CN101631802B

CN101631802B - 在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体

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Publication number: CN101631802B
Application number: CN200780041789.3A
Authority: CN
Inventors: 中村康司; 田岛理惠
Original assignee: Liv Tech Inc
Current assignee: Liv Tech Inc
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2027-11-12
Also published as: EP2096122A1; JPWO2008056833A1; KR101512203B1; US20090326205A1; WO2008056833A1; CN103073641A; EP2096122A4; ES2484842T3; US8227578B2; AU2007318483A1; JP5219827B2; CA2669731A1; CA2669731C; CN101631802A; EP2096122B1; AU2007318483B2; KR20090088893A; CN103073641B

Abstract

本发明提供与hDlk-1特异性反应且在体内具有抗肿瘤活性的抗体(抗hDlk-1抗体)、该抗体的片段、产生该抗体的杂交瘤、该抗体或抗体片段与药剂的复合体、含有该抗体等的药物组合物、肿瘤治疗剂、肿瘤血管生成抑制剂、肿瘤诊断剂、肿瘤的检测方法以及肿瘤的检测用和/或诊断用试剂盒等。

Description

在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体。另外本发明涉及产生该抗体的杂交瘤和该抗体的用途。

背景技术

人Dlk-1(delta-like 1 homolog(Drosophila)；δ样1同源物(果蝇)；以下也称为“hDlk-1”)是全长为383个氨基酸残基的单次跨膜型的1型膜蛋白，其在细胞外区域具有6个EGF样基序。其细胞外区域与Notch/Delta/Serrate家族显示出同源性。hDlk-1基因作为在GRP(gastrin releasing peptide，胃泌素释放肽)应答性的肺小细胞癌来源的细胞株中表达的分子(非专利文献1)或作为抑制前脂肪细胞分化的因子被克隆(非专利文献2)。hDlk-1由于与作为细胞分化控制因子的Notch受体的配体δ的氨基酸序列具有同源性，通常用DLK1这样的基因标识来命名，此外，虽然具有Pref-1(非专利文献2)、pG2(非专利文献3)、SCP-1(非专利文献4)和ZOG(非专利文献5)多个基因标识，但它们基本是同一分子。

而且，hDlk-1的细胞外区域的细胞膜附近被一种尚未鉴定的蛋白酶切断，并分泌到血液中。游离hDlk-1(hDlk-1细胞外区域)与225～262个氨基酸残基的被称为FA-1(Fetal antigen-1，胎儿抗原-1)(非专利文献6)的糖蛋白质是同一分子。

hDlk-1基因及其基因产物在未分化的增殖能力高的胚胎细胞中显示出高表达。尤其是，在胚胎肝脏、胚胎肾脏、胚胎骨骼肌、胚胎脑等中显示出高表达，但出生后，在大部分组织中没有发现表达，在正常的成体组织中，表达局限于肾上腺、胎盘、垂体中(专利文献1、非专利文献2)。

而且，即使在成体组织中，在被认为是未分化的干细胞和前体细胞的细胞中也发现了hDlk-1的表达。例如，hDlk-1在成体肝脏中未分化的具有多向分化潜力(multilineage potential)的肝卵圆细胞(非专利文献7、8)、骨/软骨/脂肪细胞的干细胞即间充质干细胞(非专利文献9)中的表达已有报道，这提示其与这些组织干细胞的性质、例如未分化能力的维持等相关。

hDlk-1的这种局限于胎儿期的细胞和干细胞中表达的模式，以及具有EGF样基序的基因/基因产物的家族(Notch受体，Notch配体(δ，Jagged，serrate)等)一般通过EGF样基序介导的细胞间相互作用来控制细胞的增殖和分化，由此提示hDlk-1也具有这种功能。事实上，已知随着脂肪前体细胞的分化而表达降低，而且若在脂肪前体细胞中强制表达hDlk-1基因，则脂肪分化被抑制(非专利文献2)。但是，目前，与hDlk-1相互作用的分子(配体)的详细情况尚不清楚。

另一方面，据报道hDlk-1基因及其基因产物在各种癌和肿瘤中也以高频率表达。迄今为止，作为已确认其表达的癌的种类，在实体癌中，已知有神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、1型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌和卵巢癌(专利文献1、2和非专利文献1、3、10、11、12、13、14)，在血癌中，已知有骨髓增生异常综合征(专利文献3和非专利文献15、16)和急性髓系白血病(非专利文献16)。据报道如果在红白血病细胞株(erythroleukemia)K562细胞中导入hDlk-1基因，则细胞增殖受到促进(非专利文献16)，同样，如果在成胶质细胞瘤细胞中导入hDlk-1基因，不仅细胞增殖被促进，而且细胞的接触抑制也丧失，获得锚着非依存性的 (anchorage-dependent)细胞增殖能力，这提示hDlk-1与致癌之间的关联性(非专利文献17)。

<专利文献>

专利文献1：WO 2005/052156

专利文献2：WO 02/081625

专利文献3：日本特开2001-269174号

<非专利文献>

非专利文献1：Laborda，J.et al.，J.Biol.Chem.，vol.268(6)，p.3817-3820(1993)

非专利文献2：Smas，C.M.et al.，Cell，vol.73(4)，p.725-734(1993)

非专利文献3：Helman，L.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.84，p.2336-2339(1987)

非专利文献4：Maruyama，K.et al.，Unpublished，Genebankaccession number D16847(1993)

非专利文献5：Halder，S.K.et al.，Endocrinology，vol.139，p.3316-3328(1998)

非专利文献6：Fay，T.N.et al.，Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.，vol.29，p.73-85(1988)

非专利文献7：Tanimizu，N.et al.，Gene Expression Patterns，vol.5，p.209-218(2004)

非专利文献8：Jensen，CH.et al.，Am.J.Pathol.，vol.164(4)，p.1347-1359(2004)

非专利文献9：Abdallah，B.M.et al.，J.Bone Miner.Res.，vol.19(5)，p.841-852(2004)

非专利文献10：Jensen，C.H.et al.，Br.J.Dermatol.，vol.140(6)，p.1054-1059(1999)

非专利文献11：Jensen，C.H.et al.，Tumour Biol.，vol.20(5)，p.256-262(1999)

非专利文献12：Yin，D.et al.，Int.J.Oncol.，vol.24(4)，p.1011-1015(2004)

非专利文献13：Yin，D.et al.，Oncogene，vol.25(13)，p.1852-1861(2006)

非专利文献14：Fukuzawa，R.et al.，J.Clin.Pathol.，vol.58，p.145-150(2006)

非专利文献15：Miyazato，A.et al.，Blood，vol.98，p.422-427(2001)

非专利文献16：Sakajiri，S.et al.，Leukemia，vol.19(8)，p.1404-1410(2005)

非专利文献17：Yin，D.et al.，Oncogene，vol.25(13)，p.1852-1861(2006)

发明内容

如上所述，在正常组织中，hDlk-1的表达局限于胎儿期的细胞或干细胞；癌组织中，hDlk-1则在各种肿瘤中高频率表达，并且hDlk-1是细胞膜蛋白/分泌蛋白，由此认为hDlk-1在各种肿瘤的治疗等中是好的靶标。并认为以该hDlk-1为靶标时，抗hDlk-1抗体是有用的。

因此，本发明要解决的问题在于提供具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1单克隆抗体。而且，还在于提供产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合体、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。

本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究。结果发现了与人Dlk-1特异性反应的抗体(尤其是抗人Dlk-1单克隆抗体)，其具有抗肿瘤活性；以及该抗体与各种药剂的复合体(免疫结合物(immunoconjugate))，并确认了它们在体内具有抗肿瘤活性。而且，还发现这些抗体和复合体对于肿瘤的治疗、诊断和检测有用，从而完成本发明。

即，本发明内容如下。

(1)在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1的抗体。

上述肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

在上述(1)的抗体中，抗肿瘤活性例如可以例举肿瘤血管生成抑制活性。

上述(1)所述的抗体，例如，可以例举多克隆抗体和单克隆抗体。

上述(1)所述的抗体，例如，可以例举H链V区域的CDR1～3的氨基酸序列依次分别为序列号30～32所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的CDR1～3的氨基酸序列依次分别为序列号33～35所示的氨基酸序列。

作为本发明的抗体，可以例举杂交瘤所产生的抗体、基因重组抗体等。

所谓杂交瘤，是指使通过对人以外的哺乳动物免疫抗原而获得的B细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而获得的、产生具有所希望的抗原特异性的抗体的细胞。

作为基因重组抗体，包括嵌合抗体(人源化嵌合抗体)、人化抗体、人抗体或它们的抗体片段等通过基因重组制备的抗体。基因重组抗体中，具有单克隆抗体的特征、抗原性低、血中半衰期延长的抗体优选作为治疗药。其中，作为嵌合抗体，例如，可以例举H链V区域的氨基酸序列由序列号23所示的氨基酸序列构成，L链V区域的氨基酸序列由序列号25所示的氨基酸序列构成。

(2)由保藏号为FERM BP-10707的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。

(3)由保藏号为FERM BP-10899的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。

(4)由保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤产生的抗人Dlk-1的单克隆抗体。

上述(1)～(4)中所述的抗体，例如，可以例举与序列号2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第26位～第85位的氨基酸构成的区域、第92位～第167位的氨基酸构成的区域、或第131位～第244位的氨基酸构成的区域中的至少一部分结合(识别该部分)的抗体。

(5)作为上述(1)～(4)中所述的抗体，例如，可以例举与由保藏号为FERM BP-10707、FERM BP-10899或FERMBP-10900的杂交瘤所产生的单克隆抗体所结合(识别)的部位(例如表位)结合的抗体。

(6)来源于上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体的抗体片段。

上述(6)所述的抗体片段，可以例举例如含有序列号30～32所示的氨基酸序列的抗体片段，具体而言可以例举含有序列号23所示的氨基酸序列的抗体片段。

上述(6)所述的抗体片段，例如，可以例举含有序列号33～35所示的氨基酸序列的抗体片段，具体而言可以例举含有序列号25所示的氨基酸序列的抗体片段。

(7)产生上述(1)所述的抗体的杂交瘤。

(8)保藏号为FERM BP-10707的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。

(9)保藏号为FERM BP-10899的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。

(10)保藏号为FERM BP-10900的产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。

(11)含有上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。

(12)含有上述(6)所述的抗体片段和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体片段-药剂复合体。

在上述(11)和(12)所述的复合体中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

在上述(11)和(12)所述的复合体中，抗肿瘤活性例如可以例举肿瘤血管生成抑制活性。

(13)含有选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种的药物组合物。

上述(13)所述的组合物例如可以例举用于肿瘤的治疗的组合物，作为肿瘤的治疗，例如，可以例举抑制肿瘤血管生成。而且，该组合物可以例举例如没有体重减少的副作用的组合物。

上述(13)所述的组合物可以例举例如用于肿瘤的诊断的组合物。

在上述(13)所述的组合物中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

(14)含有选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种的肿瘤治疗剂。

上述(14)所述的治疗剂，例如，可以例举没有体重减少的副作用的治疗剂。

在上述(14)所述的治疗剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

(15)含有选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种的肿瘤血管生成抑制剂。

上述(15)所述的抑制剂，例如，可以例举没有体重减少的副作用的抑制剂。

上述(15)所述的抑制剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

(16)含有选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种的肿瘤诊断剂。

上述(16)所述的诊断剂中，肿瘤例如可以例举选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

(17)一种肿瘤的检测方法，其特征在于，使选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种与从生物体采集的试样反应，检测反应的抗体的信号。

(18)一种肿瘤的诊断和/或治疗方法，其包括向患者给予选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种，或给予上述(13)的药物组合物。

作为上述(18)的方法，例如，可以例举通过阻碍或抑制肿瘤的血管生成而进行肿瘤治疗的方法。

(19)肿瘤的诊断用和/或治疗用的上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段、或上述(11)或(12)所述的复合体。

(20)上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段、或上述(11)或(12)所述的复合体在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

(21)含有选自于由上述(1)～(5)中任意一项所述的抗体、上述(6)所述的抗体片段和上述(11)或(12)所述的复合体构成的组中的至少1种的肿瘤的检测用、诊断用或治疗用试剂盒。

附图说明

图1是表示在使用表达hDlk-1的肝癌细胞株(Huh-7-hDlk细胞)的异种移植治疗(Xenograft Treatment)模型中，给予公知的(WO 2005/052156)抗hDlk-1单克隆抗体3个克隆(1C1、4C4、31C4)时的结果的图。各抗体在第1天(Day1)、第4天(Day4)、第7天(Day7)和第10天(Day10)共计4次(箭头)进行腹腔内给药。

A：大鼠IgG(对照组)(●)，1C1(○)

B：大鼠IgG(对照组)(●)，4C4(○)

C：大鼠IgG(对照组)(●)，31C4(○)

在A～C中，各组的个体数用N表示，各测定值(肿瘤体积)用平均值±标准误差表示。这些实验至少进行3次独立的实验。任意一个情况下，对于在裸小鼠皮下建立的肝癌都看不到抗肿瘤活性。

图2是在使用Huh-7-hDlk细胞的异种移植治疗模型中，评价新抗hDlk-1单克隆抗体克隆DI-2-14(小鼠IgG1)的抗肿瘤活性的图。

A：经时表示对照组(小鼠IgG)和DI-2-14给药组的肿瘤生长(平均值±标准误差)。箭头表示给予抗体(20mg/kg体重，腹腔内给药)。^*P＜0.01(通过Student’s t检验)

B：A的试验中，把第14天(Day14)(实验最后一天)时各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。各图上所示的数值为平均值±标准误差。^*P＜0.01(通过Student’s t检验)

C：表示在独立的其它实验中评价DI-2-14的抗肿瘤活性的结果。^*P＜0.01(通过Student’s t检验)

图3是在使用Huh-7-hDlk细胞的异种移植治疗模型中，评价A：克隆2-13(大鼠IgG2b)、B：克隆BA-1-3D(小鼠IgG2a)、C：克隆DI-6(小鼠IgG1)、D：克隆M3-1(小鼠IgG1)的抗肿瘤活性的图。肿瘤体积用平均值±标准误差表示，星号表示差异显著性检验(^*P＜0.01，^**P＜0.05，通过Student’s t检验)的结果。

图4是表示抗hDlk-1单克隆抗体(克隆2-13)在采用表达hDlk-1的大肠癌细胞株(SW480-hDlk细胞)的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。将SW480-hDlk细胞移植到裸小鼠皮下，建立大肠癌组织。在箭头指示的时间点进行腹腔内给予抗体(20mg/kg体重)。肿瘤体积用平均值±标准误差表示(^*P＜0.01， ^**P＜0.05，通过Student’s t检验)。

图5是表示使用HEK293-hDlk细胞通过流式细胞术进行的抗hDlk-1单克隆抗体反应性的图。各图上所示的编号表示克隆编号。涂黑的部分是同种型对照抗体。黑线是抗hDlk-1单克隆抗体。

图6是表示采用Huh-7-hDlk细胞通过流式细胞术进行的抗hDlk-1单克隆抗体的反应性的图。各图上所示的编号表示克隆编号。涂黑的部分是同种型对照抗体。黑线是抗hDlk-1单克隆抗体。

图7是为分析抗hDlk-1单克隆抗体所识别的表位而制备的缺失了各EGF样基序的突变体的示意图。

图8是表示克隆DI-2-14的表位分析的结果的图。

A：在COS-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-1基因的突变体基因，24～72小时后进行FACS分析的图(左：小鼠IgG1、右：DI-2-14)。设门部分表示克隆DI-2-14所识别的各突变体表达细胞。

B：是用阳性对照(抗hDlk-1多克隆抗体)和克隆DI-2-14对表达EGF(1-2)的COS-7细胞的涂片标本进行免疫染色的照片。染成茶褐色的部分表示EGF(1-2)的表达。

图9是表示克隆DI-6、BA-1-3D和2-13的表位分析的结果的图。

A：是在COS-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-1基因的突变体基因，24～72小时后进行FACS分析的图。设门部分表示各克隆识别的各突变体表达细胞。

B：是用克隆DI-6、BA-1-3D和2-13对表达EGF(1-2)的COS-7细胞的涂片标本进行免疫染色的照片。箭头表示的染成茶褐色的部分表示EGF(1-2)的表达。

图10是表示克隆M3-1通过FACS进行表位分析的结果的图。

在COS-7细胞中通过脂质体瞬时导入所述hDlk-1基因的突变体基因，24～72小时后进行FACS分析的图。设门部分表示克隆DI-2-14所识别的各突变体表达细胞。

图11是表示抗hDlk-1单克隆抗体结合抗原后的内化活性的分析结果的图。

A：使HEK293-hDlk细胞与抗hDlk-1单克隆抗体(克隆M3-1、M1-290和M3-4)反应(4℃，20分钟)，用PBS清洗2次后，于37℃进行图中所述时间的孵育。然后，使之与PE标记抗小鼠IgG反应，进行FACS分析。数值用相对值表示，所述相对值为以不孵育时(0分钟)的平均萤光强度作为100％时的相对值。

B：是表示使FITC标记的克隆M3-1(FITC-M3-1)与HEK293-hDlk细胞反应(4℃，20分钟)，用PBS清洗2次后，于37℃下孵育120分钟时的平均萤光强度的变化的图。黑柱表示：像A那样，使未标记的M3-1与细胞反应后，于37℃下孵育120分钟，与PE标记的抗小鼠IgG反应时的平均萤光强度的变化。

图12是表示罗丹明标记的抗hDlk-1单克隆抗体结合抗原后的内化活性的分析结果的图。

A：是使HEK-293-hDlk细胞与罗丹明标记-M3-1 (Rho-M3-1)反应(4℃，20分钟)，用PBS清洗2次后，立即制备涂片标本，用萤光显微镜观察Rho-M3-1的定位的照片。橙色所示的部分表示Rho-M3-1的定位，观察到在细胞膜中定位。

B～E：是使Rho-M3-1(B)、Rho-DI-1(C)、Rho-M1-290(D)和Rho-M3-4(E)与HEK293-hDlk细胞反应，用PBS清洗2次后，于37℃下孵育15分钟后，制备涂片标本，用萤光显微镜观察各克隆的定位的照片。观察到识别相同表位(EGF4-6)的Rho-M3-1和Rho-DI-1均进入到细胞内，以点状定位的样子。

图13是表示结合了皂草素(Saporin)的抗hDlk-1单克隆抗体对于Huh-7-hDlk细胞和SK-N-F1细胞的细胞损伤活性的图。

A：是表示对照(小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP))和M3-1-SAP对Huh-7-hDlk细胞的效果的图。纵轴用相对值表示，所述相对值为以未添加时的细胞的存活率为100％时的相对值(N＝3，平均值±标准偏差)。

B：是表示对照(IgG-SAP)、M3-1-SAP和M1-290-SAP对SK-N-F1细胞的效果的图。

图14是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，给予小鼠IgG(20mg/kg体重)、M3-1-SAP(5mg/kg体重)和M1-290-SAP(5mg/kg体重)时的、A：给药后的各小鼠的体重变化、B：小鼠存活率的图。值用平均值±标准偏差表示。箭头表示给予抗体时间。

图15是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，腹腔内给予小鼠IgG(●；N＝8)和M3-1-SAP(○：N＝8)时的肿瘤生长抑制效果的图。箭头表示给予抗体时间。值用平均值±标准偏差表示(^*P＜0.01，^**P＜0.05，通过Student’s t检验)。

图16是表示Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型中，肿瘤内给予A和B即小鼠IgG(●：N＝5)和M3-1-SAP(○：N＝5)(40μg) 时的肿瘤生长抑制效果(A)和体重变化(B)的图和腹腔内给予C和D即PBS(●：N＝4)和顺铂(Cisplatin)(○：N＝4)(5mg/kg体重)时的肿瘤生长抑制效果(C)和体重变化(D)的图。在任意一张图中，箭头均表示给予抗体时间，值用平均值±标准偏差表示(^*P＜0.01，^**P＜0.05，通过Student’s t检验)。

图17是表示用抗hDlk-1抗体对人大肠癌组织阵列(Cybrdi公司制、CC05-01-001)进行免疫染色时的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-1抗体染色的癌组织。hDlk-1阴性是指如No.48的切片(69岁男性，腺癌，阶段III)所示，完全没有观察到染色的区域的切片。No.19(55岁女性，腺癌，阶段II)显示出非常强的染色性，将显示出与No.19同等的染色性的切片作为hDlk-1强阳性。另外，将No.25(75岁男性，腺癌，阶段II)所示那样的、可明确地确认为hDlk-1阳性但染色性弱的切片作为hDlk-1弱阳性。

图18是表示用抗hDlk-1抗体对人乳腺癌组织阵列(Cybrdi公司制、CC08-02-002)进行免疫染色时的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-1抗体染色的癌组织。

照片上面部分是组织阵列中所含的正常乳腺组织被抗hDlk-1抗体染色时的照片。左：No.07(68岁女性，正常乳管；hDlk-1阴性)、右：No.01(43岁女性，正常乳腺小叶；hDlk-1弱阳性)。箭头表示hDlk-1弱阳性的部位。

照片下面部分表示浸润性导管癌患者的照片。左：No.08(45岁女性，阶段II；hDlk-1阴性)，中央：No.56(28岁女性，阶段II；hDlk-1弱阳性)，右：No.20(59岁女性，阶段II；hDlk-1强阳性)。

图19是表示在Huh-7-dlk细胞异种移植治疗模型中，克隆DI-2-14的用量依赖性抗肿瘤活性的图。

图20是表示在SK-N-F1细胞异种移植治疗模型中，克隆DI-2-14的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。

A：表示开始给予抗体以后的肿瘤生长。肿瘤体积用平均值±标准误差表示(^*P＜0.01，^**P＜0.05，通过Student’s t检验)。

B：是表示给予抗体后第23天(Day23)时摘出的癌组织的重量的图。

图21是表示克隆DI-2-14H链(重链)可变区(VH)的cDNA碱基序列(序列号22)和推定氨基酸序列(序列号23)的图。信号肽用西文斜体字表示。画了双下划线的谷氨酸(E)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线)按照Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interests，Fifthedition，NIH Publication No.91-3242，U.S.Department of Healthand Human Services，1991)的定义。克隆DI-2-14VH的CDR1～3的氨基酸序列依次分别示于序列号30～32。

图22是表示克隆DI-2-14L链(轻链)可变区(VL)的cDNA碱基序列(序列号24)和推定氨基酸序列(序列号25)的图。信号肽用西文斜体字表示。画了双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线)按照Kabat等人(1991；上述)的定义。克隆DI-2-14VL的CDR1～3的氨基酸序列依次分别示于序列号33～35。

图23是表示克隆DI-2-14VH基因的碱基序列(序列号26)和氨基酸序列(序列号27)的图。5’末端添加了SpeI位点，3’末端添加了Hind III位点(分别添加了下划线。)。用西文斜体字文字表示的碱基序列表示相当于内含子的序列。

图24是表示克隆DI-2-14VL基因的碱基序列(序列号28)和氨基酸序列(序列号29)的图。在5’末端添加了Nhe I位点，在3’末端添加了EcoR I位点(分别添加了下划线。)。用西文斜体字文字表示的碱基序列表示相当于内含子的序列。

图25是嵌合DI-2-14基因表达载体(pChDI-2-14)的概略图。该载体从SalI位点起顺时针地包括由人巨细胞病毒主要即刻早期动子(human cytomegalovirus(CMV)major immediateearly promoter)和用于抗体重链基因的转录开始的增强子起始的重链翻译单元。接着CMV区域的是VH外显子、人γ1重链恒定区(夹着内含子地包含CH1、铰链区域、CH2和CH3的外显子)的基因序列和CH3，接着是mRNA加工的聚A位点。重链基因序列后存在由CMV启动子和增强子起始的轻链翻译单元，接着是与VL外显子和在上游有内含子部分的人κ链恒定区的外显子(CL)以及κ基因的聚A信号。该轻链基因后接SV40早期启动子、大肠杆菌来源的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因(xanthine guanine phosphoribosyl transferase(gpt)gene)和含有SV40的聚A位点的片段。最后，该质粒具有含有细菌的复制起点和β-内酰胺酶基因的pUC19质粒的一部分。

图26是小鼠DI-2-14和嵌合DI-2-14(ChDI-2-14)的用SDS-PAGE展开后并经CBB染色的图。MW表示分子大小标准参照物，箭头分别表示条带的分子量(kD)。

图27是表示利用纯化FA-1(hDlk-1细胞外区域)的固相ELISA的、DI-2-14和ChDI-2-14的抗原结合活性的图。○表示小鼠IgG1抗体(克隆DI-2-14)，●表示嵌合抗体(ChDI-2-14)。

图28是表示使用HEK293-hDlk细胞，通过流式细胞术进行的DI-2-14和ChDI-2-14的反应性的图。涂黑的图是同种型对照抗体，黑线(白色空心)图分别是DI-2-14和ChDI-2-14。

图29是用流式细胞术分析人肝癌细胞株中细胞表面Dlk-1的表达的图。蓝色线表示小鼠IgG1，红色线表示抗人Dlk-1抗体，表示将各细胞染色时的图。

图30是用流式细胞术分析人乳腺癌细胞株中的细胞表面Dlk-1的表达的图。蓝色线表示小鼠IgG1，红色线表示抗人Dlk-1抗体，表示将各细胞染色时的图。

图31是用流式细胞术分析人白血病细胞株中的细胞表面Dlk-1的表达的图。蓝色线表示小鼠IgG1，红色线表示抗人Dlk-1抗体，表示将各细胞染色时的图。

图32是表示Huh-7-dlk细胞异种移植治疗模型中的摘出的癌组织中的Flk-1/VEGF-R2的免疫组化染色的图。

A：是分别用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗体对取自(摘自)小鼠IgG给药组(对照组)和克隆DI-2-14给药组的癌组织的新鲜冷冻切片进行免疫染色的照片(物镜200倍)。照片中，箭头状的标记(▲)示出的区域表示Flk-1/VEGF-R2阳性的肿瘤血管内皮细胞。

B：是用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗体对从IgG给药组(2个个体)和DI-2-14给药组(4个个体)分别采集的新鲜冷冻切片进行免疫染色，在各个切片中，对于物镜200倍下8～13个视场(IgG给药组：共21个视场、DI-2-14给药组：共35个视场)，对Flk-1/VEGF-R2阳性的肿瘤血管内皮细胞计数，表示每1个视场的细胞数的图(^*P＜0.01，通过Student’s t检验)。

图33是表示Huh-7-dlk细胞异种移植治疗模型中摘出的癌组织中的Flk-1/VEGF-R2的基因表达的图。

A：从IgG给药组(N＝7)和DI-2-14给药组(N＝7)分别摘出肿瘤后，用Trizol试剂提取RNA，然后合成第1链cDNA，分别使用各第1链cDNA作为模板，通过PCR法(30个循环)确认小鼠Flk-1/VEGF-R2(mFlk-1)和小鼠/人GAPDH(GAPDH)的基因表达的电泳图像的图。下图是用NIH image定量mFlk-1和GAPDH的PCR扩增产物的条带并以比例(mFlk-1/GAPDH) 表示的图。

B：是除了通过PCR法进行35个循环的扩增反应以外，与A同样情况的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细地说明。本发明的范围不局限于这些说明，在不损害本发明的主要内容的范围内可以在以下的例示的基础上适当变更而实施。

而且，本说明书包括作为本申请优先权主张的基础的日本特愿2006-305355号说明书的全部内容。而且，本说明书中引用的所有的出版物，例如现有技术文献和公开公报、专利公报以及其它的专利文献作为参照并入本说明书。

1.本发明的概要

如前所述，人Dlk-1(delta-like 1 homolog(果蝇)；hDlk-1)是全长为383个氨基酸残基的单次跨膜型的1型膜蛋白质，其在细胞外区域具有6个EGF样基序。而且，已知hDlk-1基因及其基因产物在各种癌和肿瘤细胞中以高频率表达。一般来说，由于难以制得在体内显示抗肿瘤活性的抗体，因此即使制备抗hDlk-1单克隆抗体，大多在体外具有抗肿瘤活性，但在体内并不显示出相同活性。而且，由于针对hDlk-1的癌细胞的增殖等功能的区域、hDlk-1的配体(或受体)和细胞内信号传递途径等尚不清楚，缩小靶点来有效地进行抗体制备也基本是不可能的。这种状况下，本发明中，通过从多个克隆中进行筛选，成功地获得了在体内具有抗肿瘤活性的克隆。

首先，本发明人通过使用公知的抗hDlk-1抗体的免疫组织化学，在迄今为止确认了hDlk-1的表达的前述癌和肿瘤细胞以外，还新发现了hDlk-1在大肠癌和乳腺癌中也表达。

然后，本发明人以制备可以在个体水平上使得表达hDlk-1的癌细胞死亡或可以抑制肿瘤生长的抗hDlk-1抗体，即在体内具有抗肿瘤活性的抗hDlk-1抗体作为目的，重新制备了约100个克隆的抗hDlk-1单克隆抗体。而且，就这些克隆，将各种癌细胞株移植到裸小鼠皮下，用这样建立的荷瘤小鼠进行体内的药效(抗肿瘤作用)评价。其结果是，成功地获得了多个显示出显著的肿瘤生长抑制活性的克隆(克隆名：DI-2-14、2-13、BA-1-3D、DI-6、M3-1)。

而且，本发明人在上述抗hDlk-1抗体中发现了在向表达hDlk-1的细胞内的移动能力(内化活性)方面优异的抗体，制备出含有这种抗体和具有抗肿瘤活性和细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。该复合体，作为所谓的免疫结合物，其对目标肿瘤细胞内的药物送达能力优异。

本发明人发现使用具有上述抗肿瘤活性的抗hDlk-1抗体和抗体-药剂复合体，对于各种肿瘤的治疗或肿瘤的诊断和检测有用。

2.抗hDlk-1抗体的制作

(1)抗原的制备

hDlk-1的氨基酸序列(序列号2)的信息，例如在NCBI(GenBank)的网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上以“登录号：NP_003827”公布。而且，编码hDlk-1的氨基酸序列的碱基序列(序列号1)的信息在同一网站上以“登录号：NM_003836”公布。

作为抗原，可以使用含有hDlk-1的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也简称为肽)，可优选使用含有hDlk-1的细胞外区域(FA-1)的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部)的肽。hDlk-1的细胞外区域为如前所述的含有6个 EGF样基序(EGF-1～EGF-6)的区域，为含有序列号2所示的氨基酸序列中的第26位～第244位的氨基酸的区域，优选为序列号2所示的氨基酸序列中的“第24位”至“第248～285位”的氨基酸构成的区域(约225～262个氨基酸残基)。

其中，就作为抗原使用的肽来说，上述“氨基酸序列的至少一部分”的长度没有特别限定，例如优选含有6个EGF样基序中的1个或2个以上的区域。更优选例如含有EGF-1和EGF-2的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第26位～第85位的氨基酸构成的区域)、含有EGF-3和EGF-4的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第92位～第167位的氨基酸构成的区域)、和含有EGF-4、EGF-5和EGF-6的区域(即序列号2所示的氨基酸序列中的第131位～第244位的氨基酸构成的区域)。

作为抗原的肽的制作方法可以是化学合成，也可以通过采用大肠杆菌等的基因工程法合成，可以使用本领域技术人员公知的方法。

进行肽的化学合成时，可以通过肽合成的公知方法进行合成。而且，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一种。还可以使用市售的肽合成装置(例如，岛津制作所制：PSSM-8等)。

在用基因工程学方式合成肽时，首先设计并合成编码该肽的DNA。该设计和合成例如可以使用以含有全长hDlk-1基因的载体等作为模板，使用设计为可以合成所希望的DNA区域的引物，通过PCR法进行。然后，通过将上述DNA连接到适当的载体上而获得蛋白质表达用重组载体，将该重组载体导入宿主中并使得目的基因可以表达，由此获得转化子(Sambrook J.et al.，Moleeular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)。

使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌体或质粒作为载体。而且还可以使用动物病毒、昆虫病毒载体。重组载体的制作可如下进行，即用适当的限制性酶切断纯化的DNA，插入适当的载体DNA的限制性酶位点等中而与载体连接。作为转化时使用的宿主，只要是可以表达目的基因的宿主即可，没有特别的限定。例如，可以例举细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞或昆虫。还可以使用山羊等哺乳动物作为宿主。向宿主导入重组载体的方法是公知的。

然后，培养前述转化子，从其培养物中收集作为抗原使用的肽。“培养物”是指(a)培养上清、(b)培养细胞或者培养菌体或其破碎物中的任意一种。

培养后，目的肽在菌体内或细胞内产生时，通过破碎菌体或细胞来提取肽。而且，目的肽在菌体外或细胞外产生时，直接使用培养液或通过离心分离等除去菌体或细胞。然后，可以通过单独使用可以在肽的分离纯化中使用的一般的生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等或将这些方法组合使用，来分离纯化目的肽。

本发明中，还可以使用无细胞蛋白质合成系统，通过体外翻译获得作为抗原的肽。此时，可以使用以RNA作为模板的方法和以DNA作为模板的方法(转录/翻译)这2种方法。作为无细胞蛋白质合成系统，可以使用市售的系统，例如Expressway^TM系统(Invitrogen公司)、PURESYSTEM(注册商标；post genome研究所)、TNT系统(注册商标；Promega公司)等。

如上所述获得的肽还可以结合到适当的载体蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin，KLH)、人甲状腺球蛋白、鸡γ-球蛋白等。

另外，抗原可以是在hDlk-1的氨基酸序列(序列号2)或前述的序列的部分序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的肽。例如，还可以使用hDlk-1的氨基酸序列或其部分序列中缺失1个或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))氨基酸，1或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))氨基酸被其它氨基酸置换，或添加了1个或多个(优选1个或多个(例如1个～10个，更优选1个～5个))其它氨基酸的氨基酸序列所构成的肽。

本发明中，作为用于导入于细胞等的基因，可以例举编码hDlk-1蛋白质或其部分片段的基因、或编码其突变型的蛋白质或片段的基因。作为这种基因，例如可以使用具有序列号1所示的碱基序列或其部分序列的基因。

而且，作为用于导入于细胞等的基因，还可以使用与序列号1所示的碱基序列互补的序列在严紧条件下杂交，且编码具有hDlk-1活性的蛋白质的碱基序列或其部分序列。

“严紧条件”是指杂交后清洗时的条件，缓冲液的盐(钠)浓度为10～500mM，温度为42℃～72℃，优选上述盐浓度为50～300mM，温度为55～68℃的条件。

为了在基因中导入突变，可以通过Kunkel法或带缺口的双链体(Gapped duplex)法等公知方法进行，例如使用利用定点突变法的突变导入用试剂盒GeneTailor^TM Site-DirectedMutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO公司制)来进行。

(2)多克隆抗体的制作

将制备的抗原给予到用于免疫的哺乳动物。哺乳动物没有特别限定，例如可以例举大鼠、小鼠和兔等，其中优选小鼠。

每一只动物的抗原给药量，可以根据佐剂的有无适当设定。作为佐剂，可以例举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要可以通过注入到静脉内、脚掌、皮下、腹腔内等来进行。而且，免疫的间隔没有特别限定，以数天至数周的间隔优选1周的间隔进行1～10次、优选2～3次免疫。然后，在最后的免疫日起3～7天后，通过酶免疫测定法(ELISA或EIA)或放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体效价，可以在出现所希望的抗体效价之日采血，获得抗血清。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等公知方法来进行纯化。然后，通过ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。

(3)单克隆抗体的制作

(3-1)抗体产生细胞的提取

本发明的抗hDlk-1抗体并没有限制，但优选为单克隆抗体。

将制备的抗原给予用于免疫的哺乳动物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只动物的抗原给药量可以根据有无佐剂适当设定。佐剂与上述同样。免疫方法也与前述同样。而且，在最后的免疫日起1～60天后，优选为1～14天后，提取抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可以例举脾细胞、淋巴结细胞和外周血细胞等，其中优选淋巴结细胞和脾脏细胞。

(3-2)细胞融合

为了获得杂交瘤(抗体产生细胞株)，进行抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的一般可以获得的已建立的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性，具有未融合的状态下在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)中无法生存而只有在与抗体产生细胞融合的状态下可以生存的性质的细胞株。

作为骨髓瘤细胞，例如可以例举P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS1)和Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等小鼠骨髓瘤细胞株。骨髓瘤细胞的选择，可以适当考虑与抗体产生细胞的适合性而进行。

然后，使骨髓瘤细胞与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合时，在不含血清的DMEM和RPMI-1640培养基等动物细胞用培养基中，混合1×10⁶～1×10⁷个/mL的抗体产生细胞和2×10⁵～2×10⁶个/mL的骨髓瘤细胞。抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比(抗体产生细胞∶骨髓瘤细胞)没有限制，但通常优选为1∶1～10∶1，更优选为3∶1。然后，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，例如可以使用平均分子量为1000～6000道尔顿(D)的聚乙二醇等。而且，还可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置，使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。

(3-3)杂交瘤的挑选和克隆

从细胞融合处理后的细胞中挑选出目的杂交瘤。作为该方法，将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的RPMI-1640培养基等适当稀释后，接种于微板上，在各孔中加入选择培养基，以后适当更换选择培养基进行培养。其结果是，在选择培养基中开始培养后，可以将14天前后开始生长的细胞作为杂交瘤。

然后，在逐步增殖的杂交瘤的培养上清中，筛选是否存在与hDlk-1反应的抗体。杂交瘤的筛选可以按照通常的方法，没有特别限制。例如，可以采集已长出杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分，通过ELISA、EIA和RIA等进行筛选。

融合细胞的克隆可以通过有限稀释法等进行。通过流式细胞术等判断与hDlk-1显示出强反应性的抗体，选择产生该抗体的杂交瘤，建立克隆。

(3-4)单克隆抗体的提取

作为培养已建立的杂交瘤并从获得的培养物中提取单克隆抗体的方法，可以采取通常的细胞培养法或腹水形成法等。“培养”是指在培养皿或培养瓶中使杂交瘤生长，或如下使杂交瘤在动物的腹腔内增殖。

细胞培养法中，可以在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养的培养基中，在通常的培养条件(例如37℃，5％CO₂浓度)下培养杂交瘤7～14天，从其培养上清中获得抗体。

腹水形成法的情况下，在与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系动物的腹腔内给予约1×10⁷个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。并且，优选在2～3周后提取腹水。

在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等公知方法来进行纯化。

(3-5)具有抗肿瘤活性的克隆的挑选

本发明的抗hDlk-1抗体是在体内具有抗肿瘤活性的抗体。

这里，“抗肿瘤活性”是指使肿瘤细胞(癌细胞)死亡的活性或抑制肿瘤生长的活性。本发明中，作为抗肿瘤活性，例如可优选例举肿瘤血管生成抑制活性。而且，作为本发明的抗体可以发挥抗肿瘤活性的人肿瘤(肿瘤细胞)的种类，可以例举已确认hDlk-1的表达的前述公知的人肿瘤(具体而言，实体癌有神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、1型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌和卵巢癌等，血癌有骨髓发育异常综合征和急性髓系白血病等。)和本发明人新确认hDlk-1 的表达的人大肠癌和人乳腺癌。其中尤其可优选例举大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤中的1种或2种以上。

体内的抗肿瘤活性的确认，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的肿瘤细胞的荷瘤小鼠，通过对该小鼠给予前述获得的抗体来进行。此时，抗体的给药可以在肿瘤细胞的移植后立即进行(预防模型)，也可以在确认移植肿瘤达到预定体积之后进行(治疗模型)。给药方法并没有限制，例如可以3天1次，以20mg/kg体重进行腹腔内给药。预防模型的情况下，可以通过肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。治疗模型的情况下，可以根据肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。

本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗hDlk-1抗体，例如可以优选例举由保藏号为FERM BP-10707的杂交瘤产生的抗hDlk-1单克隆抗体(克隆名：M3-1)，由保藏号为FERMBP-10899的杂交瘤产生的抗hDlk-1单克隆抗体(克隆名：DI-2-14)和由保藏号为FERM BP-10900的杂交瘤产生的抗hDlk-1单克隆抗体(克隆名：DI-6)等。而且，克隆名：DI-2-14的抗hDlk-1单克隆抗体作为在体内具有高抗肿瘤活性的抗体是优选的。

其中，保藏号为FERM BP-10707的杂交瘤命名为“Mouse-Mouse hybridoma：M3-1”，于2006年10月18日保藏，保藏号为FERM BP-10899的杂交瘤命名为“Mouse-Mousehybridoma DI-2-14”，于2007年8月21日保藏，保藏号为FERMBP-10900的杂交瘤称为“Mouse-Mouse hybridoma DI-6”于2007年8月21日保藏，均保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。

另外，作为本发明的抗hDlk-1抗体，例如可优选例举H链V区域的CDR1～3的氨基酸序列依次分别为序列号30～32所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的CDR1～3的氨基酸序列依次分别为序列号33～35所示的氨基酸序列的抗体。作为上述H链V区域，例如，优选序列号23所示的氨基酸序列构成的区域，作为上述L链V区域，例如，优选序列号25所示的氨基酸序列构成的区域。

而且，作为本发明的抗hDlk-1抗体，例如还可优选列举与由保藏号为FERM BP-10707、FERM BP-10899、或FERMBP-10900的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合(识别)的部位(例如表位)结合的抗hDlk-1抗体。

(3-6)抗hDlk-1抗体的表位

本发明的抗hDlk-1抗体的表位(抗原决定簇)只要是抗原hDlk-1的至少一部分即可，并没有限制，例如，优选为序列号1所示的hDlk-1的氨基酸序列中的第26位～第85位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-1的EGF-1～EGF-2的区域)、第92位～第167位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-1的EGF-3～EGF-4的区域)、或第131位～第244位的氨基酸构成的区域(含有hDlk-1的EGF-4～EGF-6的区域)中的至少一部分。其中更为优选含有hDlk-1的EGF-4～EGF-6的区域和含有EGF-4～EGF-6的区域，尤其优选含有第92位～第120位的氨基酸所构成的区域(含有hDlk-1的EGF-3的区域)。识别该区域(与该区域结合)的抗hDlk-1抗体，例如，对肿瘤细胞内的内化活性高，在后述的免疫结合物等用途中极为有用。

(4)基因重组抗体和抗体片段

(4-1)基因重组抗体

作为本发明的抗hDlk-1抗体的优选方式之一，可以例举基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限制，但例如可以例举嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。

嵌合抗体(即人源化嵌合抗体)是小鼠源抗体的可变区连接到(接合)人来源的恒定区的抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合体时，为了获得这样连结的抗体，可以通过基因重组技术容易地构建。其中，作为小鼠源抗体的可变区，H链V区域例如优选序列号23所示的氨基酸序列构成的区域，L链V区域例如优选序列号25所示的氨基酸序列构成的区域。

在制作人源化抗体时，通过从小鼠抗体的可变区将互补性决定区(CDR)移植到人可变区，框架区(FR)为人来源，CDR由小鼠来源的CDR构成，制备重构的可变区(即CDR移植(CDRgrafting))。然后，将这些人源化的重构的人可变区与人恒定区连结。这种人源化抗体的制作方法在本领域中是众所周知的(参照Nature，321，522-525(1986)；J.Mol.Biol.，196，901-917(1987)；Queen C et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)；日本特表平4-502408号公报(日本特许第2828340号公报；Queen等人)等)。其中，作为可以在本发明的人源化抗hDlk-1抗体中使用的小鼠来源的CDR序列，没有限制，例如，作为H链V区域的CDR1～3，可例举优选(依次分别)序列号30～32所示的氨基酸序列，作为L链V区域的CDR1～3，可以优选例举(依次分别)序列号33～35所示的氨基酸序列。

人抗体(完全人抗体)，一般是V区域的抗原结合部位即高变区(Hyper Variable region)，V区域的其它部分和恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。但是，高变部位也可以来源于其它动物。制作人抗体的技术也是公知的，已建立了通过基因工程学的手法来制作人共通的基因序列的方法。人抗体例如可以通过使用含有具有人抗体的H链和L链基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka，K.et al.，NatureGenetics，(1977)16，133-143；Kuroiwa，Y.et.al.，Nuc.Acids Res.，(1998)26，3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal CellTechnology：Basic and Applied Aspects，(1999)10，69-73(Kitagawa，Y.，Matuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer AcademicPublishers；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2000)97，722-727等)和获得从人抗体文库挑选的噬菌体展示来源的人抗体的方法(参照Wormstone，I.M.et.al，InvestigativeOphthalmology & Visual Science.，(2002)43(7)，2301-8；Carmen，S.et.al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics，(2002)1(2)，189-203；Siriwardena，D.et.al.，Opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)而获得。

上述嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，优选为抗体Fc区域中的N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链，具体而言可以例举在抗体分子的Fc区域中具有该岩藻糖的1位不与N-糖苷键复合型糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位发生α结合的糖链的基因重组抗体分子所构成的抗体。如果是这种抗体，则可以使ADCC活性极大提高。而且，前述的多克隆抗体和单克隆抗体同样优选这一点(抗体Fc区域中N-糖苷键复合型糖链的特征)。

(4-2)抗体片段

本发明的抗hDlk-1抗体的片段也包含于本发明的抗体中。其中，本发明的抗体片段与本发明的抗hDlk-1抗体一样，具有与hDlk-1结合的活性，在体内具有抗肿瘤活性。

作为该抗体的片段，是指抗hDlk-1多克隆抗体或抗hDlk-1单克隆抗体的一部分的区域(即，来源于本发明的抗hDlk-1抗体的抗体片段)，例如，可以例举Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv(抗体可变区)、单链抗体(H链、L链、H链V区域和L链V区域等)、scFv、双抗体(diabody)(scFv二聚物)、dsFv(二硫化物稳定化V区域)和至少一部分含有互补性决定区(complementaritydetermining region：CDR)的肽等。

Fab是用蛋白质分解酶中的木瓜蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，H链的N末端侧约一半和L链全体通过二硫键结合的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入到原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab。

F(ab’)₂是用蛋白质分解酶中的胃蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，Fab通过铰链区的二硫键结合的稍大的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过后述的使Fab形成硫醚键或二硫键进行制作。

Fab’是切断上述F(ab’)₂的铰链区的二硫键的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入于原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab’。

scFv是将1条H链V区域(VH)和1条L链V区域(VL)用适当的肽连接子(P)连结的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原结合活性的抗体片段。scFv可以如下制备，即，获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。

双抗体是scFv二聚化形成的抗体片段，其为具有二价的抗原结合活性的抗体片段。二价的抗原结合活性可以是相同的，也可以是其中一方为不同的抗原结合活性。双抗体可以如下制备，即，通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA并使P的氨基酸序列的长度达到8个残基以下，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物使之表达而进行制造。

dsFv是指使VH和VL中的各1个氨基酸残基被换成半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基间的二硫键结合形成的抗体。被换成半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等人公开的方法(Protein Engineering，7，697-704，1994)，基于抗体的立体结构预测进行选择。dsFv可以如下制备：通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。

含有CDR的肽包含VH或VL的CDR(CDR1～3)中的至少1个以上区域而构成。含有多个CDR的肽可以如下制备：通过直接或适当的肽连接子结合。含有CDR的肽可以通过构建编码抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA导入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。而且，含有CDR的肽还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。

作为本发明的抗体片段，可以是以原有的形状含有N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fc区域的一部分或全部的抗体片段，而且，也可以是上述抗体片段与N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fc 区域的一部分或全部的融合蛋白质。这种抗体片段可以极大地提高ADCC活性，因而优选。

作为本发明的抗体片段的具体例子并没有限制，但可以例举例如至少部分中含有序列号30～32所示的氨基酸序列(H链V区域的CDR1～3)的片段，具体而言，可以例举含有序列号23所示的氨基酸序列(H链V区域)的片段。另外，作为该抗体片段，可以例举至少部分中含有序列号33～35(L链V区域的CDR1～3)所示的氨基酸序列的片段，具体而言可以例举含有序列号25所示的氨基酸序列(L链V区域)的片段。

以下本说明书中的说明中，上述抗体片段也包含于本发明的抗hDlk-1抗体中。

3.抗体-药剂复合体的制作

作为使用上述本发明的抗hDlk-1抗体的免疫结合物等，可以提供含有该抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物的抗体-药剂复合体。予以说明，在预先分别制备该抗体分子和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物之后，将它们复合化而获得的物质一般被称为免疫结合物。而且，通过使用基因重组技术，将具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物中的蛋白质毒素在基因上与抗体基因连接，作为1个蛋白质(融合蛋白质)表达而获得的物质一般被称为免疫毒素。

作为具有抗肿瘤活性的化合物，例如，可以例举阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、丝裂霉素(mitomycin)C、Auristatin E等。

作为具有细胞杀伤活性的化合物，例如，可以例举皂草素、篦麻毒素、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等，其中优选使用皂草素和绿脓杆菌外毒素。

作为抗体-药剂复合体的制作方法并没有限制，例如，可以例举通过二硫键或腙键将抗体与药剂偶联的方法等。

上述本发明的抗hDlk-1抗体在对表达hDlk-1的目标肿瘤细胞内的内化活性方面优异。因此，通过预先使具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物复合化，可以使这些化合物直接且高选择地作用于肿瘤细胞。本发明的抗体-药剂复合体在向目标肿瘤细胞传送药剂的能力上极为优异。

而且，对细胞内的内化活性可以如下评价，即，通过用罗丹明等对抗体进行萤光标记，用萤光显微镜等观察向细胞内的进入举动和抗体的定位性。

另外本发明中，还可以提供在抗体-药剂复合体中，使用前述抗体片段代替抗体的抗体片段-药剂复合体。抗体片段-药剂复合体的详细内容可以适当应用上述抗体-药剂复合体的说明。

以下，本说明书的说明中，抗体片段-药剂复合体也包含于本发明的抗体-药剂复合体中。

4.药物组合物

本发明的抗hDlk-1抗体和抗体-药剂复合体作为包含于药物组合物中的有效成分是有用的。

该药物组合物作为肿瘤的治疗用和/或诊断用的药物组合物是有用的。尤其是，由于本发明的抗hDlk-1抗体和含有该抗体的抗体-药剂复合体具有肿瘤血管生成抑制活性的抗肿瘤活性，因此优选在肿瘤的治疗用中使用。即，本发明的抗hDlk-1抗体和抗体-药剂复合体作为包含于肿瘤治疗剂、肿瘤血管生成抑制剂和肿瘤诊断剂中的有效成分是有用的。

本发明的药物组合物含有本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体作为有效成分，而且优选以包括药学上允许的载体的药物组合物的形态提供。

作为本发明的药物组合物的适用对象疾病(肿瘤)，可以例举确认了表达hDlk-1的前述公知的人肿瘤和本发明人新确认的表达hDlk-1的人大肠癌和人乳腺癌。其中，尤其优选例举大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经细胞瘤中的1种或2种以上。这些疾病可以是单独的，也可以是2种以上并发。

所谓“药学上允许的载体”，可以例举赋形剂、稀释剂、增量剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味剂、增溶剂或其它添加剂等。通过使用1种以上这种载体，可以制备注射剂、液剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或糖浆剂等形态的药物组合物。这些药物组合物可以经口或非经口给药。作为用于非经口给药的其它形态，包括含有1种以上的活性物质的通过常规方法制备的注射剂等。注射剂的情况中，可以通过溶解或悬浮于生理盐水或市售的注射用蒸馏水等药学上允许的载体中来制造。

尤其是，对生物体内给予本发明的抗hDlk-1抗体来源的抗体片段(其中尤其是低分子的物质)时，在其基础上还可以使用胶体分散系。胶体分散系可期待具有提高化合物(抗体片段)在生物体内稳定性的效果和将化合物高效输送到特定的内脏器官、组织或细胞的效果。胶体分散系只要为通常使用的即可，没有限制，可以例举聚乙二醇、高分子复合体、高分子凝集体、纳米胶囊、微球体、珠子和水包油系的乳化剂、胶束、混合胶束和以包含脂质体在内的脂质为基础的分散系，优选为具有将化合物高效输送到特定脏器、组织或细胞的效果的多个脂质体、人工膜的小囊泡(Mannino et al.，Biotechniques，1988，6，682；Blume and Cevc，Biochem.et Biophys.Acta，1990，1029，91；Lappalainen et al.，Antiviral Res.，1994，23，119；Chonn andCullis，Current Op.Biotech.，1995，6，698)。

本发明的药物组合物的给药量根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、给药方法、处理时间或药物组合物所含的本发明的抗hDlk-1抗体和抗体-药剂复合体的种类等而不同。通常，成人每人每次可以在600μg到6000mg的范围内给予，但并不限于此范围。

例如通过注射剂给予时，对人患者1次的给药中，每1kg体重可以平均1天以1次～数次给予100μg～100mg的量。作为给予的形态，可以例举静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等，优选为静脉内注射。而且，注射剂根据情况还可以调制成非水性的稀释剂(例如聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浮剂或乳浊剂。这种注射剂的无菌化可以通过过滤器进行过滤杀菌、配合杀菌剂等来进行。注射剂可以制备成使用时调制的形态。即，可以通过冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前溶解于无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中再使用。

另外，本发明还提供用于制造治疗和/或诊断肿瘤的药物(药剂)的前述本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体的应用。而且，本发明还提供治疗和/或诊断肿瘤用的前述本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体。

此外，本发明还提供肿瘤的治疗和/或诊断方法，其特征在于其使用前述本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体(即给予患者)，而且还提供前述本发明的抗hDlk-1抗体和/或抗体-药剂复合体在用于治疗和/或诊断肿瘤中的应用。

5.肿瘤的检测方法

本发明的肿瘤检测方法的特征在于，使前述本发明的抗hDlk-1抗体与从生物体采集的试样(以下称生物体试样)反应，检测反应的抗体的信号的方法。

如前所述，由于确认了hDlk-1在各种肿瘤细胞中特异性表达，hDlk-1，尤其是游离hDlk-1(hDlk-1的细胞外区域部分)可以作为各种肿瘤靶标来使用。其中，优选作为人大肠癌、人乳腺癌和人肝癌的靶标来使用。

因此，可以通过使本发明的抗hDlk-1抗体与生物体试样反应，检测反应的抗体的信号来检测肿瘤。获得的抗体的信号成为生物体试样中的抗原量(即hDlk-1量或游离hDlk-1量)的指标。使用本发明的抗体的肿瘤的检测，首先，使作为试样的从被验者中提取的生物体试样，例如作为检查对象的组织片或血液等与本发明的抗体通过抗原抗体反应结合。然后，通过基于结合的抗体量的测定结果，通过测定生物体试样中的目的抗原量而进行。该测定可以按照公知的免疫学测定法进行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫比浊法、western blot法、流式细胞术法等。标记免疫测定法中，抗体的信号除了以用标记抗体直接检测的标记量表示之外，还可以以已知浓度或已知抗体效价的抗体作为标准液相对地表示。即，可以通过测定计测定标准液和试样，以标准液的值作为基准，相对地表示生物体试样中的抗体信号。作为标记免疫测定法，例如可以例举ELISA法、EI法、RIA法、萤光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(Luminescence immunoassay)等。其中尤其是，ELISA法由于简便和高灵敏度而优选。

本发明中，可以将通过上述检测方法获得的检测结果作为指标来评价或诊断肿瘤的状态。例如，检测结果超过预定的基准值时判断为肿瘤阳性，在预定的基准值以下时判断为肿瘤阴性，为阳性时，判断为有发生任意一种肿瘤的可能性，可以评价肿瘤的状态。这里，所谓肿瘤的状态是指是否患有肿瘤或其进行程度，可以例举肿瘤发症的有无、进行度、恶性程度、转移的有无和复发的有无等。

在上述评价时，作为肿瘤的状态，可以选择1个，也可以组合选择多个。肿瘤的有无的评价，可以基于所获得的检测结果，通过以预定的基准值作为界限，判断是否患有肿瘤来进行。肿瘤的恶性程度是表示癌进行到何种程度的指标，也可以基于检测结果，对病期(Stage)分类再进行评价，或分类为早期癌或晚期癌再进行评价。例如，还可以将检测结果作为指标，评价为早期癌或晚期癌。肿瘤的转移，可以通过以检测结果作为指标，根据在从原发瘤的位置离开的部位是否出现新生物来评价。复发，可以根据在间歇期或缓解后检测结果是否再次超过预定的基准值来评价。

6.肿瘤的检测用或诊断用试剂盒

本发明的抗hDlk-1抗体可以以肿瘤的检测用或诊断用试剂盒的形态提供。本发明的试剂盒含有抗体，此外还可以含有标记物质、或抗体或固定该标记物的固定化试剂等。所谓抗体的标记物质是指用酶、放射性同位素、萤光化合物和化学发光化合物等标记的物质。本发明的试剂盒除了上述构成要素之外，还可以含有用于实施本发明的检测的其它试剂，例如标记物为酶标记物时，可以含有酶底物(显色性底物等)、酶底物溶解液、酶反应停止液、或试样用稀释液等。而且，还可以含有各种缓冲液、无菌水、各种细胞培养容器、各种反应容器(Eppendorf管等)、封闭剂(牛血清白蛋白(BSA)、脱脂乳、山羊血清等血清成分)、清洗剂、表面活性剂、各种板、叠氮化钠等防腐剂和实验操作手册(说明书)等。

本发明的试剂盒可有效用于进行上述本发明的检测方法，其有用性极高。

以下，通过例举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于此。

〔实施例1〕

<材料和方法>

1.细胞株

HEK-293-hDlk细胞、7E2-C-hDlk细胞和Huh-7-hDlk细胞使用按WO 2005/052156中所述而制作的细胞株。另外，人神经母细胞瘤SK-N-F1细胞从美国标准生物品收藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC；目录号No.CRL2142)获得。

SW480-hDlk细胞是通过在人大肠癌来源的细胞株SW480(获得来源：东京大学分子细胞生物学研究所功能形成)中导入含有全长hDlk-1基因的表达载体pcDNA-hdlk-Flag(参照WO2005/052156)，进行抗生素G418(遗传霉素(geneticin)，GIBCOBRL)选择后，建立稳定表达hDlk-1的细胞株而获得。

2.抗hDlk-1多克隆抗体的制作

在构建hDlk-1的细胞外区域(FA-1)表达载体时，设计并合成以下引物。

正向(F)引物：5’-cgcgtccgcaaccagaagccc-3’(序列号3)

反向(R)引物：5’-ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3’(序列号4)

此时，在R引物上添加XhoI限制性酶切序列。使用这些引物，以hDlk-1的cDNA作为模板，按以下的反应液组成和反应条件进行PCR反应。

《反应液组成》

模板DNA： 1μL

10×PCR缓冲液：5μL

2.5mM dNTP： 4μL

Taq DNA聚合酶：0.5μL

F引物(10μM)： 1μL

R引物(10μM)：1μL

灭菌水： 37.5μL

合计： 50μL

反应条件

以“热变性/解离：95℃(60秒)→退火：55℃(60秒)→合成、伸长：72℃(60秒)”为1个循环，共计35个循环。

将获得的hDlk-1的细胞外区域(人FA1)的cDNA克隆于pCRII载体(Invitrogen)中(pCRII-hFA1)。用测序仪确认克隆的人FA1的cDNA。

从pCRII-hFA1中切出含有人FA1 cDNA的EcoRI/XhoI片段，插入到pcDNA4/Myc-His载体(Invitrogen)的EcoRI/XhoI位点(pcDNA4-hFA1)。在该表达载体中在C末端侧添加Myc标签和His标签序列，人FA1作为与Myc标签和His标签的融合蛋白质表达。以融合蛋白质作为抗原，通过常规方法，对兔进行免疫，制作抗hDlk-1多克隆抗体。

3.hDlk-1基因的EGF样基序缺失突变体的制作

为了用于抗hDlk-1单克隆抗体的表位分析，如下制作hDlk-1基因的EGF样基序缺失突变体。

首先，制作用于通过PCR法扩增该区域的引物。制作的各引物序列示于下表1。此时，在F引物上添加NotI限制性酶切序列，在R引物中添加XbaI限制性酶切序列。但是，在用于扩增EGF(4-6)和EGF(5-6)的区域的R引物上不添加XbaI限制性酶切序列。而且，表1中的构建体栏中，例如“EGF(1-4)”的记载是指存在于hDlk-1的FA-1区域中的6个EGF样基序(EGF-1～EGF-6)中由EGF-1到EGF-4的连续区域。

表1

※每个上部分为F引物，下部分为R引物

使用上述各引物的PCR，按以下的反应液组成和反应条件进行。

《反应液组成》

模板DNA： 1μL

10×PCR缓冲液：5μL

2.5mM dNTP： 4μL

Taq DNA聚合酶：0.5μL

F引物(10μM)： 1μL

R引物(10μM)： 1μL

灭菌水： 37.5μL

合计： 50μL

反应条件

通过PCR法扩增的各片段用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆到pCRII载体(Invitrogen)中，确认碱基序列。然后，获得用Not I/Xba I切断的片段，将该片段亚克隆到pME18S-CFHX-FXYD TM的Not I/Xba I位点。而且， pME18S-CFHX-FXYD TM是被设计成所表达的目的蛋白质在N末端上具有人CD8a(GenBank登录号No.NM_001768)的信号序列和His标签序列的表达载体(获得来源：东京大学分子细胞生物学研究所功能形成)。

4.抗hDlk-1单克隆抗体的制作

(1)细胞免疫、蛋白质抗原免疫

以表达hDlk-1的细胞株(HEK-293-hDlk细胞、7E2-C-hDlk细胞)和用上述方法制备的hDlk-1的FA-1区域(以下称hFA-1)作为抗原。将1×10⁷个细胞的表达hDlk-1的细胞株、20μg的hFA-1蛋白质分别与免疫辅助剂(弗氏完全佐剂：和光纯药工业)或TiterMax Gold(Funakoshi株式会社)按1∶1混合，调制乳浊液，注射到6周龄的大鼠(Wister)、小鼠(C57/BL6、Balb/c)的两脚掌(初次免疫)。从初次免疫起3天后和10天后进行加强免疫，在最终免疫的次日，取出两膝窝的淋巴结，制备淋巴细胞。加强免疫时，细胞免疫时使用5×10⁶个细胞的经PBS悬浮的细胞悬浮液，蛋白质抗原的情况下使用5μg的PBS溶液。最终免疫的次日，取出两膝窝的淋巴结，制备淋巴细胞。而且，在加强免疫时以经PBS悬浮的细胞悬浮液作为抗原。制备的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞株(P3-X63-Ag8.653)按3∶1的比例混合，用聚乙二醇法进行细胞融合。在96孔平底培养板中使用含有HAT(氨基蝶呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)的选择培养基，用5％CO₂培养箱培养。培养10天～14天，通过细胞ELISA(后述)对逐渐增殖的杂交瘤的培养上清进行一次筛选，使用HEK-293细胞通过FACS分析进行2次筛选。然后，通过有限稀释法制作产生抗hDlk-1单克隆抗体的杂交瘤克隆。

(2)DNA免疫

同样，以制作抗hDlk-1单克隆抗体为目的，通过使用DNA 免疫法这样的方法，制作识别hDlk-1的立体结构，且抑制其生物生理活性的特异性单克隆抗体。DNA免疫法，由于导入的整合到表达载体中的hDlk-1基因在小鼠体内表达，因此可以以维持本来的立体结构和翻译后的各种修饰(例如糖链修饰和二硫桥等)的形态递呈抗原，因此尝试了以往以变性蛋白质和合成肽作为免疫源时难以制作的可识别hDlk-1原本的立体结构，且抑制其生物生理活性的特异性单克隆抗体的制作。

将hDlk-1的全长cDNA整合到添加了标签的哺乳动物表达载体中。在免疫实施前使用哺乳细胞来验证构建的基因构建体是否如设计的那样在细胞表面表达。即，将构建的基因构建体瞬间性表达导入于哺乳细胞中。导入的哺乳细胞在CO₂培养箱中培养24小时，用于FCM分析。FCM分析时，在加入了导入基因的培养细胞的培养溶液中，添加与上述导入基因上所带的标签相应的抗体，静置30分钟。然后，在溶液中添加特异性识别标签的经萤光标记的二抗，静置30分钟后用于FCM分析中。证明了本发明中构建的基因构建体在细胞表面上表达。

为了开发识别hDlk-1的立体结构且抑制其生物生理活性的抗hDlk-1单克隆抗体，将前述所构建的各种基因构建体通过各种基因导入法(肌肉注射、电穿孔、基因枪)单独或混合地导入于免疫动物中(实施约2～3个月)。在从免疫后的动物中提取的血清分析中使用上述HEK293-hDlk细胞。在加入了HEK293-hDlk细胞的培养溶液中加入从上述的导入基因的免疫动物中提取的血清，静置30分钟。然后，在溶液中添加特异性识别免疫动物的免疫球蛋白的经萤光标记的二抗，静置30分钟后用于FCM分析。解剖产生识别HEK293-hDlk细胞的强特异抗体的动物，按照常规方法分离B细胞，并制作抗hDlk-1单克隆抗体。

5.抗体纯化

在预先(7天前)给予了2，6，10，14-四甲基十五烷(姥鲛烷)的BALB/c裸小鼠的腹腔内给予3×10⁶个用上述方法制作的杂交瘤的克隆，提取2周后的腹水。从该腹水中通过辛酸沉淀、用蛋白质G柱(HiTrap protein G；GE healthcare bioscience)进行亲和纯化，获得各杂交瘤克隆所产生的抗hDlk-1单克隆抗体。以后的分析中使用这种纯化的抗hDlk-1单克隆抗体来实施。

6.抗体的标记

为了对制作的抗hDlk-1单克隆抗体按照表位进行分类、或进行内化活性的评价，对抗体进行标记。该抗体的生物素标记使用ECL Protein Biotinylation module(GE healthcarebioscience，RPN2202)进行。罗丹明标记使用EZ-Label^TM罗丹明蛋白质标记试剂盒(Rhodamine Protein Labeling kit，PIERCE，53002)，FITC标记使用EZ-Label^TM荧光素异硫氰酸酯(FITC)蛋白质标记试剂盒(Fluorescein Isothiocyanate ProteinLabeling kit，PIERCE，53004)，按照各试剂盒附带的操作指南进行。

7.细胞ELISA

在用明胶包被的96孔培养板(Corning)上以7.5×10³个细胞/孔接种上述7E2-C(hdlk)株，于37℃培养2天。用冰冷PBS清洗后，用4％多聚甲醛溶液固定，用0.2％Triton-X-100(商品名)溶液处理，制成细胞ELISA用板。之后，按照常规方法进行ELISA法。具体如下所示。

首先，在室温下用1％BSA-PBS溶液进行2小时封闭。然后，加入杂交瘤上清，于室温下反应1小时后，用0.1％Tween20(商品名)-PBS溶液清洗3次。用0.1％Tween20-PBS溶液将生物素化抗大鼠IgG(Vector Laboratory)稀释100倍，作为二抗使用。于室温下反应1小时后，用0.1％Tween20-PBS溶液清洗3次。再将用0.1％Tween20-PBS溶液稀释1000倍的辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP；Vector Laboratory)在室温下反应1小时，用0.1％Tween20-PBS溶液清洗3次。添加TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺：SIGMA)底物溶液进行显色反应，加入1M硫酸使反应停止。用酶标仪(microplate reader)Model 550(Bio-Rad)测定吸光度。

8.FACS分析

通过胰蛋白酶处理将细胞从培养皿剥离，制备出细胞悬浮液(细胞密度5×10⁶个细胞/mL)。使0.5μg抗人Dlk单克隆抗体和100μL细胞悬浮液于4℃反应30分钟。用PBS清洗后，使之与PE标记抗小鼠IgG或PE标记抗大鼠IgG(均为BD Pharmingen)(0.5μg)反应(4℃，30分钟)后，用FACS Calibur(BectonDickinson)分析。

9.通过ELISA法计算解离常数(Kd值)

制作的抗hDlk-1单克隆抗体的抗原亲和性(Kd值)，通过采用ELISA的方法计算(Djavadi-Ohaniance L.et al(1996)，InAntibody Engineering，Chapter 4，pp77-97.IRL Press，Oxford)。

具体而言，在96孔培养板(Corning)中添加纯化的重组hFA-1蛋白质(1μg/mL)将抗原固定化(室温，1小时)。然后，用PBS清洗3次，加入2％脱脂乳(PBS溶液)进行封闭(室温，1小时)。用PBS清洗2次后，在上述ELISA板中添加预先混合抗原溶液(纯化hFA-1蛋白质；50，25，12.5，6.25，3.125nM)和抗hDlk-1单克隆抗体的各克隆(0.5nM)并使之平衡化的抗原-抗体复合体，并使之反应(室温，1小时)。用PBS清洗3次后，使之与用封闭液稀释的HRP标记抗小鼠IgG(最终浓度1μg/mL)或HRP标记抗大鼠IgG(最终浓度1μg/mL)(均为GE healthcare bioscience)反应(室温，1小时)。

10.抗人Dlk-1单克隆抗体的表位分析

将制作的约100种抗hDlk-1单克隆抗体根据所识别的表位进行分类。将前述表达载体hdlk-EGF(1-3)/pME18S-CFHX、hdlk-EGF(3-4)/pME18S-CFHX、hdlk-EGF(4-6)/pME18S-CFHX分别对COS-7细胞进行基因导入。基因导入之后的24～72小时后，通过胰蛋白酶处理将细胞从培养皿剥离，通过FACS分析就各抗体克隆识别hDlk-1的哪个EGF样基序进行研究。

11.免疫组化染色法

人癌组织阵列(Cybrdi公司，大肠癌组织阵列Lot：CC05-01-001，乳腺癌组织阵列Lot：CC08-02-002)在脱石蜡处理后，在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，用高压灭菌器(121℃，5分)实施抗原活化处理，用于采用抗hDlk-1多克隆抗体的染色。以DAB(3，3’-二氨基联苯胺)作为底物进行显色反应后，通过苏木精进行核染色作为对比染色。具体如下述方式进行。

通过中性福尔马林进行固定和石蜡包埋的切片经脱石蜡处理后，在10mM柠檬酸钠溶液中用高压灭菌器(121℃，5分)实施抗原活化处理。然后，用在甲醇中按终浓度为0.3％加入了双氧水的溶液，在室温下处理20分钟，除去内源性的过氧化物酶活性。用PBS在室温下进行2次各5分钟的清洗，用Block Ace试剂(大日本制药株式会社)进行30分钟封闭，对组织中的非特异性结合部位进行封闭操作。然后，与用稀释成1/10的BlockAce试剂稀释的抗hDlk-1多克隆抗体(终浓度0.5μg/mL)在室温下反应1小时，用PBS进行3次各5分钟的清洗，然后，于用稀释成1/10的Block Ace试剂稀释到100倍的生物素化抗兔IgG抗体在室温下反应1小时。用PBS进行3次各5分钟的清洗后，按说明书所述，混合ABC试剂盒的试剂，制作ABC复合物，使其在室温下反应30分钟。用PBS进行3次各5分钟的清洗后，通过过氧化物酶底物(0.02％DAB(3，3’-二氨基联苯胺)、0.03％双氧水、50mM Tris-HCl pH7.5)进行显色。确认显色后，用水清洗10分钟，用迈耶斯苏木精(Meyer’s hematoxylin)溶液(和光纯药工业)对核进行染色，然后用醇脱水，用二甲苯透明，用EntellanNew(Merck Japan)封片。

12.荷瘤小鼠的制作和抗hDlk-1单克隆抗体的药效评价

(1)预防模型

通过胰蛋白酶处理来剥离表达hDlk-1的肝癌细胞株(Huh-7-hDlk)，用PBS调制出6×10⁷个细胞/mL的细胞悬浮液，在冰上与等量的Matrigel(BD Pharmingen)混合。在6周龄的雌性裸小鼠(Balb/c、nu/nu)的右胁腹的皮下用26G的注射器注射100μL(3×10⁶个细胞)。在癌细胞移植当天，将小鼠分组，开始给予抗体(20mg/kg体重，腹腔内给药)。之后，按3天1次的间隔进行同样的给药。根据肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性。肿瘤体积的测量采用以下计算式。

肿瘤体积(mm³)＝(短径)²×(长径)×π/6

(2)治疗模型

通过胰蛋白酶处理来剥离表达hDlk-1的肝癌细胞株(Huh-7-hDlk)和表达hDlk-1的大肠癌细胞株(SW480-hDlk)，用PBS调制出6×10⁷～10×10⁷个细胞/mL的细胞悬浮液，在冰上与等量的Matrigel(BD Pharmingen)混合。在6周龄的雌性裸小鼠(Balb/c、nu/nu)的右胁腹的皮下用26G的注射器注射100μL(3×10⁶～5×10⁶个细胞)。自癌细胞移植起10～14天后，将肿瘤体积生长到50～150mm³(平均值约为100mm³)的小鼠分组，将分组的当天作为第1天(Day1)，开始给予抗体。抗体按3天1次的间隔进行腹腔内给药(20mg/kg体重)。通过测量肿瘤体积评价抗肿瘤活性。差异显著性检验用Student’s-t检验(Student’st检验)进行，将P＜0.05以下者在统计学上判断为显著。

13.抗hDlk-1单克隆抗体的内化活性的评价

hDlk-1单克隆抗体与抗原结合后，通过内吞作用进入到细胞内的内化活性依赖于抗体所识别的表位。因此，进行制作的抗hDlk-1单克隆抗体的内化活性的评价。通过FACS分析进行的评价方法通过FACS分析和用萤光显微镜进行的观察来评价。

通过FACS分析进行的内化活性的评价用以下方法进行。在HEK-293-hdlk细胞(2×10⁵个细胞)中添加抗hDlk-1单克隆抗体(0.5μg)并使之反应(4℃，20分钟)，用PBS清洗2次后，悬浮于DMEM培养基中，于37℃培养(60分钟、90分钟、120分钟、240分钟)，促进细胞表面上的抗原-抗体复合体的内化。然后，通过离心(1000rpm，5分钟)回收细胞后，使之与PE标记抗小鼠(或大鼠IgG)(0.5μg)反应(4℃，20分)后，用FACSCalibur(Becton Dickinson)分析。

另外，用同样的方法使FITC标记的抗hDlk-1单克隆抗体与HEK-293-hdlk细胞反应，用PBS清洗2次后，悬浮于DMEM培养基中，于37℃孵育(120分钟)后，用FACSCalibur(BectonDickinson)分析。

然后，在HEK-293-hdlk细胞(2×10⁵个细胞)中添加罗丹明标记的抗hDlk-1单克隆抗体(0.5μg)并使之反应(4℃，20分)，用PBS清洗2次后，悬浮于DMEM培养基中，于37℃孵育(15分钟、30分钟、60分钟、120分钟)后，用Cytospin(Shandon)制作涂片标本(800rpm，3分钟)，用封片溶液(mountingsolution)封片后(Vector Laboratory)，用萤光显微镜(Nikon；ECLIPSE E800)观察抗原-抗体复合体的定位。

14.采用抗hDlk-1单克隆抗体制作免疫结合物

制作结合抗原后内化活性高的抗hDlk-1单克隆抗体克隆M3-1(小鼠IgG1)与植物性蛋白质毒素皂草素的免疫结合物、和作为比较对照的克隆M1-290(小鼠IgG2b)与植物性蛋白质毒素皂草素的免疫结合物(Advanced Targeting System公司，San Diego)。

15.使用抗hDlk-1单克隆抗体评价免疫结合物的药效

通过胰蛋白酶处理从培养皿剥离细胞，在加入了10％FBS的DMEM培养基中制备1×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液。在胶原包被的96孔平底板上以1×10⁴/孔接种，培养2～3小时，使细胞附着。然后，添加各种免疫结合物，即小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP)、M3-1-皂草素(M3-1-SAP)和M1-290-皂草素(M1-290-SAP)。分别以0.1、1、10、100、1000ng/mL添加。培养48～72小时后，用MTT法测定吸光度。

体内的抗肿瘤活性的评价通过采用上述Huh-7-hDlk细胞的荷瘤小鼠来进行评价。

16.MTT法

向在96孔板中培养的细胞中添加TetraColor One(生化学工业)，在5％CO₂培养箱中使之反应3～4小时。用酶标仪(microplate reader)直接测定反应后的96孔板在波长490nm(对照波长：655nm)的吸光度。

<结果>

1.人肝癌细胞异种移植(预防模型)中，公知的抗hDlk-1单克隆抗体(1C1、4C4、31C4)的肿瘤生长抑制活性的研究

hDlk-1在各种癌细胞的细胞表面表达，而且一旦使hDlk-1基因在人肝癌细胞株中稳定表达，则移植到裸小鼠皮下时，肿瘤生长速度显著受到促进(参照WO 2005/052156)，由此认为抗hDlk-1抗体作为癌治疗用药物是有用的。由于hDlk-1本身的基因序列/氨基酸序列是公知的，因此原理上来说以合成肽或纯化蛋白质作为免疫源，通过公知的方法是能够获得抗hDlk-1的单克隆抗体的。然而，实际上，是否能制作显示癌治疗药的活性，即在个体水平上(体内)显示抗肿瘤活性的抗体，一般来说，由于抗原的种类、表达量、蛋白质结构等原因大多并不清楚。正如所知道的那样，在可以说有数万种之多的单克隆抗体中，作为肿瘤(癌)所代表的疾病的治疗药而上市的仅有20种左右，大部分抗体在个体水平上不显示药效。

公知的抗hDlk-1单克隆抗体(克隆1C1、4C4、31C4)至少在补体存在下使人肝癌细胞死亡是公知的(参照WO2005/052156)。然而，在体内的药效并不清楚。

首先，将表达hDlk-1的肝癌细胞株(Huh-7-hDlk)移植到裸小鼠皮下，在移植的同时开始给予抗体，来研究公知的3个克隆在体内的抗肿瘤活性即肿瘤细胞在裸小鼠皮下的存活和对肿瘤生长的效果。

如下表2所示，在细胞移植的同时开始给予抗体，在第14天(Day14)时，在对照组(给予大鼠IgG)中，10只中的所有个体都形成了肿瘤(平均肿瘤体积：382.0±74.8mm³)。另一方面，抗hDlk-1单克隆抗体给药组的肿瘤形成率在1C1给药组中为40％，在4C4给药组和31C4给药组中为30％，肿瘤形成率明显降低。在第21天(Day21)时，在1C1给药组中为70％，在4C4给药组和31C4给药组中为50％，通过给予抗体，肿瘤形成均受到抑制。形成的肿瘤的体积的平均值方面，抗体给药组显示出比对照组低的值，但统计学上看不出差异显著性。

表2

2.人肝癌细胞异种移植(治疗模型)中，公知的抗hDlk-1单克隆抗体(1C1、4C4、31C4)的肿瘤生长抑制活性的研究

为了使抗hDlk-1单克隆抗体作为癌治疗抗体发挥药效，对于已建立的肿瘤组织发挥抗肿瘤活性是非常重要的。而且，在上述预防模型中，通过比较肿瘤形成率，可以一定程度上推测抗体的抗肿瘤活性，但个体间的偏差大，无法准确评价抗肿瘤活性。

因此，接着，将Huh-7-hDlk细胞移植到裸小鼠皮下，在平均肿瘤体积生长到100mm³的阶段开始给予抗体，通过该治疗模型进行药效评价。

如图1所示，在治疗模型中，分别以20mg/kg体重的用量3天进行1次1C1(大鼠IgG1)(图1的A)、4C4(大鼠IgG2a)(图1的B)和31C4(大鼠IgG2a)(图1的C)的腹腔内给药，研究对肿瘤生长的效果。但是，所有克隆都没有显示出显著的肿瘤生长抑制活性。

3.在人肝癌细胞异种移植(治疗模型)中，新的抗hDlk-1单克隆抗体的体内抗肿瘤活性研究

以hDlk-1作为靶标的癌治疗用抗体，在异种移植治疗模型中，必须使表达hDlk-1的肿瘤组织特异性死亡，或显示出抑制肿瘤的生长的活性。

同样用Huh-7-hDlk细胞的异种移植治疗模型来评价本发明中新制作的抗hDlk-1单克隆抗体(约100克隆)。新制作的约100克隆中，大部分克隆与公知的3个克隆一样，在治疗模型中未显示出药效，但其中也获得了显示出显著的肿瘤生长抑制活性的克隆，即克隆DI-2-14、2-13、BA-1-3D、DI-6和M3-1。

在克隆DI-2-14(小鼠IgG1)给药组中，给予抗体后，所有的个体中(N＝8)肿瘤生长都受到抑制，在给药开始后第14天(Day14)时，对照组(N＝8)的肿瘤体积为907.7±142.8mm³，相对于此，克隆DI-2-14给药组中为175.5±46.5mm³(P＜0.01，通过Student’s t检验)(图2A)。以开始给予抗体时的肿瘤体积为1.0时，对照组第14天(Day14)的肿瘤体积为9.24，与之相对克隆DI-2-14给药组第14天(Day14)的肿瘤体积为1.85。对照组摘出的肿瘤重量为0.58±0.07(g)，与此相对克隆DI-2-14给药组摘出的肿瘤重量为0.15±0.04(g)(P＜0.01，通过Student’st检验)(图2B)。

如图2C中所示，通过给予克隆DI-2-14所产生的抗肿瘤活性在独立的其它试验中也能再现，同样，在肿瘤体积的平均值达到100mm³(对照组：103.8±11mm³(N＝7)，DI-2-14给药组：101.4±9.5mm³(N＝8))的阶段，开始给予抗体。在给药开始后第14天(Day14)，对照组的肿瘤体积为733.37±244.86mm³，与之相对在克隆DI-2-14给药组中为148.83±32.65mm³(P＜0.01，通过Student’s t检验)。

在克隆2-13(大鼠IgG2b)给药组(N＝10)中，虽然不完全，但在统计学上肿瘤生长速度显著受到抑制，在给药开始后第14天(Day 14)时，对照组(N＝10)的肿瘤体积为1580.2±179.4mm³，与之相对，克隆2-13给药组为832.9±131.8mm³(P＜0.01，通过Student’s t检验)，显示出约50％的抑制(图3A)。

同样，对照组(N＝8)的肿瘤体积为907.7±142.8mm³，与此相对，克隆BA-1-3D(小鼠IgG2a)给药组(N＝8)和克隆DI-6(小鼠IgG1)给药组(N＝8)分别为380.8±54.4mm³(图3B)和321.0±59.6mm³(图3C)，肿瘤生长均受到显著的抑制(P＜0.01，通过Student’s t检验)。

而且，在克隆M3-1(小鼠IgG1)给药组(N＝8)中，肿瘤生长速度受到显著抑制，在给药开始后第14天(Day 14)时，对照组(N＝7)的肿瘤体积为1123.8±249.1mm³，与此相对，克隆M3-1给药组为457.0±123.75mm³(P＜0.05，通过Student’s t检验)(参照图3D、表3)。

另外，上述克隆中，产生克隆M3-1的杂交瘤被称为小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse hybridoma)：M3-1”，于2006年10月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(

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305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(保藏号：FERM BP-10707)。

同样，产生克隆DI-2-14的杂交瘤被称为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse hybridoma)：DI-2-14”，于2007年8月21日保藏于同一中心(保藏号：FERM BP-10899)。

产生克隆DI-6的杂交瘤被称为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse hybridoma)：DI-6”，于2007年8月21日保藏于同一中心(保藏号：FERM BP-10900)。

表3

4.人大肠癌细胞异种移植(治疗模型)中，抗肿瘤活性的研究

与使用上述人肝癌细胞异种移植治疗模型时一样，研究克隆2-13在人大肠癌细胞株(SW480-hDlk)的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性(图4)。

在克隆2-13给药组中，与对照组(大鼠IgG给药组)比较，肿瘤生长受到显著抑制，在第16天(Day16)时，大鼠IgG给药组(N＝7)的肿瘤体积为877.27±176.82mm³(以给药开始日作为1.0时，为5.01)，与此相对，克隆2-13给药组(N＝8)为452.71±54.97mm³(以给药开始日作为1.0时，为2.87)(P＜0.05，通过Student’s t检验)(图4)。

根据以上结果可知，抗hDlk-1单克隆抗体不仅对于肝癌细胞，对于大肠癌细胞也显示出了在体内显著的肿瘤生长抑制活性。

5.抗hDlk-1单克隆抗体(克隆DI-2-14、2-13、BA-1-3D、 DI-6和M3-1)的抗原结合活性(使用HEK-293-hDlk细胞进行FACS分析和利用ELISA进行解离常数的计算)

对于在人癌细胞异种移植模型中显示出显著抗肿瘤活性的抗hDlk-1单克隆抗体，使用HEK-293-hDlk细胞(图5)和Huh-7-hDlk细胞(图6)对上述抗体与抗原hDlk-1的亲和性进行FACS分析，结果显示任一克隆均识别所有的细胞株，识别hDlk-1的立体结构。尽管没有显示出数据，但任一克隆均不识别不表达hDlk-1的HEK293细胞和Huh-7细胞。

然后，通过上述ELISA法计算这些克隆与抗原的亲和性(解离常数)。其结果是，各个克隆的Kd值分别为：克隆DI-2-14为9.26×10^-9(M)，克隆M3-1为6.28×10^-9(M)，克隆BA-1-3D为32.2×10^-9(M)，克隆DI-6为10.1×10^-9(M)。就克隆2-13而言，与纯化的重组hFA-1的亲和性不高，无法通过上述方法计算出Kd值。

6.抗hDlk-1单克隆抗体的表位分析

接着，进行抗hDlk-1单克隆抗体的表位分析。

将hDlk(EGF1-2)-pME-CHFX、hDlk(EGF1-3)-pME-CHFX、hDlk(EGF3-4)-pME-CHFX、hDlk(EGF4-6)-pME18-CHFX和hDlk(EGF5-6)-pME18-CHFX的各个表达载体(图7)导入于COS-7细胞，通过FACS分析和细胞离心涂片(Cytospin)标本的免疫染色，对各抗hDlk-1单克隆抗体识别包含存在于hDlk-1的FA-1区域(细胞外区域)的6个EGF样基序的区域中的哪个部位进行研究。

通过FACS分析和免疫染色，克隆DI-2-14识别EGF(1-3)和EGF(3-4)，完全不识别EGF(1-2)、EGF(4-6)和EGF(5-6)(图8)。这表示克隆DI-2-14识别的表位是包括hDlk-1的第3位的EGF样基序(EGF-3)到第4位的EGF样基序(EGF-4)的区域 (hDlk-1的第92位～第167位的氨基酸构成的区域)，大概是EGF-3(hDlk-1的第92位～第120位的氨基酸构成的区域)。据报道，小鼠中，IgG的同种型中，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)方面，IgG2a和IgG2b强，IgG1的活性低(参照Kipps，T.J.et al.，1985)。由于克隆DI-2-14的同种型是小鼠IgG1，这表明克隆DI-2-14的极强的肿瘤生长抑制活性与其说是ADCC活性等由效应细胞介导的癌细胞杀伤效应，不如说是通过抑制hDlk-1的功能来发挥抗肿瘤活性，这表示hDlk-1的包括EGF-3和EGF-4的区域，尤其是EGF-3在hDlk-1的功能中是特别重要的结构域。

而且，克隆2-13、DI-6和BA-1-3D识别EGF(1-2)和EGF(1-3)，完全不识别EGF(3-4)和EGF(4-6)(图9)。这表明这3个克隆识别的表位是hDlk-1的包括从第1位的EGF样基序(EGF-1)到第2位的EGF样基序(EGF-2)的区域(hDlk-1的第26位～第85位的氨基酸构成的区域)，这表明hDlk-1的包括EGF-1和EGF-2的区域在hDlk-1的功能中是特别重要的结构域。

此外，克隆M3-1识别EGF(1-4)和EGF(4-6)，但不识别EGF(1-2)、EGF(1-3)和EGF(3-4)(图10)。这表明克隆M3-1识别的表位是hDlk-1的包括从第4位的EGF样基序(EGF-4)到第6位的EGF样基序(EGF-6)的区域(hDlk-1的第131位～第244位的氨基酸构成的区域)，这表明hDlk-1的包括EGF-4、EGF-5和EGF-6的区域在hDlk-1的功能中是特别重要的结构域。

7.抗hDlk-1单克隆抗体的内化活性

制作的抗hDlk-1单克隆抗体的各克隆按照识别的表位进行分类，对属于分成的各组的克隆，研究其识别抗原后的内化活性。

就识别EGF(1-2)的克隆M1-290，识别EGF(4-6)的M3-1 和识别EGF(5-6)的克隆M3-4来说，各抗体与HEK293-hDlk细胞反应后，于37℃孵育，然后使之与PE标记抗小鼠抗体反应。如图11A所示，以不进行孵育时的萤光强度作为100％的情况下，克隆M3-1的荧光强度以与其它克隆相比显著快的速度减少，且该减少依赖于孵育时间。该结果表明，这是因为抗原-抗体反应后，由于时间依赖性的进入到细胞内，细胞表面上的抗原-抗体复合体减少。而且，各孵育时间后的萤光强度如下。

60分钟；M3-1：38.7％，M1-290：52.1％，M3-4：74.1％

90分钟；M3-1：36.9％，M1-290：47.1％，M3-4：71.15％

120分钟；M3-1：28.1％，M 1-290：36.3％，M3-4：57.3％

240分钟；M3-1：12.2％，M 1-290：31.2％，M3-4：41.4％

确认了孵育时平均萤光强度减少的主要原因并非是孵育期间与抗原结合的抗hDlk-1单克隆抗体从该抗原剥离。直接用FITC标记克隆M3-1，同样使之与HEK293-hDlk细胞反应，用PBS清洗后，于37℃孵育120分钟，然后，进行FACS分析，将孵育120分钟后的萤光强度与刚反应后的荧光强度进行比较。其结果是，两者间没有显著差异(不孵育：100％，孵育120分钟后：110.9％)(图11B)。

然后，使罗丹明标记的抗体与HEK293-hDlk细胞反应，PBS清洗后，同样于37℃孵育。然后，用细胞离心涂片器制作涂片标本，用萤光显微镜观察萤光标记抗体的定位。其结果如图12所示，在不孵育的情况下观察到了其在细胞膜的定位。然而，通过于37℃孵育，识别EGF(4-6)的克隆M3-1和DI-1，通过仅仅15分钟的孵育，就因内吞作用吸收到细胞内，进入到囊泡中，观察到点状的细胞内定位。另一方面，克隆M1-290和M3-4尽管观察到点状的定位，但大部分定位于细胞膜上(图12)。

根据以上结果，克隆M3-1等识别EGF(4-6)的抗体，与识别其它结构域的抗体相比，识别抗原后的内化活性显著较高。因此，由于通过使克隆M3-1等抗hDlk-1抗体与抗癌剂或细胞毒素结合而复合体化的免疫结合物快速进入到靶标细胞内，因此被认为抗癌剂或细胞毒素的药理效果高，且副作用少。

8.抗hDlk-1单克隆抗体免疫结合物的杀伤效应

分别制作使皂草素结合于内化活性高的克隆M3-1和作为比较对照的克隆M1-290上而成的免疫结合物(M3-1-SAP，M1-290-SAP)，对使用抗hDlk-1单克隆抗体的免疫结合物的导弹疗法(missile therapy)的有用性进行药效评价。M3-1-SAP和M1-290-SAP在不表达hDlk-1的HEK293细胞中均没有显示出毒性。

然后，添加于表达hDlk-1的Huh7-hDlk细胞和SK-N-F1细胞(内在地表达hDlk-1的神经母细胞瘤)中并进行培养，结果对照(小鼠IgG-SAP)在任一细胞中都几乎不显示杀伤效应。但是，在培养液中添加M3-1-SAP并进行培养的情况下，细胞被杀伤且杀伤依赖于浓度，如果浓度为1μg/mL，则Huh-7-hDlk细胞存活率为23.3±1.35％(N＝3)，SK-N-F1细胞存活率为9.38±2.1％(N＝3)，显示出强杀伤效应(图13)。

比较M3-1-SAP和M1-290-SAP对于SK-N-F1细胞(内在地表达hDlk-1的神经母细胞瘤)的杀伤效应，结果如图13B所示，两者的活性几乎相同(图13B)。

9.抗hDlk-1单克隆抗体免疫结合物的体内肿瘤生长抑制活性

通过Huh-7-hDlk细胞的异种移植模型，对M3-1-SAP作为免疫结合物的有用性、即给予小鼠个体时的抗肿瘤活性和副作用进行评价。使用M1-290-SAP作为比较对照。抗肿瘤活性的评价与前述一样按肿瘤体积进行，副作用的研究通过给药后的体重变化和致死率进行。

小鼠IgG给药组(N＝8)在整个试验期间(14天)没有发现体重的增减，但M3-1-SAP(5mg/kg体重，腹腔内给药)给药组(N＝8)和M1-290-SAP(5mg/kg体重，腹腔内给药)给药组(N＝8)在免疫结合物给药开始后第4天(Day 4)，观察到体重减少(“M3-1-SAP”为第1天：21.2±1.36(g)，Day 4：18.5±1.44(g)；“M1-290-SAP”为第1天：21.13±0.81(g)，第4天：17.9±0.85(g))。尤其是，内化活性不高的M1-290-SAP的毒性强，8个个体中，在第4天(Day 4)有2个个体死亡，在第5天(Day 5)剩余的6个个体死亡，因此结果为自给药开始起5天内所有个体死亡(图14B)。

另一方面，发现M3-1-SAP给药组所有个体生存，体重也在第8天(Day 8)以后恢复。

如图15所示，M3-1-SAP给药组的肿瘤生长受到强烈抑制，在第14天(Day 14)，对照组肿瘤体积(给药为第1天和第4天的2次)为1123.8±245.65mm³，于此相对，M3-1-SAP给药组肿瘤体积(给药为第1天和第4天的2次)为415.8±105.1mm³(P＜0.05，Student’s t检验)。

进而，为了确认M3-1-SAP的抗肿瘤活性，在肿瘤部位局部给予M3-1-SAP(1mg/mL M3-1-SAP，40μL/肿瘤)。M3-1-SAP和对照IgG的给药在达到预定的平均肿瘤体积(对照组：144.98±6.1mm³(N＝5)，M3-1-SAP组：145.87±21.26mm³(N＝5))之时和给药开始后第4天(Day 4)共进行2次，观察肿瘤体积的生长。

其结果如图16的A所示，M3-1-SAP给药组至第7天(Day 7)大体上完全抑制了肿瘤的生长(对照组：584.02±137.07mm³，M3-1-SAP组：148.67±38.0mm³，P＜0.01，通过Student’s t检验)，在第14天(Day14)时，对照组为2038.66±333.17mm³，与此相对，M3-1-SAP给药组为575.75±216.61mm³(P＜0.05，通过Student’s t检验)，显示出极强的抗肿瘤活性。

如图16的B所示，在肿瘤内给予M3-1-SAP时，在第4天(Day4)的第2次给药以后，发现体重稍有减少，但所有个体生存，第9天(Day9)以后体重逐渐恢复，在第10天(Day10)完全恢复到给药前的状态。

另一方面，如图16的C所示，在给予现有的抗癌剂顺铂(Cisplatin)(抗恶性肿瘤剂Randa Inj.；日本化药株式会社)时，以5mg/kg的给药量，肿瘤生长几乎完全被抑制(在第16天对照组(PBS组)：1085.36±286.30mm³，顺铂组：77.28±15.20mm³，P＜0.01，通过Student’s t检验)，而如图16D所示，观察到顺铂给药组体重随时间显著减少，在第16天(Day16)时，对照组的体重为20.58±0.53g，相对于此，顺铂给药组体重为13.24±1.83g(P＜0.01，通过Student’s t检验)，观察到极强的副作用(体重减少)。

以上结果显示，内化活性高的克隆M3-1(识别EGF(4-6)的抗体)作为免疫结合物使用时，与其它克隆相比，副作用少且抗肿瘤活性高。

10.人大肠癌组织、乳腺癌组织中的hDlk-1的表达

hDlk-1以往据报道在实体癌中，神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、1型神经纤维瘤病、小细胞肺癌、肝癌、肾癌和卵巢癌中表达，在血癌中，据报道在骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中表达。

为了研究hDlk-1在上述以外的癌症种类中的表达，用抗hDlk-1抗体对市售的人癌组织阵列进行免疫染色来进行研究。大肠癌中hDlk-1的阳性率，使用大肠癌组织阵列(Cybrdi公司， lot No.CC05-01-001)。图17中示出了代表性的染色照片，研究了70个试样的大肠癌组织，结果在43个腺癌(Adenocarcinoma)试样中12个试样(27.9％)呈现强阳性，19个试样(44.2％)呈现弱阳性，在所有43个腺癌试样中31个试样(72.1％)为hDlk-1阳性(参照表4)。

另外，相同组织阵列中的11个乳头状腺癌(PapilllaryAdenocaricinoma)试样中，6个试样(54.5％)显示hDlk-1强阳性(参照表4)。

表4

乳腺癌中的hDlk-1的阳性率使用乳腺癌组织阵列(Cybrdi公司，lot No.CC08-02-002)。本组织阵列由采自53个试样中的总计63个切片构成，其中17个试样(17个切片)为浸润性导管癌(Infiltrating duct carcinoma)、2个试样(2个切片)为导管内癌(Intraductal carcinoma)、34个试样(44个切片)由正常组织或胶原纤维等非癌组织构成。尽管也存在hDlk-1在正常的乳腺组织中也呈现弱阳性的试样(图18)，但染色性非常弱，另一方面，在17个浸润性导管癌试样中，5个试样(29％)呈现强阳性。(参照图18，表5)。

表5

导管内癌(2个试样)：hDlk-1强阳性(1)、hDlk-1阴性(1)

正常乳腺胶原纤维等(34)：hDlk-1阴性(24)、hDlk-1弱阳性(10)

可知除了以往公知的表达hDlk-1的癌症种类之外，大肠癌和乳腺癌中，两者都有约30％强烈表达hDlk-1。如上述实施例中所示，抗hDlk-1单克隆抗体不仅在肝癌细胞的异种移植中，在大肠癌细胞的异种移植模型中也呈现抗肿瘤活性，因此不仅对于肝癌，对于大肠癌也为有效的治疗药。同样，也是以乳腺癌和其它表达hDlk-1的癌细胞作为靶标的有效的治疗药。

〔实施例2〕

1.小鼠抗人Dlk-1抗体(克隆DI-2-14)在表达人Dlk-1的肝癌细胞株(Huh-7-Dlk细胞)异种移植治疗模型中的、用量依赖性的抗肿瘤活性

<目的>

如实施例1所述，作为抗人Dlk-1单克隆抗体的克隆DI-2-14(小鼠IgG1)在人肝癌细胞株(Huh-7-hDlk细胞)的异种移植治疗模型中，以20mg/kg体重的给药量，显示出极高的抗肿瘤活性。因此，为了进一步验证克隆DI-2-14的抗肿瘤活性，进行用量依赖性的抗肿瘤活性的评价。

<方法>

除了改变抗体的给药量之外，与实施例1同样进行抗肿瘤活性的评价。

<结果>

如图19所示，肿瘤的生长受到给予克隆DI-2-14的抑制，且所述抑制为用量依赖性的；在给予抗体后的第8天(Day8)，对照组(N＝9)的肿瘤体积为782.1±124.4mm³，相对于此，DI-2-14(1mg/kg)给药组(N＝9)为522.76±107.9mm³，DI-2-14 (2mg/kg)给药组(N＝9)为309.2±58.9mm³，DI-2-14(5mg/kg)给药组(N＝9)为285.8±38.2mm³。

2.小鼠抗人Dlk-1抗体(克隆DI-2-14)在人神经母细胞瘤SK-N-F1细胞异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性

<目的>

如实施例1中所述，5种抗人Dlk-1单克隆抗体在人肝癌细胞株(Huh-7-hDlk细胞)异种移植治疗模型中，显示出抗肿瘤活性，对其中显示出特别强的抗肿瘤活性的克隆DI-2-14(小鼠IgG1)在人神经母细胞瘤(SK-N-F1细胞)的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性进行评价。Huh-7-hDlk细胞为在Huh-7细胞中稳定表达外源性的人Dlk-1基因的细胞株，与之相对，SK-N-F1细胞是内源性的在细胞表面表达Dlk-1的细胞株。因此，在SK-N-F1细胞株的异种移植治疗模型中，给予克隆DI-2-14而产生抗肿瘤活性则表示抗人Dlk-1单克隆抗体对人神经母细胞瘤出现药效，同时，也可以说抗人Dlk-1单克隆抗体(尤其是克隆DI-2-14)对于在细胞表面表达Dlk-1的各种癌细胞有效(显示出药效)。

<方法>

通过胰蛋白酶处理来剥离内源性的在细胞表面上表达hDlk-1的人神经母细胞瘤(SK-N-F1细胞，ATCC目录号CRL2142)，用PBS制备出6×10⁷个细胞/mL的细胞悬浮液，在冰上混合等量的Matrigel(BD Pharmingen)。在6周龄的雌性重症联合免疫缺陷小鼠(NOD-scid)的右胁腹的皮下用26G的注射器注射100μL(3×10⁶个细胞)。自癌细胞移植起10～14天后，将肿瘤体积生长到50～150mm³(平均：约100mm³)的小鼠分组，以分组的当天作为第1天(Day1)，开始给予抗体(克隆DI-2-14)。抗体按3天1次的间隔通过腹腔内给药进行给予(5mg/kg体重，20mg/kg体重)。与实施例1一样，通过测量肿瘤体积来评价抗肿瘤活性。而且，在实验最后一天，通过解剖摘出肿瘤，测量肿瘤重量并进行评价。差异显著性检验用Student’s t检验进行，将P＜0.05以下判断为统计学上具有显著性。

<结果>

如图20A所示，克隆DI-2-14(小鼠IgG1)给药组与对照组(N＝7)相比，5mg/kg给药组(N＝8)和20mg/kg给药组(N＝7)肿瘤生长均显著受到抑制，尤其是20mg/kg给药组(N＝7)，其从给药开始后的次日到实验结束时的第23天(Day23)，与当天标准的肿瘤体积相比，统计学上显著小(P＜0.01，通过Student’s t检验)。

在给药开始后第23天(Day23)，对照组的肿瘤体积为527.8±48.9mm³，与之相对，克隆DI-2-14(5mg/kg体重)给药组为333.8±6.8mm³(P＜0.01，通过Student’s t检验)，克隆DI-2-14(20mg/kg体重)给药组为233.0±16.4mm³(P＜0.01，通过Student’s t检验)，确认了克隆DI-2-14的抗肿瘤活性为用量依赖性(DI-2-14(5mg/kg)和DI-2-14(20mg/kg)，Day23，P＜0.01，通过Student’s t检验)。

对照组摘出的肿瘤重量为0.07±0.04(g)，与之相对，克隆DI-2-14(5mg/kg体重)给药组摘出的肿瘤重量为0.03±0.009(g)(P＜0.05，通过Student’s t检验)，克隆DI-2-14(20mg/kg体重)给药组摘出的肿瘤重量为0.02±0.005(g)(P＜0.05，通过Student’s t检验)。与肿瘤体积一样，克隆DI-2-14的5mg/kg给药组和20mg/kg给药组的肿瘤重量的差异存在显著性(P＜0.05，通过Student’s t检验)，确认了抗肿瘤活性为用量依赖性的(图20B)。

3.小鼠抗人Dlk-1抗体(克隆DI-2-14)的抗体基因的可变区序列的确定和嵌合DI-2-14表达载体的构建

产生小鼠抗Dlk-1单克隆抗体的杂交瘤在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、7.5％CO₂培养箱中培养。用TRIzol试剂(Invitrogen)从3×10⁶个杂交瘤中提取总RNA之后，用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)按照试剂盒附带的方法，使用寡dT引物(oligo dT)合成cDNA。以上述合成后的cDNA作为模板，使用PCR法克隆出编码克隆DI-2-14(小鼠IgG1)的H链和L链的可变区(VH、VL)的基因。此时，5’-引物使用GeneRacer试剂盒所附带的引物。另一方面，3’-引物使用具有与小鼠γ1恒定区互补的序列的片段作为VH扩增用3，-引物，使用具有与小鼠κ恒定区互补的序列的片段作为VL扩增用3’-引物。

5’-引物(F引物)：

5’-cgactggagcacgaggacactga-3’ (序列号15)

3’-引物(R引物)：

VH：5’-gccagtggatagacagatgg-3’ (序列号16)

VL：5’-gatggatacagttggtgcagc-3’(序列号17)

《反应液组成》

模板cDNA： 1.5μL

10×ThermalAce PCR缓冲液：5μL

2mM dNTP： 5μL

ThermalAce聚合酶： 0.5μL

F引物(10μM)： 3μL

R引物(10μM)： 1.5μL

灭菌水：33.5μL

合计： 50μL

《反应条件》

以“热变性/解离：94℃(10秒)→退火：55℃(10秒)→合成、伸长：72℃(60秒)”为1个循环，共计35个循环。

将合成的VH和VL的cDNA亚克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中，确定碱基序列。解读多个VH克隆和VL克隆的碱基序列，判断出小鼠H链和L链的可变区中典型的碱基序列。图21和图22中示出了DI-2-14的VH和VL的共有cDNA碱基序列以及推测出的氨基酸序列。

然后，在VH和VL的编码区域中添加来自于各自相应的小鼠生殖细胞系列JH和Jκ序列的提供剪切的信号，再在两端添加用于插入于动物细胞表达载体的适当的限制性酶位点。将这样制作的具有作为外显子的功能的VH(图23)和VL(图24)基因插入于含有人γ1链和κ链的恒定区的动物细胞表达载体(图25)中，制作出小鼠-人嵌合抗体(DI-2-14 IgG1/κ)表达载体(pChDI-2-14)。

4.ChDI-2-14抗体蛋白质的纯化

将建立的产生ChDI-2-14抗体的稳定NS0细胞株在无血清培养基(Hybridoma SFM，Invitrogen)中驯化后，回收用无血清培养基进行培养的培养液，用蛋白A柱(GE healthcare)按照常规方法进行抗体纯化。

图26中示出了用SDS-PAGE展开小鼠DI-2-14抗体和纯化的ChDI-2-14抗体后，用CBB染色的图。在还原条件下，均检测到约50kD的H链和约25kD的L链，确认了产生了ChDI-2-14抗体蛋白质。

5.嵌合DI-2-14抗体(ChDI-2-14)的抗原亲和性

通过采用ELISA的方法研究纯化的ChDI-2-14蛋白质的抗原亲和性。

ELISA与实施例1同样地使用将纯化重组hFA-1蛋白质(0.5～1μg/mL)固定化的ELISA板进行。具体而言，用清洗缓冲液清洗ELISA板3次后，用封闭液在室温下封闭1小时(或4℃下过夜)，用清洗缓冲液清洗2次后，添加用ELISA缓冲液制成稀释系列的小鼠DI-2-14抗体和ChDI-2-14抗体使之反应(4℃下过夜)。用清洗缓冲液清洗3次后，使之与用封闭液稀释的HRP标记抗小鼠IgG(最终浓度1μg/mL)或HRP标记抗人IgG(最终浓度1μg/mL)(均为GE healthcare bioscience)反应。其结果是，小鼠DI-2-14和ChDI-2-14的反应曲线几乎重叠，EC50均为10ng/mL以下(图27)。

而且，使用HEK293-hDlk细胞，通过流式细胞术分析对于在活细胞的细胞表面表达的Dlk-1蛋白质的结合活性，其结果与ELISA的结果一样，ChDI-2-14显示出与小鼠DI-2-14同等的抗原结合能力(图28)。

根据以上结果，嵌合DI-2-14抗体(ChDI-2-14)维持与小鼠DI-2-14抗体几乎同等的抗原亲和性，因此制作的嵌合DI-2-14抗体保持了小鼠DI-2-14抗体所具有的体内的强抗肿瘤活性，这表明其是对在细胞表面上表达Dlk-1的癌有效的治疗用抗体、诊断用或者检测用抗体。

6.人肝癌、乳腺癌和白血病细胞株中，细胞表面Dlk-1的表达(FACS)

为了更详细地研究Dlk-1在人癌细胞中的表达，使用抗人Dlk-1抗体，通过流式细胞术分析肝癌细胞株(7个细胞株)、乳腺癌细胞株(10个细胞株)和急性髓系白血病(AML)细胞株(7个细胞株)。

使用的细胞株如下述列举，使用从ヒュ一マンサイエンス振興事業団、ATCC(American Type Culture Collection，美国标准生物品收藏中心)、ECACC(European Collection of CellCultures，欧洲生物制品收藏中心)、DSMZ(German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures，德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得的细胞株。

HL-60(ATCC)、NB-4(DSMZ)、MV-4-11(ATCC)、KG-1(ATCC)、KG-1a(ATCC)、TF-1(ATCC)、CMK-11-5(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、HepG2(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、C3A/HepG2(ATCC)、Huh-7(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、OCUG-1(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、HLE(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、HLF(ヒュ一マンサイエンス振興事業団)、SK-HEP-1(ATCC)、HCC1143(ATCC)、JIMT-1(DSMZ)、ZR-75-1(ATCC)、MDA-MB-415(ATCC)、BT549(ATCC)、BT-474(ATCC)、MDA-MB-231(ATCC)、DU4475(ATCC)、T47D(ATCC)、MDA-MB-468(ATCC)

在肝癌细胞株中，使用的7种细胞株都确认了细胞表面Dlk-1的表达(图29)。在乳腺癌细胞株中，使用的10种细胞株中，确认了在HCC1143细胞和JIMT-1细胞中强表达(图30)，在其它8种细胞株中虽然弱但也确认了细胞表面Dlk-1的表达(图30)。在AML细胞株中，7种细胞株中，在CMK-11-5细胞、TF-1细胞、MV-4-11细胞和NB-4细胞这4种细胞株中确认了细胞表面Dlk-1的表达(图31)。

〔实施例3〕

DI-2-14抗体(小鼠抗人Dlk-1单克隆抗体，克隆DI-2-14)的体内血管生成抑制效果

<方法>

(1)免疫组化染色

在Huh-7-hdlk细胞的荷瘤小鼠中，从小鼠IgG给药组(对照组：2个个体)、DI-2-14给药组的小鼠(4个个体)中分别摘出癌组织，用O.C.T混合物(Tissue-Tek)包埋后，制作新鲜冷冻切片(7μm)，用2.5％戊二醛/PBS在室温下固定15分钟，用0.5％曲拉通(Triton)X-100/PBS在室温下固定3分钟，用PBS室温下进行3次各5分钟的清洗。然后，用在甲醇中按终浓度为0.3％加入双氧水而形成的溶液，于室温下处理5分钟，除去内源性的过氧化物酶活性。然后，按PBS、0.1％Tween/PBS、0.02％Tween/PBS的顺序，分别在室温下各进行5分钟清洗，按照M.O.M.^TM Immunodetection Kit(VECTOR)的实验方案，用M.O.M.^TM小鼠Ig封闭试剂(M.O.M.^TM mouse Ig BlockingReagent)封闭组织中的非特异性结合部位进行封闭操作，用PBS于室温下进行2次各2分钟的清洗。用M.O.M.^TM稀释液于室温下反应5分钟。由于形成的Huh-7-hdlk细胞来源的肿瘤内肿瘤血管是来源于小鼠的血管内皮细胞，因此，接着在室温下与使用M.O.M.^TM小鼠Ig封闭试剂稀释的抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗体(终浓度2μg/ml)反应30分钟，用PBS于室温下进行2次各2分钟的清洗，然后，在室温下使经M.O.M.^TM Diluent稀释至100倍的生物素化抗大鼠IgG抗体反应10分钟。用PBS进行2次各2分钟的清洗后，按照11.免疫组化染色法进行。

(2)RT-PCR

本实施例中所述的RT-PCR是指分别进行由提取的RNA合成cDNA，以及以该cDNA为模板进行PCR。

在Huh-7-hdlk细胞的荷瘤小鼠中，从小鼠IgG给药组(对照组：7个个体)、DI-2-14给药组的小鼠(7个个体)中分别摘出癌组织，用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。接着，使用第1链cDNA合成试剂盒(lst-Strand cDNA Synthesis Kit)(GE healthcare)，按照该试剂盒附带的实验方案，合成第1链cDNA。

以合成的第1链cDNA作为模板，对于小鼠IgG给药组(对照组：7个个体)、DI-2-14给药组的小鼠(7个个体)摘出的癌组织，通过PCR法分析作为肿瘤血管内皮细胞标记的小鼠Flk-1/VEGF-R2(Genbank登录号No.X70842)的基因表达。

PCR引物使用下述引物(PCR扩增产物为336bp)。

F引物：5’-ctt-tac-tct-ccc-cag-tta-ca-3’(序列号18)

R引物：5’-ctt-tct-att-gtc-aag-gtg-ct-3’(序列号19)

采用上述引物的PCR，按以下的反应液组成和反应条件进行。

《反应液组成》

模板DNA： 1μL

10×PCR缓冲液：5μL

2.5mM dNTP： 4μL

Taq DNA聚合酶：0.5μL

F引物(10μM)： 1μL

R引物(10μM)： 1μL

灭菌水： 37.5μL

合计： 50μL

《反应条件》

95℃(3分钟)的变性后，以“热变性/解离：95℃(60秒)→退火：55℃(60秒)→合成、伸长：72℃(60秒)”作为1个循环，共计35个循环。

另外，作为内部对照，使用GAPDH(人GAPDH： NM_002046；小鼠GAPDH：NM_008084，NM_001001303，XM_001003314，XM_988853，XM_990238)。扩增GAPDH的PCR引物使用下述引物(PCR扩增产物为452bp)。这些引物在以人GAPDH或小鼠GAPDH作为模板的情况下均可以扩增。

F引物：5’-acc-aca-gtc-cat-gcc-atc-ac-3’(序列号20)

R引物：5’-tcc-acc-acc-ctg-ttg-ctg-ta-3’(序列号21)

另外，PCR的反应液组成和反应条件与扩增上述的Flk-1/VEGF-R2时一样。

PCR产物的定量：首先，用1.2％琼脂糖凝胶电泳展开后，用溴化乙锭染色。然后，用扫描仪读取拍摄的电泳图像，用NIHImage进行PCR产物的定量，按Flk-1/GAPDH的比例制图。

<结果>

如图32所示，对每个IgG给药组(20mg/kg体重)(2个个体)和DI-2-14给药组(20mg/kg体重)(4个个体)各组的8～13个视场(物镜×200)，通过用苏木精进行的核染色确认了核，并且数出Flk-1/VEGF-R2阳性的肿瘤血管内皮细胞的数目(IgG给药组：共25个视场，DI-2-14给药组：共35视场)，计算每1个视场的肿瘤血管细胞数，IgG给药组中为112.0±63.6(Flk-1阳性细胞数/视场)，相对的，DI-2-14给药组中为36.3±2.2(Flk-1阳性细胞数/视场)，肿瘤血管细胞数显著减少(P＜0.01)，这表示肿瘤血管生成由于给予DI-2-14而受到抑制。

而且，在另外的实验中，相同的Huh-7-hDlk-1细胞的荷瘤小鼠，从IgG给药组(20mg/kg体重，N＝7)和DI-2-14给药组(20mg/kg体重，N＝7)的小鼠中，通过RT-PCR半定量地分析各自形成的肿瘤中作为肿瘤血管内皮细胞的特异性标记基因的Flk-1/VEGF-R2的基因表达，如图33所示，DI-2-14给药组的肿瘤中Flk-1/VEGF-R2的基因表达降低，其结果表示肿瘤血管生成由于给予DI-2-14而受到抑制。

<考察>

已知在癌的形成中，肿瘤血管生成是必需的，已知抗VEGF抗体(阿瓦斯汀(Avastin))是以肿瘤血管生成抑制为主要作用机理的癌治疗抗体。迄今为止，就Dlk-1和抗Dlk-1抗体而言，对于血管生成和血管生成抑制活性并没有公开的公知信息。而且，就Dlk-1的功能而言，迄今为止，已经有对于脂肪细胞的分化控制和由于Dlk-1基因的稳定导入而导致的神经胶质瘤细胞和白血病细胞中的增殖促进的报告，基于已知的公知信息，不可能预见抗Dlk-1抗体(DI-2-14)具有肿瘤血管生成抑制活性。本实施例公开了DI-2-14抗体体内的抗肿瘤活性的至少一个作用机理。

产业上的可利用性

根据本发明，可以提供具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1单克隆抗体。而且本发明还可以提供产生该抗体的杂交瘤、该抗体和各种药剂的复合体、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用途或诊断用试剂盒。

序列表自由文本

序列号3：合成DNA

序列号4：合成DNA

序列号5：合成DNA

序列号6：合成DNA

序列号7：合成DNA

序列号8：合成DNA

序列号9：合成DNA

序列号10：合成DNA

序列号11：合成DNA

序列号12：合成DNA

序列号13：合成DNA

序列号14：合成DNA

序列号15：合成DNA

序列号16：合成DNA

序列号17：合成DNA

序列号18：合成DNA

序列号19：合成DNA

序列号20：合成DNA

序列号21：合成DNA

序列号26：重组DNA

序列号27：合成构建体(重组蛋白质)

序列号28：重组DNA

序列号29：合成构建体(重组蛋白质)

序列表

<110>株式会社立富泰克(LivTech，Inc.)

<120>在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1抗体

<130>PCT07-0041

<150>JP 2006-305355

<151>2006-11-10

<160>35

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1532

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(154)..(1305)

<400>1

gagagcgcag cgcgcagccc ggtgcagccc tggctttccc ctcgctgcgc gcccgcgccc 60

cctttcgcgt ccgcaaccag aagcccagtg cggcgccagg agccggaccc gcgcccgcac 120

cgctcccggg accgcgaccc cggccgccca gag atg acc gcg acc gaa gcc ctc 174

Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu

1 5

ctg cgc gtc ctc ttg ctc ctg ctg gct ttc ggc cac agc acc tat ggg 222

Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly

10 15 20

gct gaa tgc ttc ccg gcc tgc aac ccc caa aat gga ttc tgc gag gat 270

Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp

25 30 35

gac aat gtt tgc agg tgc cag cct ggc tgg cag ggt ccc ctt tgt gac 318

Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp

40 45 50 55

cag tgc gtg acc tct ccc ggc tgc ctt cac gga ctc tgt gga gaa ccc 366

Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu His Gly Leu Cys Gly Glu Pro

60 65 70

ggg cag tgc att tgc acc gac ggc tgg gac ggg gag ctc tgt gat aga 414

Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg

75 80 85

gat gtt cgg gcc tgc tcc tcg gcc ccc tgt gcc aac aac ggg acc tgc 462

Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys

90 95 100

gtg agc ctg gac gat ggc ctc tat gaa tgc tcc tgt gcc ccc ggg tac 510

Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr

105 110 115

tcg gga aag gac tgc cag aaa aag gac ggg ccc tgt gtg atc aac ggc 558

Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly

120 125 130 135

tcc ccc tgc cag cac gga ggc acc tgc gtg gat gat gag ggc cgg gcc 606

Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala

140 145 150

tcc cat gcc tcc tgc ctg tgc ccc cct ggc ttc tca ggc aat ttc tgc 654

Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys

155 160 165

gag atc gtg gcc aac agc tgc acc ccc aac cca tgc gag aac gac ggc 702

Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly

170 175 180

gtc tgc act gac att ggg ggc gac ttc cgc tgc cgg tgc cca gcc ggc 750

Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe Arg Cys Arg Cys Pro A1a Gly

185 190 195

ttc atc gac aag acc tgc agc cgc ccg gtg acc aac tgc gcc agc agc 798

Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser

200 205 210 215

ccg tgc cag aac ggg ggc acc tgc ctg cag cac acc cag gtg agc tac 846

Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Gln His Thr Gln Val Ser Tyr

220 225 230

gag tgt ctg tgc aag ccc gag ttc aca ggt ctc acc tgt gtc aag aag 894

Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys

235 240 245

cgc gcg ctg agc ccc cag cag gtc acc cgt ctg ccc agc ggc tat ggg 942

Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly

250 255 260

ctg gcc tac cgc ctg acc cct ggg gtg cac gag ctg ccg gtg cag cag 990

Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val His Glu Leu Pro Val Gln Gln

265 270 275

ccg gag cac cgc atc ctg aag gtg tcc atg aaa gag ctc aac aag aaa 1038

Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys

280 285 290 295

acc cct ctc ctc acc gag ggc cag gcc atc tgc ttc acc atc ctg ggc 1086

Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly

300 305 310

gtg ctc acc agc ctg gtg gtg ctg ggc act gtg ggt atc gtc ttc ctc 1134

Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly Thr Val Gly Ile Val Phe Leu

315 320 325

aac aag tgc gag acc tgg gtg tcc aac ctg cgc tac aac cac atg ctg 1182

Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn Leu Arg Tyr Asn His Met Leu

330 335 340

cgg aag aag aag aac ctg ctg ctt cag tac aac agc ggg gag gac ctg 1230

Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu

345 350 355

gcc gtc aac atc atc ttc ccc gag aag atc gac atg acc acc ttc agc 1278

Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser

360 365 370 375

aag gag gcc ggc gac gag gag atc taa gcagcgttcc cacagccccc 1325

Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile

380

tctagattct tggagttccg cagagcttac tatacgcggt ctgtcctaat ctttgtggtg 1385

ttcgctatct cttgtgtcaa atctggtgaa cgctacgctt acatatattg tctttgtgct 1445

gctgtgtgac aaacgcaatg caaaaacaat cctctttctc tctcttaatg catgatacag 1505

aataataata agaatttcat ctttaaa 1532

<210>2

<211>383

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro

20 25 30

Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly

35 40 45

Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu

50 55 60

His Gly Leu Cys Gly Glu Pro Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp

65 70 75 80

Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro

85 90 95

Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu

100 105 110

Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp

115 120 125

Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro

145 150 155 160

Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro

165 170 175

Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe

180 185 190

Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro

195 200 205

Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu

210 215 220

Gln His Thr Gln Val Ser Tyr Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr

225 230 235 240

Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr

245 250 255

Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val

260 265 270

His Glu Leu Pro Val Gln Gln Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser

275 280 285

Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala

290 295 300

Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly

305 310 315 320

Thr Val Gly Ile Val Phe Leu Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn

325 330 335

Leu Arg Tyr Asn His Met Leu Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln

340 345 350

Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys

355 360 365

Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile

370 375 380

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>3

cgcgtccgca accagaagcc c 21

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>4

ctcgaggtgc tccggctgct gcaccggc 28

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>5

gcggccggct gaatgcttcc cggcc 25

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>6

tctagagagg ctgttggcca cgatctcgc 29

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>7

gcggccggct gaatgcttcc cggcc 25

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>8

tctagacccg tcctttttct ggcagtcc 28

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>9

gcggccggct gaatgcttcc cggcc 25

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>10

tctagaggcc cgaacatctc tatcac 26

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>11

gcggccgcaa aaaggacggg ccctgtg 27

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>12

gcgtatagta agctctgcgg 20

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>13

caggcagcgg ccgcgagatc gtggccaac 29

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>14

gcgtatagta agctctgcgg 20

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>15

cgactggagc acgaggacac tga 23

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>16

gccagtggat agacagatgg 20

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>17

gatggataca gttggtgcag c 21

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>18

ctttactctc cccagttaca 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>19

ctttctattg tcaaggtgct 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>20

accacagtcc atgccatcac 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>21

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>22

<211>411

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(411)

<400>22

atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag 96

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att 144

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

aga gac acc tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gag cag ggc ctg 192

Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

gag tgg att gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt aaa tat gac 240

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp

65 70 75 80

ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac 288

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

aca gcc tac ctg cag ttc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc 336

Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

tat tac tgt gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac tgg ggc caa 384

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc 411

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala

130 135

<210>23

<211>137

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>23

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Alg Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala

130 135

<210>24

<211>396

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(396)

<400>24

atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg atc cct 48

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

gga gcc att ggg gat att gtg atg act cag gct gca ccc tct gta cct 96

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

20 25 30

gtc act cct gga gag tca gta tcc atc tcc tgc agg tct agt aag agt 144

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc ctg cag agg 192

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

cca ggc cag tct cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gcc 240

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

tca gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc 288

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac 336

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

tgt atg caa cat gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag 384

Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

ttg gaa ata aaa 396

Leu Glu Ile Lys

130

<210>25

<211>132

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>25

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210>26

<211>442

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组DNA

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(420)

<400>26

actagtacca cc atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg 51

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val

1 5 10

gtt aca ggg gtc aat tca gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag 99

Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu

15 20 25

ctt gtg aag cca ggg gcc tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc 147

Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly

30 35 40 45

ttc aac att aga gac acc tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gag 195

Phe Asn Ile Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu

50 55 60

cag ggc ctg gag tgg att gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt 243

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu

65 70 75

aaa tat gac ccg aag ttc cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca 291

Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr

80 85 90

tcc tcc aac aca gcc tac ctg cag ttc agc agc ctg aca tct gag gac 339

Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

95 100 105

act gcc gtc tat tac tgt gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac 387

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr

110 115 120 125

tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca ggtgagtcct aacttcaagc 440

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

tt 442

<210>27

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体(重组蛋白)

<400>27

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Arg Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210>28

<211>431

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组DNA

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(420)

<400>28

gctagcacca cc atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc 51

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu

1 5 10

tgg atc cct gga gcc att ggg gat att gtg atg act cag gct gca ccc 99

Trp Ile Pro Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro

15 20 25

tct gta cct gtc act cct gga gag tca gta tcc atc tcc tgc agg tct 147

Ser Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Set Val Ser Ile Set Cys Arg Ser

30 35 40 45

agt aag agt ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc 195

Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe

50 55 60

ctg cag agg cca ggc cag tct cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc 243

Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser

65 70 75

aac ctt gcc tca gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga 291

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

80 85 90

act gct ttc aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt 339

Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

95 100 105

gtt tat tac tgt atg caa cat gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc tcg 387

Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser

110 115 120 125

ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt aag tag act tttgcgaatt c 431

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Thr

130 135

<210>29

<211>134

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体(重组蛋白)

<400>29

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Lys

130

<210>30

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>30

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210>31

<211>17

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>31

Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210>32

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>32

Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr

1 5

<210>33

<211>16

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>33

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210>34

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>34

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>35

Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

Claims

1.一种在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk-1的抗体，该抗体的H链V区域的CDR1～3的氨基酸序列分别依次为序列号30～32所示的氨基酸序列；且该抗体的L链V区域的CDR1～3的氨基酸序列分别依次为序列号33～35所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中，抗肿瘤活性为肿瘤血管生成抑制活性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，抗体为单克隆抗体。

4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

5.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，抗体是基因重组抗体。

6.根据权利要求5所述的抗体，其中，基因重组抗体是嵌合抗体。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中，嵌合抗体的H链V区域的氨基酸序列由序列号23所示的氨基酸序列构成；L链V区域的氨基酸序列由序列号25所示的氨基酸序列构成。

8.根据权利要求1或2所述的抗体，其与保藏号为FERMBP-10899的杂交瘤所产生的单克隆抗体结合的部位结合。

9.根据权利要求1或2所述的抗体，其与序列号2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第92位～第167位的氨基酸所构成的区域结合。

10.一种抗人Dlk-1的单克隆抗体，其由保藏号为FERMBP-10899的杂交瘤产生。

11.一种来源于权利要求1～10中任意一项所述的抗体的抗体片段，所述抗体片段为Fab、Fab’、F（ab’）₂、Fv、scFv、双抗体、dsFv且含有序列号30～32所示的氨基酸序列以及序列号33～35所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的抗体片段，其含有序列号23所示的氨基酸序列。

13.根据权利要求11所述的抗体片段，其含有序列号25所示的氨基酸序列。

14.一种保藏号为FERM BP-10899的、产生抗人Dlk-1的单克隆抗体的杂交瘤。

15.一种抗体-药剂复合体，其含有权利要求1～10中任意一项所述的抗体和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物。

16.一种抗体片段-药剂复合体，其含有权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的化合物。

17.根据权利要求15或16所述的复合体，其中，抗肿瘤活性为肿瘤血管生成抑制活性。

18.根据权利要求15或16所述的复合体，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

19.一种药物组合物，其含有选自于由权利要求1～10中任意一项所述的抗体、权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和权利要求15～18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少1种。

20.根据权利要求19所述的组合物，其用于肿瘤的治疗。

21.根据权利要求20所述的组合物，所述肿瘤的治疗为抑制肿瘤血管生成。

22.根据权利要求19所述的组合物，其用于肿瘤的诊断。

23.根据权利要求20～22中任意一项所述的组合物，其中，肿瘤选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

24.一种肿瘤治疗剂，其含有选自于由权利要求1～10中任意一项所述的抗体、权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和权利要求15～18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少1种。

25.根据权利要求24所述的治疗剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

26.一种肿瘤血管生成抑制剂，其含有选自于由权利要求1～10中任意一项所述的抗体、权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和权利要求15～18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少1种。

27.根据权利要求26所述的抑制剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

28.一种肿瘤诊断剂，其含有选自于由权利要求1～10中任意一项所述的抗体、权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和权利要求15～18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少1种。

29.根据权利要求28所述的诊断剂，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。

30.一种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其含有选自于由权利要求1～10中任意一项所述的抗体、权利要求11～13中任意一项所述的抗体片段和权利要求15～18中任意一项所述的复合体构成的组中的至少1种。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，肿瘤为选自于人大肠癌、人乳腺癌、人肝癌和人神经母细胞瘤构成的组中的至少1种。