JP5367905B2 - ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を有効成分として含む癌転移抑制用組成物 - Google Patents

ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を有効成分として含む癌転移抑制用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、癌転移抑制能を有するＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む癌転移抑制用組成物に関するものである。
癌は、人類の生命に危険を与える主な疾病である。韓国ではこの何年間、死亡原因の１位が癌であり、米国で癌は、心臓血管疾患に続き死亡主原因の二番目となっている。多くの研究が行われてきて今も行われているが、現在でも癌は相変らず人類の最も大きな災いであり、毎年数百万名の生命と天文学的な経済的損失を与える致命的な病気である。
癌は特に、発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子などの遺伝子に変異が起きて発生する遺伝的疾患であり、細胞次元に原因がある疾患である。現在、癌の治療法としては、外科的手術療法、薬物療法、放射線療法及び免疫療法などが用いられているが、悪性腫瘍の抑制及び再発は相変らず解決されていない。
癌の最も重要な生物学的特性の一つは、転移を起こすことがあるということであり、これは癌を治療するのに最も大きな障害となっている。実際に固形腫瘍患者全体の約６０％は、原発腫瘍診断時に微細的ではあるが、すでに臨床的に転移した癌を有しており、大部分の癌患者の決定的な死亡原因が癌転移であることは、すでによく知られている。
転移が起きる過程中、癌の局所組織の浸潤とともに現れる現象が、新生血管形成であり、これには腫瘍脈管形成因子（ＴＡＦ）などが関与し、腫瘍によって新たにできた血管は欠陥が多いため癌細胞によって容易に侵犯される。また、癌の浸湿及び転移過程には、組織の基質及び基底膜に付着するのに必要なラミニン受容体などの多数の癌細胞表面の受容体、正常組織の間質を溶解させるのに必要な第ＩＶ型コラゲナーゼ、プラスミノ−ゲン活性因子及びカテプシンＤなどの多数の酵素、成長因子、自己分泌運動性因子（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ、ＡＭＦ）及び癌遺伝子などの発現が必要である。
現在までこのような癌転移抑制作用を有する物質の開発に対する期待は非常に大きいが、実際に癌転移抑制を目的にした物質の開発例は極めて少ない。硫酸化多糖類、Ｎ−ジアゾアセチルグリシン誘導体、ノイラミニターゼ及びフィブロネクチン（ＦＮ）分解酵素などがこのような抑制作用を有すると報告されているが、まだその実用化の報告はなく、それら自体が癌転移抑制効果を有するという報告もない。したがって、癌の転移を効果的に抑制することができる方法を開発すれば、癌転移による死亡を効果的に制御することができる有用な治療法の開発が可能になる。
一方、ノッチ／デルタ／セレートファミリーに属するＤＬＫ１（デルタ様１ホモログ（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ ｈｏｍｏｌｏｇ））は、染色体１４ｑ３２に位置するｄｌｋ１遺伝子にコードされている膜貫通糖タンパク質であり、３８３個のアミノ酸で構成されている。前記タンパク質は、２８０個の細胞外領域と２４個の膜貫通セグメントと、５６個の細胞質ドメインとに分けられ、この中で細胞外領域は、６個の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様反復（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｉｋｅ ｒｅｐｅａｔ）ドメインを有しており、３個のＮ−グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と７個のＯ−グリコシル化部位を有している。ＤＬＫ１は、膜貫通タンパク質でもあるが、腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）によって細胞外部分が細胞膜から離れ出て（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）、別の機能を有するタンパク質としてもよく知られている（非特許文献１）。
ＤＬＫ１は、細胞膜でグリコシル化による５０〜６０ｋＤａの多様な形態で発見されており（非特許文献２）、選択的スプライシングによる４種のスプライシング変異体（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）を有する（非特許文献３）。この中で大きな２種の変異体がタンパク質分解酵素切断部位を有し、タンパク質分解酵素であるＴＡＣＥによって切断して、５０ｋＤａの大きさと２５ｋＤａの大きさの２種の可溶性形態が生成される（非特許文献４） （図１参照）。
ＤＬＫ１は、発生段階で主に、胚組織（非特許文献２、非特許文献５）及び胎盤から発現し、特に母性の血清（ｍａｔｅｒｎａｌ ｓｅｒｕｍ）で高濃度に発現するため、胎児抗原１（ＦＡ１）としても知られている（非特許文献６）。また、膵臓の腺細胞（非特許文献５）、卵巣細胞、骨格筋管（非特許文献７）などでのＤＬＫ１の発現も報告されている。ＤＬＫ１は、出生後大部分の組織で発現が消えて前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（非特許文献２）、膵臓島細胞（非特許文献８）胸腺間質性細胞（非特許文献５）、副腎細胞（非特許文献９）などの特定の細胞でのみ発現する。ＤＬＫ１の発現は、メチル化による影響で父性の単一アレルでのみ発現（ｐａｔｅｒｎａｌ ｍｏｎｏａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することが知られている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
ＤＬＫ１の機能研究は、脂肪細胞分化を抑制する因子Ｐｒｅｆ−１（前脂肪細胞因子−１（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｆａｃｔｏｒ−１））で知られており、最も多くの研究が行われている（非特許文献２、非特許文献１３）。脂肪細胞分化抑制能力以外にも、ＤＬＫ１は造血幹細胞の分化を抑制する役割（非特許文献１４、非特許文献１５）、リンパ球前駆細胞の分化を調節する役割（非特許文献１６、非特許文献５）及び創傷治癒に関係していること（非特許文献１７）でも知られている。しかし、癌細胞に関するＤＬＫ１の役割はほとんど研究が進行していない状況である。
ＤＬＫ１と少数の癌とが関連している研究の中に、最近神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）でＤＬＫ１が過剰発現しており、ＤＬＫ１のｃＤＮＡを神経膠腫細胞に過剰発現させると、神経膠腫細胞の増殖が増加して転移が増加するという報告があり（非特許文献１８）、肝癌においてＤＬＫ１の発現が正常の肝細胞と比較して上がっており、ｓｉＲＮＡ実験を通じてＤＬＫ１の発現を減少させた時に腫瘍の大きさが減少するという報告があった（非特許文献１９）。最近、ＤＬＫ１の細胞質ドメインが腫瘍形成能に重要な役割を果たす（非特許文献２０）ことが報告されている。腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）によって細胞膜から離れ出た（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）細胞外部分である可溶性ＤＬＫ１に対する研究は、現在まで脂肪細胞の分化抑制機能に焦点が合わせられている。特に、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインと癌との関係に対する研究は全くないのが実情である。
そこで、本発明者らは、ＤＬＫ１の細胞外領域の可溶性ドメイン遺伝子とＩｇＧ抗体のＦｃドメインの遺伝子とを含む組換え発現ベクターを構築し、２９３Ｅ細胞からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を発現させて精製し、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質による癌細胞の顕著な移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）減少を確認し、かつ薬物動態（ＰＫ）パラメーターの計算によって癌転移抑制薬物としての有効性を確認することで、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を癌転位抑制用組成物の有効成分として効果的に使用することができることを確認して、本発明を完成させた。
Ｙｕｈｕｉ Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈｅｉ Ｓｏｏｋ Ｓｕｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００６年，第２６（１４）巻，ｐ．５４２１−５４３５ Ｓｍａｓ ＣＭ ａｎｄ Ｓｕｌ ＨＳ，Ｃｅｌｌ．１９９３年，第７３巻，ｐ．７２５−３４ Ｓｍａｓ ＣＭら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４年，第３３巻，ｐ．９２５７−６５ Ｙｕｈｕｉ Ｗａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６年，第１３６巻，ｐ．２９５３−２９５６ Ｋａｎｅｔａ Ｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０００年，第１６４巻，ｐ．２５６−６４ Ｊｅｎｓｅｎ ＣＨら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４年，第２２５巻，ｐ．８３−９２ Ｆｌｏｒｉｄｏｎ Ｃら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．２０００年，第６６巻，ｐ．４９−５９ Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｃら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９７年，第１３８巻，ｐ．３９４０−８ Ｈａｌｄｅｒ ＳＫら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９８年，第１３９巻，ｐ．３３１６−２８ Ｓｃｈｍｉｄｔ ＪＶら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０００年，第１４巻，ｐ．１９９７−２００２ Ｔａｋａｄａ Ｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０００年，第１０巻，ｐ．１１３５−８ Ｗｙｌｉｃ ＡＡら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００年，第１０巻，ｐ．１７１１−８ Ｖｉｌｌｅｎａ ＪＡら，Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００２年，第３４巻，ｐ．６６４−７０ Ｓａｋａｊｉｒｉ Ｓら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００５年，第１９巻，ｐ．１４０４−１０ Ｌｉ Ｌら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５年，第２４巻，ｐ．４４７２−６ Ｂａｕｅｒ ＳＲら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９８年，第１８巻，ｐ．５２４７−５５ Ｓａｍｕｌｅｗｉｃｚ ＳＪら，Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．２００２年，第１０巻，ｐ．２１５−２１ Ｙｉｎ Ｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６年，第２５巻，ｐ．１８５２−６１ Ｈｕａｎｇ Ｊら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００７年，第２８（５）巻，ｐ．１０９４−１１０３ Ｙｕｒｉ Ｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００９年，第６９（２４）巻，ｐ．ＯＦ１−１０
本発明の目的は、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質、及びこれを有効成分として含む癌転移抑制用組成物を提供する。
前記目的を達成するために、本発明は、ＤＬＫ１（デルタ様１ホモログ）の可溶性細胞外ドメインを提供する。
また、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びその組換えベクターを宿主細胞に形質移入した組換え細胞株を提供する。
また、前記ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン、及びヒト抗体Ｆｃドメインと組み合わせたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
また、本発明は、前記ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、組換えベクターを宿主細胞に形質移入した組換え細胞株を提供する。
また、本発明は、
１）組換え細胞株を培養する工程、及び
２）細胞株培養培地からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を分離する工程
を含むＤＬＫ１−ＦＣ融合タンパク質の製造方法を提供する。
また、本発明は、前記製造されたＤＬＫ１細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を有効成分として含む癌転移抑制用組成物を提供する。
また、本発明は、前記製造されたＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の薬学的に有効な量を、転移癌を有する対象に投与する工程を含む癌転移抑制方法を提供する。
また、本発明は、癌転位抑制用組成物の製造における、前記ＤＬＫ１細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の使用を提供する。
本発明のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、非融合タンパク質に比べて高い安定性を有し、多様な癌細胞株の移動を顕著に減少させ、低い濃度でも癌転移抑制効果が優れているので、癌転移抑制用組成物の有効成分として有用に使用することができる。
ＤＬＫ１タンパク質の構造を示す図である。Ｓ：シグナルペプチド、１〜６：上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様反復ドメイン、ＪＭ：膜近傍ドメイン、Ｔｍ：膜貫通ドメイン、Ｃｙ：細胞内ドメイン 癌患者組織でのＤＬＫ１遺伝子の発現率を示す図である。 癌細胞でのＤＬＫ１遺伝子の発現率を示す図である。 ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質発現のための発現ベクター構築に用いられたプライマー配列（配列番号２：５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＡ−３’；配列番号３：５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧ−３’）を示す図である。 ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質発現のための発現ベクターｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＤＬＫ１ベクターの構造を示した図である。 クローニングされたＤＬＫ１の核酸塩基配列（配列番号１）を示す図である。 クローニングされたＤＬＫ１のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。 ２９３Ｅ細胞でＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質発現を誘導して細胞培養培地を回収し、回収した培地でＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を確認した結果を示した図である。 精製されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を確認するためのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの結果を示した図である。 大腸癌細胞株ＳＷ６２０でＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含んだ細胞培養培地の移動阻害効果を示した図である。 皮膚癌黒色腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５でＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含んだ細胞培養培地の移動阻害効果を示した図である。 皮膚癌黒色腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５でのＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン及び可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図であり、ｓＤＬＫ１、ｓＤＬＫ１−Ｆｃ、Ｆｃを、それぞれ１０μｇ／ｍｌ用いる。 皮膚癌黒色腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５でのＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン及び可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示したグラフであり、ｓＤＬＫ１、ｓＤＬＫ１−Ｆｃ、Ｆｃを、それぞれ１０μｇ／ｍｌ用いる。 乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔでの可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 乳癌細胞株ＭＣＦ−７での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 子宮癌細胞株ＨｅＬａでの可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 大腸癌細胞株ＳＷ４８０での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 大腸癌細胞株ＨＴ２９での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 腎臓癌細胞株７８６−Ｏでの可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 腎臓癌細胞株ＵＯ−３１での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肝臓癌細胞株ＳＮＵ４４９での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肝臓癌細胞株ＳＮＵ３９８での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肺癌細胞株Ａ５４９での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肺癌細胞株ＮＣＩＨ２３での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 肺癌細胞株ＮＣＩＨ４６０での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 卵巣癌細胞株ＭＤＡＨ２７７４での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶ−１での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 膵臓癌細胞株Ａｓｐｃ−１での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 膵臓癌細胞株ＨＰＡＣでの可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 膵臓癌細胞株ＭＩＡ ｐａｃａ−２での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 胃癌細胞株ＳＮＵ６３８での可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 胃癌細胞株ＡＧＳでの可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果を示した図である。 可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の移動阻害効果の確認のための実験時に使用された各々の細胞株の細胞数、化学誘引物質構成、培養時間を示した図である。 可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態実験結果を示した図である。 ｓＤＬＫ１の薬物動態パラメーターを示した図である。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＤＬＫ１（デルタ様１ホモログ）の細胞外可溶性ドメイン、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びその組換えベクターを宿主細胞に形質移入した組換え細胞株を提供する。
前記ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
前記可溶性ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表される遺伝子配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
また、本発明は、前記ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン、及びヒトＩｇＧ Ｆｃドメインと組み合わせたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
用語「ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質」は、抗体重鎖の定常ドメインに由来する断片を含む組換え分子を意味する。Ｆｃ融合タンパク質は、五つのＩｇクラス（例：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）中の任意のものからの抗体のＦｃドメイン、すなわちＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインの全体または一部を含むことができる。例えば、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインのカルボキシ末端及びアミノ末端に抗体重鎖の定常ドメインの全体または一部を含む形態で作製することができる。異なる例として、Ｆｃ融合タンパク質は、２個以上の抗体重鎖の定常ドメイン部分を含む形態を含むこともでき、ここで二つの重鎖Ｆｃは、ジスルフィド結合または異なる共有結合で連結することができる。また他の例として、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質のＤＬＫ１部分は、ＤＬＫ１の２個以上の細胞外可溶性ドメインを有する形態を含むこともできる。
また、本発明は、前記ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びその組換えベクターを宿主細胞に形質移入した組換え細胞株を提供する。
また、本発明は、
１）組換え細胞株を培養する工程；及び
２）細胞株培養培地からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を分離する工程
を含むＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の製造方法を提供する。
前記遺伝子を含む発現ベクターは、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓベクターであることが好ましいが、これに限定されず、哺乳動物の発現プローモーター、Ｆｃドメインを含んだベクターはすべて使用可能である。
前記哺乳動物細胞は、２９３Ｅ細胞であることが好ましいが、これに限定されず、プローモーターが作動することができる哺乳動物細胞株はすべて使用可能である。
本発明者らの以前の研究におけるマイクロアレイ結果によると、癌患者でのＤＬＫ１の発現（図２参照）が、以前の先行文献と異なってむしろ減少していることを確認することができ、特にこのような現象は、乳癌、膵臓癌及び卵巣癌組織において顕著であることを確認した（図２参照）。また、６７個の癌細胞株での発現量調査でも、少数の細胞株を除き非常に低い発現を確認した（図３参照）。前記発現パターンを見ると、ＤＬＫ１が発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の特性以外にも癌抑制遺伝子として機能する可能性も推測され、特に腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）によって細胞膜外部分が細胞膜から離れ出て（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）自己分泌型の作用（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）をだけでなく傍分泌型の作用（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）を有する可溶性ドメインのみを用いて、研究を行った。
可溶性Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ実験及びインビボ実験で広く用いられており、特に動物実験などで非融合タンパク質に比べて高い安定性を有するなど、多くの長所を有している（Ｍｅｇ Ｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７年，第３７８巻，ｐ．３３−５２）。また、可溶性Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト抗体製剤の生産において、抗原特異性を維持しながらも多くの免疫学的な問題を排除することができる長所を有するため、現在広く用いられている。代表的な可溶性Ｆｃ融合ヒト抗体製剤としては、アムゲン（Ａｍｇｅｎ）の関節炎治療剤であるＥｔａｎｅｒｃｅｐｔを挙げることができ、これは、ＴＮＦ受容体２（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の可溶性ドメインに、ヒトＩｇＧ１のＦｃを融合して作られた製剤である（米国特許第５４４７８５１号）。
本発明の具体的な実施例において、ｐＹＫ６０２−ＨｉｓベクターにＤＬＫ１をクローニングするために、配列番号２（５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＡ−３’）及び３（５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧ−３’）で表されるプライマーを用い、ＤＮＡライブラリーミックス（腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合）を鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＬＫ１タンパク質の細胞外可溶性ドメインのみを増幅し、これにより得られたＰＣＲ産物は、ＳｆｉＩで制限酵素反応を遂行した後、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓベクターに入れてｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＤＬＫ１組換えベクターを構築した（図４及び５参照）。
以後、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＤＬＫ１ＤＮＡを２９３Ｅ細胞に形質移入して培地を回収し、ウエスタンブロット法でＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を確認した（図８参照）。発現の確認された培地は、プロティンＡカラムを用いて精製し、精製されたＤＬＫ１−Ｆｃタンパク質は、ｐＨを中性にした後、ＰＢＳ（リン酸カリウム生理食塩水）バッファーを用いて透析した後、ＢＣＡ分析により定量を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製および定量の達成を確認した（図９参照）。以後、精製されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質をＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄカラムを用いて細菌内毒素を除去し、これによりＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を製造した。
また、本発明は、前記製造されたＤＬＫ１細胞外可溶性ドメイン、またはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を有効成分として含む癌転移抑制用組成物を提供する。
前記癌は、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部または頚部癌、子宮癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌腫及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、胃癌及び膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることがさらに好ましいが、これに限定されない。
本発明の具体的な実施例で、製造されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が癌細胞株に与える影響を調べるために、参考文献（Ｃｈｅｎ ＨＣ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００５年，第２９４巻，ｐ．１５−２２）の方法を用いて癌細胞株の移動分析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を実施し、精製されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を用いて多様な癌細胞株の転移に与える影響を調査した結果、皮膚癌（図１１参照）、乳癌（図１４及び１５参照）、子宮癌（図１６参照）、大腸癌（図１７及び１８参照）、腎臓癌（図１９及び２０参照）、肝臓癌（図２１〜２３参照）、肺癌（図２４〜２６参照）、卵巣癌（図２７及び２８参照）、膵臓癌（図２９〜３１参照）及び胃癌（図３２及び３３参照）の転移を減少させることができることを確認した。
また、前記製造されたＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインのみを発現させ、かつ精製した後、皮膚癌黒色腫細胞株に処理して比較した結果、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインも癌細胞株の移動を顕著に減少させることができることを確認した（図１２及び１３参照）。
また、実際に癌転移抑制のための薬物としての有効性を検証するために、薬物動態パラメーターを決定する実験をマウスで実施した。実験の結果、５ｍｇ／ｋｇ（実際マウスの重さを考慮すると１００μｇ／マウス）で接種して、マウスの総血液がおおよそ２ｍｌであることを考慮すると、静脈注射した時に最高濃度として算定することができる濃度は５０μｇ／ｍｌであり、腹腔接種を通じて示された実験結果のＣｍａｘ値として３８．９６μｇ／ｍｌが示されたことは、相当に高い値であると言え、接種後４時間（Ｔｍａｘ値）で最高濃度を示すことが分かった。そして、生体内でどの程度安定的であるかを調べる半減期値が約２０時間と示され、生体内で相当に安定的であることを確認することができた（図３６参照）。そして、癌転移抑制力を示す濃度が、１０μｇ／ｍｌでも卓越した効果を示すことを確認したことから、４８時間後に約１０μｇ／ｍｌの濃度を維持している結果と照らし合わせると、本発明の薬物が癌転移抑制用タンパク質新薬として十分な安全性及び有効性を提供することは明らかである（図３５参照）。
したがって、前記製造されたＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン、またはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、癌転移抑制用組成物の有効成分として有用に用いることができる。
本発明の組成物は、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。投与のためには、追加に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質が０．０００１〜１０重量％であり、０．００１〜１重量％を含むことが好ましい。薬剤学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分のうちの１成分以上の混合物を用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの異なる通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当技術分野の適正な方法で、または Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明の癌転移抑制用組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるタンパク質の投与量は、成人男性を６０ｋｇと仮定した時（米国ＦＤＡ基準）０．７３８μｇ〜７．３８ｇであり、好ましくは７．３８μｇ〜０．７３８ｇ（１２．３ｍｐｋ）で、二日に一度投与することが好ましいが、投与方法は患者の必要性によって決定することができる。
また、本発明は、前記製造されたＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の薬学的に有効な量を、転移癌を有する対象に投与する工程を含む癌転移抑制方法を提供する。
前記ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
用語「ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質」は、抗体重鎖の定常ドメインに由来した断片を含む組換え分子を意味する。Ｆｃ融合タンパク質は、五つのＩｇタイプ（例：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭ）中の任意のものからの抗体のＦｃドメイン、すなわちＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインの全体または一部を含むことができる。例えば、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、細胞外可溶性ドメインのカルボキシ末端及びアミノ末端に抗体重鎖の定常ドメインの全体または一部を含む形態で作製することができる。異なる例として、Ｆｃ融合タンパク質は、２個以上の抗体の重鎖定常ドメインを有する形態をまた含むことができ、ここで二つの重鎖は、ジスルフィド結合または異なる共有結合で連結することができる。また異なる例として、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質のＤＬＫ１部分は、ＤＬＫ１の２個以上の細胞外可溶性ドメインを有する形態をまた含むことができる。
前記癌は、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部または頚部癌、子宮癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌腫及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、胃癌及び膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることがさらに好ましいが、これに限定されない。
本発明の癌転移抑制方法は、目的とする方法によって非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるタンパク質の投与量は、成人男性を６０ｋｇと仮定した時（米国ＦＤＡ基準）０．７３８μｇ〜７．３８ｇであり、好ましくは７．３８μｇ〜０．７３８ｇ（１２．３ｍｐｋ）で、二日に一度投与することが好ましいが、投与方法は患者の必要性によって決定することができる。
本発明では、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン遺伝子とＩｇＧ抗体のＦｃドメインの遺伝子とを含む組換え発現ベクターを構築し、２９３Ｅ細胞からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を発現させて精製し、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質による癌細胞の顕著な移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）減少を確認し、かつ薬物動態パラメーター計算に基づいて癌転移抑制薬物としての有効性を確認した。結果的には、本発明のＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を、転移癌を有する対象に投与することで、癌転移を抑制する方法に有用に用いることができる。
また、本発明は、癌転位抑制用組成物の製造のための、前記製造されたＤＬＫ１細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の使用を提供する。
前記ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
用語「ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質」は、抗体重鎖の定常ドメインに由来する断片を含む組換え分子を意味する。Ｆｃ融合タンパク質は、五つのＩｇタイプ（例：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭ）中の任意のものからの抗体のＦｃドメイン、すなわちＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインの全体または一部を含むことができる。例えば、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、細胞外可溶性ドメインのカルボキシ末端及びアミノ末端に抗体重鎖の定常ドメインの全体または一部を含む形態で作製することができる。異なる例として、Ｆｃ融合タンパク質は、２個以上の抗体の重鎖定常ドメインを有する形態をまた含むことができ、ここで二つの重鎖は、ジスルフィド結合または異なる共有結合で連結することができる。また異なる例として、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質のＤＬＫ１部分は、ＤＬＫ１の２個以上の細胞外可溶性ドメインを有する形態をまた含むことができる。
前記癌は、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部または頚部癌、子宮癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌腫及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、胃癌及び膵臓癌からなる群から選択されるいずれか一つであることがさらに好ましいが、これに限定されない。
本発明では、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメイン遺伝子とＩｇＧ抗体のＦｃドメインの遺伝子とを含む組換え発現ベクターを構築し、２９３Ｅ細胞からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を発現させて精製し、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質による癌細胞の顕著な移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）減少を確認し、かつ薬物動態パラメーター計算に基づいて癌転移抑制薬物としての有効性を確認した。結果的には、本発明のＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたはＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を、癌転位抑制用組成物の製造に用いる用途に有用に用いることができる。
本発明の癌転移抑制用組成物には、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。投与のためには、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質が０．０００１〜１０重量％であり、０．００１〜１重量％を含むことが好ましい。薬剤学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分のうちの１成分以上の混合物を用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの異なる通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。更に当技術分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明の癌転移抑制方法は、目的とする方法によって非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるタンパク質の投与量は、成人男性を６０ｋｇと仮定した時（米国ＦＤＡ基準）０．７３８μｇ〜７．３８ｇであり、好ましくは７．３８μｇ〜０．７３８ｇ（１２．３ｍｐｋ）で、二日に一度投与することが好ましいが、投与方法は患者の必要性によって決定することができる。
以下、本発明を実施例、実験例及び製造例によって詳しく説明する。
ただし、下記実施例、実験例及び製造例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＤＬＫ１発現ベクターの製造
ｐＹＫ６０２−ＨＩＳベクターのＤＬＫ１−Ｆｃの発現を誘導するために、それぞれ配列番号２（５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＡ−３’）及び３（５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧ−３’）で表される塩基配列を有するプライマー対を作製して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。具体的な反応の組み合わせは、鋳型に使用したＤＮＡライブラリーミックス（腎臓、胎盤、膵臓、肝臓の混合）１００ｎｇ、ｐｆｕ２．５ｕｎｉｔプライマーそれぞれ１０ｐｍｏｌを添加して、総量５０μｌで反応を遂行した。反応は９４度２分を１サイクル、９４度３０秒、５５度３０秒、７２度１分を３０サイクル、７２度１０分を１サイクルにして反応を終結した。ＰＣＲ産物は、ＳｆｉＩ制限酵素位置を含んでいるため、ＳｆｉＩで制限酵素反応を遂行した後、ｐＹＫ６０２−ＨＩＳベクターに挿入してｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＤＬＫ１組換えベクターとした（図５）。
クローニングしたＤＬＫ１は、全体で３８３個のアミノ酸における２４番目のアミノ酸から３０２番目のアミノ酸までに該当するＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインであり、シグナルペプチドと膜貫通領域と細胞質ドメインとが除去されている。クローニングされたＤＬＫ１の核酸配列とアミノ酸配列は、図６（配列番号１）及び７（配列番号４）にそれぞれ示されている。
＜実施例２＞ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
前記＜実施例１＞でクローニングされたＤＬＫ１−Ｆｃを発現させるために、２９３Ｅ細胞を使用した。具体的な発現方法は、下記の通りである。１００ｍｍプレートに７０％程度の細胞水準でＤＮＡ１０μｇ、ＰＥＩ（＃２３９６６，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国）２０μｇを混合して室温で２０分間反応させて混合物を作った後、細胞に処理した。１６〜１０時間後に無血清ＤＭＥＭ培地に代えた後、二日に一回ずつ培地を回収して新しい培地に交換した。回収した培地は、ウエスタンブロット法を用いて発現を確認した（図８）。発現の確認された培地は、残っている可能性のある細胞を遠心分離によって確実に除去した後、０．２２μｍフィルター（＃ＰＲ０２８９０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を用いてろ過した。以後プロティンＡカラムを用いて精製した。すなわち、１０ｍｌのカラムに５００μｌのプロティンＡビーズ（＃１７−１２７９−０３ ＧＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）を充填してＰＢＳで洗浄後、ＤＬＫ１−Ｆｃが発現された培地を流した。この過程は、蠕動ポンプを使用し、１分間に０．５ｍｌずつ流れ込むようにセッティングした。培地がすべてカラムを通過した後、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（＃Ｇ７１２６，Ｓｉｇｍａ，米国）で精製されたＤＬＫ１−Ｆｃタンパク質を回収した。回収されたタンパク質は、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０（＃Ｔ−１５０３，Ｓｉｇｍａ，米国）を用いてｐＨを中性にした後、ＰＢＳを用いて透析を実施した。精製されたタンパク質は、ＢＣＡ分析によって定量を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って精製有無を確認し（図９）、これを通じて精製されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を得た。
＜実験例１＞精製されたＤＬＫ１−Ｆｃの内毒素測定及び除去
精製されたＤＬＫ１−Ｆｃの細菌内毒素データを測定するために、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬ（ｃａｔ＃ Ｃ００３１，ＣＡＰＥ ＣＯＤ）を用いた。具体的には、タンパク質標準物質としてのＣＳＥ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；ｃａｔ＃ Ｅ０００５，ＣＡＰＥ ＣＯＤ）１ＥＵ／ｍｌを２倍ずつ希釈して最小濃度が０．０３１２５ＥＵ／ｍｌになるように準備した。陰性対照としてのＬＲＷ（ＬＡＬ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｔｅｒ；ｃａｔ＃ ＷＰ１００１，ＣＡＰＥ ＣＯＤ）１００μｌ＋ＬＡＬ １００μｌ、陽性対照としての０．１２５ＥＵ／ｍｌ濃度の標準物質（１００ｕｌ＋ＬＡＬ １００μｌ）を加えた。分析のために、所定の濃度（５０μｇ／ｍｌ）を有する希釈したＬＲＷサンプル１００μｌ＋ＬＡＬ １００μｌを準備した。追加で、サンプル間の干渉を確認する目的で、陽性対照の実験のために、上記の希釈したサンプル（５０μｌ＋０．１２５ＥＵ／ｍｌ）及び標準物質（５０μｌ＋ＬＡＬ １００ｕｌ）も準備した。また、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定するために、あらかじめセッティングされた値をプロトコール化したファイル（Ｃｈｒｏｍｏ ＬＡＬ ｓｅｔｔｉｎｇ．ｐｄａ）を用いた。プレートは、あらかじめ３７℃で１０分程度予熱した後、実験を始めた。ＬＡＬを処理するのと同時にセッティングされたファイルを開始して吸光度を測定した。標準曲線のＸ軸はＬｏｇ ＥＵ／ｍＬ、Ｙ軸はＬｏｇオンセット（Ｏｎｓｅｔ）時間で作成し、サンプルの内毒素データは測定した吸光度をソフトウェアで自動計算してＥＵ／ｍｌで表示した。標準曲線のＲ２値が０．９８以上になる場合に測定値に対する信頼性を置いた。ＤＬＫ１−Ｆｃタンパク質に対するＬＡＬテストの結果、１５０．２４ ＥＵ／ｍｌの内毒素を含んでいることが測定された。続いてサンプルの内毒素を除去するために、ＥｎｄｏＴｒａｐ Ｒｅｄ（ｃａｔ＃ ８３−００９Ｕ，Ｌｏｎｚａ）カラムを使用した。カラムを３ｍｌの再生バッファーで２回洗浄した後、同量の安定化バッファーで２回洗浄した。次にサンプル適用と同時に分液を得た（速度：０．５〜１ｍｌ／分）。カラム内の残余サンプルは、安定化バッファー１ｍｌを適用して得た。内毒素除去後、上記と同一の方法でＬＡＬテストを再び実施し、その結果、サンプルの内毒素のデータが７．５３ＥＵ／ｍｌと測定された。これは陰性対照と類似の量であり、結果的に、精製されたＤＬＫ１−Ｆｃタンパク質の細菌内毒素が除去されたことを確認した。
＜実験例２＞ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の癌細胞株移動抑制効果の確認
前記＜実施例２＞で製造及び精製されたＤＬＫ１−Ｆｃタンパク質が癌細胞株に与える影響を調べるために、参考文献（Ｃｈｅｎ ＨＣ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００５年，第２９４巻，ｐ．１５−２２）の方法を用いて癌細胞株の移動分析（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を実施した。
具体的には、癌細胞株［皮膚癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２９）、乳癌細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ；ＥＣＡＣＣ ８６０８２１０４及びＭＣＦ−７；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、子宮癌細胞株（ＨｅＬａ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、大腸癌細胞株（ＳＷ４８０；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２８，ＳＷ６２０；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２７及びＨＴ２９；ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、腎臓癌細胞株（７８６−Ｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９３２及びＵＯ−３１；ＤＴＰ）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２；ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５，ＳＮＵ３９８；ＫＣＬＢ ００３９８及びＳＮＵ４４９；ＫＣＬＢ ００４４９）、肺癌細胞株（Ａ５４９；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５，ＮＣＩＨ２３；ＫＣＬＢ ９００２３及びＮＣＩＨ４６０；ＫＣＬＢ ３０１７７）、卵巣癌細胞株（ＭＤＡＨ２７７４；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０３０３及びＩＧＲＯＶ−１；ＤＴＰ）、膵臓癌細胞株（Ａｓｐｃ−１；ＫＣＬＢ ２１６８２，ＨＰＡＣ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１９及びＭＩＡ ｐａｃａ−２；ＫＣＬＢ ２１４２０）及び胃癌細胞株（ＳＮＵ６３８；ＫＣＬＢ ００６３８及び、ＡＧＳ；ＫＣＬＢ ２１７３９）］を培養して細胞が５０％程度水準である時に無血清培地に交換して、２４時間後に細胞をトリプシン処理によって剥がした後に細胞数を測定した。細胞、無血清培地、及び処理しようとするそれぞれのタンパク質を合わせて１００μｌにして、３７℃で１時間培養した。２４ウェルプレートに１ｍｌの化学誘引物質（ｃｈｅｍｏ−ａｔｔｒａｃｔａｎｔ）を入れて、さらに８．０μｍの大きさのポア（孔）を有したトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３４２２）を載せてその中に１時間前培養した細胞、細胞、及びタンパク質の混合液１００μｌを入れた後、３７℃の二酸化炭素培養器で２４時間〜４８時間培養した。それぞれの細胞株に使用した細胞数、化学誘引物質構成、培養時間を図２１に示した。
培養後、トランスウェルの培地を除去した後、１００％メタノールで１５分間固定させ、その後、蒸留水を用いて２回洗浄した後、クリスタルバイオレット溶液で５分間反応させた。反応後、蒸溜水で３回洗浄後、トランスウェルを通過することができなかった細胞を綿棒を用いて完全に除去した。トランスウェルを完全に乾かした後、トランスウェルを通過した細胞を観察するために１００倍の倍率で観察及び写真を撮影した。定量的分析のためには、写真撮影が終わった後、トランスウェルに１０％酢酸溶液に入れて抽出した後、５６０ｎｍ波長で測定して吸光度を分析した。
その結果、可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含んだ細胞培養培地によって処理した大腸癌細胞株（ＳＷ６２０）及び皮膚癌黒色腫細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）では、可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、対照可溶性Ｆｃタンパク質及び非処理群に比べて癌細胞株の移動を顕著に阻害することを確認した（図１０及び１１）。また、移動が、ＤＬＫ１に結合されたＦｃの影響ではないことを調べるために、ＤＬＫ１の可溶性領域のみを発現させ、かつ精製して比較した結果、可溶性ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質と同様に癌細胞株の顕著な移動減少を確認することができた（図１２及び１３）。また、精製された可溶性ＤＬＫ１Ｆｃ融合タンパク質を用いて多様な癌細胞株の転移に与える影響を調査した結果、乳癌（図１４及び１５）、子宮癌（図１６）、大腸癌（図１７及び１８）、腎臓癌（図１９及び２０）、肝臓癌（図２１〜２３）、肺癌（図２４〜２６）、卵巣癌（図２７及び２８）、膵臓癌（図２９〜３１）及び胃癌（図３２及び３３）で、癌細胞株の移動を抑制することを確認した。
＜実験例３＞ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態パラメーター（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）確認
前記＜実施例２＞で製造及び精製されたＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が実際に転移抑制剤として用いるのに相応しいかどうかを調べるための実験として、薬物動力学実験を実施した。
具体的には、３０匹の６週齢Ｂａｌｂ／ｃメス（オリエントバイオ）に腹腔注射によって５ｍｇ／ｋｇで一度接種した後、眼球静脈叢（ｏｐｈｔａｌｍｉｃ ｖｅｎｕｓ ｐｌｅｘｕｓ）から０、０．５、２、４、６、２４、３０、４８時間毎に血液を採取し、血清を分離して実験に使用した。
サンプリングされた血清を用いて血中ＤＬＫ１−Ｆｃの濃度を測定するために酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。具体的には、ＥＬＩＳＡプレート（＃４３９４５４，ＮＵＮＣ）に１μｇ／ｍｌの濃度のＤＬＫ１抗体（＃ＭＡＢ１１４４，Ｒ＆Ｄ）を４℃でコーティングした。４％スキムミルク／ＰＢＳ（リン酸カリウム生理食塩水）バッファーでブロッキングを１時間行った後、プレートをＰＢＳＴ（リン酸カリウム生理食塩水、０．０５％ツイーン２０）バッファーで洗浄した。標準曲線の作成のために、精製されたＤＬＫ１−Ｆｃを１００ｎＭ濃度から始めて２倍ずつ希釈した。陰性対照としてｈＩｇＧ（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を使用した。実験でサンプリングされた血清は、２５０倍、５００倍、１０００倍にそれぞれ希釈した後、２時間室温で反応させた。プレートをＰＢＳＴバッファーで洗浄した後、抗Ｆｃ−ＨＲＰ（＃３１４１３、Ｐｉｅｒｃｅ）抗体を１：４０００の濃度に希釈して２時間室温で反応させた。プレートをＰＢＳＴバッファーで洗浄した後、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））溶液を準備してそれぞれのウェルに１００μｌずつ処理した。ＯＰＤ溶液は、ＰＣバッファー、ｐＨ５．０に過酸化水素水及びＯＰＤ（Ｐ９１８７，Ｓｉｇｍａ）を添加して製造した。１０分間暗室で反応後、２．５Ｍ硫酸５０μｌを処理して、発色反応を終結してＯＤ４９２ｎｍで吸光度を測定した。標準曲線については、Ｒ２値が０．９９以上の区間を選定して結果を処理した。
その結果、５ｍｇ／ｋｇ（実際マウスの重さを考慮すると１００μｇ／マウス）で接種して、マウスの総血液がおおよそ２ｍｌであることを考慮すると、静脈注射した時、最高濃度として算定することができる濃度は、５０μｇ／ｍｌであり、腹腔接種を通じて示された実験結果のＣｍａｘ値が３８．９６μｇ／ｍｌと示されたことは、相当に高い値であると言え、接種後４時間（Ｔｍａｘ値）で最高濃度を示すことが分かった。そして、生体内でどの程度安定的なのかを調べる半減期値が約２０時間と示され、生体内で相当に安定的であることを確認することができた（図３６）。そして、癌転移抑制力を示す濃度が、１０μｇ／ｍｌでも卓越した効果を示すことを確認したことから、４８時間後に約１０μｇ／ｍｌの濃度を維持している結果と照らし合わせると、本発明の薬物が癌転移抑制用タンパク質新薬として十分な安全性及び有効性を提示することは明らかである（図３５）。
したがって、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が多様な癌腫の移動を阻害することを考慮し、かつ薬物動態パラメーターを考慮すると、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、癌転移を阻害するための組成物としての十分な可能性を提供することは明らかである。
下記に、本発明の組成物のための製造例を提示する。
＜製造例１＞薬学的製剤の製造
１．散剤の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記成分を混合して気密包装に充填して散剤を製造した。
２．錠剤の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
３．カプセル剤の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
４．注射剤の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 １０μｇ／ｍｌ
希塩酸ＢＰ ｐＨ７．６になるまで
注射用塩化ナトリウムＢＰ 最大１ｍｌ
適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰ中にＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を溶解させて、生成された溶液のｐＨを希塩酸ＢＰを用いてｐＨ７．６に調節して、注射用塩化ナトリウムＢＰを用いて容積を調節して充分に混合した。溶液を透明ガラスの５ｍｌタイプＩアンプル中に充填し、ガラスを溶解させて密封し、１２０℃で１５分以上オートクレーブして殺菌して注射液剤を製造した。
５．丸薬の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キリシトール ０．５ｇ
前記成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。
６．顆粒の製造
ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 １５０ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
澱粉 ６００ｍｇ
前記成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包装に充填した。
本発明のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、非融合タンパク質に比べて高い安定性を有し、多様な癌細胞株の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を顕著に減少させ、かつ低濃度でも顕著な癌転移抑制効果を提供する。したがって、本発明のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、癌転移抑用組成物及び癌予防及び治療用組成物、癌予防及び改善用健康食品の組成物として効果的に用いられる。さらに、本発明のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、現在癌治療剤に用いられている新生血管抑制用組成物との併用に向けて製品化した場合に、顕著に増大した抗癌活性を有する癌転移抑制用及び癌治療用組成物として、効果的に用いることができる。

Claims (11)

  1. ＤＬＫ１（デルタ様１ホモログ（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ ｈｏｍｏｌｏｇ））の細胞外可溶性ドメイン及びヒト抗体Ｆｃドメインを含む、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質。
  2. 請求項１に記載のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  4. 請求項３に記載の組換えベクターを宿主細胞に形質移入した組換え細胞株。
  5. １）請求項４に記載の組換え細胞株を培養する工程と、
    ２）細胞株培養培地からＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を分離する工程と
    を含む、ＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の製造方法。
  6. ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたは請求項１に記載のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む、癌転移抑制用組成物。
  7. 前記癌が、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び胃癌からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項６に記載の組成物。
  8. ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインが、２００〜３００ａ．ａの大きさである、請求項１に記載のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 。
  9. ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質 。
  10. 癌転位抑制用組成物の製造のための、ＤＬＫ１の細胞外可溶性ドメインまたは請求項１に記載のＤＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質の使用。
  11. 前記癌が、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び胃癌からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１０に記載の使用。
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