ES2316356T3 - Peptidos sinteticos complementarios y sus utilizaciones oftalmologicas. - Google Patents
Peptidos sinteticos complementarios y sus utilizaciones oftalmologicas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2316356T3 ES2316356T3 ES00913818T ES00913818T ES2316356T3 ES 2316356 T3 ES2316356 T3 ES 2316356T3 ES 00913818 T ES00913818 T ES 00913818T ES 00913818 T ES00913818 T ES 00913818T ES 2316356 T3 ES2316356 T3 ES 2316356T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- rtr
- complementary
- peptide
- pgp
- proline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
- C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
- C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Una composición farmacéutica para utilizaciones oftalmológicas que comprende un péptido complementario que tiene una secuencia complementaria a la prolina-glicina-prolina (PGP), en la que dicha composición comprende un polímero RTR.
Description
Péptidos sintéticos complementarios y sus
utilizaciones oftalmológicas.
La presente invención se refiere generalmente a
la farmacología bioquímica de agentes oftalmológicos. Más
específicamente, la presente invención se refiere a péptidos
complementarios sintéticos y a sus utilizaciones
oftalmológicas.
La lesión por álcali del ojo provoca una
reacción inflamatoria aguda, compuesta en gran medida por leucocitos
polimorfonucleares (PMN), que son responsables de ulceraciones y
perforaciones de la córnea^{1-3}. Los cebos
químicos neutrófilos N-acetil-PGP y
N-metil-PGP liberados durante la
hidrólisis alcalina directa de las proteínas de la córnea, son los
desencadenantes iniciales de la invasión de leucocitos
polimorfonucleares en la córnea lesionada por
álcalis^{4-6}. La actividad específica de
N-acetil-PGP es mayor que la del
tripéptido metilado^{4}.
En reconocimiento de que el
N-acetil-PGP es un mediador
importante en la enfermedad ha abierto una ventana terapéutica de
oportunidades. La inhibición precoz de este cebo químico en un ojo
lesionado por álcali puede reducir o eliminar el primer influjo
neutrófilo. Minimizando el número de neutrófilos inicialmente que
penetran en la córnea dañada se limitaría la producción de los
mediadores inflamatorios secundarios, tales como el leucotrieno
B_{4}, reduciendo en consecuencia la regeneración adicional de los
leucocitos polimorfonucleares. La exclusión de neutrófilos de la
córnea lesionada por álcalis es la clave para disminuir o eliminar
la ulceración de la córnea. Por consiguiente es de la mayor
importancia investigar compuestos principales que puedan inhibir
este cebo químico.
Un método para el desarrollo de un compuesto
inhibidor principal puede encontrarse en la teoría del
reconocimiento molecular^{7}.Este concepto propone como principio
que un requisito fundamental para las reacciones biológicas
consiste en que las moléculas proteicas reconocen una a otra de
manera genéticamente definida. Blalock y Smith^{8} propusieron un
nuevo método para el reconocimiento molecular que ha tenido éxito en
la predicción de las interacciones de moléculas proteicas con mucha
frecuencia. Este método, basado en el desarrollo de péptidos
complementarios especificados por el ARN complementario del
ligando, ha demostrado ser útil para diseñar péptidos interactivos,
receptores aislantes y anti-receptores productores y
anticuerpos antiidiotípicos^{9,10}.
Por lo tanto, la técnica anterior es
insuficiente en péptidos complementarios sintéticos para tratar
trastornos oftalmológicos. La presente invención completa esta
necesidad existente desde hace tiempo en la técnica.
La presente invención demuestra una aplicación
de la teoría de reconocimiento molecular, que es la generación de
agentes terapéuticos que pueden utilizarse para tratar la
enfermedad. Utilizando este método, se diseñaron, sintetizaron y
probaron una serie de péptidos complementarios para la secuencia
pro-gly-pro como antagonistas del
cebo químico de PMN,
N-acetil-PGP.
En una forma de realización de la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica para
utilizaciones oftalmológicas. Específicamente, dicha composición es
un péptido complementario que comprende secuencias complementarias
para prolina-glicina-prolina (PGP).
Generalmente, las secuencias complementarias se diseñan basándose en
el posible triplete de codificación para prolina y glicina y en el
valor hidropático de los dos aminoácidos. El aumento de la potencia
de la secuencia complementaria se consiguió con un procedimiento de
polimerización. La molécula resultante puede dividirse en 4
subunidades específicas, conectadas por enlaces amida con diferentes
funciones: 1) subunidad de reconocimiento 2) subunidad
polimerizante del núcleo 3) subunidad espaciadora y 4) subunidad R
N-terminal.
Subunidad de reconocimiento: secuencia
complementaria a Pro-Gly-Pro, esta
subunidad es responsable de la interacción con el cebo químico. La
subunidad de reconocimiento está presente como unidad individual en
el monómero, se repite dos veces en el dímero, 4 veces en el
tetrámero y 8 veces en el octámero. Se define mediante la secuencia
todo-L Arg-Thr-Arg y
mediante la secuencia completa todo-L
Xxx-Thr-Arg (Xxx = los 20
aminoácidos naturales) y por todo-D
Arg-Thr-Arg y todo-D
Xxx-Thr-Arg (Xxx = los 20
aminoácidos naturales).
La subunidad polimerizante del núcleo, ausente
en los monómeros lineales, se caracteriza por un diaminoácido con
ramificación (lisina, ácido diamino propiónico, ácido diamino
butírico) conectado a la única alanina, donde ambos grupos amino
están implicados en un enlace amida. La función del núcleo es
determinar el número de unidades de reconocimiento en la molécula y
controlar la distribución espacial relativa de las subunidades de
reconocimiento. El núcleo representa también el punto de conexión
con la resina durante la síntesis de péptidos en fase sólida. El
núcleo octamérico está definido por la fórmula
todo-L
(((B)_{2}B)_{2})B-Ala, el
tetrámero por todo-L
(B)_{2}B-Ala y el dímero por
todo-L B-Ala (en la que B = lisina,
ácido diamino propiónico y ácido diamino butírico). El núcleo se
obtuvo también con los aminoácidos todo-D con las
mismas fórmulas genéricas.
\newpage
Los espaciadores representan el punto de
conexión entre el núcleo y las subunidades de reconocimiento y
determina la distribución espacial relativa de las subunidades de
reconocimiento. Puede estar constituido por una diglicina. La
diglicina podría estar sustituida por un solo aminoácido con la
fórmula: NH_{2}[CH_{2}]_{n}-COOH
[n=2[ácido 3-aminopropiónico]; 3; 4; 5; 6 ó 7[ácido
8-aminocaprílico]].
Subunidad R-terminal: un grupo
terminal amino libre en cada subunidad de reconocimiento no es
necesario para la función de la subunidad. Este grupo puede estar
funcionalizado por una molécula R para modificar las propiedades
dinámicas del fármaco de la molécula y para producir una molécula
más forzada. El R puede ser
H_{3}C-(CH_{2})_{n}-CO con n=0
(acetil), n=4 (caproíl) y n=14 (palmitoleíl). R puede ser también el
aminoácido cisteína. En el caso del péptido tetrámero los grupos
azufre pueden utilizarse para la formación de un puente de disulfuro
intramolecular, generando una molécula bicíclica forzada.
En otra forma de realización de la presente
invención, se proporciona la utilización de una composición
farmacéutica de la presente invención para inhibir la polarización
de leucocitos polimorfonucleares, la quimiotaxia y la infiltración
en el tejido activado por un cebo químico neutrófilo.
Preferentemente el cebo químico neutrófilo se selecciona del grupo
consistente en N-acetil-PGP,
N-acetil-PGX,
N-metil-PGX,
N-metil-PGP y pequeños cebos
químicos peptídicos que contienen prolina y glicina. Incluso
preferentemente, la composición farmacéutica se administra en un
intervalo de concentración desde aproximadamente 1 \muM hasta
aproximadamente 100 mM, dependiendo del péptido.
Incluso en otra realización de la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica para tratar
una enfermedad ocular.
Preferentemente, la composición farmacéutica se
administra en un intervalo de concentración desde aproximadamente 1
\muM a aproximadamente 100 mM, dependiendo del péptido. Las
enfermedades oculares representativas que pueden tratarse
utilizando este procedimiento de la presente invención, incluyen el
ojo lesionado por álcalis, el ojo lesionado químicamente o
enfermedades inflamatorias del ojo que son bien conocidas por los
expertos en esta materia.
Otros y más aspectos, características y ventajas
de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente
descripción de las formas de realización actualmente preferidas de
la invención. Estas formas de realización se dan a título de
exposición.
Para que la materia en la que las
características, ventajas y objetivos relacionados anteriormente de
la invención, así como otros que serán evidentes, se alcancen y
pueden entenderse con detalle, pueden hacerse más descripciones
específicas de la invención resumidas brevemente con anterioridad
haciendo referencia a determinadas de sus formas de realización que
se ilustran en las formas de realización adjuntas preferidas de la
invención y por consiguiente no se consideran limitativas del
alcance.
La Figura 1 demuestra la estructura polimérica y
los pesos moleculares de los péptidos complementarios que han sido
probados.
El cebo químico neutrófilo,
N-acetil-PGP, desempeña una función
principal en el inicio de la invasión por leucocitos
polimorfonucleares (PMN) en el ojo lesionado por álcali. En el
estudio actual, se utilizó metodología
transcrita-complementaria para desarrollar péptidos
complementarios como inhibidores potenciales de
N-acetil-PGP. Se utilizó el ensayo
de polarización para medir la respuesta quimiotáctica potencial de
leucocitos polimorfonucleares al
N-acetil-PGP sintético, los cebos
químicos tripeptídicos ultrafiltrados obtenidos a partir de córneas
de conejo degradadas con álcali, o leucotrienos B_{4}. La
inhibición se expresó como la concentración de péptido requerida
para producir 50% de inhibición (ID_{50}) de polarización. Se
probaron cinco péptidos complementarios como inhibidores
potenciales de N-acetil-PGP: RTR,
RTRGG, dímero RTR, tetrámero RTR y tetrámero ASA. Además, se
analizó, independientemente, el tetrámero RTR y ambos péptidos
monoméricos (RTR y RTRGG), de cebos químicos tripeptídicos
ultrafiltrados de LTB_{4}.
El péptido tetramérico RTR complementario fue un
antagonista potente de la polarización de leucocitos
polimorfonucleares inducida por
N-acetil-PGP (ID_{50} de 200 nM).
El dímero RTR fue mucho menos potente (ID_{50} de 105 \muM).
Ambos péptidos monoméricos, RTR y RTRGG, eran solamente antagonistas
a concentraciones milimolares. El tetrámero ASA no presentaba
capacidad para inhibir a
N-acetil-PGP. El tetrámero RTR
inhibió también la activación del leucocito polimorfonuclear por
los cebos químicos tripeptídicos ultrafiltrados (ID_{50} de 30
\muM), pero no tuvo ningún efecto sobre LTB_{4}. Se diseñó un
péptido complementario (RTR) que es un inhibidor eficaz del cebo
químico neutrófilo, N-acetil-PGP. La
potencia del péptido aumenta drásticamente por tetramerización. La
inhibición de este cebo químico en el ojo lesionado por álcali por
péptidos complementarios es muy prometedor para el control de la
respuesta inflamatoria que se espera a dichas lesiones.
En una realización, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica para utilizaciones
oftalmológicas. Específicamente, esta composición es un péptido
complementario que comprende secuencias complementarias a
prolina-glicina-prolina (PGP), en la
que dicha composición comprende un polímero RTR. Generalmente, las
secuencias complementarias se diseñan basándose en el posible
triplete de codificación para la prolina y glicina y en el valor
hidropático de los dos aminoácidos. El aumento de la potencia de la
secuencia complementaria se consiguió con un procedimiento de
polimerización. La molécula resultante puede dividirse en 4
subunidades específicas, conectadas por enlaces amida con
diferentes funciones: 1) subunidad de reconocimiento, 2) subunidad
de polimerización del núcleo, 3) subunidad espaciadora y 4)
subunidad R N-terminal.
Subunidad de reconocimiento: la secuencia
complementaria a Pro-Gly-Pro, esta
subunidad es responsable de la interacción con el cebo químico.
Está presente en una sola unidad en el monómero, se repite dos veces
en el dímero, 4 veces en el tetrámero y 8 veces en el octámero. La
subunidad de reconocimiento está definida por la secuencia
Todo-L Arg-Thr-Arg y
por la secuencia Todo-L
Xxx-Thr-Arg (Xxx = los 20
aminoácidos naturales), y por D completa
Arg-Thr-Arg y D completa
Xxx-Thr-Arg (Xxx = los 20
aminoácidos naturales).
La subunidad de polimerización del núcleo,
ausente en los monómeros lineales, se caracteriza por un
diaminoácido con ramificación (lisina, ácido diaminopropiónico,
ácido diaminobutírico) conectada a una sola alanina, en la que
ambos grupos amino están implicados en un enlace amida. La función
del núcleo consiste en determinar el número de unidades de
reconocimiento en la molécula y en controlar la distribución
espacial relativa de las subunidades de reconocimiento. El núcleo
representa también el punto de conexión a la resina durante la
síntesis de péptidos en fase sólida. El núcleo octamérico está
definido por la fórmula Todo-L
(((B)_{2}B)_{2})B-Ala, el
tetrámero por la Todo-L
(B)_{2}B-Ala y el dímero por la
Todo-L B-Ala (donde B = lisina,
ácido diamino propiónico y ácido diamino butírico). El núcleo se
obtuvo también con los aminoácidos Todo-D con las
mismas fórmulas genéricas.
Los espaciadores representan el punto de
conexión entre el núcleo y las subunidades de reconocimiento y
determina la distribución espacial relativa de las subunidades de
reconocimiento. Puede estar constituido por una
di-glicina. La di-glicina puede
sustituirse por un único aminoácido de fórmula:
NH_{2}[CH_{2}]_{n}-COOH
[n=2[ácido 3-aminopropiónico]; 3; 4; 5; 6; o
7[ácido 8-aminocaprílico]].
Subunidad R-terminal: Un grupo
terminal amino libre en cada subunidad de reconocimiento no es
necesario para la función de la subunidad. Este grupo puede estar
funcionalizado por una molécula R para modificar las propiedades
farmacodinámicas de la molécula y para producir una molécula más
forzada. El R puede ser
H_{3}C-(CH_{2})_{n}-CO con n=0
(acetil), n=4 (caproil) y n=14 (palmitoleil). R puede ser también el
aminoácido cisteína. En el caso del péptido tetrámero los grupos
azufre pueden utilizarse para la formación de un puente disulfuro
intramolecular, que genera una molécula bicíclica forzada.
En otra forma de realización de la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica para
utilizaciones oftalmológicas que comprende un péptido
complementario que tiene una secuencia complementaria a la
prolina-glicina-prolina (PGP), en
la que dicho péptido comprende RTR, para inhibir la polarización de
leucocitos polimorfonucleares, la quimiotaxia y la infiltración en
el tejido activada por un cebo químico neutrófilo.
Se proporciona también la utilización de un
péptido complementario con una secuencia complementaria a la
prolina-glicina-prolina (PGP), en
la que dicho péptido comprende RTR, para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la polimerización por leucocitos
polimorfonucleares, la quimiotaxia y la infiltración en el tejido
activada por un cebo químico neutrófilo. Los cebos químicos
neutrófilos representativos incluyen
N-acetil-PGP,
N-acetil-PGX,
N-metil-PGX,
N-metil-PGP y pequeños cebos
químicos peptídicos que contienen prolina y glicina. Incluso
preferentemente, la composición farmacéutica se administra en un
intervalo de concentración desde aproximadamente 1 \muM a
aproximadamente 100 \muM, dependiendo del péptido.
Incluso en otra forma de realización de la
presente invención, se proporciona una composición farmacéutica
reivindicada para tratar una enfermedad ocular.
Se proporciona también la utilización de un
péptido complementario que tiene una secuencia complementaria a la
prolina-glicina-prolina (PGP), en la
que dicho péptido comprende un polímero RTR, para la preparación de
un medicamento destinado a tratar una enfermedad ocular.
Preferentemente, la composición farmacéutica se administra a un
intervalo de concentración desde aproximadamente 1 \muM a
aproximadamente 100 \muM, dependiendo del péptido. Incluso
preferentemente, la enfermedad ocular puede ser el ojo lesionado por
álcali, el ojo lesionado químicamente o la enfermedad inflamatoria
de los ojos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "polímero" se referirá a un dímero, tetrámero u
octámero.
Los ejemplos siguientes se dan a título
ilustrativo de varias realizaciones de la invención y no significa
que limiten la presente invención en modo alguno:
Se adquirió solución salina equilibrada de Hanks
(HBSS) en Gibco Laboratories (Chagrin Falls, OHJ). El cloruro de
calcio, cloruro magnésico, cloruro sódico, fosfato sódico monobásico
y fosfato sódico dibásico, el glutaraldehído y Ficoll (tipo 400) se
adquirieron en Sigma Chemical Co (St. Louis, MO).
Hypaque-76 se adquirió en Winthrope Laboratories
(Nueva York, NY). El leucotrieno B_{4} (LTB_{4}) se adquirió en
Biomol Research Laboratories (Plymouth Meeting, PA). Los
aminoácidos y resinas utilizados en la síntesis de proteína fueron
de Perseptive Biosystem (Framingham, MA).
N,N-dimetilformamida, cloruro de metileno y otros
disolventes utilizados en la síntesis fueron de Fisher Scientific
(Fair Lawn, NJ).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron secuencias complementarias a PGP
basándose en el posible triplete de codificación para la prolina y
la glicina y en el valor hidropático de éstos dos aminoácidos. La
glicina es un aminoácido ligeramente hidrófilo y normalmente
complementado por serina o treonina. Las características
hidropáticas de la prolina no están bien definidas. En la escala de
Kyte y Doolittle^{11}, la prolina se considera un aminoácido
ligeramente hidrófilo, sin embargo la característica estructural de
la cadena lateral de la prolina debería comunicar un carácter más
hidrófobo. Esto se refleja en la escala de Akamatsu y Fujita^{12},
en la que el valor hidrófobo está próximo a otros aminoácidos
hidrófobos, exactamente entre la alanina y la metionina.
Se sintetizaron dos péptidos complementarios
diferentes, reflectantes de estos dos posibles características
hidropáticas de prolina. Una prolina ligeramente hidrófila está
complementada mejor por la alanina, por eso se seleccionó la
secuencia ASA. Una prolina hidrófoba está mejor complementada
genéticamente por arginina y se seleccionó RTR. Para aumentar la
afinidad potencial para
N-acetil-PGP, se sintetizaron
péptidos complementarios en formas poliméricas, partiendo de un
núcleo de polilisina, y se espaciaron del núcleo con dos glicinas.
Se sintetizaron también las secuencias RTR y RTRGG lineales
individuales para verificar la especificidad de la secuencia RTR en
los péptidos poliméricos (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron péptidos complementarios
utilizando síntesis de péptidos en fase sólida según la metodología
Fmoc en un sintetizador de péptidos 9050 de Perseptive Biosystem. Se
sintetizaron péptidos lineales utilizando una resina de
poliestireno injertada con amida-polietilenglicol
(PEG-PS) y aminoácidos preactivados con éster
O-pentafluorofenílico. Se sintetizaron péptidos ramificados
partiendo de una resina
Fmoc-alanina-PEG-PS,
con uno o dos ciclos de acoplamiento activados con HATU/DIPEA. El
reactivo de desprotección de Fmoc fue DBU al 1%, piperidina al 1%
en dimetilformamida. Los péptidos se escindieron de las resinas
añadiendo 10 ml de ácido trifluoroacético
(TFA)/fenol/tioanisol/H_{2}O/etanditiol 93/2/2/2/1 y se incubaron
a temperatura ambiente durante 5 horas. Las mezclas se filtraron y
los péptidos precipitaron en éter etílico frío. Los precipitados se
recogieron y se disolvieron en H_{2}O para liofilización. Todos
los péptidos se purificaron por cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa (RP-HPLC), utilizando una
Dynamax RP C18 (300\times10 mm d.i.) y equilibrada a 3 ml/min.
utilizando un gradiente lineal de CH_{3}CN de 5% a CH_{3}CN al
60% en TFA al 0,1% en 40 minutos. Las fracciones que contienen el
péptido se acidificaron con HCl 1 N para ayudar a la eliminación de
TFA y se liofilizaron. Se confirmó la identidad del péptido por
espectroscopía de masas de ionización con desorción por láser
asistida por la matriz de tiempo de vuelo. Se confirmó la pureza por
RP-HPLC analítica.
Para la síntesis a gran escala de
N-acetil-PGP, se utilizó un
procedimiento alternativo para aumentar el rendimiento del
producto. En este procedimiento, se acopló el dipéptido
t-Boc-PG a la resina
Pro-Merrifield utilizando el procedimiento con
diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Tras
la eliminación de la protección del N-terminal y la
acetilación utilizando anhídrido acético, el péptido se separó de la
resina utilizando ácido fluorhídrico anhidro. Se purificó el
producto en una columna con gel de sílice utilizando cloroformo:
metanol (90:10 v/v) como eluyente. La homogeneidad se confirmó por
RP-HPLC en una columna analítica Vydac C18
equilibrada a un caudal de 1,2 ml/min. y eluida con un gradiente
lineal de 0% a 30% de acetonitrilo en agua (ácido trifluoroacético
al 0,1%) en 30 minutos. Se confirmó la identidad del péptido por
espectrometría de masas por electroatomización
(Perkin-Elmer-Sciex
API-3). Se realizó análisis cuantitativo de
aminoácidos para presentar la relación correcta de los aminoácidos
y para determinar el contenido en péptido para el cálculo de la
concentración final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió LTB_{4} en etanol y se diluyó con
HBSS (pH 7,3) hasta una concentración final de etanol de 0,001%.
Los péptidos complementarios sintéticos y los cebos químicos
sintéticos se disolvieron en HBSS (pH 7,3). Cuando fue necesario,
se ajustó la osmolalidad entre 280 y 320 mOsm añadiendo una pequeña
cantidad de agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron cebos químicos tripeptídicos
ultrafiltrados de córneas de conejo degradadas con álcali. Se
extirparon los fondos de la córnea de los ojos de conejo
(Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR) utilizando un
trépano de 11 mm. Basándose en un peso medio en seco de 1 1
mg/córnea en un experimento preliminar, se colocaron las córneas en
una cantidad conocida de NaOH 1,0 N (83,34 mg de peso en seco de
córnea/ml de álcali, 1:12) durante 24 horas a 37ºC. La suspensión
resultante se valoró a pH 7,4 con HCl 1,0 N. Esto proporcionó un
extracto en bruto que contenía 41,67 mg de peso en seco de
córnea/ml de álcali neutralizado. En resumen, la técnica de
purificación implicaba la ultrafiltración (membranas con corte a
peso molecular 30.000, 3.000 y 1.000 en la secuencia) y diálisis
(membrana con corte a 100 P_{m}) de este extracto en bruto^{4}.
El ultrafiltrado final se liofilizó y se disolvió el polvo en HBSS
hasta una concentración final de 83,34 mg de peso en seco de
córnea/ml. Esta concentración estaba basada en los mg originales de
peso en seco de córnea expuestos al álcali.
Según un estudio anterior^{4}, la muestra cebo
químico ultrafiltrada se componía de pequeños péptidos entre 100 y
1.000 de P_{m}. Los únicos cebos químicos en este ultrafiltrado
fueron N-acetil-PGP y
N-metil-PGP. Se observo que la
actividad específica de N-acetil-PGP
era superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos siguieron los principios de
la declaración de Helsinki y fueron aprobados por el comité de
investigación humano en el Brookwood Medical Center. Todos los
donantes firmaron formas de consentimiento por escrito que
explicaban la naturaleza y posibles consecuencias del estudio. Se
recogió sangre de un donante solamente cada día.
Siguiendo la técnica de Ferrante y Thong^{13},
se aislaron leucocitos polimorfonucleares de la sangre completa
humana heparinizada reciente por centrifugación en
Hypaque-Ficoll (densidad=1,114) según el
procedimiento descrito^{14}. Se volvieron a poner en suspensión
los leucocitos polimorfonucleares aislados (viabilidad del 96 al
99%) en HBSS con tampón fosfato 15 mM a temperatura ambiente y se
agitaron suavemente con un agitador. La pureza de esta suspensión
celular fue \geq 85% de leucocitos polimorfonucleares, \leq 5%
de células mononucleares y plaquetas, consistiendo el porcentaje
restante en glóbulos rojos. Se utilizaron leucocitos
polimorfonucleares purificados en el ensayo de polarización. Todas
las mezclas de incubación se mantuvieron entre una osmolalidad de
280 a 320, un intervalo de pH de 7,2 a 7,6, tampón fosfato 15 mM y
Ca^{2+} 50 \muM y Mg^{2+} 50 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios anteriores utilizando ensayo
quimiotáctico visual con gel de colágeno^{4} han demostrado que
N-acetil-PGP es un cebo químico de
leucocitos polimorfonucleares. Para que se produzca el movimiento
quimiotáctico la célula debe tener una morfología polarizada, por
consiguiente, la polarización es una necesidad para la quimiotaxia.
Cuando un inhibidor evita la polarización, la quimiotaxia se inhibe
necesariamente. Para este experimento, se eligió por consiguiente
basarse directamente en los resultados de la polarización.
El ensayo de polarización^{15} se realizó a
ciegas. Este ensayo se utilizó para determinar la respuesta del
leucocito polimorfonuclear a los cebos químicos e inhibidores
midiendo la frecuencia y el grado de cambio de la forma celular. En
resumen, se mezclaron 2\times10^{5} leucocitos
polimorfonucleares con péptidos complementarios sintéticos
preincubados y cebos químicos en una cámara de reacción (volumen
total = 100 \mul) a 37ºC durante 5 min. Al final de periodo de
incubación se recogió una alícuota y se mezcló con un volumen igual
de glutaraldehído al 4% para observación al microscopio. El volumen
restante de cada suspensión celular se centrifugó inmediatamente a
15.000 \times g durante 5 segundos para separar las células. En el
sobrenadante resultante se analizó la actividad de la láctico
deshidrogenasa^{16}. Todas las incubaciones generaron actividad
de lactato deshidrogenasa que se correlaciona con <5% de muerte
celular. Los leucocitos polimorfonucleares en cada muestra se
observaron al microscopio y se les asignó puntuaciones de 0 (en
reposo = célula esférica con una membrana lisa), 1 (activado =
célula irregular con membranas desiguales) o 2 (polarizado =
longitud de la célula \geq anchura \times 2). Las puntuaciones
de 100 leucocitos polimorfonucleares para cada muestra se añadieron
para producir un índice de polarización. Se realizó una respuesta a
la dosis para cada cebo químico. Se seleccionó una concentración de
cada cebo químico de la fracción lineal de cada curva de respuesta a
la dosis y se utilizó como referencia positiva. Las muestras de
referencia negativa consistían en leucocitos polimorfonucleares en
HBSS solamente. La inhibición (ID_{50}) se expresó como
concentración en péptido requerida para producir una reducción del
50% en la respuesta de la polarización de leucocitos
polimorfonucleares al cebo químico. Se utilizó la prueba de la
t de Student (para datos independientes) para analizar las
diferencias en la respuesta media de la polarización entre los
leucocitos polimorfonucleares activados con el cebo químico en
ausencia o presencia de péptidos complementarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que el péptido complementario
RTR inhibe la polarización de los leucocitos polimorfonucleares
activados por N-acetil-PGP. La
secuencia complementaria, RTR, se diseñó para interacturar de manera
específica hidropáticamente con una secuencia PGP en
N-acetil-PGP y, por consiguiente,
debería también interactuar con la misma secuencia en
N-metil-PGP. El péptido tetrámero
D-RTR se diseñó para inhibir la polarización de
leucocitos polimorfonucleares inducida por
N-acetil-PGP o
N-metil-PGP, pero tienen una
estabilidad mayor in vivo resistiendo la degradación
proteolítica.
Un estudio preliminar demostró que el tetrámero
D-RTR inhibía (media \pm SD) la polarización de
leucocitos polimorfonucleares provocada por
N-acetil-PGP 800 \muM de la manera
siguiente: tetrámero D-RTR 100 nM = 37% \pm
inhibición del 35% (n=7), tetrámero D-RTR 1 \muM =
65% \pm inhibición del 26% (n=6) y tetrámero
D-RTR 10 \muM = 92% \pm inhibición del 6% (n=6).
El tetrámero D-RTR inhibió la polarización de
leucocitos polimorfonucleares producida por
N-metil-PGP 1 mM de la manera
siguiente: tetrámero D-RTR 1-10
\muM = 14% \pm inhibición del 10% (n=5), tetrámero
D-RTR 40-100 \muM = 45% \pm 7%
de inhibición (n=2) y tetrámero D-RTR de
200-800 \muM = 100% de inhibición (n=5).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuatro péptidos complementarios
(antisentido) que contienen la secuencia RTR, presentaron inhibición
sustancial de polarización de leucocitos polimorfonucleares
activados con N-acetil-PGP (Tabla
1). El péptido tetrámero RTR fue un potente inhibidor de
N-acetil-PGP (ID_{50} de 200 nM).
El dímero RTR fue mucho menos potente (ID_{50} de 105 \muM).
Ambos monómeros, RTR (ID_{50} de 2,5 mM) y RTRGG (ID_{50} de 2,1
mM), fueron solamente concentraciones antagonistas y milimolares.
La preincubación del péptido tetrámero RTR con
N-acetil-PGP o los neutrófilos
durante 5 min. no cambió los resultados descritos anteriormente. Un
péptido complementario adicional, el tetrámero ASA, no pudo
presentar inhibición alguna de los leucocitos polimorfonucleares
activados por N-acetil-PGP.
El tetrámero RTR y ambos péptidos monómeros (RTR
y RTRGG) inhibieron también los leucocitos polimorfonucleares
activados por cebos químicos tripeptídicos ultrafiltrados; aunque a
concentraciones muy superiores (Tabla 2). Ninguno de los péptidos
fue antagonista para la activación de LTB_{4} de leucocitos
polimorfonucleares (Tabla 3). Ninguno de los péptidos
complementarios estimuló a los leucocitos polimorfonucleares en
reposo (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El fosfato sódico monobásico y el fosfato sódico
dibásico se adquirieron en Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Los
disolventes para la síntesis del péptido se adquirieron en Fisher
Scientific Products (West Chester, PA), mientras que los reactivos
se adquirieron en Perseptive Biosystem (Framingham, MA).
Fmoc-d-Arg(Pbf)-OH
y
Fmoc-d-Thr(tBu)-OH
se adquirieron en Chem-Impex (Wood Dale, IL).
El péptido tetrámero RTR
((H_{2}N-Arg-Thr-Arg-Gly-Gly)_{2}-Lys-Ala-CONH_{2}),
que contiene las secuencias de RTR levógiras (L), se sintetizó
utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida siguiendo la
metodología Fmoc en un sintetizador de péptidos 9050 de Perseptive
Biosystem. Este péptido tetrámero fue sintetizado a partir de una
resina
Fmoc-Alanina-PEG-PS,
con uno o dos ciclos de acoplamiento con
Fmoc-K-Fmoc-OH
activado con HATU/DIPEA. Los acoplamientos siguientes se
consiguieron utilizando Fmoc aminoácidos activados con HATU/DIPEA.
El reactivo de desprotección de Fmoc fue DBU al 1%, piperidina al 1%
en dimetilformamida. El péptido se separó de la resina añadiendo 10
ml de ácido trifluoroacético
(TFA)/fenol/tioanisol/H_{2}O/etanditiol 93/2/2/2/1 y se incubó a
temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla se filtró y se
precipitó el péptido en éter etílico frío. Se recogió el
precipitado y se disolvió en H_{2}O para liofilización. Se
purificó el péptido por cromatografía líquida de alta resolución en
fase inversa (RP-HPLC), utilizando un Dynamax RP C18
(d.i. 300\times10 mm) y se equilibró a 3 ml/min. utilizando un
gradiente lineal de CH_{3}CN al 5% a CH_{3}CN al 60% en TFA al
0,1% en 40 minutos. Las fracciones que contenían el péptido se
acidificaron con HCl 1 N para ayudar a la eliminación del TFA y se
liofilizaron. Se confirmó la identidad del péptido por el tiempo de
la espectroscopía de masas de ionización por desorción por láser
asistido por la matriz. Se confirmó la pureza por
RP-HPLC analítica.
El péptido tetrámero RTR
((H_{2}N-d-Arg-d-Thr-d-Arg-Gly-Gly)_{2}-Lys)_{2}-Ala-CONH_{2}),
que contiene las secuencias RTR dextrógiras (D) (solamente RTR
tenía configuración d, las glicinas y el núcleo de polilisina no
eran quirales), se sintetizó en manual partiendo de 3 g de resina
Fmoc-Pal-Peg-PS con
una sustitución inicial de 0,2 \mumoles/g de resina. Se utilizó
DMF como disolvente para las etapas de acoplamiento y las etapas de
lavado, mientras que la desprotección de Fmoc se consiguió con DBU
al 1%/piperidina al 2% en DMF. Las etapas de control del
acoplamiento y de desprotección se realizaron utilizando la prueba
de Kaiser. Todos los aminoácidos se acoplaron dos veces durante una
hora, utilizando como reactivos de activación, HOAt para el éster
O-pentafluorofenílico aminoácido y HATU/DIPEA para
los ácidos libres. Se utilizó un exceso de 5 equivalentes de
aminoácido sobre la sustitución de la resina par la alanina y la
primera lisina, 10 equivalentes para la segunda lisina y 20
equivalentes para los siguientes aminoácidos. Se separó el péptido
de las resinas y se purificó como para el péptido
(L)-RTR.
Se disolvieron péptidos sintéticos en solución
salina tamponada con fosfato (pH 7,3). La osmolalidad estaba
comprendida entre 280 y 320 mOsm.
Se mantuvieron los animales y se trataron en
cumplimiento total con la Association for Research in Visión and
Ophthalmology (ARVO) Resolution on the Use of Animals in Research.
Se anestesiaron con cetamina HCl (12 mg/kg) y xilazina (7,5 mg/kg)
cuarenta y ocho conejos albinos de la cepa Dutch de Nueva Zelanda
(Myrtles Rabbitry, Thompson Station, TN, E.U.A) que pesaban entre
2,0 y 2,5 kg. Se colocaron dos gotas de proparacaína tópica
(Allergan, Hormigueros, Puerto Rico). Después de la próptosis
ocular, el pocillo de plástico de 12 mm se centró en la córnea y se
instilaron 0,4 ml de NaOH 1 N en el pocillo y se dejó durante un
periodo de 35 s. Se aspiró el álcali y se irrigó el pocillo con 10
ml de solución salina fisiológica. Se aplicó pomada de eritromicina
(0,5%) dos veces al día y el técnico de Fraunfelder administró las
medicaciones del estudio. Se realizaron exámenes dobles a ciegas
(lámpara translúcida y microscopia de disección) el martes,
miércoles y viernes con fotografías el miércoles. Se hizo
evaluación de la presencia y del tamaño de los defectos epiteliales,
ulceración córnea, perforación y vascularización. Se subdividieron
los animales al azar en dos grupos de 16 ojos cada uno: 1)
referencia de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 2)
tetrámero (D)-RTR 800 \muM en PBS o tetrámero
(L)-RTR 1,5 mM en PBS alternando cada hora. Cada
animal recibió una gota de la medicación apropiada cada hora
durante 14 horas al día durante 33 días y disminuyendo se
discontinuó hasta el final del experimento el día 42.
Los resultados clínicos el día 33 presentaban
una reducción estadísticamente significativa en la frecuencia de la
ulceración corneal en el grupo del tetrámero RTR en comparación con
el grupo de PBS. Habían 9 úlceras en el grupo de PBS y 4 úlceras en
el grupo de RTR (p=0,0360).
Los días restantes a partir del día 33 al 42
transcurrieron sin ningún goteo tópico adicional en ningún grupo de
animales. A pesar del cese de todas las gotas el día 33 el efecto
favorable del inhibidor de RTR (p = 0,0046) persistió al final del
experimento. Los resultados clínicos el día 42 se detallan en la
tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La lesión por álcali a los ojos degrada muchas
proteínas en todas las capas de la córnea por hidrólisis de los
enlaces peptídicos y destrucción de determinados aminoácidos^{17}.
Esta degradación de las proteínas de la córnea celulares y
extracelulares libera directamente dos cebos químicos tripeptídicos
neutrófilos^{5}. Los experimentos in vitro ulteriores
identificaron estos cebos químicos como
N-acetil-PGP y
N-metil-PGP y confirmaron sus
propiedades quimiotácticas^{4}. El tripéptido acetilado fue el más
activo. La inyección intraestrómica del
N-acetil-PGP sintético o de los
cebos químicos tripeptídicos ultrafiltrados en la córnea normal
demostró la invasión neutrófila pesada en el punto de
inyección^{6}. Considerados en conjunto estos descubrimientos
establecieron la función de este cebo químico tripeptídico en el
desencadenamiento de la respuesta neutrófila precoz en el ojo
lesionado por álcali, confirmando su importancia como mediador
inflamatorio.
Utilizando la teoría de reconocimiento
molecular, se diseñaron y se sintetizaron péptidos complementarios
de RTR que se descubrió que eran inhibidores de
N-acetil-PGP. La capacidad de estos
péptidos complementarios para inhibir la fosforilación del
leucocito polimorfonuclear variaba con el cebo químico. El péptido
complementario más potente, el tetrámero RTR, presentó potencia
inhibidora mayor para el
N-acetil-PGP sintético en
comparación con los cebos químicos tripeptícos ultrafiltrados. Este
puede ser el resultado de la interacción no específica con el grupo
heterogéneo de pequeños péptidos (100-1.000 P_{m})
que se sabe que está presente en esta última muestra. El hecho
adicional de que estos péptidos complementarios no inhibían la
polarización activada por LTB_{4} demuestra que no están actuando
directamente sobre el neutrófilo de manera inespecífica. La ausencia
de inhibición de LTB_{4} y la escasez de liberación de LDH
extracelular de todas las incubaciones confirma que los péptidos
complementarios de RTR no eran tóxicos para los neutrófilos. Por
último, estos resultados indican también que
N-acetil-PGP se une a un receptor
neutrófilo diferente de LTB_{4}.
La teoría de reconocimiento molecular (o los
péptidos complementarios) propone que el modelo de hidropatía de
aminoácidos es un determinante bruto de la forma y la función
rudimentaria de este péptido o proteína.^{7} Por consiguiente,
invirtiendo este patrón hidropático debería producirse un péptido
con una forma complementaria, ya que las mismas fuerzas directoras
están implicadas, pero en orientación inversa. Por consiguiente, se
proporciona la denominación de péptidos complementarios. Se ha
demostrado que dichos péptidos complementarios interactúan
específicamente con sus dianas con afinidad moderada^{18}. Una
manera de conseguir esta inversión de hidropatía se refiere a una
característica interesante del código genético. Es decir, ya que A y
U son complementarias, y cuando en la base media del codón se
especifica respectivamente hidrófilo e hidrófobo, entonces la cadena
no codificadora del ADN (o ARNm), codificará un péptido que es
complementario con el péptido codificado por la cadena de
codificación. Aparte de ser un procedimiento útil para diseñar
péptidos complementarios, esto sugiere un mecanismo para la
evolución de pares de ligando interactuantes. Sin embargo, el
utilizar el procedimiento del diseño basado en el ADN no siempre
produce el modelo óptimo de complementariedad hidropática. Por esta
razón ha demostrado también ser útil el diseñar péptidos
complementarios basados en el modelo hidropático del péptido diana
utilizando programas
informáticos^{19}.
informáticos^{19}.
El concepto de péptidos complementarios basados
en modelos hidropáticos se probó en primer lugar con la hormona
peptídica corticotropina (ACTH). Se sintetizó un péptido
complementario HTCA, que corresponde a la cadena no codificadora de
ARNm de ACTH y demostró su capacidad para unirse a ACTH. En el
ensayo de fijación en fase sólida, se observó que ACTH se une
específicamente a este péptido complementario, HTCA, con afinidad
nanomolar^{20}. Además, se observó fijación equivalente con
péptidos HTCA basados en una lectura transcrita o complementaria
del ARN complementario con ACTH^{21}.La observación de que estos
péptidos tenían diferentes secuencias de aminoácidos pero la misma
matriz lineal de hidropatía sugirió que esta última propiedad era
responsable de la interacción. El apoyo adicional para la idea que
la hidropatía invertida es la fuerza conductora para las córneas de
interacción a partir de la observación de que los péptidos
complementarios interactúan cuando proceden de la inversión
informatizada o la inversión dirigida a la secuencia
nucleotídica^{22}.
Los péptidos complementarios procedentes de la
teoría del reconocimiento molecular se han utilizado en una amplia
variedad de sistemas como antagonistas^{23-26}. La
presente invención describió el diseño de péptidos complementarios
que se unen específicamente y alteran la actividad del ligando
quimiotáctico, N-acetil-PGP. Dado
que las características hidropáticas de la prolina no están muy bien
definidas, se diseñaron dos péptidos complementarios con el
N-acetil-PGP. Un péptido, ASA, se
basó en la escala Kyte y Doolittle^{11} y el otro péptido, RTR,
se basó en la escala de Akamatsu y Fujita^{12}. Este último está
basado en los coeficientes de partición de los di- y
tri-péptidos haciéndolo más apropiado para el diseño
de un péptido complementario a dicha pequeña diana. Se sintetizaron
también los péptidos complementarios y se probaron como tetrámeros,
un método común utilizado para mejorar la actividad de fijación para
la diana^{27,28}. La polimerización aumenta la estequiometría de
la reacción, secuestrando un número mayor de moléculas de cebos
químicos, reduciendo por consiguiente la dosis del péptido
complementario necesario para bloquear el
N-acetil-PGP.
Las propiedades inhibidoras de los péptidos
complementarios RTR se declaran en la interacción molecular de la
secuencia RTR con N-acetil-PGP. Este
hecho se hace evidente comparando los valores de ID_{50} de cada
péptido complementario frente a
N-acetil-PGP. Las propiedades
inhibidoras de ambos péptidos monómeros, RTR y RTRGG (ID_{50} = 2
mM), eran 20 veces menores que las del dímero RTR que eran 500 veces
menores que las del tetrámero RTR. El péptido complementario ASA
(con un núcleo de polilisina y un espaciador de diglicina idéntico
al tetrámero RTR) sirve como referencia para el núcleo del tetrámero
y como referencia para la secuencia de RTR. La ausencia de
actividad inhibidora del tetrámero ASA demuestra que el núcleo de
polilisina y otra secuencia tripeptídica hidropática no es activa.
Estos resultados demuestran que el péptido RTR es específico para
R-acetil-PGP, dado que la secuencia
ASA no puede bloquear la activación de
N-acetil-PGP de la polarización del
leucocito polimorfonuclear.
La afinidad del péptido tetrámero RTR para
N-acetil-PGP fue 10.000 veces mayor
que para el monómero RTR. Es posible que la gran distribución de la
carga en el péptido polímero, resultante de las cadenas laterales de
arginina, reduzca el número de configuraciones de RTR en el
tetrámero en comparación con el monómero RTR. La presencia de
configuradores de la unión favorable en este número limitado de
configuraciones aumentaría la afinidad de unión con el cebo
químico. Alternativamente, o además, la asociación íntima de las
ramificaciones de RTR en el tetrámero podría limitar los parámetros
de difusión de N-acetil-PGP,
manteniendo el cebo químico en asociación más íntima con el
tetrámero y cambiando la cinética de la interacción. Estos
descubrimientos son coherentes con el efecto creciente a medida que
la estructura polimérica aumenta el número de secuencias de
RTR.
Los péptidos compuestos por
L-aminoácidos son degradados rápidamente por enzimas
en el cuerpo, especialmente en los tejidos inflamados. Se ha
demostrado que la forma D de los péptidos complementarios conserva
la actividad biológica de la forma L^{18,19,29}, todavía es más
resistente a las proteasas y por consiguiente más estable in
vivo. Por esta razón el tetrámero RTR, las formas D de todos los
aminoácidos, puede ser un agente terapéutico alternativo.
Las implicaciones de los procedimientos de la
presente invención para el tratamiento de pacientes con lesión por
álcali del ojo pueden ser sustanciales. Si un inhibidor de
quimiotaxia de leucocito polimorfonuclear se administra
inmediatamente después de una lesión, el estímulo de la invasión de
leucocito polimorfonuclear en la córnea puede ser suprimido. Los
neutrófilos constituyen uno de los peligros más graves para la
integridad de la córnea al iniciar y perpetuar la ulceración y
producir la perforación del ojo. Si la
N-acetil-PGP puede suprimir o
disminuir la regeneración inicial de los leucocitos
polimorfonucleares, entonces otros mediadores, que se liberan de
los leucocitos polimorfonucleares, no tendrían oportunidad para
aumentar esta respuesta neutrófila. El resultado final es la
conservación del estroma de la córnea, manteniendo la integridad del
glóbulo y proporcionando un sustrato adecuado durante el cual el
recrecimiento epitelial está estimulado.
El descubrimiento del cebo químico generado por
el álcali ha conducido a una comprensión más completa de la
quimiotaxia en las lesiones por álcali y podría también dar lugar a
un tratamiento útil en otras enfermedades oculares y en la
inflamación en otros tejidos del cuerpo. Por ejemplo, cuando el
tejido blanco es lesionado por el álcali en cualquier lugar en el
cuerpo supuestamente se genera el mismo cebo químico que podría
participar en el desencadenamiento del ciclo inflamatorio iniciado
por el álcali en estos tejidos. Un ejemplo de esto se observó con
una variedad de componentes de la sangre humana que provocó una
respuesta de la polarización de leucocito polimorfonuclear tras la
exposición al álcali. Es concebible que este género de inhibidores
podría actuar para truncar la respuesta inflamatoria de leucocito
polimorfonuclear en otras enfermedades no traumáticas no
relacionadas donde el cebo químico es el mismo o suficientemente
similar.
La utilización de esta nueva metodología acorta
sustancialmente el transcurso del tiempo durante el desarrollo de
los compuestos principales; reduciendo el método iterativo tanto en
las técnicas de modelado molecular tradicionales como informáticas.
Esta tecnología complementaria puede apoyar una clave para el
tratamiento de otras enfermedades donde los mediadores son
conocidos o pueden identificarse. Las implicaciones prácticas de
esta investigación son muy enriquecedoras, incluyendo el desarrollo
de compuestos de gran potencia que podrían ser beneficiosos para
los ojos lesionados por álcali u otros tipos de enfermedades.
Los experimentos in vitro han demostrado
de manera concluyente que el tetrámero RTR (D) y (L) fue muy
inhibidor para los cebos químicos neutrófilos liberados en las
etapas iniciales en el ojo lesionado por álcali. Cuando se aplicó
este tetrámero al ojo de conejo lesionado por álcali se identificó
una disminución estadísticamente significativa en la ulceración
córnea en comparación con el grupo de referencia. La afinidad del
tetrámero RTR por los cebos químicos que aparece después de la
lesión por álcali frustra sus propiedades quimiotácticas del
leucocito polimorfonuclear inmediatamente y de este modo reduce la
ulceración a corto y largo plazo. La prueba de esta última
afirmación se encuentra en el efecto protector continuado del pasado
día 33 cuando toda la medicación ha sido interrumpida.
N-acetil-PGP y
N-metil-PGP son los cebos químicos
neutrófilos primarios liberados en el estroma por la hidrólisis
directa de las proteínas de la córnea inmediatamente después de una
lesión por álcali. Estos cebos químicos se cree que desencadenan la
infiltración pesada ulterior de los neutrófilos lo que conduce a la
ulceración de la córnea. Es probable que la unión complementaria
del tetrámero RTR a N-acetil-PGP y a
N-metil-PGP, apenas después de la
lesión, inactiven estos cebos químicos en la córnea, reduciendo la
invasión precoz y a continuación neutrofílica ulterior. La
exclusión de los leucocitos polimorfonucleares protege el tejido de
la córnea lesionado de las enzimas degradadoras y de los radicales
libres de oxígeno contenidos en estas células inflamatorias. Estas
consideraciones explican el efecto terapéutico persistente del
tratamiento con RTR y sugieren que el tratamiento precoz del ojo
lesionado con álcali, durante un intervalo más breve, pueda
proporcionar un resultado similar.
Este experimento demuestra que el tetrámero RTR
(D) y (L), utilizado alternativamente en el mismo ojo, reduce
significativamente la incidencia de las úlceras de córnea que se
producen después de la lesión por álcali. El potencial de
degradación enzimática de los péptidos en las diferentes etapas de
cicatrización en la córnea lesionada por álcali es desconocido. Una
escasez de células corneales en los primeros días después de la
lesión sería coherente con la baja actividad enzimática en este
periodo de tiempo. Otros estudios describen que los péptidos
complementarios (D) presentan actividad biológica similar a los
péptidos (L) y que los péptidos (D) son estables in
vivo^{18,19,29}. Las enzimas de la córnea pueden ser capaces
de degradar el tetrámero RTR (L). La razón de administrar ambos
tetrámeros en horas alternativas en el mismo ojo fue de evitar la
degradación enzimática de una parte del tetrámero, manteniendo
superior la concentración del tetrámero RTR total.
En la presente memoria se citaron las
referencias siguientes:
1. Brown, et al., Otolaryngol.
1970; 74: 375-383.
2. Kenyon, et al., Invest Ophthalmol
Vis Sci. 1979; 18:570-587.
3. Foster, et al., Arch
Ophthalmol. 1982; 100:1820-1824.
4. Pfister, et al., Invest Ophthalmol
Vis Sci. 1995; 36:1306-1316.
5. Pfister, et al., Invest Ophthalmol
Vis Sci. 1996; 37:230-237.
6. Pfister, et al., Invest Ophthalmol
Vis Sci. 1998; 39:
7. Blalock, Nature Medicine.
1995; 1:876-878.
8. Blalock, et al., Bio. Biophys Res
Commun 1984; 121: 203-207.
9. Blalock, et al., Trends
Biotechnol 1990; 8:140-144.
10. Clarke, et al., In: Antisense
Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications. vandrol
Krol AV and Mol JNM (eds): Dekker, New York:
169-186 (1991).
11. Kyte, et al., J Mol Biol
1982; 157:105-132.
12. Akamatsu, et al., Journal of
Pharm. Science 1992; 2:164-174.
13. Ferrante, et al., J Immunol
Methods 1978; 24:389.
14. Pfister, et al., Cornea.
1984/1985; 3:183-188.
15. Haston, et al., J Immunol
Methods. 1985; 81:229-237.
16. Decker, In Worthington Enzyme Manual.
Freehold, NJ, Worthington Biochemical Corp., 1977,
p19-22.
17. Berry, et al., Cornea
1989; 8:150-154.
18. Fassina, et al., Arch Biochem
Biophys 1992; 296: 137-143.
19. Fassina, et al., Int J Peptide
Protein Res 1992; 39:540-548.
20. Bost, et al., Proc Natl Acad Sci
USA 1985; 82:1372-1375.
21. Blalock, et al., Biochem J
1986; 234:679-683.
22. Fassina, et al., J Biol Chem
1989; 264:11252-11257.
23. Budisavlijevic, et al., J
Hypertension 1992; 19:345-353.
24. Gartner, et al., Proc Soc Exp Biol
Med 1991; 198:649-655.
25. Gartner, et al., Bio. Biophys Res
Commun 1991; 180:1446-1452.
26. Johnson, et al., J Immunol
1988; 141:2420-2423.
27. Fassina, et al., Int J Peptide
Protein Res 1992; 39:549-556.
28. Tam, Proc Natl Acad Sci USA
1988; 85:5409-5413.
29. Fassina, et al., J Biol Chem
1989; 264:11252-11257.
<110> Haddox, Jeffrey Lynn
\hskip1cmBlalock, James Edwin
\hskip1cmPfister, Roswell Robert
\hskip1cmVillain, Matteo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos sintéticos complementarios
y sus utilizaciones oftalmológicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D6201PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-03-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/123,409
\vskip0.400000\baselineskip
<150>
1999-03-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos de cebo
químico neutrófilo liberado durante la hidrólisis alcalina directa,
de proteínas de la córnea; desencadena la invasión de leucocitos
polimorfonucleares en la córnea lesionada por álcali
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos del
inhibidor peptídico complementario de neutrófilos; utilizada como
monómero, dímero y tetrámero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos de
inhibidor peptídico complementario de neutrófilos; utilizada como
monómero
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Thr Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos de
inhibidor peptídico complementario de neutrófilos; utilizada como
tetrámero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Ala}
Claims (11)
1. Una composición farmacéutica para
utilizaciones oftalmológicas que comprende un péptido complementario
que tiene una secuencia complementaria a la
prolina-glicina-prolina (PGP), en la
que dicha composición comprende un polímero RTR.
2. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dichas secuencias complementarias se
diseñan basándose en el triplete de codificación para la prolina y
la glicina y en el valor hidropático de la prolina y la
glicina.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho péptido complementario se
selecciona de entre el grupo consistente en RTR, RTRGG, dímero RTR,
tetrámero RTR, octámero RTR, polímero
N-acetil-RTR, polímero RTR del
ácido graso de cadena corta y de cadena larga, polímero RTR que
utiliza ácido diaminopropiónico para la subunidad del núcleo,
polímero RTR que utiliza ácido diaminobutírico para la subunidad del
núcleo, polímero RTR que contiene un espaciador que tiene la
fórmula NH_{2}[CH_{2}]_{n}-COOH
[n=2 [ácido 3-aminopropiónico]... 7 [ácido
8-aminocaprílico]], sustituyendo dicho espaciador el
espaciador de diglicina, el polímero RTR de cisteína que tiene una
estructura bicíclica, en la que dichos péptidos complementarios
tienen aminoácidos dextrógiros sustituidos por el levógiro
natural.
4. Una composición farmacéutica para
utilizaciones oftalmológicas que comprende un péptido complementario
que tiene una secuencia complementaria a la de la
prolina-glicina-prolina (PGP) en la
que dicha composición comprende RTR, para inhibir la polarización
de leucocito polimorfonuclear, quimiotaxia e infiltración en el
tejido activada por el cebo químico neutrófilo.
5. Utilización de un péptido complementario que
tiene una secuencia complementaria a la de la
prolina-glicina-prolina (PGP) en la
que dicho péptido comprende RTR, para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la polarización del leucocito
polimorfonuclear, la quimiotaxia y la infiltración en el tejido
activado por un cebo químico neutrófilo.
6. La utilización según la reivindicación 5, en
la que dicha composición farmacéutica debe ser administrada a una
concentración que oscila desde aproximadamente 1 \muM a
aproximadamente 100 mM, dependiendo del péptido.
7. La composición farmacéutica o la utilización
de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en
la que dicho cebo químico neutrófilo se selecciona del grupo
constituido por N-acetil-PGP y
N-metil-PGP.
8. La composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para tratar una enfermedad
ocular.
9. Utilización de un péptido complementario que
tiene una secuencia complementaria a la
prolina-glicina-prolina (PGP), en
la que dicho péptido comprende un polímero RPR, para la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad
ocular.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la
que dicha composición farmacéutica debe administrarse en un
intervalo de concentración desde aproximadamente 1 \muM hasta
aproximadamente 100 mM, dependiendo del péptido.
11. Composición farmacéutica o utilización de la
misma según una cualquier a de las reivindicaciones 8 a 10, en la
que dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo consistente en
ojo lesionado por álcali, ojos lesionados por productos químicos y
enfermedad inflamatoria de los ojos.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12340999P | 1999-03-09 | 1999-03-09 | |
US123409P | 1999-03-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2316356T3 true ES2316356T3 (es) | 2009-04-16 |
Family
ID=22408525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00913818T Expired - Lifetime ES2316356T3 (es) | 1999-03-09 | 2000-03-08 | Peptidos sinteticos complementarios y sus utilizaciones oftalmologicas. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6310041B1 (es) |
EP (1) | EP1560590B1 (es) |
AT (1) | ATE411811T1 (es) |
AU (1) | AU3518700A (es) |
CA (1) | CA2366678A1 (es) |
DE (1) | DE60040623D1 (es) |
ES (1) | ES2316356T3 (es) |
WO (1) | WO2000053621A2 (es) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6921751B1 (en) * | 1998-05-20 | 2005-07-26 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Immunoregulator |
US20050227925A1 (en) * | 2004-04-08 | 2005-10-13 | Robbert Benner | Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration |
US6844315B2 (en) | 1998-05-20 | 2005-01-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Immunoregulator |
US8680059B2 (en) * | 1998-05-20 | 2014-03-25 | Biotempt B.V. | Oligopeptide acetate and formulations thereof |
US20040202645A1 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-14 | Khan Nisar Ahmed | Administration of gene-regulatory peptides |
US20030220258A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-11-27 | Robbert Benner | Treatment of ischemic events |
EP1138692A1 (en) | 2000-03-29 | 2001-10-04 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator |
CA2366678A1 (en) * | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Fornix Biosciences N.V. | Synthetic complementary peptides and ophthalmologic uses thereof |
NL1011737C2 (nl) * | 1999-04-06 | 2000-10-09 | Ct For Immunopharmacology | Verbinding voor het remmen van de influx van polymorphonucleaire leukocyten (PMNs) in een weefsel, werkwijze voor het selecteren van een dergelijke verbinding, een farmaceutisch preparaat en een toepassing van de verbinding. |
US7358330B2 (en) * | 2001-03-29 | 2008-04-15 | Biotempt B.V. | Immunoregulatory compositions |
US20030220257A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-11-27 | Robbert Benner | Treatment of trauma |
US20080318871A1 (en) * | 2001-12-21 | 2008-12-25 | Khan Nisar A | Treatment of neurological disorders |
US7501391B2 (en) * | 2001-12-21 | 2009-03-10 | Biotempt B.V. | Treatment of transplant survival |
US7786084B2 (en) * | 2001-12-21 | 2010-08-31 | Biotempt B.V. | Treatment of burns |
US20030220261A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-11-27 | Khan Nisar Ahmed | Treatment of iatrogenic disease |
US7560433B2 (en) | 2001-12-21 | 2009-07-14 | Biotempt B.V. | Treatment of multiple sclerosis (MS) |
US20030224995A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-12-04 | Khan Nisar Ahmed | Treatment of burns |
US20030220260A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-11-27 | Khan Nisar Ahmed | Peptide compositions |
US20040013661A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-01-22 | Gert Wensvoort | Stratification |
US20080242837A1 (en) * | 2001-12-21 | 2008-10-02 | Khan Nisar A | Peptide compositions |
ES2540926T3 (es) * | 2002-06-04 | 2015-07-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Hidrolizado de proteínas rico en tripéptidos |
US20090227505A1 (en) * | 2004-01-07 | 2009-09-10 | Biotempt B.V. | Methods and uses for protein breakdown products |
CA2614084A1 (en) * | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Biotempt B.V. | Treatment of tumors |
WO2007035406A1 (en) | 2005-09-16 | 2007-03-29 | Orthologic Corp. | Antibodies to complementary peptides of thrombin or portions thereof |
EP1864692A1 (en) | 2006-06-07 | 2007-12-12 | Biotempt B.V. | Use of peptides for the control of radiation injury |
KR101247641B1 (ko) | 2010-10-22 | 2013-03-29 | 성균관대학교산학협력단 | Cxcr2에 결합하는 펩타이드 리간드를 포함하는 감염성 및 염증성 질환 치료용 조성물 |
WO2017217728A1 (ko) * | 2016-06-13 | 2017-12-21 | 부산대학교 산학협력단 | Ac-pgp 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5077195A (en) * | 1985-03-01 | 1991-12-31 | Board Of Reagents, The University Of Texas System | Polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor |
US5242902A (en) * | 1989-09-06 | 1993-09-07 | The Regents Of The University Of California | Defensin peptide compositions and methods for their use |
US5916872A (en) * | 1996-07-24 | 1999-06-29 | Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic peptides having broad spectrum antimicrobial activity |
AU2459400A (en) * | 1999-02-12 | 2000-08-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Peptides inhibiting vascular endothelial cell migration |
CA2366678A1 (en) * | 1999-03-09 | 2000-09-14 | Fornix Biosciences N.V. | Synthetic complementary peptides and ophthalmologic uses thereof |
NL1011737C2 (nl) * | 1999-04-06 | 2000-10-09 | Ct For Immunopharmacology | Verbinding voor het remmen van de influx van polymorphonucleaire leukocyten (PMNs) in een weefsel, werkwijze voor het selecteren van een dergelijke verbinding, een farmaceutisch preparaat en een toepassing van de verbinding. |
-
2000
- 2000-03-08 CA CA002366678A patent/CA2366678A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-08 DE DE60040623T patent/DE60040623D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-08 AT AT00913818T patent/ATE411811T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-08 WO PCT/US2000/006062 patent/WO2000053621A2/en active Application Filing
- 2000-03-08 AU AU35187/00A patent/AU3518700A/en not_active Abandoned
- 2000-03-08 EP EP00913818A patent/EP1560590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-08 US US09/521,365 patent/US6310041B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-08 ES ES00913818T patent/ES2316356T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-28 US US09/967,003 patent/US6762166B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6762166B2 (en) | 2004-07-13 |
EP1560590A2 (en) | 2005-08-10 |
EP1560590B1 (en) | 2008-10-22 |
AU3518700A (en) | 2000-09-28 |
WO2000053621A2 (en) | 2000-09-14 |
WO2000053621A3 (en) | 2005-06-16 |
ATE411811T1 (de) | 2008-11-15 |
US6310041B1 (en) | 2001-10-30 |
EP1560590A4 (en) | 2005-08-10 |
US20020107202A1 (en) | 2002-08-08 |
CA2366678A1 (en) | 2000-09-14 |
DE60040623D1 (de) | 2008-12-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2316356T3 (es) | Peptidos sinteticos complementarios y sus utilizaciones oftalmologicas. | |
EP2409988B1 (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
US7696309B2 (en) | Protease resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage | |
ES2432225T3 (es) | Reactivos y procedimientos para terapias del músculo liso | |
JP2009102392A (ja) | プロテインキナーゼcのペプチドインヒビター | |
JPH03118330A (ja) | フイブリノーゲンレセプター拮抗剤 | |
CN101018563A (zh) | 衍生自cap18的抗菌肽 | |
AU2012257774A1 (en) | High-affinity, dimeric inhibitors of PSD-95 as efficient neuroprotectants against ischemic brain damage and for treatment of pain | |
CN106170491A (zh) | 神经保护肽 | |
US6057297A (en) | Inhibitor compounds of zinc-dependent metalloproteinases associated with pathological conditions, and therapeutic use thereof | |
IL105533A (en) | Stable injectable polypeptides and method of preparation | |
US20080145412A1 (en) | Method of promoting angiogenesis | |
ES2387435B1 (es) | Uso de heptapéptidos para el control de la hipertensión | |
CN116390723A (zh) | 用于将生物素递送至线粒体的方法和组合物 | |
ES2799829T3 (es) | Proteínas de fusión recombinantes para la prevención o el tratamiento de adherencias en tejidos u órganos | |
RU2682878C1 (ru) | Протеолитически устойчивый нонапептид, обладающий способностью предотвращать повышение гиперпроницаемости сосудистого эндотелия | |
Zakutskii et al. | Functional arginine-containing amino acid sequences in peptides and proteins | |
KR102666922B1 (ko) | 미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물 | |
WO2022171098A1 (zh) | 一种dapk1磷酸化底物的人工小分子干扰肽及其制药用途 | |
JPS62501291A (ja) | 精製セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
US6562788B1 (en) | Topoisomerase II inhibitor | |
KR20240073137A (ko) | 미토콘드리아에 비오틴의 전달을 위한 방법 및 조성물 | |
JPWO2020116062A1 (ja) | 新規化合物及びそれを含む血管新生剤 | |
JPH06157588A (ja) | 新規な細胞接着活性ペプチド誘導体 | |
WO2018049071A1 (en) | Vasoactive polypeptides for smooth muscle relaxation |