-1776組成之群的胺基酸序列；iii. VL FR3，其具有選自由SEQ ID NO：1778、1780-1791組成之群的胺基酸序列，及 iv. VL FR4，其具有選自由SEQ ID NO：1793及1794組成之群的胺基酸序列。
  38. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域2內之一或多個胺基酸殘基且抑制GDF15蛋白質與GFRAL蛋白質之結合。
  39. 如請求項38之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基C131至C210之間且包括殘基C131及C210的胺基酸序列。
  40. 如請求項38或39之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118及119；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204及 220；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283及284；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359及360；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414及415；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469及470。
  41. 如請求項45至48中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含： a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：49、60、61、62、63、69、70及71；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：152、153、154、155、156、161、162、163、164及165；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：237、238、239、240、245、246、247及248；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：313、314、315、316、321、322、323及324；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：385、386、387、391及392；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：435、436、437、441、442及443。
  42. 如請求項45至48中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、114、115、116、 117、118及119；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204及220；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283及284；及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、326、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359及360；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414及415；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469及470。
  43. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之結構域3內之一或多個胺基酸殘基且抑制RET蛋白質與GFRAL蛋白質之結合。
  44. 如請求項43之單株抗體或其片段，其中該抗體或其片段結合於在該GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之殘基C220至C316之間且包括殘基C220及C316的胺基酸序列。
  45. 如請求項43或44之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. 重鏈可變(VH)區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130及131；ii. VH CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218及219；及iii. VH CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295及296； 及/或b. 輕鏈可變(VL)區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、346、347、348、365、366、367、368、369、370、371及372；ii. VL CDR2，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、419、420、421及422；及iii. VL CDR3，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474、475、476、477、478及479。
  46. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197及GLN200，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  47. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之SER156、GLN147、SER150、TYR151、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、 ALA137、CYS138、ASP141、VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133及VAL134，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  48. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134及ALA135，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  49. 如請求項46至48中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：72、73、74、75及76組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：166、167、168、169及170組成之群的胺基酸序列；及 iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：249、250、251及252組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：325、326、327及328組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：386、393及394組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：444、445及446組成之群的胺基酸序列。
  50. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182及MET185，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  51. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、 ALA187、PHE188及CYS189，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  52. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188及CYS189，且抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  53. 如請求項50至52中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：64、65、66、67及68組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：157、158、159、160及220組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：241、242、243及244組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含： i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：317、318、319及320組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：388、389及390組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：438、439及440組成之群的胺基酸序列。
  54. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298及SER299，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  55. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307及MET310，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  56. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ILE224、ARG225、 GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307及MET310，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  57. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之MET214、PRO216、PRO217、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU301、LYS305、GLN308、HIS309、HIS312及SER315，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  58. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN298及GLU301，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  59. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN288、 VAL289、GLU300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、MET310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS316及PHE317，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  60. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、PHE317，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  61. 如請求項57至60中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：46、47、48、49及50組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：137、138、139、140及141組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：225、226、227及228組成之群的胺基酸序列； 及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：301、302、303及304組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：376、377及378組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：426、427及428組成之群的胺基酸序列。
  62. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ARG234、ARG238GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261及LEU262，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  63. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN246、ARG250LYS251、CYS252、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261及LEU262，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  64. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之CYS233、ARG235、 HIS236、TYR237、THR239、PHE240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、ILE259、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315及CYS316，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  65. 一種單株抗體或其片段，其結合於選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315及CYS316，且抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  66. 如請求項62至65中任一項之抗體，其中該抗體或其片段包含：a. VH區，其包含：i. VH CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：49、56、57、58及59組成之群的胺基酸序列；ii. VH CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：147、148、149、150及 151組成之群的胺基酸序列；及iii. VH CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：233、234、235及236組成之群的胺基酸序列；及b. VL區，其包含：i. VL CDR1，其具有選自由SEQ ID NO：309、310、311及312組成之群的胺基酸序列；ii. VL CDR2，其具有選自由SEQ ID NO：382、383及384組成之群的胺基酸序列；及iii. VL CDR3，其具有選自由SEQ ID NO：432、433及434組成之群的胺基酸序列。
  67. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含一或多個選自由以下組成之群的殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197及GLN200，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  68. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之SER156、GLN147、SER150、TYR151、 ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、ALA137、CYS138、ASP141、VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133及VAL134，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  69. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134及ALA135，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  70. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、 GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182及MET185，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  71. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、ALA187、PHE188及CYS189，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  72. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188及CYS189，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結合。
  73. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298及SER299，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  74. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307及MET310，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  75. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、 LEU262、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307及MET310，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  76. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之MET214、PRO216、PRO217、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU301、LYS305、GLN308、HIS309、HIS312及SER315，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  77. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN298或GLU301，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  78. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、 TRP245、LEU267、CYS269、GLN288、VAL289、GLU300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、MET310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS316及PHE317，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  79. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、PHE317，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  80. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261及LEU262，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結 合。
  81. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之GLN246、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261或LEU262，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  82. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之CYS233、ARG235、HIS236、TYR237、THR239、PHE240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、ILE259、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315及CYS316，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  83. 一種單株抗體或其片段，其結合於GFRAL蛋白質之抗原決定基，其中該抗原決定基包含選自由以下組成之群的一或多個殘基：GFRAL蛋白質(SEQ ID NO：1797)之CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、 ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315及CYS316，且其中該抗體或其片段抑制該GFRAL蛋白質與RET蛋白質之結合。
  84. 如請求項1至83中任一項之單株抗體，其中該單株抗體以小於或等於5×10-9 M之KD 結合於GFRAL。
  85. 如請求項1至84中任一項之單株抗體，其中該單株抗體抑制該GFRAL蛋白質與GDF15蛋白質之結構域或RET蛋白質之結構域之結合達至少80%。
  86. 如請求項1至85中任一項之單株抗體或片段，其中該單株抗體係人類化、人類或嵌合抗體。
  87. 如請求項1至85中任一項之抗體或其片段，其中該片段係Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、(scFv)2、單鏈抗體分子、雙可變區抗體、單可變區抗體、線形抗體、V區或由抗體片段形成之多特異性抗體。
  88. 如請求項1至87中任一項之抗體或片段，其中該抗體或片段結合於可偵測標記物。
  89. 如請求項88之抗體或片段，其中該可偵測標記物選自放射性同位素、金屬螯合劑、酶、螢光化合物、生物發光化合物及化學發光化合物。
  90. 一種轉基因動物，其產生如請求項1至87中任一項之抗體。
  91. 一種融合瘤，其產生如請求項1至87中任一項之抗體。
  92. 一種載體，其包含編碼如請求項1至87中任一項之抗體或其片段之聚核苷酸。
  93. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至87中任一項之抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑。
  94. 一種調節個體中GDF15介導之疾病或病症的方法，其包含投與該個體結合於GFRAL之抗體或其片段或包含該抗體或其片段之醫藥組合物。
  95. 如請求項94之方法，其中該抗體或其片段係如請求項1至87中任一項之抗體或其片段。
  96. 一種治療個體中之非自主體重減輕或預防具有非自主體重減輕之風險的個體中之非自主體重減輕的方法，該方法包含投與該個體結合於GFRAL之抗體或其片段或包含該抗體或其片段之醫藥組合物。
  97. 如請求項96之方法，其中該抗體或其片段係如請求項1至87中任一項之抗體或其片段。
  98. 如請求項96或97之方法，其中該個體患有惡病體質。
  99. 如請求項96或97之方法，其中該個體患有慢性疾病。
  100. 如請求項98之方法，其中該慢性疾病係選自由以下組成之群：肝硬化、甲狀腺高能症、帕金森氏病(Parkinson's disease)、癌症、慢性腎病、慢性阻塞性肺病、AIDS、結核病、慢性發炎疾病、敗血症、肌肉萎縮及神經性厭食症。
  101. 一種調節個體中之GDF15活性的方法，其包含投與該個體結合於GFRAL之抗體或其片段或包含該抗體或其片段之醫藥組合物。
  102. 如請求項102之方法，其中該抗體或其片段係如請求項1至87中任一項之抗體或其片段。
  103. 如請求項101或102之方法，其中該方法降低GDF15活性且該個體具有增加之GDF15活性或具有產生增加之GDF15活性的風險。
  104. 如請求項101或102之方法，其中該方法增加GDF15活性且該個體具有降低之GDF15活性或具有產生降低之GDF15活性的風險。
  105. 一種如請求項1至87中任一項之抗體或其片段之用途，其係用於製造藥劑，其中該藥劑用於個體中之GDF15介導之疾病、病症或病狀，包含向該個體投與該抗體或片段。
  106. 一種如請求項93之醫藥組合物之用途，其用於治療或預防個體中之GDF15介導之疾病、病症或病狀。
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