JP2021502797A - ヒトdlk1に対する抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号2、16、30、44、58、72及び86からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR1、配列番号4、18、32、46、60、74及び88からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR2、配列番号6、20、34、48、62、76及び90からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;及び
配列番号9、23、37、51、65、79、93、115及び121からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR1、配列番号11、25、39、53、67、81及び95からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR2、及び配列番号13、27、41、55、69、83、97、116及び125からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
DLK1のクローニングは、ヒト胎盤から作られたcDNAライブラリーを用いてDLK1の細胞外領域を得るために、5’と3’に制限酵素SfiIサイトが含まれたプライマー(表2)を用いてPCR(polymerase chain reaction)で増幅させ、増幅したPCR産物は、pYK−602ベクターを用いてカルボキシ−末端にヒトFcを融合させて作製した(図1A)。
実施例2−1.ファージディスプレイ(phage display)を用いたパンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは、2.7×1010の多様性を持つヒトscFvファージディスプレイライブラリー(human scFv display library)をバクテリアに感染させた後、バクテリアを30℃で16時間培養した後、遠心分離(5,000rpm、10分、4℃)して上澄液をPEG(Polyethylene glycol)で濃縮し、これをPBS緩衝溶液に溶かしてヒトscFvファージディスプレイライブラリーを準備した。
結合能の大きい3次パンニングから得られたファージを大腸菌に感染させた後、それぞれの単一クローンを96−ディープウェルプレート(96−deep well plate、バイオニア)に培養した後、上澄液に存在する単一scFvファージに対してファージ−ELISAを行って選別した。まず、コーティングバッファを用いて1ウェル当たり100ngのDLK1タンパク質を免疫−96マイクロウェルプレート(immuno−96 microwell plate)に分注し、4℃で一晩中表面固定させた後、200μlの4%脱脂粉乳が含まれたPBS−Tを全てのウェルに入れて37℃で1時間反応させることによって、非特異的なタンパク質結合を遮断した。その後、それぞれの培養された200μlの単一scFvファージを入れて37℃で2時間反応させた後、200μlのPBS−Tで3回洗浄した後、HRP(horseradish peroxidase)が結合しているマウス抗M13抗体(mouse anti−M13−HPR antibody、GE healthcare、英国)を1:2,000に希釈して37℃で1時間反応させた。PBS−Tでさらに3回洗浄後、10mlのPC緩衝溶液(0.1M Na2HPO4、0.005M Na−Citrate、pH5.0)に4mg OPD(o−phenylenediamine dihydrochloride、Sigma、米国)1錠、30%過酸化水素(H2O2)10μlを入れて、光のない条件で10分間反応させた後、50μlの2.5M硫酸(H2SO4)で反応を中断させた後、分光光度計(spectraMax M5 spectrophotometer、Molecular Devices、米国)を用いて490nmで吸光度を測定した。
選別された7種の単一クローンファージ抗体をscFv形態からIgG形態に転換するために、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ制限酵素SfiI/NheIサイトを用いてpNATVHにクローニングし、制限酵素SfiI/BglIIサイトを用いてpNATVLにクローニングした(図4A)。
実施例3−1.DLK1抗原に対する親和度(affinity)決定
7種のDLK1単一ヒト抗体の抗原に対する結合力をELISA方法で測定した。前記実施例2−2で記述したファージ−ELISA方法と同一であり、ファージの代わりに7種のDLK1単一ヒト抗体を100nMから0.046nMまで1/3ずつ段階希釈(serial dilution)し、各ウェルのカラムに順次に100μlずつ入れて行った。測定した結果はGraphPad Prism 6 software(http://www.graphpad.com/scientific−software/prism/)を用いて分析した。DLK1単一ヒト抗体17B11、18A5、20D3、21D8、21F19、27F7及び35E2の抗原に対する親和度解離定数(Kd)はそれぞれ、7.19、0.52、53.95、8.40、0.53、0.22及び0.33nMだった(図5)。
DLK1単一ヒト抗体の抗原に対する結合部位を調べるために、図6Aのように、4種のヒト由来DLK1組換えタンパク質及びhFc組換えタンパク質を、前記実施例1で述べた一方法と同一の方法で作製、生産、精製した(図6B)。このとき、精製されたDLK1組換えタンパク質の純度はいずれも95%以上だったし、7種のDLK1ヒト抗体に対してELISAを行った(図6C)。
DLK1単一ヒト抗体の他の種(species)から発見されるDLK1オルソログ(orthologue)に対する交差反応性(cross−reactivity)を調べるために、図7Aのように、マウスDLK1及びサルDLK1を、前記実施例1で述べたのと同じ方法で作製、生産、精製した(図7B)。この時、精製されたDLK1組換えタンパク質の純度は、図7Bのようにいずれも95%以上だった。これらのタンパク質を用いて7種のDLK1ヒト抗体の結合力をELISA方法で調べた(図7C)。
本発明のヒト抗体の細胞表面に存在するDLK1に対する特異的結合力は、抗原を持続して発現できるように形質転換された(DLK1が過発現した)ヒト膵癌細胞株であるMIA PaCa−2と、DLK1を内生的に発現している神経芽腫細胞株であるSK−N−F1細胞を使用し、DLK1に対するsiRNA(Dharmacon、米国)を20nM処理してDLK1の発現を減少させることによって、細胞表面の抗原発現程度による抗体の抗原結合力をFACS分析した。それぞれの細胞を5×105細胞で準備し、1次抗体として2μg/ml濃度のDLK1単一ヒト抗体である17B11、18A5、21D8、27F7を4℃で1時間反応させた。その後、細胞は、冷たいPBSで水洗した後、FITC(fluorescein isothiocyanate;Vector、米国)蛍光が結合した抗−ヒトIgG 2次抗体(Vector、米国)を用いて4℃で1時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、2% FBS(fetal bovine serum)が含まれた500μlのPBSで懸濁させた後、流細胞分析機であるFACSCantoTMII flow cytometer(BD Biosciences、米国)を用いて分析した。
8−ウェルチャンバースライド(8−well chamber slide;Nunc、米国)に、DLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞をウェル当たり2×104細胞でシード(seeding)し、10% FBSが含まれたDMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium;GE Healthcare、米国)完全培地で二日間育てた。次の日、培地を除去し、10μg/mlの陰性対照群抗−ヒトIgG、抗−DLK1抗体18A5又は抗−DLK1抗体27F7が含まれた冷たいDMEM培地を添加し、抗体が細胞表面に結合するように4℃で1時間反応させた。細胞に結合しない抗体はPBSで3回水洗して除去した後、細胞に、4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)が含まれたPBSを添加し、常温で10分間反応させることによって細胞を固定させた。固定された細胞は、10% FBSが含まれたPBSで水洗した後、FITC−抗−ヒトIgG(Vector、米国)2次抗体が1:200で含まれたPBSを添加し、常温で1時間暗培養した。蛍光染色された細胞はPBSTで3分間隔で3回水洗した後、DAPI(4’,6−diamidino−2−phenylindole;Vector、米国)が含まれたマウンティング(mounting)溶液(Vector、米国)をスライドに落とし、気泡ができないようにカバーガラスで覆って封鎖した後、共焦点レーザー顕微鏡(Confocal laser scanning microscope;LSM510META、ZEISS、ドイツ)を用いてイメージングした。
抗−DLK1抗体18A5及び27F7が細胞表面に存在する抗原と結合した後、細胞内に取り込まれ得るかを確認するために、DLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞においてエンドサイトーシス(endocytosis)試験法を行い、また、抗体の細胞内位置を確認するために、免疫細胞化学的染色を行った。8−ウェルチャンバースライドにウェル当たり2×104でシードされた細胞に、10μg/mlの抗−DLK1抗体18A5及び27F7をそれぞれ処理し、4℃で1時間、細胞表面に存在する抗原に抗体が結合するように反応させた。その後、細胞を冷たいPBSで水洗し、抗体の細胞内流入を誘導するために、37℃にあらかじめ温めておいた完全培地に入れ換え、37℃、5% CO2条件で、0.1、0.5、1、2又は4時間培養した。計画した培養時間が終わった後、細胞をPBSで3回水洗して培地を除去し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞は、PBSで3回水洗した後、0.2%サポニン(saponin)及び10% FBSが含まれたPBSに希釈したそれぞれのエンドソーム(endosome)標識抗体と共に常温で1時間反応させた。エンドソーム標識は、後期エンドソーム(late endosome)/リソソーム(lysosome)標識抗体として抗−ウサギLAMP1(Abcam、米国)を、初期エンドソーム(early endosome)標識抗体として抗−マウスEEA1(BD Biosciences、米国)を、初期/リサイクリングエンドソーム(early/recycling endosome)標識抗体として抗−マウストランスフェリン受容体(transferrin receptor(TfR);BD Biosciences、米国)を使用した。標識抗体結合後、細胞は、10% FBSが含まれたPBSで3分間隔で3回水洗した後、抗−DLK1抗体に対する2次抗体であるFITCが結合した抗−ヒトIgG(Vector、米国)、抗−ウサギLAMP1に対する2次抗体であるCy3が結合した抗−ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch、米国)、そして抗−マウスEEA1又は抗−マウスTfRに対する2次抗体であるCy3が結合した抗−マウスIgG(Jackson ImmunoResearch、米国)を、0.2%サポニン(saponin)及び10% FBSが含まれたPBSにそれぞれ1:200に希釈して常温で1時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、PBSで3分間隔で3回水洗した後、DAPIが含まれたマウンティング溶液(Vector、米国)をスライドに落とし、気泡ができないようにカバーガラスで覆って封鎖した後、共焦点レーザー顕微鏡(Confocal laser scanning microscope;LSM510META、ZEISS、ドイツ)を用いてイメージングした。
抗−DLK1抗体18A5及び27F7を、DLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞表面に結合及び細胞流入を誘導した後、時間別に細胞表面に残っている抗体の量を測定するために、蛍光利用細胞分流器を用いて定量化を行った。6−ウェルプレートにウェル当たり5×105細胞でシード(seeding)された細胞に、10μg/mlの抗−DLK1抗体18A5及び27F7をそれぞれ処理し、4℃で1時間、細胞表面に存在する抗原に抗体が結合するように反応させた。その後、細胞を冷たいPBSで水洗し、抗体の細胞内流入を誘導するために、37℃にあらかじめ温めておいた完全培地に入れ換え、37℃、5% CO2条件で0、0.5、2又は4時間培養した。各時間別に細胞は、冷たい10% FBS(Fetal Bovine Serum)が含まれたPBSで水洗し、細胞をスクラッパー(scrapper)でかき集めて遠心分離した後、FITC蛍光が結合した抗−ヒトIgG 2次抗体(Vector、米国)を用いて4℃で0.5時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、10% FBSが含まれた500μlのPBSで懸濁させた後、流細胞分析機であるFACSCantoTMII flow cytometer(BD Bioscience、米国)を用いて分析した。抗体の内在化の動力学比較は、細胞表面に残っている抗−DLK1抗体を平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)によって定量化した。細胞内流入比率は、下記のように計算した。
細胞内流入(%)=(1−MFI37℃/MIF4℃)X100
抗−DLK1抗体に対する抗−DLK1抗体−薬物接合体(Antibody−Drug Conjugation)としての開発可能性を確認するために、DLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞に、ZAP抗体内在化キット(ZAP Antibody Internalization kit)(Advance Targeting System、USA)を用いて、DLK1単一ヒト抗体18A5及び27F7に対する細胞毒性実験を行った。96−ウェルプレート(Nunc、USA)にウェル当たり細胞を2.5×103で分注し、24時間付着させた後、18A5、18A5−Fab ZAP或いは27F7、27F7−Fab ZAPを、1fM〜10nMの範囲内で、図14のように、異なる濃度別に調製して細胞培養液に処理し、陽性対照薬物であるサポリン(Saporin)は1fM〜1μMの範囲内で、IgG−SAPは1fM〜100nMの範囲内で細胞培養液に処理した。その後、DLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞は、37℃、5% CO2インキュベーターで72時間培養した後、50μl XTT/PMS溶液を加え、2時間さらに培養し、これを、ELISAリーダー(Spectra Max5;Molecular Device、USA)を用いて450nmで吸光度を測定した。各試料の細胞毒性を比較検討するために、最大効果の50%に至らせるために必要な試料の量(EC50)を測定した。
実施例5−1.DLK1−18A5抗体の最適化のためのライブラリー作製
抗体最適化は、重鎖は固定し、ワイバイオロジックスで保有している105〜106軽鎖(LC)プールを入れて新しいLCシャフリングライブラリー(LC shuffling library)を作製するLCシャフリング、重鎖の疎水性コア(hydrophobic core)、露出残基(exposed residue)、電荷クラスター(charge cluster)、塩ブリッジ(salt bridge)などのように構造的に重要な部位の残基と比較分析をして保存された残基(conserved residue)に変異させた後にLCシャフリングを進行するコアパッキング(core packing)+LCシャフリング、抗体可変領域(antibody variable region)のDNAはin vivo親和度成熟(affinity maturation)過程で頻繁に変異(mutation)され得る変異ホットスポット(mutational hot spot)をランダムに変異させた後にLCシャフリングを進行するCDRホットスポット+LCシャフリング(AM)などの3つの方法で進行した。
実施例6−1.バイオパンニング(Bio−panning)
DLK1−18A5抗体の最適化のために作製したライブラリーファージをバクテリアに感染させた後、バクテリアを30℃に16時間培養した。培養後に遠心分離して上澄液をPEGで濃縮した後、これをPBS緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。ヒトDLK1−hFcタンパク質抗原がコートされた免疫チューブにライブラリーファージを入れ、室温で2時間反応させた後、1XPBS/Tと1XPBSで水洗し、抗原に特異的に結合したscFv−ファージだけを抽出した。
パンニングから得たコロニーは、2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に1ml 96−ディープウェルプレートを用いて37℃で16時間培養した。培養細胞は、OD600で値が0.1となるように100〜200μlを取って1mlの2xYTCM、2%グルコース、5mM MgCl2培地に入れた後、96−ディープウェルプレートに37℃でOD600値が0.5〜0.7となるように2〜3時間培養した。M1ヘルパーファージ(helper phage)をMOI値が1:20となるように感染させ、2xYTCMK、5mM MgCl21mM IPTG培地に30℃で16時間培養した。
選別された単一クローンに対してDNA精製キット(Qiagen、ドイツ)を用いてDNA−prepを行ってDNAを得、配列分析を依頼した(ソルジェント)。配列分析結果から、選別された抗体のVHとVLのCDR領域を確認し、それら抗体とジャームライン(germ line)抗体群の類似性を、NCBIのウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/のIg BLASTプログラムを用いて調べた。その結果、親抗体(DLK1−18A5)に比べて抗原結合力が高い又は類似の44種(LS:19種、FR:8種、AM:17種)の特異的なファージ抗体を得、下記する実施例のように、異なる種間の交差反応性(cross−reactivity)、抗原結合部位(epitope)、親和度(affinity)、細胞結合能、細胞内流入力、癌細胞死滅効能などの分析によって18A5_LS_1A10及び18A5_AM_1A12抗体の2種を選別した。選別した2種の単一クローン特性は、表7に整理して提示した。
選別された18A5抗体変異体2種の抗体生産は、実施例2−3に述べたのと同じ過程で行われた。クローニングされた重鎖と軽鎖を含むそれぞれのベクターは、動物臨時発現細胞HEK−293Eに同時形質感染して発現させた後、タンパク質A親和性クロマトグラフィーで精製して生産量を確認し、還元、非−還元条件でSDS−PAGE分析によってタンパク質純度及び移動度状態を確認した。
実施例8−1.選別されたDLK1ヒト単一抗体変異体の交差反応性(cross−reactivity)の決定
DLK1単一ヒト抗体変異体の他の種(species)から発見されるDLK1オルソログ(orthologue)に対する交差反応性(cross−reactivity)を調べるために、図7で使用したのと同じマウスDLK1及びサルDLK1タンパク質を用いて、DLK1ヒト抗体の結合力をELISA方法で調べてみた。
DLK1単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合部位を調べるために、図6におけると同じ4種のヒト由来DLK1組換えタンパク質及びhFc組換えタンパク質を用いて、DLK1ヒト抗体変異体に対してELISAを行った。
選別されたDLK1単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合力をELISA方法で測定した。前記実施例2−2で述べたファージ−ELISA方法と同一であり、ファージの代わりに選別されたDLK1単一ヒト抗体変異体を100nMで0.046nMまで1/3ずつ段階希釈(serial dilution)して各ウェルのカラムに順次に100μlずつ入れて行った。測定した結果は、GraphPad Prism 6 software(http://www.graphpad.com/scientific−software/prism/)を用いて分析した。DLK1単一ヒト抗体18A5_LS_1A10、18A5_AM_1A12の抗原に対する親和度の解離定数(Kd)はそれぞれ、0.047、0.013nMだった(図19)。
抗−DLK1抗体18A5とDLK1ヒト抗体変異体抗体である18A5_LS_1A10、18A5_AM_1A12の、DLK1が過発現したヒト膵癌細胞株であるMIA PaCa−2細胞表面への結合力を比較するためにFACS分析を行った。細胞を5×105細胞として準備し、1次抗体として抗−DLK1抗体18A5とDLK1ヒト抗体変異体抗体である18A5_LS_1A10、18A5_AM_1A12を10μg/ml濃度から初めて1/3階段希釈して4℃で1時間細胞結合させた。その後、細胞を冷たいPBSで水洗した後、FITC(fluorescein isothiocyanate;Vector、米国)蛍光が結合した抗−ヒトIgG 2次抗体(Vector、米国)を用いて4℃で1時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、2% FBS(fetal bovine serum)が含まれた500μlのPBSで懸濁させた後、流細胞分析機であるFACSCantoTMII flow cytometer(BD Biosciences、米国)を用いて分析した。最大効果の50%に至らせるのに必要な抗体の量(EC50)を測定した。
DLK1−18A5単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合特異性は、細胞表面にDLK1が過発現したMIA PaCa−2細胞と、内生的にDLK1を発現させているSK−N−F1細胞にそれぞれ、20nMのDLK1 siRNA(siDLK1、Dharmacon、米国)又はshRNA(shDLK1、Sigma、米国)を処理してDLK1の発現を減少させた後、抗体の細胞結合力差から確認した。抗体の細胞結合力はFACS分析から確認した。それぞれの細胞を5×105細胞として準備し、DLK1単一ヒト抗体変異体18A5_LS_1A10と18A5_AM_1A12を2μg/ml濃度で4℃で1時間反応させた。その後、細胞は、冷たいPBSで水洗した後、FITC(fluorescein isothiocyanate;Vector、米国)蛍光が結合した抗−ヒトIgG抗体(Vector、米国)を4℃で1時間暗培養した。蛍光染色された細胞は2% FBS(fetal bovine serum)が含まれた500μlのPBSで懸濁させた後、流細胞分析機であるFACSCantoTMII flow cytometer(BD Biosciences、米国)を用いて分析した。
実施例9−1.IncuCyte分析による選別されたDLK1ヒト抗体変異体の細胞内流入の確認
抗−DLK1抗体18A5とその変異体抗体である18A5_LS_1A10及び18A5_AM_1A12の細胞内流入力は、それぞれ、抗体をIncucyte(R) FabFluor human red fluorescent reagent(Essen Bioscience、米国)と接合させた後、DLK1の発現率が高いDLK1過発現MIA PaCa−2細胞、発現率が普通であるSK−N−F1細胞、そして発現率が低いHepG2細胞に処理し、時間によって細胞内に流入する抗体の量をモニタリングして確認した。96−ウェルプレート(Nunc、米国)にウェル当たり1×104個のDLK1過発現MIA PaCa−2細胞と4×104個のSK−N−F1又はHepG2細胞を分注して24時間付着させ、それぞれ4μg/mlの抗体を同量のIncucyte(R) FabFluor red antibody labeling reagentと混合して37℃で15分間暗反応させた後、細胞に処理した。抗体の細胞内流入量は、時間によって細胞のリソソームに蓄積される抗体の量をIncuCyte ZOOM HD/2CLR System(Essen Biosciences、米国)を用いて15分間隔で24時間確認し、定量化を行った。
DLK1−18A5単一ヒト抗体変異体である18A5_LS_1A10と18A5_AM_1A12抗体のADC(Antibody−Drug Conjugation)開発可能性の確認は、実施例4のように、DLK1過発現MIA PaCa−2細胞とZAP抗体内在化キット(Advance Targeting System、米国)を用いて同じ方法で細胞毒性実験を行い、18A5抗体と比較確認した。
Claims (16)
- 次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むDLK1(delta−like 1 homolog(Drosophila))に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片:
配列番号2、16、30、44、58、72及び86からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR1、
配列番号4、18、32、46、60、74及び88からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR2、
配列番号6、20、34、48、62、76及び90からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;及び
配列番号9、23、37、51、65、79、93、115及び121からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR1、
配列番号11、25、39、53、67、81及び95からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR2、及び
配列番号13、27、41、55、69、83、97、116及び125からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域。 - 配列番号1、15、29、43、57、71、85及び119からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖FR1、
配列番号3、17、31、45、59、73及び87からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖FR2、
配列番号5、19、33、47、61、75及び89からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖FR3、
配列番号7、21、35、49、63、77及び91からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖FR4、
配列番号8、22、36、50、64、78、92、117及び120からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖FR1、
配列番号10、24、38、52、66、80、94及び122からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖FR2、
配列番号12、26、40、54、68、82、96、118及び123からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖FR3、又は
配列番号14、28、42、56、70、84、98及び125からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖FR4を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号99、101、103、105、107、109、111及び127からなる群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号100、102、104、106、108、110、112、126及び128からなる群から選ばれる配列と90%以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 次の段階を含むDLK1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(a)請求項7に記載の細胞を培養する段階;及び
(b)前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬物を含む抗体−薬物接合体(antibody−drug conjugate,ADC)。
- 前記薬物は、細胞毒素(cytotoxin)、放射性同位元素、抗増殖剤、アポトーシス促進剤(pro−apoptotic agent)、化学療法剤及び治療用核酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項9に記載の抗体−薬物接合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異的抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項9に記載の抗体−薬物接合体又は請求項11に記載の二重特異的抗体を有効成分として含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。
- 前記癌は、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肉腫、神経芽細胞腫及び再発癌からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の癌であることを特徴とする、請求項12に記載の組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor:CAR)。
- 腫瘍細胞で発現するDLK1に特異的に結合する請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むT細胞エンゲージャ(T−cell engager)。
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