CN110753702A - 新型抗trkb抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种分离的TrkB激动剂抗体，其结合TrkB细胞外结构域中的一个中所包含的表位并能够激活TrkB，其中所述细胞外结构域包含TrkB的细胞外D1、D2、D3、D4、D5结构域和近膜结构域。本文还提供了使用TrkB激动剂抗体治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险的方法，其中所述病症选自下组：细胞分化、突触发育、神经损伤修复和/或神经突分支。

Description

新型抗TRKB抗体
发明领域
本公开总体上涉及特异性结合人TrkB的新型抗TrkB抗体。
发明背景
神经退行性疾病是最为人知的神经系统疾病，但其医学干预却几乎没有进展。作为一种毁灭性疾病，阿尔茨海默病(AD)给越来越多的患者和家庭造成了巨大负担，而其相应的药物发现却面临着巨大的挑战。目前靶向致病毒素(淀粉样蛋白β)的AD治疗策略也已经失败了。因此，我们将注意力转向病理生理学上，并寻求利用神经营养因子(如BDNF)作为神经修复的候选物。这些神经营养因子在神经元的发育、存活和突触可塑性中起重要作用，因此被认为是治疗神经疾病的最有潜力的分子。然而，这些天然产物在其生物化学性质方面受到限制，这妨碍了它们作为治疗剂的用途。少数临床试验都是令人失望的。
发明简述
本公开中提供的特异性针对TrkB的抗体可促进该受体的二聚化并激活具有神经营养特性的下游信号传导通路。经筛选，具有良好药代动力学和较低有效浓度的抗体可被选出作为候选的抗体药物。这些候选物呈现出生物学功能，且在以下方面优于BDNF：(1)物理化学性质：BDNF太粘以至于不能扩散，而TrkB激动剂抗体(TrkB-AgoAb)能很容易地扩散到靶点；(2)特异性：BDNF不仅能激活TrkB而且能激活p75NTR，后者会导致神经元死亡和突触抑制，而TrkB-AgoAb特异性针对TrkB；(3)药代动力学：BDNF的半衰期为数小时，而TrkB-AgoAb的半衰期则为数周；(4)TrkB-AgoAb的制造成本要低得多。本公开提供了抗体的筛选、选择以及对TrkB-AgoAb的生物学和药学特性的评估。在本公开中还检测了TrkB-AgoAb在多种神经障碍中的体外和体内效应。TrkB-AgoAb可临床用于治疗AD、中风和其他神经退行性疾病(如ALS、青光眼、亨廷顿病等)。
本公开内容提供了新型的单克隆TrkB激动剂抗体、编码其的多核苷酸、使用其的方法及其在人TrkB蛋白上的结合表位。
本公开内容提供了一种分离的TrkB激动剂抗体，其结合TrkB细胞外结构域中的一个中所包含的表位并能够激活TrkB，其中所述细胞外结构域包含具有SEQ ID NO:2所示序列的D1结构域、具有SEQ ID NO:3所示序列的D2结构域、具有SEQ ID NO:4所示序列的D3结构域、具有SEQ ID NO:5所示序列的D4结构域、具有SEQ ID NO:6所示序列的D5结构域和具有TrkB的SEQ ID NO:7所示序列的近膜结构域。
在某些实施方式中，所述抗体结合近膜结构域中所包含的表位并能够激活具有SEQ ID NO:8所示序列的截短的TrkB。
本公开内容提供了一种分离的TrkB激动剂抗体，其与本文公开的抗体结合相同的表位，或具有与本文公开的抗体的竞争性结合。
在某些实施方式中，本文提供了一种分离的TrkB激动剂抗体，其包含选自SEQ IDNO:9-26、29-34、37-42、45-50、53-58、61-66和69-74，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列的1、2、3、4、5或6个CDR。在某些实施方式中，本文提供的TrkB抗体包含3个重链CDR序列，所述3个重链CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:12-14，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；2)SEQ ID NO:18-20，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；3)SEQ ID NO:24-26，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；4)SEQ ID NO:32-34，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；5)SEQ ID NO:40-42，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；6)SEQ ID NO:48-50，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；7)SEQ ID NO:56-58，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；8)SEQ ID NO:64-66，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；或9)SEQ ID NO:72-74，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供的TrkB抗体包含3个轻链CDR序列，所述3个轻链CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:9-11，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；2)SEQ IDNO:15-17，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；3)SEQ ID NO:21-23，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；4)SEQ ID NO:29-31，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；5)SEQ IDNO:37-39，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；6)SEQ ID NO:45-47，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；7)SEQ ID NO:53-55，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；8)SEQ IDNO:61-63，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列；或9)SEQ ID NO:69-71，或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本文提供了一种分离的TrkB激动剂抗体，其包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述1、2、3、4、5或6个CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:12-14，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；2)SEQ ID NO:18-20，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；3)SEQ IDNO:24-26，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；4)SEQ ID NO:32-34，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；5)SEQ ID NO:40-42，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；6)SEQ IDNO:48-50，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；7)SEQ ID NO:56-58，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；8)SEQ ID NO:64-66，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；或9)SEQID NO:72-74，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体。
在某些实施方式中，本文提供的TrkB抗体包含3个轻链CDR序列，所述3个轻链CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:9-11，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；2)SEQ ID NO:15-17，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；3)SEQ ID NO:21-23，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；4)SEQ ID NO:29-31，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；5)SEQ ID NO:37-39，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；6)SEQ ID NO:45-47，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；7)SEQ ID NO:53-55，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；8)SEQ ID NO:61-63，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；或9)SEQ ID NO:69-71，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体。
在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体包含选自SEQ ID NO:28、36、44、52、60、68、76的重链可变区或其人源化形式。在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体包含选自SEQ ID NO:27、35、43、51、59、67、75的轻链可变区或其人源化形式。
在某些实施方式中，所述分离的TrkB激动剂抗体能够通过结合不同于BDNF和/或NT-4的表位，或不同于BDNF和/或NT-4的结构域(例如TrkB的D1、D2、D3、D4或近膜结构域)激活TrkB从而具有累加效应，其中所述累加效应为当TrkB在BDNF和/或NT-4的作用下达到峰值活化时，所述抗体能额外提高TrkB的活化。用于BDNF结合的TrkB上的表位包括Asp349、Asn350、Tyr329、Asp298、Cys302、Cys345和His299。在某些实施方式中，所述不同于BDNF的表位在TrkB的D1、D2、D3、D4、D5或近膜结构域内。
在某些实施方式中，当所述抗体结合TrkB时，TrkB在TrkB的Tyr515(即Y515)、Tyr701(即Y701)、Tyr705(即Y705)、Tyr706(即Y706)、Tyr816(即Y816)、Tyr490(即Y490)、Tyr670(即Y670)、Tyr674(即Y674)、Tyr675(即Y675)、Tyr771(即Y771)、Tyr783(即Y783)、Tyr785(即Y785)、Tyr1254(即Y1254)中的至少一个氨基酸残基处自磷酸化。
在某些实施方式中，所述抗体对TrkB的活化小于BDNF和/或NT-4对TrkB的活化。在某些实施方式中，所述抗体对TrkB的活化为BDNF和/或NT-4对TrkB的活化的5％-100％(例如80％-100％、70％-100％、60％-100％、50％-100％、40％-100％、30％-100％、20％-100％、10％-100％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％)，所述活化通过TrkB的自身磷酸化水平，MAPK、PI3K或PLCγ的信号传导通路中的磷酸化水平，或其组合来确定。
在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体能够结合TrkB或其细胞外结构域(例如，D1-D5结构域)，并且其半衰期(T1/2)为至少12(例如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、36、42、48或更多个)小时。
在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体在结合TrkB或其细胞外结构域(例如，D1-D5结构域)方面的EC50小于4nM(例如小于3.5nM、小于3nM、小于2.5nM、小于2nM、小于1.5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM、或小于0.1nM)。在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体对TrkB或其细胞外结构域(例如，D1-D5结构域)的亲和力的KD值小于4.5nM(例如小于4nM、小于3.5nM、小于3nM、小于2.5nM、小于2nM、小于1.5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM、小于0.1nM、小于0.09nM、小于0.08nM、小于0.07nM、小于0.06nM或小于0.05nM)，所述KD值通过Biacore测得。
在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体不结合P75神经营养因子受体(P75NTR)、酪氨酸受体A(TrkA)或酪氨酸受体C(TrkC)。
在某些实施方式中，本文提供的分离的TrkB激动剂抗体能够增强神经细胞存活、调节突触发育和/或可塑性，增强神经突向外生长或其组合。在某些实施方式中，所述神经细胞包括PC12细胞、海马神经元、视网膜神经节细胞、运动神经元和多巴胺能神经元。在某些实施方式中，所述调节的突触可塑性包括增加的突触、增强的突触传递、增强的长期增强作用(LTP)和增强的γ振荡。
本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本文提供的分离的TrkB激动剂抗体以及药物运载体。在某些实施方式中，所述药物组合物还包含第二治疗剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是BDNF和/或NT-4。
在一个方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于诊断、预防、延迟或治疗TrkB相关病症的所述TrkB激动剂抗体或所述药物组合物。
在一个方面，本公开提供了编码所述分离的TrkB激动剂抗体的多核苷酸。在一个方面，本公开提供了包含所述多核苷酸的载体。在一个方面，本公开提供了包含所述载体的分离的宿主细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞产生由所述多核苷酸编码的抗体。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生特异性结合TrkB的抗体的方法，所述方法包括将编码所述TrkB蛋白的多核苷酸引入所述宿主细胞中，并在表达多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的TrkB激动剂抗体或所述药物组合物，从而治疗所述病症。在某些实施方式中，所述病症包括神经退行性疾病、精神病症、代谢紊乱和脑损伤。在某些实施方式中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、青光眼、亨廷顿病(HD)和帕金森病(PD)。在某些实施方式中，所述精神病症包括抑郁、自闭症、精神分裂症和创伤后应激障碍(PTSD)。在某些实施方式中，所述精神病症包括抑郁症、自闭症、精神分裂症和创伤后应激障碍(PTSD)。
在某些实施方式中，本文所述的TrkB激动剂抗体是双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。在某些实施方式中，所述抗体是选自下组的抗原结合片段：单域抗体、骆驼单域抗体、VNAR、纳米抗体、改造的人VH/VL单域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds双功能抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。
在一个方面，本公开内容提供了一种增强细胞分化和/或突触发育的方法，所述方法包括使本文提供的抗体或药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
在一个方面，本公开内容提供了一种增强神经损伤修复和/或神经突分支的方法，所述方法包括使本文提供的抗体或药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
在一个方面，本公开内容提供了一种预防细胞凋亡和/或坏死性凋亡的方法，所述方法包括使本文提供的抗体或药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
在一个方面，本公开内容提供了一种提高细胞存活的方法，所述方法包括使本文提供的抗体或药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
在某些实施方式中，所述细胞是神经细胞，包括处于各种分化阶段的神经干细胞或终末分化的神经细胞，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在某些实施方式中，神经元是中枢神经系统(CNS)中的神经元。在一些实施方式中，生物样品衍生自细胞或组织(例如来自器官的活检组织)、肿瘤细胞或体液(例如血液或血清)。
在另一个方面，本公开内容提供了一种治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用细胞，其中所述细胞在其细胞表面上表达本文提供的抗体或药物组合物。
附图简述
图1A-1F是表示抗体对人TrkB的特异性的柱状图，其通过对TrkB-agoAb104(图1A)、TrkB-agoAb202(图1B)、TrkB-agoAb203(图1C)、TrkB-agoAb303(图1D)、TrkB-agoAb1104(图1E)和TrkB-agoAb2908(图1F)的ELISA分析测得。
图2A-2B显示了截短的TrkB和TrkB激动剂抗体的靶结构域。图2A表示TrkB的五个细胞外结构域(ECD)的截短载体；图2B举例说明了通过免疫沉淀测得的TrkB-agoAb202和TrkB-agoAb418的结合结构域。
图3显示了TrkB-agoAb对TrkB的活化，其通过Alphalisa测得。
图4显示了TrkB-agoAb(TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb104)和BDNF各自对TrkB的Try515磷酸化作用，其通过AlphaLISA方法测得。
图5显示了基于在Try515上的TrkB磷酸化计算的时程曲线。X轴表示时间(分钟)，Y轴表示应答比。
图6A-6E显示了TrkB-agoAb和BDNF在不同浓度和时间段中对激酶信号传导通路MAPK、PI3K和PLCγ的磷酸化。图6A(0.56nM的TrkB-agoAb101)，图6B(2.3nM的TrkB-agoAb104)，图6C(0.83nM的TrkB-agoAb303)，图6D(1.3nM的TrkB-agoAb203)和图6E(0.3nM、1nM、3nM和10nM时的TrkB-agoAb202)。
图7显示了当用Aβ(25-35)处理时，大鼠海马神经元中细胞存活的比率。图7A显示了在用不同浓度的Aβ(25-35)处理时，海马神经元中细胞存活的比率。图7B显示了Aβ(25-35)处理后的海马神经元在加入BDNF或TrkB-AgoAb的拯救(rescue)百分比。
图8A-8C表明在血清剥夺条件下TrkB-agoAb可以改善分离自小鼠的运动神经元的细胞活力。图8A显示了不同培养条件下运动神经元的图像。图8B显示了TrkB-agoAb101和TrkB-agoAb202处理下的凋亡减少，图8C显示了TrkB-agoAb202分别在1nM和3nM的不同浓度下以及在16小时和24小时的不同时间段内的凋亡减少。
图9显示了使用BDNF或TrkB激动剂抗体后视网膜神经节细胞(RGC)的存活测定。
图10A-10F显示了当如实施例1中的实验方案所示用不同浓度的TrkB-agoAb202处理大鼠ALS模型时，其中撕脱运动神经元的存活率。
图11A和11B显示了小鼠青光眼模型中用TrkB-agoAb202处理的RGC的存活情况。图11A示出了注射有逆行标记标志物(4％Fluorogold)的RGC的荧光图像；图11B显示了根据图像结果而数得的活的RGC。
图12A和12B显示了大脑中动脉阻塞(MCAO)模型中，用TrkB-agoAb202处理的大鼠脑的梗塞体积减小。图12A示出了用IgG或TrkB-agoAb202处理的示例性TTC染色的大鼠脑切片。图12B是基于TTC染色切片量化的梗塞体积的柱状图。
图13A和13B显示了在粘合剂去除测试中，大鼠中风模型以及用TrkB-agoAb202处理后的感觉和运动功能恢复。图13A表示在1mg/kg TrkB-agoAb202处理后的不同时间点处受损前肢的感觉功能恢复。图13B表示在1mg/kg TrkB-agoAb202处理后的不同时间点处受损前肢的运动功能恢复。
图14显示了TrkB-agoAb202对凋亡的抑制，其通过剪切的胱天蛋白酶-3/前体胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3/pro-caspase 3)的相对强度测得。
图15A和15B显示TrkB-agoAb的施用赋予了减少的MLKL磷酸化。图15A显示在MCAO再灌注后24小时，动物的受损皮质组织中MLKL的相对磷酸化。图15B显示在永久性MCAO后72小时，动物的受损皮质组织中MLKL的相对磷酸化。
图16显示了本公开内容中提供的序列。
图17A和17B表示在加了BDNF或各种TrkB抗体(TrkB-agoAb)后海马神经元神经突的向外生长情况。图17A显示了神经突的总长度，图17B显示了神经突的分支点数。
图18A和18B显示了TrkB-agoAb在血浆和脑组织中的药代动力学。显示了在不同时间点血浆(图18A)和脑组织(图18B)中测得的TrkB-agoAb的浓度。
发明详述
本公开的以下描述只旨在于说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本文中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体或双特异性(二价)抗体或其功能性片段。一个天然的完整抗体包含通过二硫键彼此连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由一可变区(VH)和第一、第二、第三恒定区(分别为CH1、CH2和CH3)组成，每条轻链由一可变区(VL)和一恒定区(CL)组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区通常分成三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或辨别。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。所述三个CDR由被称为框架区(FR)的侧翼延伸部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架以支撑超变环。因此，VH和VL各自以下述顺序(从氨基酸残基的N末端至C末端)包含三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列分成五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别含有α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别的亚类为，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本文中的术语“抗原结合片段”指由含有一个或多个CDR的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整天然抗体结构的抗体部分所形成的一种抗体片段。在某些实施方式中，本文所述的抗体是抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括但不限于双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价的双功能抗体)、多特异性抗体、单域抗体、骆驼单域抗体(camelid singledomain antibody)、VNAR、纳米抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。抗原结合片段可以与亲本抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自特定人抗体的一个或多个CDR。
抗体的“Fab”片段是指抗体的单价抗原结合片段，其由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合组成。Fab可以通过在抗体铰链区的重链之间的近二硫键N-末端的残基处经由木瓜蛋白酶消化来获得。
“Fab’”指包含了部分铰链区的Fab片段，其可以通过在抗体铰链区的重链之间的近二硫键C末端的残基处经由胃蛋白酶消化来获得，因此其与Fab不同，其在铰链区有少量残基(包括一个或多个半胱氨酸)。
“F(ab')2”是指Fab’的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
抗体的“Fc”是指由第一重链的第二、第三恒定区经二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合组成的抗体部分。IgG和IgM的Fc区含有三个重链恒定区(在每条链中的第二、第三和第四重链恒定区)。其可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化获得。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。
抗体的“Fv”指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合至一条重链的可变区组成。“dsFv”指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过多肽连接子序列连接而成的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988))。“scFv二聚体”是指包含通过连接子连接的两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体或二价ScFv(BsFv)，其包含VH-VL(通过肽连接子连接)以及与其二聚化的另一VH-VL部分，以使得一个部分的VH与另一部分的VL配位并形成能够靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其他实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包含VH1-VL2(通过肽连接子连接)与VL1-VH2(也是通过肽连接子连接)结合，以使得VH1与VL1配位且VH2与VL2配位，并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由scFv连接到抗体Fc区组成的工程化抗体。
“单域抗体(sdAb)”，例如“骆驼单域抗体(Camelid single domain antibody)”、“重链抗体”、“纳米抗体”、“HCAb”或“VNAR”都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体，其具有12-15kDa的低分子量(Riechmann L.和Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。重链抗体最初从骆驼科(骆驼，单峰驼和美洲驼，VHH)、从鲨鱼物种(新抗原受体(VNAR)的可变结构域)、或者从具有特定突变(以下：F37，E44，R45，和F47)的人抗体获得。人VH/VL单域抗体可通过经由重排VH/VL结构域的合成随机化构建的噬菌体展示，从工程化抗体结构域文库分离得到(Henry KA et al.,Stability-Diversity Tradeoffs Impose Fundamental Constraints on Selection ofSynthetic Human VH/VL Single-Domain Antibodies from In Vitro DisplayLibraries.Front Immunol.2017Dec 12；8:1759)。因此，单域抗体含有至少4个框架区，它们由3个高变CDR区间隔，从而产生以下典型的抗体可变结构域结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单结构域不会与轻链抗体可变区相互作用以形成具有重链和轻链的抗原结合VII结构的常规异二聚体。
“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(VH-VL或VH-VL)(参见例如Holliger P.等，ProcNatl Acad Sci U S A.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。同一条链上的两个域由于连接子过短而不能配对，因此迫使该两个域与另一条链的互补域配对，从而形成两个抗原结合位点。这两个抗原结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
“结构域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些实施方式中，两个或多个VH域由肽连接子共价结合以形成二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsFv)2”含有三条肽链：两个VH部分间通过肽连接子相连，并通过二硫键与两个VL部分结合。
在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”含有VH1-VL2(由肽连接子相连)与VL1-VH2(也是由肽连接子相连)，其通过在VH1和VL1间的二硫键结合。
在某些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条肽链：VH1-VH2部分，其中两者的重链通过肽连接子(如：长的柔性连接子)相结合，并通过二硫键分别与VL1和VL2部分配对。每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
本申请中使用的术语“人源化”或“人源化版本”当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物(例如，啮齿动物、家兔、犬、山羊、马或鸡)的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，来自人抗体的恒定区与非人可变区融合。人源化抗体或抗原结合片段可用作人用治疗剂，因为其与非人物种抗体相比具有降低的免疫源性，或者在人体内诱导免疫应答的可能性更小。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊、牛、马、豚鼠、仓鼠或非人灵长动物(例如，猴(例如，食蟹猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩、大猩猩、类人猿或猴(affen))。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，对人源化抗体或抗原结合片段进行修饰以改善抗体性能，如结合或结合亲和性。例如，改变一个或多个非人CDR中的一个或多个氨基酸残基以降低在人体内的潜在免疫原性，其中改变的氨基酸残基对免疫特异性结合不起关键作用，或者改变是保守性改变，以使得人源化抗体与抗原的结合不受到显著影响。在一些实施方式中，所述来源于人的FR区可以包括与其来源的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一些氨基酸改变，例如，不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两个链中。在一些优选实施方式中，所述人源化抗体包括人源FR1-3和人源JH和Jκ。
本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一个物种的重链和/或轻链的一部分，且所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物物种(例如小鼠)的可变区。
本申请中使用的“TrkB激动剂抗体”或“TrkB-AgoAb”是指能够特异性结合TrkB(例如，人或非人TrkB)的细胞外结构域之一或近膜结构域的抗体，且其具有足以提供诊断和/或治疗用途的亲和性，从而在细胞或生物中激活TrkB的细胞内活性，激活BDNF细胞内信号转导通路，上调TrkB的表达或可用性，或上调由TrkB介导的BDNF信号传导调节的基因的表达或可用性。
在本申请中使用的“基本上”、“基本上相同”是指两个数值之间具有较高的相似度，并且本领域技术人员将不会识别或考虑这两个值之间有显著差异，或者在由其值所示的统计学和/或生物活性方面几乎没有差异。相比之下，“基本上更低”是指数值低于约50％、低于约40％、低于约30％、低于约20％、低于约10％的参照值。
本申请中使用的“特异性的结合”或“特异性结合”是指，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请中的抗体或抗原结合片段与人和/或非人TrkB特异性结合，并且其结合亲和力(KD)为约0.01nM至约100nM、约0.1nM至约100nM、0.01nM至约10nM、约0.1nM至约10nM、0.01nM至约5nM、约0.1nM至约5nM、0.01nM至约1nM、约0.1nM至约1nM，或者约0.01nM至约0.1nM。本申请中使用的KD是指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，可通过表面等离子体共振的方法测定，例如使用如Biacore的仪器。
本申请中使用的“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人TrkB和TrkB激动剂抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少50％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60％，大于70％，大于80％，或大于90％。
本申请中使用的术语“表位”是指抗原上与抗原结合蛋白(如抗体)结合的特定的原子基团(例如，糖侧链、磷酰基、磺酰基)或氨基酸。表位可以是构象型的或线形的。在某些实施方式中，TrkB的细胞外结构域之一中包含的表位可以是构象型的或线形的。由于蛋白的三维三级折叠，构象型表位可以包含不连续的但在空间上相邻的氨基酸残基，其中这种残基直接有助于相互作用的亲和性，并且在暴露于变性溶剂时将失去相互作用的能力。相比之下，线形表位的所有相互作用位点沿蛋白上的一级氨基酸残基线形排布，并且连续氨基酸的小区段可以由与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原消化获得，或者在暴露于变性溶剂后被保留(Salmerón A等，J Immunol.1991Nov 1；147(9):3047-52；Goldsby等，Immunology(Fifth ed.).New York:W.H.Freeman and Company.pp.57-75.ISBN 0-7167-4947-5)。在本公开的一个实施方式中，与本申请公开的TrkB抗体结合的表位是构象型的。在本公开的另一个实施方式中，与本申请公开的TrkB抗体结合的表位是线形的。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上的相同表位。例如，如果抗体或抗原结合片段阻断本公开中的示例性抗体(如TrkB-agoAb202、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb1104、TrkB-agoAb2908、TrkB-agoAb5702、TrkB-agoAb1016、TrkB-agoAb2037、TrkB-agoAbB901、TrkB-agoAbB503、TrkB-agoAbB418、TrkB-agoAb6916、TrkB-agoAb4014和TrkB-agoAb7431、其嵌合抗体、其人源化抗体)与人或非人TrkB的结合，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与那些示例性的抗体结合相同的表位。
可以将表位中的特定氨基酸残基突变(例如，通过丙氨酸扫描诱变)，并且鉴定减少或阻止蛋白结合的突变。“丙氨酸扫描诱变”是一种能够用于鉴定蛋白的某些残基或区域的方法，这些残基或区域影响表位和与该表位结合的另一化合物或蛋白的相互作用。蛋白中的残基或目标残基组被中性或带负电荷的氨基酸(最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸，或者保守性氨基酸替代)替换。氨基酸残基或编码其的密码子的任何下述突变都可能在与蛋白结合的表位内，该突变对蛋白结合的减少超过阈值，或者对蛋白结合的减少达到高于其他突变的最大程度。
下文中所述的序列可以参见图16。
本申请中使用的“TrkB-agoAb202”是指具有如SEQ ID NO:12(CDR1)、SEQ ID NO:13(CDR2)、SEQ ID NO:14(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:9(CDR1)、SEQ ID NO:10(CDR2)、SEQ ID NO:11(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的兔单克隆抗体。TrkB-agoAb202结合TrkB蛋白的D1结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb303”是指具有如SEQ ID NO:18(CDR1)、SEQ ID NO:19(CDR2)、SEQ ID NO:20(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:15(CDR1)、SEQ ID NO:16(CDR2)、SEQ ID NO:17(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体。TrkB-agoAb303结合TrkB蛋白的D3结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb203”是指具有如SEQ ID NO:24(CDR1)、SEQ ID NO:25(CDR2)、SEQ ID NO:26(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:21(CDR1)、SEQ ID NO:22(CDR2)、SEQ ID NO:23(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的兔单克隆抗体。TrkB-agoAb203结合TrkB蛋白的D5结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb2908”是指具有如SEQ ID NO:32(CDR1)、SEQ ID NO:33(CDR2)、SEQ ID NO:34(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:29(CDR1)、SEQ ID NO:30(CDR2)、SEQ ID NO:31(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且其具有SEQ ID NO:36所示的重链可变区和SEQ ID NO:35所示的轻链可变区。TrkB-agoAb2908结合TrkB蛋白的D5结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb1104”是指具有如SEQ ID NO:40(CDR1)、SEQ ID NO:41(CDR2)、SEQ ID NO:42(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:37(CDR1)、SEQ ID NO:38(CDR2)、SEQ ID NO:39(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且其具有SEQ ID NO:44所示的重链可变区和SEQ ID NO:43所示的轻链可变区。TrkB-agoAb1104结合TrkB蛋白的D1结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAbB901”是指具有如SEQ ID NO:48(CDR1)、SEQ ID NO:49(CDR2)、SEQ ID NO:50(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:45(CDR1)、SEQ ID NO:46(CDR2)、SEQ ID NO:47(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且其具有SEQ ID NO:52所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区。TrkB-agoAbB901结合TrkB蛋白的D5结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb5702”是指具有如SEQ ID NO:56(CDR1)、SEQ ID NO:57(CDR2)、SEQ ID NO:58(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:53(CDR1)、SEQ ID NO:54(CDR2)、SEQ ID NO:55(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且其具有SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:59所示的轻链可变区。TrkB-agoAb5702结合TrkB蛋白的D5结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb6916”是指具有如SEQ ID NO:64(CDR1)、SEQ ID NO:65(CDR2)、SEQ ID NO:66(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:61(CDR1)、SEQ ID NO:62(CDR2)、SEQ ID NO:63(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且其具有SEQ ID NO:68所示的重链可变区和SEQ ID NO:67所示的轻链可变区。TrkB-agoAb6916结合TrkB蛋白的D5结构域。
本申请中使用的“TrkB-agoAb7431”是指具有如SEQ ID NO:72(CDR1)、SEQ ID NO:73(CDR2)、SEQ ID NO:74(CDR3)所示的三个重链可变区CDR，以及如SEQ ID NO:69(CDR1)、SEQ ID NO:70(CDR2)、SEQ ID NO:71(CDR3)所示的三个轻链可变区CDR的小鼠单克隆抗体，并且具有SEQ ID NO:76所示的重链可变区和SEQ ID NO:75所示的轻链可变区。TrkB-agoAb7431结合TrkB蛋白的近膜结构域。
当“保守替换”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替换或对多肽的活性不起关键作用的那些氨基酸进行替换。例如，可以在具有非极性侧链的氨基酸残基间(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、Phe、Trp)、具有不带电荷的极性侧链的残基间(例如，Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、具有酸性侧链的残基间(例如，Asp、Glu)、具有碱性侧链氨基酸间(例如，His、Lys和Arg)、具有β支链侧链的氨基酸间(例如，Thr、Val和Ile)、具有含硫侧链的氨基酸间(例如，Cys和Met)或者具有芳香侧链的残基间(例如，Trp、Tyr、His和Phe)进行保守替换。在某些实施方式中，替换、缺失或添加也可以认为是“保守替换”。插入或缺失的氨基酸数量可以在约1至5个范围内。本领域公知保守替换通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
当“百分比(％)序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入空位使对应氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替换可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN，BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见Altschul S.F.等、J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“同源序列”和“同源性序列”可以互换使用，其是指与另一序列任选地比对时具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的多核苷酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
本申请中使用的“效应功能”或“抗体效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合物和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与C1复合物上的C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，以及吞噬。“降低或耗竭效应功能”是指抗体效应功能与亲本抗体相比降低至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。在某些实施方式中，通过Fc区中消除糖基化的突变(例如N297A或D265A(参见Shields等，J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001))、K322A、L234A/L235A)以消除效应功能。本申请中使用的“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域。
本申请中使用的对某种病况的“治疗”、“处理”或“疗法”可以互换使用，并且包括治疗性处理、预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，如预防或减轻病况、减缓病况的发病或发展的速率、减少发展出某种状况的风险、预防或推迟与病况相关的症状发展、减少或终止与病况相关的症状、使病况的完全或部分消退、治愈病况、或其某些组合。
本申请中使用的术语“TrkB”是指原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)，也称为酪氨酸受体激酶B，或BDNF/NT-3生长因子受体或2型神经营养酪氨酸激酶受体，其是人体中由NTRK2基因编码的蛋白质。TrkB位于细胞膜上，并通过配体与受体的细胞外结构域的结合而被激活。TrkB在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中具有三种同种型：全长同种型是典型的酪氨酸激酶受体，而两种C末端TrkB同种型具有与全长同种型相同的细胞外结构域、跨膜结构域和前12个细胞内氨基酸序列，但分别在具有11(T1同种型)和9(T2同种型)个氨基酸的C末端序列上不同。在本公开内容中，TrkB蛋白是指上述三种同种型中的任一种。TrkB是脑源性神经营养因子(BDNF)的受体，并以配体特异性的方式结合BDNF。BDNF与TrkB结合，通过其构象变化和细胞内结构域中酪氨酸残基的自身磷酸化触发其二聚化，使得涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)的三种主要信号传导通路的激活。据报道，几种神经营养因子能激活TrkB，如BDNF、神经营养因子-4(NT-4)和神经营养因子-3(NT-3)，从而激活多重效应，包括神经元分化、神经元修复、神经元可塑性、增殖和存活。BDNF和NT-4都可以与TrkB结合并且可以激活许多常见的信号传导通路。在某些实施方式中，本申请中使用的TrkB是具有登录号为S76473.1的基因序列的人TrkB，或非人动物TrkB，例如小鼠TrkB、大鼠TrkB、兔TrkB。
本申请中使用的术语“截短的TrkB”是指缺乏部分片段(例如细胞外结构域)但仍保留TrkB受体在细胞内信号传导中的主要功能的TrkB蛋白。在某些实施方式中，所述截短的TrkB缺乏D1-D5结构域并且具有SEQ ID NO:8所示的序列。
“BDNF”在人中由BDNF基因编码，并且是生长因子的神经营养因子家族的成员，与经典的神经生长因子相关。BDNF存在于大脑(如海马体、皮层和基底前脑)中，通过结合和激活TrkB来介导神经元的存活和分化活动以及调节神经元的突触功能，它还存在于周围神经系统(如视网膜、运动神经元)、肾脏、唾液和前列腺中。BDNF结合细胞表面上的至少两种受体，例如TrkB和p75(也称为LNGFR)。所有神经营养因子都可以与p75受体相互作用。当p75被激活时，会在表达p75受体但缺乏Trk受体的细胞中触发细胞凋亡而非存活通路。BDNF还结合TrkA和TrkC，TrkA和TrkC与TrkB一起属于蛋白激酶的亚家族。“前体BDNF”(Pro-BDNF)是指未被切割的BDNF前体，其由具有129个氨基酸的前结构域和具有118个氨基酸的成熟结构域组成。当前结构域通过前转化酶(proconvertase)在保守的RVRR序列上的作用从完整的前体BDNF上被切割下来时，二聚体化的成熟结构域被释放出来，并且被称为成熟的BDNF，或简称为BDNF。据报道，p75受体与前体BDNF的成熟结构域区结合，诱导与成熟BDNF引起的效应相反的效应，例如细胞死亡、生长锥回缩、促进成熟海马突触处的长期抑制和神经肌肉接头的突触消除(Hempstead BL,Trans Am Clin Climatol Assoc.2015；126:9-19)。在某些实施方式中，本公开内容中使用的BDNF是指成熟的BDNF。在某些实施方式中，本文提供的TrkB激动剂抗体结合成熟的BDNF但不结合前体BDNF。
神经营养因子-4(NT-4)，也称为神经营养因子-5(NT-5)，是主要通过TrkB受体发出信号的神经营养因子。在人中，NT-4由NTF4基因编码。NT-4参与控制神经元的存活和分化。虽然敲除其他神经营养因子(包括NGF、BDNF和NT-3)在出生后早期发育期间是致命的，但NTF5缺陷小鼠仅表现出轻微的细胞缺陷并且正常发育至成年期，表明NTF5的功能可以被其他神经营养因子补偿。
本申请中使用的“TrkB相关病症”是指由TrkB(例如人TrkB)的表达或活性的增加或减少引起的、由其加剧的、或以其他方式与其相关的任何病症，或者是由BDNF信号传导的减少或通过TrkB激活的任何其他细胞内信号传导级联引起或加剧的障碍。神经和精神疾病的实例包括神经退行性疾病(包括但不限于阿尔茨海默病和相关的痴呆、帕金森病、亨廷顿病、路易体病和相关的运动障碍、肌萎缩侧索硬化、青光眼以及弗里德里希共济失调和相关的脊髓小脑共济失调)、抑郁、焦虑、自闭症、精神分裂症和创伤后应激障碍、CNS损伤、中风和创伤性脑损伤等。代谢紊乱的例子包括肥胖和多食症。本申请中使用的“癌症”或“癌症病况”是指以恶性细胞生长或赘生物、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学病况，并且包括实体肿瘤癌症和非实体癌症(血液恶性肿瘤)，如白血病。实体肿瘤包括肉瘤(sarcoma)和癌(carcinoma)。肉瘤是在血管、骨骼、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱中的非上皮肿瘤，而癌(carcinoma)是在皮肤、腺体和器官内层的上皮肿瘤。本申请中使用的“肿瘤”是指赘生细胞和/或恶性细胞的实体团块。
“分离的”物质在人工处理后，由自然状态发生改变。如果自然界中出现某种“分离的”成分或物质，那么其发生改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，“分离的”多核苷酸或多肽是分别不含其他多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽，并且不与在天然状态下与该多核苷酸或多肽共存的天然组分结合。在某些实施方式中，通过至少一个步骤将“分离的”抗体纯化成纯度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，其通过电泳方法(如使用考马斯亮蓝或银染进行的SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)、色谱方法(如离子交换色谱或反相HPLC)或Lowry法确定。
本申请中使用的“载体”是指，可将编码蛋白的多核苷酸可操作性地插入并转运至其中，以在宿主细胞中表达该蛋白的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的示例性类型包括但不限于：质粒(例如，噬菌粒、柯斯质粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、病毒载体(噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体或动物病毒)、细菌载体或非游离型哺乳动物载体。用作载体的动物病毒种类包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体(例如，病毒载体或游离型哺乳动物载体)可以含有复制起始位点。载体还可包含协助其进入细胞的成分，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白衣壳。
本申请中使用的“宿主细胞”是指引入外源多核苷酸和/或载体以表达一种或多种外源性蛋白的细胞。其旨在指特定的对象细胞及其后代。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞或杂交瘤。其可以是不能表达所需水平的蛋白但包含该核酸的细胞，除非将调节剂引入细胞或将调控序列引入宿主细胞以使得其与核酸可操作地连接。
“药物组合物”是指一种或多种本文所述化合物或其药学上可接受的盐与其他化学组分(如生理学上可接受的运载体和辅料)的混合物，所述混合物为丸剂、片剂、胶囊形式的，或为用于通过针或类似装置注射的液体制剂形式。药物组合物的一个目的是促进向生物体施用化合物。其不限于由管理机构批准的组合物，并且旨在包括营养补充剂和其他制剂。
本申请中使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗与人TrkB相关的疾病或病况的药物的剂量或浓度。例如，对于使用本申请公开的抗体或抗原结合片段治疗癌症，治疗有效量是能够减小肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞浸润至其他器官、抑制介导癌症病况的细胞生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌症病况相关的任何症状或标志、阻止或延缓肿瘤或癌症病况进展、或其某些组合的抗体或抗原结合片段的剂量或浓度。
术语“药学上可接受的”是指所指的运载体、载剂、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。“辅料”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性物质。辅料的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
本申请中使用的“细胞分化”是指从一种细胞类型向不同细胞类型的发育。例如，双能、多能或全能细胞可以分化成神经细胞。分化可以伴随有增殖，或者可以独立于其进行。“分化”通常是指从发育不太明确的细胞类型获得成熟细胞类型(例如，神经元或淋巴细胞)的表型，但不排除其中一种成熟细胞类型转化为另一种成熟细胞类型(例如，神经元转化为淋巴细胞)的转分化。
BDNF/NT-4-TrkB信号转导通路
神经营养因子家族的成员是高度同源的二聚体生长因子，包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4/5(NT-4/5)等(McAllister等，1999)。神经营养因子具有多种功能。在细胞中神经营养因子的合成过程中，最初合成为前体(前神经营养因子)，它们被切割以产生成熟的神经营养因子，其通过激活Trk受体酪氨酸激酶来促进神经元存活并增强突触可塑性(Nagappan和Lu，2005)。前神经营养因子倾向于与p75NTR(p75神经营养因子受体，p75NTR)结合，这导致细胞凋亡(Woo等，2005)。与所有其他酪氨酸激酶受体一样，Trk受体通过二聚化被激活，使得细胞内酪氨酸残基自磷酸化并触发信号转导级联。由Trk激活的信号转导通路包括Ras/细胞外调节激酶(Erk)通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3激酶)/Akt通路和PLCγ/PKC通路(Huang和Reichardt，2001；Kaplan和Miller，2000)。
在神经营养因子受体中，TrkB及其内源性配体BDNF/NT-4由于其对突触可塑性的调节作用受到了很大的关注。神经营养因子以通过非共价键连接的稳定二聚体的形式存在。二聚化的配体将受体单体吸引到一起，诱导受体的二聚化和受体酪氨酸残基的磷酸化。然后受体的自磷酸化激活信号级联反应(Ibanez等，1993；McDonald等，1991；Radziejewski等，1992)。TrkB由细胞外结构域(包括五个结构域)、跨膜区和胞内激酶结构域组成。前三个细胞外结构域D1-D3由侧翼为两个半胱氨酸富含区的富含亮氨酸的区域组成。结构域4和5(D4，D5)都是免疫球蛋白样结构域。晶体学研究数据表明D5是BDNF与TrkB结合所在的区域(Banfield等，2001)。配体的结合诱导受体的二聚化以及受体的细胞内激酶结构域中5个酪氨酸残基(Tyr515、Tyr701、Tyr705、Tyr706和Tyr816)的磷酸化(McCarty和Feinstein，1998)。细胞内近膜区域中第515位处的酪氨酸的磷酸化通过Shc衔接分子的磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域来募集Shc衔接分子(Easton等，1999)。如果TrkB的Tyr515被F取代的话，则TrkB不能与Shc相互作用(Easton等，1999)。TrkBC末端的第816位也被磷酸化，这使得磷脂酶C-γ(PLC-γ)通过Src-同源性2(SH2)结构域与第816位结合并被磷酸化(McCarty和Feinstein，1998)。
下游为三个主要的细胞内信号级联：Ras-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt通路和PLCγ-Ca2+通路。TrkB通过MAPK通路来调节神经元分化和突触发育(Cowley等，1994)。在Tyr515位上的Shc衔接子的募集和磷酸化导致生长因子受体结合蛋白2(GRB2)和鸟嘌呤核苷交换因子(son of sevenless,SOS)的结合，激活Ras-MAPK下游通路，包括c-Raf/B-Raf/Erk1/Erk2/p38MAPK等(Ballif和Blenis，2001年)。TrkB通过PI3K-Akt通路来调节细胞发育和存活，并以Akt为中心促进树突棘的生长。PI3K和TrkB之间的关联和活化是间接的，其通过募集的GRB相关结合蛋白-1(GAB1)、胰岛素受体底物1(IRS1)和IRS2来激活PI3K。在这种关联下，PI3K产生3-磷酸肌醇，后者激活3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)。在这些3-磷酸肌醇的作用下，PDPK1激活蛋白激酶Akt，后者磷酸化包括半胱天冬酶-9、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)和FKHR家族成员等在内的几种蛋白质(vanWeeren等，1998)。
降低TrkB信号传导通路的活化水平能显著损伤轴突和树突棘的分支。支架蛋白ARMS和RhoA参与该过程(Lin等，2011)。PLCγ通路始于TrkB中Tyr816的磷酸化。PLCγ通路主要募集二酰基甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)(Gupta等，2013)。DAG可激活蛋白激酶C(PKC)，并且IP3引起钙离子内流。它们相互协调，以调节神经突分支。然而，Tyr816处的基因敲除不能完全阻断神经突分支，这表明其他信号通路也可能参与这一过程。
TrkB激动剂抗体
尽管BDNF对TrkB信号传导通路的激活具有神经营养功能，但BDNF同时对p75NTR具有一定的亲和力。该受体的激活将导致包括JNK在内的下游因子的活化，并将引起细胞毒性，其可诱导细胞死亡。此外，BDNF本身的生化特性非常不稳定。它在血浆中的半衰期仅为10分钟左右。就工业生产而言，BDNF的制备是非常昂贵的。因此，根据BDNF二聚体介导其受体的二聚化和自身磷酸化的机制，抗体分子(主要是IgG)可以实现类似的活化，因为它们也是二价的(具有2个相同的Fab结构域)。在1996年，Lucidi-Phillipi等人首先报道了在动物中抗TrkA多克隆抗体能激活TrkA并抑制胆碱能神经元的死亡(Lucidi-Phillipi等，1996)。同年，LeSauteur报道了一种TrkA的单克隆抗体。该抗人TrkA抗体能识别NGF停靠位点，结合并激活TrkA及其下游分子PI3-K(LeSauteur等，1996)。Qian等人首先报道了TrkB抗体的激动剂的开发。在研究者筛选的5种单克隆抗体中，虽然TrkB与每种抗体的结合位点都不同，但它们都能在不同程度上促进细胞存活和神经突向外生长。更重要的是，这些抗体不会激活p75NTR(Qian等，2006)。作为这些抗体中的一种，29D7已被发现在多种神经疾病中具有治疗效果。Katsuki发现，在玻璃体内给予29D7可以减少视神经损伤手术中的视网膜神经节细胞死亡(Hu等，2010)。在对新生大鼠进行缺氧缺血性手术后，29D7可以减少细胞死亡并促进长期的感觉运动功能恢复，这对脑瘫患儿的临床治疗具有重要意义(Kim等，2014)。此外，Todd证明29D7可以减少由突变的亨廷顿蛋白引起的纹状体细胞损伤(Todd等，2014)，因此它成为了治疗亨廷顿病的潜在药物。
本公开内容一方面提供了TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，本公开内容提供了示例性的单克隆抗体TrkB-agoAb202、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb1104、TrkB-agoAb2908、TrkB-agoAb5702、TrkB-agoAb1016、TrkB-agoAb2037、TrkB-agoAbB901、TrkB-agoAbB503、TrkB-agoAbB418、TrkB-agoAb6916、TrkB-agoAb4014、TrkB-agoAb7431、其嵌合抗体、及其人源化抗体。
本领域技术人员将理解，可以对本申请所述的CDR序列进行修饰，以包含一个或多个氨基酸残基的替换(或者插入或缺失)，从而使得所得到抗体在一个或多个性质上有所改进(如改进的结合或结合亲和性、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性、对偶联的相容性、降低的CDR残基上的糖基化和/或脱氨基的风险，以及降低的免疫原性)，同时其他的是与亲本抗体相当的(即除上述修饰和改变外具有相同CDR序列的抗体)，或至少实质上保留了亲本抗体的抗原结合性质。例如，可以利用噬菌体展示技术生产并表达抗体变体(例如，Fab或scFv变体)库(或集(repertoire))，随后筛选与人TrkB结合或有结合亲和性的抗体。另一个例子中，可以用计算机软件模拟所述抗体与人TrkB的结合，并鉴别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的替换以防止结合减少或结合亲和性降低，或可以靶向这些残基进行替换以形成更强的结合。在某些实施方式中，CDR序列中的至少一个(或全部)替换是保守替换。
在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段包括一个或多个CDR序列，这些序列与本申请提供的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留了与其亲本抗体水平相似或甚至更高的与人TrkB的结合活性或结合亲和性，所述亲本抗体具有基本相同的序列，但是其相应的CDR序列与本申请所述的序列具有100％序列同一性。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段是嵌合的。嵌合抗体含有来自某一抗体的一个或多个区域和来自其他抗体或物种的一个或多个区域。在某些实施方式中，嵌合TrkB激动剂抗体的至少一个CDR来源于一个物种。在某些实施方式中，所有CDR来源于另一物种。在某些实施方式中，嵌合TrkB激动剂抗体的可变区来源于一个物种，并且与另一物种的抗体的恒定区连接。嵌合抗体保留了亲本抗体的结合活性或结合亲和性。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段是人源化的。在某些实施方式中，人源化抗体源自非人物种，并对重链和轻链框架区和恒定区的若干氨基酸残基进行了突变以降低或避免在人体内的免疫原性。在某些实施方式中，将非人物种的可变区与人抗体的恒定区融合。在某些实施方式中，通过CDR移植产生人源化抗体，即用非人抗体的对应CDR替代人抗体的CDR。这样，人源化抗体在人体内的免疫原性较低。在某些实施方式中，人框架区被CDR序列来源的非人抗体(例如，小鼠框架区)的一个或多个氨基酸残基替换以，例如，改善或保持结合活性或结合亲和性。在某些实施方式中，人源化抗体保持或增强亲本抗体的结合活性或结合亲和性。
在一些实施方式中，结合亲和性可以用KD值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(koff/kon)计算得到。所述抗原结合亲和性(例如KD)可以通过本领域已知的适宜方法适当地确定，所述方法包括使用仪器如Biacore的表面等离子体共振结合法(参见例如Murphy,M.等，Current protocols in proteinscience,Chapter 19,unit 19.14,2006)。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段能够以小于4nM(例如小于3.5nM、小于3nM、小于2.5nM、小于2nM、小于1.5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM、或小于0.1nM)的EC50(即50％结合浓度)与人TrkB胞外结构域结合。可以通过本领域公知的方法测量抗体与人TrkB的结合，例如ELISA、FACS、表面等离子体共振、GST沉降技术(GST pull down)、表位标签、免疫沉淀、Far-Western、荧光共振能量转移、时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定、乳胶凝集、Western印迹和免疫组织化学或者其他结合测定。在一个说明性实例中，测试抗体(即一抗)能够与固化的人TrkB或表达人TrkB的细胞结合，随后洗掉未结合抗体，引入标记的二抗，其能够与一抗结合因此能够检测出结合的一抗。当使用固化的TrkB时，可以使用酶标仪进行检测，或者当使用表达人TrkB的细胞时，通过使用FACS分析进行检测。
在某些实施方式中，所述抗体对TrkB的活化小于BDNF或NT-4对TrkB的活化。如上所述，BDNF或NT-4的二聚体通过TrkB细胞内结构域中酪氨酸残基的构象变化和自磷酸化触发TrkB二聚化，从而介导涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)的三种主要信号传导通路。因此，TrkB的活化可以通过测量上述三种信号传导通路的活化或TrkB的磷酸化(pTrkB)来确定。在不存在TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的情况下，饱和的BDNF或NT-4(例如10nM或100nM)可用于作为100％的TrkB活化的基准。在存在TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段以及饱和的BDNF或NT-4溶液的条件下的累加效应(或增强作用)可被定义为BDNF或NT-4诱导的超过100％的TrkB活化。在某些实施方式中，所述累加效应可以是TrkB活化基准的至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、或至少150％。在某些实施方式中，本文提供的TrkB激动剂抗体具有至少120％的累加效应。在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体为TrkB-agoAb303。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体与BDNF和/或NT-4竞争结合TrkB。在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体不与BDNF和/或NT-4竞争结合TrkB。如上所述，TrkB激动剂抗体和BDNF和/或NT-4之间的竞争可以通过测量TrkB的活化来确定。或者，TrkB激动剂抗体与BDNF和/或NT-4之间的竞争可通过竞争ELISA、FMAT或BIAcore测定来确定，这些测定被设计成检测TrkB结合激动剂和BDNF是否结合相同或重合的表位、是否存在空间的结合抑制、或者第一分子的结合是否诱导能阻止或减少第二分子结合的TrkB的构象变化。
例如，在饱和BDNF浓度(例如10nM，EC100)的条件下，不与BDNF竞争的TrkB结合激动剂不会因所述激动剂的浓度上升而引起TrkB的磷酸化的变化。在饱和BDNF浓度(例如10nM，EC100)的条件下，与BDNF竞争的TrkB结合激动剂会在所述激动剂的浓度上升时引起TrkB磷酸化降低。在一个实施方式中，所述TrkB结合激动剂与BDNF是非竞争性的，其中在存在激动剂和饱和浓度(EC100)的BDNF的条件下，磷酸化TrkB的总水平与单独存在饱和浓度的BDNF的条件下的磷酸化TrkB的水平相似，即总pTrkB(EC100 BDNF+激动剂)和总pTrkB(EC100 BDNF)。类似地，在一个实施方式中，所述TrkB结合激动剂与NT-4是非竞争性的，其中在存在激动剂和饱和浓度(EC100)的NT-4的条件下，磷酸化TrkB的总水平与单独存在饱和浓度的NT-4的条件下的磷酸化TrkB的水平相似，即总pTrkB(EC100 NT-4+激动剂)和总pTrkB(EC100 NT-4)。当在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB在一定范围，即在存在饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB±3倍标准差内时，认为磷酸化TrkB的水平是相似的。在一个实施方式中，在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB是在一定范围内的，即在存在饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB±2倍标准差内。在另一个实施方式中，在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB是在一定范围内的，即在存在饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB±1倍标准差内。在前述实施方式中，是基于至少三个读数来计算磷酸化pTrkB的平均总水平的，并且使用两个标准差(即在存在激动剂的条件下算得的标准差和在不存在激动剂的条件下算得的标准差)中的较大者。在另一个实施方式中，当在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB和在存在饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB相差小于10％时，认为所述磷酸化TrkB的水平是相似的。在另一个实施方式中，当在存在激动剂和饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB和在存在饱和水平的BDNF或NT-4的条件下测得的平均总pTrkB相差小于5％时，认为所述磷酸化TrkB的水平是相似的。不与BDNF或NT-4竞争结合TrkB的TrkB结合激动剂在临床环境中是有益的，因为TrkB激动剂可激活TrkB且不与水平降低的BDNF(或NT-4)竞争。因此，除了TrkB结合激动剂之外，BDNF和NT-4可以继续发挥生理作用。
报道过的TrkB上的BDNF或NT-4/5结合表位的关键残基为Asp349、Asn350、Tyr329、Asp298、Cys302、Cys345和His299(Banfield等，2001)。ERK、Akt和PLCγ的磷酸化以及TrkB的磷酸化的检测可以在不同的时间点(例如0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时或36小时)通过本领域已知的方法(例如western印迹)进行。在某些实施方式中，由所述TrkB激动剂抗体触发的Akt磷酸化与BDNF或NT-4触发的磷酸化类似或小于其的90％(例如80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或甚至更少)，所述磷酸化通过western印迹测得。在某些实施方式中，由所述TrkB激动剂抗体触发的Erk的磷酸化与BDNF或NT-4触发的磷酸化类似或小于其的90％(例如80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或甚至更少)，所述磷酸化通过western印迹测得。在某些实施方式中，由所述TrkB激动剂抗体触发的PLCγ的磷酸化与BDNF或NT-4触发的磷酸化类似或小于其的90％(例如80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或甚至更少)，所述磷酸化通过western印迹测得。在某些实施方式中，在Erk1的Thr202和/或Tyr204(Erk2的Thr185和/或Tyr187)处测量Erk的磷酸化。在某些实施方式中，在Thr308和/或Ser473处测量Akt的磷酸化。在某些实施方式中，在Tyr771、Tyr775、Tyr783、Ser1248或其组合处测量PLC-γ的磷酸化。在某些实施方式中，在Tyr515、Tyr701、Tyr705、Tyr706、Tyr816、Tyr490、Tyr670、Tyr674、Tyr675、Tyr771、Tyr783、Tyr785、Tyr1254或其组合处测量TrkB的自磷酸化。
在某些实施方式中，可以将所述TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段包括在联用疗法中，其包括标准化疗和放疗(例如，放射疗法、X-射线疗法)、基于靶点的小分子疗法(例如，单克隆抗体、光动力疗法)、免疫疗法(例如，针对肿瘤标记物的抗体，所述肿瘤标记物如癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155、DLL4、Notch1、Notch2/3、Fzd7或者Wnt、r-spondin(RSPO)1、RSPO2、RSPO3或RSPO4)、新兴的其他免疫检查点调节剂疗法(例如疫苗)、激素疗法、血管生成抑制(血管生成抑制剂)、基因疗法(细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂或程序性细胞死亡调节剂)、姑息治疗(即旨在改善护理质量以减轻疼痛(例如，吗啡和羟考酮)、恶心、呕吐(例如，昂丹司琼和阿瑞吡坦)、腹泻和出血的治疗)和手术。在某些实施方式中，可以将抗体及其抗原结合片段作为抗体-药物偶联物、双特异性或多价抗体的基础分子。
本申请所述的TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非动物制备的抗体。双特异性抗体或二价抗体是具有两种不同的单克隆抗体的片段的人工抗体，其能结合两种不同的抗原。“二价”的抗体和其抗原结合片段包括两个抗原结合位点。两个抗原结合位点可以结合相同抗原，或者可以各自结合到不同的抗原(在这种情况下，抗体或抗原结合片段为“双特异性”)。
在一些实施方式中，本申请所述的TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方式中，使用重组方法制备人源化抗体或嵌合抗体。例如，可以用合适的抗原(如人TrkB蛋白)免疫非人动物。从小鼠单克隆抗体的基因剪切下编码与抗原结合的抗体可变区的基因片段，并将这一部分与来源于人/非人动物IgG1的抗体的恒定区基因可操作地连接。将此重组基因片段掺入表达载体，然后将该表达载体引入用于产生嵌合抗体的宿主细胞(参见美国专利号4,816,397；4,816,567；5,807,715)。
“人源化抗体”是通过将非人源抗体CDR基因移植到人抗体基因上而获得的抗体，使得可变区框架和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人抗体序列。用于制备人源化抗体的方法是本领域公知的(参见例如美国专利号5,225,539、美国专利号5,530,101、美国专利号6,407,213；美国专利号5,859,205；美国专利号6,881,557、EP239400、EP125023、WO90/07861和WO96/02576)。在某些实施方式中，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。在某些实施方式中，在人源化TrkB激动剂抗体中移植的CDR序列与对应的CDR至少60％、70％、80％、82％、85％、88％、90％、95％或100％相同。在某些实施方式中，在人源化TrkB激动剂抗体的CDR中存在不超过3个连续的氨基酸替换。在某些实施方式中，将人源化TrkB抗体可变区框架的氨基酸残基替换以进行序列优化。在某些实施方式中，人源化TrkB激动剂抗体链的可变区框架序列与对应的人可变区框架序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同。
在一些实施方式中，TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段是单域抗体、骆驼单域抗体(camelid single chain domain antibody)、VNAR、纳米抗体、改造的人VH/VL单域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds双功能抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。
在一些实施方式中，TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH1-CH2或CH1-CH3区。在一些实施方式中，恒定区还可以包含一个或多个修饰以使其具有所需的性质。例如，可以对恒定区进行修饰以降低或消除一个或多个效应功能，以改善FcRn受体结合，或引入一个或多个半胱氨酸残基。
在一些实施方式中，TrkB激动剂抗体及其抗原结合片段进一步形成抗体-药物偶联物(ADC)。可以设想，可以将多种有效载荷与本申请所述的抗体或抗原结合片段连接(参见例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruseand R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，New York(1989))。术语“有效载荷”可以与“药物”互换使用，并且这些有效载荷可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合(coordinate binding)、络合、结合(association)、混合或加成等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。在某些实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段可以通过工程化的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种有效载荷，如肽、核酸分子、药物、细胞毒素、多肽、蛋白、融合蛋白、抗体、半抗原、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子、放射性核素和报告基团。例如，这种位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，如半胱氨酸组氨酸残基，以促进其与有效载荷的共价连接。在某些实施方式中，抗体可以通过接头，或通过另一有效载荷，与有效载荷间接连接。例如，抗体或抗原结合片段可以与生物素偶联，然后与同亲和素偶联的第二有效载荷间接偶联。有效载荷可以是报告基团或可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可以包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素、发光标记)、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。在某些实施方式中，有效载荷可以是药代动力学修饰部分如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，有效载荷可以是纯化部分例如磁珠。“细胞毒性”部分的有效载荷可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包括但不限于：化疗剂、抗肿瘤剂、生长抑制剂、药物、毒素，如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、铂类(例如，顺铂和奥沙利铂)、植物生物碱(例如，拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷和表鬼臼毒素)和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。本申请中使用的术语“载荷”或“药物载荷”或“有效载荷”是指每个抗体的平均药物/有效载荷数。药物载荷可以在每个抗体1至20(例如，1至15、1至10、2至10、1至8、2至8、2至6、2至5或2至4)个药物的范围内(也称为药物与抗体之比)，其通过本领域中的适宜方法确定，如质谱、UV/可见光谱、ELISA测定和HPLC。在某些实施方式中，药物载荷是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
多核苷酸和重组方法
本公开内容提供了编码TrkB激动剂抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括一个或多个核苷酸序列，其编码本公开内容中所述的CDR序列。
可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种制备抗体。参见，例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。在某些实施方式中，产生单克隆TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的方法包括：用人TrkB蛋白或产生hTrkB激动剂的细胞免疫适宜的动物。所述动物可以是啮齿动物，例如小鼠或大鼠(如
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Aliva
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HuMab
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或MeMo)、绵羊、山羊、牛、马、兔、豚鼠等。使用脾脏或淋巴结产生杂交瘤，或者收集免疫动物的B细胞，并测量TrkB激动剂抗体滴度。克隆来自杂交瘤或来自免疫动物的B细胞克隆的编码具有适宜滴度的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。将克隆的或经修饰的(例如，嵌合的、人源化的)多核苷酸掺入适宜载体，然后将该载体引入宿主细胞以产生本公开内容所述的抗体。可以通过培养宿主细胞，随后分离和纯化宿主细胞或培养液(例如，上清液)，获得基本上纯净且均一形式的本申请所述的抗体及其抗原结合片段。可以采用用于多肽纯化的常规方法分离和纯化抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用Kohler and Milstein,Eur.I Immunol.6:511-519,1976所述的技术或其修改版本制备单克隆抗体。还包括利用转基因动物(如小鼠)表达除宿主动物之外的不同物种的抗体(如人抗体)的方法。参见例如Neuberger et al.,Nature Biotechnology 14:826,1996；Lonberg et al.,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994；和Lonberg et al.,Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。这样的例子包括由
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开发的
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平台。在某些实施方式中，本文提供的抗体通过选自以下的至少一种方法获得：(1)将来自上述免疫动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生表达抗体的杂交瘤；(2)从上述免疫动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，以及经由PCR克隆抗体并表达抗体；或(3)从上述免疫动物的淋巴细胞中分离出mRNA，通过噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示、细菌展示、杆状病毒展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示文库获得抗体获得抗体(参见例如美国专利号7,244,592；Chao et al.,NatureProtocols.1:755-768,2006)。这些展示方法都是本领域的常规技术，其具体操作可以在相应的教科书或操作手册中找到，参见例如Mondon P et al.,Front.Biosci.13:1117-1129,2008。在某些实施方式中，抗体的结合位点或其抗原结合片段选自多个结合位点(例如，结合位点文库)，其包含多个4链抗体或其抗原结合片段(如dAb、Fab或scFv)或由其组成。
使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述TrkB激动剂抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸插入载体用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。编码所述单克隆抗体的DNA可以通过常规的方法分离和测序(如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性地与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合)。多种载体可供选择。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列(例如，翻译信号或前导序列)、复制起始点、一种或多种选择性标记基因、增强子元件、启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并包括质粒，例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1、pCMV-SCRIPT.RTM.、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等，以及其他可从实验室获得或市售的表达载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。载体可以维持单一拷贝或多个拷贝，或者整合至宿主细胞基因组中。可以将包含编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞用于复制或基因表达。适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母、昆虫细胞或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包括真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科，如肠杆菌属，例如大肠杆菌，肠杆菌，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌，如绿脓杆菌和链霉菌，芽孢杆菌，链球菌，链霉菌，葡萄球菌，肠球菌，乳酸杆菌，乳球菌，梭菌，土芽孢杆菌，海洋杆菌，假单胞菌，沙门氏菌，弯曲杆菌，螺杆菌，黄杆菌，梭杆菌，泥杆菌，奈瑟氏菌和脲原体。适宜的昆虫细胞包括果蝇Schnieder S2细胞和Sf9。适宜的酵母包括甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或普通面包酵母。优选的哺乳动物细胞包括CHO细胞、HEK293细胞、淋巴细胞和骨髓瘤。在某些实施方式中，当不需要抗体的糖基化和Fc效应功能时，抗体可以在细菌中产生。
除了上面的例子以外，许多其他属、种和株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；许旺酵母，如西方许旺酵母；和丝状真菌，如脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如钩巢曲霉和黑曲霉。
适用于表达糖基化的本文所述抗体或抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviralstrains)及其变体以及对应的容许性昆虫宿主细胞(permissive insect host cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的L-1变体和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。
但是，脊椎动物细胞最为重要，且培养的脊椎动物细胞(组织培养)的扩增已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞系实例有SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCCCRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；PC12；小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3)；NSO骨髓瘤细胞(不能内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的各种特征和机制。因此，可以选择适宜的细胞系作为宿主细胞以确保对所表达抗体正确的修饰和加工(如初级转录物、糖基化和磷酸化)。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是HEK293T细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。
用上述的可产生TrkB激动剂抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在某些实施方式中，可以采用本领域公知的方法将载体转移进入宿主细胞，如转化、电穿孔、磷酸钙处理、脂质体转染。在某些实施方式中，将载体转染进入真核细胞包括磷酸钙共沉淀、显微注射、电穿孔、脂质体转染和病毒感染。可以将真核宿主细胞与编码抗体的第二多核苷酸共转化。在某些实施方式中，含有转染载体的宿主细胞能够瞬时表达TrkB激动剂抗体。
用于生产本文所述抗体或抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma)，Luria肉汤(LB)和Terrific肉汤(TB)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中描述的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围的无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域技术人员公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在使用重组技术时，所述抗体及其抗原结合片段可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片段的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下解冻细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体及其抗原结合片段分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓缩过滤器，如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及加入抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、疏水色谱、反相色谱、吸附色谱、过滤、超滤、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析、免疫沉淀、等电聚焦、重结晶以及亲和色谱，其中亲和色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白A柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences)。蛋白G适用于所有鼠源同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚苯乙烯二乙烯基苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)。也可根据待收集的抗体来确定其他蛋白纯化技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶TM色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有目的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
试剂盒
在又一个方面，本公开内容提供了试剂盒，所述试剂盒包含TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，或者包含含有本申请所述的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒用于检测生物样品中TrkB的存在情况或水平。生物样品可以包含细胞或组织。
在一些实施方式中，将包含在试剂盒中的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段与可检测标记(例如，荧光、放射性或酶标记)偶联。在某些其他实施方式中，试剂盒包含未标记的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，或者包含含有未标记的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的药物组合物，并且进一步包含能够与未标记的TrkB激动剂抗体结合的第二标记抗体。试剂盒可以进一步包括检测标记的手段(例如，用于检测荧光标记的滤波器组，用于酶标记的酶底物等)。试剂盒可以包含用于进行特定方法的其他试剂和缓冲剂。试剂盒可以进一步包含使用说明书，以及分隔试剂盒中各成分的包装。在某些实施方式中，试剂盒包含用于检测TrkB激动剂抗体的免疫测定。
在某些实施方式中，包含在试剂盒中的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段与用于夹心测定(如ELISA)或用于免疫成像测定的底物或装置结合。可用的底物或装置可以是例如酶标板和检测试纸。
在某些实施方式中，提供了用于检测TrkB蛋白水平的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒用于预测、诊断、预防或治疗与TrkB相关的病况。
药物组合物和治疗方法
本公开内容进一步提供了包含TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的运载体的药物组合物。
用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受的运载体可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体运载体、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质、其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适宜的组分可包括，例如抗氧剂、保湿剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适宜的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在一种含有本文公开的抗体或抗原结合片段和偶联物的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可降低所述抗体或抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合活性或结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，提供的组合物中含有一种或多种本文所公开的抗体或抗原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本文进一步提供了多种方法，通过将本文中提供的抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧剂(例如甲硫氨酸)混合来防止所述抗体或抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。适宜的保湿剂包括乙二醇、甘油或山梨醇。适宜的润滑剂包括，例如鲸酯蜡、氢化植物油、硬脂酸镁、硬脂酸甲酯、矿物油、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠或白蜡，或者其两种或多种的混合物。适宜的乳化剂包括卡波姆、聚氧乙烯-20-十八烷基醚、十六十八醇、十六醇、胆固醇、硬脂酸二甘醇酯、硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、聚氧乙烯十二烷基醚、甲基纤维素、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚山梨醇酯、丙二醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇酯或硬脂酸。
为了进一步说明，药用可接受的运载体可包括，例如，水相介质如：氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液，非水介质如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油，细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌剂，等渗剂如：氯化钠或葡萄糖，缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可被加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适宜的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适宜的无毒辅助物质可包括，例如，润湿剂或乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、乳液、泡沫、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或粉末。口服制剂可以包括标准运载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用于注射的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的胃肠外制剂包装在安瓿、药瓶或带有针头的针筒中。本领域习知，所有胃肠外施用的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本文公开的抗体或其抗原结合片段溶解于适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有提高稳定性的赋形剂或者粉末状或由粉末制备的重构溶液的其他药理成分。适宜的赋形剂包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适宜的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术人员公知的缓冲液，在一个实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一个实施方式中，将所得的溶液分装至药瓶中冻干。每支药瓶可容纳单次剂量或多次剂量的所述TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支药瓶中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如，约10％)，从而保证取样准确和施用准确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重构得到用于胃肠外施用的制剂。在一个实施方式中，可将冻干粉加至无菌和/或无热原水或其他适宜的液体载剂中重构。精确的量由所选择的疗法决定，和可根据经验确定。
还提供了用于治疗TrkB相关病况的治疗方法，包括将治疗有效量的本文所述的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段施用给个体，由此治疗或预防与TrkB相关的病况或病症。在另一个实施方式中，还提供了治疗会从TrkB的活化获益的个体的病况的方法，包括对所述需要其的个体施用治疗有效量的本文所述的TrkB激动剂抗体。
本文中提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效剂量(当单独使用或与其他药剂(如化疗剂)联用时)依赖于本领域公知的多种因素，例如所治疗的疾病类型、抗体类型、体重、年龄、过往病史、现用治疗、个体的健康状况、免疫状况和交叉反应的潜在可能性、过敏、敏感和副作用，以及施用途径和类型、疾病的严重程度和进展，以及主治医师或兽医的判断。在某些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以每日一次或多次以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，每日一次或多次以约0.01mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段以约50mg/kg或更低的剂量施用，在某些实施方式中，剂量为20mg/kg或更低、10mg/kg或更低、3mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.3mg/kg或更低、0.2mg/kg或更低，或者0.1mg/kg或更低。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，可以在治疗过程中根据个体的反应改变施用剂量。
施用方案可通过调整达到最佳所需应答(例如，治疗应答)。在某些实施方式中，一次性地或在一系列的治疗中向个体施用本文所述的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，取决于疾病的类型和严重程度，通过一次或多次的单独施用，或通过连续输注，向个体施用本文所述的抗体或抗原结合片段。指导可见于例如美国专利号4,657,760；5,206,344；5,225,212。
本公开内容中的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的任何施用途径施用，例如胃肠外施用(例如，皮下注射、透皮施用(例如通过贴片施用)、体外施用、腹腔注射、静脉注射，包括静脉输注、肌肉注射或皮内注射)或非胃肠外施用(例如，口服施用、鼻内施用、眼内施用、舌下施用、直肠施用或局部施用)途径。本公开内容中的抗体和抗原结合片段可以施用于中枢神经系统(例如，进入脑(脑内或脑室内)、脊髓或脑脊液)或其任意组合。
在某些实施方式中，可以以控释方式施用本文公开的抗体和抗原结合片段。可以将控释胃肠外制剂制成植入物、油性注射剂或微粒系统(例如，微球、微粒、微囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒)(参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,Pa.,(1995)；Kreuter,J.,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter编，Marcel Dekker,Inc.，纽约州纽约，pp.219-342(1994)；Tice&Tabibi,Treatise on Controlled Drug Delivery,A.Kydonieus编，Marcel Dekker,Inc.NewYork，纽约州纽约，pp.315-339,(1992))。在某些实施方式中，可以在可降解或不可降解的聚合物基质中施用本文公开的TrkB激动剂抗体和抗原结合片段(参见Langer,AccountsChem.Res.26:537-542,1993)。
与TrkB相关的病况可以是与癌症或肿瘤。在某些实施方式中，病况是实体瘤、血液病、传染病、自身免疫性疾病或纤维化疾病。在某些实施方式中，实体瘤包括例如非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌，黑色素瘤、骨髓瘤、真菌病、梅克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤。血液系统病症包括如经典型霍奇金氏淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞白血病和红白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞衍生的肿瘤、EBV-阳性和阴性PTLD、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、与HHV8相关的原发性渗出性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓发育不良综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良、中枢神经系统肿瘤(CNS)如原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体可用于治疗神经元疾病，例如神经退行性疾病、精神病症、代谢疾病、脑损伤、视神经病变和视网膜退行性病症、涉及听力丧失的病症、神经发育病症、体重调节病症、肌肉病症和其他CNS疾病。
神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病(AD)、运动神经元疾病(包括进行性肌萎缩症)、帕金森病、朊病毒疾病(包括克雅氏病(OD))、路易小体疾病、脊柱肌肉萎缩、多系统萎缩、痴呆(包括额颞痴呆)和tau蛋白病变。更具体的神经退行性疾病包括ALS、亨廷顿病和运动神经元疾病。
精神疾病包括：焦虑、情绪障碍、抑郁(包括重度抑郁障碍)、恐慌症、创伤后应激障碍(PTSD)、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、双相情感障碍和精神分裂症。
神经发育障碍包括：天使人综合征，普拉德-威利综合征(Prader-Willisyndrome)、自闭症和Rett综合征。
特定的视神经病变包括：青光眼(例如开角型青光眼、广角型青光眼、闭角型青光眼(急性和慢性)、正常眼压性青光眼)、前部缺血性视神经病变(AION)(例如，非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION))、后部缺血性视神经病变、放射性视神经病变、压迫性视神经病变(例如视神经乳头水肿)、浸润性视神经病变、创伤性视神经病变、线粒体视神经病变、中毒性视神经病变、遗传性视神经病变(例如，常染色体显性视神经萎缩(ADOA；Kjer型视神经萎缩)、Leber遗传性视神经病变、罗森博格-丘托利亚综合征(Rosenberg Chutoriansyndrome)、Wolfram综合征、视神经发育不全)、视神经炎(例如视神经脊髓炎、乳头炎)。视网膜退行性疾病包括遗传性营养不良(例如视网膜色素变性)或获得性疾病，包括年龄相关性黄斑变性(湿性和干性)。在一个实施方式中，视神经病变包括影响视网膜神经节细胞(RGC)和/或视神经的病症。特殊的视神经病变包括：青光眼(例如开角型青光眼、广角型青光眼、原发性闭角型青光眼、正常眼压性青光眼)、前部缺血性视神经病变(AION)、非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)、创伤性视神经病和Leber遗传性视神经病变。视网膜退行性疾病包括遗传性或获得性疾病，包括年龄相关性黄斑变性(湿性和干性)。
听力丧失障碍包括感音神经性耳聋(SNHL)(双侧、单侧和未指定)和复合性听力损失(其中存在感音神经性和传导性损失元件；双侧、单侧和未指定)。感音神经性耳聋包括感觉性(耳蜗相关的)或神经性(第8神经相关的)听力损失。感音神经性耳聋可能由终末器官损伤引起。与感音神经性耳聋相关的终末器官损伤包括：声学创伤(由于噪声大于例如85分贝(db)而引起)、病毒性内淋巴迷路炎(viral endolymphatic labyrinthitis)、梅尼埃病(Meniere's disease)、第8神经的小脑桥脑角肿瘤、第8神经节的细菌或病毒感染，(例如伴有带状疱疹)、急性中耳炎引起的化脓性迷路炎、化脓性脑膜炎、慢性中耳炎、突发性耳聋(包括病毒来源的突发性耳聋，例如由腮腺炎、麻疹、流感病毒、水痘、单核细胞增多症和腺病毒等病毒引起的病毒性内淋巴迷路炎)和短暂性缺血性耳聋、颞骨骨折(延伸到中耳和使鼓膜破裂以及可能使听骨链破裂)、影响耳蜗的骨折以及听神经瘤(通常是施旺细胞来源的肿瘤，起源于第8神经的听觉或前庭分裂)。终末器官损伤的听力损失可以是先天性的，例如由以下因素引起的：风疹、出生时缺氧、分娩时由于外伤引起的内耳出血、施用给母体的耳毒性药物、胎儿成红细胞增多症和遗传性疾病(包括瓦登伯革氏综合症和贺勒氏综合症)。或者，感音神经性耳聋可以与年龄相关，例如老年性聋(包括老年性耳聋)，其是作为衰老的正常部分而发生的感音神经性耳聋。感音神经性耳聋可能是耳毒性听力损失(由能影响内耳的听觉部分特别是Corti器官的耳毒性药物(例如某些抗生素、某些化学治疗药物、某些水杨酸盐化合物特别是阿司匹林、某些利尿剂、常见的袢利尿剂和某些奎宁类药物)引起的听力损失)。
肌肉疾病包括肌肉减少症。
其他CNS病症包括：糖尿病神经病变、癫痫、多发性硬化症、偏头痛、神经损伤(包括创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤和周围神经损伤)、外周神经病变、神经肌肉疾病(包括重症肌无力和肌无力综合征)、睡眠障碍和中风。在一个实例中，周围神经病变包括化疗诱导的周围神经病变(CIPN)。CIPN是许多抗癌药物的主要剂量限制性副作用。
在某些实施方式中，所述TrkB激动剂抗体可用于治疗疾病、病症或障碍，或用于生产治疗疾病、病症或障碍的药物，这些疾病、病症或障碍包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)、中风、脊髓损伤、阿尔茨海默病(AD)、运动神经元障碍、创伤性脑损伤(TBI)、痴呆、tau蛋白病变、周围神经病变、神经损伤、周围神经损伤、帕金森病、朊病毒疾病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)、精神疾病、精神分裂症、多发性硬化症、Rett综合征、路易体疾病、多系统萎缩、重症肌无力、糖尿病神经病变、视网膜变性、青光眼、听力丧失、体重调节、神经性厌食症、恶病质、神经肌肉疾病、情绪障碍和抑郁症、创伤后应激障碍、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、双相情感障碍、焦虑症、自闭症、疼痛、涉及体重调节的疾病、神经性厌食症、恶病质、不想要的体重减轻和阿片类药物引起的呕吐。
阿尔茨海默病
目前，神经退行性疾病的发病机制在基因水平上大致可分为2种：一种是病原基因的突变导致毒素积累，另一种是具有自我修复能力的基因的突变或调节紊乱。目前对神经退行性疾病的研究倾向于关注疾病的发病机制，即如何减少导致神经元死亡的神经毒素。然而，基于这一思路来治疗老年性痴呆的药物研发，包括近年来的5个大型III期临床试验，均失败了(Karran和Hardy，2014；Mullard，2012)。主要原因是药物针对的是病原毒素。然而，当出现疾病症状时，毒素已经毒害神经元数年或甚至数十年，并且神经元已经严重受损甚至死亡。这时减少毒素为时已晚。一种新的方法是研究与疾病症状直接相关的病理生理学过程(Lu等，2013a)。到目前为止，突触损失是公认的神经退行性疾病的主要病理生理特征，其导致脑认知功能受损，与此同时神经元逐渐死亡，导致更严重的认知能力丧失和其他症状。前者在疾病的生理过程中是可逆的，所以很容易治疗。因此，突触修复是研究阿尔茨海默病治疗的最可行的切入点之一(Sheng等，2012)。
生物体本身主要通过脑源性神经营养因子BDNF来保护突触并修复突触损伤。该基因的异常或表达异常可能会增加早发性阿尔茨海默病的发生几率并加速疾病的发展(Lu等，2013a)。作为神经营养因子家族中最重要的成员，在神经发育中，BDNF在神经元存活、神经可塑性和其他重要功能中起着非常重要的作用。其主要功能是由高亲和力的受体TrkB介导的(Chao和Lee Huang，2004；Reichardt，2001；Poo，2001)。一个BDNF基因的常见变体(单核苷酸多态性，SNP)是其第66位氨基酸从Val变为Met(Egan等，2003)，该变体使突变携带者的海马和杏仁核变小，并且降低了各种记忆(包括情景记忆和视觉空间记忆等)的水平。这些症状和较低的BDNF水平可在模型小鼠和阿尔茨海默病患者中同时测得，这表明在阿尔茨海默病的工作中，与BDNF有关的研究尤其必要(Dennis et al.Sanchez et,2011；al.,2011；Voineskos et al.Yang et,2011；al.,2012)。在患有阿尔茨海默病的啮齿动物和灵长类动物模型中，通过使用病毒来过量表达BDNF可以抑制神经元死亡(Nagahara等，2009)。更重要的是，在过去几年的研究中，我们发现在携带BDNF Met66基因型的ApoE4阳性的健康人和病人(欧洲人)中，在脑颞叶和前额皮质中会产生和聚集更高水平的β斑块(参见上文)。同时海马体积和情景记忆能力下降得更快。这些表明BDNF对于阿尔茨海默病的修复和治疗非常重要。因此，它是一种非常有前途的治疗靶点(Lu等，2013a；Nagahara和Tuszynski，2011)。本公开内容在此提供了TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，它们在预防、治疗、缓解阿尔茨海默病和其他痴呆、延迟阿尔茨海默病和其他痴呆的发生或降低发展成阿尔茨海默病和其他痴呆的风险(包括减缓认知功能下降的进展)方面与BDNF功能相似或比更BDNF有效。TrkB激动剂抗体可以增强细胞存活、促进神经突向外生长和/或调节突触可塑性。
肌萎缩侧索硬化症(ALS)
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是最常见的运动神经元疾病(MND)类型，这种疾病中，上和下运动神经元都受到影响(Wijesekera和Leigh，2009)。在病理学上，ALS患者显示在其脊髓前角、脑干和运动皮层中的运动神经元数量减少。运动神经元的损失导致肌肉去神经支配和萎缩。患者的特征是运动功能逐渐丧失，包括肌肉无力和吞咽困难，最后死于呼吸衰竭(Boillee等，2006；Mitchell和Borasio，2007)。大多数ALS病例是散发性的，5～10％是家族性病例。SOD1是首个发现的ALS相关基因，其突变占家族性病例的20％(Rosen，1993)。到目前为止，发现超过20个基因在突变时引起家族性ALS，在散发病例中也发现了基因突变(Couthouis等，2011；Wijesekera和Leigh，2009)。虽然存在遗传异质性，但是受影响区域的蛋白质沉积是ALS的常见标志。
目前没有治愈ALS的方法，而利鲁唑(一种谷氨酸释放抑制剂)显示出了温和的效应，能将存活提升数月(Carlesi等，2011；Miller等，2007)。经过数十年的研究，仍然没有关于ALS的致病机制的共识，这阻碍了有效疗法的开发。另一种策略试图通过激活内源性神经营养因子通路来提升运动神经元的存活，而不是特异性地阻断导致运动神经元死亡的致病过程(Lu等，2013)。脑源性神经营养因子(BDNF)以高亲和力结合原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)，其下游通路促进细胞存活和神经突生长(Huang和Reichardt，2003；Reichardt，2006)。有证据表明，病理状况下BDNF-TrkB信号的异常。早期报道显示，在ALS患者的脊髓中，TrkB mRNA和蛋白水平高于对照水平，但TrkB蛋白的磷酸化程度较低(Mutoh等，2000)。在ALS患者肌肉中，BDNF的mRNA和蛋白水平也显示为升高(Kust等，2002)。肉瘤融合(FUS)基因内的突变也导致ALS(Kwiatkowski等，2009；Vance等，2009)。最近，DNA/RNA结合蛋白FUS被发现参与调节BDNF的表达和选择性剪接(Lagier-Tourenne等，2012；Qiu等，2014)，暗示了致病突变和受损神经营养因子信号传导的关系。在表达突变体FUS的小鼠中，BDNF前mRNA的剪接受损，并且BDNF蛋白和TrkB磷酸化的水平降低(Qiu等人，2014)。
已经做了许多努力来开发BDNF和相关分子以治疗神经和精神疾病。已经在几种神经退行性疾病中检测了BDNF的效应(Bai等人，2010；Gharami等人，2008；Nagahara和Tuszynski，2011；Lu等人，2013)。虽然BDNF的转基因或病毒表达似乎对神经退行性疾病模型具有积极的效应，但简单的BDNF施用并没有积极的效应，这要归因于其较差的药代动力学和物理特性(Gharami等，2008；Xie等，2010；Thoenen等，2002)。本公开内容建立了一个制造和筛选几种TrkB激动剂单克隆抗体的系统，不仅用于神经退行性疾病的药物开发，还用于对TrkB的信号传导和结构的潜在科学研究。
已经证明，BDNF-TrkB信号传导的激活能有效地治疗动物模型中的脊髓损伤(Gransee等人，2013；Kishino等人，1997；Mantilla等人，2013)。但是，在ALS的啮齿动物模型中，BDNF的施用不能减缓疾病进展，并且BDNF在临床试验中不能使ALS患者受益(1999；Ochs等，2000)。这可能归因于BDNF较差的药代动力学和扩散性，其导致BDNF的高局部浓度，最终导致TrkB表达降低(Dittrich等，1996；Knusel等，1997)。据报道，有几种小化合物能刺激TrkB并可用于某些神经退行性疾病(Longo和Massa，2013)。但是，也有一项工作报告了有些混乱的结果(Todd等，2014)。并且似乎不太可能根据BDNF/TrkB复合物的结构发明一种小化合物来模拟BDNF的二聚化效应。先前的报道显示，特异性抗体可通过交联两个单体受体激活受体酪氨酸激酶，从而模拟天然配体(Clary等，1994；LeSauteur等，1996)。与BDNF相比，TrkB激动剂抗体具有更高的特异性、更长的半衰期等优点。TrkB激动剂单克隆抗体特异性地激活TrkB，但不激活TrkA和TrkC。更重要的是，TrkB激动剂Mab不结合p75NTR，因此不会诱导如BDNF-p75NTR可能诱导的负面效应那样的任何负面效应(Lu等，2005)。本公开内容在此提供了TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，它们在预防、治疗、缓解、延迟ALS的发生或降低发展成ALS的风险方面与BDNF功能相似或比BDNF更有效，包括促进运动神经元的存活和功能。
青光眼
青光眼是一种神经退行性眼病，其在视神经乳头(视神经盘)和视神经中具有病理变化，并且通常伴有视野损失和IOP升高(NICE，2009)。在过去的30年中，青光眼在全球一直是失明的主要原因(Dandona和Dandona，2006；Quigley，1996；Quigley和Broman，2006)。大约10％的英国失明登记归因于青光眼(Casson等，2012；NICE，2009)。在流行病学领域，随着社会的急速老龄化和信息时代眼疲劳的普遍存在，青光眼患者的人数迅速增长(图2和表1)。预计到2020年，中国青光眼患者总数将达到约2180万，占40岁以上中国人口总数的3.05％，超过世界平均水平2.86％。由于青光眼的RGC和视神经的损伤是不可逆的，各种青光眼都有很大的导致最终失明的潜在可能性。但是，根据现在中国的医疗情况，大多数人由于没有健康保险，不会在青光眼早期去医院检查他们的眼睛。因此，基于医疗情况和青光眼的进行性失明特点，中国青光眼患者的增加给家庭和社会带来了巨大的负担。我们的最终目标是寻找靶向神经营养性通路的有效药物或抗体，以减缓和逆转青光眼的进行性失明以及使晚期青光眼中受损的RGC和轴突再生。一般认为，传统的临床疗法不能逆转青光眼进展。
Barkan在20世纪30年代首先将青光眼分为闭角型和开角型(Barkan，1938)。现在，虽然青光眼的分类看起来很复杂，但它还是基于两个相对简单的标准。一个是IOP值，另一个是是否有解剖性虹膜接触(Casson等，2012)。各种青光眼具有相同的特征，即GON，其可通过多种眼科临床方法检测和诊断，如测量神经视网膜边缘厚度、扫描视网膜和视神经乳头的异常，以及检测其水平宽度(NICE，2009)。虽然并非所有的青光眼患者都患有IOP升高(部分患者的IOP在早期不能被观察到)，但是降低所有青光眼患者的IOP对他们的视力有积极的效应，从而能延缓最终失明并降低RGC损失(Heijl等，2002；Leske等，1999)。因此，在许多国家，升高的IOP始终被认为是早期或疑似青光眼的重要标志。
青光眼的进展伴随有IOP升高的原因目前尚不十分清楚。一个强有力的假设是压力诱导的轴突运输阻塞(Johnson et al.,2000)，其认为视网膜和RGC的存活受神经营养因子从下游脑区(例如上丘(SC)和外侧膝状核(LGN))逆行运输的保护。一些研究提供了大量的免疫染色或同位素实验，其证实IOP升高伴随有视神经中BDNF和NT4/5的分布减少以及胶质细胞增殖的增加(Johnson等，2000；Quigley等，2000)。此外，在青光眼模型中TrkB的轴突运输受阻(Pease等，2000b)。因此，虽然少数研究表明，基于某些免疫染色或原位杂交实验，受阻碍的神经营养因子转运假说不够稳固，但是拯救受阻碍的神经营养因子逆行运输被认为是治疗青光眼的一种有效的方法(Guo等，2009)。
基于先前的研究，已经研究了几种与实验性青光眼进展相关的神经营养通路，包括TrkA-NGF信号传导(Shi et al.,2007；Sposato et al.,2008)，TrkB-BDNF信号传导(Guoet al.,2009；Iwabe et al.,2007；Pease et al.,2000a)，TrkC和p75信号传导(Bai etal.,2010a)。此外，青光眼进展期间的小胶质细胞功能变化在最近受到了关注(Srinivasan等，2004)。无论如何，神经营养通路将是青光眼疗法的关键突破，其有助于轴突再生和RGC的功能恢复，而RGC的异常被认为是与视网膜、脑核和区域的青光眼损伤，甚至全脑的功能性转变相关的关键原因(Frezzotti等，2014；Georgiou等，2010；Williams等，2013)。本公开内容侧重于TrkB-BDNF信号传导，这是RGC存活和神经突向外生长的主要信号传导通路(Guo等，2009；Iwabe等，2007；Pease等，2000a)，当然其他因素也很重要。这个信号传导通路相对清楚，并且不与其他非神经元细胞类型(如小胶质细胞)混合。基于先前有关青光眼进展的神经营养因子运输阻塞假说(Guo等人，2009；Iwabe等人，2007；Pease等人，2000a)，RGC末端中TrkB的内吞作用在神经元存活中起作用。本公开内容在此提供了TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，它们在预防、治疗、缓解青光眼、延迟青光眼的发生或降低发展成青光眼的风险方面与BDNF功能相似或比BDNF更有效。
中风
中风是由脑血管的破裂或凝块引起的神经血管疾病。这是一个全球性的健康问题，且在中国是头号杀手。每年约有250万人中风，超过160万人死于这种疾病。由于脑毛细血管密度高，脑的任何区域都可能发生中风，导致各种后遗症，其中最常见的是偏瘫。因此，迫切需要对该疾病的治疗进行研究。
缺血性中风的主要机制包括ATP依赖性离子通道的失能、钙离子超载、兴奋性细胞毒性、自由基的产生、细胞凋亡和免疫应答。由于这些相互作用的通路的复杂性，在相当长的治疗窗口中调节细胞存活和促进神经发生的靶标(例如TrkB)可能是有希望的靶标。
据报道，BDNF能有效地减少中风模型中的梗塞体积和细胞死亡，并改善行为性效果。相反，阻断BDNF-TrkB通路会使疾病恶化。除了调节细胞存活，BDNF还促进轴突生长、改善突触功能并加速神经发生、分化和迁移。这表明BDNF可以将治疗窗口延长至中风后数天。本公开内容在此提供了TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，它们在预防、治疗、缓解中风、延迟中风的发生或降低发展成中风的风险方面与BDNF功能相似或比BDNF更有效。
使用方法
本公开内容还提供了使用TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的方法。
在一些实施方式中，本公开内容提供了治疗受试者中与TrkB相关的病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，受试者已被鉴定为患有可能对TrkB激动剂产生应答的疾病或病况。在某些实施方式中，本公开内容提供了预防、检测或诊断与TrkB相关的病况的方法，包括将本文所述的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段与获取自疑似患有或患有与TrkB相关的病况、或处于与TrkB相关的病况的风险中的个体的生物样品接触，并确定与生物样品中的TrkB结合的TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段的水平。
对于治疗与TrkB相关的病况，受试者被检测为TrkB表达阳性，或被检测为TrkB表达水平升高。可以使用各种方法来确定来自受试者的测试生物样品中的TrkB存在情况或水平。例如，可以将测试生物样品暴露于TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段，所述TrkB激动剂抗体或其抗原结合片段与TrkB蛋白结合并检测其表达。或者，还可以使用诸如qPCR、逆转录PCR、微阵列、SAGE、FISH等的方法在核酸表达水平对TrkB进行检测。在一些实施方式中，生物样品来源于细胞或组织(例如，来自器官的活检组织)、肿瘤细胞或体液(例如，血液或血清)。在某些实施方式中，在测试生物样品中存在TrkB或其水平上调表明可能产生应答。在本文中所使用的术语“上调”指与使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来检测参照样品的TrkB蛋白水平相比，使用相同抗体来检测样品的TrkB蛋白水平的总的增加不少于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。参照样品可以是从健康或无疾病的个体中获得的对照样品，或者是从测试样品来源的受试者中获得的健康或无疾病的样品，或者是在治疗病况过程中的较早时间点从同一受试者获得的样品。例如，参照样品可以是与测试样品(例如，肿瘤)临近或在其附近的无病样品。
本文公开的抗体或抗原结合片段可单独施用或与一种或多种其他治疗手段或物质联合施用。例如，本文公开的抗体或抗原结合片段可以与第二疗法联用，如放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息疗法、用于治疗癌症的手术(例如，肿瘤切除术)、用于化疗引起的并发症的一种或多种止吐药或其他治疗，或者是用于治疗由TrkB介导的任何医学病症的第二治疗剂，例如另一种神经营养因子(如BDNF、神经营养因子-3(NT-3)、NT-4/5、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF))、另一种抗体、治疗性多核苷酸、化疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、其他细胞毒性剂、生长抑制剂。在某些这样的实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种其他的治疗剂联用时，可与所述的一种或多种治疗剂同时施用，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段和其他治疗剂可作为同一个药物组合物的一部分施用。但是，与其他治疗剂“联用”的抗体和抗原结合片段不需要与所述治疗剂同时施用或与该治疗剂在同一组合物中施用。在另一个治疗剂之前或之后施用抗体和抗原结合片段，也被视为是与该另一个治疗剂的“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与这第二种治疗剂通过不同施用方式施用。在可能的情况下，与本文公开的抗体或抗原结合片段联用的其他治疗剂可参照该其他治疗剂的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，第57版；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
在一些实施方式中，使用所述抗体及其抗原结合片段的方法包括预防细胞凋亡和/或坏死性凋亡或者提高细胞存活的方法。在一个实施方式中，所述方法包括使本文提供的抗体或药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
在一些实施方式中，使用所述抗体及其抗原结合片段的方法包括基于细胞的疗法，其用于治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险。在一个实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用细胞，其中所述细胞在其细胞表面上表达本文提供的抗体或药物组合物。
用于改造细胞以表达本文提供的抗体的方法已在前面的部分中描述过了。可以被改造成表达所述抗体并用于基于细胞的方法的合适的细胞可以是与移植和细胞疗法相容的任何细胞。在一些优选的实施方式中，所述细胞来源于接受所述治疗的受试者。在一些实施方式中，所述细胞衍生自来自所述受试者的多能细胞。在一些实施方式中，所述多能细胞是诱导性多能细胞(iPS)。
以下实施例旨在更好地说明请求保护的发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明本发明的范围内的特定实施方式。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，本发明保护范围包括对本发明的方法作出的多种改动。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1：材料和方法
1.通过杂交瘤技术生产小鼠单克隆抗体
(1)抗原的制备
将TrkB细胞外结构域的编码序列克隆到含有信号肽的Pfastbac载体中，并使用昆虫sf9细胞系纯化蛋白质。制备两种具有不同标签的蛋白质：用于免疫动物的TrkB-ECD-hFc和用作筛选抗原的TrkB-ECD-His。
(2)动物免疫
将抗原(重组的TrkB-ECD-hFc)溶解于DPBS中，并用于免疫约6-8周龄的BALB/C小鼠，所述免疫通过皮下注射途径进行。在快速免疫过程中，将这些小鼠免疫约8次。
(3)淋巴细胞分离
免疫后，通过滴度ELISA测试选择动物用于收集。简单来说，将来自被免疫小鼠或初始小鼠的血清加入到具有TrkB-ECD-his蛋白涂层的ELISA板中。根据450nm处的光密度确定每只小鼠的滴度。处死免疫小鼠并收集淋巴结。将这些淋巴细胞悬浮于DMEM中，随后与骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14融合。
(4)细胞融合
在PEG(P7306,sigma)的介导下将淋巴细胞与Sp2/0-Ag14融合。随后将融合的细胞悬浮在HAT选择培养基(21060-017，Gibco)中。杂交瘤对选择培养基耐受，并具有无限增殖能力。在第7天或第10天，更换一半的培养基。
(5)杂交瘤高通量筛选和亚克隆化
在选择性培养约14天后，筛选杂交瘤上清液的TrkB特异性单克隆抗体。使用ELISA来分析抗体的亲和力，以及使用NFAT测定来选择具有活性的TrkB激动剂。在选择了阳性细胞库后，通过经典的有限稀释法进行亚克隆化。
(6)单克隆抗体同种型的鉴定和杂交瘤测序
使用ELISA试剂盒(BAT0296，Sino)鉴定单克隆抗体的同种型。用5’RACE试剂盒(目录号634858和634859，Clontech)进行杂交瘤测序。
2.通过酵母展示生产兔单克隆抗体
将抗原(重组的人TrkB-ECD)溶解于DPBS中，并用于免疫约6-8周龄的兔，所述免疫通过皮下注射途径进行。免疫后，通过滴度ELISA测试选择动物进行B细胞制备。处死被免疫的兔并收集淋巴结。通过将轻(VL)和重(VH)链的重排可变结构域进行组合克隆使被免疫兔的B细胞免疫球蛋白库永生化，将B细胞免疫球蛋白库引入酵母中并以单链FV(scFV)的形式展示在酵母表面上。用FACS对scFV抗体进行亲和选择，随后将它们重建成IgG抗体的完整模板。用NFAT试验对激动剂抗体做进一步筛选。示例性的兔单克隆抗体为TrkB-agoAb202和TrkB-agoAb203。
3.蛋白质的表达和纯化
将人TrkB基因(登录号S76473.1)的TrkB-ECD430(对应于第30-430位的氨基酸序列，即全长细胞外结构域)和TrkB-ECD365(对应于第30-365位的氨基酸序列，D1-D5细胞外结构域，不包括细胞外近膜(EJM)区域)基因片段克隆到pFastBac Dual中，其在C末端具有6×His标签。使用来自Invitrogen的Bac-to-Bac系统产生含有上述TrkB-ECD基因的杆状病毒。在感染了SF9细胞后，将培养物在27℃下在MSF1培养基中孵育。
孵育72小时后，收集培养物的上清液并在4℃下以4,000rpm离心20分钟。超声处理上清液以破坏细胞膜。将该上清液进一步高速离心，并将上清液用于蛋白质纯化。使用镍柱(70501-5，Beaver)和分子筛进行蛋白质纯化。在上样含有靶蛋白的上清液之前，用1×TBS缓冲液平衡镍柱。当靶蛋白特异性结合柱时，用缓冲液洗掉非特异性蛋白。用高浓度的咪唑缓冲液洗脱靶蛋白。随后将洗脱液上样到分子筛上，此时，高分子量蛋白质比低分子量蛋白质更早洗脱。使用Superdex200(17517501，GE)纯化靶蛋白。
4.NFAT
按照CHO-hTrkB NFAT试剂盒(K1095，Life Technologies)提供的方案进行实验。在实验前一天，将CHO-hTrkB细胞(K1435，Life Technologies)接种于具有32μl培养基的384孔板中。在37℃下用BDNF或TrkB-AgoAb处理5小时后，将培养物在室温下与8μl底物一起孵育2小时。用酶标仪(Envision，PerkinElmer)获得信号。
5.AlphaLISA
如前所述裂解细胞。在白色不透明板中，在每个孔中加入10μl供体微珠(6760617M，PerkinElmer)和10μl生物素标记的抗TrkB单克隆抗体(BAF397，R&D)，并在37℃下在柔和光下孵育30分钟。将10μl裂解物、10μl抗TrkB抗体(ab51187，Abcam)和10μl受体微珠(6760617M，PerkinElmer)加入到相应的孔中，并在37℃下在柔和光下孵育1小时。用Envision(PerkinElmer)测量信号并随后进行分析。
6.Delfia
用抗pTrkB抗体(4621S，CST)的碳酸盐缓冲液(pH 9.2)包被96孔微板(163320，NUNC)。将该板在4℃下孵育过夜。洗涤板两次。用封闭缓冲液在37℃下将板封闭2小时。然后用PBST洗涤板两次。
检测：向包被了第一抗体的板中加入50μl裂解物。将板在室温(RT)下孵育2小时，同时缓慢摇动。以50μl/孔将4μg/ml生物素山羊抗TrkB抗体(BAF397，R&D)的裂解缓冲液(CST)加入到板中。将板在室温下孵育1小时，同时缓慢摇动。随后洗涤板3次。充分清除洗涤缓冲液，并在测定缓冲液中加入100μl/孔的200ng/ml Eu标记的链霉抗生物素蛋白(1244-360，Perkinelmer)。将溶液在室温下孵育30分钟，同时缓慢摇动。随后洗涤板5次。加入50μl/孔的增强溶液，随后缓慢振荡孵育10分钟。使用Envision(默认的DELFIA配置)进行检测。
7.Biacore(SPR)(Biacore T200，GE)
超声洗涤PBS中的CM5芯片。用相同的PBS替换候选抗体和靶蛋白的缓冲液。将靶蛋白质稀释至1μg/μL作为固相，并将候选抗体按梯度稀释至7份稀释液作为流体相。获得信号后，使用Biacore Evaluation软件创建拟合曲线。ch2<Rmax/10表示良好的置信水平。
8.原代海马神经元的培养和处理
从胚胎日(E)18天的SD大鼠中分离出大脑皮层，置于HBSS中，随后剥离蛛网膜，解剖海马体并置于消化培养液(0.125％胰蛋白酶，Invitrogen，15050065)中。在37℃下消化20分钟后，用完全培养基(补充有10％FBS和GlutaMax的DMEM培养基，Gibco)终止反应。轻轻捣碎组织直至混浊，并沉降几分钟。将混浊的上清液转移到另一管中。重复该步骤直至组织消失。将悬浮液混合并使用血细胞计数器计数悬浮液中的细胞。将神经元以1000,000个细胞/孔接种在经100ng/ml聚-D-赖氨酸包被的(Sigma，030M5021V)直径为3.5cm的板上。孵育4-6小时后，完全吸出完全培养基并用维持培养基(补充有B27和GlutaMax的神经基质培养基，Gibco)更换。每3天用维持培养基更换一半的原维持培养基。将神经元培养10-14天后用BDNF或TrkB-AgoAb进行刺激。
9.细胞系培养
将所有细胞在37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育。CHO细胞在补充有10％FBS(16000044，Life technology)的FK-12K培养基(21127-022，Gibco)中培养。将PC12细胞培养在补充有5％FBS和10％马血清(HS)的DMEM培养基中。SH-SY5Y细胞在补充有15％FBS的RPMI1640培养基中培养。原代神经元的完全培养基是补充有10％FBS和1％GlutaMAX-I(35050061，Gibco)的DMEM培养基。原代神经元的维持培养基为神经基质培养基(NeuroBasal)(10888022，ThermoFisher Scientific)，其补充有2％B-27和1％GlutaMAX-1。所有这些培养基都补充有0.2％的青霉素和链霉素。在添加有5μg/mL杀稻瘟菌素(R210-01，Invitrogen)的这些培养基中培养CHO-hTrkB。当细胞传代时，用HBSS洗掉原培养基，并使用0.05％EDTA胰蛋白酶消化细胞。然后将细胞铺板在板上用于实验或维持(maintenance)。
10.细胞转染
使用Lipofectamine 2000试剂盒(11668-019，Invitrogen)转染细胞，并按照说明进行所有操作。细胞的含量为约90％。使用Opti-MEM(31985-070，Invitrogen)分别稀释质粒和Lipofectamine 2000(11668-019，Invitrogen)，随后，将稀释的质粒轻轻地加入稀释的Lipofectamine 2000中并在室温下孵育30分钟。最后，将此混合物加入细胞培养基中并轻轻混合。将转染的细胞在培养箱中孵育24小时。
11.SDS-PAGE和Western印迹
用冷的PBS洗涤细胞3次，并在冰上在缓冲液中裂解细胞30分钟，缓冲液含有50mMTris-HCl(pH 8.0)、250mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸盐、0.1％SDS和蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)。离心除去不溶物后，用10％SDS-PAGE分离溶解中的蛋白质，并转移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)。用5％BSA的Tris缓冲盐(含有0.1％Tween(TBST))封闭膜，并在4℃下与抗体孵育过夜，所述抗体稀释在5％BSA的TBST中，同时轻轻摇动。用TBST洗涤膜，将膜与第二抗体一起孵育，用TBST洗涤，再用TBS洗涤，并用SuperSignal WestPico化学发光底物(34080，Pierce)显影。
12.免疫共沉淀
用冷的PBS洗涤细胞3次，并在冰上在缓冲液中裂解细胞20分钟，缓冲液含有50mMTris-HCl(pH 8.0)、250mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸盐、0.1％SDS和蛋白酶抑制剂(4693132001,Roche)(Roche Diagnostics)。离心除去不溶物后，将裂解物中的蛋白质与靶蛋白在4℃下孵育过夜。将20μl蛋白A珠(sc-2003，Santacruz)加入蛋白质混合物中。将这些混合物在4℃下孵育4-5小时后，用裂解缓冲液洗涤珠子3次。随后除去上清液，并向沉积的珠子中加入20μl上样缓冲液。以95℃加热10分钟将与珠子偶联的蛋白质变性并进行解偶联。
13.运动神经元的培养和细胞死亡测定
通过颈脱位使E13怀孕小鼠安乐死。小心地将胚胎从子宫中取出并保持在冰冷的HBSS中。用镊子协助斩首和取下尾巴。将胚胎背侧朝上。用镊子去除皮肤的外面薄皮和打开脊髓的中央通道。将分离的脊髓转移到新的装有神经基质培养基的培养皿中，并将脊髓背部向上放置。去除背根神经节(DRG)和鞘脑膜。随后将分离的脊髓切成小块，并在37℃下在消化液(含有木瓜蛋白酶和DNA酶的神经基质培养基)中孵育20分钟。旋转沉淀并丢弃消化液，用5mL移液管在新鲜的神经基质培养基中轻轻捣碎细胞聚集体。首先将所得悬浮液在室温下以600rpm离心5分钟，以除去细胞碎片。然后使用基于Optiprep(D1556，Sigma，USA)的密度梯度离心来富集运动神经元，该方法从Graham发表的方案中改进(Graham，2002)。弃去上清液，将沉淀重悬于HBSS中，并将悬浮液铺在3mL 10.4％(w/v)Optiprep垫层的上面，并在室温下400xg离心25分钟。收集富含运动神经元的顶层，随后加入10mL神经基质培养基，再在室温下以1200rpm离心10分钟，收集细胞。最后将细胞沉淀悬浮于运动神经元完全培养基(含有10％马血清、1X B27和1X glutaMAX的神经基质培养基)中。在包被有PDL和层粘连蛋白的培养皿或盖玻片上铺上适当数量的细胞。细胞附着到培养皿表面后，小心地用完全培养基(含有神经营养因子或抗体)替换原培养基。
按照说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒(11684795910，Roche)测定细胞的死亡。简单地说，用4％PFA的PBS溶液将细胞固定20分钟并透化，然后在TUNEL反应溶液中孵育。使用高内涵扫描和分析系统对ChAT和荧光素双标记细胞进行评分。
14.免疫细胞化学
胆碱能运动神经元可通过区别于其他脊髓细胞的胆碱酰基转移酶(ChAT)高表达水平来进行鉴定(Camu和Henderson，1992)。将细胞在4％PFA的PBS溶液中固定20分钟，并按照标准方案用山羊抗ChAT抗体(AB143，Merk Millipore，USA)进行免疫染色。通过测定免疫标记细胞的百分比来评估培养物的纯度。通常，在用抗神经元III类b-微管蛋白抗体(AT-809，Beyotime Biotechnology，China)免疫标记细胞后，测定神经突的数目和长度。使用高内涵扫描和分析系统(ArrayScan VTI 700，Thermo，USA)，按照神经元谱V4方案(neuronalprofile V4 protocol)，来测量神经突的长度。
15.通过免疫淘选纯化和培养小鼠RGC
在4℃的DPBS(Gibco，14040-216)中将出生后7天小鼠的视网膜剖离。在37℃下在木瓜蛋白酶(Worthington Biochemical LS003126)溶液(含50μL木瓜蛋白酶的10mL DPBS，DNase 0.4％，L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich C7477)，通过10μL 1M NaOH调节pH至7.4)中消化视网膜。去除木瓜蛋白酶溶液并分别在低卵粘蛋白溶液(low-ovo solution)和高卵粘蛋白溶液(high-ovo solution)中重悬细胞，再在25℃下以1000r/min离心12分钟。通过将3gBSA(Sigma-Aldrich A8806)+3g胰蛋白酶抑制剂(Worthington LS003086)或6g BSA+6g胰蛋白酶抑制剂溶解在200ml DPBS中制备低和高卵粘蛋白10X原液，并将pH调节至7.4。
将细胞重悬于淘选缓冲液(18mL D-PBS，2mL 0.2％BSA和57μL胰岛素(BeyotimeP3376))中，并在4℃下在包被有BSL-1溶液(BSL(Vector Labs L-1100)20μL BSL-1和20mLD-PBS)的阴性淘选板中过夜进行淘选。30分钟后收集未结合的细胞，每15分钟轻轻摇动一次。以相同的方式，进行10分钟的第二次阴性淘选或直到看到RGC与板连接为止。收集的细胞悬浮液在用DPBS冲洗平板三次之后和之前，经历4℃的包被有山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)二抗(Jackson ImmunoResearch 115-005-044)(1:250)和包被有小鼠抗小鼠Thy1.2(CD90)IgM一抗(Serotec MCA02R)(1:1000)的阳性淘选板。
在淘选后，将100μL胰蛋白酶原液加入4mL温热的EBSS中，在37℃的细胞培养箱中孵育4分钟。将细胞转移到20mL通用管中，并加入4ml FBS溶液(30％FBS的DPBS)以停止胰蛋白酶消化。在25℃下以1000r/min离心细胞12分钟，并将细胞重悬于RGC生长培养基中。在96孔板中铺板，每孔100μL细胞悬浮液。将96孔板用小鼠层粘连蛋白溶液(层粘连蛋白(1mg/mL)，通过向5mL神经基质培养基中加入10μL层粘连蛋白原液使其终浓度为50μg/mL)和PDL溶液(1mg/mL；100×)在37℃培养箱中包被过夜(100μL每种/孔)。
16.通过RGC培养的神经元存活测定
通过
Figure BDA0002271289310000561
VTI HCS读数器(Thermo，ArrayScan VTI 700)在DIV7原代培养物中进行RGC存活率的测定。DIV7原代培养物经PFA(4％)固定，并通过DAPI、Brn3a和Tuj-1进行免疫染色。存活的RGC可以通过神经元的形态进行识别。淘选后在96孔板的每个孔上接种约30,000个RGC，每隔一天通过更换一半体积的培养基饲喂细胞，并在5个平行孔中用不同的药物处理，药物包括BDNF 1nM、CNTF 1nM、弗司可林(Forskolin)5μM或这些底物的混合物。
17.脊髓根部撕脱伤
这个研究中使用成年雌性的Sprague Dawley(SD)大鼠(250-300g体重，70-90天龄)。通过腹膜内注射，用氯胺酮(80mg/kg，体重)和甲苯噻嗪(8mg/kg)的混合物麻醉动物。将第5至第7颈椎(C5-C7)的右脊柱部分暴露出来。在椎板C6上进行背侧椎板切除术以暴露C7背根。打开硬脑膜后，使用细玻璃钩将右侧C7根部(背侧和腹侧)撕裂。在远端C7脊神经上进行另一次切割，并除去断开的C7背侧和腹侧根部以及一小段脊髓神经。立即将浸泡有5μgBDNF、5μg TrkB激动剂或相同体积的PBS的明胶海绵轻轻置于受损的脊髓表面上。之后，在损伤部位附近皮下埋入渗透微型泵，该渗透微型泵填充有与明胶海绵中相同的溶液。将泵与管连接，管将释放的药物导向受损的脊髓表面。分组和样本大小如下所示：
1)假手术组(N＝7)：
无撕脱+明胶海绵(含5μl PBS)+泵(每天释放12μl PBS)
2)PBS处理的阴性对照(N＝7)：
C7撕脱+明胶海绵(含5μl PBS)+泵(每天释放12μl PBS)
3)BDNF处理的阳性对照(N＝8)：
C7撕脱+明胶海绵(含5μg BDNF)+泵(每天释放1μg,12μl BDNF)
4)TrkB激动剂(低浓度)(N＝8)
C7撕脱+明胶海绵(含5μg TrkB激动剂)+泵(每天释放1μg,12μlTrkB激动剂)
5)TrkB激动剂(高浓度)(N＝8)
C7撕脱+明胶海绵(含5μg TrkB激动剂)+泵(每天释放6μg,12μlTrkB激动剂)
对腹侧脊髓C6-C8进行灌注和切片，厚度为20μm。腹侧脊髓的每四个切片用于Nissl染色。只有具有清晰的核并且细胞直径超过30μm的才被计为运动神经元。
18.顺磁珠青光眼小鼠模型
在眼内注射顺磁珠(20160000-1，bioWORLD)之前，应当先用荧光标志物标记RGC。选择4％的Fluorogold(AB153，Merck Millipore)溶液，通过双侧脑立体定向注射到上丘中来进行逆行标记。点位置在前囟后面6.0毫米、侧1.0毫米、深4.5毫米，用33G钢针每侧1微升。手术后，小鼠应在饲养笼中休息两周，然后进行眼内注射。使用30号针头进行顺磁珠的眼内注射(Samsel等，2011)。在不到2分钟的时间内，用针以45°穿过角膜巩膜缘后面的角膜，插入玻璃体2毫米深，以免损伤晶状体。将20μL顺磁珠注射入单侧眼的前房中，递送约0.3-0.6mg珠粒。通过磁铁将顺磁珠引导到前角。另一侧眼睛注射20μL生理盐水，成为阴性对照。
实施例2：产生和筛选单克隆TrkB激动剂抗体
通过杂交瘤技术产生单克隆TrkB抗体。单克隆抗体(MAb)产生的第一步是用抗原刺激动物免疫系统。这通过用小鼠中的TrkB-ECD(细胞外结构域)(参见SEQ ID NO:1)作为抗原，使用快速免疫方案(在前述方法中提及)完成。通过将来自被免疫小鼠的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合来制备杂交瘤克隆。用酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选杂交瘤上清液的TrkB特异性单克隆抗体，然后用NFAT测定法筛选激动剂抗体。在确定具有TrkB激活效应的培养物上清液后，将这些克隆亚克隆到单克隆细胞系中。最后，用ELISA和NFAT测定法再次筛选所有亚克隆的阳性亚克隆。使这些想要的并且稳定的克隆大量生长以产生足够量的抗体。纯化抗体后，鉴定这些纯化抗体的同种型，如下面的表1所示。
表1.单克隆TrkB激动剂抗体
TrkB抗体 同种型 物种
TrkB-agoAb1104 IgG1 小鼠
TrkB-agoAb202 兔
TrkB-agoAb101 小鼠
TrkB-agoAb303 小鼠
TrkB-agoAb203 兔
TrkB-agoAb2908 IgG1 小鼠
TrkB-agoAb5702 IgG1 小鼠
TrkB-agoAb1016 IgG1 小鼠
TrkB-agoAb2037 小鼠
TrkB-agoAbB901 IgG2 小鼠
TrkB-agoAbB503 IgG3 小鼠
TrkB-agoAbB418 IgG3 小鼠
TrkB-agoAb6916 小鼠
TrkB-agoAb4014 小鼠
TrkB-agoAb104 小鼠
TrkB-agoAb7431 IgG1 小鼠
BDNF
实施例3：抗体表征-生化性质
3.1特异性
在ELISA测定中，TrkB激动剂抗体可以特异性结合TrkB，但不结合TrkA、TrkC或P75。示例性抗体TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb202、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb1104和TrkB-agoAb2908的数据显示在图1A-1F中。在平板的每个孔上包被50μL的1μg/ml蛋白质，并加入50μL的10nM、1nM或0.1nM抗体以进行ELISA测定。
3.2亲和力
使用Biacore分析抗原-抗体相互作用的亲和力。数据如下表2所示。
表2.
抗体 Rmax(RU) Chi2 KD(M)
TrkB-agoAb104 29.44 0.725 6.684E-11
TrkB-agoAb203 42.59 2.58 5.287E-11
TrkB-agoAb303 14.78 0.938 4.019E-9
3.3抗原表位鉴定
如图2A中所示，设计五个细胞外结构域的截短的TrkB构建体，并分别转染至293T细胞用于表达。收集裂解物。使用免疫沉淀来检测不能与缀合有GFP的截短的TrkB结合的抗体(参见图2B)。结果表明D1和D2结构域可能是TrkB-agoAb202抗体与TrkB结合所必需的。其他例如TrkB-agoAb418等抗体可能与D5结构域结合。Δ1缺少D1结构域(表示成Cys 1)，Δ2缺少D1和D2(表示成LAM)结构域，Δ3缺少D1-D3(表示成Cys 2)结构域，Δ4缺少D1-D4(表示成Ig1)结构域，以及Δ5缺少D1-D5(表示成Ig2)结构域。“TM”代表跨膜结构域，“C”代表对照(空白，空载体)。FL代表全长基因(WT)。针对本文提供的TrkB激动剂抗体的TrkB靶结合域如表3所示。
表3.
Figure BDA0002271289310000591
Figure BDA0002271289310000601
在用于评价抗体与BDNF的竞争程度的Alphalisa实验中，将饱和的BDNF溶液(10nM)与稀释至0.01-100nM的一系列抗体溶液一起用于处理稳定转染有TrkB的CHO细胞(TrkB-CHO细胞)。当抗体与TrkB竞争性结合时，由10nM BDNF与高浓度(如10-100nM)抗体一起诱导的活化可能不如10nM BDNF单独诱导的效应强(竞争效应)，因为BDNF通常比抗体更有效地激活TrkB。但是，如果BDNF加上抗体可以比单独的BDNF诱导更强的TrkB活化，则该抗体显示出累加效应或增强作用。现在发现，TrkB-agoAb303具有这个特征(参见图3)。
3.4TrkB的活化-Try515的磷酸化
TrkB激动剂抗体可以激活TrkB的酪氨酸激酶，其能磷酸化TrkB细胞内结构域的酪氨酸残基。由于可以诱导信号通路的最重要的位点是Try515位点，因此通过Alphalisa方法检测Try515的磷酸化水平以指示TrkB的活化，Alphalisa方法可以量化磷酸化的强度。用不同浓度的BDNF或TrkB激动剂抗体将转染有人TrkB的CHO细胞(hTrkB-CHO细胞)处理30分钟，并收集蛋白质样品以检测TrkB的磷酸化水平。根据这些结果，计算BDNF或TrkB激动剂抗体的剂量曲线。检测的抗体示于图4和表4中。
表4.通过Alphalisa方法测得的EC50
Figure BDA0002271289310000602
Figure BDA0002271289310000611
根据剂量曲线(参见图4)，计算50％有效浓度(EC50)(参见表4)，然后用由EC50值确定的浓度处理细胞。在不同时间点，收集来自处理的细胞的蛋白质样品，用Alphalisa方法测量其磷酸化，并计算时程曲线(time course curve)(参见图5)。随后通过时程曲线计算体外半衰期(T1/2)(见表5)。
表5.
抗体 T<sub>1/2</sub>(h)
TrkB-agoAb104 12-24
TrkB-agoAb203 >24
TrkB-agoAb303 >24
BDNF 4-8
3.5TrkB激动剂抗体信号传导通路的激活
TrkB被细胞内酪氨酸残基的磷酸化激活，并且TrkB的活化诱导激酶信号传导通路MAPK、PI3K和PLCγ。Erk42/44、Akt和PLCγ的磷酸化水平可以分别指示这三种信号通路的激活。当hTrkB-CHO细胞的密度达到60-70％时，用BDNF(1nM)或TrkB激动剂抗体(TrkB-agoAb101、TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb202，参见图6A-6E)处理细胞，并于24小时内在不同时间收集样品。通过western印迹检测TrkB(Tyr515)、Erk44/42(Thr202/Tyr204)、Akt(Ser473)和PLCγ(Tyr783)的磷酸化水平。结果显示TrkB-AgoAb104也可以如BDNF一样激活TrkB信号传导通路(参见图6)。
实施例4：抗体的表征-细胞生物学
4.1细胞存活实验
4.1.1 PC12细胞
使用表达人TrkB的PC12细胞系进行细胞存活测定。将人TrkB-PC12细胞接种于96孔板中1天，随后将培养基更换为无血清培养基，其可诱导PC12细胞死亡。BDNF或TrkB-agoAb202可以保护细胞免于饥饿性细胞死亡。使用Caspase3-底物试剂盒(Promega，G7573)和细胞组学阵列扫描来定量细胞存活质量。
4.1.2海马神经元
使用公知的神经毒素Aβ(25-35)来处理培养的大鼠海马神经元，以建立AD细胞模型。根据先前的研究，Aβ(25-35)可以在体内或体外实验中模拟Aβ(1-42)作为细胞毒素，因此使用Aβ(25-35)(GL Biochem)来处理培养的大鼠海马神经元以建立体外AD细胞模型，并检测TrkB-AgoAb的神经元保护功能。我们用不同浓度的Aβ(25-35)处理神经元48小时，并使用Cell titer-Glo试剂盒来检测ATP水平，其指示活细胞的数量。结果显示，经5-40μM Aβ(25-35)处理的细胞的ATP水平是对照(未经Aβ(25-35)处理的海马神经元)的约60-70％(图7A)。随后使用毒素浓度5μM的Aβ(25-35)，因为在这个细胞死亡百分比下的挽救效果会更好。
在该细胞存活实验中，在体外培养E18大鼠海马神经元8天后，加入BDNF或TrkB-AgoAb(TrkB-agoAb1104、TrkB-agoAb2908和TrkB-agoAbB901)预处理30分钟，然后在培养基中加入5M Aβ，进一步培养神经元48小时。使用Cell titer-Glo试剂盒检测细胞存活水平。TrkB-AgoAb或BDNF在EC50下可以显著保护海马神经元(参见图7B)。***p<0.001，数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
4.1.3运动神经元
为了研究TrkB抗体激动剂对运动神经元的效应，建立了体外模型。从13天龄的胚胎小鼠中分离出运动神经元，并在体外培养。据报道，在体外，血清剥夺会导致运动神经元死亡(Wiese等，2010)。将运动神经元培养3天(DIV 3)，然后用不含血清(马血清，HS)的培养基替换原培养基(参考上述方法部分)。16或24小时后通过剩余细胞数和凋亡细胞百分比估算细胞活力。通过转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记(TUNEL)测定来确定细胞凋亡。与先前的报道一致的是，血清剥夺导致了显著的细胞损失和升高的细胞凋亡(参见图8A-8C)。细胞核(Nu)用DAPI染色。与在没有血清剥夺的条件下培养的对照相比，在血清剥夺组中检测到了更多的TUNEL标记细胞，而BDNF的处理显著减少了凋亡细胞的百分比。我们检测了TrkB的两种激动剂抗体，TrkB-agoAb102和TrkB-agoAb202。通过凋亡减少证实这两种激动剂抗体都显示出了神经元保护效应(参见图8C)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
4.1.4视网膜神经节细胞
使用免疫淘选方法从出生后7天的BALB/c小鼠中制备视网膜神经节细胞(RGC)。获得纯度为90％的RGC。RGC没有神经营养因子就会死亡，因此通过加入BDNF和TrkB激动剂抗体来进行细胞存活测定。为了鉴定所选抗体TrkB-AgoAb102和TrkB-agoAb202的功能，进行了RGC存活测定以进行功能分析(参见图9)。RGC分别经BDNF 1nM(n＝6)、TrkB-agoAb2020.5nM(n＝6)和TrkB-agoAb101 30nM(n＝6)处理；将DPBS(n＝9)作为空白对照，将K252a(n＝6)作为阴性对照，每隔一天处理一次。0.5nM TrkB-Ago202或30nM TrkB-agoAb101的处理提升了存活率。*p<0.05，**p<0.01。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
4.2神经突向外生长
4.2.1 PC12细胞
将表达人TrkB的PC12细胞系用于进行神经突向外生长测定。PC12细胞在正常情况下不具有神经突，但当NGF刺激PC12细胞时则出现神经突。人TrkB-PC12细胞在BDNF刺激后具有相同的效应。将人TrkB-PC12细胞接种于96孔板中1天，后将培养基更换为添加有BDNF或TrkB-AgoAb的1％马血清培养基。处理72小时后，通过细胞组学阵列检测细胞以定量细胞神经突。
4.2.2海马神经元
在体外培养E18大鼠海马神经元2天后，将BDNF或TrkB-AgoAb加入神经元中并再培养48小时。将培养物固定，并用抗MAP2抗体(Millipore，MAB3418)对神经元进行免疫染色以使用荧光显微镜进行形态分析。通过以下两个参数定量神经突的生长：总神经突长度和分支点的数目。BDNF或TrkB-agoAb可以提升神经突的总长度和分支点数目(图17A和17B)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
实施例5：抗体表征-动物模型
5.1 ALS动物模型
用脊髓根部撕脱损伤模拟ALS的运动神经元损伤。利用BDNF和TrkB-agoAb202恢复BDNF信号传导。撕脱后两周，虽然在PBS处理的小鼠中只有30.7％的受损运动神经元存活了下来，但是BDNF的处理使得他们中有77.2％存活了下来。与BDNF相似，低剂量(TrkB-agoAb202(L))和高剂量(TrkB-agoAb202(H))的TrkB激动剂均在挽救受损运动神经元方面显示出较高的效率，它们中分别有76.2％和80.9％存活了下来(见图10F)。此外，在BDNF和TrkB-A处理的运动神经元中，通过Nissl染色，很好地显示了健康的亚细胞结构，包括大的细胞核、染色较深的粗面内质网和大的细胞质(参见图10A、10C、10D和10E)。相反，在PBS处理的细胞中观察到了异常的细胞外观，其没有可识别的亚细胞结构。此外，PBS处理的脊髓的灰质中存在大量神经胶质细胞(图10B)，但在BDNF或TrkB-agoAb202处理的脊髓中检测到较少的神经胶质细胞。来自BDNF和TrkB-agoAb202治疗组的一些运动神经元显得肥大，但在细胞直径上没有观察到组间的统计学差异。***P<0.001。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
5.2青光眼动物模型
将通过眼内注射顺磁珠诱导的升高的眼内压(IOP)用于建立青光眼动物模型。在注射之前，用荧光标记物标记RGC。选择4％Fluorogold溶液用于通过双侧脑立体定向注射到上丘中进行逆行标记。使用30号针头进行顺磁珠的眼内注射。通过磁铁将顺磁珠引导到前角。另一侧眼睛注射20μL盐水，成为阴性对照。眼内注射后，将动物放在饲养笼中，每隔一天测试IOP。在眼内注射微珠两周后，用1μl盐水或TrkB-agoAb202(1μg)对双眼进行眼内注射。1个月后处死所有小鼠，制成视网膜漂浮片。根据通过逆行标记产生的荧光信号(参见图11A)，对RGC进行计数。TrkB-agoAb202显示出能显著增强RGC的存活(参见图11B)。***P<0.001。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
5.3中风
将Sprague Dawley大鼠(～200g)进行2小时的右大脑中动脉阻塞，随后进行再灌注(I/R)并分别施用PBS(假手术)，1mg/kg体重的正常兔IgG、1mg/kg TrkB-agoAb202和0.2mg/kg TrkB-agoAb202。检测动物的感觉和运动功能，共14天，并将动物安乐死以进行梗塞体积的测量。在第3天对另一组动物实施安乐死，用于Western印迹分析。
为了测量梗塞体积，使用三苯基四唑氯化物(TTC)来染色脑切片。在正常组织中，在呼吸链脱氢酶存在的情况下，TTC会变为红色，而它在死亡组织中保持白色。在缺血后第14天，与正常IgG处理相比，1mg/kg TrkB-agoAb202显著降低了梗塞体积。(*P<0.05。每组n≥7。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。)0.2mg/kg TrkB-agoAb202也减少了梗塞体积，但是没有统计学意义(参见图12A和12B)。
随后，通过粘合剂去除测试(adhesive-removal test)评估缺血后的行为结果。到感知和去除粘合剂为止所需的时间反向指示由大脑的相应半球调节的感觉运动功能的状态。在手术后的前5天，与假手术的结果相比，经受缺血/再灌注的动物均显示左前肢的感觉运动功能受损。然而，与正常IgG处理的结果相比，1mg/kg TrkB-agoAb202的处理在第3天和第5天加速了感觉功能的改善，同时在第5天缩短了去除时间，其显示了更好的运动功能改善。这表明TrkB-agoAb202促进了中风后的功能恢复(参见图13A和13B)。*P<0.05，**P<0.01。每组n≥9。数据表示为平均值±SEM并用双向ANOVA进行分析。
为了分析TrkB-agoAb202可能的作用机制，发明人试图探索TrkB-agoAb202是否影响细胞凋亡通路。Caspase-3是细胞凋亡的执行者，通常用作此类细胞死亡的标志物。32kDa的前-Caspase-3在活化后会被切割，从而产生活化的17kDa的形式。通过比较Western印迹的半定量结果，表明TrkB-agoAb202通过凋亡通路部分地减少细胞死亡(参见图14)。*p<0.05，各组n≥5。数据表示为平均值±SEM并用单向ANOVA进行分析。
混合谱系激酶结构域样(MLKL)是坏死因子的组分，坏死因子的活化依赖于MLKL的磷酸化。在经历缺血/再灌注或永久性缺血的皮质组织中，TrkB-agoAb202的处理显著降低了MLKL的磷酸化(参见图15A和15B)。这表明TrkB-agoAb对TrkB信号传导通路的激活抑制坏死/坏死性凋亡途径。
5.4血浆和脑组织中TrkB-agoAb的药代动力学
为了确定TrkB-agoAb(TrkB-agoAb1104、TrkB-agoAb2908、TrkB-agoAbB901和TrkB-agoAb202)在血浆和脑组织中的药代动力学，通过尾静脉注射对C57BL/6小鼠进行给药。每组3只小鼠，在不同时间点(第1天、第3天、第7天、第15天和第30天)处死，以收集血液样本和脑组织。立即从血液样品中制备血浆。在收集脑组织之前，用至少20ml PBS灌注小鼠。血浆样品和脑组织迅速用液氮冷冻并储存在-80o冰箱中。在收集了不同时间点的所有样品后，用ELISA法检测每个样品的抗体浓度。通过对照小鼠(没有注射)测定浓度的基线(0)。根据图18所示，TrkB-agoAb在7-30天后从血液中清除(参见图18A)以及在超过15天后从大脑中清除(参见图18B)。约有0.1-0.5％浓度的TrkB-agoAb通过血脑屏障(BBB)渗透到脑组织中，并且在脑中的浓度是有效浓度，能激活TrkB磷酸化和下游激酶信号通路，以及促进神经生存。例如，当血液TrkB-agoAb浓度为3mg/kg时，渗入脑组织的浓度为0.1-0.2μg/g或更高(相当于约1nM)，而在体外，TrkB-agoAb的浓度0.3-1nM是足够有效的(参见图6和8)。
虽然用参考特定实施方式(其中的一些是优选实施方式)特别示出和描述了本公开内容，但是本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本公开所述的主旨和范围的情况下，可以在形式和细节上对本文进行各种改变。
序列表
<110> 清华大学
<120> 新型抗TRKB抗体
<130> 064813-8002WO02
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 398
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
1 5 10 15
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val Asp
20 25 30
Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu Glu
35 40 45
Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn Leu
50 55 60
Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe Leu
65 70 75 80
Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu Thr
85 90 95
Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ile
100 105 110
Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys
115 120 125
Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys
130 135 140
Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro
145 150 155 160
Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val
165 170 175
Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro
180 185 190
Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met
195 200 205
Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser
210 215 220
Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val
225 230 235 240
Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro
260 265 270
Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn
275 280 285
Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val
290 295 300
Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr
305 310 315 320
His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr Gly
325 330 335
Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly Ile
340 345 350
Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp Tyr
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn Glu
370 375 380
Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His
385 390 395
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp Pro
1 5 10 15
Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser
20 25 30
<210> 3
<211> 46
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Leu Arg Asn Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala
1 5 10 15
His Lys Ala Phe Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr
20 25 30
Arg Asn Lys Leu Thr Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His
35 40 45
<210> 4
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile Lys Thr Leu Gln
1 5 10 15
Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr Cys Leu Asn Glu
20 25 30
Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile Pro Asn Cys Gly
35 40 45
Leu
<210> 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr Val Glu Glu Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp Pro Val Pro Asn Met
20 25 30
Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His Met Asn Glu Thr Ser
35 40 45
His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile Ser Ser Asp Asp Ser
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu Val Gly Glu Asp Gln
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Asp Ser Val Asn Leu Thr
85
<210> 6
<211> 70
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser
20 25 30
Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His
35 40 45
Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr
50 55 60
Thr Leu Ile Ala Lys Asn
65 70
<210> 7
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr
20 25 30
Glu Asp Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg
35 40 45
Ser Asn Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu
50 55 60
His
65
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Tyr Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp
1 5 10 15
Pro Gly Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr
20 25 30
Glu Asp Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg
35 40 45
Ser Asn Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu
50 55 60
His Leu Ser Val Tyr Ala Val Val Val Ile Ala Ser Val Val Gly Phe
65 70 75 80
Cys Leu Leu Val Met Leu Phe Leu Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Lys
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Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys
145 150 155 160
Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys Arg His Asn Ile Val Leu Lys
165 170 175
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Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg Lys Asp Phe His Arg Glu Ala
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Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly
225 230 235 240
Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys
245 250 255
His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Val
260 265 270
Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met
275 280 285
Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser
290 295 300
Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly
305 310 315 320
Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val
325 330 335
Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile
340 345 350
Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu
355 360 365
Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr
370 375 380
Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys
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Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu
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Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Tyr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Gln Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Gly Asp Tyr Ala
1 5 10
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Arg Tyr Trp Met Asn
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Gly Asp Tyr Gln Thr Ala Ser Tyr Phe Asn Leu
1 5 10
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<211> 16
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<213> 小家鼠
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Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
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<213> 小家鼠
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1 5
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
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Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val Lys
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Gly
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<213> 小家鼠
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Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Ala
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Asn Tyr Trp Met Ile
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Gly
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<400> 26
Gly Val Gly Gly Val Leu Gly Thr Ser Gly Met Asp Pro
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
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Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Asn Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
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<213> 小家鼠
<400> 28
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Gly Arg Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Asn Ser Leu Met His
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<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Pro Trp Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Ser Ser Trp Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly His Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Cys
1 5
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<211> 131
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 35
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Gly Asn Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
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Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys
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Leu Gly Val
130
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly His Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Leu Val Pro Gly Ser Leu Ala
130 135
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 37
Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 38
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 39
Gln His His Tyr Gly Pro Pro Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 40
Arg Tyr Trp Met Gln
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 41
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Gly
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 42
Ser Gly Leu Gly Arg Ala Trp Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 43
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 43
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 45
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Leu Leu Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 47
Gln Gln Phe Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 48
Arg Tyr Trp Met Ser
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 49
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Asp
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 50
Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ala Trp Phe Ala Tyr
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<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
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Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Ser Thr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 52
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 53
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 54
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 55
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 56
Ser Phe Gly Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 57
Tyr Ile Thr Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
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Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 58
Asp Gly Tyr Phe Leu Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 59
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 59
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 60
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Thr Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
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Ala Arg Asp Gly Tyr Phe Leu Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 62
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 63
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 63
His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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<213> 小家鼠
<400> 65
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Gly
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 66
Ser Asp Tyr Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 67
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 67
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Thr
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Val Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Asp Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 69
Gly Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ser Ser Tyr Ser Tyr Ile His
1 5 10 15
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 70
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 71
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 72
Thr Asn Tyr Val Val Asn
1 5
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 73
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 74
Gly Gly Ala His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 75
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 75
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 76
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 76
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Val Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115

Claims (37)

1.一种分离的TrkB激动剂抗体，其结合TrkB细胞外结构域中的一个中所包含的表位并能够激活TrkB，其中所述细胞外结构域包含具有SEQ ID NO:2所示序列的D1结构域、具有SEQ ID NO:3所示序列的D2结构域、具有SEQ ID NO:4所示序列的D3结构域、具有SEQ IDNO:5所示序列的D4结构域、具有SEQ ID NO:6所示序列的D5结构域和具有TrkB的SEQ IDNO:7所示序列的近膜结构域。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合近膜结构域中所包含的表位并能够激活具有SEQ ID NO:8所示序列的截短的TrkB。
3.一种分离的TrkB激动剂抗体，其包含选自SEQ ID NO:9-26、29-34、37-42、45-50、53-58、61-66和69-74，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列的1、2、3、4、5或6个CDR。
4.根据权利要求3所述的抗体，其包含3个重链CDR序列，所述3个重链CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:12-14，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；2)SEQ ID NO:18-20，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；3)SEQ ID NO:24-26，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；4)SEQ ID NO:32-34，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；5)SEQ ID NO:40-42，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；6)SEQ ID NO:48-50，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；7)SEQ ID NO:56-58，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；8)SEQ ID NO:64-66，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；或9)SEQ ID NO:72-74，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的抗体，其包含3个轻链CDR序列，所述3个轻链CDR序列选自下组：1)SEQ ID NO:9-11，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；2)SEQ IDNO:15-17，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；3)SEQ ID NO:21-23，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；4)SEQ ID NO:29-31，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；5)SEQ ID NO:37-39，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；6)SEQ IDNO:45-47，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；7)SEQ ID NO:53-55，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；8)SEQ ID NO:61-63，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；或9)SEQ ID NO:69-71，或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。
6.根据权利要求3所述的抗体，其包含3个重链CDR序列，所述3个重链CDR序列选自下组:1)SEQ ID NO:12-14，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；2)SEQ ID NO:18-20，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；3)SEQ ID NO:24-26，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；4)SEQ ID NO:32-34，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；5)SEQ ID NO:40-42，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；6)SEQ ID NO:48-50，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；7)SEQ ID NO:56-58，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；8)SEQ ID NO:64-66，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；或9)SEQ ID NO:72-74，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体。
7.根据权利要求3-4中任一项所述的抗体，其包含3个轻链CDR序列，所述3个轻链CDR序列选自下组:1)SEQ ID NO:9-11，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；2)SEQ ID NO:15-17，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；3)SEQ ID NO:21-23，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；4)SEQ ID NO:29-31，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；5)SEQ ID NO:37-39，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；6)SEQ ID NO:45-47，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；7)SEQ ID NO:53-55，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；8)SEQ ID NO:61-63，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体；或9)SEQ ID NO:69-71，或其具有1、2或3个氨基酸修饰的变体。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的抗体，其包含选自SEQ ID NO:28、36、44、52、60、68、76的重链可变区或其人源化形式。
9.根据权利要求3-7中任一项所述的抗体，其包含选自SEQ ID NO:27、35、43、51、59、67、75的轻链可变区或其人源化形式。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其能够通过结合不同于BDNF和/或NT-4的表位激活TrkB从而具有累加效应，其中所述累加效应为当TrkB在BDNF和/或NT-4的作用下达到峰值活化时，所述抗体能额外提高TrkB的活化。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中当所述抗体结合TrkB时，TrkB在TrkB的Y515、Y701、Y705、Y706和Y816中的至少一个氨基酸残基处被磷酸化。
12.一种分离的TrkB激动剂抗体，其能够以至少12小时的半衰期(T1/2)结合TrkB。
13.一种分离的TrkB激动剂抗体，其与前述权利要求中任一项所述的抗体结合相同的表位，或与前述权利要求中任一项所述的抗体的竞争性结合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其EC50小于3nM。
15.一种分离的TrkB激动剂抗体，其具有对TrkB的小于4.5nM的KD值的亲和力，所述KD值通过Biacore测得。
16.根据权利要求12、14和15中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合D1、D2、D3、D4、D5或近膜。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合P75神经营养因子受体(P75NTR)、酪氨酸受体A(TrkA)或酪氨酸受体C(TrkC)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够增强神经细胞存活、调节突触发育和/或可塑性、增强神经突向外生长或其组合。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述神经细胞包括PC12细胞、海马神经元、视网膜神经节细胞、运动神经元和多巴胺能神经元。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自下组的抗原结合片段：单域抗体、骆驼单域抗体、VNAR、纳米抗体、改造的人VH/VL单域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds双功能抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。
22.一种药物组合物，其包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的抗体，以及药物运载体。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其还包含第二治疗剂，所述第二治疗剂包含BDNF和/或NT-4。
24.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-21中任一项所述的抗体。
25.一种载体，其包含根据权利要求24所述的多核苷酸。
26.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的载体。
27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生由所述多核苷酸编码的抗体。
28.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物，用于诊断、预防、延迟或治疗TrkB相关病症。
29.一种产生特异性结合TrkB的抗体的方法，所述方法包括将编码TrkB蛋白的多核苷酸引入根据权利要求27所述的宿主细胞中，并在表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
30.一种用于治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述病症。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述病症是神经退行性疾病、视神经病变、视网膜退行性病症、涉及听力丧失的病症、精神病症、神经发育病症、体重调节病症、肌肉病症、代谢紊乱或脑损伤。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述病症选自下组：阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、青光眼、亨廷顿病(HD)、帕金森病(PD)、运动神经元疾病、路易体疾病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆和tau蛋白病变、青光眼、前部缺血性视神经病变(AION)、后部缺血性视神经病变、放射性视神经病变、压迫性视神经病变、线粒体视神经病变、中毒性视神经病变、创伤性视神经病变、遗传性视神经病变、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、神经性耳聋、耳蜗耳聋、耳鸣、感音神经性耳聋、复合性听力丧失、焦虑、情绪障碍、抑郁、恐慌症、创伤后应激障碍(PTSD)、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、双相情感障碍、精神分裂症、天使人综合征、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、自闭症、Rett综合征、神经性厌食症、恶病质、不想要的体重减轻、肌肉减少症、肥胖、阿片类药物引起的呕吐、肌肉减少症、糖尿病神经病变、癫痫、多发性硬化症、偏头痛、神经损伤、周围神经病变、神经肌肉疾病、睡眠障碍、创伤性脑损伤(TBI)和中风。
33.一种增强细胞分化和/或突触发育的方法，所述方法包括使根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
34.一种增强神经损伤修复和/或神经突分支的方法，所述方法包括使根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
35.一种预防细胞凋亡和/或坏死性凋亡的方法，所述方法包括使根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
36.一种提高细胞存活的方法，所述方法包括使根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物与表达TrkB的生物样品接触。
37.一种治疗受试者中TrkB相关病症或降低其风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用细胞，其中所述细胞在其细胞表面上表达根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或根据权利要求22-23中任一项所述的药物组合物。
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