KR20210144767A

KR20210144767A - 암 치료용 의약

Info

Publication number: KR20210144767A
Application number: KR1020217033277A
Authority: KR
Inventors: 고지 나카무라; 고타 다카하시; 이즈미 사카구치; 링이 장
Original assignee: 치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2021-11-30
Also published as: JPWO2020204033A1; WO2020204033A1; EP3949990A1; IL286680A; US20220193064A1; AU2020255907A1; CA3135157A1; JP7549889B2; EP3949990A4; TW202104259A; CN113660954A

Abstract

기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는, 간세포암의 치료약, 치료 방법 등을 제공한다. 본 발명은, 간세포암을 치료하기 위한 조합 의약으로서, 렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

Description

암 치료용 의약

본 발명은 간세포암 치료용 의약 및 방법 등에 관한 것이다.

간암 (肝癌) 은, 전세계에 있어서의 암 관련 사망 원인의 제 2 위이며, 세계에서 연간 약 75 만명이 간암 때문에 사망하고 있다. 연간 신규 환자수 약 78 만명 중 약 80 ％ 가, 일본과 중국을 포함한 아시아 지역에 집중되어 있다. 간세포암은, 간암 전체의 85 ∼ 90 ％ 를 차지하고 있으며, 일본 내에 있어서는, 간세포암 환자수는 약 4 만 2 천명, 연간 사망수는 약 2 만 6 천명으로 보고되고 있다. 절제 불능 간세포암은, 치료 방법이 한정되어 있고, 예후가 매우 나쁘고, 언멧·메디컬·니즈가 높은 질환이다.

절제 불능 진행성 간세포암에 대한 치료약으로는, 복수의 수용체 티로신 키나아제에 대한 멀티키나아제 저해제가 사용되고 있다. 구체적으로는, 제 1 선택약으로는 소라페닙이나 렌바티닙, 제 2 선택약으로는 레고라페닙이나 카보잔티닙이 사용되고 있다.

렌바티닙은, 멀티키나아제 저해제의 하나로, 혈관 내피 증식 인자 수용체 (VEGFR) 인 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 이나 선유아세포 증식 인자 수용체 (FGFR) 의 FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 에 더하여, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 (PDGFR) 의 PDGFRα, KIT, RET 등의 종양 혈관 신생 혹은 종양 악성화에 관여하는 수용체형 티로신 키나아제에 대한 선택적 저해 활성을 갖는, 경구 투여 가능한, 티로신 키나아제 저해제이며, 2018년 3월 일본에서, 세계에 앞서, 절제 불능 진행성 간세포암의 1 차 치료약으로서 승인받았다. 2018년 8월에는 미국, 유럽에서 승인받았다. 또한, 렌바티닙은, 약제로서 사용되는 경우, 메실산염의 형태로 사용되는 것이 일반적이다.

절제 불능 간세포암에 대한 1 차 치료로서 렌바티닙과 소라페닙을 비교한 오픈 라벨 무작위화 페이즈 III 시험 (REFLECT 시험) 의 결과, 렌바티닙군의 주효율은 40.6 ％ 를 나타내어, 소라페닙의 12.4 ％ 보다 높고, 또, REFLECT 시험에서는, 렌바티닙군에 할당된 일본인 집단 (81 명) 의 주효율은 46.9 ％ 였다 (비특허문헌 1 참조).

이와 같이, 렌바티닙은 절제 불능 간세포암에 대하여 40.6 ％ 로 높은 주효율을 나타내고 있지만, 나머지 약 60 ％ 의 환자에게 있어서는 효과가 확인되지 않았다. 또한, 또 다른 1 차 치료약인 소라페닙에서의 주효율은 더욱 낮아 12.4 ％ 로, 멀티 키나아제 저해제의 단독 요법에 의한 치료 효과는 한정적이다.

Kudo M, et al., Lancet, vol. 391 (10126), p. 1163-1173, 2018

이와 같은 상황하에 있어서, 기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는, 간세포암의 치료약, 치료 방법 등의 개발이 요망되고 있었다.

본 발명은 상기 상황을 고려하여 이루어진 것으로, 이하에 나타내는, 간세포암 치료용의 조합 의약 등을 제공하는 것이다.

(1) 간세포암을 치료하기 위한 조합 의약으로서,

렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및

in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편

을 포함하는, 상기 조합 의약.

(2) 상기 종양이, 간세포암인, 상기 (1) 에 기재된 조합 의약.

(3) 상기 항체는, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 조합 의약.

(4) 상기 항체는,

(a) H 사슬 V 영역 (중쇄 가변 영역) 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 3 ∼ 5 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역 (경쇄 가변 영역) 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 6 ∼ 8 로 나타내는 아미노산 서열인 항체,

(b) H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 9 ∼ 11 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 12 ∼ 14 로 나타내는 아미노산 서열인 항체,

(c) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,

(d) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,

(e) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 24 또는 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,

(f) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 30, 32, 34 또는 36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,

(g) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 38, 40, 42 또는 44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,

(h) 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체,

(i) 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체,

(j) 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체, 및

(k) 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 조합 의약.

(5) 상기 항체 또는 항체 단편이, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물과의 복합체의 형태인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 조합 의약.

(6) 상기 조합 의약의 투약 종료 후에 있어서도, 암 세포의 증식을 억제할 수 있거나 또는 종양을 축소 혹은 소실시킬 수 있는 것인, 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 조합 의약.

(7) 간세포암 치료용 약제를 제조하기 위한

의 사용.

(8) 렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및

을 피험 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 간세포암의 치료 방법.

(9) 렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및

을 포함하는, 간세포암을 치료하기 위한 키트.

본 발명에 의하면, 간세포암의 치료에 관해서, 기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는 치료약 및 치료 방법 등을 제공할 수 있다. 본 발명의 치료약 및 치료 방법 등은, 예를 들어, 지금까지 치료 효과를 기대할 수 없었던 환자에 대해서도 효과를 발휘할 수 있는 것인 점에서, 매우 유용하다.

도 1a 는, 본 실시예에 있어서의, Hep3B 제노그래프트 모델을 사용한 렌바티닙과 항hDLK-1 항체 (HuBA-1-3D 항체) 의 병용 효과 측정 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는, 본 실시예에 있어서의, Hep3B 제노그래프트 모델을 사용한 렌바티닙과 항hDLK-1 항체 (HuBA-1-3D 항체) 의 병용 효과 측정 시험에 관한 것으로, 각 개체의 종양 체적의 증감 (이식 후 38 일간) 의 결과를 나타내는 도면이다.
도 1c 는, 본 실시예에 있어서의, Hep3B 제노그래프트 모델을 사용한 렌바티닙과 항hDLK-1 항체 (HuBA-1-3D 항체) 의 병용 효과 측정 시험에 관한 것으로, 측정 시험 종료 후에 적출한 종양의 중량 및 사진을 나타내는 도면이다.
도 2a 는, 본 실시예에 있어서의, HepG2 제노그래프트 모델을 사용한 렌바티닙과 항hDLK-1 항체 (HuBA-1-3D 항체) 의 병용 효과 측정 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2b 는, 본 실시예에 있어서의, HepG2 제노그래프트 모델을 사용한 렌바티닙과 항hDLK-1 항체 (HuBA-1-3D 항체) 의 병용 효과 측정 시험에 관한 것으로, 렌바티닙 투여군, 항hDLK-1 항체 투여군, 렌바티닙 및 항hDLK-1 항체 투여군의 종양 이식 후 34 일째의 종양 체적을 나타내는 도면이다.
도 3 는, Hep3B 제노그래프트 모델 및 HepG2 제노그래프트 모델을 사용한, Hep3B 및 HepG2 의 렌바티닙에 대한 감수성의 결과를 나타내는 도면이다. A 는, Hep3B 제노그래프트 모델을 사용한 결과, B 는, HepG2 제노그래프트 모델을 사용한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2019-070120호 명세서 (헤세이 31년 (2019년) 4월 1일 출원) 전체를 포함한다. 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은, 참조로서 본 명세서에 도입된다.

1. 본 발명의 개요

전술한 바와 같이, 렌바티닙은, 혈관 내피 증식 인자 수용체 (VEGFR1 ∼ 3) 나, 선유아세포 증식 인자 수용체 (FGFR1 ∼ 4) 에 더하여, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 (PDGFR) 의 PDGFRα, KIT, RET 등의 종양 혈관 신생 혹은 종양 악성화에 관여하는 수용체형 티로신 키나아제에 대한 선택적 저해 활성을 갖는, 경구 투여 가능한, 멀티 키나아제 저해제이다. 2018년 3월, 세계에 앞서, 절제 불능 진행성 간세포암의 1 차 치료약으로서 일본에서 승인받고, 2018년 8월에는 미국 및 유럽에 있어서도 승인받은 것이다. REFRECT 시험에 있어서, 렌바티닙은 40.6 ％ 로 높은 주효율을 나타냈지만, 나머지 약 60 ％ 의 환자에 있어서는 효과가 보이지 않아, 렌바티닙 단독 요법의 치료 효과는 한정적이다.

본 발명자는, 기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는 치료약을 개발하기 위해서, 인간 간세포암 유래 Hep3B 세포주나 HepG2 세포주를 사용한 제노그래프트 치료 모델에 의한 실험 및 검토를 실시하였다. 그 결과, 렌바티닙과, 인간 DLK-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila) ; 이하 「hDLK-1」 이라고 하는 경우가 있다) 에 대한 항체를 조합하여 투여함으로써, 렌바티닙이나 당해 항체의 단독 투여에 의한 경우와 비교하여, 지속적이고, 또한 현저하게 강한 종양 증식 억제 및 종양 축소 효과를 발휘하는 것을 밝혀내었다.

여기서, hDLK-1 은, 383 잔기의 아미노산으로 이루어지는 1 회 막관통형의 I 형 막 단백질로, 간세포암, 소세포 폐암, 췌장암, 유방암 등의 성인암, 신경아세포종, 간아종, 횡문근육종, 바이러스 종양 등의 소아암에 발현하고 있는 것이 알려져 있다. 한편, 정상적인 조직, 장기에서는 DLK-1 의 발현은 부신, 하수체 등에 한정되어 있고, 대부분의 장기에서는 발현하고 있지 않기 때문에, 암 치료 표적 분자로서 적합한 것이다. 지금까지, 우수한 종양 축소 효과를 포함하는 종양 세포 증식 저해, 및 종양 세포사 유도 작용을 나타내는, 항hDLK-1 모노클로날 항체가 창제 (創製) 되어 있고, 복수의 인간 암 세포주를 사용한 제노그래프트 치료 모델에 있어서, 항체의 단독 투여에 의한 항종양 활성이 나타나 있다.

본 발명자가 알아낸, 렌바티닙과 항hDLK-1 항체를 조합한 병용 의약·병용 요법에 의하면, 지금까지 멀티 키나아제 저해제의 단독 투여만으로는 충분한 치료 효과를 기대할 수 없었던 (불응답이었던) 간세포암의 환자에 대해서도, 충분한 치료 효과를 기대할 수 있다. 본 발명은 이와 같이 하여 완성되었다.

2. 암 치료용 조합 의약

본 발명의 간세포암을 치료하기 위한 조합 의약 (이하, 「본 발명의 조합 의약」 이라고 하는 경우가 있다.) 은, 전술한 바와 같이,

·렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물 (이하, 본 명세서에 있어서 「렌바티닙 등」 이라고 하는 경우가 있다.) 과,

·in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항hDLK-1 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편 (이하, 본 명세서에 있어서 「항hDLK-1 항체 등」 이라고 하는 경우가 있다.) 을

유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 것이다.

또한, 본 발명은, (i) 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을 사용하는 것, 구체적으로는, 예를 들어, 렌바티닙 등 및 항hDLK-1 항체 등의 유효량을 피험 대상 (간세포암 환자 또는 그럴 우려 (발증 리스크) 가 있는 환자, 혹은 그와 같은 비인간 포유 동물) 에게 투여하는 것을 포함하는, 간세포암의 치료 방법, (ii) 간세포암 치료용 약제를 제조하기 위한 렌바티닙 등 및 항hDLK-1 항체 등의 사용, (iii) 간세포암의 치료를 위한 렌바티닙 등 및 항hDLK-1 항체 등의 사용, 그리고, (iv) 간세포암 치료용의 렌바티닙 등 및 항hDLK-1 항체 등도 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, 간세포암의 치료에는, 예를 들어, 간세포암의 진행 억제, 예후 개선, 및/또는 재발 방지 등도 포함된다.

(1) 렌바티닙 등

본 발명의 조합 의약의 유효 성분인, 렌바티닙 등은, 공지된 시판되는 것을 사용할 수 있지만, 한정되지는 않으며, 독자적으로 합성, 추출 및 정제 등 한 것을 사용해도 된다. 독자적으로 합성 등 하는 경우에는, 미국 특허 제7,612,092호 명세서에 기재된 합성 방법을 참조할 수도 있다.

또한, 렌바티닙은, 정식 명칭 (IUPAC 명) 은, 4-[3-클로로-4-(시클로프로필 카르바모일아미노)페녹시]-7-메톡시-퀴놀린-6-카르복사미드 (4-[3-chloro-4-(cyclopropylcarbamoylamino)phenoxy]-7-methoxy-quinoline-6-carboxamide) 이며, 하기 구조식으로 나타내는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 조합 의약의 유효 성분으로는, 렌바티닙과 함께 또는 렌바티닙 대신에, 렌바티닙 유도체를 사용할 수도 있다. 당해 유도체로는, 렌바티닙 유래의 화학 구조를 갖는 등, 당업자의 기술 상식에 기초하여 렌바티닙의 유도체라고 생각되는 것이면 되며, 한정되지는 않지만, 항종양 활성이 렌바티닙과 동일한 정도인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 간단히 렌바티닙이라고 하는 경우도, 렌바티닙의 유도체를 포함할 수 있는 의미인 것으로 한다.

본 발명에 사용하는 렌바티닙으로는, 예를 들어, 생체내에서 산화, 환원, 가수분해, 또는 포합 (抱合) 등의 대사를 받는 것도 포함하는 것 외에, 생체내에서 산화, 환원, 또는 가수분해 등의 대사를 받아 렌바티닙을 생성하는 화합물 (이른바 프로드러그) 도 포함된다. 본 발명에 있어서, 프로드러그란, 약리학적으로 허용할 수 있는, 통상 프로드러그에 있어서 사용되는 기 (基) 로 친화합물을 수식한 화합물을 말하며, 예를 들어, 안정성이나 지속성의 개선 등의 특성이 부여되어, 장관내 등에서 친화합물로 변환되어 효과를 발현하는 것을 기대할 수 있는 화합물을 말한다. 예를 들어, 렌바티닙의 프로드러그는, 대응하는 할로겐화물 등의 프로드러그화 시약을 사용하여, 통상적인 방법에 의해, 당해 화합물 중의 프로드러그화가 가능한 기 (예를 들어, 수산기, 아미노기, 그 밖의 기) 에서 선택되는 1 이상의 임의의 기에, 통상적인 방법에 따라 적절히 프로드러그를 구성하는 기를 도입한 후, 필요에 따라, 단리 정제함으로써 제조할 수 있다. 여기서, 상기 프로드러그를 구성하는 기로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 저급 알킬-CO-, 저급 알킬-O-저급 알킬렌-CO-, 저급 알킬-OCO-저급 알킬렌-CO-, 저급 알킬-OCO-, 및 저급 알킬-O-저급 알킬렌-OCO- 등을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 조합 의약의 유효 성분으로는, 렌바티닙이나 그 프로드러그와 함께, 또는 렌바티닙이나 그 프로드러그 대신에, 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염을 사용할 수도 있다.

당해 약리학적으로 허용할 수 있는 염으로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 유기 술폰산염 (예를 들어, 메탄술폰산염 (메실산염이라고도 한다), 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 및 캠퍼술폰산염 등), 유기 카르복실산염 (예를 들어, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 및 시트르산염 등), 아미노산염 (예를 들어, 아스파르트산염, 및 글루타민산염 등), 4 급 아민염, 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨염, 및 칼륨염 등), 무기산염 (예를 들어, 황산염, 질산염, 과염소산염, 인산염, 탄산염, 및 중탄산염 등), 할로겐화수소산염 (예를 들어, 염산염, 브롬화수소산염, 및 요오드화수소산염 등), 알칼리 토금속염 (예를 들어, 마그네슘염, 및 칼슘염 등) 등을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명에 사용하는 렌바티닙의 약리학적으로 허용할 수 있는 염의 바람직한 일 양태로는, 렌바티닙 메실산염을 들 수 있다.

본 발명에 사용하는 렌바티닙은, 화합물의 구조상 발생할 수 있는 모든 이성체 (예를 들어, 기하 이성체, 부제 탄소에 기초하는 광학 이성체, 회전 이성체, 입체 이성체, 및 호변 이성체 등) 및 이들 이성체의 2 종 이상의 혼합물도 포함하며, 편의상 구조식 기재 등에 한정되는 것은 아니다. 또, 렌바티닙은, S-체, R-체 또는 RS-체 중 어느 것이어도 되고, 한정되지는 않는다. 또한, 렌바티닙은, 그 종류에 따라 수화물이나 용매화물의 형태로 존재하는 경우도 있으며, 본 발명에 있어서는 당해 수화물 및 용매화물도, 렌바티닙에 포함하는 것으로 하고, 본 발명의 조합 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 당해 용매화물로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 에탄올과의 용매화물 등을 들 수 있다.

본 발명의 조합 의약에 있어서, 유효 성분으로서의 렌바티닙 등의 함유 비율은, 한정되지는 않고, 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들어, 조합 의약 전체에 대하여, 0.01 ∼ 99 중량％ 의 범위 내로 할 수 있고, 바람직하게는 0.01 ∼ 30 중량％, 보다 바람직하게는 0.05 ∼ 20 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 10 중량％ 의 범위 내로 해도 된다. 유효 성분의 함유 비율이 상기 범위 내임으로써, 본 발명의 조합 의약은, 간세포암의 치료 효과를 충분히 발휘할 수 있다.

본 발명의 조합 의약은, 렌바티닙 등 이외에도, 본 발명의 효과가 현저하게 손상되지 않는 범위에서, 임의의 다른 멀티 키나아제 저해제 등을 포함하고 있어도 된다.

(2) 항hDLK-1 항체 등

본 발명의 조합 의약의 유효 성분인, 항hDLK-1 항체 (in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체) 는, 이하의 설명 기재에 기초하여 제조할 수 있다.

(i) 항원의 조제

hDLK-1 의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 의 정보는, 예를 들어 NCBI (GenBank) 의 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 「Accession number : NP_003827」 로서 공표되어 있다. 또한, hDLK-1 의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열 (서열 번호 1) 의 정보는, 동 (同) 웹 사이트에 「Accession number : NM 003836」 으로서 공표되어 있다.

항원으로는, hDLK-1 의 아미노산 서열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드 (간단히 펩티드라고도 한다) 를 사용할 수 있으며, 바람직하게는, hDLK-1 의 세포외 영역 (FA-1) 의 아미노산 서열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 펩티드를 사용할 수 있다. hDLK-1 의 세포외 영역은, 전술한 바와 같이 6 개의 EGF 형 모티프 (EGF-1 ∼ EGF-6) 를 포함하는 영역을 말하며, 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 제 24 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산을 포함하는 영역, 바람직하게는, 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 「제 24 번째」 부터 「제 248 ∼ 285 번째」 까지의 아미노산으로 이루어지는 영역 (대략 225 ∼ 262 아미노산 잔기) 을 말한다.

여기서, 항원에 사용하는 펩티드에 대해, 상기 「아미노산 서열의 적어도 일부」 란, 길이가 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 6 개의 EGF 형 모티프 중 1 개 또는 2 개 이상을 포함하는 영역이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 예를 들어, EGF-1 및 EGF-2 를 포함하는 영역 (즉 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), EGF-3 및 EGF-4 를 포함하는 영역 (즉 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), 그리고, EGF-4, EGF-5 및 EGF-6 을 포함하는 영역 (즉 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열 중 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 이다.

항원으로 하는 펩티드의 제조 방법은, 화학 합성이어도 되고, 대장균 등을 사용하는 유전자 공학적 수법에 의한 합성이어도 되며, 당업자에게 주지의 방법을 사용할 수 있다.

펩티드의 화학 합성을 실시하는 경우에는, 펩티드 합성의 주지 방법에 의해 합성할 수 있다. 또, 그 합성은, 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것도 적용할 수 있다. 시판되는 펩티드 합성 장치 (예를 들어, 시마즈 제작소 제조 : PSSM-8 등) 를 사용해도 된다.

펩티드를 유전자 공학적으로 합성하는 경우에는, 먼저, 당해 펩티드를 코드하는 DNA 를 설계하고 합성한다. 당해 설계 및 합성은, 예를 들어, 전체 길이 hDLK-1 유전자를 포함하는 벡터 등을 주형 (鑄型) 으로 하고, 원하는 DNA 영역을 합성할 수 있도록 설계한 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 상기 DNA 를 적당한 벡터에 연결함으로써 단백질 발현용 재조합 벡터를 얻고, 이 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현할 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다 (Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).

벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 또한, 동물 바이러스, 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 재조합 벡터의 제조는, 정제된 DNA 를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA 의 제한 효소 부위 등에 삽입하여 벡터에 연결하면 된다. 형질 전환에 사용하는 숙주로는, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 세균 (대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포 또는 곤충을 들 수 있다. 염소 등의 포유 동물을 숙주로서 사용하는 것도 가능하다. 숙주에 대한 재조합 벡터의 도입 방법은 공지이다.

그리고, 상기 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 항원으로서 사용되는 펩티드를 채취한다. 「배양물」 이란, 배양 상청, 배양 세포 혹은 배양균체 또는 그 파쇄물, 모두 의미하는 것이다.

배양 후, 목적 펩티드가 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 펩티드를 추출한다. 또, 목적 펩티드가 균체외 또는 세포외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 펩티드의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 목적으로 하는 펩티드를 단리 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 무세포 합성계를 사용한 in vitro 번역에 의해 항원이 되는 펩티드를 얻을 수도 있다. 이 경우에는, RNA 를 주형으로 하는 방법과 DNA 를 주형으로 하는 방법 (전사/번역) 2 가지 방법을 사용할 수 있다. 무세포 합성계로는, 시판되는 시스템, 예를 들어 Expressway TM 시스템 (인비트로젠사), PURESYSTEM (등록상표 ; 포스트 게놈 연구소), TNT 시스템 (등록상표 ; 프로메가사) 등을 사용할 수 있다.

상기와 같이 얻어진 펩티드는, 적당한 캐리어 단백질, 예를 들어 우혈청 알 부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 티로글로불린, 닭 감마글로불린 등에 결합하는 것도 가능하다.

또 항원은, hDLK-1 의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 또는 전술한 그 부분 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실 (缺失), 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드여도 된다. 예를 들어, hDLK-1 의 아미노산 서열 또는 그 부분 서열 중 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실되어 있거나, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있거나, 혹은, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, hDLK-1 단백질 혹은 그 부분 단편 또는 이들 변이형의 단백질 또는 단편을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로는, 예를 들어, 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다.

또, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 hDLK-1 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열, 또는 그 부분 서열을 사용하는 것도 가능하다.

「스트린젠트한 조건」 이란, 하이브리다이즈시킨 후의 세정 시의 조건으로서, 버퍼의 염 (나트륨) 농도가 10 ∼ 500 mM 이고, 온도가 42 ℃ ∼ 72 ℃, 바람직하게는, 상기 염 농도가 50 ∼ 300 mM 이고, 온도가 55 ∼ 68 ℃ 에서의 조건을 말한다.

유전자에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Prime STAR (등록상표) Mutagenesis Basal kit, Mutan (등록상표) - Super Express Km 등 : 다카라 바이오사 제조) 을 사용하여 실시할 수 있다.

(ii) 폴리클로날 항체의 제조

조제한 항원을, 면역을 위해 포유 동물에게 투여한다. 포유 동물은 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등을 들 수 있고, 그 중에서도 마우스가 바람직하다.

항원 동물 한 마리당 투여량은, 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는, 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA), 프로인트 불완전 아쥬반트 (FIA), 수산화알루미늄 아쥬반트 등을 들 수 있다. 면역은, 주로 정맥내, 발바닥, 피하, 복강내 등에 주입함으로써 실시할 수 있다. 또, 면역 간격에 대해서는, 특별히 한정되지 않으며, 수 일 내지 수 주일 간격, 바람직하게는 1 주일 간격으로, 1 ∼ 10 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종 면역일부터 3 ∼ 7 일 후에, 효소 면역 측정법 (ELISA 또는 EIA) 이나 방사성 면역 측정법 (RIA) 등으로 항체값을 측정하고, 원하는 항체값을 나타낸 날에 채혈하여, 항혈청을 얻을 수 있다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요해지는 경우에는, 황안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써, 정제할 수 있다. 그 후에는, 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등으로 측정한다.

(iii) 모노클로날 항체의 제조

·항체 산생 세포의 채취

본 발명의 항hDLK-1 항체는, 한정되지는 않지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

조제한 항원을, 면역을 위해 포유 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등에게 투여한다. 항원 동물 한마리당 투여량은, 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는 상기와 동일하다. 면역 수법도 상기와 동일하다. 그리고, 최종 면역일부터 1 ∼ 60 일 후, 바람직하게는 1 ∼ 14 일 후에, 항체 산생 세포를 채취한다. 항체 산생 세포로는, 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 림프절 세포 및 비장 세포가 바람직하다.

·세포 융합

하이브리도마 (항체 산생 세포주) 를 얻기 위해서, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 (柱化) 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는, 약제 선택성을 가지며, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함한다) 에서 생존할 수 없고, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다.

미엘로마 세포로는, 예를 들어, P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8(X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1 (NS1) 및 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 등의 마우스 미엘로마 세포주를 들 수 있다. 미엘로마 세포의 선택은, 항체 산생 세포와의 적합성을 적절히 고려하여 실시할 수 있다.

이어서, 미엘로마 세포와 항체 산생 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM 및 RPMI-1640 배지 등의 동물 세포용 배지 중에서, 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10⁷ 개/㎖ 의 항체 산생 세포와 2 × 10⁵ ∼ 2 × 10⁶ 개/㎖ 의 미엘로마 세포를 혼합한다. 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 (항체 산생 세포 : 미엘로마 세포) 는, 한정되지는 않지만, 통상적으로 1 : 1 ∼ 10 : 1 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 : 1 이다. 다음으로, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서, 예를 들어, 평균 분자량 1,000 ∼ 6,000 달톤 (D) 의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사용하여, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.

·하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그러한 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에 적당히 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 뿌리고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당히 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 14 일 전후부터 생육해 오는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.

다음으로, 증식해 온 하이브리도마의 배양 상청 중에, hDLK-1 에 반응하는 항체가 존재하는지 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은, 통상적인 방법을 따르면 되고, 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어, 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하고, ELISA, EIA 및 RIA 등에 의해 스크리닝 할 수 있다.

융합 세포의 클로닝은, 한계 희석법 등에 의해 실시할 수 있다. hDLK-1 에 강한 반응성을 나타내는 항체를 플로 사이토메트리 등에 의해 판정하고, 이것을 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 클론으로서 수립한다.

·모노클로날 항체의 채취

수립한 하이브리도마를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법, 또는 복수 (腹水) 형성법 등을 채용할 수 있다. 「배양」 이란, 하이브리도마를 배양 접시 또는 배양 보틀 안에서 생육시키는 것, 혹은 하이브리도마를 하기와 같이 동물의 복강내에서 증식시키는 것을 의미한다.

세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO₂ 농도) 으로 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득할 수 있다.

복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강내에 하이브리도마를 약 1 × 10⁷ 개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 2 ∼ 3 주일 후에 복수를 채취하는 것이 바람직하다.

상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요해지는 경우에는, 황안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.

·항종양 활성을 갖는 클론의 선별

본 발명에 사용하는 항hDLK-1 항체는, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체이다.

여기서, 「항종양 활성」 이란, 종양 세포 (암 세포) 를 사멸시키는 활성 또는 종양 성장을 저해하는 활성을 의미한다. 본 발명에 있어서, 항종양 활성으로는, 예를 들어, 종양 혈관 신생 저해 활성을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명의 항hDLK-1 항체가 항종양 활성을 발휘할 수 있는 인간 종양 (종양 세포) 의 종류로는, hDLK-1 의 발현이 확인되고 있는 공지된 인간 종양을 들 수 있다.

in vivo 에서의 항종양 활성의 확인은, 예를 들어, 원하는 종양 세포를 마우스의 피하에 이식한 담암 (擔癌) 마우스를 사용하고, 이 마우스에 상기한 바와 같이 얻어진 항체를 투여함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 투여는, 종양 세포의 이식 직후부터 실시해도 되고 (Prevention 모델), 이식에 종양이 소정의 체적이 된 것을 확인하고 나서 실시해도 된다 (Treatment 모델). 투여 방법은, 조금도 한정되지는 않지만, 예를 들어, 3 일에 1 회, 20 ㎎/㎏ 체중, 복강내 투여로 해도 된다. Prevention 모델의 경우에는, 종양 형성 빈도와 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다. Treatment 모델의 경우에는, 종양 체적 및 종양 중량에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항hDLK-1 항체로는, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, WO2008/056833, WO2009/116670, WO2014/054820 의 각 공보에 개시되어 있는, 항hDLK-1 을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들어, 이하의 (a) ∼ (k) 의 항hDLK-1 항체를 들 수 있으며, 그들 중 적어도 1 종을 사용할 수 있다.

(a) H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 3 ∼ 5 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 6 ∼ 8 로 나타내는 아미노산 서열인 항체.

(b) H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 9 ∼ 11 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 12 ∼ 14 로 나타내는 아미노산 서열인 항체.

(c) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 15) 로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 18 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 17) 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체. 또한, 당해 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역 중의 각 CDR 서열은, 상기 (a) 의 항체와 동일하다.

(d) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 19) 로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 22 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 21) 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체. 또한, 당해 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역 중의 각 CDR 서열은, 상기 (b) 의 항체와 동일하다.

(e) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 24 또는 26 으로 나타내는 아미노산 서열 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 23 또는 25) 로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 27) 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체 (인간화 항체). 또한, 당해 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역 중의 각 CDR 서열은, 상기 (a) 의 항체와 동일하다.

(f) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 30, 32, 34 또는 36 으로 나타내는 아미노산 서열 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 29, 31, 33 또는 35) 로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 45) 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체 (인간화 항체). 또한, 당해 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역 중의 각 CDR 서열은, 상기 (b) 의 항체와 동일하다.

(g) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 38, 40, 42 또는 44 로 나타내는 아미노산 서열 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 37, 39, 41 또는 43) 로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 (대응하는 염기 서열은 서열 번호 45) 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체 (인간화 항체). 또한, 당해 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역 중의 각 CDR 서열은, 상기 (b) 의 항체와 동일하다.

(h) 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체.

(i) 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체.

(j) 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체.

(k) 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체.

여기서, 상기 (f) 의 항체에 관해서는, 서열 번호 32 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이고,

서열 번호 34 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열의 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이고,

서열 번호 36 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열의, 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

마찬가지로, 상기 (g) 의 항체에 관해서는, 서열 번호 40 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이고,

서열 번호 42 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열의 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이고,

서열 번호 44 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열의, 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

이와 같은, 상기 (f) 및 (g) 의 항체 (인간화 항체) 에 있어서의, 아미노산 치환이 이루어진 개변 항체는, 보다 한층 어비디티 (Avidity ; 항원 결합 활성) 가 높은 항체이며, 예를 들어, 세포 표면에 있어서의 항원의 발현량이 적은 암 세포와의 결합 활성의 유지를 가능하게 하는 것이다. 또, 당해 개변 항체는, 액제 처방 중 및 원숭이나 인간의 혈중 (혈장중) 등에 있어서 장기 안정적인 항원 결합 활성을 유지할 수 있는 것이다.

또, 상기 (h) ∼ (k) 의 항체에 관해서는, 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마는, 「Mouse-Mouse hybridoma BA-1-3D」 라고 칭하고 2011년 2월 1일자로, 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마는, 「Mouse-Mouse hybridoma : M3-1」 이라고 칭하고 2006년 10월 18일자로, 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마는, 「Mouse-Mouse hybridoma DI-2-14」 라고 칭하고 2007년 8월 21일자로, 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마는, 「Mouse-Mouse hybridoma DI-6」 이라고 칭하고 2007년 8월 21일자로, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (수탁증 발행 당시의 국제 기탁 당국의 명칭) 에, 기탁된 것이다.

본 발명에 사용할 수 있는 항hDLK-1 항체로는, 예를 들어, 상기 서술한 여러 가지 항hDLK-1 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항hDLK-1 항체 등, 상기 서술한 여러 가지 항hDLK-1 항체와 경합할 수 있는 항체도 바람직하게 들 수 있다.

·항hDLK-1 항체의 에피토프

항hDLK-1 항체의 에피토프 (항원 결정기) 는, 항원인 hDLK-1 의 적어도 일부이면 되고, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 서열 번호 2 에 나타내는 hDLK-1 의 아미노산 서열 중의, 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDLK-1 의 EGF-1 ∼ EGF-2 를 포함하는 영역), 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDLK-1 의 EGF-3 ∼ EGF-4 를 포함하는 영역), 혹은 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDLK-1 의 EGF-4 ∼ EGF-6 을 포함하는 영역) 의 적어도 일부인 것이 바람직하다. 그 중에서도, hDLK-1 의 EGF-1 ∼ EGF-2 를 포함하는 영역이 보다 바람직하다. 당해 영역을 인식하는 (당해 영역과 결합한다) 항hDLK-1 항체는, 예를 들어, 종양 세포내에 대한 인터널리제이션 활성이 높고, 후술하는 이뮤노 콘주게이트 등의 용도에 매우 유용한 것이다.

(iv) 유전자 재조합 항체, 및 항체 단편

·유전자 재조합 항체

항hDLK-1 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 키메라 항체 및 인간화 항체 등을 들 수 있다.

키메라 항체 (즉 인간형 키메라 항체) 는, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체이며 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 키메라를 제조하는 경우에는, 그와 같이 연결한 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다.

인간화 항체를 제조하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하여, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제조한다 (이른바 CDR 그라프팅 (CDR 이식)). 다음으로, 이들 인간화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 인간화 항체의 제조법은, 예를 들어, Nature, 321, 522-525 (1986) ; J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ; Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989) ; 일본 공표특허공보 평4-502408호 (일본 특허공보 제2828340호 ; 퀸 등) 등을 참조할 수 있다. 또한 본 발명에 있어서는, 상기 인간화 항체의 H 사슬 또는 L 사슬의 V 영역의 일부 (CDR 서열을 제외한다) 의 아미노산 (바람직하게는 1 ∼ 몇 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개의 아미노산) 을 다른 아미노산으로 치환한, 개변형의 아미노산도 포함된다. 개변 인간화 항hDLK-1 항체로는, 보다 한층 어비디티 (Avidity ; 항원 결합 활성) 가 높은 인간화 항체로 할 수도 있으며, 예를 들어, 세포 표면에 있어서의 항원의 발현량이 적은 암 세포와의 결합 활성의 유지를 가능하게 하는 것이다. 또, 개변 인간화 항hDLK-1 항체는, 액제 처방 중 및 원숭이나 인간의 혈중 (혈장중) 등에 있어서 장기 안정적인 항원 결합 활성을 유지할 수 있는 것으로 할 수도 있다.

상기 키메라 항체 및 인간화 항체는, 예를 들어, 항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 것이 바람직하고, 상세하게는, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당사슬을 항체 분자의 Fc 영역에 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이러한 점 (항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 특징) 은, 전술한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체에 대해서도 마찬가지로 바람직하다.

·항체 단편

본 발명에 있어서는, 항hDLK-1 항체의 단편도, 본 발명의 항hDLK-1 항체와 함께, 또는 본 발명의 항hDLK-1 항체 대신에, 사용할 수 있다. 여기서, 당해 항체 단편은, 본 발명의 항hDLK-1 항체 (마우스 항체 이외의 인간화 항체 등을 포함한다) 와 마찬가지로, hDLK-1 에 대한 결합 활성을 갖는 것인 것이 바람직하고, 또 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것이나, 본 발명의 항hDLK-1 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 것도 바람직하지만, 특별히 이것들에 제한되지는 않는다.

당해 항체 단편으로는, 항hDLK-1 폴리클로날 항체 또는 항hDLK-1 모노클로날 항체의 일부분의 영역 (즉, 본 발명의 항hDLK-1 항체에서 유래하는 항체 단편) 을 의미하며, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv (variable fragment of antibody), 1 본쇄 항체 (H 사슬, L 사슬, H 사슬 V 영역, 및 L 사슬 V 영역 등), scFv, diabody (scFv 2량체), dsFv (디술파이드 안정화 V 영역), 그리고, 상보성 결정 영역 (complementarity determining region : CDR) 을 적어도 일부에 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.

Fab 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H 사슬의 N 말단측 약 절반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합으로 결합한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab 를 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab 를 제조할 수도 있다.

F(ab')₂ 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 개재하여 결합된 것 보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 후술하는 Fab 를 티오에테르 결합 혹은 디술파이드 결합시켜, 제조할 수도 있다.

Fab' 는, 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab' 를 제조할 수도 있다.

scFv 는, 1 개의 H 사슬 V 영역 (VH) 과 1 개의 L 사슬 V 영역 (VL) 을 적당한 펩티드 링커 (P) 를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

diabody 는, scFv 가 2량체화 한 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은, 동일할 수도 있고, 일방을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 P 의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를, 그 시스테인 잔기 사이의 디술파이드 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, Reiter 등에 의해 개시된 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라서, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

CDR 을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL 의 CDR (CDR 1 ∼ 3) 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 개재하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 펩티드는, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명에 사용하는 항체 단편으로는, 그대로의 형상으로 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이어도 되고, 또, 상기 서술한 항체 단편과 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부와의 융합 단백질이어도 된다. 이와 같은 항체 단편이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에 사용하는 항체 단편의 구체예로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 전술한 각종 항hDLK-1 항체에 있어서의, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 과 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 을 포함하는 것이나, H 사슬 V 영역 전체와 L 사슬 V 영역 전체를 포함하는 것 등을 들 수 있다.

(v) 항체 - 약제 복합체

본 발명에 사용하는 항hDLK-1 항체, 및 항체 단편은, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물과 복합체를 형성한 형태여도 된다. 또한, 미리, 항체 분자나 항체 단편 분자와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을, 각각 조제한 후, 이들을 복합화시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노 콘주게이트라고 칭해진다. 또, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물로서의 단백질 톡신을, 유전자 상에서 항체나 항체 단편의 유전자와 연결시켜, 1 개의 단백질 (융합 단백질) 로서 발현시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노톡신이라고 칭해진다.

항종양 활성을 갖는 화합물로는, 예를 들어, 독소르비신, 칼리케아마이신, 마이토마이신 C, Auristatin E 등을 들 수 있다. 살세포 활성을 갖는 화합물로는, 예를 들어, 사포린, 리신, 녹농균 외 독소, 디프테리아 톡신 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 사포린 및 녹농균 외 독소가 바람직하게 사용된다.

당해 복합체의 제조 방법으로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 디술파이드 결합이나 하이드라존 결합에 의해 항체와 약제를 커플링하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 사용하는 항hDLK-1 항체는, hDLK-1 을 발현하는 표적 종양 세포내에 대한 인터널리제이션 활성이 우수한 것이다. 그 때문에, 미리, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 복합화시켜 둠으로써, 이들 화합물을 종양 세포에 직접 또한 고선택적으로 작용시킬 수 있다. 당해 복합체는, 표적 종양 세포에 대한 약제 송달능이 매우 우수한 것이다.

또한, 세포내에 대한 인터널리제이션 활성은, 항체를 로다민 등에 의해 형광 표지하고, 세포내로의 이행 거동 및 항체의 국재성에 대해 형광 현미경 등을 사용하여 관찰함으로써 평가할 수 있다.

(3) 조합 의약

본 발명의 조합 의약은, 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을 유효 성분으로서 각각 함유하는 것이다.

본 발명의 조합 의약은, 피험 대상으로서의 인간, 또는 비인간 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여, 다양한 투여 경로, 구체적으로는, 경구, 또는 비경구 (예를 들어 정맥내 주사 (정주 (靜注)), 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 직장 투여, 경피 투여) 로 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조합 의약은, 단독으로 사용하는 것도 가능하지만, 투여 경로에 따라 관용되는 방법에 의해 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 사용하여 적당한 제형으로 제제화하여 사용할 수 있다.

제형으로는, 경구제에서는, 예를 들어, 정제, 산제, 세립제, 과립제, 피복 정제, 캡슐제, 내용수제, 현탁제, 유제, 시럽제, 및 트로키제 등을 들 수 있고, 비경구제에서는, 예를 들어, 주사제 (링겔제를 포함한다), 흡입제, 연고제, 점비제, 및 리포솜제 등을 들 수 있다.

이들 제제의 제제화에 사용할 수 있는 담체로는, 예를 들어, 통상적으로 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 및 교미교취제 외에, 필요에 따라, 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면 활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제, 증량제, 습윤화제, 표면 활성화제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 및 무통화제 등을 들 수 있으며, 의약품 제제의 원료로서 사용할 수 있는 공지된 성분을 배합하여 통상적인 방법에 의해 제제화하는 것이 가능하다.

당해 성분으로서 사용 가능한 무독성의 것으로는, 예를 들어, 대두유, 우지, 및 합성 글리세라이드 등의 동식물유 ; 유동 파라핀, 스쿠알란, 및 고형 파라핀 등의 탄화수소 ; 미리스트산옥틸도데실, 및 미리스트산이소프로필 등의 에스테르유 ; 세토스테알릴코올, 및 베헤닐알코올 등의 고급 알코올 ; 실리콘 수지 ; 실리콘유 ; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 등의 계면 활성제 ; 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리아크릴산, 카르복시비닐 폴리머, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 및 메틸셀룰로오스 등의 수용성 고분자 ; 에탄올, 및 이소프로판올 등의 저급 알코올 ; 글리세린, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 및 폴리에틸렌글리콜 등의 다가 알코올 (폴리올) ; 글루코오스, 및 자당 등의 당 ; 무수 규산, 규산알루미늄마그네슘, 및 규산알루미늄 등의 무기 분체 ; 염화나트륨, 인산 나트륨 등의 무기염 ; 정제수 등을 들 수 있으며, 모두 그 염 또는 그 수화물이어도 된다.

부형제로는, 예를 들어, 젖당, 과당, 콘 스타치, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 및 이산화규소 등을, 결합제로는, 예를 들어, 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜·폴리옥시에틸렌·블록 폴리머, 및 메글루민 등을, 붕괴제로는, 예를 들어, 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 시트르산칼슘, 덱스트린, 펙틴, 및 카르복시메틸셀룰로오스·칼슘 등을, 활택제로는, 예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탤크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 및 경화 식물유 등을, 착색제로는 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것을, 교미교취제로는, 예를 들어, 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 및 계피 분말 등을, 각각 바람직하게 들 수 있으며, 모두 그 염 또는 그들의 수화물이어도 된다.

본 발명의 조합 의약의 투여량은, 일반적으로는, 제제 중의 유효 성분의 배합 비율을 고려한 다음에, 투여 대상 (환자) 의 연령, 체중, 병의 종류·진행 상황이나, 투여 경로, 투여 횟수 (/1 일), 투여 기간 등을 감안하여, 적절히, 광범위하게 설정할 수 있다. 또, 본 발명의 조합 의약은, 유효 성분인 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을 실질적으로 동시에 투여해도 되고, 어느 것을 먼저 타방을 나중에 차례로 투여해도 되며 한정되지는 않는다. 또, 이들 투여는, 조합 의약에 포함되는 양을 한 번에 투여해도 되고, 연속적으로 투여해도 되며, 한정되지는 않는다.

본 발명의 조합 의약을, 비경구제 또는 경구제로서 사용하는 경우에 대해서, 이하에 설명한다.

비경구제로서 사용하는 경우, 일반적으로 그 형태는 한정되지 않지만, 각종 주사제의 경우에는, 예를 들어, 단위 투여량 앰플 또는 다투여량 용기의 상태나, 사용 시에 용해액에 재용해시키는 동결 건조 분말 상태로 제공될 수 있다. 당해 비경구제에는, 유효 성분이 되는 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등 외에, 각종 형태에 따라, 공지된 각종 부형재나 첨가제를 상기 유효 성분의 효과가 저해되지 않는 범위에서 함유할 수 있다. 예를 들어, 각종 주사제의 경우에는, 물, 글리세롤, 프로필렌글리콜이나, 폴리에틸렌글리콜 등의 지방족 폴리알코올 등을 들 수 있다.

비경구제의 투여량 (1 일당) 은, 한정되지는 않지만, 예를 들어 각종 주사제이면, 일반적으로는, 유효 성분이 되는 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을, 적용 대상 (피험자, 환자 등) 의 체중 1 ㎏ 당, 0.01 ∼ 1000 ㎎, 0.05 ∼ 500 ㎎, 또는 0.1 ∼ 50 ㎎ 복용할 수 있는 양으로 할 수 있고, 혹은 0.5 ∼ 20 ㎎ 복용할 수 있는 양이나 1 ∼ 10 ㎎ 복용할 수 있는 양으로 할 수도 있다.

경구제로서 사용하는 경우, 일반적으로 그 형태는 한정되지 않으며, 전술한 제 형 중 어느 것이어도 되고, 사용할 때에 재용해시키는 건조 생성물로 해도 된다. 당해 경구제에는, 유효 성분이 되는 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등 외에, 각종 형태에 따라, 공지된 각종 부형재나 첨가제를 상기 유효 성분의 효과가 저해되지 않는 범위에서 함유할 수 있다. 예를 들어, 결합제 (시럽, 아라비아 고무, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈 등), 충전재 (젖당, 당, 콘 스타치, 감자 전분, 인산칼슘, 소르비톨, 글리신 등), 윤활제 (스테아르산마그네슘, 탤크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카 등), 붕괴제 (각종 전분 등), 및 습윤제 (라우릴황산나트륨 등) 등을 들 수 있다.

경구제의 투여량 (1 일당) 은, 일반적으로는, 유효 성분이 되는 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을, 적용 대상 (피험자, 환자 등) 의 체중 1 ㎏ 당, 0.05 ∼ 5000 ㎎, 0.1 ∼ 1000 ㎎, 또는 0.1 ∼ 100 ㎎ 복용할 수 있는 양으로 할 수 있고, 혹은 0.5 ∼ 50 ㎎ 복용할 수 있는 양이나 1 ∼ 10 ㎎ 복용할 수 있는 양으로 할 수도 있다. 또, 경구제 중의 유효 성분의 배합 비율은, 한정되지는 않으며, 1 일당 투여 횟수 등을 고려하여, 적절히 설정할 수 있다.

본 발명의 조합 의약은, 간세포암의 치료에 관한 것으로, 기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것이고, 예를 들어, 당해 의약의 투약 종료 후에 있어서도, 암 세포의 증식을 억제할 수 있거나, 종양을 축소 또는 소실시킬 수 있는 것이다. 지금까지 치료 효과를 기대할 수 없었던 간세포암 환자에 대해서도 효과를 발휘할 수 있는 것인 점에서, 본 발명의 조합 의약은 매우 유용하다.

3. 키트

본 발명은, 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을 구성 요소로서 포함하는, 간세포암 치료용 키트의 형태를 제공할 수도 있다.

당해 키트에 있어서의 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등은, 안정성 (보존성) 및 사용 용이성 등을 고려하여, 예를 들어 용해한 상태로 구비되어 있어도 된다.

당해 키트는, 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등 이외에도, 적절히, 다른 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 표지 물질, 혹은 항체 또는 그 표지물을 고정시킨 고상화 시약 등을 포함할 수 있다. 항체의 표지 물질이란, 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학 발광 화합물 등에 의해 표지된 것을 의미한다. 또, 각종 버퍼, 멸균수, 각종 세포 배양 용기, 각종 반응 용기 (에펜도르프 튜브 등), 블로킹제 (Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, 염소 혈청 등의 혈청 성분), 세정제, 계면 활성제, 각종 플레이트, 아지화 나트륨 등의 방부제, 및 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등을 포함하고 있어도 된다.

당해 키트는, 구성 요소로서 적어도 전술한 렌바티닙 등과 항hDLK-1 항체 등을 구비하고 있는 것이면 된다. 따라서, 간세포암 치료에 필수가 되는 구성 요소 전부가 함께 키트에 구비되어 있어도 되고, 개개 따로따로 구비되어 있어도 되며, 한정되지는 않는다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

Hep3B 제노그래프트 모델을 사용하여, 렌바티닙 메실산염과 항hDLK-1 항체의 종양 형성 저해 활성에 있어서의 병용 효과를 검토하였다.

여기서, 렌바티닙 메실산염은, 시판되는 것을 사용하였다 (이하, 본 실시예에서는, 간단히 「렌바티닙」 이라고 칭한다.). 본 실시예에서 사용한 항hDLK-1 항체는, WO2014/054820 공보에 기재된 「HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체」 (이하, 본 실시예에서는, 간단히 「HuBA-1-3D 항체」 라고 칭한다.) 이며, 당해 항체 단백질을 코드하는 DNA 의 구축은 동 (同) 공보 (명세서 중의 실시예) 에 기재된 방법에 따라, 그 후, 숙주 세포에 의한 당해 항체 단백질의 산생·조제에 대해서는 GlymaxX (등록상표) 기술 (ProBioGen AG ; https://www.probiogen.de/genetic-glyco-engineering-adcc-glymaxx.html 을 참조) 을 사용하여 실시하였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체는, H 사슬 V 영역이 서열 번호 36 에 나타내는 아미노산으로 이루어지고, L 사슬 V 영역이 서열 번호 46 에 나타내는 아미노산으로 이루어지는 것이다.

1 × 10⁶ 의 Hep3B 세포를 6 ∼ 7 주령 암컷 NOD/ShiJic-scidJcl 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 평균 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계 (Day 14) 에서, 컨트롤군 (N = 8, 103.5 ± 18.1 ㎣) 과, 렌바티닙 (3 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 102.8 ± 16.8 ㎣) 과, HuBA-1-3D 항체 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 102.7 ± 15.0 ㎣) 과, 렌바티닙 (3 ㎎/㎏ 체중) 및 HuBA-1-3D 항체 (1 ㎎/㎏ 체중) 의 병용 투여군 (N = 8, 102.5 ± 12.5 ㎣) (이하, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군) 으로 군나누기를 실시하고, 같은 날부터 12 일간, HuBA-1-3D 항체는 주 2 회의 페이스로 (합계 4 회 ; Day 14, 18, 22, 25), 렌바티닙은 주 5 회 (5 일간 투여, 2 일간 휴약) 의 페이스로 (합계 10 회 ; Day 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25), 투약을 실시하였다. 주 2 회의 빈도로 종양 체적의 계측을 실시하고, 1500 ㎣ 에 도달한 개체는 관찰 종료로 하였다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 25 일째 (투약 종료일, Day 25) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 557.5 ± 240.5 ㎣ 였던 데 반해, 렌바티닙 투여군이 268.1 ± 175.7 ㎣, HuBA-1-3D 항체 투여군이 144.6 ± 111.2 ㎣, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군이 66.2 ± 59.1 ㎣ 가 되어, 어느 투여군도 컨트롤군과 비교하여 강한 항종양 활성이 확인되었다. 또, 투약 종료 후의 약효를 검토한 바, 암 세포 이식으로부터 31 일째 (투약 종료 후 6 일, Day 31) 에 있어서는, 컨트롤군이 1282.8 ± 448.3 ㎣, 렌바티닙 투여군이 572.2 ± 456.0 ㎣, HuBA-1-3D 항체 투여군이 92.9 ± 79.3 ㎣ 였던 데 반해, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군이 40.3 ± 46.1 ㎣ 가 되었다. 또한, 암 세포 이식으로부터 38 일째 (투약 종료 후 13 일, Day 38) 에 있어서는, 렌바티닙 투여군이 1148.5 ± 591.0 ㎣, HuBA-1-3D 항체 투여군이 402.3 ± 364.4 ㎣ 였던 데 반해, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군이 52.8 ± 63.9 ㎣ 가 되었다. 즉, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군은, 렌바티닙 투여군이나 HuBA-1-3D 항체 투여군과 비교하여, 투약 종료 후에도 강한 항종양 활성이 지속되는 것이 확인되었다 (도 1a).

각 개체의 종양 체적의 추이를 도 1b 에 나타낸다. 투약 기간 중, 렌바티닙 투여군, HuBA-1-3D 항체 투여군은 컨트롤군과 비교하여 종양 체적의 증가가 억제되고 있었지만, 투여 기간 종료 후, 렌바티닙 투여군과 HuBA-1-3D 항체 투여군에서는, 거의 모든 개체에 있어서 종양 체적의 증가가 확인되었다. 그에 반해, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군에 있어서는, 투약 기간이 종료한 후에도, 거의 모든 개체에 있어서 종양 체적의 증가가 억제되고 있었다.

관찰 종료일 (Day 38) 에 채취한 종양의 중량과 사진을 도 1c 에 나타낸다. 종양 중량은, 렌바티닙 투여군 (N = 7) 이 841.1 ± 515.8 ㎎, HuBA-1-3D 항체 투여군 (N = 8) 이 392.3 ± 412.9 ㎎, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군 (N = 8) 이 22.9 ± 40.5 ㎎ 이 되고, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군은, 렌바티닙 투여군이나 HuBA-1-3D 항체 투여군과 비교하여, 종양 중량이 유의하게 작았다. 또, 렌바티닙 투여군이나 HuBA-1-3D 항체 투여군에 비해, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군의 종양은 작고, 절반수의 개체에 있어서 종양의 소실이 확인되었다.

실시예 2

HepG2 제노그래프트 모델을 사용하여, 렌바티닙 메실산염과 항hDLK-1 항체의 종양 형성 저해 활성에 있어서의 병용 효과를 검토하였다.

여기서, 렌바티닙 메실산염은, 시판되는 것을 사용하였다 (이하, 본 실시예에서는, 간단히 「렌바티닙」 이라고 칭한다.). 본 실시예에서 사용한 항hDLK-1 항체는, WO2014/054820 공보에 기재된 「HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체」 (이하, 본 실시예에서는, 간단히 「HuBA-1-3D 항체」 라고 칭한다.) 이며, 당해 항체 단백질을 코드하는 DNA 의 구축은 동 공보 (명세서 중의 실시예) 에 기재된 방법에 따라, 그 후, 숙주 세포에 의한 당해 항체 단백질의 산생·조제에 대해서는 GlymaxX (등록상표) 기술 (ProBioGen AG ; https://www.probiogen.de/genetic-glyco-engineering-adcc-glymaxx.html 을 참조) 을 사용하여 실시하였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체는, H 사슬 V 영역이 서열 번호 36 에 나타내는 아미노산으로 이루어지고, L 사슬 V 영역이 서열 번호 46 에 나타내는 아미노산으로 이루어지는 것이다.

5 × 10⁶ 의 HepG2 세포를 7 주령 암컷 NOD/ShiJic-scidJcl 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 평균 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계 (Day 10) 에서, 컨트롤군 (N = 8, 118.4 ± 15.6 ㎣) 과, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 118.8 ± 15.2 ㎣) 과, HuBA-1-3D 항체 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8, 119.8 ± 12.9 ㎣) 과, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 및 HuBA-1-3D 항체 (1 ㎎/㎏ 체중) 의 병용 투여군 (N = 8, 119.7 ± 13.4 ㎣) (이하, 렌바티닙 ＋ HuBA-1-3D 항체 투여군) 으로 군나누기를 실시하고, 같은 날부터 12 일간, HuBA-1-3D 항체는 주 2 회의 페이스로 (합계 4 회 ; Day 10, 13, 17, 21), 렌바티닙은 주 5 회 (5 일간 투여, 2 일간 휴약) 의 페이스로 (합계 10 회 ; Day 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21), 투약을 실시하였다. 주 2 회의 빈도로 종양 체적의 계측을 실시하고, 1500 ㎣ 에 도달한 개체는 관찰 종료로 하였다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 21 일째 (투약 종료일, Day 21) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 596.1 ± 201.6 ㎣ (N = 8) 였던 데 반해, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군이 326.2 ± 188.7 ㎣ (N = 8), HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군이 116.4 ± 42.4 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) ＋ HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 항체 투여군이 110.6 ± 33.3 ㎣ (N = 8) 가 되어, 어느 투여군도 컨트롤군과 비교하여 강한 항종양 활성이 확인되었다. 또한, 투약 종료 후의 약효를 검토한 바, 암 세포 이식으로부터 31 일째 (투약 종료 후 10 일, Day 31) 에 있어서는, 컨트롤군이 1427.7 ± 591.7 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군이 817.4 ± 583.4 ㎣ (N = 8), HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 항체 투여군이 394.0 ± 169.8 ㎣ (N = 8) 였던 데 반해, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) ＋ HuBA-1-3D 항체 (1 ㎎/㎏) 투여군에서는 240.8 ± 90.7 ㎣ (N = 8) 가 되었다. 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 과 HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 의 병용 투여군에서는, HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군과 비교하여 종양 체적은 유의하게 작고, 병용 투여에 의한 항종양 효과의 증강이 확인되었다 (도 2a). Day 31 의 시점에서, 컨트롤군에 있어서는 8 개체 중 종양 체적이 1500 ㎣ 를 초과한 4 개체에 대해서는 새크리파이스하고, 렌바티닙 투여군에서는 8 개체 중 종양 체적이 1500 ㎣ 를 초과한 1 개체에 대해 새크리파이스하였다. Day 31 의 시점에서 병용 효과가 관찰된 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) ＋ HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군, 및 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군, HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군에 대해, Day 34 (투약 종료 후 13 일) 까지 관찰한 바, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 7) 의 종양 체적은 796.2 ± 461.7 ㎣, HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군 (N = 8) 이 584.1 ± 241.9 ㎣ 였던 데 반해, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) ＋ HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군 (N = 8) 에서는, 358.0 ± 168.1 ㎣ 이고, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 과 HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 의 병용 투여군에서는, HuBA-1-3D (1 ㎎/㎏) 투여군, 렌바티닙 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군과 비교하여 종양 체적은 유의하게 작고, 병용 투여에 의한 항종양 효과의 증강이 확인되었다 (도 2b).

[참고예 1]

인간 간세포암 유래의 2 종류의 세포주 (Hep3B 와 HepG2) 에 대해, 렌바티닙 메실산염 (시판품 ; 이하, 본 실시예에서는, 간단히 「렌바티닙」 이라고 칭한다.) 에 대한 감수성을 제노그래프트 치료 모델로 비교하였다.

Hep3B 제노그래프트 모델에 있어서는, 세포를 NOD/SCID 마우스 피하에 세포를 이식하고, 평균 종양 체적이 100 ㎣ 를 초과한 시점 (Day 14) 에 있어서, 1 군 8 마리로 군나누기를 실시하고, 같은 날부터 투여를 개시하였다. 투여는, 마우스 체중당 10 ㎕/g 으로 경구 존데를 사용하여 경구 투여하고, 주 5 회 (5 일간 투여, 2 일간 휴약) 의 페이스로 (합계 12 회 ; Day 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 29), 시험 최종일까지 실시하였다. 이식으로부터 29 일째 (Day 29 ; 시험 최종일) 에 있어서의 종양 체적 (평균값 ± 표준 편차) 은, 비히클 (주사용수) 투여군이 1050.3 ± 553.8 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (3 ㎎/㎏) 투여군이 400.9 ± 160.9 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (10 ㎎/㎏) 투여군이 200.2 ± 133.3 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (30 ㎎/㎏) 투여군이 136.2 ± 33.8 ㎣ (N = 8) 였다. 비히클군을 기준으로 하여, Day 29 에 있어서의 종양 체적의 비율 (T/C) 은, 렌바티닙 투여군 (3, 10, 30 ㎎/㎏ 투여군) 에 있어서, 각각 순서대로, 38.2 ％ (P < 0.05), 19.1 ％ (P < 0.05), 13.0 ％ (P < 0.05) 였다 (도 3a).

한편, HepG2 제노그래프트 모델에 있어서는, 렌바티닙에 대한 감수성이 Hep3B 모델과 비교하여 낮은 것이 판명되었다. 세포를 NOD/SCID 마우스 피하에 세포를 이식하고, 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 를 초과한 시점 (Day 10) 에 있어서, 1 군 8 마리로 군나누기를 실시하고, 같은 날부터 투여를 개시하였다. 투여는, 마우스 체중당 10 ㎕/g 으로 경구 존데를 사용하여 경구 투여하고, 주 5 회 (5 일간 투여, 2 일간 휴약) 의 페이스로 (합계 14 회 ; Day 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27), 시험 최종일 전날까지 실시하였다. 이식으로부터 28 일째 (Day 28 ; 시험 최종일) 에 있어서의 종양 체적 (평균값 ± 표준 편차) 은, 비히클 (주사 용수) 투여군이 1163.0 ± 205.1 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (3 ㎎/㎏) 투여군이 892.5 ± 220.7 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (10 ㎎/㎏) 투여군이 506.8 ± 215.7 ㎣ (N = 8), 렌바티닙 (30 ㎎/㎏) 투여군이 380.0 ± 146.8 ㎣ (N = 8) 였다. 비히클군을 기준으로 하여, Day 28 에 있어서의 종양 체적의 비율 (T/C) 은, 렌바티닙 투여군 (3, 10, 30 ㎎/㎏ 투여군) 에 있어서, 각각 순서대로, 76.7 ％ (P < 0.05), 43.6 ％ (P < 0.05), 32.7 ％ (P < 0.05) 였다 (도 3b).

산업상 이용가능성

본 발명에 관련된 치료약 및 치료 방법 등은, 간세포암 치료에 관해서, 기존의 멀티 키나아제 저해제보다 강력하고 또한 지속적인 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것이고, 예를 들어, 지금까지 치료 효과를 기대할 수 없었던 환자에 대해서도 효과를 발휘할 수 있는 것인 점에서, 매우 유용하다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 23 : 재조합 DNA

서열 번호 24 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 25 : 재조합 DNA

서열 번호 26 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 27 : 재조합 DNA

서열 번호 28 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 29 : 재조합 DNA

서열 번호 30 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 31 : 재조합 DNA

서열 번호 32 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 33 : 재조합 DNA

서열 번호 34 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 35 : 재조합 DNA

서열 번호 36 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 37 : 재조합 DNA

서열 번호 38 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 39 : 재조합 DNA

서열 번호 40 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 41 : 재조합 DNA

서열 번호 42 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 43 : 재조합 DNA

서열 번호 44 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

서열 번호 45 : 재조합 DNA

서열 번호 46 : 합성 컨스트럭트 (재조합 단백질)

SEQUENCE LISTING <110> Chiome Bioscience Inc. <120> A pharmaceutical combination for treating tumor <130> G2308WO <150> JP 2019-070120 <151> 2019-04-01 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (154)..(1305) <400> 1 gagagcgcag cgcgcagccc ggtgcagccc tggctttccc ctcgctgcgc gcccgcgccc 60 cctttcgcgt ccgcaaccag aagcccagtg cggcgccagg agccggaccc gcgcccgcac 120 cgctcccggg accgcgaccc cggccgccca gag atg acc gcg acc gaa gcc ctc 174 Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu 1 5 ctg cgc gtc ctc ttg ctc ctg ctg gct ttc ggc cac agc acc tat ggg 222 Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly 10 15 20 gct gaa tgc ttc ccg gcc tgc aac ccc caa aat gga ttc tgc gag gat 270 Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp 25 30 35 gac aat gtt tgc agg tgc cag cct ggc tgg cag ggt ccc ctt tgt gac 318 Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp 40 45 50 55 cag tgc gtg acc tct ccc ggc tgc ctt cac gga ctc tgt gga gaa ccc 366 Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu His Gly Leu Cys Gly Glu Pro 60 65 70 ggg cag tgc att tgc acc gac ggc tgg gac ggg gag ctc tgt gat aga 414 Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg 75 80 85 gat gtt cgg gcc tgc tcc tcg gcc ccc tgt gcc aac aac ggg acc tgc 462 Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys 90 95 100 gtg agc ctg gac gat ggc ctc tat gaa tgc tcc tgt gcc ccc ggg tac 510 Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr 105 110 115 tcg gga aag gac tgc cag aaa aag gac ggg ccc tgt gtg atc aac ggc 558 Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly 120 125 130 135 tcc ccc tgc cag cac gga ggc acc tgc gtg gat gat gag ggc cgg gcc 606 Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala 140 145 150 tcc cat gcc tcc tgc ctg tgc ccc cct ggc ttc tca ggc aat ttc tgc 654 Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys 155 160 165 gag atc gtg gcc aac agc tgc acc ccc aac cca tgc gag aac gac ggc 702 Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly 170 175 180 gtc tgc act gac att ggg ggc gac ttc cgc tgc cgg tgc cca gcc ggc 750 Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly 185 190 195 ttc atc gac aag acc tgc agc cgc ccg gtg acc aac tgc gcc agc agc 798 Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser 200 205 210 215 ccg tgc cag aac ggg ggc acc tgc ctg cag cac acc cag gtg agc tac 846 Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Gln His Thr Gln Val Ser Tyr 220 225 230 gag tgt ctg tgc aag ccc gag ttc aca ggt ctc acc tgt gtc aag aag 894 Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys 235 240 245 cgc gcg ctg agc ccc cag cag gtc acc cgt ctg ccc agc ggc tat ggg 942 Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly 250 255 260 ctg gcc tac cgc ctg acc cct ggg gtg cac gag ctg ccg gtg cag cag 990 Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val His Glu Leu Pro Val Gln Gln 265 270 275 ccg gag cac cgc atc ctg aag gtg tcc atg aaa gag ctc aac aag aaa 1038 Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys 280 285 290 295 acc cct ctc ctc acc gag ggc cag gcc atc tgc ttc acc atc ctg ggc 1086 Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly 300 305 310 gtg ctc acc agc ctg gtg gtg ctg ggc act gtg ggt atc gtc ttc ctc 1134 Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly Thr Val Gly Ile Val Phe Leu 315 320 325 aac aag tgc gag acc tgg gtg tcc aac ctg cgc tac aac cac atg ctg 1182 Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn Leu Arg Tyr Asn His Met Leu 330 335 340 cgg aag aag aag aac ctg ctg ctt cag tac aac agc ggg gag gac ctg 1230 Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu 345 350 355 gcc gtc aac atc atc ttc ccc gag aag atc gac atg acc acc ttc agc 1278 Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser 360 365 370 375 aag gag gcc ggc gac gag gag atc taa gcagcgttcc cacagccccc 1325 Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile 380 tctagattct tggagttccg cagagcttac tatacgcggt ctgtcctaat ctttgtggtg 1385 ttcgctatct cttgtgtcaa atctggtgaa cgctacgctt acatatattg tctttgtgct 1445 gctgtgtgac aaacgcaatg caaaaacaat cctctttctc tctcttaatg catgatacag 1505 aataataata agaatttcat ctttaaa 1532 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro 20 25 30 Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly 35 40 45 Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp Gln Cys Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu 50 55 60 His Gly Leu Cys Gly Glu Pro Gly Gln Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp 65 70 75 80 Asp Gly Glu Leu Cys Asp Arg Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro 85 90 95 Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys Val Ser Leu Asp Asp Gly Leu Tyr Glu 100 105 110 Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Lys Asp Cys Gln Lys Lys Asp 115 120 125 Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser Pro Cys Gln His Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Val Asp Asp Glu Gly Arg Ala Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Gly Asn Phe Cys Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro 165 170 175 Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe 180 185 190 Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro 195 200 205 Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu 210 215 220 Gln His Thr Gln Val Ser Tyr Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr 225 230 235 240 Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr 245 250 255 Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val 260 265 270 His Glu Leu Pro Val Gln Gln Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser 275 280 285 Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala 290 295 300 Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly 305 310 315 320 Thr Val Gly Ile Val Phe Leu Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn 325 330 335 Leu Arg Tyr Asn His Met Leu Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln 340 345 350 Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys 355 360 365 Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile 370 375 380 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Thr Tyr Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Gln His Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 15 gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag cca ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aga gac acc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gag cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt aaa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag ttc agc agc ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct gca gcc 354 Val Thr Val Ser Ala Ala 115 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala Ala 115 <210> 17 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 17 gat att gtg atg act cag gct gca ccc tct gta cct gtc act cct gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag tca gta tcc atc tcc tgc agg tct agt aag agt ctc ctg cat agt 96 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc ctg cag agg cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gcc tca gga gtc cca 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc aca ctg aga atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac tgt atg caa cat 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 336 Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 19 cag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag ctg gtg agg cct ggg gtc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg aag cag agt cat gca aag agt cta gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt gcc aga ttg aca tct gag gat tct gcc atc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga tta cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 21 gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tcc ctg gct atg tca gta gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 cag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt cag agc ctt tta aat agt 96 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 tct cct aaa ctt ctg gta tac ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc ata ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gat tac ttc tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc act cct ccc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg 336 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 23 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 23 cag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aag aag cca ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtc aag gtc tcc tgc aag gct tct ggc ttc aac att aga gac acc 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg cgg cag gcc cct gga cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt aaa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ttc agc agc ctg aga tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 336 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 25 cag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aag aag cca ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtc aag gtc tcc tgc aag gct tct ggc ttc aac att aga gac acc 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg cgg cag gcc cct gga cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct ccg aat ggt aat ctt aaa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agg tct gat ggt tac tcc ttt gct tac tgg ggc caa gga act ctg 336 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 gtc act gtc tct tca 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 27 gat att gtg atg act cag tct cca ctc tct ctg cct gtc act cct gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agc aag agt ctc ctg cat agt 96 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc ctg cag aag cca ggc cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cct cag ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gcc tca gga gtc cca 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac tgt atg caa cat 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 gta gaa tat cca ttc acg ttc ggc caa ggg aca aag gtg gaa atc aaa 336 Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 31 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 33 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 35 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 37 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 39 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 41 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 43 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 45 gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc ctt ctg aat agt 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aaa ctt ctg gtc tac 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Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys

Claims

간세포암을 치료하기 위한 조합 의약으로서,
렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및
in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편
을 포함하는, 상기 조합 의약.
제 1 항에 있어서,
상기 종양이, 간세포암인, 조합 의약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 항체는, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 조합 의약.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는,
(a) H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 3 ∼ 5 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 6 ∼ 8 로 나타내는 아미노산 서열인 항체,
(b) H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 9 ∼ 11 로 나타내는 아미노산 서열이고, 또한, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 서열이, 각각 순서대로, 서열 번호 12 ∼ 14 로 나타내는 아미노산 서열인 항체,
(c) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,
(d) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,
(e) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 24 또는 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,
(f) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 30, 32, 34 또는 36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,
(g) H 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 38, 40, 42 또는 44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 46 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 항체,
(h) 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체,
(i) 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체,
(j) 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체, 및
(k) 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항체
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 조합 의약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편이, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물과의 복합체의 형태인, 조합 의약.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조합 의약의 투약 종료 후에 있어서도, 암 세포의 증식을 억제할 수 있거나 또는 종양을 축소 혹은 소실시킬 수 있는 것인, 조합 의약.
간세포암 치료용 약제를 제조하기 위한
렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및
in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편
의 사용.
렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및
in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편
을 피험 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 간세포암의 치료 방법.
렌바티닙, 혹은 그 프로드러그, 또는 그들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염, 혹은 그들의 수화물 혹은 용매화물, 및
in vivo 에서 항종양 활성을 갖는, 인간 DLK-1 에 대한 항체, 혹은 당해 항체에서 유래하는 항체 단편
을 포함하는, 간세포암을 치료하기 위한 키트.