ES2540926T3 - Hidrolizado de proteínas rico en tripéptidos - Google Patents
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Abstract
Un hidrolizado de proteínas en el que al menos 20% molar de los péptidos que tienen un peso molecular de 200 a 2000 Daltons está presente en el hidrolizado como tripéptido y en el cual al menos 30% de los tripéptidos tienen una prolina carboxi-terminal.
Description
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mezcla con Pefabloc, las metaloproteasas por mezcla con fosforamidón y las proteasas aspárticas por mezcla con pepstatina. Todos los inhibidores más los procedimientos de trabajo pueden obtenerse de Roche.
La solicitud de patente de los mismos inventores, también en tramitación, PCT/EP01/14.480 describe el uso de una endoproteasa específica de prolina que, en conjunción con las endoproteasas de la técnica anterior, es capaz de generar hidrolizados de proteína no amargos. Esta endoproteasa específica de prolina es una enzima capaz de escindir péptidos o polipéptidos en el extremo carboxi-terminal de residuos prolina. Endoproteasas específicas de prolina se encuentran ampliamente en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece ser limitada. Hasta la fecha, se han identificado endoproteasas específicas de prolina en especies de Aspergillus (EP 0 522 428 y WO 02/45.524), Flavobacterium (EP 0 967 285), Aeromonas (J.Biochem.113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. Se ha demostrado que una incidencia alta de residuos prolina en el extremo carboxi-terminal de los péptidos puede estar correlacionada con amargor bajo. Además, los autores de la invención han demostrado que la alta incidencia deseada de residuos prolina carboxi-terminales puede conseguirse sólo con concentraciones elevadas de una endoproteasa específica de prolina, a saber concentraciones que exceden de la actividad especificada en JP5.015.314 por varios órdenes de magnitud y además en ausencia de una carboxipeptidasa.
En conjunción con las endoproteasas de la técnica anterior, la endoproteasa específica de prolina es capaz de hidrolizar extensamente proteínas ricas en prolina produciendo péptidos relativamente pequeños con una distribución de tamaños estrecha. Debido a la preferencia de escisión, de la endoproteasa específica de prolina, muchos de los péptidos formados tienen un residuo prolina carboxi-terminal. Adicionalmente, el proceso del hidrolizado es relativamente simple, dado que no está implicado un paso de eliminación del amargor por exoproteasas, por lo que únicamente se formarán niveles bajos de aminoácidos libres.
Desde un punto de vista económico, la implicación de esta observación es que existe una clara necesidad en el presente proceso para el uso de endoproteasas específicas de prolina en cantidades altas y en una forma pura o aislada, que se describe en la solicitud de patente de los mismos inventores, también en tramitación, PCT/EP01/14.180. Una vía preferida de obtención de PSE purificada y aislada es por la superproducción de una endoproteasa específica de prolina de este tipo utilizando técnicas de DNA recombinante. Dado que muchos productos alimenticios son ácidos y las incubaciones enzimáticas de larga duración en circunstancias industriales no estériles requieren condiciones de incubación ácidas y una temperatura de proceso de 50 ºC o mayor para prevenir la contaminación microbiana, un método más preferido es la superproducción de una endoproteasa específica de prolina estable en medio ácido utilizando técnicas de DNA recombinante. Un método particularmente preferido es la superproducción de una endoproteasa específica de prolina derivada de Aspergillus, y un método muy preferido es la superproducción de una endoproteasa específica de prolina derivada de Aspergillus niger. Adicionalmente, las enzimas conforme a la invención pueden utilizarse en forma inmovilizada, con lo que pueden tratarse grandes cantidades de líquidos que contengan proteínas. Vías para seleccionar materiales soporte apropiados y métodos de inmovilización adecuados han sido descritos extensamente en la bibliografía, por ejemplo en "Immobilization of Enzymes and Cells" (ed. Gordon F. Bickerstaff; ISBN 0-89603-386-4).
Una vez que las nuevas enzimas se han hecho disponibles en forma relativamente pura, se contemplan otras aplicaciones nuevas y sorprendentes que presentan ventajas técnicas y económicas.
Una nueva aplicación podría ser la creación de hidrolizados no amargos a partir de sustratos proteináceos con nuevas composiciones de aminoácidos. Dichas nuevas composiciones de aminoácidos pueden ofrecer ventajas importantes en ciertas aplicaciones alimentarias y médicas. Ejemplos son caseína o aislado de proteína de gluten de trigo o maíz con niveles altos de residuos de aminoácidos hidrófobos y, más específicamente, residuos prolina presentes. Hasta ahora, tales sustratos no tenían uso práctico alguno debido a los desagradables sabores amargos generados por hidrólisis y los grados limitados de hidrólisis obtenidos utilizando los métodos de la técnica anterior. Por utilización del método de hidrólisis conforme a la invención, pueden hacerse disponibles nuevos hidrolizados no amargos para uso en nutrición infantil y clínica, en dietas terapéuticas así como en dietas para el consumidor y nutrición deportiva.
Otras ventajas, no relacionadas directamente con la supresión de sabores amargos, incluyen la incubación de la enzima con proteínas alimentarias a fin de reducir su respuesta alergénica o inmunológica. Varias proteínas alimentarias contienen subfracciones altamente alergénicas, tales como el gluten de trigo que contiene prolaminas con secuencias peptídicas ricas en prolina. Estas proteínas pueden someterse a las nuevas enzimas para atenuar su antigenicidad. Una aplicación específica es el uso de una combinación de una endoproteasa, preferiblemente una endoproteasa específica de prolina con una tripeptidasa para consumo oral. Una composición de este tipo para ingestión oral podría ser una tableta o una píldora o un polvo o líquido en el cual la combinación de las dos enzimas exhibe una estabilidad al almacenamiento satisfactoria. Si se mantiene en forma seca, la estabilidad al almacenamiento deseada de las enzimas planteará pocos problemas técnicos. Formulaciones líquidas de enzimas que proporcionan estabilidades al almacenamiento satisfactorias y adecuadas para consumo oral han sido descritas en la técnica anterior. Por ingestión oral y la combinación de las 2 enzimas estables en medio ácido, se facilitará la digestión de proteínas ricas en prolina tales como caseínas o glútenes, previniendo o minimizando con ello los efectos descritos para, por ejemplo, el esprue celíaco.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Propiedades de la tripeptidilpeptidasa codificada por el gen 12 (TPAP-A) de Aspergillus niger
La enzima codificada por el gen 12 (descrita en la solicitud de patente de los mismos inventores, también en tramitación, PCT/EP02/01984) se obtuvo por superproducción en una célula hospedadora de A. niger y se purificó por cromatografía. La purificación se llevó a cabo en una columna Resource Q en acetato de 50 milimoles/litro de pH 4,5. La elución por aumento de la concentración de NaCl produjo la enzima en un pico de actividad neta. La actividad se midió por incubación con el péptido sintético Ala-Ala-Phe-pNA. La solución con la enzima purificada contenía 8 unidades/mL si se ensayaba en el péptido sintético Ala-Ala-Phe-pNA a pH 4,0 y 60 ºC (véase la sección Materiales y Métodos).
En un primer experimento, la enzima pura se incubó a pH 5 y 50 ºC con 2 sustratos cromógenos sintéticos diferentes, a saber Ala-Ala-Phe-pNA y Ala-Phe-pNA (ambos de Bachem, Suiza). Se prepararon soluciones stock de estos péptidos en DMSO, que se diluyeron luego 100 veces en el tampón acuoso deseado. La incubación con el sustrato Ala-Ala-Phe-pNA condujo a un aumento significativo de la absorbancia a 410 nanómetros, mientras que la incubación con Ala-Phe-pNA no lo hizo. Esta observación demuestra claramente que esta tripeptidasa puede escindir únicamente tripéptidos y no exhibe actividad de aminopeptidasa que pueda conducir a un aumento indeseable de aminoácidos libres.
En un segundo experimento, se demostraron las características preferidas de estabilidad de la enzima codificada por el gen 12. Cuatro muestras de la enzima purificada se incubaron a pH 5 durante una hora a 0, 40, 50 y 60 ºC respectivamente. Se añadió luego a cada muestra de enzima el sustrato Ala-Ala-Phe-pNA arriba mencionado y se determinó la actividad enzimática en cada muestra calentada por medida del aumento de absorbancia a 410 nanómetros. Mientras que la muestra de 0 ºC exhibía 100% de actividad, la muestra de 40 grados exhibía 96% de actividad residual, la muestra de 50 grados 92% de actividad residual y la muestra de 60 grados 88% de actividad residual. Estos datos confirman la estabilidad sorprendente de esta tripeptidasa TPAP-A de Aspergillus en las condiciones de proceso preferidas por la industria alimentaria.
Por último, se obtuvo una impresión de las preferencias de escisión de la tripeptidilpeptidasa corriente. A este fin, la incubación se llevó a cabo con los péptidos sintéticos Ala-Ala-Phe-pNA, Ala-Ala-Ala-pNA y Ala-Ala-Pro-pNA. Los 3 péptidos se disolvieron en DMSO a una concentración 150 milimolar. La reacción se efectuó en tampón de citrato (citrato 0,1 M), a pH 4,0 y a 60 ºC.
Se añadieron a la cubeta 940 microlitros de tampón, 50 microlitros de muestra enzimática y 10 microlitros de sustrato, y después de agitar se midió cinéticamente la reacción a 405 nanómetros durante 10 minutos. La enzima se testó en diferentes diluciones.
Con objeto de calcular la actividad específica, se determinó espectrofotométricamente la concentración de proteínas de la solución enzimática a 280 nanómetros utilizando un coeficiente de extinción molar de 1,21 para 1 gramo/litro (basado en contenido de Trp y Tyr en la molécula de enzima).
- sustratos
- dilución U/mL Actividad específica, U/mg
- Ala-Ala-Phe-pNA
- 1:50 7,81 -8,95 2,3
- Ala-Ala-Ala-pNA
- 1:50 a 1:200 76,2 -81,5 21,8
- Ala-Ala-Pro-pNA
- No diluida 0,0 0,0
Por comparación de las absorbancias a 410 nanómetros, estaba claro que la enzima exhibe una preferencia clara para escisión del sustrato Ala-Ala-Ala-pNA. Ala-Ala-Phe-pNA se escindía también, pero a una tasa significativamente menor. No pudo registrarse actividad alguna hacia el sustrato Ala-Ala-Pro-pNA. La última observación demuestra claramente que la combinación con una endonucleasa específica de prolina se prefiere para convertir sustratos proteínicos ricos en residuos prolina en tripéptidos fácilmente asimilables y resistentes a la degradación con residuos prolina carboxi-terminales.
Ejemplo 2
Los hidrolizados de caseína sometidos a una endoproteasa específica de prolina en combinación con una tripeptidilaminopeptidasa están exentos de amargor y contienen una proporción elevada de tripéptidos que tienen residuos prolina carboxiterminales.
Se preparó una solución de caseína al 6% (p/p referido a proteína) por disolución de caseinato de sodio en agua. Después de ajustar el pH a 8,0 con NaOH, se añadió la serina-proteasa Delvolase a una concentración del 4%
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