KR100982170B1

KR100982170B1 - ＤＬＫ１―Ｆｃ 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물

Info

Publication number: KR100982170B1
Application number: KR1020100023180A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 조기원; 이동희; 유정; 박지현; 박찬웅; 김은진; 박윤정
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2010-09-15
Also published as: MX342222B; CN102341408A; JP2012513775A; WO2011115323A1; EP2548887A1; AU2010348423B2; EP2548887B1; BR112012023416A2; MX2012010560A; US20130202592A1; CA2792413A1; AU2010348423A1; RU2012143943A; CA2792413C; RU2531756C2; US8785392B2; CN102341408B; JP5367905B2; EP2548887A4

Abstract

본 발명은 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인 유전자에 IgG 항체의 Fc 도메인의 유전자를 합친 재조합 발현 벡터를 구축하고 293E 세포에서 DLK1-Fc 융합 단백질을 발현하고 정제하여, DLK1-Fc 융합 단백질에 의한 암세포의 현저한 이동(mitgration) 감소 및 약물 속도론적 파라메타 계산을 통한 실제 암 전이 억제 개념의 약으로서의 효율성을 확인한 것으로, DLK1-Fc 융합 단백질은 비 융합 단백질에 비해 높은 안정성을 가지고, 다양한 암세포주에서 그 이동(migration)을 현저히 감소시키며 적은 농도에서도 암 전이 억제 효과가 뛰어나므로, 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＤＬＫ１―Ｆｃ 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물{Composition for the Anti―Cancer metastasis containing ＤＬＫ１―Ｆｃ fusion protein as an effective ingredient}

본 발명은 암 전이 억제능을 갖는 ＤＬＫ１―Ｆｃ 융합 단백질을 함유하는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 생명에 위험을 주는 주된 질병이다. 한국에서는 지난 몇 년간 사망원인 1위가 암이며, 미국에서 암은 심장혈관질환에 이어 죽음의 두 번째 주원인이다. 많은 연구가 수행되었고 지금도 수행되고 있지만 현재에도 암은 여전히 인류의 가장 큰 재앙이며 매년 수백만 명의 생명과 천문학적인 경제적 손실을 주는 치명적인 병이다.

암은 특히 발암유전자(oncogene) 및 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)와 같은 유전자에 변이(mutaion)가 일어나서 발생하는 유전적 질환이며, 세포 차원에 원인이 있는 질환이다. 현재 암의 치료법으로는 외과적 수술요법, 약물요법, 방사선 요법 및 면역요법 등이 이용되고 있으나, 악성 종양의 억제 및 재발은 여전히 해결되지 않고 있다.

암의 가장 중요한 생물학적 특성의 하나는 전이를 일으킬 수 있다는 것이며, 이는 암을 치료하는데 가장 큰 장애물로 여겨지고 있다. 실제로 모든 고형 종양 환자의 약 60%는 이미 원발종양 진단시 미세하게나마 임상적으로 전이된 암을 가지고 있으며, 대부분의 암환자들의 중요한 사망 원인이 암 전이임은 이미 잘 알려져 있다.

전이가 일어나는 과정 가운데 암의 국소조직의 침윤과 동반되어 나타나는 현상이 신생혈관형성인데, 여기에는 종양맥관형성인자 등이 관여하며, 종양에 의해 새로 생겨난 혈관들은 결함이 많기 때문에 암세포들에 의해 쉽게 침범된다. 또한, 암의 침습 및 전이 과정에는 조직의 기질 및 기저막에 유착하는데 필요한 라미닌 수용체와 같은 수많은 암세포 표면의 수용체들, 제 IV형 콜라게나제(collagenase), 플라스미노겐(plasminogene) 활성 인자 및 카텝신 D 등과 같은 정상조직의 간질을 용해시키는데 필요한 수많은 효소들, 성장인자, 자분비 운동인자(autocrine motility factor) 및 암 유전자 등의 발현이 필요하다.

현재까지 이러한 암 전이 억제 작용을 가지는 물질의 개발에 대한 기대는 매우 크지만, 실제로 암 전이 억제를 목적으로 한 물질의 개발예는 극히 적다. 황산화 다당류, N-디아조아세틸글리신 유도체, 노이라미니타제 및 피브로넥틴 분해효소(FNS) 등이 이러한 억제 작용을 갖는다고 보고되어 있지만 아직 그 실용화의 보고는 없으며 그들 자체가 암 전이 억제 효과를 갖는다는 보고도 없다. 따라서, 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다.

한편, 노취/델타/서레이트계(notch/delta/serrate family)에 속하는 DLK1(delta-like 1 homolog)은 염색체 14q32에 위치하는 dlk1 유전자에 암호화되어 있는 막통과(transmembrane) 당단백질로 383개의 아미노산으로 구성되어 있다. 상기 단백질은 280개의 세포 외 지역과 24개의 막 통과 지역, 56개의 세포 내 지역으로 나뉘며, 이중 세포막 바깥 부분에 6개의 상피세포 성장 인자 유사 반복(epidermal growth factor like repeat) 도메인을 가지고 있으며, 3개의 N-당화(glycosylation)와 7개의 O-당화 위치를 가지고 있다. DLK1은 막단백질이기도 하지만, 종양괴사인자 알파 전환 효소(Tumor necrosis factor alpha converting enzyme; TACE)에 의해 세포막 바깥 부분이 세포막에서 떨어져 나와(shedding), 따로 기능을 가지기도 하는 단백질로 잘 알려져 있다(Yuhui Wang and Hei Sook Sul, Molecular and cellular biology . 26(14): 5421-5435, 2006).

DLK1은 세포막에서 당화에 의해 50 ~ 60 kDa의 다양한 형태로 발견되고 있으며(Smas CMCM and Sul HS, Cell. 73:725-34, 1993), 선택적 유전자 접합(alternative splicing)에 의해 4가지 접합 변이체(splicing variant)를 가진다(Smas CM et al., Biochemistry. 33:9257-65, 1994). 이 중 큰 2가지의 변이체가 단백질 분해효소 절단 부위를 가지며, 단백질 분해 효소인 TACE에 의해 절단되어, 50 kDa 크기와 25 kDa 크기의 2가지 수용성 형태가 생성이 된다(Yuhui Wang et al., Journal of Nutrition . 136:2953-2956, 2006) (도 1 참조).

DLK1은 발생 단계에서 주로 발현이 되며 발현이 되는 조직은 배아 조직(Smas CM et al., Cell . 73:725-34, 1993; Kaneta M et al ., Journal of Immunology . 164:256-64, 2000) 및 태반(placenta)이고, 특히 모자의 혈청(maternal serum)에서 고농도로 검출되고 있어 태아 항원 1(fetal antigen 1; FA1)으로도 알려져 있다(Jensen CH et al ., European Journal of Biochemistry. 225:83-92, 1994). 또한 췌장의 성세포(glandular cell)(Kaneta M et al ., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000), 난소 세포(ovary), 골격 근섬유(skeletal myotubes)(Floridon C et al ., Differentiation. 66:49-59, 2000)등에서의 발현도 보고되어 있다. DLK1은 출생 이후 대부분의 조직에서 발현이 없어지고 지방 분화 전 세포(preadipocyte)(Smas CM et al ., Cell. 73:725-34, 1993), 췌장 섬 세포(pancreatic islet cell)(Carlsson C et al ., Endocrinology. 138:3940-8, 1997) 흉선 체세포(thymic stromal cell)(Kaneta M et al ., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000), 부신 세포(adrenal gland cell)(Halder SK et al., Endocrinology. 139:3316-28, 1998)등의 특정 세포에서만 발현이 된다. DLK1의 발현은 메칠화에 의한 영향으로 부계의 염색체에서만 발현(paternal monoallelic expression)이 되는 것으로 알려져 있다(Schmidt JV et al ., Genes and Development. 14:1997-2002, 2000; Takada S et al ., Current Biology 10:1135-8, 2000; Wylic AA et al , Genome Research. 10:1711-8, 2000).

DLK1의 기능연구는 지방세포분화를 억제하는 인자 Pref-1(preadipocyte factor-1)으로 알려져 가장 많은 연구가 되어져 있다(Smas CM et al ., Cell. 73:725-34; Villena JA et al ., Hormone and Metabolic Research. 34:664-70, 2002). 지방세포 분화 억제능력을 제외하고도 DLK1은 혈액 생성 줄기 세포 (hematopoietic stem cells)의 분화를 억제하고(Sakajiri S et al ., Leukemia. 19:1404-10, 2005; Li L et al ., Oncogene. 24:4472-6, 2005), 임파선 전구세포(lymphoid progenitor cell)의 분화를 조절(Bauer SR et al ., Molecular and Cellular Biology. 18:5247-55, 1998; Kaneta M et al ., Journal of Immunology. 164:256-64, 2000)하는 역할 및 상처 치유(wound healing)에 관계(Samulewicz SJ et al ., Wound Repair and Regeneration. 10:215-21, 2002)된 것으로도 알려져 있다. 하지만 암세포에서의 역할은 아직 연구가 많이 진행되지 않은 상황이다.

DLK1과 소수의 암과 관련된 연구 중에 최근 뇌암세포(glioma)에서 DLK1의 발현이 과발현되어 있으며, DLK1의 cDNA를 뇌암세포에 과발현시키면 뇌암세포의 증식(proliferation)이 증가하여 전이(migration)가 증가한다는 보고가 있었으며(Yin D et al ., Oncogene. 25:1852-61, 2006), 간암에서 DLK1의 발현이 정상 간세포에 비해 올라가 있으며, siRNA 실험을 통하여 DLK1의 발현을 감소시켰을 때 종양의 크기가 감소한다는 보고가 있었다(Huang J et al ., Carcinogenesis . 28(5):1094-1103, 2007). 하지만, DLK1과 암과의 관계는 최근 DLK1의 세포 내 도메인(cytoplasmic domain)이 종양형성능에 중요한 역할을 수행하는(Yuri K et al ., Cancer Research. 69(24):OF1-10, 2009) 것으로 보고가 되었고, 종양괴사인자 알파 전환 효소(Tumor necrosis factor alpha converting enzyme; TACE)에 의해 세포막에서 떨어져 나온(shedding) 세포막 바깥 부분인 수용성 DLK1에 대한 연구는 현재까지 지방세포의 분화 억제 기능에 초점이 맞추어져 있다. 특히 DLK1의 세포막 바깥의 수용성 도메인과 암의 관계에 대한 연구는 전무한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인 유전자에 IgG 항체의 Fc 도메인의 유전자를 합친 재조합 발현 벡터를 구축하고 293E 세포에서 DLK1-Fc 융합 단백질을 발현하고 정제하여, DLK1-Fc 융합 단백질에 의한 암세포의 현저한 이동(migration) 감소 및 약물 속도론적 파라메타 계산을 통한 실제 암 전이 억제 개념의 약으로서의 효율성을 확인함으로써, DLK1-Fc 융합 단백질을 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 상용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DLK1-Fc 융합 단백질, 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DLK1(delta-like 1 homolog)의 세포외 영역의 수용성 도메인을 제공한다.

또한, DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 및 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 상기 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인, 및 인간 항체 Fc 영역이 접합된 DLK1-Fc 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DLK1-Fc 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 재조합 세포주를 배양하는 단계; 및

2) 세포주 배양액으로부터 DLK1-Fc 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 DLK1-FC 융합 단백질 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조된 DLK1 세포외 영역의 수용성 도메인 또는 DLK1-Fc 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 DLK1-Fc 융합 단백질은 비 융합 단백질에 비해 높은 안정성을 가지고, 다양한 암세포주에서 그 이동(migration)을 현저히 감소시키며 적은 농도에서도 암 전이 억제 효과가 뛰어나므로, 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 DLK1 단백질의 구조를 나타내는 그림이다.
S: 시그날 펩타이드, 1 ~ 6 : 상피세포 성장 인자 유사 반복 도메인, JM : 막근접 도메인, Tm : 막통과 도메인, Cy : 세포내 도메인
도 2는 암환자 조직에서의 DLK1 유전자의 발현율을 나타내는 그림이다.
도 3은 암세포에서의 DLK1 유전자의 발현율을 나타내는 그림이다.
도 4는 DLK1-Fc 융합 단백질 발현을 위한 발현 벡터 구축에 사용된 프라이머 서열을 나타내는 그림이다.
도 5는 DLK1-Fc 융합 단백질 발현을 위한 발현벡터 pYK602-His-DLK1 벡터의 구조를 나타낸 그림이다.
도 6은 클로닝 된 DLK1의 핵산 염기 서열을 나타내는 그림이다.
도 7은 클로닝 된 DLK1의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 8은 293E 세포에서 DLK1-Fc 융합 단백질 발현을 유도하고 세포 배양 배지를 회수하고, 회수한 배지에서 DLK1-Fc 융합 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 정제된 DLK1-Fc 융합 단백질을 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤의 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 대장암 세포주 SW620와 피부암 흑색종 세포주 MDA-MB-435에서의 DLK1-Fc 융합 단백질을 포함한 세포 배양액의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 11은 피부암 흑색종 세포주 MDA-MB-435에서의 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인 및 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
sDLK1, sDLK1-Fc, Fc는 10 ug/ml을 사용함.
도 12는 유방암 세포주 Hs578T와 MCF-7에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 13은 자궁암 세포주 HeLa에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 14는 대장암 세포주 SW480 및 HT29에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 15는 신장암 세포주 786-O 및 UO-31에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 16은 간암 세포주 HepG2, SNU398 및 SNU449에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 17은 폐암 세포주 A549, NCIH23 및 NCIH460에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 18은 난소암 세포주 MDAH2774 및 IGROV-1에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 19는 췌장암 세포주 Aspec-1, HPAC 및 MIA paca-2 에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 20은 위암 세포주 SNU638 및 AGS에서의 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 21은 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 이동 저해 효과의 확인을 위한 실험시 사용된 각각의 세포주의 세포수, 화학 유인 물질 구성, 배양 시간을 나타낸 그림이다.
도 22는 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질의 약물 속도론적 실험 결과를 나타낸 그림이다.
도 23은 sDLK1의 약물 속도론적 파라메타를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 DLK1(delta-like 1 homolog)의 세포외 영역의 수용성 도메인, DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 및 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

상기 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 수용성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 유전자 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인 및 인간 IgG Fc 영역이 접합된 DLK1-Fc 융합 단백질을 제공한다.

용어 "DLK1-Fc 융합 단백질"은 항체의 중쇄(heavy chain) 의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 재조합 분자를 의미한다. Fc 융합 단백질은 다섯 개의 Ig 부류(예: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 중 임의의 것으로부터의 항체의 Fc 도메인, 즉 CH2와 CH3 불변 도메인(constant domain) 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, DLK1-Fc 융합 단백질은 DLK1의 세포외 수용성 도메인의 카복시- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 형태로 만들어질 수 있다. 다른 예로, Fc 융합 단백질은 2개 이상의 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인 영역을 가지는 형태를 또한 포함할 수 있으며, 여기서 두 개의 중쇄 Fc는 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결될 수 있다. 또 다른 예로, DLK1-Fc 융합 단백질의 DLK1 부분은 2개 이상의 DLK1의 세포외 수용성 도메인의 영역을 가지는 형태를 또한 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DLK1-Fc 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 재조합 세포주를 배양하는 단계; 및

상기 유전자를 포함하는 발현벡터는 pYK602-His 벡터인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 포유동물의 발현 프로모터, Fc 도메인을 포함한 벡터는 모두 사용가능하다.

상기 포유동물 세포는 293E 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 프로모터가 작동할 수 있는 포유동물 세포주는 모두 사용이 가능하다.

본 발명자들의 선행연구에서 마이크로 어레이 결과에 의하면 암환자에서 DLK1의 발현(도 2 참조)이 이전 선행문헌과 달리 오히려 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 이러한 현상은 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreas cancer) 및 난소암(ovarian cancer) 조직에서 두드러짐을 확인하였다(도 2 참조). 또한 67개의 암세포주에서의 발현양 조사에서도 소수의 세포주를 제외하고는 매우 낮은 발현을 확인하였다(도 3 참조). 상기 발현 양상 패턴을 통하여 DLK1이 암 발생 유전자(oncogene)의 특성 이외에도 암 억제 유전자(Tumor suppressor gene)로의 역할의 가능성도 추측해 볼 수 있었으며, 특히 종양괴사인자 알파 전환 효소(Tumor necrosis factor alpha converting enzyme; TACE)에 의해 세포막 바깥 부분이 세포막에서 떨어져 나와(shedding) 자기 세포에 영향(autocrine effect)을 줄 뿐만 아니라, 주위의 다른 세포에도 영향(paracrine effect)를 줄 수 있는 수용성 도메인만을 이용하여 연구를 진행하였다.

수용성 Fc 융합 단백질은 세포 외의 실험 (in vitro experiment) 및 세포 내 실험(in vivo experiment)에서 널리 이용되고 있으며 특히 동물 실험 등에서 비 융합 단백질에 비해 높은 안정성을 가지는 등 많은 장점을 가지고 있다(Meg L et al., Methods in Molecular Biology 378:33-52, 2007). 또한 인간항체 제제의 생산에서 항원 특이성은 유지하면서도 많은 면역학적인 문제를 배제할 수 있는 장점을 가지고 있어 현재 널리 이용되고 있는 방법이다. 대표적인 수용성 Fc 융합 인간항체 제제로는 암젠(Amgen)의 관절염 치료제인 Etanercept를 들 수 있으며 이는 TNF 수용체 2 (TNF receptor 2)의 수용성 도메인에 인간 IgG1의 Fc을 융합하여 만든 제제이다(U.S. Patent number: 5447851).

본 발명의 구체적인 실시예에서, pYK602-His 벡터에 DLK1을 클로닝하기 위하여, 서열번호 2 및 3으로 기재되는 프라이머를 이용하여 디엔에이 라이브러리 믹스(신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 DLK1 단백질의 세포외 영역의 수용성 도메인만을 증폭하였고, 이를 통해 얻어진 중합효소 연쇄 반응 결과물은 SfiI으로 제한효소 반응을 수행한 후, pYK602-His 벡터에 넣어 pYK602-His-DLK1 재조합 벡터를 구축하였다(도 4 및 5 참조).

이후, pYK602-His-DLK1 DNA를 293E 세포에 형질전환하고 배지를 회수하여 웨스턴 블랏 방법으로 DLK1-Fc 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 8 참조). 발현이 확인된 배지는 프로테인 A 컬럼을 이용하여 정제를 수행하였고, 정제된 DLK1-Fc 단백질은 pH를 중화시켜 준 후, PBS(Photassium phosphate saline) 버퍼를 이용하여 투석을 수행한 후, BCA 분석을 통하여 정량을 수행하고 SDS-PAGE를 수행하여 정제와 정량의 여부를 확인하였다(도 9 참조). 이후 정제된 DLK1-Fc 융합 단백질을 EndoTrap Red 컬럼을 이용하여 박테리아 내독소를 제거하였고, 이를 통하여 DLK1-Fc 융합 단백질을 제조하였다.

또한, 본 발명은 상기 제조된 DLK1 세포외 영역의 수용성 도메인, 또는 DLK1-Fc 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 유방암, 자궁암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 위암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 제조된 DLK1-Fc 융합 단백질의 암세포주에 미치는 영향을 알아보기 위하여 참고문헌(Chen HC, Methods in molecular biology . 294:15-22, 2005)의 방법을 사용하여 암세포주의 이동 분석(migration assay)을 실시하였고, 정제된 DLK1-Fc 융합 단백질을 이용하여 다양한 암세포주의 전이에 미치는 영향을 조사한 결과 유방암(도 12 참조), 자궁암(도 13 참조), 대장암(도 14 참조), 신장암(도 15 참조), 간암(도 16 참조), 폐암(도 17 참조), 난소암(도 18 참조), 췌장암(도 19 참조) 및 위암(도 20 참조)의 암종의 전이를 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다.

또한, 상기 제조된 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인만을 발현 및 정제한 후 세포주에 처리하여 비교해 본 결과, 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질과 같이 암세포주의 이동을 현저히 감소시킴을 확인하였다(도 11 참조).

또한 실제로 암 전이 억제 개념의 약으로서의 효율성을 검증하기 위하여 약물 속도론적 파라메타들을 결정하는 실험을 마우스에서 수행하였고, 실험 결과 5 mg/kg(실제 마우스의 무게를 고려하면 100 ug/마우스)로 접종하여 마우스의 총 혈액이 대략 2 ml인 것을 고려하면 정맥 주사로 놓았을 시 가장 최고 농도로 산정할 수 있는 농도는 50 ug/ml로써 복강 접종을 통해 나타난 실험 결과의 Cmax값이 38.96 ug/ml이 나온 것은 상당히 높은 값이라고 할 수 있으며 접종 후 4시간 (Tmax 값)이면 최고 농도를 나타내는 것을 알 수 있었다. 그리고 생체 내에서 얼마나 안정적인지를 알아보는 반감기 값이 약 20시간으로 나타나 생체 내에서 상당히 안정적인 것을 확인할 수 있었다. 그리고 암 전이 억제력을 나타내는 농도가 10 ug/ml에서도 탁월한 효과를 보이는 것을 확인하였으므로 48 시간 후에 약 10 ug/ml의 농도를 유지하고 있는 결과를 비추어 보아 암 전이 억제용 단백질 신약으로써 충분한 안전성 및 효율성을 보여 주고 있음을 알 수 있다.

이에, 상기 제조된 DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인, 또는 DLK1-Fc 융합 단백질은 이를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 암 전이 억제용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 단백질의 투여량은 성인 남성을 60 kg으로 가정하였을 때(미국 FDA 기준) 0.738 ug ~ 7.38 g이며, 바람직하게는 7.38 ug ~ 0.738 g (12.3 mpk)이며, 이틀에 한번 투여하는 것이 바람직하나 투여 방법은 환자 필요에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> pYK602 - His - DLK1 발현벡터의 제조

pYK602-HIS 벡터에 DLK1-Fc형태의 발현을 유도하기 위하여, 각각 서열번호 2 및 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 제작하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 구체적으로 반응 조합은 주형으로 사용한 디엔에이 라이브러리 믹스(신장, 태반, 췌장, 간의 혼합) 100 ng, pfu 2.5 unit 프라이머 각각 10 pmol을 첨가하고 총 50 ul로 반응을 수행하였다. 반응은 94도 2분, 1 싸이클 94도 30초, 55도 30초, 72도 1분, 30 싸이클, 72도 10분 1싸이클로 하여 반응을 종결하였다. 중합효소 연쇄 반응 결과물은 SfiI 제한 효소 자리를 포함하고 있어 SfiI으로 제한효소 반응을 수행한 후에 pYK602-HIS 벡터에 넣어 pYK602-His-DLK1 재조합 벡터를 제조하였다(도 5).

클로닝한 DLK1은 전체 383개의 아미노산 중에 25번째 아미노산에서 302번째 아미노산까지에 해당하는 세포막 바깥의 수용성 도메인으로 시그날 펩타이드(signal peptide)와 막통과 부위(transmembrane region) 밑 세포내 부위(cytoplasmic domain)를 제거한 부분이고, 클로닝 된 DLK1의 핵산 염기서열과 아미노산 서열은 도 6(서열번호 1) 및 7(서열번호 4)과 같다.

< 실시예 2> DLK1 - Fc 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 <실시예 1>에서 클로닝 된 DLK1-Fc를 발현하기 위하여 293E 세포를 사용하였다. 구체적인 발현 방법은 다음과 같다. 100 mm 플레이트에 70% 정도 세포 수준에서 DNA 10 ug, PEI(#23966, Polysciences, USA) 20 ug을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켜 혼합체를 만든 후 세포에 처리해 주었다. 16 ~ 10시간 후에 혈청이 없는 DMEM 배지로 갈아 준 후, 이틀에 한번 씩 배지를 회수하고 새로운 배지로 갈아 주었다. 회수한 배지는 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 발현을 확인하였다(도 8). 발현이 확인된 배지는 원심분리를 통하여 남아 있을지 모를 세포들을 확실히 제거해 준 후, 0.22 um 필터(#PR02890 Millipore, USA)를 이용하여 걸러 주었다. 이후 프로테인 A 컬럼을 이용하여 정제를 수행하였다. 이는 10 ml의 컬럼에 500 ul의 프로테인 A 비드(#17-1279-03 GE, Sweden)를 충진하고 PBS로 씻어 준 후 DLK1-Fc가 발현된 배지를 흘려 주었다. 이 과정은 페리-스타트 펌프를 사용하였으며, 1분에 0.5 ml씩 흘러들어 가게 세팅해 주었다. 배지가 모두 컬럼을 통과 한 후 PBS로 씻어 준 후 0.1 M glycine-HCl(#G7126, Sigma, USA)로 정제된 DLK1-Fc 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질은 1M Tris pH 9.0(#T-1503, Sigma, USA)를 이용하여 pH를 중화시켜 준 후 PBS를 이용하여 투석을 실시하였다. 정제된 단백질은 BCA 분석을 통하여 정량을 수행하였고, SDS-PAGE를 수행하여 정제 여부를 확인하였고(도 9), 이를 통하여 정제된 DLK1-Fc 융합 단백질을 얻었다.

< 실험예 1> 정제된 DLK1 - Fc 의 내독소 측정 및 제거

상기 <실시예 2>에서 제조 및 정제된 DLK1-Fc의 박테리아 내독소 수치를 측정하기 위해서 Chromo-LAL(cat# C0031, CAPE COD)을 이용하였다. 구체적으로 단백질 표준물질로 CSE(control standard endotoxin ; cat# E0005, CAPE COD)를 1 EU/ml부터 2배 씩 희석하여 최소 농도가 0.03125 EU/ml이 되도록 준비한다. 음성 대조군으로 LRW(LAL reagent water; cat# WP1001, CAPE COD) 100 ul + LAL 100 ul, 양성 대조군으로 0.125EU/ml 농도의 스탠다드 100ul + LAL 100 ul 넣는다. 분석을 위해 LRW로 일정농도 (50 ug/ml)가 되도록 희석한 샘플 100 ul + LAL 100 ul를 준비한다. 추가로 샘플의 간섭확인을 위해 프로덕트 양성 대조군을 실험하는데, 앞서 희석한 샘플 50 ul + 0.125 EU/ml 스탠다드 50 ul + LAL 100ul로 준비한다. 또한, VersaMax microplate reader(Molecular devices)로 측정하는데 미리 셋팅된 값을 프로토콜화한 파일(Chromo LAL setting.pda)을 이용하였다. 플레이트는 미리 37℃로 10분 정도 예열한 후 실험을 시작한다. LAL을 처리함과 동시에 셋팅된 파일을 시작하여 흡광도를 측정한다. 표준 곡선은 X축은 Log EU/mL, Y축은 Log Onset 시간으로 작성되며, 샘플의 내독소 수치는 측정한 흡광도를 소프트웨어 상에서 자동으로 계산하여 EU/ml로 표시된다. 표준 곡선의 R² 값이 0.98이상 되는 경우에 측정치에 대한 신뢰성을 두었다. DLK1-Fc 단백질에 대한 LAL test 결과, 150.24 EU/ml의 내독소를 함유하고 있는 것으로 측정되었다. 이어서 샘플의 내독소를 제거하기 위해 EndoTrap Red(cat# 83-009U, Lonza) 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 3 ml의 재생 버퍼로 2회 세척한 후, 동량의 안정화 버퍼로 2회 세척한다. 다음으로 샘플 적용과 동시에 분액을 받기 시작한다(속도: 0.5 ~ 1 ml/분). 컬럼 내의 잔여샘플은 안정화 버퍼 1 ml을 적용하여 받았다. 내독소 제거 후 위와 동일한 방법으로 LAL test를 다시 실시하였고, 그 결과 샘플의 내독소의 수치가 7.53 EU/ml로 측정되었으며, 이는 음성 대조군과 비슷한 양으로, 결과적으로 정제된 DLK1-Fc 단백질의 박테리아 내독소가 제거되었음을 확인하였다.

< 실험예 2> DLK1 - Fc 융합 단백질의 암세포주 이동 억제 효과 확인

상기 <실시예 2>에서 제조 및 정제된 DLK1-Fc 단백질이 암세포주에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 참고문헌(Chen HC, Methods in molecular biology . 294:15-22, 2005)의 방법을 사용하여 암세포주의 이동 분석(migration assay)을 실시하였다.

구체적으로, 암세포주[피부암 세포주 (MDA-MB-435; ATCC HTB-129), 유방암 세포주 (Hs578T; ECACC 86082104 및 MCF-7; ATCC HTB-22), 자궁암 세포주 (HeLa; ATCC CCL-2), 대장암 세포주 (SW480; ATCC CCL-228, SW620; ATCC CCL-227 및 HT29; ATCC HTB-38), 신장암 세포주 (786-O; ATCC CRL-1932 및 UO-31; DTP), 간암 세포주 (HepG2; ATCC HB-8065, SNU398; KCLB 00398 및 SNU449; KCLB 00449), 폐암 세포주 (A549; ATCC CCL-185, NCIH23; KCLB 90023 및 NCIH460; KCLB 30177), 난소암 세포주 (MDAH2774; ATCC CRL-10303 및 IGROV-1; DTP), 췌장암 세포주 (Aspec-1; KCLB 21682, HPAC; ATCC CRL-2119 및 MIA paca-2; KCLB 21420) 및 위암 세포주 (SNU638; KCLB 00638 및, AGS; KCLB 21739)]를 배양하여 세포가 50%정도 수준일 때 무혈청 배지로 갈아 주고, 24시간 후에 세포를 트립신 처리를 통하여 떼어낸 후에 세포 수를 측정하였다. 세포와 무혈청 배지 및 처리하고자 하는 각각의 단백질을 합하여 100 ul를 만들고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1 ml의 화학 유인 물질(chemo-attractant)을 넣어주고, 그 위에 8.0 um 크기의 포어를 가진 트랜스웰(Corning #3422)을 올리고 그 안에 1시간 동안 전배양한 세포 및 세포, 단백질 혼합액 100 ul를 넣은 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 24시간 내지 48시간 배양하였다. 각각의 세포 주에 사용한 세포수, 화학 유인 물질 구성, 배양 시간은 도 21과 같다.

배양 후, 트렌스웰의 배지를 제거한 후, 100% 메탄올에서 15분간 고정시켰고, 그 후 증류수를 이용하여 2번 씻어 준 후, 크리스탈 바이올렛 용액에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 증류수에서 3번 씻어 준 후, 면봉을 이용하여 트랜스웰을 통과하지 못한 세포들을 면봉을 이용하여 완전히 제거해 주었다. 트랜스웰을 완전히 말린 후, 트랜스웰을 통과한 세포들을 관찰하기 위하여 100배의 배율로 관찰 및 사진을 촬영하였다. 정량적 분석을 위해서는 사진 촬영이 끝난 후, 트랜스웰에 10% 초산 용액(acetic acid)에 담구어서 추출 한 후 560nm 파장에서 측정하여 흡광도를 분석하였다.

그 결과, 대장암(colon cancer) 세포주 SW620 및 피부암 흑색종(melanoma) 세포주 MDA-MB-435에 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질을 포함한 세포 배양액을 처리한 결과, 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질은 대조군 수용성 Fc 단백질 및 비처리군에 비해 암세포주의 이동(migration)을 현저히 저해하는 것을 확인하였다(도 10). 또한 이동이 DLK1에 결합된 Fc의 영향이 아님을 알아보기 위하여 DLK1의 수용성 부분만을 발현 및 정제하여 비교해 본 결과, 수용성 DLK1-Fc 융합 단백질과 같이 암세포주의 현저한 이동 감소를 확인할 수 있었다(도 11). 또한, 정제된 수용성 DLK1 Fc 융합 단백질을 이용하여 다양한 암세포주의 전이에 미치는 영향을 조사한 결과, 유방암(도 12), 자궁암(도 13), 대장암(도 14), 신장암(도 15), 간암(도 16), 폐암(도 17), 난소암(도 18), 췌장암(도 19) 및 위암(도 20)에서 암세포주의 이동을 억제하는 것을 확인하였다.

< 실험예 3> DLK1 - Fc 융합 단백질의 약물 속도론적 파라메타( pharmacokinetice parameter) 확인

상기 <실시예 2>에서 제조 및 정제된 DLK1-Fc 융합 단백질이 실제 항전이 억제제로 쓰이기에 적합한지 알아보기 위한 실험으로 약물 동역학 실험을 수행하였다.

구체적으로, 30마리의 Balb/c 암컷 6주령(오리엔트 바이오)에 복강 주사를 통해 5 mg/kg으로 한번 접종한 후 안구 정맥 망(ophtalmic venus plexus)에서 0, 0.5, 2, 4, 6, 24, 30, 48시간마다 혈액을 채취 한 후 혈청을 분리하여 실험에 사용하였다.

샘플링된 혈청을 이용하여 혈중 DLK1-Fc의 농도를 측정하기 위하여 효소면역측정법을 사용하였다. 구체적으로, 효소면역측정법 플레이트(#439454, NUNC)에 1 ug/ml의 농도의 DLK1 항체(#MAB1144, R&D)를 4℃에서 코팅하였다. 4% 스킴 밀크/PBS(Photassium phosphate saline) 버퍼로 블로킹을 1시간 동안 수행한 후 플레이트를 PBST(Photassium phosphate saline, 0.05% Tween 20) 버퍼로 씻어 주었다. 표준 커브의 구축을 위하여 정제된 DLK1-Fc를 100 nM 농도부터 시작해서 2배씩 희석하고 음성 대조군으로는 hIgG(human IgG)를 사용하였다. 실험에서 샘플링된 혈청은 250배, 500배, 1000배로 각각 희석한 후 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 플레이트를 PBST 버퍼로 씻어 준 후 항 Fc-HRP(#31413, Pierce) 항체를 1:4000의 농도로 희석하여 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 플레이트를 PBST 버퍼로 씻어 준 후 OPD(o-Phenylenediamine dihydrochloride) 용액을 준비하여 각각의 웰에 100 ul씩 처리해 주었다. OPD 용액은 PC 버퍼, pH 5.0에 과산화 수소수 및 OPD(P9187, Sigma)를 첨가하여 제조하였다. 10분 동안 암실에서 반응 후 2.5 M 황산 50 ul를 처리해 주어 발색 반응을 종결하고 OD 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 커브는 R² 값이 0.99값 이상의 구간을 선정하여 결과를 처리하였다.

그 결과, 5 mg/kg (실제 마우스의 무게를 고려하면 100 ug/마우스)로 접종하여 마우스의 총 혈액이 대략 2 ml인 것을 고려하면 정맥 주사로 놓았을 시 가장 최고 농도로 산정할 수 있는 농도는 50 ug/ml로써 복강 접종을 통해 나타난 실험 결과의 Cmax값이 38.96 ug/ml이 나온 것은 상당히 높은 값이라고 할 수 있으며 접종 후 4시간(Tmax 값)이면 최고 농도를 나타내는 것을 알 수 있었다. 그리고 생체 내에서 얼마나 안정적인지를 알아보는 반감기 값이 약 20시간으로 나타나 생체 내에서 상당히 안정적인 것을 확인할 수 있었다(도 23). 그리고 암 전이 억제력을 나타내는 농도가 10 ug/ml에서도 탁월한 효과를 보이는 것을 확인하였으므로 48시간 후에 약 10 ug/ml의 농도를 유지하고 있는 결과를 비추어 보아 암 전이 억제용 단백질 신약으로써 충분한 안전성 및 효율성을 보여 주고 있음을 확인하였다(도 22).

따라서 본 실험 결과는 DLK1-Fc 융합 단백질이 다양한 암종의 이동을 저해하고 약물 속도론적 파라메타 들을 비추어 볼 때 암 전이를 막는 조성물로서의 충분한 가능성이 있음을 보여준다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

5. 주사제의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 DLK1-Fc 융합 단백질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

6. 환의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

7. 과립의 제조

DLK1-Fc 융합 단백질 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

본 발명의 DLK1-Fc 융합 단백질은 비 융합 단백질에 비해 높은 안정성을 가지고, 다양한 암세포주에서 그 이동(migration)을 현저히 감소시키며 적은 농도에서도 암 전이 억제 효과가 뛰어나므로, 암 전이 억제 및 암 예방 및 치료용 조성물, 암 예방 및 개선용 건강식품의 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라, 현재 암 치료제로 사용되고 있는 신생혈관억제용 조성물과 병용 상용화시, 현저히 우수한 항암활성을 갖는 암 전이 억제 및 암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

DLK1(delta-like 1 homolog)의 세포외 영역의 수용성 도메인을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인은 200 ~ 300 a.a의 크기임을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, DLK1의 세포외 영역의 수용성 도메인은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
DLK1(delta-like 1 homolog)의 세포외 영역의 수용성 도메인 및 인간 항체 Fc 영역이 접합된 DLK1-Fc 융합 단백질.
제 4항의 DLK1-Fc 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 5항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
제 6항의 재조합 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주.
1) 제 7항의 재조합 세포주를 배양하는 단계; 및
2) 세포주 배양액으로부터 DLK1-Fc 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 DLK1-FC 융합 단백질 제조방법.
제 4항의 DLK1-Fc 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 조성물.
제 1항 및 제 9항에 있어서, 상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.