CN102341408A

CN102341408A - 含有DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分的用于抗癌症转移的组合物

Info

Publication number: CN102341408A
Application number: CN201080013202XA
Authority: CN
Inventors: 朴荣祐; 赵基沅; 李东熙; 柳奵; 朴芝贤; 朴灿雄; 金恩珍; 朴允贞
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: EP2548887A4; CA2792413C; RU2012143943A; MX2012010560A; WO2011115323A1; AU2010348423A1; RU2531756C2; AU2010348423B2; KR100982170B1; JP2012513775A; CA2792413A1; US20130202592A1; JP5367905B2; BR112012023416A2; CN102341408B; EP2548887B1; MX342222B; US8785392B2; EP2548887A1

Abstract

构建包含DLK1胞外可溶域基因和IgG抗体Fc域基因的重组表达载体，在293E细胞中表达并纯化DLK1-Fc融合蛋白。本发明通过证实DLK1-Fc融合蛋白引起癌细胞迁移显著降低并计算药代动力学参数，证实DLK1-Fc融合蛋白作为用于抑制癌症转移的药物的功效。DLK1-Fc融合蛋白具有比非融合蛋白相对高的稳定性，显著降低多种癌细胞系的迁移，甚至在低浓度下提供优秀的癌症转移抑制作用。因此，DLK1-Fc融合蛋白可以有效用作用于抑制癌症转移的组合物的有效成分。

Description

含有DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分的用于抗癌症转移的组合物

技术领域

本发明涉及用于抗癌症转移的组合物，所述组合物含有具有抑制癌症转移功能的DLK1-Fc融合蛋白。

背景技术

癌症是威胁人类生命的主要疾病。在韩国，癌症在过去数年已是第一死因。在美国，癌症是继心血管疾病之后的第二主要死因。虽然已经进行了并正进行着众多研究，癌症仍然是人类曾遭受过的最大灾难，它每年夺取数百万条生命并带来极大的开销。

考虑到癌症随诸如原癌基因和抑癌基因的基因发生突变而进展，在细胞水平上，癌症可以被认为是遗传疾病。当前可用的癌症疗法包括手术、化学疗法、放射疗法和免疫疗法，然而涉及抑制恶性肿瘤及其复发的问题还没有有效的解决方案。

癌症最为重要的生物学特性之一在于癌症能够迁移，这成为了寻找癌症疗法的最大障碍。实际上，在全部实体瘤患者中，约有60％在原发肿瘤诊断中表现出微小但可临床迁移的肿瘤，并且已得到广泛认同的是，大多数癌症患者最为关键的死因就是转移。所述转移过程涉及肿瘤向局部组织渗透并伴有新血管的形成(即血管新生)，血管新生因子(TAF)参与其中。由肿瘤新生成的血管具有很多缺陷，使得癌细胞容易渗透。癌症渗透和转移需要癌细胞表面的众多受体(诸如层粘连蛋白受体，所述层粘连蛋白受体是与组织基质和基底膜粘附所必需的)；溶解正常组织间质所必需的多种酶(诸如胶原酶IV型、纤溶酶原激活因子和组织蛋白酶D)；生长因子；自分泌运动因子(autocrine motility factor)(AMF)；以及原癌基因的表达。

具有转移抑制作用的物质承载着巨大的期望，但是怀着抑制转移的目的，事实上几乎没有开发出任何物质。当前，已报道包括硫酸多糖、N-重氮乙酰甘氨酸衍生物、神经氨酸酶和纤连蛋白(FNs)酶在内的物质具有转移抑制作用。然而，这些物质并没有已商业化的报道，并且尚未阐明所述物质自身具有这种转移抑制作用。如果开发出了有效抑制癌症迁移的方法，那么能有效抑制由转移所造成的死亡的疗法会是可行的。

同时，notch/delta/serrate家族成员δ样1同源物(DLK1)是定位于基因14q32上的dlk1编码的跨膜糖蛋白，它由383个氨基酸构成，包含280个氨基酸的胞外区、24个氨基酸的跨膜区段(segment)和56个氨基酸的胞质域。其中，在胞外区有6个表皮生长因子(EGF)样重复域，其具有3个N-糖基化位点和7个O-糖基化位点。如所解释的，DLK1是跨膜蛋白，但也众所周知的是，它是能从细胞膜脱落的胞外部分，具有独立功能，所述脱落是由肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)所引起的(YuhuiWang和Hei Sook Sul，Molecular and cellularbiology.26(14)：5421-5435，2006)。

在细胞膜上，DLK1通过糖基化以50-60kDa的多种形式存在(SmasCM和Sul HS，Cell.73：725-34，1993)，并具有经可变剪接的4种剪接变体(Smas CM等，Biochemistry.33：9257-65，1994)。其中，两种较大变体具有蛋白水解酶的酶切位点，所述酶切位点由TACE切割而生成大小为50kDa和25kDa的两种可溶形式(Yuhui Wang等，Journal of Nutrition.136：2953-2956，2006)(见图1)。

由于DLK1主要是在胚胎组织发育阶段(Smas CM等，Cell.73：725-34，1993；Kaneta M等，Journal of Immunology.164：256-64，2000)和胎盘中表达、特别是在产妇血清中高浓度地表达而被广泛称作胚胎抗原1(FA1)(Jensen CH等，European Journal of Biochemistry.225：83-92，1994)。一些人报道DLK1在胰腺的腺细胞(Kaneta M等，Journal ofImmunology.164：256-64，2000)、卵巢细胞或骨骼肌管(Floridon C等，Differentiation.66：49-59，2000)中表达。出生后，DLK1在大多数组织中的表达消失，并出现在诸如前成脂肪细胞(Smas CM等，Cell.73：725-34，1993)、胰岛细胞(Carlsson C等，Endocrinology.138：3940-8，1997)、胸腺基质细胞(Kaneta M等，Journal of Immunology.164：256-64，2000)或肾上腺细胞(Halder SK等，Endocrinology.139：3316-28，1998)等有限细胞中。由于甲基化的影响，DLK1的表达也称作父系单等位基因表达(Schmidt JV等，Genes and Development.14：1997-2002，2000；Takada S等，Current Biology 10：1135-8，2000；Wylic AA等，Genome Research.10：1711-8，2000)。

DLK1被广泛地称作前成脂肪细胞因子-1(Pref-1)，它在抑制脂肪细胞分化中起作用，并在该方面得到了最频繁地研究(Smas CM等，Cell.73：725-34；Villena JA等，Hormone and Metabolic Research.34：664-70，2002)。除抑制脂肪细胞分化外，对DLK1的了解还在于它抑制造血干细胞的分化(Sakajiri S等，Leukemia.19：1404-10，2005；Li L等，Oncogene.24：4472-6，2005)，调节淋巴祖细胞的分化(Bauer SR等，Molecular andCellular Biology.18：5247-55，1998；Kaneta M等，Journal of Immunology.164：256-64，2000)并参与创伤愈合(Samulewicz SJ等，WoundRepair andRegeneration.10：215-21，2002)。然而，在DLK1对癌细胞的作用方面仅有少许研究。

对DLK1与若干类型的癌症间关联的研究最近已报道了DLK1在神经胶质瘤中过表达，并且发现，如果DLK1在神经胶质瘤中过表达，DLK1的cDNA加强神经胶质瘤的增殖并因而促进迁移(Yin D等，Oncogene.25：1852-61，2006)。该报道还指出，相比在正常肝细胞中的表达，DLK1在肝癌中的表达提高，并且还指出，经由siRNA试验发现，当DLK1表达被降低时，肿瘤大大缩小(Huang J等，Carcinogenesis.28(5)：1094-1103，2007)。近来已报道，DLK1的胞质域在肿瘤发生中起重要作用(Yuri K等，Cancer Research.69(24)：OF1-10，2009)。迄今，关于可溶DLK1的研究已主要集中在抑制脂肪细胞分化的功能上，所述可溶DLK1是借助TACE从细胞膜脱落的胞外部分。DLK1的胞外可溶域与癌症间的关联尚未得到研究。

因此，本发明人等通过以下步骤完成了本发明：构建包含DLK1胞外区的可溶域基因及IgG抗原的Fc域基因的重组表达载体；在293E细胞中表达并纯化DLK1-Fc融合蛋白；以及证实DLK1-Fc融合蛋白引起癌细胞迁移显著降低，再通过测量药代动力学(PK)参数证实其作为抑制转移的药物的功效，从而证实DLK1-Fc融合蛋白能够被有效地用作抑制转移的组合物的有效成分。

发明内容

本发明的目的在于提供DLK1-Fc融合蛋白和含有DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分的用于抗癌症转移的组合物。

为实现上述目的，本发明提供DLK1(δ样1同源物)胞外可溶域。

此外，本发明提供编码DLK1胞外可溶域的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体，以及转染的重组细胞株，在所述细胞株中，重组载体被转染到宿主细胞中。

此外，本发明提供DLK1胞外可溶域，以及与人抗体Fc域结合的DLK1-Fc融合蛋白。

此外，本发明提供编码所述DLK1-Fc融合蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体，以及转染的重组细胞株，在所述细胞株中，重组载体被转染到宿主细胞中。

此外，本发明提供制备DLK1-Fc融合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

1)培养重组细胞株；和

2)将DLK1-Fc融合蛋白与细胞株培养基分离。

此外，本发明提供用于抗癌症转移的组合物，所述组合物含有如上所述制备的DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分。

此外，本发明提供抑制癌症转移的方法，所述方法包括将药学上有效量的、如上所述制备的DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白给予患有转移性肿瘤的受试者的步骤。

此外，本发明提供DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白在制备用于抗癌症转移的组合物中的用途。

与非融合蛋白相比，本发明的DLK1-Fc融合蛋白具有高的稳定性，在多种癌细胞株中表现出显著降低的迁移，甚至在低浓度下也具有优秀的抑制癌症转移的作用，因此能够用作用于抗癌症转移的组合物的有效成分。

附图说明

图1示出DLK1蛋白的结构，其中

S：信号肽

1-6：表皮生长因子(EGF)样重复域

Jm：近膜域

Tm：跨膜域

Cy：胞内域

图2表示DLK1基因在癌症患者组织中的表达率。

图3表示DLK1基因在癌细胞中的表达率。

图4示出用于构建表达DLK1-Fc融合蛋白的表达载体的引物序列(SEQ.ID.NO.2：5′-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3′；和SEQ.ID.No.3：5′-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3′)。

图5表示pYK602-His-DLK1载体的结构，所述载体是用于表达DLK1-Fc融合蛋白的表达载体。

图6表示所克隆的DLK1的核酸序列(SEQ.ID.NO.1)。

图7表示所克隆的DLK1的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.4)。

图8表示从细胞培养基中得到的DLK1-Fc融合蛋白的表达，所述融合蛋白培养基是在诱导293E细胞中的DLK1-Fc融合蛋白表达后回收的。

图9示出SDS-聚丙烯酰胺凝胶的结果，以确认所纯化的DLK1-Fc融合蛋白。

图10示出含有DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在结肠癌细胞系(SW620)中的迁移抑制作用。

图11示出含有DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在皮肤癌黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)中的迁移抑制作用。

图12示出含有DLK1胞外可溶域和可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在皮肤癌黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)中的迁移抑制作用，其中，分别使用浓度为10μg/ml的sDLK1、sDLK1-Fc和Fc。

图13的图表示出含有DLK1胞外可溶域和可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在皮肤癌黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)中的迁移抑制作用，其中，分别使用浓度为10μg/ml的sDLK1、sDLK1-Fc和Fc。

图14示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在乳腺癌细胞系(Hs578T)中的迁移抑制作用。

图15示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在乳腺癌细胞系(MCF-7)中的迁移抑制作用。

图16示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在子宫癌细胞系(HeLa)中的迁移抑制作用。

图17示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在结肠癌细胞系(SW480)中的迁移抑制作用。

图18示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在结肠癌细胞系(HT29)中的迁移抑制作用。

图19示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肾癌细胞系(786-O)中的迁移抑制作用。

图20示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肾癌细胞系(UO-31)中的迁移抑制作用。

图21示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肝癌细胞系(HepG2)中的迁移抑制作用。

图22示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肝癌细胞系(SNU449)中的迁移抑制作用。

图23示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肝癌细胞系(SNU398)中的迁移抑制作用。

图24示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肺癌细胞系(A549)中的迁移抑制作用。

图25示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肺癌细胞系(NCIH23)中的迁移抑制作用。

图26示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在肺癌细胞系(NCIH460)中的迁移抑制作用。

图27示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在卵巢癌细胞系(MDAH2774)中的迁移抑制作用。

图28示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在卵巢癌细胞系(IGROV-1)中的迁移抑制作用。

图29示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在胰腺癌细胞系(Aspc-1)中的迁移抑制作用。

图30示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在胰腺癌细胞系(HPAC)中的迁移抑制作用。

图31示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在胰腺癌细胞系(MIA paca-2)中的迁移抑制作用。

图32示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在胃癌细胞系(SNU638)中的迁移抑制作用。

图33示出含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基在胃癌细胞系(AGS)中的迁移抑制作用。

图34示出用于证实可溶性DLK1-Fc融合蛋白的癌症迁移抑制作用的测试中的各细胞系的细胞数、趋化剂构成和孵育时间。

图35示出可溶性DLK1-Fc融合蛋白的药代动力学测试结果。

图36示出sDLK1的药代动力学参数。

具体实施方式

以下会更为详细地解释本发明。

本发明提供DLK1(δ样1同源物)胞外部分的可溶域、编码所述DLK1胞外可溶域的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体以及重组细胞株，在所述重组细胞株中，所述重组载体被转染到宿主细胞中。

DLK1胞外可溶域可以合意地具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列，但不限于此。

编码所述胞外可溶域的多核苷酸可以合意地具有SEQ.ID.No.1的基因序列，但不限于此。

此外，本发明提供DLK1胞外可溶域和与人IgG Fc域结合的DLK1-Fc融合蛋白。

术语“DLK1-Fc融合蛋白”指含有源白抗体重链恒定区的片段的重组分子。所述Fc融合蛋白可以包含随机来自5种Ig类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的抗体的Fc域，即包含全部或部分的CH2和CH3恒定区。例如，可以将DLK1-Fc融合蛋白制备为在DLK1胞外可溶域羧基末端和氨基末端含有全部或部分重链恒定区的形式。又例如，所述Fc融合蛋白可以包括含有两个或更多个抗体重链的恒定区部分的形式，并且在本文中，两个Fc重链可以通过二硫键或共价键连接。又例如，DLK1-Fc融合蛋白的DLK1部分可以包括含有两个或更多个DLK1胞外可溶域的形式。

此外，本发明提供编码DLK1-Fc融合蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体和转染的重组细胞株，其中，重组载体被转染到宿主细胞中。

1)培养重组细胞株；和

2)将DLK1-Fc融合蛋白与细胞株培养基分离。

含有该基因的表达载体可以合意地是pYK602-His载体，但不限于此。可以使用任何载体，前提是该载体包含表达启动子、哺乳动物Fc域。

哺乳动物细胞可以合意地是293E细胞，但不限于此。可以使用任何哺乳动物细胞株，其中，启动子是可操纵的。

基于本发明人等在先研究的微阵列结果，与现有文献不同，DLK1的表达(见图2)颇为降低，并且这种现象特别是在乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌的组织中被观察到(图2)。另外，除少数细胞株外，在67种癌细胞株中，DLK1的表达非常低(见图3)。鉴于以上表达类型，可以预期DLK1行使抑癌基因及原癌基因功能的可能性。该研究特别地仅使用可溶域，所述可溶域是借助肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)从细胞膜脱落的细胞膜外部部分，并因而具有旁分泌作用和自分泌作用。

可溶性Fc融合蛋白被广泛用于体外实验和体内实验中，尤其是在动物实验中，与非融合蛋白相比，它因具有较高稳定性而具有许多优点(MegL等，Methods in Molecular Biology 378：33-52，2007)。当前广泛使用可溶性Fc融合蛋白，这是因为它在人抗体药物生成时保留了抗原特异性，而同时排除了许多免疫学问题。代表性的可溶性Fc融合人抗体药物是Amgen的关节炎药依那西普(Etanercept)，它是通过将TNF受体2的可溶域与人IgG1的Fc融合而制备的(美国专利第5447851号)。

在本发明的特定实施例中，为了将DLK1克隆至pYK602-His载体中，使用(肾、胎盘、胰腺和肝的)DNA文库混合物作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，使用引物SEQ.ID.NO.2(5′-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3′)和SEQ.ID.No.3(5′-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3′)以选择性扩增DLK1蛋白的胞外可溶域，并使用SfiI对PCR产物进行限制性酶反应，再通过合并pYK602-His-DLK1构建pYK602-His-DLK1重组载体(图4和图5)。

此后，将pYK602-His-DLK1DNA转染到293E细胞中，回收培养基，并通过蛋白印迹法(Western Blotting)观察DLK1-Fc融合蛋白的表达(图8)。针对具有经确认表达的培养基，使用蛋白A柱进行纯化，中和所纯化的DLK1-Fc蛋白的pH，使用磷酸钾盐(PBS)缓冲液进行透析，通过BCA分析进行定量，并通过SDS-PAGE证实纯化和定量的完成(图9)。此后，使用EndoTrap Red柱从所纯化的DLK1-Fc融合蛋白中去除细菌内毒素。结果便制备了DLK1-Fc融合蛋白。

此外，本发明提供用于抑制癌症转移的组合物，所述组合物包括如上所述制备的DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分。

所述癌症可以是选自由以下癌症组成的组中的至少一种：皮肤癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头癌或颈癌、子宫癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin′sdisease)、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤，更为优选地，所述癌症是选自以下癌症组成的组中的一种：皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌，然而并不限于此。

在本发明的特定实施例中，分析所制备的DLK1-Fc融合蛋白对癌细胞系的影响。也就是使用并入本文作为参考的Chen HC，Methods inmolecular biology.294：15-22，2005的方法，进行癌细胞系迁移测定。另外，作为研究所纯化的DLK1-Fc融合蛋白对多种癌细胞转移的影响的结果，证实了DLK1-Fc融合蛋白能够降低皮肤癌(图11)、乳腺癌(图14和图15)、子宫癌(图16)、结肠癌(图17和图18)、肾癌(图19和图20)、肝癌(图21-图23)、肺癌(图24-图26)、卵巢癌(图27和图28)、胰腺癌(图29-图31)和胃癌(图32和图33)的转移。

此外，所制备的DLK1胞外可溶域被选择性地表达和纯化，并用皮肤癌黑素瘤处理。随后，作为比较的结果，证实了DLK1胞外可溶域还能够显著降低癌细胞的迁移(图12和图13)。

另外，为了研究作为抑制癌症转移的药物的功效，在小鼠上进行了测定药代动力学参数的实验。考虑到所述实验注射了5mg/kg(即100μg/小鼠，考虑到小鼠的实际体重)及小鼠全部血液为约2ml，可以估计，通过静脉注射的最大浓度为50μg/ml。因此，作为通过腹膜注射进行实验的结果，38.96μg/ml(C_max)是相当高的值。经证实，最大浓度出现在注射后4小时(T_max)。就半衰期(其代表药物如何能在体内保持稳定)而言，大约为20小时，从而证实药物在体内相当稳定(见图36)。由于表示转移抑制力的浓度值在10μg/ml的浓度下非常出色，考虑到所述浓度在48小时后维持在约10μg/ml的事实，很明显该药物提供了作为抑制癌症转移的新药物的足够的安全性和功效(图35)。

因此，如上所述制备的胞外DLK1域中的可溶域或DLK1-Fc融合蛋白可以有效地用作抑制癌症转移的组合物的有效成分。

本发明的组合物可以另外包括一种或多种类型的、具有相同或相似功能的有效成分。为了给药，所述组合物可以另外包括一种或多种类型的药学上可接受的载体。本发明的组合物包括重量为所述组合物总重量0.0001-10重量％、或优选0.001-1重量％的蛋白。药学上可接受的载体可以包括盐溶液、蒸馏水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及其一种或多种的混合物，并且如有需要，还可以另外包括其它常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲溶液、制菌剂(bacteristat)等。所述组合物还可以通过另外包括稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂而制备成用于注射的剂型，诸如水性溶液剂、悬浮剂或乳剂、片剂、胶囊剂、散剂或丸剂。此外，可以根据靶向的疾病或其成分，使用Remington′s Pharmaceutical Science(MackPublishing Company，Easton PA，18th，1990)中公开的方法将所述组合物配制为期望的形式。

本发明的用于抑制癌症转移的组合物的给药可以通过肠胃外给药(例如静脉给药、肌内给药、腹内给药、皮下给药或局部给药)或口服给药，而剂量因患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄速率和疾病严重性而在宽的范围中变化。对于60kg重的成年男性，待给药的蛋白的量处于0.738μg～7.38g的范围(基于美国FDA标准)、优选处于7.38μg～0.738g的范围(12.3mpk)，并且期望的是每隔一天给予一次蛋白，但这可以根据患者需要而确定。

此外，本发明提供抑制癌症转移的方法，所述方法包括将药学上有效量的如上所述制备的DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白给予患有转移性肿瘤的受试者的步骤。

DLK1的胞外可溶域可以优选具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列，但不限于此。

在本文中，术语“DLK1-Fc融合蛋白”指含有源自重链恒定区的片段的重组分子。所述Fc融合蛋白可以包含全部或部分的CH2和CH3恒定区，诸如随机选自5种Ig类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的抗体的Fc域。例如，可以将DLK1-Fc融合蛋白制备为在胞外可溶域羧基末端和氨基末端含有全部或部分的抗体重链恒定区的类型。又例如，所述Fc融合蛋白还可以包括具有两个或更多个抗体的重链恒定区的类型，其中，两个重链可以通过二硫键或共价键连接。再例如，所述Fc融合蛋白的DLK1部分还可以包括具有两个或更多个DLK1胞外可溶域的类型。

所述癌症可以是选自由以下癌症组成的组中的一种：皮肤癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头癌或颈癌、子宫癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤，更为优选地，所述癌症是选自以下癌症组成的组中的一种：皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌，然而并不限于此。

取决于使用目的，本发明的抑制癌症转移的方法可以通过肠胃外给药(例如静脉给药、肌内给药、腹内给药、皮下给药或局部给药)，且剂量因患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄速率和疾病严重性而在宽的范围中变化。根据本发明，可以向例如60kg重的成年男性，以0.738μg～7.38g的范围(基于美国FDA标准)、优选以7.38μg～0.738g范围(12.3mpk)的量给予蛋白，并且优选的是每隔一天给予一次，但给药方法可以根据患者需要而变化。

本发明构建了包含DLK1胞外可溶域基因和IgG抗体Fc域基因的重组表达载体，从293E细胞中表达并纯化了DLK1-Fc融合蛋白，并且证实了DLK1-Fc融合蛋白使迁移明显减少，又基于对药代动力学参数的计算证实其作为抑制癌症转移的药物的功效。结果，对患有转移性肿瘤的受试者给予DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白能够被有效用于抑制癌症转移的方法中。

此外，本发明提供如上所述制备的DLK1胞外可溶域或DLK1-Fc融合蛋白在制备用于抑制癌症转移的组合物中的用途。

所述癌症可以是由选自以下癌症组成的组中的一种：皮肤癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头癌或颈癌、子宫癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤，更为优选地，所述癌症是选自以下癌症组成的组中的一种：皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌，然而并不限于此。

本发明的组合物可以另外包括一种或多种类型的、具有相同或相似功能的有效成分。为了给药，所述组合物可以另外包括一种或多种类型的药学上可接受的载体。本发明的组合物包括重量为所述组合物总重量0.0001-10重量％、或优选0.001-1重量％的蛋白。药学上可接受的载体可以包括盐溶液、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及其一种或多种的混合物，并且如有需要，还可以另外包括其它常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲溶液、制菌剂等。所述组合物还可以通过另外包括稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂而制备成用于注射的剂型，诸如水性溶液、悬浮剂或乳剂、片剂、胶囊剂、散剂或丸剂。此外，可以根据靶向的疾病或其成分，使用Remington′s Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company，Easton PA，18th，1990)中公开的方法将所述组合物配制为期望的形式。

本发明的抑制癌症转移的组合物的给药可以通过肠胃外给药(例如静脉给药、肌内给药、腹内给药、皮下给药或局部给药)或口服给药，而剂量因患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄速率和疾病严重性而在宽的范围中变化。对于60kg重的成年男性，待给药的蛋白的量处于0.738μg～7.38g的范围(基于美国FDA标准)、优选处于7.38μg～0.738g的范围(12.3mpk)，并且期望的是每隔一天给予一次蛋白，但这可以根据患者需要而确定。

以下将更为详细地解释本发明的若干实施方式、实验实施例和制备实施例。

然而，应当注意的是，本文所记载的实施方式、实验实施例和制备实施例仅为解释性目的而书写，因此不应被理解为限制性的。

实施例1pYK602-His-DLK1表达载体的制备

为诱导pYK602-His载体的DLK1-Fc表达，分别制备如SEQ ID NO.2(5′-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAATGCTTCCCGGCCTGCAA-3′)和SEQ ID NO.3(5′-TAGCGGCCGACGCGGCCGCCCTCGGTGAGGAGAGGGG-3′)所示的引物对，随后进行聚合酶链式反应(PCR)。具体的反应组合如下：添加用作模板的100ng DNA文库混合物(肾、胎盘、胰腺和肝的DNA文库混合物)和10pmol的每一pfu 2.5单位的引物，并使其以总体积50μl进行反应。以94℃2分钟1个循环，94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟30个循环，和72℃10分钟1个循环进行所述反应，然后结束。由于PCR产物包括SfiI限制性酶位点，因而用SfiI进行限制性酶反应，随后将其插入pYK602-His载体以获得pYK602-His-DLK1重组载体(图5)。

克隆的DLK1是DLK1的胞外可溶域，它对应总共383个氨基酸中的第25至第302位的氨基酸，信号肽、跨膜区和胞质域被从这383个氨基酸中移除。所克隆的DLK1的核酸序列和氨基酸序列分别示于图6(SEQID NO：1)和图7(SEQ ID NO：4)。

实施例2DLK1-Fc融合蛋白的表达和纯化

为表达实施例1克隆的DLK1-Fc，使用293E细胞。具体的表达方法如下。在具有约70％水平的细胞的100mm平板中，将10μgDNA和20μgPEI(#23966，Polysciences，USA)混合，使其在室温下反应20分钟以获得混合物，随后用细胞处理。16-10小时后，替换无血清DMEM培养基，并每隔一天回收一次培养基并用新培养基进行替换。通过蛋白印迹证实所回收培养基的表达(图8)。对具有经证实表达的培养基进行离心，以移除可能残留的细胞，并通过0.22μm滤器(#PR02890Millipore，USA)进行过滤。此后，利用蛋白A柱进行纯化。也就是在10ml柱中，装入500μl的蛋白A珠(#17-1279-03GE，Sweden)，用PBS清洗，并使具有DLK1-Fc表达的培养基流过。在该过程中，使用蠕动泵，将其流速设置为0.5ml/min。当培养基完全通过柱时，用PBS清洗培养基，并回收用0.1M甘氨酸-HCl(#G7126，Sigma，USA)纯化的DLK1-Fc蛋白。利用1M pH 9.0的Tris(#T-1503，Sigma，USA)中和所回收蛋白的pH，随后利用PBS进行透析。通过BCA分析，进行所纯化蛋白的定量，并通过SDS-PAGE以证实纯化(图9)，从而获得纯化的DLK1-Fc融合蛋白。

实验实施例1所纯化的DLK1-Fc的内毒素的测定和移除

使用Chromo-LAL(货号C0031，CAPE COD)测定所纯化的DLK1-Fc的细菌内毒素数据。具体地，将作为蛋白标准物质的1EU/ml的CSE(对照标准内毒素；货号E0005，CAPE COD)稀释2次以获得0.03125EU/ml的浓度。添加作为阴性对照的LRW(LAL试剂水；货号WP 1001，CAPECOD)(100μl+LAL 100μl)和浓度为0.125EU/ml的作为阳性对照的标准品(100μl+LAL 100μl)。为了分析，制备100μl+LAL 100μl的稀释的LRW样品，其具有预定的浓度(50μg/ml)。另外，为检验样品间的干扰，还制备了上述所稀释样品(50μl+0.125EU/ml)和标准品(50μl+LAL 100μl)用于产物阳性对照实验。此外，用于VersaMax酶标仪(Molecular devices)测量的文件(Chromo LAL setting.pda)为预置值的协议资料。实验前，在37℃下预热平板约10分钟。自设定文件起始，处理LAL，并同时测量吸光度。使用Log EU/mL作为X轴、Log开始时间作为Y轴，构建标准曲线，测量样品内毒素数据的吸光度自动在软件上计算并以EU/ml单位表示。当标准曲线的R2超过0.98时，确定测量结果的可靠性。作为对DLK1-Fc蛋白的LAL测试的结果，测定了150.24EU/ml的内毒素。接下来，使用EndoTrap Red(货号83-009U，Lonza)柱移除样品内毒素。用3ml新缓冲液漂洗柱2次，并用相同量的稳定缓冲液漂洗2次。接下来，取所述样品上样，并同时接收组分(速率：0.5-1ml/分钟)。通过加入1ml稳定缓冲液，接收柱内残留样品。内毒素移除后，以如上所述的相同方式再进行LAL测试，结果，内毒素数据经测定为7.53EU/ml，其与阴性对照的量相似。因此，经证实，所纯化的DLK1-Fc蛋白的细菌内毒素被移除。

实验实施例2DLK1-Fc融合蛋白对癌细胞系迁移抑制作用的证实

使用Chen HC，Methods in molecular biology.294：15-22，2005的方法，对癌细胞系的迁移进行测定，以研究实施例2所制备和纯化的DLK1-Fc蛋白的影响。

具体地，培养癌细胞系{皮肤癌细胞系(MDA-MB-435，ATCCHTB-129)、乳腺癌细胞系(Hs578T，ECACC 86082104；和MCF-7，ATCCHTB-22)、子宫癌细胞系(HeLa，ATCC CCL-2)、结肠癌细胞系(SW480，ATCC CCL-228；SW620，ATCC CCL-227；和HT29，ATCC HTB-38)、肾癌细胞系(786-O，ATCC CRL-1932；和UO-31，DTP)、肝癌细胞系(HepG2，ATCC HB-8065；SNU398，KCLB 00398；和SNU449，KCLB00449)、肺癌细胞系(A549，ATCC CCL-185；NCI-H23，KCLB 90023；和NCI-H460，KCLB 30177)、卵巢癌细胞系(MDAH2774，ATCCCRL-10303；和IGROV-1，DTP)、胰腺癌细胞系(Aspc-1，KCLB 21682；HPAC，ATCC CRL-2119；和MIA paca-2，KCLB 21420)和胃癌细胞系(SNU638，KCLB 00638；和AGS，KCLB 21739)}，当细胞水平为约50％时，用无血清培养基进行替换，24小时后利用胰蛋白酶移除细胞，并测量细胞数。将所述细胞、无血清培养基和待处理的各蛋白一起混合为100μl混合物，并在37℃下孵育1小时。将1ml趋化剂加入24孔培养板中，将具有8.0μm孔的trans well小室(Corning#3422)置于其上，将100μl的细胞、无血清培养基和蛋白的预培养混合物置于其中，并在37℃下的二氧化碳培养基中孵育24至48小时。图34示出各细胞系所用的细胞数、趋化剂构成和培养时间。

培养后，移除trans well中的培养基，在100％甲醇中固定15分钟，并在此后，使用蒸馏水漂洗2次，并在结晶紫溶液中反应5分钟。反应后，用蒸馏水将混合物漂洗3次，并使用棉拭子完全移除未通过trans well小室的细胞。将trans well小室完全干燥后，借助放大100倍的观察和照相术，观察通过trans well小室的细胞。为了定量分析，在拍照后，将10％乙酸置于trans well小室中并对其进行提取，在560nm波长下进行测量以分析吸光度。

结果是，与对照可溶性Fc蛋白和未处理组相比，用含有可溶性DLK1-Fc融合蛋白的细胞培养基处理的结肠癌细胞系(SW620)和皮肤癌黑素瘤细胞系(MDA-MB-435)表现出可溶性DLK1-Fc融合蛋白引起对癌细胞系迁移显著提高的抑制(图10和图11)。此外，选择性地表达和纯化DLK1可溶性区，以证实迁移受Fc与DLK1结合的影响，结果，在可溶性DLK1-Fc融合蛋白的情况下，证实了对癌细胞系迁移显著提高的抑制(图12和图13)。还研究了所纯化的可溶性DLK1-Fc融合蛋白对多种癌细胞系转移的影响，结果，证实了对乳腺癌(图14和图15)、子宫癌(图16)、结肠癌(图17和图18)、肾癌(图19和图20)、肝癌(图21-图23)、肺癌(图24-图26)、卵巢癌(图27和图28)、胰腺癌(图29-图31)和胃癌(图32和图33)的迁移抑制作用。

实验实施例3对DLK1-Fc融合蛋白药代动力学参数的确认

进行药代动力学测试，以研究如实施例2所述制备并纯化的DLK1-Fc融合蛋白用作癌症转移抑制剂的实用性。

具体地，通过腹部注射对30只6周龄的雌性Balb/c小鼠(Orient Bio)以5mg/kg注射一次，在0、0.5、2、4、6、24、30、48小时从眼静脉丛取血，分离血清并将其用于测试。

利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对所采样血清测量DLK1-Fc的血液浓度。具体地，在4℃下，将浓度为1μg/ml的DLK1抗体(#MAB 1144，R&D)包被在ELISA板(#439454，NUNC)上。利用4％脱脂奶粉/PBS(磷酸钾盐)缓冲液封闭1小时，并用PBST(磷酸钾盐，0.05％吐温20)缓冲液漂洗该板。为构建标准曲线，自100nM的浓度将所纯化的DLK1-Fc稀释2次。将hIgG(人IgG)用作阴性对照。将测试中所采样的血清分别稀释250倍、500倍和1000倍，并在室温下反应2小时。用PBST缓冲液漂洗板，并以1∶4000的浓度稀释抗Fc-HRP(#31413，Pierce)抗体，并使其在室温下反应2小时。用PBST缓冲液漂洗板，并配制OPD(邻苯二胺二盐酸盐)溶液。用100μl OPD溶液处理各孔。通过向PC缓冲液(pH 5.0)添加充氧水和OPD(P9187，Sigma)制备所述OPD溶液。在暗室中反应10分钟后，用50μl的2.5M的硫酸处理各孔。由此完成显色反应，并在OD 492nm下测量吸光度。选择R²超过0.99的区域，并处理结果用于标准曲线。

结果是，考虑到注射了5mg/kg(100μg/小鼠，考虑到小鼠实际体重)和小鼠全部血液为约2ml，可以估计最大浓度为50μg/ml，腹部注射的测试结果表现出相当高的浓度，即C_max＝38.96μg/ml。因此，最大浓度出现在注射后4小时(T_max)。就半衰期(其代表药物如何能在体内保持稳定)而言，大约为20小时，从而证实药物在体内相当稳定(见图36)。由于表示转移抑制力的浓度值在10μg/ml的浓度下非常出色，考虑到所述浓度在48小时后维持在约10μg/ml的事实，很明显该药物提供了作为抑制癌症转移的新药物的足够的安全性和功效(图35)。

因此，考虑到所述DLK1-Fc融合蛋白能够抑制多种肿瘤的迁移，再考虑到药代动力学参数，很明显所述DLK1-Fc融合蛋白提供了作为用于抑制癌症转移的组合物的足够可能性。

以下将说明制备根据本发明的组合物的实施例。

制备实施例1药物制备

1.散剂的制备

DLK1-Fc融合蛋白 2g

乳糖 1g

混合以上成分，并将其装入气密小袋中以获得散剂。

2.片剂的制备

混合以上成分并根据一般常规片剂包装方法将其包装成片剂。

3.胶囊剂的制备

混合以上成分并根据一般常规胶囊制备方法将其装入明胶胶囊中。

4.注射剂的制备

DLK1-Fc融合蛋白 10μg/ml

盐酸BP 直至pH为7.6

注射用氯化钠BP 最大1ml

以适当含量的注射用氯化钠BP溶解DLK1-Fc融合蛋白，使用盐酸BP将所生成溶液的pH调至pH 7.6，使用注射用氯化钠BP调节含量，并将溶液充分混合。将溶液装入5ml I型透明玻璃安瓿中，熔化玻璃，并在气体下将溶液密封。将所述安瓿于120℃下高压灭菌15分钟以上，以获得注射剂。

5.丸剂的制备

混合以上成分并根据一般常规方法将其制成4g的丸剂。

6.颗粒剂的制备

混合以上成分，并添加100mg的30％乙醇，在60℃将其干燥以获得颗粒剂，并包装在小袋中。

工业实用性

与非融合蛋白相比，所述DLK1-Fc融合蛋白具有更高的稳定性，显著降低多种癌细胞系的迁移，甚至在低浓度下也提供了显著降低的癌症迁移。因此，所述DLK1-Fc融合蛋白可以有效用作抑制癌症转移和预防及治疗癌症的组合物以及用作预防和改善癌症的健康食品组合物。此外，当与目前作为癌症疗法可用的抗血管新生组合物联用而商业化时，所述DLK1-Fc融合蛋白可以被有效用作抗癌症活性显著提高的抑制癌症转移和治疗癌症的组合物。

序列表

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

<120> 含有DLK1-Fc融合蛋白作为有效成分的用于抗癌症转移的组合物

<130> 11fpo-05-05/CN

<150> KR 10-2010-0023180

<151> 2010-03-16

<150> PCT/KR2010/002277

<151> 2010-04-13

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 834

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

gaatgcttcc cggcctgcaa cccccaaaat ggattctgcg aggatgacaa tgtttgcagg 60

tgccagcctg gctggcaggg tcccctttgt gaccagtgcg tgacctctcc cggctgcctt 120

cacggactct gtggagaacc cgggcagtgc atttgcaccg acggctggga cggggagctc 180

tgtgatagag atgttcgggc ctgctcctcg gccccctgtg ccaacaacgg gacctgcgtg 240

agcctggacg atggcctcta tgaatgctcc tgtgcccccg ggtactcggg aaaggactgc 300

cagaaaaagg acgggccctg tgtgatcaac ggctccccct gccagcacgg aggcacctgc 360

gtggatgatg agggccgggc ctcccatgcc tcctgcctgt gcccccctgg cttctcaggc 420

aatttctgcg agatcgtggc caacagctgc acccccaacc catgcgagaa cgacggcgtc 480

tgcactgaca ttgggggcga cttccgctgc cggtgcccag ccggcttcat cgacaagacc 540

tgcagccgcc cggtgaccaa ctgcgccagc agcccgtgcc agaacggggg cacctgcctg 600

cagcacaccc aggtgagcta cgagtgtctg tgcaagcccg agttcacagg tctcacctgt 660

gtcaagaagc gcgcgctgag cccccagcag gtcacccgtc tgcccagcgg ctatgggctg 720

gcctaccgcc tgacccctgg ggtgcacgag ctgccggtgc agcagccgga gcaccgcatc 780

ctgaaggtgt ccatgaaaga gctcaacaag aaaacccctc tcctcaccga gggc 834

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DLK1(δ样1同源物)的正向引物

<400> 2

cagggggccg tgggggccga atgcttcccg gcctgcaa 38

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DLK1(δ样1同源物)的反向引物

<400> 3

tagcggccga cgcggccgcc ctcggtgagg agagggg 37

<210> 4

<211> 278

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp Asp

1 5 10 15

Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp Gln

20 25 30

Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu His Gly Leu Cys Gly Glu Pro Gly

35 40 45

Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg Asp

50 55 60

Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys Val

65 70 75 80

Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Ser

85 90 95

Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser

100 105 110

Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala Ser

115 120 125

His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys Glu

130 135 140

Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly Val

145 150 155 160

Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly Phe

165 170 175

Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser Pro

180 185 190

Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Gln His Thr Gln Val Ser Tyr Glu

195 200 205

Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys Arg

210 215 220

Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly Leu

225 230 235 240

Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val His Glu Leu Pro Val Gln Gln Pro

245 250 255

Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys Thr

260 265 270

Pro Leu Leu Thr Glu Gly

275

Claims

1.DLK1(δ样1同源物)胞外可溶域。

2.如权利要求1所述的DLK1胞外可溶域，所述DLK1胞外可溶域大小为200-300个氨基酸。

3.如权利要求1所述的DLK1胞外可溶域，所述DLK1胞外可溶域包含SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列。

4.包含权利要求1所述的DLK1胞外可溶域和人抗体Fc域的DLK1-Fc融合蛋白。

5.如权利要求4所述的DLK1-Fc融合蛋白，其中，所述DLK1胞外可溶域大小为200-300个氨基酸。

6.如权利要求4所述的DLK1-Fc融合蛋白，其中，所述DLK1胞外可溶域包含SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列。

7.编码权利要求4所述的DLK1-Fc融合蛋白的多核苷酸。

8.包含权利要求7所述的多核苷酸的重组载体。

9.将权利要求8所述的重组载体转染到宿主细胞中的重组细胞系。

10.制备DLK1-Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：

1)培养权利要求9所述的重组细胞系；和

2)将DLK1-Fc融合蛋白与细胞系培养基分离。

11.用于抑制癌症转移的组合物，所述组合物包括权利要求1所述的DLK1胞外可溶域或权利要求4所述的DLK1-Fc融合蛋白。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述癌症选自由皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和胃癌组成的组中的一种。

13.权利要求1所述的DLK1胞外可溶域或权利要求4所述的DLK1-Fc融合蛋白在制备用于抑制癌症转移的组合物中的用途。

14.如权利要求13所述的用途，其中，所述癌症选自由皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和胃癌组成的组中的一种。