CN110177564A - 多价的调节t细胞调节剂 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含IL‑2受体结合部分和ST2结合部分的化合物。本公开中描述的方法提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的包含IL‑2受体结合部分和ST2结合部分的化合物来治疗病症的方法。

Description

多价的调节T细胞调节剂

相关申请

本申请要求2016年12月13日提交的美国临时专利申请No.62/433,533的优先权，其内容以其整体并入本文。

序列表的提交

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背景技术

炎性肌病是以慢性肌肉炎症和肌无力为特征的病症。肌肉萎缩症是由突变的肌营养不良蛋白基因引起的退行性肌肉疾病，但进行性退化的根本原因是肌肉炎症。与这些疾病相关的炎症可以损伤肌肉纤维，从而引起疲劳、疼痛和进行性肌肉退化。调节T细胞(Treg)是T细胞的特化亚群。Treg抑制免疫系统的活化，且由此调节免疫系统的自身耐受性。表达限定的分子标志物如受体ST2的Treg亚群存在于发炎的组织中，例如损伤的骨骼肌和发炎的肺。表达ST2的Treg的扩增和激活涉及急性肌肉损伤和与肌肉萎缩相关的肌肉炎症的解决。另外，ST2+Treg存在于如内脏脂肪、结肠和肺的组织中，并且在这些组织中具有免疫调节和组织修复功能。

发明内容

在一些实施方案中，本公开提供包含以下的融合蛋白：人IL-2蛋白结构域；免疫球蛋白Fc蛋白结构域；和结合白介素1受体-样1(ST2)的蛋白结构域。在某些实施方案中，结合ST2的蛋白结构域是人IL-33蛋白结构域。在某些实施方案中，结合ST2的蛋白结构域是对ST2特异性的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，融合蛋白包含至少一个肽接头结构域。在某些实施方案中，人IL-2蛋白结构域包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有选自以下的置换的人IL-2：T3A、N88R、N88G、D20H、C125S、Q126L和Q126F。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc蛋白结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的人IgG1Fc变体的氨基酸序列。在某些实施方案中，人IL-33蛋白结构域包含相对于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有选自C208S、C227S、C232S和C259S的置换的人IL-33。在某些实施方案中，肽接头结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，融合蛋白还包含第一肽接头结构域和第二肽接头结构域。

在本文所述融合蛋白的某些实施方案中，各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)，且其中融合蛋白配置为使得人IL-2蛋白结构域的C-末端通过肽键与第一肽接头结构域的N-末端融合；IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与第一肽接头结构域的C-末端融合；第二肽接头结构域的N-末端通过肽键与IgG Fc蛋白结构域的C-末端融合；和结合ST2的蛋白结构域的N-末端通过肽键与第二肽接头结构域的C-末端融合。

在本文所述融合蛋白的某些实施方案中，各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)；且其中融合蛋白配置为使得结合ST2的蛋白结构域的C-末端通过肽键与第一肽接头结构域的N-末端融合；IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与第一肽接头结构域的C-末端融合；第二肽接头结构域的N-末端通过肽键与IgG Fc蛋白结构域的C-末端融合；和人IL-2蛋白结构域的N-末端通过肽键与第二肽接头结构域的C-末端融合。在某些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开提供编码本文所述的融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，本公开提供包含本文所述的融合蛋白的二聚体蛋白。在一些实施方案中，本公开提供包含第一融合蛋白和第二融合蛋白的二聚体蛋白，其中：融合蛋白包含免疫球蛋白(IgG)Fc蛋白结构域和选自人IL-2蛋白结构域和结合白介素1受体样1(ST2)的蛋白结构域的至少一个另外的蛋白结构域；且二聚体蛋白包含至少一个人IL-2蛋白结构域和至少一个结合ST2的蛋白结构域。

在某些实施方案中，第一融合蛋白包含人IL-2蛋白结构域、第一免疫球蛋白Fc蛋白结构域和第一肽接头；和第二融合蛋白包含结合ST2的蛋白结构域、第二免疫球蛋白Fc蛋白结构域和第二肽接头结构域。在某些实施方案中，各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)；第一融合蛋白配置为使得人IL-2蛋白结构域的C-末端通过肽键与第一肽接头结构域的N-末端融合；和第一IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与第一肽接头结构域的C-末端融合；和第二融合蛋白配置为使得第二IgG Fc蛋白结构域的C-末端通过肽键与第二肽接头结构域的N-末端融合；和结合ST2的蛋白结构域的N-末端通过肽键与第二肽接头结构域的C-末端融合。在某些实施方案中，结合ST2的蛋白结构域是人IL-33蛋白结构域。在某些实施方案中，结合ST2的蛋白结构域是对ST2特异性的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，二聚体蛋白的至少一个融合蛋白还包含至少一个肽接头结构域。在某些实施方案中，人IL-2蛋白结构域包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有选自以下的置换的人IL-2：T3A、N88R、N88G、D20H、C125S、Q126L和Q126F。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc蛋白结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的人IgG1Fc变体的氨基酸序列。在某些实施方案中，人IL-33蛋白结构域包含相对于SEQID NO:10的氨基酸序列具有选自C208S、C227S、C232S和C259S的置换的人IL-33。在某些实施方案中，肽接头结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在本文所述的二聚体蛋白的某些实施方式中，第一融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列和第二融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列和第二融合蛋白包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列和第二融合蛋白包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和第二融合蛋白包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列和第二融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQID NO:26的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；第一融合蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或者第一融合蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，第二融合蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。

在本文所述的二聚体蛋白的某些实施方式中，IgG Fc蛋白包含半胱氨酸残基，且第一融合蛋白和第二融合蛋白通过IgG Fc蛋白结构域的半胱氨酸残基彼此连接。在某些实施方案中，二聚体蛋白相对于ST2^-调节T细胞选择性地靶向ST2⁺调节T细胞。在一些实施方案中，本公开提供包含本文所述的融合蛋白或本文所述的二聚体蛋白的药物组合物。

在一些实施方案中，本公开提供治疗病症的方法，该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的权利要求28的药物组合物。在某些实施方案中，相对于受试者中ST2^-调节T细胞的水平，施用导致受试者中ST2⁺调节T细胞的水平的更大提高。在某些实施方案中，相对于受试者中的ST2^-调节T细胞，施用导致在受试者中选择性地激活ST2⁺调节T细胞。在某些实施方案中，治疗有效量是约1μg/kg-约250μg/kg。

在某些实施方案中，病症是炎性肌病。在某些实施方案中，炎性肌病选自肌肉萎缩、多肌炎、皮肌炎。在某些实施方案中，病症选自脂肪组织的炎性病症、结肠的炎性病症和肺的炎性病症。在某些实施方案中，脂肪组织是内脏脂肪组织。在某些实施方案中，病症是自身免疫疾病。在某些实施方案中，自身免疫疾病选自移植物抗宿主病、寻常型天疱疮、系统性红斑狼疮、硬皮病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、斑秃、葡萄膜炎、视神经脊髓炎和杜氏肌肉萎缩症。在某些实施方案中，施用是静脉内的。在某些实施方案中，施用是皮下的。在某些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，本公开提供在受试者中相对于ST2^-调节T细胞选择性激活ST2⁺调节T细胞的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求28的药物组合物。在某些实施方案中，治疗有效量是约1μg/kg-约250μg/kg。在某些实施方案中，施用是静脉内的。在某些实施方案中，施用是皮下的。在某些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，本公开提供一种化合物，其包含：a)结合与免疫球蛋白Fc结构域共价连接的IL-2受体的第一部分；和b)结合与免疫球蛋白Fc结构域共价连接的ST2的第二部分。

在一些实施方案中，本公开提供一种化合物，其包含：a)结合IL-2受体的第一部分；和b)结合ST2的第二部分；其中结合IL-2受体的第一部分包含相对于野生型IL-2的突变，其相对于野生型IL-2提高结合IL-2受体的部分在受试者中的稳定性。

在一些实施方案中，本公开提供一种化合物，其包含：a)结合IL-2受体的第一部分；和b)结合ST2的第二部分；其中结合IL-2受体的第一部分相对于IL2Rβγ受体选择性地结合IL2Rαβγ受体。

在一些实施方案中，本公开提供一种化合物，其包含：a)结合IL-2受体的第一部分；和b)结合ST2的第二部分；其中结合IL-2受体的第一部分与野生型IL-2不同在于相对于野生型IL-2的N88R置换。

在本文所述化合物的一些实施方式中，第一部分包含多肽。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分包含与野生型IL-2具有至少90％同一性的肽序列。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2提高结合IL-2受体的部分在受试者中的稳定性的突变是相对于野生型IL-2的C125S置换。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分与野生型IL-2不同在于相对于野生型IL-2的T3A置换。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分是SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，结合ST2的第二部分包含多肽。在一些实施方案中，结合ST2的第二部分包含与野生型IL-33具有至少90％同一性的肽序列。在一些实施方案中，结合ST2的第二部分与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性。在一些实施方案中，结合ST2的第二部分是针对ST2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合ST2的第二部分包含SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，结合ST2的第二部分是SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分共价连接。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分通过二硫键共价连接。

在本文所述化合物的一些实施方式中，化合物还包含两个多聚化部分。在一些实施方案中，第一多聚化部分共价连接于结合IL-2受体的第一部分且第二多聚化部分共价连接于结合ST2的第二部分。在一些实施方案中，两个多聚化部分彼此共价连接。在一些实施方案中，两个多聚化部分是多肽序列。在一些实施方案中，两个多聚化部分是免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域相对于野生型免疫球蛋白Fc结构域是效应子功能缺陷的。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1免疫球蛋白Fc结构域与野生型IgG1免疫球蛋白Fc结构域不同在于相对于野生型IgG1免疫球蛋白Fc结构域的N297A置换。在一些实施方案中，每个免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，每个免疫球蛋白Fc结构域是SEQ ID NO:7。

在本文所述化合物的一些实施方式中，化合物包含与结合IL-2受体的第一部分共价连接和与第一多聚化部分共价连接的接头肽。在一些实施方案中，化合物包含与结合ST2的第二部分共价连接和与第二多聚化部分共价连接的接头肽。在一些实施方案中，化合物包含与结合IL-2受体的第一部分共价连接和与第一多聚化部分共价连接的第一接头肽，及与结合ST2的第二部分共价连接和与第二多聚化部分共价连接第二接头肽。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分在第一接头肽的N-末端，和第一多聚化部分在第一接头肽的C-末端，和结合ST2的第二部分在第二接头肽的N-末端，和第二多聚化部分在第二接头肽的C-末端。在一些实施方案中，第一接头肽和第二接头肽各自是6-20个氨基酸残基。在一些实施方案中，第一接头肽和第二接头肽各自是12-17个氨基酸残基。在一些实施方案中，第一接头肽和第二接头肽各自是作为各自独立地为丝氨酸或甘氨酸的氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，第一接头肽和第二接头肽各自是15个氨基酸残基。在一些实施方案中，第一接头肽和第二接头肽各自是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，化合物相对于ST2^-调节T细胞选择性地靶向ST2⁺调节T细胞。

在某些方面，本公开涉及治疗病症的方法，该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-40任一项的化合物。在一些实施方案中，该施用相对于受试者中的ST2-调节T细胞计数增加受试者中的ST2+调节T细胞计数。在一些实施方案中，该施用相对于受试者中的ST2-调节T细胞选择性地激活ST2+调节T细胞。在一些实施方案中，治疗有效量是约1μg/kg-约250μg/kg。在一些实施方案中，病症是炎性肌病。在一些实施方案中，炎性肌病是肌肉萎缩。在一些实施方案中，炎性肌病是多肌炎。在一些实施方案中，炎性肌病是皮肌炎。在一些实施方案中，病症是脂肪组织的炎性病症。在一些实施方案中，脂肪组织是内脏脂肪组织。在一些实施方案中，病症是结肠的炎性病症。在一些实施方案中，病症是肺的炎性病症。在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，施用是皮下的。在一些实施方案中，受试者是人。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。

附图说明

图1显示了说明表达IL-2Rαβγ和ST2的细胞的重叠的示意图。

图2显示了本公开的示例性化合物的示意表示。

图3A显示具有IL2R结合部分、ST2结合部分和它们之间的接头的化合物的示意图。

图3B显示具有与多聚化部分共价连接的IL2R结合部分、与多聚化部分共价连接的ST2结合部分和多聚化部分之间的共价键的示例性化合物的示意图。

图3C显示具有与多聚化部分共价连接的IL2R结合部分、与共价连接至多聚化部分的接头共价连接的ST2结合部分和多聚化部分之间的共价键的示例性化合物的示意图。

图3D显示具有与共价连接至多聚化部分的接头共价连接的IL2R结合部分、与多聚化部分共价连接的ST2结合部分和多聚化部分之间的共价键的示例性化合物的示意图。

图3E显示具有与共价连接至多聚化部分的接头共价连接的IL2R结合部分、与共价连接至多聚化部分的接头共价连接的ST2结合部分和多聚化部分之间的共价键的示例性化合物的示意图。

图3F显示了具有a)与共价连接至ST2结合部分的多聚化部分共价连接的IL2R结合部分，b)与共价连接至IL2R结合部分的多聚化部分共聚连接的ST2结合部分，和c)多聚化部分之间的共价键的示例性化合物的示意图。

图4A-4J显示了包含IgG1Fc区的二聚体蛋白的示意图。二聚体蛋白包含IL-33变体(C208S、C227S、C232S、C259S)，或IL-33变体和IL-2变体(N88R、C125S)的各种组合。在蛋白质名称中，“N”表示N-末端，“C”表示C-末端，“v”表示变体，“B”表示二价，和“M”表示单价。

图5A-5E显示了包含IgG1Fc区的二聚体蛋白的示意图。二聚体蛋白包含IL-2变体(N88R、C125S)和结合ST2的抗原结合片段(Fab)(Ab2或Ab4)。每个图表示两种不同的二聚体蛋白，一种含有Ab2作为Fab区，另一种含有Ab4作为Fab区。在蛋白质名称中，“N”表示N-末端，“C”表示C-末端，“v”表示变体，“B”表示二价，和“M”表示单价。

图6A显示Biacore传感图，其显示人ST2和IL-2v/IL-33v双特异性和单价IL-33分子之间的结合。

图6B显示Biacore传感图，其显示小鼠ST2和IL-2v/IL-33v双特异性&单价IL-33分子之间的结合。

图7显示Biacore传感图，其显示人IL2Rα和IL-2v/IL-33v双特异性&单价IL-33分子之间的结合。

图8A显示Biacore传感图，其显示人ST2和Ab2/IL-2v双特异性分子之间的结合。

图8B显示Biacore传感图，其显示人ST2和Ab4/IL-2v双特异性分子之间的结合。

图9A显示Biacore传感图，其显示人IL2Rα和Ab2/IL-2v双特异性分子之间的结合。

图9B显示Biacore传感图，其显示人IL2Rα和Ab4/IL-2v双特异性分子之间的结合。

图10A显示用一系列浓度的单价N88R-Fc、单价IL-33-Fc或双特异性IL2vNM-IL33vCM刺激的小鼠脾细胞悬液中ST2+调节T细胞的pSTAT5活性。

图10B显示用一系列浓度的单价N88R-Fc、单价IL-33-Fc或双特异性IL2vNM-IL33vCM刺激的小鼠脾细胞悬液中ST2-调节T细胞的pSTAT5活性。

图11A和11B显示IL33-IL2双特异性蛋白质中IL-33部分的生物活性。

具体实施方式

调节T细胞(Treg)是抑制其他免疫细胞(例如CD4+传统T细胞(Tconv)和CD8+细胞)的活性的一类CD4+CD25+T细胞。Treg是免疫系统内稳态的核心，维持对自身抗原的耐受性，并调节对外来抗原的免疫应答。白介素2(IL-2)可以强烈激活Treg，但IL-2也激活许多其他细胞类型，这可能导致严重的毒性。已经清楚的是，存在可以通过特定分子标志物的表达和通过它们在不同免疫应答中的作用来定义的Treg亚群。一个Treg亚群是ST2+Treg亚群。ST2+Treg的定义细胞表面标志物是ST2，一种细胞因子受体的组分，也称为白介素1受体样1蛋白(IL1RL1)，并且是IL-33受体的亚基。IL-33被归类为“警报素(alarmin)”，一种与急性炎症反应相关的炎性细胞因子。ST2+Treg存在于如肌肉、内脏脂肪、结肠和肺的组织中，且具有免疫调节和组织修复功能。

骨骼肌通常缺乏T细胞，但在急性肌肉损伤后，大量ST2+Treg迅速迁移到肌肉组织中。这些Treg募集到肌肉组织中和生长因子双调蛋白(AREG)的产生与肌肉卫星细胞的激活和与组织修复有关。Treg缺乏影响损伤后的肌肉修复，并且肌肉中使用IL-2-IL-2R复合物的Treg扩增在肌营养不良蛋白缺陷的肌肉萎缩动物模型中导致改善的结果。产生AREG的Treg的很大一部分是ST2+。ST2+Treg也与流感病毒感染后发炎的肺组织有关，并且与感染后的肺组织修复有关。用ST2受体的配体IL-33处理ST2+Treg增加AREG产生和组织修复。因此，增加ST2+Treg的数量或增强ST2+Treg的活性可以治疗或预防自身免疫和炎性疾病，例如炎性肌病、炎症性肌肉疾病，并改善损伤或应激后的组织愈合。

例如，已经在肌肉炎症的动物模型中确认了ST2+Treg的作用。这些动物模型中的一种是野生型小鼠的急性肌肉损伤(Burzyn等,2013,Cell 155(6):1282-1295)，且第二种模型是mdx小鼠肌肉萎缩模型，一种由肌营养不良蛋白的遗传缺陷引起的慢性肌肉炎症的模型(mdx小鼠；Villalta等，2014,Sci Transl Med 5(258):258ra142)。还在炎性肠病的小鼠模型中确认了ST2+Treg的作用(Schiering等，2014,Nature 513(7519):564-568)。

通过提供能够选择性地扩增ST2+Treg数量和/或增强ST2+Treg活性的化合物和方法，本公开使得可能对炎性和退行性疾病进行新的治疗。例如，本公开提供具有结合IL-2受体(IL-2R或IL2R)的第一部分和结合ST2的第二部分的化合物。IL-2R是在多种不同免疫细胞类型(包括T细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞)上表达的异源三聚体蛋白。这种广泛的表达模式提供了对免疫系统的多效作用和导致IL-2治疗的高度全身性毒性，并且可以使得靶向IL-2R+细胞具有挑战性。

IL2-R具有三种形式，由三种不同IL-2R蛋白的不同组合产生：α(alpha)、β(beta)和γ(gamma)。这些受体链组装以产生三种不同的受体形式：(1)低亲和力受体IL2Rα，其不发出信号；(2)中间亲和受体(IL2Rβγ)，由IL2Rβ和IL2Rγ组成，其广泛表达于CD4+传统T细胞(Tconv)、NK细胞、酸性粒细胞和单核细胞上；和(3)由IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ组成的高亲和力受体(IL2Rαβγ)，其在活化的T细胞上瞬时表达并在Treg细胞上组成型表达。传统T细胞(Tconv)是被抗原激活并参与免疫攻击的T细胞。传统T细胞包括辅助T细胞、细胞毒性T细胞和记忆T细胞。IL-2中的突变可以改变IL-2与不同IL-2R受体形式的结合亲和力。因此，本公开提供了通过包含选择性结合高亲和力受体(IL2Rαβγ)的部分来选择性地激活和扩增Treg(例如ST2+Treg)的化合物。示例性的部分包括但不限于包含一个或多个相对于野生型IL-2改变结合的突变的IL-2变体，使得IL-2变体相对中间亲和力受体和低亲和力受体选择性地结合高亲和力受体(IL2Rαβγ)。

本公开的方法和组合物涉及包含结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分的化合物，使得该化合物在其激活和扩增ST2+Treg的能力方面更具选择性和有效性。在一些实施方案中，这些化合物靶向表达IL-2受体或其特定亚型和ST2两者的细胞。例如，特异性结合IL2Rαβγ亚型的化合物可以结合表达ST2的Treg细胞。图1显示了混合Treg群体中IL-2Rα1和ST2的表达结构域和本公开的化合物可以结合的重叠区域的实例。在一些实施方案中，第一和第二部分，例如，通过免疫球蛋白Fc结构域共价连接。在一些实施方案中，化合物还包含连接IL-2受体结合部分和免疫球蛋白Fc结构域的接头和/或连接ST2结合部分和免疫球蛋白Fc结构域的接头。在一些实施方案中，该化合物可以调节负责免疫的白血细胞，例如白细胞或淋巴细胞的活性。免疫球蛋白Fc结构域可以增加分子的体内稳定性，并且接头共价连接部分和Fc结构域。通过提供与IL2受体和ST2结合的部分，本文所述的化合物可以靶向表达IL2受体和ST2两者的细胞(例如，T调节细胞)。在一些实施方案中，Fc结构域缺乏其效应子功能。示例性化合物包含结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分，其中结合IL-2受体的第一部分通过接头共价连接于第一效应子缺陷的Fc结构域和结合ST2的第二部分通过接头共价连接于第二效应子缺陷的Fc结构域，并且其中第一效应子缺陷的Fc结构域和第二效应子缺陷的Fc结构域通过二硫键共价连接。这种化合物的实例如图2所示。其他示例性化合物示于图3A-3E中，其描绘了包含在与接头和多聚化结构域(其可以是例如Fc结构域)的各种组合中的ST2结合和IL2R结合部分的化合物。这种化合物的另一个例子如图3F所示，其中IL2部分和ST2结合部分分别位于IgG Fc蛋白的N-末端和C-末端。这种蛋白质可以是反向定向的，其中ST2结合部分位于N-末端和IL2部分位于C-末端，并且可以在一个或两个ST-2结合部分和它们相应的Fc结构域之间或在一个或两个IL2R结合部分与它们相应的Fc结构域之间加入肽接头。用于治疗病症(例如炎性病症，如炎性肌病)的示例性方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的化合物。示例性病症包括但不限于肌肉萎缩和皮肌炎。

结合IL-2受体的部分

如上所述，本公开提供包含结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分的化合物。结合IL-2受体的部分可以是包含野生型IL-2的全长、更短或更长的多肽。IL-2受体结合部分可以具有野生型IL-2序列，如SEQ ID NO：2所示：(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT)，或IL-2的变体。IL-2变体可含有一个或多个偏离野生型IL-2氨基酸序列的置换、缺失或插入。残基在本文中通过单字母氨基酸代码表示，后面是IL-2氨基酸位置，例如，K35是野生型IL-2序列的第35位的赖氨酸残基。置换在本文中用单字母氨基酸代码表示，其后是IL-2氨基酸位置，然后是置换单字母氨基酸代码，例如，K35A是SEQ ID NO：2的35位赖氨酸残基用丙氨酸残基的置换。

本文的化合物可以表现出与对野生型IL-2的特异性相似或不相似的对于不同IL-2受体类别的特异性。与野生型IL-2相比，本文的化合物可表现出增加的稳定性或生物学效应。例如，与野生型IL-2相比，突变可以提供对某些IL-2受体具有增加的特异性的化合物。在一些实施方案中，化合物相对于IL2Rβγ受体选择性地结合IL2Rαβγ受体，例如，通过其IL-2结合部分。在一些实施方案中，这种选择性结合是由于与野生型IL-2序列相比IL-2序列中的一个或多个突变。例如，IL-2N88R对于与IL2Rαβγ受体的结合相对于IL2Rβγ受体是选择性的。IL-2可以与野生型IL-2一样有效地刺激表达IL2Rαβγ的PHA激活T细胞的增殖，同时表现出对表达IL2Rβγ的NK细胞的增殖的3,000倍的刺激。对IL2Rαβγ表现出增加的选择性的其他突变包括置换D20H、N88I、N88G、Q126L和Q126F。

在一些实施方案中，IL-2受体结合部分包含增强本公开化合物的稳定性的突变。例如，IL-2C125S突变通过消除未配对的半胱氨酸残基来促进稳定性，从而防止IL-2多肽的错折叠。错折叠可导致蛋白质聚集并提高多肽的体内清除率。在一些实施方案中，IL-2多肽包含产生或去除糖基化位点的突变。例如，IL-2突变T3A去除O-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，具有T3A突变的IL-2变体还包含N88R突变和/或C125S突变。在一些实施方案中，IL-2变体包含T3A、N88R和C125S突变，如SEQ ID NO：3中。

在一些实施方案中，置换发生在位置3、20、88、125和126中的一个或多个处。在一些实施方案中，置换发生在一个、两个、三个、四个或五个位置处。在一些实施方案中，IL-2变体包含位置88和125处的突变，例如N88R和C125S。在一些实施方案中，IL-2受体结合部分包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列：APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT。在一些实施方案中，IL-2变体包含位置3、88和125处的突变，例如T3A、N88R和C125S，如SEQ ID NO：3中：APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT。在一些实施方案中，IL-2变体与野生型IL-2序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变(例如，置换)。

本文的化合物包括含有与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的IL-2变体。本文的化合物包括含有与野生型IL-2氨基酸序列60％-99％相同的氨基酸序列的IL-2变体，例如，与野生型IL-2氨基酸序列80％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列85％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列90％-99％相同的氨基酸序列，或与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)95％-99相同的氨基酸序列。本文的化合物包括包含具有N88R突变的与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的IL-2变体。本文的化合物包括包含具有N88R突变的与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)60％-99％相同的氨基酸序列的IL-2变体，例如，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)80％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)85％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)90％-99％相同的氨基酸序列或与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)95％-99％相同的氨基酸序列。

实施方案还包括选择性刺激Treg细胞并且包含具有N88R和C125S突变的与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。实施方案还包括选择性刺激Treg细胞，并且包含具有N88R和C125S突变的至少与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相同的氨基酸序列的IL-2变体。本文的化合物包括包含具有N88R和C125S突变的与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)60％-99％相同的氨基酸序列的IL-2变体，例如，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)80％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)85％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)90％-99％相同的氨基酸序列或与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)95％-99％相同的氨基酸序列。

化合物还包括选择性刺激Treg细胞，并且包含与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ IDNO:2)具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的IL-2变体。化合物还包括选择性刺激Treg细胞，并且包含与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)60％-99％相同的氨基酸序列的IL-2变体，例如，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)80％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)85％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)90％-99％相同的氨基酸序列或与野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)95％-99％相同的氨基酸序列。

可以使用各种方法和软件程序来确定两个或更多个肽或核酸之间的同源性，例如NCBI BLAST、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline或另一合适的方法或算法。在一些实施方案中，基于以下参数通过FastDB计算百分同一性：错配罚分1；空位罚分1；空位大小罚分0.33；和接合罚分30。

有用算法的示例是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对从一组相关序列创建多序列比对。该算法还可以绘制一个显示用于创建比对的聚类关系的树。PILEUP参数的非限制性示例包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。

有用算法的另一个示例是BLAST算法。BLAST程序的非限制性示例是WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，例如，其大多数被设置为默认值。可调节参数例如以以下值设置：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和针对其搜索感兴趣的序列的特定数据库的组成确定。该值可以调整以提高灵敏度。

另一种有用的算法是带空位BLAST。带空位BLAST使用BLOSUM-62置换评分；阈值T参数设置为9；触发无空位延伸的双命中方法，以10+k的代价承担k的空位长度；Xu设置为16，且Xg对于数据库搜索阶段设置为40和对于算法的输出阶段设置为67。通过对应于例如大约22比特的分数来触发带空位比对。

另一种有用的工具是Clustal，用于多序列比对的一系列常用计算机程序。Clustal的最新版本包括ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。使用Clustal方法的成对比对和蛋白质序列百分同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4和DIAGONALS SAVED＝4。

突变可以设置在选定的位点处或是随机的。例如，在目标密码子或区域的随机诱变可以提供筛选活性的突变体。在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行置换突变的技术包括例如M13引物诱变和PCR诱变。例如，可以使用本文所述的测定法完成突变体的筛选。

氨基酸置换可以是单个或多个残基。插入可以是，例如，约1至约20个氨基酸残基或更多。缺失可以是，例如，约1至约20个氨基酸残基或更多。置换、缺失、插入或其任何组合可以在样品化合物中发生。

结合ST2的部分

ST2(白介素1受体样1)是膜结合的细胞因子受体和是IL-1受体家族的成员。人ST2由具有三个Ig样结构域的310个氨基酸(aa)的细胞外结构域(ECD)、21aa跨膜区段和207aa的具有细胞内TIR结构域的细胞质结构域组成(Tominaga,S.等，Biochim.Biophys.Acta1171:215和Li,H.等,2000,Genomics 67:284)。ST2结合IL-33并与IL-1受体辅助蛋白(1RAcP)异二聚化。在一些实施方案中，本公开的化合物包含结合ST2的结合部分。结合ST2的部分可以是包含野生型IL-33全长、更短或更长的多肽。ST2结合部分可以具有野生型IL-33序列，如SEQ ID NO：10(SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET)所示，或其可以是IL-33的变体。IL-33变体可含有一个或多个偏离野生型IL-33氨基酸序列的置换、缺失或插入。残基在本文中用单字母氨基酸代码接着IL-33氨基酸位置表示。置换在本文中用单字母的氨基酸代码然后IL-33氨基酸位置和接着单字母的置换氨基酸表示。在一些实施方案中，IL-33序列是人IL-33序列，例如野生型序列的残基112-170。

本文的化合物可对ST2或对ST2-1RAcP受体复合物具有增加或降低的亲和力。一些化合物可以对ST2具有增强的亲和力。其他化合物对1RAcP可具有降低的亲和力，这会导致激活IL-33受体的能力降低。与野生型IL-33相比，本文的化合物可表现出增加的稳定性或生物学效应。

可以产生对IL-33受体亚基ST2或IL1RAcP具有改变的亲和力的IL-33变体。在一些实施方案中，IL-33氨基酸序列可以相对于野生型IL-33序列在以下一个或多个位置突变：E119、Y122、D131、E144、Y146、D149、Y163、H246、N222和N226。在一些实施方案中，这些中的一个或多个处的氨基酸置换可以调节IL-33对ST2的亲和力。在一些实施方案中，IL-33氨基酸序列可以突变以改变与IL1RAcP的接触：H168、N171、E200、H201、H224、D244、K251和E261(均相对于野生型IL-33序列)。在一些实施方案中，这些中的一个或多个处的氨基酸置换可以调节IL-33对IL1RAcP的亲和力，从而调节激活受体的能力。

在一些实施方案中，ST2结合部分包含IL-33的变体，其包含例如与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。本文的化合物包括IL-33变体，其包含与野生型IL-33氨基酸序列(SEQID NO:10)60％-99％相同的氨基酸序列，例如，与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)80％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)85％-99％相同的氨基酸序列，与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)90％-99％相同的氨基酸序列或与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)95％-99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ST2结合部分与野生型IL-33氨基酸序列(SEQ ID NO:10)100％相同。

ST2结合配体可包括对ST2具有结合亲和力的抗体和抗原结合抗体片段。如本文所用，“抗体”是包含至少一个与特定靶抗原(例如，ST2)结合的互补决定区的蛋白质。抗体通常包括至少一个免疫球蛋白可变区，例如提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的氨基酸序列。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。例如，抗体可以是单克隆抗体、修饰的抗体、嵌合抗体、重构抗体或人源化抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指仅含有一个种类的能够与特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的抗体分子群体。抗体可以从商业来源获得或使用已知方法产生。抗体可以是任何免疫球蛋白类型，例如IgG、IgM、IgY、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在一个实施方案中，抗体可以是人抗体。

适用于本发明的抗原结合抗体片段包括但不限于Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、单链Fv、二聚化可变区(V区)片段(双体抗体)、二硫键稳定的V区片段(dsFv)、亲和体、抗体模拟物以及保留与有效负载(例如，ST2)的特异性结合的一个或多个分离的互补决定区(CDR)。如本文所用，“分离的”CDR是不在天然存在抗体的环境中的CDR。

可以通过用本发明的蛋白质作为免疫原免疫合适的受试者来制备多克隆抗体。可以通过标准技术随时间监测免疫受试者中的抗体滴度，例如使用固定化多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在免疫后的适当时间，例如，当特异性抗体滴度最高时，可以从受试者获得抗体产生细胞并用于通过标准技术制备单克隆抗体(mAb)，例如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等，1983,Immunol.Today 4:72)、EBV-杂交瘤技术(参见Cole等，pp.77-96In MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,1985)或三源杂交瘤(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是众所周知的(一般参见Current Protocols in Immunology,Coligan等ed.,John Wiley&Sons,New York,1994)。产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液中结合目标多肽(即ST2)的抗体来检测，例如使用标准ELISA测定法。

作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方案，可以通过用目标多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离针对ST2的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System,目录号27-9400-01和the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit,目录号240612)。另外，特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如美国专利No.5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85；Huse等(1989)Science 246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J.12:725-734中找到。

还可以制备特异性结合ST2的重组抗体。重组抗体包括但不限于嵌合和人源化单克隆抗体(包含人和非人部分)、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(参见，例如，Cabilly等，美国专利号4,816,567和Boss等，美国专利号4,816,397，其通过引用整体并入本文)。单链抗体具有抗原结合位点和由单一多肽组成。它们可以通过本领域已知的技术生产，例如使用Ladner等，美国专利号4,946,778(其全部内容通过引用并入本文)；Bird等，(1988)Science 242:423-426；Whitlow等,(1991)Methods in Enzymology 2:1-9；Whitlow等,(1991)Methods in Enzymology 2:97-105；和Huston等,(1991)Methods inEnzymology Molecular Design and Modeling:Concepts and Applications 203:46-88描述的方法。

人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见，例如，Queen，美国专利号5,585,089，其通过引用整体并入本文)。人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240:1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等(1986)Bio/Techniques 4:214；美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239:1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060中描述的方法。

更具体地，人源化抗体可以例如使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，但可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来产生。用选择的抗原(例如ST2)以正常方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生IgG、IgA和IgE抗体。关于用于产生人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论以及用于产生这种抗体的方案，参见例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。另外，公司可以使用与上述类似的技术参与提供针对所选抗原(例如ST2)的人抗体。

可以使用称为“指导选择”的技术产生识别ST2的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，Bio/technology 12:899-903)。

ST2抗体可以在产生(例如，从受试者的血液或血清)或合成后分离，并通过众所周知的技术进一步纯化。例如，可以使用蛋白A色谱法纯化IgG抗体。可以通过例如亲和色谱选择或(例如，部分纯化)或纯化对ST2特异性的抗体。例如，产生重组表达和纯化的(或部分纯化的)ST2蛋白，并共价或非共价偶联于固体支持物，例如色谱柱。然后该柱可用于从含有针对大量不同表位的抗体的样品中亲和纯化对ST2特异性的抗体，从而产生基本上纯化的抗体组合物，即基本上不含污染抗体的组合物。

结合ST2的抗体是本领域熟知的。例如，US2017/0002079描述了使用技术制备的针对人ST2的一系列ST2结合抗体(例如Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab12-Ab36)(美国专利号6,114,598；6,162,963；6,833,268；7,049,426；7,064,244，其全部内容通过引用并入本文；Green等，1994，Nature Genetics 7:13-21；Mendez等,1997,Nature Genetics 15:146-156；Green和Jakobovitis,1998,J.Ex.Med.188:483-495,Kellermann和Green,2002,Current Opinion in Biotechnology,13:593-597)。特别地，参见US2017/0002079的实施例2，其通过引用整体并入本文。针对人ST2的抗-ST2抗体也描述于WO2012/113813(例如单克隆抗体ral70)和美国专利号7087396(例如单克隆抗体2A5、FB9和HB12)，其各自通过引用整体并入本文。例如，美国专利号7087396在实施例1中描述了针对人ST2的单克隆抗体的制备。ST2结合抗体也是可商购的(例如R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,目录号MAB523和AF523)。MAB523是检测人ST2的单克隆小鼠IgG1抗体。AF523是检测人ST2的抗原亲和纯化的多克隆山羊IgG1。

IL-2R-结合部分和ST2结合部分之间的连接

IL-2R和ST2结合部分是连接的。结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分共价或非共价连接。在一些实施方案中，结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分共价连接。例如，结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分可以通过硫醚键或二硫键共价连接。在一些实施方案中，包含结合IL-2受体的第一部分和结合ST2的第二部分的化合物包含一个多聚化部分或两个多聚化部分，例如Fc结构域。例如，第一多聚化部分可以与结合IL-2的第一部分共价连接，且第二多聚化部分可以与结合ST2的第二部分共价连接。两个多聚化部分也可以彼此共价连接。在一些实施方案中，两个多聚化部分是多肽序列。例如，在一些实施方案中，二硫键共价连接第一Fc结构域和第二Fc结构域，第一Fc结构域共同连接于IL-2R-结合部分，和第二Fc结构域共同连接于ST2结合部分。

免疫球蛋白Fc结构域

在一些实施方案中，多聚化部分是免疫球蛋白Fc结构域，例如相对于相应的野生型免疫球蛋白Fc结构域缺乏效应子功能的免疫球蛋白Fc结构域。免疫球蛋白Fc结构域的非限制性实例是IgG、IgA、IgD、IgM和IgE免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1免疫球蛋白Fc结构域。

当结合到融合蛋白中时，免疫球蛋白Fc结构域具有许多治疗益处。例如，免疫球蛋白Fc结构域可以增加融合伴体蛋白的循环半衰期。

在一些实施方案中，增加的循环半衰期是由于Fc结构域阻止融合蛋白的聚集，从而增加其稳定性和减慢清除。

四种人IgG亚类在效应子功能(CDC、ADCC)、循环半衰期和稳定性方面不同。IgG1具有Fc效应子功能，并且是最丰富的IgG亚类。IgG2缺乏Fc效应子功能，但是与其他IgG2分子二聚化且由于铰链区中二硫键的扰乱而不稳定。IgG3具有Fc效应子功能，并具有长的、刚性的铰链区。IgG4缺乏Fc效应子功能，并且具有比其他亚类更短的循环半衰期。由于在铰链区仅具有单个二硫键导致不同IgG4分子之间的H链交换，IgG4二聚体是生物化学不稳定的。可以对IgG2Fc的铰链区进行Fc序列修饰以防止聚集，或者对IgG4Fc的铰链区进行Fc序列修饰以稳定二聚体。

可以产生IgG1的效应子功能缺陷的变体。例如，氨基酸置换可以在N297位进行，这是N-连接的糖基化位点的位置。在一些实施方案中，置换是N297A。该天冬酰胺残基的置换移除了糖基化位点并显著降低了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，从而防止了不需要的细胞裂解。

技术人员也可以理解各种其他效应功能缺陷的IgG1变体。这种变体的一个非限制性实例是IgG1(L234F/L235E/P331S)，其突变C1q和FcγR结合位点中的氨基酸。这些(或类似的)Fc变体可用于产生效应子缺陷的和稳定的IL-2选择性激动剂-Fc融合蛋白(IL2SA-Fc)。Fc蛋白部分的形式还可以工程化以产生稳定的单体而不是二聚体。这些修饰的Fc蛋白部分也可以与本公开的IL-2化合物组合。另外，包含IL-2-Fc H链多肽的功能性单体的异二聚体可与Fc H链多肽组合，并使用双特异性抗体技术与IL-2选择性激动剂组装。IL-2Fc融合蛋白也可以用完整的IgG抗体分子制备，在IgG部分中具有或不具有抗原特异性。此外，缺少部分铰链区的Fc变体可与本文所述的化合物和方法一起使用。

在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc部分的序列是包含N297A突变的IgG1Fc部分，例如以下所示的序列：

(SEQ ID NO:7；N297A突变粗体和下划线显示)。

在一些实施方案中，IgG1Fc部分与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

本公开的化合物可以在允许两个Ig多肽形成Fc结构域的条件下产生。两个Ig多肽可以与不同的部分缀合。在一些情况下，一个IgG多肽与IL-2部分缀合，和第二Ig多肽与结合IL2受体之外的细胞表面蛋白的部分结合。在一些实施方案中，结合部分所结合的细胞表面蛋白是ST2。

接头

Fc结构域和IL2受体结合部分或ST2结合部分之间的接合部的连接可以是：(1)两个蛋白质序列的直接融合；(2)与插入的接头肽融合；或(3)通过非肽部分的融合。在一些实施方案中，接头直接连接IL2R-结合部分和ST2结合部分。可以包括接头肽作为两个蛋白质部分之间的间隔序列。接头肽可促进组分蛋白质部分的适当蛋白质折叠、稳定性、表达和生物活性。长的柔性接头肽可由甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸组成，其中多个甘氨酸残基提供高度柔性的构象。丝氨酸或苏氨酸残基提供极性表面区域以限制肽内或与组分融合蛋白部分的疏水相互作用。在一些实施方案中，肽接头富含甘氨酸和丝氨酸，例如序列GGGGS(SEQ IDNO：31)的重复序列。在一些实施方案中，肽接头具有(GGGGS)_n(SEQ ID NO:31)的序列，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，n为3；即肽接头具有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)的序列。在一些实施方案中，IL-2受体结合部分在接头肽的N-末端，并且免疫球蛋白Fc结构域在接头肽的C-末端。在一些实施方案中，IL-2受体结合部分在接头肽的C-末端，并且免疫球蛋白Fc结构域在接头肽的N-末端。

在一些实施方案中，肽接头与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

药物组合物

本发明的药物组合物可包含本文所述的任何化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本公开的化合物与其他化学组分，例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。药物组合物有助于将本公开的化合物施用于生物体。药物组合物可以通过各种形式和途径作为药物组合物以治疗有效量施用，包括例如静脉内、皮下、肌肉内、口服、肠胃外、眼科、皮下、透皮、鼻、阴道和局部施用。

药物组合物可以以局部方式施用，例如，通过将化合物直接注射到器官中，任选地在长效制剂或缓释制剂或植入物中。药物组合物可以以快速释放制剂的形式、以延长释放制剂的形式或以中间释放制剂的形式提供。快速释放形式可以提供即释。延长释放制剂可提供控制释放或持续延迟释放。

对于口服施用，药物组合物可以通过将本公开的化合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合来配制。这些载体可用于配制液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液或悬浮液以供受试者口服摄取。用于口服可溶解制剂的溶剂的非限制性实例可包括水、乙醇、异丙醇、盐水、生理盐水、DMSO、二甲基甲酰胺、磷酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液(MOPS)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)缓冲液(PIPES)和盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)。用于口服可溶解制剂的助溶剂的非限制性实例可包括蔗糖、尿素、cremaphor、DMSO和磷酸钾缓冲剂。

可以配制药物制剂用于静脉内施用。药物组合物可以是作为油性或水性媒介中的无菌悬浮液、溶液或乳液适于肠胃外注射的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶形式的本公开化合物的水溶液。本公开的化合物的悬浮液可以作为油性注射悬浮液制备。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介(例如无菌无热原水)构建。

本公开的化合物可以局部施用，并且可以配制成多种可局部施用的组合物，例如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药用棒、香膏、乳膏和软膏。这种药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

本公开的化合物还可以配制成直肠组合物，例如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂、栓剂、胶冻栓剂或保留灌肠剂，其含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯，以及合成聚合物如聚乙烯吡咯烷酮和PEG。在组合物的栓剂形式中，低熔点蜡如脂肪酸甘油酯的混合物，任选地与可可脂组合，可以熔化。

在实施本文提供的治疗方法或用途时，将治疗有效量的本文所述化合物在药物组合物中施用于患有待治疗的疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效能以及其他因素而广泛变化。该化合物可单独使用或与作为混合物的组分的一种或多种治疗剂组合使用。

药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将本公开的化合物加工成可以药学上使用的制剂。制剂可以根据所选择的施用途径修改。包含本文所述化合物的药物组合物可以例如通过混合、溶解、乳化、包封、包埋或压缩方法制备。

药物组合物可包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和本文所述的化合物，其为游离碱或药学上可接受的盐形式。药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

制备包含本文所述化合物的组合物的方法包括将化合物与一种或多种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体一起配制以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉末、片剂、可分散颗粒、胶囊和扁囊剂。液体组合物包括，例如，其中溶解化合物的溶液、包含化合物的乳液或包含含有本文公开的化合物的脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。组合物可以是液体溶液或悬浮液、适于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式或作为乳液。这些组合物还可含有少量无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其它药学上可接受的添加剂。

适用于本发明的剂型的非限制性实例包括液体、粉末、凝胶、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、水性或油性悬浮液、乳液及其任何组合。

适用于本发明的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括粘合剂、崩解剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、滚圆剂(spheronization agent)及其任意组合。

本发明的组合物可以是例如即释形式或控释制剂。可以配制即释制剂以使化合物迅速起作用。即释制剂的非限制性实例包括易溶解的制剂。控释制剂可以是经适应以使得活性剂的释放速率和释放曲线可以与生理和时间治疗要求相匹配，或者，已经配制成以编程速率实现活性剂的释放的药物制剂。控释制剂的非限制性实例包括颗粒、延迟释放颗粒、水凝胶(例如，合成或天然来源的)、其他胶凝剂(例如，形成凝胶的膳食纤维)、基于基质的制剂(例如，包含至少一种活性成分分散于其中的聚合物材料的制剂)、基质内的颗粒、聚合物混合物和颗粒状物质。

在一些实施方案中，控释制剂是延迟释放形式。可以配制延迟释放形式以延迟化合物的作用一段延长的时间。可以配制延迟释放形式以延迟有效剂量的一种或多种化合物的释放，例如，约4小时、约8小时、约12小时、约16小时或约24小时。

控释制剂可以是持续释放形式。可以配制持续释放形式以例如在延长的时间段内维持化合物的作用。可以配制持续释放形式以在约4、约8、约12、约16或约24小时内提供有效剂量的本文所述的任何化合物(例如，提供生理学上有效的血液分布)。

药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可以在例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；及Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)中找到，其全部内容通过引用并入本文。

多种治疗剂可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，本发明化合物与抗生素组合、在其之前或之后施用。如果同时施用，多种治疗剂可以以单一、统一的形式或以多种形式提供，例如，作为多个单独的丸剂。药剂可以一起包装或分开包装，包装在单个包装中或多个包装中。一种或所有治疗剂可以多剂量施用。如果不同时，多个剂量之间的时间可以变化多达大约一个月。

本文所述的治疗剂可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用，并且施用含有治疗剂的组合物的时机可以变化。例如，组合物可以用作预防剂，并且可以连续施用于具有病症或疾病倾向的受试者以减少疾病或病症发生的可能性。可以在症状发作期间或症状发作后尽可能快地将组合物施用于受试者。治疗剂的施用可以在症状发作的前48小时内，症状发作的前24小时内，症状发作的前6小时内或者在症状发作的3小时内开始。初始施用可以通过任何实用的途径，例如使用本文描述的任何制剂通过本文描述的任何途径。可以在检测到或怀疑疾病或病症发作后，在可行的情况下尽快地施用治疗剂，并且持续疾病治疗需要的一段时间，例如，约1个月到约3个月。每个受试者的治疗长度可能变化。

本文所述的药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是包含离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装的注射剂、小瓶或安瓿。水性悬浮液组合物可以包装在单剂量的不可重新封闭的容器中。可以使用多剂量的可重新封闭的容器，例如，与防腐剂组合或不与防腐剂组合。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如，在安瓿中，或在具有防腐剂的多剂量容器中。

本文提供的药物组合物可以与其他疗法联合施用，例如化疗、放射、外科手术、抗炎剂和选定的维生素。其他药剂可以在该药物组合物之前、之后或同时施用。

根据预期的施用方式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉末、液体、悬浮液、洗剂、乳膏或凝胶，例如，适合单次施用精确剂量的单位剂型。

对于固体组合物，非毒性固体载体包括，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。

适用于本公开的剂型的非限制性实例包括液体、酏剂、纳米悬浮液、水性或油性悬浮液、滴剂、糖浆及其任何组合。适用于本公开的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括造粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、调味剂、涂层剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、植物纤维素材料和滚圆剂，以及它们的任意组合。

本发明的组合物可以作为试剂盒包装。在一些实施方案中，试剂盒包括关于组合物的施用/用途的书面说明。书面材料可以是例如标签。书面材料可以建议施用条件方法。说明书为受试者和监督医师提供了从治疗施用获得最佳临床结果的最佳指导。书面材料可以是标签。在一些实施方案中，标签可以由管理机构批准，例如美国食品和药物管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)或其他管理机构。

疾病

本公开的化合物可以应用于各种自身免疫或免疫相关的疾病或病症，例如用于治疗这些疾病或病症。例如，本公开提供治疗病症的方法，该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的本公开的化合物。在一些实施方案中，施用于有需要的受试者的化合物包含结合IL-2R的第一部分和结合ST2的第二部分，其中第一部分通过接头与第一Fc结构域共价连接，和第二部分通过接头与第二Fc结构域共价连接，并且第一和第二Fc结构域共价连接，并且进一步地其中第一和第二Fc结构域缺乏效应子功能。

自身免疫疾病包括影响器官的疾病，例如心脏、肾脏、肝脏、肺、生殖器官、消化系统或皮肤。自身免疫疾病包括影响腺体的疾病，包括内分泌腺，肾上腺、甲状腺、唾液腺和外分泌腺以及胰腺。自身免疫疾病也可以是多腺体的。自身免疫疾病可以靶向一种或多种组织，例如结缔组织、肌肉或血液。自身免疫疾病可以靶向神经系统或眼睛、耳朵或血管系统。自身免疫疾病也可以是全身性的，从而影响多个器官、组织和/或系统。在一些实施方案中，免疫相关疾病或病症是炎性疾病或病症。在一些实施方案中，炎性疾病或病症是涉及发炎的肌肉、内脏脂肪、结肠和/或肺组织的疾病或病症。

在某些实施方案中，自身免疫疾病选自移植物抗宿主病、寻常型天疱疮、系统性红斑狼疮、硬皮病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、斑秃、葡萄膜炎、视神经脊髓炎和杜氏肌肉萎缩症。

在一些实施方案中，本公开的化合物治疗影响肌肉组织的疾病，例如炎性肌病、肌肉萎缩症、免疫系统受累的肌肉疾病和涉及炎症的肌肉疾病。

炎性肌病是通常涉及肌肉的炎症和相关症状(例如肌肉无力)的疾病。肌无力可以是进行性的。与炎性肌病(例如皮肌炎)相关的症状可包括例如肌肉无力(例如近端肌肉无力)、皮疹、行走或站立后疲劳、绊倒或摔倒、吞咽困难、发音困难、呼吸困难、肌肉疼痛、肌肉松弛、体重减轻、低烧、肺部发炎、光敏感、皮肤下或肌肉中钙沉积(钙质沉着)和炎症性肌病的生物伴随物。

炎性肌病可以由过敏反应、其他疾病、药物或毒素暴露或感染因子暴露引起，或者可以是特发性的(未知原因)。炎性肌病可以是急性炎性肌病或慢性炎性肌病。炎性肌病可以影响成人和儿童(例如，青少年皮肤炎)。炎性肌病可包括影响身体其他器官或系统的症状，例如皮肤、肺、心脏、眼睛和胃肠系统。在一些实施方案中，炎性肌病是慢性炎性肌病(例如皮肌炎、多肌炎或包涵体肌炎)。

在一些实施方案中，炎性肌病可由过敏反应、另一种疾病(例如，癌症或结缔组织疾病)、有毒物质、药物或感染因子(例如，病毒)的暴露引起。在一些实施方案中，炎性肌病与狼疮、类风湿性关节炎或系统性硬化有关。在一些实施方案中，炎性肌病是特发性的。在一些实施方案中，炎性肌病选自多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎和免疫介导的坏死性肌病。在一些实施方案中，炎性肌病是皮肌炎。

炎性肌病(例如，皮肌炎)的生物伴随物包括，例如，改变的(例如，增加的)细胞因子水平(例如，I型干扰素(例如IFN-α和/或IFN-β))、白介素(如IL-6、IL-10、IL-15、IL-17和IL-18)和TNF-α)、TGF-β、B细胞活化因子(BAFF)和IFN诱导基因的过表达(例如，I型IFN诱导基因)。炎性肌病的其他生物伴随物可包括例如增加的红细胞沉降率(ESR)和/或肌酸激酶水平升高。炎性肌病的进一步的生物学伴随物可包括自身抗体，例如抗合成酶自身抗体(例如，抗-Jo1抗体)、抗信号识别颗粒抗体(抗-SRP)、抗-Mi-2抗体、抗-p155抗体、抗-PM/Sci抗体和抗-RNP抗体。

肌肉萎缩症是一组多样的、可遗传的神经肌肉障碍，其代表以一级或二级骨骼肌受累为特征的一组破坏性神经肌肉疾病。肌肉萎缩症的实例包括但不限于杜氏肌肉萎缩症、Beckers肌肉萎缩症、肢带型肌肉萎缩症、面肩胛肱型肌肉萎缩症、福山型先天性肌肉萎缩症和分区蛋白缺陷的先天肌肉萎缩。肌肉萎缩最常见的形式是杜氏肌肉萎缩症(DMD)。DMD是一种X连锁隐性遗传障碍，其特征在于编码肌营养不良蛋白的基因中的突变。大多数患者在30岁之前因呼吸或心脏衰竭而死亡。Beckers肌肉萎缩(也称为良性假性营养肌肉萎缩)与DMD相关在于它们都是由肌营养不良蛋白基因中的突变引起的。患有DMD的生物体不产生功能性肌营养不良蛋白。因此，DMD比BMD严重得多。

受试者

本公开的化合物给予需要的受试者，例如脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、绵羊、奶牛、猴、食蟹猴或人。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿和婴儿。在一些实施方案中，受试者是炎性肌病的动物模型。在一些实施方案中，受试者是具有炎性肌病的人，或具有发生炎性肌病风险的人。在一些实施方案中，受试者具有炎性肌病的家族史。在一些实施方案中，受试者携带与炎性肌病相关的基因。在一些实施方案中，受试者对与炎性肌病相关的生物标志物呈阳性。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有炎性肌病。在一些实施方案中，受试者具有与炎性肌病相关的一种或多种体征或症状，例如本文所述的一种或多种症状。

在一些实施方案中，受试者是肌肉萎缩的动物模型。在一些实施方案中，受试者是具有肌肉萎缩的人，或具有发生肌肉萎缩风险的人。在一些实施方案中，受试者具有肌肉萎缩的家族史。在一些实施方案中，受试者携带与肌肉萎缩相关的基因。在一些实施方案中，受试者对与肌肉萎缩相关的生物标志物呈阳性。在一些实施方案中，受试者被诊断患有肌肉萎缩。在一些实施方案中，受试者具有与肌肉萎缩相关的一种或多种体征或症状，例如本文所述的一种或多种症状。

给药

本文所述的药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是包含离散量制剂的包装形式。非限制性实例是小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可以包装在单剂量的不可重新封闭的容器中。可以使用多剂量的可重新封闭的容器，例如与防腐剂结合。用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如，在安瓿中，或在具有防腐剂的多剂量容器中。

本文所述的化合物可以在组合物中以每剂约0.5μg-约7000μg、约1μg-约1000μg、约1μg-约250μg、约1μg-约25μg、约5μg-约50μg、约0.5μg-约15μg或约0.5μg-约10μg的范围存在。

本文所述的化合物可以在组合物中以约0.5μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg、约100μg、约125μg、约150μg、约175μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg、约750μg、约800μg、约850μg、约900μg、约950μg、约1000μg、约1050μg、约1100μg、约1150μg、约1200μg、约1250μg、约1300μg、约1350μg、约1400μg、约1450μg、约1500μg、约1550μg、约1600μg、约1650μg、约1700μg、约1750μg、约1800μg、约1850μg、约1900μg、约1950μg、约2000μg、约2500μg、约3000μg、约3500μg、约4000μg、约4500μg、约5000μg、约5500μg、约6000μg、约6500μg、约7000μg、约7500μg、约8000μg、约9000μg、约10,000μg(10mg)、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约26mg、约27mg、约28mg、约29mg、约30mg、约31mg、约32mg、约33mg、约34mg、约35mg、约36mg、约37mg、约38mg、约39mg或约40mg的量存在。这些值中的任一个可以用于限定这些值中的任一个可以用于限定组合物中化合物的量的范围。例如，化合物可以在组合物中以约0.5μg-约40mg、约500μg-约10mg或约50μg-约5mg的范围存在。

在一些实施方案中，剂量可以以药物的量除以受试者的质量表示，例如，微克或毫克药物/千克受试者质量。在一些实施方案中，化合物以约0.5μg/kg、约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、约10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg、约20μg/kg、约25μg/kg、约30μg/kg、约35μg/kg、约40μg/kg、约45μg/kg、约50μg/kg、约55μg/kg、约60μg/kg、约65μg/kg、约70μg/kg、约75μg/kg、约80μg/kg、约85μg/kg、约90μg/kg、约95μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg/kg、约250μg/kg、约300μg/kg、约350μg/kg、约400μg/kg、约450μg/kg、约500μg/kg、约550μg/kg、约600μg/kg、约650μg/kg、约700μg/kg、约750μg/kg、约800μg/kg、约850μg/kg、约900μg/kg、约950μg/kg、约1000μg/kg、约1050μg/kg、约1100μg/kg、约1150μg/kg、约1200μg/kg、约1250μg/kg、约1300μg/kg、约1350μg/kg、约1400μg/kg、约1450μg/kg、约1500μg/kg、约1550μg/kg、约1600μg/kg、约1650μg/kg、约1700μg/kg、约1750μg/kg、约1800μg/kg、约1850μg/kg、约1900μg/kg、约1950μg/kg、约2000μg/kg、约2500μg/kg、约3000μg/kg、约3500μg/kg、约4000μg/kg、约4500μg/kg或约5000μg/kg的剂量施用。这些值中的任一个可以用于限定化合物剂量的范围。例如，在一些实施方案中，化合物以约0.5μg/kg-约250μg/kg,1μg/kg-约200μg/kg,5μg/kg-约150μg/kg、约10μg/kg-约100μg/kg、约10μg/kg-约50μg/kg、约15μg/kg-约35μg/kg或约0.5μg/kg-约5000μg/kg范围的剂量施用。

所公开的化合物可以任何所需的间隔施用。例如，化合物可以每周一次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每周7次、每周8次、每周9次或每周10次施用。每日给药之间的间隔可以是任何小时间隔，例如，每小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时、每10小时、每11小时或每12小时。该化合物可以每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次或每8周一次施用。化合物的施用可具有不规律的给药时间表以适应于施用化合物的人或接受化合物的受试者。因此，化合物可以例如每天一次、一天两次或一天三次施用。

施用的量可以是每个剂量中相同的量或剂量可以变化。例如，第一个量可以在早晨给药，第二个量可以在晚上施用。受试者可以接受高的第一剂量和较低的后续剂量。可以根据症状或疾病标志物的改善或不良反应的发生来上调或下调剂量。

药学上可接受的载体的非限制性实例包括盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。液体载体可用于制备溶液、悬浮液和乳液。本文所述的化合物可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体如水、有机溶剂或两者的混合物，或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可含有其它合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂和渗透调节剂。用于肠胃外施用的液体载体的实例包括水、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物，和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，载体可以是油性酯，例如油酸乙酯或肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体以无菌液体形式用于肠胃外施用的组合物中。溶液的pH可以是约5-约8，例如约7-约7.5。

在一些实施方案中，本公开的分子的治疗比野生型IL-2多肽的治疗更好地耐受。在一些实施方案中，治疗有效剂量的本公开分子的治疗相对于IL2(C125S)的治疗引起更少的腹泻发生率。在一些实施方案中，治疗有效量的本公开分子的治疗不会引起毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，治疗有效量的本公开分子的治疗不会引起中性粒细胞活性降低或感染风险增加。

本公开的化合物对IL-2受体具有高、中等或低亲和力。本公开的化合物对ST2具有高、中等或低亲和力。当两种受体都存在于细胞上时，对IL2R和ST2单独具有中等或低亲和力的化合物可以具有高亲合力。本公开的化合物对于单独与ST2或IL2R结合的解离常数(Kd)为例如约1pmol-1mmol、约10pmol-1mmol、约100pmol-1mmol、约1μmol-1mmol、约10μmol-约1mmol、约1μmol-约100μmol、约1μmol-约500μmol、约200μmol-约800μmol、约10μmol-约100μmol或约500μmol-约1mmol。当与ST2和IL-2R两者结合时，本公开的化合物可具有较低的表观Kd，例如，小于单独Kd的95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。

药代动力学

如本文所述，可以调节剂量以实现期望的药代动力学(PK)或药效学特征，例如期望的或有效的血液分布。

药代动力学和药效学数据可通过各种实验技术获得。描述特定组合物的合适的药代动力学和药效学特征组分可因人类受试者中药物代谢的变异而变化。药代动力学和药效学特征可以基于一组受试者的平均参数的确定。受试者的组包括适合于确定代表性平均值的任何合理数量的受试者，例如，5个受试者、10个受试者、15个受试者、20个受试者、25个受试者、30个受试者、35个受试者或更多。例如，通过计算对于所测量的每个参数所有受试者测量值的平均来确定平均值。如本文所述，可以调节剂量以实现期望的药代动力学或药效学特征，例如期望的或有效的血液分布。

药效学参数可以是适合于描述本发明的组合物的任何参数。例如，药效学特征可以在施用后约0分钟、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约31分钟、约32分钟、约33分钟、约34分钟、约35分钟、约36分钟、约37分钟、约38分钟、约39分钟、约40分钟、约41分钟、约42分钟、约43分钟、约44分钟、约45分钟、约46分钟、约47分钟、约48分钟、约49分钟、约50分钟、约51分钟、约52分钟、约53分钟、约54分钟、约55分钟、约56分钟、约57分钟、约58分钟、约59分钟、约60分钟、约0小时、约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、约10.5小时、约11小时、约11.5小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约16.5小时、约17小时、约17.5小时、约18小时、约18.5小时、约19小时、约19.5小时、约20小时、约20.5小时、约21小时、约21.5小时、约22小时、约22.5小时、约23小时、约23.5小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天的时间获得。

药代动力学参数可以是适合于描述本发明的组合物的任何参数。C_max可以例如，不小于约1ng/mL；不小于约5ng/mL；不小于约10ng/mL；不小于约15ng/mL；不小于约20ng/mL；不小于约25ng/mL；不小于约50ng/mL；不小于约75ng/mL；不小于约100ng/mL；不小于约200ng/mL；不小于约300ng/mL；不小于约400ng/mL；不小于约500ng/mL；不小于约600ng/mL；不小于约700ng/mL；不小于约800ng/mL；不小于约900ng/mL；不小于约1000ng/mL；不小于约1250ng/mL；不小于约1500ng/mL；不小于约1750ng/mL；不小于约2000ng/mL；不小于约2500ng/mL；或适合于描述本文所述的化合物的药代动力学特征的任何其它C_max。当通过静脉内注射例如，以50μg/kg施用时，C_max可以是例如，血液中约5-约10,000ng/mL、约50-约10,000ng/mL、约500-约10,000ng/mL、约5000-约10,000ng/mL、约1000-约5,000ng/mL、约1000-约3,000ng/mL、约5,000-约8,000ng/mL或约500-约1000ng/mL。当通过皮下内注射例如，以50μg/kg施用时，C_max可以是例如，血液中约5-约50ng/mL、约50-约500ng/mL、约100-约250ng/mL、约1000-约5000ng/mL、约1000-约2000ng/mL、约2000-约5000ng/mL、约5000-约10000ng/mL或约5000-约7000ng/mL。C_max可以取决于接受的化合物的剂量。接受的剂量可以是50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg或1000μg/kg。

本文所述的化合物的T_max可以例如，不大于约0.5小时、不大于约1小时、不大于约1.5小时、不大于约2小时、不大于约2.5小时、不大于约3小时、不大于约3.5小时、不大于约4小时、不大于约4.5小时、不大于约5小时、不大于约5.5小时、不大于约6小时、不大于约6.5小时、不大于约7小时、不大于约7.5小时、不大于约8小时、不大于约8.5小时、不大于约9小时、不大于约9.5小时、不大于约10小时、不大于约10.5小时、不大于约11小时、不大于约11.5小时、不大于约12小时、不大于约12.5小时、不大于约13小时、不大于约13.5小时、不大于约14小时、不大于约14.5小时、不大于约15小时、不大于约15.5小时、不大于约16小时、不大于约16.5小时、不大于约17小时、不大于约17.5小时、不大于约18小时、不大于约18.5小时、不大于约19小时、不大于约19.5小时、不大于约20小时，或适合于描述本文所述的化合物的药代动力学特征的任何其它T_max。T_max可以是例如，约0.1小时-约24小时；约0.1小时-约0.5小时；约0.5小时-约1小时；约1小时-约1.5小时；约1.5小时-约2小时；约2小时-约2.5小时；约2.5小时-约3小时；约3小时-约3.5小时；约3.5小时-约4小时；约4小时-约4.5小时；约4.5小时-约5小时；约5小时-约5.5小时；约5.5小时-约6小时；约6小时-约6.5小时；约6.5小时-约7小时；约7小时-约7.5小时；约7.5小时-约8小时；约8小时-约8.5小时；约8.5小时-约9小时；约9小时-约9.5小时；约9.5小时-约10小时；约10小时-约10.5小时；约10.5小时-约11小时；约11小时-约11.5小时；约11.5小时-约12小时；约12小时-约12.5小时；约12.5小时-约13小时；约13小时-约13.5小时；约13.5小时-约14小时；约14小时-约14.5小时；约14.5小时-约15小时；约15小时-约15.5小时；约15.5小时-约16小时；约16小时-约16.5小时；约16.5小时-约17小时；约17小时-约17.5小时；约17.5小时-约18小时；约18小时-约18.5小时；约18.5小时-约19小时；约19小时-约19.5小时；约19.5小时-约20小时；约20小时-约20.5小时；约20.5小时-约21小时；约21小时-约21.5小时；约21.5小时-约22小时；约22小时-约22.5小时；约22.5小时-约23小时；约23小时-约23.5小时；或约23.5小时-约24小时。

本文所述的化合物的AUC_(0-inf)(也称为AUC_(0-∞))或AUC_(last)可以例如，不小于约1ng·hr/mL、不小于约5ng·hr/mL、不小于约10ng·hr/mL、不小于约20ng·hr/mL、不小于约30ng·hr/mL、不小于约40ng·hr/mL、不小于约50ng·hr/mL、不小于约100ng·hr/mL、不小于约150ng·hr/mL、不小于约200ng·hr/mL、不小于约250ng·hr/mL、不小于约300ng·hr/mL、不小于约350ng·hr/mL、不小于约400ng·hr/mL、不小于约450ng·hr/mL、不小于约500ng·hr/mL、不小于约600ng·hr/mL、不小于约700ng·hr/mL、不小于约800ng·hr/mL、不小于约900ng·hr/mL、不小于约1000ng·hr/mL、不小于约1250ng·hr/mL、不小于约1500ng·hr/mL、不小于约1750ng·hr/mL、不小于约2000ng·hr/mL、不小于约2500ng·hr/mL、不小于约3000ng·hr/mL、不小于约3500ng·hr/mL、不小于约4000ng·hr/mL、不小于约5000ng·hr/mL、不小于约6000ng·hr/mL、不小于约7000ng·hr/mL、不小于约8000ng·hr/mL、不小于约9000ng·hr/mL、不小于约10,000ng·hr/mL、不小于约11,000ng·hr/mL、不小于约12,000ng·hr/mL、不小于约13,000ng·hr/mL、不小于约14,000ng·hr/mL、不小于约15,000ng·hr/mL、不小于约16,000ng·hr/mL、不小于约17,000ng·hr/mL、不小于约18,000ng·hr/mL、不小于约19,000ng·hr/mL、不小于约20,000ng·hr/mL，或适合于描述本文所述的化合物的药代动力学特征的任何其它AUC_(0-inf)。化合物的AUC_(0-inf)可以是例如，约1ng·hr/mL-约10,000ng·hr/mL；约1ng·hr/mL-约10ng·hr/mL；约10ng·hr/mL-约25ng·hr/mL；约25ng·hr/mL-约50ng·hr/mL；约50ng·hr/mL-约100ng·hr/mL；约100ng·hr/mL-约200ng·hr/mL；约200ng·hr/mL-约300ng·hr/mL；约300ng·hr/mL-约400ng·hr/mL；约400ng·hr/mL-约500ng·hr/mL；约500ng·hr/mL-约600ng·hr/mL；约600ng·hr/mL-约700ng·hr/mL；约700ng·hr/mL-约800ng·hr/mL；约800ng·hr/mL-约900ng·hr/mL；约900ng·hr/mL-约1,000ng·hr/mL；约1,000ng·hr/mL-约1,250ng·hr/mL；约1,250ng·hr/mL-约1,500ng·hr/mL；约1,500ng·hr/mL-约1,750ng·hr/mL；约1,750ng·hr/mL-约2,000ng·hr/mL；约2,000ng·hr/mL-约2,500ng·hr/mL；约2,500ng·hr/mL-约3,000ng·hr/mL；约3,000ng·hr/mL-约3,500ng·hr/mL；约3,500ng·hr/mL-约4,000ng·hr/mL；约4,000ng·hr/mL-约4,500ng·hr/mL；约4,500ng·hr/mL-约5,000ng·hr/mL；约5,000ng·hr/mL-约5,500ng·hr/mL；约5,500ng·hr/mL-约6,000ng·hr/mL；约6,000ng·hr/mL-约6,500ng·hr/mL；约6,500ng·hr/mL-约7,000ng·hr/mL；约7,000ng·hr/mL-约7,500ng·hr/mL；约7,500ng·hr/mL-约8,000ng·hr/mL；约8,000ng·hr/mL-约8,500ng·hr/mL；约8,500ng·hr/mL-约9,000ng·hr/mL；约9,000ng·hr/mL-约9,500ng·hr/mL；约9,500ng·hr/mL-约10,000ng·hr/mL；约10,000ng·hr/mL-约10,500ng·hr/mL；约10,500ng·hr/mL-约11,000ng·hr/mL；约11,000ng·hr/mL-约11,500ng·hr/mL；约11,500ng·hr/mL-约12,000ng·hr/mL；约12,000ng·hr/mL-约12,500ng·hr/mL；约12,500ng·hr/mL-约13,000ng·hr/mL；约13,000ng·hr/mL-约13,500ng·hr/mL；约13,500ng·hr/mL-约14,000ng·hr/mL；约14,000ng·hr/mL-约14,500ng·hr/mL；约14,500ng·hr/mL-约15,000ng·hr/mL；约15,000ng·hr/mL-约15,500ng·hr/mL；约15,500ng·hr/mL-约16,000ng·hr/mL；约16,000ng·hr/mL-约16,500ng·hr/mL；约16,500ng·hr/mL-约17,000ng·hr/mL；约17,000ng·hr/mL-约17,500ng·hr/mL；约17,500ng·hr/mL-约18,000ng·hr/mL；约18,000ng·hr/mL-约18,500ng·hr/mL；约18,500ng·hr/mL-约19,000ng·hr/mL；约19,000ng·hr/mL-约19,500ng·hr/mL；或约19,500ng·hr/mL-约20,000ng·hr/mL。例如，当以50μg/kg静脉内施用时化合物的AUC_(0-inf)可以是约8500ng·hr/mL，或者当以50μg/kg皮下内施用时是约4000ng·hr/mL。

本文所述的化合物的血浆浓度可以例如，不小于约1ng/mL、不小于约5ng/mL、不小于约10ng/mL、不小于约15ng/mL、不小于约20ng/mL、不小于约25ng/mL、不小于约50ng/mL、不小于约75ng/mL、不小于约100ng/mL、不小于约150ng/mL、不小于约200ng/mL、不小于约300ng/mL、不小于约400ng/mL、不小于约500ng/mL、不小于约600ng/mL、不小于约700ng/mL、不小于约800ng/mL、不小于约900ng/mL、不小于约1000ng/mL、不小于约1200ng/mL，或本文所述的化合物的任何其它血浆浓度。血浆浓度可以是例如，约1ng/mL-约2,000ng/mL；约1ng/mL-约5ng/mL；约5ng/mL-约10ng/mL；约10ng/mL-约25ng/mL；约25ng/mL-约50ng/mL；约50ng/mL-约75ng/mL；约75ng/mL-约100ng/mL；约100ng/mL-约150ng/mL；约150ng/mL-约200ng/mL；约200ng/mL-约250ng/mL；约250ng/mL-约300ng/mL；约300ng/mL-约350ng/mL；约350ng/mL-约400ng/mL；约400ng/mL-约450ng/mL；约450ng/mL-约500ng/mL；约500ng/mL-约600ng/mL；约600ng/mL-约700ng/mL；约700ng/mL-约800ng/mL；约800ng/mL-约900ng/mL；约900ng/mL-约1,000ng/mL；约1,000ng/mL-约1,100ng/mL；约1,100ng/mL-约1,200ng/mL；约1,200ng/mL-约1,300ng/mL；约1,300ng/mL-约1,400ng/mL；约1,400ng/mL-约1,500ng/mL；约1,500ng/mL-约1,600ng/mL；约1,600ng/mL-约1,700ng/mL；约1,700ng/mL-约1,800ng/mL；约1,800ng/mL-约1,900ng/mL；或约1,900ng/mL-约2,000ng/mL。

药效学参数可以是适合于描述本发明的组合物的任何参数。例如，药效学特征可以表现出增加的Treg细胞计数，例如，约24小时、约48小时、约72小时或1周。

可以对于用本发明方法施用的化合物计算的药效学和药代动力学参数的非限制性实例包括：a)施用的药物量，其可以表示为剂量D；b)给药间隔，其可表示为τ；c)药物分布的表观体积，其可以表示为分布容积V_d，其中V_d＝D/C₀；d)给定血浆体积中的药物量，其可表示为浓度C₀或C_ss，其中C₀或C_ss＝D/Vd，并且可表示为多个样品的平均血浆浓度；e)药物的半衰期t_1/2，其中t_1/2＝ln(2)/k_e；f)药物从体内移除的速率k_e，其中k_e＝ln(2)/t_1/2＝CL/V_d；g)平衡方程式K_in所需的输注速率，其中K_in＝C_ss.CL；h)单剂量施用后浓度-时间曲线的积分，其可表示为AUC_0-∞，其中或者在稳态中，其可表示为AUCτ,ss，其中i)每单位时间药物清除的血浆体积，其可表示为CL(清除率)，其中CL＝V_d.k_e＝D/AUC；j)药物的全身可用分数，其可表示为f，其中k)施用后药物的峰值血药浓度C_max；l)药物达到C_max所需的时间，t_max；m)在下一施用之前药物达到的最低浓度C_min；和n)稳态下一个给药间隔内的峰谷波动，其可以表示为 其中

本公开的化合物在施用于受试者时可以具有高稳定性。施用的化合物可以具有大于约6hrs、大于约7hrs、大于约8hrs、大于约9hrs、大于约10hrs、大于约11hrs、大于约12hrs、大于约13hrs、大于约14hrs、大于约15hrs、大于约16hrs、大于约17hrs、大于约18hrs、大于约19hrs、大于约20hrs、大于约21hrs、大于约22hrs、大于约23hrs、大于约24hrs、大于约25hrs、大于约26hrs、大于约27hrs、大于约28hrs、大于约29hrs、大于约30hrs、大于约31hrs、大于约32hrs、大于约33hrs、大于约34hrs、大于约35hrs、大于约36hrs、大于约37hrs、大于约38hrs、大于约39hrs、大于约40hrs、大于约41hrs、大于约42hrs、大于约43hrs、大于约44hrs、大于约45hrs、大于约46hrs、大于约47hrs、大于约48hrs、大于约49hrs、大于约50hrs、大于约51hrs、大于约52hrs、大于约53hrs、大于约54hrs、大于约55hrs、大于约56hrs、大于约57hrs、大于约58hrs、大于约59hrs、大于约60hrs、大于约61hrs、大于约62hrs、大于约63hrs或大于约64hrs的生理半衰期。

本公开的化合物的半衰期可基于施用剂量而变化。例如，以50μg/kg的剂量施用时化合物的半衰期可短于相同化合物以100μg/kg或250μg/kg的剂量施用时的半衰期。化合物的半衰期可根据使用的施用途径而变化。如果化合物皮下施用而不是静脉内施用，则化合物的半衰期可以更长。例如，皮下递送的化合物的半衰期可以在约15小时和约25小时之间，而静脉内递送的化合物的半衰期可以在约5小时和约15小时之间。在一些实施方案中，以50μg/kg静脉内施用时化合物的半衰期是约6hrs-约14hrs、约7hrs-约13小时、约8hrs-约12hrs或约9hrs-约11hrs。在一些实施方案中，以50μg/kg静脉内施用时化合物的半衰期是约5hrs、约6hrs、约7hrs、约8hrs、约9hrs、约10hrs、约11hrs、约12hrs、约13hrs、约14hrs或约15hrs。在一些实施方案中，以50μg/kg皮下施用时化合物的半衰期是约15hrs-约27hrs、约16hrs-约26小时、约17hrs-约25hrs、约18hrs-约24hrs、约19hrs-约23hrs或约20hrs-约22hrs。在一些实施方案中，以50μg/kg皮下施用时化合物的半衰期是约10hrs、约11hrs、约12hrs、约13hrs、约14hrs、约15hrs、约16hrs、约17hrs、约18hrs、约19hrs、约21hrs、约22hrs、约23hrs、约24hrs、约25hrs、约26hrs、约27hrs、约28hrs、约29hrs或约30hrs。对于静脉内递送的化合物，化合物从血液中的清除可以比皮下递送的化合物更快。

二聚体蛋白的产生：异二聚体和同二聚体

在一些实施方案中，本公开的化合物是异二聚体，例如，包含作为第一融合蛋白的部分的IL2R-结合部分(例如IL-2或IL-2变体)和作为第二融合蛋白的部分的ST2结合部分(例如IL-33、IL-33变体、结合ST2的抗体或其抗原结合片段)的异二聚体。在一些实施方案中，第一和第二融合蛋白各自包含IgG Fc结构域，例如IgG1Fc结构域或其变体。异二聚体可以通过单独表达两种组成重组蛋白，纯化它们，并在体外将它们组合以形成二硫键连接的异二聚体来产生。异二聚体Fc融合蛋白也可以使用“杵-臼”方法在用两种组成cDNA构建体转染的单细胞中制备。通过该策略，将突变引入两条Fc多肽链之间的CH2-CH3界面中，其阻止同型二聚体的形成，但形成促进异二聚体形成的互补界面。以这种方式，异二聚体Fc融合蛋白可以在表达重组蛋白的宿主细胞内形成并分泌为异二聚体蛋白。以下是两个在例如人IgG1背景上的Fc构建体的例子。突变的残基T366Y和Y407T以粗体和下划线表示，N297A残基用下划线表示。

(A)IgG1Fc(N297A；T366Y):

(B)IgG1Fc(N297A；Y407T):

两个不同的结合部分，例如IL-2和IL-33，可以分别附接到Fc序列(A)和(B)，以构建异二聚体蛋白。

在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG1Fc结构域，其包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V(例如SEQ ID NO：4)；和第二融合蛋白包含突变T350V、T366L、K392L和T394W(例如SEQ ID NO：5)。据报道，此类突变可改善正确的配对和稳定性(Von Kreudenstein等，2013，mAbs 5：646-654；WO 2014082179A1)。示例性的人IgG1Fc结构域序列如下所示，其中N297A突变加下划线，T350V、L351Y、F405A、Y407V、T350V、T366L、K392L和T394W突变以粗体和下划线表示。

(A)IgG1Fc(N297A、T350V、L351Y、F405A和Y407V)

(B)IgG1Fc(N297A、T350V、T366L、K392L和T394W)

示例性异二聚体显示在图4A、4B、4C、4D和4E中。

在一些实施方案中，本公开的化合物是同二聚体，例如，包含两个相同的融合蛋白的同二聚体，每个含有IL2R-结合部分(例如IL-2或IL-2变体)和ST2结合部分(例如IL-33、IL-33变体、结合ST2的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，两个相同的融合蛋白各自包含IgG Fc结构域，例如IgG1Fc结构域或其变体。在具体实施方案中，IgG1Fc结构域是包含N297A突变的人IgG1Fc结构域(例如SEQ ID NO：7)。示例性同二聚体显示在图1F和1G中。

IL2R-结合部分(例如IL-2或IL-2变体)和ST2结合部分(例如IL-33、IL-33变体、结合ST2的抗体或其抗原结合片段)可以直接或通过肽接头(例如G4S接头)附接于IgG Fc结构域的N-末端或C-末端。可以使用IL2R-结合部分和ST2结合部分的各种组合。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含第一融合蛋白(其包含IgG Fc结构域N-末端的IL2R-结合部分)和第二融合蛋白(其包含IgG Fc结构域C-末端的ST2结合部分)(参见，例如，图4A)。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG Fc结构域N-末端的IL2R-结合部分，和第二融合蛋白包含IgG Fc结构域N-末端的ST2结合部分(参见，例如，图4B和5D)。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分，并且第二融合蛋白包含与IgG Fc结构域N-末端的ST2结合部分(参见，例如，图4C和5C)。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgGFc结构域C-末端的IL2R-结合部分，并且第二融合蛋白包含IgG Fc结构域C-末端的ST2结合部分。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG Fc结构域N末端的ST2结合部分和IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分，并且第二融合蛋白包含IgG Fc结构域N-末端的ST2结合部分(参见，例如，图4D和5B)。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG Fc结构域N末端的ST2结合部分和IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分，并且第二融合蛋白包含IgG Fc结构域N-末端的IL2R-结合部分(参见，例如，图4E)。在一些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白均包含IgG Fc结构域N末端的ST2结合部分和IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分(参见，例如，图4F和图5A)。在一些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白均包含IgGFc结构域N末端的IL2R-结合部分和IgG Fc结构域C-末端的ST2结合部分(参见，例如，图4G)。在一些实施方案中，第一融合蛋白包含IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分，并且第二融合蛋白包含IgG Fc结构域N-末端的ST2结合部分和IgG Fc结构域C-末端的IL2R-结合部分(参见，例如，图5E)。

在一些实施方案中，二聚体蛋白包含至少一个IL2R-结合部分(例如IL-2或IL-2变体)和至少一个ST2结合部分(例如IL-33、IL-33变体、结合ST2的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，二聚体蛋白仅包含一个IL2R-结合部分。在一些实施方案中，二聚体蛋白仅包含一个ST2结合部分。

在一些实施方案中，二聚体蛋白包含至少两个IL2R结合部分。例如，在一些实施方案中，第一和第二融合蛋白各自含有至少一个IL2R-结合部分。参见，例如，图4E、4F和4G。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含至少两个ST2结合部分。例如，在一些实施方案中，第一和第二融合蛋白各自含有至少一个ST2结合部分。参见，例如，图4D、4F和4G。

在本文所述的任何实施方案中，IL2R-结合部分和ST2结合部分可以通过肽接头(例如，G₄S接头)连接至IgG Fc结构域。二聚体蛋白可含有1、2、3、4或更多个肽接头。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含至少1、2、3或4个肽接头。

在一些实施方案中，IL2R-结合部分和/或ST2结合部分通过肽键直接与IgG Fc结构域融合，即在结合部分和IgG Fc结构域之间不添加肽接头。在一些实施方案中，二聚体蛋白不包含肽接头。

在一些实施方案中，二聚体蛋白的第一融合蛋白配置为使得IL-2结合部分(例如人IL-2蛋白结构域或其变体)的C-末端通过肽键与第一肽接头结构域的N末端融合；并且第一IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与第一肽接头结构域的C-末端融合。在一些实施方案中，二聚体蛋白的第二融合蛋白配置为使得第二IgG Fc蛋白结构域的C-末端通过肽键与第二肽接头结构域的N-末端融合；并且结合ST2的蛋白结构域的N-末端通过肽键与第二肽接头结构域的C-末端融合。参见，例如，图4A。在一些实施方案中，二聚体蛋白的第二融合蛋白配置为使得ST2结合部分的C-末端通过肽键与第二肽接头结构域的N-末端并融合；且第二IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与第二肽接头结构域的C-末端融合。参见，例如，图4B。

在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ IDNO:29的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。在一些实施方案中，二聚体蛋白包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的融合蛋白。

序列表中序列的描述

实施例

实施例1.ST2和IL2R靶向双特异性分子的构建

构建了靶向ST2(IL-33受体)和IL-2高亲和力受体的双特异性分子。所有构建的分子列于下表1和2中。它们的示意图如图4和5所示。

表1和图4中的双特异性分子是Fc融合蛋白，其由作为IL-2高亲和力受体激动剂(即IL-2变体)的受体靶向部分和IL-33变体组成。每个分子在N或C-末端含有单价或二价受体靶向部分。肽接头(G₄S)₃连接人IgG1Fc结构域和受体靶向部分。Fc结构域含有置换N297A以降低FcgR和C1q结合，从而降低Fc效应子功能。IL-33部分包含人IL-33的Ser112-Thr270片段，其是IL-33蛋白的生物活性形式。另外，IL-33部分含有置换C208S、C227S、C232S和C259S。已报道半胱氨酸至丝氨酸置换防止IL-33被氧化失活(Cohen等，2015，NatureCommun 6：8327；WO2016/156440)。选择该变体以促进在HEK293细胞中产生含活性IL-33变体的蛋白质。IL-2受体激动剂是133个氨基酸的人IL-2变体，其相对于野生型人IL-2序列(SEQ ID NO：2)包含置换N88R和C125S。

表2和图5中的双特异性分子由人IL-2变体(N88R、C125S)和抗ST2抗体的抗原结合片段(Fab)组成。作为概念验证，从公开的专利申请(US2017/0002079A1)选择两种抗ST2mAb，Ab2和Ab4。每个双特异性分子对于抗ST2抗原结合片段是单价的或二价的，并且通过肽接头(G₄S)₃在N或C-末端与IL-2受体激动剂共价连接。

由于潜在的同二聚体污染，异二聚体Fc蛋白的产生可能是具有挑战性的。该实施例中的所有异二聚体分子在Fc结构域上具有突变以减少不需要的同二聚体配对。突变包括一条链上的T350V、L351Y、F405A和Y407V；和另一条链上的T350V、T366L、K392L和T394W。据报道，此类突变可改善正确的配对和稳定性(Von Kreudenstein等，2013，mAbs 5：646-654；WO 2014082179A1)。

表1.包含人IgG1Fc区和人IL-33变体(C208S,C227S,C232S,C259S)或人IL-2变体(N88R,C125S)和人IL-33变体的组合的二聚体蛋白。蛋白质的示意图在图4A-4J中提供。在二聚体蛋白名称中，“N”表示与Fc结构域的N-末端融合，“C”表示C-末端融合，“M”表示单价，“B”表示双价和“v”表示变体。

表2.包含Fc区、抗-ST2抗体的抗原结合片段和IL-2变体(N88R,C125S)的二聚体蛋白。蛋白质的示意图在图5A-5E中提供。

所有分子在瞬时转染的HEK293细胞中产生，并通过蛋白A亲和色谱然后尺寸排阻色谱纯化。由于相对于IL2vNM-IL33vCM显著降低的蛋白质表达水平(图4A)，以下分子不包括在结合表征中：IL33vNM-IL2vCM(图4C)、IL33vNB-IL2vCM(图4D)、IL2vNB-IL33vCM(图4E)、IL33vNB-IL2vCB(图4F)和IL2vNB-IL33vCB(图4G)。

实施例2.IL33-IL2v双特异性分子的结合特征

使用Biacore T200仪器(GE)通过表面等离振子共振(SPR)评估双特异性蛋白质与ST2(Sino Biological)和IL2Ra(Lake Pharma，Inc.)的细胞外结构域(ECD)的结合。通过NHS-EDS偶联将抗His标签抗体(GenScript)固定在CM4芯片(GE)上，并在25℃下在HBS-EP+缓冲液(GE)中进行结合反应。His标记的ST2ECD蛋白被抗His标签抗体包被的芯片捕获。

对于ST2结合，组氨酸标记的人或小鼠ST2ECD蛋白作为配体捕获在芯片上。双特异性分子作为分析物以50μl/min的流速注射60秒，并允许对人ST2解离200秒，和对小鼠ST2解离120秒。双特异性分子以不同浓度制备(对于人ST2相互作用0.12nM-10nM，3倍稀释；和对于小鼠ST2相互作用2.5nM-200nM，3倍稀释)。用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片表面。使用Biacore Evaluation Software Version2.0将结合和解离信号拟合于1：1结合，以产生动力学常数(k_a&k_d)并计算解离常数(K_d)。

传感图显示在图6A和6B中；且表3总结了动力学常数和解离常数。IL2vNM-IL33vCM和IL2vNM-IL33vNM与人ST2结合，其K_d值范围为0.17-0.3nM，略低于先前报道的wt IL-33和ST2相互作用(K_d＝0.4-0.7nM)(Lingel等，2009，Structure 17(10)：1398-1410；Liu等，2013，PNAS 110(37)：14918-14923)。这些蛋白质与小鼠ST2结合，但亲和力降低。所有双特异性分子和单价IL-33分子显示出与人ST2相当的亲和力。然而，IL2vNM-IL33vCM对小鼠ST2显示出比IL2vNM-IL33NM更高的亲和力(>10倍)。此外，IL33vCM对小鼠ST2的亲和力高于IL33vNM。这表明C-末端IL-33定位对小鼠ST2的亲和力高于N-末端IL-33。

此外，IL2vNM-IL33vNM样品含有可通过SDS PAGE检测的IL2v同二聚体污染，而同二聚体在IL2vNM-IL33vCM样品中检测不到。总之，C-末端IL-33双特异性蛋白IL2vNM-IL33vCM对小鼠ST2表现出更高的亲和力，并表达为更均一的异二聚体蛋白。因此，其在实施例4中选择用于小鼠T细胞的生物活性测定。

表3.与人和小鼠ST2ECD蛋白的结合的分析

表4.蛋白质与ST2ECD和IL2Ra ECD两者的同时结合

为了测试双特异性分子是否同时结合ST2和IL-2Rα两者，双特异性分子被固定在芯片上的组氨酸标记的人ST2捕获。随后，以50μl/min的流速将人IL2Rα作为分析物注射50秒并使其解离60秒。IL2Rα以各种浓度制备(2.5nM-200nM，3倍稀释)。用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片表面。使用Biacore Evaluation Software Version 2.0将结合和解离信号拟合于1：1结合以产生动力学常数(k_a&k_d)并计算解离常数(K_d)。

传感图显示在图7中，并且动力学常数和解离常数总结在上表4中。IL2vNM-IL33vCM和IL2vNM-IL33vNM以与先前报道的值相当的K_d值(26-32nM)与人IL2Rα结合(Landgraf BE等，1992，J Biol Chem.267(26)：18511-9；Myszka DG等，1996，ProteinSci.5(12)：2468-78；Shanafelt AB等，2000，Nat Biotechnol.(11)：1197-202)。这些数据显示IL-2v部分保留IL2Ra结合；并且双特异性分子能够同时与ST2和IL2Ra两者结合，因为它们在与ST2蛋白结合的同时与IL2Ra结合。

实施例3.抗-ST2/IL2v双特异性分子的结合特征

通过表面等离振子共振(SPR)以类似于实施例2中所述的方式评估抗ST2/IL2v双特异性蛋白质与人ST2和IL2Ra的结合。

对于ST2结合，组氨酸标记的人ST2ECD蛋白作为配体捕获在芯片上。将由抗ST2mAb的Fab(Ab2)和IL-2v组成的Ab2-IL2v双特异性分子作为分析物以50μl/min的流速注射400秒并使其解离600秒。Ab4-IL2v双特异性分子以各种浓度(0.012nM-1nM，3倍稀释)制备。将由抗-ST2mAb的Fab，Ab4和IL-2v组成的Ab4-IL2v双特异性分子以50μl/min的流速作为分析物注射200秒并使其解离400秒。Ab4-IL2v双特异性分子以各种浓度(0.062nM-5nM，3倍稀释)制备。用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片表面。使用Biacore Evaluation SoftwareVersion 2.0将单价抗-ST2双特异性分子的结合和解离信号拟合于1：1结合以产生动力学常数(k_a&k_d)并计算解离常数(K_d)。

传感图显示在图8A和8B中；且动力学常数和解离常数总结在下表5中。所有双特异性分子均表现出与ST2蛋白的明显结合。与报道的值(专利US2017/0002079A1中34pM)相比，单价Ab2-IL2v双特异性分子的K_d值范围为94pM至137pM。与报道的值(专利US2017/0002079A1中的301pM)相比，单价Ab4/IL2v双特异性分子的K_d值范围为289pM至378pM。

表5.与人ST2ECD蛋白结合的分析

为了测试双特异性分子是否同时结合ST2和IL2Ra两者，双特异性分子通过固定在芯片上的组氨酸标记的人ST2捕获。随后，以50μl/min的流速将IL2Rα作为分析物注射50秒并使其解离60秒。IL2Ra以各种浓度制备(2.5nM-200nM，3倍稀释)。用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片表面。使用Biacore Evaluation Software Version 2.0将结合和解离信号拟合于1：1结合以产生动力学常数(k_a&k_d)并计算解离常数(K_d)。

传感图显示在图9A和9B中；且动力学常数和解离常数总结在下表6中。它们都以与之前报道的值相当的K_d值(25-43nM)与人IL2Rα结合。这表明IL2v部分保留IL2Ra结合；且双特异性分子能够同时与ST2和IL2Ra两者结合，因为它们显示出在与ST2蛋白结合的同时与IL2Ra结合。

表6.蛋白质与ST2 ECD和IL2Ra ECD两者的同时结合

实施例4.IL2vNM-IL33vCM对小鼠ST2+Treg的活性

通过测定细胞中磷酸化STAT5(pSTAT5)的水平可以评价IL-2对T细胞的激活。通过用抗-pSTAT5抗体染色细胞和然后通过流式细胞术分离出各种淋巴细胞亚群来测量pSTAT5。

ST2+Treg以高水平存在于几种人体组织中，但在血液中以非常低的频率(<0.01％)存在。由于难以从人类供体获得组织，首先评估IL2vNM-IL33vCM对来自小鼠脾脏的ST2+Treg的影响，其中发现具有更高的ST2+Treg水平(5-10％的Treg)，比血液中发现的(0.1-1.0％的Treg)更多。从C57Bl/6J小鼠分离脾脏，并用一系列浓度的IL2vNM(单价IL-2变体Fc融合体)、IL33vCM(单价IL-33变体Fc融合体)或双特异性IL2vNM-IL33vCM刺激单细胞悬浮液(图10)。IL-2的Treg激活可以通过用流式细胞术测定细胞内磷酸化STAT5(pSTAT5)的水平来测量。IL33vCM仅在高的非生理浓度(10-100nM，图8B)下诱导边缘水平的pSTAT5。相反，IL2vNM以低得多的浓度诱导pSTAT5，ST2+Treg上的EC50为2.4nM(图8A)和ST2-Treg上的EC50为0.86nM(图8B)。IL2vNM-IL33vCM双特异性蛋白增强了ST2+Treg中的pSTAT5诱导，高于单独的IL33vCM或IL2vNM蛋白所见的水平(图8A)，但在ST2-Treg中没有(图8B)。该分析中IL2vNM-IL33vCM的EC50为0.26nM，比IL2vNM的EC50低约10倍。总之，IL2vNM-IL33vCM在ST2+Treg中诱导比ST2-Treg更高的pSTAT5，证明双特异性分子优先激活ST2+Treg。

实施例5:Fc区C-末端的IL-33部分具有更高活性

IL-33与ST2和IL1RAcP复合物的结合通过衔接子MyD88激活信号传导。IL-33信号传导和下游效应的机制在不同细胞类型中不同。因此，选择信号传导报告细胞系来测量含有IL-33部分的蛋白质的生物活性。报告细胞系HEK-Blue-IL-33^TM(InVivoGen Inc)是过表达人IL-33受体的基于HEK293的细胞系，其是IL-33活性的灵敏示数。根据制造商的方案测试表1中列出的含IL-33的分子的活性在HEK-Blue-IL-33^TM细胞中刺激IL-33信号传导的能力。

比较IL-33v单价分子，IL-33vCM的EC50比IL-33vNM的EC50高3倍(与0.053pM相比的0.016pM，表7，图11A)。向IL-33vNM分子的N-末端添加额外的IL-33部分不提高EC50(IL-33vNB的0.059pM，与IL-33vNM的0.053pM相比)。IL-2v和IL-33v两者通过肽接头与Fc结构域的N-末端融合的双特异性分子(IL2vNM-IL33vNM)具有比单价IL-33vNM明显更低的IL-33活性(0.128pM与0.053pM相比，图11)，表明由于Fc结构域N-末端的两个部分的存在而导致活性损失。然而，具有Fc结构域N-末端的IL-2和Fc结构域C-末端的IL-33的双特异性分子(IL2vNM-IL33vCM)具有比具有Fc结构域N-末端的IL-33的任何分子更好的活性(表7，0.03pM，图11B)，且与单价Fc结构域C-末端的IL-33(IL-33vCM)相比，活性仅降低两倍。

与实施例2中的动力学分析一致，这些测定确定具有Fc结构域C-末端的IL-33的IL-vNM-IL33vCM与IL2vNM-IL33vNM相比具有优异的IL-33生物活性(图11)。因此，如上文实施例4中所述，选择IL2vNM-IL33vCM分子用于使用小鼠调节T细胞的进一步测定。

表7:IL-33生物活性分析的EC50

实施例6.IL2/IL-33双特异性分子在正常小鼠中的活性(预测的)

为了确定它们对正常小鼠中Treg群体的活性，BALB/c小鼠静脉内注射单剂量的0.001、0.01或0.1mg/kg的IL2vNM、IL33vCM或双特异性IL2vNM-IL33vCM蛋白(例如，图4A)。处理后2、4、6或8天收获脾和肝，并测定ST2+Treg的数量和百分比(作为CD4细胞的分数)。此外，ST2+和ST2-Treg亚群的增殖指数通过细胞用针对Ki67的抗体的细胞内染色来确定。

如果双特异性IL2vNM-IL33vCM对ST2+Treg的选择性高于IL2vNM和IL33vCM蛋白，则与IL2vNM和IL33vCM相比，用双特异性蛋白处理时观察到ST2+Treg比ST2-Treg更大的扩增。与IL2vNM或IL33vCM相比，用双特异性蛋白质处理也会导致增殖指数的增加(如通过Ki67+细胞百分比所反映的)。蛋白质对Treg的作用可以与施用的蛋白质的药代动力学相关联。施用后采集的血液样品将通过定量免疫测定来评估以确定施用的分子的药代动力学。

实施例7.肌肉炎症模型中的活性(预测的)

已经在肌肉炎症的动物模型中确定了ST2+Treg的作用。这些动物模型中的一种是野生型小鼠的急性肌肉损伤(Burzyn等，2013，Cell 155(6)：1282-1295)，和第二种模型是mdx小鼠肌肉萎缩模型，一种由肌营养不良蛋白中的遗传缺陷引起的慢性肌肉炎症模型(mdx小鼠；Villalta等，2014，Sci Transl Med 5(258)：258ra142)。

如Burzyn等人(如上所引用)所述，通过将心脏毒素注射到C57Bl/6J小鼠的后肢肌肉中在小鼠中引发急性肌肉损伤。用0.1mg/kg IL-2-IL-33双特异性分子的处理(例如图4A和4B)将在损伤当天开始，并且在第7天再次进行。在第1、4、7和14天处死小鼠，并通过流式细胞术确定肌肉中Treg、Teff和其它浸润性免疫细胞的数量。Treg的双调蛋白(AREG)产生是肌肉修复的关键介质(Burzyn等，上文引用)，并且AREG+Treg的频率和增殖指数(Ki67+Treg)通过细胞内流式细胞术确定。还评估肌肉损伤和修复的量度，例如血清中的肌酸激酶水平和肌纤维形态。

对于小鼠mdx肌肉萎缩模型，mdx小鼠的治疗在2周龄时开始。每周用0.1mg/kg测试蛋白处理小鼠，并在6周龄处死。与年龄匹配的未处理对照相比，在处理小鼠的肌肉中测量增殖Treg(Ki67+)和AREG+Treg的数量和频率。

ST2+Treg的成功激活将导致肌肉中Treg的数量增加、Ki67+Treg的较高比例或AREG+Treg的较高比例。此外，小鼠可表现出Teff细胞减少、血清肌酸激酶降低和肌肉形态改善。

实施例8.炎性肠病模型中的活性(预测的)

已经在炎性肠病的小鼠模型中确定了ST2+Treg的作用(Schiering等，2014，Nature 513(7519)：564-568)。在炎性肠病的急性模型中测试测试蛋白质对结肠组织中ST2+Treg的影响。C57Bl/6J小鼠在饮用水中喂食3％葡聚糖硫酸钠(DSS)7天。在DSS处理的第1天和第4天，用0.1或0.4mg/kg的IL-2/IL-33双特异性分子(例如图4A和4B)对小鼠进行IV、IP或SC治疗，DSS处理在第1天开始。在7天DSS处理后，处死小鼠，并收获脾、结肠和肠系膜淋巴结(MLN)。通过组织学分析结肠切片的疾病严重性和结肠炎评分。测量脾、结肠和MLN中的ST2+Treg群体。

与对照相比，成功治疗可导致治疗小鼠中Tre减少的体重减轻、改善的疾病评分或组织学。疾病改善可能伴随着处理小鼠的结肠和MLN中Ki67+增殖性ST2+Treg的特异性增加。

虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (46)

1.一种融合蛋白，其包含

a)人IL-2蛋白结构域；

b)免疫球蛋白Fc蛋白结构域；和

c)结合白介素1受体-样1(ST2)的蛋白结构域。

2.如权利要求1的融合蛋白，其中所述结合ST2的蛋白结构域是人IL-33蛋白结构域。

3.如权利要求1或2的融合蛋白，其中所述结合ST2的蛋白结构域是对ST2特异性的抗体或其抗原结合片段。

4.如权利要求1-3任一项的融合蛋白，还包含至少一个肽接头结构域。

5.如权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中所述人IL-2蛋白结构域包括相对于SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有选自以下的置换的人IL-2：T3A、N88R、N88G、D20H、C125S、Q126L和Q126F。

6.如权利要求1-5任一项的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc蛋白结构域包含选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的人IgG1 Fc变体的氨基酸序列。

7.如权利要求2-6任一项的融合蛋白，其中所述人IL-33蛋白结构域包括相对于SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有选自C208S、C227S、C232S和C259S的置换的人IL-33。

8.如权利要求4-7任一项的融合蛋白，其中所述肽接头结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

9.如权利要求1-8任一项的融合蛋白，还包含第一肽接头结构域和第二肽接头结构域。

10.如权利要求9的融合蛋白，其中各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)；且其中所述融合蛋白配置为使得

a)所述人IL-2蛋白结构域的C-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的N-末端融合；

b)所述IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的C-末端融合；

c)所述第二肽接头结构域的N-末端通过肽键与所述IgG Fc蛋白结构域的C-末端融合；和

d)所述结合ST2的蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第二肽接头结构域的C-末端融合。

11.如权利要求9的融合蛋白，其中各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)；且其中所述融合蛋白配置为使得

a.所述结合ST2的蛋白结构域的C-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的N-末端融合；

b.所述IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的C-末端融合；

c.所述第二肽接头结构域的N-末端通过肽键与所述IgG Fc蛋白结构域的C-末端融合；和

d.所述人IL-2蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第二肽接头结构域的C-末端融合。

12.如权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

13.一种核酸，其编码权利要求1-12任一项的融合蛋白。

14.一种二聚体蛋白，其包含权利要求1-12任一项的融合蛋白。

15.一种二聚体蛋白，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：

a.各融合蛋白包含免疫球蛋白(IgG)Fc蛋白结构域和至少一个选自以下的另外的蛋白结构域

i.人IL-2蛋白结构域；和

ii.结合白介素1受体-样1(ST2)的蛋白结构域；且

b.所述二聚体蛋白包含至少一个人IL-2蛋白结构域和至少一个结合ST2的蛋白结构域。

16.如权利要求15的二聚体蛋白，其中

a.所述第一融合蛋白包含人IL-2蛋白结构域、第一免疫球蛋白Fc蛋白结构域和第一肽接头；和

b.所述第二融合蛋白包含结合ST2的蛋白结构域、第二免疫球蛋白Fc蛋白结构域和第二肽接头结构域。

17.如权利要求16的二聚体蛋白，其中

a.各结构域具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)；

b.所述第一融合蛋白配置为使得

i.所述人IL-2蛋白结构域的C-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的N-末端融合；和

ii.所述第一IgG Fc蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第一肽接头结构域的C-末端融合；且

c.所述第二融合蛋白配置为使得

i.所述第二IgG Fc蛋白结构域的C-末端通过肽键与所述第二肽接头结构域的N-末端融合；和

ii.所述结合ST2的蛋白结构域的N-末端通过肽键与所述第二肽接头结构域的C-末端融合。

18.如权利要求15-17任一项的二聚体蛋白，其中所述结合ST2的蛋白结构域是人IL-33蛋白结构域。

19.如权利要求15-18任一项的二聚体蛋白，其中所述结合ST2的蛋白结构域是对ST2特异性的抗体或其抗原结合片段。

20.如权利要求15的二聚体蛋白，其中所述融合蛋白中的至少一个还包含至少一个肽接头结构域。

21.如权利要求15-20任一项的二聚体蛋白，其中所述人IL-2蛋白结构域包括相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有选自以下的置换的人IL-2：T3A、N88R、N88G、D20H、C125S、Q126L和Q126F。

22.如权利要求15-21任一项的二聚体蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc蛋白结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的人IgG1 Fc变体的氨基酸序列。

23.如权利要求18-22任一项的二聚体蛋白，其中所述人IL-33蛋白结构域包含相对于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有选自C208S、C227S、C232S和C259S的置换的人IL-33。

24.如权利要求15-20任一项的二聚体蛋白，其中所述肽接头结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

25.如权利要求15的二聚体蛋白，其中：

a.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列和所述第二融合蛋白包含SEQID NO:13的氨基酸序列；

b.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和所述第二融合蛋白包含SEQID NO:15的氨基酸序列；

c.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列和所述第二融合蛋白包含SEQID NO:15的氨基酸序列；

d.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和所述第二融合蛋白包含SEQID NO:15的氨基酸序列；

e.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列和所述第二融合蛋白包含SEQID NO:12的氨基酸序列；

f.所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；

g.所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

h.所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；

i.所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；

j.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；

k.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；

l.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；

m.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；

n.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；

o.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；

p.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或

q.所述第一融合蛋白包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述第二融合蛋白包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列，和所述二聚体蛋白进一步包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。

26.如权利要求15-25任一项的二聚体蛋白，其中所述IgG Fc蛋白包含半胱氨酸残基，且所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白通过所述IgG Fc蛋白结构域的半胱氨酸残基彼此连接。

27.如权利要求14-26任一项的二聚体蛋白，其中所述二聚体蛋白相对于ST2^-调节T细胞选择性地靶向ST2⁺调节T细胞。

28.一种药物组合物，其包含权利要求1-12任一项的融合蛋白或权利要求14-27任一项的二聚体蛋白。

29.一种用于治疗病症的方法，该方法包括对需要的受试者施用治疗有效量的权利要求28的药物组合物。

30.如权利要求29的方法，其中相对于所述受试者中ST2^-调节T细胞的水平，所述施用导致所述受试者中ST2⁺调节T细胞的水平的更大提高。

31.如权利要求29或30的方法，其中相对于所述受试者中的ST2^-调节T细胞，所述施用导致在所述受试者中选择性地激活ST2⁺调节T细胞。

32.如权利要求29的方法，其中所述治疗有效量是约1μg/kg-约250μg/kg。

33.如权利要求29的方法，其中所述病症是炎性肌病。

34.如权利要求33的方法，其中所述炎性肌病选自肌肉萎缩、多肌炎、皮肌炎。

35.如权利要求29的方法，其中所述病症选自脂肪组织的炎性病症、结肠的炎性病症和肺的炎性病症。

36.如权利要求35的方法，其中所述脂肪组织是内脏脂肪组织。

37.如权利要求29的方法，其中所述病症是自身免疫疾病。

38.如权利要求37的方法，其中所述自身免疫疾病选自移植物抗宿主病、寻常型天疱疮、系统性红斑狼疮、硬皮病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、银屑病、1型糖尿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、斑秃、葡萄膜炎、视神经脊髓炎和杜氏肌肉萎缩症。

39.如权利要求29-39任一项的方法，其中所述施用是静脉内的。

40.如权利要求29-39任一项的方法，其中所述施用是皮下的。

41.如权利要求29-40任一项的方法，其中所述受试者是人。

42.一种在受试者中相对于ST2^-调节T细胞选择性激活ST2⁺调节T细胞的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求28的药物组合物。

43.如权利要求42的方法，其中所述治疗有效量是约1μg/kg-约250μg/kg。

44.如权利要求42或43的方法，其中所述施用是静脉内的。

45.如权利要求42或43的方法，其中所述施用是皮下的。

46.如权利要求42-45任一项的方法，其中所述受试者是人。