WO2008056833A1 - Anticorps anti-humain spécifiques de dlk1 présentant une activité anti-tumorale in vivo - Google Patents

Anticorps anti-humain spécifiques de dlk1 présentant une activité anti-tumorale in vivo Download PDF

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WO2008056833A1
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Koji Nakamura
Rie Tajima
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-human Dlk-1 antibody having antitumor activity, and particularly to an anti-human Dlk-1 antibody having antitumor activity at J! Oo.
  • the present invention also relates to a hybridoma that produces the antibody, and a use of the antibody. Background art
  • Human Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila); hereinafter referred to as “hDlk-l”) is a single transmembrane type 1 membrane protein with a total length of 383 amino acid residues. Has six EGF-like motifs in the extracellular region. Its extracellular region is homologous to the Notch / Delta / Serrate family.
  • the hDlk-1 gene was cloned as a molecule that is expressed in GRP (gastrin releasing peptide) -responsive cell lines derived from small cell carcinoma (Non-patent document 1) or as a factor that suppresses preadipocyte differentiation (Non-patent document) 2).
  • hDlk-1 is commonly referred to as the gene symbol DLK1 because of its homology to the amino acid sequence of Delta, a Notch receptor ligand, a cell differentiation regulator, and Pref-1 (Non-Patent Document 2), pG2 (Non-Patent Document 3), SCP-1 (Non-Patent Document 4), and ZOG (Non-Patent Document 5) have multiple gene symbols, but these are basically the same molecule. is there.
  • hDlk-1 is cleaved by an unidentified protease near the cell membrane in the extracellular region and secreted into the blood.
  • Free hDlk-1 (hDlk-1 extracellular region) is a molecule identical to a glycoprotein called FA-1 (Fetal antigen-1) (Non-patent Document 6) having 225 to 262 amino acid residues.
  • the hDlk-1 gene and its gene product are highly expressed in undifferentiated and highly proliferative fetal cells.
  • high expression is observed in fetal liver, fetal kidney, fetal skeletal muscle, fetal brain, etc., but expression is not observed in most tissues after birth, and adrenal gland, placenta, pituitary gland in normal adult tissues (Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • hDlk-1 expression is observed in cells considered to be undifferentiated stem cells and progenitor cells.
  • Non-patent Documents 7 and 8 that have undifferentiated and multipotency in adult liver
  • Non-patent Document 9 mesenchymal stem cells that are stem cells of osteochondral Z adipocytes. Expression of 1 has been reported, suggesting that it is involved in the properties of these tissue stem cells, such as maintenance of undifferentiated ability.
  • hDlk-1 which is restricted to fetal cells and stem cells, and gene gene products with EGF-like motifs (Notch-receptor, Notch ligand (Delta, Jagged, serrate), etc. ) Regulates cell proliferation and differentiation through cell-cell interactions via EGF-like motifs, suggesting that hDlk-1 also has such a function.
  • EGF-like motifs Notch-receptor, Notch ligand (Delta, Jagged, serrate), etc.
  • hDlk-1 also has such a function.
  • it is well known that expression decreases with the differentiation of preadipocytes, and that fat differentiation is suppressed when the hDlk-1 gene is forcibly expressed in preadipocytes Non-patent Document 2.
  • details about the molecule (ligand) that interacts with hDlk-1 are unknown.
  • hDlk-1 gene and its gene product are frequently expressed in various cancers and tumors.
  • the types of cancers that have been confirmed to date are solid endocrine tumors, neuroendocrine tumors, neuroblastoma, glioma, type 1 neurofibromatosis, small cell lung cancer, liver cancer, kidney Cancer and ovarian cancer are known (patent documents 1, 2, and non-patent documents 1, 3, 10, 11, 1 2, 13, 14), and in blood cancer, myelodysplastic syndrome (Patent Literature 3, and Non-Patent Literature 15, 16) and acute myelogenous leukemia (Non-Patent Literature 16) are known.
  • Patent Document 17 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-269174
  • Non-Patent Document 1 Laborda, J. et al., J. Biol .Chem., Vol.268 (6), p.3817-3820 (1993)
  • Non-Patent Document 2 Smas, C.M. et al., Cell, vol.73 (4), p.725-734 (1993)
  • Non-Patent Document 3 Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.84, p.2336-2339 (1987)
  • Non-Patent Document 4 Maruyama, K. et al., Unpublished, Genebank accession number D 16847 (1993)
  • Non-Patent Document 5 Haider, S. K. et al., Endocrinology, vol.139, p.3316 3328 (1998)
  • Non-Patent Document 6 Fay, T. ⁇ . Et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., Vol.29, p.73-85 (1988)
  • Non-Patent Document 7 Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol.5, p.209-218 (2004)
  • Non-Patent Document 8 Jensen, CH. Et al "Am. J. Pathol., Vol.164 (4), p.1347-1359 (2004)
  • Non-Patent Document 9 AbdaUah, B.M. et al., J. Bone Miner. Res., Vol.19 (5), p.841-852 (2004)
  • Non-Patent Document 10 Jensen, C.H. et al., Br. J. Dermatol., Vol.140 (6), p.1054- 1059 (1999)
  • Non-Patent Document 1 1 Jensen, CH. Et al "Tumour Biol., Vol.20 (5), p.256 262 (1999)
  • Non-patent document 12 Yin, D. et al., Int. J. Oncol., Vol.24 (4), p.1011-1015 (2004)
  • Non-patent document 13 Yin, D. et al., Oncogene, vol.25 (13), p.1852- 1861 (2006)
  • Non-patent document 14 Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., vol.58, p.145-150 (2006)
  • Non-Patent Document 15 Miyazato, A. et al., Blood, vol.98, p.422-427 (2001)
  • Non-patent literature 16 Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol. 19 (8), p. 1404- 1410 (2005)
  • Non-patent literature 17 Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13 ), P.1852- 1861 (2006) Disclosure of the Invention
  • hDlk-1 expression is restricted to fetal cells and stem cells in normal tissues, but is frequently expressed in various tumors in cancer tissues, and hDlk-1 is expressed in cell membranes. Because it is a protein / secreted protein, hDlk-1 is considered to be a good target for the treatment of various tumors. When targeting this hDlk-1, anti-hDlk-1 antibody is considered useful.
  • an object of the present invention is to provide an anti-human Dlk-1 antibody having anti-tumor activity, particularly an anti-human Dlk-1 monoclonal antibody having anti-tumor activity in Vo.
  • the present invention also provides a hybridoma that produces the antibody, a complex of the antibody and a drug, a pharmaceutical composition for diagnosis or treatment of a tumor, a method for detecting a tumor, and a kit for detection or diagnosis of a tumor.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • antibodies that specifically react with human Dlk-1 have antitumor activity, and further, conjugates of these antibodies with various drugs (immunoconjugates).
  • conjugates of these antibodies with various drugs are used for tumor therapy, diagnosis and detection, and completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • the antitumor activity includes, for example, tumor angiogenesis inhibitory activity.
  • the antibodies described in (1) above are, for example, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies The thing which is is mentioned.
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of the H chain V region are the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30 to 32, respectively, and / or the L chain V Examples are those in which the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 in the region are the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33 to 35, respectively.
  • Examples of the antibody of the present invention include antibodies produced by hybridomas and recombinant antibodies.
  • a hybridoma refers to a cell that produces an antibody having a desired antigen specificity obtained by cell fusion of a B cell obtained by immunizing a mammal other than human with an antigen and a myeloma cell. .
  • the recombinant antibody includes antibodies produced by genetic recombination, such as chimeric antibodies (human chimeric antibodies), humanized antibodies, human antibodies or antibody fragments thereof. Recombinant antibodies having the characteristics of monoclonal antibodies, low antigenicity, and extended blood half-life are preferred as therapeutic agents.
  • the chimeric antibody for example, the amino acid sequence of the H chain V region consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence of the L chain V region is represented by SEQ ID NO: 25. The thing which consists of an arrangement
  • the antibody described in (1) to (4) above is, for example, a region consisting of the 26th to 85th amino acids in the amino acid sequence of human Dlk-1 represented by SEQ ID NO: 2, Binds to at least part of the region consisting of the 9th 2nd to 16th 7th amino acid, or the region consisting of the 1st 3rd 1st to 24th 4th amino acid (recognizes the part) Things.
  • Examples of the antibodies described in the above (1) to (4) include, for example, an accession number of FERM BP-10707, Examples thereof include an antibody that binds to a site (for example, an epitope) to which a monoclonal antibody produced by a hybridoma that is FERM BP-10899 or FERM BP-10900 binds (recognizes).
  • Examples of the antibody fragment described in (6) above include those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30 to 32, and specifically those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23. It is done.
  • Examples of the antibody fragment described in (6) above include those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 33 to 35, specifically, those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25. It is done.
  • An antibody-drug complex comprising the antibody according to any one of (1) to (5) above and a compound having antitumor activity and / or cell killing activity.
  • An antibody fragment-drug complex comprising the antibody fragment according to (6) above and a compound having antitumor activity and / or cell killing activity.
  • examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma. .
  • the antitumor activity includes, for example, tumor angiogenesis inhibitory activity.
  • compositions comprising one species.
  • examples of the composition described in (13) above include those used for tumor therapy, and examples of tumor therapy include inhibiting tumor angiogenesis.
  • examples of the composition include those having no side effect of weight loss.
  • Examples of the composition described in (13) above include those used for tumor diagnosis.
  • examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colorectal cancer, human breast cancer, human liver cancer, and human vaginal blastoma. .
  • Examples of the therapeutic agent described in (14) above include those having no side effect of weight loss.
  • examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human milk, cancer, human liver cancer, and human neuroblastoma. .
  • Examples of the inhibitor described in (15) above include those that do not have the side effect of weight loss.
  • examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colorectal cancer, human breast cancer, human liver cancer, and human human transblastoma. .
  • examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • (17) Selected from the group consisting of the antibody according to any one of (1) to (5) above, the antibody disruption according to (6) above, and the complex according to (11) or (12) above.
  • a method for detecting a tumor comprising reacting at least one species with a sample collected from a living body and detecting a signal of the reacted antibody.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • Examples of the method (18) include a method for treating a tumor by inhibiting or suppressing tumor angiogenesis.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma.
  • Examples of the tumor include at least one selected from the group consisting of human colon cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma. Brief Description of Drawings
  • Fig. 1 shows the well-known (WO 2005/052156) anti-hDlk-1 monoclonal antibody 3 clones (1C1, 4C4, It is a figure showing the result at the time of administering 31C4).
  • Each antibody was intraperitoneally administered four times (arrows) on the first day (Day 1), 40th day (Day 4), 7th day (Day 7) and 10th day (Day 10).
  • FIG. 2 shows the evaluation of the antitumor activity of a new anti-hDlk-1 monoclonal antibody clone DI-2-14 (mouse IgG 1) in a Xenograft Treatment model using Huh-7-hDlk cells.
  • C represents the result of evaluating the antitumor activity of D 2-14 in a separate independent experiment. * P ⁇ 0.01 (by Student's-t-test)
  • Figure 3 shows the Xenograft Treatment model using Huh-7-hDlk cells.
  • Tumor volume is expressed as mean soil standard error, and an asterisk indicates the result of a significant difference test (* P ⁇ 0.01, ** P ⁇ 0.05 by Student's-t-test).
  • FIG 4 shows the antitumor activity of the anti-hDlk-1 monoclonal antibody (clone 2-13) in the Xenograft Treatment model using the hDlk-1-expressing colon cancer cell line (SW480-hDlk cells).
  • SW480-hDlk cells were transplanted subcutaneously into nude mice to establish a colon cancer tissue.
  • Antibody (20 mg kg body weight) was intraperitoneally administered at the time indicated by the arrow. Tumor volume was expressed as mean soil standard error (* P ⁇ 0.01, ** P ⁇ 0.05 by Student's t-test)
  • FIG. 5 is a view showing the reactivity of anti-hDlk-1 monoclonal antibody using HEK293-hDlk cells by flow cytometry. The number shown above each histogram indicates the clone number. Black is the isotype control antibody. The black line is the anti-hDlk-1 monoclonal antibody.
  • FIG. 8 shows the results of the epitope analysis of clone D 2-14.
  • Figure 9 shows the results of the epitope analysis of clones DI-6, BA-1-3D and 2-13.
  • A The hDlk-1 gene mutant described is transiently introduced into COS-7 cells by lipofection and subjected to FACS analysis 24-72 hours later. The part to which the gate is applied indicates each mutant-expressing cell recognized by each clone.
  • B Photograph of a COS-7 cell smear that expressed EGF (1-2) immunostained with clones Dl_6, BA-1-3D, and 2-13. The brown-browned area indicated by the arrow indicates the expression of EGF (1-2).
  • FIG. 10 shows the results of epitope analysis of clone M3-1 by FACS.
  • FIG. 6 is a diagram showing the FACS analysis 24 to 72 hours after transient introduction of the described hDlk-1 gene mutant into COS-7 cells using lipofussion. The gated portion indicates each mutant-expressing cell recognized by D2-14.
  • FIG. 11 shows the analysis results of internalization activity after antigen binding of anti-hDlk-1 monoclonal antibody.
  • HEK293-hDlk cells were reacted with anti-hDlk-1 monoclonal antibodies (clone M3-1 M1-290 and M3-4) (4 ° C, 20 min), washed twice with PBS, and then at 37 ° C. Incubated for the time indicated. Thereafter, it was reacted with PE-labeled anti-mouse IgG, and FACS analysis was performed. The value was expressed as a relative value when the average fluorescence intensity was taken as 100% without incubation (0 min).
  • FITC-labeled clone M3-1 (FITC-M3-1) was reacted with HEK293-hDlk cells (4 ° C, 20 minutes), washed twice with PBS, and incubated at 37 ° C for 120 minutes. It is a figure showing the change of the average fluorescence intensity at the time.
  • the black column showed the change in average fluorescence intensity when reacted with PE-labeled anti-mouse IgG after reacting unlabeled M3-1 and cells in the same manner as in A, followed by incubation at 37 ° C for 120 minutes.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of internalization activity after antigen binding of a rhodamine-labeled anti-hDlk-1 monoclonal antibody.
  • Rho-M3_l rhodamine-labeled M3-l
  • Rho-M3-l B
  • Rho DI-1 C
  • Rho-Ml-290 D
  • Rho_M3-4 E
  • FIG. 13 shows the cytotoxic activity of anti-hDlk-1 monoclonal antibody conjugated with saporin against Huh-7-hDlk cells and SK-N-F1 cells.
  • FIG. 7 is a graph showing A: change in body weight of each mouse after administration, and B: survival rate of mice when (body weight) is administered. The value was expressed as a mean value standard deviation. The arrow indicates the time of antibody administration.
  • FIG. The arrow indicates the time of antibody administration. Values were expressed as mean soil standard deviation (* P ⁇ 0.01, ** P ⁇ 0.05 by Student's t-test).
  • C, D: PBS (N: 4) and cisbratin ( ⁇ : N 4) intraperitoneally (5 (mg / kg body weight) shows tumor growth inhibitory effect (C) and body weight change (D).
  • the arrow indicates the time of antibody administration, and the value is expressed as a mean soil standard deviation (* P ⁇ 0.01, ** P ⁇ 0.05 by Student's t-test).
  • Fig. 17 is a photograph showing a typical example of human colon cancer tissue array (Cybrdi, CC05-01-001) immunostained with anti-hDlk-1 antibody.
  • the brown part shows the cancer tissue stained with anti-hDlk-1 antibody.
  • hDlk-1 negative refers to a section where no stained area was observed, as shown in section No. 48 (69-year-old male, adenocarcinoma, Grade III).
  • No.19 shows very strong staining and is equivalent to No.19 Sections exhibiting the above-mentioned staining ability were regarded as positive for hDlk-1.
  • No. 25 75-year-old male, acupuncture, Grade II
  • hDlk-1 was positive
  • a section with weak staining was regarded as hDlk-1 weakly positive.
  • Fig. 18 is a photograph showing a typical example of a human breast cancer tissue array (Cybrdi, CC08-02-002) immunostained with anti-hDlk-1 antibody.
  • the brown part shows cancer tissue stained with anti-hDlk-1 antibody.
  • the upper part of the photograph is a photograph of normal breast tissue contained in the tissue array stained with anti-hDlk-1 antibody. Left: No.07 (68-year-old female, normal breast duct; hDlk-1 negative), Right: No.Ol (43-year-old female, normal mammary lobule; hDlk-1 weakly positive). Arrows indicate hDlk-1 weakly positive sites.
  • the lower row shows photographs of patients with invasive ductal carcinoma. Left: No.08 (45-year-old woman, Grade II; hDlk-1 negative), Center: No.56 (28-year-old woman, Grade II; slightly weaker hDlk-1), Right: No.20 (59-year-old woman, Grade II; hDlk-1 strong positive).
  • FIG. 19 shows the dose-dependent antitumor activity of clone DI-2-14 in Huh-7-dlk cell Xenograft treatment model.
  • FIG. 20 shows the dose-dependent antitumor activity of clone DI-2-14 in SK-N-F1 cell Xenograft treatment model.
  • Tumor growth after the start of antibody administration was expressed as mean standard error (* P ⁇ 0.01, ** P ⁇ 0.05 by Student's t-test).
  • B A graph showing the weight of the cancer tissue excised on the 23rd day (Day 23) after antibody administration.
  • FIG. 21 shows the cDNA base sequence (SEQ ID NO: 2 2) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2 3) of clone DI-2-14 H chain (heavy chain) variable region (VH). Signal peptides are shown in italics.
  • the double-underlined glutamic acid (E) indicates the N-terminal amino acid residue of the mature peptide.
  • CDR sequences (underlined) were as defined by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, 1991).
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of clone DI-2-14 VH are shown in SEQ ID NOs: 30 to 32, respectively.
  • Fig. 2 2 shows the clone DI-2-14 L chain (light chain) variable region (VL (n 1 ⁇ ⁇ ⁇ as ss, column number 2 4) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 25)
  • Signal peptide is shown in italics
  • Double-underlined aspartic acid (D) indicates the N-terminal amino acid residue of the mature peptide CDR sequence (underlined) is Kabat et al. 1991; the above-mentioned definition)
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 of clone DI-2-14 VL are shown in SEQ ID NOs: 33 to 35, respectively.
  • FIG. 23 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 26) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 27) of clone DI-2-14 VH gene.
  • a Spel site is added to the 5 'end and a Hindlll site is added to the 3' end (underlined respectively).
  • the base sequence indicated in italic letters indicates the sequence corresponding to the intron.
  • FIG. 24 shows the base sequence (SEQ ID NO: 28) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 29) of clone DI-2-14 VL gene.
  • a Nhel site is added to the 5 'end and an EcoRI site is added to the 3' end (each underlined).
  • the base sequence shown in italic letters indicates the sequence corresponding to the intron.
  • FIG. 25 is a schematic diagram of the chimeric D 2-14 gene expression vector (pChDI-2-14).
  • the vectors are clockwise from the Sail site, the human cytomegalovirus (CMV) major immediate early promoter, and the enhancer for transcription initiation of the antibody heavy chain gene. Contains heavy chain translation units starting with.
  • the CMV region then consists of the VH exon, the human ⁇ 1 heavy chain constant region (including the CH1, hinge region, CH2 and CH3 exons via the intron), and the polymorphism for mRNA processing following CH3. Continues to site A.
  • the heavy chain gene sequence is a light chain translation unit that begins with the CMV promoter and an enhancer, followed by a VL exon and a human c chain constant region exon (CL) with an intron upstream. It continues to the poly A signal of the / c gene.
  • the light chain gene is a segment containing the SV40 early promoter, the E.coh xanthine guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene, and the polyA site of SV40. It continues to.
  • the plasmid contains bacterial origins of replication and i3-lactama -It has a part of pUC19 plasmid containing the gene.
  • FIG. 26 is a diagram showing mouse DI-2-14 and chimera D 2-14 (ChD 2-14) developed by SDS-PAGE and stained with CBB. MW indicates a size marker, and arrows indicate the molecular weight (kD) of each band.
  • FIG. 27 shows the antigen binding activity of DI-2-14 and ChDI-2-14 by purified FA-1 (hDlk l extracellular region) solid-phase ELISA.
  • ⁇ represents a mouse IgGl antibody (Clone D 2-14) or a chimeric antibody (ChDI-2-14).
  • FIG. 28 shows the reactivity of DI-2-14 and ChD 2-14 using flow cytometry using HEK293-hDlk cells.
  • the black histograms are isotype control antibodies, and the black (white) histograms are DI-2-14 and ChDI-2-14, respectively.
  • Fig. 29 is a flow cytometric analysis of cell surface Dlk-1 expression in a human hepatoma cell line.
  • the blue line is mouse IgG1 and the red line is anti-human Dlk-1 antibody, and the histogram is shown when each cell is stained.
  • FIG. 30 shows the analysis of cell surface Dlk-1 expression in human breast cancer cell lines by flow cytometry.
  • the blue line is mouse IgG1 and the red line is anti-human Dlk-1 antibody, and the histogram is shown when each cell is stained.
  • Figure 31 shows the flow cytometric analysis of cell surface Dlk-1 expression in a human leukemia cell line.
  • the blue line is mouse IgG1 and the red line is anti-human Dlk-1 antibody, and the histogram is shown when each cell is stained.
  • FIG. 32 is a diagram showing immunohistochemical staining of Flk-1 / VEGF-R2 in cancer tissue excised from Huh-7-dlk cell Xenograft treatment model.
  • A Photographs of freshly frozen sections of cancer tissue collected (extracted) from mouse IgG administration group (control group) and clone DI-2-14 administration group, respectively, immunostained with anti-mouse Flk-1 / VEGF-R2 antibody Yes (objective 200x).
  • object 200x the point indicated by an arrowhead ( ⁇ ) indicates Flk-1 / VEGF-R2 positive tumor vascular endothelial cells.
  • Fig. 33 shows the expression of Flk-1 / VEGF-R2 gene in cancer tissue excised from Huh-7-dlk cell Xenograft treatment model.
  • RNA was extracted with Trizol reagent, and then 1st strand cDNA was synthesized.
  • 1st strand cDNA of No. 1 as a saddle type, an electrophoretic image confirming gene expression of mouse Flk-l / VEGF-R2 (mFlk-l) and mouse / human GAPDH (GAPDH) by PCR (30 cycles) was used.
  • FIG. The lower graph is a graph showing the ratio (mFlk-1 / GAPDH) of the amplified product band obtained by PCR of mFlk-1 and GAPDH as determined by NIH image.
  • human Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila); hDlk-1) is a one-transmembrane type 1 membrane protein with a total length of 383 amino acid residues and is located in the extracellular region. Has 6 EGF-like motifs. It is known that the hDlk-1 gene and its gene product are expressed at high frequency in various cancers and tumor cells. In general, since it is difficult to produce and acquire antibodies that exhibit antitumor activity in vivo, even if anti-hDlk-1 monoclonal antibodies are produced, they have antitumor activity in vitro, but ⁇ ⁇ o Often does not show the same activity.
  • the inventor then developed an anti-iDlk-1 antibody that can kill hDlk-1 expressing cancer cells or inhibit tumor growth at the individual level, ie, anti-hDlk-1 having antitumor activity in vivo.
  • About 100 new anti-hDlk-1 monoclonal antibodies were produced for the purpose of producing antibodies.
  • various cancer cell lines were transplanted subcutaneously into nude mice, and the tumor-bearing mice established were evaluated for in vivo efficacy (antitumor activity).
  • we succeeded in obtaining multiple clones showing remarkable tumor growth inhibitory activity (clone names: DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6, M3-1).
  • the present inventor has also found an antibody having excellent ability to move into cells expressing hDlk-1 (internalization activity) among the above-described anti-hDlk-1 antibodies.
  • An antibody-drug complex containing a compound having activity and cell killing activity was prepared. This complex, as a so-called immunoconjugate, has an excellent ability to deliver a drug into a target tumor cell.
  • the present inventor has found that the use of the above-described anti-hDlk-1 antibody or antibody-drug complex having antitumor activity is useful for the treatment of various tumors or the diagnosis and detection of tumors.
  • a polypeptide or peptide (also simply referred to as a peptide) containing at least a part (all or a part) of the amino acid sequence of hDlk-1 can be used.
  • the extracellular region of hDlk-1 Peptides containing at least part (all or part) of the amino acid sequence of FA-1) can be used.
  • the extracellular region of hDlk-1 refers to a region containing six EGF-like motifs (EGF-l to EGF-6) as described above, the 26th to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a region containing the 244th amino acid preferably a region consisting of amino acids from the 24th to the 248th to 285th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (approximately 225 to 262 amino acid residues) Say that.
  • the above-mentioned “at least part of the amino acid sequence” of the peptide used for the antigen is not particularly limited in length, and includes, for example, one or more of six EGF-like motifs A region is preferred. More preferably, for example, a region containing EGF-1 and EGF-2 (that is, a region consisting of the 26th to 85th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2), EGF-3 and EGF-4 (Ie, a region consisting of amino acids 92 to 167 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2), and a region containing EGF-4, EGF-5, and EGF-6 (ie The region consisting of the 131st to 244th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the method for producing a peptide as an antigen may be chemical synthesis or synthesis by genetic engineering techniques using E. coli or the like, and methods well known to those skilled in the art can be used.
  • a peptide is chemically synthesized, it can be synthesized by a well-known method of peptide synthesis.
  • the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method are suitable for the synthesis.
  • Commercially available peptide synthesizers for example, Shimadzu Corporation; manufactured by ⁇ :
  • PSSM-8 etc. may be used.
  • DNA encoding the peptide is designed and synthesized.
  • the design and synthesis can be performed by PCR using a primer designed to synthesize a desired DNA region using, for example, a vector containing the full-length hDlk-1 gene as a cage.
  • a recombinant vector for protein expression is obtained by ligating the DNA to an appropriate vector, and the recombinant vector is introduced into the host so that the target gene can be expressed.
  • a phage or plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used.
  • animal virus and insect virus vectors can be used.
  • purified DNA is cleaved with appropriate restriction enzymes and inserted into restriction vector sites of appropriate vector DNA.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene.
  • bacteria E. coli, Bacillus subtilis, etc.
  • yeast animal cells
  • COS cells COS cells, CHO cells, etc.
  • Mammals such as goats can also be used as hosts. Methods for introducing a recombinant vector into a host are known.
  • “Culture” means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells, cultured cells, or crushed materials thereof.
  • the peptide is extracted by disrupting the cells or cells.
  • the target peptide is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like.
  • general biochemical methods used for peptide isolation and purification such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in combination as appropriate, The desired peptide can be isolated and purified.
  • a peptide serving as an antigen can also be obtained by translation using a cell-free synthesis system.
  • RNA into a cage two methods can be used: a method of making RNA into a cage and a method of making DNA into a cage (transcription and translation).
  • a commercially available system such as Express way TM system (Invitrogen), PURESYSTEM (registered trademark; Post Genome Laboratories), TNT system (registered trademark; Promega) and the like can be used.
  • Peptides obtained as described above can also bind to appropriate carrier proteins such as bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemosyanine (KLH), human thyroglobulin, and chicken gamma glopurin. is there.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH keyhole limpet hemosyanine
  • human thyroglobulin and chicken gamma glopurin. is there.
  • the antigen may also be a peptide comprising the amino acid sequence of hDlk-1 (SEQ ID NO: 2) or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial partition sequence described above.
  • one or more (preferably 1 or several (eg 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids of the amino acid sequence of hDlk-1 or its partial partition sequence are deleted.
  • 1 or more (preferably 1 or several (for example, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids are substituted with other amino acids, or Use one or more (preferably one or several '(for example, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acid sequences to which other amino acids are added. You can also.
  • examples of the gene to be introduced into cells and the like include a gene encoding an hDlk-1 dump protein or a partial fragment thereof, or a mutant protein or fragment thereof.
  • a gene for example, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof can be used.
  • a base sequence encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has hDlk-1 activity is also possible to use a partial sequence thereof.
  • “Stringent conditions” are the conditions for washing after hybridization, and the buffer salt (sodium) concentration is 10 to 500 mM, and the temperature is 42 ° C. -72 ° C, preferably the salt concentration is 50-300 mM and the temperature is 55-68. The condition in C.
  • a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as the GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen) is used, for example, by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method.
  • a site-directed mutagenesis method such as the GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen) is used, for example, by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method.
  • TaKaRa Site Directea Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan- Super
  • the prepared antigen is administered to a mammal for immunization.
  • Mammals are not particularly limited, and examples include rats, mice, and rabbits, among which mice are preferred.
  • the dose of the antigen per animal can be appropriately set depending on the presence or absence of an adjuvant.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Aluminum hydroxide adjuvant examples include aluminum hydroxide adjuvant.
  • Immunization can be performed mainly by injecting intravenously, footpads, subcutaneously, intraperitoneally, and the like. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 3 times at intervals of several days to several weeks, preferably at one week intervals.
  • antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA or EIA), radioimmunoassay (RIA), etc., and blood is collected on the day when the desired antibody titer is shown.
  • Antiserum can be obtained.
  • ELISA or EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and affinity chromatography is appropriately selected. Or by combining them. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by ELISA.
  • the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is not limited, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the prepared antigen is administered to mammals such as rats, mice and rabbits for immunization.
  • the dose of the antigen per animal can be appropriately set depending on the presence or absence of an adjuvant.
  • the adjuvant is the same as described above.
  • the immunization technique is the same as described above.
  • antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the final immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, among which lymph node cells and spleen cells are preferred.
  • Hybridoma antibody-producing cell line
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • myeloma cells examples include P3-X63-Ag8.653, P3-X63_Ag8 (X63),
  • mice myeloma cell lines such as P3-X63-Ag8.Ul (P3Ul), P3 / NS I / l-Ag4-l (NSl), and Sp2 / 0-Agl4 (Sp2 / 0).
  • P3Ul P3-X63-Ag8.Ul
  • NSl P3 / NS I / l-Ag4-l
  • Sp2 / 0-Agl4 Sp2 / 0-Agl4
  • the myeloma cells and the antibody-producing cells are fused.
  • Cell fusion is performed in animal cell media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media, and 1 ⁇ 10 6 to 1 xlO 7 ZmL antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 xlO 6 ZmL. Mix with myeloma cells.
  • the cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is not limited, but is usually preferably 1: 1 to 10: 1, more preferably 3: 1. .
  • a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 daltons (D) can be used.
  • electrical stimulation eg It is also possible to fuse antibody-producing cells and myeloma cells using a commercially available cell fusion device utilizing a tropo- lation.
  • the cell suspension is appropriately diluted, for example, in RPMI-1640 medium containing urine fetal serum, and then seeded on a microtiter plate.
  • a selective medium is added to each tool, and then the appropriate selection is made. Cultivate by changing the medium. As a result, cells that grow from about 14 days after culturing in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening may be performed in accordance with an ordinary method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by ELISA, EIA, RIA or the like.
  • Cloning of fused cells can be performed by limiting dilution or the like.
  • An antibody showing strong reactivity to hDlk-1 is determined by flow cytometry, etc., and a hyperdoma that produces this antibody is selected and established as a clone.
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be employed as a method for culturing the established hybridoma and collecting the monoclonal antibody from the obtained culture.
  • “Cultivation” means growing hyperpridoma in a culture dish or culture bottle, or growing hyperidoma in the abdominal cavity of an animal as described below.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium or serum-free medium containing 10% ushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37 ° C, 5% C0 2
  • the concentration can be 7 to 14 days, and the antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • ascites formation about 7 xlO hybridomas are administered to the peritoneal cavity of mammals derived from myeloma cells and grafted animals, and a large amount of hybridomas are proliferated. And it is preferable to collect ascites after 2 to 3 weeks.
  • the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is an antibody having antitumor activity in vivo.
  • the “antitumor activity” means an activity of killing tumor cells (cancer cells) or an activity of inhibiting tumor growth.
  • examples of the antitumor activity preferably include tumor angiogenesis inhibitory activity.
  • the types of human tumors (tumor cells) to which the antibody of the present invention can exert antitumor activity include the above-mentioned known human tumors (specifically, solids) in which hDlk-1 expression has been confirmed.
  • cancer such as acupuncture endocrine tumor, neuroblastoma, glioma, type 1 neurofibromatosis, small cell lung cancer, liver cancer, kidney cancer and ovarium cancer, for blood cancer, myelodysplastic syndrome and acute Myeloid leukemia, etc.
  • human colon cancer and human breast cancer for which the present inventors have newly confirmed the expression of hDlk-1 are mentioned.
  • colorectal cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neuroblastoma are particularly preferred.
  • Confirmation of the antitumor activity in vivo can be performed, for example, by using a tumor-bearing mouse in which a desired tumor cell is transplanted subcutaneously into a mouse and administering the antibody obtained as described above to this mouse.
  • the antibody may be administered immediately after tumor cell transplantation (Prevention model) or after confirming that the tumor has reached a predetermined volume for transplantation (Treatment model).
  • the administration method is not limited, but can be, for example, once every 3 days, 20 mg / kg body weight, intraperitoneal administration.
  • an anti-hDlk-1 antibody having antitumor activity in vivo for example, an anti-hDlk-1 monoclonal antibody produced by a hybridoma whose accession number is FERM BP-10707 (clone name: M3- 1) Produced by an anti-hDlk-1 monoclonal antibody (clone name: D 2-14) produced by a hybridoma whose accession number is FERM BP-10899 and a hybridoma whose accession number is FERM BP-10900
  • Preferred examples include anti-hDlk-1 monoclonal antibody (clone name: DI-6).
  • an anti-hDlk-1 monoclonal antibody having a clone name of DI-2-14 is also preferable
  • the hybridoma whose accession number is FERM BP-10707 is ⁇ Mouse_ Mouse hybridoma: M3 1J and dated 18 October 2006
  • Examples of the anti-hDlk-1 antibody of the present invention include, for example, those in which the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the H chain V region are respectively the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30 to 32, Preferred examples include those in which the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the L chain V region are the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33 to 35, respectively.
  • the H chain V region is preferably composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and the L chain V region is preferably composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, for example.
  • examples of the anti-hDlk-1 antibody of the present invention include a site to which a monoclonal antibody produced by a hybridoma whose accession number is FERM BP-10707, FERM BP-10899, or FERM BP-10900 binds (recognizes).
  • An anti-hDlk-1 antibody that binds to is also preferred.
  • the epitope (antigenic determinant) of the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is the antigen of hDlk-1 Although it is not particularly limited as long as it is at least a part, for example, a region consisting of the second 6th to 85th amino acids in the amino acid sequence of hDlk-1 represented by SEQ ID NO: 1 (EGF- l ⁇ EGF-2 area), 9th 2nd ⁇ 16th 7th amino acid area (hDlk-1 containing EGF-3 ⁇ EGF-4 area), or 1 3rd 1st It is preferable that at least a part of the region consisting of the 244th amino acid (the region containing EGF-4 to EGF-6 of hDlk-1).
  • the region containing EGF-4 to EGF-6 and the region containing EGF-4 to EGF-6 of hDlk-1 are more preferred, and the 92nd to 120th amino acids are particularly preferred. It is a region consisting of (region containing EGF-3 of hDlk-1).
  • the anti-hDlk-1 antibody that recognizes the region (binding to the region) has high internalization activity into tumor cells, for example, and is extremely useful for applications such as immunoconjugates described later.
  • One preferred embodiment of the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is a recombinant antibody.
  • the recombinant antibody include, but are not limited to, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody.
  • a chimeric antibody ie, a human chimeric antibody
  • a human chimeric antibody is an antibody in which the variable region of a mouse-derived antibody is linked (conjugated) to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
  • the H chain V region is preferably composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, for example, and the L chain V region is represented by SEQ ID NO: 25, for example. Those having an amino acid sequence are preferred.
  • CDR complementarity-determining region
  • FR framework region
  • CDR transplantation CDR transplantation
  • CDR sequences derived from mice that can be used include, but are not limited to, for example, the CDRs 1 to 3 of the H chain V region (in order), the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 30 to 32 is the L chain.
  • Preferred examples of the V region CDR1 to CDR3 include the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 33 to 35 (in that order).
  • the human antibody (complete human antibody) generally has the same structure as the human antibody in the hypervariable region, which is the antigen binding site of the V region, the rest of the V region, and the constant region. It is what you have. However, the hypervariable site may be derived from another animal. Techniques for producing human antibodies are also known, and methods for producing gene sequences common to humans by genetic engineering techniques have been established.
  • the human antibody can be obtained, for example, by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the H chain and L chain genes of the human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977 ) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et.al., Nuc.
  • the chimeric antibody, human antibody, and human antibody are sugar chains in which the N-glycoside-bonded complex sugar chain in the antibody Fc region does not have fucose bound to N-acetyldecarcosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • the Fc region of the antibody molecule is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not conjugated to the 6-position of N-acetylcolcamine at the reducing end of the N-daricoside-linked complex type sugar chain.
  • Consisting of genetically engineered antibody molecules An antibody is mentioned. With such an antibody, ADCC activity can be dramatically improved. This point (characteristics of the N-glycoside-linked complex sugar chain in the antibody Fc region) is also preferable for the polyclonal antibody and the monoclonal antibody described above.
  • a fragment of the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is also included in the antibody of the present invention.
  • the antibody fragment of the present invention has a binding activity against hDlk-1, and has an antitumor activity in vivo.
  • the antibody fragment means a partial region of an anti-hDlk-1 polyclonal antibody or anti-iDlk-1 monoclonal antibody (ie, an antibody fragment derived from the anti-hDlk-1 antibody of the present invention), for example, Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fv (variable fragment of antibody), single chain antibody (H chain, L chain, H chain V region, L chain V region, etc.), scFv, diabody (scFv Dimer), dsFv (disulfide stabilized V region), and complementarity determining region Examples include peptides that contain at least part of the determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • Fab is a fragment obtained by treating antibody molecules with proteolytic enzyme papain. About half of the N chain of the H chain and the entire L chain are linked by disulfide bonds. Antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000. It is an antibody fragment having
  • DNA encoding the antibody Fab is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to be expressed to produce Fab. You can also.
  • F (ab ') 2 is an antigen with a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than the fragment obtained by treating antibody molecules with the proteolytic enzyme pepsin, where the Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region.
  • An antibody fragment having binding activity It can also be prepared by linking a Fab described later with a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab).
  • Fab ' can also be produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P that consists of one H chain V region (VH) and one L chain V region (VL) linked using an appropriate peptide linker (P).
  • -VH polypeptide which is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • scFv acquires cDNA that encodes antibody VH and VL, constructs DNA that encodes scFv, and inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector.
  • the vector can be expressed and produced by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen-binding activity can be the same, or one can be a different antigen-binding activity.
  • the diabody obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of P is 8 residues or less, and uses the DNA for prokaryotes. It can be produced by inserting into an expression vector or an eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • dsFv obtains cDNA encoding antibody VH and VL, constructs DNA encoding dsFv, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector Can be expressed by introducing it into prokaryotes or eukaryotes.
  • the peptide containing CDR comprises at least one region of VH or VL CDR (CDR1-3).
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be bound directly or via an appropriate peptide linker.
  • a peptide containing CDR constructs DNA encoding antibody VH and VL CDRs, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and inserts the expression vector into prokaryotic or It can be expressed and introduced by introduction into eukaryotes. Also,
  • Peptides containing CDRs can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the antibody fragment of the present invention includes an antibody Fc region in which the N-glycoside-bonded complex type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylcylcosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • an antibody fragment containing the above-mentioned antibody fragment and an N-glycoside-bonded complex type sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyldylcosamine at the reducing end of the sugar chain It may be a fusion protein with part or all of the Fc region. Such an antibody fragment is preferable because ADCC activity can be dramatically improved.
  • antibody fragment of the present invention include, but are not limited to, those containing at least a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30 to 32 (H chain V region CDR1 to 3). Specific examples include those containing the amino acid sequence (H chain V region) represented by SEQ ID NO: 23. Examples of the antibody fragment include those containing at least a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 33 to 35 (L chain V region CDR1 to 3). Specifically, SEQ ID NO: 25 And those containing the amino acid sequence shown in (L chain V region).
  • a product obtained by preparing each of the antibody molecule and a compound having antitumor activity and / or cell killing activity in advance and then combining them is generally called an immunoconjugate.
  • an immunoconjugate A product obtained by preparing each of the antibody molecule and a compound having antitumor activity and / or cell killing activity in advance and then combining them is generally called an immunoconjugate.
  • a protein toxin as a compound having antitumor activity and / or cell killing activity is linked to an antibody gene on the gene, and one protein ( What is expressed as a fusion protein) is generally referred to as an immunotoxin.
  • Examples of the compound having antitumor activity include doxorubicin, calicheamicin, mitomycin C, Auristatin E and the like.
  • Examples of the compound having cell killing activity include saborin, ricin, Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin, etc. Among them, saborin and Pseudomonas aeruginosa exotoxin are preferably used.
  • a method for producing an antibody-drug complex is not limited, and examples thereof include a method of coupling an antibody and a drug by disulfide bond or hydrazone bond.
  • the anti-hDlk-1 antibody of the present invention is excellent in the activity of internalization into target tumor cells that express hDlk-1. Therefore, by compounding compounds having antitumor activity and / or cell killing activity in advance, these compounds can directly and highly selectively act on tumor cysts.
  • the antibody-drug complex of the present invention is extremely excellent in drug delivery ability to target tumor cells.
  • the intracellularization activity can be evaluated by fluorescently labeling the antibody with rhodamine or the like, and observing the migration behavior into the cell and the localization of the antibody using a fluorescence microscope or the like. .
  • an antibody fragment-drug complex in which the above-mentioned antibody fragment is used in place of the antibody in the antibody-drug complex can also be provided.
  • the description of the antibody-drug complex described above can be applied as appropriate.
  • an antibody fragment-drug complex is also included in the antibody-drug complex of the present invention.
  • the anti-hDlk-1 antibody and antibody-drug complex of the present invention are useful as an active ingredient contained in a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is used as an easy composition for tumor treatment and / or diagnosis.
  • the anti-hDlk-1 antibody of the present invention and the antibody-drug complex containing the antibody have tumor angiogenesis inhibitory activity as anti-tumor activity, and therefore can be used for tumor therapy.
  • the anti-hDlk-1 antibody and antibody-drug complex of the present invention are useful as active ingredients contained in tumor therapeutic agents, tumor angiogenesis inhibitors, and tumor diagnostic agents.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the anti-hDlk-1 antibody and Z or antibody-drug complex of the present invention as an active ingredient, and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. preferable.
  • the diseases (tumors) to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include the above-mentioned known human tumors in which the expression of hDlk-1 has been confirmed, as well as the expression of hDlk-1 by the present inventors.
  • Examples include confirmed human colon cancer and human breast cancer. Of these, one or more of colorectal cancer, human breast cancer, human liver cancer and human neurocytoma are particularly preferred. These diseases may be singly or two or more of them may occur together.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, taste masks. Agents, solubilizers or other additives.
  • pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods. In the case of an injection, it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.
  • a colloid dispersion system can be used in addition to the above.
  • the colloid dispersion system is expected to increase the in vivo stability of the compound (antibody fragment) and to efficiently transport the compound to specific organs, tissues or cells.
  • the colloidal dispersion system is not particularly limited as long as it is normally used, but polyethylene glycol, polymer composite, polymer aggregate, nanocapsule, microsphere, bead, And oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and dispersions based on lipids that encapsulate liposomes.
  • the compound is efficiently used in specific organs, tissues or cells.
  • Multiple ribosomes, artificial membrane vesicles Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. Et Biop ys. Acta, 1990, 1029, 91 Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the anti-hDlk-1 antibody and antibody of the present invention contained in the pharmaceutical composition It depends on the type of complex. Usually, it can be administered in the range of 600 / g to 6000mg per adult, but it is not limited to this range.
  • human patients when administered by injection, can be administered in an amount of 100 x g to 100 mg per kg body weight in a single dose, once to several times per day on average.
  • the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection, and preferably intravenous injection.
  • injections can be prepared as non-aqueous diluents (eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions, or emulsions.
  • Such an injection can be sterilized by filtration sterilization using a filter, blending of a bactericidal agent, or the like.
  • An injection can be produced in a form prepared at the time of use. That is, it can be made into a sterile solid composition by lyophilization or the like and dissolved in sterile water for injection or other solvent before use.
  • the present invention also provides use of the anti-hDlk-1 antibody and / or antibody-drug complex of the present invention for producing a medicament (drug) for treating and / or diagnosing a tumor.
  • the present invention also provides the anti-hDlk-1 antibody and / or antibody-drug complex of the present invention for treating and / or diagnosing a tumor.
  • the present invention provides a method for treating and / or diagnosing a tumor characterized in that the anti-hDlk-1 antibody and Z or antibody-drug complex of the present invention is used (ie, administered to a patient). Yes, before treatment and Z or diagnosis of tumor
  • the anti-hDlk-1 antibody and / or antibody-drug complex of the present invention is also provided.
  • the tumor detection method of the present invention comprises reacting the anti-hDlk-1 antibody of the present invention with a sample collected from a living body (hereinafter referred to as a biological sample), and detecting the signal of the reacted antibody. It is a method to do.
  • hDlk-1 has been confirmed to be specifically expressed in various tumor cells
  • hDlk-l particularly free hDlk-1 (the extracellular region of hDlk-1)
  • hDlk-l is not available in various tumor cells. It can be used as a marker. Of these, it is preferably used as a marker for human colon cancer, human breast cancer and human liver cancer.
  • a tumor can be detected by reacting the anti-hDlk-1 antibody of the present invention with a biological sample and detecting the signal of the reacted antibody.
  • the obtained antibody signal serves as an index of the amount of antigen in the biological sample (that is, the amount of hDlk-1 or the amount of free hDlk-1).
  • Tumor detection using the antibody of the present invention is performed by first binding a biological sample collected from a subject as a specimen, such as a tissue piece or blood to be examined, and the antibody of the present invention by an antigen antibody reaction. Let Then, based on the measurement result of the amount of bound antibody, the target antigen amount in the biological sample is measured.
  • the measurement may be performed according to a known immunological measurement method, for example, using an immunoprecipitation method, an immunoagglutination method, a label immunoassay method, an immunospecific suspension method, a Western plot method, a flow cytometry method, or the like. Can do.
  • the antibody signal may be represented by the amount of label directly detected using the labeled antibody, or may be relatively represented by using an antibody of known concentration or known antibody titer as a standard solution. That is, the standard solution and the specimen can be measured with a measuring meter, and the antibody signal in the biological sample can be relatively represented based on the value of the standard solution.
  • labeled immunoassay include ELISA, EI, RIA, and fluorescent immunoassay
  • FIA chemiluminescence immunoassay
  • Luminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay
  • the ELISA method is particularly preferable in terms of simplicity and high sensitivity.
  • the state of the tumor can be evaluated or diagnosed using the detection result obtained by the detection method as an index. For example, the detection result exceeds a predetermined reference value If the tumor is positive, and if it is positive, it is judged that there is a possibility that any tumor has developed, and the state of the tumor can be evaluated. it can.
  • the state of a tumor means the presence / absence or progression of a tumor, and includes the presence / absence of tumor development, progression, malignancy, presence / absence of metastasis, presence / absence of recurrence, and the like.
  • one tumor condition may be selected, or a combination of multiple tumor conditions may be selected.
  • the evaluation of the presence or absence of a tumor can be performed by determining whether or not the tumor is affected with a predetermined reference value as a boundary based on the obtained detection result.
  • Tumor malignancy is an indicator of how far the cancer has progressed, and it can be used to classify and evaluate the stage based on the detection results, It is also possible to classify and evaluate advanced cancer.
  • the detection result can be used as an index to evaluate early cancer or advanced cancer.
  • Tumor metastasis can be evaluated based on whether or not a neoplasm has appeared at a site distant from the position of the primary lesion, using the detection result as an index. Recurrence can be assessed by whether the detection result again exceeds a predetermined reference value after an intermittent period or remission.
  • the anti-hDlk-1 antibody of the present invention can be provided in the form of a tumor detection or diagnostic kit.
  • the kit of the present invention contains an antibody, but may additionally contain a labeling substance, or a solid phase reagent immobilizing the antibody or its label.
  • the antibody labeling substance means a substance labeled with an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, or the like.
  • the kit of the present invention includes other reagents for carrying out the detection of the present invention, for example, when the label is an enzyme label, an enzyme substrate (chromogenic substrate, etc.), an enzyme substrate solution It may contain an enzyme reaction stop solution, a sample diluent, or the like.
  • kits of the present invention can be effectively used for carrying out the detection method of the present invention and is extremely useful.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • SW480-hDlk cells human colon cancer-derived cell line SW480 (source: Institute for Molecular Cell Biology, University of Tokyo) was used as an expression vector containing the full-length hDlk-1 gene.
  • PcDNA-hdlk-Flag WO (See 2005/052156)
  • selection with the antibiotic G418 gene, GIBCO BRL
  • establishment of a cell line stably expressing hDlk-1 was used.
  • a mouthpiece PT ... 50 / iL
  • an EGF-like motif deletion mutant of hDlk-1 gene was prepared as follows.
  • primers were prepared to amplify the relevant region by PCR.
  • the prepared primer sequences are shown in Table 1 below.
  • the F primer is notl
  • the restriction enzyme digestion sequence by Xbal is not added to the R primer for amplifying EGF (4-6) and EGF (5-6) regions.
  • EGF (1-4) in the context column in Table 1 indicates the six EGF-like motifs (EGF-l to EGF-) present in the FA-1 region of hDlk-1. Of 6), it means the continuous region from EGF-1 to EGF-4.
  • reaction solution composition The upper part is the F primer and the lower part is the R primer.
  • PCR using the above primers was performed with the following reaction solution composition and reaction conditions. ⁇ Reaction solution composition>
  • Taq DNA polymerase 0.5 u L
  • PME18S_CFHX FXYDTM is an expression vector designed so that the target protein to be expressed has the signal sequence of His CD8a (GenBank Accession No. NM_001768) and His tag sequence at the N-terminus. (Source: Institute for Molecular Cell Biology, University of Tokyo)
  • hDlk-1-expressing cell lines ⁇ -293-hDlk cells, 7E2-C_hDlk cells
  • the FA-1 region of hDlk-1 prepared by the above method hFA-1
  • hDlk-1-expressing cell line, lxlO 7 cell, 1 ⁇ 1 protein is 20 ⁇ mixed with immune adjuvant (complete Freund adjuvant: Wako Pure Chemical Industries) or TiterMax Gold (Funakoshi Co., Ltd.)
  • Booster immunization was performed 3 days and 10 days after the initial immunization, and the day after the final immunization, both knee plaster lymph nodes were collected and lymphocytes were prepared.
  • a cell suspension using 5 ⁇ 10 6 cells of PBS was used for cell immunization, and 5 ⁇ l of PBS solution was used for protein antigen.
  • the day after the final immunization both plaster lymph nodes were collected and lymphocytes were prepared.
  • a cell suspension in PBS was used as the antigen.
  • the prepared lymphocytes and mouse myeloma cell line (P3-X63-Ag8.653) were mixed at a ratio of 3: 1 and cell fusion was performed by the polyethylene glycol method.
  • a specific monoclonal that recognizes the three-dimensional structure of hDlk-1 and inhibits its biophysiological activity was produced by using a method called DNA immunization.
  • the DNA immunization method the hDlk-1 gene incorporated in the introduced expression vector is expressed in the mouse body, so that the original three-dimensional structure and various post-translational modifications (such as sugar chain modification and disulfide crosslinking) are maintained. It is possible to present the antigen in the form of an antigen, which recognizes the original three-dimensional structure of hDlk-1, which is difficult when using a conventional denatured protein or synthetic peptide as an immunogen. An attempt was made to produce a specific monoclonal that inhibits the above.
  • the full length cDNA of hDlk-1 is integrated into a tagged mammalian expression vector.
  • the constructed gene construct was transiently introduced into mammalian cells. Introduced the mammalian cells cultured for 24 hours at C0 2 incubator, was used for FCM analysis. When FCM analysis is performed, the culture cells containing the transfected cells containing antibodies against the tags added to the above-described introduced genes are contained. Added to the nutrient solution and allowed to stand for 30 minutes. After that, a fluorescently labeled secondary antibody that specifically recognizes the tag was added to the solution and allowed to stand for 30 minutes before being used for FCM analysis. It was proved that the gene construct constructed in the present invention was expressed on the cell surface.
  • various gene constructs constructed as described above may be used alone or in combination to produce various genes. It was introduced into immunized animals by introduction (intramuscular injection, electroporation, gene gun) (performed for about 2 to 3 months).
  • the HEK293-hDlk cells described above were used for the analysis of sera collected from immunized animals. Serum collected from an animal immunized with the above-described transgene was added to a culture solution containing HEK293-hDlk cells and allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, a fluorescently labeled secondary antibody that specifically recognizes the immunoglobulin of the immunized animal was added to the solution and allowed to stand for 30 minutes before being used for FCM analysis.
  • hybridoma clones prepared by the above method were administered 3 x 10 6 intraperitoneally to BALB / c nude mice that had been administered (6 days ago) 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristan). Ascites was collected 2 weeks later. Furthermore, anti-hDlk-1 monoclonal antibodies produced by each of the high-pridoma clones can be purified from this ascites by affinity purification using force prillic acid precipitation and a protein G column (HiTrap protein G; GE Healthcare Bioscience). Antibody was obtained. Subsequent analysis was performed using this purified anti-hDlk-1 monoclonal antibody.
  • the antibody was labeled.
  • the antibody was labeled with biotin using the ECL Protein Biotinylation module (GE Healthcare Bioscience, RPN2202).
  • ECL Protein Biotinylation module GE Healthcare Bioscience, RPN2202.
  • EZ-Label TM Rhodamine Protein Labeling kit (Pierce, 53002) was used.
  • FITC labeling EZ-Label TM Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Protein Labeling kit (Pierce, 53004) was used according to the manual attached to each kit.
  • the 7E2-C (hdlk) strain was seeded in a 7.5 ⁇ 10 3 cell Z-well on a gelatin-coated 96-well culture plate (Coung) and cultured at 37 ° C. for 2 days. After washing with ice-cold PBS, it was fixed with 4% paraformaldehyde solution, treated with 0.2% Triton-X-100 (trade name) solution, and used as a cell ELISA plate. Thereafter, ELISA was performed according to a conventional method. Specifically, it is as follows.
  • horseradish peroxidase-streptavidin HRP; Vector Laboratory
  • HRP horseradish peroxidase-streptavidin
  • the cells were detached from the culture dish by trypsin treatment to prepare a cell suspension (cell density 5 ⁇ 10 6 ceUs / mL).
  • Anti-human Dlk monoclonal antibody 0.5 ⁇ g and cell suspension IOO JU L were reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • ELISA was used for the antigen affinity (Kd value) of the prepared anti-hDlk-1 monoclonal antibody. (Djavadi-Ohaniance L. et al U996 in In Antibody Engineering, Chapter 4, pp77-97. IRL Press, Oxford).
  • purified recombinant hFA-1 protein (l w g / mL) was added to a 96-well culture plate (coining) to immobilize the antigen (room temperature, 1 hour). Next, it was washed 3 times with PBS and blocked by adding 2% skim milk (PBS solution) (room temperature, 1 hour). After washing twice with PBS, the antigen solution (purified hFA-1 protein; 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM) and anti-hDlk-1 monoclonal antibody clones (0.5 nM) are mixed and equilibrated in advance. The antigen-antibody complex was added to the ELISA plate and allowed to react (room temperature, 1 hour).
  • HRP-labeled anti-mouse IgG final concentration l // g / mL
  • HRP-labeled anti-rat IgG final concentration 1 xg / mL
  • Classification was performed by epitope that recognizes about 100 kinds of anti-hDlk-1 monoclonal antibodies produced.
  • the expression vectors hdlk-EGF (l-3) / pME18S-CFHX, hdlk-EGF (3-4) / pME18S-CFHX, hdlk-EGF (4-6) / pME18S_CFHX were each introduced into COS-7 cells. 24-72 hours after gene transfer, cells were detached from the culture dish by trypsin treatment, and FACS analysis was performed to determine which EGF-like motif of each antibody clone recognized by hDlk-1.
  • the human cancer tissue array (Cybrdi, colorectal cancer tissue array Lot: CC05 01 001, breast cancer tissue array Lot: CC08 02-002) was deparaffinized and then in 10 mM citrate buffer (pH 6.0). Antigen activation treatment was performed using an autoclave (121 ° C, 5 minutes) and used for staining with an anti-hDlk-1 polyclonal antibody. After a color reaction using DAB (3,3'-diaminobenzidine) as a substrate, nuclear staining with hematoxylin was performed as a counterstain. Specifically, it was performed as follows.
  • Sections fixed in neutral formalin and embedded in paraffin were deparaffinized.
  • antigen activation treatment was performed using an autoclave U2r (J, 5 minutes) in a 10 mM sodium citrate solution.
  • it was treated with a solution of methanolic hydrogen peroxide to a final concentration of 0.3% for 20 minutes at room temperature to remove endogenous peroxidase activity.
  • the plate was washed twice with PBS for 5 minutes at room temperature, blocked with Block Ace Reagent (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) for 30 minutes, and the non-specific binding site in the tissue was blocked.
  • a hepatocarcinoma cell line (Huh-7-hDlk) expressing hDlk-1 is removed by trypsin treatment, a 6 ⁇ 10 7 cell / mL cell suspension is prepared with PBS, and an equal volume of Matrigel (BD Farmingen) ).
  • Six-week-old female nude mice (Balb / c, nu / nu) were injected with 100; u L (3 xlO 6 cell) subcutaneously in the right flank using a 26 G syringe.
  • mice were divided into groups and antibody administration (20 mg / kg body weight, intraperitoneal administration) was started. Thereafter, the same administration was performed once every 3 days.
  • Antitumor activity was evaluated by tumor formation frequency and tumor volume. The tumor volume was measured using the following formula.
  • Tumor volume (mm3) (minor axis) 2 X (major axis) X ⁇ / 6 (2) Treatment model
  • HDlk-1 expressing hepatoma cell line (Huh-7-hDlk) and hDlk-1 expressing colon cancer cell line (SW480-hDlk) are removed by trypsin treatment, and 6 X 10 7 ⁇ 10 X with PBS
  • a cell suspension of 10 7 cells / mL was prepared and mixed with an equal amount of Matrigel (BD Farmingen) on ice.
  • Sixty-week-old female nude mice (Balb / c, nu / nu) were injected 100 / L (3 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 cells) subcutaneously into the right flank using a 26 G syringe.
  • mice Ten to 14 days after cancer cell transplantation, mice whose tumor volume grew to 50 to 150 mm 3 (average value about 100 mm 3 ) were divided into groups, and the day of grouping was defined as the first day (Day 1). Antibody administration was started. The antibody was administered intraperitoneally once every 3 days (20 mg / kg body weight). Antitumor activity was assessed by measuring tumor volume. The significant difference test was performed by Student's-t test (Student's-t-test), and P ⁇ 0.05 or less was determined to be statistically significant.
  • the internalization activity taken up into the cell by endocytosis depends on the epitope recognized by the antibody.
  • the evaluation method by FACS analysis was evaluated by FACS analysis and observation with a fluorescence microscope.
  • FITC-labeled anti-hDlk-1 monoclonal antibody was reacted with HEK-293-hdlk cells in the same manner, washed twice with PBS, suspended in DMEM medium, and incubated at 37 ° C (120 minutes) To FACSCalibur (Becton Dickinson) More analyzed.
  • rhodamine-labeled anti-hDlk-1 monoclonal antibody (0.5 / ig) was added to HEK-293-hdlk cells (2 X 10 5 cells) and allowed to react (4 ° C, 20 min), and twice with PBS After washing, suspend in DMEM medium and incubate at 37 ° C (15 min, 30 min, 60 min, 120 min), then prepare a smear with a site spin (chandon) (800 rpm, 3 min) After mounting with a mounting solution (Vector Laboratories), the localization of the antigen-antibody complex was observed with a fluorescence microscope (Nikon; Eclipse E800).
  • Anti-hDlk-1 monoclonal antibody clone M3-1 (mouse IgGl) with high internalization activity after antigen binding, and clone M1-290 (mouse IgG2b) as a comparative control, and saporin, a plant protein toxin An Imno Conjugate (Advanced Targeting System, San Diego).
  • 1 5. Evaluation of drug efficacy of immunoconjugate using anti-hDlk-1 monoclonal antibody Cells were detached from the culture dish by trypsin treatment, and a cell suspension of 1 xlO 5 cell / mL in DMEM medium supplemented with 10% FBS. Adjusted.
  • I Takeno conjugate i.e. mouse IgG- Saborin (IgG-SAP), M3 -1-saporin (M3 + SAP) and Ml-290-saporin (Ml-290'SAP) were added. Added at 0.1, 1, 10, 100, and 1,000 ng / mL, respectively. After culturing for 48 to 72 hours, the absorbance was measured by the MTT method.
  • IgG-SAP mouse IgG- Saborin
  • M3 + SAP M3 -1-saporin
  • Ml-290'SAP Ml-290-saporin
  • the antitumor activity in vivo was evaluated using the above-mentioned tumor-bearing mouse using Huh-7-hDlk cells.
  • hDlk-1 is expressed on the surface of various cancer cells, and when the hDlk-1 gene is stably expressed in a human hepatoma cell line, the tumor growth rate is significantly accelerated when transplanted subcutaneously in nude mice. Therefore, the anti-hDlk-1 antibody is considered to be useful as a drug for cancer treatment (see WO 2005/052156). Since hDlk-1 itself has a known gene sequence and amino acid sequence, it is possible in principle to obtain monoclonal antibodies against hDlk-1 by known methods using synthetic peptides and purified proteins as immunogens. .
  • an antibody that shows activity as a cancer therapeutic agent that is, an anti-tumor activity at an individual level in vivo
  • an anti-tumor activity at an individual level in vivo depends on the type of antigen, expression level, protein structure, etc. Often unknown.
  • monoclonal antibodies that are said to be the therapeutic agents for diseases such as tumors (cancers) the majority of antibodies Does not show efficacy at the individual level.
  • Known anti-hDlk-1 monoclonal antibodies (clone 1C1, 4C4, 31C4) are known to kill human hepatoma cells in the presence of at least complement (see WO 2005/052156). However, the efficacy of ino was unknown.
  • C the anti-tumor activity of ⁇ ⁇ 'in the known 3 clones was evaluated using a hepatoma cell line (Huh-7-hDlk) expressing hDlk-1 subcutaneously in nude mice. Implantation of antibodies was started at the same time as transplantation, and the effect of tumor cells on the subcutaneous growth of nude mice and tumor growth were examined.
  • an anti-hDlk-1 monoclonal antibody In order for an anti-hDlk-1 monoclonal antibody to exert its efficacy as a cancer therapeutic antibody, it is very important to exert antitumor activity against established tumor tissues. In the above prevention model, it is possible to estimate the antitumor activity of antibodies to some extent by comparing the tumor formation rate, but there is great variation among individuals, and it is not possible to accurately evaluate antitumor activity. Can not.
  • Huh-7-hDlk cells were transplanted subcutaneously into nude mice, and the efficacy was evaluated in a treatment model in which antibody administration was started when the average tumor volume grew to 100 mm 3 .
  • antibodies for cancer treatment targeting hDlk-1 exhibit the activity of specifically killing tumor tissue expressing hDlk-1 or inhibiting tumor growth in the Xenograft Treatment model.
  • a newly prepared anti-hDlk-1 monoclonal antibody (about 100 clones) in the present invention was similarly evaluated in the Xenograft Treatment model of Huh-7-hDlk cells.
  • the majority of the clones like the three known clones, did not show efficacy in the Treatment model, but among them, the following clones showing remarkable tumor growth inhibitory activity, namely clones: DI-2-14, 2-13, BA-1-3D, DI-6 and M3-1 were obtained.
  • the excised tumor weight was also 0.58 ⁇ 0.07 (g) in the control group, while 0-15 ⁇ 0.04 (g) (P ⁇ 0.01 by Student's t-test) in the clone DI-2-14 administration group. ( Figure 2B).
  • the antibody administration was started. On the 14th day (Day 14) after the start of administration, the tumor volume in the control group was 733.37 ⁇ 244.86 mm 3 whereas the clone In the 14 administration group, the value was 148.83 ⁇ 32 ⁇ 65 mm 3 (P ⁇ 0.01 by Student's t-test).
  • the hybridoma that produces clone M3-1 is called “Mouse-Mouse hybridoma: M3-1J” and is dated October 18, 2006. Deposited at the Deposit Center (Corporate 6th, 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki 305-8566) (Accession Number: FERM BP-10707).
  • the hybridoma producing clone DI-6 was deposited with the center as “Mouse-Mouse hybridoma: M3 1 J” dated August 210, 2007 (accession number: FERM BP-10900). Table 3
  • Group N (number of individuals) Tumor volume (mm 3 ) Growth rate (times) Tumor weight (g) Mau TJgG
  • Anti-hDlk-1 monoclonal antibody (clone DI-2-14, 2-13, BA 1-3D, DL6 and And M3-1) antigen binding activity (FACS analysis using ⁇ -293-hDlk cells and calculation of dissociation constants by ELISA)
  • Anti-hDlk-1 monoclonal antibody which showed remarkable antitumor activity in the human cancer cell Xenograft model, was tested for its affinity with the antigen hDlk-1, ⁇ -293-hDlk cells ( Figure 5) and Huh-7.
  • FACS analysis using -hDlk cells showed that all clones recognized all cell lines and recognized the 3D structure of hDlk-1. Although no data is shown, none of the clones recognized any HEK293 and Huh-7 cells that did not express hDlk-1.
  • the affinity (dissociation constant) of these clones with the antigen was calculated by the ELISA method described above.
  • the Kd value of each clone was 9.26 X 10 9 (M) for clone DI-2-14, 6.28 X 10 " 9 (M) for clone M3-1, and 32.2 X 10 for clone BA- 1-3D.
  • 9 (M) clone DI-6 was 10.1 X 10 (M)
  • affinity for purified recombinant hFA-1 is not high, and Kd value should be calculated by the above method I could not.
  • hDlk (EGF l-2) -pME-CHFX, hDlk (EGF l-3) pME-CHFX, hDlk (EGF 3-4) -pME-CHFX, hDlk (EGF 4-6) -pME18_CHFX, and hDlk (EGF 5 6)
  • Each of the expression vectors of -pME18-CHFX (Fig. 7) was introduced into COS-7 cells, and each anti-hDlk-1 monoclonal antibody was converted to FA of hDlk-1 by FACS analysis and immunostaining of the site spin preparation. We examined which part of the region containing the 6 EGF-like motifs in the -1 region (extracellular region) was recognized.
  • EGF (1-3) and EGF (3-4) by FACS analysis and immunostaining.
  • the epitope recognized by clone DI-2-14 is the region containing the 3rd EGF-like motif (EGF-3) to the 4th EGF-like motif (EGF-4) of -hDlk-1. (Region consisting of amino acid No. 167), possibly EGF-3 (region consisting of amino acid No. 92-120 of hDlk-1).
  • the epitope recognized by these three clones is the region containing the first EGF-like motif (EGF-1) of hDlk-1 to the second EGF-like motif (EGF-2) (26th to the second of hDlk-1).
  • the 85th amino acid region and the region containing EGF-1 and EGF-2 of hDlk-1 is a particularly important domain in the function of hDlk-1. It was done.
  • clone M3-1 recognized EGF (l-4) and EGF (4-6), but not EGF (1-2), EGF (l-3) and EGF (3-4).
  • the epitope recognized by clone M3-1 is the region from the 4th EGF-like motif (EGF-4) to the 6th EGF-like motif (EGF-6) of hDlk-1 (from the 131st to the beginning of hDlk-1).
  • the region containing EGF-4, EGF-5 and EGF-6 of hDlk-1 is a particularly important domain in hDlk-1 function. It was shown.
  • Each clone of the prepared anti-hDlk-1 monoclonal antibody was classified by the recognized epitope, and the internalization activity after antigen recognition was examined for the clones belonging to each classified group.
  • each antibody was combined with HEK293_hDlk cells. After the reaction, it was incubated at 37 ° C, and then reacted with a PE-labeled anti-mouse antibody. As shown in Figure 11A, when the fluorescence intensity without incubation is 100%, clone M3-1 is significantly faster than the other clones, depending on the incubation time. Decreased. This result indicates that the antigen-antibody complex on the cell surface is reduced by being taken into the cell in a time-dependent manner after the antigen-antibody reaction.
  • the fluorescence intensity after each incubation time was as follows.
  • rhodamine-labeled antibody was reacted with HEK293-hDlk cells, washed with PBS, and incubated at 37 ° C in the same manner. Subsequently, smears were prepared using a site spin, and the localization of fluorescently labeled antibodies was observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in Fig. 12, localization to the cell membrane was observed without incubation. However, clones M3-1 and DI, which recognize EGF (4-6) by incubating at 37 ° C, were incorporated into the cells by endocytosis in just 15 minutes of incubation, and the vesicles Incorporated into the cells, dot-like intracellular localization was observed. On the other hand, in clones M1-290 and M3-4, although dot-like localization was observed, most were localized in the cell membrane (Fig. 12).
  • the effectiveness of the missile therapy using the immunoconjugate of the anti-hDlk-1 monoclonal antibody was compared with clone M3-1 with high internalization activity and clone M1-290 as a comparative control.
  • Combined immunoconjugates (M3-1-SAP, M1-290-SAP) were prepared and evaluated for their efficacy. Neither M3-1-SAP nor M1-290-SAP showed any toxicity to HEK293 cells that did not express hDlk-1.
  • M3-1-SAP as an immunoconjugate, ie, antitumor activity and side effects when administered to mice, was evaluated using the Xenograft model of Huh-7-hDlk cell. M1-290-SAP was used as a comparative control. The evaluation of anti-tumor activity is Similar to the above, the treatment was performed on the tumor volume, and the side effects were examined based on body recovery and mortality after administration.
  • ⁇ 3 ⁇ 1 SAP is Day 1: 21.2 ⁇ 1.36 (g), Day 4: 18.5 ⁇ 1.44 (g); “M1_290-SAP” is Day 1: 21 ⁇ 13 ⁇ 0 ⁇ 81 (g ), Day 4: 17 ⁇ 9 ⁇ 0 ⁇ 85 (g)).
  • M1-290-SAP which is not high in internalization activity, is strong.
  • 8 individuals 2 died on the 4th day (Day 4) and the remaining 6 on the 5th day (Day 5). As a result, all individuals died within 5 days from the start of administration (Fig. 14 B).
  • M3-1-SAP was locally administered to the tumor site (lmg / mL M3-1-SAP, 40 // L / tumor).
  • clone M3-1 (EGF (4-6) recognition antibody) with high internalization activity has fewer side effects when used as an immunoconjugate. And it was shown that antitumor activity is high.
  • hDlk-1 is expressed in neuroendocrine tumors, neuroblastomas, gliomas, type 1 neurofibromatosis, small cell lung cancer, liver cancer, kidney cancer and ovarian cancer in solid cancers It has been reported that in blood cancer, it is expressed in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia.
  • hDlk-1 To examine the expression of hDlk-1 in other cancer types, a commercially available human cancer tissue array was immunostained with an anti-hDlk-1 antibody and examined.
  • the colon cancer tissue array (Cybrdi, lot NO.CC05-01-001) was used for the positive rate of hDlk-1 in colorectal cancer.
  • Fig. 17 shows representative stained photographs. When 70 colon cancer tissues were examined, 12 out of 43 (27.9%) of Adenocarcinoma (adenocarcinoma) were strongly positive, 19 (44.2). %) Were weakly positive, and in all adenocarcinomas, 31 of 43 (72.1%) were hDlk-1 positive (see Table 4).
  • the breast cancer tissue array (Cybrdi, lot No. CC08-02-002) was used for the positive rate of hDlk-1 in breast cancer.
  • This tissue array consists of a total of 63 sections taken from 53 specimens, of which 17 specimens (17 sections) are Infiltrating duct carcinoma (invasive ductal carcinoma) and 2 specimens (2 sections) are intraductal carcinoma (milk).
  • Intraductal cancer) 34 specimens (44 sections) consist of normal tissues and non-cancerous tissues such as collagen fibers.
  • both colon cancer and breast cancer were found to have strong expression of hDlk-1 in about 30%.
  • the anti-hDlk-1 monoclonal antibody showed antitumor activity in the Xenograft model of colon cancer cells in addition to Xenograft of liver cancer cells. Even an effective treatment. Similarly, it is an effective therapeutic drug targeting breast cancer and other hDlk-1-expressing cancer cells.
  • clone D 2-14 (mouse IgGl), which is an anti-human Dlk-1 monoclonal antibody, is 20 mg / kg in the Xenograft Treatment model of human liver cancer cell line (Huh-7-hDlk cells). It showed very high antitumor activity at a dose of kg body weight. Therefore, in order to further verify the antitumor activity of clone DI-2-14, dose-dependent antitumor activity was evaluated.
  • the antitumor activity was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the antibody dose was changed. It was.
  • Huh-7-hDlk cells As described in Example 1, in the Xenograft Treatment model of human hepatoma cell line (Huh-7-hDlk cells), it is particularly strong among the five types of anti-human Dlk-1 monoclonal antibodies that showed antitumor activity. Clone DI-2-14 (mouse IgGl), which showed antitumor activity, was evaluated for antitumor activity in the Xenograft Treatment model of human transblastoma (SK-N-F1 cells).
  • Huh-7-hDlk cells are cell lines that stably express the human Dlk-1 gene exogenously in Huh-7 cells, whereas SK-N-F1 cells are endogenously Dlk Is a cell line expressing -1 on the cell surface.
  • the antitumor activity of clone DI-2-14 administration in the Xenograft Treatment model in the SK-N-F1 cell line is the anti-human Dlk-1 monoclonal antibody against human neuroblastoma.
  • anti-human Dlk-1 monoclonal antibody especially clone DI-2-14 is effective against various cancer cells expressing Dlk-1 on the cell surface ( It can be said that this is a medicinal effect.
  • Endogenously-Human neuroblastoma (SK-N-F1 cells, ATCC: Kataguchi No. CRL2142) expressing hDlk-1 on the cell surface is removed by trypsin treatment and 6 x 10 7 ceU / in PBS mL of the cell suspension was prepared and mixed with an equal volume of Matrigel (BD Farmingen) on ice.
  • mice that had grown to a tumor volume of 50 to 150 mm 3 were grouped, and the day of grouping was defined as day 1 (Day 1 ), Administration of the antibody (clone D 2-14) was started.
  • the antibody was administered by intraperitoneal administration once every 3 days (5 mg / kg body weight, 20 mg / kg body weight).
  • Antitumor activity was evaluated by measuring tumor volume in the same manner as in Example 1. On the final day of the experiment, tumors were removed by necropsy and evaluated by measuring tumor weight. The significance test was performed by Student's t-test, and P ⁇ 0.05 or less was judged to be statistically significant.
  • the tumor volume in the control group was 527.8 ⁇ 48.9 mm 3 compared to 333.8 in the clone DI-2-14 (5 mg / kg body weight) administration group.
  • ⁇ 6.8 mm 3 P ⁇ 0.01 by Student's t-test
  • clone DI-2.14 (20 mg / kg body weight
  • 233.0 soil 16.4 mm 3 P ⁇ 0.01 by Student's t-test
  • clone DI -2- 14 dose-dependent antitumor activity was confirmed (D 2-14 (5 mg / kg) vs DL2-14 (20 mg / kg), Day 23, P 0.01 by Student's t-test )
  • the excised tumor weight was 0.07 ⁇ 0.04 (g) in the control group, compared with 0.03 ⁇ 0.009 (g) in the clone D 2-14 (5 mg / kg body weight) group (P ⁇ 0.05 by Student's t-test) and 0.02 ⁇ 0.005 (g) (P ⁇ 0.05 by Student's t-test) in the clone DI-2-14 (20 mg / kg body weight) administration group. Similar to the tumor volume, the difference in tumor weight between the 5 mg / kg and 20 mg kg groups of clone DI-2-14 was also significant (P ⁇ 0.05 by Student's t-test). Tumor activity was confirmed (Fig. 20 B). 3. Determination of the variable region sequence of antibody gene of mouse anti-human Dlk-1 antibody (clone D 2-14) and construction of chimeric DI-2-14 expression vector
  • Mouse anti-human Dlk- 1 monoclonal antibody-producing hybridoma is in DMEM medium containing supernatant with 10% fetal calf blood and incubated at 37 ° C, 7.5% C0 2 incubator. Extract total RNA from 3 x 10 6 hybridomas using TRIzol reagent (Invitrogen), then use GeneRacer Kit (Invitrogen) and follow the method attached to the kit, and use oligo dT primer. cDNA was synthesized. The gene encoding the variable regions (VH, VL) of the H-chain and L-chain of clone DI-2-14 (mouse IgGl) was cloned by PCR using the synthesized cDNA as a saddle.
  • 3'-primer uses a 3 'primer for VH amplification that has a sequence complementary to the mouse ⁇ constant region, and a 3'-primer for VL amplification that is complementary to the mouse ⁇ constant region. The one with the typical sequence was used.
  • VH 5-gccagtggatagacagatgg-3 (SEQ ID NO: 1 6)
  • VL 5-gatggatacagttggtgcagc-3 (SEQ ID NO: 1 ⁇ ) PCR using the above primers was performed under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • FIG. 26 shows a diagram in which mouse DI-2-14 antibody and purified ChDI-2-14 antibody were developed by SDS-PAGE and stained with CBB. Under reducing conditions, about 50 kD H chain and about 25 kD L chain were detected, confirming the production of ChDI-2-14 antibody protein.
  • Antigen affinity of the purified ChDI-2-14 protein was examined by a method using ELISA.
  • the ELISA was performed in the same manner as in Example 1 using an ELISA plate on which purified recombinant hFA-1 protein (0.5 to 1 ⁇ g / mL) was immobilized. Specifically, after washing the ELISA plate 3 times with wash buffer, block with blocking solution for 1 hour at room temperature (or at 4 ° C), wash 2 times with wash buffer, and dilute with ELISA buffer. The prepared mouse DI-2-14 antibody and ChDI-2-14 antibody were added and reacted (4 ° C, ⁇ ⁇ ).
  • ChDI-2-14 was found to be mouse D
  • the antigen-binding ability was the same as 2-14 ( Figure 28).
  • the chimeric D 2-14 antibody (ChDI-2-14) maintains almost the same antigen affinity as the mouse DI-2-14 antibody.
  • the antibody retains the strong antitumor activity of mouse DI-2-14 antibody, and is a therapeutic antibody effective against cancer that expresses Dlk-1 on the cell surface. Or have been shown to be diagnostic or detection antibodies
  • hepatoma cell line (7 cell line), breast cancer cell line (10 cell line), and acute myeloid leukemia (AML) cell line (7 cell line) was analyzed by flow cytometry using anti-human Dlk-1 antibody.
  • the cell lines used were those obtained from Human Science Promotion Agency, ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) as listed below. used.
  • HL-60 (ATCC), NB-4 (DSMZ), MV-4-11 (ATCC), KG-1 (ATCC), KG-la (ATCC), TF-1 (ATCC), CMK-11-5 ( Human Science Promotion Corporation), HepG2 (Human Science Promotion Corporation), C3A / HepG2 (ATCC), Huh-7 (Human Science Promotion Corporation), OCUG-1 (Human Science Promotion Corporation), HLE (Human Science) Promotion Agency), HLF (Human Science Promotion Agency), SK-HEP-1 (ATCC), HCC1143 (ATCC), JIMT-1 (DSMZ), ZR-75-1 (ATCC), MDA MB- 415 (ATCC), BT549 (ATCC), BT-474 (ATCC), MDA MB-231 (ATCC), DU4475 (ATCC), T47D (ATCC), MDA MB-468 (ATCC) Hepatoma cell lines used 7 Expression of cell surface Dlk-1 was confirmed in all types of cell lines (Fig.
  • cancer tissues were removed from the mouse IgG administration group (control group: 2 individuals) and the D 2-14 administration group (4 individuals), respectively, and OCT compound (Tissue- Tek), prepare fresh frozen sections (7 ⁇ ), fix with 15% 2.5% dartaldehyde / PBS, 3 minutes with 0.5% Triton X 100 / PBS, and fix at room temperature with PBS for 5 minutes. The minute wash was performed 3 times. Next, endogenous peroxidase activity was removed by treatment with methanol in a solution of hydrogen peroxide to a final concentration of 0.3% for 5 minutes at room temperature.
  • tumor blood vessels in the tumor derived from Huh-7-hdlk cells are derived from mouse vascular endothelial cells
  • anti-mouse Flk-1 / VEGF-R2 antibody diluted with MOMTM mouse Ig Blocking Reagent (end) (Concentration 2 ⁇ g / ml) at room temperature for 30 minutes, washed twice with PBS for 2 minutes at room temperature, followed by a 100-fold dilution of Piotinylated anti-rat IgG antibody with MOM / TM Diluent. The reaction was allowed to proceed for 10 minutes at room temperature.
  • RT-PCR in this example means a reaction in which cDNA synthesis from extracted RNA and PCR using the cDNA as a template are performed separately.
  • mice were treated with IgG (control) Group: 7 individuals), D 2-14 administration group (7 individuals), cancer tissues were extracted from each, and RNA was extracted with Trizol reagent (Invitrogen). Next, 1st strand cDNA was synthesized using a 1st strand cDNA sysntesis kit (GE Healthcare) according to the protocol attached to the kit.
  • PCR primers were used (PCR amplification product was 336 bp).
  • Taq DNA polymerase 0.5 ⁇ L
  • F primer 5'-acc-aca-gtc-cat-gcc-atc-ac-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • R primer 5'-tcc-acc-acc-ctg-ttg-ctg-ta-3' (SEQ ID NO: 21)
  • the PCR reaction solution composition and reaction conditions were the same as in the case of amplifying Flk-1 GF-R2 described above.
  • the PCR product was quantified by 1.2% agarose gel electrophoresis and then stained with ethidium bromide.
  • the captured electrophoretic image was captured with a scanner, the PCR product was quantified with NIH Image, and a draft was created with Flk-1 / GAPDH: Ratio.
  • IgG administration group (20 mg / kg body weight) (2 individuals) and DI-2-14 administration group (20 mg kg body weight) (4 individuals), 8-13 fields each (objective x 200) ), The number of tumor vascular endothelial cells whose nuclei were confirmed by nuclear staining with hematoxylin and Flk-1 / VEGF-R2 positive were counted (IgG administration group: total 25 fields, DI-2-14 injection).
  • anti-VEGF antibody Asvastin
  • Dlk-1 and anti-Dlk-1 antibodies Regarding Dlk-1 function, there have been reports on the enhancement of proliferation in Dario cells and leukemia cells by controlling differentiation of adipocytes and stable introduction of Dlk-1 gene. Based on the results, it was unpredictable that anti-Dlk-1 antibody (DI-2-14) had tumor angiogenesis inhibitory activity. This example showed at least one mechanism of action of DI-2-14 antibody in vivo antitumor activity.
  • an anti-human Dlk-1 antibody having anti-tumor activity particularly an anti-human Dlk-1 monoclonal antibody having anti-tumor activity in w'w.
  • the present invention provides a hybridoma that produces the antibody, a complex of the antibody and various drugs, a pharmaceutical composition for diagnosis or treatment of a tumor, a method for detecting a tumor, and for detection or diagnosis of a tumor. be able to. Sequence listing free text
  • Sequence number 8 Synthetic DNA SEQ ID NO: 9 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 19 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 2 7 Synthetic construct (recombinant protein)
  • SEQ ID NO: 2 8 Recombinant DNA
  • SEQ ID NO: 29 Synthetic construct (recombinant protein)

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Description

明 細 書 in oで抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk-1抗体 技術分野
本発明は、 抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk- 1抗体、 特に J!O oで抗腫瘍活性を 有する抗ヒ ト Dlk-1抗体に関する。 また本発明は、 当該抗体を産生するハイプリ ドーマ、 及び当該抗体の用途に関する。 背景技術
ヒ ト Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila)；以下 「hDlk- l」 とレ、うこと がある。 ） は、 全長 383アミノ酸残基の 1回膜貫通型の 1型膜タンパク質であり、 細胞外領域に 6 つの EGF様モチーフを有する。 その細胞外領域は、 Notch/Delta/Serrateファ ミ リーと相同性を示す。 hDlk- 1遺伝子は、 GRP ( gastrin releasing peptide) 応答性の肺小細胞癌由来細胞株で発現する分子 （非 特許文献 1 ) あるいは前脂肪細胞の分化を抑制する因子としてクローニングされ た （非特許文献 2 ) 。 hDlk-1は、 細胞分化制御因子である Notchレセプターのリ ガンドである Deltaとのアミノ酸配列の相同性から、 DLK1という遺伝子シンボ ルで称されるのが一般的であり、 その他に、 Pref- 1 (非特許文献 2 ) 、 pG2 (非 特許文献 3 ) 、 SCP-1 (非特許文献 4 ) 及び ZOG (非特許文献 5 ) といった複 数の遺伝子シンボルを持つが、 これらは基本的に同一分子である。
また、 hDlk- 1は、 細胞外領域の細胞膜近傍が未同定のプロテアーゼにより切 断され、 血液中に分泌される。 遊離 hDlk-1 (hDlk-1細胞外領域） は、 225〜262 アミノ酸残基の FA-1 (Fetal antigen- 1) (非特許文献 6 ) と呼ばれる糖タンパ ク質と同一の分子である。
hDlk-1遺伝子及びその遺伝子産物は、 未分化で増殖能の高い胎児細胞で高発 現を示す。 特に、 胎児肝臓、 胎児腎臓、 胎児骨格筋、 胎児脳などで高い発現を示 すが、 出生後はほとんどの組織で発現が認められなくなり、 正常な成体組織にお いては副腎、 胎盤、 下垂体に限局している （特許文献 1、 非特許文献 2 ) 。 さらに、 成体組織においても、 未分化な幹細胞や前駆細胞と考えられている細 胞には、 hDlk- 1の発現が認められる。 例えば、 成体肝臓における未分化で多分 化能を有する肝オーパル細胞 （非特許文献 7、 8 ) や、 骨 軟骨 Z脂肪細胞の幹 細胞である間葉系幹細胞 （非特許文献 9 ) で、 hDlk-1の発現が報告されており、 これら組織幹細胞の性質、 例えば未分化能の維持等、 に関与していることが示唆 される。
このような、 胎児期の細胞や幹細胞に限局している hDlk-1の発現様式や、 EGF様モチーフを有する遺伝子 遺伝子産物のファミ リ一 （Notch-receptor, Notch ligand (Delta, Jagged, serrate)など） は、 一般に EGF様モチーフを介す る細胞間相互作用により、 細胞の増殖や分化を制御することから、 hDlk- 1もそ のような機能を有することが示唆されている。 事実、 脂肪前駆細胞の分化にとも ない、 発現が低下し、 また脂肪前駆細胞に hDlk-1遺伝子を強制発現させると脂 肪分化が抑制されることがよく知られている （非特許文献 2 ) 。 しかしながら、 現時点において、 hDlk-1と相互作用する分子 （リガンド） についての詳細は不 明である。
一方、 hDlk- 1遺伝子及びその遺伝子産物は、 様々な癌や腫瘍でも高頻度で発 現していることが報告ざれている。 現在までに、 その発現が確認されている癌の 種類としては、 固形癌では、 神経内分泌腫瘍、 神経芽細胞腫、 神経膠腫、 1型神 経線維腫症、 小細胞肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌及び卵巣癌が知られており （特許文献 1、 2、 及び、 非特許文献 1、 3、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4 ) 、 血液癌で は、 骨髄異形成症候群 （特許文献 3、 及び、 非特許文献 1 5、 1 6 ) 及び急性骨 髄性白血病 （非特許文献 1 6 ) が知られている。 赤白血病細胞株 （ erythroleukemia) である K562細胞に hDlk- 1遺伝子を導入すると細胞増殖が亢 進されること （非特許文献 1 6 ) 、 同様に、 グリア芽種細胞に hDlk-1遺伝子を 導入すると、 細胞増殖の亢進に加えて、 細胞の接触阻止が失われ、 足場非依存的 な細胞増殖能を獲得することが報告されており、 hDlk-1と発癌との関連性が示 唆されている （非特許文献 1 7 ) 。 ぐ特許文献 > 特許文献 3 : 特開 2001-269174号
<非特許文献〉
非特許文献 1 : Laborda, J. et al., J. Biol .Chem., vol.268 (6), p.3817-3820 (1993)
非特許文献 2： Smas, C. M. et al., Cell, vol.73 (4)， p.725-734 (1993)
非特許文献 3 : Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.84, p.2336-2339 (1987)
非特許文献 4 : Maruyama, K. et al., Unpublished, Genebank accession number D 16847 (1993)
非特許文献 5 : Haider, S. K. et al., Endocrinology, vol.139, p.3316 3328 (1998)
非特許文献 6： Fay, T. Ν. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol.29, p.73-85 (1988)
非特許文献 7 : Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol.5, p.209- 218 (2004)
非特許文献 8 : Jensen, CH. et al" Am. J. Pathol., vol.164 (4)， p.1347-1359 (2004)
非特許文献 9 : AbdaUah, B.M. et al., J. Bone Miner. Res., vol.19 (5), p.841- 852 (2004)
非特許文献 10 : Jensen, C. H. et al., Br. J. Dermatol., vol.140 (6), p.1054- 1059 (1999)
非特許文献 1 1 : Jensen, CH. et al" Tumour Biol., vol.20 (5), p.256 262 (1999)
非特許文献 12 : Yin, D. et al., Int. J. Oncol., vol.24 (4)， p.1011-1015 (2004) 非特許文献 13 : Yin, D. et al., Oncogene, vol.25 (13)， p.1852- 1861 (2006) 非特許文献 14 : Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., vol.58, p.145-150 (2006) 非特許文献 15 : Miyazato, A. et al., Blood, vol.98, p.422-427 (2001)
非特許文献 16 : Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol.19 (8), p.1404- 1410 (2005) 非特許文献 17 : Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13)， p.1852- 1861 (2006) 発明の開示
上述したように、 hDlk-1の発現は正常組織では胎児期の細胞や幹細胞に限局し ているが癌組織では種々の腫瘍で高頻度に発現していること、 及び hDlk-1が細 胞膜タンパク/分泌タンパクであることから、 hDlk-1は、 各種腫瘍の治療等に おいて良い標的になると考えられる。 そして、 この hDlk- 1を標的とする場合、 抗 hDlk- 1抗体が有用であると考えられる。
そこで、 本発明が解決しょうとする課題は、 抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk-1 抗体、 特に in Voで抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk-1モノクローナル抗体を提供 することにある。 さらに、 当該抗体を産生するハイプリ ドーマ、 当該抗体と薬剤 との複合体、 腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、 腫瘍の検出方法、 腫瘍の検出 用又は診断用キットを提供することにある。
本発明者は、 上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。 その結果、 ヒ ト Dlk-1と特異的に反応する抗体 （特に抗ヒ ト Dlk-1モノクローナル抗体） であつ て抗腫瘍活性を有する抗体、 さらには当該抗体と各種薬剤との複合体 （ィムノコ ンジュゲート） を見出し、 これらが 'wにおいて抗腫瘍活性を有することを 確認した。 また、 これら抗体及び複合体が、 腫瘍の治療、 診断及び検出に有用で あることも見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
( D in oで抗腫瘍活性を有する、 ヒ ト Dlk- 1に対する抗体。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。
上記 (1)の抗体において、 抗腫瘍活性は、 例えば腫瘍血管新生阻害活性が挙げ られる。
上記 (1)記載の抗体は、 例えば、 ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体 であるものが挙げられる。
上記 (1)記載の抗体は、 例えば、 H鎖 V領域の C D R 1〜3のアミノ酸配列が、 それぞれ順に、 配列番号 3 0〜3 2で示されるアミノ酸配列であるもの、 及び 又は、 L鎖 V領域の C D R 1〜3のアミノ酸配列が、 それぞれ順に、 配列番号 3 3〜3 5で示されるアミノ酸配列であるものが挙げられる。
本発明の抗体としては、 ハイプリ ドーマが産生する抗体、 遺伝子組換え抗体な どが挙げられる。
ハイプリ ドーマとは、 ヒ ト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B 細 胞と、 ミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有する抗 体を生産する細胞をいう。
遺伝子組換え抗体としては、 キメラ抗体 （ヒ ト型キメラ抗体）、 ヒ ト化抗体、 ヒ ト抗体またはそれらの抗体断片など、 遺伝子組換えにより製造される抗体を包 含する。 遺伝子組換え抗体において、 モノクローナル抗体の特徴を有し、 抗原性 が低く、 血中半減期が延長されたものは、 治療薬として好ましい。 ここで、 キメ ラ抗体としては、 例えば、 H鎖 V領域のァミノ酸配列が配列番号 2 3で示される アミノ酸配列からなり、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 2 5で示されるァ ミノ酸配列からなるものが挙げられる。
( 2 ) 受託番号が FERM BP- 10707であるハイブリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
( 3 ) 受託番号が FERM BP-10899であるハイプリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
(4 ) 受託番号が FERM BP- 10900であるハイブリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
上記 (1)〜(4)に記載の抗体は、 例えば、 配列番号 2に示されるヒ ト Dlk-1のァ ミノ酸配列中の、 第 2 6番目〜第 8 5番目のアミノ酸からなる領域、 第 9 2番目 〜第 1 6 7番目のアミノ酸からなる領域、 又は第 1 3 1番目〜第 2 4 4番目のァ ミノ酸からなる領域の少なくとも一部と結合する （当該一部を認識する） ものが 挙げられる。
( 5 ) 上記 (1)〜(4)に記載の抗体としては、 例えば、 受託番号が FERM BP- 10707、 FERM BP- 10899、 又は FERM BP- 10900であるハイブリ ドーマにより産生され るモノクローナル抗体が結合 （認識） する部位 （例えばェピトープ） に結合する 抗体が挙げられる。
( 6 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体に由来する抗体断片。
上記 (6)記載の抗体断片は、 例えば、 配列番号 3 0〜 3 2で示されるアミノ酸 配列を含むものが挙げられ、 具体的には、 配列番号 2 3で示されるアミノ酸配列 を含むものが挙げられる。
上記 (6)記載の抗体断片は、 例えば、 配列番号 3 3〜 3 5で示されるアミノ酸 配列を含むものが挙げられ、 具体的には、 配列番号 2 5で示されるアミノ酸配列 を含むものが挙げられる。
( 7 ) 上記 (1)記載の抗体を産生するハイプリ ドーマ。
( 8 ) 受託番号が FERM BP-10707である、 ヒ ト Dlk_lに対するモノクローナル 抗体を産生するハイプリ ドーマ。
( 9 ) 受託番号が FERM BP-10899である、 ヒ ト Dlk-Ιに対するモノクローナル 抗体を産生するハイブリ ドーマ。
( 1 0 ) 受託番号が FERM BP-10900である、 ヒ ト Dlk_lに対するモノクローナ ル抗体を産生するハイプリ ドーマ。
( 1 1 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体と、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞 活性を有する化合物とを含む、 抗体一薬剤複合体。
( 1 2 ) 上記 (6)記載の抗体断片と、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞活性を有する化 合物とを含む、 抗体断片一薬剤複合体。
上記 (11)及び (12)記載の複合体において、 腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1 種が挙げられる。
上記 (11)及び (12)記載の複合体において、 抗腫瘍活性は、 例えば腫瘍血管新生 阻害活性が挙げられる。
( 1 3 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 医 薬組成物。 上記 (13)記載の組成物は、 例えば、 腫瘍の治療に用いるものが挙げられ、 腫瘍 の治療としては、 例えば、 腫瘍血管新生を阻害することが挙げられる。 また、 当 該組成物は、 例えば、 体重減少の副作用を有しないものが挙げられる。
上記 (13)記載の組成物は、 例えば、 腫瘍の診断に用いるものが挙げられる。 上記 (13)記載の組成物において、 腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト祌経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なぐとも 1種が挙げら れる。
( 1 4 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫 瘍治療剤。
上記 (14)記載の治療剤は、 例えば、 体重減少の副作用を有しないものが挙げら れる。
上記 (14)記載の治療剤において、 腫瘍としては、 例えば、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳 ,癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙 げられる。
( 1 5 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫 瘍血管新生阻害剤。
上記 (15)記載の阻害剤は、 例えば、 体重減少の副作用を有しないものが挙げら れる。
上記 (15)記載の阻害剤において、 腫瘍としては、 例えば、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳 癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト祌経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙 げられる。
( 1 6 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫 瘍診断剤。
上記 (16)記載の診断剤において、 腫瘍としては、 例えば、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳 癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙 げられる。 ( 1 7 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断斤、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種と、 生体か ら採取された試料とを反応させ、 反応した抗体のシグナルを検出することを特徴 とする、 腫瘍の検出方法。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。
( 1 8 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種、 あるいは 上記 (13)の医薬組成物を患者に投与することを含む、 腫瘍の診断及び Z又は治療 方法。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。
上記 (18)の方法としては、 例えば、 腫瘍の血管新生を阻害又は抑制することに よる腫瘍の治療方法が挙げられる。
( 1 9 ) 腫瘍の診断用及び/又は治療用の、 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗 体、 上記 (6)記載の抗体断片、 又は上記 (11)若しくは (12)記載の複合体。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。
( 2 0 ) 腫瘍を診断及び 又は治療するための医薬の製造のための、 上記 (1)〜 (5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載 の抗体断片、 又は上記 (11)若しくは (12)記載の複合体の使用。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。
( 2 1 ) 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載の抗体、 上記 (6)記載の抗体断片、 及び上 記 (11)又は (12)記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫 瘍の検出用、 診断用又は治療用キット。
上記腫瘍としては、 例えばヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細 胞腫からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 hDlk-1発現肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk cell) を用いた Xenograft Treatmentモデルにおいて、 公知の （WO 2005/052156) 抗 hDlk-1モノクローナ ル抗体 3クローン （1C1, 4C4, 31C4) を投与した場合の結果を表す図である。 各抗体は、 1 日目（Day 1)、 4 0目（Day 4)、 7日目（Day 7) 及び 1 0日目（Day 10)の計 4回 （矢印） 腹腔内投与を行った。
A： ラット IgG (コントロール群） （秦） ， 1C1 (〇）
B： ラット IgG (コントロール群） (·) ， 4C4 (〇）
C： ラット IgG (コントロール群） （き） ， 31C4 (〇）
A〜Cのそれぞれにおいて、 各群の個体数は Nで示し、 各測定値 (腫瘍体積)は平 均値士標準誤差で表した。 これらの実験は、 少なくとも 3回の独立した実験を行 つた。 いずれの場合もヌードマウス皮下で確立した肝癌に対する抗腫瘍活性は認 められなかった。
図 2は、 Huh-7-hDlk cellを用いた Xenograft Treatmentモデルにおいて、 新 規な抗 hDlk-1モノクローナル抗体クローン DI-2-14 (マウス IgG 1)の抗腫瘍活性を 評価した図である。
A： コントロール群 （マウス IgG) と DI-2-14投与群の腫瘍成長を経時的 に表した （平均値土標準誤差） 。 矢印は抗体投与 （20 mg/kg体重、 腹腔内投与 ) を表す。 * P < 0.01 (by Student's t-test)
B： Aの試験において、 1 4日目（Dayl4) (実験最終日） の時点での各マ ウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。 各プロット上に示す数値は、 平 均値士標準誤差。 * P < 0.01 (by Student's-t-test)
C ： D 2-14の抗腫瘍活性を独立した別の実験で評価した結果を表す。 * P < 0.01 (by Student's-t-test)
図 3は、 Huh-7-hDlk cellを用いた Xenograft Treatmentモデルにおいて、 A : クローン 2-13 (ラッ ト IgG2b)、 B： クローン BA-1-3D (マウス IgG2a)、 C ： クロー ン D 6 (マウス IgGl)、 D： クローン M3-1 (マウス IgGl) の抗腫瘍活性を評価し た図である。 腫瘍体積は平均値土標準誤差で表し、 アスタリスクは、 有意差検定 (* P < 0.01, **P < 0.05 by Student's-t-test) の結果を示す。 図 4は、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体（クローン 2-13)の hDlk-1発現大腸癌細 胞株 （SW480-hDlk 細胞） を用いた Xenograft Treatmentモデルでの抗腫瘍活 性を示した図である。 SW480-hDlk細胞をヌードマウス皮下に移植し、 大腸癌組 織を確立させた。 矢印で示す時点で抗体 （20 mg kg体重） を腹腔内投与した。 腫瘍体積は平均値土標準誤差で示した （*P < 0.01， **P < 0.05 by Student's t- test)
図 5は、 HEK293-hDlk細胞を用いた抗 hDlk-1モノクローナル抗体のフローサ ィ トメ トリーによる反応性を示す図である。 各ヒス トグラムの上に示す番号は、 クローン番号を示す。 黒塗りがアイソタイプコントロール抗体。 黒線が抗 hDlk- 1モノクローナル抗体である。
図 6は、 Huh-7-hDlk細胞を用いた抗 hDlk-1モノクローナル抗体のフローサイ トメ トリーによる反応性を示す図である。 各ヒス トグラムの上に示す番号は、 ク ローン番号を示す。 黒塗りがアイソタイプコントロール抗体。 黒線が抗 hDlk-1 モノクローナル抗体である。 ' 図 7は、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体が認識するェピトープを解析するため に作製した、 各 EGF様モチーフを欠失させた変異体の模式図である。
図 8は、 クローン D 2-14のェピトープ解析の結果を示す図である。
A： 記載してある hDlk-1遺伝子の変異体を、 COS-7細胞にリポフエクシ ヨンにより一過性に遺伝子導入し 24〜72時間後に FACS解析した図である （左： マウス IgGl、 右： DI-2-14 )。 ゲートをかけている部分が、 クローン DI-2-14が認 識している各変異体発現細胞を示す。
B： EGF (1-2)を発現させた COS-7細胞の塗沫標本を、 陽性コントロール (抗 hDlk-1ポリクローナル抗体） とクローン DI-2-14とで免疫染色した写真であ る。 茶褐色に染色されている部分が EGF (1-2)の発現を示す。
図 9は、 クローン DI-6、 BA-1-3D及び 2-13のェピトープ解析の結果を示す図 である。
A： 記載してある hDlk-1遺伝子の変異体を、 COS-7細胞にリポフエクシ ョンにより一過性に遺伝子導入し 24〜72時間後に FACS解析した図である。 ゲー トをかけている部分が、 各クローンが認識している各変異体発現細胞を示す。 B ： EGF (1-2)を発現させた COS-7細胞の塗沫標本を、 クローン Dl_6、 BA-1-3D及び 2-13で免疫染色した写真である。 矢印で示す茶褐色に染色されてい る部分が EGF (1-2)の発現を示す。
図 1 0は、 クローン M3-1の FACSによるェピトープ解析の結果を示す図であ る。
記載してある hDlk-1遺伝子の変異体を、 COS-7細胞にリポフエクシヨンによ り一過性に遺伝子導入し 24〜72時間後に FACS解析した図である。 ゲートをかけ ている部分が、 D 2-14が認識している各変異体発現細胞を示す。
図 1 1は、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体の抗原結合後のインターナリゼーシ ヨン活性の分析結果を示す図である。
A： HEK293-hDlk細胞を抗 hDlk-1モノクローナル抗体 （クローン M3-1 M1-290及び M3-4) と反応させ （4 °C、 20分） 、 PBSで 2回洗浄した後、 37°C で、 記載している時間インキュベートした。 その後、 PE標識抗マウス IgGと反 応させ、 FACS解析を行った。 値は、 インキュベート無し （0分） における、 平 均蛍光強度を 100%とした場合の相対値として表した。
B： FITC標識したクローン M3- 1 (FITC-M3- 1)を HEK293-hDlk細胞と反 応させ （4 °C、 20分） 、 PBSで 2回洗浄した後、 37°Cで 120分インキュベートし た時の平均蛍光強度の変化を表した図である。 黒カラムは、 Aと同様に未標識 M3-1と細胞を反応後、 37°Cで 120分インキュベートし、 PE標識抗マウス IgGと 反応させた場合の平均蛍光強度の変化を示した。
図 1 2は、 ローダミン標識した抗 hDlk-1モノクローナル抗体の抗原結合後の ィンターナリゼーション活性の分析結果を示す図である。
A： ΗΕΚ-293-hDlk細胞を、 ローダミン標識— M3-l(Rho-M3_l)と反応さ せ （4°C， 20分） 、 PBSで 2回洗浄後、 ただちに塗沫標本を作製し、 蛍光顕微鏡 で Rho-M3-lの局在を観察した写真である。 オレンジ色で示される部分が Rho- M3 1 の局在を示し、 細胞膜へ局在が観察された。
B〜E： Rho-M3-l (B)、 Rho DI-1 (C) 、 Rho-Ml-290 (D)及び Rho_M3- 4 (E)を HEK293-hDlk細胞と反応させ、 PBSで 2回洗浄後、 37°Cで 15分インキ ュペートした後、 塗沫標本を作製し、 蛍光顕微鏡で各クローンの局在を観察した 写真である。 同じェピトープ （EGF 4-6)を認識する Rho-M3-l及び Rho-DI-1は、 いずれも細胞内に取り込まれ、 ドット状に局在している様子が観察された。
図 1 3は、 サポリ ンを結合させた抗 hDlk-1モノクローナル抗体の、 Huh-7- hDlk細胞及び SK-N-F1細胞に対する細胞障害活性を示した図である。
A： Huh-7-hDlk細胞に対する、 コントロール （マウス IgG-サポリン （
IgG-SAP))及び M3- 1-SAPの効果を示した図である。 縦軸は未添加の場合の細胞 の生存率を 100%としたときの相対値 （N=3， 平均値土標準偏差） で表した。
B ： SK-N-F1細胞に対する、 コントロール （IgG-SAP) 、 M3- 1-SAP及び M1-290-SAPの効果を示した図である。
図 1 4は、 Huh-7-hDlk細胞の Xenograftモデルにおいて、 マウス IgG (20 mg/kg体重） 、 M3-l-SAP (5 mg/kg体重） 、 及び M1-290-SAP (5 mg/kg体重） を 投与した場合の、 A: 投与後の各マウスの体重変化、 B: マウス生存率を示した図 である。 値は平均値士標準偏差で表した。 矢印は、 抗体投与時を示す。
図 1 5は、 Huh-7-hDlk細胞の Xenograftモデルにおいて、 マウス IgG (· ； N=8)、 及び M3-1-SAP (〇： N=8) を腹腔内投与した場合の腫瘍成長阻害効果を 示した図である。 矢印は、 抗体投与時を示す。 値は平均値土標準偏差で表した （ * P < 0.01, ** P < 0.05 by Student's t-test) 。
図 1 6は、 Huh-7-hDlk細胞の Xenograftモデルにおいて、 A, B：マウス IgG ( ： N=5) と M3-1-SP (〇： N=5) を腫瘍内投与 (40 w g) した場合の腫瘍成長阻 害効果 （A) 及び体重変化 （B) を示した図、 並びに、 C， D： PBS (き： N=4) と シスブラチン （〇： N=4) を腹腔内投与 （5 mg/kg体重） した場合の腫瘍成長阻 害効果 （C) 及び体重変化 （D) を示した図である。 いずれの図においても、 矢 印は抗体投与時を示し、 値は平均値土標準偏差で表した （* P < 0.01, ** P < 0.05 by Student's t-test) 。
図 1 7は、 ヒ ト大腸癌組織アレイ （Cybrdi社製、 CC05-01-001)を抗 hDlk- 1抗 体で免疫染色した場合の代表例を示す写真。 茶褐色の部分が、 抗 hDlk- 1抗体で 染色された癌組織を示す。 hDlk-1陰性は、 No.48の切片 （69才男性、 腺癌、 Grade III)に示すように、 全く染色された領域が観察されなかった切片を指す。
No.19 (55才女性、 腺癌、 Grade II)は、 非常に強い染色性を示し、 No.19と同等 の染色性を示した切片を hDlk- 1強陽性とした。 また、 No.25 (75才男性、 脲楹、 Grade II)のように、 明らかに hDlk-1陽性であることが確認され、 染色性が弱い 切片を hDlk-1弱陽性とした。
図 1 8は、 ヒ ト乳癌組織アレイ （Cybrdi社製、 CC08-02-002)を抗 hDlk-1抗体 で免疫染色した場合の代表例を示す写真。 茶褐色の部分が、 抗 hDlk- 1抗体で染 色された癌組織を示す。
写真上段は、 組織アレイ中に含まれる正常乳腺組織を抗 hDlk-1抗体で染色し た場合の写真である。 左： No.07 (68才女性、 正常乳管； hDlk-1陰性） 、 右： No.Ol (43才女性、 正常乳腺小葉； hDlk-1弱陽性） 。 矢印は、 hDlk- 1弱陽性の部 位を示した。
写真下段は、 浸潤性乳管癌患者の写真を示す。 左 ： No.08 (45才女性、 Grade II； hDlk-1陰性） 、 中央： No.56 (28才女性， Grade II； hDlk- 1弱陽性)、 右 ： No.20 (59才女性、 Grade II； hDlk-1強陽性)。
図 1 9は、 Huh-7-dlk細胞 Xenograft treatment modelにおけるクローン DI- 2-14の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
図 2 0は、 SK-N-F1細胞 Xenograft treatment modelにおけるクローン DI- 2-14の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
A : 抗体投与開始以後の腫瘍成長を示す。 腫瘍体積は平均値士標準誤差 で表した （*P < 0.01, **P < 0.05 by Student's t-test) 。
B： 抗体投与後 2 3日目（Day 23)において、 摘出した癌組織の重量を示 すグラフである。
図 2 1は、 クローン DI-2-14 H鎖 (重鎖)可変領域 （VH) の cDNA塩基配列 （配 列番号 2 2 ) と推定アミノ酸配列 （配列番号 2 3 ) を示す図である。 シグナルぺ プチドはイタリックで表している。 二重下線を引いたグルタミン酸 （E) は、 成 熟ペプチドの N末端アミノ酸残基を示す。 CDR配列 （下線） は、 Kabatら (Sequences of Proteins of Immunological interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)の定義に従った。 クローン DI-2-14 VHの CDR1〜3のアミノ酸配列は、 そ れぞれ順に、 配列番号 3 0 ~ 3 2に示す。 図 2 2は、 クローン DI-2-14 L鎖 (軽鎖)可変領域 （VLノ (ノ 1^丄 Λ as日しッリ 、 し 列番号 2 4 ) と推定アミノ酸配列 （配列番号 2 5 ) を示す図である。 シグナルぺ プチドはイタリックで表している。 二重下線を引いたァスパラギン酸 （D) は、 成熟ペプチドの N末端アミノ酸残基を示す。 CDR配列 (下線)は、 Kabatら（1991 ；前掲)の定義に従った。 クローン DI-2-14 VLの CDR1〜3のアミノ酸配列は、 そ れぞれ順に、 配列番号 3 3 〜 3 5に示す。
図 2 3は、 クローン DI-2-14 VH遺伝子の塩基配列 （配列番号 2 6 ) 及びァミ ノ酸配列 （配列番号 2 7 ) を示す図である。 5'末端に Spel部位、 3'末端に Hindlll部位を付加してある （それぞれ下線を付した。 ） 。 イタリック文字で示 した塩基配列は、 イントロンに相当する配列を示す。
図 2 4は、 クローン DI-2-14 VL遺伝子の塩基配列 （配列番号 2 8 ) 及びァミ ノ酸配列 （配列番号 2 9 ) を示す図である。 5'末端に Nhel部位、' 3'末端に EcoRI 部位を付加してある （それぞれ下線を付した。 ） 。 イタリック文字で示した塩基 配列は、 イントロンに相当する配列を示す。
図 2 5は、 キメラ D 2-14 遺伝子発現ベクター （pChDI-2-14) の概略図であ る。 当該ベクターは、 Sail サイ トから時計回りに、 ヒ トサイ トメガロウィルス (CMV) 主要最初期プロモーター （the human cytomegalovirus (CMV) major immediate early promoter) と 抗体重鎖遺伝子の転写開始のためのェンハンサ 一とで始まる 重鎖翻訳ユニットを含む。 CMV領域は、 その後、 VHェキソン、 ヒ ト γ 1重鎖定常領域 （イントロンを介在し CH1、 ヒンジ領域、 CH2 及び CH3のェキソンを含む） の遺伝子配列、 並びに CH3に続く mRNAプロセッシ ングのためのポリ A部位へと 続いている。 重鎖遺伝子配列の後は、 CMVプロ モーター及びェンハンサ一で始まる軽鎖翻訳ュニットがあり、 その後、 VL ェキ ソン 及び上流にイントロン部分を有するヒ ト c鎖定常領域のェキソン (CL)、 並 びに/ c遺伝子のポリ Aシグナルへと 続いている。 当該軽鎖遺伝子は、 その後、 SV40 初期プロモーター、 大腸菌由来 キサンチングァニン ホスホリボシルトラ ンスフエフーセ igpt) 遺 1 子 (the E. coh xanthine guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene) 、 及び SV40のポリ A部位を含むセグメントへと続い ている。 最後に、 当該プラスミ ドは、 バクテリアの複製起点 及び i3—ラクタマ —ゼ遺伝子を含む pUC19プラスミ ドの一部を有している。
図 2 6は、 マウス DI-2-14 及びキメラ D 2-14(ChD 2-14)の SDS-PAGEで の展開後、 CBB染色した図である。 MWはサイズマーカーを示し、 矢印はそ れぞれのバンドの分子量 （kD) を示す。
図 2 7は、 精製 FA-1 (hDlk l細胞外領域） 固相 ELISAによる、 DI-2-14及 び ChDI-2-14 の抗原結合活性を示す図である。 〇は、 マウス IgGl 抗体 （クロ ーン D 2-14) 、 きは、 キメラ抗体 （ChDI-2-14) を表す。
図 2 8は、 HEK293-hDlk細胞を用いた DI-2- 14及び ChD 2-14のフローサ イ トメ トリーによる反応性を示す図である。 黒塗りのヒス トグラムが、 アイソタ ィプコントロール抗体であり、 黒線 （白抜き） のヒス トグラムが、 それぞれ DI- 2-14 および ChDI-2-14である。
図 2 9は、 ヒ ト肝癌細胞株における細胞表面 Dlk-1 の発現をフローサイ トメ トリーで解析した図である。 青のラインはマウス IgGl、 赤のラインは抗ヒ ト Dlk-1抗体であり、 それぞれの細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。
図 3 0は、 ヒ ト乳癌細胞株における細胞表面 Dlk-1 の発現をフローサイ トメ トリーで解析した図である。 青のラインはマウス IgGl、 赤のラインは抗ヒ ト Dlk-1抗体であり、 それぞれの細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。
図 3 1は、 ヒ ト白血病細胞株における細胞表面 Dlk-1 の発現をフローサイ ト メ トリーで解析した図である。 青のラインはマウス IgGl、 赤のラインは抗ヒ ト Dlk-1抗体であり、 それぞれの細胞を染色した場合のヒス トグラムを示す。
図 3 2は、 Huh-7-dlk細胞 Xenograft treatment modelにおける摘出した癌 組織における Flk-1/VEGF-R2の免疫組織染色を示す図である。
A： マウス IgG投与群 （コントロール群） 及びクローン DI-2-14投与群 から採取 （摘出） した癌組織の新鮮凍結切片を、 それぞれ抗マウス Flk- 1/VEGF-R2抗体で免疫染色した写真である （対物 200倍） 。 写真中、 矢頭状の 印 （▲) で示した箇所は、 Flk-1/VEGF-R2陽性の腫瘍血管内皮細胞を示す。
B： IgG 投与群 （2個体） 及び D 2-14投与群 （4個体） からそれぞれ 採取した新鮮凍結切片を、 抗マウス Flk-1/VEGF-R2抗体で免疫染色し、 それぞ れの切片において、 対物 200倍下で 8〜： 13視野 （IgG投与群：全 21視野、 DI- 2-14投与群：全 35視野） について、 Flk- 1/VEGF-R2 陽性の腫瘍血管内皮細胞 数をカウントし、 1視野あたりの細胞数を示したグラフである （*P < 0.01 by Student's t-test) 。
図 3 3は、 Huh-7-dlk細胞 Xenograft treatment modelにおける摘出した癌 組織における Flk-1/VEGF-R2の遺伝子発現を示した図である。
A： IgG 投与群 （N=7) 及び DI-2-14 投与群 （N=7) から、 それぞれ腫 瘍を摘出した後、 Trizol試薬で RNAを抽出し、 次いで 1st strand cDNAを合成 し、 それぞれの 1st strand cDNAを铸型として用いて、 PCR法 （30サイクル） によりマウス Flk-l/VEGF-R2(mFlk-l) 及びマウス/ヒ ト GAPDH (GAPDH) の 遺伝子発現を確認した電気泳動像を示す図である。 下のグラフは、 mFlk-1 及び GAPDH の PCR による増幅産物のバンドを NIH image で定量し、 Ratio (mFlk- 1/GAPDH) として示したグラフである。
B： PCR 法による増幅反応を 35 サイクル行った以外は、 A と同様にし た場合の図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ とはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変 更し実施し得る。
なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特願 2 0 0 6 - 3 0 5 3 5 5 号明細書の全体を包含する。 また、 本明細書において引用された全ての刊行物、 例えば先行技術文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 参照として 本明細書に組み込まれる。 1 . 本発明の概要
ヒ ト Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila)； hDlk-1) は、 前述したよう に、 全長 383アミノ酸残基の 1回膜貫通型の 1型膜タンパク質であり、 細胞外領 域に 6つの EGF様モチーフを有する。 そして、 hDlk- 1遺伝子及びその遺伝子産 物は、 種々の癌や腫瘍細胞において高頻度で発現していることが知られている。 一般的に、 in w oで抗腫瘍活性を示す抗体を作製し取得することは困難である ため、 抗 hDlk- 1モノクローナル抗体を作製したとしても、 in vitroでは抗腫瘍活 性を有するが ώ oでは同活性を示さないことが多い。 また、 hDlk-1の癌細胞 の増殖などに対する機能的ドメインや、 hDlk-1のリガンド （または受容体） 及 び細胞内シグナル伝達経路などは明らかではないため、 ターゲットを絞って効率 的に抗体作製を行うことも実質的に不可能である。 このような状況の下、 本発明 においては、 多数のクローンからスクリーニングを行うことによって、 in vivo で抗腫瘍活性を有するクローンを取得することに成功した。
まず、 本発明者は、 公知の抗 hDlk-1抗体を用いた免疫組織化学により、 これ まで hDlk-1の発現が確認されていた前述の癌や腫瘍細胞以外に、 新たに大腸癌 及び乳癌においても hDlk-1が発現していることを見出した。
次いで、 本発明者は、 個体レベルで hDlk- 1発現癌細胞を死滅させ得る又は腫 瘍成長を阻害し得る抗! iDlk-1抗体、 すなわち in oにおいて抗腫瘍活性を有す る抗 hDlk- 1抗体を作製することを目的として、 新たに抗 hDlk-1モノクローナル 抗体を約 100クローン作製した。 そして、 これらクローンにっき、 各種癌細胞株 をヌードマウス皮下に移植し確立した担癌マウスを用いて in w oにおける薬効 (抗腫瘍作用） の評価を行った。 その結果、 顕著な腫瘍成長阻害活性を示すクロ ーンを複数得ることに成功した （クローン名 ： DI-2-14, 2-13， BA-1-3D, DI-6, M3-1) 。
また本発明者は、 上述した抗 hDlk- 1抗体の中でも、 hDlk-1を発現する細胞内 への移動能 （インターナリゼーシヨン活性） に優れた抗体を見出し、 このような 抗体と、 抗腫瘍活性や殺細胞活性を有する化合物とを含む、 抗体一薬剤複合体を 作製した。 この複合体は、 いわゆるィムノコンジュゲートとして、 目的とする腫 瘍細胞内への薬剤送達能に優れたものである。
本発明者は、 上述した抗腫瘍活性を有する抗 hDlk- 1抗体や抗体一薬剤複合体 を用いると、 各種腫瘍の治療、 あるいは腫瘍の診断及び検出に有用であることを 見出した。
2 . 抗 hDlk-1抗体の作製 ( 1 ) 抗原の調製
hDlk-1のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) の情報は、 例えば NCBI (GenBank) のゥエフサイ ト ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) に 「 Accession number ： NP_003827J として公表されている。 なお、 hDlk- 1のアミノ酸配列をコードす る塩基配列 （配列番号 1 ) の情報は、 同ウェブサイ トに 「Accession number： NM_003836J として公表されている。
抗原としては、 hDlk- 1のアミノ酸配列の少なくとも一部 （全部又は一部） を 含むポリペプチド又はペプチド （単にペプチドともいう） を使用することができ、 好ましくは、 hDlk-1の細胞外領域 （FA-1) のアミノ酸配列の少なく とも一部 （ 全部又は一部） を含むペプチドを使用することができる。 hDlk-1の細胞外領域 は、 前述したように 6つの EGF様モチーフ （EGF-l〜EGF-6) を含む領域を言 レ、、 配列番号 2で示されるアミノ酸配列のうちの第 26番目〜第 244番目のァミノ 酸を含む領域、 好ましくは、 配列番号 2で示されるアミノ酸配列のうちの 「第 24番目」 から 「第 248〜285番目」 までのアミノ酸からなる領域 （およそ 225〜 262アミノ酸残基） のことを言う。
ここで、 抗原に用いるペプチドにっき、 上記 「アミノ酸配列の少なくとも一部 」 とは、 長さが特に限定されるわけではなく、 例えば、 6つの EGF様モチーフ のうちの 1つ又は 2つ以上を含む領域が好ましい。 より好ましくは、 例えば、 EGF-1及び EGF-2を含む領域 （すなわち配列番号 2で示されるアミノ酸配列の うちの第 26番目〜第 85番目のアミノ酸からなる領域） 、 EGF-3及び EGF-4を含 む領域 （すなわち配列番号 2で示されるアミノ酸配列のうちの第 92番目〜第 167 番目のアミノ酸からなる領域） 、 並びに、 EGF-4、 EGF-5及び EGF-6を含む領 域 （すなわち配列番号 2で示されるァミノ酸配列のうちの第 131番目〜第 244番 目のアミノ酸からなる領域） である。
抗原とするペプチドの作製方法は、 化学合成でも、 大腸菌などを用いる遺伝子 工学的手法による合成でもよく、 当業者に周知の方法を用いることができる。 ぺプチドの化学合成を行う場合は、 ぺプチドの合成の周知方法によつて合成す ることができる。 また、 その合成は、 固相合成法及び液相合成法のいずれをも適 用することができる。 市販のペプチド合成装置 （例えば、 島津製作尸; Γ製：
PSSM-8など） を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、 まず、 当該ペプチドをコードする DNAを設計し合成する。 当該設計及び合成は、 例えば、 全長 hDlk- 1遺伝子を含 むベクター等を铸型とし、 所望の DNA領域を合成し得るように設計したプライ マーを用いて、 PCR法により行うことができる。 そして、 上記 DNAを適当なベ クタ一に連結することによってタンパク質発現用組換えべクターを得、 この組換 えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質
¥s換体を得る (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 。
ベクターには、 宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ドが使 用される。 さらに、 動物ウィルス、 昆虫ウィルスベクターを用いることもできる, 組換えベクターの作製は、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、 適当な べクター DNAの制限酵素部位等に挿入してべクターに連結すればよい。 形質転 換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定さ れるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌等） 、 酵母、 動物細胞 （
COS細胞、 CHO細胞等） 、 昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。 ャギ等の哺乳動物 を宿主として使用することも可能である。 宿主への組換えベクターの導入方法は 公知である。
そして、 前記形質転換体を培養し、 その培養物から抗原として使用されるぺプ チドを採取する。 「培養物」 とは、 （a )培養上清、 （b )培養細胞若しくは培養菌 体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、 目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は細 胞を破砕することによりペプチドを抽出する。 また、 目的ペプチドが菌体外又は 細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により 菌体又は細胞を除去する。 その後、 ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生 化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトダラ フィ一、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用 いることにより、 目的のぺプチドを単離精製することができる。 本発明においては、 無細胞合成系を用いた ώ ' ^訳により抗原となるぺプ チドを得ることもできる。 この場合は、 RNAを铸型にする方法と DNAを铸型に する方法 （転写 Ζ翻訳） の 2通りの方法を用いることができる。 無細胞合成系と しては、 市販のシステム、 例えば Express way™システム （インビトロジェン社 ) 、 PURESYSTEM (登録商標；ポス トゲノム研究所） 、 TNTシステム （登録 商標；プロメガ社） 等を用いることができる。
上記のごとく得られたペプチドは、 適当なキャリアタンパク質、 例えば牛血清 アルブミン (BSA)、 キーホールリンペッ トへモシァニン (KLH)、 ヒ トチログロブ リン、 ニヮトリガンマグロプリン等に結合することも可能である。
また抗原は、 hDlk- 1のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) 又は前述したその部分配 列において 1又は複数のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から なるペプチドであってもよい。 例えば、 hDlk-1のアミノ酸配列又はその部分配 列のうち 1又は複数個 （好ましくは 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに 好ましくは 1個〜 5個） ） のアミノ酸が欠失しており、 1又は複数個 （好ましく は 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個） ） のアミ ノ酸が他のアミノ酸で置換されており、 あるいは、 1又は複数個 （好ましくは 1 個又は数個 '（例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個） ） の他のアミ ノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるぺプチドを使用することもできる。 本発明において、 細胞等に導入するための遺伝子としては、 hDlk- 1ダンパク 質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする 遺伝子が挙げられる。 そのような遺伝子としては、 例えば、 配列番号 1に示され る塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
また、 細胞等に導入するための遺伝子としては、 配列番号 1に示される塩基配 列に相補的な配列とス トリンジヱントな条件下でハイブリダイズし且つ hDlk-1 活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、 又はその部分配列を使用するこ とも可能である。
「ストリンジヱントな条件」 とは、 ハイブリダィズさせた後の洗浄時の条件で あって、 バッファーの塩 （ナトリウム） 濃度が 10〜500mMであり、 温度が 42°C 〜72°C、 好ましくは、 上記塩濃度が 50〜300mMであり、 温度が 55〜68。Cでの条 件をいう。
遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法に より、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィンビトロジェン社製） 、 TaKaRa Site Directea Mutagenesis System (Mutan-K、 Mutan- Super
Express Km等： タカラバイオ社製） を用いて行うことができる。
( 2 ) ポリクローナル抗体の作製
調製した抗原を、 免疫のため哺乳動物に投与する。 哺乳動物は特に限定はされ ず、 例えばラット、 マウス及びゥサギなどを挙げることができ、 なかでもマウス が好ましい。
抗原の動物一匹あたりの投与量は、 アジュバントの有無により適宜設定するこ とができる。 アジュバントとしては、 フロイント完全アジュバント (FCA)、 フロ イント不完全アジュバント (FIA)、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げら れる。 免疫は、 主として静脈内、 足摭、 皮下、 腹腔内等に注入することにより行 うことができる。 また、 免疫の間隔については、 特に限定されず、 数日から数週 間間隔、 好ましくは 1週間間隔で、 1〜： 10回、 好ましくは 2〜 3回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日から 3〜7日後に、 酵素免疫測定法 （ELISA又は EIA) や 放射性免疫測定法 （RIA) 等で抗体価を測定し、 所望の抗体価を示した日に採血 して、 抗血清を得ることができる。 上記抗体の採取方法において、 抗体の精製が 必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過ク 口マトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の公知の方法を適宜選 択して、 又はこれらを組み合わせることにより、 精製することができる。 その後 は、 抗血清中のポリクローナル抗体の反応性を ELISA法などで測定する。
( 3 ) モノクローナル抗体の作製
(3-1) 抗体産生細胞の採取 本発明の抗 hDlk-1抗体は、 限定はされないが、 モノクローナル抗体であるこ とが好ましい。
調製した抗原を、 免疫のため哺乳動物、 例えばラット、 マウス及びゥサギなど に投与する。 抗原の動物一匹あたりの投与量は、 アジュバントの有無により適宜 設定することができる。 アジュバントとしては上記と同様である。 免疫手法も前 記と同様である。 そして、 最終の免疫日から 1〜60日後、 好ましくは 1〜14日 後に、 抗体産生細胞を採取する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細 胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、 なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好 ましい。
(3-2) 細胞融合
ハイプリ ドーマ （抗体産生細胞株） を得るため、 抗体産生細胞とミエローマ細 胞との細胞融合を行う。 抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、 マウ スなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。 用いる細胞株 としては、 薬剤選択性を有し、 未融合の状態では HAT選択培地 （ヒポキサンチ ン、 アミノプテリン及びチミジンを含む） で生存できず、 抗体産生細胞と融合し た状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
ミエローマ細胞としては、 例えば、 P3-X63-Ag8.653、 P3-X63_Ag8(X63)、
P3-X63-Ag8.Ul(P3Ul)、 P3/NS I/l-Ag4-l(NSl) 及び Sp2/0-Agl4(Sp2/0)等のマ ウスミエローマ細胞株が挙げられる。 ミエローマ細胞の選択は、 抗体産生細胞と の適合性を適宜考慮して行うことができる。
次いで、 ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞融合は、 血 清を含まなレ、 DMEM及び RPMI-1640培地などの動物細胞用培地中で、 1 χ106〜 1 xlO7個 ZmLの抗体産生細胞と 2 χ105〜 2 xlO6個 ZmLのミエ口一マ細胞とを 混合する。 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 （抗体産生細胞： ミエロー マ細胞） は、 限定はされないが、 通常、 1 ： 1〜 1 0 ： 1とすることが好ましく、 より好ましくは 3 ： 1である。 次に、 細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。 細胞融合促進剤として、 例えば、 平均分子量 1，000〜6，000ダルトン (D)のポリェ チレングリコールなどを使用することができる。 また、 電気刺激 （例えばエレク トロポレーシヨン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて、 抗体産生細胞とミ エローマ細胞とを融合させることもできる。
(3-3) ハイブリ ドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマを選別する。 その方法と して、 細胞懸濁液を、 例えばゥシ胎児血清含有 RPMI-1640培地などに適当に希 釈後、 マイクロタイタープレート上に播き、 各ゥヱルに選択培地を加え、 以後適 当に選択培地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 14日 前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 hDlk-1に反応する抗体 が存在するか否かをスクリーニングする。 ハイブリ ドーマのスクリーニングは、 通常の方法に従えばよく、 特に限定はされない。 例えば、 ハイプリ ドーマとして 生育したゥエルに含まれる培養上清の一部を採取し、 ELISA、 EIA及び RIAなど によってスクリーニングすることができる。
融合細胞のクローニングは、 限界希釈法等により行うことができる。 hDlk-1 に強い反応性を示す抗体をフローサイ トメ トリー等により判定し、 これを産生す るハイプリ ドーマを選択し、 クローンとして樹立する。
(3-4) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイプリ ドーマを培養し、 得られる培養物からモノクローナル抗体を 採取する方法として、 通常の細胞培養法、 又は腹水形成法等を採用することがで きる。 「培養」 とは、 ハイプリ ドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させるこ と、 あるいはハイプリ ドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意 味する。
細胞培養法においては、 ハイブリ ドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640 培地、 MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、 通常の培養条件 （ 例えば 37°C、 5 %C02濃度） で 7〜： 14日間培養し、 その培養上清から抗体を取 得することができる。 腹水形成法の場合は、 ミエ口一マ細胞由来の哺乳動物と问植糸動物の腹腔 に ハイブリ ドーマを約 l xlO7個投与し、 ハイプリ ドーマを大量に増殖させる。 そ して、 2〜 3週間後に腹水を採取することが好ましい。
上記抗体の採取方法において、 抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティークロマトグラフィー 等の公知の方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わせることにより精製する ことができる。
(3-5) 抗腫瘍活性を有するクローンの選別
本発明の抗 hDlk-1抗体は、 in oで抗腫瘍活性を有する抗体である。
ここで、 「抗腫瘍活性」 とは、 腫瘍細胞 （癌細胞） を死滅させる活性又は腫瘍 成長を阻害する活性を意味する。 本発明において、 抗腫瘍活性としては、 例えば、 腫瘍血管新生阻害活性が好ましく挙げられる。 また、 本発明の抗体が抗腫瘍活性 を発揮しうるヒ ト腫瘍 （腫瘍細胞） の種類としては、 hDlk- 1の発現が確認され ている前述した公知のヒ ト腫瘍 （具体的には、 固形癌では、 祌経内分泌腫瘍、 神 経芽細胞腫、 神経膠腫、 1型神経線維腫症、 小細胞肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌及び卵 巣癌など、 血液癌では、 骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病など。 ） ならび に本発明者が新たに hDlk-1の発現を確認したヒ ト大腸癌及びヒ ト乳癌が挙げら れる。 なかでも特に、 大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫のうち の 1種又は 2種以上が好ましく挙げられる。
in oでの抗腫瘍活性の確認は、 例えば、 所望の腫瘍細胞をマウスの皮下に 移植した担癌マウスを用い、 このマウスに前記のとおり得られた抗体を投与する ことにより行うことができる。 この場合、 抗体の投与は、 腫瘍細胞の移植直後か ら行ってもよいし （Preventionモデル） 、 移植に腫瘍が所定の体積になったの を確認してから行ってもよい （Treatmentモデル） 。 投与方法は、 限定はされな いが、 例えば、 3日に 1回、 20mg/kg体重、 腹腔内投与とすることができる。
Preventionモデルの場合は、 腫瘍形成頻度と腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無 及びレベルを評価することができる。 Treatmentモデルの場合は、 腫瘍体積によ り抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。 本発明において、 in vivoで抗腫瘍活性を有する抗 hDlk- 1抗体としては、 例 えば、 受託番号が FERM BP-10707であるハイプリ ドーマにより産生される抗 hDlk-1モノクローナル抗体 （クローン名 ： M3-1) 、 受託番号が FERM BP- 10899であるハイブリ ドーマにより産生される抗 hDlk-1モノクローナル抗体 (クローン名 ： D 2- 14) 、 及び受託番号が FERM BP-10900であるハイプリ ド 一マにより産生される抗 hDlk- 1モノクローナル抗体 （クローン名 ： DI-6) など が好ましく挙げられる。 また、 クローン名 ： DI-2- 14の抗 hDlk-1モノクローナ ル抗体も in oでの高い抗腫瘍活性を有する抗体として好ましい。
ここで、 受託番号が FERM BP- 10707 であるハイブリ ドーマは、 「Mouse_ Mouse hybridoma: M3 1J と称し 2006年 10月 18 日付で、 受託番号が FERM BP- 10899 であるハイプリ ドーマは、 「Mouse-Mouse hybridoma D 2- 14」 と 称し 2007年 8月 21 日付で、 受託番号が FERM BP- 10900であるハイブリ ドー マは、 「Mouse-Mouse hybridoma DI_6」 と称し 2007年 8月 21 日付で、 いず れも独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （〒 305-8566 茨 城県つくば巿東 1-1-1 中央第 6) に寄託されたものである。
また、 本発明の抗 hDlk-1抗体としては、 例えば、 H鎖 V領域の CDR1〜3の ァミノ酸配列が、 それぞれ順に、 配列番号.3 0〜 3 2で示されるァミノ酸配列で あるもの、 及び/又は、 L鎖 V領域の CDR1〜3のアミノ酸配列が、 それぞれ順 に、 配列番号 3 3〜3 5で示されるアミノ酸配列であるものが、 好ましく挙げら れる。 上記 H鎖 V領域としては、 例えば、 配列番号 2 3で示されるアミノ酸配列 からなるものが好ましく、 上記 L鎖 V領域としては、 例えば、 配列番号 2 5で 示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
さらに、 本発明の抗 hDlk-1抗体としては、 例えば、 受託番号が FERM BP- 10707、 FERM BP- 10899, 又は FERM BP- 10900であるハイブリ ドーマにより 産生されるモノクローナル抗体が結合 （認識） する部位 （例えばェピトープ） に 結合する抗 hDlk-1抗体も好ましく挙げられる。
(3-6) 抗 hDlk- 1抗体のェピトープ
本発明の抗 hDlk-1抗体のェピトープ （抗原決定基） は、 抗原である hDlk- 1の 少なくとも一部であればよく限定はされないが、 例えば、 配列番号 1に示される hDlk-1のアミノ酸配列中の、 第 2 6番目〜第 8 5番目のアミノ酸からなる領域 (hDlk-1の EGF- l〜EGF-2を含む領域） 、 第 9 2番目〜第 1 6 7番目のァミノ 酸からなる領域 （hDlk-1の EGF-3〜EGF-4を含む領域） 、 若しくは第 1 3 1番 目〜第 2 4 4番目のアミノ酸からなる領域 （hDlk-1の EGF-4〜EGF-6を含む領 域） の少なく とも一部であることが好ましい。 なかでも、 hDlk-1の EGF-4〜 EGF-6を含む領域及び EGF-4〜EGF-6を含む領域がより好ましく、 特に好まし くは、 第 9 2番目〜第 1 2 0番目のアミノ酸からなる領域 （hDlk-1の EGF-3を 含む領域） である。 当該領域を認識する （当該領域と結合する） 抗 hDlk- 1抗体 は、 例えば、 腫瘍細胞内へのインターナリゼーシヨン活性が高く、 後述するィム ノコンジユゲート等の用途に極めて有用なものである。
(4 ) 遺伝子組換え抗体、 及び抗体断片
(4-1) 遺伝子組換え抗体
本発明の抗 hDlk-1抗体の好ましい態様の一つとして、 遺伝子組換え抗体が挙 げられる。 遺伝子組換え抗体としては、 限定はされないが、 例えば、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体 及びヒ ト抗体等が挙げられる。
キメラ抗体 （すなわちヒ ト型キメラ抗体） は、 マウス由来抗体の可変領域をヒ ト由来の定常領域に連結 （接合） した抗体であり （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
, 6851-6855, (1984) 等を参照） 、 キメラを作製する場合は、 そのように連結 した抗体が得られるよう、 遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。 ここで、 マウス由来抗体の可変領域としては、 H鎖 V領域は、 例えば、 配列番号 2 3で示 されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、 L鎖 V領域は、 例えば、 配列番号 2 5で示されるァミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒ ト型化抗体を作製する場合は、 マウス抗体の可変領域から相補性決定領域 （ CDR) をヒ ト可変領域に移植して、 フレームワーク領域 （FR) 〖まヒ ト由来のも ので CDRはマウス由来のものからなる、 再構成した可変領域を作製する （いわ ゆる CDRグラフティング （CDR移植） ） 。 次に、 これらのヒ ト型化された再構 成ヒ ト可変領域をヒ ト定常領域に連結する。 このようなヒ ト型化抗体の作製法は、 当分野において周知である （Nature, 321, 522-525 (1986；； J. Mol. Biol., 196. 901-917 (1987)； Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86： 10029- 10033 (1989)；特表平 4-502408号公報 （特許第 2828340号公報； クィーンら） 等を参 照） 。 ここで、 本発明のヒ ト型化抗 hDlk-1抗体に用いることができるマウス由 来の CDR配列としては、 限定はされないが、 例えば、 H鎖 V領域の CDR1〜3と して （それぞれ順に） 配列番号 3 0〜3 2に示されるアミノ酸配列が、 L鎖 V領 域の CDR1〜3として （それぞれ順に） 配列番号 3 3〜3 5に示されるアミノ酸 配列が、 好ましく挙げられる。
ヒ ト抗体 （完全ヒ ト抗体） は、 一般に V領域の抗原結合部位である超過変領域 (Hyper Variable region) 、 V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、 ヒ トの抗体と同じ構造を有するものである。 但し、 超可変部位は他の動物由来であ つてもよい。 ヒ ト抗体を作製する技術も公知であり、 ヒ トに共通の遺伝子配列に ついては遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。 ヒ ト抗体は、 例えば、 ヒ ト抗体の H鎖及び L鎖の遺伝子を含むヒ ト染色体断片を有するヒ ト抗 体産生マウスを用いた方法 （Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16， 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448； Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10， 69 73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers! Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等を参照） や、 ヒ ト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒ ト抗体を 取得す ο方 fe (Wormstone, I. M.et.ai, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8； Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002)1 (2), 189 203； Siriwardena, D. et.al.,
Opthalmology, (2002)109 (3)， 427 431 等を参照） により取得することができる。 上記キメラ抗体、 ヒ ト型抗体及びヒ ト抗体は、 抗体 Fc領域における N-グリコ シド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコース が結合していない糖鎖であるものが好ましく、 詳しくは、 該フコースの 1位が N-ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にひ結 合していない糖鎖を抗体分子の Fc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる 抗体が挙げられる。 このような抗体であれば、 ADCC活性を飛躍的に向上させる ことができる。 なお、 この点 （抗体 Fc領域における N-グリコシド結合複合型糖 鎖の特徴） は、 前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても 同様に好ましい。
(4-2) 抗体断片
本発明の抗 hDlk-1抗体の断片も、 本発明の抗体に含まれるものとする。 ここ で、 本発明の抗体断片は、 本発明の抗 hDlk- 1抗体と同様に、 hDlk-1に対する結 合活性を有するものであって in oで抗腫瘍活性を有するものである。
当該抗体の断片としては、 抗 hDlk-1ポリクローナル抗体又は抗! iDlk-1モノク ローナル抗体の一部分の領域 （すなわち、 本発明の抗 hDlk-1抗体に由来する抗 体断片） を意味し、 例えば、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv (variable fragment of antibody) 、 一本鎖抗体. (H鎖、 L鎖、 H鎖 V領域、 及び L鎖 V領域等） 、 scFv、 diabody (scFv二量体） 、 dsFv (ジスルフィ ド安定化 V領域） 、 並びに、 相補性 決定領域
Figure imgf000030_0001
determining region： CDR) を少なくとも一部に 含むぺプチド等が挙げられる。
Fabは、 抗体分子をタンパク質分解酵素パパィンで処理して得られる断片のう ち、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体とがジスルフィ ド結合で結合した、 分子量 約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 また、 抗体の Fabをコードする DNAを、 原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、 該べ クタ一を原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造する こともできる。
F(ab')2は、 抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片 のうち、 Fabがヒンジ領域のジスルフィ ド結合を介して結合されたものよりやや 大きい、 分子量約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 また、 後述す る Fabをチォエーテル結合あるいはジスルフィ ド結合させて、 作製することもで さる。
Fab'は、 上記 F(ab のヒンジ領域のジスルフイ ド結合を切断した、 分子量約 5 万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 また、 抗体の Fab'断片をコードす る DNAを、 原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、 該 ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、 Fab'を製造 することもできる。
scFvは、 1本の H鎖 V領域 （VH) と 1本の L鎖 V領域 （VL) とを適当なぺプチ ドリンカ一 （P) を用いて連結した、 VH-P-VLないしは VL-P-VHポリペプチド で、 抗原結合活性を有する抗体断片である。 scFvは、 抗体の VHおよび VLをコ 一ドする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築して、 該 DNAを原核生 物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核 生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、 製造することができる。
diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、 二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。 二価の抗原結合活性は、 同一であることもできるし、 一方を異な る抗原結合活性とすることもできる。 diabodyは、 抗体の VHおよひ VLをコード する cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを Pのアミノ酸配列の長さが 8残基 以下となるように構築して、 該 DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用 発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入すること により発現させて、 製造することができる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換 したポリペプチドを、 該システィン残基間のジスルフィ ド結合を介して結合させ たものをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は、 Reiterらにより示さ れた方法 （Protein Engineering, 7， 697-704， 1994) に従って、 抗体の立体構造 予測に基づいて選択することができる。 dsFvは、 抗体の VHおよひ VLをコード する cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築して、 該 DNAを原核生物用 発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物 又は真核生物へ導入することにより発現させて、 製造することができる。
CDRを含むペプチドは、 VH又は VLの CDR (CDR1〜3) の少なくとも 1領域 以上を含んで構成される。 複数の CDRを含むペプチドは、 直接又は適当なぺプ チドリンカーを介して結合させることができる。 CDRを含むペプチドは、 抗体 の VHおよび VLの CDRをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現べ クタ一又は真核生物用発現ベクターに挿入して、 該発現ベクターを原核生物又は 真核生物へ導入することにより発現させて、 製造することができる。 また、
CDRを含むペプチドは、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法） 及 び tBoc法 （t-プチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によって製造すること もできる。
本発明の抗体断片としては、 そのままの形状で N-グリコシド結合複合型糖鎖 が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖である抗体 Fc領域の一部または全部を含む抗体断片でもよく、 また、 上述し た抗体断片と N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体 Fc領域の一部または全 部との融合タンパク質であってもよい。 このような抗体断片であれば、 ADCC活 性を飛躍的に向上させることができるため、 好ましい。
本発明の抗体断片の具体例としては、 限定はされないが、 例えば、 配列番号 3 0〜3 2で示されるアミノ酸配列 （H鎖 V領域の CDR1〜3) を少なくとも一部に 含むものが挙げられ、 具体的には、 配列番号 2 3で示されるアミノ酸配列 （H鎖 V領域） を含むものが挙げられる。 また、 当該抗体断片としては、 配列番号 3 3 〜3 5 (L鎖 V領域の CDR1〜3) で示されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含 むものが挙げられ、 具体的には、 配列番号 2 5で示されるアミノ酸配列 （L鎖 V 領域） を含むものが挙げられる。
以下、 本明細書中の説明においては、 上述した抗体断片も、 本発明の抗 hDlk- 1抗体に含まれるものとする。
3 . 抗体一薬剤複合体の作製
上記本発明の抗 hDlk-1抗体を用いたィムノコンジユゲート等として、 当該抗 体と、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、 杭体一薬剤複 合体を提供することができる。 なお、 予め、 当該抗体分子と、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞活性を有する化合物とを、 それぞれ調製したのち、 これらを複合化さ せて得られたものは、 一般に、 ィムノコンジュゲートと称される。 また、 遺伝子 組換え技術を用い、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞活性を有する化合物としてのタ ンパク質トキシンを、 遺伝子上で抗体遺伝子と連結させて、 1つのタンパク質 （ 融合タンパク質） として発現させて得られたものは、 一般に、 ィムノ トキシンと 称される。
抗腫瘍活性を有する化合物としては、 例えば、 ドキソルビシン、 カリケアマ イシン、 マイ トマイシン C、 Auristatin Eなどが挙げられる。
殺細胞活性を有する化合物としては、 例えば、 サボリン、 リシン、 緑膿菌外 毒素、 ジフテリアトキシン等が挙げられ、 なかでもサボリン及び緑膿菌外毒素 が好ましく用いられる。
抗体一薬剤複合体の作製方法としては、 限定はされないが、 例えば、 ジスルフ ィ ド結合ゃヒ ドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが 挙げられる。
上記本発明の抗 hDlk-1抗体は、 hDlk-1を発現する標的腫瘍細胞内へのィンタ ーナリゼーシヨン活性に優れたものである。 そのため、 予め、 抗腫瘍活性及び 又は殺細胞活性を有する化合物を複合化させておくことにより、 これら化合物を 腫瘍钾胞に直接かつ高選択的に作用させることができる。 本発明の抗体一薬剤複 合体は、 標的腫瘍細胞への薬剤送達能に極めて優れたものである。
なお、 細胞内へのインターナリゼーシヨン活性は、 抗体をローダミン等により 蛍光標識し、 細胞内への移行挙動及び抗体の局在性について蛍光顕微鏡等を用い て観察することにより評価することができる。
また本発明においては、 抗体一薬剤複合体において、 抗体の代わりに前述の抗 体断片を用いた抗体断片一薬剤複合体を提供することもできる。 抗体断片一薬剤 複合体の詳細については、 上述の抗体一薬剤複合体の説明を適宜適用することが できる。
以下、 本明細書中の説明においては、 抗体断片一薬剤複合体も、 本発明の抗体 一薬剤複合体に含まれるものとする。
4 . 医薬組成物
本発明の抗 hDlk-1抗体及び抗体一薬剤複合体は、 医薬組成物に含まれる有効 成分として有用である。 当該医薬組成物は、 腫瘍の治療用及び 又は診断用の^楽組成物と して 用で ある。 特に、 本発明の抗 hDlk-1抗体、 及び該抗体を含む抗体一薬剤複合体は、 抗腫瘍活性として、 腫瘍血管新生阻害活性を有するものであるため、 腫瘍の治療 用に使用されることが好ましい。 すなわち、 本発明の抗 hDlk-1抗体及び抗体一 薬剤複合体は、 腫瘍治療剤、 腫瘍血管新生阻害剤及び腫瘍診断剤に含まれる有効 成分として有用なものである。
本発明の医薬組成物は、 本発明の抗 hDlk- 1抗体及び Z又は抗体一薬剤複合体 を有効成分として含み、 さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態 で提供することが好ましい。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患 （腫瘍） としては、 hDlk-1の発 現が確認されている前述した公知のヒ ト腫瘍ならびに本発明者が新たに hDlk- 1 の発現を確認したヒ ト大腸癌及びヒ ト乳癌が挙げられる。 なかでも特に、 大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経細胞腫のうちの 1種又は 2種以上が好ましく挙 げられる。 これらの疾患は単独であってもよく、 2つ以上が併発してもよレ、。
「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤、 安定 剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解 補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の 1種以上を用 いることにより、 注射剤、 液剤、 カプセル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤 等の形態の医薬組成物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経口あ るいは非経口的に投与することができる。 非経口投与のためのその他の形態とし ては、 1つ以上の活性物質を含み、 常法により処方される注射剤などが含まれる。 注射剤の場合には、 生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される 担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
特に、 本発明の抗 hDlk-1抗体由来の抗体断片 （中でも低分子のもの） を生体 内に投与する場合は、 上記に加えて、 コロイ ド分散系を用いることができる。 コ ロイ ド分散系は化合物 （抗体断片） の生体内の安定性を高める効果や、 特定の臓 器、 組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。 コロイ ド分散 系は、 通常用いられるものであればよく限定はされないが、 ポリエチレングリコ ール、 高分子複合体、 高分子凝集体、 ナノカプセル、 ミクロスフヱァ、 ビーズ、 及び水中油系の乳化剤、 ミセル、 混合ミセル及びリポソ一ムを包^する脂莨をべ ースとする分散系を挙げることができ、 好ましくは、 特定の臓器、 組織又は細胞 へ化合物を効率的に輸送する効果のある、 複数のリボソーム、 人工膜の小胞であ る (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem.et Biop ys. Acta, 1990, 1029, 91； Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995， 6, 698) 。
本発明の医薬組成物の投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間、 あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗 hDlk-1抗体 及び抗体一薬剤複合体の種類などにより異なる。 通常、 成人一人あたり、 一回に つき 600 / gから 6000mgの範囲で投与することができるが、 この範囲に限定され るものではない。
例えば注射剤により投与する場合は、 ヒ ト患者に対し、 1回の投与において 1 kg体重あたり、 100 x g〜100mgの量を、 1 日平均あたり 1回〜数回投与するこ とができる。 投与の形態としては、 静脈内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注 射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、 好ましくは静脈内注射である。 また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈剤 （例えばポリエチレングリコール、 オリ ーブ油等の植物油、 エタノール等のアルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤 として調製することもできる。 そのような注射剤の無菌化は、 フィルターによる 濾過滅菌、 殺菌剤の配合等により行うことができる。 注射剤は、 用時調製の形態 として製造することができる。 すなわち、 凍結乾燥法などによって無菌の固体組 成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用すること ができる。
なお、 本発明は、 腫瘍を治療及び 又は診断する医薬 （薬剤） を製造するため の、 前記本発明の抗 hDlk-1抗体及び 又は抗体一薬剤複合体の使用を提供する ものでもある。 また、 本発明は、 腫瘍を治療用及び 又は診断用の、 前記本発明 の抗 hDlk-1抗体及び 又は抗体一薬剤複合体を提供するものでもある。
さらに、 本発明は、 前記本発明の抗 hDlk- 1抗体及び Z又は抗体一薬剤複合体 を用いる （すなわち患者に投与する） ことを特徴とする腫瘍の治療及び 又は診 断方法を提供するものであり、 また、 腫瘍を治療及び Z又は診断するための、 前 記本発明の抗 hDlk-1抗体及び 又は抗体一薬剤複合体の便用を提供するもので もある。
5 . 腫瘍の検出方法
本発明の腫瘍の検出方法は、 前記本発明の抗 hDlk-1抗体と、 生体から採取さ れた試料 （以下、 生体試料） とを反応させ、 反応した抗体のシグナルを検出する ことを特徴とする方法である。
前述したように、 hDlk-1は各種腫瘍細胞において特異的に発現することが確 認されているため、 hDlk-l、 特に遊離 hDlk-1 (hDlk-1の細胞外領域部分） は、 各種腫瘍マーカーとして利用することが可能である。 なかでも、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌及びヒ ト肝癌のマーカーとして利用することが好ましい。
そこで、 本発明の抗 hDlk-1抗体を生体試料と反応させ、 反応した抗体のシグ ナルを検出することにより、 腫瘍を検出することができる。 得られた抗体のシグ ナルは、 生体試料中の抗原量 （すなわち hDlk-1量又は遊離 hDlk-1量） の指標と なる。 本発明の抗体を用いた腫瘍の検出は、 まず、 検体として被験者から採取し た生体試料、 例えば検查対象とする組織片又は血液等と、 本発明の抗体とを、 抗 原抗体反応によって結合させる。 次いで、 結合した抗体量の測定結果に基づいて、 生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。 当該測定は、 公知の 免疫学的測定法に従って行えばよく、 例えば、 免疫沈降法、 免疫凝集法、 標識免 疫測定法、 免疫比懸濁法、 ウェスタンプロット法、 フローサイ トメ トリー法など を用いることができる。 標識免疫測定法では、 抗体のシグナルは、 標識抗体を用 いて直接検出した標識量で表すほか、 既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準 液として相対的に表してもよい。 すなわち、 標準液と検体を測定計により測定し、 標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。 標識免疫測定法としては、 例えば ELISA法、 EI法、 RIA法、 蛍光免疫測定法
(FIA)、 化学発光免疫測定法 (Luminescence immunoassay)等が挙げられる。 な かでも特に、 ELISA法が、 簡便かつ高感度という点で好ましい。
本発明においては、 上記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の 状態を評価又は診断することができる。 例えば、 検出結果が所定の基準値を超え るものを腫瘍陽性、 所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、 陽性の場合には、 いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、 腫瘍の状態を評価するこ とができる。 ここで、 腫瘍の状態とは、 腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味 し、 腫瘍の発症の有無、 進行度、 悪性度、 転移の有無及び再発の有無等が挙げら れる。
上記評価にあたり、 腫瘍の状態としては 1つを選択してもよいし、 複数個を組 み合わせて選択してもよい。 腫瘍の有無の評価は、 得られた検出結果に基づいて、 所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行う ことができる。 腫瘍の悪性度は、 癌がどの程度進行しているのかを示す指標とな るものであり、 検出結果に基づいて、 病期 (Stage)を分類して評価したり、 ある いは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。 例えば、 検出 結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。 腫瘍の転移 は、 検出結果を指標として、 原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現してい るか否かにより評価することができる。 再発は、 間欠期又は寛解の後に検出結果 が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。
6 . 腫瘍の検出用又は診断用キット
本発明の抗 hDlk- 1抗体は、 腫瘍の検出用又は診断用キットの形態で提供する ことができる。 本発明のキットは抗体を含むが、 その他に、 標識物質、 あるいは 抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。 抗体の標 識物質とは、 酵素、 放射性同位体、 蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標 識されたものを意味する。 本発明のキットは、 上記の構成要素のほか、 本発明の 検出を実施するための他の試薬、 例えば標識物が酵素標識物の場合は、 酵素基質 (発色性基質等） 、 酵素基質溶解液、 酵素反応停止液、 あるいは検体用希釈液等 を含んでいてもよい。 また、 各種バッファー、 滅菌水、 各種細胞培養容器、 各種 反応容器 （エツペンドルフチューブ等） 、 ブロッキング剤 （Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等の血清成分） 、 洗浄剤、 界面活性剤、 各種プレート、 アジ化ナトリウム等の防腐剤、 及び実験操作マニュアル （説明書 ) 等を含んでいてもよい。 本発明のキットは、 上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることがで き、 極めて有用性が高いものである。 以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
ぐ材料及び方法 >
1 . 細胞株
ΗΕΚ-293-hDlk細胞、 7E2-C_hDlk細胞、 及び Huh-7-hDlk細胞は、 WO 2005/052156に記載の通り作製した細胞株を用いた。 また、 ヒ ト神経芽細胞腫 SK-N-F1細胞は、 American Type Culture Collection (ATCC ； カタログ No.CRL2142) から入手した。
SW480-hDlk細胞については、 ヒ ト大腸癌由来細胞株 SW480 (入手元：東京 大学分子細胞生物学研究所 機能形成） に、 全長 hDlk-1遺伝子を含む発現べクタ 一 pcDNA-hdlk-Flag (WO 2005/052156 参照） を遺伝子導入し、 抗生物質 G418 (geneticin, GIBCO BRL) による選択を行った後、 hDlk-1を安定して発現して いる細胞株を樹立することにより得た。
2 . 抗 hDlk-1ポリク口ーナル抗体の作製
hDlk-1の細胞外領域 （FA-1) 発現ベクターを構築するにあたり、 以下のプラ イマ一を設計し、 合成した。 フォヮ一ド (F)プライマー： 5'-cgcgtccgcaaccagaagccc-3， （酉己列番号 3 ) リノくース (R)プフイマ一 ： 5'-ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3' (酉己歹 IJ畨 4 ) この際、 Rプライマーには Xholによる制限酵素消化配列を付加した。 これらの プライマーを用い、 hDlk-1の cDNAを踌型として、 以下の反応液組成及び反応条 件で、 PCR反応を行った。 《反応液組成》
铸型 DNA： 1 / L
10XPCRバッファ 5 β Li
2.5mM d TP： 4μ
TaqDNAポリメラーゼ 0.5 μL
Fプライマー （ΙΟμΜ)： 1 μ L
Rプライマー （10//M) 1 L
滅菌水： 37.5 «L
A口き PT· · . 50/iL
《反応条件》
「熱変性'解離： 95°C (60 sec) →ァニーリング： 55°C (60 sec) →合成 '伸長： 72°C (60 sec) 」 を 1サイクルとして、 計 3 5サイクル。 得られた hDlk-1の細胞外領域 （ヒ ト FA1) の cDNAを、 pCRIIベクター (イン ビトロジェン） にクローニングした （pCRII-hFAl) 。 クローニングしたヒ ト FA1の cDNAは、 シークェンサ一により確認した。
pCRII-hFAl力 ら ヒ ト FAl cDNAを含む EcoRI/XhoI断片を切り 出し、 pcDNA4/Myc-Hisべクタ一（ィンビトロジェン） の EcoRlZXhoI部位に挿入した (pcDNA4-hFAl) 。 この発現ベクターには C末端側に Mycタグ及び Hisタグ配 列が付加されており、 ヒ ト FA1は Mycタグ及び Hisタグとの融合タンパク質とし て発現する。 融合タンパク質を抗原として、 常法により、 ゥサギに免疫を行い、 抗 hDlk-1ポリク口ーナル抗体を作製した。 3. hDlk-1遺伝子の EGF様モチーフ欠失変異体の作製
抗 hDlk-1モノクローナル抗体のェピトープ解析に用いるため、 以下の通り、 hDlk-1遺伝子の EGF様モチーフ欠失変異体を作製した。
まず、 該当する領域を PCR法で増幅するためのプライマーを作製した。 作製 した各プライマー配列を、 下記表 1に示す。 この時、 Fプライマーには Notlによ る制限酵素消化配列を付加し、 Rプライマーには Xbalによる制限酵索消化 タリを 付加した。 ただし、 EGF (4-6)及び EGF (5-6)の領域を増幅するための Rプライマ 一には、 Xbalによる制限酵素消化配列は付加していない。 なお、 表 1中のコン ス トラク ト欄につき、 例えば 「EGF (1-4)」 との表記は、 hDlk-1の FA-1領域に 存在する 6つの EGF様モチーフ （EGF-l〜EGF-6) のうち、 EGF-1から EGF-4 までの連続した領域を意味する。
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
※ それぞれ、上段が Fプライマー、下段が Rプライマー 上記各プライマーを用いた PCRは、 以下の反応液組成及び反応条件で行つた。 《反応液組成》
铸型 DNA：
10 X PCRバッファ' Ο μ L
2.5mM dNTP： 4u L
Taq DNAポリメラーゼ： 0.5 u L
Fプライマー （10 Μ)： l u L
Rプライマー （10 μ Μ)： I M L
滅菌水： 37.5 u L
八き + . 50 u L
《反応条件》
「熱変性'解離： 95°C (60 sec) →ァ二一リング ： 55°C (60 sec) →合成 '伸長： 72°C (60 sec) 」 を 1サイクルとして、 計 3 5サイクル。 PCR法で増幅した各断片は TAクローニングキット （インビトロジェン） を用 いて pCR II ベクター （インビトロジェン） にクローニングし、 塩基配列を確認 した。 その後、 Not I/Xba Iで切断した断片を得、 当該断片を pMEl8S-CFHX- FXYD TMの Not I/Xba I部位へ、 サブクロ一エングした。 なお、 pME18S_ CFHX FXYD TMは、 発現させた目的タンパク質が N末端にヒ ト CD8a ( GenBank Accession No. NM_001768) のシグナル配列及び Hisタグ配列を有す るものとなるように設計された発現ベクターである （入手元：東京大学分子細胞 生物学研究所機能形成） 。
4 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体の作製
(1) 細胞免疫， タンパク抗原免疫
hDlk-1発現細胞株 （ΗΕΚ-293-hDlk細胞， 7E2-C_hDlk細胞） 、 及び上記方法 で調製した hDlk-1の FA-1領域 （以下、 hFA- 1) を抗原とした。 hDlk-1発現細胞 株は、 lxlO7 cell, 1^ 1タンパクは20 ^を免疫補助剤 （完全フロイントアジュ バンド：和光純薬工業） 、 または TiterMax Gold (フナコシ株式会社)と、 1 ： 1 で混合してェマルジヨンを調製し、 6週齢のラッ ト （Wister) 、 マウス （ C57/BL6, Balb/c) の両足躕に注射した （初回免疫） 。 初回免疫から 3日後及び 10日後に追加免疫を行い、 最終免疫の翌日に、 両膝膏リンパ節を採取し、 リン パ球を調製した。 追加免疫は、 細胞免疫では 5 X 106 cellの PBSによる細胞懸濁液 を用い、 タンパク質抗原の場合は、 5 μ の PBS溶液を用いた。 最終免疫の翌日 に、 両膝膏リンパ節を採取し、 リンパ球を調製した。 なお、 追加免疫時には、 PBSによる細胞懸濁液を抗原とした。 調製したリンパ球とマウスミエローマ細 胞株 （P3-X63-Ag8.653) とを、 3 ： 1の割合で混合し、 ポリエチレングリコー ル法で細胞融合を行った。 96穴平底プレートで HAT (アミノプテリン、 ヒポキ サンチン、 チミジン） を含む選択培地を用い、 5% C02インキュベーターで培養 した。 10日〜 14日培養し、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清を、 Cell ELISA (後述） による一次スク リーニング、 HEK-293細胞を用いた FACS解析 で 2次スクリーニングを行った。 その後、 限界希釈法で抗 hDlk-1モノクローナ ル抗体を産生するハイプリ ドーマクローン作製した。 - (2) DNA免疫
同様に、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体を作製する目的で、 DNA免疫法という 方法を用いることにより、 hDlk-1の立体構造を認識し、 その生物生理活性を阻 害する特異的モノクローナルを作製した。 DNA免疫法は、 マウス体内において、 導入した発現ベクターに組み込まれた hDlk- 1遺伝子が発現されるため、 本来の 立体構造や翻訳後の各種修飾 （例えば糖鎖修飾及びジスルフィ ド架橋等） を維持 した形で、 抗原を提示することが可能なため、 従来の変性タンパク質や合成ぺプ チドを免疫源とした場合には困難な、 本来の hDlk-1の立体構造を認識し、 その 生物生理活性を阻害する特異的モノクローナルの作製を試みた。
hDlk-1の全長 cDNAをタグ付の哺乳動物発現べクタ一に組み込む。 構築した遺 伝子コンストラク トが設計した通りに細胞表面に発現されるかどうかについて、 免疫実施前に哺乳細胞を用いて検証した。 すなわち、 構築した遺伝子コンス トラ ク トを哺乳細胞に一過性発現導入した。 導入した哺乳細胞を C02インキュベー ターにて 24時間培養し、 FCM解析に用いた。 FCM解析する際、 上記の導入遺伝 子に付加しているタグに対する抗体を、 遺伝子導入した培養細胞が入つている培 養溶液に加え、 30分間静置した。 その後、 タグを特異的に認識する茧光標識し た二次抗体を溶液に添加し、 30分間静置してから FCM解析に使用した。 本発明 で構築した遺伝子コンストラク トが細胞表面に発現していることを証明した。
hDlk-1の立体構造を認識し且つその生物生理活性を阻害する抗 hDlk-1モノク ローナル抗体の開発するため、 前記の通り構築した各種遺伝子コンストラク トを、 単独で又は混合して、 様々な遺伝子導入法 （筋肉注射、 electroporation、 遺伝子 銃） により免疫動物に導入した （約 2〜 3ヶ月間実施） 。 免疫した動物より採取 した血清解析には、 上記 HEK293-hDlk細胞を用いた。 上記の導入遺伝子で免疫 動物より採取した血清を HEK293-hDlk細胞が入っている培養溶液に加え、 30分 間静置した。 その後、 免疫動物の免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識し た二次抗体を溶液に添加し、 30分間静置してから FCM解析に使用した。
HEK293-hDlk細胞を認識する強い特異抗体を産生している動物を解剖し、 常法 に従い、 B細胞を単離して抗 hDlk-1モノクローナル抗体作製した。 5 . 抗体精製
上記方法で作製したハイブリ ドーマのクローンを、 予め （7日前） 2,6,10,14- テトラメチルペンタデカン （プリスタン） を投与された BALB/cヌードマウスの 腹腔内に 3 X 106個投与し、 2週間後の腹水を採取した。 さらに、 この腹水から、 力プリル酸沈澱、 プロテイン Gカラム （HiTrap protein G； GEヘルスケアバイ ォサイエンス） を用いてァフィ二ティー精製を行うことで、 各ハイプリ ドーマク ローンが産生する抗 hDlk-1モノクローナル抗体を得た。 以後の解析は、 この精 製した抗 hDlk-1モノクローナル抗体を用いて、 実施した。
6 . 抗体の標識
作製した抗 hDlk-1モノクローナル抗体のェピトープによる分類、 又はインタ ーナリゼーシヨン活性の評価を行うために、 抗体の標識を行った。 当該抗体のビ ォチン標識は、 ECL Protein Biotinylation module (GEヘルスケアバイォサイェ ンス、 RPN2202)を用いて行った。 ローダミン標識は、 EZ-Label™ Rhodamine Protein Labeling kit (ピアス， 53002)を用いて、 FITC標識は、 EZ-Label™ Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Protein Labeling kit (ピアス、 53004)を用 いて、 各キットに添付のマニュアルに従って行った。
7 . CeU ELISA
ゼラチンでコートした 96穴培養プレート（コーユング）に、 上記 7E2-C(hdlk)株 を 7.5 X 103 細胞 Zゥヱルで播種し、 37°Cで 2日間培養した。 氷冷 PBSで洗浄後、 4 %パラホルムアルデヒ ド溶液で固定、 0.2% Triton-X- 100 (商品名） 溶液で処 理し、 cell ELISA用プレートとした。 以後、 常法に従い、 ELISA法を行った。 具体的には以下の通りである。
まず、 1 %BSA-PBS溶液によるブロッキングを室温で 2時間行った。 次に、 ハイプリ ドーマ上清を加え、 室温で 1時間反応させた後、 0.1%Tween20 (商品 名） -PBS溶液で 3回洗浄した。 二次抗体としてピオチン化抗ラット IgG (ベクタ ーラボラ トリ一）を 0.1%Tween20-PBS溶液で 100倍希釈して使用した。 室温で 1 時間反応させた後、 0.1%Tween20-PBS溶液で 3 回洗浄した。 さ らに 0.1%Tween20-PBS溶液で 1000倍希釈した horseradish peroxidase-streptavidin (HRP；ベクターラボラトリ一）を室温で 1時間反応させ、 0.1%Tween20-PBS溶 液で 3回洗浄した。 TMB(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine: SIGMA)基質溶液を 添加して発色反応を行い、 1 M硫酸を加えて反応を停止させた。 Microplate reader Model 550 (バイオ ' ラッド）を用いて、 吸光度を測定した。
8 . FACS 解析
細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、 細胞懸濁液 （細胞密度 5 X 106ceUs/mL) を調製した。 抗ヒ ト Dlkモノクローナル抗体 0.5 μ gと細胞懸濁液 IOO JU Lとを、 4°Cで 30分間反応させた。 PBSで洗浄後、 PE標識抗マウス IgGま たは PE標識抗ラット IgG (いずれも BDファーミンゲン） （0·5 μ ) と反応 (4°C、 30分)させた後、 FACSCalibur (べク トンディッキンソン)により解析した。
9 . ELISA法による解離定数 （Kd値） の算出
作製した抗 hDlk- 1モノクローナル抗体の抗原親和性 （Kd値)は、 ELISA を用 いた方法で算出した （ Djavadi-Ohaniance L. et al U996入 In Antibody Engineering, Chapter 4, pp77-97. IRL Press, Oxford) 。
具体的には、 96穴培養プレー ト（コ一二ング）に、 精製したリ コンビナント hFA-1タンパク （l w g/mL) を添加して抗原を固相化した （室温， 1時間） 。 次 に、 PBSで 3回洗浄し、 2% スキムミルク （PBS溶液） を加えてブロッキングを 行った （室温、 1時間） 。 PBSで 2回洗浄後、 予め抗原溶液 （精製 hFA- 1タンパ ク ； 50， 25, 12.5， 6.25, 3.125 nM) と抗 hDlk-1モノクローナル抗体の各クローン (0.5nM) とを混合し平衡化させておいた抗原一抗体複合体を、 上記 ELISAプ レートに添加して反応させた （室温、 1時間） 。 PBSで 3回洗浄した後、 ブロッ キング液で希釈した HRP標識抗マウス IgG (最終濃度 l // g/mL)または HRP標識 抗ラット IgG (最終濃度 1 x g/mL) (いずれも GEヘルスケアバイオサイエンス） と反応させた （室温、 1時間） 。
1 0 . 抗ヒ ト Dlk-1モノクローナル抗体のェピトープ解析
作製した約 100種類の抗 hDlk- 1モノクローナル抗体を認識するェピトープによ る分類を行った。 前記発現ベクター hdlk-EGF(l-3)/pME18S-CFHX, hdlk-EGF (3-4)/pME18S-CFHX, hdlk-EGF (4-6)/pME18S_CFHXをそれぞれ COS-7細胞に 遺伝子導入した。 遺伝子導入してから 24〜72時間後に、 細胞をトリプシン処理 によって培養皿から剥がし、 FACS解析によって、 各抗体クローンが hDlk- 1のど の EGF様モチーフを認識するものであるかについて検討した。
1 1 . 免疫組織染色法
ヒ ト癌組織アレイ （Cybrdi 社、 大腸癌組織アレイ Lot: CC05 01 001, 乳癌組 織アレイ Lot: CC08 02-002) は、 脱パラフィン処理後、 10mMクェン酸緩衝液 (pH6.0) 中で、 オートクレーブ （121°C， 5分） を用いて抗原賦活化処理を施し、 抗 hDlk-1ポリクローナル抗体を用いた染色に使用した。 DAB(3，3'-ジアミノベン チジン)を基質とて発色反応を行った後、 対比染色としてへマトキシリンによる 核染色を行った。 具体的には、 以下のようにして行なった。
中性ホルマリンによる固定及びパラフィン包埋された切片を、 脱パラフィン処 理後、 10mMクェン酸ナトリウム溶液中でオートクレーブ U2r(J， 5分） を用い て抗原賦活化処理を施した。 次に、 メタノールに終濃度 0.3%となるように過酸 化水素水を加えた溶液によって、 室温で 20分間処理し内因性のペルォキシダー ゼ活性を除いた。 PBSで室温 5分間の洗いを 2回行い、 ブロックエース試薬 （ 大日本製薬株式会社） を用いて 30分間ブロッキングを行い、 組織中の非特異的 結合部位をふさぐ操作を行った。 次に、 1/10に希釈したブロックエース試薬によ り希釈した抗 hDlk-1ポリク口ーナル抗体 （終濃度 0.5 μ g/mL) を室温で 1時間反 応させ、 PBSで 5分の洗浄を 3回行い、 続いて、 1/10に希釈したブロックエース 試薬によって 100倍に希釈したピオチン化抗ゥサギ IgG抗体を室温で 1時間反応 させた。 PBSによる 5分間の洗浄を 3回行った後、 ABCキッ トの試薬を説明書 通りに混ぜて ABCコンプレックスを作り、 これを室温で 30分反応させた。 PBS で 5分間の洗浄を 3回行った後、 ペルォキシダーゼ基質 （0.02%DAB(3,3'-ジァ ミノベンチジン)、 0.03%過酸化水素水、 50mM Tris-HCl pH 7.5) によって発色 を行った。 発色を確認した後、 水で 10分間洗浄し、 マイヤーへマトキシリン溶 液 （和光純薬工業） によって核を染色し、 その後アルコールで脱水し、 キシレン で透徹して、 ェンテランニュー （メルク · ジャパン） で封入した。
1 2 . 担癌マウスの作製、 及び抗 hDlk-1モノクローナル抗体の薬効評価
(1) Prevention モテノレ
hDlk-1を発現する肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk) をトリプシン処理で剥がし、 PBSで 6 X 107 cell/mLの細胞懸濁液を調整し、 氷上にて等量のマトリゲル （BD ファーミンゲン） と混合した。 6週齢の雌のヌードマウス （Balb/c， nu/nu) の 右脇腹の皮下に 26 Gのシリンジを用いて 100 ;u L (3 xlO6 cell) 注射した。 癌細 胞移植当日に、 マウスを群分し、 抗体の投与 （20 mg/kg体重、 腹腔内投与） を 開始した。 以降は、 3日に 1回の間隔で同様の投与を行った。 抗腫瘍活性は、 腫 瘍形成頻度及び腫瘍体積により評価した。 腫瘍体積の計測は、 以下の計算式を用 いた。
腫瘍体積 (mm3) = (短径) 2 X (長径） X π /6 (2) Treatment モデル
hDlk- 1を発現する肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk) 及び hDlk- 1を発現する大腸癌細 胞株 （SW480-hDlk)を ト リプシン処理で剥がし、 PBSで 6 X 107 ·〜 10 X 107 cell/mLの細胞懸濁液を調整し、 氷上にて等量のマトリゲル （BDファーミンゲン ) と混合した。 6週齢の雌のヌードマウス （Balb/c, nu/nu) の右脇腹の皮下に 26 Gのシリンジを用いて 100 / L (3 X 106〜5 X 106 cell) 注射した。 癌細胞移植 から 10〜14日後、 腫瘍体積が 50〜 150 mm3 (平均値で約 100 mm3)に成長したマ ウスを群分し、 群分した当日を 1日目 （Day 1) として、 抗体投与を開始した。 抗体は 3日に 1回の間隔で腹腔内投与を行った （20 mg/kg 体重） 。 抗腫瘍活性 は、 腫瘍体積を計測することによって評価した。 有意差検定は、 Student's-t検 定 （Student's-t-test) で行い、 P < 0.05以下を統計的に有意と判定した。
1 3 . 抗 hDlk- 1モノクローナル抗体のインターナリゼーシヨン活性の評価
hDlk- 1モノクローナル抗体が抗原に結合した後、 エンドサイ トーシスによつ て細胞内に取り込まれるインターナリゼーシヨン活性は、 抗体が認識するェピト ープに依存する。 そこで、 作製した抗 hDlk- 1モノクローナル抗体のインターナ リゼーシヨン活性の評価を行った。 FACS解析による評価方法は、 FACS 解析と 蛍光顕微鏡による観察により評価した。
FACS解析によるインターナリゼーション活性の評価は以下の方法で行った。 抗 hDlk- 1モノクローナル抗体 （0.5 / g) を ΗΕΚ-293-hdlk細胞 （2 X 105cell) に 添加して反応させ （4 °C、 20分） 、 PBSで 2回洗浄した後、 DMEM培地に懸濁 し、 37°Cでインキュベート （60分、 90分、 120分， 240分） し、 細胞表面上に抗 原一抗体複合体のインターナリゼーシヨ ンを促進させた。 その後、 遠心 （ l，000rpm、 5分） して細胞を回収後、 PE標識抗マウス （又はラット IgG) (0.5 /z g) と反応 (4°C、 20分）させた後、 FACSCalibur (べク トンディッキンソン)に より解析した。
また、 FITC標識した抗 hDlk- 1モノクローナル抗体を、 同様な方法で HEK- 293-hdlk細胞と反応させ、 PBSで 2回洗浄した後、 DMEM培地に懸濁し、 37°C でインキュベート （120分） した後、 FACSCalibur (べク トンディッキンソン)に より解析した。
次に、 ローダミン標識した抗 hDlk-1モノクローナル抗体 （0.5 /i g) を HEK- 293-hdlk細胞 （2 X 105cell) に添加して反応させ （4 °C、 20分） 、 PBSで 2回洗 浄した後、 DMEM培地に懸濁し、 37°Cでインキュベート （15分、 30分、 60分、 120分） した後、 サイ トスピン （シャンドン） で塗沫標本を作製し （800rpm、 3 分） 、 マウンティング溶液で封入後 （ベクターラボラトリー） 、 蛍光顕微鏡 （二 コン；ェクリプス E800) で、 抗原—抗体複合体の局在を観察した。
1 4 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体を用いたィムノコンジユゲートの作製
抗原結合後のインターナリゼーション活性の高い抗 hDlk- 1モノクローナル抗 体クローン M3-1 (マウス IgGl)、 及び比較対照としてのクローン M1-290 (マウス IgG2b)と.、 植物性タンパク毒素であるサポリンとのィムノコンジユゲートを作 製した (Advanced Targeting System社、 サンディエゴ) 。 1 5 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体を用いたィムノコンジュゲートの薬効評価 細胞は、 トリプシン処理によって培養皿から剥がし、 10% FBSを加えた DMEM培地に 1 xlO5 cell/mLの細胞懸濁液を調整した。 コラーゲンコートした 96穴平底プレートに 1 xl04/wellで播いて、 2〜 3時間培養し細胞を接着させた c 次に、 各種ィムノコンジュゲート、 すなわちマウス IgG—サボリン （IgG-SAP) , M3-1—サポリン （M3十 SAP) 、 及び Ml-290—サポ.リン （Ml-290'SAP) を添 カロした。 それぞれ、 0.1, 1, 10, 100, 1,000 ng/mLで添加した。 48〜72 時間培養 後、 MTT法により吸光度を測定した。
in oにおける抗腫瘍活性の評価は、 上記 Huh-7-hDlk細胞を用いた担癌マウ スで評価した。
1 6 . MTT法
96穴プレートで培養した細胞にテトラカラーワン （生化学工業） を添加し、 5% C02インキュベーターで 3〜4時間反応させた。 反応後の 96穴プレートを、 そ のままマイクロプレートリーダーを用いて波長 490nm (対照波長： 655nm) の 吸光度を測定した
<結果 >
1 . ヒ ト肝癌細胞 Xenograft (Preventionモデル） における公知の抗 hDlk-1モノ クローナル抗体 （1C1， 4C4, 31C4) の腫瘍成長阻害活性の検討
hDlk- 1は、 種々の癌細胞の細胞表面に発現し、 またヒ ト肝癌細胞株に hDlk-1 遺伝子を安定的に発現させると、 ヌードマウス皮下に移植した場合、 腫瘍成長速 度が著しく促進されることから （WO 2005/052156 参照） 、 抗 hDlk- 1抗体は、 癌治療用薬剤として有用であると考えられる。 hDlk-1自体は遺伝子配列 アミ ノ酸配列が公知であるので、 原理的には合成ペプチドや精製タンパクを免疫源と して、 公知の方法により hDlk- 1に対するモノクローナル抗体を得ることは可能 である。 しかしながら、 実際に、 癌治療薬として活性を示す、 すなわち個体レべ ル in vivo) で抗腫瘍活性を示す抗体が作製できるか否かは、 一般に、 抗原の 種類、 発現量、 タンパク構造などからは不明なことが多い。 数万種類とも言われ るモノクローナル抗体の中で、 腫瘍 （癌） を代表とする疾患の治療薬として上巿 されているものは、 わずか 20種類程度ということからも分かるように、 大部分 の抗体は、 個体レベルで薬効を示さない。
公知の抗 hDlk-1モノクローナル抗体 （クローン 1C1, 4C4, 31C4) は、 少なく とも補体存在下においてヒ ト肝癌細胞を死滅させることが公知である （WO 2005/052156 参照） 。 しかしながら、 in oでの薬効については不明であった c まず、 公知の 3クローンの ώ ' における抗腫瘍活性を、 hDlk-1を発現する 肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk) をヌードマウス皮下に移植し、 移植と同時に抗体投 与を開始し、 腫瘍細胞のヌードマウス皮下への生着と腫瘍成長への効果を検討し た。
下記表 2に示した通り、 細胞移植と同時に抗体投与を開始し、 1 4日目 (Day 14)において、 コントロール群 （ラッ ト IgG投与） では、 10匹中全ての個体で腫 瘍が形成された （平均腫瘍体積： 382.0 ± 74.8 mm3) 。 一方、 抗 hDlk- 1モノク 口一ナル抗体投与群の腫瘍形成率は、 1C1投与群で 40%、 4C4投与群及び 31C4投 与群で 30%と、. 著しく腫瘍形成率が低かった。 2 1 日目（Day 21)においても、 1C1投与群で 70%、 4C4投与群及び 31C4投与群で 50%と、 いすれも沉 ff:扠与によ つて腫瘍形成が阻害された。 形成された腫瘍の体積は、 平均値では抗体投与群は コントロール群よりも低い値を示したが、 統計的な有意差が認められなかった。 表 2 投与群 N (個体数） 腫瘍形成率 腫 体積 (mm3)
Day 14 ラッ卜 IgG 10 100% (10/10) 382.0 ±74.8
1 C1 4 40% (4/10) 656.2±241.21
4C4 3 30% (3/10) 77.1 ±30.0
31 C4 3 40% (3/10) 156.5±55.8
Day 18 ラッ卜 IgG 10 100% (10/10) 979.2± 152.7
1 C1 6 60% (6/10) 646.7 ±280.8
4C4 5 50% (5/10) 371.7± 1 18.2
31 C4 5 50% (5/10) 474.5 ± 163.1
Day 21 ラッ卜 IgG 10 100% (10/10) 1464.4± 207.6
1 C1 7 70% (7/10) 899.25 ±308.4
4C4 5 50% (5/10) 653.5±212.8
31 C4 5 50% (5/10) 770.1 ±216.1.8
2 . ヒ ト肝癌細胞 Xenograft (Treatmentモデル） における公知の抗 hDlk-1モノ クローナル抗体 （1C1, 4C4， 31C4) の腫瘍成長阻害活性の検討
抗 hDlk-1モノクローナル抗体が、 癌治療抗体として薬効を発揮するためには、 確立した腫瘍組織に対して、 抗腫瘍活性を発揮することが非常に重要である。 ま た、 上記 Preventionモデルでは、 腫瘍形成率を比較することによって、 抗体の 抗腫瘍活性をある程度推測することは可能であるが、 個体間のばらつきが大きく、 抗腫瘍活性を正確に評価することはできない。
そこで、 次に Huh-7-hDlk細胞をヌードマウス皮下に移植し、 平均腫瘍体積が 100mm3に成長した段階で抗体投与を開始する Treatment モデルで薬効評価し た。
図 1に示すように、 Treatmentモデルでは、 1C1(ラッ ト IgGl) (図 1 A) 、 4C4(ラット IgG2a) (図 1 B) 及び 31C4(ラッ ト IgG2a) (図 1 C) を、 それぞれ 20 mg/kg 体重の用量で 3日に 1回腹腔内投与を行い、 腫瘍成長に対する効果を検 討した。 しかし、 いずれのクローンも有意な腫瘍成長阻害活性を示さなかった。 3 . ヒ ト肝癌細胞 Xenograft (Treatmentモデル） における新規な抗 hDlk-1モノ クローナル抗体の in KZ Oにおける抗腫瘍活性の検討
hDlk- 1を標的とした癌治療用抗体は、 Xenograft Treatmentモデルにおいて、 hDlk-1を発現する腫瘍組織を特異的に死滅させるか、 腫瘍の成長を阻害する活 性を示すことが必須である。
本願発明において新たに作製した抗 hDlk- 1モノクローナル抗体 (約 100クロー ン）を、 同様に Huh-7-hDlk細胞の Xenograft Treatmentモデルで評価した。 新規 に作製した約 100クローンのうち、 大部分のクローンは公知の 3クローンと同様 に、 Treatmentモデルでは薬効を示さなかったが、 その中でも顕著な腫瘍成長阻 害活性を示す以下のクローン、 すなわちクローン DI-2- 14、 2-13、 BA-1-3D、 DI-6及び M3-1が得られた。
クローン D 2-14 (マウス IgGl) 投与群では、 抗体投与後、 全ての個体で （ N=8) 腫瘍成長が阻害され、 投与開始後 1 4日目 (Day 14)において、 コントロー ル群 （N=8) の腫瘍体積が 907.7± 142.8 mm3に対し、 クローン DI-2-14投与群で は 175.5 ±46.5 mm3 (P < 0.01 by Student's t-test) であった （図 2 A) 。 抗体 投与開始時点での腫瘍体積を 1.0としたときの、 1 4日目（Day 14)における腫瘍 体積は、 コントロール群が 9.24であるのに対し、 クローン D 2-14投与群では 1.85であった。 摘出した腫瘍重量も、 コントロール群が 0.58 ±0.07 (g)であった のに対し、 クローン DI-2-14投与群では 0· 15 ±0.04 (g) (P < 0.01 by Student's t- test) であった （図 2 B) 。
図 2 Cに示すように、 クローン DI-2-14の投与による抗腫瘍活性は、 独立した 別の試験においても再現され、 同様に腫瘍体積の平均値が 100 mm3 (コント口 ール群： 103.8± 11 mm3 (N=7)、 D 2_14投与群： 101.4±9.5 mm3 (N=8)) に達 した段階で、 抗体投与を開始した。 投与開始後 1 4日目 (Day 14)において、 コン トロール群の腫瘍体積が 733.37±244.86 mm3であったのに対し、 クローン 14投与群では 148.83 ±32·65 mm3 (P < 0.01 by Student's t-test)であった。
クローン 2-13 (ラット IgG2b) 投与群 (N=10)では、 完全ではないが、 腫瘍成長 速度が統計的に有意に阻害され、 投与開始後 1 4日目 (Day 14)において、 コント ロール群 （N=10) の腫瘍体積が 1580.2± 179.4 mm3であったのに対し、 クロー ン 2-13投与群では 832.9± 131.8 mm3 (Pく 0.01 by Student's t-test)であり、 約 50 %の阻害を示した （図 3 A) 。
同様に、 クローン BA-1-3D (マウス IgG2a) 投与群 (N=8) 及びクローン DI-6 ( マウス IgGl) 投与群 (N=8)では、 コン トロール群 (N=8)の腫瘍体積が 907.7土 142.8 mm3であったのに対し、 それぞれ、 380.8 ± 54.4 mm3 (図 3 B) 及び 321.0 ± 59.6 mm3 (図 3 C) であり、 いずれも有意に腫瘍成長が阻害された （P < 0.01 bv Student's t-test) 。
また、 クローン M3-l(マウス IgGl) 投与群 (N=8)でも、 腫瘍成長速度が有意に 阻害され、 投与開始後 1 4日目（Day 14)におけるコントロール群 (N=7)の腫瘍体 積が 1123.8 ± 249.1 mm3であったのに対し、 クローン M3-1投与群では 457.0士 123.75 mm3であった （Pく 0.05 by Student's t-test) (図 3 D、 表 3参照） 。 なお、 上記クローンのうち、 クローン M3-1を産生するハイブリ ドーマは、 「 Mouse-Mouse hybridoma: M3-1J と称して、 2006年 10月 18日付で、 独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （〒305-8566 茨城県つくば市東 1-1-1 中央第 6) に寄託した （受託番号： FERM BP-10707) 。
同様に、 クローン DI-2-14を産生するハイブリ ドーマは、 「Mouse_Mouse hybridoma: M3 1J と称して、 2007年 8月 21日付で、 同センターに寄託した （受 託番号： FERM BP- 10899) 。
クローン DI-6を産生するハイブリ ドーマは、 「 Mouse-Mouse hybridoma: M3 1 J と称して、 2007年 8月 21 0付で、 同センターに寄託した （受託番号： FERM BP- 10900) 。 表 3
群 N (個体数） 腫瘍体積（mm3) 成長率 (倍） 腫瘍重量（g) マウ TJgG
8 907.7 ± 142.8 9.42 0.58±0.07
(コントロール）
DI-2-14 8 • 75.5±46.5 1.85 *0.15±0.04
DI-6 8 * 321.0±59.6 3.41 0.37 ±0.06
BA-1-3D 8 * 380.8 ±54.4 4.06 * 0.34 ±0.06 マウス IgG 7 1 123.8±249.1 9.61 n.e..
(コントロール）
M3-1 8 * *457.0± 123.75 4.1 n.e..
ラッ卜 IgG 10 1580.2 ± 179.4 14.5 n.e..
(コントロール）
2-13 10 * 832.9± 131.8 7.5 n.e..
4 . ヒ ト大腸癌細胞 Xenograft (Treatmentモデル） における抗腫瘍活性の検討 上記のヒ 卜肝癌細胞 Xenograft Treatmentモデルを用いた場合と同様に、 ヒ ト 大腸癌細胞株 （SW480-hDlk) の Xenograft Treatmentモデルでの抗腫瘍活性を クローン 2-13について検討した （図 4 ) 。
クローン 2-13投与群では、 コントロール群 （ラット IgG投与群） と比較して、 腫瘍成長が有意に阻害され、 1 6日目（Day 16)において、 ラット IgG投与群 （ N=7) の腫瘍体積が 877.27± 176.82 mm3 (投与開始日を 1.0とした場合、 5.01)で あつたのに対し、 クローン 2-13投与群 （N=8) では 452.71 ± 54.97 mm3 (投与開 始日を 1.0とした場合、 2.87)であった (P < 0.05 by Student's t-test) (図 4 ) 以上の結果より、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体は、 肝癌細胞のみならず、 大 腸癌細胞に対しても、 in 'raでの有意な腫瘍成長阻害活性を示すことが明らか となった。
5 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体 （クローン DI-2-14、 2- 13、 BA 1-3D, DL6及 び M3- 1 ) の抗原結合活性 （ΗΕΚ-293-hDlk細胞を用いた FACS 解析、 及び ELISAによる解離定数の算出）
ヒ ト癌細胞 Xenograft モデルで顕著な抗腫瘍活性を示した抗 hDlk- 1モノクロ ーナル抗体について、 抗原である hDlk-1との親和性を、 ΗΕΚ-293-hDlk細胞 （ 図 5 ) 及び Huh-7-hDlk細胞 （図 6 ) を用いて FACS解析したところ、 いずれの クローンも全ての細胞株を認識し、 hDlk- 1の立体構造を認識することが示され た。 データは示していないが、 いずれのクローンも、 hDlk- 1を発現していない HEK293細胞及び Huh-7細胞については全く認識しなかった。
次に、 これらクローンの抗原との親和性 （解離定数） を上記 ELISA法により 算出した。 その結果、 それぞれのクローンの Kd値は、 クローン DI-2- 14は 9.26 X 10 9 (M)、 クローン M3- 1は 6.28 X 10"9 (M)、 クローン BA- 1-3Dは 32.2 X 10 9 (M)、 クローン DI-6は 10.1 X 10 (M)であった。 クローン 2-13については、 精製 したリコンビナント hFA-1との親和性が高くなく、 上記方法により Kd値を算出 することができなかった。
6 . 抗 hDlk- 1モノクローナル抗体のェピトープ解析
次に、 抗 hDlk-1モノクローナル抗体のェピトープの解析を行った。
hDlk (EGF l-2)-pME-CHFX、 hDlk (EGF l-3) pME-CHFX、 hDlk (EGF 3- 4)-pME-CHFX、 hDlk (EGF 4-6)-pME18_CHFX、 及び hDlk (EGF 5 6)-pME18- CHFXのそれぞれの発現ベクター （図 7 ) を、 COS-7細胞に導入し、 FACS解析 及びサイ トスピン標本の免疫染色により、 各抗 hDlk- 1モノクローナル抗体が、 hDlk-1の FA-1領域 （細胞外領域） に存在する 6つの EGF様モチーフを含む領域 のうち、 どのあたりの部位を認識しているかについて検討した。
クローン DI-2-14は、 FACS解析と免疫染色により、 EGF (1-3)及び EGF (3-4) を認識し、 EGF (1-2)、 EGF (4-6)及び EGF (5-6)は全く認識しなかった （図 8 ) 。 クローン DI-2-14が認識するェピトープは、 -hDlk-1の 3番目の EGF様モチーフ （ EGF-3) から 4番目の EGF様モチーフ （EGF-4) を含む領域 （hDlk- 1の第 92番 目〜第 167番目のアミノ酸からなる領域） 、 おそらく EGF-3 (hDlk-1の第 92番 目〜第 120番目のアミノ酸からなる領域） であることが示された。 マウスにおい ては、 IgGのアイソタイプのうち、 抗体依存性細胞障害活性 （ADCC) は、 IgG2aと IgG2bと力 S強く、 IgGlは活性が低いことが報告されている （Kipps, T.J. et al., 1985 参照） 。 クローン D 2-14のアイソタイプはマウス IgGlであること から、 クローン D 2-14 の非常に強い腫瘍成長阻害活性は、 ADCC活性などのェ フエクタ一細胞を介した癌細胞障害活性よりも、 hDlk- 1の機能を阻害すること により抗腫瘍活性を発揮していることが示され、 hDlk- 1の EGF-3及び EGF-4を 含む領域、 特に EGF-3は、 hDlk- 1の機能において特に重要なドメインであるこ とが示された。
また、 クローン 2-13、 DI-6及び BA-1-3Dは、 EGF(l-2)及び EGF(l-3)を認識し、 EGF(3-4)及び EGF (4-6)は全く認識しなかった （図 9 ) 。 これら 3クローンが認 識するェピトープは、 hDlk-1の 1番目の EGF様モチーフ （EGF-1) から 2番目 の EGF様モチーフ （EGF-2) を含む領域 （hDlk-1の第 26番目〜第 85番目のアミ ノ酸からなる領域） であることが示され、 hDlk-1の EGF- 1及ぴ EGF-2を含む領 域は、 hDlk- 1の機能において特に重要なドメインであることが示された。
さらに、 クローン M3-1は、 EGF(l-4)及び EGF(4-6)を認識したが、 EGF (1-2)、 EGF(l-3)及び EGF (3-4)は認識しなかった （図 1 0 ) 。 クローン M3-1が認識す るェピトープは、 hDlk-1の 4番目の EGF様モチーフ （EGF-4) から 6番目の EGF様モチーフ （EGF-6) を含む領域 （hDlk-1の第 131番目〜第 244番目のアミ ノ酸からなる領域） であることが示され、 hDlk-1の EGF-4、 EGF-5及び EGF-6 を含む領域は、 hDlk-1の機能において特に重要なドメインであることが示され た。
7 . 抗 hDlk- 1モノクローナル抗体のインターナリゼーシヨン活性
作製した抗 hDlk- 1モノクローナル抗体の各クローンを、 認識するェピトープ によって分類し、 分類された各グループに属するクローンについて、 抗原認識後 のインターナリゼーシヨン活性を調べた。
EGF (1-2)を認識するクローン Ml-290、 EGF (4-6)を認識する Μ3· 1、 及ぴ EGF (5-6) を認識するクローン Μ3-4について、 各抗体を HEK293_hDlk細胞と 反応後、 37°Cでインキュベートし、 その後、 PE標識抗マウス抗体と反応させた。 図 1 1 Aに示すように、 インキュベートをしなかった場合の蛍光強度を 100%と した場合、 クローン M3-1は他のクローンと比べて著しく早い速度で、 インキュ ペート時間に依存して蛍光強度が減少した。 この結果により、 抗原一抗体反応後、 時間依存的に細胞内に取り込まれることによって、 細胞表面上の抗原 -抗体複合 体が減少するためであることが示された。 なお、 各インキュベート時間後の蛍光 強度は以下の通りであった。
60分； M3-1： 38.7 %, M1-290: 52.1 %, M3-4: 74.1%
90分； M3- 1: 36.9%, M1-290: 47.1%, M3.4: 71.15%
120分； M3-1: 28.1%， M1-290: 36.3%， M3-4: 57.3%
240分； M3-1: 12.2%, M1-290: 31.2%, M3-4: 41.4% ィンキュベートした場合の平均蛍光強度の減少の要因が、 ィンキュベート間に 抗原と結合した抗 hDlk-1モノクローナル抗体が当該抗原から剥がれたことでは ないことを確認した。 クローン M3- 1を直接 FITCで標識し、 同様に HEK293- hDlk細胞と反応させ、 PBSで洗浄後、 37°Cで 120分インキュベートし、 その後、 FACS解析を行い、 反応直後とインキュベート 120分後の蛍光強度を比較した。 その結果、 両者で有意差はなかった （インキュベート無し： 100%， インキュべ 一ト 120分後： 110.9%) (H i I B) 。
次に、 ローダミン標識した抗体を HEK293-hDlk細胞と反応させ、 PBS洗浄後、 同様に 37°Cでインキュベートした。 その後、 サイ トスピンを用いて塗沫標本を 作製し、 蛍光顕微鏡で蛍光標識抗体の局在を観察した。 その結果、 図 1 2に示す ように、 インキュベート無しでは、 細胞膜への局在が観察された。 しかし、 37°Cでインキュベー卜することによって、 EGF (4-6)を認識するクローン M3- 1 及び D Iでは、 わずか 15分のインキュベートで、 エンドサイ ト一シスにより細 胞内に取り込まれ、 べシクルに取り込まれ、 ドット状の細胞内局在が観察された。 一方、 クローン M1-290及び M3-4では、 ドット状の局在が観察されるものの、 大 部分は細胞膜に局在していた （図 1 2 ) 。
以上の結果から、 クローン M3-1などの EGF (4-6)を認識する抗体は、 他のドメ ィンを認識する抗体と比較して、 抗原認識後のィンターナリゼーション沽性が著 しく高かった。 従って、 クローン M3-1などの抗 hDlk-1抗体を、 抗癌剤や細胞毒 素と結合させて複合体化したィムノコンジュゲートは、 すばやく標的細胞内に取 り込まれるため、 抗癌剤や細胞毒素の薬理効果が高く、 しかも副作用が少ないこ とが考えられた。
8 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体ィムノコンジユゲー卜の細胞障害活性
抗 hDlk-1モノクローナル抗体のィムノコンジユゲートを用いたミサイル療法 の有用性を、 インターナリゼーシヨン活性の高いクローン M3-1と、 比較対照と してのクローン M1-290に、 それぞれサポリンを結合させたィムノコンジユゲー ト （M3-1-SAP, M1-290-SAP) を作製し、 薬効評価をおこなった。 M3-1-SAP及 び M1-290-SAPのいずれも、 hDlk-1を発現していない HEK293細胞には、 全く 毒性を示さなかった。
次に、 hDlk-1を発現している Huh7-hDlk細胞及び SK-N-F1細胞 （内在性 hDlk-1発現神経芽細胞腫） に添加して培養したところ、 コントロール （マウス IgG-SAP) では、 いずれの細胞でもほとんど細胞障害性を示さなかった。 しか し、 M3-1-SAPを培養液に添加して培養したところ、 濃度依存的に細胞が障害さ れ、 1 μ g/mLの濃度であると、 Huh-7-hDlk細胞では生存率 23.3± 1.35% (N=3)、 SK-N-Fl細胞では生存率 9.38±2.1% (N=3)であり、 強い細胞障害活性を示した (図 1 3 ) 。
SK-N-F1細胞 （内在性 hDlk-1発現神経芽細胞腫)に対する、 M3-1-SAPと M1-
290-SAPとの細胞障害活性を比較したところ、 図 1 3 Bに示すように、 両者の活 性はほぼ同等であった （図 1 3 B) 。 9 . 抗 hDlk-1モノクローナル抗体ィムノコンジュゲートの ώ oにおける腫瘍 成長阻害活性
M3-1-SAPのィムノコンジユゲートとしての有用性、 すなわちマウス個体に投 与した場合の、 抗腫瘍活性及び副作用について、 Huh-7-hDlk cellの Xenograftモ デルで評価した。 比較対照として M1-290-SAPを用いた。 抗腫瘍活性の評価は、 前記と同様に腫瘍体積で行い、 副作用の検討は投与後の体直 ¾化及び钦死率で仃 つた。
マウス IgG投与群 （N=8) では、 試験期間 （14日間） を通して、 体重の増減は 認められなかったが、 M3-1-SAP ( 5 mg/kg体重、 腹腔内投与)投与群 （N=8) 及 び M1-290-SAP ( 5 mg/kg体重、 腹腔内投与)投与群 （N=8) では、 ィムノコンジ ュゲート投与開始後 4日目（Day 4)において、 体重の減少が観察された （ 「Μ3· 1 SAP」 は、 Day 1 ： 21.2± 1.36 (g)， Day 4： 18.5± 1·44 (g)； 「M1_290-SAP」 は、 Day 1 ： 21·13±0·81 (g), Day 4： 17·9±0·85 (g)) 。 特に、 インターナリゼ ーシヨ ン活性の高くない M1-290-SAPの毒性は強く、 8個体のうち、 4日目 (Day 4)で 2個体が死亡し、 5日目 (Day 5)で残り 6個体が死亡したため、 結果と して投与開始から 5日間で全ての個体が死亡した （図 1 4 B) 。
一方、 M3-1-SAP投与群では全個体が生存し、 体重も 8日目（Day 8)以降回復 が見られた。
腫瘍成長についても、 図 1 5に示すように、 M3-1-SAP投与群では強ぐ阻害さ れ、 1 4日目（Day 14)における腫瘍体積は （投与は Day 1及び Day 4 の 2回） 、 コントロール群が 1123.8±245.65 mm3であったのに対し、 M3-1-SAP投与群で は 415.8± 105.1 mm3 (P < 0.05 Student's t'test)であった。
さらに、 M3-1-SAPの抗腫瘍活性を確認するために、 M3-1-SAPを腫瘍部位に 局所投与 （lmg/mL M3-1-SAP, 40 // L/腫瘍） した。 M3-1-SAP及びコントロー ル IgGの投与は、 所定の平均腫瘍体積 （コン トロール群 ： 144.98 ± 6.1 mm3 (N=5)、 M3- 1-SAP群： 145.87±21.26 mm3 (N=5)) となった時点と、 投与開始 後 4日目（Day 4)との 2回行い、 腫瘍体積の成長を観察した。
. その結果、 図 1 7 Aに示すように、 M3-1-SAP投与群では 7日目（Day 7)までほ ぼ完全に腫瘍の成長が阻害され （コントロール群： 584.02± 137.07 mm3、 M3- 1-SAP群： 148.67±38.0 mm3、 P < 0.01 by Student's t-test) 、 1 4日目（Day 14)においても、 コントロール群が 2038.66 ± 333.17 mm3であったのに対し、 M3-1-SAP投与群は 575·75±216·61 mm3 (P < 0.05 by Student's t test) であり、 非常に強い抗腫瘍活性を示した。
図 1 6 Bに示すように、 M3-1-SAPの腫瘍内投与の場合においても、 4日目 (Day 4)における 2回目の投与以後、 若干の体重減少が認められたが、 全 1固体生 存しており、 9日目（Day 9)以後は体重も次第に回復し、 1 0日目 (Day 10)では 完全に投与前の状態にまで回復した。
一方、 図 1 6 Cに示すように、 既存の抗癌剤であるシスブラチン (Cisplatin) ( 抗悪性腫瘍剤ランダ注； 日本化薬株式会社） を投与した場合、 5 mg/kgの投与量 で、 腫瘍成長はほぼ完全に阻害されたものの （ 1 6 日目でコントロール群 （ PBS群） ： 1085.36±286.30 mmS, Cisplatin群： 77.28± 15.20 mm3, P < 0.01 by Student' s t-test) 、 図 1 6 Dに示すように、 Cisplatin投与群では、 経時的 な体重の著しい減少が観察され、 1 6日目 （Day 16) におけるコントロール群 の体重が、 20.58±0.53 gであったのに対し、 Cisplatin投与群では 13.24± 1.83 g (P < 0.01 by Student' s t-test)であり、 非常に強い副作用 （体重減少） が観察 された。
以上の結果から、 インターナリゼーシヨン活性の高いクローン M3- 1 (EGF (4-6)の認識抗体） は、 ィムノコンジュゲートとして使用した場合、 他のクロー ンと比べて、 副作用が少なく、 かつ抗腫瘍活性が高いことが示された。
1 0 . ヒ ト大腸癌組織、 乳癌組織における hDlk-1の発現
hDlk-1は、 従来、 固形癌では、 神経内分泌腫瘍、 神経芽細胞腫、 神経膠腫、 1型神経線維腫症、 小細胞肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌及び卵巣癌において発現してい ることが報告され、 血液癌では、 骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病におい て発現していることが報告されている。
上記以外の癌種での hDlk- 1の発現を調べるため、 市販のヒ ト癌組織アレイを 抗 hDlk- 1抗体で免疫染色し検討した。 大腸癌における hDlk-1の陽性率は、 大腸 癌組織アレイ （Cybrdi社、 lot NO.CC05-01-001) を用いた。 図 1 7に、 代表的 な染色写真を示したが、 70検体の大腸癌組織を検討した と ころ、 Adenocarcinoma (腺癌)では 43検体中 12検体 （27.9%) が強陽性、 19検体 （44.2 %) が弱陽性を示し、 腺癌全体では 43検体中 31検体 （72.1%) で hDlk-1陽性で あった （表 4参照） 。
また、 同じ組織アレイ中の Papilllary Adenocaricinoma (乳頭状腺癌） の 11検 体については、 6検体 （54.5%) で hDlk- 1強陽性を示した （表 4参照） 。 表 4
腺がん hDlk-1陰性 hDlk-1弱陽性 hDlk-1強陽性
Grade I 0 2 1
Grade II 4 13 8
Grade III 8 4 3
Aき
口 a _ 1 12 19 12 乳頭上腺がん hDlk-1陰性 hDlk- 1弱陽性 hDlk-1強陽性
Grade I 0 3 3
Grade II 1 2 3
Grade III 0 0 0
A口 +T 1 5 6
乳癌における hDlk- 1の陽性率は、 乳癌組織アレイ （Cybrdi社、 lot No. CC08- 02-002) を用いた。 本組織アレイは、 53検体から採取した計 63切片から構成さ れ、 このうち、 17検体 （17切片） が Infiltrating duct carcinoma (浸潤性乳管癌 ) 、 2検体 （2切片） が Intraductal carcinoma (乳管内癌） 、 34検体 （44切片 ) が正常組織やコラーゲンファイバーなどの非癌組織からなる。 hDlk- 1は正常 な乳腺組織でも弱陽性を示す検体もあったが （図 1 8 ) 、 染色性は非常に弱く、 一方、 Infiltrating duct carcinomaでは 17検体中 5検体 （29%) で強陽性を示し た。 （図 1 8、 表 5参照） 。 表 5
浸潤性乳管がん hDlk-1陰性 hDlk-1弱陽性 hDlk- 1強陽性
Grade I 1 0 0
Grade II 7 3 5
Grade III 0 1 0
口 8 4 5 乳管内がん (2検体）： hDlk-1強陽性（ 1 )、 hDlk-1陰性（ 1 )
正常乳腺、コラーゲンファイバーなど (34)： hDlk-1陰性 (24)、 hDlk- 1弱陽性（10)
従来公知の hDlk- 1発現癌種に加え、 大腸癌及び乳癌でも、 両者ともに約 30% で hDlk- 1が強発現していることが明らかとなった。 抗 hDlk-1モノクローナル抗 体は、 上記実施例で示したとおり、 肝癌細胞の Xenograftに加えて、 大腸癌細胞 の Xenograftモデルでも抗腫瘍活性を示したことから、 肝癌に加えて、 大腸癌に 対しても有効な治療薬となる。 同様に乳癌やその他の hDlk- 1発現癌細胞を標的 とした有効な治療薬となる。
〔実施例 2〕
1 . マウス抗ヒ ト Dlk-1抗体 （クローン D 2-14) の、 ヒ ト Dlk-1発現肝癌細胞 株 （Huh-7-Dlk細胞） Xenograft treatmentモデルにおける用量依存的な抗腫瘍 活性
<目的 >
抗ヒ ト Dlk-1 モノクローナル抗体であるクローン D 2-14(マウス IgGl)は、 実施例 1に記載の通り、 ヒ ト肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk 細胞） の Xenograft Treatment モデルにおいて、 20mg/kg体重の投与量で、 非常に高い抗腫瘍活性 を示した。 そこで、 クローン DI-2-14 の抗腫瘍活性を更に検証するために、 用 量依存的な抗腫瘍活性の評価を行った。
<方法 >
抗体の投与量を変えた以外は、 実施例 1と同様にして抗腫瘍活性の評価を行つ た。
<結果 >
図 1 9に示したとおり、 腫瘍の成長はクローン D 2-14 の投与によって用量 依存的に阻害され、 抗体投与後 8 日 目（Day 8)において、 コン トロール群 (N=9 ) の腫瘍体積が 782·1 ± 124.4 mm3 であったのに対し、 DI-2-14 ( 1 mg/kg) 投与群 （N=9) 力 522.76 ± 107.9 mm3、 DI-2-14 (2mg/kg) 投与群 (N= 9) 309.2 ± 58.9 mm3, DI-2-14 (5mg/kg) 投与群 (N=9) 285.8土 38.2 mm3であった。 2 . マウス抗ヒ ト Dlk-1 抗体 （クローン DI-2-14) のヒ ト神経芽細胞腫 SK-N- F1細胞 Xenograft treatment モデルにおける抗腫瘍活性
<目的 >
実施例 1に記載の通り、 ヒ ト肝癌細胞株 （Huh-7-hDlk 細胞） の Xenograft Treatment モデルにおいて、 抗腫瘍活性を示した 5種類の抗ヒ ト Dlk-1 モノク ローナル抗体の中でも、 特に強い抗腫瘍活性を示したクローン DI-2-14 (マウス IgGl) について、 ヒ ト祌経芽細胞腫 （SK-N-F1細胞） の Xenograft Treatment モデルにおける抗腫瘍活性の評価を行った。 Huh-7-hDlk細胞は、 Huh-7細胞に 外来性にヒ ト Dlk-1遺伝子を安定的に発現させた細胞株であるのに対して、 SK- N-F1細胞は、 内在的に Dlk-1 を細胞表面に発現している細胞株である。 そのた め、 SK-N-F1細胞株での Xenograft Treatmentモデルにおいてクローン DI-2- 14 投与による抗腫瘍活性を示すことは、 ヒ ト神経芽細胞腫に対して抗ヒ ト Dlk-1 モノクローナル抗体が薬効を示すことであり、 同時に、 細胞表面に Dlk-1 を発現している各種癌細胞に対して抗ヒ ト Dlk-1 モノクローナル抗体 （特にク ローン DI-2-14) が有効である （薬効を示す） ことであると言える。
く方法〉
内在的に - hDlk-1 を細胞表面に発現するヒ ト神経芽細胞腫 （SK-N-F1 細胞、 ATCC:カタ口グ No. CRL2142) をトリプシン処理で剥し、 PBS で 6 x 107 ceU/mL の細胞懸濁液を調製し、 氷上にて等量のマトリゲル （BD ファーミンゲ ン） と混合した。 6週齢の雌の重症複合免疫不全マウス （NOD-scid) の右脇腹 の皮下に 26Gのシリンジを用いて 100 /z L (3 X 106 cell) 注射した。 癌細胞移植 から 1 0〜： 1 4日後、 腫瘍体積が 50〜： 150 mm3 (平均：約 100 mm3) に成長し たマウスを群分し、 群分した当日を 1日目（Day 1)として、 抗体 （クローン D 2-14) の投与を開始した。 抗体は、 3日に 1回の間隔で腹腔内投与により投与 した （5 mg/kg体重、 20 mg/kg体重） 。 抗腫瘍活性は、 実施例 1と同様にして 腫瘍体積を計測することにより評価した。 また、 実験最終日に、 剖検により腫瘍 を摘出し、 腫瘍重量を計測して評価した。 有意差検定は、 Student's t-test で行 い、 P < 0.05以下を統計的に有意であると判定した。
<結果 >
図 2 O Aに示すように、 クローン DI-2- 14(マウス IgGl)投与群では、 コント口 ール群 （N=7) と比較して、 5mg/kg 投与群 （N=8) 及び 20 mg/kg 投与群 (N=7) のいずれにおいても腫瘍成長が顕著に阻害され、 特に 20 mg/kg投与群 (N=7) では、 投与開始後の翌日から実験終了時である 2 3日目 (Day 23)まで、 同日基準の腫瘍体積が統計的に有意に小さかった （P < 0.01 by Student's t- test) 。
投与開始後 2 3日目（Day 23)においては、 コントロール群の腫瘍体積が 527.8 ±48.9 mm3であったのに対して、 クローン DI-2- 14 (5 mg/kg体重)投与群では 333.8 ±6.8 mm3 (P < 0.01 by Student's t-test), クローン DI-2.14 (20 mg/kg体 重)投与群では 233.0土 16.4 mm3 (P < 0.01 by Student's t-test)であり、 クローン DI-2- 14の用量依存的な抗腫瘍活性が確認された （Dト 2-14 (5 mg/kg) vs DL2-14 (20 mg/kg), Day 23, Pく 0.01 by Student's t-test) 。
摘出した腫瘍重量も、 コントロール群が 0.07± 0.04(g)であったのに対して、 クローン D 2-14 (5 mg/kg 体重）投与群では 0.03 ± 0.009(g) (P < 0.05 by Student's t-test) 、 クローン DI-2- 14 (20 mg/kg体重)投与群では 0.02 ±0.005 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) であった。 腫瘍体積と同様に、 クローン DI- 2-14の 5mg/kg投与群と 20 mg kg投与群との腫瘍重量の差も有意 （P < 0.05 by Student's t-test) であり、 用量依存的な抗腫瘍活性が確認された （図 2 0 B) 。 3 . マウス抗ヒ ト Dlk-1抗体 （クローン D 2-14) の抗体遺伝子の可変領域配列 の決定と、 キメラ DI-2-14発現ベクターの構築
マウス抗ヒ ト Dlk- 1 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 10%牛胎児血 清を含む DMEM培地で、 37°C、 7.5% C02 インキュベーターで培養した。 3 x 106 個のハイブリ ドーマより、 TRIzol試薬 （Invitrogen) を用いて、 全 RNAを 抽出したのち、 GeneRacer Kit (Invitrogen) を用いて、 キット添付の方法に従 レ、、 オリゴ dTプライマーを用いて cDNAを合成した。 クローン DI-2-14 (マウ ス IgGl) の H鎖及び L鎖の可変領域 （VH, VL) をコードする遺伝子は、 上記 合成後の cDNAを铸型として、 PCR法を用いてクローニングした。 この際、 5'- プライマーは GeneRacer Kit に添付されているものを使用した。 一方、 3'-プラ イマ一は、 VH増幅用 3'·プライマーとしてはマウス γΐ定常領域に相補的な配列 を有するものを使用し、 VL増幅用 3'-プライマーとしてはマウス κ 定常領域に 相補的な配列を有するものを使用した。
5'-プライマー （Fプライマー） ：
5 -cgactggagcacgaggacactga-3 (配列番号 1 5 )
3'-プライマー （Rプライマー） ：
VH： 5 - gccagtggatagacagatgg- 3 (配列番号 1 6 )
VL： 5 - gatggatacagttggtgcagc- 3 (配列番号 1 Ί ) 上記各プライマーを用いた PCRは、 以下の反応液組成及び反応条件で行つた
《反応液組成》
铸型 cDNA： 1.0 i L
10 X T ermalAce PCRバッファ 5 // L
2mM dNTP： 5 /z L
ThermalAce ポリメラーセ： 0.5 /iL
Fプライマー （10 μΜ)： 3 At L
Rプライマー （10 μΜ) 1.0 μ L
滅黄水： 3ό.ο u L
Αき· . 50 /L
《反応条件》
「熱変性'解離： 94°C (10 sec) →ァニーリング ： 55°C (10 sec) →合成 '伸 長： 72°C (60 sec) 」 を 1サイクルとして、 計 35サイクル。 合成した VH及び VLの cDNAを、 pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen)に サブクローニングして、 塩基配列を決定した。 複数の VHクローン及び VLクロ ーンの塩基配列を解読し、 マウス H鎖及び L鎖の可変領域に典型的な塩基配列 を同定した。 図 2 1及び図 2 2に、 DI-2-14 の VH 及び VL のコンセンサス cDNA塩基配列、 ならびに推定ァミノ酸配列を示した。
次に、 VH 及び VL のコード領域に、 それぞれ対応するマウス生殖細胞系列 JH及び JK 配列由来のスプライシング供与シグナルを付加し、 さらに両端に動 物細胞発現ベクターに挿入するために適切な制限酵素部位を付加した。 このよう にして作製された、 ェキソンとしての機能を持つ VH (図 2 3 ) 及び VL (図 2 4 ) 遺伝子を、 ヒ ト γΐ鎖及び κ鎖の定常領域を含む動物細胞発現ベクター （図 2 5 ) に挿入し、 マウス一ヒ トキメラ抗体 （DI-2-14 IgGl/κ) 発現ベクター (pChDI-2-14) を作製した。
4. ChD 2-14抗体タンパクの精製
樹立した ChDI-2-14 の抗体産生安定 NS0 細胞株を、 無血清培地 (Hybridoma SFM, Invitrogen) に順化した後、 無血清培地で培養した培養液 を回収し、 Protein Aカラム （GE ヘルスケア） を用いて、 常法に従い、 抗体精 製を行った。
図 2 6に、 マウス DI-2-14 抗体、 及び精製した ChDI-2-14 抗体を、 SDS- PAGE で展開後、 CBB 染色した図を示した。 還元条件下で、 いずれも約 50kD の H鎖と約 25kDの L鎖が検出され、 ChDI-2-14抗体タンパクの産生が確認さ れた。
5 . キメラ DI-2-14抗体 （ChDI-2-14) の抗原親和性
精製した ChDI-2-14タンパクの抗原親和性を、 ELISAを用いた方法で検討し た。
ELISAは、 実施例 1と同様に、 精製リコンビナント hFA-1 タンパク （0.5〜1 β g/mL) を固相化した ELISA プレートを使用して行った。 具体的には、 ELISA プレートを洗浄バッファーで 3回洗浄後、 ブロッキング液により室温で 1時間 （または 4 °Cでー晚） ブロッキングを行い、 洗浄バッファーで 2回洗浄後, ELISA バッファーで希釈系列を作成したマウス DI-2-14 抗体 及び ChDI-2-14 抗体を添加して反応させた （4 °C， ー晚） 。 洗浄バッファーで 3回洗浄した後、 ブロッキング液で希釈した HRP標識抗マゥス IgG (最終濃度 1 μ g/mL) または HRP標識 ί :ヒ ト IgG (最終濃度 1 / g/mL) (いずれも GEヘルスケアバイオサ ィエンス） と反応させた。 その結果、 マウス D 2-14及び ChD 2-14の反応曲 線はほぼ重なり、 EC50はいずれも 10 ng/mL以下であった （図 2 7 ) 。
また、 生細胞の細胞表面に発現している Dlk-1 タンパクに対する結合活性を HEK293 hDlk 細胞を用いたフローサイ トメ トリーで解析した結果、 ELISA の 結果と同様に、 ChDI-2-14 は、 マウス D 2-14 と同等の抗原結合能を示した (図 2 8 ) 。
以上の結果から、 キメラ D 2-14抗体 （ChDI-2-14) は、 マウス DI-2-14抗体 とほぼ同等の抗原親和性を維持していることから、 作製したキメラ DI-2-14 抗 体は、 マウス DI-2-14抗体が有する ώ w oにおける強い抗腫瘍活性を保持する ものであり、 細胞表面に Dlk-1 を発現する癌に対して有効な治療用抗体、 ある いは診断用又は検出用抗体となることが示された
6 . ヒ ト肝癌、 乳がん及び白血病細胞株での細胞表面 Dlk-1の発現 (FACS)
Dlk-1 のヒ ト癌細胞での発現を更に詳細に調べるために、 肝癌細胞株 （7細胞 株） 、 乳がん細胞株 （10 細胞株） 及び急性骨髄性白血病 （AML) 細胞株 （7 細 胞株） について、 抗ヒ ト Dlk-1 抗体を用いたフローサイ トメ トリーによる解析 を行った。
使用した細胞株は、 以下に列挙する通り、 ヒューマンサイエンス振興事業団、 ATCC (American Type Culture Collection)、 ECACC (European Collection of Cell Cultures)、 DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)より入手したものを使用した。
HL-60(ATCC)、 NB-4 (DSMZ) , MV-4-11 (ATCC) , KG-1 (ATCC) , KG-la(ATCC), TF-1 (ATCC), CMK-11-5 (ヒューマンサイエンス振興 事業団）、 HepG2 (ヒューマンサイエンス振興事業団）、 C3A/HepG2 (ATCC), Huh-7 (ヒューマンサイエンス振興事業団)、 OCUG-1 (ヒユー マンサイエンス振興事業団）、 HLE (ヒューマンサイエンス振興事業団)、 HLF (ヒ ューマンサイエンス振興事業団）、 SK-HEP-1 (ATCC)、 HCC1143 (ATCC), JIMT-1 (DSMZ)、 ZR-75-1 (ATCC), MDA MB-415 (ATCC), BT549 (ATCC), BT-474 (ATCC), MDA MB-231 (ATCC), DU4475 (ATCC), T47D (ATCC), MDA MB-468 (ATCC) 肝癌細胞株では、 使用した 7種類の細胞株全てにおいて、 細胞表面 Dlk-1の発 現が確認された （図 2 9 ) 。 乳がん細胞株では、 使用した 1 0種類の細胞株のう ち、 HCC1143細胞及び JIMT-1細胞で強い発現が確認され （図 3 0 ) 、 その他の 8種類の細胞株においても弱いながらも細胞表面 Dlk-1の発現が確認された （図 3 0 ) 。 AML細胞株では、 7種類の細胞株のうち、 CMK-11-5細胞、 TF-1細胞、 MV-4-11細胞及び NB-4細胞の 4種類の細胞株で、 細胞表面 Dlk-1の発現が確認さ れた （図 3 1 ) 。 〔実施例 3〕
D 2- 14抗体 （マウス抗ヒ ト Dlk-1 モノクローナル抗体、 クローン DI-2-14) の in vivoにおける血管新生阻害効果
ぐ方法 >
(1) 免疫組織染色
Huh-7-hdlk 細胞の担癌マウスにおいて、 マウス IgG 投与群 （コントロール 群： 2 個体） 、 D 2-14投与群のマウス （4個体） から、 それぞれ癌組織を摘出 し、 O.C.T コンパウンド （Tissue-Tek) で包埋後、 新鮮凍結切片 （7 μ ιη) を作 製し、 2.5%ダルタルアルデヒ ド/ PBSで 15分、 0.5% Triton X 100/PBSで 3分 室温にて固定し、 PBSで室温 5分間の洗いを 3回行った。 次に、 メタノールに 終濃度 0.3%となるように過酸化水素水を加えた溶液によって、 室温で 5分間処 理し内因性のペルォキシダーゼ活性を除いた。 次いで、 PBS、 0.1% Tween/PBS, 0.02% Tween/PBS の順番で、 それぞれ室温で 5分間ずつ洗い、 M.O.M.TM Immunodetection Kit (VECTOR) のプロ トコールに従い M.O.M.™ mouse Ig Blocking Reagent で組織中の非特異的結合部位を塞ぐブロッキング操作を行い、 PBSで室温 2分間の洗いを 2回行った。 M.O.M.TM Diluentで室温 5分間反応 させた。 形成した Huh-7-hdlk 細胞由来の腫瘍内の腫瘍血管は、 マウスの血管 内皮細胞に由来するため、 次いで、 M.O.M.TM mouse Ig Blocking Reagentでで 希釈した抗マゥス Flk- 1 /VEGF-R2抗体 （終濃度 2 μ g/ml) を室温で 30分反応 させ、 PBSで室温 2分間の洗いを 2回行い、 続いて、 M.O.M/™ Diluentによつ て 100倍に希釈したピオチン化抗ラット IgG抗体を室温で 10分反応させた。
PBSによる 2分間の洗浄を 2回行った後は、 11. 免疫組織染色法に従って行つ た。
(2) RT PCR
本実施例で言う RT-PCRは、 抽出 RNAからの cDNA合成と、 該 cDNAを铸 型とする PCRとを別々に行った反応を意味する。
Huh-7-hdlk 細胞の担癌マウスにおいて、 マウス IgG 投与群 （コントロール 群： 7個体） 、 D 2-14投与群のマウス （7個体） から、 それぞれ癌組織を摘出 し、 Trizol試薬 （Invitrogen) で RNA を抽出した。 ついで 1st strand cDNA sysntesis kit (GE ヘルスケア）を用い、 該 kit 添付のプロ トコールに従い、 1st strand cDNAを合成した。
合成した 1st strand cDNAを铸型として、 マウス IgG投与群 （コントロール 群： 7個体） 、 DI-2-14投与群のマウス （7個体） の摘出癌組織について、 腫瘍 血管内皮細胞マーカーであるマウス Flk- 1/VEGF-R2 ( Genbank accession No.X70842) の遺伝子発現を、 PCR法により解析した。
PCRプライマーは下記のものを使用した （PCR増幅産物は 336 bp) 。
Fプライマー ： 5， -ctt-tac-tct-ccc-cag-tta-ca-3 ' (配列番号 1 8 ) Rプライマー ： 5' -ctt-tct-att-gtc-aag-gtg-ct-3 ' (配列番号 1 9 ) 上記プライマーを用いた PCRは、 以下の反応液組成及び反応条件で行った。 《反応液組成》
醒 DNA： 1//L
10XPCRバッファー： 5 /L
2.5mM dNTP： 4μL
Taq DNAポリメラーゼ： 0.5 μ L
Fプライマー （2^10/ M)： 1/ L
Rプライマー （ 10//M)： 1UL
滅菌水： 37.5 M L
合計： 50// L 《反応条件》
95°C (3 分間） の変性後に、 「熱変性'解離： 95°C (60sec) →ァニーリン グ： 55°C (60sec) →合成 '伸長： 72°C (60sec) 」 を 1サイクルとして、 計 30 サイクルの反応と計 35サイクル。 なお、 内部コントローノレとしては GAPDH (ヒ ト GAPDH: NM_002046； マ ゥス GAPDH: NM_008084, NM_001001303, XM— 001003314， XM_988853, XM_990238) を用いた。 GAPDH を増幅する PCR プライマーは下記のものを 使用した （PCR増幅産物は 452 bp) 。 これらのプライマーは、 ヒ ト GAPDH及 びマウス GAPDHのいずれを铸型とした場合も増幅可能なものである。
Fプライマー ： 5 ' -acc-aca-gtc-cat-gcc-atc-ac-3' (配列番号 2 0 ) Rプライマー ： 5' -tcc-acc-acc-ctg-ttg-ctg-ta-3 ' (配列番号 2 1 ) なお、 PCR の反応液組成及び反応条件は、 上述した Flk- 1 GF-R2 を増幅 する場合と同様にした。
PCR 産物の定量は、 まず、 1.2% ァガロースゲル電気泳動で展開した後、 ェ チジゥムブロマイ ドで染色した。 次いで、 撮影した電気泳動像をスキャナーで取 り込み、 NIH Imageで PCR産物の定量を行い、 Flk- 1/GAPDHの: Ratioでダラ フを作成した。
<結果 >
図 3 2に示す通り、 IgG投与群 （20 mg/kg体重） （ 2個体） と DI-2-14投与 群 (20 mg kg体重） （4個体） にっき、 それぞれ 8〜13視野 （対物 x 200) につ いて、 へマトキシリンによる核染色で核が確認され、 かつ Flk-1/VEGF-R2陽性 である腫瘍血管内皮細胞数をカウントし （IgG投与群：全 25視野、 DI-2-14投 与群：全 35視野） 、 1視野当たりの腫瘍血管細胞数を計測したところ、 IgG投 与群では 112.0±63.6 (Flk-1陽性細胞数/視野)であったのに対して、 DI-2-14投 与群では 36.3±2.2 (Flk- 1陽性細胞数/視野)であり、 有意に腫瘍血管細胞数が少 なかったため （P < 0.01) 、 DI-2- 14投与により腫瘍血管新生が阻害されている ことが示された。
また、 別の実験において、 同じく Huh-7-hDlk-l細胞の担癌マウスで、 IgG投 与群 （20 mg/kg体重、 N=7) 及び DL2-14投与群 （20 mg/kg体重、 N=7) のマ ウスから、 それぞれ形成された腫瘍における腫瘍血管内皮細胞の特異的なマーカ —遺伝子である Flk-1/VEGF-R2 の遺伝子発現を RT-PCR で半定量的に解析し たところ、 図 3 3に示す通り、 D 2-14投与群の腫瘍では Flk- 1/VEGF-R2 の遺 伝子発現が低下しており、 この結果は DI-2-14 投与によって腫瘍血管新生が阻 害されていることが示された。
ぐ考察〉
癌の形成において、 腫瘍血管の新生は必須であることが知られており、 腫瘍血 管新生阻害を主な作用機所としている癌治療抗体として抗 VEGF 抗体 （ァバス チン） が知られている。 これまでに、 Dlk-1及び抗 Dlk-1抗体に関して、 血管新 生や血管新生阻害活性について示された公知情報は無かった。 また Dlk-1 の機 能に関しては、 これまでに、 脂肪細胞の分化制御や Dlk-1 遺伝子の安定的導入 によるダリオ一マ細胞や白血病細胞での増殖亢進についての報告はあるが、 先行 公知情報に基づいて抗 Dlk-1 抗体 （DI-2- 14) が腫瘍血管新生阻害活性を有する ことは予見不可能であった。 本実施例により、 DI-2-14 抗体の、 in vivo におけ る抗腫瘍活性の少なくとも 1つの作用機序が示された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk-1抗体、 特に in w'wにおいて 抗腫瘍活性を有する抗ヒ ト Dlk-1モノクローナル抗体を提供することができる。 さらに本発明は、 当該抗体を産生するハイプリ ドーマ、 当該抗体と各種薬剤との 複合体、 腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、 腫瘍の検出方法、 腫瘍の検出用又 は診断用を提供することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ：合成 DNA
配列番号 4 ：合成 DNA
配列番号 5 ：合成 DNA
配列番号 6 ：合成 DNA
配列番号 7 ：合成 DNA
配列番号 8 ：合成 DNA 配列番号 9 合成 DNA
配列番号 1 0 ：合成 DNA
配列番号 1 1 ：合成 DNA
配列番号 1 2 ：合成 DNA
配列番号 1 3 ：合成 DNA
配列番号 1 4 ：合成 DNA
配列番号 1 5 ：合成 DNA
配列番号 1 6 ：合成 DNA
配列番号 1 7 ：合成 DNA
配列番号 1 8 ：合成 DNA
配列番号 1 9 ：合成 DNA
配列番号 2 0 ：合成 DNA
配列番号 2 1 ：合成 DNA
配列番号 2 6 ：組換え DNA
配列番号 2 7 ：合成コンストラクト (組換えタン 'パク質) 配列番号 2 8 ：組換え DNA
配列番号 2 9 ：合成コンストラタト (組換えタン 'パク質)

Claims

請 求 の 範 囲
I. in iTC抗腫瘍活性を有する、 ヒ ト Dlk-1に対する抗体。
2. 抗腫瘍活性が腫瘍血管新生阻害活性である、 請求項 1記載の抗体。
3. 抗体がモノクローナル抗体である、 請求項 1又は 2記載の抗体。
4. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト祌経芽細胞腫からなる群 より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の 抗体。
5. 抗体の H鎖 V領域の CDR 1〜3のアミノ酸配列が、 それぞれ順に、 配列番 号 30〜 32で示されるアミノ酸配列である、 請求項 1〜4のいずれか 1項 に記載の抗体。
6. 抗体の L鎖 V領域の CDR 1〜3のアミノ酸配列が、 それぞれ順に、 配列番 号 33〜35で示されるアミノ酸配列である、 請求項 1〜5のいずれか 1項 に記載の抗体。
7. 抗体が遺伝子組換え抗体である、 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体 (
8. 遺伝子組換え抗体が、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体 又はヒ ト化抗体である、 請求項 7記載の抗体。
9. キメラ抗体は、 H鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 29で示されるァミノ 酸配列からなり、 L鎖 V領域のアミノ酸配列が配列番号 36で示されるアミ ノ酸配列からなるものである、 請求項 8記載の抗体。
10. 受託番号が FERM BP- 10707であるハイプリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
I I. 受託番号力 FERM BP- 10899であるハイプリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
12. 受託番号が FERM BP- 10900であるハイプリ ドーマにより産生される、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル抗体。
13. 受託番号が FERM BP- 10707、 FERM BP- 10899, 又は FERM BP- 10900 であるハイプリ ドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合する部位 に結合する、 請求項 1〜12のいずれか 1項に記載の抗体。
14. 配列番号 2に示されるヒ ト Dlk-1のアミノ酸配列中の、 第 26番目〜第 8 5番目のアミノ酸からなる領域、 第 92番目〜第 167番目のアミノ酸から なる領域、 又は第 13 1番目〜第 244番目のアミノ酸からなる領域の少な くとも一部と結合するものである、 請求項 1〜1 3のいずれか 1項に記載の 抗体。
1 5. 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体に由来する抗体断片。
1 6. 配列番号 30〜32で示されるアミノ酸配列を含むものである、 請求項 1 5記載の抗体断片。
1 7. 配列番号 29で示されるアミノ酸配列を含むものである、 請求項 16記載 の抗体断片。
1 8. 配列番号 33〜 35で示されるアミノ酸配列を含むものである、 請求項 1 5記載の抗体断片。
1 9. 配列番号 36で示されるアミノ酸配列を含むものである、 請求項 1 8記載 の抗体断片。
20. 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体を産生するハイブリ ドーマ。
21. 受託番号が FERM BP-10707である、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル 抗体を産生するハイプリ ドーマ。
22. 受託番号が FERM BP-10899である、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル 抗体を産生するハイプリ ドーマ。
23. 受託番号が FERM BP- 10900である、 ヒ ト Dlk-1に対するモノクローナル 抗体を産生するハイプリ ドーマ。
24. 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体と、 抗腫瘍活性及び Z又は殺 細胞活性を有する化合物とを含む、 抗体一薬剤複合体。
25. 請求項 1 5〜1 9のいずれか 1項に記載の抗体断片と、 抗腫瘍活性及び/ 又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、 抗体断片一薬剤複合体。
26. 抗腫瘍活性が腫瘍血管新生阻害活性である、 請求項 24又は 25記載の複 合体。
27. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト祌経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 24〜26のいずれか 1項に 記載の複合体。 .
28. 請求項 1〜 14のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9のいずれ か 1項に記載の記載の抗体断片、 及び請求項 24〜 27のいずれか 1項に記 載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 医薬組成物。
29. 腫瘍の治療に用いるものである、 請求項 28記載の組成物。
30. 腫瘍の治療が腫瘍血管新生を阻害することである、 請求項 29記載の組成 物。
3 1. 体重減少の副作用を有しないものである、 請求項 29又は 30記載の組成 物。
32. 腫瘍の診断に用いるものである、 請求項 28記載の組成物。
33. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 28〜32のいずれか 1項に 記載の組成物。
34. 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9のいずれ か 1項に記載の記載の抗体断片、 及び請求項 24〜 27のいずれか 1項に記 載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫瘍治療剤。
35. 体重減少の副作用を有しないものである、 請求項 34記載の治療剤。
36. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 34又は 35記載の治療剤。
37. 請求項 1〜 14のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9のいずれ か 1項に記載の記載の抗体断片、 及び請求項 24〜 27のいずれか 1項に記 載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫瘍血管新生阻 害剤。
38. 体重減少の副作用を有しないものである、 請求項 37記載の阻害剤。
39. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 37又は 38記載の阻害剤。
40. 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9のいずれ か 1項に記載の記載の抗体断片、 及び請求項 24〜27のいずれか 1項に記 載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫瘍診断剤。
. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ 卜神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 4 0記載の診断剤。
. 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9記載の抗 体断片、 及び請求項 2 4〜2 7のいずれか 1項に記載の複合体からなる群よ り選ばれる少なくとも 1種と、 生体から採取された試料とを反応させ、 反応 した抗体及び Z又は抗体断片のシグナルを検出することを特徴とする、 腫瘍 の検出方法。
. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 4 2記載の方法。
. 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の抗体、 請求項 1 5〜 1 9記載の抗 体断片、 及び請求項 2 4〜2 7のいずれか 1項に記載の複合体からなる群よ り選ばれる少なくとも 1種を含む、 腫瘍の治療用、 診断用又は検出用キット。. 腫瘍が、 ヒ ト大腸癌、 ヒ ト乳癌、 ヒ ト肝癌及びヒ ト神経芽細胞腫からなる 群より選ばれる少なくとも 1種である、 請求項 4 4記載のキット。
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