KR20030013189A

KR20030013189A - 파골세포 분화를 억제하는 펩타이드 ｐ1

Info

Publication number: KR20030013189A
Application number: KR1020010047541A
Authority: KR
Inventors: 김홍희; 이장희; 함경수
Original assignee: 주식회사 코메드
Priority date: 2001-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2003-02-14
Also published as: WO2003014146A1

Abstract

본 발명은 파골세포의 분화를 억제하는 신규한 펩타이드 P1에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 펩타이드 P1을 코드하는 아미노산 서열 및 핵산 서열, 상기 서열에 의해 코드되는 펩타이드 P1 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 분리 정제된 P1 펩타이드, 그 기능적 동등물 및 이들을 함유하는 골의 대사성 질환 치료용 약학 조성물과 이를 투여하여 파골세포의 분화를 억제하는 방법을 제공한다.

Description

파골세포 분화를 억제하는 펩타이드 Ｐ1{A Novel Peptide P1 Inhibiting Differentiation of Osteoclasts}

본 발명은 파골세포의 분화를 억제하는 신규한 펩타이드 P1에 관한 것이다. 뼈는 골세포(osteocyte), 파골세포(osteoclast), 조골세포(osteoblast)와 같은 뼈세포(bone cell), 수산화인회석(hydroxyapatite crystal), 교원질 섬유 (collagenous fibers), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)과 같은 뼈 기질 (bone matrix) 및 골수의 공동(bone marrow cavity), 혈관(vascular canals), 소관 (canaliculi), 골소강(lacunae)과 같은 공간(space)으로 구성되어 있다 (Stavros C. M., Endocrine Reveiws, 21(2), 115-137 (2000)). 뼈는 몸을 기계적으로 지지하고, 중요장기를 보호하며, 조혈작용(hemopoeisis)에 필요한 미세 환경을 제공하고, 칼슘 및 여러 미네랄을 저장하는 역할을 한다.

뼈의 성장, 발달 및 유지는 일생을 거쳐 연속적으로 일어난다. 노화된 뼈는 파괴되고 이를 대신하여 새로운 뼈가 재형성(regeneration)된다. 이러한 교체 (turnover)는 파골세포와 조골세포로 구성된 BMU(Basic Multicellular Units)에서 주로 일어나는데, 이 과정은 성장과 스트레스로 인한 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 뼈의 기능을 유지하게 하는 역할을 한다. 노화된 뼈의 파괴 또는 흡수는 파골세포(osteoclast)가 그 일을 수행한다. 반면, 새로운 뼈의 형성은 조골세포(osteoblast)가 이를 담당한다. 파골세포는 뼈의 표면에 부착하여 산과 분해효소를 분비함으로서 뼈를 구성하는 인회석 결정 및 교원질과 같은 뼈 기질(bone matrix)을 제거하여 뼈를 파괴하고, 조골세포는 뼈 기질을 합성하여 분비하고 칼슘과 인의 농도를 조절하여 골격을 형성한다 (Stavros C. M., Endocrine Reviews, 21(2), 115-137 (2000)).

골의 대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포의 평형이 깨어짐으로써 발생한다. 대표적인 골 대사성 질환으로는 골다공증(osteoporosis)이 있다. 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골의 대사성 질환으로는 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양 (예, multiple myeloma), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병 (Paget's disease) 등이 있다.

골수종은 심한 통증을 동반하면서 뼈가 쉽게 골절이 되는 질환으로 종양세포가 파골세포의 활성을 증진시켜 발생한다. 유방암이나 전립선암은 쉽게 뼈로 전이되어 역시 파골세포의 활성을 증진시켜 뼈를 파괴시킨다. 류마티스성 관절염이나 퇴행성 관절염이 있는 경우에도 면역반응에 의해 생성된 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등이 관절강에 존재하는 파골세포의 활성을 증진시켜 관절 부위에 국소적인 뼈의 파괴가 일어난다. 치주질환을 일으키는 세균이 감염되어 염증을 일으키면 면역반응의 결과, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등 염증성 싸이토카인이 만들어지고 이들이 파골세포의 분화를 촉진시켜 치아를 지지하고 있는 치조골을 파괴하게 된다.

최근에 골다공증을 비롯한 이러한 골대사성 질환의 치료를 위한 분자생물학적 연구가 활발하게 이루어지면서 골형성 촉진 인자와 파골 억제 인자가 개발되었다. 골형성 촉진 인자로는 불소제재, 부갑상선 호르몬, 티지에프-베타(TGF-β), 골형성 단백질(Bone Morphogenetic protein), 인슐린유사 성장호르몬(insulin like growth factor) 등이 있다. 파골 억제 인자로는 에스트로겐, 칼시토닌, 비타민D와 그의 유사체(Vitamin analogues), 비스포스포네이트(bisphosphonate)등이 알려져 있다 (Jardine et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 31, 211 (1996)).

지금까지 여러 물질이 골다공증 치료제로 개발되었다. 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야하는 단점이 있고 또한, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다.

이에 본 발명자들은 뼈의 대사성 질환 치료제를 연구하던 중 파골세포의 분화를 강력하게 억제하는 신규한 펩타이드 P1을 제조함으로써 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 파골세포의 분화를 억제하는 신규한 펩타이드 P1을 코드하는 아미노산 서열 및 핵산서열을 제공한다.

본 발명은 상기 아미노산 서열에 의해 코드화된 펩타이드 P1 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 분리 정제된 P1 펩타이드 및/또는 그 기능적 동등물을 함유하는 골의 대사성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 P1 펩타이드 및/또는 기능적 동등물을 환자에게 투여하여 파골세포의 분화를 억제하는 방법을 제공한다.

도 1은 파골세포의 분화과정을 나타내는 개요도이다.

도 2는 골수세포와 조골세포의 상호배양시 펩타이드 P1이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 3은 골수세포에서 펩타이드 P1이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 파골세포 전구세포에서 펩타이드 P1이 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5는 조골세포에 대한 펩타이드 P1의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 6은 골수세포에 대한 펩타이드 P1의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 복강대식세포에 대한 펩타이드 P1의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 인간배신장세포주인 293T 세포에 대한 펩타이드 P1의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 펩타이드 P1이 MAP 키나제인 JNK의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 10은 펩타이드 P1이 핵전사인자 NF-kB에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 파골세포의 분화를 억제하는 신규한 펩타이드 P1을 코드하는 아미노산 서열을 제공한다.

파골세포 전구체 (osteoclast progenitor)는 골수(bone marrow)에서 기원하는 단핵세포/대식세포(monocyte/macrophage) 계통의 조혈세포(hematopoietic cell)이다. 파골세포 전구체는 골수에서 생성되는 성장인자와 싸이토카인에 의해 파골세포로 분화 및 발달된다. (Roodman G. D., Endocr. Rev., 17, 308-332 (1996)) (도 1). 파골세포는 뼈를 파괴 또는 흡수하는 역할을 한다.

이 파골세포를 분화하는데 필요한 파골세포 분화인자 (osteoclast differentiation factor: ODF)가 최근에 클로닝되었다. 파골세포 분화인자는 세포막에 결합된 TNF 리간드족의 일원이다. 유전공학적으로 만들어진 수용성의 ODF (soluble ODF)는 M-CSF 존재 하에, 조골세포나 기저세포 (stromal cells) 없이도 파골세포를 형성할 수 있음이 밝혀졌다. ODF는 다른 이름으로 TRANCE, OPGL 또는 RANKL이라고도 한다. ODF는 TNF 수용체의 일종으로 파골세포의 전구체 및 성숙한 파골세포에 존재하는 RANK에 결합하여 작용한다. 생쥐에서는 ODF의 발현이 뼈, 비장 흉선(spleen thymus), 폐에 한정되어 있다. 배양된 조골세포에 있어서는 뼈의 재흡수 자극과 함께 ODF의 발현이 증가한다고 보고되었다. (Suda T. et. al., Endocr. Rev., 20, 345-357 (1999); Yasuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(7), 3597-3604 (1998)).

파골세포 생성 억제인자 (osteoclastogenesis-inhibitory factor: OPG)는 오스테오프로토게린 (osteoprotogerin)이라고도 하는 데 파골세포의 생성 및 성숙한 파골세포의 활성을 억제하는 단백질이다. OPG는 TNF 수용체족의 분비 단백질로 세포에 결합한 ODF와 높은 친화도로 결합한다. 이 ODF와 OPG에 의해 뼈의 재생이 조절되고 있다 (도 1).

성숙한 파골세포는 직경이 약 50-100μm인 다핵세포이다. 형태학적으로는 주름진 표면을 가진 특성이 있으며 석회화된 뼈 기질을 흡수하는 기능을 한다(Boskey A. L., J. Cell. Biochem. Suppl., 30-31, 83-91 (1998)). 성숙한 파골세포는 골기질의 표면에 부착하게 되며, 파골세포의 세포막과 골기질 사이의 실링 존(sealing zone)내로 단백질 분해 효소와 산을 분비하며, 상기 단백질 분해효소와 산에 의해 뼈의 파괴가 일어난다.

본 발명의 신규한 펩타이드 P1은 파골세포의 분화를 억제하는 펩타이드로서 세크로핀 A(Cecropin A)와 마가이닌 2(Magainin 2) 서열의 일부를 가지고 있다. 구체적으로 본 발명의 펩타이드 P1은, NH₂-(세크로핀A의 1번부터 8번까지의 아미노산)-(Pro)-(마가이닌2의 4번부터 7번까지의 아미노산)-(Leu)-(마가이닌2의 9번부터 12번까지의 아미노산)-COOH 와 같은 아미노산 서열로 구성되어 있다. 본 발명의 펩타이드 P1은 바람직하게는 하기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 의해 코드되는 펩타이드이다.

펩타이드 P1 (서열번호 3)

NH₂-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Pro-Lys-Phe-Leu-His-Leu-Ala-Lys-Lys-Phe-COOH

본 발명에 사용된 약자의 정의는 다음과 같다. Ala(알라닌); Arg(아르기닌); Cys(시스테인); Ile(이소로이신); Gly(글리신); Leu(로이신);Lys(리신); Orn(오르니틴); Phe(페닐알라닌); Pro(프롤린); Trp(프립토판); Tyr(티로신); Val(발린); His(히스티딘); Gln(글루타민); Thr(쓰레오닌); Met(메티오닌); Asp(아스파르트산)

본 발명 펩타이드의 N-말단부분에 일부 포함된 세크로핀(Cecropin)은 산누에나방(Cecropia moth)으로부터 분리된 항균성(antibacterial) 펩타이드이다(Boman, H. G. and Steiner, H., Current Topics In Microbiology and Immunology, 94/95, 75-91 (1981)). 세크로핀 A, B 및 D는 면역 혈림프로부터 순수분리되었고 그 아미노산 서열도 밝혀져 있다 (Steiner, et al., Nature, 292, 246-248 (1981); Hultmaker, D., European J. Biochem., 127, 207-217 (1982); 미국특허공보 US4355104). 세크로핀 A는 히야로포라 세크로피아(Hyalophora cecropia)의 번데기에서 추출한 37개의 선형 폴리펩타이드이다 (Hultmark et al., Eur. J. Biochem. 106, 7-16 (1980)). 세크로핀A는 항미생물제제로 사용되는 것으로 세균의 세포막에 선택적으로 작용하여 항세균능을 나타낸다. 문헌에 의하면 상기 폴리펩타이드는 음전하를 띠고 있는 막지질에 결합하여 세포막에 투과성을 부여하여 항세균능을 나타나게 한다 (Steiner, et al., Nature, 292, 246-248 (1981)).

본 발명 펩타이드의 C-말단부분에 포함된 마가이닌(Magainin)은 아프리카산 발톱 개구리인 세노푸스 래비스(Xenopus laevis)에서 분리된 항미생물능을 가진 펩타이드이다 (Soravia et al., Febs. Lett., 15, 228, 337-340 (1998)). 마가이닌은 마가이닌 1과 마가이닌 2의 두가지 활성 형태로 존재한다. 마가이닌 2는 23개의 잔기를 가진 선형 폴리펩타이드이다. 상기 폴리펩타이드는 그람음성 세균 뿐아니라 그람양성 세균, 진균 및 원생동물에도 광범위한 항미생물 효과가 있다. 또한, 매우 높은 선택적인 독력을 가지고 있어 적은 양으로도 유효하나 포유동물의 세포에는 독성이 매우 작은 특성이 있다. 최근에는 항암능력이 있는 것으로도 보고되고 있다. 세포막의 투과성을 증진시켜 삼투압에 의해 세포를 파괴하는 것으로 알려져 있다.

본 발명 펩타이드의 범위에는 NH₂-(세크로핀A의 1번부터 8번까지의 아미노산)-(Pro)-(마가이닌2의 4번부터 7번까지의 아미노산)-(Leu)-(마가이닌2의 9번부터 12번까지의 아미노산)-COOH의 기능적 동등물, 더욱 구체적으로는 서열번호1 펩타이드의 기능적 동등물 및 그들의 염이 포함된다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열 3의 P1 펩타이드와 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 펩타이드 P1과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 파골세포에 작용하여 파골세포의 분화를 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 "기능적 동등물"의 범위에는 펩타이드 P1의 기본골격과 파골세포 분화억제 활성을 유지하면서 펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 펩타이드 P1의 유도체가 포함된다. 예를 들어 P1 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 펩타이드는 파골세포 분화를 억제하는 기능을 가지고 있다. 파골세포의 분화를 연구하는 데 있어서 큰 장애물로 간주되는 것은 파골세포의 기능을 유지하는 세포주가 확립되어 있지 않다는 것이다. 따라서, 파골세포의 분화모델시스템으로 골수세포와 조골세포의 상호 배양 시스템이 많이 사용되고 있는데, 이러한 상호 배양 시스템에서 펩타이드 P1을 처리하지 않았을 때보다 펩타이드 P1을 처리하였을 때 단핵파골세포 및 다핵파골세포로 분화되는 양이 현저히 줄어듬을 알 수 있었다 (도 2). P1의 처리농도를 각각, 2nM, 4nM, 20nM로 하여 결과를 비교하였을 때 펩타이드 P1의 분화억제 능력은 P1의 농도에 비례하였다.

이와 같이, 조골세포와 골수세포의 상호배양에서 펩타이드 P1이 파골세포의 분화를 억제한 것이 확인되었으나, 펩타이드 P1이 조골세포에 작용하여 ODF의 생성을 방해하는 등의 기작을 통해 파골세포의 분화를 억제할 수도 있기 때문에 본 발명자들은 실시예 3의 상호배양 시스템에서 골수세포만을 분리하고, 여기에 ODF를 처리한 후 펩타이드 P1의 파골세포 분화 억제 능력을 측정하였다. 이 경우에도 펩타이드 P1은 용량 의존적으로 파골세포의 분화를 억제하였다 (도 3).

본 발명자들은 아울러 뼈에 존재하는 파골세포 전구세포를 분리하여 여기에 ODF를 처리한 후 펩타이드 P1이 파골세포의 분화를 억제하는지를 측정하였다. 펩타이드 P1은 골수세포로부터의 파골세포 분화를 억제할 뿐만이 아니라 골수세포에서 파골세포 전구세포로 분화된 세포의 분화도 억제함을 알 수 있었다.

세포의 분화 및 증식에는 복잡한 신호전달 체계가 관여한다. 이와 관련된 것으로 오랫동안 연구되어온 것이 MAP 키나제이다. 본 발명자들은 펩타이드 P1이 MAP 키나제의 일종인 JNK에 미치는 영향을 조사하였다. 상호배양 시스템으로 파골세포를 얻은 후 펩타이드 P1, ODF, TNF-α를 단독 처리하거나 P1과 ODF를 함께 처리하였다. 그 결과 펩타이드 P1 단독 혹은 TNF-α를 단독 처리한 경우 JNK의 활성에 영향을 주지 않았다. 반면, 파골세포 분화 유도 인자인 ODF와 펩타이드 P1을 함께 처리한 경우에는 JNK의 활성이 저해되는 것을 확인하였다 (도 9). 이는 JNK가 ODF에 의해 활성화되는 것을 펩타이드 P1이 강력하게 억제하는 것을 시사하는 것이다. NF-kB는 파골세포의 분화에 가장 중요한 핵전사인자로서 ODF에 의해 활성화된다. NF-kB가 결실된 마우스(Knock-out mouse)에서는 파골세포 분화가 일어나지 않아 골항진증(osteopetrosis)이 나타난다는 보고가 있다. 본 발명 펩타이드 P1은 ODF에 의한 핵전사인자인 NF-κB의 활성화도 억제하였다(도 10).

본 발명은 펩타이드 P1을 코드하는 핵산서열을 제공한다. 본 발명의 핵산서열은 코돈 축퇴에 의하여 NH₂-(세크로핀A의 1번부터 8번까지의 아미노산)-(Pro)-(마가이닌2의 4번부터 7번까지의 아미노산)-(Leu)-(마가이닌2의 9번부터 12번까지의 아미노산)-COOH 의 아미노산 서열을 코드하는 핵산서열들의 집합을 말한다. 본 발명의 핵산서열은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드를 코드하는 핵산서열이다. 본 발명의 핵산서열은 당 분야에 공지된 기술로 합성할 수 있다.

본 발명은 분리된 펩타이드 P1 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 당분야에 공지된 기술로 합성할 수 있다 (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida,(1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)).

특히, 바람직한 P1 단백질의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 펩타이드 P1은 보호된 아미노산간의 응축반응 (condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 서열번호 3의 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해 (acid decomposition) E또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다 (Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

본 발명 펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 이 분야에서 통상 사용되는 담체로서 예를 들어, 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 레진 (polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 레진, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 레진, 펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 레진 등을 사용할 수 있다. 아미노산 응축 또한 통상의 방법일 수 있으며, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드(DDC), 산 무수물(acid anhydride) 및 활성화 에스테르 (activated ester) 방법이 사용될 수 있다.

최초 보호 아미노산의 보호기들은 통상의 펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체예로는 포밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-) 클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-) 브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시키므로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만, 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠슬포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일수도 있다.

탈보호 및 담체로부터 결과 펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger) 하에 무수 하이드로 플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-) 크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법등의 본 분야에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있으며, 역상 고성능 액체 크로마토그래피가 가장 효과적이다. 고체상법의 장점은 각 단계에서 생성되는 생성물이 비드에 결합되어 있기 때문에, 중간물질의 정제가 필요하지 않다는 것이다. 상기 방법을 사용하여 본 발명의 18머 (18-mer)를 높은 수득률 및 순도로 합성할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 이외에도 상기 제공된 펩타이드 P1의 핵산서열을 이용하여 유전공학적 방법에 의하여 제조될 수 있다. 펩타이드 P1을 코드하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터를 제조하여, 그 발현벡터를 적당한 숙주세포에서 발현시키고, 숙주세포로부터 펩타이드를 분리한다. 유전공학적으로 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Maniatis et al., Molecula Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif. (1991); Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080 (1980)).

본 발명은 분리 정제된 P1 펩타이드, 그의 염 및 그 기능적 동등물을 포함하는 골 대사성 질환 치료용 약학 조성물, 치약 또는 구강청정제, 및 그 사용방법을 제공한다. "골 대사성 질환"이란 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질병을 말한다. 골대사성 질환의 예로는 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양 (예, multiple myeloma), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골(alveolar bone)의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병 (Paget's disease) 등이 있다.

본 발명의 치료용 약학 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체와 혼합하여 제조할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 혼합하여 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 사용할 수 있다. 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존재 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 치주질환의 치료제로는 서방형 약물전달체 (delayed delivery substance: DDS) 또는 치과임프란트체에 DDS를 이용하여 코팅한 형태로 사용될 수 있다.

상기와 같이 제조된 약학 조성물은 경구투여, 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구 투여할 수 있다. 이외에 본 발명 약학 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 투여 용량은 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태 및 치료할 질병의 중증정도에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명은 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하여 골대사성 질환을 치료하는방법을 제공한다. 골대사성 질환의 정의 및 예는 상술한 바와 같다. 따라서, 환자의 상태에 따라 적절히 투여된 본발명의 조성물은 파골세포의 과활성과 관련된 각종 질환, 예를 들면, 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양 (예, multiple myeloma), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병 (Paget's disease) 등을 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 조골세포, 골수세포, 복강 대식세포 및 인간배신장세포주인 239T 세포를 가지고 행한 독성시험에서 전혀 세포 독성을 나타내지 않았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

펩타이드 P1의 제조

본 발명의 합성 펩타이드 P1은 18개의 아미노산이 연결된 것으로 다음 구조를 가지고 있다.

N-말단-(세크로핀A의 1번부터 8번까지의 아미노산)-(Pro)-(마가이닌2의 4번부터 7번까지의 아미노산)-(Leu)-(마가이닌2의 9번부터 12번까지의 아미노산)-COOH

세크로핀 A (서열번호 1)

NH₂-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-Asn-Ile-Arg-Asp-Gly-

Ile-Ile-Gly-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-Val-Val-Gly-Gln-Ala-Thr-Gln-Ile-Ala-Lys- COOH

마가이닌 2 (서열 번호 2)

NH₂-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-COOH

펩타이드 P1 (서열번호 3)

본 발명 펩타이드는 상술한 고체상(solid-phage) 합성 방법에 의해 제조하였다. 상기 펩타이드를 역상 고속 액체 크로마토그래피(reverse-phase highperformance liquid chromatography)로 순수 분리하였다. 합성된 펩타이드는 질량분석법(mass spectrometry)으로 확인하였다.

실시예 2

세포의 배양

실험에 사용된 일차 조골세포 (primary osteoblast), 골수세포 (bone marrow cell), 그리고 파골세포 전구세포 (osteoclast precursor cell)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, Gibco BRL), 1X의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 항생제(Gibco, BRL)를 첨가한 α-최소필수배지(α-Minimum Essential Medium; α-MEM, Gibco BRL)에서 배양하였다.

실시예 3

펩타이드 P1의 파골세포 분화 억제능: 골수세포(bone marrow cells)와 조골세포(osteoblasts)의 상호배양

파골세포의 분화를 연구하는 데 있어서 가장 큰 어려운 점은 현재까지 파골세포의 기능을 유지하고 있는 세포주가 확립되어 있지 않다는 것이다. 파골세포는 골수기원의 조혈모세포에서 기원하고 이들이 분화를 할 때 조골세포/기저세포의 도움을 받기 때문에 파골세포의 분화모델 시스템으로 골수세포와 조골세포의 상호배양 시스템이 많이 이용되고 있다. 본 실시예에서는 골수세포와 조골세포를 상호배양하여 골수세포가 파골세포로 분화되는 시스템을 조성하고 이 스시템에서 본 발명의 펩타이드 P1이 파골세포의 분화를 억제하는지를 실험하였다.

1) 조골세포의 분리

생후 1일인 ICR 마우스를 70% 에탄올에 넣어 소독한 후 가위와 핀셋을 이용하여 두개골을 분리하여 몇 조각으로 자른 후 3X HBSS가 들어있는 6cm 배양접시에 모은다. 여기에 0.1% 콜라젠분해효소 (collagenase, Gibco BRL)와 0.2% 디스파제(dispase; Boehringer Mannheim)를 넣고 37℃에서 15분간 5회 처리한다. 2회 처리 시부터 얻은 세포를 수집하여 원침 (1600rpm, 5분)하여 조골세포를 얻는다. 조골세포의 갯수가 약 1-2×10⁶이 되게 조절하여 10cm 배양접시에 옮겨 10% FBS가 함유된 α-MEM 15ml에서 3일간 배양한다. 배양 후 냉동 바이얼에 분주하여 질소탱크에 냉동보관하였다가 상호배양 (co-culture) 실험에 사용한다.

2) 골수세포의 분리

6주내지 7주령인 ICR 암컷 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 70% 에탄올로 뒷다리 부위를 소독한 다음 경골(tibia)를 무균적으로 분리하였다. 분리한 경골을 3X HBSS (Gibco BRL)에 넣고 연조직을 깨끗하게 제거하였다. 상기 경골의 양쪽 끝을 자르고 1cc 주사기를 이용하여 1X α-MEM으로 골수에 주입하여 골수세포를 얻은 후에 수회 파이펫팅하여 골수세포를 충분히 풀어주었다. 그 후 원심분리(1600rpm, 5min)하여 상청액은 버리고 침전된 세포 성분 (골수세포와 적혈구)을 획득하였다. 침전된 세포에 ACK 완충액 (155 mM NH4Cl, 11 mM KHCO3, 0.01 mM EDTA) 약 15-20 ml을 2분간 처리하고, 인산완충용액을 첨가하여 골수세포의 손상을 최소한으로 줄이고 적혈구를 용해시켰다. 그 후 원침(1600rpm, 5분)하고 10% α-MEM으로 세포를 현탁하였다.

3) 상호배양 (Co-culture)

상기 분리 및 배양한 골수세포와 조골세포를 상호배양하였다. 각각 웰(well)당 2×10⁵개와 2×10⁴개가 되도록 조절하고 48웰(well) 세포배양접시에 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 상호배양하였다. 이때 비타민 D₃(10^-8), PGE 2(10^-6)를 처리 후 펩타이드 P1을 20nM, 4nM, 2nM의 농도가 되도록 처리하였다. 이때 펩타이드 P1을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 배양 3일 후 배지를 교환할 때 상기와 동일하게 비타민 D₃(10^-8), PGE (Prostaglandin E) 2(10^-6)를 처리하고 P1을 동일한 농도로 처리하였다.

배양 6일 후 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거하고 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% 트립톤 X-100(Triton X-100)을 10초 동안 처리하였다. 트립톤 X-100 용액을 제거하고 5분간 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)염색하였다.TRAP 염색은 백혈구 산 포스파타제 키트(LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma, cat. No. 387-A)를 사용하였다. TRAP 염색용액 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시킨 다음 TRAP 양성인 파골세포의 수를 광학현미경(X100)으로 카운팅하였다. 이때 핵이 10개 이상인 것을 다핵파골세포(multinucleated osteoclast)로 핵이 10개 이하인 것을 단핵파골세포 (mononuleated osteoclast)로 지정하여 각각을 산정하였다.

실험결과, 대조군의 경우에 TRAP 양성 세포의 수는 단핵파골세포는 314 ±66.9개, 다핵파골세포는 157.6±52.3개로 나타났다. 이에 비해 본 발명 펩타이드 P1을 20nM 처리한 경우 파골세포가 검출되지 않았으며 4nM 처리한 경우 단핵파골세포 및 다핵파골세포의 수가 각각 168.3±54.15개, 80.6±38.7개로 나타났으며, 2nM로 처리한 경우 단핵파골세포 및 다핵파골세포의 수가 각 175.25±7.1개, 83.25±9.18개로 나타났다 (도 2). 따라서, 펩타이드 P1은 골수세포를 조골세포로 상호배양 처리한 경우에 단핵파골세포와 다핵파골세포의 분화를 모두 용량별로 억제함을 알 수 있다.

실시예 4

펩타이드 P1의 파골세포 분화 억제능: 골수세포의 배양

실시예 3에서 수행한 골수세포와 조골세포의 상호배양 실험에서는 펩타이드 P1이 조골세포에 영향을 미쳐 간접적으로 파골세포의 분화를 억제할 수도 있기 때문에 본 실시예에서는 골수세포만을 분리하여 재조합 단백질 ODF를 처리한 후 펩타이드 P1의 분화 억제능을 관찰하였다. 실시예 3과 동일한 방법으로 분리한 골수세포를 웰당 4×10⁵개가 되도록 조절하여 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 48웰 배양접시에 배양하였다. 이때 ODF (50 ng/ml), M-CSF (30 ng/ml)를 처리 후 펩타이드 P1을 20 nM, 4 nM, 2 nM의 농도가 되도록 처리하였다. 배양 3일 후 배지를 교환할 때 동일하게 ODF와 M-CSF를 처리하고 P1을 동일하게 처리하였다. 배양 6일 후 동일하게 배지를 교환하고, 2일 더 배양하였다.

분화가 완료된 파골세포는 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 염색에 의해 확인하였다. TRAP 염색은 LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT(Sigma, cat. No. 387-A)를 사용하였다. 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거한 후에 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% 트립톤(Triton) X-100을 10초 동안 처리하였다. 그 후 트립톤 X-100 용액을 제거하고 키트에 있는 TRAP 염색용액을 약 5분 동안 처리한다. TRAP 염색용액 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시킨다. TRAP 양성인 파골세포의 수를 광학현미경 100배에서 산정하였다.

실험결과, 실시예 3의 상호배양과 실시예 5의 파골세포 전구세포를 배양했을 때와는 달리 주로 단핵파골세포가 나타났다. 대조군의 경우에 TRAP 양성 세포의 수는 453±67.5 개 로 나타났다. 이에 비해 본 발명 펩타이드 P1을 20nM 처리한 경우 파골세포의 수가 255±17.52개로 나타났으며, 4nM, 2nM 처리한 경우 단핵파골세포의 수가 각각 274.3±35.79개, 383±45.9개로 나타났다(도 3). 따라서, 펩타이드 P1은 골수세포에서 ODF 처리에 의하여 파골세포 분화과정 중 단핵파골세포와 다핵파골세포의 분화를 모두 용량별로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 5

펩타이드 P1의 파골세포 분화 억제능: 파골세포 전구세포(osteoclast precusor cells)에 대한 분화 억제능

골수세포에서 기원하는 파골세포 전구체는 최종적으로는 뼈로 이동하여 파골세포 전구세포로 된 후 좀더 분화를 하여 흡수기능이 있는 활성상태의 파골세포로 분화하여 그 기능을 발휘한다. 즉, 뼈에 존재하는 파골세포 전구세포는 파골세포와 분화의 단계가 다르다고 할 수 있다. 최근에 파골세포의 분화에 매우 중요한 싸이토카인이 ODF (OPGL 혹은 RANKL)라는 것이 밝혀지고 재조합단백질의 생산이 가능하여 일차배양을 통한 파골세포의 분화가 매우 용이하게 되었다.

뼈에서 분리한 파골세포 전구세포를 재조합 단백질인 ODF로 처리한 후 이 단계에서 합성 펩타이드 P1의 파골세포 전구세포에 대한 분화 억제능을 조사하였다. 파골세포 전구세포는 마우스 장골로부터 분리하였다. 5주 내지 6주령인 암컷 ICR 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 70% 에탄올로 뒷다리 부위를 소독한 다음 경골 (tibia)과 대퇴골(femur)을 무균적으로 분리하였다. 분리한 경골과 대퇴골은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 연조직을 제거한 다음 3X HBSS(Gibco BRL)를 골수에 수회 주입하여 골수세포를 제거하였다. 수술용 가위로 뼈를 작은 조각으로 자른후에 콜라젠분해효소가 함유된 효소액 (1mg/ml collagenase type II, 0.05% trypsin, 4 mM EDTA, Gibco BRL)이 들어있는 배양접시에 넣어 37℃에서 15분간 5회 처리하였다. 이때 3회 처리 후에 뼈조각을 한번 더 잘게 잘랐다. 효소 처리 후 3XHBSS로 5회 수세, 원침하여 효소액을 모두 제거한 후 냉각된 α-MEM에 현탁시키고 얼음위에서 15분간 방치하였다. 1분간 혼합(vortexing) 하고 동량의 냉각된 α-MEM을 첨가한 후 얼음위에서 15분간 방치하였다. 현탁액을 멸균된 그물망을 통과시켜 세포 성분만 얻고 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 배양하였다.

상기 분리 및 배양한 파골세포 전구세포를 웰당 0.5^-1×10^-6개가 되도록 조절 하여 10% FBS가 함유된 α-MEM으로 48웰 배양접시에서 배양하였다. 이때 ODF (100 ng/ml), M-CSF (30 ng/ml)를 처리한 후 펩타이드 P1을 각각 20 nM, 4 nM, 2 nM의 농도가 되도록 처리하였다. 펩타이드 P1을 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다. 배양 3일 후 배지를 교환할 때 동일하게 ODF와 M-CSF를 처리하고 펩타이드 P1을 상기와 동일하게 처리하였다. 배양 6일 후 동일한 방법으로 배지를 교환하고, 배양 9일 후 TRAP 염색하여 TRAP 양성인 파골세포의 수를 광학현미경(X100)으로 산정한다. 이때 핵이 10개 이상인 것을 다핵파골세포 (multinucleated osteoclast)로 핵이 10개 이하인 것을 단핵파골세포 (mononuleated osteoclast)로 지정하여 각각을 산정하였다.

실험결과, 대조군의 경우에 TRAP 양성 세포의 수는 단핵파골세포는 224 ±48.5개, 다핵파골세포는 97.66±7.57개로 나타났다. 이에 비해 본 발명 펩타이드 P1을 20nM 처리한 경우 파골세포가 검출되지 않았으며 4nM 처리한 경우 단핵파골세포 및 다핵파골세포의 수가 각각 126.3±22.66개, 40.45±11.59개로 나타났으며, 2nM로 처리한 경우 단핵파골세포 및 다핵파골세포의 수가 각각 121.33±26.66개, 53.15±10.12개로 나타났다 (도 4). 따라서, 펩타이드 P1은 뼈에서 분리한 파골세포 전구세포의 분화과정에 있어서 단핵파골세포와 다핵파골세포의 분화를 모두 용량별로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 6

펩타이드 P1의 세포독성 실험

펩타이드 P1이 세포에 독성을 미치는 지 여부를 확인하기 위하여 각종 세포에서 MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 시행하였다.

MTT 분석에는 상기 실시예 3에서 분리한 조골세포와 마우스 골수세포, 복강 대식세포 및 인간배신장세포주인 293T을 사용하였다. 상기 세포를 각각 웰당 1.5×10⁴개, 1×10⁵개, 1×10⁵개, 1.5×10⁴개가 되도록 조절하여 96웰 배양접시에 분주하였다. 상기 분주한 세포에 펩타이드 P1을 20 nM, 4 nM, 2 nM의 농도로 처리한 후 배양하였다. 배양 24시간 후에 MTT분석 혼합액(MTT labeling reagent 1ml과 electron coupling reagent 0.2ml의 혼합)을 각 웰에 50㎕씩 첨가하였다. 4시간 상온에서 배양 후 효소면역분석 리더(ELISA reader, Bio-Tek Instrument, Winooski, VT)를 사용하여 파장 450과 630 nM에서 측정하였다. 이상의 실험은 3회반복하였다.

실험결과, 펩타이드 P1은 조골세포, 골수세포, 복강 대식세포 및 293T 세포주에서 모두 세포독성을 나타내지 않았다 (도 5 내지 도 8).

실시예 7

펩타이드 P1이 JNK의 활성에 미치는 영향

세포의 분화 및 증식에 MAP 키나제(kinase)가 관여한다는 보고에 따라, MAP 키나제의 하나인 c-Jun NH₂-말단 키나제(c-Jun NH₂-terminal kinase, JNK)의 활성에 펩타이드 P1이 미치는 영향을 조사하기 위해 JNK 키나제 분석(kinase assay)을 시행하였다.

실시예 3의 조골세포와 골수세포를 콜라젠 젤이 코팅된 배양접시에서 각각의 세포수가 1×10⁶개, 1×10⁷개가 되도록 조절하여 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 상호배양(coculture)하였다. 이때 비타민 D₃(10^-8), PGE 2(10^-6)를 같이 첨가하였다. 3일 후 배지를 교환하고 3일간 더 배양한 후 0.2% 콜라젠 분해효소를 처리하여 모든 세포를 떼어내어 6웰 배양접시에 옮겨 배양하였다. 다음날 0.1% 콜라겐분해효소를 처리하여 조골세포를 떼어내고 순수한 파골세포만을 획득하였다.

순수한 파골세포에 펩타이드 P1 (20 nM), ODF (500 ng/ml), 그리고 TNF (100ng/ml)를 처리하였다. 이때 조골세포를 제거하고 약 1시간 후 P1을 30분 전처리하고 ODF 또는 TNF를 30분 처리한 후 인산완충용액으로 수세한 다음 파골세포를 수집하였다. 수집된 파골세포에 용해 완충용액(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 용해하고 단백질 정량을 하였다. 키나제 분석(Kinase assay)은 단백질 A 아가로스 비드 (protein A agarose bead, Pierrce)에 항-JNK 항체를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 럭킹(rocking)하였다. 상기 비드를 용해 완충용액으로 2회 수세, 원침 (3000rpm, 4min)한 다음, 비드에 상기에서 준비한 파골세포 용해액을 첨가한 후 하룻밤동안 럭킹하였다. 럭킹후 비드를 용해 완충용액으로 2회 수세, 원침 (3000rpm, 4min)하였다. 키나제 분석 완충용액(kinase assay buffer)으로 2회 수세, 원침 (3000rpm, 4min)하고, 비드에 키나제 반응 혼합물(γ³²P-ATP-1㎕, 1mM ATP-1.5㎕, c-Jun-1㎍에 1× kinase buffer로 최종 용적이 10 ㎕로 조절)를 넣고 30℃에서 30분간 반응을 시켰다. 여기에 3×시료 완충용액(sample buffer)을 15 ㎕ 첨가하고 5분간 끓인 후에 전기영동하여 젤을 건조하였다. 전기영동 결과, 형성된 각 밴드의 정량적 분석을 위해 포스포이미저(Phosphoimager, BAS1500, Fuji film)로 결합한 방사선 동위원소의 양을 cpm으로 측정하였다.

실험결과, 파골세포의 분화에 있어서 펩타이드 P1 단독 혹은 TNF-α를 단독 처리한 경우 JNK의 활성에 영향을 주지 않았다. 반면, 파골세포 분화 유도 인자인 ODF와 펩타이드 P1을 함께 처리한 경우에는 JNK의 활성이 저해되는 것을 확인하였다. 이는 JNK가 ODF에 의해 활성화되는 것을 펩타이드 P1이 강력하게 억제하는 것을 시사하는 것이다. 따라서, 펩타이드 P1은 JNK의 신호전달경로에 관여하는 것으로 이해된다 (도 9).

실시예 8

핵전사인자인 NF-kB에 펩타이드 P1이 미치는 영향

파골세포의 분화에 관여하는 핵전사인자인 NF-kB의 활성에 펩타이드 P1이 미치는 영향을 조사하였다.

펩타이드 P1에 의한 핵전사인자 NF-kB 활성 억제능은 EMSA (electrophoresis mobility shift assay)를 수행하여 조사하였다. 파골세포는 실시예 6과 같이 준비하여 저장 용해 완충용액(hypotonic lysis buffer; 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF)에서 10분간 얼음위에서 배양하였다. 배양물은 미세원심분리용(microcentrifuge) 튜브에 옮기고 NP-40를 0.1%가 되도록 첨가한 후 간헐적으로 진탕을 하면서 15분간 배양하였다. 상기 배양액을 원침 (4,000 rpm, 15분)한 다음, 세포 덩어리에 15 μl의 고염완충용액(high salt buffer; 20 mM HEPES, pH 7.9, 420 mM NaCl, 25% glycerol, 1.5 mM MgCl2 , 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT)을 첨가하여 얼음 위에서 20분간 배양하였다. 여기에 75 μl의 보관 완충용액(storage buffer; 20 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM NaCl, 20% glycerol, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT)을 첨가하고 10초간 진탕한 다음 원침 (14,000 rpm, 20분)하고 상청액을 취하여 단백질 정량을 실시하였다. 단백질 정량은 DC 단백질 분석 키트(DC Protein Assay Kit; Bio-Rad)를 사용하였다.

NF-kB 부위 결합 올리고머(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3', Santa Cruz)는γ-P32 ATP와 Klenow 효소로 표지하여 프로브로 준비하였다. 10μg의 단백질에 표지된 프로브를 1μg poly(dIdC)가 함유된 20μl의 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 2 mM DTT)을 약 20,000 cpm이 되도록하여 첨가하고 상온에서 30분간 반응시켰다. DNA와 결합된 단백질을 4-5% 폴리아크리라마이드젤에서 전기영동하고 건조시켜 자기방사선법을 시행하였다.

실험 결과, 파골세포 분화 유도 인자인 ODF가 핵전사인자인 NF-kB를 활성화하는 것을 펩타이드 P1이 억제함을 알 수 있었다(도 10).

본 발명의 펩타이드 P1은 파골세포의 분화를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 뼈의 과다한 파괴가 문제되는 골 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 펩타이드는 파골세포의 분화 또는 분화를 억제하는 분자생물학적 기작을 연구하는 데 유용한 재료로 사용될 수 있다.

Claims

아미노산의 부가, 결실 또는 치환의 결과, 서열번호 3으로 표시되는 펩타이드 P1과 70% 이상의 서열 상동성을 보이며, 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 펩타이드.
세크로핀A의 1번부터 8번까지의 아미노산, 마가이닌2의 4번부터 7번까지의 아미노산 및 마가이닌2의 9번부터 12번까지의 아미노산을 포함하며, 서열번호 3으로 표시되는 펩타이드 P1과 70% 이상의 서열 상동성을 가지고, 파골세포의 분화를 억제하는 능력을 갖는 펩타이드.
서열번호 3으로 표시되는 펩타이드 P1 또는 그의 염.
서열번호 3으로 표시되는 펩타이드 P1을 코드하는 핵산서열.
제1항의 내지 제3항의 펩타이드를 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 고상 합성법에 의하여 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 골대사성 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 약학 조성물.
제7항에 있어서, 골대사성 질환이 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소 (bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양 (예, multiple myeloma), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병 (Paget's disease) 중에서 선택된 것인 약학조성물.
제7항에 있어서, 치주질환의 치료제는 서방형 약물전달체 (delayed delivery substance: DDS) 또는 치과임프란트체에 DDS를 이용하여 코팅한 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제3항의 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 치약 또는 구강청정제.