KR101972625B1 - ｉｎ ｖｉｖｏ 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 ＴＲＯＰ－２ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 hTROP-2 와 특이적으로 반응하고 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체 (특히 인간형화 항체), 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 약제의 복합체, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공한다.

Description

ｉｎ ｖｉｖｏ 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 ＴＲＯＰ－２ 항체 {ANTI-HUMAN TROP-2 ANTIBODY HAVING AN ANTITUMOR ACTIVITY IN VIVO}
본 발명은 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 TROP-2 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 및 당해 항체의 용도에 관한 것이다.
인간 TROP-2 (Tacstd2, GA733-1, EGP-1) (이하, hTROP-2 라고도 표기한다) 는, 다양한 상피 세포암종에 있어서 과잉 발현하고 있는 것이 알려진, 323 아미노산 잔기 (배열 번호 2 참조) 로 이루어지는 1 회 막관통형의 1 형 세포막 단백질이다. 이전부터, 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 와 암 세포에 공통되는 면역 저항성에 관여하는 세포막 단백질의 존재 (비특허문헌 1) 가 시사되어 있었는데, 인간 융모암 세포주 BeWo 의 세포막 단백질에 대한 마우스 모노클로날 항체 (162-25.3, 162-46.2) 에 의해 인식되는 항원 분자가 특정되고, 인간 영양막 세포 (trophoblasts) 에 발현하는 분자의 1 개로서 Trop-2 라고 명명되었다 (비특허문헌 2). 후에, 동일한 분자가 다른 연구자에 의해 발견되어, 위암 세포 SW948 을 면역하여 얻어진 마우스 모노클로날 항체 GA733 에 의해 인식되는 종양 항원 GA733-1 (비특허문헌 3), 비소세포 폐암 세포 면역에 의해 얻어진 마우스 모노클로날 항체 RS7-3G11 에 의해 인식되는 상피 당단백질 (epithelial/carcinoma antigen, EGP-1) (비특허문헌 4) 이라고도 불렸지만, 1995년에 Trop-2 의 유전자가 클로닝되고, 이들이 동일한 분자인 것이 확인되었다 (비특허문헌 5). 또한, 암 세포에 있어서 세포 내 칼슘 시그널을 증폭시키는 기능이 밝혀져 (비특허문헌 6), tumor-associated calcium signal transducer 2, TACSTD2 라고도 불린다.
hTROP-2 유전자는 염색체 1p32 에 매핑되어, 약 50 ％ 의 상동성을 갖는 GA733-2 (TACSTD1, 상피 당단백질 EGP-2, EpCAM 및 Trop-1 로도 알려져 있다) 와 함께 TACSTD 유전자 패밀리를 구성하고 있다 (비특허문헌 7). hTROP-2 단백질 (323 아미노산 잔기 ; 배열 번호 2) 은 대략 36 킬로 달톤의 분자량을 갖고, 친수성의 시그널 펩타이드 (제 1 ∼ 26 번째의 아미노산), 세포 외 도메인 (제 27 ∼ 274 번째의 아미노산), 세포막 관통 도메인 (제 275 ∼ 297 번째의 아미노산) 그리고 세포 내 도메인 (제 298 ∼ 323 번째의 아미노산) 으로 이루어진다. 세포 외 도메인에는 4 개의 불균질 N 결합 글리코실화 부위가 있고, 당사슬 부가에 의해 외관상의 분자량은 11 ∼ 13 킬로 달톤 증가한다 (비특허문헌 5). TACSTD 유전자 패밀리에서는, 세포 외 도메인에 특징적인 thyroglobulin (TY) 배열을 갖고, 암 세포의 증식이나 침윤, 전이에 관여하는 것으로 생각되고 있다.
지금까지, hTROP-2 의 생리학적 리간드는 동정되어 있지 않아, 분자 기능은 분명하지 않지만, 종양 세포에 있어서 칼슘 시그널을 전달하는 것이 나타나고 (비특허문헌 6), 또한, Ca2 + 의존성의 키나아제인 프로테인 키나아제 C (PKC) 에 의해, 세포 내 세린 303 잔기가 인산화되는 점 (비특허문헌 4) 이나, 세포 내 도메인에 PIP2 결합 배열을 갖는 점에서, 종양 세포에 있어서의 시그널 전달 기능이 시사되어 있다 (비특허문헌 8).
면역 조직 화학 (IHC) 및 플로우 사이토메트리 등의 해석에 의해, 위암, 폐암, 대장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 식도암 등의 많은 상피 유래 암종에 있어서 hTROP-2 의 과잉 발현이 보고되어 있다. 이에 반하여, 정상 조직에 있어서의 발현은 상피 영역의 세포에 한정되고, 발현 레벨도 암종과 비교하여 낮은 것이 나타나, TROP-2 의 종양 형성에 대한 관여가 시사되어 있다 (특허문헌 1 ∼ 3 및 9).
또한, 임상 검체에 있어서의 바이오 마커로서의 hTROP-2 의 발현은 대장암 (비특허문헌 10 및 11), 췌장암 (비특허문헌 12) 이나 구강암 (비특허문헌 13) 의 악성도와 상관이 있고, hTROP-2 가 고발현하고 있는 경우에는 암의 전이나 재발이 유의하게 높은 것이 나타나 있다. 또한, cDNA 마이크로 어레이 기술을 사용한 대규모 유전자 발현 분석에 있어서, 정상적인 난소 상피와 비교하여 난소의 중증의 유두상선암에 가장 고도로 과잉 발현하고 있는 유전자군의 1 개로서 동정되었다 (비특허문헌 14).
또한, 최근, 종양 형성에 있어서의 hTROP-2 의 중요한 역할이 대장암 세포를 사용한 모델에 의해 증명되었다 (비특허문헌 15). hTROP-2 의 발현이 종양 세포의 족장 비의존적 세포 증식을 촉진시키고, 면역 부전 마우스의 피하에 이식한 암 세포의 종양 형성 및 증식에 필요한 점에서, 기능적인 종양 항원으로서 새로운 치료 표적이 될 가능성을 나타냈다.
지금까지, 몇 개의 항 hTROP-2 항체에 대하여 항종양 효과의 검토가 보고되어 있다. RS7 항체 (특허문헌 1) 에 대하여, 방사성 물질로 표지한 항체를 사용한 in vivo 모델에 있어서 시험되고, 누드 마우스 이종 이식 모델에 있어서의 항종양 활성이 나타나 있지만, 항체 단독 (누드 항체) 에서의 항종양 효과는 보고되어 있지 않다.
이 밖에, 세포 독소를 결합시킨 항 hTROP-2 모노클로날 항체 BR110 (특허문헌 2) 에 의한, 인간 암 세포주 H3619, H2987, MCF-7, H3396 및 H2981 에 대한 in vitro 실험에서의 세포 장해성이 보고되어 있지만, in vivo 데이터에서는 누드 항체 또는 BR110 의 면역 복합체에 대하여 개시되어 있는 것은 없었다.
최근, 인간 난소암 조직을 마우스에 면역함으로써 얻어진 하이브리도마 세포주 AR47A6.4.2 혹은 AR52A301.5 에 의해 산생되는 단리 모노클로날 항체가, hTROP-2 와 결합하고, 누드 항체로서 처음으로, in vitro 에서의 세포 장해성에 더하여, 누드 마우스 이종 이식 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 것이 보고되었다 (특허문헌 3 및 4). 그러나, 이들 문헌 중에서는, 췌장암 세포주 BxPC-3 및 PL45, 전립선암 세포 PC-3, 유방암 세포 MCF-7 그리고 대장암 세포 Colo205 를 이식한 마우스 이종 이식 모델에 있어서 항체 단독으로의 항종양 효과가 나타나 있지만, BxPC-3 세포 이식에 있어서 치료 효과가 나타나 있는 것 이외에는, 항체의 예방적 투여에 의해 종양 형성 및 증식을 부분적으로 (약 40 ∼ 60 ％) 억제하는 것이 나타나 있는 것에 불과하고, 또한, 필요한 항체량도, 20 ㎎/㎏ 정도로 매우 고용량이었다.
이상의 종래의 지견으로부터, 항 hTROP-2 항체의 항종양 항체로서의 가능성이 시사되어 있지만, 동시에, 항 hTROP-2 항체 모두가 누드 항체로서 항체 단독으로 in vivo 에 있어서 항종양 효과를 나타내는 것이 아니라, 항체의 결합 부위나 친화성, 모노클로날 항체의 성질에 따라, hTROP-2 에 대한 작용이 상이한 것을 나타내고 있다.
미국 특허 제6653104호 미국 특허 제5840854호 미국 특허 제7420040호 미국 특허 제7420041호
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이와 같은 상황하에 있어서, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체 (항 hTROP-2 모노클로날 항체), 구체적으로는, 누드 항체로서 항체 단독으로 in vivo 에 있어서의 항종양 효과를 갖고, 게다가 저용량으로 당해 효과를 갖는 항 hTROP-2 항체, 특히 당해 항체로서 인간형화 항체인 것 등의 개발이 요망되고 있었다.
본 발명은 상기 상황을 고려하여 이루어진 것으로, 이하에 나타내는, 항 hTROP-2 항체 (항 hTROP-2 모노클로날 항체), 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체의 단편, 당해 항체 등과 약제의 복합체 (이뮤노콘쥬게이트), 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트 등을 제공하는 것이다.
(1) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
상기 (1) 의 항체는, 그 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 36 ∼ 38 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 41 ∼ 43 으로 나타내는 아미노산 배열이다.
(2) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
상기 (2) 의 항체는, 그 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 66 ∼ 68 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, 항체의 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 71 ∼ 73 으로 나타내는 아미노산 배열이다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 인간형화 항체인 것을 들 수 있다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것을 들 수 있다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 5 ∼ 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것을 들 수 있다. 여기서, 당해 종양 성장 저해 활성을 나타내기 위한 투여 횟수는, 예를 들어, 많아도 1 주일에 1 회이다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 10 ㎎/㎏ 체중의 단회 투여로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것을 들 수 있다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대하여 항종양 활성을 갖는 것을 들 수 있다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 해리 정수 (定數) (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 것을 들 수 있다.
상기 (1) 및 (2) 의 항체는, 예를 들어, 모노클로날 항체인 것을 들 수 있다.
여기서, 상기 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다.
또한, 상기 종양으로는, 예를 들어, 재발암 또는 전이암을 들 수 있다.
또한, 상기 종양 세포주로는, 예를 들어, 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 췌장암 세포주 KP-3L, 인간 췌장암 세포주 KP-2, 인간 췌장암 세포주 PK-1, 인간 췌장암 세포주 PK-45H, 인간 췌장암 세포주 PK-45P, 인간 췌장암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌장암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468, 인간 전립선암 세포주 DU145 및 인간 전립선암 세포주 PC-3, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 인간 난소암 세포주 SK-OV-3, 및 인간 담관암 세포주 TFK-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 들 수 있고, 그 중에서도, 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468 및 인간 난소암 세포주 SK-OV-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 바람직하게 들 수 있다.
(3) 상기 (1) 및 (2) 의 항체에서 유래하는 항체 단편.
상기 (3) 의 항체 단편은, 예를 들어, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것이나, 혹은, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및/또는, 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있다.
(4) 상기 (1) 및 (2) 의 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는, 항체-약제 복합체.
(5) 상기 (3) 의 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는, 항체 단편-약제 복합체.
상기 (4) 및 (5) 의 복합체에 있어서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 종양으로는, 예를 들어, 재발암 또는 전이암도 들 수 있다.
(6) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 및 상기 (4) 및 (5) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 의약 조성물.
상기 (6) 의 의약 조성물은, 예를 들어, 종양의 치료에 사용하는 것이나, 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것이나, 종양의 진단에 사용하는 것을 들 수 있다. 여기서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 종양으로는, 예를 들어, 재발암 또는 전이암도 들 수 있다.
(7) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 및 상기 (4) 및 (5) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 종양 치료제.
상기 (7) 의 종양 치료제는, 예를 들어, 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다. 여기서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다.
(8) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 및 상기 (4) 및 (5) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 종양 진단제.
상기 (8) 의 종양 진단제에 있어서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다.
(9) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 및 상기 (4) 및 (5) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시켜, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는, 종양의 검출 방법.
상기 (9) 의 종양의 검출 방법에 있어서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다.
(10) 상기 (1) 및 (2) 의 항체, 상기 (3) 의 항체 단편, 및 상기 (4) 및 (5) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
상기 (10) 의 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트에 있어서, 종양으로는, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있고, 그 중에서도 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 폐암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 바람직하게 들 수 있다.
(11) 상기 (1) 및 (2) 의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(12) 상기 (3) 의 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(13) 상기 (11) 또는 (12) 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
(14) 상기 (13) 의 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.
도 1 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 항원 친화성 (Kd : 해리 정수) 측정을 나타내는 도면이다. Abt : Antibody (total), Agf : Antigen (free)
도 2 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 배양 상청의, HuH-7 세포 (hTROP-2 음성) 와 HuH-7-hTROP-2 세포의 반응성을 나타내는 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 HuH-7 세포를 나타내고, 검은 색 라인의 히스토그램은 HuH-7-hTROP-2 세포를 나타낸다.
도 3 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 4 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (BxPC-3 세포) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 5 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 인간 췌장암 세포주와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 6 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (K5-70) 의, 인간 대장암 세포주 (Colo320, CACO2, SW480, DLD1, CW2, HCT 116), 인간 유방암 (JIMT-1, HCC1143) 및 인간 전립선암 세포주 (PC-3, DU145) 와의 반응성을 나타내는 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 7 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 마우스 TROP-2 와의 교차 반응성을 조사한 도면이다. 세포는, CHO-K1 세포에, 마우스 TROP-2 유전자를 일과성 발현시킨 세포를 이용하고, 양성 대조 항체로서 마우스 TROP-2 와 교차성을 나타내는 T2-102 항체 (마우스 IgG1) 를 사용하였다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 8 은 항 hTROP-2 모노클로날 항체의, 인간 EpCAM/TROP-1 과의 교차 반응성을 조사한 도면이다. 세포는, CHO-K1 세포에 인간 EpCAM/TROP-1 유전자를 일과성 발현시킨 세포를 이용하고, 양성 대조 항체로서 PE 표지 항인간 EpCAM 모노클로날 항체 (벡톤 딕킨손) 를 사용하였다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인의 히스토그램은 각 항 hTROP-2 모노클로날 항체와 반응시킨 것을 나타낸다.
도 9 는 항 hTROP-2 항체 (T6-16, T5-86, K5-70, K5-107) 의 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 의 세포 증식 저해 활성을 나타내는 도면이다. mIgG 는 컨트롤 항체 (마우스 IgG), YY01 : 시판되는 항 hTROP-2 항체 (Santa Cruz) 를 나타낸다. 백색 칼럼 : 0 ㎍/㎖, 회색 칼럼 : 0.1 ㎍/㎖, 검은색 칼럼 : 1 ㎍/㎖. 항체 첨가를 하지 않았을 (0 ㎍/㎖) 때의 값에 대한 ratio 로 나타냈다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 10 은 항 hTROP-2 항체 (T6-16, K5-70) 의 인간 췌장암 세포주 (PK-59 세포) 의 스크래치 어세이를 나타내는 도면이다.
A. PK-59 세포의 스크래치 영역의 사진의 대표예를 나타낸다. Day 0 : 스크래치 직후의 대표예를 나타낸다. mIgG (Day 1) : 스크래치 후, 컨트롤 항체 (마우스 IgG, 1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진이다. K5-70 (Day 1) : 스크래치 후, K5-70 항체 (1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진이다. T6-16 (Day 1) : 스크래치 후, T6-16 항체 (1 ㎍/㎖) 를 배지에 첨가하고, 1 일 후 (24 시간 후) 의 사진이다. 사진 중에 나타낸 화살표는 스크래치 영역의 폭을 나타냈다.
B. 화상 해석 소프트 (Scion Image) 로 스크래치 영역의 면적을 해석하고, 그 값을 기초로, 컨트롤 항체 (mIgG) 첨가군의 Day 0 을 기준치 1 로 하여, 각 피검 항체에 있어서의 값을 산출하였다.
* P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 11 은 인간 췌장암 세포주, PK-59 세포의 줄기세포 마커의 발현을 나타내는 FACS 의 도면이다. A : PK-59 세포에 있어서의 EpCAM 의 발현을 나타내는 FACS 의 도면이다. 검게 칠해진 히스토그램은 2 차 항체 (PE 표지 항마우스 IgG) 만, 검은 색 라인은 항인간 EpCAM 항체 (벡톤 딕킨손) 와 반응시킨 경우의 히스토그램을 나타낸다. B, C : PK-59 세포에 있어서의 P-glycoprotein/MCR1 (B), 및 ABCG2 (C) 의 발현을 나타내는 FACS 의 도면이다. 청색의 히스토그램은 2 차 항체만, 적색의 히스토그램이 항인간 P-glycoprotein/MDR1 항체 (BD 파민겐) (B), 항인간 ABCG2 항체 (BD 파민겐) (C) 와 반응시킨 경우를 나타낸다. D : PK-59 세포를 췌장암 줄기세포 마커인 FITC 표지 항인간 CD24 항체 (BD 파민겐) 와 PE 표지 항인간 CD44 항체 (BD 파민겐) 로 이중 염색한 FACS 의 도면이다. D 의 도면 중의 숫자는 각각의 획분의 세포의 존재 비율을 나타낸다.
도 12 는 PK-59 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서, 신규의 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 항종양 활성을 평가한 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 21 일째 (Day 21) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. 각 플롯 상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 13 은 PK-59 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, A. 클론 K5-107, B. 클론 T6-16, C. 클론 K5-116-2-1 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. ● 는 컨트롤군 (마우스 IgG), ○ 는 항 hTROP-2 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군을 나타낸다. 그래프 중의 화살표는 항체 투여 기간을 나타내고, 각 플롯 상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 14 는 PK-59 세포를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 (A), 클론 T6-16 (B) 및, 클론 K5-116-2-1 (C) 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. ● 는 컨트롤군 (마우스 IgG), ○ 는 항 hTROP-2 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군을 나타낸다. 그래프 중의 화살표는 항체 투여 기간을 나타내고, 각 플롯 상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 15 는 BxPC-3 세포를 사용한 xenograft prevention 및 treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 평가한 도면이다. A : prevention 모델에 있어서의 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test) B : treatment 모델에 있어서의 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 성장을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 16 은 PK-59 세포를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타낸 도면이다. 종양 체적은 평균치 ± 표준 편차로 나타냈다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 각 용량에서의 K5-70 항체 투여군 (□ : 1 ㎎/㎏ 체중, △ : 5 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 성장을 시간경과적으로 나타낸다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test), ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 17 일째 (Day 17) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. 각 플롯 상에 나타내는 수치는 평균치 ± 표준 편차. ** P < 0.01 (by Student's-t-test)
도 17 은 실험에 사용한 인간/마우스 키메라 TROP-2 단백질의 모식도이다. SP : 시그널 배열, TY domain : 사일로글로블린 타입 1 영역, TM : 막 관통 영역, C : 세포 내 영역 검은 색으로 나타내고 있는 영역은 hTROP-2 유래의 폴리펩타이드이다. 백색으로 나타내고 있는 영역은 마우스 TROP-2 유래의 폴리펩타이드이다. 키메라 단백질의 모식도의 상단에 나타내고 있는 숫자는 마우스 TROP-2 단백질의, 하단은 hTROP-2 단백질의 아미노산 번호를 각각 나타내고 있다.
도 18 은 인간/마우스 키메라 TROP-2 를 사용한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 결합 영역의 동정의 결과를 나타내는 도면이다. 인간/마우스 키메라 TROP2-C (hmTROP2-C) 및 마우스/인간 키메라 TROP2-D (mhTROP2-D) 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포를 이용하여, 도면 중에 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체와의 반응성을 검토하였다. 음성 컨트롤은 mouse IgG2b 를 사용하였다.
도 19 는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 항체 결합 영역의 동정의 결과를 나타내는 도면이다.
hTROP-2 유전자 및 각 인간/마우스 키메라 TROP-2 유전자를 HEK293 세포에 도입하고, 일과성으로 발현시킨 세포를 이용하여 FACS 해석을 실시하였다. (A) K5-70, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 항체에 대하여, hTROP-2 (상단), hmTROP-2-A (중단) 및 hmTROP-2-B (하단) 와의 반응성을 검토하였다. mouse IgG2b 는 음성 컨트롤로서 사용하였다. (B) T6-4 및 T6-16 항체에 대하여, hTROP-2 (상단), mhTROP-2-E (중단) 및 mhTROP-2-F (하단) 와의 반응성을 검토하였다. mouse IgG2b 는 음성 컨트롤로서 사용하였다.
도 20 은 인간 정상 조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현을 나타내는 도면이다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여 인간 정상 조직 어레이의 면역 염색을 실시하였다. (A) 피부, (B) 식도, (C) 신장 (피질), (D) 신장 (수질), (E) 췌장, (F) 전립선, (G) 방광, (H) 편도선, (I) 심장, (J) 간장 (배율 : × 200)
도 21 은 암 조직에서의 hTROP-2 의 발현을 나타내는 도면이다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여 인간 암 조직 어레이의 면역 염색을 실시하였다. (A) 유방암, (B) 폐암, (C) 식도암, (D) 위암, (E) 췌장암, (F) 대장암, (G) 방광암, (H) 전립선암, (I) 난소암 (배율 : × 100)
도 22 는 PK-59 세포를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 단회 투여에 의한 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
A. 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여를 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test), ** P < 0.01 (by Student's t-test).
B. A 의 시험에 있어서, 28 일째 (Day 28) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's-t-test).
C. 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의, 각 개체의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸다. 화살표는 항체 투여를 나타낸다.
도 23 은 인간 대장암 세포 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 44 일째 (Day 44) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 24 는 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-116-2-1 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-116-2-1 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 25 는 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 T6-16 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 26 은 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 투여군 (○ : 1 ㎎/㎏ 체중, △ : 5 ㎎/㎏ 체중, □ : 10 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 42 일째 (Day 42) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 27 은 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 1 주일에 1 회의 투여 간격에서의 K5-70 항체의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표 머리 (Day 10, 17, 24, 31, 38) 는 K5-70 항체의 투여를 나타낸다. * P < 0.05 by Student's t-test.
B : 10 일에 1 회 (q10d), 또는 2 주일에 1 회 (q14d) 의 투여 간격에서의 K5-70 항체의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤군 (● : 마우스 IgG, 10 ㎎/㎏) 과 K5-70 항체 투여군 (○ : q10d, 10 ㎎/㎏, △ : q14d, 10 ㎎/㎏) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 흑색의 화살표 머리 (▼ ; Day 9, 19, 29) 와 백색의 화살표 머리 (▽ ; Day 9, 23, 37) 는 K5-70 항체의 투여를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 by Student's t-test.
도 28 은 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 T6-16 항체 투여군 (○ : 1 ㎎/㎏ 체중, △ : 5 ㎎/㎏ 체중, □ : 10 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 43 일째 (Day 43) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 29 는 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 클론 T6-16 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤군 (● : 마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중), T6-16 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○ : q7d, △ : q10d) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표 머리 (Day 10, 17, 24, 31, 38), 및 화살표 (Day 10, 20, 30, 40) 는 T6-16 항체의 투여를 나타낸다. 컨트롤군은 3 일에 1 회 투여를 실시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01 by Student's t-test.
도 30 은 인간 전립선암 세포 DU-145 세포를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서의, 클론 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 40 일째 (Day 40) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 31 은 PK-59 세포의 간 전이 모델을 사용한 클론 K5-70 의 전이 억제 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : 마우스 IgG) 과 B : K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군의 세포 이식 6 주일 후의 적출 간장 이미지를 나타낸다. 화살표는 간 전이소를 나타낸다.
도 32 는 SW480 세포를 사용한 xenograft 모델에 있어서의 염산이리노테칸 투여 후의 암 재발 모델에 있어서의 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 무처치군 (◆) 과 염산이리노테칸 (40 ㎎/㎏ 체중) 투여 후 K5-70 항체 (○ : 10 ㎎/㎏ 체중), 혹은 마우스 IgG 투여군 (● : 10 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타낸 도면이다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표 머리 (Day 11, 14, 17) 는 염산이리노테칸의 투여를 나타낸다. K5-70 항체 혹은 마우스 IgG 는 Day 20 부터 3 일에 1 회 투여를 실시하였다. 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 by Student's t-test.
도 33 은 클론 K5-70 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 34) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 35) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; IYWIN , NIYPSDSYTNYNQKFKD, TSMADY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-70 VH 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 36 ∼ 38 에 나타낸다.
도 34 는 클론 K5-70 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 39) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 40) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RASQSIGTSIH, YASESIS , QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-70 VL 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 41 ∼ 43 에 나타낸다.
도 35 는 클론 K5-107 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 44) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 45) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; SYWMH , NIYPGGGYTNYDEKFKS, SSVFDY) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-107 VH 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 46 ∼ 48 에 나타낸다.
도 36 은 클론 K5-107 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 49) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 50) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RASQNIGTSIH, YASESIS , QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-107 VL 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 51 ∼ 53 에 나타낸다.
도 37 은 클론 K5-116-2-1 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 54) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 55) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; SYWIT , NIYPSDSYTNYNQKFRD, LFDY) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-116-2-1 VH 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 56 ∼ 58 에 나타낸다.
도 38 은 클론 K5-116-2-1 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 59) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 60) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RASQSIGTSIH, YASESIS , QQSNSWPFT) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-116-2-1 VL 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 61 ∼ 63 에 나타낸다.
도 39 는 클론 T6-16 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 64) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 65) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민산 (E) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; DYNMH , YIYPYNGGTGYNQRFKS, EDYGSSPSYAMDY) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 T6-16 VH 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 66 ∼ 68 에 나타낸다.
도 40 은 클론 T6-16 L 사슬 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 69) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 70) 을 나타내는 도면이다. 시그널 펩타이드는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RSSQSLVHGNGNTYLH, KVSNRFS , SQTTHVPT) 은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 T6-16 VL 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 71 ∼ 73 에 나타낸다.
도 41 은 클론 K5-70 의 H 사슬 가변 영역 (K5-70 VH) 의 아미노산 배열 (배열 번호 35), 인간형화 K5-70 의 H 사슬 가변 영역 (HuK5-70 VH) 의 아미노산 배열 (배열 번호 75), 및 인간형화 항체 제작에 사용한 억셉터 (Genbank accession No. DA980102 ; 배열 번호 84) 의 H 사슬 가변 영역 (DA980102 VH) 의 아미노산 배열 (배열 번호 85) 에 대한, 얼라인먼트를 나타내는 도면이다 (또한, 도면 중의 어느 아미노산 배열도 각각의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 배열의 일부 (구체적으로는, 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분의 아미노산 배열) 이다).
K5-70 VH 중에 언더라인으로 나타낸 아미노산 배열은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 의해 정의된 CDR 배열을 나타내고 있다. 또한, 아미노산 배열 상부에 기록된 번호는 상기 Kabat 등의 정의에 따른 아미노산의 위치 번호를 나타내고 있다. DA980102 VH 중의 각 CDR 배열은 도면 중에서는 --- 로 표기하고, 기재를 생략하였다. HuK5-70 VH 중의 언더라인으로 나타낸 아미노산은, CDR 의 구조 유지에 중요한 것으로 예상되기 때문에, K5-70 VH 의 배열을 유지하였다. 또한, HuK5-70 VH 중의 이중 밑줄로 나타낸 아미노산은 대응하는 DA980102 VH 의 아미노산 (메티오닌 (M)) 이 이 위치에서는 소량만 확인되는 것으로, 항원성을 저하시킬 목적으로 동일한 서브 그룹에 속하는 전형적인 아미노산인 류신 (L) 으로 치환하였다.
도 42 는 클론 K5-70 의 L 사슬 가변 영역 (K5-70 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 40), 인간형화 K5-70 의 L 사슬 가변 영역 (HuK5-70 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 77), 및 인간형화 항체 제작에 사용한 억셉터 (Genbank accession No. L41174 ; 배열 번호 86) 의 L 사슬 가변 영역 (L41174 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 87 ; Genbank accession No. AAA64877) 에 대한, 얼라인먼트를 나타내는 도면이다 (또한, 도면 중의 어느 아미노산 배열도 각각의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 배열의 일부 (구체적으로는, 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분의 아미노산 배열) 이다).
K5-70 VL 중에 언더라인으로 나타낸 아미노산 배열은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 의해 정의된 CDR 배열을 나타내고 있다. 또한, 아미노산 배열 상부에 기록된 번호는 상기 Kabat 등의 정의에 따른 아미노산의 위치 번호를 나타내고 있다. L41174 VL 중의 각 CDR 배열은 도면 중에서는 --- 로 표기하고, 기재를 생략하였다. HuK5-70 VL 중의 언더라인으로 나타낸 아미노산은, CDR 의 구조 유지에 중요한 것으로 예상되기 때문에, K5-70 VL 의 배열을 유지하였다.
도 43 은 클론 T6-16 의 H 사슬 가변 영역 (T6-16 VH) 의 아미노산 배열 (배열 번호 65), 2 종류의 인간형화 T6-16 의 H 사슬 가변 영역 (HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2) 의 아미노산 배열 (각각 순서대로, 배열 번호 79, 배열 번호 81), 및 인간형화 항체 제작에 사용한 억셉터 (Genbank accession No. DA935238 ; 배열 번호 88) 의 H 사슬 가변 영역 (DA935238 VH) 의 아미노산 배열 (배열 번호 89) 에 대한, 얼라인먼트를 나타내는 도면이다 (또한, 도면 중의 어느 아미노산 배열도 각각의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 배열의 일부 (구체적으로는, 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분의 아미노산 배열) 이다).
HuT6-16 VH 중에 언더라인으로 나타낸 아미노산 배열은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 의해 정의된 CDR 배열을 나타내고 있다. 또한, 아미노산 배열 상부에 기록된 번호는 상기 Kabat 등의 정의에 따른 아미노산의 위치 번호를 나타내고 있다. DA935238 VH 중의 각 CDR 배열은 도면 중에서는 --- 로 표기하고, 기재를 생략하였다. HuT6-16 VH1 및 HuT6-16 VH2 중의 언더라인으로 나타낸 아미노산은, CDR 의 구조 유지에 중요한 것으로 예상되기 때문에, T6-16 VH 의 배열을 유지하였다. 또한, HuT6-16 VH1 중의 73 번째의 위치에 있는 리신 (K) 은 HuT6-16 VH2 에서는 억셉터 배열인 DA935238 VH 에서 유래하는 트레오닌 (T) 으로 치환하였다.
도 44 는 클론 T6-16 의 L 사슬 가변 영역 (T6-16 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 70), 인간형화 T6-16 의 L 사슬 가변 영역 (HuT6-16 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 83), 및 인간형화 항체 제작에 사용한 억셉터 (Genbank accession No. M99608 ; 배열 번호 90) 의 L 사슬 가변 영역 (M99608 VL) 의 아미노산 배열 (배열 번호 91 ; Genbank accession No. AAA60341) 에 대한, 얼라인먼트를 나타내는 도면이다 (또한, 도면 중의 어느 아미노산 배열도 각각의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 배열의 일부 (구체적으로는, 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분의 아미노산 배열) 이다).
T6-16 VL 중에 언더라인으로 나타낸 아미노산 배열은 Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 의해 정의된 CDR 배열을 나타내고 있다. 또한, 아미노산 배열 상부에 기록된 번호는 상기 Kabat 등의 정의에 따른 아미노산의 위치 번호를 나타내고 있다. M99608 VL 중의 각 CDR 배열은 도면 중에서는 --- 로 표기하고, 기재를 생략하였다.
도 45 는 HuK5-70 VH 의 유전자 배열 (배열 번호 74) 및 아미노산 배열 (배열 번호 75) 을 나타내는 도면이다.
각 행의 상단은 유전자 배열 (cDNA 배열), 하단은 아미노산 배열을 나타낸다. 당해 아미노산 배열 중, 시그널 펩타이드 부분에는 파선의 밑줄을, 각 CDR 배열 (CDR 1 ∼ 3) 에는 실선의 밑줄을 그었다 (당해 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분만의 아미노산 배열은 배열 번호 92 에 나타낸다). 또한, HuK5-70 VH 유전자의 5' 말단에는 EcoRI 부위 (GAA TTC) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에는 Nhe I 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다.
도 46 은 HuK5-70 VL 의 유전자 배열 (배열 번호 76) 및 아미노산 배열 (배열 번호 77) 을 나타내는 도면이다.
각 행의 상단은 유전자 배열 (cDNA 배열), 하단은 아미노산 배열을 나타낸다. 당해 아미노산 배열 중, 시그널 펩타이드 부분에는 파선의 밑줄을, 각 CDR 배열 (CDR 1 ∼ 3) 에는 실선의 밑줄을 그었다 (당해 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분만의 아미노산 배열은 배열 번호 93 에 나타낸다). 또한, HuK5-70 VL 유전자의 5' 말단에는 Age I 부위 (ACC GGT) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에는 BsiWI 부위 (CGT ACG) 를 부가하였다.
도 47 은 HuT6-16 VH1 의 유전자 배열 (배열 번호 78) 및 아미노산 배열 (배열 번호 79) 을 나타내는 도면이다.
각 행의 상단은 유전자 배열 (cDNA 배열), 하단은 아미노산 배열을 나타낸다. 당해 아미노산 배열 중, 시그널 펩타이드 부분에는 파선의 밑줄을, 각 CDR 배열 (CDR 1 ∼ 3) 에는 실선의 밑줄을 그었다 (당해 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분만의 아미노산 배열은 배열 번호 94 에 나타낸다). 또한, HuT6-16 VH1 유전자의 5' 말단에는 EcoRI 부위 (GAA TTC) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에는 Nhe I 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다.
도 48 은 HuT6-16 VH2 의 유전자 배열 (배열 번호 80) 및 아미노산 배열 (배열 번호 81) 을 나타내는 도면이다.
각 행의 상단은 유전자 배열 (cDNA 배열), 하단은 아미노산 배열을 나타낸다. 당해 아미노산 배열 중, 시그널 펩타이드 부분에는 파선의 밑줄을, 각 CDR 배열 (CDR 1 ∼ 3) 에는 실선의 밑줄을 그었다 (당해 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분만의 아미노산 배열은 배열 번호 95 에 나타낸다). 또한, HuT6-16 VH2 유전자의 5' 말단에는 EcoRI 부위 (GAA TTC) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에는 Nhe I 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다.
도 49 는 HuT6-16 VL 의 유전자 배열 (배열 번호 82) 및 아미노산 배열 (배열 번호 83) 을 나타내는 도면이다.
각 행의 상단은 유전자 배열 (cDNA 배열), 하단은 아미노산 배열을 나타낸다. 당해 아미노산 배열 중, 시그널 펩타이드 부분에는 파선의 밑줄을, 각 CDR 배열 (CDR 1 ∼ 3) 에는 실선의 밑줄을 그었다 (당해 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 단백질 부분만의 아미노산 배열은 배열 번호 96 에 나타낸다). 또한, HuT6-16 VL 유전자의 5' 말단에는 Age I 부위 (ACC GGT) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에는 BsiWI 부위 (CGT ACG) 를 부가하였다.
도 50 은 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
(A) 293F 세포에 발현 벡터 pFUSE-CHIg-HuK5-70 및 pFUSE2-CLIg-HuK5-70 을 도입하고, 배양 상청 중의 HuK5-70 항체의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검토하였다. 레인 1 은 유전자 도입을 실시하지 않은 293F 세포의 배양 상청 (네거티브 컨트롤), 레인 2 는 상기 발현 벡터를 도입한 293F 세포의 배양 상청. HuK5-70 항체의 중사슬 및 경사슬 단백질은 비오틴 표지한 항인간 IgG F(ab')2 항체로 검출하였다.
(B) 293F 세포에 발현 벡터 pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (레인 3), pFUSE-CHIg-HuT6-16-2 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (레인 4) 의 조합으로 각각 도입하고, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검토하였다. HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 중사슬 단백질은 비오틴 표지한 항인간 IgG Fc 항체로, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 경사슬 단백질은 비오틴 표지한 항인간 IgG F(ab')2 항체로 각각 검출하였다.
도 51 은 정제한 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 쿠마시 염색의 결과를 나타내는 도면이다.
정제한 HuK5-70 항체 (레인 1), HuT6-16-1 항체 (레인 2) 및 HuT6-16-2 항체 (레인 3) 각각 1 ㎍ 을 SDS-PAGE 에 의해 전개하고, 쿠마시 염색을 실시하였다.
도 52 는 플로우 사이토미터를 사용한 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 항원 결합능의 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도면에 나타낸 각 항체를 이용하여 HEK293-hTROP-2 세포 (A) 및 PK-59 세포 (B) 에 대한 반응성을 FACS 해석에 의해 검토하였다. 네거티브 컨트롤은 2 차 항체만으로 하고 (검은 색칠), 각 항체의 반응성을 그레이 라인으로 나타냈다.
도 53 은 ELISA 법을 사용한 HuK5-70 항체의 항원 결합능의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
항원 고상화 ELISA 법에 의해 K5-70 항체 및 HuK5-70 항체의 항원 결합능에 대하여 검토하였다. ▲ 는 K5-70 항체, ● 는 HuK5-70 항체의 측정 결과를 나타낸다.
도 54 는 ELISA 법을 사용한 HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 항원 결합능의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
항원 고상화 ELISA 법에 의해 T6-16 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 항원 결합능에 대하여 검토하였다. ▲ 는 T6-16 항체, ● 는 HuT6-16-1 항체, ■ 는 HuT6-16-2 항체의 측정 결과를 나타낸다.
도 55 는 인간 대장암 세포 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70 항체) 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS) 과 HuK5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 39 일째 (Day 39) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 56 은 인간 대장암 세포 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70) 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS) 과 HuK5-70 항체 투여군 (○ ; 1 ㎎/㎏ 체중, △ ; 5 ㎎/㎏ 체중, □ ; 10 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 48 일째 (Day 48) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 57 은 인간 대장암 세포 SW480 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuT6-16-2) 의 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS) 과 HuT6-16-2 항체 투여군 (○ ; 1 ㎎/㎏ 체중, △ ; 5 ㎎/㎏ 체중, □ ; 10 ㎎/㎏ 체중) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 48 일째 (Day 48) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 58 은 인간 난소암 세포 SK-OV-3 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 마우스 항 hTROP-2 항체 (K5-70 및 T6-16) 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS), K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○), 및 T6-16 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (△) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 56 일째 (Day 56) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05 (by Student's t-test)
도 59 는 인간 유방암 세포 MDA-MB-468 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 마우스 항 hTROP-2 항체 (K5-70 및 T6-16) 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS), K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○), 및 T6-16 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (△) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 54 일째 (Day 54) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 60 은 인간 폐암 세포 Calu-3 세포를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서의, 마우스 항 hTROP-2 항체 (K5-70 및 T6-16) 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS), K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○), 및 T6-16 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (△) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 41 일째 (Day 41) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 61 은 인간 담관암 세포 TFK-1 세포를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서의, 마우스 항 hTROP-2 항체 K5-70 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● : PBS), 및 K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (○) 의 종양 형성을 시간경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 화살표는 항체 투여 기간을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
B : A 의 시험에 있어서, 암 세포 이식으로부터 31 일째 (Day 31) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 62 는 HuK5-70 및 HuT6-16-2 항체의 결합 활성을, 저농도 항원 고상화 ELISA 를 이용하여 검토한 결과이다. 96 구멍 플레이트를 0.1 ㎍/㎖ 의 리콤비넌트 hTACSTD2-Fc-His 단백질로 코팅하고, 20 ㎍/㎖ 부터 2 배씩의 희석 계열을 조제한 피검 항체 (K5-70, HuK5-70, T6-16 및 HuT6-16-2 항체) 를 반응시켰다. (A) 는 K5-70 (▲) 및 HuK5-70 (●) 항체를, (B) 는 T6-16 (▲) 및 HuT6-16-2 항체 (●) 를 각각 피험 항체로서 사용하였다.
도 63 은 hTROP-2 의 K5-70 및 HuK5-70 항체에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. 96 구멍 플레이트에 anti-mouse IgG (γ chain specific) 및 anti-human IgG1 (Fcγ specific) 을 개재하여 K5-70 및 HuK5-70 항체를 고상화하고, 5 ㎍/㎖ 부터 2 배 희석 계열을 조제한 hTROP-2-EC-His 단백질을 반응시켰다. hTROP-2-EC-His 단백질의 결합은 항 His 태그 항체를 이용하여 검출하였다. (▲) K5-70 항체, (●) HuK5-70 항체
도 64 는 유전자 합성에 의해 제작한 K5-70 VH 유전자의 염기 배열 (상단 ; 배열 번호 99) 과 K5-70 VH 의 아미노산 배열 (하단 ; 배열 번호 35) 을 나타내는 도면이다. 당해 염기 배열에 있어서는, 5' 말단에 EcoRI 부위 (GAA TTC) 및 Kozak 배열 (ACC ACC) 을 부가하고, 3' 말단에 NheI 부위 (GCT AGC) 를 부가하고 있다. 당해 아미노산 배열은 1 문자 표기로 나타내고 있으며, N 말단측의 시그널 펩타이드는 이탤릭체로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; IYWIN , NIYPSDSYTNYNQKFKD, TSMADY) 은 Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-70 VH 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 36 ∼ 38 에 나타낸다.
도 65 는 유전자 합성에 의해 제작한 K5-70 VL 유전자의 염기 배열 (상단 ; 배열 번호 100) 과 K5-70 VL 의 아미노산 배열 (하단 ; 배열 번호 40) 을 나타내는 도면이다. 당해 염기 배열에 있어서는, 5' 말단에 AgeI 부위 (ACC GGT) 및 Kozak 배열 (ACC ACC) 을 부가하고, 3' 말단에 BsiWI 부위 (CGT ACG) 를 부가하고 있다. 당해 아미노산 배열은 1 문자 표기로 나타내고 있으며, N 말단의 시그널 펩타이드는 이탤릭체로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 성숙 펩타이드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 ; RASQSIGTSIH , YASESIS , QQSNSWPFT) 은, Kabat 등 (상기 게재 ; U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따라 결정하였다. 클론 K5-70 VL 의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 41 ∼ 43 에 나타낸다.
도 66 은 ChK5-70, HuK5-70, HuVH/MuVL (HuK5-70 항체의 VL 을 K5-70 항체의 VL 로 치환한 것) 및 MuVH/HuVL (HuK5-70 항체의 VH 를 K5-70 항체의 VH 로 치환한 것) 항체의 hTROP-2 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다. 96 구멍 플레이트를 0.1 ㎍/㎖ 의 리콤비넌트 hTACSTD2-Fc-His 단백질로 코팅하고, 피검 항체 (ChK5-70, HuK5-70, HuVH/MuVL 및 MuVH/HuVL 항체) 를 일과성 발현시킨 세포의 배양 상청을 1, 0.1, 0.01, 0.001 ㎍/㎖ 의 항체 농도가 되도록 희석하여 반응시켰다. (▲) ChK5-70 항체, (△) MuVH/HuVL 항체, (○) HuVH/MuVL 항체, (●) HuK5-70 항체
도 67 은 HuK5-70 VH 및 그 아미노산 치환 변이체의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 아미노산은 1 문자 표기로 나타냈다. 각 아미노산 치환 변이체에서는, HuK5-70 VH 의 아미노산과 동일한 아미노산에 대해서는 "-" 로 나타내고, 치환한 아미노산에 대해서만 1 문자 표기로 나타냈다. 배열 상부의 숫자는 아미노산 번호를 나타낸다 (Kabat 등 1991).
도 68 은 ChK5-70, HuK5-70, HuK5-70 VH A40R (HuK5-70 항체의 VH 의 40 번째의 알라닌을 아르기닌으로 치환한 변이체) 및 HuK5-70 VH R44G 항체 (HuK5-70 항체의 VH 의 44 번째의 아르기닌을 글리신으로 치환한 변이체) 의 hTROP-2 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다. 96 구멍 플레이트를 0.1 ㎍/㎖ 의 리콤비넌트 hTACSTD2-Fc-His 단백질로 코팅하고, 피검 항체 (ChK5-70, HuK5-70, HuK5-70 VH A40R 및 HuK5-70 VH R44G 항체) 를 일과성 발현시킨 세포의 배양 상청을 0.5 ㎍/㎖ 부터 2 배 희석 계열 (6 점) 을 제작하여 반응시켰다. (▲) ChK5-70 항체, (△) HuK5-70 VH R44G 항체, (○) HuK5-70 VH A40R 항체, (●) HuK5-70 항체
도 69 는 유전자 합성에 의해 제작한 HuK5-70 VH R44G 유전자의 염기 배열 (상단) 과 아미노산 배열 (하단) 을 나타낸다. 5' 말단에 EcoRI 부위 (GAA TTC) 및 Kozak 배열 (ACC ACC), 3' 말단에 NheI 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다. 아미노산 배열은 1 문자 표기로 나타냈다. N 말단의 시그널 펩타이드는 이탤릭체로 나타내고, 성숙 VH 의 N 말단측의 아미노산 (Q : 글루타민) 을 이중 밑줄로 나타내고, CDR 배열 (Kabat 등, 1991) 을 밑줄로 나타냈다.
도 70 은 정제 HuK5-70-2 항체의 SDS-PAGE 의 도면이다. HuK5-70-2 항체 1 ㎍ 을 환원 조건하에서 11 ％ SDS-PAGE 겔로 전개하였다. 레인 1 : 분자량 마커 (프레시젼 Plus 듀얼 스탠다드 (BIO-RAD)), 레인 2 : HuK5-70-2 항체. 도면의 좌측의 수치는 분자량을 나타낸다.
도 71 은 K5-70, HuK5-70 및 HuK5-70-2 항체의 hTROP-2 에 대한 결합 활성을 나타낸 도면이다. 96 구멍 플레이트를 0.1 ㎍/㎖ 의 리콤비넌트 hTACSTD2-Fc-His 단백질로 코팅하고, 정제한 피검 항체 (K5-70, HuK5-70 및 HuK5-70-2 항체) 를 1 ㎍/㎖ 부터 2 배 희석 계열 (10 점) 을 제작하여 반응시켰다. (■) K5-70 항체, (△) HuK5-70-2 항체, (●) HuK5-70 항체
도 72a 는 인간형화 항 hTROP-2 항체 (백색 칼럼 : HuK5-70, 검은색 칼럼 : HuT6-16-2) 를 사용한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다. 상세하게는, 인간 대장암 세포주 SW480 에, HuK5-70 항체 및 HuT6-16-2 항체 (모두 0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ㎍/㎖) 와 정상인 말초혈 단핵구를 첨가하고, 6 시간 배양하여, 배양 상청 중에 방출되는 LDH 의 활성을 측정함으로써 ADCC 활성을 측정한 결과를 나타낸다 (평균치 ± 표준 오차 (N = 3), : 이펙터/타겟 (E/T) = 40). 항체 농도 0 은 항체 비첨가를 나타낸다. * P < 0.05, ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 72b 는 인간형화 항 hTROP-2 항체 (백색 칼럼 : HuK5-70, 회색 칼럼 : HuK5-70-2, 검은색 칼럼 : HuT6-16-2) 를 사용한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다. 상세하게는, 인간 췌장암 세포주 (PK-59) 에, HuK5-70 항체, HuK5-70-2 항체 및 HuT6-16-2 항체 (모두 0, 0.3, 1, 3, 10, 30 ㎍/㎖) 와 정상인 말초혈 단핵구를 첨가하고, 6 시간 배양하여, 배양 상청 중에 방출되는 LDH 의 활성을 측정함으로써 ADCC 활성을 측정한 결과를 나타낸다 (평균치 ± 표준 오차 (N = 3), : 이펙터/타겟 (E/T) = 40). 항체 농도 0 은 항체 비첨가인 것을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test)
도 72c 는 인간형화 항 hTROP-2 항체 (백색 칼럼 : HuK5-70, 회색 칼럼 : HuK5-70-2, 검은색 칼럼 : HuT6-16-2) 를 사용한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다. 상세하게는, 인간 전립선암 세포주 (PC-3) 에, HuK5-70 항체, HuK5-70-2 항체 및 HuT6-16-2 항체 (모두 0, 0.3, 1, 3, 10, 30 ㎍/㎖) 와 정상인 말초혈 단핵구를 첨가하고, 6 시간 배양하여, 배양 상청 중에 방출되는 LDH 의 활성을 측정함으로써 ADCC 활성을 측정한 결과를 나타낸다 (평균치 ± 표준 오차 (N = 3), : 이펙터/타겟 (E/T) = 40). 항체 농도 0 은 항체 비첨가인 것을 나타낸다. ** P < 0.01 (by Student's t-test).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되는 것은 아니며, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
또한, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 미국 가출원 61/562,672호 명세서 (2011년 11월 22 일 출원) 의 전체를 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은 참조로서 본 명세서에 받아들여진다.
1. 본 발명의 개요
인간 TROP-2 (hTROP-2) 는, 전술한 바와 같이, 전체 길이 323 아미노산 잔기로 이루어지는 1 회 막 관통형의 1 형 막단백질이다. 그리고, hTROP-2 유전자 및 그 유전자 산물은 다양한 암 세포에 있어서 발현하고 있는 것이 알려져 있다.
전술한 바와 같이, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체 (항 hTROP-2 모노클로날 항체) 등의 개발이 요망되고 있던 상황하, 본 발명자는, 극히 다수의 클론으로부터 스크리닝을 실시함으로써, in vivo 에서 높은 항종양 활성을 갖는 클론을 취득하는 것에 성공하였다. 구체적으로는, 본 발명은 in vivo 에 있어서 hTROP-2 의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체, 특히 피코몰 오더 (pM) 의 높은 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항체는, 누드 항체의 단독 투여로, 기존의 항 hTROP-2 항체와 비교하여, 보다 적은 용량 (예를 들어 1/20 투여량) 으로 현저한 종양 성장 저해 활성을 갖고, 또한 복수의 인간 암 세포를 사용한 담암 마우스 치료 모델에 있어서 현저한 종양 성장 저해 활성을 나타내는, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (특히 인간형화 항체) 인 점에서, 매우 유용한 것이다.
2. 항 hTROP-2 항체의 제작
(1) 항원의 조제
hTROP-2 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 의 정보는 예를 들어 NCBI (GenBank) 의 웹사이트 (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 「Accession number : NP 002344」 로서 공표되어 있다. 또한, hTROP-2 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열 (배열 번호 1) 의 정보는 동 웹사이트에 「Accession number : NM 002353」 으로서 공표되어 있다.
항원으로는, hTROP-2 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 (간단히 펩타이드라고도 한다) 를 사용할 수 있고, 바람직하게는, hTROP-2 의 세포 외 영역의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 펩타이드를 사용할 수 있다. hTROP-2 의 세포 외 영역 (시그널 펩타이드를 포함한다) 은 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ∼ 제 274 번째의 아미노산을 포함하는 영역 (시그널 펩타이드 : 제 1 번째 ∼ 제 26 번째의 아미노산) 을 말한다. 여기서, 항원에 사용하는 펩타이드에 대하여, 상기 「아미노산 배열의 적어도 일부」 란, 길이가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ∼ 제 145 번째의 아미노산을 포함하는 영역이나, 당해 아미노산 배열 중 제 146 번째 ∼ 제 274 번째의 아미노산을 포함하는 영역 등이 바람직하다.
항원으로 하는 펩타이드의 제작 방법은 화학 합성이어도 되고, 대장균 등을 사용하는 유전자 공학적 수법에 의한 합성이어도 되며, 당업자에게 주지의 방법을 사용할 수 있다.
펩타이드의 화학 합성을 실시하는 경우에는, 펩타이드의 합성의 주지 방법에 의해 합성할 수 있다. 또한, 그 합성은 고상 합성법 및 액상 합성법의 어느 것도 적용할 수 있다. 시판되는 펩타이드 합성 장치 (예를 들어, 시마즈 제작소 제조 : PSSM-8 등) 를 사용해도 된다.
펩타이드를 유전자 공학적으로 합성하는 경우에는, 먼저, 당해 펩타이드를 코드하는 DNA 를 설계하여 합성한다. 당해 설계 및 합성은, 예를 들어, 전체 길이 hTROP-2 유전자를 포함하는 벡터 등을 주형으로 하고, 원하는 DNA 영역을 합성할 수 있도록 설계한 프라이머를 이용하여, PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 상기 DNA 를 적당한 벡터에 연결함으로써 단백질 발현용 재조합 벡터를 얻고, 이 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현할 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다 (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 또한, 동물 바이러스, 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 재조합 벡터의 제작은 정제된 DNA 를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA 의 제한 효소 부위 등에 삽입하여 벡터에 연결하면 된다. 형질 전환에 사용하는 숙주로는, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 세균 (대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포 또는 곤충을 들 수 있다. 염소 등의 포유 동물을 숙주로서 사용하는 것도 가능하다. 숙주에 대한 재조합 벡터의 도입 방법은 공지이다.
그리고, 상기 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 항원으로서 사용되는 펩타이드를 채취한다. 「배양물」 이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 혹은 배양균체 또는 그 파쇄물 모두를 의미하는 것이다.
배양 후, 목적 펩타이드가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 펩타이드를 추출한다. 또한, 목적 펩타이드가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 펩타이드의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 목적으로 하는 펩타이드를 단리 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 무세포 합성계를 사용한 in vitro 번역에 의해 항원이 되는 펩타이드를 얻을 수도 있다. 이 경우에는, RNA 를 주형으로 하는 방법과 DNA 를 주형으로 하는 방법 (전사/번역) 의 2 가지 방법을 사용할 수 있다. 무세포 합성계로는, 시판되는 시스템, 예를 들어 ExpresswayTM 시스템 (인비트로젠사), PURESYSTEM (등록상표 ; 포스트 게놈 연구소), TNT 시스템 (등록상표 ; 프로메가사) 등을 사용할 수 있다.
상기와 같이 얻어진 펩타이드는 적당한 캐리어 단백질, 예를 들어 우혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 타이로글로블린, 닭 감마글로불린 등에 결합하는 것도 가능하다.
또한 항원은 hTROP-2 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 또는 전술한 그 부분 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결손, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩타이드이어도 된다. 예를 들어, hTROP-2 의 아미노산 배열 또는 그 부분 배열 중 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결손되어 있고, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있고, 혹은, 1 또는 복수 개 (바람직하게는 1 개 또는 몇 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩타이드를 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, hTROP-2 단백질 혹은 그 부분 단편 또는 이들의 변이형의 단백질 또는 단편을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로는, 예를 들어, 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열 또는 그 부분 배열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
또한, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로는, 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열에 상보적인 배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 hTROP-2 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열, 또는 그 부분 배열을 사용하는 것도 가능하다.
「스트린젠트한 조건」 이란, 하이브리다이즈시킨 후의 세정시의 조건으로서, 버퍼의 염 (나트륨) 농도가 10 ∼ 500 mM 이고, 온도가 42 ℃ ∼ 72 ℃, 바람직하게는, 상기 염 농도가 50 ∼ 300 mM 이고, 온도가 55 ∼ 68 ℃ 에서의 조건을 말한다.
유전자에 변이를 도입하는 데에는, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 : 다카라 바이오사 제조) 을 이용하여 실시할 수 있다.
(2) 폴리클로날 항체의 제작
조제한 항원을, 면역을 위하여 포유 동물에 투여한다. 포유 동물은 특별히 한정은 되지 않고, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등을 들 수 있고, 그 중에서도 마우스가 바람직하다.
항원의 동물 1 마리당의 투여량은 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는, 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA), 프로인트 불완전 아쥬반트 (FIA), 수산화알루미늄 아쥬반트 등을 들 수 있다. 면역은 주로 정맥 내, 족척, 피하, 복강 내 등에 주입함으로써 실시할 수 있다. 또한, 면역의 간격에 대해서는, 특별히 한정되지 않고, 며칠부터 수 주일 간격, 바람직하게는 1 주일 간격으로, 1 ∼ 10 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종의 면역일로부터 3 ∼ 7 일 후에, 효소 면역 측정법 (ELISA 또는 EIA) 이나 방사성 면역 측정법 (RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 원하는 항체가를 나타낸 날에 채혈하여, 항혈청을 얻을 수 있다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요한 경우에는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써, 정제할 수 있다. 그 후에는, 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등으로 측정한다.
(3) 모노클로날 항체의 제작
(3-1) 항체 산생 세포의 채취
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 한정은 되지 않지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
조제한 항원을, 면역을 위하여 포유 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등에 투여한다. 항원의 동물 1 마리당의 투여량은 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로는 상기와 동일하다. 면역 수법도 상기와 동일하다. 그리고, 최종의 면역일로부터 1 ∼ 60 일 후, 바람직하게는 1 ∼ 14 일 후에, 항체 산생 세포를 채취한다. 항체 산생 세포로는, 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 림프절 세포 및 비장 세포가 바람직하다.
(3-2) 세포 융합
하이브리도마 (항체 산생 세포주) 를 얻기 위하여, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는, 약제 선택성을 갖고, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함한다) 에서 생존할 수 없고, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다.
미엘로마 세포로는, 예를 들어, P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8(X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) 및 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 등의 마우스 미엘로마 세포주를 들 수 있다. 미엘로마 세포의 선택은 항체 산생 세포와의 적합성을 적절히 고려하여 실시할 수 있다.
이어서, 미엘로마 세포와 항체 산생 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM 및 RPMI-1640 배지 등의 동물 세포용 배지 중에서, 1 × 106 ∼ 1 × 107 개/㎖ 의 항체 산생 세포와 2 × 105 ∼ 2 × 106 개/㎖ 의 미엘로마 세포를 혼합한다. 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 (항체 산생 세포 : 미엘로마 세포) 는 한정은 되지 않지만, 통상적으로, 1 : 1 ∼ 10 : 1 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 : 1 이다. 다음으로, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서 예를 들어, 평균 분자량 1,000 ∼ 6,000 달톤 (D) 의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또한, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 이용하여, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.
(3-3) 하이브리도마의 선별 및 클로닝
세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에 적당하게 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 뿌리고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당하게 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지로 배양 개시 후, 14 일 전후부터 생육되는 세포를 하이브리마로서 얻을 수 있다.
다음으로, 증식한 하이브리도마의 배양 상청 중에, hTROP-2 에 반응하는 항체가 존재하는지 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들어, 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하고, ELISA, EIA 및 RIA 등에 의해 스크리닝할 수 있다.
융합 세포의 클로닝은 한계 희석법 등에 의해 실시할 수 있다. hTROP-2 에 강한 반응성을 나타내는 항체를 플로우 사이토메트리 등에 의해 판정하고, 이것을 산생하는 하이브리도마를 선택하여, 클론으로서 수립한다.
(3-4) 모노클로날 항체의 채취
수립한 하이브리도마를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법, 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 「배양」 이란, 하이브리도마를 배양 접시 또는 배양 보틀 중에서 생육시키는 것, 혹은 하이브리도마를 하기와 같이 동물의 복강 내에서 증식시키는 것을 의미한다.
세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO2 농도) 으로 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득할 수 있다.
복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1 × 107 개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 2 ∼ 3 주일 후에 복수를 채취하는 것이 바람직하다.
상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요한 경우에는, 유안(硫安) 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.
(3-5) 항종양 활성을 갖는 클론의 선별
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체이다.
여기서, 「항종양 활성」 이란, 종양 세포 (암 세포) 를 사멸시키는 활성 또는 종양 성장을 저해하는 활성을 의미한다. 항종양 활성으로는, 예를 들어, 암 세포의 증식 저해 활성이나 종양 혈관 신생 저해 활성을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항체가 항종양 활성을 발휘할 수 있는 인간 종양 (종양 세포) 의 종류로는, hTROP-2 의 발현이 확인되어 있는 공지된 각종 인간 종양을 들 수 있고, 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암 등의 각종 인간 종양 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있고, 보다 바람직하게는 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암 및 인간 폐암 중 1 종 또는 2 종 이상이고, 더욱 바람직하게는 인간 췌장암 및/또는 인간 대장암이다. 또한, 상기 종양의 종류로는, 재발암이나 전이암이어도 되고, 본 발명의 항체는 이들 종양에 대해서도 우수한 항종양 활성을 발휘할 수 있다.
in vivo 에서의 항종양 활성의 확인은, 예를 들어, 원하는 종양 세포를 마우스의 피하에 이식한 담암 마우스 (담암 동물 치료 모델) 를 이용하여, 이 마우스에 상기와 같이 얻어진 항체를 투여함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 투여는 종양 세포의 이식 직후부터 실시해도 되고 (prevention 모델), 이식으로 종양이 소정의 체적이 된 것을 확인한 후 실시해도 된다 (treatment 모델). 투여 방법은 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 3 일, 1 주일, 10 일 또는 2 주일에 1 회 혹은 단회 (1 회만) 로, 5 ∼ 20 ㎎/㎏ 체중, 복강 내 투여 등으로 할 수 있다. prevention 모델의 경우에는, 종양 형성 빈도와 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다. treatment 모델의 경우에는, 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체로는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 36 ∼ 38 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 41 ∼ 43 으로 나타내는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 40 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 46 ∼ 48 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 51 ∼ 53 으로 나타내는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 45 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
동일하게, 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 56 ∼ 58 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 61 ∼ 63 으로 나타내는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 55 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 60 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
동일하게, 본 발명의 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 66 ∼ 68 로 나타내는 아미노산 배열이고, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 71 ∼ 73 으로 나타내는 아미노산 배열인 것을 바람직하게 들 수 있다. 당해 H 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 65 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하고, 당해 L 사슬 V 영역으로는, 예를 들어, 배열 번호 70 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hTROP-2 항체로는, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 수령 번호가 FERM BP-11251 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 : K5-70), 수령 번호가 FERM BP-11252 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 : K5-107), 수령 번호가 FERM BP-11253 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 : K5-116-2-1), 수령 번호가 FERM BP-11346 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 : T6-16) 및 수령 번호가 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론명 : T5-86) 등을 바람직하게 들 수 있다.
여기서, 수령 번호가 FERM BP-11251 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-70」 이라고 칭하며 2010년 5월 12일자이고, 수령 번호가 FERM BP-11252 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-107」 이라고 칭하며 2010년 5월 12일자이고, 수령 번호가 FERM BP-11253 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma K5-116-2-1」 이라고 칭하며 2010년 5월 12일자이고, 수령 번호가 FERM BP-11346 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma T6-16」 이라고 칭하며 2011년 3월 1일자이고, 수령 번호가 FERM BP-11254 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse Hybridoma T5-86」 이라고 칭하며 2010년 5월 12일자이고, 모두 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 ((우) 305-8566 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6) 에 기탁된 것이다.
또한, 본 발명의 항 hTROP-2 항체로는, 예를 들어, 수령 번호가 FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 또는 FERM BP-11254 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항 hTROP-2 항체도 바람직하게 들 수 있다. 에피토프로는, 하기 (3-6) 항에 있어서 예시하는 것을 바람직하게 들 수 있다.
(3-6) 항 hTROP-2 항체의 에피토프
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 에피토프 (항원 결정기) 는 항원인 hTROP-2 의 적어도 일부이면 되고 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 배열 번호 2 에 나타내는 hTROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 252 번째 ∼ 제 260 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 제외한 영역의 적어도 일부인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 제 1 번째 ∼ 제 69 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부 또는 제 100 번째 ∼ 제 274 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (제 252 번째 ∼ 제 260 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역을 제외한다) 의 적어도 일부이고, 더욱 바람직하게는 제 27 번째 ∼ 제 69 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부 또는 제 109 번째 ∼ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부이다. 상기 에피토프로서 특히 바람직하게는, 배열 번호 2 에 나타내는 hTROP-2 의 아미노산 배열 중의, 제 43 번째 ∼ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ∼ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ∼ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 109 번째 ∼ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 193 번째 ∼ 제 206 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 43 번째 ∼ 제 56 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 그리고 이들을 포함하는 부분이고, 그 중에서도 특히 바람직한 것은, 제 43 번째 ∼ 제 65 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 152 번째 ∼ 제 165 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 제 171 번째 ∼ 제 183 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 및 제 109 번째 ∼ 제 120 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역, 그리고 이들을 포함하는 부분이다. 당해 영역을 인식하는 (당해 영역 또는 그것을 포함하는 부분과 결합하는) 항 hTROP-2 항체는, 예를 들어, 종양 세포 내로의 인터널리제이션 활성이 높아, 후술하는 이뮤노콘쥬게이트 등의 용도에 매우 유용한 것이다.
(3-7) 항 hTROP-2 항체의 특성
본 발명의 항 hTROP-2 항체는, 전술한 바와 같이, 저용량으로 높은 in vivo 항종양 활성을 갖는 항체이다. 구체적으로는, 담암 동물 모델에 대하여, 20 ㎎/㎏ 체중 이하 (바람직하게는 10 ㎎/㎏ 체중 이하, 보다 바람직하게는 5 ㎎/㎏ 체중 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 체중 이하) 의 투여량 (누드 항체) 으로 50 ％ 이상 (바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 대략 100 ％ (예를 들어 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상)) 의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것이 바람직하다.
여기서, 종양 성장 저해 활성 (％) 은, 예를 들어, 하기 식에 의해 산출할 수 있다.
종양 성장 저해 활성 (％) = 100 - [(항체 투여군의 종양 체적 또는 종양 중량) ÷ (대조군의 종양 체적 또는 종양 중량)] × 100
또한, 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대하여 항종양 활성을 갖는 것이 바람직하다. 인간 종양 세포주로는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 각종 인간 췌장암 세포주, 인간 전립선암 세포주, 인간 대장암 세포주, 인간 유방암 세포주, 인간 난소암 세포주, 인간 폐암 세포주 및 인간 담관암 세포주로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 들 수 있고, 구체적으로는, 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 췌장암 세포주 KP-3L, 인간 췌장암 세포주 KP-2, 인간 췌장암 세포주 PK-1, 인간 췌장암 세포주 PK-45H, 인간 췌장암 세포주 PK-45P, 인간 췌장암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌장암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468, 인간 전립선암 세포주 DU145, 인간 전립선암 세포주 PC-3, 인간 난소암 세포주 SK-OV-3, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 및 인간 담관암 세포주 TFK-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 바람직하게 들 수 있다. 그 중에서도, 상기 2 종 이상의 인간 종양 세포주로는, 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468, 및 인간 난소암 세포주 SK-OV-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종을 보다 바람직하게 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 해리 정수 (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.0 × 10-11 M 이하이고, 더욱 바람직하게는 1.0 × 10-12 M 이하이다. 여기서, 항체의 결합능 (친화성) 은, 예를 들어, 스캐차드 해석이나 Biacore 라고 불리는 표면 플라스몬 공명 센서에 의해, 해리 정수 (Kd 값), 해리 속도 정수 (Kdiss [1/Sec]), 결합 속도 정수 (Kass [1/M.Sec]) 로서 측정할 수 있다. Biacore 장치로는, 예를 들어 Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, Biacore Q (모두 Biacore 사) 등을 들 수 있다. 항체는 해리 정수 (Kd 값) 가 작은 값일수록 결합능 (친화성) 이 높다는 점에서 바람직하다. Kd 값은 Kdiss 및 Kass 의 2 개의 파라미터에 의해 결정되며, 예를 들어, 식 : Kd [M] = Kdiss/Kass 에 의해 나타낼 수 있다. 또한, Kd 값의 산출 방법에 대해서는, 후술하는 실시예 (구체적으로는 실시예 10) 에 기재된 방법도 바람직하게 채용할 수 있다.
(4) 유전자 재조합 항체, 및 항체 단편
(4-1) 유전자 재조합 항체
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체 및 인간 항체 등을 들 수 있다.
키메라 항체 (즉 인간형 키메라 항체) 는 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체로 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 키메라를 제작하는 경우에는, 그와 같이 연결된 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다.
인간형화 항체를 제작하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하여, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것이고 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제작한다 (이른바 CDR 그래프팅 (CDR 이식)). 다음으로, 이들 인간형화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 이와 같은 인간형화 항체의 제작법은 당 분야에 있어서 주지이다 (Nature, 321, 522-525 (1986) ; J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ; Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989) ; 일본 공표특허공보 평4-502408호 (일본 특허 제2828340호 ; 퀸 등) 등을 참조).
여기서, 본 발명의 인간형화 항 hTROP-2 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 배열로는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, H 사슬 V 영역 (VH) 의 CDR 1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 36 ∼ 38 에 나타내는 아미노산 배열이나 배열 번호 66 ∼ 68 로 나타내는 아미노산 배열을, L 사슬 V 영역 (VL) 의 CDR 1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 41 ∼ 43 에 나타내는 아미노산 배열이나 배열 번호 71 ∼ 73 으로 나타내는 아미노산 배열을 바람직하게 들 수 있다.
또한, 인간형화된 재구성 인간 가변 영역 중, H 사슬 V 영역의 아미노산 배열로는, 예를 들어, 배열 번호 92 로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 36 ∼ 38 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 75 로 나타낸다), 배열 번호 98 로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 36 ∼ 38 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 97 로 나타낸다), 배열 번호 94 로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 66 ∼ 68 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 79 로 나타낸다), 및 배열 번호 95 로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 66 ∼ 68 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 81 로 나타낸다) 을 바람직하게 들 수 있다. 여기서, 상기 배열 번호 98 로 나타내는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열은 상기의 배열 번호 92 로 나타내는 H 사슬 V 영역의 아미노산 배열의 제 44 번째의 아르기닌 (R) 을 글리신 (G) 으로 치환한 개변형의 아미노산 배열이다.
동일하게, 인간형화된 재구성 인간 가변 영역 중, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열로는, 예를 들어, 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 41 ∼ 43 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 77 로 나타낸다), 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열 (배열 번호 71 ∼ 73 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDR 1 ∼ 3 을 포함하고 ; 추가로 시그널 펩타이드를 포함하는 아미노산 배열은 배열 번호 83 으로 나타낸다) 을 바람직하게 들 수 있다.
여기서, 본 발명의 인간형화 항 hTROP-2 항체의 양태로는, 예를 들어, (i) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 92 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이나, (ii) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 98 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다. 그 중에서도, H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 98 로 나타내는 아미노산 배열인 상기 (ii) 의 인간형화 항 hTROP-2 항체는, 아비디티 (Avidity) (즉 2 개의 항원 결합 아암의 운동능에 관한 플렉서빌리티) 가 보다 향상된 것으로, 항원 결합 활성이 높은 것이기 때문에, 특히 바람직하다.
동일하게, 본 발명의 인간형화 항 hTROP-2 항체의 다른 양태로는, 예를 들어, (iii) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 94 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이나, (iv) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 95 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것이 바람직하다.
인간 항체 (완전 인간 항체) 는 일반적으로 V 영역의 항원 결합 부위인 초가변 영역 (Hyper Variable region), V 영역의 그 밖의 부분 및 정상 영역의 구조가 인간의 항체와 동일한 구조를 갖는 것이다. 단, 초가변 부위는 다른 동물 유래이어도 된다. 인간 항체를 제작하는 기술도 공지로, 인간에 공통적인 유전자 배열에 대해서는 유전자 공학적 수법에 의해 제작하는 방법이 확립되어 있다. 인간 항체는, 예를 들어, 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143 ; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727 등을 참조) 이나, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.
상기 키메라 항체, 인간형 항체 및 인간 항체는 항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬인 것이 바람직하고, 상세하게는, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합하고 있지 않은 당사슬을 항체 분자의 Fc 영역에 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이 점 (항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 특징) 은 전술한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체에 대해서도 동일하게 바람직하다.
(4-2) 항체 단편
본 발명의 항 hTROP-2 항체의 단편 (부분 단편) 도 본 발명의 항체에 포함되는 것으로 한다. 여기서, 본 발명의 항체 단편은, 본 발명의 항 hTROP-2 항체와 동일하게, hTROP-2 에 대한 결합 활성을 갖는 것 (즉 hTROP-2 에 결합할 수 있는 것) 으로서 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것이다.
당해 항체의 단편으로는, 항 hTROP-2 폴리클로날 항체 또는 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 일부분의 영역 (즉, 본 발명의 항 hTROP-2 항체에서 유래하는 항체 단편) 을 의미하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv (variable fragment of antibody), 1 개 사슬 항체 (H 사슬, L 사슬, H 사슬 V 영역, 및 L 사슬 V 영역 등), scFv, diabody (scFv 2 량체), dsFv (디술파이드 안정화 V 영역), 그리고, 상보성 결정 영역 (complementarity determining region : CDR) 을 적어도 일부에 포함하는 펩타이드 등을 들 수 있다.
Fab 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H 사슬의 N 말단측 약 절반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합으로 결합된, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또한, 항체의 Fab 를 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab 를 제조할 수도 있다.
F(ab')2 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 개재하여 결합된 것 보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또한, 후술하는 Fab 를 티오에테르 결합 혹은 디술파이드 결합시켜, 제작할 수도 있다.
Fab' 는 상기 F(ab')2 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또한, 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab' 를 제조할 수도 있다.
scFv 는, 1 개의 H 사슬 V 영역 (VH) 과 1 개의 L 사슬 V 영역 (VL) 을 적당한 펩타이드 링커 (P) 를 이용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
diabody 는 scFv 가 2 량체화한 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은 동일해도 되고, 일방을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 P 의 아미노산 배열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를, 그 시스테인 잔기 사이의 디술파이드 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, Reiter 등에 의해 나타내진 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축하여, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
CDR 을 포함하는 펩타이드는, VH 의 CDR (CDR 1 ∼ 3) 및 VL 의 CDR (CDR 1 ∼ 3) 중의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성되고, VH 의 CDR 을 모두 포함하는 것, 및 VL 의 CDR 을 모두 포함하는 것이 보다 바람직하고, VH 및 VL 의 CDR (합계 6 영역) 을 모두 포함하는 것이 특히 바람직하다. CDR 의 아미노산 배열로는, 예를 들어, 전술한 배열 번호 36 ∼ 38, 41 ∼ 43, 46 ∼ 48, 51 ∼ 53, 56 ∼ 58, 61 ∼ 63, 66 ∼ 68 및 71 ∼ 73 에 나타내는 아미노산 배열을 바람직하게 들 수 있다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩타이드는 직접 또는 적당한 펩타이드 링커를 개재하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 펩타이드는, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또한, CDR 을 포함하는 펩타이드는 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체 단편으로는, 그대로의 형상으로 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이어도 되고, 또한, 상기 서술한 항체 단편과 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부의 융합 단백질이어도 된다. 이와 같은 항체 단편이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.
이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 상기 서술한 항체 단편도 본 발명의 항 hTROP-2 항체에 포함되는 것으로 한다.
3. 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터 및 형질 전환체
본 발명에 있어서는, 상기 서술한 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 그 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드 (유전자, DNA) 도 제공할 수 있다. 당해 폴리뉴클레오티드로는, 구체적으로는, 상기 서술한 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 항체 단편의 예시로서 나타낸 각 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드만으로 이루어지는 것이어도 되고, 당해 폴리뉴클레오티드를 일부에 포함하고, 그 외에 유전자 발현에 필요한 공지된 염기 배열 (전사 프로모터, SD 배열, Kozak 배열, 터미네이터 등) 도 포함하는 것이어도 되며, 한정은 되지 않는다.
본 발명의 항 hTROP-2 항체나 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드로는, 번역 후의 개개의 아미노산에 대응하는 코돈은 특별히 한정은 되지 않고, 전사 후, 인간 등의 포유류에 있어서 일반적으로 이용되고 있는 코돈 (바람직하게는 사용 빈도가 높은 코돈) 을 나타내는 뉴클레오티드 DNA 를 포함하는 것이어도 되고, 또한, 대장균이나 효모 등의 미생물이나, 식물 등에 있어서 일반적으로 이용되고 있는 코돈 (바람직하게는 사용 빈도가 높은 코돈) 을 나타내는 뉴클레오티드 DNA 를 포함하는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서는, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터나, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체를 제공할 수도 있다.
재조합 벡터로서 사용하는 발현 벡터에 삽입하는 폴리뉴클레오티드 (유전자, DNA) 에는, 필요에 따라, 미리, 상류에 전사 프로모터, SD 배열 (숙주가 원핵 세포인 경우) 및 Kozak 배열 (숙주가 진핵 세포인 경우) 을 연결해 두어도 되고, 하류에 터미네이터를 연결해 두어도 되고, 그 외에, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커 등을 연결해 둘 수도 있다. 또한, 상기 전사 프로모터 등의 유전자 발현에 필요한 각 요소는 처음부터 당해 폴리뉴클레오티드에 포함되어 있어도 되고, 원래 발현 벡터에 포함되어 있는 경우에는 그것을 이용해도 되며, 각 요소의 사용 양태는 특별히 한정되지 않는다.
발현 벡터에 당해 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 방법으로는, 예를 들어, 제한 효소를 사용하는 방법이나, 토포이소머라아제를 사용하는 방법 등, 공지된 유전자 재조합 기술을 이용한 각종 방법을 채용할 수 있다. 또한, 발현 벡터로는, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 레트로바이러스 벡터, 인공 염색체 DNA 등, 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 그 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드 (유전자, DNA) 를 유지할 수 있는 것이면, 한정은 되지 않고, 사용하는 숙주 세포에 적합한 벡터를 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
이어서, 구축한 상기 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이것을 배양함으로써, 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 그 항체 단편을 발현시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 말하는 「형질 전환체」 란 숙주에 외래 유전자가 도입된 것을 의미하고, 예를 들어, 숙주에 플라스미드 DNA 등을 도입함 (형질 전환) 으로써 외래 유전자가 도입된 것, 그리고, 숙주에 각종 바이러스 및 파지를 감염시킴 (형질 도입) 으로써 외래 유전자가 도입된 것이 포함된다.
숙주로는, 상기 재조합 벡터가 도입된 후, 본 발명의 항 hTROP-2 항체나 그 항체 단편을 발현할 수 있는 것이면, 한정은 되지 않고, 적절히 선택할 수 있는데, 예를 들어, 인간이나 마우스 등의 각종 동물 세포, 각종 식물 세포, 세균, 효모, 식물 세포 등의 공지된 숙주를 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어, 인간 섬유아세포, 인간 태아 신장 세포, HEK293 세포, 293F 세포, CHO 세포, 원숭이 세포 COS-7, Vero, 마우스 L 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 또한, Sf9 세포, Sf21 세포 등의 곤충 세포를 사용할 수도 있다.
세균을 숙주로 하는 경우, 예를 들어, 대장균, 고초균 등이 사용된다.
효모를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어, 사카로미세스·세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스·폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 등이 사용된다.
식물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어, 담배 BY-2 세포 등이 사용된다.
형질 전환체를 얻는 방법은 한정은 되지 않고, 숙주와 발현 벡터의 종류의 조합을 고려하여, 적절히 선택할 수 있는데, 예를 들어, 전기 천공법, 리포펙션법, 히트쇼크법, PEG 법, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 그리고, DNA 바이러스나 RNA 바이러스 등의 각종 바이러스를 감염시키는 방법 등을 바람직하게 들 수 있다.
얻어지는 형질 전환체에 있어서는, 재조합 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오티드의 코돈형은 사용한 숙주의 코돈형과 일치하고 있어도 되고 상이해도 되며, 한정은 되지 않는다.
4. 항체-약제 복합체의 제작
상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체를 사용한 이뮤노콘쥬게이트 등으로서, 당해 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질 (화합물 등) 을 포함하는, 항체-약제 복합체를 제공할 수 있다. 또한, 미리, 당해 항체 분자와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을, 각각 조제한 후, 이들을 복합화시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노콘쥬게이트라고 칭해진다. 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질로서의 단백질 톡신을, 유전자 상에서 항체 유전자와 연결시켜, 1 개의 단백질 (융합 단백질) 로서 발현시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노톡신이라고 칭해진다.
항종양 활성을 갖는 물질로는, 예를 들어, 독소루비신, 칼리키아마이신, 마이토마이신 C, Auristatin E, 방사성 동위체 (RI) 등을 들 수 있다. 살세포 활성을 갖는 물질로는, 예를 들어, 사포린, 리신, 녹농균 외독소, 디프테리아 톡신, 방사성 동위체 (RI) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 사포린 및 녹농균 외독소가 바람직하게 사용된다. 또한, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 RI 로는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 90Y, 111In, 125I, 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189Re, 177Lu, 67Cu, 212Bi, 213Bi, 211At, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94 mTc, 121 mTe, 122 mTe, 125 mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 18F, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212Pb 및 223Ra 등을 들 수 있다.
항체-약제 복합체의 제작 방법으로는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 디술파이드 결합이나 히드라존 결합에 의해 항체와 약제를 커플링하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체는 hTROP-2 를 발현하는 표적 종양 세포 내로의 인터널리제이션 활성이 우수한 것이다. 그 때문에, 미리, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 복합화시켜 둠으로써, 이들 물질을 종양 세포에 직접 또한 고선택적으로 작용시킬 수 있다. 본 발명의 항체-약제 복합체는 표적 종양 세포로의 약제 송달능이 매우 우수한 것이다.
또한, 세포 내로의 인터널리제이션 활성은 항체를 로다민 등에 의해 형광 표지하고, 세포 내로의 이행 거동 및 항체의 국재성에 대하여 형광 현미경 등을 이용하여 관찰함으로써 평가할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서는, 항체-약제 복합체에 있어서, 항체 대신 전술한 항체 단편을 사용한 항체 단편-약제 복합체를 제공할 수도 있다. 항체 단편-약제 복합체의 상세한 것에 대해서는, 상기 서술한 항체-약제 복합체의 설명을 적절히 적용할 수 있다.
이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 항체 단편-약제 복합체도 본 발명의 항체-약제 복합체에 포함되는 것으로 한다.
5. 의약 조성물
본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체는 의약 조성물에 포함되는 유효 성분으로서 유용하다.
당해 의약 조성물은 종양의 치료용 및/또는 진단용의 의약 조성물로서 유용하다. 특히, 본 발명의 항 hTROP-2 항체, 및 그 항체를 포함하는 항체-약제 복합체는, 항종양 활성으로서 우수한 종양 성장 저해 활성을 갖는 것이기 때문에, 종양의 치료용에 사용되는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체는 종양 치료제 및 종양 진단제에 포함되는 유효 성분으로서 유용한 것이다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 종양의 치료에는, 종양의 성장 저해 및 성장 억제의 의미도 포함하는 것으로 하고, 구체적으로는, 예를 들어 종양 치료제이면, 종양의 성장 저해제 및 성장 억제제의 형태도 포함하는 것으로 한다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 유효 성분으로서 포함하고, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 공지된 항종양제와의 병용도 할 수 있다. 병용에 의해 더욱 높은 항종양 효과가 얻어진다.
본 발명의 의약 조성물의 적용의 대상이 되는 질환 (종양) 으로는, hTROP-2 의 발현이 확인되어 있는 전술한 공지된 각종 인간 종양을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암 등의 각종 인간 종양 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다. 이들 질환은 단독이어도 되고, 2 개 이상이 병발해도 된다. 또한, 대상이 되는 종양은 재발암이나 전이암이어도 되고, 본 발명의 의약 조성물 (나아가, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체) 은 재발암이나 전이암의 치료제 및 진단제로서도 유효하게 사용할 수 있다.
「약학적으로 허용될 수 있는 담체」 란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 혹은 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그러한 담체의 1 종 이상을 사용함으로써, 주사제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제 혹은 시럽제 등의 형태의 의약 조성물을 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물은 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로는, 1 개 이상의 활성 물질을 포함하고, 통상적인 방법에 의해 처방되는 주사제 등이 포함된다. 주사제의 경우에는, 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 항 hTROP-2 항체 유래의 항체 단편 (그 중에서도 저분자의 것) 을 생체 내에 투여하는 경우에는, 상기에 더하여, 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다. 콜로이드 분산계는 화합물 (항체 단편) 의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정한 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 기대된다. 콜로이드 분산계는 통상적으로 사용되는 것이면 되고 한정은 되지 않지만, 폴리에틸렌글리콜, 고분자 복합체, 고분자 응집체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비즈, 및 수중유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는, 특정한 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는, 복수의 리포솜, 인공막의 소포이다 (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682 ; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91 ; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119 ; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 혹은 의약 조성물에 함유되는 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및 항체-약제 복합체의 종류 등에 따라 상이하다. 통상적으로, 성인 1 명당, 1 회에 대하여 600 ㎍ 내지 6000 ㎎ 의 범위로 투여할 수 있지만, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어 주사제에 의해 투여하는 경우에는, 인간 환자에 대하여, 1 회의 투여에 있어서 1 ㎏ 체중당, 100 ㎍ ∼ 100 ㎎ 의 양을, 1 일 평균 당 1 회 ∼ 몇 회 투여해도 되고, 바람직하게는 3 일, 1 주일, 10 일 또는 2 주일에 1 회 투여하거나 혹은 단회 (합계 투여 횟수가 1 회) 투여하는 양태도 취할 수 있다. 투여의 형태로는, 정맥 내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 내 주사 혹은 복강 내 주사 등을 들 수 있고, 바람직하게는 정맥 내 주사이다. 또한, 주사제는, 경우에 따라, 비수성의 희석제 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 등의 식물유, 에탄올 등의 알코올류 등), 현탁제 혹은 유탁제로서 조제할 수도 있다. 그러한 주사제의 무균화는 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시할 수 있다. 주사제는 사용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결 건조법 등에 의해 무균의 고체 조성물로 하고, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 종양을 치료 및/또는 진단하는 의약 (약제) 을 제조하기 위한, 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 종양을 치료용 및/또는 진단용의, 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 제공하는 것이기도 하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 사용하는 (즉 환자에게 투여하는) 것을 특징으로 하는 종양의 치료 및/또는 진단 방법을 제공하는 것이고, 또한, 종양을 치료 및/또는 진단하기 위한, 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다.
6. 종양의 검출 방법
본 발명의 종양의 검출 방법은 상기 본 발명의 항 hTROP-2 항체와, 생체로부터 채취된 시료 (이하, 생체 시료) 를 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
전술한 바와 같이, hTROP-2 는 각종 종양 세포에 있어서 특이적으로 발현하는 것이 확인되어 있기 때문에, hTROP-2, 특히 유리 hTROP-2 (hTROP-2 의 세포 외 영역 부분) 는 각종 종양 마커로서 이용하는 것이 가능하다. 그 중에서도, 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암 및 인간 유방암의 마커로서 이용하는 것이 바람직하다.
그래서, 본 발명의 항 hTROP-2 항체를 생체 시료와 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출함으로써, 종양을 검출할 수 있다. 얻어진 항체의 시그널은 생체 시료 중의 항원량 (즉 hTROP-2 량 또는 유리 hTROP-2 량) 의 지표가 된다. 본 발명의 항체를 사용한 종양의 검출은, 먼저, 검체로서 피험자로부터 채취한 생체 시료, 예를 들어 검사 대상으로 하는 조직편 또는 혈액 등과 본 발명의 항체를, 항원 항체 반응에 의해 결합시킨다. 이어서, 결합한 항체량의 측정 결과에 기초하여, 생체 시료 중의 목적으로 하는 항원량을 측정함으로써 실시한다. 당해 측정은 공지된 면역학적 측정법에 따라 실시하면 되고, 예를 들어, 면역 침강법, 면역 응집법, 표지 면역 측정법, 면역비 현탁법, 웨스턴 블롯법, 플로우 사이토메트리법 등을 사용할 수 있다. 표지 면역 측정법에서는, 항체의 시그널은, 표지 항체를 이용하여 직접 검출한 표지량으로 나타내는 것 외에, 이미 알려진 농도 혹은 이미 알려진 항체가의 항체를 표준액으로 하여 상대적으로 나타내도 된다. 즉, 표준액과 검체를 측정계에 의해 측정하고, 표준액의 값을 기준으로 하여 생체 시료 중의 항체 시그널을 상대적으로 나타낼 수 있다. 표지 면역 측정법으로는, 예를 들어 ELISA 법, EI 법, RIA 법, 형광 면역 측정 (FIA) 법, 화학 발광 면역 측정법 (Luminescence immunoassay) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, ELISA 법이 간편하고 또한 고감도라는 점에서 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과를 지표로 하여 종양의 상태를 평가 또는 진단할 수 있다. 예를 들어, 검출 결과가 소정의 기준치를 초과하는 것을 종양 양성, 소정의 기준치 이하의 것을 종양 음성으로 하고, 양성의 경우에는, 어느 종양을 발증하고 있을 가능성이 있다고 판단하고, 종양의 상태를 평가할 수 있다. 여기서, 종양의 상태란, 종양의 이환의 유무 또는 그 진행도를 의미하고, 종양의 발증의 유무, 진행도, 악성도, 전이의 유무 및 재발의 유무 등을 들 수 있다.
상기 평가에 있어서, 종양의 상태로는 1 개를 선택해도 되고, 복수 개를 조합하여 선택해도 된다. 종양의 유무의 평가는, 얻어진 검출 결과에 기초하여, 소정의 기준치를 경계로 하여 종양에 이환하고 있는지 여부를 판단함으로써 실시할 수 있다. 종양의 악성도는 암이 어느 정도 진행되어 있는지를 나타내는 지표가 되는 것으로, 검출 결과에 기초하여, 병기 (Stage) 를 분류하여 평가하거나, 혹은 조기암이나 진행암을 분류하여 평가하는 것도 가능하다. 예를 들어, 검출 결과를 지표로 하여 조기암 또는 진행암이라고 평가할 수도 있다. 종양의 전이는, 검출 결과를 지표로 하여, 원발소의 위치로부터 떨어진 부위에 신생물이 출현하고 있는지 여부에 따라 평가할 수 있다. 재발은 간헐기 또는 관해 후에 검출 결과가 다시 소정의 기준치를 초과했는지 여부에 따라 평가할 수 있다.
7. 종양의 검출용 또는 진단용 키트
본 발명의 항 hTROP-2 항체는 종양의 검출용 또는 진단용 키트의 형태로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 항체를 포함하지만, 그 외에, 표지 물질, 혹은 항체 또는 그 표지물을 고정시킨 고상화 시약 등을 포함할 수 있다. 항체의 표지 물질이란, 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학 발광 화합물 등에 의해 표지된 것을 의미한다. 본 발명의 키트는, 상기의 구성 요소 외에, 본 발명의 검출을 실시하기 위한 다른 시약, 예를 들어 표지물이 효소 표지물인 경우에는, 효소 기질 (발색성 기질 등), 효소 기질 용해액, 효소 반응 정지액, 혹은 검체용 희석액 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 각종 버퍼, 멸균수, 각종 세포 배양 용기, 각종 반응 용기 (에펜도르프 튜브 등), 블로킹제 (Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat 혈청 등의 혈청 성분), 세정제, 계면 활성제, 각종 플레이트, 아지화나트륨 등의 방부제, 및 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 키트는 상기 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위하여 유효하게 사용할 수 있으며, 매우 유용성이 높은 것이다.
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[hTROP-2 유전자의 클로닝]
hTROP-2 유전자 전체 길이의 단리는 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 RT-PCR 법에 의해 실시하였다. 먼저 hTROP-2 유전자 (Genbank accession No. NM_002353) 의 배열을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계하였다.
포워드측 프라이머 : 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (배열 번호 3)
리버스측 프라이머 : 5'-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3' (배열 번호 4)
이 때, 리버스측 프라이머에는 스톱 코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하였다. 이들 프라이머와 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 조제한 전체 RNA (TAKARA) 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 그 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 전개, 목적으로 하는 밴드의 추출을 실시하고, pCRII 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝하였다 (pCRII-hTROP2). 클로닝한 hTROP-2 의 cDNA 는 시퀀스에 의해 확인하였다.
발현 벡터의 구축은, pCRII-hTROP2 로부터 hTROP-2 유전자를 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 잘라, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 Eco RI/Xho I 부위에 삽입하여 실시하였다 (pcDNA4-hTROP2-myc/His). 또한 pcDNA4-hTROP2-myc/His 로부터 hTROP-2 유전자를 포함하는 Hind III/Pme I 단편을 잘라 (Hind III 절단 부위는 평활 말단화하였다), pcDNA3.1 (+) 벡터 (Invitrogen) 의 Pme I 부위에 삽입함으로써 네오마이신 내성 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축하였다 (pcDNA3.1-hTROP2-myc/His).
[실시예 2]
[hTROP-2 유전자 안정 세포주의 구축]
상기의 방법으로 제작한 hTROP-2 의 전체 길이 cDNA 를 코드한 발현 벡터 (pcDNA3.1-hTROP2-myc/His) 를, HEK293 세포 (RIKEN), HuH-7 세포 (HSRRB), 7E2-C 세포 (WO 2005/052156 에 기재), CHO-K1 세포 (HSRRB) 에 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen) 을 이용하여 유전자 도입하고, 항생 물질 G418 (geneticin, GIBCO BRL) 에 의한 선택을 실시한 후, hTROP-2 를 안정적으로 발현하고 있는 세포주를 수립함으로써 얻었다.
[실시예 3]
[hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 제작]
hTROP-2 세포 외 영역의 일부 (구체적으로는, 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 중 제 1 번째 ∼ 제 263 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 를 코드하는 유전자 단편은 PCR 법에 의해 증폭하였다. 증폭에 사용한 프라이머는 이하와 같다.
포워드측 프라이머 : 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (배열 번호 3)
리버스측 프라이머 : 5'-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3' (배열 번호 5)
이 때, 리버스측 프라이머에 Xho I 에 의한 제한 효소 소화 부위를 부가하였다. PCR 법에 의해 증폭한 DNA 단편은 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 전개하고, QIAquick (등록상표) Gel Extraction Kit (QIAGEN) 를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 pCR Blunt 벡터 (Invitrogen) 에 서브 클로닝하고 (pCRB-hTROP-2 EC), 유전자 배열을 확인하였다. 다음으로 pCRB-hTROP-2 EC 로부터 hTROP-2 의 세포 외 영역을 코드하는 유전자 단편을 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 잘라, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 Eco RI/Xho I 부위에 삽입하였다 (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). 추가로 pcDNA4mH-hTROP-2 EC 의 Bam HI/Eco RI 부위에 Nru I 제한 효소 절단 부위를 제작하기 위하여, 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 회합시켜 삽입하였다.
올리고뉴클레오티드 1 : 5'-gatccactagtcgcgagtggtgg-3' (배열 번호 6)
올리고뉴클레오티드 2 : 5'-aattccaccactcgcgactagtg-3' (배열 번호 7)
동일하게 pcDNA4mH-hTROP-2 EC 의 Pme I 부위에 pBgl II 링커 (TAKARA) 를 삽입하였다 (pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC). 바큘로 바이러스를 사용한 리콤비넌트 단백질 제작을 위하여, pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC 로부터 hTROP-2 의 세포 외 영역을 코드하는 유전자 단편을 포함하는 Nru I/Bgl II 단편을 잘라, pPSC8 벡터 (니혼 농산 공업) 의 Nru I/Bgl II 부위에 삽입하였다 (pPSC8-hTROP2 EC). 바큘로 바이러스를 사용한 hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 제작은 니혼 농산 공업에 위탁하였다.
hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질의 정제는 이하와 같이 실시하였다. 리콤비넌트 단백질을 포함하는 배양 상청에 Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) 를 첨가하고 4 ℃, 2 시간 결합시켰다. 그 후, 에코노 컬럼 (BIO RAD) 을 이용하여 20 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충액으로 세정, 300 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충액으로 용출을 실시하여 정제하였다.
[실시예 4]
[인간 EpCAM cDNA 의 단리와 발현 벡터의 구축]
인간 EpCAM 유전자 전체 길이의 단리는 인간 태아 간장 (태생 10 주) 으로부터 RT-PCR 법에 의해 실시하였다. 먼저 인간 EpCAM 유전자 (Genbank accession No. NM 002354) 의 배열을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계하였다.
포워드측 프라이머 : 5'-tcctcgtgtcccactcccgg-3' (배열 번호 8)
리버스측 프라이머 : 5'-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3' (배열 번호 9)
이 때, 리버스측 프라이머에는 스톱 코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하였다. 이들 프라이머와 인간 태아 간장 (태생 10 주) 유래의 전체 RNA (TAKARA) 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 그 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의한 전개, 목적으로 하는 밴드의 추출을 실시하고, pCRII 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝하였다 (pCRII-hEpCAM). 클로닝한 인간 EpCAM 의 cDNA 는 시퀀스에 의해 확인하였다.
발현 벡터의 구축은, pCRII-hEpCAM 으로부터 인간 EpCAM 유전자를 포함하는 EcoRI/Xho I 단편을 잘라, pcDNA4/myc-Hisⓒ A 벡터 (Invitrogen) 의 Eco RI/Xho I 부위에 삽입하여 실시하였다 (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). 또한 pcDNA4-hEpCAM-myc/His 로부터 인간 EpCAM 유전자를 포함하는 Hind III/Pme I 단편을 잘라 (Hind III 절단 부위는 평활 말단화하였다), pcDNA3.1 (+) 벡터 (Invitrogen) 의 Pme I 부위에 삽입함으로써 네오마이신 내성 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축하였다 (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His).
[실시예 5]
[항 hTROP-2 모노클로날 항체의 제작]
면역원으로는, hTROP-2 발현 안정 세포주 (HEK293-hTROP-2 세포, CHO-K1-hTROP-2 세포, 7E2-C-hTROP-2 세포), 내재적으로 hTROP-2 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는, 인간 췌장암 세포주 (PK-59, RCB1901 ; RIKEN cell bank 로부터 구입), 또는 상기의 방법으로 제작한, hTROP-2 의 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질을 사용하였다.
hTROP-2 발현 안정 세포주의 경우에는 1 × 107 세포, 리콤비넌트 hTROP-2 단백질의 경우에는, 20 ㎍ 의 단백질을, 각각 면역 보조제 TiterMax Gold (푸나코시 주식회사) 와 1 : 1 로 혼합하여 에멀션을 조제하고, 마우스 (C57/BL6, Balb/c) 의 양 족척, 또는 복강 내에 주사하였다 (첫회 면역). 양 족척에 대한 단기 면역의 경우에는, 첫회 면역으로부터 3 일 후 및 10 일 후에 추가 면역을 실시하고, 최종 면역 다음날에, 양 무릎 림프절을 채취하여, 림프구를 조제하였다. 복강 내에 대한 장기 면역의 경우에는, 첫회 면역으로부터 1 주일에 1 회의 비율로, 추가 면역을 실시하고 (1 ∼ 2 개월간 실시), 통상적인 방법에 따라, 비장으로부터 B 세포를 단리하였다. 추가 면역은, 세포 면역에서는 5 × 106 세포의 PBS 에 의한 세포 현탁액을 이용하고, 단백질 항원의 경우에는 5 ㎍ 의 PBS 용액을 사용하였다.
조제한 림프구와 마우스 미엘로마 세포주 (P3-X63-Ag8.653) 를, 3 : 1 의 비율로 혼합하고, 폴리에틸렌글리콜법으로 세포 융합을 실시하여, HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 포함하는 메틸셀룰로오스 배지 (상품명 : ClonaCell-HY Cloning Medium D ; Stem Cell) 로 7 ∼ 28 일간 배양하고, 증식된 하이브리도마의 단일 콜로니를, 1 개 1 개를 96 구멍 평저 플레이트에 픽업하여, HAT 를 포함하는 액체 선택 배지를 이용하여, 5 ％ CO2 인큐베이터로 배양하였다. 증식된 단일 콜로니 유래의 하이브리도마의 배양 상청을, Cell ELISA (후술) 에 의한 1 차 스크리닝, HuH-7-hTROP-2 세포, PK-59 를 사용한 FACS 해석으로 2 차 스크리닝을 실시함으로써, 생세포의 세포 표면에 발현하고 있는 hTROP-2 단백질을 인식하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 300 종류 수립하였다.
[실시예 6]
[Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝]
96 구멍 배양 플레이트 (BD 팔콘) 에, CHO-K1 세포 (hTROP-2 음성 컨트롤 : 휴먼 사이언스 진흥 사업단으로부터 구입) 와 CHO-K1-hTROP-2 세포 (또는, HuH-7 세포 (hTROP-2 음성 컨트롤 : 휴먼 사이언스 진흥 사업단으로부터 구입) 와 HuH-7-hTROP-2 세포) 를 3 × 104 세포/웰로 교대로 파종하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 1 ∼ 2 일간 배양하였다. 데칸테이션으로 세포 배양액을 제거하고, 이어서, 빙랭 PBS 로 세정 후, 4 ％ 파라포름알데하이드-PBS 로 5 분간 처리함으로써 세포를 고정시키고, 빙랭 PBS 로 세정 후 ELISA 플레이트로 하였다. 이후, 통상적인 방법에 따라, ELISA 법을 실시하였다. 구체적으로는 이하와 같다.
먼저, 2 ％ 스킴 밀크-PBS 용액에 의한 블로킹을 실온에서 30 분 ∼ 1 시간 실시하였다. 다음으로, 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1 ％ Tween 20-PBS 용액으로 3 회 세정하였다. 2 차 항체로서, 블로킹 용액으로 1000 배 희석한, Horseradish peroxidase (HRP) 표지 항마우스 IgG (GE 헬스케어 바이오사이언스) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 0.1 ％ Tween 20-PBS 용액으로 3 회 세정하였다. TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine : SIGMA) 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate reader Model 550 (바이오·래드) 을 이용하여, 흡광도 (405 ㎚) 를 측정하였다. 음성 컨트롤에 대하여, 높은 흡광도의 값을 나타낸 하이브리도마 배양 상청에 대응하는 하이브리도마를 24 구멍 평저 플레이트에 확대 배양을 실시하여, FACS 해석을 사용한 2 차 스크리닝 (후술) 에 이행하였다.
[실시예 7]
[FACS 해석을 사용한 2 차 스크리닝]
상기의 Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝에서 양성이었던 하이브리도마에 대하여, FACS 해석을 사용한 2 차 스크리닝을 실시하였다. 세포는, hTROP-2 를 발현하고 있지 않은 인간 간암 세포주인 HuH-7 세포를 음성 컨트롤로 하여, hTROP-2 를 발현시킨 안정 세포주인 HuH-7-hTROP-2 세포에 대한 반응성을 지표로 평가하고, 다음으로 내재적으로 hTROP-2 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는 인간 췌장암 세포주인 PK-59 세포 (RCB1901 ; RIKEN cell bank 로부터 구입) 와의 반응성으로 평가하였다.
세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 박리하여, 세포 현탁액 (세포 밀도 2 × 106 cells/㎖) 을 조제하였다. Cell ELISA 를 사용한 1 차 스크리닝에서 양성 반응을 나타낸 하이브리도마 배양 상청과 세포 현탁액 100 ㎕ 를, 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. PBS 로 세정 후, PE 표지 항마우스 IgG (BD 파민겐) (0.1 ㎍) 와 반응 (4 ℃, 30 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤 딕킨손) 에 의해 해석하였다.
최종적으로, 생세포의 세포 표면에 발현하고 있는 hTROP-2 단백질을 인식하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 약 300 종류 수립하였다.
[실시예 8]
[아이소타입의 동정]
제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 아이소타입은, MOUSE MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (Serotec 사) 를 이용하여, 키트에 첨부된 방법에 따라 실시하였다.
[실시예 9]
[TROP-2 항체의 복수화 및 항체 정제]
상기 방법으로 제작한 하이브리도마의 클론을, 미리 (7 일 전) 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (프리스탄) 이 투여된 BALB/c 누드 마우스의 복강 내에 3 × 106 개 투여하고, 2 주일 후의 복수를 채취하였다. 또한 이 복수로부터, 카프릴산 침전, 프로테인 G 칼럼 (HiTrap protein G ; GE 헬스케어 바이오사이언스), 또는 프로테인 A 칼럼 (HiTrap protein A ; GE 헬스케어 바이오사이언스) 을 이용하여 어피니티 정제를 실시함으로써, 각 하이브리도마 클론이 산생하는 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 얻었다.
[실시예 10]
[항원 친화성의 측정 (Kd 값의 측정)]
제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 항원 친화성 (Kd 값) 은 ELISA 를 사용한 방법으로 산출하였다 (Djavadi-Ohaniance L. et al (1996), In Antibody Engineering, Chapter 4, pp77-97. IRL Press, Oxford).
구체적으로는, 96 구멍 배양 플레이트 (코닝) 에, 정제한 리콤비넌트 hTROP-2 단백질 (0.1 ㎍/㎖) 을 첨가하여 항원을 고상화하였다 (실온, 1 시간, 또는 4 ℃, 하룻밤). 다음으로, PBS 로 3 회 세정하고, 2 ％ 스킴 밀크 (PBS 용액) 를 첨가하여 블로킹을 실시하였다 (실온, 1 시간). PBS 로 2 회 세정 후, 미리 항원 용액 (정제 hTROP-2 단백질 ; 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM) 과 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 각 클론 (0.5 nM) 을 혼합하여 평형화시켜 둔 항원-항체 복합체를, 상기 ELISA 플레이트에 첨가하여 반응시켰다 (실온, 1 시간). PBS 로 3 회 세정한 후, 블로킹액으로 희석한 HRP 표지 항마우스 IgG (최종 농도 1 ㎍/㎖) (GE 헬스케어 바이오사이언스) 와 반응시켰다 (실온, 1 시간). 이어서, 0.1 ％ Tween 20-PBS 용액으로 3 회 세정한 후에, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine : SIGMA) 기질 용액을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Microplate reader Model 550 (바이오·래드) 을 이용하여, 흡광도를 측정하였다.
해리 정수 (Kd) 의 계산식은 이하와 같이 하였다.
항원 항체 반응은 질량 작용의 법칙에 의해,
Figure 112014054930572-pct00001
Figure 112014054930572-pct00002
(2) 식에서, Agf 는 유리 항원의 농도, Abf 는 유리 항체의 농도, Ag-Ab 는 항원-항체 복합체의 농도를 나타내고, Ag-Ab = x 로 하면, 유리 항체 농도는,
Abf = Abt - x ···(3)
(2) 식은,
Kd = Agf × (Abt - x)/x ···(4)
(4) 식의 양 항에 x/Kd × Abt 를 곱하면,
x/Abt = Agf × (1 - x/Abt) × 1/Kd
x/Abt × 1/Agf = (1 - x/Abt) × 1/Kd ··· (5)
(5) 식에 있어서, X = x/Abt, Y = x/Abt × Agf 로 하면,
Y = (1 - X) × 1/Kd ···(6)
(6) 식으로부터, Kd 값을 산출하였다.
상기의 방법으로, 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 300 클론의 Kd 값을 측정한 결과, 1 × 10-10 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 133 클론, 1 × 10-11 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 59 클론, 1 × 10-12 (M) 이하의 Kd 값을 나타내는 클론이 2 클론이었다.
in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 중, K5-70 (마우스 IgG2a), T6-16 (마우스 IgG2a), K5-107 (마우스 IgG1), K5-116-2-1 (마우스 IgG2a), 및 T5-86 (마우스 IgG1) 의 Kd 값은, 각각 순서대로, 6.8 × 10-12 (M), 4.3 × 10-12 (M), 4.7 × 10-12 (M), 2.69 × 10-11 (M), 및 8.49 × 10-11 (M) 이었다 (도 1, 표 1).
Figure 112014054930572-pct00003
[실시예 11]
[항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암 세포주와의 반응성]
인간 암 세포주 (인간 종양 세포주) 는, 휴먼 사이언스 진흥 사업단 (HSRRB), RIKEN cell bank (RIKEN), ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures), DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 로부터 입수한 것을 사용하였다. 구체적으로는, 이하에 열거한 바와 같다.
huH-1 (HSRRB), HUH-6 (HSRRB), HuH-7 (HSRRB), JHH-5 (HSRRB), JHH-6 (HSRRB), JHH-7 (HSRRB), HLE (HSRRB), HLF (HSRRB), HepG2 (HSRRB), Alexander (HSRRB), KP-1N (HSRRB), KP-1NL (HSRRB), KP-2 (HSRRB), KP-3 (HSRRB), KP-3L (HSRRB), PK-1 (RIKEN), PANC-1 (RIKEN), MIA PaCa-2 (HSRRB), PK-59 (RIKEN), PK-45H (RIKEN), PK-45P (RIKEN), BxPC-3 (ATCC), SUIT-2 (HSRRB), TCC-PAN2 (HSRRB), SW480 (ATCC), DLD-1 (HSRRB), LoVo (HSRRB), COLO-320 (RIKEN), CACO-2 (RIKEN), CW-2 (RIKEN), HCT 116 (ATCC), HCC-56 (HSRRB), MCF-7 (HSRRB), JIMT-1 (DSMZ), HCC1143 (ATCC), A549 (HSRRB), DU145 (RIKEN), PC-3 (HSRRB)
암 세포는 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 박리하고, 세포 현탁액 (세포 밀도 2 × 106 cells/㎖) 을 조제하였다. 세포 현탁액 100 ㎕ 에 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 첨가하고 (0.1 ㎍), 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. PBS 로 세정 후, PE 표지 항마우스 IgG (BD 파민겐) (0.1 ㎍) 와 반응 (4 ℃, 30 분) 시킨 후, FACSCalibur (벡톤 딕킨손) 에 의해 해석하였다.
제작한 항 hTROP-2 항체는 모두 내재적으로 hTROP-2 를 발현하고 있지 않은 인간 간암 세포주 HuH-7 과는 결합하지 않고, 한편 hTROP-2 유전자를 발현시킨 안정 세포주인 HuH-7-hTROP-2 세포에는 결합을 나타냈다 (도 2). 다음으로, 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암 세포주 (내재적으로 세포 표면에 발현하고 있는 hTROP-2 단백질) 와의 반응성을 FACS 해석에 의해 검토한 결과, 제작한 300 종류의 항 hTROP-2 모노클로날 항체는, 모두, 인간 췌장암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 와의 결합을 나타내고, 특히, in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸, K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는, PE 표지 항마우스 IgG (BD 파민겐) 와만 반응시킨 경우와 비교하여, PK-59 세포에서는, 평균 형광 강도로 K5-70 (44 배), T6-16 (59 배), K5-107 (89 배), K5-116-2-1 (122 배), T5-86 (15 배) (도 3), BxPC-3 세포에서는, K5-70 (45 배), T6-16 (25 배), K5-107 (90 배), K5-116-2-1 (121 배), T5-86 (10 배) 로, 모든 항체가 높은 결합을 나타냈다 (도 4).
PK-59 와 BxPC-3 이외의 인간 암 세포주에서는, 췌장암 세포주 12 종류 중, KP-2, KP-3L, PK-1, PK-45H, SUIT-2, TCC-PAN2 에 결합하고, KP-1N, KP-1NL, KP-3, PANC-1, MIA-PaCa2 에는 결합하지 않았다 (도 5). 인간 대장암 세포주에서는, CACO-2, SW480, DLD-1, HCT 116 에 결합하고, COLO-320, CW-2 에는 결합하지 않았다 (도 6). 그 외에, JIMT-1, HCC1143 (모두 인간 유방암 세포주), PC-3, DU145 (모두 인간 전립선암 세포주) 와 결합하여, 대부분의 인간 암 세포주의 세포 표면에 내재적으로 발현하고 있는 hTROP-2 단백질을 인식하였다 (도 6).
[실시예 12]
[마우스 TROP-2 단백질, 인간 TROP-1/EpCAM 단백질과의 교차 반응성]
제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 특이성을 조사할 목적으로, hTROP-2 단백질과 아미노산 배열로 80 ％ 의 상동성을 나타내는 마우스 TROP-2 단백질, hTROP-2 단백질과 아미노산 배열로 50 ％ 의 상동성을 나타내는 인간 TROP-1/EpCAM 과의 반응성을 FACS 해석으로 실시하였다.
구체적으로는, 마우스 TROP-2 유전자 (GenBank accession No. NM_020047, Y08830) 의 전체 길이 cDNA 를 포함하는 발현 벡터 (마우스 TROP-2-pcDNA3.1 (+), 토쿄 대학·분자 세포 생물학 연구소에서 공여), 및 인간 TROP-1/EpCAM 유전자 (GenBank accession No. NM_002354) 의 전체 길이 cDNA 를 포함하는 발현 벡터 (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His) 를, 각각 Lipofectamine2000 시약 (Invitrogen) 을 이용하여, 일과성으로 CHO-K1 세포에 유전자 도입을 실시하고, 24 ∼ 48 시간 후에 세포를 트립신 처리로 배양 접시로부터 박리하여 세포 현탁액을 조정하고, 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (0.1 ㎍), PE 표지 항마우스 IgG 와 순차 반응시킨 후, FACSCalibur 에 의해 해석하였다.
마우스 TROP-2 유전자를 일과성으로 발현시킨 CHO-K1 세포에 있어서, 양성 대조로서 사용한 마우스 TROP-2 와 교차 반응을 나타내는 T2-102 항체 (마우스 IgG1) 는 강한 결합을 나타내고, 한편, K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 마우스 TROP-2 와의 교차 반응은 나타내지 않았다 (도 7).
동일하게, 인간 EpCAM/TROP-1 유전자를 일과성으로 발현시킨 CHO-K1 세포에 있어서, 양성 대조로서 사용한 항인간 EpCAM 모노클로날 항체 (BD 파민겐) 는 강한 결합을 나타내고, 한편, K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 인간 EpCAM/TROP-1 과의 교차 반응은 나타내지 않았다 (도 8).
이상의 결과는 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 나타낸 K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 항체는 hTROP-2 에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
[실시예 13]
[세포 증식 저해 활성의 측정]
항 hTROP-2 모노클로날 항체의 hTROP-2 의 기능 저해를 조사하는 방법의 1 개로서, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하고 있는 인간 암 세포의 세포 증식에 대한 영향을, 테트라컬러 원 (세이카가쿠 공업) 을 사용한 생세포 수의 측정에 기초하여 평가하였다. 구체적으로는, PK-59 세포를 0.5 ％ 의 소 태아 혈청 (BioWest 사 제조) 을 포함하는 RPMI1640 배지에 2 × 105 세포/㎖ 의 세포 농도가 되도록 세포 현탁액을 조제하고, 96 구멍 배양 플레이트에 100 ㎕ 씩 파종하였다. 이어서, 마우스 IgG (음성 컨트롤), 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (최종 농도 0.1, 1 ㎍/㎖) 를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터로 72 시간 배양하였다. 비교 대조로서, 시판되는 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론 YY01, Santa Cruz) 를 사용하였다. 세포에 테트라컬러 원 (세이카가쿠 공업) 을 첨가하고, 5 ％ CO2 인큐베이터로 1 ∼ 2 시간 반응시켰다. 반응 후의 96 구멍 플레이트를, 그대로 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 파장 490 ㎚ (대조 파장 : 655 ㎚) 의 흡광도를 측정하였다. 각 군 3 웰로 실시하여, Student's t 검정 (Student's t-test) 으로 유의차 검정을 실시하고, P < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
지금까지 자사에서 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 중, 약 160 클론에 대하여, 상기의 방법으로 PK-59 세포의 세포 증식에 주는 효과를 조사한 결과, in vivo 에서 종양 성장 저해 활성을 나타낸, T6-16, T5-86, K5-70, K5-107 은, 마우스 IgG (음성 컨트롤) 와 비교하여, 20 ％ ∼ 40 ％ 의 세포 증식 저해 활성이 확인되고, 이들 항 hTROP-2 항체는, 인간 암 세포 표면에 발현하는 hTROP-2 단백질에 결합하고, hTROP-2 단백질의 기능을 중화하여, 암 세포의 증식을 저해하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다 (도 9).
[실시예 14]
[스크래치 어세이]
항 hTROP-2 모노클로날 항체의 인간 암 세포의 이동능을 스크래치 어세이로 평가하였다. PK-59 세포를 10 ％ 의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 3 × 105 cell/㎖ 의 세포 농도가 되도록 세포 현탁액을 조제하고, 96 구멍 배양 플레이트에 100 ㎕ 씩 파종하였다. 세포가 콘플루언트에 이른 단계에서, 칩의 선단에서 세로로 선을 긋듯이 하여 단층 배양한 세포의 일부를 박리하였다. 항 hTROP-2 모노클로날 항체, 및 음성 컨트롤로서 마우스 IgG 를 최종 농도가 0.1, 및 1 ㎍/㎖ 가 되도록 배지에 첨가하고, 24 시간 배양을 실시하여, 항체 첨가 전 (Day 0) 과 24 시간 배양 후 (Day 1) 의 박리한 영역의 사진을 촬영하고, 세포간 거리를 측정하였다. 또한, 박리 영역의 면적을 Scion Image 소프트웨어로 정량화하였다. 각 군 8 웰로 실시하여, Student's t-test 로 유의차 검정을 실시하고, P < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
스크래치 영역에 침윤하는 세포의 운동능에 대한 hTROP-2 항체의 효과를 조사하였다. 세포 증식 저해 어세이와 동일하게 약효가 있었던 항체를 평가하였다. 평가 방법으로서, Day 0 (항체 첨가시) 및 Day 1 (24 시간 경과 후) 의 세포를 촬영하여, 이동 거리 (㎛) 및, 스크래치 영역의 면적을 화상 해석하였다. 결과, 도 10 에 나타내는 바와 같이, 세포의 운동능에 분명한 차이를 볼 수 있었다. 본 시험에 사용한 T6-16 및 K5-70 은 컨트롤과 비교하여, 어느 쪽도 유의한 증식 저해를 볼 수 있고, 재현성 시험에 있어서도 동일한 경향을 확인할 수 있었다. 특히 T6-16 에 대해서는 P < 0.01 (by Student's t-test) 로, in vivo 의 시험과의 상관성이 확인되었다.
[실시예 15]
[담암 마우스에서의 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 약효 평가]
prevention 모델
hTROP-2 를 발현하는 췌장암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 를 트립신 처리로 박리하고, PBS 로 1 × 108 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하여, 빙상에서 등량의 마트리겔 (BD 파민겐) 과 혼합하였다. 6 주령의 암컷의 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리의 피하에 26 G 의 시린지를 이용하여 100 ㎕ (5 × 106 cell) 주사하였다. 암 세포 이식 당일 (Day 1) 에, 마우스를 군 분류하고, 항체의 투여 (1, 5, 또는 10 ㎎/㎏ 체중, 복강 내 투여) 를 개시하였다. 이후에는, 3 일에 1 회의 간격으로 동일한 투여를 실시하였다. 항종양 활성은 종양 형성 빈도 및 종양 체적에 의해 평가하였다. 종양 체적의 계측은 이하의 계산식을 사용하였다.
종양 체적 (㎣) = (단경)2 × (장경) × π/6
treatment 모델
hTROP-2 를 발현하는 췌장암 세포주 (PK-59, BxPC-3) 를 트립신 처리로 박리하고, PBS 로 1 × 108 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하여, 빙상에서 등량의 마트리겔 (BD 파민겐) 과 혼합하였다. 6 주령의 암컷의 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 오른쪽 옆구리의 피하에 26 G 의 시린지를 이용하여 100 ㎕ (5 × 106 cells) 주사하였다. 암 세포 이식으로부터 5 ∼ 6 일 후, 종양 체적이 50 ∼ 150 ㎣ (평균치로 약 100 ㎣) 로 성장한 마우스를 군 분류하고, 군 분류한 당일을 1 일째 (Day 1) 로 하여 항체 투여를 개시하였다. 항체는 3 일에 1 회의 간격으로 복강 내 투여를 실시하였다 (10 ㎎/㎏ 체중). 항종양 활성은 종양 체적을 계측함으로써 평가하였다. 유의차 검정은 Student's t-test 로 실시하여, P < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
[실시예 16]
[인간 췌장암 세포 xenograft 모델에 있어서의 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성의 검토]
hTROP-2 를 표적으로 한 암 치료용 항체는, xenograft treatment 모델에 있어서, hTROP-2 를 발현하는 종양 조직을 특이적으로 사멸시키거나, 종양의 성장을 저해하는 활성을 나타내는 것이 필수이다.
본 발명에 있어서 새롭게 제작한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 (약 160 클론) 를, 췌장암 세포주 PK-59 세포의 xenograft treatment 모델로 평가하였다. PK-59 세포는 췌장암 줄기세포 마커인 EpCAM 을 발현하고 (도 11A) (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007 ; 67 : (3). 1030-1037), 약제 내성에 관련되는 ABC 트랜스포터인 P-glycoprotein/MDR1 (도 11B), ABCG2/CDw338 (도 11C) 을 세포 표면에 발현하고 있다 (Chen, C. J. et al. Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R., et al. Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996). 또한, 췌장암 줄기세포의 특징인 CD24 와 CD44 공양성의 세포 획분 (8.93 ％) (도 11D) 을 포함하여, 악성도가 높은 인간 췌장암 세포주인 것으로 추측된다 (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007 ; 67 : (3). 1030-1037, Jane E. Visvader and Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cancer. Vol.8 (10) : 755-68, 2008).
신규로 제작한 약 160 클론 중, 대부분의 클론은 PK-59 세포 xenograft treatment 모델에서는 약효를 나타내지 않았지만, 그 중에서도 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 이하의 클론, 즉 클론 K5-70, T6-16, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 이 얻어졌다.
클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 투여군에서는, 종양 성장 속도가 통계적으로 유의하게 저해되고, 투여 개시 후 21 일째 (Day 21) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 14) 의 종양 체적이 1200.8 ± 377.3 ㎣ 에 대하여, 클론 K5-70 투여군에서는 748.7 ± 175.0 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 12A). 항체 투여 개시 시점에서의 종양 체적을 1.0 으로 했을 때의, 21 일째 (Day 21) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 12.5 인 데에 반하여, 클론 K5-70 투여군에서는 7.8 이었다 (도 12A). 적출한 종양 중량도, 컨트롤군이 0.73 ± 0.26 g 이었던 데에 반하여, 클론 K5-70 투여군에서는 0.43 ± 0.14 g (P < 0.01 by Student's t-test) 로, 약 60 ％ 의 저해를 나타냈다 (도 12B).
동일하게, 클론 K5-107 (마우스 IgG1) 투여군 (N = 8), 클론 T6-16 (마우스 IgG2a) 투여군 (N = 8), 클론 T5-86 (마우스 IgG1) 및 클론 K5-116-2-1 (마우스 IgG2a) 투여군 (N = 8) 에서도, 종양 성장 속도가 통계적으로 유의하게 저해되었다. 클론 K5-107 투여군 (N = 8) 그리고 클론 T6-16 투여군 (N = 8) 에서는, 투여 개시 후 17 일째 (Day 17) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1039.3 ± 271.6 ㎣ 에 대하여, 각각 698.2 ± 175.9 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test), 707.2 ± 254.5 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 였다. 동일하게, 클론 K5-116-2-1 투여군 (N = 8) 에서는, 투여 개시 후 16 일째 (Day 16) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 797.0 ± 172.9 ㎣ 에 대하여, 508.5 ± 225.2 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 였다 (도 13).
한편, 클론 T5-86 에 대해서는, 투여 개시 후 15 일째 (Day 15) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1033.2 ± 319.4 ㎣ 에 대하여, 클론 T5-86 투여군 (N = 8) 에서는 744.1 ± 289.1 ㎣ 로, 종양 체적의 비교에서는 유의차는 없었지만, 동일한 날에 있어서의 종양 중량의 비교에서는, 컨트롤군이 0.62 ± 0.14 g 이었던 데에 반하여, 클론 T5-86 투여군에서는 0.44 ± 0.13 g (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 유의한 저해가 나타났다.
또한, 하기 표 2 에, 각 클론 항체 투여군의 실험 최종일에 있어서의 컨트롤군과의 비율 (T/C) 을, 종양 체적 및 종양 중량의 각각에 대하여 나타냈다. 표 2 에 나타낸 바와 같이, 각 클론 항체 투여군에 있어서, 각각 T/C = 62 ∼ 72 ％ 의 유의한 저해가 얻어졌다.
Figure 112014054930572-pct00004
또한, 클론 K5-70, 클론 T6-16, 클론 K5-116-2-1 에 대하여, 각각 췌장암 세포주 PK-59 세포의 xenograft prevention 모델에서의 항종양 활성을 검토하였다. 각각의 클론에 있어서, 항체 투여 후 모든 개체에서 (N = 8) 종양 성장이 저해되고, 클론 K5-70 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 18 일째 (Day 18) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 880.8 ± 206.4 ㎣ 에 대하여, 62.4 ± 80.4 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 92.9 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타내고, 클론 T6-16 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 28 일째 (Day 28) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 992.3 ± 250.8 ㎣ 에 대하여, 152.14 ± 122.3 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 84.6 ％ 의 종양 성장 저해 활성, 클론 K5-116-2-1 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 클론 K5-116-2-1 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 투여 개시 후 20 일째 (Day 20) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 1159.4 ± 413.3 ㎣ 에 대하여, 207.7 ± 319.2 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 82.1 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타냈다 (도 14, 표 3). 또한, 모든 실험에 있어서, 시험 기간을 통하여, 컨트롤군과 항 hTROP-2 항체 투여군 사이에, 평균 체중의 변화에 유의한 차는 없었다.
하기 표 3 에, 각 클론 항체 투여군의, 실험 최종일에 있어서의 컨트롤군과의 비율 (T/C) 을, 종양 체적 및 종양 중량 각각에 대하여 나타냈다. 표 3 에 나타낸 바와 같이, 각 클론 항체 투여군에 있어서, 유의한 종양 성장 저해를 볼 수 있고, 특히 클론 K5-70 투여군에서는, T/C = 10 ％ 이하의 현저한 효과가 확인되었다.
Figure 112014054930572-pct00005
공지된 항 TROP-2 항체 AR47A6.4.2 (미국 특허 제7420041호) 는, 다양한 인간 암 세포주를 사용한 20 ㎎/㎏ 의 투여량에서, xenograft prevention 모델로 종양 성장 저해 효과를 나타내고 있는데, 인간 췌장암 세포주 PL45 세포에서는, 대략 100 ％ 의 종양 성장을 저해하고 있지만, 췌장암 세포주 BxPC-3 에서는 약 50 ％, 전립선암 세포주 PC-3 에서는 약 40 ％, 유방암 세포주인 MCF-7 에서는 약 60 ％, 대장암 세포주 Colo205 에서 약 40 ％ 의 종양 성장 저해 효과였던 데에 반하여, 본원 발명의 항 hTROP-2 항체는, 절반의 투여량 (10 ㎎/㎏ 체중) 으로, 보다 강한 종양 성장 저해 효과를 발휘하였다.
[실시예 17]
[인간 췌장암 세포주 BxPC-3 세포의 xenograft 모델 (prevention 모델 및 treatment 모델) 에 있어서의 항종양 활성의 검토]
상기의 인간 췌장암 세포주 PK-59 세포의 xenograft treatment 모델을 사용한 경우와 동일하게, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3 세포의 xenograft prevention 모델 및 xenograft treatment 모델에서의 항종양 활성을, 클론 K5-70 에 대하여 검토하였다.
클론 K5-70 투여군 (N = 8) 에서는, 컨트롤군 (N = 8) 과 비교하여, 종양 성장이 유의하게 저해되고, 52 일째 (Day 52) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8) 의 종양 체적이 616.3 ± 266.8 ㎣ 였던 데에 반하여, 클론 K5-70 투여군 (N = 8) 에서는 236.0 ± 136.4 ㎣ 로 61.7 ％ 의 종양 성장 저해 효과를 나타냈다 (P < 0.01 by Student's t-test) (도 15).
이상의 결과로부터, 항 hTROP-2 모노클로날 항체는, 적어도 2 개 이상의 복수의 암 세포종에 대하여, in vivo 에서의 유의한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[실시예 18]
[항 hTROP2 항체 (클론 K5-70) 의, hTROP2 발현 췌장암 세포주 (PK-59 세포) xenograft prevention 모델에 있어서의 용량 의존적인 항종양 활성]
항 hTROP-2 항체의 in vivo 에 있어서의 종양 성장 저해 활성을, 보다 상세하게 검토할 목적으로 용량 의존성 시험을 실시하였다. 도 16 에 나타낸 바와 같이, PK-59 세포의 종양의 성장은 K5-70 항체의 투여에 의해 용량 의존적으로 저해되고, 항체 투여 후 21 일째 (Day 21) 에 있어서, 컨트롤군 (N = 8 의 종양 체적이 937.8 ± 295.3 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 (1 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8) 이 493.5 ± 305.1 ㎣ 로 50 ％ 의 저해율을 나타내고, K5-70 항체 (5 ㎎/㎏ 체중) 투여군 (N = 8) 이 124.7 ± 89.0 ㎣ 로 90 ％ 의 저해 효과를 나타내어, 공지된 항 TROP-2 항체 AR47A6.4.2 (미국 특허 제7420041호) 와 비교하여, 20 분의 1 의 투여량으로 대략 동등한 in vivo 에 있어서의 종양 성장 저해 효과를 나타내고, 4 분의 1 의 투여량에서는, 보다 높은 90 ％ 의 저해 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
[실시예 19]
[에피토프 어세이]
인간/마우스 키메라 TROP -2 단백질의 제작
인간/마우스 키메라 TROP-2 유전자는 PCR 법을 이용하여 제작하였다. 인간 TROP-2 유전자 배열 및 마우스 TROP-2 유전자 배열 (Genbank accession No. NM_020047) 을 기초로 이하에 나타내는 PCR 프라이머를 설계하였다.
인간/마우스 TROP-2-C 프라이머
Y606 (포워드측) : 5'-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3' (배열 번호 10)
Y607 (리버스측) : 5'-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3' (배열 번호 11)
인간/마우스 TROP-2-A 프라이머
Y612 (포워드측) : 5'-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3' (배열 번호 12)
Y613 (리버스측) : 5'-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3' (배열 번호 13)
인간/마우스 TROP-2-B 프라이머
Y614 (포워드측) : 5'-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3' (배열 번호 14)
Y615 (리버스측) : 5'-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3' (배열 번호 15)
마우스/인간 TROP-2-D 프라이머
Y608 (포워드측) : 5'-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3' (배열 번호 16)
Y609 (리버스측) : 5'-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3' (배열 번호 17)
마우스/인간 TROP-2-E 프라이머
Y616 (포워드측) : 5'-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3' (배열 번호 18)
Y617 (리버스측) : 5'-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3' (배열 번호 19)
마우스/인간 TROP-2-F 프라이머
Y618 (포워드측) : 5'-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3' (배열 번호 20)
Y619 (리버스측) : 5'-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3' (배열 번호 21)
마우스 TROP-2 프라이머
포워드측 : 5-ctactccaccccaccctggcg-3' (배열 번호 22)
리버스측 : 5'-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3' (배열 번호 23)
마우스 TROP-2 리버스측 프라이머에는 스톱 코돈을 제외하고, Xho I 에 의한 제한 효소 소화 배열을 부가하였다. 제작한 인간/마우스 키메라 TROP-2 단백질의 모식도를 도 17 에 나타낸다.
hmTROP-2-A 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단으로부터 69 번째까지의 폴리펩타이드와 마우스 TROP-2 단백질의 64 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다. hmTROP2-B 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단부터 101 번째까지의 폴리펩타이드와 마우스 TROP-2 단백질의 96 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다. hmTROP2-C 키메라 단백질은 hTROP-2 단백질의 N 말단부터 145 번째까지의 폴리펩타이드와 마우스 TROP-2 단백질의 140 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-D 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단부터 139 번째까지의 폴리펩타이드와 hTROP-2 단백질의 146 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-E 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단부터 187 번째까지의 폴리펩타이드와 hTROP-2 단백질의 194 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다. mhTROP-2-F 키메라 단백질은 마우스 TROP-2 단백질의 N 말단부터 227 번째까지의 폴리펩타이드와 hTROP-2 단백질의 234 번째부터 C 말단까지의 폴리펩타이드로 이루어지는 키메라 단백질이다.
상기 키메라 단백질을 제작하기 위한 발현 벡터는 구체적으로는 이하의 방법으로 구축하였다. hmTROP-2-A 키메라 유전자를 제작하기 위하여 hTROP-2 유전자를 주형으로 하여, hTROP-2 포워드측 프라이머 및 인간/마우스 TROP-2-A 프라이머 Y613 을 이용하여 PCR 을 실시하였다. 동일하게 마우스 TROP-2 유전자를 주형으로 하여, 인간/마우스 TROP-2-A 프라이머 Y612 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 에 의해 증폭한 DNA 단편은 아크릴아미드 겔을 이용하여 전개, 목적 밴드의 추출에 의해 회수하였다. 다음으로 추출한 2 종류의 DNA 단편을 혼합하여 주형으로 하고, hTROP-2 포워드측 프라이머 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시하였다. PCR 산물은 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 전개하고, 목적으로 하는 DNA 단편을 추출하였다. 추출한 DNA 단편은 pCR (등록상표)-Blunt 벡터 (Invitrogen) 에 클로닝하고 (pCRB-hmTROP-2-A), 유전자 배열을 확인하였다. 동물 세포용 발현 벡터는 pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His 로부터 Eco RI/Xho I 소화에 의해 hTROP-2 유전자를 제거하고, pCRB-hmTROP-2-A 로부터 조제한 hmTROP-2-A 키메라 유전자를 포함하는 Eco RI/Xho I 단편을 삽입함으로써 제작하였다 (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). 그 외에 hmTROP-2-B (인간 TROP-2 포워드측 프라이머, 인간/마우스 TROP-2-B 프라이머 Y615, 인간/마우스 TROP-2-B 프라이머 Y614 및 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), hmTROP-2-C (인간 TROP-2 포워드측 프라이머, 인간/마우스 TROP-2-C 프라이머 Y607 및 인간/마우스 TROP-2-C 프라이머 Y606, 마우스 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-D (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-D 프라이머 Y609 및 마우스/인간 TROP-2-D 프라이머 Y608, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-E (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-E 프라이머 Y617 및 마우스/인간 TROP-2-E 프라이머 Y616, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용), mhTROP-2-F (마우스 TROP-2 포워드측 프라이머, 마우스/인간 TROP-2-F 프라이머 Y619 및 마우스/인간 TROP-2-F 프라이머 Y618, 인간 TROP-2 리버스측 프라이머를 사용) 에 대해서도 동일한 방법으로 키메라 유전자를 제작하여, 발현 벡터를 구축하였다 (pcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-E-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-F-myc/His).
hTROP -2, 인간/마우스 키메라 TROP -2-C, 및 마우스/인간 키메라 TROP -2-D 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포주의 수립
HEK293 세포주에 상기 발현 벡터 pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His 및 pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His 를 각각 유전자 도입하였다. 항생 물질 G418 (Calbiochem) 에 의한 선택을 실시하여, hTROP-2 단백질, hmTROP-2-C 키메라 단백질 및 mhTROP-2-D 키메라 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포주를 수립하였다.
췌장암 세포주 PK-59 를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서, 약효를 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체 K5-70, T5-86, K5-107, T6-4, T6-16 및 K5-116-2-1 에 대하여 결합 영역의 동정을 실시하였다. 먼저 hmTROP-2-C, mhTROP-2-D, 각각의 키메라 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK293 세포를 이용하여, 약효를 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 반응성을 FACS 해석에 의해 검토하였다 (도 18). 그 결과, K5-70, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 항체는 hmTROP-2-C 와 반응하였지만 mhTROP-2-D 와는 반응하지 않았다. 한편, T6-4 및 T6-16 항체는 mhTROP-2-D 와 반응하였지만 hmTROP-2-C 와는 반응하지 않았다. 이들 점에서 K5-70, K5-107, T5-84 및 K5-116-2-1 항체의 결합 영역은 hTROP-2 의 N 말단부터 145 번째의 아미노산까지의 영역, T6-4 및 T6-16 항체의 결합 영역은 hTROP-2 의 146 번째의 아미노산부터 C 말단까지의 영역에 한정되었다 (도 18).
더욱 상세하게 결합 영역의 해석을 실시하기 위하여, hmTROP-2-A, hmTROP-2-B, mhTROP-2-E 및 mhTROP-2-F 키메라 단백질 발현용 벡터를 제작하여, 약효를 나타내는 항 hTROP-2 모노클로날 항체와의 반응성을 검토하였다 (도 19). 새롭게 제작한 키메라 단백 발현용 벡터를 HEK293 세포에 유전자 도입하고, 일과성으로 발현시킨 세포를 이용하여 FACS 해석을 실시하였다. K5-70, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 항체는 hmTROP-2-A 와는 반응하였지만 mhTROP-2-B 와는 반응하지 않았다. 조사한 6 종류의 모노클로날 항체는 모두 hTROP-2 와는 반응을 나타냈다. 이 점에서 K5-70, K5-107, T5-86 및 K5-116-2-1 항체의 결합 영역은 hTROP-2 의 N 말단부터 69 번째의 아미노산까지의 영역에 존재하는 것이 분명해졌다. 또한 T6-4 및 T6-16 항체는 mhTROP-2-E, mhTROP-2-F 모두 반응하지 않은 점에서, hTROP-2 의 146 번째부터 193 번째의 아미노산까지의 영역을 인식하는 것이 시사되었다.
[실시예 20]
[면역 조직 화학]
＜재료·방법＞
면역 조직 염색에 사용한 정상 및 암 조직 어레이는 이하와 같다.
인간 정상 조직 어레이 :
Human, Normal organs in duplicates (Catalog No. : AB1, Super Bio Chips)
Normal tissues more than single spots (Catalog No. : A103 (VI), ISU ABXIS)
폐암 조직 어레이 :
Human Lung cancer-metastasis-normal (Catalog No. : CCA3, Super Bio Chips)
Human lung carcinoma tissue with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-RsLug03-002, Shanghai Outdo Biotech)
췌장암 조직 어레이 :
Human Pancreas carcinoma tissue with mono-pathological type from 60 cases, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgPan03-001, Shanghai Outdo Biotech)
간암 조직 어레이 :
Hepatocellular carcinoma, grade I ∼ III with normal tissue controls, 63 cases tissue arrays (Catalog No. : CS03-01-002U, Cybrdi)
Human liver carcinoma tissue with mono-pathological type from 30 cases, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech)
대장암 조직 어레이 :
Human, Colorectal cancer (Catalog No. : CD3, Super Bio Chips)
Human colon carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgCol03-002, Shanghai Outdo Biotech)
대장암 림프절 전이, 간 전이 조직 어레이 :
Colorectal (colon and rectum) cancer with matched lymph node metastasis tissue array, 44 cases/99 cores, trial slide (Catalog No. : CO991t, Biomax us)
Colorectal (colon and rectum) cancer with matched lymph node metastasis and normal adjacent tissue array, 43 cases/99 cores (Catalog No. : CO992, Biomax us)
Colon cancer tissues_liver metastasis (Catalog No. : A203(IV), ISU ABXIS)
유방암 조직 어레이 :
Human, Breast cancer-metastasis-normal (Catalog No. : CBA3, Super Bio Chips)
Human breast carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-RpBre03-002, Shanghai Outdo Biotech)
위암 조직 어레이 :
Human, Stomach cancer (Catalog No. : CQ1, Super Bio Chips)
Human gastric carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech)
식도암 조직 어레이 :
Human, Esophagus cancer (Catalog No. : CR1, Super Bio Chips)
Human esophagus carcinoma with margin tissue, 2 location cores (Catalog No. : OD-CT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech)
난소암 조직 어레이 :
Human, Ovary cancer (Catalog No. : CJ1, Super Bio Chips)
전립선암 조직 어레이 :
Human, Prostate cancer-normal (Catalog No. : CA3, Super Bio Chips)
방광암 조직 어레이 :
Bladder carcinoma/transitional cell carcinoma, grade I ∼ III with normal tissue arrays (Catalog No. : CC12-01-001U, Cybrdi)
상기 조직 어레이의 환자 정보 및 임상 정보는 첨부한 데이터 시트 및 각사의 홈 페이지로부터 입수하였다.
면역 조직 염색법
인간 정상 조직 및 암 조직의 조직 어레이 파라핀 절편은, 탈파라핀 처리 후, 37 ℃ 에서 5 분간 펩신에 의한 프로테아제 처리를 실시하여, 항 hTROP-2 모노클로날 항체를 사용한 면역 염색에 사용하였다. DAB (3,3'-디아미노벤지딘) 를 기질로 하여 발색 반응을 실시한 후, 대비 염색으로서 헤마톡실린에 의한 핵 염색을 실시하였다.
이들 조작은 보다 구체적으로는 다음과 같이 하여 실시하였다. 파라핀 포매된 절편을 탈파라핀 처리한 후, 37 ℃ 에서 5 분간 펩신 (DAKO) 에 의한 프로테아제 처리를 실시하였다. 항원 부활화 후, 메탄올에 최종 농도 0.3 ％ 가 되도록 과산화수소수를 첨가한 용액에 의해, 실온에서 20 분간 처리하여 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 제거하였다. PBS 로 실온 5 분간의 세정을 2 회 실시한 후, 1.5 ％ 의 정상 말 혈청 (DAKO) 을 포함하는 PBS 용액을 이용하여 실온 30 분간의 블로킹을 실시하여, 조직 중의 비특이적 결합 부위를 막는 조작을 실시하였다. 다음으로 1.5 ％ 의 정상 말 혈청을 포함하는 PBS 용액에 의해 희석한 항 hTROP-2 모노클로날 항체 clone K5-63-17 (최종 농도 10 ㎍/㎖) 을 실온에서 1 시간 반응시킨 후, PBS 로 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시하고, 계속해서 1.5 ％ 의 정상 말 혈청을 포함하는 PBS 용액에 의해 200 배로 희석한 비오틴화 항마우스 IgG 항체 (Vector) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 에 의한 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시한 후, Vectastain ABC 키트 (Vector) 의 시약을 설명서대로 혼합하고 ABC 컴플렉스를 만들어, 이것을 실온에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 실온 5 분간의 세정을 3 회 실시한 후, 히스토파인 퍼옥시다아제 기질 심플 스테인 DAB 용액 (니치레이 바이오사이언스) 에 의해 발색을 실시하였다. 발색을 확인한 후, 탈이온수로 5 분간 세정하고, 마이어 헤마톡실린 용액 (와코 쥰야쿠) 에 의해 핵을 염색하고, 그 후 알코올로 탈수, 자일렌으로 투철하여 엔텔란 뉴 (메르크·재팬 주식회사) 로 봉입하였다.
＜결과＞
인간 정상 조직에 있어서의 hTROP - 2 의 발현
인간 정상 조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현 패턴에 대하여, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여 해석하였다. 인간 정상 조직 어레이 (Catalog No. : AB1, Super Bio Chips) 를 탈파라핀, 친수화 처리를 실시한 후, 단백질 분해 효소 펩신에 의한 항원의 부활화를 실시하고, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 로 면역 염색을 실시하였다 (도 20). 그 결과, 피부, 식도, 신장 (피질 및 수질), 췌장, 전립선, 방광, 편도선에서 염색을 볼 수 있었다. 대부분의 염색 이미지는 세포막에 대한 국재를 나타내고 있었지만 (도 20A, B, C, D, F, G, H), 일부 세포질에도 발현을 볼 수 있었다 (도 20. E, H). 한편, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 골격근, 폐, 비장, 흉선 등에서는 염색되지 않았다 (도 20. I, J).
인간 암 조직에 있어서의 hTROP - 2 의 발현
인간 암 조직에 있어서의 hTROP-2 의 발현 (hTROP-2 의 양성률) 을 조사하기 위하여, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-63-17 을 이용하여, 인간의 각 암종의 암 조직 어레이의 면역 염색을 실시하였다. 암 세포의 10 ％ 이상이 염색되는 조직 절편을 hTROP-2 양성으로 하였다. 이 염색 결과를 표 4 에 나타냈다.
Figure 112014054930572-pct00006
또한, 대표적인 염색 이미지를 도 21 에 나타냈다. hTROP-2 의 발현을 검토한 암종에서는, 전립선암에서 가장 양성률이 높고 (92.1 ％), 폐암 (65.4 ％), 식도암 (76.7 ％), 방광암 (71.2 ％) 등으로 높은 양성률이었다. 가장 양성률이 낮았던 것은 간암으로 7.61 ％ 였다. 암 세포에서도 정상 세포와 마찬가지로, hTROP-2 는 세포막에 강하게 국재하고 있는 염색 이미지를 볼 수 있었다 (도 21. A ∼ F, H, I). 또한 일부는 세포질에도 발현하고 있었다 (도 21. A, B, E, G).
췌장암에서의 hTROP-2 의 양성률은 41.9 ％ 였다. 이 때의 hTROP-2 양성률과 췌장암의 그레이드 (분화도) 의 관계에 대하여 검토하였다. 그 결과, 그레이드가 높은, 즉 저분화 췌장암에서 고빈도로 발현하고 있었다 (표 5).
Figure 112014054930572-pct00007
[실시예 21]
[K5-70 항체의 단회 투여에 의한, 인간 췌장암 세포주 PK-59 xenograft prevention 모델에서의 항종양 효과]
클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 in vivo 에 있어서의 강한 항종양 활성은, 인간 췌장암 세포주 PK-59 를 사용한 xenograft prevention 모델에 있어서, 10 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 1 회 투여한 경우에 있어서도 나타났다. 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중, N = 3) 에서는, 모든 개체에 있어서 종양 형성이 관찰되고, 세포 이식 후 28 일째 (Day 28) 에 있어서의 종양 체적은 781.7 ± 74.5 ㎣ 였던 데에 반하여, 암 세포 이식일 (Day 1) 에 1 회 K5-70 항체를 투여한 군에서는 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 3), Day 28 에 있어서의 종양 체적은 144.4 ± 176.9 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로 81.5 ％ 의 종양 성장 저해 활성을 나타냈다 (도 22A). 종양 중량에 있어서는, Day 28 에 있어서 컨트롤군이 0.59 ± 0.06 g 이었던 데에 반하여, 클론 K5-70 항체 투여군에서는 0.07 ± 0.10 g (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 88 ％ 의 저해 활성을 나타냈다 (도 22B). 종양 체적, 종양 중량 중 어느 것에 있어서도, K5-70 항체 투여군에서는 3 개체 중 2 개체에서는, 1 회의 10 ㎎/㎏ 체중의 투여로, 완전하게 종양 형성이 저해되었다 (도 22C).
[실시예 22]
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 항 hTROP-2 모노클로날 항체의 항종양 활성]
항 hTROP-2 모노클로날 항체 (클론 K5-70, K5-116-2-1 및 T6-16) 의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 군 분류를 실시하고 (Day 7 또는 Day 10), Day 7 또는 Day 10 부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 개시하였다. 클론 K5-70 항체의 항종양 활성 평가와 클론 K5-116-2-1 항체 및 클론 T6-16 항체의 항종양 활성 평가는 각각 독립적인 시험으로 평가하였다. K5-70 항체의 항종양 활성 평가 시험에 있어서는, 암 세포 이식으로부터 44 일째 (Day 44) 에 있어서의 컨트롤군 (마우스 IgG (10 ㎎/㎏ 체중), N = 8) 의 종양 체적이 365.4 ± 214.6 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 (10 ㎎/㎏ 체중) 투여군에서는, 27.4 ± 29.4 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 현저하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 92.5 ％) (도 23A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.11 ± 0.07 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 0.005 ± 0.007 (g) (P < 0.01 by Student's t-test) 로 95.5 ％ 의 저해율이었다 (도 23B). 특히, K5-70 항체 투여군에서는 8 개체 중 2 개체에서는, 완전하게 종양 형성이 저해되어 종양을 확인할 수 없었다.
별도로 실시한 K5-116-2-1 항체 및 T6-16 항체의 항종양 활성 평가 시험에 있어서는, Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ (N = 8) 이었던 데에 반하여, K5-116-2-1 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 188.9 ± 97.4 ㎣ (N = 8, P < 0.01 by Student's t-test) (도 24A), T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중) 에서는, 292.8 ± 199.7 ㎣ (N = 8, P < 0.05 by Student's t-test) (도 25A) 로 각각 73.5 ％, 59.0 ％ 의 저해율이었다. 종양 중량에 대해서도 동일하게, 컨트롤군에서는 0.39 ± 0.19 g 이었던 데에 반하여, K5-116-2-1 항체 투여군, T6-16 항체 투여군에서는, 0.10 ± 0.07 g (P < 0.01 by Student's t-test), 0.17 ± 0.14 g (P < 0.05 by Student's t-test) 로 각각 72.2 ％, 56.4 ％ 의 저해율을 나타냈다 (도 24B, 도 25B).
[실시예 23]
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 클론 K5-70 의 용량 의존적인 항종양 활성]
다음으로, K5-70 항체의 용량 의존적인 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중 투여군, N = 8, 104.4 ± 17.6 ㎣), 1 ㎎/㎏ 체중의 K5-70 항체 투여군 (N = 8, 104.3 ± 16.1 ㎣), 5 ㎎/㎏ 체중의 K5-70 항체 투여군 (N = 8, 104.6 ± 15.9 ㎣), 10 ㎎/㎏ 체중의 K5-70 항체 투여군 (N = 8, 104.8 ± 14.9 ㎣) 으로 군 분류를 실시하고, 3 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시하였다. Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 용량 의존적인 종양 형성 저해 활성이 관찰되고, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 485.0 ± 207.3 ㎣ (저해율 32.1 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 339.5 ± 253.2 ㎣ (저해율 52.4 ％), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 355.4 ± 202.8 ㎣ (저해율 50.2 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 였다 (도 26A). 동일하게, Day 42 에 있어서의 종양 중량에 대해서는, 컨트롤군이 0.39 ± 0.19 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체의 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 0.24 ± 0.11 g (저해율 37.8 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 0.17 ± 0.14 g (저해율 55.8 ％, P < 0.05 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 0.20 ± 0.13 g (저해율 47.1 ％) 이 되어, 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (도 26B).
[실시예 24]
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 K5-70 항체의 투여 간격의 검토]
추가로, K5-70 항체의 지적 투여 간격을 검토하기 위하여, 주에 1 회 (7 일에 1 회) 투여를 실시했을 때의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG, 10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, 104.42 ± 15.1 ㎣), K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, 104.3 ± 16.1 ㎣) 으로 군 분류을 실시하고, 7 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시하였다. Day 42 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 713.8 ± 354.5 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군 (주 1 회 투여) 에서는, 332.3 ± 239.9 ㎣ (저해율 55 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 가 되었다 (도 27A). 또한, 투여 간격을 벌려 10 일에 1 회 및 2 주일에 1 회 투여한 경우, Day 39 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 956.9 ± 367.8 ㎣ 였던 데에 반하여, 10 일에 1 회의 K5-70 항체 투여군에서는, 525.4 ± 180.6 ㎣ (저해율 45.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 2 주일에 1 회의 K5-70 항체 투여군에서는 459.4 ± 217.6 ㎣ (저해율 52.0 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 가 되었다 (도 27B). 선행 기술 (US 7420040, US 7420041) 에서는, 췌장암 세포주 (BxPC-3) 를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서, 20 ㎎/㎏ 체중, 주에 3 회의 항체 투여 (투여 간격 2 일간) 로, 저해율 50 - 60 ％ 의 항종양 활성을 나타내고 있는 데에 반하여, K5-70 항체는 1 회의 투여량이 절반 (10 ㎎/㎏ 체중), 또한 2 주일에 1 회의 투여 (투여 간격 13 일간) 로, 선행 기술에 필적하는 항종양 활성을 나타냈다. 따라서 K50-70 항체는 적어도 선행 기술의 12 분의 1 의 총 투여량으로 현저한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[실시예 25]
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 T6-16 항체의 용량 의존적인 항종양 활성]
다음으로, T6-16 항체의 용량 의존적인 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG 10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, 105.8 ± 9.9 ㎣), 1 ㎎/㎏ 체중의 T6-16 항체 투여군 (N = 8, 104.4 ± 13.3 ㎣), 5 ㎎/㎏ 체중의 T6-16 항체 투여군 (N = 8, 104.7 ± 13.0 ㎣), 10 ㎎/㎏ 체중의 T6-16 항체 투여군 (N = 8, 104.8 ± 12.4 ㎣) 으로 군 분류을 실시하고, 3 일에 1 회의 복강 내 투여를 실시하였다. Day 43 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 473.5 ± 137.0 ㎣ 였던 데에 반하여, T6-16 항체 투여군에서는 용량 의존적인 종양 형성 저해 활성이 관찰되고, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 397.9 ± 97.5 ㎣ (저해율 16.0 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 195.9 ± 89.7 ㎣ (저해율 58.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 190.2 ± 56.5 ㎣ (저해율 59.8 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 28A). 동일하게, Day 43 에 있어서의 종양 중량은, 컨트롤군이 0.19 ± 0.07 g 이었던 데에 반하여, 1 ㎎/㎏ 체중의 T6-16 항체 투여군에서는, 0.20 ± 0.08 g, 5 ㎎/㎏ 체중의 투여군에서는, 0.08 ± 0.04 g (저해율 57.9 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중의 투여군에서는, 0.09 ± 0.04 g (저해율 52.6 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이 되어, 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다 (도 28B).
[실시예 26]
[인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 T6-16 항체의 투여 간격의 검토]
또한, T6-16 항체의 지적 투여 간격을 검토하기 위하여, 주에 1 회 (7 일에 1 회) 및 10 일에 1 회의 투여 간격에서의 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 6 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 컨트롤군 (마우스 IgG, 10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, 105.8 ± 9.9 ㎣), 주 1 회의 T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, 105.0 ± 11.6 ㎣), 10 일에 1 회의 T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 5, 130.8 ± 2.4 ㎣) 으로 군 분류를 실시하고, 투여를 개시하였다. Day 43 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 473.5 ± 137.0 ㎣ 였던 데에 반하여, 주 1 회의 T6-16 항체 투여군에서는, 243.7 ± 65.3 ㎣ (저해율 48.5 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 일에 1 회의 T6-16 항체 투여군에서는, 297.8 ± 54.4 ㎣ (저해율 37.1 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 가 되었다 (도 29). 선행 기술 (US 7420040, US 7420041) 이 췌장암 세포주 (BxPC-3) 를 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서, 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로, 주에 3 회 투여 (투여 간격 2 일간) 로, 저해율 50 - 60 ％ 의 항종양 활성을 나타내고 있는 데에 반하여, T6-16 항체는, 1 회의 투여량이, 선행 기술의 절반의 용량 또한, 10 일에 1 회의 투여 (투여 간격 9 일간) 로, 현저한 항종양 활성을 나타냈다. 따라서, T6-16 항체는 적어도 선행 기술의 8 분의 1 의 총 투여량으로 현저한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[실시예 27]
[인간 전립선암 세포주 DU-145 xenograft prevention 모델에 있어서의 항종양 활성의 검토]
클론 K5-70 의 인간 전립선암에 대한 항종양 활성을, DU-145 세포 (RIKEN Cell Bank, RCB2143) 를 사용한 xenograft prevention 모델로 평가하였다. 5 × 106 세포의 DU-145 세포를 6 주령의 암컷의 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 의 피하에 이식하고, 이식 당일을 Day 1 로 하고, 컨트롤군 (마우스 IgG) (N = 8) 과 K5-70 항체 투여군 (N = 8) 으로 군 분류를 실시하고, Day 1 부터 3 일에 1 회의 빈도로 10 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 복강 내 투여하였다. Day 40 에 있어서, 컨트롤군에 있어서의 종양 체적이 368.2 ± 307.8 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 30.6 ± 29.6 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로 약 90 ％ 의 종양 형성 저해 활성을 나타냈다 (도 30A). 종양 중량에 있어서는, 더욱 현저한 항종양 활성이 확인되었다. Day 40 에 있어서의 컨트롤군의 종양 중량이 0.18 ± 0.18 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 8 개체 모두에 있어서 종양이 소실되어 있어, 완전하게 종양 형성이 저해되었다 (도 30B). 이상의 결과로부터, 항인간 TROP-2 모노클로날 항체 클론 K5-70 은 인간 전립선암 세포에 대해서도 강한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[실시예 28]
[인간 췌장암 세포주 PK-59 세포의 간 전이 모델을 사용한 K5-70 항체의 전이 억제 활성]
소화기암의 치료에 있어서, 암의 전이는 임상 상의 예후를 좌우하는 중요한 인자로, 전이를 컨트롤하는 것은 치료상 중요한 의미를 갖는다. TROP-2 를 표적으로 한 암 치료용 항체 투여에 의해, 종양 형성의 억제뿐만 아니라, 암 세포의 타장기로의 전이를 억제하는 것이 가능하면, 높은 임상 상의 유용성이 기대되기 때문에, 암 치료 항체로서 바람직한 특성이다.
TROP-2 는 많은 암종에 있어서의 발현이 확인되어 있지만, 특히 전이소에 있어서 고발현하고 있는 것이 나타나 있다 (Br. J. Cancer (2008) ; 99 : 1290-1295, Clin. Cancer Res. (2006) ; 12 : 3057-3063, Mod. Pathol. (2008) ; 21 : 186-191). 또한, Trop-2 유전자를 도입한 암 세포를 경비적 혹은 경췌적으로 누드 마우스에 이식한 경우에, 간 전이의 발증률이 증가하는 것 (WO 2010/089782, Molecular Cancer (2010) ; 9 : 253) 이 보고되어, TROP-2 의 암 전이 과정에 있어서의 중요성이 시사되어 있다. 그러나, TROP-2 를 표적으로 한 항체를 이용하여 in vivo 에서 전이 억제 작용을 구체적으로 나타낸 보고는 지금까지 확인되지 않았다.
본 발명에 의해 알아낸 항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 은 인간 췌장암 세포를 피하에 이식한 제노그래프트 모델에 있어서 높은 치료 효과가 나타나 있는데, 암 세포의 증식 억제 효과에 더하여, 인간 췌장암 세포주 PK-59 의 유주능을 억제하는 것이, in vitro 의 스크래치 어세이에서 나타나 있어, 암의 전이를 in vivo 에 있어서도 억제할 가능성이 고려되었다. 그래서, PK-59 세포를 누드 마우스의 비장으로부터 주입하고, 간 전이를 발생시키는 모델을 이용하여 항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체의 전이 억제 효과를 검증하였다.
암 세포 이식 전날에, 마우스를 군 분류하고, 항 hTROP-2 모노클로날 항체 K5-70 혹은 대조 항체 (정제 마우스 IgG) 를 10 ㎎/㎏ 체중으로 복강 내 투여하였다. 다음 날, hTROP-2 를 내재적으로 발현하는 인간 췌장암 세포주 (PK-59) 를 트립신 처리로 박리하고, PBS 로 2 × 107 cells/㎖ 의 세포 현탁액을 조제하였다. 세포 현탁액은 이식시까지 빙상에 보관하였다. 6 ∼ 7 주령의 암컷의 누드 마우스 (Balb/c, nu/nu) 를 펜토바르비탈의 복강 내 투여에 의해 마취하고, 마취하에서 좌측 복부를 10 ∼ 15 ㎜ 절개하고, 비장을 복강 외로 꺼내어, 27 G 의 시린지를 이용하여 50 ㎕ 의 세포 현탁액 (1 × 106 cell) 을 비장 내에 주입하였다. 세포 주입 4 분 후에 비문부를 5 - 0 silk 로 결찰하고, 비장을 적출하였다. 절개한 복막을 4 - 0 silk 로 폐창하고, Wound Clips (AUTOCLIP 9 ㎜, Becton Dickinson) 를 이용하여 폐복하였다. 암 세포 이식 7 일 후에, 추가로 K5-70 항체 및 대조 항체를 10 ㎎/㎏ 체중으로 투여하였다. 암 세포 이식으로부터 4 ∼ 6 주일 후에 경추 탈구에 의해 마우스를 안락사시키고, 간장을 적출하여, 전이소의 유무를 확인하였다.
컨트롤로서 사용한 마우스 IgG 를 투여한 군에 있어서는, PK-59 세포를 이식한 6 마리의 마우스 중, 4 마리에 있어서, 이식 후 4 내지 6 주일 후에 간엽 변연부로의 분명한 전이소 (2 ∼ 7 개) 가 확인되었다 (도 31A, 전이 발생률 67 ％, 표 6). 이에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는, PK-59 세포를 이식한 4 마리의 마우스에 있어서, 어느 개체에서도 전혀 간장으로의 전이소가 확인되지 않아, 전이 발생률은 0 ％ 였다 (도 31B, 표 6).
Figure 112014054930572-pct00008
이들 결과로부터, 항 hTROP-2 항체 K5-70 은 인간 췌장암 세포주 PK-59 의 간 전이에 대하여 매우 강한 억제 작용을 갖는 것이 분명해졌다.
[실시예 29]
[인간 대장암 세포주 SW480 xenograft 모델에 있어서의 염산이리노테칸 투여 후의 암 재발 모델에 있어서의 K5-70 항체의 항종양 활성]
암 치료제로서 최근, 암 세포의 증식을 억제하는 화학 요법제가 많이 개발되어, 일정한 치료 성적을 올리고 있지만, 암 세포 이외의 정상 세포에 대한 증식 억제 작용에 수반하는 부작용과, 치료 중지 후의 암의 재발이 큰 문제가 되고 있다. 따라서, TROP-2 를 표적으로 한 암 치료용 항체 투여에 의해, 화학 요법제에 의한 치료 후의 종양 재발을 억제하는 것이 가능하면, 높은 임상 상의 유용성이 기대되기 때문에, 암 치료 항체로서 바람직한 특성이다.
대장암의 치료제로는, 5-FU, 백금 제제에 더하여, 토포이소머라아제 저해 효과를 갖는 염산이리노테칸 (토포테신, 다이이치산쿄 주식회사) 이 최근 임상 적응되어, 동물 모델에 있어서도, 대장암을 비롯한 다양한 인간 종양 세포를 이식한 마우스 모델에 있어서의 항종양 효과가 보고되어 있다 (Cancer Chemother Pharmacol. (1991) ; 28(3) : 192-8). 그래서, 염산이리노테칸 투여 후의 종양 재발에 대한 항 hTROP-2 항체 클론 K5-70 (마우스 IgG2a) 의 재발 예방 효과에 대하여, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 8 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 이식으로부터 11 일 후 (Day 11) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 이상에 이른 단계에서 무처치군 (생리 식염수 투여군, N = 8, 130.7 ± 16.2 ㎣), 염산이리노테칸 (CPT-11, 토포테신, 다이이치산쿄 주식회사) 투여군 (N = 16, 123.0 ± 21.4 ㎣) 으로 군 분류를 실시하고, 염산이리노테칸을 40 ㎎/㎏ 체중으로 3 일에 1 회, 합계 3 회 (Day 11, 14, 17) 복강 내 투여하였다. 염산이리노테칸의 최종 투여로부터 3 일째 (Day 20) 에, 무처치군의 종양 체적은 232.1 ± 21.1 ㎣ 에 이른 데에 반하여, 염산이리노테칸 투여군은 126.6 ± 26.6 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로, 분명한 종양 억제 효과가 확인되었다. 이 단계에서 종양 사이즈에 기초하여 염산이리노테칸 투여군을 2 군으로 나누고, 일방은 K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, Day 20 의 종양 체적 126.0 ± 28.0 ㎣) 으로 하고, 다른 일방은 마우스 IgG 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8, Day 20 의 종양 체적 127.2 ± 27.0 ㎣) 으로 하였다. 각각 3 일에 1 회의 항체의 복강 내 투여와 종양 체적의 측정을 실시하여 종양의 재발을 평가하였다 (도 32). 마우스 IgG 투여군에서는, 염산이리노테칸의 최종 투여로부터 18 일째 (Day 35) 부터 종양 체적이 300 ㎣ 를 초과하는 분명한 재발 종양을 갖는 개체가 복수 확인되고, 염산이리노테칸의 최종 투여로부터 30 일째 (Day 47) 에 있어서는, 8 예 중 5 예에서 300 ㎣ 를 초과하는 종양이 확인되었다 (종양 평균 체적 401.7 ± 172.7 ㎣). 이에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 현저하게 종양 재발이 억제되어, 종양 평균 체적은 180.5 ± 142.1 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 였다 (도 32). 특히, K5-70 항체 투여군에서는, Day 47 에 있어서의 종양 체적이 군 분류시 (126.0 ± 28.0 ㎣) 보다 퇴축하여, 100 ㎣ 미만이 된 개체가 8 예 중 4 예 확인되었다. 이들 결과로부터, 항 hTROP-2 항체 K5-70 은 염산이리노테칸 투여 후의 종양 재발에 대해서도 매우 강한 억제 작용을 갖는 것이 분명해졌다.
[실시예 30]
[CLIPS 기술을 사용한 에피토프 맵핑]
＜재료와 방법＞
펩타이드 합성
본 실험에서 사용한 직사슬형 15-mer 및 30-mer 의 TROP-2 세포 외 영역에서 유래하는 펩타이드는 Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) 법에 의한 고상 합성에 의해 취득하였다. 또한 불연속 에피토프 해석을 위하여, 양단에 시스테인 잔기를 부가한 TROP-2 세포 외 영역에서 유래하는 17-mer 의 펩타이드를 합성하고, CLIPS 기술 (Chemically Linked Peptides on Scaffolds technology) 에 의해 루프 구조를 1 개 또는 2 개 갖는 입체 구조를 재구축하였다. 부가한 시스테인 잔기 근방에 다른 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 알라닌으로 치환하였다.
에피토프 스크리닝 ELISA
5034 종류의 합성한 펩타이드를 PEPSCAN 카드 (455 펩타이드/카드) 에 공유 결합시키고, ELISA 법에 의해 합성 펩타이드와 항체의 결합을 검증하였다. PEPSCAN 카드는 블로킹 버퍼 (4 ％ 말 혈청, 5 ％ 난백 알부민, 1 ％ Tween 을 포함하는 인산 완충액) 로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 항인간 TROP-2 모노클로날 항체 (K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86, T6-16) 와 반응시켰다. 세정 후, 1000 배 희석한 퍼옥시다아제-2 차 항체 복합체와 25 ℃, 1 시간 반응시켰다. 세정 후, 기질 용액 (2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate (ABTS) 와 2 ㎕ 의 3 ％ 과산화수소수를 포함하는 용액) 을 첨가하여, 1 시간 발색 반응을 실시하였다. 항체 결합 활성은 CCD 카메라로 촬영하여, 화상 해석을 실시하여 정량하였다.
＜결과＞
약효를 나타낸 항 hTROP-2 모노클로날 항체 K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86, T6-16 에 대하여 CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 이용하여 에피토프 해석을 실시하였다. 또한, 이하, 본 실시예에 있어서 「아미노산 번호」 란, 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열 (hTROP-2 단백질 (323 아미노산 잔기)) 중의 아미노산 번호를 의미한다.
K5-70 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 7 에 나타낸다. 그 결과, 33 펩타이드가 K5-70 항체와 강한 결합을 나타내는 것이 분명해졌다. 이들 33 펩타이드 중에서, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43 - 65) 를 포함하는 배열 (표 7 중에 기재된 펩타이드 No. 1 - 7, 9), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152 - 165) 를 포함하는 배열 (표 7 중에 기재된 펩타이드 No. 14, 22 - 24, 28), VHYEQPTIQIELRQ (아미노산 번호 193 - 206) 를 포함하는 배열 (표 7 중에 기재된 펩타이드 No. 8, 10, 12, 13, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30, 32), DLDAELRRLFRER (아미노산 번호 171 - 183) 을 포함하는 배열 (표 7 중에 기재된 펩타이드 No. 11, 16, 18, 19, 21, 22, 29, 31) 은 반복 출현하였다. K5-70 항체는 특히 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 를 포함하는 배열에 강하게 결합하였다. 이들 결과로부터, hTROP-2 단백질 중, 상기 4 종류의 펩타이드 배열 영역이 K5-70 항체의 에피토프일 가능성이 시사되었다.
Figure 112014054930572-pct00009
K5-107 에 대한 해석 결과를 하기 표 8 에 나타낸다. 그 결과, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43 - 65) 를 포함하는 배열이 20 펩타이드 중 10 펩타이드 (표 8 중에 기재된 펩타이드 No. 1 - 6, 8, 9, 14, 17) 에 포함되어 있었다 (표 8).
따라서, hTROP-2 단백질 중, 상기 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 의 펩타이드 배열 영역이 K5-107 항체의 에피토프인 것이 시사되었다.
Figure 112014054930572-pct00010
K5-116-2-1 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 9 에 나타낸다. 당해 해석에서는, VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (아미노산 번호 43 - 65) 를 포함하는 배열 (표 9 중에 기재된 펩타이드 No. 1 - 7, 15, 25), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152 - 165) 를 포함하는 배열 (표 9 중의 펩타이드 No. 8 - 11, 16, 17, 19, 20, 22 - 24, 27 - 29), DLDAELRRLFRER (아미노산 번호 171 - 183) 을 포함하는 배열 (표 9 중에 기재된 펩타이드 No. 11 - 14, 17, 19, 21, 23, 29) 의 3 종류의 펩타이드 배열이 복수 회 출현하였다 (표 9). 따라서, hTROP-2 단백질 중, 이들 3 종류의 펩타이드 배열 영역이 K5-116-2-1 항체의 에피토프인 것이 시사되었다.
Figure 112014054930572-pct00011
T5-86 및 T6-16 항체에 대한 해석 결과를 하기 표 10 및 표 11 에 나타낸다. 당해 해석에서는, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109 - 120) 의 배열을 포함하는 펩타이드와 강하게 결합하였다. T5-86 항체에 대해서는 결합하는 26 펩타이드 중 22 펩타이드 (표 10 중에 기재된 펩타이드 No. 1 - 4, 6 - 8, 10 - 13, 15 - 19, 21 - 26) 에, T6-16 항체에 대해서는 결합하는 26 펩타이드 중 4 펩타이드 (표 11 중에 기재된 펩타이드 No. 1, 2, 9, 13) 에, 상기 펩타이드 배열이 포함되어 있었다 (표 10 및 표 11). 또한 T5-86 항체에 대한 해석에서는, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109 - 120) 을 포함하는 배열 이외에도 VCSPDGPGGRCQCRA (아미노산 번호 43 - 57) 를 포함하는 배열 (표 10 중에 기재된 펩타이드 No. 5, 14, 20) 이 복수 회 출현하였다. 또한, T6-16 항체에 대한 해석에서도, 다른 배열로서 HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152 - 165) 를 포함하는 배열 (표 11 중에 기재된 펩타이드 No. 4 - 8, 10 - 12, 19, 21, 23, 25, 26) 이 복수 회 확인되었다. 따라서, T5-86 항체의 에피토프로는, hTROP-2 단백질 중, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109 - 120), VCSPDGPGGRCQCRA (아미노산 번호 43 - 57) 의 2 종류의 펩타이드 배열 영역이 시사되고, T6-16 항체의 에피토프로는, hTROP-2 단백질 중, DPEGRFKARQCN (아미노산 번호 109 - 120), HHILIDLRHRPTAG (아미노산 번호 152 - 165) 의 2 종류의 펩타이드 배열 영역이 시사되었다.
Figure 112014054930572-pct00012
Figure 112014054930572-pct00013
[실시예 31]
[마우스 항 hTROP-2 항체 (클론 K5-70, K5-107, K5-116-2-1 및 T6-16) 의 항체 유전자의 가변 영역의 배열 결정]
3 × 106 개의 마우스 항 TROP-2 모노클로날 항체 산생 하이브리도마로부터, TRIzol 시약 (Invitrogen) 을 이용하여 전체 RNA 를 추출하였다. 클론 K5-70, 클론 K5-107 및 클론 K5-116-2-1 에 대해서는, SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit (Clontech) 를 이용하여, 키트에 첨부된 방법에 따라, 마우스 IgG 의 H 사슬 특이적 프라이머 (5'-TCCAKAGTTCCA-3' (배열 번호 24)) 와, L 사슬 특이적 프라이머 (5'-GCTGTCCTGATC-3' (배열 번호 25)) 를 이용하여 cDNA 를 합성하였다. 클론 T6-16 에 대해서는, GeneRacer Kit (Invitrogen) 를 이용하여, 키트에 첨부된 방법에 따라, 올리고 dT 프라이머를 이용하여 cDNA 를 합성하였다. 클론 K5-70 (마우스 IgG2a), 클론 K5-107 (마우스 IgG1), 및 클론 K5-116-2-1 (마우스 IgG2a) 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역 (VH, VL) 을 코드하는 유전자는, 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여, PCR 법을 이용하여 클로닝하였다. 이 때, 5'-프라이머는 SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit 에 첨부되어 있는 10 × Universal Primer A Mix (UPM) 를 사용하였다. 한편, 3'-프라이머는 VH 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 IgG H 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 IgG L 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하였다.
5'-프라이머 (10 × Universal Primer A Mix (UPM)) :
Long (0.4 μM)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (배열 번호 26)
Short (2 μM)
5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (배열 번호 27)
3'-프라이머 (R 프라이머) :
VH : 5'-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3' (배열 번호 28)
5'-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3' (배열 번호 29)
VL : 5'-CACTGCCATCAATVCTCCACTTGACA-3' (배열 번호 30)
상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다. 또한 VH 의 cDNA 증폭의 R 프라이머는 상기의 2 배열을 등몰수씩 혼합하여 사용하였다.
＜반응액 조성＞
주형 cDNA : 2.5 ㎕
5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg2 + plus) : 10 ㎕
2.5 mM dNTP : 4 ㎕
PrimeSTAR HS DNA 폴리머라아제 (2.5 U/㎕) : 0.5 ㎕
10 × Universal Primer A Mix (UPM) : 5 ㎕
R 프라이머 (10 μM) : 1 ㎕
멸균수 : 27 ㎕
합계 : 50 ㎕
＜반응 조건＞
94 ℃ (10 sec) 반응시킨 후, 「열변성·해리 : 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 : 60 ℃ (5 sec) → 합성·신장 : 72 ℃ (60 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 30 사이클 반응시킨 후, 마지막에 72 ℃ (3 min) 반응시켰다.
합성한 VH 및 VL 의 cDNA 를, pMD20-T vector (다카라 바이오) 에 서브 클로닝하여, 염기 배열을 결정하였다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하고, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정하였다. 도 33 및 도 34 에, K5-70 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다. 도 35 및 도 36 에, K5-107 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다. 도 37 및 도 38 에, K5-116-2-1 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다.
클론 T6-16 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역 (VH, VL) 을 코드하는 유전자는, 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여, PCR 법을 이용하여 클로닝하였다. 이 때, 5'-프라이머는 GeneRacer Kit 에 첨부되어 있는 것을 사용하였다. 한편, 3'-프라이머는 VH 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 IgG H 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로는 마우스 IgG L 사슬에 특이적인 배열을 갖는 것을 사용하였다.
5'-프라이머 (F 프라이머) :
5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (배열 번호 31)
3'-프라이머 (R 프라이머) :
VH : 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG -3' (배열 번호 32)
VL : 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (배열 번호 33)
상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.
＜반응액 조성＞
주형 cDNA : 1.0 ㎕
5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg2 + plus) : 10 ㎕
2.5 mM dNTP : 4 ㎕
PrimeSTAR HS DNA 폴리머라아제 (2.5 U/㎕) : 0.5 ㎕
F 프라이머 (10 μM) : 3 ㎕
R 프라이머 (10 μM) : 1.0 ㎕
멸균수 : 30.5 ㎕
합계 : 50 ㎕
＜반응 조건＞
「열변성·해리 : 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 : 57 ℃ (10 sec) → 합성·신장 : 72 ℃ (60 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.
합성한 VH 및 VL 의 cDNA 를, pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여, 염기 배열을 결정하였다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하고, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정하였다. 도 39 및 도 40 에, T6-16 의 VH 및 VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다.
[실시예 32]
[인간형화 K5-70 항체의 디자인]
상기의 실시예로 제작한 K5-70 항체에 대하여, 그 가변 영역 (VH, VL) 의 인간형화를, Queen 등의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 10029-10033, 1989) 에 따라 이하와 같이 실시하였다. 먼저, K5-70 항체 가변 영역의 입체 구조의 분자 모델링을 컴퓨터로 실시하고, 이어서, 인간 항체 유전자의 가변 영역 배열과의 호몰로지 검색에 의해, K5-70 VH 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 영역을 제공하는 억셉터로서 GenBank accession number 가 DA980102 인 cDNA 배열 (DA980102 VH) 을 선택하였다 (Genome Res. 16 : 55-65, 2006). 동일하게, K5-70 VL 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 영역을 제공하는 억셉터로서 GenBank accession number 가 L41174 인 cDNA 배열 (L41174 VL) 을 선택하였다 (J. Biol. Chem. 270 : 12457-12465, 1995).
K5-70 VH 의 인간형화에서는, K5-70 VH 의 CDR 배열을 억셉터인 DA980102 VH 의 대응하는 위치에 치환하여 삽입하였다. 컴퓨터 모델링에 의한 입체 구조 해석에 의해, K5-70 VH 의 CDR 에 인접하고, 그 구조 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각되는 아미노산 잔기 (48 번째의 이소류신 (I), 66 번째의 리신 (K), 67 번째의 알라닌 (A), 71 번째의 발린 (V), 93 번째의 트레오닌 (T)) 에 대해서는 K5-70 VH 의 것을 유지하고, 그 이외의 FR 영역을 억셉터 배열로 치환하였다. VH 및 VL 내의 아미노산 잔기 위치 번호는 Kabat 등의 정의 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 준거하였다.
또한, 억셉터 배열 DA980102 VH 의 82 번째의 아미노산 잔기인 메티오닌 (M) 은 somatic hypermutation 에 의한 특수한 아미노산 잔기일 가능성이 높은 것으로 생각된다. 그래서 잠재적 항원성을 작게 하기 위해서, 82 번째의 아미노산 잔기로서 가장 일반적인 류신 (L) 으로 치환하였다. 상기 서술한 바와 같이 디자인한 인간형화 K5-70 VH (HuK5-70 VH), K5-70 VH 및 DA980102 VH 의 아미노산 배열 얼라인먼트를 도 41 에 나타냈다.
인간형화 K5-70 VL 의 디자인에 대해서도 동일하게 CDR 배열의 이식을 실시하고, CDR 의 구조 유지에 중요한 아미노산 잔기 (49 번째의 리신 (K)) 는 K5-70 VL 의 것을 유지하고, 그 이외의 FR 영역을 억셉터 배열로 치환하였다 (HuK5-70 VL). HuK5-70 VL, K5-70 VL 및 L41174 VL 의 아미노산 배열 얼라인먼트를 도 42 에 나타냈다.
[실시예 33]
[인간형화 T6-16 항체의 디자인]
상기의 실시예로 제작한 T6-16 항체에 대하여, 그 가변 영역 (VH, VL) 의 인간형화를, Queen 등의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 10029-10033, 1989) 에 따라 이하와 같이 실시하였다. 먼저, T6-16 항체 가변 영역의 입체 구조의 분자 모델링을 컴퓨터로 실시하고, 이어서, 인간 항체 유전자의 가변 영역 배열과의 호몰로지 검색에 의해, T6-16 VH 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 영역을 제공하는 억셉터로서 GenBank accession number 가 DA935238 인 cDNA 배열 (DA935238 VH) 을 선택하였다 (Genome Res. 16 : 55-65, 2006). 동일하게, T6-16 VL 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 영역을 제공하는 억셉터로서 GenBank accession number 가 M99608 인 cDNA 배열 (M99608 VL) 을 선택하였다 (J. Immunol. 149 : 2518-2529, 1992).
T6-16 VH 의 인간형화에서는, T6-16 VH 의 CDR 배열을 억셉터인 DA935238 VH 의 대응하는 위치에 치환하여 삽입하였다. 컴퓨터 모델링에 의한 입체 구조 해석에 의해, T6-16 VH 의 CDR 에 인접하고, 그 구조 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각되는 아미노산 잔기 (48 번째의 이소류신 (I), 67 번째의 알라닌 (A), 73 번째의 리신 (K)) 에 대해서는 T6-16 VH 의 것을 유지하고, 그 이외의 FR 영역을 억셉터 배열로 치환하였다 (HuT6-16 VH1). 또한 73 번째의 리신 잔기 (K) 에 대해서는, 항원 결합 부위의 적절한 형성에 대한 영향이 적을 가능성이 있어, HuT6-16 VH1 의 리신 잔기를 보다 관용의 아미노산 잔기인 트레오닌 (T) 으로 치환한 아미노산 배열을 별도로 디자인하였다 (HuT6-16 VH2). 디자인한 인간형화 T6-16 VH (HuT6-16 VH1 및 HuT6-16 VH2), T6-16 VH 및 DA935238 VH 의 아미노산 배열 얼라인먼트를 도 43 에 나타냈다.
인간형화 T6-16 VL 의 디자인에 대해서도, 동일하게 CDR 배열의 이식을 실시하였다. CDR 의 구조 유지에 중요한 아미노산 잔기는 억셉터 배열에서도 유지되고 있어, FR 배열은 억셉터 배열과 동일한 배열을 사용하였다 (HuT6-16 VL). HuT6-16 VL, T6-16 VL 및 L41174 VL 의 아미노산 배열 얼라인먼트를 도 44 에 나타냈다.
[실시예 34]
[인간형화 K5-70 VH 및 VL 유전자 합성]
HuK5-70 VH 및 HuK5-70 VL 을 코드하는 유전자는 이하와 같이 제작하였다. 상기 서술한 바와 같이 디자인한 HuK5-70 VH 및 VL 의 N 말단측에, 각각 K5-70 VH, VL 유래의 시그널 펩타이드 배열을 부가한 아미노산 배열을 기초로 유전자 합성을 실시하였다 (Operon 사). 그 때, 각각 합성한 HuK5-70 VH 및 HuK5-70 VL 의 유전자 배열의 5' 말단측에 Kozak 배열 (ACC ACC) 을 부가하고, 또한 HuK5-70 VH 의 5' 말단에는, 제한 효소 부위로서 EcoRI 의 부위 (GAA TTC) 를 부가하고, 3' 말단에는 NheI (GCT AGC) 의 부위를 부가하였다. 동일하게, HuK5-70 VL 의 5' 말단에는, 제한 효소 부위로서 Age I 의 부위 (ACC GGT) 를 부가하고, 3' 말단에는 BsiWI 의 부위 (CGT ACG) 를 부가하였다. 합성한 HuK5-70 VH 유전자, 및 HuK5-70 VL 유전자는 pCR2.1 벡터 (Invitrogen) 에 TA 클로닝에 의해 삽입하였다. 유전자 합성에 의해 제작한 HuK5-70 VH 및 VL 의 유전자 배열을 각각 도 45 및 46 에 나타냈다.
[실시예 35]
[인간형화 T6-16 VH1, T6-16 VH2 및 T6-16 VL 유전자 합성]
HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 및 HuT6-16 VL 을 코드하는 유전자는 이하와 같이 제작하였다. 디자인한 HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 의 N 말단측에 T6-16 VH 유래의 시그널 펩타이드 배열을, HuT6-16 VL 의 N 말단측에 T6-16 VL 유래의 시그널 펩타이드 배열을 각각 부가한 아미노산 배열을 기초로 유전자 합성을 실시하였다 (Operon 사). 그 때, 각각 합성한 HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 및 HuT6-16 VL 의 유전자 배열의 5' 말단측에 Kozak 배열 (ACC ACC) 을 부가하고, 또한 HuT6-16 VH1 및 HuT6-16 VH2 의 5' 말단에는, 제한 효소 부위로서 EcoRI 의 부위 (GAA TTC) 를 부가하고, 3' 말단에는 NheI 의 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다. 동일하게, 인간형화 T6-16 VL 의 5' 말단에는, 제한 효소 부위로서 Age I 의 부위 (ACC GGT) 를 부가하고, 3' 말단에는 BsiWI 의 부위 (CGT ACG) 를 부가하였다. 합성한 HuT6-16 VH1 유전자 및 HuT6-16 VH2 유전자 그리고 HuT6-16 VL 유전자는 pCR2.1 벡터 (Invitrogen) 에 TA 클로닝에 의해 삽입하였다.
유전자 합성에 의해 제작한 HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 및 HuT6-16 VL 의 유전자 배열을 각각 도 47 ∼ 49 에 나타냈다.
[실시예 36]
[인간형화 K5-70 VH 및 VL 유전자 발현 벡터 구축]
pCR2.1 벡터 (Invitrogen) 에 삽입한 HuK5-70 VH 및 VL 유전자는 각각 제한 효소 EcoRI 및 Nhe I, Age I 및 BsiWI 에 의해 소화하고, 유전자 단편의 회수를 실시하였다. 다음으로, 잘라낸 HuK5-70 VH 유전자는 인간 IgG1 폼의 발현용의 동물 세포 발현 벡터인, pFUSE-CHIg-hG1 벡터 (InvivoGen) 의 EcoRI/Nhe I 부위에 삽입하고 (pFUSE-CHIg-HuK5-70), HuK5-70 VL 유전자는 인간 Ig κ 폼 발현용 벡터인 pFUSE2-CLIg-hk 벡터 (InvivoGen) 의 Age I/BsiWI 부위에 삽입하여 (pFUSE2-CLIg-HuK5-70), 각각, 콘스트럭트를 완성시켰다.
[실시예 37]
[인간형화 T6-16 VH1, T6-16 VH2 및 T6-16 VL 유전자 발현 벡터 구축]
pCR2.1 벡터 (Invitrogen) 에 삽입한 T6-16 VH1, T6-16 VH2 유전자는 제한 효소 EcoRI 및 Nhe I 로 소화하고, T6-16 VL 유전자는 Age I 및 BsiWI 로 소화하여, 유전자 단편의 회수를 실시하였다. 다음으로, 잘라낸 T6-16 VH1 유전자는 pFUSE-CHIg-hG1 벡터 (InvivoGen) 의 EcoRI/Nhe I 부위에 삽입하고 (pFUSE-CHIg-HuT6-16-1), T6-16 VH2 유전자도 동일하게 pFUSE-CHIg-hG1 벡터 (InvivoGen) 의 EcoRI/Nhe I 부위에 삽입하고 (pFUSE-CHIg-HuT6-16-2), T6-16 VL 유전자는 pFUSE2-CLIg-hk 벡터 (InvivoGen) 의 Age I/BsiWI 부위에 삽입하여 (pFUSE2-CLIg-HuT6-16), 각각, 콘스트럭트를 완성시켰다.
[실시예 38]
[HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체를 안정적으로 발현하는 293F 세포주의 수립]
293F 세포 (Invitrogen) 는, FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) 으로 유지, 배양하였다. 293F 세포에 대한 유전자 도입은 293 fectin 시약 (Invitrogen) 을 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 실시하였다. pFUSE-CHIg-HuK5-70 및 pFUSE2-CLIg-HuK5-70 을 모두 293F 세포에 도입하고, Zeocin (InvivoGen) 및 Blasticidin (InvivoGen) 에 의한 약제 선택을 실시함으로써 HuK5-70 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 수립하였다. 동일하게, pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 을 모두 293F 세포에 도입하고, 상기의 약제 선택을 실시함으로써 HuT6-16-1 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 수립하였다. 또한 동일하게, pFUSE-CHIg-HuT6-16-2 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 을 모두 293F 세포에 도입하고, 상기의 약제 선택을 실시함으로써 HuT6-16-2 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 수립하였다.
[실시예 39]
[HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체 단백질의 정제]
수립한 각 항체 발현 세포주는 1 ∼ 2.5 × 105 cells/㎖ 로 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) 에 접종하고, 6 ∼ 8 일간 롤러 보틀 배양을 실시하였다. 배양 상청을 회수한 후, rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) 를 이용하여 정법에 따라 각 인간형화 항체의 정제를 실시하였다.
도 50 에, HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체를 발현시킨 293F 세포의 배양 상청 중의, 각 인간형화 항체 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 도면을 나타냈다. 구체적으로는, SDS-PAGE 를 실시한 후, PVDF 멤브레인 (Immobilon-P, Millipore, IPVH00010) 에 전사하였다. 멤브레인은 5 ％ 스킴 밀크를 포함하는 TBS (Tris-buffered saline) 를 이용하여 실온, 30 분간 블로킹을 실시하였다. 0.1 ％ TBST (0.1 ％ Tween 20 함유 TBS) 로 5 분간, 3 회 세정한 후, 1 차 항체와의 반응을 실시하였다.
레인 1 은 유전자 도입을 실시하지 않은 293F 세포의 배양 상청 (네거티브 컨트롤), 레인 2 는 pFUSE-CHIg-HuK5-70 및 pFUSE2-CLIg-HuK5-70 을 도입한 293F 세포의 배양 상청을 나타낸다. HuK5-70 항체의 중사슬 및 경사슬 단백질의 검출은 비오틴 표지한 항인간 IgG F(ab')2 항체 (Rockland) 를 사용하였다. 레인 3 은 293F 세포에 pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 을 도입한 293F 세포의 상청, 레인 4 는 pFUSE-CHIg-HuT6-16-2 및 pFUSE2-CLIg-HuT6-16 을 도입한 293F 세포의 상청을 나타내고, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 중사슬 단백질은 비오틴 표지한 항인간 IgG Fc 항체 (Rockland) 로, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 경사슬 단백질은 비오틴 표지한 항인간 IgG F(ab')2 항체 (Rockland) 로 각각 검출하였다.
그 결과, HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체 중 어느 것에 있어서도, 중사슬 및 경사슬 단백질의 배양 상청 중에서의 발현이 확인되었다.
또한, 도 51 에, 정제한 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체를, SDS-PAGE 로 전개 후, CBB 염색한 도면을 나타냈다. 환원 조건하에서, 모두 약 50 kD 의 중사슬과 약 25 kD 의 경사슬이 검출되어, 상기 서술한 웨스턴 블롯으로 검출된 각 중사슬 및 경사슬과 동일한 위치에 밴드가 확인되었다. 이상의 결과로부터, HuK5-70 항체 단백질, HuT6-16-1 항체 단백질 및 HuT6-16-2 항체 단백질의 산생이 확인되었다.
[실시예 40]
[인간형화 K5-70 항체 (HuK5-70) 및 인간형화 T6-16 항체 (HuT6-16-1, HuT6-16-2) 의 항원 친화성]
정제한 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체의 항원 친화성을 FACS, 및 ELISA 를 사용한 방법으로 검토하였다.
FACS 는 실시예 5 에 기재한 HEK293 세포에 인간 전체 길이 TROP-2 유전자를 안정적으로 발현시킨 HEK293-hTROP-2 세포와 내재적으로 인간 TROP-2 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는 췌장암 세포주 PK-59 를 이용하여 실시하였다. 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 박리한 세포 (HEK293-hTROP-2 세포, 또는 PK-59 세포) 의 현탁액 (5 × 105 cells) 에 대하여, 1 차 항체로서 10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 항체 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 20 분간 incubation 하였다. 그 후, 1 ㎖ 의 10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 세정하고, 피코에리트린 (PE) 표지 anti-mouse IgG 항체 (BD Pharmingen) 및 비오틴 표지 anti-human IgG Fc 항체 (Rockland) 를 각각 200 배, 2000 배 희석한 2 차 항체 용액 100 ㎕ 를 첨가하였다. 4 ℃ 에서 20 분간 incubation 한 후, 다시 1 ㎖ 의10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 세정하였다. 2 차 항체로서 비오틴 표지 anti-human IgG Fc 항체를 사용한 경우에는, 형광 표지 시약으로서 스트렙트아비딘 표지 PE (BD Pharmingen) 를 400 배 희석한 표지 용액을 100 ㎕ 첨가하고, 4 ℃ 에서 20 분간 incubation 한 후, 1 ㎖ 의 10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 세정하였다. 그 후, 표지 세포를 포함하는 샘플은 1 ㎖ 의 1 ％ FCS, 2 mM EDTA 가 들어간 PBS 에 현탁하고, FACSCalibur (Becton Dickinson) 를 이용하여 해석하였다. 그 결과, HEK293-hTROP-2 세포에 있어서도, PK-59 세포에 있어서도, HuK5-70 항체는 마우스 K5-70 항체와 동등한 반응성을 나타냈다. 동일하게 HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체는 T6-16 항체와 동등한 반응성을 나타냈다 (도 52).
또한 ELISA 법에 의해 항원 친화성에 대하여 검증하였다. ELISA 는, 실시예 3 에서 나타낸 hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질을 고상화한 ELISA 플레이트를 사용하여 실시하였다. 구체적으로는, 96 well plate (BD FALCON) 를 PBS 로 0.5 ㎍/㎖ 로 희석한 hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질을 50 ㎕/well 로 코팅하였다 (4 ℃, 하룻밤). 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정 후, 블로킹 버퍼 (2 ％ 스킴 밀크, 0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 를 200 ㎕/well 로 첨가하여 블로킹을 실시하였다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체, HuT6-16-2 항체, K5-70 항체 및 T6-16 항체를 ELISA 버퍼 (1 ％ 스킴 밀크, 0.025 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 3.05 × 10-4 ∼ 5 ㎍/㎖ 의 범위에서 2 배 희석 계열 샘플을 조제하고, 각 50 ㎕/well 로 첨가하였다 (실온, 2 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, 검출용 항체로서 ELISA 버퍼로 2000 배 희석한 HRP 표지 goat 항인간 κ 사슬 항체 (SouthernBiotech) 혹은 2000 배 희석한 HRP 표지 sheep 항마우스 IgG 항체 (GE Healthcare) 를 50 ㎕/well 로 첨가하였다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정 후, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, SIGMA) 를 기질 용액으로서 50 ㎕/well 로 첨가하고, 발색 반응을 실시하였다. 1 M 황산을 25 ㎕/well 로 첨가하고 반응을 정지시킨 후, Microplate reader Model 550 (BioRad) 을 이용하여, 655 ㎚ 의 흡광도를 레퍼런스로 하여 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, K5-70 및 HuK5-70 의 반응 곡선은 대략 중복되어, EC50 은 각각 27 ng/㎖, 22 ng/㎖ 였다 (도 53). 동일하게, T6-16, HuT6-16-1 및 HuT6-16-2 의 반응 곡선도 대략 중복되어, EC50 은 각각 30 ng/㎖, 27 ng/㎖, 27 ng/㎖ 였다 (도 54). 이들 결과로부터 HuK5-70 항체, HuT6-16-1 항체 및 HuT6-16-2 항체는, 각각, 인간형화하기 전의 친항체인 K5-70 또는 T6-16 항체와 동등한 항원 친화성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[실시예 41]
[인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70) 의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성]
다음으로, HuK5-70 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 인간 TROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 군 분류를 실시하고 (Day 9), Day 9 부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 개시하였다. 암 세포 이식으로부터 39 일째 (Day 39) 에 있어서의 컨트롤군 (PBS 투여, N = 8) 의 종양 체적이 824.3 ± 188.8 ㎣ 였던 데에 반하여, HuK5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 455.5 ± 208.6 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 44.7 ％) (도 55A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.509 ± 0.161 g 이었던 데에 반하여, HuK5-70 항체 투여군에서는 0.272 ± 0.162 g (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 46.6 ％ 의 저해율이었다 (도 55B).
[실시예 42]
[인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70 및 HuT6-16-2) 의 인간 대장암 세포주 SW480 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 용량 의존적인 항종양 활성]
HuK5-70 및 HuT6-16-2 항체의 용량 의존적인 항종양 활성을, 인간 대장암 세포주 SW480 을 사용한 xenograft treatment 모델에 있어서 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SW480 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 암 세포 이식으로부터 9 일째 (Day 9) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 에 이른 단계에서 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 101.65 ± 8.35 ㎣), 1 ㎎/㎏ 체중의 HuK5-70 항체 투여군 (N = 8, 103.18 ± 9.86 ㎣), 5 ㎎/㎏ 체중의 HuK5-70 항체 투여군 (N = 8, 101.34 ± 8.94 ㎣), 10 ㎎/㎏ 체중의 HuK5-70 항체 투여군 (N = 8, 101.53 ± 8.98 ㎣), 1 ㎎/㎏ 체중의 HuT6-16-2 항체 투여군 (N = 8, 103.18 ± 9.86 ㎣), 5 ㎎/㎏ 체중의 HuT6-16-2 항체 투여군 (N = 8, 101.34 ± 8.94 ㎣), 10 ㎎/㎏ 체중의 HuT6-16-2 항체 투여군 (N = 8, 101.53 ± 8.98 ㎣) 으로 군 분류을 실시하고, Day 9 부터 3 일에 1 회의 간격으로 항체의 복강 내 투여를 실시하였다. 암 세포 이식으로부터 48 일째 (Day 48) 에 있어서의 컨트롤군의 종양 체적이 754.67 ± 276.05 ㎣ 였던 데에 반하여, HuK5-70 항체 투여군에서는, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 521.81 ± 183.45 ㎣ (저해율 30.9 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 258.78 ± 137.02 ㎣ (저해율 65.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 314.60 ± 152.89 ㎣ (저해율 58.3 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 56A). HuT6-16-2 항체 투여군에서는, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 600.41 ± 319.84 ㎣ (저해율 20.4 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 315.32 ± 189.02 ㎣ (저해율 58.2 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서는, 270.79 ± 266.71 ㎣ (저해율 64.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 57A). Day 48 에 있어서의 종양 중량에 대해서는, 컨트롤군이 0.422 ± 0.201 g 이었던 데에 반하여, HuK5-70 항체 투여군에서는, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.301 ± 0.160 g (저해율 28.7 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.115 ± 0.083 g (저해율 72.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.244 ± 0.181 g (저해율 42.2 ％) 이 되었다 (도 56B). HuT6-16-2 항체 투여군에서는, 1 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.422 ± 0.255 g (저해율0 ％), 5 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.247 ± 0.151 g (저해율 41.5 ％), 10 ㎎/㎏ 체중 투여군에서, 0.190 ± 0.190 g (저해율 53.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이 되었다 (도 57B). 이들 결과로부터, HuK5-70 및 HuT6-16-2 항체의 용량 의존적인 항종양 활성이 확인되었다.
[실시예 43]
[항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 및 T6-16 의 인간 난소암 세포주 SK-OV-3 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 항종양 활성]
모항체인 K5-70 및 T6-16 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 난소암 세포주 SK-OV-3 을 사용한 xenograft treatment 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 SK-OV-3 세포를 7 주령 암컷의 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 암 세포 이식으로부터 11 일째 (Day 11) 에, 분명한 종양 형성이 확인된 개체 (평균의 종양 체적 약 50 ㎣) 에 대하여 군 분류를 실시하고, Day 11 부터 주에 2 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 실시하였다. 암 세포 이식으로부터 56 일째 (Day 56) 에 있어서의 컨트롤군 (PBS 투여, N = 8) 의 종양 체적이 652.6 ± 349.1 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 253.7 ± 137.3 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되고 (저해율 61.1 ％), T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 214.6 ± 98.6 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 67.1 ％) (도 58A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.413 ± 0.218 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 0.194 ± 0.112 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 53.0 ％ 의 저해율, T6-16 항체 투여군에서는 0.183 ± 0.093 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 55.7 ％ 의 저해율이었다 (도 58B).
[실시예 44]
[항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 및 T6-16 의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 항종양 활성]
동일하게, K5-70 그리고 T6-16 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468 을 사용한 xenograft treatment 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 MDA-MB-468 세포를 7 주령 암컷의 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 암 세포 이식으로부터 12 일째 (Day 12) 에, 분명한 종양 형성이 확인된 개체 (평균의 종양 체적 약 50 ㎣) 에 대하여 군 분류를 실시하고, Day 12 부터 주에 2 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 실시하였다. 암 세포 이식으로부터 54 일째 (Day 54) 에 있어서의 컨트롤군 (PBS 투여, N = 8) 의 종양 체적이 218.6 ± 75.5 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 70.2 ± 37.4 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되고 (저해율 67.9 ％), T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 88.3 ± 42.9 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 59.6 ％) (도 59A). Day 54 에 있어서의 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.142 ± 0.049 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 0.050 ± 0.033 (g) (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 64.8 ％ 의 저해율, T6-16 항체 투여군에서는 0.077 ± 0.046 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 45.8 ％ 의 저해율이었다 (도 59B).
[실시예 45]
[항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 및 T6-16 의 인간 폐암 세포주 Calu-3 세포 xenograft treatment 모델에 있어서의 항종양 활성]
동일하게, K5-70 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 폐암 세포주 Calu-3 을 사용한 xenograft treatment 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 Calu-3 세포를 7 주령 암컷의 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 암 세포 이식으로부터 9 일째 (Day 9) 에, 분명한 종양 형성이 확인된 개체 (평균의 종양 체적 약 100 ㎣) 에 대하여 군 분류를 실시하고, Day 9 부터 주에 2 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 실시하였다. 암 세포 이식으로부터 41 일째 (Day 41) 에 있어서의 컨트롤군 (PBS 투여, N = 8) 의 종양 체적이 395.7 ± 221.2 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 120.7 ± 125.6 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되고 (저해율 69.5 ％), T6-16 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 8) 에서는, 146.3 + 128.4 ㎣ (P < 0.05 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 63.0 ％) (도 60A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.301 ± 0.189 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 0.08 ± 0.085 (g) (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 73.5 ％ 의 저해율, T6-16 항체 투여군에서는 0.106 ± 0.096 (g) (P < 0.05 by Student's t-test) 으로 64.9 ％ 의 저해율이었다 (도 60B).
[실시예 46]
[항 hTROP-2 마우스 모노클로날 항체 K5-70 의 인간 담관암 세포주 TFK-1 세포 xenograft prevention 모델에 있어서의 항종양 활성]
동일하게, K5-70 항체의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 담관암 세포주 TFK-1 을 사용한 xenograft preventiont 모델로 검토하였다. 5 × 106 cells 의 TFK-1 세포를 7 주령 암컷의 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 1) 하고, 동일 날부터, 주에 2 회의 투여 간격으로, 항체의 복강 내 투여를 개시하였다. 암 세포 이식으로부터 31 일째 (Day 31) 에 있어서의 컨트롤군 (PBS 투여, N = 5) 의 종양 체적이 1000.4 ± 268.9 ㎣ 였던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군 (10 ㎎/㎏ 체중, N = 5) 에서는, 197.2 ± 215.5 ㎣ (P < 0.01 by Student's t-test) 로 유의하게 종양 형성이 저해되었다 (저해율 80.3 ％) (도 61A). 종양 중량에 있어서는, 컨트롤군이 0.443 ± 0.070 g 이었던 데에 반하여, K5-70 항체 투여군에서는 0.063 ± 0.052 (g) (P < 0.01 by Student's t-test) 으로 85.8 ％ 의 저해율이었다 (도 61B).
[실시예 47]
[HuK5-70 및 HuT6-16-2 항체의 avidity 해석]
HuK5-70 및 HuT6-16-2 항체의 항원 결합 활성에 대하여, 저밀도의 항원을 고상화한 96 well plate 를 사용한 ELISA 법 (저밀도 항원 고상화 ELISA) 에 의해 검토하였다. 96 구멍 플레이트에 0.1 M 아세트산 버퍼 (pH 5.3) 로 0.1 ㎍/㎖ 로 조제한 리콤비넌트 hTACSTD2-Fc-His 단백 (Creative BioMart) 을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅한 후, 실시예 40 과 동일한 해석을 실시하였다. 피험 항체는 ELISA 버퍼 (1 ％ 스킴 밀크, 0.025 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 20 ㎍/㎖ 로부터 2 배 희석 계열 (15 점) 을 제작하여 사용하였다. 그 결과, HuT6-16-2 항체는 T6-16 항체와 대략 동등한 결합 활성인 데에 반하여 (EC50 값은 각각 49 ng/㎖ 와 41 ng/㎖), HuK5-70 항체의 EC50 값은 K5-70 항체의 약 20 배가 되었다 (각각 222 ng/㎖, 12 ng/㎖, 도 62).
다음으로 HuK5-70 및 K5-70 항체의 항원 결합 활성에 대하여, 1 가의 항원-항체 반응을 해석하는 ELISA 에 의해 검토하였다. 96 구멍 플레이트에 0.1 M 아세트산 버퍼 (pH 5.3) 로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 Goat anti-human IgG (Fcγ specific) (Southern Biotech) 및 3 ㎍/㎖ 로 희석한 Goat anti-mouse IgG (γ chain specific) (Southern Biotech) 를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅하였다. 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정 후, 블로킹 버퍼 (2 ％ 스킴 밀크, 0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 를 200 ㎕/웰로 첨가하여 블로킹을 실시하였다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, ELISA 버퍼 (1 ％ 스킴 밀크, 0.025 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 1 ㎍/㎖ 희석한 시험 항체를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 이 때, Goat anti-human IgG (Fcγ specific) 를 코트한 웰에는 HuK5-70 항체를 첨가하고, Goat anti-mouse IgG (γ chain specific) 를 코트한 웰에는 K5-70 항체를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 세정 버퍼로 세정하고, 실시예 3 에서 나타낸 hTROP-2 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 (hTROP-2 EC) 을 ELISA 버퍼로 5 ㎍/㎖ 로부터 3 배 희석 계열 (10 점) 을 제작하고, 각 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 세정 버퍼로 세정하고, 1 차 항체로서 ELISA 버퍼로 2 ㎍/㎖ 로 희석한 anti-His (G-18) (Santa Cruz) 를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 세정 버퍼로 세정하고, 2 차 항체로서 ELISA 버퍼로 1000 배 희석한 HRP 표지 anti-rabbit IgG (GE Healthcare) 를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 세정 버퍼로 세정하고, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, SIGMA) 를 기질 용액으로서 50 ㎕/웰로 첨가하고, 발색 반응을 실시하였다. 1 M 황산을 25 ㎕/웰로 첨가하고 반응을 정지시킨 후, Microplate reader Model 550 (Bio Rad) 을 이용하여, 655 ㎚ 의 흡광도를 레퍼런스로 하여 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, hTROP-2EC 단백질의 K5-70 및 HuK5-70 항체와의 결합 커브로부터 산출되는 EC50 은 각각 7 ng/㎖, 6 ng/㎖ 가 되었다 (도 63). 이 점으로부터 1 가의 항원-항체 반응에 있어서는 HuK5-70 항체와 K5-70 항체는 동등한 항원 친화성 (어피니티) 인 것이 나타났다.
실시예 40 에서 나타낸 바와 같이, 고밀도의 항원 (0.5 ㎍/㎖) 을 고상화한 96 well plate 를 사용한 ELISA 법 (항원 고상화 ELISA) 에서는 K5-70 항체와 HuK5-70 항체의 항원 친화성이 동등한 점에서 (도 53), 저밀도의 항원 (0.1 ㎍/㎖) 을 고상화한 ELISA 법으로 HuK5-70 항체의 항원 결합 활성이 K5-70 항체와 비교하여 상대적으로 낮은 원인으로서, HuK7-50 항체에서는 2 개의 항원 결합 아암의 운동능에 관한 플렉서빌리티, 이른바 "아비디티 (Avidity)" 가 K5-70 항체와 비교하여 상대적으로 낮은 것이 생각되었다.
[실시예 48]
[ 인간형화 K5 -70 항체의 변이체의 제작과 캐릭터라이제이션 ]
HuK5-70 항체의 "아비디티 (Avidity)" 를 향상시키는 것을 목적으로 하여, 이하의 실험을 실시하였다.
전술한 바와 같이 HuK5-70 항체의 "아비디티 (Avidity)" 가 상대적으로 낮은 것이 VH 와 VL 의 어느 것에서 기인하는 것인지를 이하의 실험으로 검토하였다. 먼저, 친항체인 K5-70 항체의 H 사슬 가변 영역 (K5-70 VH), 및 L 사슬 가변 영역 (K5-70 VL) 을 코드하는 유전자를 유전자 합성에 의해 제작하였다 (Operon 사). 그 때, K5-70 VH 및 K5-70 VL 의 유전자 배열의 5' 말단측에 Kozak 배열 (ACC ACC) 을 부가하였다. 또한 K5-70 VH 의 5' 말단에는 제한 효소 부위로서 EcoRI 의 부위 (GAA TTC) 를, 3' 말단에는 NheI 의 부위 (GCT AGC) 를 부가하였다. 동일하게, K5-70 VL 의 5' 말단에는 제한 효소 부위로서 Age I 의 부위 (ACC GGT) 를, 3' 말단에는 BsiWI 의 부위 (CGT ACG) 를 부가하였다. 합성한 K5-70 VH 유전자, 및 K5-70 VL 유전자는 pCR2.1 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하였다. 유전자 합성에 의해 제작한 K5-70 VH 및 VL 의 유전자 배열을 각각 도 64 와 도 65 에 나타냈다. pCR2.1 벡터에 삽입한 K5-70 VH 및 K5-70 VL 유전자는 각각 제한 효소 EcoRI 및 Nhe I, Age I 및 BsiWI 에 의해 소화하고, 유전자 단편의 회수를 실시하였다. 다음으로, 잘라낸 K5-70 VH 유전자는, 인간 IgG1 폼 발현용 벡터인, pFUSE-CHIg-hG1 벡터 (InvivoGen) 의 EcoRI/Nhe I 부위에, K5-70 VL 유전자는 인간 Ig κ 폼 발현용 벡터인 pFUSE2-CLIg-hk 벡터 (InvivoGen) 의 Age I/BsiWI 부위에 각각 삽입하고, 마우스-인간 키메라 콘스트럭트를 완성시켰다 (pFUSE-CHIg-MuK5-70, pFUSE2-CLIg-MuK5-70).
상기에서 제작한 콘스트럭트와 실시예 36 에서 제작한 HuK5-70 H 사슬 발현 벡터 (pFUSE-CHIg-HuK5-70) 및 HuK5-70 L 사슬 발현 벡터 (pFUSE2-CLIg-HuK5-70) 를, 하기 표의 1 ∼ 4 와 같은 조합으로 293F 세포 (Invitrogen) 에 공발현시켰다.
Figure 112014054930572-pct00014
293F 세포 (Invitrogen) 에 대한 트랜스펙션은 NeoFection 시약 (Astec) 을 이용하여 첨부한 방법에 따랐다. 트랜스펙션 후, 5 일간 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) 을 이용하여 37 ℃, CO2 농도 8 ％ 의 CO2 인큐베이터로 배양을 실시한 후 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청 중의 항체 농도는 샌드위치 ELISA 법으로 측정하였다. 구체적으로는, 96 구멍 플레이트를 PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 Goat anti-human IgG (Fcγ specific) (Southern Biotech) 를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅하였다. 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정한 후, 블로킹 버퍼 (2 ％ 스킴 밀크와 0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 를 200 ㎕/웰로 첨가하고, 1 시간, 실온에서 블로킹을 실시하였다. 세정 버퍼로 세정한 후, ELISA 버퍼 (1 ％ 스킴 밀크와 0.025 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 적당한 희석 배율로 희석한 배양 상청을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 2 시간 반응시켰다. 표준품으로서 HuK5-70 항체를 사용하였다. 세정 버퍼로 세정한 후, 검출용 항체로서 ELISA 버퍼로 1,000 배 희석한 HRP 표지 Goat anti-human kappa (κ chain specific) (Southern Biotech) 를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 세정 버퍼로 세정한 후, TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, SIGMA) 기질 용액을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 발색 반응을 실시하였다. 1 M 황산을 25 ㎕/웰로 첨가하고 반응을 정지시킨 후, iMark Microplate reader (Bio Rad) 를 이용하여 655 ㎚ 의 흡광도를 레퍼런스로 하여 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 4 종류의 배양 상청 중의 항체와 hTROP-2 의 결합은 전술한 저밀도 항원 고상화 ELISA 로 측정하였다. 그 결과, 마우스 K5-70 VH 와 HuK5-70 VL 로 구성되는 MuVH/HuVL 항체의 hTROP-2 에 대한 결합은 ChK5-70 항체와 동등하였지만, HuK5-70 VH 와 마우스 K5-70 VL 로 구성되는 HuVH/MuVL 항체의 hTROP-2 에 대한 결합 활성은 ChK5-70 과 비교하여 상대적으로 낮았다 (도 66). 이 점으로부터, HuK5-70 VH 가 HuK5-70 의 "아비디티" 에 관여하고 있는 것이 시사되었다. 그래서, HuK5-70 항체의 "아비디티" 를 향상시킨 개변 항체를 제작하기 위해서, HuK5-70 VH 의 아미노산의 치환을 실시하였다. 도 41 에 나타낸 HuK5-70 VH 와 K5-70 VH 의 아미노산 배열의 얼라인먼트로부터 알 수 있는 바와 같이, 아미노산 번호가 5, 7, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 44, 73, 75, 81, 82c, 83, 87, 108 및 109 번째의 합계 17 개의 아미노산이 HuK5-70 VH 와 K5-70 VH 사이에서 상이하였다 (아미노산 번호는 Kabat 등의 정의 (1991) 에 따랐다). HuK5-70 VH 의 이들 아미노산을 대응하는 K5-70 VH 의 아미노산으로 1 개씩 치환한 변이체를 유전자 합성에 의해 제작하고, 발현 벡터 (pFUSE-CHIg-HuK5-70 변이체) 를 제작하였다. 또한, Landolfi 등의 보고 (J. Immunol. 166 : 1748, 2001) 에 의하면, VH 의 11 번째와 38 번째의 아미노산이 인간형화 항체의 아비디티에 관여하고 있고, 양자의 아미노산을 대응하는 마우스 유래의 아미노산으로 치환함으로써, 아비디티, 및 생물 활성이 향상되는 것이 보고되어 있다. 그래서, 11 번째와 38 번째의 아미노산의 2 중 변이체도 함께 제작하였다. 도 67 에 제작한 18 종류의 HuK5-70 VH 변이체의 명칭과 아미노산 배열을 나타냈다.
제작한 18 종류의 HuK5-70 VH 변이체 (pFUSE-CHIg-HuK5-70 변이체의 발현 벡터) 를, 각각 HuK5-70 L 사슬 발현 벡터 (pFUSE2-CLIg-HuK5-70) 와 조합하여, HEK293 세포로 트랜스펙션하고, 그 배양 상청을 이용하여 각 아미노산 치환 항체와 hTROP-2 의 결합 활성을 저밀도 항원 고상화 ELISA 로 검토하였다. 그 결과, 18 종류의 HuK5-70 VH 변이체 중, HuK5-70 VH 의 44 번째의 R (아르기닌) 을 G (글리신) 로 치환한 R44G 변이체 (HuK5-70 R44G ; 이하 HuK5-70-2) 에 있어서, 분명한 항원 결합 활성의 향상이 확인되었다 (도 68). HuK5-70 VH R44G (이하 HuK5-70 VH2) 유전자의 배열은 도 69 에 나타냈다.
[실시예 49]
[ HuK5 -70-2 항체의 정제 및 캐릭터라이제이션 ]
HuK5-70 R44G 변이형 항체인 HuK5-70-2 항체는 이하와 같이 정제하였다. pFUSE-CHIg-HuK5-70 R44G 와 pFUSE2-CLIg-HuK5-70 을 293F 세포로 트랜스펙션하고, 5 일간 배양을 실시한 후, 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청으로부터 rProtein A sepharose Fast Flow (GE Healthcare) 를 이용하여, HuK5-70-2 항체를 정제하였다. 정제한 HuK5-70-2 항체를 환원 조건하에서 SDS-PAGE 에 의해 전개한 결과, 약 50 kDa 의 H 사슬과 약 25 kDa 의 L 사슬이 확인되고, 각각의 항체의 순도는 95 ％ 이상이었다 (도 70).
정제한 HuK5-70-2 및 HuK5-70 항체의 hTROP-2 와의 결합 활성을 고밀도 항원 고상화 ELISA 및 저밀도 항원 고상화 ELISA 로 검토하였다. 고밀도 항원 고상화 ELISA 로 (1 ㎍/㎖ 의 hTROP-2 를 고상화한 96 웰 플레이트를 사용), 어피니티의 검증을 실시한 결과, HuK5-70 항체와 HuK5-70-2 항체의 결합 곡선은 대략 중복되어, 양자의 어피니티는 동등하고, 다음으로 저밀도 항원 고상화 ELISA (0.1 ㎍/㎖ 의 hTROP-2 를 고상화한 96 웰 플레이트를 사용) 에 의해 아비디티의 검증을 실시한 결과, 배양 상청을 사용한 경우의 결과와 동일하게, HuK5-70-2 항체의 항원 결합 활성은 HuK5-70 항체보다 분명하게 높았다 (도 71). 구체적으로는, EC50 값은, K5-70 항체가 11.4 ng/㎖, HuK5-70 항체가 33.4 ng/㎖, HuK5-70-2 항체가 11.4 ng/㎖ 로, HuK5-70-2 항체는, HuK5-70 항체와 비교하여 "아비디티" 가 향상되어, K5-70 항체와 동등한 활성을 갖는 것이 나타났다.
[실시예 50]
[인간형화 항 hTROP-2 항체의 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성의 측정]
(1) 표적 세포 용액의 조정
표적 세포로는, 내재적으로 hTROP-2 를 발현하는 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 전립선암 세포주 PC-3 을 사용하였다. 10 cm 세포 배양 디쉬로 배양한 타겟 세포를 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 박리하고, 어세이 배지에 현탁하였다. ADCC 어세이용의 배지는 0.5 ％ FBS 를 첨가한 Leivovitz L-15 배지 (SW480 세포) 또는 RPMI-1640 배지 (PK-59, PC-3 세포) 를 사용하였다. 원심 후 (1000 rpm, 3 분, 실온), 펠릿을 동일한 배지로 2 × 105 cell/㎖ 의 세포 밀도가 되도록 조제하고, 표적 세포 용액으로 하였다.
(2) 인간 말초혈 단핵 세포의 분리
정상인 정맥혈을 헤파린 채혈하고, PBS 로 2 배로 희석 후, Lymphoprep (다이이치 화학 약품) 상에 중층하여 원심하였다 (실온, 750 rpm, 5 분, 다음으로 2000 rpm, 20 분). 원심 후, 중간층 분획에 있는 단핵 세포 (정상인 말초혈 단핵구) 를 회수하고, PBS 로 3 회 세정 후, 어세이 배지로 세포 현탁액을 조제하여, 이펙터 세포로서 사용하였다.
(3) 인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70, HuK5-70-2 및 HuT6-16-2 항체) 의 ADCC 활성
96 구멍 평저 플레이트 (FALCON 사 제조) 에 조제한 표적 세포 용액의 100 ㎕ (2 × 104 cell/웰) 를 분주하였다. 이어서, 인간 말초혈 단핵 세포 (이펙터 세포) 를, 이펙터 세포 : 타겟 세포비가 40 : 1 이 되도록 첨가하였다. 또한, 피험 항체로서, 인간형화 항 hTROP-2 항체 (HuK5-70, HuK5-70-2 및 HuT6-16-2 항체) 를 최종 농도가 0.1 ∼ 30 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하여, 전체량을 200 ㎕ 로 하여 CO2 인큐베이터 내 (37 ℃, 5 ％ CO2) 에서 6 시간 배양을 실시하였다. 배양 후, Cytotoxicity Detection Kit (LDH) (Roche, Cat. No. 11 644 793 001) 를 이용하여 Kit 에 첨부된 프로토콜에 따라, 이펙터 세포에 의해 상해를 받은 타겟 세포의 세포질로부터 배양 상청에 방출되는 락트산 탈수소 효소 (LDH) 의 활성을 측정하고, 이 측정 결과를 지표로 하여 ADCC 활성을 평가하였다.
도 72a ∼ 72c 에 나타낸 바와 같이, HuK5-70, 및 HuT6-16-2 항체는 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 인간 대장암 세포주 SW480 (도 72a), 인간 췌장암 세포주 PK-59 (도 72b), 인간 전립선암 세포주 PC-3 (도 72c) 에 대하여, 용량 의존적으로 ADCC 활성을 발휘하는 것이 분명해졌다. 또한 도 72b 및 도 72c 에 나타낸 바와 같이, HuK5-70-2 항체는 인간 췌장암 세포주 PK-59 및 인간 전립선암 세포주 PC-3 세포에 대하여, HuK5-70 항체보다 강한 ADCC 활성을 발휘하는 것이 분명해졌다. HuK5-70-2 항체는, 전술한 바와 같이, HuK5-70 VH 의 44 번째의 R (아르기닌) 을 G (글리신) 로 치환함으로써, hTROP-2 에 대한 결합능 (아비디티) 이 향상된 항체로, HuK5-70 항체에 비하여 향상된 아비디티가 ADCC 활성에 반영되어 있는 것이 나타났다. 따라서, HuK5-70-2 항체는, in vivo 에 있어서도, HuK5-70 항체와 마찬가지로 우수한 항종양 활성을 갖는 (바람직하게는, HuK5-70 항체보다 높은 항종양 활성을 가질 수 있는) 것으로 추인된다. 이상의 결과로부터, HuK5-70, HuK5-70-2 및 HuT6-16-2 항체는 hTROP-2 를 세포 표면에 발현하는 암에 대하여 유효한 치료용 항체가 되는 것이 시사되었다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, hTROP-2 와 특이적으로 반응하고, in vivo 에 있어서 높은 항종양 활성을 갖는 항체, 구체적으로는, 저용량으로 in vivo 에서의 높은 항종양 활성을 갖는 모노클로날 항체, 특히 당해 항체 중 인간형화 항체인 것을 제공할 수 있다. 또한 본 발명은, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체의 단편, 당해 항체 등과 각종 약제의 복합체, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트를 제공할 수 있다.
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(1)..(402) <400> 44 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag caa cct ggg tct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg 20 25 30 cct gga gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cat gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga aat att tat cct ggt ggt ggt tat act aac tac gat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp 65 70 75 80 gag aag ttc aag agc aag ggc aca ctg act gta gac aca tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt aca aga tca tcc gtt ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 act ctc aca gtc tcc tca 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 45 <211> 134 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 46 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 47 Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 48 Ser Ser Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 381 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 49 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag aac 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 40 45 att ggc aca agc ata cac tgg ttt cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 50 <211> 127 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 50 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 51 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 52 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 53 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 54 <211> 396 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 54 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg ata acc tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg atc gga aat att tat cct tct gat agt tat act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 caa aag ttc agg gac aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agt 288 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ccg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt tca gcc ctc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 384 Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 aca gtc tcc tca 396 Thr Val Ser Ser 130 <210> 55 <211> 132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 55 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 56 Ser Tyr Trp Ile Thr 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 57 Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 58 Leu Phe Asp Tyr 1 <210> 59 <211> 381 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 59 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agc 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 att ggc aca agc ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt att ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 90 95 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 60 <211> 127 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 60 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 61 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 62 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 63 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 64 <211> 423 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(423) <400> 64 atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggc 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cac tct gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gac tac aat atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 gaa tgg att gga tat att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 cag agg ttc aag agc agg gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gat gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gaa gac tac ggt agt agc ccc tct tat gct atg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 gac tat tgg ggt caa gga acc tca gtc atc gtc tcc tca 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser 130 135 140 <210> 65 <211> 141 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 65 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser 130 135 140 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 66 Asp Tyr Asn Met His 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 67 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 68 Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 390 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <400> 69 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat cag gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gta cac ggt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg acg gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa act aca cat gtt ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa 384 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ata aaa 390 Ile Lys 130 <210> 70 <211> 130 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 70 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 71 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 72 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 73 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr 1 5 <210> 74 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(402) <400> 74 atg ggg tgg agc tgc att atc ctg ttt ctt gtc gca act gca aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtt cac tca cag gtt cag cta gtc cag tct gga gct gag gtg aag aaa 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca ggg gca tct gtc aaa gtg agc tgt aag gcc tct ggc tat acg ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acg ata tac tgg atc aat tgg gtg agg caa gct cct gga caa cgg ttg 192 Thr Ile Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 gaa tgg att ggc aac atc tat ccc tca gac tcc tac acc aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gac aaa gcc act ctc acc gta gat acc agt gcc tcc 288 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gag ctg agc agt tta cgc agc gaa gat aca gcg gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgc acc aga acc tcc atg gct gac tat tgg ggt cag ggt aca 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 ctg gtg act gtg agc tcc 402 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 75 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 75 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ile Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 76 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <400> 76 atg gta agc aca ccc cag ttc ctc gtt ttc ctc ctg ttt tgg att ccc 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 gca agt aga ggg gag atc gtc ttg act cag agt cct gcc aca ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ctt tca cca gga gaa agg gcg aca ctt agc tgt cga gct tct cag agc 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 att ggc acg tcc ata cac tgg tat cag cag aaa ccg gga caa gct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 cgg tta ctg atc aag tat gcc tcc gaa agc atc tct ggg att cct gca 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 cgc ttt agc gga agc ggt agt ggt acc gac ttc act ctg acc ata tcc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 tca cta gaa ccc gag gat ttt gcc gtg tac tac tgc cag cag tcc aac 336 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 tca tgg cct ttc acc ttt ggc caa ggc acc aaa gtg gag atc aag 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 77 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 77 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 78 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(423) <400> 78 atg gga tgg tct tgg atc ttt ctc ttc ctg ctg tct ggc aca gct gga 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtg cat tcc caa gtt cag ctg gtc cag tcc gga gct gaa gtt aaa aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 ccc ggg gcc agc gtc aaa gtc tcc tgc aag gca tcc ggg tat act ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc gat tat aac atg cac tgg gtg cgc caa gca ccc ggc cag ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att ggc tat atc tat cct tat aat gga ggg acc ggc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 cag aga ttc aag agc aga gcc acc atg aca gtg gat aaa tct acc agc 288 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 act gcc tac atg gag ctg aga agc ctg cgg agc gac gac aca gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgt gcc cgc gag gat tac gga agc agc cca agc tac gcc atg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 gat tac tgg ggc caa ggc act atg gtg acc gtg agc agc 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 79 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 79 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 80 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(423) <400> 80 atg ggc tgg tct tgg atc ttc ctc ttc ctg ctg agc ggg acc gct gga 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 gtc cat tct caa gtc caa ctg gtc cag tcc ggg gct gaa gtg aaa aaa 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca gga gca tcc gtt aag gtg tcc tgt aag gca agc gga tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc gac tat aac atg cac tgg gtg agg cag gcc ccc gga cag ggg ctg 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg atc ggc tat att tat cct tac aac ggg ggc act ggc tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 cag aga ttt aag agc cgc gct acc atg acc gtg gac acc tcc act tct 288 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gag ctg aga agc ctg cgg agc gat gat aca gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgc gcc aga gaa gat tac ggc agc agc ccc agc tac gcc atg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120 125 gac tac tgg ggc cag ggc aca atg gtt act gtg agc agc 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 81 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 81 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly 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30 aca cca ggc gaa cct gca tct att agc tgt aga agc agc cag tcc ctg 144 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gtg cac gga aac gga aac acc tat ctg cac tgg tac ctg caa aaa cct 192 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 gga cag agc ccc cag ctg ctg atc tac aaa gtc agc aat aga ttt agc 240 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtg ccc gac agg ttt agc ggc agc ggc agc ggc aca gat ttc acc 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctg aaa atc tcc cgg gtg gaa gcc gag gac gtt ggg gtt tac tat tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 agc cag aca acc cat gtg ccc act ttc ggg ggc ggc act aag gtg gag 384 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 atc aag 390 Ile Lys 130 <210> 83 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (recombinant protein) <400> 83 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 84 <211> 563 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (102)..(458) <400> 84 aaccacatcc ctcctcagaa gcccccagag cacaactcct taccatggac tggacctgga 60 ggatcctctt tttggtggca gcagccacag gtgcccactc c cag gtc cag ctt gtg 116 Gln Val Gln Leu Val 1 5 cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc 164 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 10 15 20 tgc aag gct tct gga tac acc ttc act aac tat gct ctg cat tgg gtg 212 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ala Leu His Trp Val 25 30 35 cgc cag gcc ccc gga caa agg ctt gag tgg atg gga tgg atc aac act 260 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 40 45 50 ggc aat ggt aac aca aaa tat tca cag aag ttc cag ggc aga gtc acc 308 Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr 55 60 65 ctt acc agt gac aca tcc gcg agc aca gcc tac atg gag atg agc agc 356 Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Met Ser Ser 70 75 80 85 ctg aga tct gaa gac acg gct gtg tat tac tgt gcg agg agc agt ggc 404 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Gly 90 95 100 tgg tac gtt tgg ttc gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc 452 Trp Tyr Val Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 tcc tca gcttccacca agggcccatc ggttttcccc ctggcgccct gctccaggag 508 Ser Ser cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaa 563 <210> 85 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ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtt agc agc tac tta gcc tgg tat caa cag aaa cct ggc cag gct ccc 192 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc 240 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc cta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc 336 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 aac tgg cct cgg tcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cga 384 Asn Trp Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 87 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Met Glu Val Leu Val Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 88 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (112)..(477) <400> 88 acccaaaaac cacacccctc cttgggagaa tcccctagat cacagctcct caccatggac 60 tggacctgga gcatcctttt cttggtggca gcagcaacag gtgcccactc c cag gtt 117 Gln Val 1 cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc tca gtg 165 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 5 10 15 aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc agt tat ggt atc 213 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile 20 25 30 agt tgg gtg cgc cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg gga ttg 261 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Leu 35 40 45 50 atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc cag ggc 309 Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly 55 60 65 aga gtc acc atg acc gta gac acg tct acg agc aca gcc tat atg gaa 357 Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 70 75 80 ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtc tat tac tgt gcg aga 405 Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 gat gga ata gca gtg gcg acc aaa gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 453 Asp Gly Ile Ala Val Ala Thr Lys Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 ggg aca atg gtc acc gtc tct tca gcacccacca aggctccgga tgtgttcccc 507 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 atcatatcag ggtgcagaca cccaaaggat aacagccctg tggtcctggc atgcttgata 567 actgggtacc acccaacgtc cgtgactgtc acct 601 <210> 89 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gln Val Gln Leu 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Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc agg gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 cta caa act ctg ggg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 336 Leu Gln Thr Leu Gly Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 aaa cga 342 Lys Arg <210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 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Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 98 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant protein <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (13)..(414) <400> 99 gaattcacca cc atg gga tgg tcc tgc att att ctc ttt ctc gtc gcc acc 51 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr 1 5 10 gcc aca ggc gtg cac agc cag gtt caa ctg cag caa cct ggg gca gag 99 Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu 15 20 25 ctg gtt cgg cca ggg gcc tcc gtc aaa ctg tcc tgc aaa gct tct ggc 147 Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly 30 35 40 45 tac act ttc acc atc tac tgg atc aac tgg gtg aag cag agg ccc ggc 195 Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 50 55 60 cag ggc ctg gaa tgg atc gga aat atc tat cct agc gat tct tac aca 243 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 65 70 75 aat tac aac cag aag ttc aag gac aag gct acc ctg acc gtg gac aaa 291 Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 80 85 90 tct agc tcc aca gcc tac atg cag ctg agc agc ccc act agc gag gat 339 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp 95 100 105 agc gca gtg tat tat tgt acc aga acc agc atg gcc gac tat tgg gga 387 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly 110 115 120 125 cag ggc aca act ctg acc gtg agc agc gctagc 420 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 100 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (13)..(393) <400> 100 accggtacca cc atg gtt agc aca cct caa ttt ctg gtc ttc ctg ctc ttc 51 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe 1 5 10 tgg att cct gcc agc aga gga gat atc ctc ctg aca caa agc ccc gca 99 Trp Ile Pro Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala 15 20 25 atc ctg agc gtg tcc ccc gga gag cgc gtg agc ttt agc tgc cgg gcc 147 Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala 30 35 40 45 agc cag agc att gga acc agc atc cac tgg tat cag cag aga acc aac 195 Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn 50 55 60 ggg tct ccc agg ctg ctg att aaa tac gct tct gag tct att tcc ggg 243 Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly 65 70 75 atc cca agc aga ttc tcc ggc tct ggc agc ggc act gat ttt act ctg 291 Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 80 85 90 tct atc aac agc gtg gag tcc gaa gac atc gcc gac tac tat tgt cag 339 Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 95 100 105 cag agc aat tcc tgg cca ttc acc ttt ggc agc ggc acc aag ctg gaa 387 Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 110 115 120 125 atc aag cgtacg 399 Ile Lys <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 101 Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln 1 5 10 15 Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr 20 25 30 <210> 102 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 102 Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser 20 25 30 <210> 103 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 103 Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys 1 5 10 15 Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser 20 25 30 <210> 104 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 104 Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg 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Gln Asn Thr Ser Gln Lys Ala Ala 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 121 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 121 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 122 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 123 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 123 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 124 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 124 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 125 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 125 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys <210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 126 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys <210> 127 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 127 Cys Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 128 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 128 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 129 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 129 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys <210> 130 <211> 32 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 130 Val His 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Arg Glu Arg Cys 20 25 30 <210> 166 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 166 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 167 <211> 19 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 167 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys Pro Lys <210> 168 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 168 Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys 20 25 30 <210> 169 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 169 Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu 1 5 10 15 Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His 20 25 30 <210> 170 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 170 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 1 5 10 15 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 20 25 30 Cys <210> 171 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 171 Cys Phe Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro 1 5 10 15 Cys <210> 172 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 172 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys <210> 173 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 173 Cys Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 174 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 174 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 175 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 175 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 176 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 176 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys <210> 177 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 177 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu 20 25 30 Cys <210> 178 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 178 Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu 1 5 10 15 <210> 179 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 179 Cys Thr Val Ala Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Ala Gln Ala Arg 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 180 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 180 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 181 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 181 Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile 1 5 10 15 Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser 20 25 30 <210> 182 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 182 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 183 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 183 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 1 5 10 15 Cys Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr 20 25 30 Cys <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 184 Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn 1 5 10 15 <210> 185 <211> 31 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 185 Cys Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Cys Pro 1 5 10 15 Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Cys 20 25 30 <210> 186 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 186 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 187 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 187 Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala 1 5 10 15 <210> 188 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 188 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 189 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 189 Cys Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr 1 5 10 15 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 20 25 30 Cys <210> 190 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 190 Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln 1 5 10 15 <210> 191 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 191 Cys Thr Val Ala Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Ala Gln Ala Arg 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 192 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 192 Cys Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln 1 5 10 15 Cys Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln 20 25 30 Cys <210> 193 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 193 Cys Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val Ala Trp 1 5 10 15 Cys Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn 20 25 30 Cys <210> 194 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 194 Cys Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 195 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 195 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 196 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 196 Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu 1 5 10 15 <210> 197 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 197 Cys Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Cys Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val Ala 20 25 30 Cys <210> 198 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 198 Cys Thr Val Ala Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Ala Gln Ala Arg 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 199 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 199 Cys Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 200 <211> 31 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 200 Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn 1 5 10 15 Cys Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg 20 25 30 <210> 201 <211> 32 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 201 Cys Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Cys 20 25 30 <210> 202 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 202 Cys Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Ala Gln Ala Arg Ala Leu Gly Ser 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 203 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 203 Cys Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn Asp Gly 1 5 10 15 Cys Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val Ala Trp 20 25 30 Cys <210> 204 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 204 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 1 5 10 15 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 20 25 30 Cys <210> 205 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 205 Cys Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala 1 5 10 15 Cys Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr Ser Val 20 25 30 Cys <210> 206 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 206 Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 1 5 10 15 <210> 207 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 207 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 1 5 10 15 Cys Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn Gln Thr 20 25 30 Cys <210> 208 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 208 Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr 1 5 10 15 <210> 209 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 209 Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser 1 5 10 15 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 20 25 30 Cys <210> 210 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 210 Cys Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 1 5 10 15 Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln 20 25 30 Cys <210> 211 <211> 32 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 211 His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Cys 1 5 10 15 His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Cys 20 25 30 <210> 212 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 212 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 1 5 10 15 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 20 25 30 Cys <210> 213 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 213 Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser 1 5 10 15 Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile 20 25 30 <210> 214 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 214 Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro 20 25 30 <210> 215 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 215 Cys Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 216 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 216 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 217 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 217 Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 218 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 218 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 219 <211> 30 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 219 Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp 1 5 10 15 Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 <210> 220 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 220 Cys Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 221 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 221 Cys Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 1 5 10 15 Cys Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln Ala Asn 20 25 30 Cys <210> 222 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 222 Cys Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Cys Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 20 25 30 Cys <210> 223 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 223 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 224 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 224 Cys Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 1 5 10 15 Cys Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe 20 25 30 Cys <210> 225 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 225 Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser 1 5 10 15 Cys Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Ala Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala 20 25 30 Cys <210> 226 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 226 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 1 5 10 15 Cys His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg 20 25 30 Cys <210> 227 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 227 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 228 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 228 Cys Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg 1 5 10 15 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 20 25 30 Cys <210> 229 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 229 Cys Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys <210> 230 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 230 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 1 5 10 15 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 20 25 30 Cys <210> 231 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 231 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Cys Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 20 25 30 Cys <210> 232 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 232 Cys Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Ala Asp 1 5 10 15 Cys Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Ala Asp 20 25 30 Cys <210> 233 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 233 Cys Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg 1 5 10 15 Cys His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 234 <211> 33 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 234 Cys Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg 1 5 10 15 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 20 25 30 Cys

Claims (45)

  1. 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 사슬(H 사슬) 가변 영역(V 영역)과, 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 사슬(L 사슬) 가변 영역(V 영역)을 포함하는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역은 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ~ 3 의 아미노산 배열을 포함하고,
    상기 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 36 ∼ 38 로 나타내는 아미노산 배열이고; 및/또는,
    항체의 L 사슬 V 영역은 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ~ 3 의 아미노산 배열을 포함하고,
    상기 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 41 ∼ 43 으로 나타내는 아미노산 배열인 항체.
  3. 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 사슬(H 사슬) 가변 영역(V 영역)과, 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 사슬(L 사슬) 가변 영역(V 영역)을 포함하는 인간 TROP-2 에 대한 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    항체의 H 사슬 V 영역은 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ~ 3 의 아미노산 배열을 포함하고,
    상기 H 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 66 ∼ 68 로 나타내는 아미노산 배열이고; 및/또는,
    항체의 L 사슬 V 영역은 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ~ 3 의 아미노산 배열을 포함하고,
    상기 L 사슬 V 영역의 CDR 1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 71 ∼ 73 으로 나타내는 아미노산 배열인 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간형화 항체인 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것인 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    5 ∼ 20 ㎎/㎏ 체중의 투여량으로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것인 항체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 종양 성장 저해 활성을 나타내기 위한 투여 횟수가 많아도 1 주일에 1 회인 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    10 ㎎/㎏ 체중의 단회 투여로 50 ％ 이상의 종양 성장 저해 활성을 나타내는 것인 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 종 이상의 인간 종양 세포주에 대하여 항종양 활성을 갖는 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해리 정수 (Kd 값) 가 1.0 × 10-10 M 이하인 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 모노클로날 항체인 항체.
  13. 제 6 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항체.
  14. 제 6 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 폐암, 인간 유방암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항체.
  15. 제 6 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 항체.
  16. 제 10 항에 있어서,
    종양 세포주가 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 췌장암 세포주 KP-3L, 인간 췌장암 세포주 KP-2, 인간 췌장암 세포주 PK-1, 인간 췌장암 세포주 PK-45H, 인간 췌장암 세포주 PK-45P, 인간 췌장암 세포주 TCC-PAN2, 인간 췌장암 세포주 SUIT-2, 인간 대장암 세포주 CACO-2, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 대장암 세포주 DLD-1, 인간 대장암 세포주 HCT 116, 인간 유방암 세포주 JIMT-1, 인간 유방암 세포주 HCC1143, 인간 유방암 세포주 MCF-7, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468, 인간 전립선암 세포주 DU145, 인간 전립선암 세포주 PC-3, 인간 난소암 세포주 SK-OV-3, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 인간 담관암 세포주 TFK-1 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종인 항체.
  17. 제 10 항에 있어서,
    종양 세포주가 인간 췌장암 세포주 PK-59, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, 인간 대장암 세포주 SW480, 인간 폐암 세포주 Calu-3, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468 및 인간 난소암 세포주 SK-OV-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2 종인 항체.
  18. 삭제
  19. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서,
    배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편.
  20. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서,
    배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편.
  21. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체.
  22. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체 단편-약제 복합체.
  23. 제 21 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 복합체.
  24. 제 21 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 대장암, 인간 폐암, 인간 유방암 및 인간 난소암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 복합체.
  25. 제 21 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 복합체.
  26. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편, 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는,
    종양의 치료용 또는 진단용 의약 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    종양의 치료에 사용하는 것인 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 조성물.
  29. 제 26 항에 있어서,
    종양의 진단에 사용하는 것인 조성물.
  30. 제 26 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 조성물.
  31. 제 26 항에 있어서,
    종양이 재발암 또는 전이암인 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편, 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.
  33. 제 32 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 치료제.
  34. 제 32 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 치료제.
  35. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편, 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 진단제.
  36. 제 35 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 진단제.
  37. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편, 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 종양의 검출 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편으로서, 배열 번호 92 또는 98 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 93 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하거나, 배열 번호 94 또는 95 로 나타내는 아미노산 배열, 및 배열 번호 96 으로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 항체 단편, 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 물질을 포함하는 항체-약제 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
  40. 제 39 항에 있어서,
    종양이 인간 췌장암, 인간 전립선암, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 난소암, 인간 폐암 및 인간 담관암으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 키트.
  41. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  42. 제 19 항에 기재된 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  43. 제 41 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  44. 제 43 항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질 전환체.
  45. 제 20 항에 기재된 항체 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
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