KR20150011681A

KR20150011681A - 파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150011681A
Application number: KR1020130086939A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 이태훈; 한아름
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-02-02
Also published as: EP3026058A4; JP2016525539A; CN105408351A; EP3026058B1; EP3026058A1; ES2745802T3; KR101510743B1; US20180170966A1; US9908916B2; US11512112B2; JP6154958B2; CN109251242A; US20200331967A1; US10669312B2; WO2015012438A1; CN105408351B; ES2745544T3; EP3336101A1; CN109251242B; EP3336101B1

Abstract

본 발명의 펩타이드는 천연의 IL(interleukin)-3의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-RANK 시그널링 경로 억제를 통해 NF-B의 활성화 및 핵 전이를 억제시킬 뿐 아니라 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신(cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킴으로써 파골세포 분화를 처리 농도-의존적으로 억제시킨다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킴으로써 조골세포 분화에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 또는 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having an Inhibitory Activity on Osteoclast Differentiation and Uses Thereof}

본 발명은 파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

뼈 항상성과 골격의 구조적 모양은 뼈를 흡수하는 파골세포와 뼈를 형성하는 조골세포 사이의 조직화된 활성에 의해 유지된다. 다핵세포인 파골세포는 조혈모세포로부터 분화되고[T. Miyamoto, O. Ohneda, F. Arai, et al., Blood 98 (2001) 2544-2554] 파골세포로의 분화는 조골세포와 활성화된 T 림포구에서 분비되는 RANK 리간드에 의해 조절된다[Y.Y. Kong, U. Feige, I. Sarosi, et al., Nature 402 (1999) 304-309].

RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)은 파골세포 전구체에 존재하는 수용체인 RANK와 결합하고 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)가 존재할 때 파골세포 분화가 유도된다. RANKL은 파골세포 형성과 뼈 흡수를 조절하는 신호전달 경로를 활성화시킨다[J. Li, I. Sarosi, X.Q. Yan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1566-1571]. RANK는 타이로신 키나제 활성(tyrosine kinase activity)을 가지지 않고 TRAFs(TNF receptor-associated factors)라고 알려진 어댑터 단백질(adaptor protein)을 통해 신호전달을 유도한다[L. Galibert, M.E. Tometsko, D.M. Anderson, et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 34120-34127]. 세포 내의 분자 일부인 TRAF6는 파골세포 생성의 중요한 역할을 하고 다양한 하위 신호를 활성화시킨다[M.A. Lomaga, W.C. Yeh, I. Sarosi, et al., Genes Dev. 13 (1999) 1015-1024]. TRAF6는 RANK의 세포질의 도메인과 결합한 후, NF-κB와 AP-1(activator protein-1)을 활성화시킨다[S.L. Teitelbaum, J. Clin. Invest. 114 (2004) 463-465].

TNF(tumor necrosis factor)-α는 TNF 리간드 계열 단백질로 이는 단핵세포/대식세포 또는 파골세포를 포함한 여러 종류의 세포에서 분비되고, TNFR1, TNFR2(TNFR p55와 TNFR p75라고 알려진)라는 두 개의 세포 막 수용체를 통해 여러 가지 생물학적 반응을 유도하며, TNFR1과 TNFR2 모두 NF-κB의 세포질 내 억제제인 IκB의 단백질 가수분해를 촉진시킬 수 있는 세포내 시그널을 유도한다[Verma, I. M., Stevenson, J. K., Schwarz, E. M., Van Antwerp, D., and Miyamoto, S. (1995) Genes Dev. 9, 2723-2735].

TNF-α는 염증반응, 면역 조절, 세포증식 및 분화, 세포자살과 같은 다양한 범위의 반응을 조절한다[Ledgerwood, E. C., Pober, J. S., and Bradley, J. R. (1999) Lab. Invest. 79, 1041-1050]. 또한, TNF-α는 인 비트로 및 인 비보에서 뼈 흡수를 촉진하며[Bertolini, D. R., Nedwin, G. E., Bringman, T. S., Smith, D. D., and Mundy, G. R. (1986) Nature 319, 516-518], 조골세포에서 RANKL의 분비를 유도할 수 있다[Hofbauer, L. C., Lacey, D. L., Dunstan, C. R., Spelsberg, T. C., Riggs, B. L., and Khosla, S. (1999) Bone 25, 255-259]. 또한, TNF-α는 류마티스 관절염에서 발생되는 뼈와 관절 파괴의 원인에 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 치주염, 정형외과의 이식 후 해리, 만성 염증성 골흡수의 다양한 형태에서 그 원인으로 기능하는 것으로 밝혀졌다. TNF-α는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)에 의해 자극된 파골세포에 의해 매개된다[Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., and Teitelbaum, S. L. (1997) J. Clin. Invest. 100, 1557-1565]. TNF-α는 폐경 후에 나타나는 골다공증에서 에스트로겐 결핍에 의해 나타나는 골 소실에 중요한 역할을 한다[Cenci, S., Weitzmann, M. N., Roggia, C., Namba, N., Novack, D., Woodring, J., and Pacifici, R. (2000) J. Clin. Invest. 106, 1229-1237].

활성화된 T 림프구에 의해 주로 분비되는 사이토카인인 IL(interleukin)-3는 면역과 조혈모세포 시스템 사이의 연결고리로 쓰일 수 있다[J.W. Schrader, Interleukin-3, in: A.W. Thomson, M.T. Lotze (Eds.), Academic Press, London, UK, 2003, pp. 201-225]. IL-3는 마우스 파골세포 전구체에 직접적으로 작용할 뿐 아니라, 대식세포 쪽으로 세포 분화를 촉진시킴으로써 RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화를 억제한다[S.M. Khapli, L.S. Mangashetti, S.D. Yogesha, M.R. Wani, J. Immunol. 171 (2003) 142-151]. 파골세포 전구체에서 IL-3는 IB의 인산화와 분해를 억제함으로써 RANKL에 의해 유도된 NF-κB의 핵으로 이동을 방해한다. 또한 RANKL에 유도된 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 활성을 억제시키며, c-Fos, NFATc1 전사인자의 발현을 하향 조절한다. IL-3는 전사 후 단계에서 RANK의 발현을 억제시키며, 상기 과정은 마우스를 이용한 인 비보 실험을 통해 다시 되돌릴 수 없다는 것이 확인되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 IL-3(Interleukin 3)와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 IL-3 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 많은 펩타이드 후보물질 중에서 우수한 생리 활성(예컨대, 파골세포 분화 억제능, 골분화 촉진능, 등)을 가지는 IL-3-유래된 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 골 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 IL-3(Interleukin 3)와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 IL-3 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 많은 펩타이드 후보물질 중에서 우수한 생리 활성(예컨대, 파골세포 분화 억제능, 골분화 촉진능, 등)을 가지는 IL-3-유래된 펩타이드를 선별하였다.

본 발명자들은 인간 IL-3의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 IL-3-유래된 펩타이드를 합성하였다. 보다 상세하게는, IL-3 단백질의 여러 부위를 임의적으로 부분 합성하여 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 1차 탐색한 뒤, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 본 발명의 펩타이드를 선별적으로 제조하였으며 이들 후보 펩타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 펩타이드를 제조하였다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 펩타이드는 인간 IL-3(GenBank Accession Number, AAH66275.1; 서열목록 제3서열)에서 유래하였으며, 이는 표 1에 예시되어 있다. 본 발명의 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 펩타이드는 천연 IL-3과 유사한 작용을 수행하여 이의 수용기와 결합하여 성장인자와 같은 활성을 가지는 펩타이드이다.

본 발명의 펩타이드는 처리 농도-의존적으로 강력한 파골세포 분화 억제능을 가질 뿐 아니라 조골세포 분화를 현저하게 촉진시켰다(참고: 도 3 내지 도 8).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-RANK 시그널링 경로를 억제시킨다.

본 발명의 펩타이드는 RANKL-매개된 NF-κB의 활성화 및 핵 전이를 뚜렷하게 억제시켰다(참고: 도 7a 및 도 7b).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 파골세포 분화능을 억제시키고, RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신(cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상술한 염증성 사이토카인은 TNF(tumor necrosis factor)-α, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor), IL(interleukin)-1β, IL-6 및 IL-7을 포함하고, 보다 구체적으로는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 TNF-α 및 IL-1β를 포함하고, 가장 구체적으로는 TNF-α이다.

본 발명의 펩타이드는 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 및 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킨다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 예를 들어 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 IL-3 단백질보다 안정성이 우수하지만 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다(참고: 도 2a 및 도 2b).

본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 천연의 IL-3 단백질에 비해 매우 뛰어난 열안정성을 가진다. 천연 IL-3 단백질은 제조의 어려움 및 높은 생산 비용 뿐만 아니라, 온도 및 장기 보관 시에 낮은 안정성을 가진다. 하지만, 본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에, 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내 외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성"은 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 IL-3-관련 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "골 질환"은 RANKL-매개된 시그널링과 관련된 질환, 질병 또는 상태로, 골 형성 및 재흡수의 조절과 연관된 질환, 질병 또는 상태를 포함할 뿐 아니라 골량 감소, 골다공증 및 골 용해를 비롯한 골량 감소성 장애도 포함한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물들은 (a) 상술한 본 발명의 IL-3 단백질의 활성을 나타내는 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 IL-3 관련 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사가 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0005-1,000 mg/kg이다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 IL-3-유래된 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물로 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명의 펩타이드는 천연의 IL(interleukin)-3의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수하다.

(ii) 본 발명의 펩타이드는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-RANK 시그널링 경로 억제를 통해 NF-B의 활성화 및 핵 전이를 억제시킬 뿐 아니라 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신(cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킴으로써 파골세포 분화를 처리 농도-의존적으로 억제시킨다.

(iii) 또한, 본 발명의 펩타이드는 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킴으로써 조골세포 분화에 기여할 수 있다.

(iv) 따라서, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 또는 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 합성예 1에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(도 1a)과 서열목록 제2서열(도 1b)의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 합성예 1에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(도 2a)과 서열목록 제2서열(도 2b)의 펩타이드 안정성 테스트 결과를 순도로 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드(도 3a) 및 서열목록 제2서열의 펩타이드(도 3b)를 처리한 파골세포의 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드(4a) 및서열목록 제2서열의 펩타이드(도 4b)를 처리하였을 때 파골세포 분화 촉진 효소의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드(도 5a) 및 서열목록 제2서열의 펩타이드(도 5b)를 처리하였을 때 파골세포 분화 마커인 TRAP 및 카뎁신(Cathepsin) K의 mRNA 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드(도 6a) 및 서열목록 제2서열의 펩타이드(도 6b)를 처리하였을 때 타입 1 및 타입 2 TNF 수용체의 mRNA 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드(도 7a) 및 서열목록 제2서열의 펩타이드(도 7b)를 처리하였을 때 RANKL 시그널 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(8a) 및 서열목록 제2서열(8b)의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포 분화 촉진을 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(9a) 및 서열목록 제2서열의 펩타이드(9b)를 처리하였을 때 조골세포에서 BMP2 시그널인 p-Smad1/5/8의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: Asn-Cys-Ser-Asn-Met-Ile-Cys-Glu-Ile-Ile-Thr-His(서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분 동안 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄(DCM) 용액을 넣고 Fmoc-L-His(Trt)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분 동안 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF를 10 ml 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분 동안 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분 동안 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 His(Trt)-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Thr(tBu)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분 동안 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Thr(tBu)-His(Trt)-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ile, Fmoc-Ile, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Met, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(Trt) 및 Fmoc-Asn(Trt) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 1시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, 오산화인(Phosphorus pentoxide, P₂O₅) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[TFA(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Asn-Cys-Ser-Asn-Met-Ile-Cys-Glu-Ile-Ile-Thr-His-OH 펩타이드 1을 0.5 g 합성하였다(수율: 89.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1375.4 Da(이론값: 1377.6 Da)를 얻을 수 있었다(도 1a). 위와 같은 방법으로 서열목록 제2서열의 펩타이드 (NH₂-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-OH)도 합성하였다(수율: 92.1%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1568.5 Da(이론값 :1567.9 Da)의 값을 얻을 수 있었다(도 1b).

합성된 펩타이드 서열 및 분자량.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
번호	아미노산 서열	분석치	이론치
IL-3-1	Asn-Cys-Ser-Asn-Met-Ile-Cys-Glu-Ile-Ile-Thr-His	1375.4	1377.6
IL-3-2	Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu	1568.5	1567.9

시험예 1 : 제조된 펩타이드의 열 안정성

합성예 1에서 합성된 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 펩타이드와 NIBSC(UK)에서 구입한 표준품 성장인자(IL-3)를 0.1 mg/ml의 농도의 인산완충용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 1, 3, 5, 10, 20, 그리고 40일째에 샘플링하여 날자별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다(각각, 도 2a 및 도 2b).

시험예 2: 합성 펩타이드를 활용한 파골세포 분화 억제효과의 확인

합성예 1에서 합성된 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 펩타이드에 대한 인터류킨(Interleukin, IL)-3의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 주석산염-저항 산성인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266(1988))을 참조하여 파골세포로 분화가 가능한 Raw264.7 세포주를 이용한 TRAP(Tartrate-res) 비색법을 이용하여 측정하였다.

Raw264.7 세포주(ATCC)를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modied Eagle's medium, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 파이펫팅(pipetting)으로 조심스럽게 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 상기 세포 침전물을 10% FBS가 함유된 DMEM 배양액에 재-현탁시킨 후, 46-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 1 X 10⁴ 세포가 되도록 넣고 공 시료와 RAW264.7 세포의 분화를 유도하기 위해 RANKL을 10 ng/ml, TNF-α 50 ng/ml의 농도와 합성된 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1 μg/ml 또는 10 μg/ml의 농도로 함께 처리하여 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 72시간 뒤 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 공 시료와 RANKL을 10 ng/ml, TNF-α 50 ng/ml의 농도와 합성 펩타이드를 다시 1 μg/ml, 10 μg/ml의 농도로 48시간 동안 상기한 조건과 동일하게 배양하였다. 총 5일 동안 배양을 진행이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 세포를 고정하기 위해 시트른산 용액(citration solution) 25 ml, 아세톤 65 ml 및 37% 포름알하이드 8 ml을 포함하는 고정 완충액(fixation buffer)을 제조하여 이를 이용해 30초 동안 고정화시킨 다음, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 백혈구 알카라인 포스파타제 키트(leukocyte alkaline phosphatase kit; Sigma, 미국)를 이용하여 염색하였다.

도 3은 RANKL와 TNF-α에 의해 분화 유도가 될 수 있는 Raw264.7 세포가 IL-3-1(도 3a) 및 IL-3-2(도 3b)에 의해 분화억제에 대한 결과이다. 도 3a 및 3b에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 Raw264.7 세포가 RANKL와 TNF-에 의한 파골세포로의 분화를 억제할 수 있다는 결과이다.

시험예 3: 합성 펩타이드의 활용한 파골세포 분화 억제효과의 확인

Raw264.7 세포에 RANKL 10 ng/ml 또는 TNF-α 50 ng/ml과 합성예 1에서 합성한 펩타이드를 1 또는 10 μg/ml로 함께 처리하고 5일 동안 분화 유도 후 파골세포 분화 마커인 TRAP 활성의 억제 정도를 확인하는 실험을 실시하였다. 배양 후 배양액을 제거한 후 용해 완충액(20 mM tris buffer, 3% triton X-100) 100 l를 첨가하여 세포벽을 파괴하였다. 시트르산 용액(18 mM citric acid, 9 mM sodium chloride, 12 mM surfactant; pH3.5) 500 μl, 타르타르산 용액(tartrate solution) 50 μl, 20 mM 포스페이트 기질 500 μl를 넣어 반응 용액을 만든 후, 상기 용해물(lysate) 100 μl와 반응 용액 100 μl를 동량으로 넣은 후 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 분광광도계(spectrophometer)를 이용하여 흡광도 405 nm에서 발색을 측정하였다. 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 펩타이드를 RANKL 및 TNF-α와 함께 처리하였을 경우 파골세포의 분화마커인 TRAP 활성은 펩타이드 처리에 따라 농도-의존적으로 분화 억제 효과를 확인하였다(도 4a 및 도 4b).

시험예 4: 합성 펩타이드의 활용한 파골세포 분화 마커의 mRNA 억제효과의 확인

Raw264.7 세포에 RANKL 10 ng/ml 또는 TNF-α 50 ng/ml과 합성예 1에서 합성한 펩타이드를 1 또는 10 μg/ml로 함께 처리하고 5일 동안 분화를 유도시킨 후 카뎁신(cathepsin) K의 mRNA 발현에 대한 억제 정도를 확인하는 실험을 실시하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 카뎁신 K의 mRNA 레벨이 감소되는 것을 보여준다. 또한, 도 6a 및 6b는 RANKL 또는 TNF-α을 처리하였을 때 증가되는 타입 1 또는 타입 2의 TNF 수용체가 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 이들의 mRNA 발현이 모두 감소되는 것을 확인시켜 주었다. PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: TRAP 정방향 프라이머 서열, 5'-AAATCACTCTTTAAGAACAG-3' 및 TRAP 역방향 프라이머, 5'-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3'(어닐링 온도, 45℃); 카뎁신 K 정방향 프라이머 서열, 5'-CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3' 및 카뎁신 K 역방향 프라이머, 5'-ATCTCTCTGTACCCTCTGCA-3'(어닐링 온도, 53℃); GAPDH 정방향 프라이머 서열, 5'-GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG-3' 및 GAPDH 역방향 프라이머, 5'-CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3'(어닐링 온도, 55℃); 타입 1 TNF 수용체 정방향 프라이머 서열, 5'-acctttacggcttcccagaa-3' 및 타입 1 TNF 수용체 역방향 프라이머, 5'-tccttacagccacacaccgt-3'(어닐링 온도, 55℃); 타입 2 TNF 수용체 정방향 프라이머 서열, 5'-aggctggaaagcccctaact-3' 및 타입 2 TNF 수용체 역방향 프라이머, 5'-atgggggtactggagacagg-3'(어닐링 온도, 55℃); 및 액틴 정방향 프라이머 서열, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCA-3' 및 액틴 역방향 프라이머, 5' -TTGGCTTAGGGTTCAGGGGG-3'(어닐링 온도, 55℃).

따라서, 본 발명의 펩타이드는 RANKL과 TNF-에 의해 증가되는 TRAP, 카뎁신 K, 그리고 타입 1 및 타입 2 TNF 수용체를 모두 억제시킬 수 있다(도 5a-5b 및 도 6a-6b).

시험예 5: 합성 펩타이드에 의한 RANKL의 시그날 억제 확인 실험

Raw264.7 세포에 합성예 1에서 합성한 펩타이드들을 처리하고 30분 경과 후, RANKL 단백질의 대표적인 시그널인 NF-κB의 핵 내 이동을 확인하였다. 각 펩타이드의 효과는 NF-κB의 다중클론 항체(Cat.No sc-372, 산타크루즈, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 경우 NF-κB 활성화 및 핵 내 이동이 확인되었다(도 7a 및 도 7b). 그 외 RANKL 단백질의 대표적인 시그널 중에 c-Jun의 인산화와 인산화된 c-Jun의 핵 내 이동을 확인하였다. 각 펩타이드의 효과는 포스포-c-Jun의 다중클론 항체(Cat.No sc-1694, 산타크루즈, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다(도 7a 및 도 7b).

시험예 1 내지 시험예 5의 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 펩타이드는 RANKL-RANK 시그널링의 활성화 억제를 통해 파골세포 분화를 매우 효과적으로 억제시킨다.

시험예 6: 합성 펩타이드에 의한 골분화 마커 유전자 촉진 효과 확인

MC3T3-E1 세포에 합성예 1에서 합성한 펩타이드를 10 또는 50 μg/ml로 처리하고 2일 동안 분화를 유도시킨 후 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 및 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 mRNA 발현 확인 실험을 진행하였다. 도 8은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포의 분화마커인 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: OCN 정방향 프라이머 서열, 5'-gcgctctgtctctctgacct-3' 및 OCN 역방향 프라이머, 5'-tttgtaggcggtcttcaagc-3'(어닐링 온도, 60℃); OPG 정방향 프라이머 서열, 5'-ctgcctgggaagaagatcag-3' 및 OPG 역방향 프라이머, 5'-ttgtgaagctgtgcaggaac-3'(어닐링 온도, 60℃); BSP 정방향 프라이머 서열, '5-aaagtgaaggaaagcgacga-3' 및 BSP 역방향 프라이머, 5'-gttccttctgcacctgcttc-3'(어닐링 온도, 60℃); OPN 정방향 프라이머 서열, 5'-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3' 및 OPN 역방향 프라이머, 5'-CTGCTTAATCCTCACTAACAC-3'(어닐링 온도, 50℃). 상기 유전자들의 mRNA 레벨이 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 펩타이드에 의해 증가되는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 조골세포 분화 마커인 OCN, OPN, BSP 및 OPN의 유전자 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

시험예 7: 합성 펩타이드에 의한 골분화의 시그널 촉진 효과 확인

골 분화 촉진에 관련된 시그널인 pSmad1/5/8을 본 펩타이드가 활성화 시키는 지 여부를 확인하기 위해, MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 2 X 10⁵ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청이 포함되지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 스타베이션(starvation)을 진행시킨 후, 펩타이드를 10 μg/ml 농도로 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP2는 50 ng/ml로 30분 동안 처리하고, 상기 세포들을 PBS로 세척하고 용해 완충액을 넣어 용해시켜 단백질을 수득하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.

상술한 결과들과 일치하게도, 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 펩타이드를 처리하였을 때 Smad1/5/8의 인산화가 일어난다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명의 펩타이드 처리에 의해 골 형성 촉진 시그널이 전달되어 조골세포 분화(osteoblast differentiation)가 유지된다는 것을 의미한다(각각, 도 9a 및 도 9b).

제형예 1: 유연화장수

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

유연화장수 조성.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 보습크림

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 보습크림 제조방법에 따라 제조하였다.

보습크림 조성.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 보습화장수

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

보습화장수 조성.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.002
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.

에센스 조성.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.005
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Caregen Co. Ltd. <120> Peptides Having an Inhibitory Activity on Osteoclast Differentiation and Uses Thereof <130> PN130366 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-3-1 peptide <400> 1 Asn Cys Ser Asn Met Ile Cys Glu Ile Ile Thr His 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-3-2 peptide <400> 2 Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu 1 5 10

Claims

서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 IL-3(Interleukin 3) 단백질에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-RANK 시그널링 경로를 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 파골세포 분화능을 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신(cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 TNF(tumor necrosis factor)-α, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor), IL(interleukin)-1β, IL-6 또는 IL-7을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 조골세포의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget’s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 또는 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopontin)의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.