KR101512203B1

KR101512203B1 - ｉｎｖｉｖｏ 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Ｄｌｋ－１ 항체

Info

Publication number: KR101512203B1
Application number: KR1020097011429A
Authority: KR
Inventors: 고지 나카무라; 리에 다지마
Original assignee: 가부시키가이샤 리부텍쿠
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2015-04-15
Also published as: JPWO2008056833A1; CN101631802A; KR20090088893A; ES2484842T3; JP5219827B2; CN103073641A; CN101631802B; US20090326205A1; CA2669731A1; AU2007318483B2; EP2096122A4; WO2008056833A1; US8227578B2; EP2096122A1; CN103073641B; AU2007318483A1; EP2096122B1; CA2669731C

Abstract

본 발명은, hDlk-1 과 특이적으로 반응하여 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체 (항hDlk-1 항체), 당해 항체의 단편, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체 또는 항체 단편과 약제의 복합체, 당해 항체 등을 포함하는 의약 조성물, 종양 치료제, 종양 혈관 신생 저해제, 종양 진단제, 종양의 검출 방법, 그리고 종양의 검출용 및/또는 진단용 키트 등을 제공한다.

Description

ｉｎｖｉｖｏ 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Ｄｌｋ－１ 항체{ANTI-HUMAN Dlk-1 ANTIBODY SHOWING ANTI-TUMOR ACTIVITY IN VIVO}

본 발명은, 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체에 관한 것이다. 또 본 발명은, 당해 항체를 산생(産生)하는 하이브리도마, 및 당해 항체의 용도에 관한 것이다.

인간 Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila)；이하 「hDlk-1」 이라고 하는 경우가 있다.) 은, 전체 길이 383 아미노산 잔기의 1 회 막 관통형의 1 형 막 단백질이고, 세포 외 영역에 6 개의 EGF 유사 모티브를 갖는다. 그 세포 외 영역은, Notch/Delta/Serrate 패밀리와 상동성을 나타낸다. hDlk-1 유전자는, GRP (gastrin releasing peptide) 응답성의 폐 소세포 암 유래 세포주에서 발현되는 분자 (비특허 문헌 1) 혹은 전 (前) 지방 세포의 분화를 억제하는 인자로서 클로닝되었다 (비특허 문헌 2). hDlk-1 은, 세포 분화 제어 인자인 Notch 리셉터의 리간드인 Delta 와의 아미노산 배열의 상동성 면에서, DLK1 이라는 유전자 심볼로 칭해지는 것이 일반적이고, 그 외에, Pref-1 (비특허 문헌 2), pG2 (비특허 문헌 3), SCP-1 (비특허 문헌 4) 및 ZOG (비특허 문헌 5) 와 같은 복수의 유전자 심볼을 갖지만, 이들은 기본적으로 동일 분자이다.

또, hDlk-1 은, 세포 외 영역의 세포막 근방이 미(未)동정 프로테아제에 의해 절단되어 혈액 중으로 분비된다. 유리 hDlk-1 (hDlk-1 세포 외 영역) 은, 225 ∼ 262 아미노산 잔기의 FA-1 (Fetal antigen-1 ; 비특허 문헌 6) 로 불리는 당 단백질과 동일한 분자이다.

hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은, 미(未) 분화되고 증식능이 높은 태아 세포에서 고발현을 나타낸다. 특히, 태아 간장, 태아 신장, 태아 골격근, 태아 뇌 등에서 높은 발현을 나타내지만, 출생 후에는 대부분의 조직에서 발현이 확인되지 않게 되어, 정상적인 성체 조직에 있어서는 부신, 태반, 하수체에 국한되어 있다 (특허 문헌 1, 비특허 문헌 2).

또한, 성체 조직에 있어서도, 미분화된 간세포 (幹細胞) 나 전구 세포로 여겨지고 있는 세포에는, hDlk-1 의 발현이 확인된다. 예를 들어 성체 간장에 있어서의 미분화되고 다분화능을 갖는 간 난원형 세포 (비특허 문헌 7, 8) 나, 뼈/연골/지방 세포의 간세포인 간엽계 간세포 (비특허 문헌 9) 에서 hDlk-1 의 발현이 보고되어 있고, 이들 조직 간세포의 성질, 예를 들어 미분화능의 유지 등에 관여하고 있는 것이 시사된다.

이와 같은, 태아기의 세포나 간세포에 국한되어 있는 hDlk-1 의 발현 양식이나, EGF 유사 모티브를 갖는 유전자/유전자 산물의 패밀리 (Notch-receptor, Notch ligand (Delta, Jagged, serrate) 등) 는, 일반적으로 EGF 유사 모티브를 통한 세포 간 상호 작용에 의해 세포의 증식이나 분화를 제어하는 점에서, hDlk-1 도 그러한 기능을 갖는 것이 시사되어 있다. 사실, 지방 전구 세포의 분화에 따라, 발 현이 저하되고, 또 지방 전구 세포에 hDlk-1 유전자를 강제 발현시키면 지방 분화가 억제되는 것이 잘 알려져 있다 (비특허 문헌 2). 그러나, 현 시점에 있어서, hDlk-1 과 상호 작용하는 분자 (리간드) 에 대한 상세한 내용은 불명확하다.

한편, hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은, 여러 암이나 종양에서도 고빈도로 발현되고 있는 것이 보고되어 있다. 현재까지, 그 발현이 확인되어 있는 암의 종류로는, 고형 암에서는, 신경내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경섬유종증, 소세포폐암, 간장암, 신장암 및 난소암이 알려져 있고 (특허 문헌 1, 2, 및 비특허 문헌 1, 3, 10, 11, 12, 13, 14), 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 (특허 문헌 3, 및 비특허 문헌 15, 16) 및 급성 골수성 백혈병 (비특허 문헌 16) 이 알려져 있다. 적백혈병 세포주 (erythroleukemia) 인 K562 세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면 세포 증식이 항진되는 것 (비특허 문헌 16), 마찬가지로, 글리아 아종 세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면, 세포 증식의 항진에 더하여 세포의 접촉 저지가 없어져, 고정 비의존적인 세포 증식능을 획득하는 것이 보고되어 있어, hDlk-1 과 발암의 관련성이 시사되어 있다 (비특허 문헌 17).

＜특허 문헌＞

특허 문헌 1 : WO 2005/052156

특허 문헌 2 : WO 02/081625

특허 문헌 3 : 일본 공개특허공보 2001-269174호

＜비특허 문헌＞

비특허 문헌 1 : Laborda, J.et al., J.Biol.Chem., vol.268 (6), p.3817-3820 (1993)

비특허 문헌 2 : Smas, C.M.et al., Cell, vol.73 (4), p.725-734 (1993)

비특허 문헌 3 : Helman, L.J.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.84, p.2336-2339 (1987)

비특허 문헌 4 : Maruyama, K.et al., Unpublished, Genebank accession number D16847 (1993)

비특허 문헌 5 : Halder, S.K.et al., Endocrinology, vol.139, p.3316-3328 (1998)

비특허 문헌 6 : Fay, T.N.et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol.29, p.73-85 (1988)

비특허 문헌 7 : Tanimizu, N.et al., Gene Expression Patterns, vol.5, p.209-218 (2004)

비특허 문헌 8 : Jensen, CH.et al., Am.J.Pathol., vol.164 (4), p.1347-1359 (2004)

비특허 문헌 9 : Abdallah, B.M.et al., J.Bone Miner.Res., vol.19 (5), p.841-852 (2004)

비특허 문헌 10 : Jensen, C.H.et al., Br.J.Dermatol., vol.140 (6), p.1054-1059 (1999)

비특허 문헌 11 : Jensen, C.H.et al., Tumour Biol., vol.20 (5), p.256- 262 (1999)

비특허 문헌 12 : Yin, D.et al., Int.J.Oncol., vol.24 (4), p.1011-1015 (2004)

비특허 문헌 13 : Yin, D.et al., Oncogene, vol.25 (13), p.1852-1861 (2006)

비특허 문헌 14 : Fukuzawa, R.et al., J.Clin.Pathol., vol.58, p.145-150 (2006)

비특허 문헌 15 : Miyazato, A.et al., Blood, vol.98, p.422-427 (2001)

비특허 문헌 16 : Sakajiri, S.et al., Leukemia, vol.19 (8), p.1404-1410 (2005)

비특허 문헌 17 : Yin, D.et al., Oncogene, vol. 25 (13), p.1852-1861 (2006)

발명의 개시

상기 서술한 바와 같이, hDlk-1 의 발현은 정상 조직에서는 태아기의 세포나 간세포에 국한되어 있지만 암 조직에서는 여러 종양에서 고빈도로 발현되고 있는 것, 및 hDlk-1 이 세포막 단백/분비 단백인 점에서, hDlk-1 은, 각종 종양 치료 등에 있어서 좋은 표적이 될 것으로 생각된다. 그리고, 이 hDlk-1 을 표적으로 하는 경우, 항hDlk-1 항체가 유용할 것으로 생각된다.

그래서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체를 제공하는 것에 있다. 또한, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 약제의 복합체, 종양 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시하였다. 그 결과, 인간 Dlk-1 과 특이적으로 반응하는 항체 (특히 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체) 로서 항종양 활성을 갖는 항체, 나아가서는 당해 항체와 각종 약제의 복합체 (이뮤노콘쥬게이트) 를 알아내어, 이들이 in vivo 에 있어서 항종양 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또, 이들 항체 및 복합체가 종양 치료, 진단 및 검출에 유용한 것도 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 인간 Dlk-1 에 대한 항체.

상기 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

상기 (1) 의 항체에 있어서, 항종양 활성은, 예를 들어 종양 혈관 신생 저해 활성을 들 수 있다.

상기 (1) 에 기재된 항체는, 예를 들어 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체인 것을 들 수 있다.

상기 (1) 에 기재된 항체는, 예를 들어 H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 30 ∼ 32 에 나타내는 아미노산 배열인 것, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 33 ∼ 35 로 나타내는 아미노산 배열인 것을 들 수 있다.

본 발명의 항체로는, 하이브리도마가 산생하는 항체, 유전자 재조합 항체 등을 들 수 있다.

하이브리도마란, 인간 이외의 포유 동물에게 항원을 면역시켜 취득된 B 세포와, 미엘로마 세포를 세포 융합시켜 얻어지는 원하는 항원 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 말한다.

유전자 재조합 항체로는, 키메라 항체 (인간형 키메라 항체), 인간화 항체, 인간 항체 또는 그들의 항체 단편 등, 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함 한다. 유전자 재조합 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 갖고, 항원성이 낮으며, 혈중 반감기가 연장된 것은 치료약으로서 바람직하다. 여기에서, 키메라 항체로는, 예를 들어 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것을 들 수 있다.

(2) 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체.

(3) 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체.

(4) 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체.

상기 (1) ∼ (4) 에 기재된 항체는, 예를 들어 배열 번호 2 로 나타내는 인간 Dlk-1 의 아미노산 배열 중의 제 26 번째 ∼ 제 85 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 또는 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부와 결합하는 (당해 일부를 인식하는) 것을 들 수 있다.

(5) 상기 (1) ∼ (4) 에 기재된 항체로는, 예를 들어 수탁 번호가 FERM BP-10707, FERM BP-10899, 또는 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항체를 들 수 있다.

(6) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편.

상기 (6) 에 기재된 항체 단편은, 예를 들어 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있다.

상기 (6) 에 기재된 항체 단편은, 예를 들어 배열 번호 33 ∼ 35 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있다.

(7) 상기 (1) 에 기재된 항체를 산생하는 하이브리도마.

(8) 수탁 번호가 FERM BP-10707 인, 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.

(9) 수탁 번호가 FERM BP-10899 인, 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.

(10) 수탁 번호가 FERM BP-10900 인, 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.

(11) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체와 항종양 활성 및/또는 살세포 (殺細胞) 활성을 갖는 화합물을 함유하는 항체-약제 복합체.

(12) 상기 (6) 에 기재된 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 함유하는 항체 단편-약제 복합체.

상기 (11) 및 (12) 에 기재된 복합체에 있어서, 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

상기 (11) 및 (12) 에 기재된 복합체에 있어서, 항종양 활성은, 예를 들어 종양 혈관 신생 저해 활성을 들 수 있다.

(13) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 의약 조성물.

상기 (13) 에 기재된 조성물은, 예를 들어 종양 치료에 사용하는 것을 들 수 있고, 종양 치료로는, 예를 들어 종양 혈관 신생을 저해하는 것을 들 수 있다. 또, 당해 조성물은, 예를 들어 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다.

상기 (13) 에 기재된 조성물은, 예를 들어 종양 진단에 사용하는 것을 들 수 있다.

상기 (13) 에 기재된 조성물에 있어서, 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(14) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.

상기 (14) 에 기재된 치료제는, 예를 들어 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다.

상기 (14) 에 기재된 치료제에 있어서, 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(15) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 혈관 신생 저해제.

상기 (15) 에 기재된 저해제는, 예를 들어 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다.

상기 (15) 에 기재된 저해제에 있어서, 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(16) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 진단제.

상기 (16) 에 기재된 진단제에 있어서, 종양으로는, 예를 들어 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(17) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시켜, 반응한 항체의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 종양의 검출 방법.

(18) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종, 혹은 상기 (13) 의 의약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양 진단 및/또는 치료 방법.

상기 (18) 방법으로는, 예를 들어 종양의 혈관 신생을 저해 또는 억제하는 것에 의한 종양 치료 방법을 들 수 있다.

(19) 종양 진단용 및/또는 치료용의, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 또는 상기 (11) 혹은 (12) 에 기재된 복합체.

(20) 종양을 진단 및/또는 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 또는 상기 (11) 혹은 (12) 에 기재된 복합체의 사용.

(21) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체, 상기 (6) 에 기재된 항체 단편, 및 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 검출용, 진단용 또는 치료용 키트.

도 1 은, hDlk-1 발현 간암 세포주 (Huh-7-hDlk cell) 를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서, 공지된 (WO 2005/052156) 항hDlk-1 모노클로날 항체 3 클론 (1C1, 4C4, 31C4) 을 투여했을 경우의 결과를 나타내는 도면이다. 각 항체는, 1 일째 (Day 1), 4 일째 (Day 4), 7 일째 (Day 7) 및 10 일째 (Day 10) 의 총 4 회 (화살표) 복강 내 투여를 실시하였다.

A : 래트 IgG (컨트롤군) (●), 1C1 (○)

B : 래트 IgG (컨트롤군) (●), 4C4 (○)

C : 래트 IgG (컨트롤군) (●), 31C4 (○)

A ∼ C 의 각각에 있어서, 각 군의 개체 수는 N 으로 나타내고, 각 측정치(종양 체적) 는 평균치±표준 오차로 나타내었다. 이들 실험은, 적어도 3 회의 독립된 실험을 실시하였다. 어느 경우도 누드 마우스 피하에서 확립된 간암에 대한 항종양 활성은 확인되지 않았다.

도 2 는, Huh-7-hDlk cell 을 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서, 신규 항hDlk-1 모노클로날 항체 클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 의 항종양 활성을 평가한 도면이다.

A : 컨트롤군 (마우스 IgG) 과 DI-2-14 투여군의 종양 성장을 시간 경과적으로 나타내었다 (평균치±표준 오차). 화살표는 항체 투여 (20mg/kg 체중, 복강 내 투여) 를 나타낸다. * P < 0.01 (by Student's t-test)

B : A 의 시험에 있어서, 14 일째 (Day 14) (실험 마지막 날) 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. 각 플롯 상에 나타내는 수치는 평균치±표준 오차. * P < 0.01 (by Student's-t-test)

C : DI-2-14 의 항종양 활성을 독립된 다른 실험에서 평가한 결과를 나타낸다. * P < 0.01 (by Student's-t-test)

도 3 은, Huh-7-hDlk cell 을 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서, A : 클론 2-13 (래트 IgG2b), B : 클론 BA-1-3D (마우스 IgG2a), C : 클론 DI-6 (마우스 IgG1), D : 클론 M3-1 (마우스 IgG1) 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. 종양 체적은 평균치±표준 오차로 나타내고, 아스터리스크는, 유의차 검정 (* P < 0.01, **P < 0.05 by Student's-t-test) 의 결과를 나타낸다.

도 4 는, 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론 2-13) 의 hDlk-1 발현 대장암 세포주 (SW480-hDlk 세포) 를 사용한 Xenograft Treatment 모델에서의 항종양 활성을 나타낸 도면이다. SW480-hDlk 세포를 누드 마우스 피하에 이식하고, 대장암 조직을 확립시켰다. 화살표로 나타내는 시점에서 항체 (20mg/kg 체중) 를 복강 내 투여하였다. 종양 체적은 평균치±표준 오차로 나타내었다 (*P < 0.01, **P < 0.05 by Student's-t-test).

도 5 는, HEK293-hDlk 세포를 사용한 항hDlk-1 모노클로날 항체의 플로사이트메트리에 의한 반응성을 나타내는 도면이다. 각 히스토그램 상에 나타내는 번호는 클론 번호를 나타낸다. 흑색칠이 아이소타이프 컨트롤 항체. 흑색선이 항hDlk-1 모노클로날 항체이다.

도 6 은, Huh-7-hDlk 세포를 사용한 항hDlk-1 모노클로날 항체의 플로사이트메트리에 의한 반응성을 나타내는 도면이다. 각 히스토그램 상에 나타내는 번호는 클론 번호를 나타낸다. 흑색칠이 아이소타이프 컨트롤 항체. 흑색선이 항hDlk-1 모노클로날 항체이다.

도 7 은, 항hDlk-1 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프를 해석하기 위해서 제작한 각 EGF 유사 모티브를 결실시킨 변이체의 모식도이다.

도 8 은, 클론 DI-2-14 의 에피토프 해석의 결과를 나타내는 도면이다.

A : 기재되어 있는 hDlk-1 유전자의 변이체를, COS-7 세포에 리포펙션에 의해 일과성으로 유전자 도입하여 24 ∼ 72 시간 후에 FACS 해석한 도면이다 (왼쪽 : 마우스 IgG1, 오른쪽 : DI-2-14). 게이트를 가하고 있는 부분이, 클론 DI-2-14 가 인식하고 있는 각 변이체 발현 세포를 나타낸다.

B : EGF (1-2) 를 발현시킨 COS-7 세포의 도말 표본을 양성 컨트롤 (항hDlk-1 폴리클로날 항체) 과 클론 DI-2-14 에 의해 면역 염색한 사진이다. 다갈색으로 염색되어 있는 부분이 EGF (1-2) 의 발현을 나타낸다.

도 9 는, 클론 DI-6, BA-1-3D 및 2-13 의 에피토프 해석의 결과를 나타내는 도면이다.

A : 기재되어 있는 hDlk-1 유전자의 변이체를 COS-7 세포에 리포펙션에 의해 일과성으로 유전자 도입하여 24 ∼ 72 시간 후에 FACS 해석한 도면이다. 게이트를 가하고 있는 부분이, 각 클론이 인식하고 있는 각 변이체 발현 세포를 나타낸다.

B : EGF (1-2) 를 발현시킨 COS-7 세포의 도말 표본을 클론 DI-6, BA-1-3D 및 2-13 에 의해 면역 염색한 사진이다. 화살표로 나타내는 다갈색으로 염색되어 있는 부분이 EGF (1-2) 의 발현을 나타낸다.

도 10 은, 클론 M3-1 의 FACS 에 의한 에피토프 해석의 결과를 나타내는 도면이다.

기재되어 있는 hDlk-1 유전자의 변이체를 COS-7 세포에 리포펙션에 의해 일 과성으로 유전자 도입하여 24 ∼ 72 시간 후에 FACS 해석한 도면이다. 게이트를 가하고 있는 부분이, DI-2-14 가 인식하고 있는 각 변이체 발현 세포를 나타낸다.

도 11 은, 항hDlk-1 모노클로날 항체의 항원 결합 후의 인터날리제이션 활성의 분석 결과를 나타내는 도면이다.

A : HEK293-hDlk 세포를 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론 M3-1, M1-290 및 M3-4) 와 반응시키고 (4℃, 20 분), PBS 로 2 회 세정한 후, 37℃ 에서 기재되어 있는 시간 인큐베이트하였다. 그 후, PE 표지 항마우스 IgG 와 반응시켜, FACS 해석을 실시하였다. 값은, 인큐베이트 없음 (0 분) 에 있어서의 평균 형광 강도를 100% 로 했을 경우의 상대치로서 나타내었다.

B : FITC 표지한 클론 M3-1 (FITC-M3-1) 을 HEK293-hDlk 세포와 반응시키고 (4℃, 20 분), PBS 로 2 회 세정한 후, 37℃ 에서 120 분 인큐베이트했을 때의 평균 형광 강도의 변화를 나타낸 도면이다. 흑색 칼럼은, A 와 동일하게 미표지 M3-1 과 세포를 반응시킨 후, 37℃ 에서 120 분 인큐베이트하여, PE 표지 항마우스 IgG 와 반응시켰을 경우의 평균 형광 강도의 변화를 나타내었다.

도 12 는, 로다민 표지한 항hDlk-1 모노클로날 항체의 항원 결합 후의 인터날리제이션 활성의 분석 결과를 나타내는 도면이다.

A : HEK-293-hDlk 세포를 로다민 표지-M3-1 (Rho-M3-1) 과 반응시키고 (4℃, 20 분), PBS 로 2 회 세정 후, 즉시 도말 표본을 제조하여, 형광 현미경으로 Rho-M3-1 의 편재를 관찰한 사진이다. 오렌지색으로 나타내는 부분이 Rho-M3-1 의 편재를 나타내고, 세포막에 편재가 관찰되었다.

B ∼ E : Rho-M3-1 (B), Rho-DI-1 (C), Rho-M1-290 (D) 및 Rho-M3-4 (E) 를 HEK293-hDlk 세포와 반응시켜, PBS 로 2 회 세정 후, 37℃ 에서 15 분 인큐베이트한 후, 도말 표본을 제조하여, 형광 현미경으로 각 클론의 편재를 관찰한 사진이다. 동일한 에피토프 (EGF 4-6) 를 인식하는 Rho-M3-1 및 Rho-DI-1 은, 모두 세포 내에 도입되어, 도트상으로 편재되어 있는 모습이 관찰되었다.

도 13 은, 사포린을 결합시킨 항hDlk-1 모노클로날 항체의, Huh-7-hDlk 세포 및 SK-N-F1 세포에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 도면이다.

A : Huh-7-hDlk 세포에 대한 컨트롤 (마우스 IgG-사포린 (IgG-SAP)) 및 M3-1-SAP 의 효과를 나타낸 도면이다. 세로축은 미첨가한 경우의 세포의 생존율을 100% 로 했을 때의 상대치 (N=3, 평균치±표준 편차) 로 나타내었다.

B : SK-N-F1 세포에 대한 컨트롤 (IgG-SAP), M3-1-SAP 및 M1-290-SAP 의 효과를 나타낸 도면이다.

도 14 는, Huh-7-hDlk 세포의 Xenograft 모델에 있어서, 마우스 IgG (20mg/kg 체중), M3-1-SAP (5mg/kg 체중), 및 M1-290-SAP (5mg/kg 체중) 를 투여했을 경우의 A : 투여 후의 각 마우스의 체중 변화, B : 마우스 생존율을 나타낸 도면이다. 값은 평균치±표준 편차로 나타내었다. 화살표는, 항체 투여시를 나타낸다.

도 15 는, Huh-7-hDlk 세포의 Xenograft 모델에 있어서, 마우스 IgG (●；N=8), 및 M3-1-SAP (○ : N=8) 을 복강 내 투여했을 경우의 종양 성장 저해 효과를 나타낸 도면이다. 화살표는 항체 투여시를 나타낸다. 값은 평균치±표준 편차로 나타내었다 (* P < 0.01, ** P < 0.05 by Student's t-test).

도 16 은, Huh-7-hDlk 세포의 Xenograft 모델에 있어서, A, B : 마우스 IgG (● : N=5) 와 M3-1-SAP (○ : N=5) 를 종양 내 투여 (40μg) 했을 경우의 종양 성장 저해 효과 (A) 및 체중 변화 (B) 를 나타낸 도면, 그리고, C, D : PBS (● : N=4) 와 시스프라틴 (○ : N=4) 을 복강 내 투여 (5mg/kg 체중) 했을 경우의 종양 성장 저해 효과 (C) 및 체중 변화 (D) 를 나타낸 도면이다. 어느 도면에 있어서도, 화살표는 항체 투여시를 나타내고, 값은 평균치±표준 편차로 나타내었다 (* P < 0.01, ** P < 0.05 by Student's t-test).

도 17 은, 인간 대장암 조직 어레이 (Cybrdi 사 제조, CC05-01-001) 를 항hDlk-1 항체로 면역 염색했을 경우의 대표 예를 나타내는 사진. 다갈색 부분이 항hDlk-1 항체로 염색된 암 조직을 나타낸다. hDlk-1 음성은, No.48 의 절편 (69세 남성, 선암, Grade Ⅲ) 에 나타내는 바와 같이, 완전히 염색된 영역이 관찰되지 않은 절편을 가리킨다. No.19 (55세 여성, 선암, Grade Ⅱ) 는, 매우 강한 염색성을 나타내고, No.19 와 동등한 염색성을 나타낸 절편을 hDlk-1 강양성으로 하였다. 또, No.25 (75세 남성, 선암, Grade Ⅱ) 와 같이, 분명하게 hDlk-1 양성인 것이 확인되어, 염색성이 약한 절편을 hDlk-1 약양성으로 하였다.

도 18 은, 인간 유방암 조직 어레이 (Cybrdi 사 제조, CC08-02-002) 를 항hDlk-1 항체로 면역 염색했을 경우의 대표 예를 나타내는 사진. 다갈색 부분이 항hDlk-1 항체로 염색된 암 조직을 나타낸다.

사진 상단은, 조직 어레이 중에 포함되는 정상 유선 조직을 항hDlk-1 항체로 염색했을 경우의 사진이다. 왼쪽 : No.07 (68세 여성, 정상 유관；hDlk-1 음성), 오른쪽 : No.01 (43세 여성, 정상 유선 소엽 ; hDlk-1 약양성). 화살표는, hDlk-1 약양성의 부위를 나타내었다.

사진 하단은, 침윤성 유관암 환자의 사진을 나타낸다. 왼쪽 : No.08 (45세 여성, Grade Ⅱ ; hDlk-1 음성), 중앙 : No.56 (28세 여성, Grade Ⅱ ; hDlk-1 약양성), 오른쪽 : No.20 (59세 여성, Grade Ⅱ ; hDlk-1 강양성).

도 19 는, Huh-7-dlk 세포 Xenograft treatment model 에 있어서의 클론 DI-2-14 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.

도 20 은, SK-N-F1 세포 Xenograft treatment model 에 있어서의 클론 DI-2-14 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.

A : 항체 투여 개시 이후의 종양 성장을 나타낸다. 종양 체적은 평균치±표준 오차로 나타내었다 (*P < 0.01, **P < 0.05 by Student's t-test).

B : 항체 투여 후 23 일째 (Day 23) 에 있어서, 적출된 암 조직의 중량을 나타내는 그래프이다.

도 21 은, 클론 DI-2-14 H 사슬 (중쇄(重鎖)) 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 22) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 23) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭체로 나타내고 있다. 이중 하선을 그은 글루타민산 (E) 은, 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (하선) 은, Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. 클론 DI-2-14 VH 의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열은 각각 순서대로 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타낸다.

도 22 는, 클론 DI-2-14 L 사슬 (경쇄(輕鎖)) 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 24) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 25) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩티드는 이탤릭체로 나타내고 있다. 이중 하선을 그은 아스파르트산 (D) 은, 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (하선) 은, Kabat 들 (1991；전술) 의 정의에 따랐다. 클론 DI-2-14 VL 의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열은 각각 순서대로 배열 번호 33 ∼ 35 에 나타낸다.

도 23 은, 클론 DI-2-14 VH 유전자의 염기 배열 (배열 번호 26) 및 아미노산 배열 (배열 번호 27) 을 나타내는 도면이다. 5' 말단에 SpeI 부위, 3' 말단에 HindⅢ 부위를 부가하고 있다 (각각 하선을 그었다.). 이탤릭 문자로 나타낸 염기 배열은, 인트론에 상당하는 배열을 나타낸다.

도 24 는, 클론 DI-2-14 VL 유전자의 염기 배열 (배열 번호 28) 및 아미노산 배열 (배열 번호 29) 을 나타내는 도면이다. 5' 말단에 NheI 부위, 3' 말단에 EcoRI 부위를 부가하고 있다 (각각 하선을 그었다.). 이탤릭 문자로 나타낸 염기 배열은, 인트론에 상당하는 배열을 나타낸다.

도 25 는, 키메라 DI-2-14 유전자 발현 벡터 (pChDI-2-14) 의 개략도이다. 당해 벡터는, SalI 사이트로부터 시계 방향 회전으로, 인간 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 주요 최초기 프로모터 (the human cytomegalovirus (CMV) major immediate early promoter) 와 항체 중쇄 유전자의 전사 개시를 위한 인핸서에서 시작되는 중쇄 번역 유닛을 포함한다. CMV 영역은, 그 후, VH 엑손, 인간 γ1 중쇄 정상 영역 (인트론을 개재하여 CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3 의 엑손을 포함한다) 의 유전자 배열, 그리고 CH3 에 이어지는 mRNA 프로세싱을 위한 폴리 A 부위에 이어지고 있다. 중쇄 유전자 배열 뒤에는, CMV 프로모터 및 인핸서에서 시작되는 경쇄 번역 유닛이 있고, 그 후, VL 엑손 및 상류에 인트론 부분을 갖는 인간 κ 사슬 정상 영역의 엑손 (CL), 그리고 κ 유전자의 폴리 A 시그널에 이어지고 있다. 당해 경쇄 유전자는, 그 후, SV40 초기 프로모터, 대장균 유래 크산틴구아닌 포스폴리보실트랜스페라아제 (gpt) 유전자 (the E.coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene), 및 SV40 의 폴리 A 부위를 함유하는 세그먼트 (segment) 에 이어지고 있다. 마지막으로, 당해 플라스미드는, 박테리아의 복제 기점 및 β-락타마아제 유전자를 함유하는 pUC19 플라스미드의 일부를 가지고 있다.

도 26 은, 마우스 DI-2-14 및 키메라 DI-2-14 (ChDI-2-14) 의 SDS-PAGE 에서의 전개 후, CBB 염색한 도면이다. MW 는 사이즈 마커를 나타내고, 화살표는 각각의 밴드의 분자량 (kD) 을 나타낸다.

도 27 은, 정제 FA-1 (hDlk-1 세포 외 영역) 고상 ELISA 에 의한 DI-2-14 및 ChDI-2-14 의 항원 결합 활성을 나타내는 도면이다. ○ 은, 마우스 IgG1 항체 (클론 DI-2-14), ● 는, 키메라 항체 (ChDI-2-14) 를 나타낸다.

도 28 은, HEK293-hDlk 세포를 사용한 DI-2-14 및 ChDI-2-14 의 플로사이트메트리에 의한 반응성을 나타내는 도면이다. 흑색칠된 히스토그램이 아이소타 이프 컨트롤 항체이고, 흑색선 (검은 부분) 의 히스토그램이 각각 DI-2-14 및 ChDI-2-14 이다.

도 29 는, 인간 간암 세포주에 있어서의 세포 표면 Dlk-1 의 발현을 플로사이트메트리로 해석한 도면이다. 청색 라인은 마우스 IgG1, 적색 라인은 항인간 Dlk-1 항체이며, 각각의 세포를 염색했을 경우의 히스토그램을 나타낸다.

도 30 은, 인간 유방암 세포주에 있어서의 세포 표면 Dlk-1 의 발현을 플로사이트메트리로 해석한 도면이다. 청색 라인은 마우스 IgG1, 적색 라인은 항인간 Dlk-1 항체이며, 각각의 세포를 염색했을 경우의 히스토그램을 나타낸다.

도 31 은, 인간 백혈병 세포주에 있어서의 세포 표면 Dlk-1 의 발현을 플로사이트메트리로 해석한 도면이다. 청색 라인은 마우스 IgG1, 적색 라인은 항인간 Dlk-1 항체이며, 각각의 세포를 염색했을 경우의 히스토그램을 나타낸다.

도 32 는, Huh-7-dlk 세포 Xenograft treatment model 에 있어서의 적출한 암 조직에 있어서의 Flk-1/VEGF-R2 의 면역 조직 염색을 나타내는 도면이다.

A : 마우스 IgG 투여군 (컨트롤군) 및 클론 DI-2-14 투여군으로부터 채취 (적출) 한 암 조직의 신선 동결 절편을 각각 항마우스 Flk-1/VEGF-R2 항체로 면역 염색한 사진이다 (대물 200 배). 사진 중, 화살 머리 형상의 표시 (▲) 로 나타낸 지점은, Flk-1/VEGF-R2 양성의 종양 혈관 내피 세포를 나타낸다.

B : IgG 투여군 (2 개체) 및 DI-2-14 투여군 (4 개체) 으로부터 각각 채취한 신선 동결 절편을 항마우스 Flk-1/VEGF-R2 항체로 면역 염색하고, 각각의 절편에 있어서, 대물 200 배 하에서 8 ∼ 13 시야 (IgG 투여군 : 전체 21 시야, DI-2-14 투여군 : 전체 35 시야) 에 대해, Flk-1/VEGF-R2 양성의 종양 혈관 내피 세포 수를 카운트하여, 1 시야당 세포 수를 나타낸 그래프이다 (*P < 0.01 by Student's t-test).

도 33 은, Huh-7-dlk 세포 Xenograft treatment model 에 있어서의 적출한 암 조직에 있어서의 Flk-1/VEGF-R2 의 유전자 발현을 나타낸 도면이다.

A : IgG 투여군 (N=7) 및 DI-2-14 투여군 (N=7) 으로부터 각각 종양을 적출한 후, Trizol 시약으로 RNA 를 추출하고, 이어서 1st strand cDNA 를 합성하고, 각각의 1st strand cDNA 를 주형으로서 사용하여, PCR 법 (30 사이클) 에 의해 마우스 Flk-1/VEGF-R2 (mFlk-1) 및 마우스/인간 GAPDH (GAPDH) 의 유전자 발현을 확인한 전기 영동 이미지를 나타내는 도면이다. 아래의 그래프는, mFlk-1 및 GAPDH 의 PCR 에 의한 증폭 산물의 밴드를 NIH image 로 정량하고, Ratio (mFlk-1/GAPDH) 로서 나타낸 그래프이다.

B : PCR 법에 의한 증폭 반응을 35 사이클 실시한 것 이외에는, A 와 동일하게 한 경우의 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들의 설명에 구속되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2006-305355호 명세서의 전체를 포함한다. 또, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간 행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은 참조로서 본 명세서에 도입된다.

1. 본 발명의 개요

인간 Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila)；hDlk-1) 은, 전술한 바와 같이, 전체 길이 383 아미노산 잔기의 1 회막 관통형의 1 형막 단백질이고, 세포 외 영역에 6 개의 EGF 유사 모티브를 갖는다. 그리고, hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은, 여러 가지 암이나 종양 세포에 있어서 고빈도로 발현되고 있는 것이 알려져 있다. 일반적으로, in vivo 에서 항종양 활성을 나타내는 항체를 제조하여 취득하기는 곤란하기 때문에, 항hDlk-1 모노클로날 항체를 제조하였다고 해도, in vitro 에서는 항종양 활성을 갖지만 in vivo 에서는 동 활성을 나타내지 않는 경우가 많다. 또, hDlk-1 의 암 세포의 증식 등에 대한 기능적 도메인이나, hDlk-1 의 리간드 (또는 수용체) 및 세포 내 시그널 전달 경로 등은 분명하지 않기 때문에, 타겟을 좁혀서 효율적으로 항체 제조를 실시하는 것도 실질적으로 불가능하다. 이와 같은 상황하, 본 발명에 있어서는, 다수의 클론으로부터 스크리닝을 실시함으로써, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 클론을 취득하는 것에 성공하였다.

먼저, 본 발명자는, 공지된 항hDlk-1 항체를 사용한 면역 조직 화학에 의해, 지금까지 hDlk-1 의 발현이 확인된 전술한 암이나 종양 세포 이외에, 새롭게 대장암 및 유방암에 있어서도 hDlk-1 이 발현된 것을 알아내었다.

이어서, 본 발명자는, 개체 레벨에서 hDlk-1 발현 암 세포를 사멸시킬 수 있 거나 또는 종양 성장을 저해할 수 있는 항hDlk-1 항체, 즉 in vivo 에 있어서 항종양 활성을 갖는 항hDlk-1 항체를 제조하는 것을 목적으로 하여, 새롭게 항hDlk-1 모노클로날 항체를 약 100 클론 제조하였다. 그리고, 이들 클론에 대해, 각종 암 세포주를 누드 마우스 피하에 이식하여 확립한 담암 (擔癌) 마우스를 사용하여 in vivo 에 있어서의 약효 (항종양 작용) 를 평가하였다. 그 결과, 현저한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 클론을 복수 얻는 것에 성공하였다 (클론명 : DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6, M3-1).

또 본 발명자는, 상기 서술한 항hDlk-1 항체 중에서도 hDlk-1 을 발현하는 세포 내로의 이동능 (인터날리제이션 활성) 이 우수한 항체를 알아내어, 이와 같은 항체와, 항종양 활성이나 살세포 활성을 갖는 화합물을 함유하는 항체-약제 복합체를 제조하였다. 이 복합체는, 이른바 이뮤노콘쥬게이트로서, 목적으로 하는 종양 세포 내로의 약제 송달능이 우수한 것이다.

본 발명자는, 상기 서술한 항종양 활성을 갖는 항hDlk-1 항체나 항체-약제 복합체를 사용하면, 각종 종양 치료, 혹은 종양 진단 및 검출에 유용한 것을 알아내었다.

2. 항hDlk-1 항체의 제조

(1) 항원의 조제

hDlk-1 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 의 정보는, 예를 들어 NCBI (GenBank) 의 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 「Accession number : NP_003827」 로서 공표되어 있다. 또한, hDlk-1 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열 (배열 번호 1) 의 정보는, 동 웹 사이트에 「Accession number : NM_003836」 으로서 공표되어 있다.

항원으로는, hDlk-1 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드 (간단히 펩티드라고도 한다) 를 사용할 수 있고, 바람직하게는, hDlk-1 의 세포 외 영역 (FA-1) 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 펩티드를 사용할 수 있다. hDlk-1 의 세포 외 영역은, 전술한 바와 같이 6 개의 EGF 유사 모티브 (EGF-1 ∼ EGF-6) 를 포함하는 영역을 말하고, 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중의 제 26 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산을 포함하는 영역, 바람직하게는, 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중 「제 24 번째 」 내지 「제 248 ∼ 285 번째」 까지의 아미노산으로 이루어지는 영역 (대략 225 ∼ 262 아미노산 잔기) 을 말한다.

여기에서, 항원에 사용하는 펩티드에 대해, 상기 「아미노산 배열의 적어도 일부」 란, 길이가 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 6 개의 EGF 유사 모티브 중 하나 또는 2 개 이상을 포함하는 영역이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 예를 들어 EGF-1 및 EGF-2 를 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중의 제 26 번째 ∼ 제 85 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), EGF-3 및 EGF-4 를 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중의 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), 그리고, EGF-4, EGF-5 및 EGF-6 을 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중의 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 이다.

항원으로 하는 펩티드의 제조 방법은, 화학 합성이어도 되고, 대장균 등을 사용하는 유전자 공학적 수법에 의한 합성이어도 되며, 당업자에게 주지 방법을 사용할 수 있다.

펩티드의 화학 합성을 실시하는 경우에는, 펩티드 합성의 주지 방법에 의해 합성할 수 있다. 또, 그 합성은, 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것이나 적용할 수 있다. 시판되는 펩티드 합성 장치 (예를 들어 시마즈 제작소 제조 : PSSM-8 등) 을 사용해도 된다.

펩티드를 유전자 공학적으로 합성하는 경우에는, 먼저, 당해 펩티드를 코드하는 DNA 를 설계하여 합성한다. 당해 설계 및 합성은, 예를 들어 전체 길이 hDlk-1 유전자를 함유하는 벡터 등을 주형으로 하고, 원하는 DNA 영역을 합성할 수 있도록 설계한 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 상기 DNA 를 적당한 벡터에 연결함으로써 단백질 발현용 재조합 벡터를 얻고, 이 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현할 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다 (Sambrook J.et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 또한, 동물 바이러스, 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 재조합 벡터의 제조는, 정제된 DNA 를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA 의 제한 효소 부위 등에 삽입하여 벡터에 연결하면 된다. 형질 전환에 사용하는 숙주로는, 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되 는 것은 아니다. 예를 들어 세균 (대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포 또는 곤충을 들 수 있다. 염소 등의 포유 동물을 숙주로서 사용할 수도 있다. 숙주에 대한 재조합 벡터의 도입 방법은 공지되어 있다.

그리고, 상기 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 항원으로서 사용되는 펩티드를 채취한다. 「배양물」 이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 혹은 배양균체 또는 그 파쇄물의 모두를 의미하는 것이다.

배양 후, 목적 펩티드가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 펩티드를 추출한다. 또, 목적 펩티드가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 펩티드의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산 암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 목적하는 펩티드를 단리 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 무세포 합성계를 사용한 in vitro 번역에 의해 항원이 되는 펩티드를 얻을 수도 있다. 이 경우에는, RNA 를 주형으로 하는 방법과 DNA 를 주형으로 하는 방법 (전사/번역) 의 2 가지 방법을 사용할 수 있다. 무세포 합성계로는, 시판되는 시스템, 예를 들어 Expressway^TM 시스템 (인비트로젠사), PURESYSTEM (등록 상표；포스트 게놈 연구소), TNT 시스템 (등록 상표；프로메 가사) 등을 사용할 수 있다.

상기와 같이 얻어진 펩티드는, 적당한 캐리어 단백질, 예를 들어 우혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 티로글로블린, 닭 감마글로블린 등에 결합하는 것도 가능하다.

또 항원은, hDlk-1 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 또는 전술한 그 부분 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드이어도 된다. 예를 들어 hDlk-1 의 아미노산 배열 또는 그 부분 배열 중 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실되어 있고, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있거나, 혹은, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, hDlk-1 단백질 혹은 그 부분 단편 또는 이들의 변이형 단백질 또는 단편을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로는, 예를 들어 배열 번호 1 에 나타내어진 염기 배열 또는 그 부분 배열을 갖는 것을 사용할 수 있다.

또, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, 배열 번호 1 에 나타내어진 염기 배열에 상보적인 배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 hDlk-1 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열, 또는 그 부분 배열을 사용할 수도 있다.

「스트린젠트한 조건」 이란, 하이브리다이즈시킨 후 세정시의 조건으로서, 버퍼의 염 (나트륨) 농도가 10 ∼ 500mM 이고, 온도가 42℃ ∼ 72℃, 바람직하게는, 상기 염 농도가 50 ∼ 300mM 이고, 온도가 55 ∼ 68℃ 에서의 조건을 말한다.

유전자에 변이를 도입하기 위해서는, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km등 : 다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 실시할 수 있다.

(2) 폴리클로날 항체의 제조

조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물에게 투여한다. 포유 동물은 특별히 한정되지는 않고, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등을 들 수 있고, 그 중에서도 마우스가 바람직하다.

항원의 동물 한 마리당 투여량은 아쥬반트의 유무에 의해 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는, 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA), 프로인트 불완전 아쥬반트 (FIA), 수산화알루미늄 아쥬반트 등을 들 수 있다. 면역은, 주로 정맥 내, 족척, 피하, 복강 내 등에 주입함으로써 실시할 수 있다. 또, 면역의 간격에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 수 일 내지 수 주일 간격, 바람직하게는 1 주일 간격으로, 1 ∼ 10 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종의 면역일로부터 3 ∼ 7 일 후에 효소 면역 측정법 (ELISA 또는 EIA) 이나 방사성 면역 측정법 (RIA) 등에 의해 항체가 (價) 를 측정하고, 원하는 항체가를 나타낸 날에 채혈하여 항혈청을 얻을 수 있다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요시되는 경우에는, 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하거나, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다. 그 후에는, 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등에 의해 측정한다.

(3) 모노클로날 항체의 제조

(3-1) 항체 산생 세포의 채취

본 발명의 항hDlk-1 항체는 한정되지는 않지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등에게 투여한다. 항원의 동물 한 마리당 투여량은, 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는 상기와 동일하다. 면역 수법도 상기와 동일하다. 그리고, 최종의 면역일로부터 1 ∼ 60 일 후, 바람직하게는 1 ∼ 14 일 후에 항체 산생 세포를 채취한다. 항체 산생 세포로는, 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포 등을 들 수 있고, 그 중에서도 림프절 세포 및 비장 세포가 바람직하다.

(3-2) 세포 융합

하이브리도마 (항체 산생 세포주) 를 얻기 위해, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수할 수 있는 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는, 약제 선택성을 가지고, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유한다) 에서 생존할 수 없으며, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다.

미엘로마 세포로는, 예를 들어 P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8(X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) 및 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 등의 마우스 미엘로마 세포주를 들 수 있다. 미엘로마 세포의 선택은, 항체 산생 세포의 적합성을 적절히 고려하여 실시할 수 있다.

이어서, 미엘로마 세포와 항체 산생 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM 및 RPMI-1640 배지 등의 동물 세포용 배지 중에서, 1×10⁶ ∼ 1×10⁷ 개/㎖ 의 항체 산생 세포와 2×10⁵ ∼ 2×10⁶ 개/㎖ 의 미엘로마 세포를 혼합한다. 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 (항체 산생 세포 : 미엘로마 세포) 는 한정되지는 않지만, 통상적으로 1 : 1 ∼ 10 : 1 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 : 1 이다. 다음으로, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서, 예를 들어 평균 분자량 1,000 ∼ 6,000 돌턴 (D) 의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사 용하여, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.

(3-3) 하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을 예를 들어 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에 적당하게 희석시킨 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 뿌려, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당하게 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 14 일 전후부터 생육하는 세포를 하이브리마로서 얻을 수 있다.

다음으로, 증식된 하이브리도마의 배양 상청 중에 hDlk-1 에 반응하는 항체가 존재하는지의 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은, 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하여, ELISA, EIA 및 RIA 등에 의해 스크리닝할 수 있다.

융합 세포의 클로닝은, 한계 희석법 등에 의해 실시할 수 있다. hDlk-1 에 강한 반응성을 나타내는 항체를 플로사이트메트리 등에 의해 판정하고, 이것을 산생하는 하이브리도마를 선택하여, 클론으로서 수립한다.

(3-4) 모노클로날 항체의 채취

수립한 하이브리도마를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법, 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 「배양」 이란, 하이브리도마를 배양 접시 또는 배양 보틀 중에서 생육시 키는 것, 혹은 하이브리도마를 하기와 같이 동물의 복강 내에서 증식시키는 것을 의미한다.

세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10% 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37℃, 5% CO₂ 농도) 에서 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득할 수 있다.

복수 (復水) 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1×10⁷ 개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 2 ∼ 3 주일 후에 복수를 채취하는 것이 바람직하다.

상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요시되는 경우에는, 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하거나, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.

(3-5) 항종양 활성을 갖는 클론의 선별

본 발명의 항hDlk-1 항체는, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체이다.

여기에서, 「항종양 활성」 이란, 종양 세포 (암 세포) 를 사멸시키는 활성 또는 종양 성장을 저해하는 활성을 의미한다. 본 발명에 있어서, 항종양 활성으로는, 예를 들어 종양 혈관 신생 저해 활성을 바람직하게 들 수 있다. 또, 본 발명의 항체가 항종양 활성을 발휘할 수 있는 인간 종양 (종양 세포) 의 종류로는, hDlk-1 의 발현이 확인된 전술한 공지된 인간 종양 (구체적으로는, 고형 암에 서는, 신경내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경섬유종증, 소세포폐암, 간장암, 신장암 및 난소암 등, 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 등.) 그리고 본 발명자가 새롭게 hDlk-1 의 발현을 확인한 인간 대장암 및 인간 유방암을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다.

in vivo 에서의 항종양 활성의 확인은, 예를 들어 원하는 종양 세포를 마우스의 피하에 이식한 담암 마우스를 사용하고, 이 마우스에게 상기와 같이 얻어진 항체를 투여함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 투여는, 종양 세포의 이식 직후부터 실시해도 되고 (Prevention 모델), 이식에 종양이 소정의 체적이 된 것을 확인하고 나서 실시해도 된다 (Treatment 모델). 투여 방법은 한정되지는 않지만, 예를 들어 3 일에 1 회, 20mg/kg 체중, 복강 내 투여로 할 수 있다. Prevention 모델인 경우에는, 종양 형성 빈도와 종양 체적에 따라 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다. Treatment 모델인 경우에는, 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항hDlk-1 항체로는, 예를 들어 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 : M3-1), 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 : DI-2-14), 및 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 : DI-6) 등을 바람직하게 들 수 있다. 또, 클론명 : DI-2-14 의 항hDlk-1 모노클 로날 항체도 in vivo 에서의 높은 항종양 활성을 갖는 항체로서 바람직하다.

여기에서, 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma : M3-1」이라고 칭하고, 2006년 10월 18 일자로 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma DI-2-14」 라고 칭하고, 2007년 8월 21 일자로 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma DI-6」 이라고 칭하여 2007년 8월 21 일자로 모두 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 ((우)305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6) 에 기탁된 것이다.

또, 본 발명의 항hDlk-1 항체로는, 예를 들어 H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열인 것, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 33 ∼ 35 로 나타내는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 상기 H 사슬 V 영역으로는, 예를 들어 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 L 사슬 V 영역으로는, 예를 들어 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 항hDlk-1 항체로는, 예를 들어 수탁 번호가 FERM BP-10707, FERM BP-10899, 또는 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항hDlk-1 항체도 바람직하게 들 수 있다.

(3-6) 항hDlk-1 항체의 에피토프

본 발명의 항hDlk-1 항체의 에피토프 (항원 결정기) 는, 항원인 hDlk-1 의 적어도 일부이면 되고 한정되지는 않지만, 예를 들어 배열 번호 1 에 나타내어진 hDlk-1 의 아미노산 배열 중의 제 26 번째 ∼ 제 85 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-1 ∼ EGF-2 를 포함하는 영역), 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-3 ∼ EGF-4 를 포함하는 영역), 혹은 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-4 ∼ EGF-6 을 포함하는 영역) 이 적어도 일부인 것이 바람직하다. 그 중에서도, hDlk-1 의 EGF-4 ∼ EGF-6 을 포함하는 영역이 보다 바람직하고, 특히 바람직하게는, 제 92 번째 ∼ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-3 을 포함하는 영역) 이다. 당해 영역을 인식하는 (당해 영역과 결합하는) 항hDlk-1 항체는, 예를 들어 종양 세포 내에 대한 인터날리제이션 활성이 높아, 후술하는 이뮤노콘쥬게이트 등의 용도로 매우 유용한 것이다.

(4) 유전자 재조합 항체, 및 항체 단편

(4-1) 유전자 재조합 항체

본 발명의 항hDlk-1 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로는 한정되지는 않지만, 예를 들어 키메라 항체, 인간형화 항체 및 인간 항체 등을 들 수 있다.

키메라 항체 (즉 인간형 키메라 항체) 는, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체이고 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 키메라를 제조하는 경우에는, 그와 같이 연결된 항 체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다. 여기에서, 마우스 유래 항체의 가변 영역으로는, H 사슬 V 영역은, 예를 들어 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, L 사슬 V 영역은, 예를 들어 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.

인간형화 항체를 제조하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하고, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로, CDR 는 마우스 유래의 것으로 이루어지는 재구성한 가변 영역을 제조한다 (이른바 CDR 그래프팅 (CDR 이식)). 다음으로, 이들의 인간형화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 이와 같은 인간형화 항체의 제조법은, 당 분야에 있어서 주지되어 있다 (Nature, 321, 522-525 (1986)；J.Mol.Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86 : 10029-10033 (1989)；일본 공표특허공보 평4-502408호 (일본 특허 제2828340호；퀸 들) 등을 참조). 여기에서, 본 발명의 인간형화 항hDlk-1 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 배열로는 한정되지는 않지만, 예를 들어 H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열이, L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 33 ∼ 35 에 나타내어진 아미노산 배열을 바람직하게 들 수 있다.

인간 항체 (완전 인간 항체) 는, 일반적으로 V 영역의 항원 결합 부위인 초가변 영역 (Hyper Variable region), V 영역의 그 밖의 부분 및 정상 영역의 구조 가 인간의 항체와 동일한 구조를 갖는 것이다. 단, 초가변 부위는 다른 동물 유래이어도 된다. 인간 항체를 제조하는 기술도 공지되어 있고, 인간에게 공통되는 유전자 배열에 대해서는 유전자 공학적 수법에 의해 제조하는 방법이 확립되어 있다. 인간 항체는, 예를 들어 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143 ; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc.Acids Res., (1998) 26, 3447-3448 ; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, (2000) 97, 722-727 등을 참조) 나, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I.M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8 ;Carmen, S.et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203 ; Siriwardena, D.et.al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.

상기 키메라 항체, 인간형 항체 및 인간 항체는, 항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당 사슬인 것이 바람직하고, 상세하게는, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당 사슬을 항체 분자의 Fc 영역에 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이런 점 (항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬의 특징) 은, 전술한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체에 대해서도 마찬가지로 바람직하다.

(4-2) 항체 단편

본 발명의 항hDlk-1 항체의 단편도 본 발명의 항체에 포함되는 것으로 한다. 여기에서, 본 발명의 항체 단편은 본 발명의 항hDlk-1 항체와 마찬가지로, hDlk-1 에 대한 결합 활성을 갖는 것으로서 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것이다.

당해 항체의 단편으로는, 항hDlk-1 폴리클로날 항체 또는 항hDlk-1 모노클로날 항체의 일부분의 영역 (즉, 본 발명의 항hDlk-1 항체에서 유래하는 항체 단편) 을 의미하고, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv (variable fragment of antibody), 한개 사슬 항체 (H 사슬, L 사슬, H 사슬 V 영역, 및 L 사슬 V 영역 등), scFv, diabody (scFv 2 량체), dsFv (디술파이드 안정화 V 영역), 그리고 상보성 결정 영역 (complementarity determining region : CDR) 를 적어도 일부에 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.

Fab 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H 사슬의 N 말단측 약 절반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합에 의해 결합된 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab 를 코드하는 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab 를 제조할 수도 있다.

F(ab')₂ 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 통하여 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 후술하는 Fab 를 티오에테르 결합 혹은 디술파이드 결합시켜 제조할 수도 있다.

Fab' 는, 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab' 를 제조할 수도 있다.

scFv 는, 1 개의 H 사슬 V 영역 (VH) 과 1 개의 L 사슬 V 영역 (VL) 을 적당한 펩티드 링커 (P) 를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

diabody 는, scFv 가 2 량체화한 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은 동일한 것도 할 수 있고, 일방 을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 P 의 아미노산 배열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 그 시스테인 잔기 간의 디술파이드 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, Reiter 들에 의해 나타낸 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

CDR 을 함유하는 펩티드는, VH 또는 VL 의 CDR (CDR1 ∼ 3) 가 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 함유하는 펩티드는, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐 법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명의 항체 단편으로는, 그대로의 형상으로 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당 사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이어도 되고, 또, 상기 서술한 항체 단편과 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬이 그 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당 사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부의 융합 단백질이어도 된다. 이와 같은 항체 단편이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있으므로 바람직하다.

본 발명의 항체 단편의 구체예로는 한정되지는 않지만, 예를 들어 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열 (H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3) 을 적어도 일부에 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열 (H 사슬 V 영역) 을 포함하는 것을 들 수 있다. 또, 당해 항체 단편으로는, 배열 번호 33 ∼ 35 (L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3) 로 나타내는 아미노산 배열을 적어도 일부에 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열 (L 사슬 V 영역) 을 포함하는 것을 들 수 있다.

이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 상기 서술한 항체 단편도, 본 발명의 항hDlk-1 항체에 포함되는 것으로 한다.

3. 항체-약제 복합체의 제조

상기 본 발명의 항hDlk-1 항체를 사용한 이뮤노콘쥬게이트 등으로 하여, 당해 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체-약제 복합체를 제공할 수 있다. 또한, 미리 당해 항체 분자와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 각각 조제한 후, 이들을 복합화시켜 얻어진 것은 일반적으로 이뮤노콘쥬게이트라고 칭해진다. 또, 유전자 재조합 기술을 사용하여, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물로서의 단백질 톡신을 유전자 상에서 항체 유전자와 연결시켜, 1 개의 단백질 (융합 단백질) 로서 발현시켜 얻어진 것은 일반적으로 이뮤노톡신이라고 칭해진다.

항종양 활성을 갖는 화합물로는, 예를 들어 독솔비신, 칼리키아마이신, 미토마이신 C, Auristatin E 등을 들 수 있다.

살세포 활성을 갖는 화합물로는, 예를 들어 사포린, 리신, 녹농균 외 독소, 디프테리아톡신 등을 들 수 있고, 그 중에서도 사포린 및 녹농균 외 독소가 바람직하게 사용된다.

항체-약제 복합체의 제조 방법으로는 한정되지는 않지만, 예를 들어 디술파이드 결합이나 히드라존 결합에 의해 항체와 약제를 커플링하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 본 발명의 항hDlk-1 항체는, hDlk-1 을 발현하는 표적 종양 세포 내에 대한 인터날리제이션 활성이 우수한 것이다. 그 때문에, 미리 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 복합화시켜 둠으로써, 이들 화합물을 종양 세포에 직접적으로 또한 고선택적으로 작용시킬 수 있다. 본 발명의 항체-약제 복합체는, 표적 종양 세포로의 약제 송달능이 매우 우수한 것이다.

또한, 세포 내에 대한 인터날리제이션 활성은, 항체를 로다민 등에 의해 형 광 표지하고, 세포 내로의 이행 거동 및 항체의 편재성에 대해 형광 현미경 등을 사용하여 관찰함으로써 평가할 수 있다.

또 본 발명에 있어서는, 항체-약제 복합체에 있어서, 항체 대신에 전술한 항체 단편을 사용한 항체 단편-약제 복합체를 제공할 수도 있다. 항체 단편-약제 복합체의 상세한 내용에 대해서는, 상기 서술한 항체-약제 복합체의 설명을 적절히 적용할 수 있다.

이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 항체 단편-약제 복합체도 본 발명의 항체-약제 복합체에 포함되는 것으로 한다.

4. 의약 조성물

본 발명의 항hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는, 의약 조성물에 포함되는 유효 성분으로서 유용하다.

당해 의약 조성물은, 종양 치료용 및/또는 진단용의 의약 조성물로서 유용하다. 특히, 본 발명의 항hDlk-1 항체, 및 그 항체를 포함하는 항체-약제 복합체는, 항종양 활성으로서, 종양 혈관 신생 저해 활성을 갖는 것이기 때문에, 종양 치료용으로 사용되는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 항hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는, 종양 치료제, 종양 혈관 신생 저해제 및 종양 진단제에 포함되는 유효 성분으로서 유용한 것이다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 항hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 유효 성분으로서 포함하고, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물의 적용 대상이 되는 질환 (종양) 으로는, hDlk-1 의 발현이 확인된 전술한 공지된 인간 종양 그리고 본 발명자가 새롭게 hDlk-1 의 발현을 확인한 인간 대장암 및 인간 유방암을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경세포종 중의 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다. 이들 질환은 단독이어도 되고, 2 개 이상이 병발해도 된다.

「약학적으로 허용될 수 있는 담체」 란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 혹은 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그러한 담체의 1 종 이상을 사용함으로써, 주사제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제 혹은 시럽제 등의 형태의 의약 조성물을 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물은, 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로는, 1 개 이상의 활성 물질을 포함하고, 통상적인 방법에 의해 처방되는 주사제 등이 포함된다. 주사제의 경우에는, 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다.

특히, 본 발명의 항hDlk-1 항체 유래의 항체 단편 (그 중에서도 저분자인 것) 을 생체 내에 투여하는 경우에는, 상기에 추가하여, 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다. 콜로이드 분산계는 화합물 (항체 단편) 의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과를 기대할 수 있다. 콜로이드 분산계는, 통상적으로 사용되는 것이면 되며 한정되지 는 않지만, 폴리에틸렌글리콜, 고분자 복합체, 고분자 응집체, 나노 캡슐, 미크로스페어, 비즈, 및 수중 유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는, 특정 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는, 복수의 리포솜, 인공막의 소포이다 (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682 ; Blume and Cevc, Biochem.et Biophys.Acta, 1990, 1029, 91 ; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119 ; Chonn and Cullis, Current Op.Biotech., 1995, 6, 698).

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 혹은 의약 조성물에 함유되는 본 발명의 항hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체의 종류 등에 따라 상이하다. 통상적으로 성인 한 명당, 1 회당 600μg 내지 6000mg 의 범위에서 투여할 수 있지만, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어 주사제에 의해 투여하는 경우에는, 인간 환자에 대해, 1 회의 투여에 있어서 1kg 체중당 100μg ∼ 100mg 의 양을 1 일 평균당 1 회 ∼ 수 회 투여할 수 있다. 투여 형태로는, 정맥 내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 내 주사 혹은 복강 내 주사 등을 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 주사이다. 또, 주사제는, 경우에 따라, 비수성의 희석제 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 등의 식물유, 에탄올 등의 알코올류 등), 현탁제 혹은 유탁제로 하여 조제할 수도 있다. 그러한 주사제의 무균화는, 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시할 수 있다. 주사제는, 용시 (用時) 조제의 형태로서 제조할 수 있 다. 즉, 동결 건조법 등에 의해 무균의 고체 조성물로 하고, 사용 전에 무균 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은, 종양을 치료 및/또는 진단하는 의약 (약제) 을 제조하기 위한, 상기 본 발명의 항hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다. 또, 본 발명은, 종양을 치료용 및/또는 진단용의, 상기 본 발명의 항hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 제공하는 것이기도 하다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명의 항hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 사용하는 (즉 환자에게 투여하는) 것을 특징으로 하는 종양 치료 및/또는 진단 방법을 제공하는 것이고, 또, 종양을 치료 및/또는 진단하기 위한, 상기 본 발명의 항hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다.

5. 종양의 검출 방법

본 발명의 종양의 검출 방법은, 상기 본 발명의 항hDlk-1 항체와, 생체로부터 채취된 시료 (이하, 생체 시료) 를 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

전술한 바와 같이, hDlk-1 은 각종 종양 세포에 있어서 특이적으로 발현되는 것이 확인되었기 때문에, hDlk-1, 특히 유리 hDlk-1 (hDlk-1 의 세포 외 영역 부분) 은, 각종 종양 마커로서 이용할 수 있다. 그 중에서도, 인간 대장암, 인간 유방암 및 인간 간암의 마커로서 이용하는 것이 바람직하다.

그래서, 본 발명의 항hDlk-1 항체를 생체 시료와 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출함으로써, 종양을 검출할 수 있다. 얻어진 항체의 시그널은, 생 체 시료 중의 항원량 (즉 hDlk-1 량 또는 유리 hDlk-1 량) 의 지표가 된다. 본 발명의 항체를 사용한 종양의 검출은, 먼저 검체로서 피험자로부터 채취한 생체 시료, 예를 들어 검사 대상으로 하는 조직편 또는 혈액 등과 본 발명의 항체를 항원 항체 반응에 의해 결합시킨다. 이어서, 결합된 항체량의 측정 결과에 기초하여, 생체 시료 중의 목적으로 하는 항원량을 측정함으로써 실시한다. 당해 측정은, 공지된 면역학적 측정법에 따라 실시하면 되고, 예를 들어 면역 침강법, 면역 응집법, 표지 면역 측정법, 면역비 현탁법, 웨스턴 블롯법, 플로사이트메트리법 등을 사용할 수 있다. 표지 면역 측정법에서는, 항체의 시그널은, 표지 항체를 사용하여 직접 검출한 표지량으로 나타내는 것 외에, 이미 알려진 농도 혹은 이미 알려진 항체가의 항체를 표준액으로서 상대적으로 나타내어도 된다. 즉, 표준액과 검체를 측정계에 의해 측정하고, 표준액의 값을 기준으로 하여 생체 시료 중의 항체 시그널을 상대적으로 나타낼 수 있다. 표지 면역 측정법으로는, 예를 들어 ELISA 법, EI 법, RIA 법, 형광 면역 측정법 (FIA), 화학 발광 면역 측정법 (Luminescence immunoassay) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, ELISA 법이 간편하고 고감도라는 점에서 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과를 지표로 하여 종양 상태를 평가 또는 진단할 수 있다. 예를 들어 검출 결과가 소정의 기준치를 초과하는 것을 종양 양성, 소정의 기준치 이하인 것을 종양 음성으로 하고, 양성인 경우에는, 어느 하나의 종양을 발병시킬 가능성이 있는 것으로 판단하여, 종양 상태를 평가할 수 있다. 여기에서, 종양 상태란, 종양 이환 (罹患) 의 유 무 또는 그 진행도를 의미하고, 종양의 발증 유무, 진행도, 악성도, 전이의 유무 및 재발의 유무 등을 들 수 있다.

상기 평가에 있어서, 종양 상태로는 1 개를 선택해도 되고, 복수 개를 조합하여 선택해도 된다. 종양 유무의 평가는, 얻어진 검출 결과에 기초하여, 소정의 기준치를 경계로 하여 종양으로 이환되고 있는지의 여부를 판단함으로써 실시할 수 있다. 종양의 악성도는, 암이 어느 정도 진행되고 있는지를 나타내는 지표가 되는 것으로, 검출 결과에 기초하여, 병기 (Stage) 를 분류하여 평가하거나, 혹은 조기 암이나 진행 암을 분류하여 평가하거나 할 수도 있다. 예를 들어 검출 결과를 지표로 하여 조기 암 또는 진행 암으로 평가할 수도 있다. 종양의 전이는, 검출 결과를 지표로 하여, 원발소의 위치에서 떨어진 부위에 신생물이 출현하고 있는지의 여부에 따라 평가할 수 있다. 재발은, 간헐기 또는 관해 후에 검출 결과가 다시 소정의 기준치를 초과했는지의 여부에 따라 평가할 수 있다.

6. 종양의 검출용 또는 진단용 키트

본 발명의 항hDlk-1 항체는, 종양의 검출용 또는 진단용 키트의 형태로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 항체를 포함하지만, 그 외에 표지 물질, 혹은 항체 또는 그 표지물을 고정시킨 고상화 시약 등을 포함시킬 수 있다. 항체의 표지 물질이란, 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학 발광 화합물 등에 의해 표지된 것을 의미한다. 본 발명의 키트는, 상기의 구성 요소 외, 본 발명의 검출을 실시하기 위한 다른 시약, 예를 들어 표지물이 효소 표지물인 경우에는, 효소 기질 (발색성 기질 등), 효소 기질 용해액, 효소 반응 정지액, 혹은 검체용 희석액 등을 포함하고 있어도 된다. 또, 각종 버퍼, 멸균수 (水), 각종 세포 배양 용기, 각종 반응 용기 (에펜도르프 튜브 등), 블로킹제 (Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat 혈청 등의 혈청 성분), 세정제, 계면 활성제, 각종 플레이트, 아지화나트륨 등의 방부제, 및 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 키트는, 상기 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위해서 유효하게 사용할 수 있어, 매우 유용성이 높은 것이다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕

＜재료 및 방법＞

1. 세포주

HEK-293-hDlk 세포, 7E2-C-hDlk 세포, 및 Huh-7-hDlk 세포는, WO 2005/052156에 기재된 바와 같이 제조한 세포주를 사용하였다. 또, 인간 신경아세포종 SK-N-F1 세포는, American Type Culture Collection (ATCC；카탈로그 No.CRL2142) 로부터 입수하였다.

SW480-hDlk 세포에 대해서는, 인간 대장암 유래 세포주 SW480 (입수원 : 토쿄 대학 분자 세포 생물학 연구소 기능 형성) 에, 전체 길이 hDlk-1 유전자를 포함하는 발현 벡터 pcDNA-hdlk-Flag (WO 2005/052156 참조) 를 유전자 도입하고, 항생 물질 G418 (geneticin, GIBCO BRL) 에 의한 선택을 실시한 후, hDlk-1 을 안정적으로 발현하고 있는 세포주를 수립함으로써 얻었다.

2. 항hDlk-1 폴리클로날 항체의 제조

hDlk-1 의 세포 외 영역 (FA-1) 발현 벡터를 구축할 때에, 이하의 프라이머를 설계하여 합성하였다.

이 때, R 프라이머에는 XhoI 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하였다. 이들 프라이머를 사용하고, hDlk-1 의 cDNA 를 주형으로 하여, 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 PCR 반응을 실시하였다.

≪반응액 조성≫

주형 DNA : 1μL

10×PCR 버퍼 : 5μL

2.5mM dNTP : 4μL

Taq DNA 폴리머라아제 : 0.5μL

F 프라이머 (10μM) : 1μL

R 프라이머 (10μM) : 1μL

멸균수 : 37.5μL

총 : 50μL

≪반응 조건≫

「열 변성·해리 : 95℃ (60sec)→어닐링 : 55℃ (60sec)→합성·신장 : 72℃ (60sec)」 를 1 사이클로 하여, 총 35 사이클.

얻어진 hDlk-1 의 세포 외 영역 (인간 FA1) 의 cDNA 를 pCRⅡ 벡터 (인비트로젠) 에 클로닝하였다 (pCRⅡ-hFA1). 클로닝된 인간 FA1 의 cDNA 는, 시퀀서에 의해 확인하였다.

pCRⅡ-hFA1 로부터 인간 FA1 cDNA 를 포함하는 EcoRI/XhoI 단편을 잘라내어, pcDNA4/Myc-His 벡터 (인비트로젠) 의 EcoRI/XhoI 부위에 삽입하였다 (pcDNA4-hFA1). 이 발현 벡터에는 C 말단측에 Myc 태그 및 His 태그 배열이 부가되어 있고, 인간 FA1 은 Myc 태그 및 His 태그의 융합 단백질로서 발현한다. 융합 단백질을 항원으로 하여, 통상적인 방법에 의해, 토끼에 면역을 실시하여, 항hDlk-1 폴리클로날 항체를 제조하였다.

3. hDlk-1 유전자의 EGF 유사 모티브 결실 변이체의 제조

항hDlk-1 모노클로날 항체의 에피토프 해석에 사용하기 위해 이하와 같이, hDlk-1 유전자의 EGF 유사 모티브 결실 변이체를 제조하였다.

먼저, 해당되는 영역을 PCR 법에 의해 증폭시키기 위한 프라이머를 제조하였다. 제조된 각 프라이머 배열을 하기 표 1 에 나타낸다. 이 때, F 프라이머에는 NotI 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하고, R 프라이머에는 xbaI 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하였다. 단, EGF (4-6) 및 EGF (5-6) 의 영역을 증폭시키기 위한 R 프라이머에는, XbaI 에 의한 제한 효소 소화 배열은 부가되어 있지 않다. 또한, 표 1 중의 콘스트럭트란에 대해, 예를 들어 「EGF (1-4)」 라는 표기는, hDlk-1 의 FA-1 영역에 존재하는 6 개의 EGF 유사 모티브 (EGF-1 ∼ EGF-6) 중, EGF-1 에서 EGF-4 까지가 연속된 영역을 의미한다.

상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은, 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 실시하였다.

≪반응액 조성≫

주형 DNA : 1μL

10×PCR 버퍼 : 5μL

2.5mM dNTP : 4μL

Taq DNA 폴리머라아제 : 0.5μL

F 프라이머 (10μM) : 1μL

R 프라이머 (10μM) : 1μL

멸균수 : 37.5μL

총 : 50μL

≪반응 조건≫

PCR 법에 의해 증폭된 각 단편은 TA 클로닝 키트 (인비트로젠) 를 사용하여 pCR Ⅱ 벡터 (인비트로젠) 에 클로닝하여, 염기 배열을 확인하였다. 그 후, Not I/Xba I 로 절단한 단편을 얻어, 당해 단편을 pME18S-CFHX-FXYD TM 의 Not I/Xba I 부위에 서브 클로닝하였다. 또한, pME18S-CFHX-FXYD TM 은, 발현시킨 목적 단백질이 N 말단에 인간 CD8a (GenBank Accession No.NM_001768) 의 시그널 배열 및 His 태그 배열을 갖게 되도록 설계된 발현 벡터이다 (입수원 : 토쿄 대학 분자 세포 생물학 연구소 기능 형성).

4. 항hDlk-1 모노클로날 항체의 제조

(1) 세포 면역, 단백 항원 면역

hDlk-1 발현 세포주 (HEK-293-hDlk 세포, 7E2-C-hDlk 세포), 및 상기 방법에 의해 조제한 hDlk-1 의 FA-1 영역 (이하, hFA-1) 을 항원으로 하였다. hDlk-1 발현 세포주는, 1×10⁷ cell, hFA-1 단백은 20μg 를 면역 보조제 (완전 프로인트 아쥬반드 : 와코 순약 공업), 또는 TiterMax Gold (후나코시 주식회사) 와 1 : 1 로 혼합하여 에멀젼을 조제하고, 6 주령된 래트 (Wister), 마우스 (C57/BL6, Balb/c) 의 양 족척에 주사하였다 (첫 회 면역). 첫 회 면역으로부터 3 일 후 및 10 일 후에 추가 면역을 실시하고, 최종 면역의 다음날에 양 무릎 고(膏)림프절을 채취하여, 림프구를 조제하였다. 추가 면역은, 세포 면역에서는 5×10⁶cell 의 PBS 에 의한 세포 현탁액을 사용하고, 단백질 항원인 경우에는, 5μg 의 PBS 용액을 사용하였다. 최종 면역의 다음날에, 양 무릎 고림프절을 채취하여, 림프구를 조제하였다. 또한, 추가 면역시에는, PBS 에 의한 세포 현탁액을 항원으로 하였다. 조제한 림프구와 마우스 미엘로마 세포주 (P3-X63-Ag8.653) 를 3 : 1 의 비율로 혼합하여, 폴리에틸렌글리콜법에 의해 세포 융합을 실시하였다. 96 웰의 평저 플레이트에서 HAT (아미노프테린, 히폭산틴, 티미딘) 를 함유하는 선택 배지를 사용하여, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 10 일 ∼ 14 일 배양하고, 증식된 하이브리도마의 배양 상청을 Cell ELISA (후술) 에 의한 1 차 스크리닝, HEK-293 세포를 사용한 FACS 해석에 의해 2 차 스크리닝을 실시하였다. 그 후, 한계 희석법으로 항hDlk-1 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 클론 제조하였다.

(2) DNA 면역

마찬가지로, 항hDlk-1 모노클로날 항체를 제조하는 목적에서, DNA 면역법이라는 방법을 사용함으로써, hDlk-1 의 입체 구조를 인식하고, 그 생물 생리 활성을 저해하는 특이적 모노클로날 항체를 제조하였다. DNA 면역법은, 마우스 체내에 있어서, 도입된 발현 벡터에 끼워 넣어진 hDlk-1 유전자가 발현되기 때문에, 본래의 입체 구조나 번역 후의 각종 수식 (예를 들어 당 사슬 수식 및 디술파이드 가교 등) 을 유지한 형태로, 항원을 제시할 수 있기 때문에, 종래의 변성 단백질이나 합성 펩티드를 면역원으로 한 경우에는 곤란한, 본래의 hDlk-1 의 입체 구조를 인식하고, 그 생물 생리 활성을 저해하는 특이적 모노클로날의 제조를 시도하였다.

hDlk-1 의 전체 길이 cDNA 를 태그가 부착된 포유 동물 발현 벡터에 끼워 넣는다. 구축한 유전자 콘스트럭트가 설계한 대로 세포 표면에 발현되는지의 여부에 대해, 면역 실시 전에 포유 세포를 사용하여 검증하였다. 즉, 구축한 유전자 콘스트럭트를 포유 세포에 일과성 발현 도입하였다. 도입된 포유 세포를 CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양하여, FCM 해석에 사용하였다. FCM 해석할 때, 상기의 도입 유전자에 부가되어 있는 태그에 대한 항체를 유전자 도입한 배양 세포가 들어 있는 배양 용액에 첨가하여 30 분간 정치 (靜置) 시켰다. 그 후, 태그를 특이적으로 인식하는 형광 표지한 2 차 항체를 용액에 첨가하여, 30 분간 정치시키고 나서 FCM 해석에 사용하였다. 본 발명에서 구축한 유전자 콘스트럭트가 세포 표면에 발현된 것을 증명하였다.

hDlk-1 의 입체 구조를 인식하고 또한 그 생물 생리 활성을 저해하는 항hDlk-1 모노클로날 항체를 개발하기 위해, 상기와 같이 구축한 각종 유전자 콘스트럭트를 단독으로 또는 혼합하여, 여러가지 유전자 도입법 (근육 주사, electroporation, 유전자 총) 에 의해 면역 동물에 도입하였다 (약 2 ∼ 3 개월간 실시). 면역한 동물로부터 채취한 혈청 해석에는, 상기 HEK293-hDlk 세포를 사용하였다. 상기의 도입 유전자에서 면역 동물로부터 채취한 혈청을 HEK293-hDlk 세포가 들어가 있는 배양 용액에 첨가하여 30 분간 정치하였다. 그 후, 면역 동물의 면역 글로블린을 특이적으로 인식하는 형광 표지한 2 차 항체를 용액에 첨가하고, 30 분간 정치하고 나서 FCM 해석에 사용하였다. HEK293-hDlk 세포를 인식하는 강한 특이 항체를 산생하고 있는 동물을 해부하고, 통상적인 방법에 따라, B 세포를 단리하여 항hDlk-1 모노클로날 항체 제조하였다.

5. 항체 정제

상기 방법에 의해 제조된 하이브리도마의 클론을, 미리 (7 일전) 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (프리스테인) 이 투여된 BALB/c 누드 마우스의 복강 내에 3×10⁶ 개 투여하여, 2 주일 후의 복수를 채취하였다. 또한 이 복수로부터, 카프릴산 침전, 프로테인 G 칼럼 (HiTrap protein G；GE 헬스케어 바이오 사이언스) 를 사용하여 어피니티 정제를 실시함으로써, 각 하이브리도마 클론이 산생하는 항hDlk-1 모노클로날 항체를 얻었다. 이후의 해석은, 이 정제한 항hDlk-1 모노클로날 항체를 사용하여 실시하였다.

6. 항체의 표지

제조된 항hDlk-1 모노클로날 항체의 에피토프에 의한 분류, 또는 인터날리제이션 활성을 평가하기 위해서, 항체의 표지를 실시하였다. 당해 항체의 비오틴 표지는, ECL Protein Biotinylation module (GE 헬스케어 바이오 사이언스, RPN2202) 를 사용하여 실시하였다. 로다민 표지는, EZ-Label^TM Rhodamine Protein Labeling kit (피어스, 53002) 를 사용하여, FITC 표지는, EZ-Label^TM Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Protein Labeling kit (피어스, 53004) 를 사용하여, 각 키트에 첨부한 매뉴얼에 따라 실시하였다.

7. Cell ELISA

젤라틴으로 코트한 96 웰 배양 플레이트 (코닝) 에 상기 7E2-C(hdlk) 주를 7.5×10³ 세포/웰로 파종하고, 37℃ 에서 2 일간 배양하였다. 빙랭 PBS 로 세정 후, 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정, 0.2% Triton-X-100 (상품명) 용액으로 처리하여, cell ELISA 용 플레이트로 하였다. 이후, 통상적인 방법에 따라, ELISA 법을 실시하였다. 구체적으로는 이하와 같다.

먼저, 1% BSA-PBS 용액에 의한 블로킹을 실온에서 2 시간 실시하였다. 다음으로, 하이브리도마 상청을 첨가하고 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1% Tween20 (상품명) -PBS 용액으로 3 회 세정하였다. 2 차 항체로서 비오틴화 항래트 IgG (벡터 래버러터리) 를 0.1% Tween20-PBS 용액으로 100 배 희석하여 사용하였다. 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1% Tween20-PBS 용액으로 3 회 세정하였다. 또한 0.1% Tween20-PBS 용액으로 1000 배 희석시킨 horseradish peroxidase-streptavidin (HRP；벡터 래버러터리) 을 실온에서 1 시간 반응시켜, 0.1% Tween20-PBS 용액으로 3 회 세정하였다. TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine : SIGMA) 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 1M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate reader Model 550 (바이오·래드) 을 사용하여, 흡광도를 측정하였다.

8. FACS 해석

세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 떼어내어, 세포 현탁액 (세포 밀도 5×10⁶cells/㎖) 을 조제하였다. 항인간 Dlk 모노클로날 항체 0.5μg 와 세포 현탁액 100μL 를 4℃ 에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 세정 후, PE 표지 항마우스 IgG 또는 PE 표지 항래트 IgG (모두 BD 화민겐) (0.5μg) 와 반응 (4℃, 30 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤 디킨슨) 에 의해 해석하였다.

9. ELISA 법에 의한 해리 상수 (Kd 값) 의 산출

제조된 항hDlk-1 모노클로날 항체의 항원 친화성 (Kd 값) 은, ELISA 를 사용한 방법에 의해 산출하였다 (Djavadi-Ohaniance L.et al (1996), In Antibody Engineering, Chapter 4, pp77-97. IRL Press, Oxford).

구체적으로는, 96 웰 배양 플레이트 (코닝) 에 정제된 리콤비넌트 hFA-1 단백 (1μg/㎖) 을 첨가하여 항원을 고상화하였다 (실온, 1 시간). 다음으로, PBS 로 3 회 세정하여, 2% 스킴 밀크 (PBS 용액) 를 첨가하여 블로킹을 실시하였다 (실온, 1 시간). PBS 로 2 회 세정 후, 미리 항원 용액 (정제 hFA-1 단백；50, 25, 12.5, 6.25, 3.125nM) 와 항hDlk-1 모노클로날 항체의 각 클론 (0.5nM) 을 혼합하여 평균화시켜 둔 항원-항체 복합체를 상기 ELISA 플레이트에 첨가하여 반응시켰다 (실온, 1 시간). PBS 로 3 회 세정한 후, 블로킹액으로 희석시킨 HRP 표지 항마우스 IgG (최종농도 1μg/㎖) 또는 HRP 표지 항래트 IgG (최종농도 1μg/㎖) (모두 GE 헬스케어 바이오 사이언스) 와 반응시켰다 (실온, 1 시간).

10. 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체의 에피토프 해석

제조된 약 100 종류의 항hDlk-1 모노클로날 항체를 인식하는 에피토프에 의한 분류를 실시하였다. 상기 발현 벡터 hdlk-EGF(1-3)/pME18S-CFHX, hdlk-EGF (3-4)/pME18S-CFHX, hdlk-EGF (4-6)/pME18S-CFHX 를 각각 COS-7 세포에 유전자 도입하였다. 유전자 도입하고 나서 24 ∼ 72 시간 후에 세포를 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 떼어내고, FACS 해석에 의해, 각 항체 클론이 hDlk-1 의 어느 EGF 유사 모티브를 인식하는 것인지에 대해 검토하였다.

11. 면역 조직 염색법

인간 암 조직 어레이 (Cybrdi 사, 대장암 조직 어레이 Lot : CC05-01-001, 유방암 조직 어레이 Lot : CC08-02-002) 는, 탈파라핀 처리 후, 10mM 시트르산 완충액 (pH6.0) 중에서, 오토클레이브 (121℃, 5 분) 를 사용하여 항원 부활화 처리를 실시하고, 항hDlk-1 폴리클로날 항체를 사용한 염색에 사용하였다. DAB (3,3'-디아미노벤티딘) 를 기질로 하여 발색 반응을 실시한 후, 대비 염색으로서 헤마톡실린에 의한 핵 염색을 실시하였다. 구체적으로는, 이하와 같이 하여 실시하였다.

중성 포르말린에 의한 고정 및 파라핀 포매된 절편을 탈파라핀 처리 후, 10mM 시트르산나트륨 용액 중에서 오토클레이브 (121℃, 5 분) 를 사용하여 항원 부활화 처리를 실시하였다. 다음으로, 메탄올에 종농도 0.3% 가 되도록 과산화수소수를 첨가한 용액에 의해, 실온에서 20 분간 처리하여 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 제거하였다. PBS 로 실온 5 분간 세정을 2 회 실시하고, 블록 에이스 시약 (다이닛폰 제약 주식회사) 을 사용하여 30 분간 블로킹을 실시하여, 조직 중의 비특이적 결합 부위를 막는 조작을 실시하였다. 다음으로, 1/10 로 희석시킨 블록 에이스 시약에 의해 희석시킨 항hDlk-1 폴리클로날 항체 (종농도 0.5μg/㎖) 를 실온에서 1 시간 반응시켜, PBS 로 5 분간 세정을 3 회 실시하고, 계속해서, 1/10 로 희석시킨 블록 에이스 시약에 의해 100 배로 희석시킨 비오틴화 항토끼 IgG 항체를 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBS 에 의한 5 분간 세정을 3 회 실시한 후, ABC 키트의 시약을 설명서대로 혼합하여 ABC 컴플렉스를 만들어, 이것을 실온에서 30 분 반응시켰다. PBS 로 5 분간 세정을 3 회 실시한 후, 퍼옥시다아제 기질 (0.02% DAB (3,3'-디아미노벤티딘), 0.03% 과산화수소수, 50mM Tris-HCl pH7.5) 에 의해 발색을 실시하였다. 발색을 확인한 후, 물로 10 분간 세정하고, 마이어 헤마톡실린 용액 (와코 순약 공업) 에 의해 핵을 염색하고, 그 후 알코올로 탈수하고, 자일렌으로 투철하여, 엔테란뉴 (머크·재팬) 로 봉입하였다.

12. 담암 마우스의 제조, 및 항hDlk-1 모노클로날 항체의 약효 평가

(1) Prevention 모델

hDlk-1 을 발현하는 간암 세포주 (Huh-7-hDlk) 를 트립신 처리에 의해 떼어내고, PBS 로 6×10⁷cell/㎖ 의 세포 현탁액을 조정하여, 얼음 상에서 등량의 마트리겔 (BD 화민겐) 과 혼합하였다. 6 주령된 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리 피하에 26 G 의 시린지를 사용하여 100μL (3×10⁶cell) 주사하였다. 암 세포 이식 당일에 마우스를 군분 (群分) 하고, 항체의 투여 (20mg/kg 체중, 복강 내 투여) 를 개시하였다. 이후에는, 3 일에 1 회의 간격으로 동일한 투여를 실시하였다. 항종양 활성은, 종양 형성 빈도 및 종양 체적에 의해 평가하였다. 종양 체적의 계측은, 이하의 계산식을 사용하였다.

종양 체적 (㎣) = (짧은 직경)²× (긴 직경)×π/6

(2) Treatment 모델

hDlk-1 을 발현하는 간암 세포주 (Huh-7-hDlk) 및 hDlk-1 을 발현하는 대장암 세포주 (SW480-hDlk) 를 트립신 처리에 의해 떼어내고, PBS 로 6×10⁷ ∼ 10×10⁷ cell/㎖ 의 세포 현탁액을 조정하여, 얼음 상에서 등량의 마트리겔 (BD 화민겐) 과 혼합하였다. 6 주령된 암컷 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리 피하에 26 G 의 시린지를 사용하여 100μL (3×10⁶ ∼ 5×10⁶cell) 주사하였다. 암 세포 이식으로부터 10 ∼ 14 일 후, 종양 체적이 50 ∼ 150㎣ (평균치로 약 100㎣) 로 성장한 마우스를 군분하고, 군분 당일을 1 일째 (Day 1) 로 하여 항체 투여를 개시하였다. 항체는 3 일에 1 회의 간격으로 복강 내 투여를 실시하였다 (20mg/kg 체중). 항종양 활성은, 종양 체적을 계측함으로써 평가하였다. 유의차 검정은, Student's-t 검정 (Student's-t-test) 에 의해 실시하여, P < 0.05 이하를 통계적으로 유의로 판정하였다.

13. 항hDlk-1 모노클로날 항체의 인터날리제이션 활성의 평가

hDlk-1 모노클로날 항체가 항원에 결합한 후, 엔드사이토시스에 의해 세포 내에 도입되는 인터날리제이션 활성은, 항체가 인식하는 에피토프에 의존한다. 그래서, 제조된 항hDlk-1 모노클로날 항체의 인터날리제이션 활성을 평가하였다. FACS 해석에 의한 평가 방법은, FACS 해석과 형광 현미경에 의한 관찰에 의해 평가하였다.

FACS 해석에 의한 인터날리제이션 활성의 평가는 이하의 방법으로 실시하였다. 항hDlk-1 모노클로날 항체 (0.5μg) 를 HEK-293-hdlk 세포 (2×10⁵cell) 에 첨가하여 반응시키고 (4℃, 20 분), PBS 로 2 회 세정한 후, DMEM 배지에 현탁하고, 37℃ 에서 인큐베이트 (60 분, 90 분, 120 분, 240 분) 하고, 세포 표면 상에 항원-항체 복합체의 인터날리제이션을 촉진시켰다. 그 후, 원심 (1,000rpm, 5 분) 하여 세포를 회수 후, PE 표지 항마우스 (또는 래트 IgG) (0.5μg) 와 반응 (4℃, 20 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤 디킨슨) 에 의해 해석하였다.

또, FITC 표지한 항hDlk-1 모노클로날 항체를 동일한 방법으로 HEK-293-hdlk 세포와 반응시켜, PBS 로 2 회 세정한 후, DMEM 배지에 현탁하고, 37℃ 에서 인큐베이트 (120 분) 한 후, FACSCalibur (벡톤 디킨슨) 에 의해 해석하였다.

다음으로, 로다민 표지한 항hDlk-1 모노클로날 항체 (0.5μg) 를 HEK-293-hdlk 세포 (2×10⁵cell) 에 첨가하여 반응시키고 (4℃, 20 분), PBS 로 2 회 세정한 후, DMEM 배지에 현탁하고, 37℃ 에서 인큐베이트 (15 분, 30 분, 60 분, 120 분) 한 후, 사이토스핀 (샹동) 으로 도말 표본을 제조하여 (800rpm, 3 분), 마운팅 용액으로 봉입 후 (벡터 래버러터리), 형광 현미경 (니콘；에크리프스 E800) 으로 항원-항체 복합체의 편재를 관찰하였다.

14. 항hDlk-1 모노클로날 항체를 사용한 이뮤노콘쥬게이트의 제조

항원 결합 후의 인터날리제이션 활성이 높은 항hDlk-1 모노클로날 항체 클론 M3-1 (마우스 IgG1), 및 비교 대조로서의 클론 M1-290 (마우스 IgG2b) 과, 식물성 단백 독소인 사포린의 이뮤노콘쥬게이트를 제조하였다 (Advanced Targeting System사, 샌디에고).

15. 항hDlk-1 모노클로날 항체를 사용한 이뮤노콘쥬게이트의 약효 평가

세포는, 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 떼어내고, 10% FBS 를 첨가한 DMEM 배지에 1×10⁵cell/㎖ 의 세포 현탁액을 조정하였다. 콜라겐 코트한 96 웰의 평저 플레이트에 1×10⁴/well 로 파종하고, 2 ∼ 3 시간 배양하여 세포를 접착시켰다. 다음으로, 각종 이뮤노콘쥬게이트, 즉 마우스 IgG-사포린 (IgG-SAP), M3-1-사포린 (M3-1-SAP), 및 M1-290-사포린 (M1-290-SAP) 을 첨가하였다. 각각 0.1, 1, 10, 100, 1,000ng/㎖ 로 첨가하였다. 48 ∼ 72 시간 배양 후, MTT 법에 의해 흡광도를 측정하였다.

in vivo 에 있어서의 항종양 활성의 평가는, 상기 Huh-7-hDlk 세포를 사용한 담암 마우스로 평가하였다.

16. MTT 법

96 웰 플레이트에서 배양한 세포에 테트라컬러원 (생화학 공업) 을 첨가하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 3 ∼ 4 시간 반응시켰다. 반응 후의 96 웰 플레이트를 그대로 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 파장 490nm (대조 파장 : 655nm) 의 흡광도를 측정하였다.

＜결과＞

1. 인간 간암 세포 Xenograft (Prevention 모델) 에 있어서의 공지된 항hDlk-1 모노클로날 항체 (1C1, 4C4, 31C4) 의 종양 성장 저해 활성의 검토

hDlk-1 은, 여러 가지 암 세포의 세포 표면에 발현하고, 또 인간 간암 세포주에 hDlk-1 유전자를 안정적으로 발현시키면, 누드 마우스 피하에 이식했을 경우, 종양 성장 속도가 현저하게 촉진되는 점에서 (WO 2005/052156 참조), 항hDlk-1 항체는, 암 치료용 약제로서 유용한 것으로 생각된다. hDlk-1 자체는 유전자 배열/아미노산 배열이 공지되어 있으므로, 원리적으로는 합성 펩티드나 정제 단백을 면역원으로 하여, 공지된 방법에 의해 hDlk-1 에 대한 모노클로날 항체를 얻을 수는 있다. 그러나, 실제로 암 치료약으로서 활성을 나타내는, 즉 개체 레벨 (in vivo) 에서 항종양 활성을 나타내는 항체를 제조할 수 있는지의 여부는, 일반적으로 항원의 종류, 발현량, 단백 구조 등으로부터는 불명확한 경우가 많다. 수만 종류라고도 일컬어지는 모노클로날 항체 중에서 종양 (암) 을 대표로 하는 질환의 치료약으로서 출시되어 있는 것은, 불과 20 종류 정도라는 점에서도 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 항체는, 개체 레벨에서 약효를 나타내지 않는다.

공지된 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론 1C1, 4C4, 31C4) 는, 적어도 보체 존재하에 있어서 인간 간암 세포를 사멸시키는 것이 공지되어 있다 (WO 2005/052156 참조). 그러나, in vivo 에서의 약효에 대해서는 불명확하였다.

먼저, 공지된 3 클론의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을 hDlk-1 을 발현하는 간암 세포주 (Huh-7-hDlk) 를 누드 마우스 피하에 이식하고, 이식과 동시에 항체 투여를 개시하여, 종양 세포의 누드 마우스 피하에 대한 생착 (生着) 과 종양 성장에 대한 효과를 검토하였다.

하기 표 2 에 나타낸 바와 같이, 세포 이식과 동시에 항체 투여를 개시하고, 14 일째 (Day 14) 에 있어서, 컨트롤군 (래트 IgG 투여) 에서는, 10 마리 중 모든 개체에서 종양이 형성되었다 (평균 종양 체적 : 382.0±74.8㎣). 한편, 항hDlk-1 모노클로날 항체 투여군의 종양 형성율은, 1C1 투여군에서 40%, 4C4 투여군 및 31C4 투여군에서 30% 로 현저하게 종양 형성율이 낮았다. 21 일째 (Day 21) 에 있어서도, 1C1 투여군에서 70%, 4C4 투여군 및 31C4 투여군에서 50% 로 모두 항체 투여에 의해 종양 형성이 저해되었다. 형성된 종양의 체적은, 평균치에서는 항체 투여군은 컨트롤군보다 낮은 값을 나타냈지만, 통계적인 유의차가 확인되지 않았다.

2. 인간 간암 세포 Xenograft (Treatment 모델) 에 있어서의 공지된 항hDlk-1 모노클로날 항체 (1C1, 4C4, 31C4) 의 종양 성장 저해 활성의 검토

항hDlk-1 모노클로날 항체가 암 치료 항체로서 약효를 발휘하기 위해서는, 확립된 종양 조직에 대해 항종양 활성을 발휘하는 것이 매우 중요하다. 또, 상기 Prevention 모델에서는, 종양 형성율을 비교함으로써, 항체의 항종양 활성을 어느 정도 추측할 수는 있지만, 개체 간의 편차가 커, 항종양 활성을 정확하게 평가할 수는 없다.

그래서, 다음으로 Huh-7-hDlk 세포를 누드 마우스 피하에 이식하고, 평균 종양 체적이 100㎣ 로 성장한 단계에서 항체 투여를 개시하는 Treatment 모델로 약효 평가하였다.

도 1 에 나타내는 바와 같이, Treatment 모델에서는, 1C1 (래트 IgG1) (도 1A), 4C4 (래트 IgG2a) (도 1B) 및 31C4 (래트 IgG2a) (도 1C) 를 각각 20mg/kg 체중의 용량으로 3 일에 1 회 복강 내 투여를 실시하여, 종양 성장에 대한 효과를 검토하였다. 그러나, 어느 클론도 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내지 않았다.

3. 인간 간암 세포 Xenograft (Treatment 모델) 에 있어서의 신규 항hDlk-1 모노클로날 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성의 검토

hDlk-1 을 표적으로 한 암 치료용 항체는, Xenograft Treatment 모델에 있어서, hDlk-1 을 발현하는 종양 조직을 특이적으로 사멸시키거나, 종양의 성장을 저해하는 활성을 나타내는 것이 필수적이다.

본원 발명에 있어서 새롭게 제조한 항hDlk-1 모노클로날 항체 (약 100 클론) 를 동일하게 Huh-7-hDlk 세포의 Xenograft Treatment 모델로 평가하였다. 신규로 제조한 약 100 클론 중, 대부분의 클론은 공지된 3 클론과 동일하게, Treatment 모델에서는 약효를 나타내지 않았지만, 그 중에서도 현저한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 이하의 클론, 즉 클론 DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 및 M3-1 이 얻어졌다.

클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 투여군에서는, 항체 투여 후, 모든 개체에서 (N=8) 종양 성장이 저해되고, 투여 개시 후 14 일째 (Day 14) 에 있어서, 컨트롤군 (N=8) 의 종양 체적이 907.7±142.8㎣ 에 대해, 클론 DI-2-14 투여군에서는 175.5±46.5㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 2A). 항체 투여 개시 시점에서의 종양 체적을 1.0 으로 했을 때의, 14 일째 (Day 14) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 9.24 인데 대해, 클론 DI-2-14 투여군에서는 1.85 였다. 적출된 종양 중량도, 컨트롤군이 0.58±0.07(g) 인 것에 대해, 클론 DI-2-14 투여군에서는 0.15±0.04(g ; P < 0.01 by Student's t-test) 이었다 (도 2B).

도 2C 에 나타내는 바와 같이, 클론 DI-2-14 의 투여에 의한 항종양 활성은, 독립된 다른 시험에 있어서도 재현되어, 동일하게 종양 체적의 평균치가 100㎣ (컨트롤군 : 103.8±11㎣ (N=7), DI-2-14 투여군 : 101.4±9.5㎣ (N=8)) 에 이른 단계에서 항체 투여를 개시하였다. 투여 개시 후 14 일째 (Day 14) 에 있어서, 컨트롤군의 종양 체적이 733.37±244.86㎣ 인 것에 대해, 클론 DI-2-14 투여군에서는 148.83±32.65㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 였다.

클론 2-13 (래트 IgG2b) 투여군 (N=10) 에서는 완전하지는 않지만, 종양 성장 속도가 통계적으로 유의하게 저해되어, 투여 개시 후 14 일째 (Day 14) 에 있어서, 컨트롤군 (N=10) 의 종양 체적이 1580.2±179.4㎣ 인 것에 대해, 클론 2-13 투여군에서는 832.9±131.8㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로, 약 50% 의 저해를 나타내었다 (도 3A).

마찬가지로, 클론 BA-1-3D (마우스 IgG2a) 투여군 (N=8) 및 클론 DI-6 (마우스 IgG1) 투여군 (N=8) 에서는, 컨트롤군 (N=8) 의 종양 체적이 907.7±142.8㎣ 인 것에 대해, 각각 380.8±54.4㎣ (도 3B) 및 321.0±59.6㎣ (도 3C) 로, 모두 유의하게 종양 성장이 저해되었다 (P < 0.01 by Student's t-test).

또, 클론 M3-1 (마우스 IgG1) 투여군 (N=8) 에서도, 종양 성장 속도가 유의하게 저해되어, 투여 개시 후 14 일째 (Day 14) 에 있어서의 컨트롤군 (N=7) 의 종양 체적이 1123.8±249.1㎣ 인 것에 대해, 클론 M3-1 투여군에서는 457.0±123.75㎣ 였다 (P < 0.05 by Student's t-test ; 도 3D, 표 3 참조).

또한, 상기 클론 중, 클론 M3-1 을 산생하는 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma : M3-1」 이라고 칭하고, 2006년 10월 18 일자로 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 ((우)305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6) 에 기탁하였다 (수탁 번호 : FERM BP-10707).

마찬가지로, 클론 DI-2-14 를 산생하는 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma : DI-2-14」 라고 칭하고, 2007년 8월 21 일자로 동 센터에 기탁하였다 (수탁 번호 : FERM BP-10899).

클론 DI-6 을 산생하는 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma : DI-6」 이라고 칭하고, 2007 년 8 월 21 일자로 동 센터에 기탁하였다 (수탁 번호 : FERM BP-10900).

4. 인간 대장암 세포 Xenograft (Treatment 모델) 에 있어서의 항종양 활성의 검토

상기의 인간 간암 세포 Xenograft Treatment 모델을 사용한 경우와 동일하게, 인간 대장암 세포주 (SW480-hDlk) 의 Xenograft Treatment 모델에서의 항종양 활성을 클론 2-13 에 대해 검토하였다 (도 4).

클론 2-13 투여군에서는, 컨트롤군 (래트 IgG 투여군) 과 비교하여, 종양 성장이 유의하게 저해되어, 16일째 (Day 16) 에 있어서, 래트 IgG 투여군 (N=7) 의 종양 체적이 877.27±176.82㎣ (투여 개시일을 1.0 으로 한 경우, 5.01) 인 것에 대해, 클론 2-13 투여군 (N=8) 에서는 452.71±54.97㎣ (투여 개시일을 1.0 으로 한 경우, 2.87) 였다 (P < 0.05 by Student's t-test ; 도 4).

이상의 결과로부터, 항hDlk-1 모노클로날 항체는 간암 세포뿐만 아니라, 대장암 세포에 대해서도 in vivo 에서의 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.

5. 항hDlk-1 모노클로날 항체 (클론 DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 및 M3-1) 의 항원 결합 활성 (HEK-293-hDlk 세포를 사용한 FACS 해석, 및 ELISA 에 의한 해리 상수의 산출)

인간 암 세포 Xenograft 모델에서 현저한 항종양 활성을 나타낸 항hDlk-1 모노클로날 항체에 대해, 항원인 hDlk-1 과의 친화성을 HEK-293-hDlk 세포 (도 5) 및 Huh-7-hDlk 세포 (도 6) 를 사용하여 FACS 해석한 결과, 어느 클론이나 모든 세포주를 인식하고, hDlk-1 의 입체 구조를 인식하는 것이 보였다. 데이터는 나타내고 있지 않지만, 어느 클론이나 hDlk-1 을 발현하고 있지 않은 HEK293 세포 및 Huh-7 세포에 대해서는 전혀 인식하지 않았다.

다음으로, 이들 클론의 항원과의 친화성 (해리 상수) 을 상기 ELISA 법에 의해 산출하였다. 그 결과, 각각의 클론의 Kd 값은, 클론 DI-2-14 는 9.26×10^-9(M), 클론 M3-1 은 6.28×10^-9(M), 클론 BA-1-3D 는 32.2×10^-9(M), 클론 DI-6 은 10.1×10^-9(M) 이었다. 클론 2-13 에 대해서는, 정제된 리콤비넌트 hFA-1 과의 친화성이 높지 않아, 상기 방법에 의해 Kd 값을 산출할 수 없었다.

6. 항hDlk-1 모노클로날 항체의 에피토프 해석

다음으로, 항hDlk-1 모노클로날 항체의 에피토프를 해석하였다.

hDlk (EGF 1-2)-pME-CHFX, hDlk (EGF 1-3)-pME-CHFX, hDlk (EGF 3-4)-pME-CHFX, hDlk (EGF 4-6)-pME18-CHFX, 및 hDlk (EGF 5-6)-pME18-CHFX 각각의 발현 벡터 (도 7) 를 COS-7 세포에 도입하고, FACS 해석 및 사이토스핀 표본의 면역 염색에 의해, 각 항hDlk-1 모노클로날 항체가 hDlk-1 의 FA-1 영역 (세포 외 영역) 에 존재하는 6 개의 EGF 유사 모티브를 포함하는 영역 중, 어느 근처의 부위를 인식하고 있는지에 대해 검토하였다.

클론 DI-2-14 는, FACS 해석과 면역 염색에 의해, EGF (1-3) 및 EGF (3-4) 를 인식하고, EGF (1-2), EGF (4-6) 및 EGF (5-6) 은 전혀 인식하지 않았다 (도 8). 클론 DI-2-14 가 인식하는 에피토프는, hDlk-1 의 3 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-3) 내지 4 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-4) 를 포함하는 영역 (hDlk-1 의 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), 아마 EGF-3 (hDlk-1 의 제 92 번째 ∼ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 인 것이 보였다. 마우스에 있어서는, IgG 의 아이소타이프 중, 항체 의존성 세포 장해 활성 (ADCC) 은, IgG2a 와 IgG2b 가 강하고, IgG1 는 활성이 낮은 것이 보고되어 있다 (Kipps, T.J. et al., 1985 참조). 클론 DI-2-14 의 아이소타이프는 마우스 IgG1 인 점에서, 클론 DI-2-14 의 매우 강한 종양 성장 저해 활성은, ADCC 활성 등의 이펙터 세포를 통한 암 세포 장해 활성보다, hDlk-1 의 기능을 저해함으로써 항종양 활성을 발휘하고 있는 것이 나타나고, hDlk-1 의 EGF-3 및 EGF-4 를 포함하는 영역, 특히 EGF-3 은, hDlk-1 의 기능에 있어서 특히 중요한 도메인인 것이 보였다.

또, 클론 2-13, DI-6 및 BA-1-3D 는, EGF (1-2) 및 EGF (1-3) 를 인식하고, EGF (3-4) 및 EGF (4-6) 는 전혀 인식하지 않았다 (도 9). 이들 3 클론이 인식하는 에피토프는, hDlk-1 의 1 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-1) 내지 2 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-2) 를 포함하는 영역 (hDlk-1 의 제 26 번째 ∼ 제 85 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 인 것이 보이고, hDlk-1 의 EGF-1 및 EGF-2 를 포함하는 영역은, hDlk-1 의 기능에 있어서 특히 중요한 도메인인 것이 보였다.

또한, 클론 M3-1 은, EGF (1-4) 및 EGF (4-6) 를 인식했지만, EGF (1-2), EGF (1-3) 및 EGF (3-4) 는 인식하지 않았다 (도 10). 클론 M3-1 이 인식하는 에피토프는, hDlk-1 의 4 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-4) 내지 6 번째의 EGF 유사 모티브 (EGF-6) 를 포함하는 영역 (hDlk-1 의 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 인 것이 보이고, hDlk-1 의 EGF-4, EGF-5 및 EGF-6 을 포함하는 영역은 hDlk-1 의 기능에 있어서 특히 중요한 도메인인 것이 보였다.

7. 항hDlk-1 모노클로날 항체의 인터날리제이션 활성

제조된 항hDlk-1 모노클로날 항체의 각 클론을, 인식되는 에피토프에 따라 분류하고, 분류된 각 그룹에 속하는 클론에 대해, 항원 인식 후의 인터날리제이션 활성을 조사하였다.

EGF (1-2) 를 인식하는 클론 M1-290, EGF (4-6) 를 인식하는 M3-1, 및 EGF (5-6) 를 인식하는 클론 M3-4 에 대해, 각 항체를 HEK293-hDlk 세포와 반응시킨 후, 37℃ 에서 인큐베이트 하고, 그 후, PE 표지 항마우스 항체와 반응시켰다. 도 11A 에 나타내는 바와 같이, 인큐베이트를 하지 않은 경우의 형광 강도를 100% 로 했을 경우, 클론 M3-1 은 다른 클론과 비교하여 현저하게 빠른 속도로, 인큐베이트 시간에 의존하여 형광 강도가 감소하였다. 이 결과에 의해, 항원-항체 반응 후, 시간 의존적으로 세포 내에 도입됨으로써, 세포 표면 상의 항원-항체 복합체가 감소되기 때문인 것이 보였다. 또한, 각 인큐베이트 시간 후의 형광 강도는 이하와 같았다.

60 분；M3-1 : 38.7 %, M1-290 : 52.1 %, M3-4 : 74.1%

90 분；M3-1 : 36.9%, M1-290 : 47.1%, M3-4 : 71.15%

120 분；M3-1 : 28.1%, M1-290 : 36.3%, M3-4 : 57.3%

240 분；M3-1 : 12.2%, M1-290 : 31.2%, M3-4 : 41.4%

인큐베이트했을 경우의 평균 형광 강도의 감소 요인이, 인큐베이트 간에 항원과 결합한 항hDlk-1 모노클로날 항체가 당해 항원으로부터 떼어진 것이 아닌 것을 확인하였다. 클론 M3-1 을 직접 FITC 로 표지하고, 동일하게 HEK293-hDlk 세포와 반응시켜 PBS 로 세정 후, 37℃ 에서 120 분 인큐베이트하고, 그 후, FACS 해석을 실시하여, 반응 직후와 인큐베이트 120 분 후의 형광 강도를 비교하였다. 그 결과, 양자에서 유의 차는 없었다 (인큐베이트 없음 : 100%, 인큐베이트 120 분 후 : 110.9% ; 도 11B).

다음으로, 로다민 표지한 항체를 HEK293-hDlk 세포와 반응시켜, PBS 세정 후, 동일하게 37℃ 에서 인큐베이트하였다. 그 후, 사이토스핀을 사용하여 도말 표본을 제조하고, 형광 현미경으로 형광 표지 항체의 편재를 관찰하였다. 그 결과, 도 12 에 나타내는 바와 같이, 인큐베이트 없음에서는 세포막으로의 편재가 관찰되었다. 그러나, 37℃ 에서 인큐베이트함으로써, EGF (4-6) 를 인식하는 클론 M3-1 및 DI-1 에서는, 불과 15 분의 인큐베이트에서, 엔드사이토시스에 의해 세포 내에 도입되고, 베시클에 도입되어, 도트상의 세포 내 편재가 관찰되었다. 한편, 클론 M1-290 및 M3-4 에서는, 도트상의 편재가 관찰되지만, 대부분은 세포막에 편재되었다 (도 12).

이상의 결과로부터, 클론 M3-1 등의 EGF (4-6) 를 인식하는 항체는, 다른 도메인을 인식하는 항체와 비교하여, 항원 인식 후의 인터날리제이션 활성이 현저하게 높았다. 따라서, 클론 M3-1 등의 항hDlk-1 항체를 항암제나 세포 독소와 결합시켜 복합체화한 이뮤노콘쥬게이트는, 신속하게 표적 세포 내에 도입되기 때문에, 항암제나 세포 독소의 약리 효과가 높고, 또한 부작용이 적은 것이 생각되었다.

8. 항hDlk-1 모노클로날 항체 이뮤노콘쥬게이트의 세포 장해 활성

항hDlk-1 모노클로날 항체의 이뮤노콘쥬게이트를 사용한 미사일 요법의 유용성을, 인터날리제이션 활성이 높은 클론 M3-1 과, 비교 대조로서의 클론 M1-290 에 각각 사포린을 결합시킨 이뮤노콘쥬게이트 (M3-1-SAP, M1-290-SAP) 를 제조하여, 약효 평가를 실시하였다. M3-1-SAP 및 M1-290-SAP 모두 hDlk-1 을 발현하고 있지 않은 HEK293 세포에는 전혀 독성을 나타내지 않았다.

다음으로, hDlk-1 을 발현하고 있는 Huh7-hDlk 세포 및 SK-N-F1 세포 (내재성 hDlk-1 발현 신경아세포종) 에 첨가하여 배양한 결과, 컨트롤 (마우스 IgG-SAP) 에서는, 어느 세포에서도 거의 세포 장해성을 보이지 않았다. 그러나, M3-1-SAP 를 배양액에 첨가하여 배양한 결과, 농도 의존적으로 세포가 장해되어, 1μg/㎖ 의 농도이면, Huh-7-hDlk 세포에서는 생존률 23.3±1.35% (N=3), SK-N-F1 세포에서는 생존율 9.38±2.1% (N=3) 로, 강한 세포 장해 활성을 나타내었다 (도 13).

SK-N-F1 세포 (내재성 hDlk-1 발현 신경아세포종) 에 대한 M3-1-SAP 와 M1-290-SAP 의 세포 장해 활성을 비교한 결과, 도 13B 에 나타내는 바와 같이, 양자의 활성은 거의 동등하였다 (도 13B).

9. 항hDlk-1 모노클로날 항체 이뮤노콘쥬게이트의 in vivo 에 있어서의 종양 성장 저해 활성

M3-1-SAP 의 이뮤노콘쥬게이트로서의 유용성, 즉 마우스 개체에 투여했을 경우의 항종양 활성 및 부작용에 대해, Huh-7-hDlk cell 의 Xenograft 모델로 평가하였다. 비교 대조로서 M1-290-SAP 를 사용하였다. 항종양 활성의 평가는, 상기와 마찬가지로 종양 체적으로 실시하고, 부작용의 검토는 투여 후의 체중 변화 및 치사율로 실시하였다.

마우스 IgG 투여군 (N=8) 에서는, 시험 기간 (14 일간) 을 통해, 체중의 증감은 확인되지 않았지만, M3-1-SAP (5mg/kg 체중, 복강 내 투여) 투여군 (N=8) 및 M1-290-SAP (5mg/kg 체중, 복강 내 투여) 투여군 (N=8) 에서는, 이뮤노콘쥬게이트 투여 개시 후 4 일째 (Day 4) 에 있어서, 체중의 감소가 관찰되었다 (「M3-1-SAP」 는, Day 1 : 21.2±1.36(g), Day 4 : 18.5±1.44(g)；「M1-290-SAP」 는, Day 1 : 21.13±0.81(g), Day 4 : 17.9±0.85(g)). 특히, 인터날리제이션 활성이 높지 않은 M1-290-SAP 의 독성은 강하고, 8 개체 중, 4 일째 (Day 4) 에 2 개체가 사망하고, 5 일째 (Day 5) 에 나머지 6 개체가 사망했기 때문에, 결과적으로 투여 개시로부터 5 일간 모든 개체가 사망하였다 (도 14B).

한편, M3-1-SAP 투여군에서는 전 개체가 생존하고, 체중도 8 일째 (Day 8) 이후 회복이 보였다.

종양 성장에 대해서도, 도 15 에 나타내는 바와 같이, M3-1-SAP 투여군에서는 강하게 저해되고, 14 일째 (Day 14) 에 있어서의 종양 체적은 (투여는 Day 1 및 Day 4 의 2 회), 컨트롤군이 1123.8±245.65㎣ 인 것에 대해, M3-1-SAP 투여군에서는 415.8±105.1㎣ (P < 0.05 Student's t-test) 였다.

또한, M3-1-SAP 의 항종양 활성을 확인하기 위해서, M3-1-SAP 를 종양 부위에 국소 투여 (1mg/㎖ M3-1-SAP, 40μL/종양) 하였다. M3-1-SAP 및 컨트롤 IgG 의 투여는, 소정의 평균 종양 체적 (컨트롤군 : 144.98±6.1㎣ (N=5), M3-1-SAP군 : 145.87±21.26㎣ (N=5)) 이 된 시점과, 투여 개시 후 4 일째 (Day 4) 의 2 회 실시하여, 종양 체적의 성장을 관찰하였다.

그 결과, 도 16A 에 나타내는 바와 같이, M3-1-SAP 투여군에서는 7 일째 (Day 7) 까지 거의 완전하게 종양의 성장이 저해되고 (컨트롤군 : 584.02±137.07㎣, M3-1-SAP 군 : 148.67±38.0㎣, P < 0.01 by Student's t-test), 14 일째 (Day 14) 에 있어서도, 컨트롤군이 2038.66±333.17㎣ 인 것에 대해, M3-1-SAP 투여군은 575.75±216.61㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로, 매우 강한 항종양 활성을 보였다.

도 16B 에 나타내는 바와 같이, M3-1-SAP 의 종양 내 투여의 경우에 있어서도, 4 일째 (Day 4) 에 있어서의 2 회째의 투여 이후, 약간의 체중 감소가 확인되었지만, 전 개체 생존하고 있고, 9 일째 (Day 9) 이후에는 체중도 점차 회복하여, 10 일째 (Day 10) 에는 완전히 투여 전 상태로까지 회복하였다.

한편, 도 16C 에 나타내는 바와 같이, 기존 항암제인 시스플라틴 (Cisplatin ; 항악성 종양제 란다주；닛폰 화약 주식회사) 를 투여했을 경우, 5mg/kg 의 투여량으로, 종양 성장은 거의 완전히 저해되었지만 (16 일째에 컨트롤군 (PBS 군) : 1085.36±286.30㎣, Cisplatin 군 : 77.28±15.20㎣, P < 0.01 by Student's t-test), 도 16D 에 나타내는 바와 같이, Cisplatin 투여군에서는, 시간 경과적인 체중의 현저한 감소가 관찰되어, 16 일째 (Day 16) 에 있어서의 컨트롤군의 체중이 20.58±0.53g 인 것에 대해, Cisplatin 투여군에서는 13.24±1.83g (P < 0.01 by Student's t-test) 으로, 매우 강한 부작용 (체중 감소) 이 관찰되었다.

이상의 결과로부터, 인터날리제이션 활성이 높은 클론 M3-1 (EGF (4-6) 의 인식 항체) 은, 이뮤노콘쥬게이트로서 사용했을 경우, 다른 클론과 비교하여 부작용이 적고, 또한 항종양 활성이 높은 것이 보였다.

10. 인간 대장암 조직, 유방암 조직에 있어서의 hDlk-1 의 발현

hDlk-1 은, 종래 고형암에서는 신경내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경섬유종증, 소세포폐암, 간장암, 신장암 및 난소암에 있어서 발현되고 있는 것이 보고되고, 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병에 있어서 발현되고 있는 것이 보고되고 있다.

상기 이외의 암 종에서의 hDlk-1 의 발현을 조사하기 위해, 시판되는 인간 암 조직 어레이를 항hDlk-1 항체로 면역 염색하여 검토하였다. 대장암에 있어서의 hDlk-1 의 양성률은, 대장암 조직 어레이 (Cybrdi 사, lot No.CC05-01-001) 를 사용하였다. 도 17 에 대표적인 염색 사진을 나타내었는데, 70 검체의 대장암 조직을 검토한 결과, Adenocarcinoma (선암) 에서는 43 검체 중 12 검체 (27.9%) 가 강양성, 19 검체 (44.2%) 가 약양성을 나타내고, 선암 전체에서는 43 검체 중 31 검체 (72.1%) 에서 hDlk-1 양성이었다 (표 4 참조).

또, 동일한 조직 어레이 중의 Papilllary Adenocaricinoma (유두상 선암) 의 11 검체에 대해서는, 6 검체 (54.5%) 에서 hDlk-1 강양성을 보였다 (표 4 참조).

유방암에 있어서의 hDlk-1 의 양성률은, 유방암 조직 어레이 (Cybrdi 사, lot No. CC08-02-002) 를 사용하였다. 본 조직 어레이는, 53 검체로부터 채취한 총 63 절편으로 구성되고, 이 중, 17 검체 (17 절편) 가 Infiltrating duct carcinoma (침윤성 유관암), 2 검체 (2 절편) 가 Intraductal carcinoma (유관내 암), 34 검체 (44 절편) 가 정상 조직이나 콜라겐 화이버 등의 비암 조직으로 이루어진다. hDlk-1 은 정상적인 유선 조직에서도 약양성을 나타내는 검체도 있었지만 (도 18), 염색성은 매우 약하고, 한편, Infiltrating duct carcinoma 에서는 17 검체 중 5 검체 (29%) 에서 강양성을 보였다. (도 18, 표 5 참조).

종래 공지된 hDlk-1 발현암 종에 추가하여 대장암 및 유방암에서도, 양자 모두 약 30% 로 hDlk-1 이 강발현되고 있는 것이 분명해졌다. 항hDlk-1 모노클로날 항체는, 상기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 간암 세포의 Xenograft 에 추가하여, 대장암 세포의 Xenograft 모델에서도 항종양 활성을 보인 점에서, 간암에 추가하여, 대장암에 대해서도 유효한 치료약이 된다. 마찬가지로 유방암이나 그 밖의 hDlk-1 발현 암 세포를 표적으로 한 유효한 치료약이 된다.

〔실시예 2〕

1. 마우스 항인간 Dlk-1 항체 (클론 DI-2-14) 의 인간 Dlk-1 발현 간암 세포주 (Huh-7-Dlk 세포) Xenograft treatment 모델에 있어서의 용량 의존적인 항종양 활성

＜목적＞

항인간 Dlk-1 모노클로날 항체인 클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 는, 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 인간 간암 세포주 (Huh-7-hDlk 세포) 의 Xenograft Treatment 모델에 있어서, 20mg/kg 체중의 투여량에서 매우 높은 항종양 활성을 보였다. 그래서, 클론 DI-2-14 의 항종양 활성을 더욱 검증하기 위해서, 용량 의존적인 항종양 활성을 평가하였다.

＜방법＞

항체의 투여량을 바꾼 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 항종양 활성을 평가하였다.

＜결과＞

도 19 에 나타낸 바와 같이, 종양의 성장은 클론 DI-2-14 의 투여에 의해 용량 의존적으로 저해되어, 항체 투여 후 8 일째 (Day 8) 에 있어서, 컨트롤군 (N=9) 의 종양 체적이 782.1±124.4㎣ 인 것에 대해, DI-2-14 (1mg/kg) 투여군 (N=9) 이 522.76±107.9㎣, DI-2-14 (2mg/kg) 투여군 (N=9) 이 309.2±58.9㎣, DI-2-14 (5mg/kg) 투여군 (N=9) 이 285.8±38.2㎣ 였다.

2. 마우스 항인간 Dlk-1 항체 (클론 DI-2-14) 의 인간 신경아세포종 SK-N-F1 세포 Xenograft treatment 모델에 있어서의 항종양 활성

＜목적＞

실시예 1 에 기재된 바와 같이, 인간 간암 세포주 (Huh-7-hDlk 세포) 의Xenograft Treatment 모델에 있어서, 항종양 활성을 보인 5 종류의 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체 중에서도, 특히 강한 항종양 활성을 보인 클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 에 대해, 인간 신경아세포종 (SK-N-F1 세포) 의 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 항종양 활성을 평가하였다. Huh-7-hDlk 세포는, Huh-7 세포에 외래성에 인간 Dlk-1 유전자를 안정적으로 발현시킨 세포주인 데 대해, SK-N-F1 세포는, 내재적으로 Dlk-1 을 세포 표면에 발현하고 있는 세포주이다. 그 때문에, SK-N-F1 세포주에서의 Xenograft Treatment 모델에 있어서 클론 DI-2-14 의 투여에 의한 항종양 활성을 보이는 것은, 인간 신경아세포종에 대해 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체가 약효를 나타내는 것이고, 동시에, 세포 표면에 Dlk-1 을 발현하고 있는 각종 암 세포에 대해 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체 (특히 클론 DI-2-14) 가 유효한 (약효를 나타내는) 것이라고 할 수 있다.

＜방법＞

내재적으로 hDlk-1 을 세포 표면에 발현하는 인간 신경아세포종 (SK-N-F1 세포, ATCC : 카탈로그 No. CRL2142) 를 트립신 처리에 의해 떼어내고, PBS 로 6×10⁷cell/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하고, 얼음 상에서 등량의 마트리겔 (BD 화민겐) 과 혼합하였다. 6 주령된 암컷의 중증 복합 면역 부전 마우스 (NOD-scid) 의 오른쪽 옆구리 피하에 26G 의 시린지를 사용하여 100μL (3×10⁶cell) 주사하였다. 암 세포 이식으로부터 10 ∼ 14 일 후, 종양 체적이 50 ∼ 150㎣ (평균 : 약 100㎣) 로 성장한 마우스를 군분하고, 군분 당일을 1 일째 (Day 1) 로 하여 항체 (클론 DI-2-14) 의 투여를 개시하였다. 항체는, 3 일에 1 회의 간격으로 복강 내 투여에 의해 투여하였다 (5mg/kg 체중, 20mg/kg 체중). 항종양 활성은, 실시예 1 과 동일하게 하여 종양 체적을 계측함으로써 평가하였다. 또, 실험 마지막 날에, 부검에 의해 종양을 적출하여, 종양 중량을 계측하여 평가하였다. 유의차 검정은, Student's t-test 에 의해 실시하고, P < 0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 판정되었다.

＜결과＞

도 20A 에 나타내는 바와 같이, 클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 투여군에서는, 컨트롤군 (N=7) 과 비교하여, 5mg/kg 투여군 (N=8) 및 20mg/kg 투여군 (N=7) 중 어느 하나에 있어서도 종양 성장이 현저하게 저해되고, 특히 20mg/kg 투여군 (N=7) 에서는, 투여 개시 후의 다음날부터 실험 종료시인 23 일째 (Day 23) 까지, 동일 기준의 종양 체적이 통계적으로 유의하게 작았다 (P < 0.01 by Student's t-test).

투여 개시 후 23 일째 (Day 23) 에 있어서는, 컨트롤군의 종양 체적이 527.8±48.9㎣ 인 것에 대해, 클론 DI-2-14 (5mg/kg 체중) 투여군에서는 333.8±6.8㎣ (P < 0.01 by Student's t-test), 클론 DI-2-14 (20mg/kg 체중) 투여군에서는 233.0±16.4㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로, 클론 DI-2-14 의 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (DI-2-14 (5mg/kg) vs DI-2-14 (20mg/kg), Day 23, P < 0.01 by Student's t-test).

적출된 종양 중량도, 컨트롤군이 0.07±0.04(g) 인 것에 대해, 클론 DI-2-14 (5mg/kg 체중) 투여군에서는 0.03±0.009(g) (P < 0.05 by Student's t-test), 클론 DI-2-14 (20mg/kg 체중) 투여군에서는 0.02±0.005 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) 이었다. 종양 체적과 동일하게, 클론 DI-2-14 의 5mg/kg 투여군과 20mg/kg 투여군의 종양 중량의 차이도 유의 (P < 0.05 by Student's t-test) 하며, 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (도 20B).

3. 마우스 항인간 Dlk-1 항체 (클론 DI-2-14) 의 항체 유전자의 가변 영역 배열의 결정과, 키메라 DI-2-14 발현 벡터의 구축

마우스 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는, 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃, 7.5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 3×10⁶ 개의 하이브리도마로부터 TRIzol 시약 (Invitrogen) 을 사용하여 전체 RNA 를 추출한 후, GeneRacer Kit (Invitrogen) 를 사용하여, 키트 첨부의 방법에 따라, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 클론 DI-2-14 (마우스 IgG1) 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역 (VH, VL) 을 코드하는 유전자는, 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여, PCR 법을 사용하여 클로닝하였다. 이 때, 5'-프라이머는 GeneRacer Kit 에 첨부되어 있는 것을 사용하였다. 한편, 3'-프라이머는, VH 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 γ1 정상 영역에 상보적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 κ 정상 영역에 상보적인 배열을 갖는 것을 사용하였다.

≪반응액 조성≫

주형 cDNA : 1.5μL

10×ThermalAce PCR 버퍼 : 5μL

2mM dNTP : 5μL

ThermalAce 폴리머라아제 : 0.5μL

F 프라이머 (10 μM) : 3μL

R 프라이머 (10 μM) : 1.5μL

멸균수 : 33.5μL

총 : 50μL

≪반응 조건≫

「열 변성·해리 : 94℃ (10sec)→어닐링 : 55℃ (10sec)→합성·신장 : 72℃ (60sec)」 를 1 사이클로 하여, 총 35 사이클.

합성된 VH 및 VL 의 cDNA 를 pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여, 염기 배열을 결정하였다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하고, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정하였다. 도 21 및 도 22 에, DI-2-14 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타내었다.

다음으로, VH 및 VL 의 코드 영역에 각각 대응하는 마우스 생식 세포 계열 JH 및 Jκ 배열 유래의 스프라이싱 공여 시그널을 부가하고, 추가로 양단에 동물 세포 발현 벡터에 삽입하기 위해서 적절한 제한 효소 부위를 부가하였다. 이와 같이 하여 제조된 엑손으로서의 기능을 갖는 VH (도 23) 및 VL (도 24) 유전자를, 인간 γ1 사슬 및 κ 사슬의 정상 영역을 포함하는 동물 세포 발현 벡터 (도 25) 에 삽입하고, 마우스 인간 키메라 항체 (DI-2-14 IgG1/κ) 발현 벡터 (pChDI-2-14) 를 제조하였다.

4. ChDI-2-14 항체 단백의 정제

수립된 ChDI-2-14 의 항체 산생 안정 NS0 세포주를 무혈청 배지 (Hybridoma SFM, Invitrogen) 에 순화시킨 후, 무혈청 배지에서 배양한 배양액을 회수하여, Protein A 칼럼 (GE 헬스케어) 을 사용하여, 통상적인 방법에 따라 항체 정제를 실시하였다.

도 26 에, 마우스 DI-2-14 항체, 및 정제된 ChDI-2-14 항체를 SDS-PAGE 로 전개 후, CBB 염색한 도면을 나타내었다. 환원 조건하에서, 모두 약 50kD 의 H 사슬과 약 25kD 의 L 사슬이 검출되어, ChDI-2-14 항체 단백의 산생이 확인되었다.

5. 키메라 DI-2-14 항체 (ChDI-2-14) 의 항원 친화성

정제된 ChDI-2-14 단백의 항원 친화성을 ELISA 를 사용한 방법으로 검토하였다.

ELISA 는, 실시예 1 과 동일하게, 정제 리콤비넌트 hFA-1 단백 (0.5 ∼ 1μg/㎖) 을 고상화시킨 ELISA 플레이트를 사용하여 실시하였다. 구체적으로는, ELISA 플레이트를 세정 버퍼로 3 회 세정 후, 블로킹액에 의해 실온에서 1 시간 (또는 4℃ 에서 하룻밤) 블로킹을 실시하고, 세정 버퍼로 2 회 세정 후, ELISA 버퍼로 희석 계열을 제조한 마우스 DI-2-14 항체 및 ChDI-2-14 항체를 첨가하여 반응시켰다 (4℃, 하룻밤). 세정 버퍼로 3 회 세정한 후, 블로킹액으로 희석시킨 HRP 표지 항마우스 IgG (최종농도 1μg/㎖) 또는 HRP 표지 항인간 IgG (최종농도 1μg/㎖ ; 모두 GE 헬스케어 바이오 사이언스) 와 반응시켰다. 그 결과, 마우스 DI-2-14 및 ChDI-2-14 의 반응 곡선은 거의 겹쳐, EC50 는 모두 10ng/㎖ 이하였다 (도 27).

또, 생 세포의 세포 표면에 발현되고 있는 Dlk-1 단백에 대한 결합 활성을 HEK293-hDlk 세포를 사용한 플로사이트메트리로 해석한 결과, ELISA 의 결과와 동일하게, ChDI-2-14 는, 마우스 DI-2-14 와 동등한 항원 결합능을 보였다 (도 28).

이상의 결과로부터, 키메라 DI-2-14 항체 (ChDI-2-14) 는, 마우스 DI-2-14 항체와 거의 동등한 항원 친화성을 유지하고 있는 점에서, 제조된 키메라 DI-2-14 항체는, 마우스 DI-2-14 항체가 갖는 in vivo 에 있어서의 강한 항종양 활성을 유지하는 것이며, 세포 표면에 Dlk-1 을 발현시키는 암에 대해 유효한 치료용 항체, 혹은 진단용 또는 검출용 항체가 되는 것이 보였다.

6. 인간 간암, 유방암 및 백혈병 세포주에서의 세포 표면 Dlk-1 의 발현 (FACS)

Dlk-1 의 인간 암 세포에서의 발현을 더욱 상세하게 조사하기 위해서, 간암 세포주 (7 세포주), 유방암 세포주 (10 세포주) 및 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주 (7 세포주) 에 대해, 항인간 Dlk-1 항체를 사용한 플로사이트메트리에 의한 해석을 실시하였다.

사용한 세포주는, 이하에 열거하는 바와 같이, 휴먼 사이언스 진흥 사업단, ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 로부터 입수한 것을 사용하였다.

HL-60 (ATCC), NB-4 (DSMZ), MV-4-11 (ATCC), KG-1 (ATCC),

KG-1a (ATCC), TF-1 (ATCC), CMK-11-5 (휴먼 사이언스 진흥 사업단), HepG2 (휴먼 사이언스 진흥 사업단), C3A/HepG2 (ATCC), Huh-7 (휴먼 사이언스 진흥 사업단), OCUG-1 (휴먼 사이언스 진흥 사업단), HLE (휴먼 사이언스 진흥 사업단), HLF (휴먼 사이언스 진흥 사업단), SK-HEP-1 (ATCC), HCC1143 (ATCC), JIMT-1 (DSMZ), ZR-75-1 (ATCC), MDA-MB-415 (ATCC), BT549 (ATCC), BT-474 (ATCC), MDA-MB-231 (ATCC), DU4475 (ATCC), T47D (ATCC), MDA-MB-468 (ATCC)

간암 세포주에서는, 사용한 7 종류의 세포주 모두에 있어서, 세포 표면 Dlk-1 의 발현이 확인되었다 (도 29). 유방암 세포주에서는, 사용한 10 종류의 세포주 중, HCC1143 세포 및 JIMT-1 세포에서 강한 발현이 확인되고 (도 30), 그 밖의 8 종류의 세포주에 있어서도 약하면서도 세포 표면 Dlk-1 의 발현이 확인되었다 (도 30). AML 세포주에서는, 7 종류의 세포주 중, CMK-11-5 세포, TF-1 세포, MV-4-11 세포 및 NB-4 세포의 4 종류의 세포주에서 세포 표면 Dlk-1 의 발현이 확인되었다 (도 31).

〔실시예 3〕

DI-2-14 항체 (마우스 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체, 클론 DI-2-14) 의 in vivo 에 있어서의 혈관 신생 저해 효과

＜방법＞

(1) 면역 조직 염색

Huh-7-hdlk 세포의 담암 마우스에 있어서, 마우스 IgG 투여군 (컨트롤군 : 2 개체), DI-2-14 투여군의 마우스 (4 개체) 로부터, 각각 암 조직을 적출하여, O.C.T 콤파운드 (Tissue-Tek) 로 포매 후, 신선 동결 절편 (7μm) 을 제조하고, 2.5% 글루타르알데히드/PBS 로 15 분, 0.5% Triton X-100/PBS 로 3 분 실온에서 고정시켜, PBS 로 실온 5 분간 세정을 3 회 실시하였다. 다음으로, 메탄올에 종농도 0.3% 가 되도록 과산화수소수를 첨가한 용액에 의해, 실온에서 5 분간 처리하여 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 제거하였다. 이어서, PBS, 0.1% Tween/PBS, 0.02% Tween/PBS 의 순서로 각각 실온에서 5 분간씩 세정하고, M.O.M.^TM Immunodetection Kit (VECTOR) 의 프로토콜에 따라 M.O.M.^TM mouse Ig Blocking Reagent 에서 조직 중의 비특이적 결합 부위를 막는 블로킹 조작을 실시하여, PBS 로 실온 2 분간 세정을 2 회 실시하였다. M.O.M.^TM Diluent 에서 실온 5 분간 반응시켰다. 형성된 Huh-7-hdlk 세포 유래의 종양 내의 종양 혈관은, 마우스의 혈관 내피 세포에서 유래하기 때문에, 이어서, M.O.M.^TM mouse Ig Blocking Reagent 로 희석시킨 항마우스 Flk-1/VEGF-R2 항체 (종농도 2μg/㎖) 를 실온에서 30 분 반응시켜, PBS 로 실온 2 분간의 세정을 2 회 실시하고, 계속해서, M.O.M.^TM Diluent 에 의해 100 배로 희석시킨 비오틴화 항래트 IgG 항체를 실온에서 10 분 반응시켰다. PBS 에 의한 2 분간의 세정을 2 회 실시한 후에는, 11. 면역 조직 염색법에 따라 실시하였다.

(2) RT-PCR

본 실시예에서 말하는 RT-PCR 는, 추출 RNA 로부터의 cDNA 합성과, 그 cDNA 를 주형으로 하는 PCR 를 따로따로 실시한 반응을 의미한다.

Huh-7-hdlk 세포의 담암 마우스에 있어서, 마우스 IgG 투여군 (컨트롤군 : 7 개체), DI-2-14 투여군의 마우스 (7 개체) 로부터, 각각 암 조직을 적출하여, Trizol 시약 (Invitrogen) 으로 RNA 를 추출하였다. 이어서 1st strand cDNA synthesis kit (GE 헬스케어) 를 사용하여 그 kit 첨부의 프로토콜에 따라, 1st strand cDNA 를 합성하였다.

합성된 1st strand cDNA 를 주형으로 하여, 마우스 IgG 투여군 (컨트롤군 : 7 개체), DI-2-14 투여군의 마우스 (7 개체) 의 적출 암 조직에 대해, 종양 혈관 내피 세포 마커인 마우스 Flk-1/VEGF-R2 (Genbank accession No.X70842) 의 유전자 발현을 PCR 법에 의해 해석하였다.

PCR 프라이머는 하기의 것을 사용하였다 (PCR 증폭 산물은 336bp).

F 프라이머 : 5'-ctt-tac-tct-ccc-cag-tta-ca-3' (배열 번호 18)

R 프라이머 : 5'-ctt-tct-att-gtc-aag-gtg-ct-3' (배열 번호 19)

상기 프라이머를 사용한 PCR 은, 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 실시하였다.

≪반응액 조성≫

주형 DNA : 1μL

10×PCR 버퍼 : 5μL

2.5mM dNTP : 4μL

Taq DNA 폴리머라아제 : 0.5μL

F 프라이머 (10μM) : 1μL

R 프라이머 (10μM) : 1μL

멸균수 : 37.5μL

총 : 50μL

≪반응 조건≫

95℃ (3 분간) 의 변성 후에, 「열 변성·해리 : 95℃ (60sec)→어닐링 : 55℃ (60sec)→합성·신장 : 72℃ (60sec)」 를 1 사이클로 하여, 총 35 사이클의 반응과 총 35 사이클.

또한, 내부 컨트롤로는 GAPDH (인간 GAPDH : NM_002046；마우스 GAPDH : NM_008084, NM_001001303, XM_001003314, XM_988853, XM_990238) 을 사용하였다. GAPDH 를 증폭하는 PCR 프라이머는 하기의 것을 사용하였다 (PCR 증폭 산물은 452bp). 이들 프라이머는, 인간 GAPDH 및 마우스 GAPDH 중 어느 하나를 주형으로 한 경우에도 증폭 가능한 것이다.

또한, PCR 의 반응액 조성 및 반응 조건은, 상기 서술한 Flk-1/VEGF-R2 를 증폭시키는 경우와 동일하게 하였다.

PCR 산물의 정량은, 먼저, 1.2% 아가로오스 겔 전기 영동으로 전개한 후, 에티듐브로마이드로 염색하였다. 이어서, 촬영한 전기 영동 이미지를 스캐너로 도입하여, NIH Image 로 PCR 산물의 정량을 실시하여, Flk-1/GAPDH 의 Ratio 로 그래프를 작성하였다.

＜결과＞

도 32 에 나타내는 바와 같이, IgG 투여군 (20mg/kg 체중 ; 2 개체) 과 DI-2-14 투여군 (20mg/kg 체중 ; 4 개체) 에 대해, 각각 8 ∼ 13 시야 (대물×200) 에 대해, 헤마톡실린에 의한 핵 염색으로 핵이 확인되고, 또한 Flk-1/VEGF-R2 양성인 종양 혈관 내피 세포 수를 카운트하여 (IgG 투여군 : 전체 25 시야, DI-2-14 투여군 : 전체 35 시야), 1 시야 당의 종양 혈관 세포 수를 계측한 결과, IgG 투여군에서는 112.0±63.6 (Flk-1 양성 세포 수/시야) 인 것에 대해, DI-2-14 투여군에서는 36.3±2.2 (Flk-1 양성 세포 수/시야) 로, 유의하게 종양 혈관 세포 수가 적었기 때문에 (P < 0.01), DI-2-14 투여에 의해 종양 혈관 신생이 저해된 것이 보였다.

또, 다른 실험에 있어서, 동일하게 Huh-7-hDlk-1 세포의 담암 마우스에서, IgG 투여군 (20mg/kg 체중, N=7) 및 DI-2-14 투여군 (20mg/kg 체중, N=7) 의 마우스로부터, 각각 형성된 종양에 있어서의 종양 혈관 내피 세포의 특이적 마커 유전자인 Flk-1/VEGF-R2 의 유전자 발현을 RT-PCR 에 의해 반 정량적으로 해석한 결과, 도 33 에 나타내는 바와 같이, DI-2-14 투여군의 종양에서는 Flk-1/VEGF-R2 의 유전자 발현이 저하되었고, 이 결과는 DI-2-14 투여에 의해 종양 혈관 신생이 저해된 것이 보였다.

＜고찰＞

암 형성에 있어서, 종양 혈관의 신생은 필수적인 것이 알려져 있고, 종양 혈관 신생 저해를 주된 작용 기전으로 하고 있는 암 치료 항체로서 항VEGF 항체 (아바스틴) 가 알려져 있다. 지금까지, Dlk-1 및 항Dlk-1 항체에 관해서, 혈관 신생이나 혈관 신생 저해 활성에 대해 나타난 공지 정보는 없었다. 또 Dlk-1 의 기능에 관해서는, 지금까지, 지방 세포의 분화 제어나 Dlk-1 유전자의 안정적 도입에 의한 글리오마 세포나 백혈병 세포에서의 증식 항진에 대한 보고는 있지만, 선행 공지 정보에 기초하여 항Dlk-1 항체 (DI-2-14) 가 종양 혈관 신생 저해 활성을 갖는 것은 예견 불가능하였다. 본 실시예에 의해, DI-2-14 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성의 적어도 1 개의 작용 기전이 보였다.

본 발명에 의하면, 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체, 특히 in vivo 에 있어서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체를 제공할 수 있다. 또한 본 발명은, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 각종 약제의 복합체, 종양 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공할 수 있다.

배열표 프리텍스트

배열 번호 3 : 합성 DNA

배열 번호 4 : 합성 DNA

배열 번호 5 : 합성 DNA

배열 번호 6 : 합성 DNA

배열 번호 7 : 합성 DNA

배열 번호 8 : 합성 DNA

배열 번호 9 : 합성 DNA

배열 번호 10 : 합성 DNA

배열 번호 11 : 합성 DNA

배열 번호 12 : 합성 DNA

배열 번호 13 : 합성 DNA

배열 번호 14 : 합성 DNA

배열 번호 15 : 합성 DNA

배열 번호 16 : 합성 DNA

배열 번호 17 : 합성 DNA

배열 번호 18 : 합성 DNA

배열 번호 19 : 합성 DNA

배열 번호 20 : 합성 DNA

배열 번호 21 : 합성 DNA

배열 번호 26 : 재조합 DNA

배열 번호 27 : 합성 콘스트럭트 (재조합 단백질)

배열 번호 28 : 재조합 DNA

배열 번호 29 : 합성 콘스트럭트 (재조합 단백질)

SEQUENCE LISTING <110> LivTech, Inc. <120> anti-hDlk-1 antibody <130> PCT07-0041 <150> JP 2006-305355 <151> 2006-11-10 <160> 35 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (154)..(1305) <400> 1 gagagcgcag cgcgcagccc ggtgcagccc tggctttccc ctcgctgcgc gcccgcgccc 60 cctttcgcgt ccgcaaccag aagcccagtg cggcgccagg agccggaccc gcgcccgcac 120 cgctcccggg accgcgaccc cggccgccca gag atg acc gcg acc gaa gcc ctc 174 Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu 1 5 ctg cgc gtc ctc ttg ctc ctg ctg gct ttc ggc cac agc acc tat ggg 222 Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly 10 15 20 gct gaa tgc ttc ccg gcc tgc aac ccc caa aat gga ttc tgc gag gat 270 Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp 25 30 35 gac aat gtt tgc agg tgc cag cct ggc tgg cag ggt ccc ctt tgt gac 318 Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp 40 45 50 55 cag tgc gtg acc tct ccc ggc tgc ctt cac gga ctc tgt gga gaa ccc 366 Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu His Gly Leu Cys Gly Glu Pro 60 65 70 ggg cag tgc att tgc acc gac ggc tgg gac ggg gag ctc tgt gat aga 414 Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg 75 80 85 gat gtt cgg gcc tgc tcc tcg gcc ccc tgt gcc aac aac ggg acc tgc 462 Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys 90 95 100 gtg agc ctg gac gat ggc ctc tat gaa tgc tcc tgt gcc ccc ggg tac 510 Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr 105 110 115 tcg gga aag gac tgc cag aaa aag gac ggg ccc tgt gtg atc aac ggc 558 Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly 120 125 130 135 tcc ccc tgc cag cac gga ggc acc tgc gtg gat gat gag ggc cgg gcc 606 Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala 140 145 150 tcc cat gcc tcc tgc ctg tgc ccc cct ggc ttc tca ggc aat ttc tgc 654 Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys 155 160 165 gag atc gtg gcc aac agc tgc acc ccc aac cca tgc gag aac gac ggc 702 Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly 170 175 180 gtc tgc act gac att ggg ggc gac ttc cgc tgc cgg tgc cca gcc ggc 750 Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly 185 190 195 ttc atc gac aag acc tgc agc cgc ccg gtg acc aac tgc gcc agc agc 798 Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser 200 205 210 215 ccg tgc cag aac ggg ggc acc tgc ctg cag cac acc cag gtg agc tac 846 Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Gln His Thr Gln Val Ser Tyr 220 225 230 gag tgt ctg tgc aag ccc gag ttc aca ggt ctc acc tgt gtc aag aag 894 Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys 235 240 245 cgc gcg ctg agc ccc cag cag gtc acc cgt ctg ccc agc ggc tat ggg 942 Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly 250 255 260 ctg gcc tac cgc ctg acc cct ggg gtg cac gag ctg ccg gtg cag cag 990 Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val His Glu Leu Pro Val Gln Gln 265 270 275 ccg gag cac cgc atc ctg aag gtg tcc atg aaa gag ctc aac aag aaa 1038 Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys 280 285 290 295 acc cct ctc ctc acc gag ggc cag gcc atc tgc ttc acc atc ctg ggc 1086 Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly 300 305 310 gtg ctc acc agc ctg gtg gtg ctg ggc act gtg ggt atc gtc ttc ctc 1134 Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly Thr Val Gly Ile Val Phe Leu 315 320 325 aac aag tgc gag acc tgg gtg tcc aac ctg cgc tac aac cac atg ctg 1182 Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn Leu Arg Tyr Asn His Met Leu 330 335 340 cgg aag aag aag aac ctg ctg ctt cag tac aac agc ggg gag gac ctg 1230 Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu 345 350 355 gcc gtc aac atc atc ttc ccc gag aag atc gac atg acc acc ttc agc 1278 Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser 360 365 370 375 aag gag gcc ggc gac gag gag atc taa gcagcgttcc cacagccccc 1325 Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile 380 tctagattct tggagttccg cagagcttac tatacgcggt ctgtcctaat ctttgtggtg 1385 ttcgctatct cttgtgtcaa atctggtgaa cgctacgctt acatatattg tctttgtgct 1445 gctgtgtgac aaacgcaatg caaaaacaat cctctttctc tctcttaatg catgatacag 1505 aataataata agaatttcat ctttaaa 1532 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro 20 25 30 Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly 35 40 45 Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu 50 55 60 His Gly Leu Cys Gly Glu Pro Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp 65 70 75 80 Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro 85 90 95 Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu 100 105 110 Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp 115 120 125 Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro 165 170 175 Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe 180 185 190 Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro 195 200 205 Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu 210 215 220 Gln His Thr Gln Val Ser Tyr Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr 225 230 235 240 Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr 245 250 255 Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val 260 265 270 His Glu Leu Pro Val Gln Gln Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser 275 280 285 Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala 290 295 300 Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly 305 310 315 320 Thr Val Gly Ile Val Phe Leu Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn 325 330 335 Leu Arg Tyr Asn His Met Leu Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln 340 345 350 Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys 355 360 365 Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser Lys Glu Ala Gly 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aaaggacggg ccctgtg 27 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 12 gcgtatagta agctctgcgg 20 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 13 caggcagcgg ccgcgagatc gtggccaac 29 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 14 gcgtatagta agctctgcgg 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 15 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 16 gccagtggat agacagatgg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 17 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 18 ctttactctc cccagttaca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 19 ctttctattg tcaaggtgct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 20 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 21 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 22 <211> 411 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <400> 22 atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag 96 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 aga gac acc tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gag cag ggc ctg 192 Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt aaa tat gac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp 65 70 75 80 ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 aca gcc tac ctg cag ttc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac tgg ggc caa 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc 411 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 23 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 130 135 <210> 24 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 24 atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg atc cct 48 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 gga gcc att ggg gat att gtg atg act cag gct gca ccc tct gta cct 96 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 gtc act cct gga gag tca gta tcc atc tcc tgc agg tct agt aag agt 144 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc ctg cag agg 192 Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 cca ggc cag tct cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gcc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 tca gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac 336 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgt atg caa cat gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag 384 Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 115 120 125 ttg gaa ata aaa 396 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 25 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 26 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (13)..(420) <400> 26 actagtacca cc atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg 51 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val 1 5 10 gtt aca ggg gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag 99 Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu 15 20 25 ctt gtg aag cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc 147 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 30 35 40 45 ttc aac att aga gac acc tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gag 195 Phe Asn Ile Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu 50 55 60 cag ggc ctg gag tgg att gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt 243 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu 65 70 75 aaa tat gac ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca 291 Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr 80 85 90 tcc tcc aac aca gcc tac ctg cag ttc agc agc ctg aca tct gag gac 339 Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 95 100 105 act gcc gtc tat tac tgt gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac 387 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr 110 115 120 125 tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca ggtgagtcct aacttcaagc 440 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 tt 442 <210> 27 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 27 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 28 <211> 431 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (13)..(420) <400> 28 gctagcacca cc atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc 51 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu 1 5 10 tgg atc cct gga gcc att ggg gat att gtg atg act cag gct gca ccc 99 Trp Ile Pro Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro 15 20 25 tct gta cct gtc act cct gga gag tca gta tcc atc tcc tgc agg tct 147 Ser Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser 30 35 40 45 agt aag agt ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc 195 Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe 50 55 60 ctg cag agg cca ggc cag tct cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc 243 Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser 65 70 75 aac ctt gcc tca gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga 291 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 80 85 90 act gct ttc aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt 339 Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 95 100 105 gtt tat tac tgt atg caa cat gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc tcg 387 Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser 110 115 120 125 ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt aag tag act tttgcgaatt c 431 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Thr 130 135 <210> 29 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 29 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Lys 130 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Asp Thr Tyr Ile His 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5

Claims

in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 인간 Dlk-1 에 대한 항체로서, 상기 항체의 H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열이고, 또한,

항체의 L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이 각각 순서대로 배열 번호 33 ∼ 35 로 나타내는 아미노산 배열인 항체.
제 1 항에 있어서,

항종양 활성이 종양 혈관 신생 저해 활성인 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

항체가 모노클로날 항체인 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항체.
삭제
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

항체가 유전자 재조합 항체인 항체.
제 7 항에 있어서,

유전자 재조합 항체가 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체인 항체.
제 8 항에 있어서,

키메라 항체는, H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이, 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열, 또는 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열의 제20번째 ~ 제137번째 아미노산으로 이루어지는 아미노산배열을 포함하는 것이고,

L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이, 배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열, 또는 배열번호 25 로 나타내는 아미노산 배열의 제21번째~제132번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산배열을 포함하는 것인 항체.
삭제
수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체.
삭제
삭제
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제 1 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 30 ∼ 32 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 33 ∼ 35 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
삭제
제 15 항에 있어서,

배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열, 또는 배열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 배열의 제20번째 ~ 제137번째 아미노산으로 이루어지는 아미노산배열을 포함하는 것인 항체 단편.
삭제
제 15 항에 있어서,

배열 번호 25 로 나타내는 아미노산 배열, 또는 배열번호 25 로 나타내는 아미노산 배열의 제21번째~제132번째의 아미노산으로 이루어지는 아미노산배열을 포함하는 것인 항체 단편.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 항체를 산생하는 하이브리도마.
삭제
수탁 번호가 FERM BP-10899 인, 인간 Dlk-1 에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.
삭제
제 1 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 함유하는 항체-약제 복합체.
제 15 항에 기재된 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 함유하는 항체 단편-약제 복합체.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,

항종양 활성이 종양 혈관 신생 저해 활성인 복합체.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 복합체.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료용 의약 조성물.
삭제
제 28 항에 있어서,

종양 치료가 종양 혈관 신생을 저해하는 것인 조성물.
제 28 항에 있어서,

체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 조성물.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 종양 진단용 의약 조성물.
제 28 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 조성물.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.
제 34 항에 있어서,

체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 치료제.
제 34 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 치료제.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 혈관 신생 저해제.
제 37 항에 있어서,

체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 저해제.
제 37 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 저해제.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 진단제.
제 40 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 진단제.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시켜, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 종양의 검출 방법.
제 42 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
제 1 항에 기재된 항체, 제 15 항에 기재된 항체 단편, 제 24 항에 기재된 복합체, 및 제 25 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
제 44 항에 있어서,

종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 키트.