CN102898508B - 封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫生物学和生物医药领域，涉及封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种多肽或多肽组合，其氨基酸序列如下的（1）－（4）中的任一项或多项所示：（1）SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，（2）SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，（3）SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，和（4）SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。本发明的多肽能够有效地封闭TGF-β受体或IL-10受体，从而增强了T细胞（特别是抗原特异性T细胞）的肿瘤杀伤活性，具有作为治疗或辅助治疗前列腺癌药物的潜力。

Description

封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于免疫生物学和生物医药领域，涉及封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重要疾病。其中，前列腺癌是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤，在我国发病率逐年上升。

恶性肿瘤的T细胞过继输入治疗在恶性黑色素瘤取得了肿瘤消退，有效率达50%-70%的治疗效果，目前正开始向其他实体瘤过渡[June C,Rosenberg SA,Sadelain M,Weber JS.T-cell therapy atthe threshold.Nat Biotechnol.2012 Jul 10;30(7):611-4；DeVitaVT Jr,Rosenberg SA.Two hundred years of cancer research.NEngl J Med.2012 Jun 7;366(23):2207-14.]。

T细胞过继输入治疗是通过分离病人自身血液或肿瘤组织来源的T细胞（CD4或CD8），体外抗原刺激，扩增，活化后再回输病人，达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用。近年来，随着对调控性T细胞和肿瘤微环境的认识逐渐加深，在过继输入治疗同时，通过药物去除或降低患者自身的血白细胞，并利用细胞因子如IL-2，IL-12等维持输入的T细胞的存活及活性，使疗效进一步提高[Rosenberg SA.Raising thebar:the curative potential of human cancer immunotherapy.SciTransl Med.2012 Mar 28;4(127):127.]。

前列腺癌的恶性生物学表型差异较大，目前主要有严密观察随访，手术切除，放射治疗以及雄激素阻断治疗。晚期常转移至其他器官如骨，肝等，且对激素治疗不再敏感，演变为激素非依赖性，使治疗非常棘手。Sipuleucel-T(Provenge)是FDA批准的第一个用于前列腺癌免疫治疗的个体化药物，使免疫疗法在晚期前列腺的治疗中占重要地位[Gardner T,Elzey B,Hahn NM.Sipuleucel-T(Provenge)autologous vaccine approved for treatment of men withasymptomatic or minimally symptomatic castrate-resistantmetastatic prostate cancer.Hum Vaccin Immunother.2012 Apr1;8(4):534-9.]，其原理主要是回输经体外融合抗原（PAP+GM-CSF）刺激的抗原递呈细胞，达到体内刺激活化T细胞的功能。

但是，上述方法存在不足之处，例如：1）体内抗原活化T细胞仍存在诸多限制，如抗原递呈效率，共刺激分子等。2）肿瘤局部的微环境，活化的T细胞到达肿瘤局部却失能。3）针对TGF-β，IL-10的化学小分子阻滞剂，阻断多不完全和不特异。4）应用病毒载体的基因转染，试图使TGF-β受体变异或基因敲除TGF-β受体，存在病毒致基因变异的风险，尚不能应用于临床。5）目前消除肿瘤局部微环境TGF-β或IL-10的作用主要使用TGF-β或IL-10的抗体阻断，但由于人源化抗体的获取困难及异种抗体的免疫原性，临床应用受限。

此外，在前列腺癌的自身抗原特异性T细胞过继免疫治疗中，过继免疫输入的T细胞常常受到肿瘤组织内或全身的免疫抑制性细胞的功能抑制，其中转化生长因子（TGF-β）和白细胞介素10（IL-10）是主要的两种抑制因子。TGF-β有TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3三种类型，分别作用于相应受体TGF-βR1,TGF-βR2和TGF-βR3。IL-10有受体IL-10RA和IL-10RB。因此，如何有效地使活化的CD4或CD8细胞逃过机体和肿瘤的免疫抑制是亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了一组多肽，并且惊奇地发现，该多肽能够有效地封闭TGF-β受体和/或IL-10受体，从而使过继输入的T细胞对肿瘤局部的免疫抑制机制不敏感，增强了T细胞（特别是抗原特异性T细胞）的肿瘤杀伤活性，具有作为治疗或辅助治疗癌症特别是前列腺癌药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种多肽或多肽组合，其氨基酸序列如下面的（1）－（4）中的任意一项或多项（例如任意2、3、或4项）所示：

（1）SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，

（2）SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，

（3）SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，和

（4）SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。

所述多肽或多肽组合可以通过人工化学合成制得。所述多肽或多肽组合物能够用于封闭TGF-β受体和/或IL-10受体。

在本发明的一个实施方案中，从噬菌体随机肽库中筛选TGF-βR1,TGF-βR2，TGF-βR3，IL-10RA和IL-10RB的亲和短肽。方法：以重组可溶性人TGF-βR1,TGF-βR2，TGF-βR3，IL-10RA和IL-10RB作为靶标，应用噬菌体随机十二肽库进行筛选，经过5轮淘选，提取阳性噬菌体克隆ssDNA，测序并进行序列分析。结果：通过筛选噬菌体获得富集，能与人TGF-βR1,TGF-βR2，TGF-βR3，IL-10RA和IL-10RB特异性结合的噬菌体克隆，测序得到核酸序列，未发现共有保守序列，进一步获得其多肽序列。

本发明的另一方面涉及一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：45（抗原表位肽）或SEQ ID NO：46（抗原表位模拟肽）所示。所述抗原表位为具有6个跨膜区的前列腺上皮抗原（six transmembraneepithelial antigen of the prostate 2，STEAP2）的针对HLA-A的抗原表位肽VAITLLSLV（SEQ ID NO：45）和抗原表位模拟肽VAIMLLSLV（SEQ ID NO：46）。

在本发明的一个实施方案中，利用噬菌体随机9肽库探索STEAP2的抗原表位。以抗STEAP2单克隆抗体(mAb)作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机9肽库。阳性克隆经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个克隆,DNA测序,同源性分析。结果显示筛选到的噬菌体展示短肽能特异地与STEAP2结合,这种结合可被天然抗原所抑制。10个克隆的氨基酸序列相同,均为VAITLLSLV（SEQ ID NO：45）。进一步通过逐个突变分析，证实表位模拟肽VAIMLLSLV（SEQ IDNO：46）具有较强的T细胞刺激作用。

本发明的再一方面涉及一种多核苷酸，其编码本发明任一项所述的多肽或者本发明任一项所述的抗原表位。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其包含本发明任一项所述的多核苷酸；具体地，所述核酸构建体为重组载体；具体地，所述重组载体为重组表达载体。

本发明的再一方面涉及一种重组细胞，其包含本发明任一项所述的核酸构建体。

本发明的多肽或抗原表位可以通过人工化学合成的方法制得，也可以通过基因重组的方法通过构建合适的表重组达载体，通过适当的宿主细胞（例如大肠杆菌或者酵母等）进行表达。

化学合成多肽的技术是本领域成熟的技术，也可以委托商业公司进行合成。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。

可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外活化T细胞的方法，包括使用有效量的一种或两种本发明任一项所述的抗原表位的步骤（例如，在体内或体外，使有效量的一种或两种本发明任一项所述的抗原表位与T细胞相接触）；具体地，包括下述步骤：

1）分离提取肿瘤患者自身血液单个核细胞PBMC，重悬于无血清培养基，得到细胞浓度为10⁶/ml－10⁸/ml（例如10⁷/ml）的细胞培养液；

2）向步骤1）中得到的细胞培养液中加入一种或两种本发明任一项所述的抗原表位（抗原表位肽或抗原表位模拟肽），终浓度为5pM－15pM（例如10pM）,培养1－14天（优选3天）后收集细胞；优选地，在培养之前或培养过程中加入CD3和/或CD28。

所述抗原表位配制成10nM的储存母液。优选地，在CD3,CD28的辅助下，通过加入IL-2，IL-12的常规扩增方法，经过14天左右，使CD8⁺T淋巴细胞活化扩增到5x10¹⁰。目的在于提高活化T细胞的靶向性。

本发明还涉及根据上面的方法处理得到的T细胞（活化T细胞，例如CD8⁺T细胞）

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外封闭T细胞表面上的TGF-β受体或IL-10受体的方法，或者一种在体内或体外增强T细胞抗肿瘤活性的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或多肽组合的步骤（例如，在体内或体外，将有效量的本发明任一项所述的多肽或多肽组合与T细胞例如CD8⁺T细胞进行接触）；具体地，包括下述步骤：

将所述多肽或多肽组合加入到T细胞（例如CD8⁺T细胞）液中（优选地，细胞浓度10⁷/ml,多肽浓度10pM），培养1－2小时（培养条件为常规的细胞培养条件，例如37℃，5%CO₂）；优选地，所述T细胞为上述的在体内或体外活化T细胞的方法制得的T细胞。本发明还涉及根据该方法处理得到的T细胞。实施例证明，经封闭的T细胞显示明显的体内体外抗瘤活性。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的多肽或多肽组合、和/或本发明任一项所述抗原表位、和/或上述任一项方法制得的T细胞；可选地，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的药物组合物，其为液体制剂或固体制剂；优选地，为注射剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的全部四条多肽。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其中，所述四条多肽之间的摩尔比为1∶1∶1∶1。

在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其中，每条多肽的浓度为1－20pM，优选10pM。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的多肽或多肽组合或者本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的药物组合物或者本发明任一项所述的方法制得的T细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症的药物中的用途；具体地，所述癌症为前列腺癌。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症的方法，包括使用有效量的本发明任一项所述的多肽或多肽组合的步骤；优选地，还包括在使用多肽或多肽组合之前，先使用有效量的一种或两种本发明任一项所述的抗原表位的步骤；具体地，所述癌症为前列腺癌。

具体的治疗有效剂量水平（例如封闭的T细胞的用量）须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的前列腺癌的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；治疗持续时间；同时使用的其它药物；以及及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

在本发明的一个实施方案中，所述的治疗方法包括下述步骤：

首先利用血细胞采集分离机得到PBMC,采用CD3,IL-2和针对PSCM抗原的特异性表位肽和模拟表位肽体外刺激活化CD8⁺T细胞（14天），获得抗原特异性T细胞后，以混合性含12个氨基酸的短肽封闭TGF-β和IL-10受体，然后按肿瘤大小估计出需要的T细胞总量（约1x10⁹）,回输病人，可辅以IL-2或CMSF体外注射，获得提高的抗肿瘤效应。

在本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、辅助治疗、预防、减轻和/或缓解前列腺癌的剂量。

术语“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。

术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

发明的有益效果

1）由于使活化的T细胞同时对TGF-β和IL-10的抑制作用不敏感，增强了抗原特异性T细胞的肿瘤杀伤活性。

2）由于所采用的抗原为前列腺所独有，因此具有良好的组织特异性，不会造成自身免疫性反应。

3）由于前列腺器官功能上相对不重要，不是影响生命体征的重要器官，因此即使正常前列腺组织有STEAP2的表达引起前列腺上皮细胞的破坏或自身免疫反应，也无重要影响。

4）由于使用的短肽可人工合成，达到很高的纯度，避开了应用抗体封闭的异种抗体的免疫原性，提高治疗效果。

附图说明

图1：合成的各种短肽（1－44）对活化的抗原特异性T细胞的TGF-β和IL-10的封闭作用（活化T细胞所用的短肽剂量，活化时间均固定一致）。横坐标为多肽的编号，A：活化的T细胞＋Treg，B：未活化的T细胞＋Treg，C：仅活化的T细胞。显示编号为6、14、25、以及37的短肽有较强的封闭作用。经体外封闭1-2小时后，活化的抗原特异性CD8⁺T细胞对调节性T细胞（Treg）的抑制作用不敏感。

图2：肽6、14、25、37的混合肽，可有效封闭活化的抗原特异性CD8+T细胞表面的TGF-β和IL-10的受体，使其对调控性T细胞的抑制作用不敏感，抗原特异性T细胞分泌表达的IFN-γ增加。横坐标为多肽的编号。图2A：LNCaP细胞，图2B：PC3细胞。

图3：过继输入经混合肽处理和封闭的活化的抗原特异性T细胞，使肿瘤生长速度减慢（4天内），甚至肿瘤缩小（6天后）。实验组（混合肽处理）和对照组（未处理）各用12只裸鼠，每个时间点取肿瘤大小的平均值。T检验，P<0.05有统计学差异，以星号表示。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：多肽（短肽）的设计与合成

每条短肽人工合成5mg,由上海科肽生物技术公司合成，稀释成10nM,使用时终浓度为10pM,等比例混合。如下面的表1所示。

表1：合成的多肽（短肽）：

实施例2：具有封闭作用的多肽（短肽）的筛选

样品：实施例1中的44种多肽。

筛选方法：按表1合成多肽序列后，配制成10nM浓度。分离肿瘤患者的血液PBMC，应用流式分选出CD4CD25，CD8。CD4CD25保存备用。CD8体外培养，培养液为无血清培养基，购自美国QIAGEN，应用本例所述45号多肽，在D1细胞（购自ATCC，培养在本实验室）递呈下，活化CD8细胞3天。同时应用CD3，IL-2扩增活化的CD8 T细胞。收集细胞冻存备用。在本室建立的CD4CD25，CD8共培养体系中，首先将活化的CD8，加入终浓度10pM的封闭多肽作用2小时，然后与调节性T细胞（按1∶100比例）共培养3天，利用ELISA检测培养上清的IFN-γ。

图1显示，编号为6、14、25、37号短肽有较强的封闭作用。经体外封闭1-2小时后，CD8⁺T细胞对调节性T细胞的抑制作用不敏感。

经上述的体外共培养体系筛选出有效短肽4条。

实际上，本发明人还筛选了其它设计长度例如20个氨基酸的多肽，其封闭效果都没有上述4条多肽理想。

实施例3：混合多肽的抗肿瘤实验

在共培养体系中加入肿瘤靶细胞LNCaP（图2A）或PC3细胞（图2B）（2X10⁵），显示加入肽6、肽14、肽25、肽37的混合具有特别强的肿瘤杀伤效应。

方法：首先以CFSE标记靶细胞[Quah BJ,Parish CR.New andimproved methods for measuring lymphocyte proliferation invitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.J ImmunolMethods.2012 May 31;379(1-2):1-14.Epub 2012 Feb 21.]，加入包含经肽处理或未经肽处理的1X10⁶活化的CD8⁺T细胞和1X10⁵调节性T细胞共培养三天的共培养体系中，流式细胞术检测CFSE阳性的细胞个数。T细胞再刺激的表位肽和模拟表位肽仍为VAITLLSLV和VAIMLLSLV。

图2A－B显示，肽6、14、25、37的混合肽，可有效封闭TGF-β和IL-10的受体，使调控性T细胞的作用不明显，抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用增强。

实施例4：封闭的活化CD8 ⁺ T细胞的抗肿瘤作用

经混合肽封闭的活化CD8⁺T细胞（实施例3），过继转入负载PC3肿瘤的裸鼠（Jax mice），肿瘤生长速度减慢甚至缩小。

方法：首先建立负载PC3细胞的移植瘤模型，于裸鼠右腿皮下注射1X10⁵的PC3肿瘤细胞，约一周后，肿瘤体积达1cm左右，转移入经混合肽封闭的活化CD8⁺T细胞1X10⁸,以此为零点，每隔一天度量肿瘤的大小,以长径X短径X高（CM³）表示。

图3显示，过继输入经混合肽处理和封闭的活化的抗原特异性T细胞，使肿瘤生长速度减慢（4天内），甚至肿瘤缩小（6天后）。实验组和对照组各用12只裸鼠，每个时间点取肿瘤大小的平均值。T检验，P<0.05有统计学差异，以星号表示。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (23)

1.一种多肽组合，其氨基酸序列如下面的（1）－（4）所示：

（1）SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，

（2）SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，

（3）SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，和

（4）SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。

2.一种在体外封闭T细胞表面上的TGF-β受体或IL-10受体的方法，或者一种在体外增强T细胞抗肿瘤活性的方法，包括使用有效量的权利要求1所述的多肽组合的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在体外将有效量的权利要求1所述的多肽组合与T细胞进行接触。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述T细胞为CD8⁺T细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，将所述多肽组合加入到T细胞液中，培养1－2小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述T细胞为CD8⁺T细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，细胞浓度10⁷/ml,多肽浓度10pM。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，在使用有效量的权利要求1所述的多肽组合的步骤之前，所述T细胞通过如下方法处理：

使用有效量的SEQ ID NO：45和/或SEQ ID NO：46所示的抗原表位处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在体外使有效量的SEQ IDNO：45和/或SEQ ID NO：46所示的抗原表位与T细胞相接触。

10.根据权利要求8所述的方法，所述处理包括下述步骤：

1）分离提取肿瘤患者自身血液单个核细胞PBMC，重悬于无血清培养基，得到细胞浓度为10⁶/ml－10⁸/ml的细胞培养液；

2）向步骤1）中得到的细胞培养液中加入SEQ ID NO：45和/或SEQ ID NO：46所示的抗原表位，终浓度为5pM－15pM,培养1－14天后收集细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤1）中，所述细胞浓度为107/ml。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤2）中，抗原表位的终浓度为10pM。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤2）中，培养3天。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤2）中，在培养之前或培养过程中加入CD3和/或CD28。

15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法处理得到的T细胞。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽组合和/或权利要求15所述的T细胞。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体或辅料。

18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其为液体制剂或固体制剂。

19.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其为注射剂。

20.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其中，四条多肽之间的摩尔比为1：1：1：1。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，每条多肽的浓度为1－20pM。

22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，每条多肽的浓度为10pM。

23.权利要求1所述的多肽组合或者权利要求16至22中任一项所述的药物组合物或者权利要求15所述的T细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症的药物中的用途，其中，所述癌症为前列腺癌。

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