CN109251242B - 破骨细胞分化抑制用肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明的肽不仅起到与天然的白细胞介素‑3的功能相同或类似的功能，并根据小的大小，皮肤渗透度非常优秀。并且，本发明的肽通过抑制核因子kb受体活化因子配体‑核因子kb受体活化因子信号路径，不仅抑制核因子κB的活性化及核转录，还抑制由核因子kb受体活化因子配体及炎性细胞因子诱导的抗酒石酸盐酸性磷酸酶、组织蛋白酶K或1型或2型肿瘤坏死因子受体的表达，从而以处理浓度‑依赖性的方式抑制破骨细胞分化。并且，本发明的肽促进骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白等的多个造骨细胞分化标记的表达，从而有助于造骨细胞分化。因此，本发明肽的优秀的活性及稳定性可非常有用地适用于医药、医药外品或化妆品。

Description

破骨细胞分化抑制用肽及其用途

本申请是2013年10月25日提交的同名发明专利申请201380078414.X的分案申请。

技术领域

本专利申请针对2013年07月23日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第10-2013-0086939号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书作为参照。

本发明涉及破骨细胞分化抑制用肽及其用途。

背景技术

骨平衡性和骨骼的结构形状借助吸收骨的破骨细胞和形成骨的造骨细胞之间的组织化的活性来维持。作为多核细胞的破骨细胞从造血干细胞分化[T.Miyamoto,O.Ohneda,F.Arai,et al.,Blood 98(2001)2544-2554.]，破骨细胞的分化通过从造骨细胞和活性化的T淋巴细胞分泌的核因子kb受体活化因子(RANK)配体来调节[Y.Y.Kong,U.Feige,1.Sarosi,et al.,Nature 402(1999)304-309]。

核因子kb受体活化因子配体(RANKL，receptor activator of nu clear factorkappa-B ligand)与作为存在于破骨细胞前体的受体的核因子kb受体活化因子相结合，当巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，macr ophage-colony stimulating factor)存在时，诱导破骨细胞分化。核因子kb受体活化因子配体使调节破骨细胞的形成和骨的吸收的信号传输路径活性化[J.Li,1.Sarosi,X.Q.Yan,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)1566-1571.]。核因子kb受体活化因子不具有酪氨酸激酶活性(tyrosine kinase activity)，通过已知的作为肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs，TNF receptor-associated factors)的接头蛋白质(ad aptor protein)诱导信号传输[L.Galibert,M.E.Tometsko,D.M.Anderson,et al.,J.Biol.,Chem.273(1998)34120-34127]。作为细胞内分子的一部分的肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)起到破骨细胞生成的重要作用，并使多种下位信号活性化[M.A.Lomaga,W.C.30Yeh,1.Sarosi,et al.,Genes Dev.13(1999)1015-1024]。肿瘤坏死因子受体相关蛋白6与核因子kb受体活化因子的细胞质的结构域相结合后，使核因子κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1，activator protein-1)活性化[S.L.Teitelbaum,J.Clin.Invest.114(2004)463-465]。

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)-α作为肿瘤坏死因子配体系列蛋白质，从包含单核细胞/巨噬细胞或破骨细胞的多种细胞分泌，通过被称为肿瘤坏死因子R1、肿瘤坏死因子R2(已知为肿瘤坏死因子R p55和肿瘤坏死因子R p75)的2个细胞膜受体来诱导多种生物学反应，肿瘤坏死因子R1和肿瘤坏死因子R2均诱导可促进作为核因子κB的细胞质内抑制剂的IκB的蛋白质水解的细胞内信号[Verma,1.M.,Stevenson,J.K.,Schwarz,E.M.,Van Antwerp,D.,and Miyamoto,S.(1995)Genes Dev.9,2723-2735J]。

肿瘤坏死因子-α调节炎症反应、免疫调节、细胞增殖及分化、细胞自杀等的多种范围的反应[Ledgerwood,E.C.,Pober,J.S.,and Br adley,J.R.(1999)Lab.Invest.79,1041-1050]。并且，肿瘤坏死因子-α在体外及体内促进骨的吸收[Bertolini,D.R.,Nedwin,G.E.,Bringma n,T.S.,Smith,D.D.,and Mundy,G.R.(1986)Nature 319,516-518]，且可在造骨细胞中诱导核因子kb受体活化因子配体的分泌[Hofba uer,L.C.,Lacey,D.L.,Dunstan,C.R.,Spelsberg,T.C.,Riggs,B.L.,and Khos1a,S.(1999)Bone 25,255-259]。并且，肿瘤坏死因子-α不仅对在风湿性关节炎中发生的骨和关节破坏的原因起到重要作用，已知在牙周炎、整形外科的移植后分离、慢性炎症性骨吸收的各种形态中，还起到其原因的功能。肿瘤坏死因子-α由借助脂多糖(lipopoly saccharide)来刺激的破骨细胞介导[Abu-Amer,Y.,Ross,F.P.,Edwar ds,J.,and Teitelbaum,S.L.(1997)1.Clin.Invest.100,1557-1565]。肿瘤坏死因子-α在闭经后出现的骨质疏松症中，对雌激素缺乏带来的骨质流失起到重要的作用[Cenci,S.,Weitzmann,M.N.,Roggia,C.,Namba,N.,Novack,D.,Woodring,J.,and Pacifici,R.(2000)J.Clin.Invest.106,1229-1237]。

作为主要通过活性化的T淋巴细胞分泌的细胞因子的白细胞介素(IL，interleukin)-3可用作免疫与造血干细胞系统之间的纽带[J.W.S chrader,Interleukin-3,in:A.W.Thomson,M.T.Lotze(Eds.),Academ ic Press,London,UK,2003,pp.201-225]。白细胞介素-3不仅直接作用于小鼠破骨细胞前体，还向巨噬细胞一侧促进细胞分化，来抑制通过核因子kb受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化[S.M.Khapli,L.S.Mangashetti,S.D.Yogesha,M.R.Wani,J.Immunol.171(2003)142-151]。在破骨细胞前体中，白细胞介素-3抑制IκB的磷酸化和分解，从而妨碍向由核因子kb受体活化因子配体诱导的核因子κB的核移动。并且，抑制由核因子kb受体活化因子配体诱导的c-Jun氨基端激酶(JNK，c-Jun N-terminal kinase)的活性，向下调节c-Fos、小鼠激活T-细胞核因子1(NFATc1)转录因子的表达。确认到白细胞介素-3在转录后步骤中，抑制核因子kb受体活化因子的表达，不能通过利用小鼠的体内实验返回到上述过程。

本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

要解决的问题

本发明人努力开发维持与白细胞介素-3(Interleukin 3)相同的功能或类似的功能，并与天然的白细胞介素-3蛋白质相比，活性及稳定性优秀的物质。其结果，本发明人在很多肽候选物质中选择具有优秀的生理活性(例如，破骨细胞分化抑制能力、骨分化促进能力等)的来源于白细胞介素-3的肽，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成的肽。

本发明的再一目的在于，提供骨疾病改善或治疗用药剂学组合物。

本发明的另一目的在于，提供骨分化促进用组合物。

本发明的还一目的在于，提供骨疾病改善或治疗方法。

本发明的又一目的在于，提供骨分化促进方法。

以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。

解决问题的手段

根据本发明的一实施方式，本发明提供由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成的肽。

本发明人努力开发维持与白细胞介素-3相同的功能或类似的功能，并与天然的白细胞介素-3蛋白质相比，活性及稳定性优秀的物质。其结果，本发明人在很多肽候选物质中选择了具有优秀的生理活性(例如，破骨细胞分化抑制能力、骨分化促进能力等)的来源于白细胞介素-3的肽。

本发明人以与人体白细胞介素-3的功能有关的部位为基础合成了表示上述特性的来源于多个白细胞介素-3的肽。更详细地，任意部分合成白细胞介素-3蛋白质的多个部分来第一次探索受体蛋白质的可结合部位后，最优化所预测部位的氨基酸序列来选择性地制备本发明的肽，并从这些多个候选肽中筛选活性最优秀的肽，从而制备了本发明的SEQID NO:1及SEQ ID NO:2的肽。

根据本发明的一些实例，本发明的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽来源于人体白细胞介素-3(GenBank Accession Number，AA H66275.1；SEQ ID NO:3)，其例示在表1中。本发明的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽是起到与天然白细胞介素-3类似的作用，从而与其受体相结合，来具有生长因子等的活性的肽。

本发明的肽不仅以处理浓度-依赖性的方式具有强烈的破骨细胞分化抑制能力，还明显促进了造骨细胞分化(参照图3a、图3b至图8a、图8b)。

根据本发明的一些实例，本发明的肽抑制核因子kb受体活化因子配体(RANKL，receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-核因子kb受体活化因子(RANK)信号路径。

本发明的肽明显抑制了由核因子kb受体活化因子配体介导的核因子κB的活性化及核转录(参照图7a及图7b)。

根据本发明的一些实例，本发明的肽抑制由核因子kb受体活化因子配体或炎性细胞因子诱导的破骨细胞分化能力，并抑制由核因子kb受体活化因子配体或炎性细胞因子诱导的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TR AP，tartrate-resistant acid phosphatase)、组织蛋白酶(cathepsin)K或1型或2型肿瘤坏死因子受体的表达。

根据本发明的一些实例，上述炎性细胞因子包含肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor)-α、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，macropha ge colony-stimulating factor)、白细胞介素-1β、白细胞介素-6及白细胞介素-7，更具体地，上述炎性细胞因子包含肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β及白细胞介素-6，尤其具体地，上述炎性细胞因子包含肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-1β，最具体地，上述炎性细胞因子包含肿瘤坏死因子-α。

本发明的肽可促进造骨细胞的分化。

根据本发明的一些实例，本发明的肽促进骨钙素(OCN，osteocal cin)、骨保护素(OPG，osteoprotegerin)、骨唾液酸蛋白(BSP，bone sialoprotein)及骨桥蛋白(OPN，osteopontin)等的多个造骨细胞分化标记的表达。

在本说明书中，术语“肽”是指通过肽键来由多个氨基酸残基互相结合而成的线性分子。本发明的肽可通过本领域中公知的化学合成方法，例如，固相合成技术(solid-phasesynthesis techniques:Merrifi eld,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,etal.,So]id Ph ase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.:Rockford,111(1984))或液相合成技术(美国登录专利第5，516，891号)来制备而成。

本发明的肽其自身与天然的白细胞介素-3蛋白质相比，稳定性优秀，但是，根据氨基酸的变形可更加提高稳定性(参照图2a及图2b)。

根据本发明，本发明的肽与天然的白细胞介素-3蛋白质相比，具有非常突出的热稳定性。天然白细胞介素-3蛋白质不仅难以制备，且生产费用高，而且当温度及长期保管时具有低的稳定性。但是，本发明的肽能够以非常低廉的方式大量合成，在高温等条件下，物理化学性质稳定，因而可最大限度地防止生理活性下降，并增加体内外的残存期间，从而具有更加得到提高的治疗效果。因此，本发明的肽可有利地适用于医药品、医药外品及化妆品等需要长时间储存的产品中。

根据本发明的一些实例，上述肽的N-末端或C-末端可与选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基相结合。

上述氨基酸的变形起到大大改善本发明的肽的稳定性的作用。在本发明中提及的术语“稳定性”不仅是指“体内”稳定性，还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含上述肽作为有效成分的骨疾病改善或治疗用药剂学组合物。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述肽作为有效成分的骨分化促进用组合物。

本发明的组合物包含与上述的本发明的白细胞介素-3有关的肽作为有效成分，因而为了避免本说明书过于复杂，省略两者之间的共同的记载内容。

在本说明书中使用的术语“骨疾病”作为与由核因子kb受体活化因子配体介导的信号有关的疾患、疾病或状态，不仅包含与骨形成及再吸收的调节有关的疾患、疾病或状态，还包含骨量减少、骨质疏松症及骨溶解等的骨量减少性障碍。

根据本发明的一些实例，可利用本发明的药剂学组合物来改善或治疗的骨疾病包含骨质疏松症、青少年骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、佩吉特氏病(Paget’s disease)、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性(metastatic)骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病及随年龄的骨量损失，但不局限于此。

本发明的多个组合物可利用为药剂学组合物，上述药剂学组合物包含：(a)表示上述的本发明的白细胞介素-3蛋白质活性的肽的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体。

在本说明书中使用的术语“药剂学有效量”是指达成与上述的白细胞介素-3有关的肽的功效或活性的充分量。

包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适当的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于Remington’Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。

本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服的方式进行给药，在以非口服的方式给药的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、经皮给药等的方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适当的给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等的因素而多样，一般可容易确定及处方对熟练的医生希望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1天给药量为0.0005-1000mg/kg。

并且，本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可制备成单位容量形态或装入多容量容器内来制备。此时，剂型还可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或凝胶(例如，水凝胶)形态，还可包含分散剂或稳定剂。

并且，本发明的组合物可利用为化妆品组合物，上述化妆品组合物包含：(a)来源于上述的本发明的白细胞介素-3的肽的化妆品学有效量(cosmetically effectiveamount)；以及(b)化妆品学上接受的载体。在本说明书中使用的术语“化妆品学有效量”是指达成上述的本发明的组合物的功效的充分量。

本发明的化妆品组合物可制备成本发明所属领域中通常制备的任何剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含有表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底及喷雾剂等，但不局限于此。更详细地，可制备成柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂或粉的剂型。

在本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，可利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等作为载体成分。

在本发明的剂型为粉或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉作为载体成分，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，可利用水、乙醇或丙二醇等的液态稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯脱水山梨醇酯等的悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等作为载体成分。

在本发明的剂型为含有表面活性剂的洁面剂的情况下，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。

包含于本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的肽类和载体成分之外，包含通常利用于化妆品组合物的多种成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的通常的助剂。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供骨疾病改善或治疗方法，上述骨疾病改善或治疗方法包括如下步骤：将包含上述的肽作为有效成分的组合物给药到对象(subject)中。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供骨分化促进方法，上述骨分化促进方法包括如下步骤：使包含上述的肽作为有效成分的组合物与细胞相接触。

本发明的方法利用上述的组合物，因而为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。

发明的效果

归纳本发明的特征及优点如下。

(i)本发明的肽不仅起到与天然的白细胞介素-3的功能相同或类似的功能，而且根据小的大小，皮肤渗透度非常优秀。

(ii)本发明的肽不仅通过抑制核因子kb受体活化因子配体(RA NKL，receptoractivator of nuclear factor kappa-B ligand)-核因子kb受体活化因子信号路径来抑制核因子κB的活性化及核转录，还抑制由核因子kb受体活化因子配体或炎性细胞因子诱导的抗酒石酸盐酸性磷酸酶、组织蛋白酶K或1型或2型肿瘤坏死因子受体的表达，从而以处理浓度-依赖性的方式抑制破骨细胞分化。

(iii)并且，本发明的肽促进骨钙素、骨保护素(OPG，osteopro tegerin)、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白等的多个造骨细胞分化标记的表达，从而有助于造骨细胞分化。

(iv)因此，本发明肽的优秀的活性及稳定性可非常有用地适用于医药、医药外品或化妆品。

附图说明

图1a、图1b为表示根据本发明的合成例1制备的SEQ ID NO:1(图1a)和SEQ ID NO:2(图1b)的肽的高效液相色谱法分析结果的图表。

图2a、图2b为用纯度表示根据本发明的合成例1制备的SEQ ID NO:1(图2a)和SEQID NO:2(图2b)的肽的稳定性测试结果的图表。

图3a、图3b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1的肽(图3a)及SEQID NO:2的肽(图3b)进行处理的破骨细胞的分化抑制效果的结果。

图4a、图4b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1的肽(图4a)及SEQID NO:2的肽(图4b)进行处理时，破骨细胞分化促进酶的抑制效果的图表。

图5a、图5b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1的肽(图5a)及SEQID NO:2的肽(图5b)进行处理时，作为破骨细胞分化标记的抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶K的信使核糖核酸(mRNA)抑制效果的结果。

图6a、图6b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1的肽(图6a)及SEQID NO:2的肽(图6b)进行处理时，1型或2型肿瘤坏死因子受体的信使核糖核酸抑制效果的结果。

图7a、图7b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1的肽(图7a)及SEQID NO:2的肽(图7b)进行处理时，核因子kb受体活化因子配体信号抑制效果的结果。

图8a、图8b为对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1(图8a)及SEQ ID NO:2(图8b)的肽进行处理时，造骨细胞分化促进的结果。

图9a、图9b为表示对根据本发明的合成例制备的SEQ ID NO:1(图9a)及SEQ IDNO:2的肽(图9b)进行处理时，在造骨细胞中，增加作为BMP2信号的p-Smad1/5/8的表达的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

合成例1：Asn-Cys-Ser-Asn-Met-Ile-Cys-Glu-Ile-Ile-Thr-His(SEQ ID NO:1)的合成

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin；CTL resin，Novabiochem Cat No.01-64-0021)放入反应容器中，并加入10ml的二氯甲烷(MC)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷(DCM)溶液放入反应器中，并放入200mmole的Fmoc-L-His(Trt)-OH(Bachem，Swiss)及400mmole的二异丙基乙胺(DIEA)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(Piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了His(Trt)-CTL树脂。在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的Fmoc-Thr(tBu)-OH(Bachem，Swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(Bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的N，N-二异丙基乙胺(DIEA，N，N-Diisopropylethylamine)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用茚三酮测试(Nihydrin test)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了Thr(tBu)-His(Trt)-CTL树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次茚三酮测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。根据选定的氨基酸序列，按Fmoc-Ile、Fmoc-Ile、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-Met、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)及moc-Asn(Trt)的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使Fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐和N，N-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(HoBt，Hydroxybenzotriazole)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide，P₂O₅)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(Thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并维持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.5g的纯化前NH₂-Asn-Cys-Ser-Asn-Met-Ile-Cys-Glu-Ile-Ile-Thr-His-OH肽1(收率：89.9％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1375.4Da(理论值：1377.6Da)(图1a)。以如上所述的方法还合成了SEQ ID NO:2的肽(NH₂-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-OH)(收率：92.1％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1568.5Da(理论值：1567.9Da)(图1b)。

表1

合成的肽序列及分子量

试验例1：制备的肽的热稳定性

将在合成例1中合成的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽和从英国国家生物制品检定所(NIBSC，UK)购买的标准生长因子(IL-3)制备为浓度为0.1mg/ml的磷酸缓冲溶液。以1ml的方式分别将准备的溶液放入玻璃小瓶后，在37℃温度下进行放置。分别在0天、1天、3天、5天、10天、20天及40天，将在37℃温度下进行放置的溶液进行采样，按日期进行离心分离来去除改性的肽或蛋白质，提取上清液，并利用高效液相色谱法(HPLC)进行定量(分别为图2a及图2b)。

试验例2：利用合成肽的破骨细胞分化抑制效果的确认

为了分析对在合成例1中合成的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的肽的白细胞介素(Interleukin，IL)-3的类似功效及抑制功效，参照抗酒石酸盐酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase)染色等的方法(Rizzino,et al.Cancer Res.48:4266(1988))，通过利用可分化为破骨细胞的Raw264.7细胞株的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP，Tar trate-res)比色法进行测定。

在包含10％的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum，希格玛(Sigma)公司)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’medium，美国吉毕科公司(Gibco，U.S.A.))中，分别利用容量为250ml的组织培养用烧瓶，将Raw264.7细胞株(ATCC)进行培养。针对培养的多个细胞株，小心地从培养容器底部移液(pipetting)后，进行离心分离，并只收集了细胞沉淀物。使上述细胞沉淀物再次在包含10％的胎牛血清的DMEM培养液中悬浮后，放入46-孔组织培养用平板中，使得每个孔有1×10⁴细胞，并为了诱导试销品和RAW264.7细胞的分化，针对核因子kb受体活化因子配体，以灭菌状态使以10ng/ml、肿瘤坏死因子-α50ng/ml的浓度合成的肽溶解于10％的蒸馏水之后，与1μg/ml或10μg/ml的浓度一同进行处理，并在37℃温度且5％的CO₂条件下培养72小时。72小时后，用相同的培养液交换培养基，针对试销品和核因子kb活化因子配体，10ng/ml、50ng/ml的肿瘤坏死因子-α的浓度和合成肽再次以1μg/ml、10μg/ml的浓度，以与上述条件相同的方法培养了48小时。共5天的培养结束之后，去除培养上清液，并为了固定细胞，制备包含25ml的柠檬酸溶液(citration solution)、65ml的丙酮及8ml的37％甲醛的固定缓冲液(fixation buffer)，并利用上述固定缓冲液固定30秒钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer saline)清洗3次。去除清洗溶液后，利用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(leukocyte alk aline phosphatase kit，希格玛(Sigma)公司，美国)进行了染色。

图3a、图3b为可通过核因子kb受体活化因子配体和肿瘤坏死因子-α诱导分化的Raw264.7细胞借助IL-3-1(图3a)及IL-3-2(图3b)进行分化抑制的结果。图3a及图3b所示，结果表明，本发明的肽可抑制Raw264.7细胞通过核因子kb受体活化因子配体和肿瘤坏死因子-α分化为破骨细胞。

试验例3：利用合成肽的破骨细胞分化抑制效果的确认

在Raw264.7细胞中，将10ng/ml的核因子kb受体活化因子配体或50ng/ml的肿瘤坏死因子-α和在合成例1中合成的肽一同处理为1或10μg/ml，并分化诱导5天后，实施了确认作为破骨细胞分化标记的抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性的抑制程度的实验。培养后去除培养液，并添加100μl的溶解缓冲液(20mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris buffer)，3％triton×-100)来破坏了细胞壁。放入500μl的柠檬酸溶液(18mM的柠檬酸(citric acid)，9mM的氯化钠(sodium chloride)，12mM的表面活性剂(surfactant)，pH3.5)、50μl的酒石酸溶液(tartrate solution)、500μl的20mM磷酸盐基质来制备反应溶液后，放入100μl的上述溶解物(lysate)和同量的反应溶液100μl，接着，在37℃温度下反应30分钟。利用分光光度计(spectrophometer)，在吸光度为405nm的条件下测定了发色。在本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽与核因子kb受体活化因子配体及肿瘤坏死因子-α一同进行处理的情况下，确认到作为破骨细胞的分化标记的抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性根据肽处理以浓度-依赖性的方式具有分化抑制效果。

试验例4：利用合成肽的破骨细胞分化标记的信使核糖核酸抑制效果的确认

在Raw264.7细胞中，将10ng/ml的核因子kb受体活化因子配体或50ng/ml的肿瘤坏死因子-α和在合成例1中合成的肽一同处理为1或10μg/ml，并诱导5天分化后，实施确认对组织蛋白酶K的信使核糖核酸表达的抑制程度。图5a及图5b示出当分别处理本发明的肽时，组织蛋白酶K的信使核糖核酸水平减少。并且，在图6a及图6b中，确认到处理核因子κB受体活化因子配体或肿瘤坏死因子-α时增加的1型1或2型的肿瘤坏死因子受体在处理本发明的肽时，它们的信使核糖核酸表达均减少。利用于聚合酶链式反应(PCR)的靶-特异性引物序列如下：抗酒石酸盐酸性磷酸酶正向引物序列、5’-AAATCACTCTTTAAGAACAG-3’及抗酒石酸盐酸性磷酸酶反向引物，5’-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3’(退火温度，45℃)；组织蛋白酶K正向引物序列、5’-CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3’及组织蛋白酶K反向引物、5’-ATCTCTCTGTACCCTCTGCA-3’(退火温度，53℃)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正向引物序列、5’-GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG-3’及甘油醛-3-磷酸脱氢酶反向引物，5’-CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3’(退火温度，55℃)；1型肿瘤坏死因子受体正向引物序列、5’-acctttacggcttcccagaa-3’及1型肿瘤坏死因子受体反向引物，5’-tccttacagccacacaccgt-3’(退火温度，55℃)；2型肿瘤坏死因子受体正向引物序列、5’-aggctggaaagcccctaact-3’及2型肿瘤坏死因子受体反向引物、5’-atgggggtactggagacagg-3’(退火温度，55℃)；以及肌动蛋白正向引物序列、5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCA-3’及肌动蛋白反向引物、5’-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGG-3’(退火温度，55℃)。

因此，本发明的肽可均抑制核因子kb受体活化因子配体和借助肿瘤坏死因子-α增加的抗酒石酸盐酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、1型及2型肿瘤坏死因子受体(图5a、图5b、图6a及图6b)。

试验例5：借助合成肽的核因子kb受体活化因子配体的信号抑制确认实验

针对Raw264.7细胞处理在合成例1中合成的多个肽，并经过30分钟后，确认了作为核因子kb受体活化因子配体蛋白质的代表性信号的核因子κB的核内移动。各个肽的效果利用核因子κB的多克隆抗体(Cat.No sc-372，圣克鲁斯，美国)通过免疫印迹来确认。在处理本发明的肽的情况下，确认了核因子κB活性化及核内移动(图7a及图7b)。除此之外，在核因子kb受体活化因子配体蛋白质的代表性的信号中，确认到c-Jun的磷酸化和磷酸化的c-Jun的核内移动。各个肽的效果利用磷酸-c-Jun的多克隆抗体(Cat.No sc-1694，圣克鲁斯，美国)通过免疫印迹来确认(图7a及图7b)。

综合试验例1至试验例5的实验结果，本发明的肽通过抑制核因子kb受体活化因子配体-核因子kb受体活化因子信号的活性化，非常有效地抑制破骨细胞分化。

试验例6：借助合成肽的骨分化标记基因促进效果的确认

在MC3T3-E1细胞中，处理10或50μg/ml的在合成例1中合成的肽，并诱导分化2天后，进行了确认骨钙素、骨保护素(OPG，osteop rotegerin)、骨唾液酸蛋白及骨桥蛋白等的造骨细胞分化标记的信使核糖核酸表达实验。在图8a、图8b中，当处理本发明的肽时，利用于作为造骨细胞的分化标记的聚合酶链式反应的靶-特异性引物序列如下：骨钙素正向引物序列、5’-gcgctctgtctctctgacct-3’及骨钙素反向引物、5’-tttgtaggcggtcttcaagc-3’(退火温度，60℃)；骨保护素正向引物序列、5’-ctgcctgggaagaagatcag-3’及骨保护素反向引物、5’-ttgtgaagctgtgcaggaac-3’(退火温度，60℃)；骨唾液酸蛋白正向引物序列、5’-aaagtgaaggaaagcgacga-3’及骨唾液酸蛋白反向引物，5’-gttccttctgcacctgcttc-3’(退火温度，60℃)；骨保护素正向引物序列、5’-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3’及骨保护素反向引物，5’-CTGCTTAATCCTCACTAACAC-3’(退火温度，50℃)。多个上述基因的信使核糖核酸水平根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽增加。因此，本发明的肽增加作为造骨细胞分化标记的骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白及骨桥蛋白的基因表达，从而可促进造骨细胞的分化。

试验例7：借助合成肽的骨分化的信号促进效果的确认

为了确认本发明的肽是否活性化作为有关骨分化促进的信号的pSmad1/5/8，将MC3T3-E1细胞，在6-孔板中分株2×10⁵细胞，并在37℃温度且5％CO₂条件下培养24小时。24小时后交换为未包含血清的培养基，并绝食(starvation)24小时，接着以10μg/ml的浓度处理肽或用作阳性对照组的BMP2以50ng/ml处理30分钟，使用磷酸盐缓冲液清洗上述细胞，放入溶解缓冲液来获取蛋白质，从而实施免疫印迹。

与上述结果一致地，可确认当处理本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽时，发生Smad1/5/8的磷酸化，这指通过本发明的肽处理，传输骨形成促进信号，从而维持造骨细胞分化(osteoblast differentiation)(分别为图9a及图9b)。

剂型例1：柔肤化妆水

通过一般化妆水的制备方法制备了包含纳米微脂囊，并由以下组成成分形成的柔肤化妆水，上述纳米微脂囊包含在上述合成例1中制备的肽1或肽2。

表2

柔肤化妆水的组成成分

剂型例2：保湿霜

通过一般的保湿霜的制备方法制备了包含纳米微脂囊，并由以下组成成分形成的营养霜，上述纳米微脂囊包含在上述合成例1中制备的肽1或肽2。

表3

保湿霜的组成成分

剂型例3：保湿化妆水

通过一般的化妆水的制备方法制备了包含纳米微脂囊，并由以下组成成分形成的营养化妆水，上述纳米微脂囊包含在上述合成例1中制备的肽1或肽2。

表4

保湿化妆水的组成成分

剂型例4：精华素

通过一般的精华素的制备方法制备了包含纳米微脂囊，并由以下组成成分形成的精华素，上述纳米微脂囊包含在上述合成例1中制备的肽1或肽2。

表5

精华素的组成成分

成分	含量(重量百分比)
		肽纳米微脂囊	0.005
甘油	10.0
		1，3-丁二醇	5.0
聚乙二醇1500	2.0
		尿囊素	0.1
DL-泛醇	0.3
		乙二胺四乙酸二钠	0.02
羟乙基纤维素	0.1
		透明质酸钠	8.0
羧乙烯聚合物	0.2
		三乙醇胺	0.18
辛基十二醇聚醚-16	0.4
		乙醇	6.0
香料、防腐剂、色素	适量
		纯化水	余量
合计	100

以上，详细说明了本发明的特定部分，但可以明确的是，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这些具体说明只属于一个实例，本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。

本说明书还包括下列内容：

1.一种肽，其特征在于，由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成。

2.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽来源于白细胞介素-3蛋白质。

3.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽抑制核因子kb受体活化因子配体-核因子kb受体活化因子信号路径。

4.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽抑制由核因子kb受体活化因子配体或炎性细胞因子诱导的破骨细胞分化能力。

5.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽抑制由核因子kb受体活化因子配体或炎性细胞因子诱导的抗酒石酸盐酸性磷酸酶、组织蛋白酶K或1型或2型肿瘤坏死因子受体的表达。

6.根据实施方式4或5所述的肽，其特征在于，上述炎性细胞因子包含肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-1β、白细胞介素-6或白细胞介素-7。

7.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽促进造骨细胞的分化。

8.根据实施方式1所述的肽，其特征在于，上述肽的N-末端或C-末端结合有选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇组成的组中的保护基。

9.一种骨疾病改善或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含实施方式1至8中任一项所述的肽作为有效成分。

10.根据实施方式9所述的骨疾病改善或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述骨疾病包含骨质疏松症、青少年骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、佩吉特氏病、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病或随年龄的骨量损失。

11.一种骨分化促进用组合物，其特征在于，包含实施方式1至8中任一项所述的肽作为有效成分。

12.根据实施方式11所述的骨分化促进用组合物，其特征在于，上述骨分化促进用组合物促进骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白的表达。

13.一种骨疾病改善或治疗方法，其特征在于，包括如下步骤：将包含实施方式1至8中任一项所述的肽作为有效成分的骨分化促进用组合物给药到对象中。

14.根据实施方式13所述的骨疾病改善或治疗方法，其特征在于，上述骨疾病包含骨质疏松症、青少年骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、佩吉特氏病、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病或随年龄的骨量损失。

15.一种骨分化促进方法，其特征在于，包括如下步骤：使包含实施方式1至8中任一项所述的肽作为有效成分的骨分化促进用组合物与细胞相接触。

16.根据实施方式15所述的骨分化促进方法，其特征在于，上述骨分化促进用组合物促进骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白的表达。

序列表

<110> Caregen Co. Ltd.

<120> 破骨细胞分化抑制用肽及其用途

<130> PN130366

<160> 2

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-3-1 肽

<400> 1

Asn Cys Ser Asn Met Ile Cys Glu Ile Ile Thr His

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-3-2 肽

<400> 2

Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu

1 5 10

Claims (10)

1.肽，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

2.权利要求1所述的肽，其中所述肽的N-末端或C-末端结合有选自乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇的保护基。

3.骨疾病改善或治疗用药剂学组合物，其包含权利要求1所述的肽作为有效成分。

4.权利要求3所述的组合物，其中所述骨疾病包含骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、佩吉特氏病、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病或随年龄的骨量损失。

5.骨分化促进用组合物，其包含权利要求1所述的肽作为有效成分。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述骨分化促进用组合物促进骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白的表达。

7.权利要求1所述的肽用于制备骨疾病改善或治疗用药物的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中所述骨疾病包含骨质疏松症、成骨不全症、骨软化症、骨坏死症、佝偻病、骨髓炎、牙槽骨质丢失、佩吉特氏病、高钙血症、原发性甲状旁腺功能亢进症、转移性骨疾病、骨髓瘤、风湿性关节炎中的骨质流失、由癌症引起的骨质流失、纤维异常增殖症、无力型骨病、代谢性骨疾病或随年龄的骨量损失。

9.权利要求1所述的肽用于制备骨分化促进用药物的用途。

10.权利要求9所述的用途，其中所述药物促进骨钙素、骨保护素、骨唾液酸蛋白或骨桥蛋白的表达。

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