本発明は、ペプチドまたはポリペプチドのタンパク質加水分解のための方法であって、前記ペプチドまたはポリペプチドは４〜４０、好ましくは５〜３５アミノ酸残基を含んでなり、前記ペプチドまたはポリペプチドはスブチリシンによって加水分解され得ず、それによって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、前記ペプチドまたはポリペプチドを加水分解するための６．５もしくはそれ以下、好ましくは５．５もしくはそれ以下、およびより好ましくは５．０もしくはそれ以下のｐＨでプロリン特異的エンドプロテアーゼにより加水分解される、方法に関する。好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、および最も好ましくは、少なくとも９０％のペプチドまたはポリペプチドがこの方法において加水分解される。

別の実施態様に従えば、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドのタンパク質加水分解のための方法であって、前記ペプチドまたはポリペプチドは４〜４０、好ましくは５〜３５アミノ酸残基を含んでなり、そしてトリペプチドモチーフＧｌｕ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏ、Ｇｌｎ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＰｈｅまたはＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを含んでなり、それによって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、前記ペプチドまたはポリペプチドを加水分解するための６．５もしくはそれ以下、好ましくは５．５もしくはそれ以下およびより好ましくは５．０もしくはそれ以下のｐＨでプロリン特異的エンドプロテアーゼにより加水分解される、方法に関する。好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、および最も好ましくは、少なくとも９０％のペプチドまたはポリペプチドがこの方法において加水分解される。

さらに、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドのタンパク質加水分解のための方法であって、前記ペプチドまたはポリペプチドは４〜４０、好ましくは５〜３５アミノ酸残基を含んでなり、それによって、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸残基は少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％のプロリンおよび／またはグルタミン残基を含んでなり、それによって、前記ペプチドまたはポリペプチドは、前記ペプチドまたはポリペプチドを加水分解するための６．５もしくはそれ以下、好ましくは５．５もしくはそれ以下およびより好ましくは５．０もしくはそれ以下のｐＨでプロリン特異的エンドプロテアーゼにより加水分解されるが、但し、ペプチドまたはポリペプチドは少なくとも１０％のプロリン残基を含んでなる、方法を提供する。好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、および最も好ましくは、少なくとも９０％のペプチドまたはポリペプチドがこの方法において加水分解される。

好ましくは、本発明の方法におけるペプチドまたはポリペプチドは、モチーフＧｌｎ−Ｘｘｘ−ＰｒｏまたはＧｌｕ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏを含んでなり、９もしくはそれ以上のアミノ酸残基を含有する。このペプチドまたはポリペプチドは、有利なことに、８もしくはそれ以下のアミノ酸残基を含有するペプチドに加水分解される。ペプチドまたはポリペプチドがモチーフＴｙｒ−Ｐｒｏ−ＰｈｅまたはＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを有する場合、好ましくは、ＰｒｏとＰｈｅとの間またはＰｒｏとＴｒｐとの間の結合が加水分解される。

本発明の方法において使用される好適なエンドプロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から誘導されるか、またはセリンプロテアーゼのＳ２８ファミリーに属するプロリン特異的エンドプロテアーゼである。この酵素は、好ましくは、スブチリシンによって加水分解され得ない４〜４０、好ましくは５〜３５アミノ酸残基を含んでなるペプチドまたはポリペプチドを加水分解するための６．５未満、好ましくは５．５未満、より好ましくは５．０未満の至適ｐＨ値を有する。

プロリン特異的エンドプロテアーゼは、自閉症、統合失調症、ＡＤＨＤ、双極性気分障害およびうつを含む精神障害ならびに自己免疫障害、具体的には、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性甲状腺炎、膠原病、自己免疫性脱毛および自己免疫性肝炎のようなセリアック病に関連する障害ならびにＩＢＳに関連するプロリンリッチペプチドを５．５未満のｐＨで加水分解するために使用することができる。

有利なことに、この酵素は、セリアック病関連エピトープ、好ましくはグルテンのエピトープ、より好ましくはコムギまたはオオムギのエピトープを欠く食物、例えば、ビールもしくはパンを生成するために使用される。

本発明はまた、医薬品としての使用のためかまたは医薬品の製造における使用のためのプロリン特異的エンドプロテアーゼに関し、該プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、より好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の酵素である。

本発明の別の実施態様に従えば、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、自閉症、統合失調症、ＡＤＨＤ、双極性気分障害およびうつを含む精神障害ならびに自己免疫障害（ａｕｔｏｉｍｍｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、具体的には、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性甲状腺炎、膠原病、自己免疫性脱毛および自己免疫性肝炎のようなセリアック病に関連する障害ならびにＩＢＳの処置もしくは防止のための栄養補助食品または医薬品の製造のために使用される。

有利なことに、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、年齢２５歳未満の個体のための栄養補助食品もしくは医薬品の製造のために使用される。

本発明に従えば、プロリン特異的エンドプロテアーゼはまた、自閉症、統合失調症、ＡＤＨＤ、双極性気分障害およびうつを含む精神障害ならびに自己免疫障害（ａｕｔｏｉｍｍｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、具体的には、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性甲状腺炎、膠原病、自己免疫性脱毛および自己免疫性肝炎のようなセリアック病に関連する障害ならびにＩＢＳの処置もしくは防止のための栄養補助食品または医薬品のために使用される。

さらに、本発明は、３０を超えるアミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドを加水分解するためのプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用に関する。本発明に従う使用では、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、より好ましくは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）のプロリン特異的エンドプロテアーゼが適用される。

本発明はまた、ペプシンの存在下、５もしくは５以下のｐＨで活性であるプロリン特異的プロテアーゼの使用に関する。

有利なことに、本発明は、β−カゼインＡ１またはβ−カゼインＡ２対立遺伝子を担持するウシから得られる乳タンパク質中に存在する前記ペプチドもしくはタンパク質のタンパク質加水分解の方法に関する。

タンパク質はまた、本発明の方法においても使用することができる。第１に、タンパク質は、４〜４０アミノ酸残基を含んでなるペプチドに加水分解されなければならない。タンパク質の加水分解は、本発明の方法の前、または同時に行うことができる。

さらに、本発明は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物を意図した栄養補助食品の生成のため、医薬品の生成のためまたはペットフードを含む食物の生成のための栄養補助食品として、医薬品としての６．５未満、好ましくは５．５未満、より好ましくは５．０未満の至適ｐＨ値を有するプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用に関する。

一般に、先行技術は、体内摂取の前の食物から毒性のプロリンリッチペプチドを取り出すこと、または不適切な腸内消化プロセスを補整するための調整酵素の経口的供給を目的とする。正常な消化管消化プロセスでは、酵素ペプシンによる胃内のタンパク質分解は、食餌タンパク質の分解における第１の工程であると理解される。第２の工程は、小腸、即ち、胃のすぐ下流に位置する十二指腸および空腸において生じる。十二指腸では、胃内容物の酸性ｐＨは、様々なエンド−およびカルボキシペプチダーゼをも含有する膵液の添加によって生じる。後者の酵素によって触媒されるペプシン分解食餌タンパク質のさらなる分解は、５を超えるｐＨ値で十二指腸および空腸の内腔において達成される。腸壁を超える輸送の前に、第３の工程は、腸（ｉｎｔｅｓｔｅｓｔｉｎａｌ）上皮の刷子縁表面膜におけるさらなるペプチド加水分解に関与する。後者の工程は、これらの上皮細胞の膜に位置するＤＰＰ ＩＶを含む多くのプロテアーゼによって達成される。先行技術は、いくらかの疾患を患う個体の腸において、本発明は、いくらかのこれらの上皮酵素を目的としており、とりわけ、ＤＰＰ ＩＶは部分的に不活性であるかまたは存在さえしないことを示唆している。セリアック病の患者では、これらの上皮酵素のレベルはおそらく正常であるが、このグループの個体内では、低レベルの所定のプロリンリッチペプチドであっても強力な炎症性Ｔ細胞応答を発揮することができる。先行技術において示される解決方法は、消化器官の管腔に存在する毒性のプロリンリッチペプチドのレベルを最小限にするために、経口用調整酵素をヒト消化器官に導入することである。このアプローチでは、先行技術は、できるだけ天然のヒト酵素を模倣する選択された酵素を有し、即ち、酵素は、ｐＨ５を超える条件下の消化器官において活性である。これらの先行技術の酵素は酸性条件下では活性ではないか、またはこれらの先行技術の酵素を含有するオーラル・プレゼンテーション形態は、酸性条件下でのそれらの活性を防止するために適切に被覆される。

本発明者らは、胃における酸性条件下でその主要な活性を発達する酵素が、不十分に消化されたプロリンリッチペプチドの問題に対し、より優れた解決を提供することを見出した。このアプローチは新規であり、問題を解決するために文献に記載された酵素以外の酵素を使用する可能性を開く。

上記で考察したように、いくらかの刊行物は、オピオイド代謝障害の防止におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびプロリルオリゴペプチダーゼのような酵素を使用する可能性について指摘している。さらに、中性付近のｐＨ条件下で典型的に活性であるジペプチジルペプチダーゼＩＶならびにプロリルオリゴペプチダーゼ酵素が選択される。ここで意味することは、これらの酵素のみが、ｐＨ５を超える条件下で効率的にプロリンリッチタンパク質を加水分解することである。ヒト消化管のｐＨプロフィールを考慮すると、これらの先行技術の酵素は、十二指腸の遠位部、即ち、胃よりかなり先方に到達する前に、活性になることはない。しかし、十二指腸の遠位部は、タンパク質吸収の主要部位であり、また、セリアック病患者では影響を受けることが公知である。そのため、事実上、これらの先行技術の酵素は、障害の部分を受けている場所で作用し始める。

さらに、先行技術の酵素は、プロリンリッチタンパク質の有意なプレ消化後にのみ活性になる。膵臓の酵素によるこのようなプレ消化を達成するのに必要な時間は、経口的に適用された酵素がプロリンリッチ配列の完全な加水分解を達成するのに利用可能な期間をさらに制限する。本発明に従えば、食物が小腸に侵入する前にほとんどのプロリンリッチおよび／またはグルタミンリッチタンパク質配列を分解する酵素が使用される。胃における正常な食物滞留時間は、プロリンリッチまたはグルタミンリッチタンパク質の適切な加水分解に必要な期間を提供する。さらに、本発明に従えば、好ましくは、プロリン残基のカルボキシル側でペプチドを切断することが可能であり、また、プロリン残基のカルボキシル側でかつペプシンの存在下であっても無傷なタンパク質を切断することが可能である酵素が使用される。先行技術の酵素は、胃の低いｐＨ条件下で、かつ胃に分泌されるタンパク質分解性ペプシン酵素に暴露される場合、加水分解される。しかし、これまで、そのような酸性／ペプシン安定性酵素の使用は、現在の方法では知られていない。本アプローチは、腸においてプロリンリッチペプチドを加水分解する天然のプロセスを模倣することを提唱する先行技術のアプローチの代わりに、腸に到達する前にプロリンリッチペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の実質的な分解を生じる。本発明の方法において使用される好適な酵素は、５未満のｐＨ値、ペプシンの存在下で活性である酵素であり、食餌タンパク質またはポリペプチドならびにペプチドを分解することが可能である。先行技術の解決方法は、常に、食餌タンパク質をペプチドにプレ加水分解する補酵素を必要とし、その後にのみ、さらなるプロリン特異的酵素がそれらの活性を展開し始めることができる。

「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書において、ペプチド結合を介して連結される２〜３０アミノ酸残基の鎖として規定される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、同義（共通認識される）とみなされ、各用語は、状況に応じて交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書において、３０を超えるアミノ酸残基を含有する鎖として規定される。

スブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、好ましくは、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇによって加水分解され得ない４〜４０アミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドは、２０ｇ／ｌタンパク質および１グラムのタンパク質あたり０．１２ＡＵ−Ａ（アンソン単位アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ））プロテアーゼ単位の酵素対基質を含有する懸濁液または溶液において、ｐＨ８．０ならびに６０℃で２時間のインキュベーション後にも無傷（ｉｎｔａｃｔ）を保持するペプチドまたはポリペプチドであると理解される。ＡＵ−Ａプロテアーゼ単位は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（丁国）により提出された分析方法ＬＵＮＡ番号２００３−３２１５３−０１において特定されるように規定される。無傷な（ｉｎｔａｃｔ）とは、インキュベーション後、本来のペプチドまたはポリペプチドが８０％を超え、好ましくは９０％を超え、より好ましくは、９５％を超えて得られる酵素反応産物を形成することを意味する。実際には、酵素消化は、示される条件下、および存在する１グラムの基質タンパク質あたりの４０マイクロリットルのアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）を使用して、行われる。そのような非加水分解性ペプチドの例は、実施例４に記載のβ−カゼイン加水分解から得られるＶＹＰＦＰＧＰＩＰＮペプチドである。そのような非加水分解性ポリペプチドのもう１つの例は、実施例６に記載の３３マーである。

オリゴペプチダーゼは、ＥＣ３．４．２１．２６として分類される酵素であり、セリンプロテアーゼｃｌａｎＳＣのファミリー、ファミリーＳ９に属する。

本明細書に記載のすべての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、定法に従い、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、左から右に記載される。本明細書において使用するアミノ酸の１文字コードは、当該分野において一般に公知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）において見出すことができる。アミノ酸Ｘｘｘ、Ｘａａ、ＸｂｂまたはＸｃｃは、任意のアミノ酸であることが意図される。モチーフとは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の部分であるアミノ酸配列を意味する。ここで、グルタミン（ＱもしくはＧｌｎ）は、グルタミンまたはグルタミン酸（ＥもしくはＧｌｕ）であることが理解される。例えば、化学的に脱アミド化されたグルテンでは、存在する天然のグルタミン残基の大きな部分が、グルタミン酸に変換される。そのため、モチーフＧｌｎ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏはまた、モチーフＧｌｕ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏも含んでなっている。また、他のペプチドでは、ポリペプチドまたはタンパク質のグルタミン（ｇｌｕｍｉｎｅ）を、例えば、ｐＨ条件、温度によりまたは例えば、トランスグルタミナーゼによる酵素変換によって、グルタミン酸に変換することができる。

プロリンリッチペプチドまたはポリペプチドとは、４〜４０アミノ酸残基を含んでなるペプチドまたはポリペプチドを意味し、ここで、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸残基は、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％のプロリンおよび／またはグルタミン残基を含んでなるが、但し、ペプチドまたはポリペプチドは少なくとも１０％のプロリン残基を含んでなる。栄養補助食品は、ＤＳＨＥＡ、以下の食餌成分の１つもしくはそれ以上を有するかまたは含有する食餌を補助することを目的とした製品（タバコ以外）の適応された規定に従う：酵素を含むタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物性薬品、アミノ酸、全摂取量を増加することによって食餌を補助するためのヒトによる使用のための食餌物質、または濃縮物、代謝物、構成物、抽出物、あるいはこれらの成分の組み合わせ。

さらに、栄養補助食品は、
・丸剤、カプセル剤、錠剤、または液体剤形での摂取を目的とする。
・従来の食物としてまたは食事もしくは食餌の単独の品目としての使用には該当しない。
・一般に、「栄養補助食品」として標識される。
・承認された新規の薬物、保証された抗生物質、または承認、保証、もしくは認可前に食物の栄養補助食品として市販された認可された生物工学製品のような製品を含む（但し、Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓがこの条項を放棄する場合を除く）。

毒性のプロリンリッチペプチドまたはポリペプチドは、オピオイド受容体への結合または精神もしくはセリアック障害の発達もしくは重症度において関連するペプチドまたはポリペプチドである。

精神障害としては、自閉症、統合失調症、ＡＤＨＤ、双極性気分障害ならびにうつが挙げられる。

セリアック病に関連する障害は、自己免疫障害、具体的には、１型糖尿病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性甲状腺炎、膠原病、自己免疫性脱毛および自己免疫性肝炎である。

ＩＵＭＢ由来のすべての酵素の分類および命名法についての国際的に認められたスキームは、プロテアーゼを含む。プロテアーゼＥＣ番号の更新されたＩＵＭＢテキストは、インターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ／ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／４／１１／で見出すことができる。このシステムでは、酵素は、それらが単一の反応を触媒するという事実によって規定される。該システムは、プロテアーゼをエンドおよびエキソプロテアーゼを分類する。エンドペプチダーゼは、内部のペプチド結合を加水分解するそれらの酵素であり、エキソプロテアーゼは、末端のα−アミノ基に隣接するペプチド結合（「アミノペプチダーゼ」）、または末端のカルボキシル基と最後から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合（「カルボキシペプチダーゼ」）を加水分解する。エンドペプチダーゼは、触媒機構に基づいてサブ‐サブクラスに分けられる。セリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブ‐サブクラスが存在する。

国際公開第０２／４５５２４号パンフレットは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から入手可能なプロリン特異的エンドプロテアーゼについて説明している。驚くべきことに、本発明者らは、今回、このアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素は、胃の酸性条件下で本方法において有利に使用され、これらの条件下でも無傷な食餌タンパク質、ポリペプチドならびにより小さなペプチド分子を加水分解することができることを見出した。さらに、この酵素は、酸性条件で酵素ペプシンの存在下でも残存し、十二指腸通じてその活性を継続するようである。本発明者らは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが、活性ならびに進化の観点から既知のプロリン特異的プロテアーゼおよび国際公開第０３／０６８１７０号パンフレットにおいて特定されるグルテナーゼとはまったく異なることを実証している。後者の特徴は、国際公開第０３／０６８１７０号パンフレットにおいて特定されるグルテナーゼとＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素との間のアミノ酸配列相同性が、グローバルアラインメントアルゴリズム解析を使用して典型的に２０％未満であるという事実により十分に実証される。この結果は、プロリルオリゴペプチダーゼが、本発明に従うプロリン特異的エンドプロテアーゼが単離されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のような真菌では発生しないという現在の観点（ヴェナライネンＪ．Ｉ．（Ｖｅｎａｅｌａｅｉｎｅｎ，Ｊ．Ｉ．）ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ２７１，２７０５−２７１５（２００４））と一致する。

本発明に従うかまたは本発明に従って使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼとは、例えば、本明細書において参考として援用される国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３に記載のポリペプチドを意味する。従って、このプロリン特異的エンドプロテアーゼは、以下よりなる群から選択されるプロリン特異的エンド型プロテアーゼ活性を有するポリペプチドである：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６またはそのフラグメントと少なくとも４０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）低いストリンジェンシー条件で、（ｉ）少なくとも８０％もしくは９０％同一な６０を超える、好ましくは１００を超えるヌクレオチド、より好ましくは少なくとも９０％同一な２００を超えるヌクレオチドである配列番号１の核酸配列またはそのフラグメント、あるいは（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列、とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。配列番号１および配列番号２は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示される通りである。好ましくは、ポリペプチドは単離された形態である。

好適なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、およびさらに最も好ましくは少なくとも約９７％同一性を有するかまたは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。

好ましくは、ポリペプチドは、低いストリンジェンシー条件、より好ましくは中等度のストリンジェンシー条件、および最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１の核酸配列もしくはそのフラグメント、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。

用語「ハイブリダイズすることが可能」は、本発明の標的ポリヌクレオチドが、プローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント、または配列番号１の相補物）に、バックグランドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的であるヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含むＤＮＡであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび最も好ましくは、ゲノムＤＮＡ配列である。典型的に、本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で、コーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチドの連続配列を含んでなる。そのようなヌクレオチドは、当該分野において周知の方法に従って合成することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、コーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物に、バックグランドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーに存在する他のｃＤＮＡのため、バックグランドのハイブリダイゼーションが生じ得る。本発明のポリヌクレオチドとコーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物との間の相互作用によって作製されるシグナルレベルは、典型的に、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコーディング配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも１００倍の強度である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば、^３２Ｐで放射性標識することによって、測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的に、低いストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約４０℃）、中等度のストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃）または高いストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約６０℃）の条件を使用して、達成することができる。

ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、そのデフォルト設定値に対して使用される）同一性を算出するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する。

ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ Ｎアルゴリズムを使用して、配列同一性を算出するかまたは（例えば、それらのデフォルト設定値に対する等価もしくは対応する配列を同定するような）配列を列挙することができる。

ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと共に整列される場合、いくつかのポジティブ評価された閾値スコアＴに一致または満たすかのいずれかである問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアリング配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を第１に同定することに関与する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される。これらの初期の隣接ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を初期化するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向において拡張される。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下する場合；１つもしくはそれ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの累積により累積スコアが０もしくはそれ以下となる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合、各方向におけるワードヒットの拡張は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の示度を提供する最小の全確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、配列は、第１の配列と第２の配列との比較における最小全確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、もう１つの配列に類似であるとみなされる。

本発明に従う酵素は、好ましくは、真菌、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、より好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から得られる。そのため、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素は、酸性安定であり、好ましくは、胃において示現するｐＨ条件下でのペプシンの存在の影響を受けない真のエンドペプチダーゼとして見出される。フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得ることができる酵素を一般に含むプロリン特異的オリゴペプチダーゼは、ｐＨ５以下でほとんど活性を有さず、低ｐＨおよび酵素ペプシンの存在の組み合わせにより不活化される。さらに、プロリン特異的プロテアーゼは、一般に、無傷なタンパク質を分解することができず、より小さなペプチドのみ、即ち、約３０アミノ酸残基の長さまでのペプチドを効率的に加水分解することが見出された。

本発明は、毒性のプロリンリッチペプチドもしくはオピオイド代謝障害の現象を延期または最小限にする経済的な食品用組成物を提供する。組成物は、食物的、薬学的および獣医学的使用に適した経口用酵素処方ならびに有意に低減されたレベルのオピオイドまたは毒性プロリンリッチペプチドを伴うタンパク質加水分解物および食品の生成に適した酵素処方を含む。

本発明は、精神障害もしくはセリアック病またはオピオイド代謝障害の発達に関連するプロリンリッチペプチドまたはポリペプチドを加水分解するための方法を開示する。本発明はまた、幼児におけるかもしくは一般に年齢２５歳未満の個体のそのような障害の発達を防止または遅延することができる食物を生成する方法についても開示する。また、セリアック病およびＩＢＳに関係する胃の症状を患う人により良好に忍容性である食物は、そのような方法によって調製することができる。本発明の実施形態は、体内摂取前のこれらのプロリンリッチペプチドまたはポリペプチドの分解に関連付けられ、それによって、身体の毒性プロリンリッチペプチドへの暴露が防止または最小限にされる。幼児では、これによりオピオイドへの早期の暴露が回避され、未成熟な免疫系は、そのような毒性のプロリンリッチペプチドに感作されない。また、十代および成人については、低いレベルの毒性プロリンリッチペプチドを含有する食餌は、例えば、看過され得るセリアック病またはＩＢＳを患うヒトに対し予防的利益を有する。本発明はまた、胃、即ち、酸性ｐＨ条件下、好ましくはｐＨ５未満の条件下で、これらの毒性のプロリンリッチペプチドまたはペプチドの身体（ヒトもしくは動物）における分解に安定な酵素の補充に関する。後者の実施態様に従えば、セリアック病、セリアック病の発症に関係する疾患またはこれらのペプチドまたはポリペプチドの分解に必要な低いレベルの身体中プロリン特異的プロテアーゼによって生じる疾患を患うヒトが、胃および十二指腸の近接部において関連のプロリンリッチペプチドまたはポリペプチドを分解することも可能である。さらに、本発明に従う酵素は、保護被覆を必要としない。

好ましくは、中性ｐＨ条件下でのペプチドもしくはポリペプチドまたはタンパク質とスブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、好ましくは、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のスブチリシン（またはスブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ）とのインキュベーション時に形成される少なくとも８０％の毒性プロリンリッチペプチドまたはポリペプチドが、本発明に従うプロリン特異的エンドプロテアーゼによって加水分解される。そのようなスブチリシン耐性ペプチドの形成を、本出願の実施例４に例示する。そのようなスブチリシン耐性プロリンリッチペプチドは、しばしば、上記の疾患と関連付けられる。これらのペプチドの例には、ＢＣＭ−７、ＢＣＭ−７関連ペプチド、即ち、β−カゼイン分子の位置６０〜６３に存在するアミノ酸配列ＹＰＦＰを含んでなるペプチドがある。さらに、モチーフＧｌｎ−Ｘｘｘ−Ｐｒｏ（Ｑ−Ｘ−Ｐ）を含んでなるグリアジン由来ペプチド、例えば、ＰＹＰＱＰＱＬＰＹエピトープ、ならびにグリアジン、ホルデイン、セカリンまたはアベニンから得ることができるこのＱ−Ｘ−ＰまたはＥ−Ｘ−Ｐモチーフを含んでなる他のスブチリシン耐性分子がその例である。スブチリシンによる加水分解によって形成され得るプロリンリッチペプチドのうち、より好ましくは、少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９５％および最も好ましくは、少なくとも９９％が、本発明に従うプロリン特異的エンドプロテアーゼを使用することによって分解されるか、または形成されない。最も好ましくは、これらのプロリンリッチペプチドは、ｐＨ５．５未満の条件下で本発明の方法に従って分解することができる。

必要とする酵素を供給する１つの方法は、例えば、食餌中プロリンリッチペプチドまたはポリペプチドの胃腸消化を援助するために食物と共に同時摂取される安定化された酵素処方としての消化剤の形態であり得る。もう１つの方法は、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素によって「予め消化された」タンパク質食物を使用することによって、問題のある毒性のプロリンリッチ配列の摂取を防止または制限することである。そのようなタンパク質食物は、加水分解物、例えば、グルテンまたは乳タンパク質加水分解物の形態で供給され得、多量の遊離アミノ酸を遊離するためのエンド−ならびにエキソプロテアーゼによって広範に消化されている加水分解物を含む。後者のアプリケーションの典型的な例は、とりわけセイボリーアプリケーションのためのグルタミン酸に富むグルテン加水分解物の作製であり得る。加水分解物は、そのままの形で体内摂取され得るか、または食物成分として役立ち得る。別の方法では、本発明は、組成物が本発明に従う酸性に安定なプロリン特異的エンドペプチダーゼを含んでなることを特徴とする食品の忍容性を改善するための組成物の使用を提供する。さらに別の方法では、本発明は、食品の改善された忍容性のための酸性に安定なプロリン特異的エンドペプチダーゼの添加を含んでなる食品を調製するための方法を提供する。すべてのそのようなアプリケーションにおいて、プロリン特異的酵素は、いわゆる加工助剤として使用され得る。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の株は食物用として位置付けられており、これらの微生物由来の酵素は、思いも寄らない食物用供給源を形成することが公知である。別の好適な実施態様に従えば、酵素は、非分泌型のいわゆるサイトゾルまたはペリプラズム酵素を提示するのではなく、その産生細胞によって分泌される。この方法では、酵素は、高価な精製工程を伴わずに、本質的に純粋な状態で細胞ブロスから回収することができる。好ましくは、酵素は、示現するｐＨおよび温度条件下でその基質に対して高い親和性を有する。好ましくは、酵素は、消化管の当該関連部位のｐＨで、消化管タンパク質分解酵素、例えば、ペプシンまたはトリプシン、エラスターゼおよびキモトリプシンによって不活化されない。より好ましくは、酵素は、胃ならびに十二指腸において活性であり、保護被覆を必要としない。

ヒトの消化管は、異なるコンパートメントの連続である。食物が摂取され、嚥下された後、それは、胃に到達し、ここで、それは酸およびエンドペプチダーゼのペプシンと混合される。胃における固形食物の典型的な残留時間は、１〜数時間の範囲である。幽門が時々開放することにより、酸性化されかつ部分的に加水分解された食物を小腸に流動させることが可能である。小腸の第１の部分、即ち、十二指腸では、胆汁ならびに膵液が添加される。膵液は、胃の内容物を部分的に中和するための重炭酸塩を含有する。膵液はまた、プロテアーゼのさらなる組、即ち、エンドペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼならびに胃においてペプシンにより形成されるペプチドおよびポリペプチドをさらに分解するためのカルボキシペプチダーゼＡおよびＢを含有する。十二指腸後、消化物は空腸に到達する。十二指腸および空腸は、消化管におけるタンパク質吸収の主要な部位である。このような吸収プロセスは、腸管上皮の刷子縁細胞に固定された異なるプロテアーゼによる食餌タンパク質のさらなるタンパク質分解に関与する。後者の加水分解は、腸壁の上での小さなペプチドならびに遊離のアミノ酸の促進された輸送によって達成される。小腸の最後の部分は回腸によって形成され、その後、消化物は大腸（直腸）に進入する。直腸では、集中的な発酵が存在するが、アミノ酸またはペプチドの吸収は認められない。

セリアック病患者によるグルテンの摂取により、近位小腸の病巣がもたらされる。腸絨毛の萎縮は、そのような病巣の１つの最も特徴的な特徴である。この絨毛の萎縮は、空腸に限定されず、遠位の十二指腸においても実証され得る（メイジャー，Ｊ．Ｗ．Ｒ．（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｒ．）ら；Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．２００３年２月；４４２：１２４−１２８）。このような観察は、セリアック病の患者における毒性のプロリンリッチペプチドの損傷の影響は、胃のすぐ下流の領域において常に明らかであることを示す。本発明者らは、セリアック病の症状の防止を目的とする酵素療法が、消化管のより遠位部ではなく、胃における関連のプロリンリッチペプチドを加水分解することを意図すべきであることを見出した。有利なことに、酵素療法において適用される酵素の活性は、胃において作用し始め、十二指腸においても継続して活性であるほどである。本発明者らは、精神、呼吸器および循環器障害の発達において役割を果たすオピオイドペプチドもまた、胃において最も良好に破壊されることを見出した。十二指腸および空腸はタンパク質吸収の主要部位であるため、小腸のこの部位における毒性ペプチドのレベルは、これらの毒性ペプチドの存在に関係する症状を最小限にするためにできるだけ低くあるべきである。

消化剤としての使用では、調整酵素は、３７℃の温度で十分に活性あるべきであり、好ましくは、胃における酸性条件下で残存するために低い至適ｐＨ値を有するべきである。公開されたデータに従えば、摂取された食物の酸性度は、摂取の３０分後、初期値のｐＨ５からｐＨ３．５に減少し、続いて、摂取６０分後にさらにｐＨ２に減少する（論文マンス・ミンクス（Ｍａｎｓ Ｍｉｎｋｕｓ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔｒｅｃｈｔ；蘭国；ＩＳＢＮ：９０−３９３−１６６６−Ｘ）。そのため、酵素療法を意図する理想的な酵素は、２のような低いｐＨ値下で活性であるべきである。胃内容排出に関する研究では、摂取４５分後、固形食物のほぼ９０％がなお胃に存在することが示されている（Ｒ．ノチボル（Ｒ．Ｎｏｔｉｖｏｌ）ら、１９８４年、Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９：１１０７−１１１３）。胃より先では、食物のｐＨは緩徐に上昇して、十二指腸の遠位部、即ち、幽門部より約５０ｃｍ先で５のｐＨに到達する（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン市、１９６８年、ベルナー・ハイデル（Ｗｅｒｎｅｒ Ｈｅｉｄｅｌ）編；セクション６：Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ Ｃａｎａｌ、第１１１巻、１４５７−１４９０頁）。国際公開第０３／０６８１７０号パンフレットでは、患者による摂取の前または後のいずれかで、食材中の毒性グルテンオリゴペプチドのレベルを減少することができる異なる「グルテナーゼ」が特定されている。用語「グルテナーゼ」は、プロテアーゼまたはペプチダーゼ酵素、より具体的には、グルテンタンパク質の毒性オリゴペプチドを切断して非毒性のフラグメントにすることが可能であるプロピル特異的プロテアーゼを指す。これらのすべてのグルタナーゼのすべては、典型的に腸において活性であることが意図されるため、それらは、中性付近のｐＨ条件下で、最適に活性である。国際公開第０３／０６８１７０号パンフレットは、胃または十二指腸の近接部ではなく、十二指腸中もしくはそれより先における毒性のプロリンリッチペプチドの分解について教示している。さらに、国際公開第０３／０６８１７０号パンフレットは、存在する酵素が胃を通過し、中性ｐＨ条件下の腸においてのみ活性となるように、低いｐＨで酵素活性を遮蔽するいわゆる腸溶コーティングによって保護される酵素調製物を目的とする。

タンパク質加水分解物の生成における産業用加工助剤として使用される場合、酵素は、非滅菌産業的条件下での微生物学的に安全なインキュベーションを可能にする条件下で、十分に活性であるべきである。少なくとも５０℃のプロセシング温度およびｐＨ５．５よりも十分に低いｐＨ値での適切な酵素活性は、これらの要件を満たす。

担子菌アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（サッタル（Ｓａｔｔａｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７，２５６−２６１（１９９０））および非関連の子嚢菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（国際公開第０２／４５５２４号パンフレット）は、両方とも、細胞外プロリルエンドペプチダーゼを産生することが明らかにされている。しかし、担子菌から得られる酵素は、５未満のｐＨ値では残存せず、従って、あまり興味を引かない。好ましくは、酸性の至適ｐＨ値を有するＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来のプロリルエンドペプチダーゼが使用される。

本発明は、低コスト、法的許容性とプロリンリッチペプチド配列に対する酸性ｐＨ条件下で証明された有効性とを組み合わせた酵素調製物を提供する。好ましくは、同酵素を使用して、Ａ１ならびにＡ２型β−カゾモルフィンだけではなく、多様なグルテンのエピトープをも分解することができる。

このアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、プロリンリッチペプチドまたはポリペプチドまたはさらにタンパク質の分解において極めて活性であることが見出されている。有利なことに、この酵素は、産生微生物によって発酵ブロスに分泌され、酸性の至適ｐＨ値を有し、食物用かつ経済的方法で産生させることができる。関連のβ−カゾモルフィンペプチドは、分子中に４個までのプロリン残基を含有し、さらに、Ａ１およびＡ２β−カゾモルフィンは異なるアミノ酸配列を有する。かなり驚くべきことに、本発明者らは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素が位置６１のプロリンのＣ末端側でβ−カゾモルフィンを加水分解することが可能であり、従って、Ａ１またはＡ２β−カゼインの両方について、すべてのＢＣＭ−７およびＢＣＭ−７関連ペプチドを効率的に不活化することを見出した。本発明者らは、例えば、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）のように市販のスブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６４）のような広い基質特異性を伴う広範に使用されかつ高度に強度のエンドペプチダーゼが、ＢＣＭ−７を分解することができないことを見出したため、これはかなり注目に値する。同様に、産業上利用可能なプロテアーゼは、ＢＣＭ−７を分解することができない。事実、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、β−カゾモルフィン（ｂｅｔａ−ｃａｓｏｍｏｐｈｉｎｅ）を、但し、かなり驚くべきことに、ＢＣＭ−７に存在する４個のプロリン残基のうちの１箇所のみで加水分解することができる。それにもかかわらず、この特定のプロリン残基に対するこの特定のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素の特異性のため、ＢＣＭ−７ならびにすべてのＢＣＭ−７関連分子は、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフが酵素によって切断されるため、この酵素とのインキュベーションによって効率的に分解される。さらに、β−カゼイン由来のＡ１ならびにＡ２から誘導されるＢＣＭ−７分子は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションによって不活化される。

真のプロリン特異的エンドプロテアーゼの利点は、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、酵素とタンパク質とを接触させるときに直ちにプロリンリッチ配列を加水分解し始めることができることである。プロリルオリゴペプチダーゼは、例えば、他の消化管エンドペプチダーゼによって、グルテンまたはカゼイン分子の有意なプレ消化後にのみ活性になることができる。必要とされる広範な分解および食物が小腸に進入する前に利用することができる限られた時間の観点から、真のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、既知のオリゴペプチダーゼを超える重要なアプリケーションの利点を有する。真のプロリン特異的エンドペプチダーゼの別の利点は、グルテン構造の全体的な破壊を伴わずに、グルテン中の毒性プロリンリッチペプチドのレベルを減少するために、それを産業的に使用することができることである。例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素と共にコムギグルテンのペーストを押し出し形成すると、いくつかの残留する基本構造特性を伴うが、強度に減少したレベルの毒性プロリンリッチペプチドを伴う生成物を生じる。プロリルオリゴペプチダーゼによる毒性プロリンリッチペプチドの同じような減少を達成するために、他のプロテアーゼによるほとんどすべてのプレ加水分解が、３０アミノ酸残基未満の所望されるペプチド長を達成するのに必要であり得る。これにより、グルテンのすべての関連する物理化学的特性の完全な消失、即ち、生地の固さが消失し、許容可能な形状および容積でパンを焼くことができなくなることは言うまでもない。ディ・カグノ（Ｄｉ Ｃａｇｎｏ）ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第７０（２）巻、１０８８−１０９６、２００４年）は、セリアックスプルー患者によって良好に忍容されるサワー種のパンの作製について報告している。彼らのアプローチでは、高い割合の非毒性小麦粉で調製した生地を使用し、これを選択されたラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）で２４時間の期間、発酵させることによって、毒性のプロリンリッチエピトープのレベルを最小限にした。彼らの結果は科学的には確かに興味深いが、２４時間もの長い産業環境での発酵期間は、経済的に容易ではないことは明白である。さらに、彼らの高い割合の非毒性小麦粉は、「規格通りの」グルテンが不足し、そのため最終的なパンの容積が制限されることを含意する。従って、現存の産業的手順を使用するが、毒性プロリンリッチペプチドのレベルが制限される１００％コムギパンの生産を可能にする経済的な方法の役に立つことは有利である。そのようなパンは、毒性ペプチドの日々の摂取量を減少することを目的とする食餌の重要な成分となることができる。そのような食餌と特別な関連性がある消費者グループとして、幼児、ＩＢＳを患う若年者、高齢者ならびに記載の疾患および症状を患う個体が挙げられる。セリアック病の患者では、５０ミリグラム未満のグルテンの日々の摂取は安全とみなされるが、平均的な欧米での消費量である１日あたり１３グラムのグルテンに存在する量より有意に少ない毒性プロリンリッチペプチドを含有する任意の食餌は、上記の消費者グループにとって有益であるようである。

総合的に見ると、これらの考慮から、先行技術において記載の酵素よりもＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素は新規であり、かなり有利であることが示される。本発明に従う酵素を含有する組成物は、グルテンの感作またはオピオイド代謝障害の現象もしくはＩＢＳの現象を抑制あるいは遅延させるために有利に使用される。そのような組成物を消化剤として適用し、毒性プロリンリッチペプチドの消化管でのインサイチュ減少を達成することができる。あるいは、そのような組成物を加工助剤として適用し、そのような毒性のプロリンリッチペプチドを伴わないタンパク質加水分解物を生成させることができる。タンパク質加水分解物の分野内では、ビールの醸造は、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来、低いｐＨのプロリン特異的エンドプロテアーゼの適用が驚くべき数の利点を付与する特別な場合を提供する。国際公開第０２／０４６３８１号パンフレットは、ビール糖化工程中またはビールのろ過前もしくはビールのラガーリングの前のいずれかに適用されるプロリル特異的エンドペプチダーゼは、ビールの濁りの形成を減少することを教示している。本発明者らの示すデータは、低いｐＨ酵素との適切なインキュベーションもまた、穀物由来毒性プロリンリッチプロリンリッチペプチドのレベルを減少することを例示する。驚くべきことに、本発明者らは、穀物タンパク質を含有するビールまたは他の飲料をプロリン特異的エンドペプチダーゼで処置すると、濁りのレベルが減少するだけではなく、セリアック病を患うヒトに安全な製品がもたらされることを見出した。

本出願の実施例１は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの酸性の至適ｐＨ値および理想的な至適温度を示している。実施例２および３では、本発明者らは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）より産生可能なプロリン特異的エンドプロテアーゼが、より小さなペプチドまたはポリペプチドと同じ効率で大きな無傷なタンパク質を切断することができる真のプロリン特異的エンドプロテアーゼであることを示している。事実、本発明者らのデータは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素が、既知のオリゴペプチダーゼが属するＳ９ファミリー（Ｎ．Ｄ．ローリングス（Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ）およびＡ．Ｊ．バレット（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２４４巻、１９−６１頁、１９９４年；Ｎ．Ｄ．ローリングス（Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ）およびＡ．Ｊ．バレット（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ１２９８（１９９６年）１−３）ではなく、Ｓ２８ファミリーの新規のメンバーであることを示している。本発明者らは、既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは対照的に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリルエンドペプチダーゼが、胃における酸性条件下で活性であり、大きなプロリンリッチタンパク質フラグメントおよびポリペプチドの加水分解に対して高い有効性を示すことを見出した。そのような高い効率は、実施例４、５および６において例示される。実施例４では、本発明者らは、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（タンパク質加水分解物の生成において頻繁に使用される強力な広域スペクトルのプロテアーゼ）によるミルクタンパク質加水分解物の生成中に、ＢＣＭ−７配列を組み入れたいくらかのペプチドが、加水分解方法において残存することを実証している。しかし、これらのペプチドは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリルエンドペプチダーゼとの酸性条件下でのインキュベーション時に迅速に消滅する。実施例５に提供されるデータは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の酵素が、β−Ａ２カゼイン由来ＢＣＭ−７分子において利用可能な４個のプロリン残基のうちの１つでしか切断しないという驚くべき事実を表している。これは、プロリンリッチ基質と任意のプロリン特異的プロテアーゼとのインキュベーションが、劇的に増加した酵素／基質比の条件下であっても、プロリン残基を含むすべてのペプチド結合の切断を自動的に含意するわけではないことを示す。実施例６では、本発明者らは、セリアック病の患者において主要なエピトープであることが要求されるグリアジン由来３３マーに対するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリルエンドペプチダーゼの有効性について実証している。また、広域スペクトルのアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）は、アルカリ性または酸性条件下のいずれでも、この分子を切断することができないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素は、頻繁に、酸性条件下で分子を切断し、最大で６アミノ酸残基の長さを伴う９９．５％のペプチドが作製される。そのため、酸性条件下でのプロリンリッチペプチドに対するその高い有効性にもかかわらず、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素でさえ、アミノ酸配列ＹＰＱＰＱＬＰを伴う少なくとも０．５％のヘプタマーを遊離する。配列ＰＹＰＱＰＱＬＰＹが既知のセリアック病の患者に特異的なＴ細胞エピトープであるため、この所見は、最適とは言えないプロリン特異的酵素、例えば、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から誘導される酵素を含む既知のプロリン特異的オリゴペプチダーゼでは、グルテン分子由来の毒性ペプチドの形成を防止するための現実的なインビボアプリケーションが、実現不可能であることを証明することを例示している。後者の結論は、実施例７および８において示される実験によって確認される。実施例７では、本発明者らは、ｐＨ２〜１２の間で、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとＦ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来プロリン特異的オリゴペプチダーゼとの活性プロフィールを比較している。Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素はｐＨ２．５〜７．０の間で活性を示すが、Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の酵素は、活性になるために、５．０を超えるｐＨを必要とする。実施例８では、本発明者らは、両方のプロリン特異的酵素を、胃の酵素ペプシンの非存在下および存在下で低いｐＨ条件に暴露することによって、胃における状況を模倣している。個々の酵素に至適なｐＨ条件下でのその後の活性測定は、Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の酵素がｐＨ２またはｐＨ３条件下でも残存することができることを示している。ペプシンの存在下では、Ｆ．メニンゴゼプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の酵素は、ｐＨ４で既に不可逆的な損傷を受ける。対照的に、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素は、ｐＨ２の低いｐＨ条件下およびペプシンの存在下でも残存し、それによって、胃において毒性ペプチドを加水分解するその価値が強調される。実施例９では、本発明者らは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素が多数の既知のＨＬＡ−ＤＱ２グルテンのエピトープを切断することができることを例示している。興味深いことに、観察される切断部位の位置から、文献から公知のすべてのＴ細胞のエピトープが破壊されることが推定される。実施例１０では、本発明者らは、１００％麦芽ビールおよび１００％コムギパンからグルテンのエピトープを回収し、本発明者らが抗体アッセイにおいてこれらのエピトープを検出することができることを実証している。実施例１１では、本発明者らは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素を生産プロセスに組み入れることによって生成されるビールが、認知されうる程度に低減されたレベルのグルテンのエピトープを生じることを実証している。実施例１２では、本発明者らは、酵素をコムギ生地に組み入れ、低減されたレベルのグルテンのエピトープでダッチ（Ｄｕｔｃｈ）型焼きパンを生成することによって、類似の効果を得ることができることを示している。

グルテンは、複雑な３次元構造を伴う水に不溶な化合物である。そのプロリンリッチアミノ酸組成物との組み合わせにおけるこれらの特性により、胃および腸でのタンパク質分解に対し、グルテン分子を耐性にする。消化管腔に分泌される天然のタンパク質分解活性のうち、プロリンに関与するペプチド結合を切断することが可能である活性は存在しないため、共同作用性の内因性プロリン特異的酵素を使用することが理解される。しかし、セリアック病を患うヒトは、グルテンに存在する多くのエピトープに対して極めて感受性であることができる。本発明に従えば、天然の消化プロテアーゼの効果は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリルエンドペプチダーゼで改善することができ、このタンパク質分解混合物の加水分解能のさらなる増強についてさえも本明細書胃おいて開示する。

負に荷電した残基、例えば、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）を含むペプチド結合が、プロテアーゼに対して不十分な基質を形成することは周知である。また、天然の消化管タンパク質分解酵素は、これらの残基を処理することができず、これは、グリアジンから胃および膵プロテアーゼ耐性ペプチドＷＱＩＰＥＱＳＲを単離することによって証明される（シャン（Ｓｈａｎ）らを参照のこと）後者の刊行物はまた、グルテンに普遍的に存在するグルタミン残基（Ｑ）を、組織トランスグルタミナーゼによって、グルタミン酸残基（Ｅ）に脱アミド化することができることを明らかにしている。不幸なことに、グリアジンペプチドのこの位置特異的脱アミノ化は、それらの潜在的免疫原性をさらに増加する。このような背景に対し、本発明者らは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼと補助的なエンドペプチダーゼとの有効な酵素の組み合わせを生じさせ、プロリンリッチ毒性プロリンリッチペプチドの形成を防止することを可能にしている。本発明に従えば、グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１９）、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような多くの食物用微生物によって過剰分泌される該グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼを使用することができる。これらの酵素は、経済的かつ食物用の方法で産生させることができる。胃を安全に通過する酵素が、それらの酵素活性に関して、好適である。一般に、該酵素は、酸性または中性の至適ｐＨ値を有する。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロリルエンドペプチダーゼとの組み合わせで、グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼのこのカテゴリーは、低いレベルの毒性プロリンリッチペプチドを伴うタンパク質加水分解物の産生において、有用であるとみなされる。

かなり驚くべきことに、本発明者らの示す研究は、グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼとは別に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションに対して相乗効果を有する他のエンドペプチダーゼが存在することを実証している。本発明者らは、アミノ酸残基Ｑ（グルタミン）とＬ（ロイシン）との間を切断することが可能なエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１−９９）は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のプロリン特異的エンドペプチダーゼと有利に組み合わせられると結論している。具体的には、ｐＨ５．０未満の至適ｐＨ値を有し、基質のＰ１またはＰ１^’位置においてグルタミンまたはロイシン残基のいずれかを選好するエンドプロテアーゼ、例えば、アスペルギロペプシン（ＥＣ３．４．２３．１８および１９）ならびにムコールペプシン（ＥＣ３．４．２３．２３）が有利に使用される。

本発明に従う酵素の１つのアプリケーションは消化剤としてのそれらの使用である。本出願では、本発明の組成物は、好ましくは経口的に投与されるが、他の直接的経路を介してとよしてもよい。組成物は、典型的に、ヒトに投与されるが、増加したグルテン感受性またはカゼインもしくはグルテンの代謝障害あるいはＩＢＳに典型的な症状を緩和するために、動物、好ましくは哺乳動物に投与してもよい。消化剤としてのそれらのアプリケーションでは、本発明に従う酵素は、例えば、丸剤、錠剤、顆粒剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）またはカプセル剤中の乾燥粉末として処方してもよい。あるいは、本発明に従う酵素は、例えば、シロップ剤もしくはカプセル剤中の液体として処方してもよく、または０．８５未満の水分活性（Ａｗ）を伴う食品に組み入れてもよい。多様な処方物において使用され、かつ本発明に従う酵素を含有する組成物はまた、生理学的に許容可能なキャリア、アジュバント、賦形剤、安定剤、緩衝液および希釈剤よりなる群の少なくとも１つの化合物を組み入れてもよく、該用語は、包装、送達、吸収、安定化、またはアジュバントの場合には、酵素の生理学的効果を増強することを援助する物質を示すためにそれらの常識的な意味で使用される。粉末化された形態において本発明に従う酵素と組み合わせて使用することができる多様な化合物に関する関連背景は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃに見出すことができる。乾燥粉末として処方される本発明に従う酵素は、幾分長期間保存することができるが、水分または多湿な空気との接触は、例えば、アルミニウムブリスターのような適切な包装を選択することによって、回避すべきである。液体形態で処方する場合、酵素活性を安定化するためおよび防微生物のために使用される化合物は重要な役割を果たす。酵素活性の安定化は、ポリオール、例えば、グリセロールまたは多様な糖の使用によって得ることができる低減された水分活性を必要とし得る。さらに、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋のような２価のカチオンは、それらの安定化効果について公知であり、ならびにイオウ含有アミノ酸のような還元剤およびＢＨＴまたは没食子酸プロピルのようなフェノール化合物も公知である。食物用防微生物は、低ｐＨ条件または低い水分活性とソルビン酸塩もしくは安息香酸塩もしくはパラベンとの周知の組み合わせを使用して、達成することができる。さらに、ハイドロコロイドのような食物用増粘財も必要とし得る。比較的新規の経口アプリケーション形態は、液体を含有するゼラチンカプセルの使用である。本出願では、液体は、本発明の乾燥させた酵素を懸濁することができる典型的にオイルまたはポリエチレングリコールまたはレシチンである。改善された酵素安定性を伴う錠剤処方物の例は、米国公開特許第２００２／０１３６８００号明細書において提供される。