JP6043725B2 - ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体 - Google Patents

ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体 Download PDF

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Description

本発明は、抗腫瘍活性を有する抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体、特にｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体に関する。また本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、及び当該抗体の用途に関する。
ヒトＴＲＯＰ−２（Ｔａｃｓｔｄ２，ＧＡ７３３−１，ＥＧＰ−１）（以下、ｈＴＲＯＰ−２とも表記する。）は、種々の上皮細胞癌種において過剰発現していることが知られる、３２３アミノ酸残基（配列番号２参照）からなる１回膜貫通型の１型細胞膜タンパク質である。以前より、ヒト栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）と癌細胞に共通する免疫抵抗性に関与する細胞膜タンパク質の存在（非特許文献１）が示唆されていたが、ヒト絨毛癌細胞株ＢｅＷｏの細胞膜タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（１６２−２５．３，１６２−４６．２）により認識される抗原分子が特定され、ヒト栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）に発現する分子の一つとしてＴｒｏｐ−２と命名された（非特許文献２）。後に、同じ分子が、他の研究者によって発見され、胃癌細胞ＳＷ９４８を免疫して得られたマウスモノクローナル抗体ＧＡ７３３によって認識される腫瘍抗原ＧＡ７３３−１（非特許文献３）、非小細胞肺癌細胞免疫によって得られたマウスモノクローナル抗体ＲＳ７−３Ｇ１１により認識される上皮糖タンパク質（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ／ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ，ＥＧＰ−１）（非特許文献４）とも呼ばれたが、１９９５年にＴｒｏｐ−２の遺伝子がクローニングされ、これらが同一の分子であることが確認された（非特許文献５）。また、癌細胞において細胞内カルシウムシグナルを増幅させる機能が明らかにされ（非特許文献６）、ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ２，ＴＡＣＳＴＤ２とも呼ばれる。
ｈＴＲＯＰ−２遺伝子は、染色体１ｐ３２にマッピングされ、約５０％の相同性を持つＧＡ７３３−２（ＴＡＣＳＴＤ１、上皮糖タンパク質ＥＧＰ−２、ＥｐＣＡＭ及びＴｒｏｐ−１としても知られている）とともにＴＡＣＳＴＤ遺伝子ファミリーを構成している（非特許文献７）。ｈＴＲＯＰ−２タンパク質（３２３アミノ酸残基；配列番号２）は、およそ３６キロダルトンの分子量を有し、親水性のシグナルペプチド（第１〜２６番目のアミノ酸）、細胞外ドメイン（第２７〜２７４番目のアミノ酸）、細胞膜貫通ドメイン（第２７５〜２９７番目のアミノ酸）ならびに細胞内ドメイン（第２９８〜３２３番目のアミノ酸）からなる。細胞外ドメインには４つの不均質Ｎ結合グリコシル化部位があり、糖鎖付加により見かけ上の分子量は１１〜１３キロダルトン増加する（非特許文献５）。ＴＡＣＳＴＤ遺伝子ファミリーでは、細胞外ドメインに特徴的なｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＴＹ）配列を有し、癌細胞の増殖や浸潤、転移に関与すると考えられている。
これまでに、ｈＴＲＯＰ−２の生理学的リガンドは同定されておらず、分子機能は明らかにされていないが、腫瘍細胞においてカルシウムシグナルを伝達することが示され（非特許文献６）、また、Ｃａ２＋依存性のキナーゼであるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）により、細胞内セリン３０３残基がリン酸化されること（非特許文献４）や、細胞内ドメインにＰＩＰ２結合配列を有することから、腫瘍細胞におけるシグナル伝達機能が示唆されている（非特許文献８）。
免疫組織化学（ＩＨＣ）及びフローサイトメトリーなどの解析により、胃癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵癌、肝癌、食道癌などの多くの上皮由来癌腫においてｈＴＲＯＰ−２の過剰発現が報告されている。これに対し、正常組織における発現は上皮領域の細胞に限定され、発現レベルも癌腫に比較して低いことが示され、ＴＲＯＰ−２の腫瘍形成への関与が示唆されている（特許文献１〜３及び９）。
また、臨床検体におけるバイオマーカーとしてのｈＴＲＯＰ−２の発現は、大腸癌（非特許文献１０及び１１）、膵臓癌（非特許文献１２）や口腔癌（非特許文献１３）の悪性度と相関し、ｈＴＲＯＰ−２が高発現している場合には癌の転移や再発が有意に高いことが示されている。また、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用した大規模遺伝子発現分析において、正常な卵巣上皮と比較して卵巣の重篤な乳頭状腺癌に最も高度に過剰発現している遺伝子群のひとつとして同定された（非特許文献１４）。
さらに、近年、腫瘍形成におけるｈＴＲＯＰ−２の重要な役割が大腸癌細胞を用いたモデルにより証明された（非特許文献１５）。ｈＴＲＯＰ−２の発現が腫瘍細胞の足場非依存的細胞増殖を促進し、免疫不全マウスの皮下に移植した癌細胞の腫瘍形成及び増殖に必要であることから、機能的な腫瘍抗原として新たな治療標的となる可能性を示した。
これまでに、いくつかの抗ｈＴＲＯＰ−２抗体について抗腫瘍効果の検討が報告されている。ＲＳ７抗体（特許文献１）について、放射性物質で標識した抗体を用いたｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験され、ヌードマウス異種移植モデルにおける抗腫瘍活性が示されているが、抗体単独（裸抗体）での抗腫瘍効果は報告されていない。
この他に、細胞毒素を結合させた抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０（特許文献２）による、ヒト癌細胞株Ｈ３６１９、Ｈ２９８７、ＭＣＦ−７、Ｈ３３９６及びＨ２９８１に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験での細胞障害性が報告されているが、ｉｎ ｖｉｖｏデータでは裸抗体又はＢＲ１１０の免疫複合体について開示されているものはなかった。
近年、ヒト卵巣癌組織をマウスに免疫することで得られたハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２あるいはＡＲ５２Ａ３０１．５により産生される単離モノクローナル抗体が、ｈＴＲＯＰ−２と結合し、裸抗体として初めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞障害性に加え、ヌードマウス異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を示すことが報告された（特許文献３及び４）。しかしながら、これら文献中では、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３及びＰＬ４５、前立腺癌細胞ＰＣ−３、乳癌細胞ＭＣＦ−７並びに大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５を移植したマウス異種移植モデルにおいて抗体単独での抗腫瘍効果が示されているが、ＢｘＰＣ−３細胞移植において治療効果が示されている以外は、抗体の予防的投与により腫瘍形成及び増殖を部分的に（約４０〜６０％）抑制することが示されているに留まり、また、必要とされる抗体量も、２０ｍｇ／ｋｇ程度と非常に高用量であった。
以上の従来の知見から、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の抗腫瘍抗体としての可能性が示唆されているが、同時に、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体のすべてが裸抗体として抗体単独でｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍効果を示すものではなく、抗体の結合部位や親和性、モノクローナル抗体の性質により、ｈＴＲＯＰ−２に対する作用が異なることを示している。
米国特許第６６５３１０４号 米国特許第５８４０８５４号 米国特許第７４２００４０号 米国特許第７４２００４１号 Ｆａｕｌｋ ＷＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，７５（４），ｐ．１９４７−１９５１（１９７８） Ｌｉｐｉｎｓｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，７８（８），ｐ．５１４７−５１５０（１９８１） Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ，８６（１），ｐ．２７−３１（１９８９） Ｂａｓｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２（４），ｐ．４７２−４７９（１９９５） Ｆｏｒｎａｒｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２（５），ｐ．６１０−６１８（１９９５） Ｒｉｐａｎｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６（５），ｐ．６７１−６７６（１９９８） Ｃａｌａｂｒｅｓｅ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，９２（１−２），ｐ．１６４−１６５（２００１） Ｅｌ Ｓｅｗｅｄｙ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５（２），ｐ．３２４−３３０（１９９８） Ｃｕｂａｓ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７９６（２），ｐ．３０９−３１４（２００９） Ｏｈｍａｃｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２（１０），ｐ．３０５７−３０６３（２００６） Ｆａｎｇ ＹＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ．，２４（８），ｐ．８７５−８８４（２００９） Ｆｏｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９９（８），ｐ．１２９０−１２９５（２００８） Ｆｏｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，２１（２），ｐ．１８６−１９１（２００８） Ｓａｎｔｉｎ ＡＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２（１），ｐ．１４−２５（２００４） Ｗａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，７（２），ｐ．２８０−２８５（２００８）
このような状況下において、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて高い抗腫瘍活性を有する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体）、具体的には、裸抗体として抗体単独でｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を有し、しかも低用量で当該効果を有する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体、特に当該抗体であってヒト型化抗体であるもの等の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体）、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体の断片、当該抗体等と薬剤との複合体（イムノコンジュゲート）、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍の検出方法、腫瘍の検出用又は診断用キット等を提供するものである。
（１）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９２又は９８で示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９３で示されるアミノ酸配列からなるヒトＴＲＯＰ−２に対する抗体。
上記（１）の抗体は、そのＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３６〜３８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１〜４３で示されるアミノ酸配列である。
（２）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９４又は９５で示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９６で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトＴＲＯＰ−２に対する抗体。
上記（２）の抗体は、そのＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６６〜６８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号７１〜７３で示されるアミノ酸配列である。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、ヒト型化抗体であるものが挙げられる。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものが挙げられる。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で５０％以上の腫瘍成長阻害活性を示すものが挙げられる。ここで、当該腫瘍成長阻害活性を示すための投与回数は、例えば、多くても１週間に１回である。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で５０％以上の腫瘍成長阻害活性を示すものが挙げられる。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、２種以上のヒト腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性を有するものが挙げられる。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、解離定数（Ｋｄ値）が１．０×１０−１０Ｍ以下であるものが挙げられる。
上記（１）及び（２）の抗体は、例えば、モノクローナル抗体であるものが挙げられる。
ここで、上記腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。
また、上記腫瘍としては、例えば、再発癌又は転移癌が挙げられる。
また、上記腫瘍細胞株としては、例えば、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト膵癌細胞株ＫＰ−３Ｌ、ヒト膵癌細胞株ＫＰ−２、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−１、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｈ、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐ、ヒト膵癌細胞株ＴＣＣ−ＰＡＮ２、ヒト膵癌細胞株ＳＵＩＴ−２、ヒト大腸癌細胞株ＣＡＣＯ−２、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ １１６、ヒト乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１１４３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞株ＭＢＡ−ＭＤ−４６８、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、及びヒト胆管癌細胞株ＴＦＫ−１からなる群より選ばれる少なくとも２種が挙げられ、なかでも、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＢＡ−ＭＤ−４６８及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３からなる群より選ばれる少なくとも２種が好ましく挙げられる。
（３）上記（１）及び（２）の抗体に由来する抗体断片。
上記（３）の抗体断片は、例えば、配列番号９２または９８で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号９３で示されるアミノ酸配列を含むものや、あるいは、配列番号９４又は９５で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号９６で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
（４）上記（１）及び（２）の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体−薬剤複合体。
（５）上記（３）の抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体断片−薬剤複合体。
上記（４）及び（５）の複合体において、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。また、腫瘍としては、例えば、再発癌又は転移癌も挙げられる。
（６）上記（１）及び（２）の抗体、上記（３）の抗体断片、及び上記（４）及び（５）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
上記（６）の医薬組成物は、例えば、腫瘍の治療に用いるものや、体重減少の副作用を有しないものや、腫瘍の診断に用いるものが挙げられる。ここで、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。また、腫瘍としては、例えば、再発癌又は転移癌も挙げられる。
（７）上記（１）及び（２）の抗体、上記（３）の抗体断片、及び上記（４）及び（５）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
上記（７）の腫瘍治療剤は、例えば、体重減少の副作用を有しないものが挙げられる。ここで、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。
（８）上記（１）及び（２）の抗体、上記（３）の抗体断片、及び上記（４）及び（５）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍診断剤。
上記（８）の腫瘍診断剤において、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。
（９）上記（１）及び（２）の抗体、上記（３）の抗体断片、及び上記（４）及び（５）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。
上記（９）の腫瘍の検出方法において、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。
（１０）上記（１）及び（２）の抗体、上記（３）の抗体断片、及び上記（４）及び（５）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット
上記（１０）の腫瘍の治療用、診断用又は検出用キットにおいて、腫瘍としては、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、なかでもヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肺癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。
（１１）上記（１）及び（２）の抗体をコードするポリヌクレオチド。
（１２）上記（３）の抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
（１３）上記（１１）又は（１２）のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（１４）上記（１３）の組換えベクターを含む形質転換体。
図１は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（Ｋ５−７０）の、抗原親和性（Ｋｄ：解離定数）測定を示す図である。Ａｂｔ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｔｏｔａｌ），Ａｇｆ：Ａｎｔｉｇｅｎ（ｆｒｅｅ）
図２は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ培養上清の、ＨｕＨ−７細胞（ｈＴＲＯＰ−２陰性）とＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞との反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムはＨｕＨ−７細胞を示し、黒のラインのヒストグラムはＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞を示す。
図３は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現している、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９細胞）との反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、各抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す
図４は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現している、ヒト膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ−３細胞）との反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、各抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す。
図５は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（Ｋ５−７０）の、ヒト膵臓癌細胞株との反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す。
図６は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（Ｋ５−７０）の、ヒト大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ３２０，ＣＡＣＯ２，ＳＷ４８０，ＤＬＤ１，ＣＷ２，ＨＣＴ １１６），ヒト乳癌（ＪＩＭＴ−１，ＨＣＣ１１４３）およびヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３，ＤＵ１４５）との反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す。
図７は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の、マウスＴＲＯＰ−２との交差反応性を調べた図である。細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、マウスＴＲＯＰ−２遺伝子を一過性発現させた細胞を用い、陽性対照抗体として、マウスＴＲＯＰ−２と交差性を示すＴ２−１０２抗体（マウスＩｇＧ１）を用いた。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、各抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す。
図８は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の、ヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１との交差反応性を調べた図である。細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１遺伝子を一過性発現させた細胞を用い、陽性対照抗体として、ＰＥ標識抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（ベクトンディッキンソン）を用いた。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインのヒストグラムは、各抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体と反応させたものを示す。
図９は、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｔ６−１６，Ｔ５−８６，Ｋ５−７０，Ｋ５−１０７）のヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９細胞）の細胞増殖阻害活性を示す図である。ｍＩｇＧはコントロール抗体（マウスＩｇＧ），ＹＹ０１：市販の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を示す。白カラム：０μｇ／ｍＬ，灰色カラム：０．１μｇ／ｍＬ，黒カラム：１μｇ／ｍＬ。抗体添加をしていない（０μｇ／ｍＬ）時の値に対するｒａｔｉｏで表した。エラーバーは標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１０は、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｔ６−１６，Ｋ５−７０）のヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９細胞）のスクラッチアッセイを示す図である。
Ａ．ＰＫ−５９細胞のスクラッチ領域の写真の代表例を示す。Ｄａｙ０：スクラッチ直後の代表例を示す。ｍＩｇＧ（Ｄａｙ１）：スクラッチ後、コントロール抗体（マウスＩｇＧ、１μｇ／ｍＬ）を培地に添加し、１日後（２４時間後）の写真。Ｋ５−７０（Ｄａｙ１）：スクラッチ後、Ｋ５−７０抗体（１μｇ／ｍＬ）を培地に添加し、１日後（２４時間後）の写真。Ｔ６−１６（Ｄａｙ１）：スクラッチ後、Ｔ６−１６抗体（１μｇ／ｍＬ）を培地に添加し、１日後（２４時間後）の写真。写真中に示した矢印は、スクラッチ領域の幅を示した。
Ｂ．画像解析ソフト（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ）でスクラッチ領域の面積を解析し、その値を基に、コントロール抗体（ｍＩｇＧ）添加群のＤａｙ０を基準値１として、各被検抗体における値を算出した。
＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１１は、ヒト膵臓癌細胞株，ＰＫ−５９細胞の幹細胞マーカーの発現を示すＦＡＣＳの図である。Ａ：ＰＫ−５９細胞におけるＥｐＣＡＭの発現を示すＦＡＣＳの図である。黒塗りのヒストグラムは二次抗体（ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ）のみ、黒ラインは、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（ベクトンディッキンソン）と反応させた場合のヒストグラムを示す。Ｂ，Ｃ：ＰＫ−５９細胞におけるＰ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＭＣＲ１（Ｂ），およびＡＢＣＧ２（Ｃ）の発現を示すＦＡＣＳの図である。青のヒストグラムは、二次抗体のみ、赤のヒストグラムが抗ヒトＰ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＭＤＲ１抗体（ＢＤファーミンジェン）（Ｂ），抗ヒトＡＢＣＧ２抗体（ＢＤファーミンジェン）（Ｃ）と反応させた場合を示す。Ｄ：ＰＫ−５９細胞を膵臓癌幹細胞マーカーであるＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２４抗体（ＢＤファーミンジェン）とＰＥ標識抗ヒトＣＤ４４抗体（ＢＤファーミンジェン）で二重染色したＦＡＣＳの図である。Ｄの図中の数字は、それぞれの画分の細胞の存在比率を示す。
図１２は、ＰＫ−５９細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、新規な抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ）の抗腫瘍活性を評価した図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍成長を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、２１日目（Ｄａｙ２１）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。各プロット上に示す数値は、平均値±標準偏差。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１３は、ＰＫ−５９細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、Ａ．クローンＫ５−１０７，Ｂ．クローンＴ６−１６，Ｃ．クローンＫ５−１１６−２−１の抗腫瘍活性を評価した図である。●はコントロール群（マウスＩｇＧ）、○は抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群を示す。グラフ中の矢印は抗体投与期間を表し、各プロット上に示す数値は、平均値±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１４は、ＰＫ−５９細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける、クローンＫ５−７０（Ａ）、クローンＴ６−１６（Ｂ）及び，クローンＫ５−１１６−２−１（Ｃ）の抗腫瘍活性を評価した図である。●はコントロール群（マウスＩｇＧ）、○は抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群を示す。グラフ中の矢印は抗体投与期間を表し、各プロット上に示す数値は、平均値±標準偏差。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１５は、ＢｘＰＣ−３細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ及びｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＫ５−７０の抗腫瘍活性を評価した図である。Ａ： ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおけるコントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍成長を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）Ｂ： ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるコントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍成長を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図１６は、ＰＫ−５９細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける、クローンＫ５−７０の用量依存的な抗腫瘍活性を示した図である。腫瘍体積は平均値±標準偏差で表した。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）と各用量でのＫ５−７０抗体投与群（□：１ｍｇ／ｋｇ体重、△：５ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍成長を経時的に表す（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、１７日目（Ｄａｙ１７）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。各プロット上に示す数値は、平均値±標準偏差。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）
図１７は、実験に使用したヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２タンパク質の模式図である。ＳＰ：シグナル配列、ＴＹ ｄｏｍａｉｎ：サイログロブリンタイプ１領域、ＴＭ：膜貫通領域、Ｃ：細胞内領域黒の塗りつぶしで表している領域はｈＴＲＯＰ−２由来のポリペプチドである。白抜きで表している領域は、マウスＴＲＯＰ−２由来のポリペプチドである。キメラタンパク質の模式図の上段に示してある数字は、マウスＴＲＯＰ−２タンパク質の、下段はｈＴＲＯＰ−２タンパク質のアミノ酸番号をそれぞれ示している。
図１８は、ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２を用いた抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体結合領域の同定の結果を示す図である。ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ２−Ｃ（ｈｍＴＲＯＰ２−Ｃ）及びマウス／ヒトキメラＴＲＯＰ２−Ｄ（ｍｈＴＲＯＰ２−Ｄ）タンパク質を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞を用い、図中に示した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体との反応性を検討した。陰性コントロールはｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂを用いた。
図１９は、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の抗体結合領域の同定の結果を示す図である。
ｈＴＲＯＰ−２遺伝子及び各ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に導入し、一過性に発現させた細胞を用いてＦＡＣＳ解析を行った。（Ａ）Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｔ５−８６およびＫ５−１１６−２−１抗体について、ｈＴＲＯＰ−２（上段）、ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａ（中段）及びｈｍＴＲＯＰ−２−Ｂ（下段）との反応性を検討した。ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂは陰性コントロールとして用いた。（Ｂ）Ｔ６−４およびＴ６−１６抗体について、ｈＴＲＯＰ−２（上段）、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅ（中段）及びｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆ（下段）との反応性を検討した。ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂは陰性コントロールとして用いた。
図２０は、ヒト正常組織におけるｈＴＲＯＰ−２の発現を示す図である。抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−６３−１７を用いてヒト正常組織アレイの免疫染色を行った。（Ａ）皮膚、（Ｂ）食道、（Ｃ）腎臓（皮質）、（Ｄ）腎臓（髄質）、（Ｅ）膵臓、（Ｆ）前立腺、（Ｇ）膀胱、（Ｈ）扁桃腺、（Ｉ）心臓、（Ｊ）肝臓 （倍率：×２００）
図２１は、癌組織でのｈＴＲＯＰ−２の発現を示す図である。抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−６３−１７を用いてヒト癌組織アレイの免疫染色を行った。（Ａ）乳癌、（Ｂ）肺癌、（Ｃ）食道癌、（Ｄ）胃癌、（Ｅ）膵臓癌、（Ｆ）大腸癌、（Ｇ）膀胱癌、（Ｈ）前立腺癌、（Ｉ）卵巣癌 （倍率：×１００）
図２２は、ＰＫ−５９細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける、クローンＫ５−７０の単回投与による抗腫瘍活性を示した図である。
Ａ．コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表す（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）．
Ｂ．Ａの試験において、２８日目（Ｄａｙ２８）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）．
Ｃ．コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の、各個体の腫瘍形成を経時的に表す。矢印は抗体投与を示す。
図２３は、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＫ５−７０の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４４日目（Ｄａｙ４４）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図２４は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＫ５−１１６−２−１の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−１１６−２−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４２日目（Ｄａｙ４２）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図２５は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＴ６−１６の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＴ６−１６抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４２日目（Ｄａｙ４２）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図２６は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＫ５−７０の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体投与群（○：１ｍｇ／ｋｇ体重，△：５ｍｇ／ｋｇ体重，□：１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４２日目（Ｄａｙ４２）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図２７は、．ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＫ５−７０の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：１週間に１回の投与間隔でのＫ５−７０抗体の抗腫瘍活性を示す図である。コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢頭（Ｄａｙ１０，１７，２４，３１，３８）は、Ｋ５−７０抗体の投与を示す。＊Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ．
Ｂ：１０日に１回（ｑ１０ｄ）、または２週間に１回（ｑ１４ｄ）の投与間隔でのＫ５−７０抗体の抗腫瘍活性を示す図である。コントロール群（●：マウスＩｇＧ、１０ｍｇ／ｋｇ）とＫ５−７０抗体投与群（○：ｑ１０ｄ、１０ｍｇ／ｋｇ，△：ｑ１４ｄ、１０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。黒塗りの矢頭（▼；Ｄａｙ９，１９，２９）と白塗りの矢頭（▽；Ｄａｙ９，２３，３７）は、Ｋ５−７０抗体の投与を示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ．
図２８は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＴ６−１６の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＴ６−１６抗体投与群（○：１ｍｇ／ｋｇ体重，△：５ｍｇ／ｋｇ体重，□：１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４３日目（Ｄａｙ４３）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図２９は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、クローンＴ６−１６の抗腫瘍活性を示す図である。コントロール群（●：マウスＩｇＧ１０ｍｇ／ｋｇ体重）、Ｔ６−１６抗体（１０ｍｇ／ｋｇ 体重）投与群（○：ｑ７ｄ，△：ｑ１０ｄ）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢頭（Ｄａｙ１０，１７，２４，３１，３８）、及び矢印（Ｄａｙ１０，２０，３０，４０）は、Ｔ６−１６抗体の投与を示す。コントロール群は３日に１回投与を行った。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ．
図３０は、ヒト前立腺癌細胞ＤＵ−１４５細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける、クローンＫ５−７０の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、４０日目（Ｄａｙ４０）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図３１は、ＰＫ−５９細胞の肝転移モデルを用いたクローンＫ５−７０の転移抑制活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：マウスＩｇＧ）とＢ： Ｋ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群の細胞移植６週間後の摘出肝臓像を示す。矢印は、肝転移巣を示す。
図３２は、ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおける塩酸イリノテカン投与後の癌再発モデルにおけるＫ５−７０の抗腫瘍活性を示す図である。無処置群（◆）、と塩酸イリノテカン（４０ｍｇ／ｋｇ体重）投与後Ｋ５−７０抗体（○：１０ｍｇ／ｋｇ体重）、あるいはマウスＩｇＧ投与群（●：１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍形成を経時的に表した図である（平均値±標準偏差）。矢頭（Ｄａｙ１１，１４，１７）は、塩酸イリノテカンの投与を示す。Ｋ５−７０抗体あるいはマウスＩｇＧはＤａｙ２０より３日に１回投与を行った。矢印は抗体投与期間を示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ．
図３３は、クローンＫ５−７０Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３４）と推定アミノ酸配列（配列番号３５）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＩＹＷＩＮ，ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ，ＴＳＭＡＤＹ）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−７０ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号３６〜３８に示す。
図３４は、クローンＫ５−７０ Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３９）と推定アミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ，ＹＡＳＥＳＩＳ，ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−７０ ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号４１〜４３に示す。
図３５は、クローンＫ５−１０７ Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号４４）と推定アミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＳＹＷＭＨ，ＮＩＹＰＧＧＧＹＴＮＹＤＥＫＦＫＳ，ＳＳＶＦＤＹ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−１０７ ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号４６〜４８に示す。
図３６は、クローンＫ５−１０７ Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号４９）と推定アミノ酸配列（配列番号５０）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＨ，ＹＡＳＥＳＩＳ，ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−１０７ ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番５１０〜５３に示す。
図３７は、クローンＫ５−１１６−２−１Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号５４）と推定アミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＳＹＷＩＴ，ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＲＤ，ＬＦＤＹ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−１１６−２−１ ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号５６〜５８に示す。
図３８は、クローンＫ５−１１６−２−１ Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号５９）と推定アミノ酸配列（配列番号６０）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ，ＹＡＳＥＳＩＳ，ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−１１６−２−１ ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号６１〜６３に示す。
図３９は、クローンＴ６−１６ Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号６４）と推定アミノ酸配列（配列番号６５）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン酸（Ｅ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＤＹＮＭＨ，ＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＲＦＫＳ，ＥＤＹＧＳＳＰＳＹＡＭＤＹ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＴ６−１６ ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号６６〜６８に示す。
図４０は、クローンＴ６−１６ Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号６９）と推定アミノ酸配列（配列番号７０）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＲＳＳＱＳＬＶＨＧＮＧＮＴＹＬＨ，ＫＶＳＮＲＦＳ，ＳＱＴＴＨＶＰＴ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＴ６−１６ ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号７１〜７３に示す。
図４１は、クローンＫ５−７０のＨ鎖可変領域（Ｋ５−７０ ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号３５）、ヒト型化Ｋ５−７０のＨ鎖可変領域（ＨｕＫ５−７０ ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号７５）、及びヒト型化抗体作製に用いたアクセプター（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＡ９８０１０２；配列番号８４）のＨ鎖可変領域（ＤＡ９８０１０２ ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号８５）についての、アライメントを示す図である（なお、図中のいずれのアミノ酸配列も、各々のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列の一部（具体的には、シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のアミノ酸配列）である。）。
Ｋ５−７０ ＶＨ中にアンダーラインで示したアミノ酸配列はＫａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）により定義されたＣＤＲ配列を表している。また、アミノ酸配列上部に記された番号は上記Ｋａｂａｔらの定義に従ったアミノ酸の位置番号を示している。ＤＡ９８０１０２ ＶＨ中の各ＣＤＲ配列は、図中では−−−と表記し、記載を省略している。ＨｕＫ５−７０ ＶＨ中のアンダーラインで示したアミノ酸は、ＣＤＲの構造維持に重要であると予想されるため、Ｋ５−７０ ＶＨの配列を維持した。また、ＨｕＫ５−７０ ＶＨ中の二重下線で示したアミノ酸は、対応するＤＡ９８０１０２ ＶＨのアミノ酸（メチオニン（Ｍ））がこの位置では稀にしか認められないものであり、抗原性を低下させる目的で同様のサブグループに属する典型的なアミノ酸であるロイシン（Ｌ）に置換した。
図４２は、クローンＫ５−７０のＬ鎖可変領域（Ｋ５−７０ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号４０）、ヒト型化Ｋ５−７０のＬ鎖可変領域（ＨｕＫ５−７０ ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号７７）、及びヒト型化抗体作製に用いたアクセプター（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ４１１７４；配列番号８６）のＬ鎖可変領域（Ｌ４１１７４ ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号８７；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ６４８７７）についての、アライメントを示す図である（なお、図中のいずれのアミノ酸配列も、各々のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列の一部（具体的には、シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のアミノ酸配列）である。）。
Ｋ５−７０ ＶＬ中にアンダーラインで示したアミノ酸配列はＫａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）により定義されたＣＤＲ配列を表している。また、アミノ酸配列上部に記された番号は上記Ｋａｂａｔらの定義に従ったアミノ酸の位置番号を示している。Ｌ４１１７４ ＶＬ中の各ＣＤＲ配列は、図中では−−−と表記し、記載を省略している。ＨｕＫ５−７０ ＶＬ中のアンダーラインで示したアミノ酸は、ＣＤＲの構造維持に重要であると予想されるため、Ｋ５−７０ ＶＬの配列を維持した。
図４３は、クローンＴ６−１６のＨ鎖可変領域（Ｔ６−１６ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号６５）、２種類のヒト型化Ｔ６−１６のＨ鎖可変領域（ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２）のアミノ酸配列（それぞれ順に、配列番号７９、配列番号８１）、及びヒト型化抗体作製に用いたアクセプター（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＡ９３５２３８；配列番号８８）のＨ鎖可変領域（ＤＡ９３５２３８ ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号８９）についての、アライメントを示す図である（なお、図中のいずれのアミノ酸配列も、各々のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列の一部（具体的には、シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のアミノ酸配列）である。）。
ＨｕＴ６−１６ ＶＨ中にアンダーラインで示したアミノ酸配列はＫａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）により定義されたＣＤＲ配列を表している。また、アミノ酸配列上部に記された番号は上記Ｋａｂａｔらの定義に従ったアミノ酸の位置番号を示している。ＤＡ９３５２３８ ＶＨ中の各ＣＤＲ配列は、図中では−−−と表記し、記載を省略している。ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１およびＨｕＴ６−１６ ＶＨ２中のアンダーラインで示したアミノ酸は、ＣＤＲの構造維持に重要であると予想されるため、Ｔ６−１６ ＶＨの配列を維持した。また、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１中の７３番目の位置にあるリジン（Ｋ）は、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２ではアクセプター配列であるＤＡ９３５２３８ ＶＨに由来するスレオニン（Ｔ）に置換した。
図４４は、クローンＴ６−１６のＬ鎖可変領域（Ｔ６−１６ ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号７０）、ヒト型化Ｔ６−１６のＬ鎖可変領域（ＨｕＴ６−１６ ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号８３）、及びヒト型化抗体作製に用いたアクセプター（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ９９６０８；配列番号９０）のＬ鎖可変領域（Ｍ９９６０８ ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号９１；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ６０３４１）についての、アライメントを示す図である（なお、図中のいずれのアミノ酸配列も、各々のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列の一部（具体的には、シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のアミノ酸配列）である。）。
Ｔ６−１６ ＶＬ中にアンダーラインで示したアミノ酸配列はＫａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）により定義されたＣＤＲ配列を表している。また、アミノ酸配列上部に記された番号は上記Ｋａｂａｔらの定義に従ったアミノ酸の位置番号を示している。Ｍ９９６０８ ＶＬ中の各ＣＤＲ配列は、図中では−−−と表記し、記載を省略している。
図４５は、ＨｕＫ５−７０ ＶＨの遺伝子配列（配列番号７４）及びアミノ酸配列（配列番号７５）を示す図である。
各行の上段は遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）、下段はアミノ酸配列を示す。当該アミノ酸配列中、シグナルペプチド部分には破線の下線を、各ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１〜３）には実線の下線を引いている（当該シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のみのアミノ酸配列は、配列番号９２に示す）。なお、ＨｕＫ５−７０ ＶＨ遺伝子の５’末端にはＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にはＮｈｅＩ部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。
図４６は、ＨｕＫ５−７０ ＶＬの遺伝子配列（配列番号７６）及びアミノ酸配列（配列番号７７）を示す図である。
各行の上段は遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）、下段はアミノ酸配列を示す。当該アミノ酸配列中、シグナルペプチド部分には破線の下線を、各ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１〜３）には実線の下線を引いている（当該シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のみのアミノ酸配列は、配列番号９３に示す）。なお、ＨｕＫ５−７０ ＶＬ遺伝子の５’末端にはＡｇｅＩ部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にはＢｓｉＷＩ部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加した。
図４７は、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１の遺伝子配列（配列番号７８）及びアミノ酸配列（配列番号７９）を示す図である。
各行の上段は遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）、下段はアミノ酸配列を示す。当該アミノ酸配列中、シグナルペプチド部分には破線の下線を、各ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１〜３）には実線の下線を引いている（当該シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のみのアミノ酸配列は、配列番号９４に示す）。なお、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１遺伝子の５’末端にはＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にはＮｈｅＩ部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。
図４８は、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２の遺伝子配列（配列番号８０）及びアミノ酸配列（配列番号８１）を示す図である。
各行の上段は遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）、下段はアミノ酸配列を示す。当該アミノ酸配列中、シグナルペプチド部分には破線の下線を、各ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１〜３）には実線の下線を引いている（当該シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のみのアミノ酸配列は、配列番号９５に示す）。なお、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２遺伝子の５’末端にはＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にはＮｈｅＩ部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。
図４９は、ＨｕＴ６−１６ ＶＬの遺伝子配列（配列番号８２）及びアミノ酸配列（配列番号８３）を示す図である。
各行の上段は遺伝子配列（ｃＤＮＡ配列）、下段はアミノ酸配列を示す。当該アミノ酸配列中、シグナルペプチド部分には破線の下線を、各ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１〜３）には実線の下線を引いている（当該シグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質部分のみのアミノ酸配列は、配列番号９６に示す）。なお、ＨｕＴ６−１６ ＶＬ遺伝子の５’末端にはＡｇｅＩ部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にはＢｓｉＷＩ部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加した。
図５０は、ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の発現を確認した結果を示す図である。
（Ａ）２９３Ｆ細胞に発現ベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０を導入し、培養上清中のＨｕＫ５−７０抗体の発現をウエスタンブロットにより検討した。レーン１は遺伝子導入を行っていない２９３Ｆ細胞の培養上清（ネガティブコントロール）、レーン２は上記発現ベクターを導入した２９３Ｆ細胞の培養上清。ＨｕＫ５−７０抗体の重鎖および軽鎖タンパク質はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体で検出した。
（Ｂ）２９３Ｆ細胞に発現ベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−１およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６（レーン３）、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−２およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６（レーン４）の組み合わせでそれぞれ導入し、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の発現をウエスタンブロットにより検討した。ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の重鎖タンパク質はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体で、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の軽鎖タンパク質はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体でそれぞれ検出した。
図５１は、精製したＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体のクマシー染色の結果を示す図である。
精製したＨｕＫ５−７０抗体（レーン１）、ＨｕＴ６−１６−１抗体（レーン２）およびＨｕＴ６−１６−２抗体（レーン３）それぞれ１μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、クマシー染色を行った。
図５２は、フローサイトメーターを用いたＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の抗原結合能の解析結果を示す図である。
図に示した各抗体を用いてＨＥＫ２９３−ｈＴＲＯＰ−２細胞（Ａ）およびＰＫ−５９細胞（Ｂ）に対する反応性をＦＡＣＳ解析により検討した。ネガティブコントロールは二次抗体のみとし（黒塗り）、各抗体の反応性をグレーラインで示した。
図５３は、ＥＬＩＳＡ法を用いたＨｕＫ５−７０抗体の抗原結合能の測定結果を示す図である。
抗原固相化ＥＬＩＳＡ法によりＫ５−７０抗体およびＨｕＫ５−７０抗体の抗原結合能について検討した。▲はＫ５−７０抗体、●はＨｕＫ５−７０抗体の測定結果を表す。
図５４は、ＥＬＩＳＡ法を用いたＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の抗原結合能の測定結果を示す図である。
抗原固相化ＥＬＩＳＡ法によりＴ６−１６抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の抗原結合能について検討した。▲はＴ６−１６抗体、●はＨｕＴ６−１６−１抗体、■はＨｕＴ６−１６−２抗体の測定結果を表す。
図５５は、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０抗体）の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、３９日目（Ｄａｙ３９）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図５６は、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０）の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＫ５−７０抗体投与群（○；１ｍｇ／ｋｇ体重，△；５ｍｇ／ｋｇ体重，□；１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。 ＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から４８日目（Ｄａｙ４８）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図５７は、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞を用いたｘｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＴ６−１６−２）の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＴ６−１６−２抗体投与群（○；１ｍｇ／ｋｇ体重，△；５ｍｇ／ｋｇ体重，□；１０ｍｇ／ｋｇ体重）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から４８日目（Ｄａｙ４８）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図５８は、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、マウス抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｋ５−７０およびＴ６−１６）の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）、Ｋ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）、およびＴ６−１６抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（△）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から５６日目（Ｄａｙ５６）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図５９は、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を用いたｘｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、マウス抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｋ５−７０およびＴ６−１６）の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）、Ｋ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）、およびＴ６−１６抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（△）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から５４日目（Ｄａｙ５４）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図６０は、ヒト肺癌細胞Ｃａｌｕ−３細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、マウス抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（Ｋ５−７０およびＴ６−１６）の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）、Ｋ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）、およびＴ６−１６抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（△）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から４１日目（Ｄａｙ４１）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図６１は、ヒト胆管癌細胞ＴＦＫ−１細胞を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける、マウス抗ｈＴＲＯＰ−２抗体Ｋ５−７０の抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）、およびＫ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（○）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。矢印は、抗体投与期間を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの試験において、癌細胞移植から３１日目（Ｄａｙ３１）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図６２は、ＨｕＫ５−７０およびＨｕＴ６−１６−２抗体の結合活性を、低濃度抗原固相化ＥＬＩＳＡを用いて検討した結果である。９６穴プレートを０．１μｇ／ｍＬのリコンビナントｈＴＡＣＳＴＤ２−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質でコーティングし、２０μｇ／ｍＬから２倍ずつの希釈系列を調製した被検抗体（Ｋ５−７０、ＨｕＫ５−７０、Ｔ６−１６およびＨｕＴ６−１６−２抗体）を反応させた。（Ａ）はＫ５−７０（▲）およびＨｕＫ５−７０（●）抗体を、（Ｂ）はＴ６−１６（▲）およびＨｕＴ６−１６−２抗体（●）をそれぞれ被験抗体として使用した。
図６３は、ｈＴＲＯＰ−２のＫ５−７０およびＨｕＫ５−７０抗体に対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。９６穴プレートにａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（γ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）およびａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ｆｃγ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を介してＫ５−７０およびＨｕＫ５−７０抗体を固相化し、５μｇ／ｍＬから２倍希釈系列を調製したｈＴＲＯＰ−２−ＥＣ−Ｈｉｓタンパク質を反応させた。ｈＴＲＯＰ−２−ＥＣ−Ｈｉｓタンパク質の結合は、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した。（▲）Ｋ５−７０抗体、（●）ＨｕＫ５−７０抗体
図６４は、遺伝子合成により作製したＫ５−７０ ＶＨ遺伝子の塩基配列（上段；配列番号９９）とＫ５−７０ ＶＨのアミノ酸配列（下段；配列番号３５）を示す図である。当該塩基配列においては、５’末端にＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）を付加し、３’末端にＮｈｅＩ部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加している。当該アミノ酸配列は、一文字表記で示しており、Ｎ末端側のシグナルペプチドはイタリック体で表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＩＹＷＩＮ，ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ，ＴＳＭＡＤＹ）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−７０ ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号３６〜３８に示す。
図６５は、遺伝子合成により作製したＫ５−７０ ＶＬ遺伝子の塩基配列（上段；配列番号１００）とＫ５−７０ ＶＬのアミノ酸配列（下段；配列番号４０）を示す図である。当該塩基配列においては、５’末端にＡｇｅＩ部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）を付加し、３’末端にＢｓｉＷＩ部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加している。当該アミノ酸配列は、一文字表記で示しており、Ｎ末端のシグナルペプチドはイタリック体で表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線；ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ，ＹＡＳＥＳＩＳ，ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ）は、Ｋａｂａｔら（前掲；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従って決定した。クローンＫ５−７０ ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号４１〜４３に示す。
図６６は、ＣｈＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０、ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ（ＨｕＫ５−７０抗体のＶＬをＫ５−７０抗体のＶＬに置換したもの）およびＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ（ＨｕＫ５−７０抗体のＶＨをＫ５−７０抗体のＶＨに置換したもの）抗体のｈＴＲＯＰ−２に対する結合活性を示した図である。９６穴プレートを０．１μｇ／ｍＬのリコンビナントｈＴＡＣＳＴＤ２−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質でコーティングし、被検抗体（ＣｈＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０、ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬおよびＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ抗体）を一過性発現させた細胞の培養上清を１、０．１、０．０１、０．００１μｇ／ｍＬの抗体濃度になるように希釈し反応させた。（▲）ＣｈＫ５−７０抗体、（△）ＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ抗体、（○）ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ抗体、（●）ＨｕＫ５−７０抗体
図６７は、ＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびそのアミノ酸置換変異体のアミノ酸配列を示した図である。アミノ酸は一文字表記で示した。各アミノ酸置換変異体では、ＨｕＫ５−７０ ＶＨのアミノ酸と同じアミノ酸については “−“で示し、置換したアミノ酸についてのみ一文字表記で示した。配列上部の数字はアミノ酸番号を示す（Ｋａｂａｔら１９９１）。
図６８は、ＣｈＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ａ４０Ｒ（ＨｕＫ５−７０抗体のＶＨの４０番目のアラニンをアルギニンに置換した変異体）およびＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ｒ４４Ｇ抗体（ＨｕＫ５−７０抗体のＶＨの４４番目のアルギニンをグリシンに置換した変異体）のｈＴＲＯＰ−２に対する結合活性を示した図である。９６穴プレートを０．１μｇ／ｍＬのリコンビナントｈＴＡＣＳＴＤ２−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質でコーティングし、被検抗体（ＣｈＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ａ４０ＲおよびＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ｒ４４Ｇ抗体）を一過性発現させた細胞の培養上清を０．５μｇ／ｍＬから２倍希釈系列（６点）を作製し反応させた。（▲）ＣｈＫ５−７０抗体、（△）ＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ｒ４４Ｇ抗体、（○）ＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ａ４０Ｒ抗体、（●）ＨｕＫ５−７０抗体
図６９は、遺伝子合成により作製したＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ｒ４４Ｇ遺伝子の塩基配列（上段）とアミノ酸配列（下段）を示す。５’末端にＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）およびＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）、３’末端にＮｈｅＩ部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。アミノ酸配列は一文字表記で示した。Ｎ末端のシグナルペプチドはイタリック体で示し、成熟ＶＨのＮ末端側のアミノ酸（Ｑ：グルタミン）を二重下線で示し、ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔら、１９９１）を下線で示した。
図７０は、精製ＨｕＫ５−７０−２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。ＨｕＫ５−７０−２抗体１μｇを還元条件下で１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開した。レーン１：分子量マーカー（プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ）），レーン２：ＨｕＫ５−７０−２抗体。図の左側の数値は分子量を示す。
図７１は、Ｋ５−７０、ＨｕＫ５−７０およびＨｕＫ５−７０−２抗体のｈＴＲＯＰ−２に対する結合活性を示した図である。９６穴プレートを０．１μｇ／ｍＬのリコンビナントｈＴＡＣＳＴＤ２−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質でコーティングし、精製した被検抗体（Ｋ５−７０、ＨｕＫ５−７０およびＨｕＫ５−７０−２抗体）を１μｇ／ｍＬから２倍希釈系列（１０点）を作製し反応させた。（■）Ｋ５−７０抗体、（△）ＨｕＫ５−７０−２抗体、（●）ＨｕＫ５−７０抗体
図７２Ａは、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（白カラム：ＨｕＫ５−７０，黒カラム：ＨｕＴ６−１６−２）を用いたＡＤＣＣ活性を示す図である。詳しくは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、ＨｕＫ５−７０抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体（いずれも０，０．１，０．３，１，３，１０μｇ／ｍＬ）と健常人末梢血単核球を加え、６時間培養し、培養上清中に放出されるＬＤＨの活性を測定することによりＡＤＣＣ活性を測定した結果を示す（平均値±標準誤差（Ｎ＝３），：エフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）＝４０）。抗体濃度０は抗体非添加を示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図７２Ｂは、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（白カラム：ＨｕＫ５−７０，灰色カラム：ＨｕＫ５−７０−２，黒カラム：ＨｕＴ６−１６−２）を用いたＡＤＣＣ活性を示す図である。詳しくは、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９）に、ＨｕＫ５−７０抗体，ＨｕＫ５−７０−２抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体（いずれも０，０．３，１，３，１０，３０μｇ／ｍＬ）と健常人末梢血単核球を加え、６時間培養し、培養上清中に放出されるＬＤＨの活性を測定することによりＡＤＣＣ活性を測定した結果を示す（平均値±標準誤差（Ｎ＝３），：エフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）＝４０）。抗体濃度０は抗体非添加であることを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
図７２Ｃは、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（白カラム：ＨｕＫ５−７０，灰色カラム：ＨｕＫ５−７０−２，黒カラム：ＨｕＴ６−１６−２）を用いたＡＤＣＣ活性を示す図である。詳しくは、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）に、ＨｕＫ５−７０抗体，ＨｕＫ５−７０−２抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体（いずれも０，０．３，１，３，１０，３０μｇ／ｍＬ）と健常人末梢血単核球を加え、６時間培養し、培養上清中に放出されるＬＤＨの活性を測定することによりＡＤＣＣ活性を測定した結果を示す（平均値±標準誤差（Ｎ＝３），：エフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）＝４０）。抗体濃度０は抗体非添加であることを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願６１／５６２，６７２号明細書（２０１１年１１月２２日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ヒトＴＲＯＰ−２（ｈＴＲＯＰ−２）は、前述したように、全長３２３アミノ酸残基からなる１回膜貫通型の１型膜タンパク質である。そして、ｈＴＲＯＰ−２遺伝子及びその遺伝子産物は、種々の癌細胞において発現していることが知られている。
前述したように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて高い抗腫瘍活性を有する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体）などの開発が望まれていた状況の下、本発明者は、極めて多数のクローンからスクリーニングを行うことにより、ｉｎ ｖｉｖｏで高い抗腫瘍活性を有するクローンを取得することに成功した。具体的には、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域を特異的に認識するモノクローナル抗体、特にピコモルオーダー（ｐＭ）の高い親和性を示すモノクローナル抗体を提供するものである。本発明の抗体は、裸抗体の単独投与で、既存の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体と比較して、より少ない用量（例えば１／２０投与量）で顕著な腫瘍成長阻害活性を有し、かつ複数のヒト癌細胞を用いた担癌マウス治療モデルにおいて顕著な腫瘍成長阻害活性を示す、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（特にヒト型化抗体）である点で、極めて有用なものである。
２．抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の作製
（１）抗原の調製
ｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列（配列番号２）の情報は、例えばＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ００２３４４」として公表されている。なお、ｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、同ウェブサイトに「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ００２３５３」として公表されている。
抗原としては、ｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができ、好ましくは、ｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むペプチドを使用することができる。ｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域（シグナルペプチドを含む）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第２７４番目のアミノ酸を含む領域（シグナルペプチド：第１番目〜第２６番目のアミノ酸）のことを言う。ここで、抗原に用いるペプチドにつき、上記「アミノ酸配列の少なくとも一部」とは、長さが特に限定されるわけではないが、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第１４５番目のアミノ酸を含む領域や、当該アミノ酸配列のうちの第１４６番目〜第２７４番目のアミノ酸を含む領域などが好ましい。
抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ｈＴＲＯＰ−２遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；プロメガ社）等を用いることができる。
上記のごとく得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また抗原は、ｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列（配列番号２）又は前述したその部分配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、ｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列又はその部分配列のうち１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失しており、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つｈＴＲＯＰ−２活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩（ナトリウム）濃度が１０〜５００ｍＭであり、温度が４２℃〜７２℃、好ましくは、上記塩濃度が５０〜３００ｍＭであり、温度が５５〜６８℃での条件をいう。
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。
抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３〜７日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
（３）モノクローナル抗体の作製
（３−１）抗体産生細胞の採取
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。
（３−２）細胞融合
ハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳ Ｉ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）及びＳｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。
次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比（抗体産生細胞：ミエローマ細胞）は、限定はされないが、通常、１：１〜１０：１とすることが好ましく、より好ましくは３：１である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００ダルトン（Ｄ）のポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（３−３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ｈＴＲＯＰ−２に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ及びＲＩＡなどによってスクリーニングすることができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。ｈＴＲＯＰ−２に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。
（３−４）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１ｘ１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、２〜３週間後に腹水を採取することが好ましい。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３−５）抗腫瘍活性を有するクローンの選別
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗体である。
ここで、「抗腫瘍活性」とは、腫瘍細胞（癌細胞）を死滅させる活性又は腫瘍成長を阻害する活性を意味する。抗腫瘍活性としては、例えば、癌細胞の増殖阻害活性や腫瘍血管新生阻害活性が好ましく挙げられる。また、本発明の抗体が抗腫瘍活性を発揮しうるヒト腫瘍（腫瘍細胞）の種類としては、ｈＴＲＯＰ−２の発現が確認されている公知の各種ヒト腫瘍が挙げられ、特に限定はされないが、例えば、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌などの各種ヒト腫瘍のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられ、より好ましくはヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌及びヒト肺癌のうちの１種又は２種以上であり、さらに好ましくはヒト膵癌及び／又はヒト大腸癌である。さらに、上記腫瘍の種類としては、再発癌や転移癌であってもよく、本発明の抗体はこれらに腫瘍に対しても優れた抗腫瘍活性を発揮し得る。
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の確認は、例えば、所望の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植した担癌マウス（担癌動物治療モデル）を用い、このマウスに前記のとおり得られた抗体を投与することにより行うことができる。この場合、抗体の投与は、腫瘍細胞の移植直後から行ってもよいし（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル）、移植に腫瘍が所定の体積になったのを確認してから行ってもよい（ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）。投与方法は、限定はされないが、例えば、３日、１週間，１０日又は２週間に１回あるいは単回（１回のみ）で、５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与等とすることができる。ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルの場合は、腫瘍形成頻度と腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルの場合は、腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。
本発明において、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３６〜３８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１〜４３で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号４０で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
また本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の他の態様としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４６〜４８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５１〜５３で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号４５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号５０で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
同様に、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の他の態様としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５６〜５８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６１〜６３で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号５５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号６０で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
同様に、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の他の態様としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６６〜６８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号７１〜７３で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号６５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、当該Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号７０で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
本発明において、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体としては、より具体的には、例えば、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５１であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン名：Ｋ５−７０）、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５２であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン名：Ｋ５−１０７）、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５３であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン名：Ｋ５−１１６−２−１）、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１３４６であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン名：Ｔ６−１６）及び受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５４であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン名：Ｔ５−８６）などが好ましく挙げられる。
ここで、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５１であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｋ５−７０」と称し２０１０年５月１２日付で、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５２であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｋ５−１０７」と称し２０１０年５月１２日付で、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５３であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｋ５−１１６−２−１」と称し２０１０年５月１２日付で、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１３４６であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔ６−１６」と称し２０１１年３月１日付で、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５４であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔ５−８６」と称し２０１０年５月１２日付で、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託されたものである。
さらに、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体としては、例えば、受領番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３４６又はＦＥＲＭ ＢＰ−１１２５４であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体も好ましく挙げられる。エピトープとしては、下記（３−６）項において例示するものが好ましく挙げられる。
（３−６）抗ｈＴＲＯＰ−２抗体のエピトープ
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるｈＴＲＯＰ−２の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、配列番号２に示されるｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列中の、第２５２番目〜第２６０番目のアミノ酸からなる領域を除いた領域の少なくとも一部であることが好ましく、より好ましくは、第１番目〜第６９番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部又は第１００番目〜第２７４番目のアミノ酸からなる領域（第２５２番目〜第２６０番目のアミノ酸からなる領域を除く）の少なくとも一部であり、さらに好ましくは第２７番目〜第６９番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部又は第１０９番目〜第２０６番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。上記エピトープとして、特に好ましくは、配列番号２に示されるｈＴＲＯＰ−２のアミノ酸配列中の、第４３番目〜第６５番目のアミノ酸からなる領域、第１５２番目〜第１６５番目のアミノ酸からなる領域、第１７１番目〜第１８３番目のアミノ酸からなる領域、第１０９番目〜第１２０番目のアミノ酸からなる領域、第１９３番目〜第２０６番目のアミノ酸からなる領域、及び第４３番目〜第５６番目のアミノ酸からなる領域、並びにこれらを含む部分であり、中でも特に好ましいのは、第４３番目〜第６５番目のアミノ酸からなる領域、第１５２番目〜第１６５番目のアミノ酸からなる領域、第１７１番目〜第１８３番目のアミノ酸からなる領域、及び第１０９番目〜第１２０番目のアミノ酸からなる領域、並びにこれらを含む部分である。当該領域を認識する（当該領域又はそれを含む部分と結合する）抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、例えば、腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性が高く、後述するイムノコンジュゲート等の用途に極めて有用なものである。
（３−７）抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の特性
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、前述の通り、低用量で高いｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する抗体である。具体的には、担癌動物モデルに対して、２０ｍｇ／ｋｇ体重以下（好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ体重以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重以下）の投与量（裸抗体）で５０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくはほぼ１００％（例えば９８％以上又は９９％以上））の腫瘍成長阻害活性を示すものであることが好ましい。
ここで、腫瘍成長阻害活性（％）は、例えば、下記式により算出することができる。
腫瘍成長阻害活性（％）＝１００−〔（抗体投与群の腫瘍体積又は腫瘍重量）÷（対照群の腫瘍体積又は腫瘍重量）〕×１００
また、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、２種以上のヒト腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性を有するものであることが好ましい。ヒト腫瘍細胞株としては、限定はされないが、例えば、各種ヒト膵癌細胞株、ヒト前立腺癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、ヒト乳癌細胞株、ヒト卵巣癌細胞株、ヒト肺癌細胞株及びヒト胆管癌細胞株からなる群より選ばれる少なくとも２種が挙げられ、具体的には、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト膵癌細胞株ＫＰ−３Ｌ、ヒト膵癌細胞株ＫＰ−２、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−１、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｈ、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−４５Ｐ、ヒト膵癌細胞株ＴＣＣ−ＰＡＮ２、ヒト膵癌細胞株ＳＵＩＴ−２、ヒト大腸癌細胞株ＣＡＣＯ−２、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１、ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１１４３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３、及びヒト胆管癌細胞株ＴＦＫ−１からなる群より選ばれる少なくとも２種が好ましく挙げられる。中でも、前記２種以上のヒト腫瘍細胞株としては、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＢＡ−ＭＤ−４６８、及びヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３からなる群より選ばれる少なくとも２種がより好ましく挙げられる。
さらに、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、解離定数（Ｋｄ値）が１．０×１０−１０Ｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０×１０−１１Ｍ以下であり、さらに好ましくは１．０×１０−１２Ｍ以下である。ここで、抗体の結合能（親和性）は、例えば、スキャッチャード解析やＢｉａｃｏｒｅと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数（Ｋｄ値）、解離速度定数（Ｋｄｉｓｓ［１／Ｓｅｃ］）、結合速度定数（Ｋａｓｓ［１／Ｍ．Ｓｅｃ］）として測定することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ装置としては、例えばＢｉａｃｏｒｅ ３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｊ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｑ（いずれもＢｉａｃｏｒｅ社）などが挙げられる。抗体は、解離定数（Ｋｄ値）が小さい値であるほど結合能（親和性）が高いという点で好ましい。Ｋｄ値は、Ｋｄｉｓｓ及びＫａｓｓの２つのパラメーターにより決定され、例えば、式：Ｋｄ［Ｍ］＝Ｋｄｉｓｓ／Ｋａｓｓにより表すことができる。なお、Ｋｄ値の算出方法については、後述する実施例（具体的には実施例１０）に記載の方法も好ましく採用することができる。
（４）遺伝子組換え抗体、及び抗体断片
（４−１）遺伝子組換え抗体
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特表平４−５０２４０８号公報（特許第２８２８３４０号公報；クイーンら）等を参照）。
ここで、本発明のヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲ配列としては、限定はされないが、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域（ＶＨ）のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号３６〜３８に示されるアミノ酸配列や配列番号６６〜６８で示されるアミノ酸配列が、Ｌ鎖Ｖ領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号４１〜４３に示されるアミノ酸配列や配列番号７１〜７３で示されるアミノ酸配列が、好ましく挙げられる。
また、ヒト型化された再構成ヒト可変領域のうち、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号９２で示されるアミノ酸配列（配列番号３６〜３８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号７５で示される）、配列番号９８で示されるアミノ酸配列（配列番号３６〜３８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号９７で示される）、配列番号９４で示されるアミノ酸配列（配列番号６６〜６８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号７９で示される）、及び配列番号９５で示されるアミノ酸配列（配列番号６６〜６８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号８１で示される）が好ましく挙げられる。ここで、上記配列番号９８で示されるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列は、上記の配列番号９２で示されるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列の第４４番目のアルギニン（Ｒ）をグリシン（Ｇ）に置換した改変型のアミノ酸配列である。
同様に、ヒト型化された再構成ヒト可変領域のうち、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号９３で示されるアミノ酸配列（配列番号４１〜４３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号７７で示される）、及び配列番号９６で示されるアミノ酸配列（配列番号７１〜７３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１〜３を含む；さらにシグナルペプチドを含むアミノ酸配列は配列番号８３で示される）が好ましく挙げられる。
ここで、本発明のヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の態様としては、例えば、（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９２で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９３で示されるアミノ酸配列からなるものや、（ｉｉ）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９８で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９３で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。なかでも、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９８で示されるアミノ酸配列である上記（ｉｉ）のヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、アビディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ）（すなわち２つの抗原結合アームの運動能に関するフレキシビィリティー）がより向上したものであり、抗原結合活性が高いものであるため、特に好ましい。
同様に、本発明のヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の他の態様としては、例えば、（ｉｉｉ）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９４で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９６で示されるアミノ酸配列からなるものや、（ｉｖ）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９５で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９６で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超可変領域（Ｈｙｐｅｒ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
上記キメラ抗体、ヒト型抗体及びヒト抗体は、抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるものが好ましく、詳しくは、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖を抗体分子のＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体が挙げられる。このような抗体であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができる。なお、この点（抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の特徴）は、前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても同様に好ましい。
（４−２）抗体断片
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の断片（部分断片）も、本発明の抗体に含まれるものとする。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体と同様に、ｈＴＲＯＰ−２に対する結合活性を有するもの（すなわちｈＴＲＯＰ−２に結合し得るもの）であってｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものである。
当該抗体の断片としては、抗ｈＴＲＯＰ−２ポリクローナル抗体又は抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の一部分の領域（すなわち、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体に由来する抗体断片）を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｈ鎖Ｖ領域、及びＬ鎖Ｖ領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域）、並びに、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するＦａｂをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
ｓｃＦｖは、１本のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）と１本のＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよひＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよひＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。ｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）及びＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の中の少なくとも１領域以上を含んで構成され、ＶＨのＣＤＲをすべて含むもの、及びＶＬのＣＤＲをすべて含むものがより好ましく、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ（計６領域）をすべて含むものが特に好ましい。ＣＤＲのアミノ酸配列としては、例えば、前述した配列番号３６〜３８、４１〜４３、４６〜４８、５１〜５３、５６〜５８、６１〜６３、６６〜６８及び７１〜７３に示されるアミノ酸配列が好ましく挙げられる。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体断片としては、そのままの形状でＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含む抗体断片でもよく、また、上述した抗体断片とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部との融合タンパク質であってもよい。このような抗体断片であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができるため、好ましい。
以下、本明細書中の説明においては、上述した抗体断片も、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体に含まれるものとする。
３．ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体
本発明においては、上述した本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体やその抗体断片をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、ＤＮＡ）も提供することができる。当該ポリヌクレオチドとしては、具体的には、上述した本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体や抗体断片の例示として示した各アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体や抗体断片をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、当該ポリヌクレオチドを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体や抗体断片をコードするポリヌクレオチドとしては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされず、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドＤＮＡを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドＤＮＡを含むものであってもよい。
本発明においては、上記本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターや、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することもできる。
組換えベクターとして用いる発現ベクターに組込むポリヌクレオチド（遺伝子、ＤＮＡ）には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、ＳＤ配列（宿主が原核細胞の場合）及びＫｏｚａｋ配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。
発現ベクターに当該ポリヌクレオチドを組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、レトロウイルスベクター、人工染色体ＤＮＡなど、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体やその抗体断片をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、ＤＮＡ）を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体やその抗体断片を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドＤＮＡ等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。
宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体やその抗体断片を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等の公知の宿主が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ヒト胎児腎細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコＢＹ−２細胞等が用いられる。
形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれるポリヌクレオチドのコドン型は、用いた宿主のコドン型と一致していても異なっていてもよく、限定はされない。
４．抗体−薬剤複合体の作製
上記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体を用いたイムノコンジュゲート等として、当該抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質（化合物等）とを含む、抗体−薬剤複合体を提供することができる。なお、予め、当該抗体分子と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質とを、それぞれ調製したのち、これらを複合化させて得られたものは、一般に、イムノコンジュゲートと称される。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と連結させて、１つのタンパク質（融合タンパク質）として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。
抗腫瘍活性を有する物質としては、例えば、ドキソルビシン、カリケアマイシン、マイトマイシシＣ、Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、放射性同位体（ＲＩ）などが挙げられる。殺細胞活性を有する物質としては、例えば、サポリン、リシン、緑膿菌外毒素、ジフテリアトキシン、放射性同位体（ＲＩ）等が挙げられ、なかでもサポリン及び緑膿菌外毒素が好ましく用いられる。なお、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有するＲＩとしては、限定はされないが、例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ、１４Ｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、９４ｍＴｃ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１１１Ａｇ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、１８Ｆ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、１６９Ｙｂ、１６６Ｄｙ、２１２Ｐｂ及び２２３Ｒａ等が挙げられる。
抗体−薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。
上記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、ｈＴＲＯＰ−２を発現する標的腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性に優れたものである。そのため、予め、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質を複合化させておくことにより、これら物質を腫瘍細胞に直接かつ高選択的に作用させることができる。本発明の抗体−薬剤複合体は、標的腫瘍細胞への薬剤送達能に極めて優れたものである。
なお、細胞内へのインターナリゼーション活性は、抗体をローダミン等により蛍光標識し、細胞内への移行挙動及び抗体の局在性について蛍光顕微鏡等を用いて観察することにより評価することができる。
また本発明においては、抗体−薬剤複合体において、抗体の代わりに前述の抗体断片を用いた抗体断片−薬剤複合体を提供することもできる。抗体断片−薬剤複合体の詳細については、上述の抗体−薬剤複合体の説明を適宜適用することができる。
以下、本明細書中の説明においては、抗体断片−薬剤複合体も、本発明の抗体−薬剤複合体に含まれるものとする。
５．医薬組成物
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び抗体−薬剤複合体は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
当該医薬組成物は、腫瘍の治療用及び／又は診断用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体、及び該抗体を含む抗体−薬剤複合体は、抗腫瘍活性として優れた腫瘍成長阻害活性を有するものであるため、腫瘍の治療用に使用されることが好ましい。すなわち、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍治療剤及び腫瘍診断剤に含まれる有効成分として有用なものである。なお、本発明において、上記腫瘍の治療には、腫瘍の成長阻害及び成長抑制の意味も含むものとし、具体的には、例えば腫瘍治療剤であれば、腫瘍の成長阻害剤及び成長抑制剤の形態も含むものとする。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、公知の抗腫瘍剤との併用もすることができる。併用によりさらに高い抗腫瘍効果が得られる。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患（腫瘍）としては、ｈＴＲＯＰ−２の発現が確認されている前述した公知の各種ヒト腫瘍が挙げられる。なかでも特に、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌などの各種ヒト腫瘍のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられる。これらの疾患は単独であってもよく、２つ以上が併発してもよい。また、対象となる腫瘍は、再発癌や転移癌であってもよく、本発明の医薬組成物（ひいては、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体）は、再発癌や転移癌の治療剤及び診断剤としても有効に用いることができる。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
特に、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体由来の抗体断片（中でも低分子のもの）を生体内に投与する場合は、上記に加えて、コロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物（抗体断片）の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ ａｎｄ Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８）。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び抗体−薬剤複合体の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき６００μｇから６０００ｍｇの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１００μｇ〜１００ｍｇの量を、１日平均あたり１回〜数回投与してもよく、好ましくは３日、１週間、１０日又は２週間に１回投与したり、あるいは単回（合計投与回数が１回）投与する態様も採ることができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、本発明は、腫瘍を治療及び／又は診断する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。また、本発明は、腫瘍を治療用及び／又は診断用の、前記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を提供するものでもある。
さらに、本発明は、前記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を用いる（すなわち患者に投与する）ことを特徴とする腫瘍の治療及び／又は診断方法を提供するものであり、また、腫瘍を治療及び／又は診断するための、前記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。
６．腫瘍の検出方法
本発明の腫瘍の検出方法は、前記本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体と、生体から採取された試料（以下、生体試料）とを反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することを特徴とする方法である。
前述したように、ｈＴＲＯＰ−２は各種腫瘍細胞において特異的に発現することが確認されているため、ｈＴＲＯＰ−２、特に遊離ｈＴＲＯＰ−２（ｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域部分）は、各種腫瘍マーカーとして利用することが可能である。なかでも、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌及びヒト乳癌のマーカーとして利用することが好ましい。
そこで、本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体を生体試料と反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することにより、腫瘍を検出することができる。得られた抗体のシグナルは、生体試料中の抗原量（すなわちｈＴＲＯＰ−２量又は遊離ｈＴＲＯＰ−２量）の指標となる。本発明の抗体を用いた腫瘍の検出は、まず、検体として被験者から採取した生体試料、例えば検査対象とする組織片又は血液等と、本発明の抗体とを、抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。当該測定は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）法、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等が挙げられる。なかでも特に、ＥＬＩＳＡ法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。
本発明においては、上記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを腫瘍陽性、所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。ここで、腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、転移の有無及び再発の有無等が挙げられる。
上記評価にあたり、腫瘍の状態としては１つを選択してもよいし、複数個を組み合わせて選択してもよい。腫瘍の有無の評価は、得られた検出結果に基づいて、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行うことができる。腫瘍の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、検出結果に基づいて、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、あるいは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、検出結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。腫瘍の転移は、検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価することができる。再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。
７．腫瘍の検出用又は診断用キット
本発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、腫瘍の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［ｈＴＲＯＰ−２遺伝子のクローニング］
ｈＴＲＯＰ−２遺伝子全長の単離は、ヒト胎児肝臓（胎生１０週）からＲＴ−ＰＣＲ法により行った。まずｈＴＲＯＰ−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５３）の配列をもとに以下に示すＰＣＲプライマーを設計した。
このとき、リバース側プライマーにはストップコドンを除き、Ｘｈｏ Ｉによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーとヒト胎児肝臓（胎生１０週）より調製した全ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動による展開、目的のバンドの抽出を行い、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした（ｐＣＲＩＩ−ｈＴＲＯＰ２）。クローニングしたｈＴＲＯＰ−２のｃＤＮＡはシークエンスにより確認した。
発現ベクターの構築は、ｐＣＲＩＩ−ｈＴＲＯＰ２からｈＴＲＯＰ−２遺伝子を含むＥｃｏ
ＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ Ｉ部位に挿入して行った（ｐｃＤＮＡ４−ｈＴＲＯＰ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。またｐｃＤＮＡ４−ｈＴＲＯＰ２−ｍｙｃ／ＨｉｓからｈＴＲＯＰ−２遺伝子を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｐｍｅ Ｉ断片を切り出し（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ切断部位は平滑末端化した）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰｍｅ Ｉ部位へ挿入することでネオマイシン耐性遺伝子を持つ発現ベクターを構築した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴＲＯＰ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。
［ｈＴＲＯＰ−２遺伝子安定細胞株の構築］
上記の方法で作製したｈＴＲＯＰ−２の全長ｃＤＮＡをコードした発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴＲＯＰ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）を、ＨＥＫ２９３細胞（ＲＩＫＥＮ）、ＨｕＨ−７細胞（ＨＳＲＲＢ）、７Ｅ２−Ｃ細胞（ＷＯ ２００５／０５２１５６に記載）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＨＳＲＲＢ）にリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入し、抗生物質Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）による選択を行った後、ｈＴＲＯＰ−２を安定して発現している細胞株を樹立することにより得た。
［ｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質作製］
ｈＴＲＯＰ−２細胞外領域の一部（具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第１番目〜第２６３番目のアミノ酸からなる領域）をコードする遺伝子断片はＰＣＲ法により増幅した。増幅に使用したプライマーは以下の通りである。
このとき、リバース側プライマーにＸｈｏＩによる制限酵素消化部位を付加した。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動により展開し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片はｐＣＲ Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし（ｐＣＲＢ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣ）、遺伝子配列を確認した。次にｐＣＲＢ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣからｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域をコードする遺伝子断片を含むＥｃｏ ＲＩ／Ｘｈｏ Ｉ断片を
挿入した（ｐｃＤＮＡ４ｍＨ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣ）。さらにｐｃＤＮＡ４ｍＨ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣのＢａｍ ＨＩ／Ｅｃｏ ＲＩ部位にＮｒｕ Ｉ制限酵素切断部位を作製するため、以下に示すオリゴヌクレオチドを会合させ挿入した。
同様にｐｃＤＮＡ４ｍＨ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣのＰｍｅ Ｉ部位にｐＢｇｌ ＩＩリンカー（ＴＡＫＡＲＡ）を挿入した（ｐｃＤＮＡ４ｍＨ−ＮＢ−ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣ）。バキュロウイルスを用いたリコンビナントタンパク質作製のため、ｐｃＤＮＡ４ｍＨ−ＮＢ−ｈＴＲＯＰ−２ＥＣからｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域をコードする遺伝子断片を含むＮｒｕ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩ断片を切り出し、ｐＰＳＣ８ベクター（日本農産工業）のＮｒｕ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩ部位に挿入した（ｐＰＳＣ８−ｈＴＲＯＰ２ ＥＣ）。バキュロウイルスを用いたｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質作製は日本農産工業に委託した。
ｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質の精製は以下のように行った。リコンビナントタンパク質を含む培養上清にＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、４℃、２時間結合させた。その後、エコノカラム（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて２０ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝液で洗浄、３００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝液で溶出を行い精製した。
［ヒトＥｐＣＡＭ ｃＤＮＡの単離と発現ベクターの構築］
ヒトＥｐＣＡＭ遺伝子全長の単離は、ヒト胎児肝臓（胎生１０週）からＲＴ−ＰＣＲ法により行った。まずヒトＥｐＣＡＭ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ００２３５４）の配列をもとに以下に示すＰＣＲプライマーを設計した。
このとき、リバース側プライマーにはストップコドンを除き、Ｘｈｏ Ｉによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーとヒト胎児肝臓（胎生１０週）由来の全ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。その後、アガロースゲル電気泳動による展開、目的のバンドの抽出を行い、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした（ｐＣＲＩＩ−ｈＥｐＣＡＭ）。クローニングしたヒトＥｐＣＡＭのｃＤＮＡはシークエンスにより確認した。
発現ベクターの構築は、ｐＣＲＩＩ−ｈＥｐＣＡＭからヒトＥｐＣＡＭ遺伝子を含むＥｃｏ
ＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ Ｉ部位に挿入して行った（ｐｃＤＮＡ４−ｈＥｐＣＡＭ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。またｐｃＤＮＡ４−ｈＥｐＣＡＭ−ｍｙｃ／ＨｉｓからヒトＥｐＣＡＭ遺伝子を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｐｍｅ Ｉ断片を切り出し（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ切断部位は平滑末端化した）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰｍｅ Ｉ部位へ挿入することでネオマイシン耐性遺伝子を持つ発現ベクターを構築した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＥｐＣＡＭ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。
［抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の作製］
免疫原としては、ｈＴＲＯＰ−２発現安定細胞株（ＨＥＫ２９３−ｈＴＲＯＰ−２細胞、ＣＨＯ−Ｋ１−ｈＴＲＯＰ−２細胞、７Ｅ２−Ｃ−ｈＴＲＯＰ−２細胞）、内在的にｈＴＲＯＰ−２タンパク質を細胞表面に発現している、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９，ＲＣＢ１９０１；ＲＩＫＥＮ ｃｅｌｌ ｂａｎｋより購入）、または上記の方法で作製した、ｈＴＲＯＰ−２の細胞外領域のリコンビナントタンパク質を用いた。
ｈＴＲＯＰ−２発現安定細胞株の場合は１×１０７細胞、リコンビナントｈＴＲＯＰ−２タンパク質の場合は、２０μｇのタンパク質を、それぞれ免疫補助剤ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ株式会社）と、１：１で混合してエマルジョンを調製し、マウス（Ｃ５７／ＢＬ６，Ｂａｌｂ／ｃ）の両足蹠、または腹腔内に注射した（初回免疫）。両足蹠への短期免疫の場合は、初回免疫から３日後及び１０日後に追加免疫を行い、最終免疫の翌日に、両膝膏リンパ節を採取し、リンパ球を調製した。腹腔内への長期免疫の場合は、初回免疫から１週間に１回の割合で、追加免疫を行い（１〜２ヵ月間実施）、常法に従い、脾臓よりＢ細胞を単離した。追加免疫は、細胞免疫では５×１０６細胞のＰＢＳによる細胞懸濁液を用い、タンパク質抗原の場合は、５μｇのＰＢＳ溶液を用いた。
調製したリンパ球とマウスミエローマ細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを、３：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール法で細胞融合を行い、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を含むメチルセルロース培地（商品名：ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）で７〜２８日間培養し、増殖してきたハイブリドーマの単一コロニーを、１つ１つを９６穴平底プレートにピックアップして、ＨＡＴを含む液体選択培地を用い、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した。増殖してきた単一コロニー由来のハイブリドーマの培養上清を、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（後述）による一次スクリーニング、ＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞，ＰＫ−５９を用いたＦＡＣＳ解析で２次スクリーニングを行うことで、生細胞の細胞表面に発現しているｈＴＲＯＰ−２タンパク質を認識する抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを３００種類樹立した。
［Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡを用いた一次スクリーニング］
９６穴培養プレート（ＢＤファルコン）に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｈＴＲＯＰ−２陰性コントロール：ヒューマンサイエンス振興事業団より購入）とＣＨＯ−Ｋ１−ｈＴＲＯＰ−２細胞（または、ＨｕＨ−７細胞（ｈＴＲＯＰ−２陰性コントロール：ヒューマンサイエンス振興事業団より購入）とＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞）を３×１０４細胞／ウェルで交互に播種し、５％ ＣＯ２、３７℃で１〜２日間培養した。デカンテーションで細胞培養液を除去し、次いで、氷冷ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳで５分間処理することにより細胞を固定し、氷冷ＰＢＳで洗浄後ＥＬＩＳＡプレートとした。以後、常法に従い、ＥＬＩＳＡ法を行った。具体的には以下のとおりである。
まず、２％スキムミルク−ＰＢＳ溶液によるブロッキングを室温で３０分〜１時間行った。次に、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で１時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。二次抗体として、ブロッキング溶液で１０００倍希釈した、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を加え、室温で１時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＳＩＧＭＡ）基質溶液を添加して発色反応を行い、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０（バイオ・ラッド）を用いて、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。陰性コントロールに対して、高い吸光度の値を示したハイブリドーマ培養上清に対応するハイブリドーマを２４穴平底プレートに拡大培養を行い、ＦＡＣＳ解析を用いた二次スクリーニング（後述）に移行した。
［ＦＡＣＳ解析を用いた二次スクリーニング］
上記のＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡを用いた一次スクリーニングで陽性であったハイブリドーマについて、ＦＡＣＳ解析を用いた二次スクリーニングを行った。細胞は、ｈＴＲＯＰ−２を発現していないヒト肝癌細胞株であるＨｕＨ−７細胞を陰性コントロールとして、ｈＴＲＯＰ−２を発現させた安定細胞株であるＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞に対する反応性を指標に評価し、次に内在的にｈＴＲＯＰ−２タンパク質を細胞表面に発現しているヒト膵臓癌細胞株であるＰＫ−５９細胞（ＲＣＢ１９０１；ＲＩＫＥＮ ｃｅｌｌ ｂａｎｋより購入）との反応性で評価した。
細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、細胞懸濁液（細胞密度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡを用いた一次スクリーニングで陽性反応を示したハイブリドーマ培養上清と細胞懸濁液１００μＬとを、４℃で２０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ＢＤファーミンゲン）（０．１μｇ）と反応（４℃、３０分）させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）により解析した。
最終的に、生細胞の細胞表面に発現しているｈＴＲＯＰ−２タンパク質を認識する抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを約３００種類樹立した。
［アイソタイプの同定］
作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のアイソタイプは、ＭＯＵＳＥ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）を用いて、キット添付の方法に従って行った。
［ＴＲＯＰ−２抗体の腹水化及び抗体精製］
上記方法で作製したハイブリドーマのクローンを、予め（７日前）２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を投与されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの腹腔内に３×１０６個投与し、２週間後の腹水を採取した。さらに、この腹水から、カプリル酸沈澱、プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、またはプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてアフィニティー精製を行うことで、各ハイブリドーマクローンが産生する抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を得た。
［抗原親和性の測定（Ｋｄ値の測定）］
作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の抗原親和性（Ｋｄ値）は、ＥＬＩＳＡを用いた方法で算出した（Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９６），Ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ７７−９７．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
具体的には、９６穴培養プレート（コーニング）に、精製したリコンビナントｈＴＲＯＰ−２タンパク質（０．１μｇ／ｍＬ）を添加して抗原を固相化した（室温，１時間、または４℃，一晩）。次に、ＰＢＳで３回洗浄し、２％スキムミルク（ＰＢＳ溶液）を加えてブロッキングを行った（室温、１時間）。ＰＢＳで２回洗浄後、予め抗原溶液（精製ｈＴＲＯＰ−２タンパク質；５０，２５，１２．５，６．２５，３．１２５ｎＭ）と抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の各クローン（０．５ｎＭ）とを混合し平衡化させておいた抗原−抗体複合体を、上記ＥＬＩＳＡプレートに添加して反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング液で希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）と反応させた（室温、１時間）。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した後に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＳＩＧＭＡ）基質溶液を添加して発色反応を行い、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０（バイオ・ラッド）を用いて、吸光度を測定した。
解離定数（Ｋｄ）の計算式は以下の通りとした。
抗原抗体反応は質量作用の法則により、
（２）式で、Ａｇｆは遊離抗原の濃度、Ａｂｆは遊離抗体の濃度、Ａｇ−Ａｂは抗原−抗体複合体の濃度を表し、Ａｇ−Ａｂ＝ｘとおくと、遊離抗体濃度は、
（２）式は、
（４）式の両項にｘ／Ｋｄ×Ａｂｔをかけると、
（５）式において、Ｘ＝ｘ／Ａｂｔ，Ｙ＝ｘ／Ａｂｔ×Ａｇｆとおくと、
（６）式から、Ｋｄ値を算出した。
上記の方法で、作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体３００クローンのＫｄ値を測定した結果、１×１０−１０（Ｍ）以下のＫｄ値を示すクローンが１３３クローン、１×１０−１１（Ｍ）以下のＫｄ値を示すクローンが５９クローン、１×１０−１２（Ｍ）以下のＫｄ値を示すクローンが２クローンであった。
ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長阻害活性を示した、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のうち、Ｋ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ）、Ｔ６−１６（マウスＩｇＧ２ａ）、Ｋ５−１０７（マウスＩｇＧ１）、Ｋ５−１１６−２−１（マウスＩｇＧ２ａ）、及びＴ５−８６（マウスＩｇＧ１）のＫｄ値は、それぞれ順に、６．８×１０−１２（Ｍ）、４．３×１０−１２（Ｍ）、４．７×１０−１２（Ｍ）、２．６９×１０−１１（Ｍ）、及び８．４９×１０−１１（Ｍ）であった（図１、表１）。
［抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のヒト癌細胞株との反応性］
ヒト癌細胞株（ヒト腫瘍細胞株）は、ヒューマンサイエンス振興事業団（ＨＳＲＲＢ）、ＲＩＫＥＮ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ（ＲＩＫＥＮ），ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）より入手したものを使用した。具体的には、以下に列挙した通りである。
ｈｕＨ−１（ＨＳＲＲＢ），ＨＵＨ−６（ＨＳＲＲＢ），ＨｕＨ−７（ＨＳＲＲＢ），ＪＨＨ−５（ＨＳＲＲＢ），ＪＨＨ−６（ＨＳＲＲＢ），ＪＨＨ−７（ＨＳＲＲＢ），ＨＬＥ（ＨＳＲＲＢ），ＨＬＦ（ＨＳＲＲＢ），ＨｅｐＧ２（ＨＳＲＲＢ），Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＨＳＲＲＢ），ＫＰ−１Ｎ（ＨＳＲＲＢ），ＫＰ−１ＮＬ（ＨＳＲＲＢ），ＫＰ−２（ＨＳＲＲＢ），ＫＰ−３（ＨＳＲＲＢ），ＫＰ−３Ｌ（ＨＳＲＲＢ），ＰＫ−１（ＲＩＫＥＮ），ＰＡＮＣ−１（ＲＩＫＥＮ），ＭＩＡ ＰａＣａ−２（ＨＳＲＲＢ），ＰＫ−５９（ＲＩＫＥＮ），ＰＫ−４５Ｈ（ＲＩＫＥＮ），ＰＫ−４５Ｐ（ＲＩＫＥＮ），ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ），ＳＵＩＴ−２（ＨＳＲＲＢ），ＴＣＣ−ＰＡＮ２（ＨＳＲＲＢ），ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ），ＤＬＤ−１（ＨＳＲＲＢ），ＬｏＶｏ（ＨＳＲＲＢ），ＣＯＬＯ−３２０（ＲＩＫＥＮ），ＣＡＣＯ−２（ＲＩＫＥＮ），ＣＷ−２（ＲＩＫＥＮ），ＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ），ＨＣＣ−５６（ＨＳＲＲＢ），ＭＣＦ−７（ＨＳＲＲＢ），ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ），ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ），Ａ５４９（ＨＳＲＲＢ），ＤＵ１４５（ＲＩＫＥＮ），ＰＣ−３（ＨＳＲＲＢ）
癌細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、細胞懸濁液（細胞密度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。細胞懸濁液１００μＬに抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を加え（０．１μｇ）、４℃で２０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ＢＤファーミンゲン）（０．１μｇ）と反応（４℃、３０分）させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）により解析した。
作製した抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、いずれも内在的にｈＴＲＯＰ−２を発現していないヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７とは結合せず、一方ｈＴＲＯＰ−２遺伝子を発現させた安定細胞株であるＨｕＨ−７−ｈＴＲＯＰ−２細胞には結合を示した（図２）。次に、作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のヒト癌細胞株（内在的に細胞表面に発現しているｈＴＲＯＰ−２タンパク質）との反応性をＦＡＣＳ解析により検討した結果、作製した３００種類の抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体は、全て、ヒト膵臓癌細胞株（ＰＫ−５９、ＢｘＰＣ−３）との結合を示し、特に、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長阻害活性を示した、Ｋ５−７０，Ｔ６−１６，Ｋ５−１０７，Ｋ５−１１６−２−１，Ｔ５−８６抗体は、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ＢＤファーミンジェン）のみと反応させた場合と比較して、ＰＫ−５９細胞では、平均蛍光強度でＫ５−７０（４４倍）、Ｔ６−１６（５９倍）、Ｋ５−１０７（８９倍）、Ｋ５−１１６−２−１（１２２倍）、Ｔ５−８６（１５倍）（図３）、ＢｘＰＣ−３細胞では、Ｋ５−７０（４５倍）、Ｔ６−１６（２５倍）、Ｋ５−１０７（９０倍）、Ｋ５−１１６−２−１（１２１倍）、Ｔ５−８６（１０倍）と、いずれの抗体も高い結合を示した（図４）。
ＰＫ−５９とＢｘＰＣ−３以外のヒト癌細胞株では、膵臓癌細胞株１２種類のうち、ＫＰ−２，ＫＰ−３Ｌ，ＰＫ−１，ＰＫ−４５Ｈ、ＳＵＩＴ−２、ＴＣＣ−ＰＡＮ２に結合し、ＫＰ−１Ｎ，ＫＰ−１ＮＬ，ＫＰ−３，ＰＡＮＣ−１，ＭＩＡ−ＰａＣａ２には結合しなかった（図５）。ヒト大腸癌細胞株では、ＣＡＣＯ−２，ＳＷ４８０，ＤＬＤ−１，ＨＣＴ １１６に結合し、ＣＯＬＯ−３２０，ＣＷ−２には結合しなかった（図６）。その他、ＪＩＭＴ−１，ＨＣＣ１１４３（いずれもヒト乳癌細胞株）、ＰＣ−３，ＤＵ１４５（いずれもヒト前立腺癌細胞株）と結合し、多くのヒト癌細胞株の細胞表面に内在的に発現しているｈＴＲＯＰ−２タンパク質を認識した（図６）。
［マウスＴＲＯＰ−２タンパク質、ヒトＴＲＯＰ−１／ＥｐＣＡＭタンパク質との交差反応性］
作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の特異性を調べる目的で、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質とアミノ酸配列で８０％の相同性を示すマウスＴＲＯＰ−２タンパク質、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質とアミノ酸配列で５０％の相同性を示すヒトＴＲＯＰ−１／ＥｐＣＡＭとの反応性をＦＡＣＳ解析にて行った。
具体的には、マウスＴＲＯＰ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２００４７、Ｙ０８８３０）の全長ｃＤＮＡを含む発現ベクター（マウスＴＲＯＰ−２−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、東京大学・分子細胞生物学研究所より供与）、およびヒトＴＲＯＰ−１／ＥｐＣＡＭ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２３５４）の全長ｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＥｐＣＡＭ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）を、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、一過性にＣＨＯ−Ｋ１細胞に遺伝子導入を行い、２４〜４８時間後に細胞をトリプシン処理で培養皿から剥がして細胞懸濁液を調整し、作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧと順次反応させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより解析した。
マウスＴＲＯＰ−２遺伝子を一過性に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞において、陽性対照として用いたマウスＴＲＯＰ−２と交差反応を示すＴ２−１０２抗体（マウスＩｇＧ１）は強い結合を示し、一方、Ｋ５−７０，Ｔ６−１６，Ｋ５−１０７，Ｋ５−１１６−２−１，Ｔ５−８６抗体はマウスＴＲＯＰ−２との交差反応は示さなかった（図７）。
同様に、ヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１遺伝子を一過性に発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞において、陽性対照として用いた抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（ＢＤファーミンジェン）は強い結合を示し、一方、Ｋ５−７０，Ｔ６−１６，Ｋ５−１０７，Ｋ５−１１６−２−１，Ｔ５−８６抗体はヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１との交差反応は示さなかった（図８）。
以上の結果は、作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体、特にｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示したＫ５−７０，Ｔ６−１６，Ｋ５−１０７，Ｋ５−１１６−２−１，Ｔ５−８６抗体は、ｈＴＲＯＰ−２に特異的に結合することが示された。
［細胞増殖阻害活性の測定］
抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のｈＴＲＯＰ−２の機能阻害を調べる方法の１つとして、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現しているヒト癌細胞の細胞増殖に対する影響を、テトラカラーワン（生化学工業）を用いた生細胞数の測定に基づいて評価した。具体的には、ＰＫ−５９細胞を０．５％のウシ胎児血清（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０５細胞／ｍＬの細胞濃度となるように細胞懸濁液を調製し、９６穴培養プレートに１００μＬずつ播種した。次いで、マウスＩｇＧ（陰性コントロール）、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（最終濃度０．１，１μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。比較対照として、市販の抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン ＹＹ０１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用した。細胞にテトラカラーワン（生化学工業）を添加し、５％ ＣＯ２インキュベーターで１〜２時間反応させた。反応後の９６穴プレートを、そのままマイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍ（対照波長：６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。各群３ウェルで実施し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で有意差検定を行い、Ｐ＜０．０５を統計的に有意と判定した。
これまでに自社で作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のうち、約１６０クローンについて、上記の方法でＰＫ−５９細胞の細胞増殖に与える効果を調べたところ、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長阻害活性を示した、Ｔ６−１６，Ｔ５−８６，Ｋ５−７０，Ｋ５−１０７は、マウスＩｇＧ（陰性コントロール）と比較して、２０％〜４０％の細胞増殖阻害活性が確認され、これら抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、ヒト癌細胞表面に発現するｈＴＲＯＰ−２タンパク質に結合し、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質の機能を中和し、癌細胞の増殖を阻害する活性を有することが明らかとなった（図９）。
［スクラッチアッセイ］
抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のヒト癌細胞の移動能をスクラッチアッセイで評価した。ＰＫ−５９細胞を１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に３×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞濃度となるように細胞懸濁液を調製し、９６穴培養プレートに１００μＬずつ播種した。細胞がコンフルエントに達した段階で、チップの先端で縦に線を引くようにして単層培養した細胞の一部を剥離した。抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体、および陰性コントロールとしてマウスＩｇＧを最終濃度が０．１、および１μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、２４時間培養を行い、抗体添加前（Ｄａｙ０）と２４時間培養後（Ｄａｙ１）の剥離した領域の写真を撮影し、細胞間距離を測定した。また、剥離領域の面積をＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェアで定量化した。各群８ウェルで実施し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで有意差検定を行い、Ｐ＜０．０５を統計的に有意と判定した。
スクラッチ領域に浸潤する細胞の運動能に対するｈＴＲＯＰ−２抗体の効果を調べた。細胞増殖阻害アッセイと同様に薬効のあった抗体を評価した。評価方法として、Ｄａｙ０（抗体添加時）およびＤａｙ１（２４時間経過後）の細胞を撮影し、移動距離（μｍ）および、スクラッチ領域の面積を画像解析した。結果、図１０に示すように、細胞の運動能に明らかな違いが見られた。本試験に使用したＴ６−１６およびＫ５−７０はコントロールと比較し、どちらも有意な増殖阻害が見られ、再現性試験においても同様の傾向が確認できた。特にＴ６−１６についてはＰ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、ｉｎ ｖｉｖｏの試験との相関性が認められた。
［担癌マウスでの抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の薬効評価］
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル
ｈＴＲＯＰ−２を発現する膵癌細胞株（ＰＫ−５９，ＢｘＰＣ−３）をトリプシン処理で剥がし、ＰＢＳで１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、氷上にて等量のマトリゲル（ＢＤファーミンゲン）と混合した。６週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）の右脇腹の皮下に２６Ｇのシリンジを用いて１００μＬ（５×１０６ｃｅｌｌ）注射した。癌細胞移植当日（Ｄａｙ１）に、マウスを群分し、抗体の投与（１，５，または１０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）を開始した。以降は、３日に１回の間隔で同様の投与を行った。抗腫瘍活性は、腫瘍形成頻度及び腫瘍体積により評価した。腫瘍体積の計測は、以下の計算式を用いた。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×（長径）×π／６
ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル
ｈＴＲＯＰ−２を発現する膵癌細胞株（ＰＫ−５９，ＢｘＰＣ−３）をトリプシン処理で剥がし、ＰＢＳで１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、氷上にて等量のマトリゲル（ＢＤファーミンゲン）と混合した。６週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）の右脇腹の皮下に２６Ｇのシリンジを用いて１００μＬ（５×１０６ｃｅｌｌｓ）注射した。癌細胞移植から５〜６日後、腫瘍体積が５０〜１５０ｍｍ３（平均値で約１００ｍｍ３）に成長したマウスを群分し、群分した当日を１日目（Ｄａｙ１）として、抗体投与を開始した。抗体は３日に１回の間隔で腹腔内投与を行った（１０ｍｇ／ｋｇ体重）。抗腫瘍活性は、腫瘍体積を計測することによって評価した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行い、Ｐ＜０．０５を統計的に有意と判定した。
［ヒト膵癌細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおける抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の検討］
ｈＴＲＯＰ−２を標的とした癌治療用抗体は、ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、ｈＴＲＯＰ−２を発現する腫瘍組織を特異的に死滅させるか、腫瘍の成長を阻害する活性を示すことが必須である。
本発明において新たに作製した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（約１６０クローン）を、膵癌細胞株ＰＫ−５９細胞のｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで評価した。ＰＫ−５９細胞は、膵臓癌幹細胞マーカーであるＥｐＣＡＭを発現し（図１１Ａ）（Ｃｈｅｎｗｅｉ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７：（３）．１０３０−１０３７），薬剤耐性に関わるＡＢＣ トランスポーターであるＰ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＭＤＲ１（図１１Ｂ），ＡＢＣＧ２／ＣＤｗ３３８（図１１Ｃ）を細胞表面に発現している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ４７（３），３８１−３８９（１９８６），Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５（１０），１６４９−１６５５（１９９６）。また、膵臓癌幹細胞の特徴であるＣＤ２４とＣＤ４４共陽性の細胞画分（８．９３％）（図１１Ｄ）を含み、悪性度の高いヒト膵臓癌細胞株であると推測される（Ｃｈｅｎｗｅｉ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７：（３）．１０３０−１０３７、Ｊａｎｅ Ｅ．Ｖｉｓｖａｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｏｆｆｒｅｙ Ｊ．Ｌｉｎｄｅｍａｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．Ｖｏｌ．８（１０）：７５５−６８，２００８）。
新規に作製した約１６０クローンのうち、大部分のクローンはＰＫ−５９細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでは薬効を示さなかったが、その中でも有意な腫瘍成長阻害活性を示す以下のクローン、すなわちクローンＫ５−７０，Ｔ６−１６，Ｋ５−１０７，Ｔ５−８６及びＫ５−１１６−２−１が得られた。
クローンＫ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ）投与群では、腫瘍成長速度が統計的に有意に阻害され、投与開始後２１日目（Ｄａｙ２１）において、コントロール群（Ｎ＝１４）の腫瘍体積が１２００．８±３７７．３ｍｍ３に対し、クローンＫ５−７０投与群では７４８．７±１７５．０ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図１２Ａ）。抗体投与開始時点での腫瘍体積を１．０としたときの、２１日目（Ｄａｙ２１）における腫瘍体積は、コントロール群が１２．５であるのに対し、クローンＫ５−７０投与群では７．８であった（図１２Ａ）。摘出した腫瘍重量も、コントロール群が０．７３±０．２６ｇであったのに対し、クローンＫ５−７０投与群では０．４３±０．１４ｇ（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、約６０％の阻害を示した（図１２Ｂ）。
同様に、クローンＫ５−１０７（マウスＩｇＧ１）投与群（Ｎ＝８）、クローンＴ６−１６（マウスＩｇＧ２ａ）投与群（Ｎ＝８）、クローンＴ５−８６（マウスＩｇＧ１）及びクローンＫ５−１１６−２−１（マウスＩｇＧ２ａ）投与群（Ｎ＝８）でも、腫瘍成長速度が統計的に有意に阻害された。クローンＫ５−１０７投与群（Ｎ＝８）並びにクローンＴ６−１６投与群（Ｎ＝８）では、投与開始後１７日目（Ｄａｙ１７）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が１０３９．３±２７１．６ｍｍ３に対し、それぞれ６９８．２±１７５．９ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、７０７．２±２５４．５ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった。同様に、クローンＫ５−１１６−２−１投与群（Ｎ＝８）では、投与開始後１６日目（Ｄａｙ１６）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が７９７．０±１７２．９ｍｍ３に対し、５０８．５±２２５．２ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図１３）。
一方、クローンＴ５−８６については、投与開始後１５日目（Ｄａｙ１５）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が１０３３．２±３１９．４ｍｍ３に対し、クローンＴ５−８６投与群（Ｎ＝８）では７４４．１±２８９．１ｍｍ３であり、腫瘍体積の比較では有意差はつかなかったものの、同日における腫瘍重量の比較では、コントロール群が０．６２±０．１４ｇであったのに対し、クローンＴ５−８６投与群では０．４４±０．１３ｇ（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり有意な阻害が示された。
また、下記表２に、各クローン抗体投与群の実験最終日におけるコントロール群との比率（Ｔ／Ｃ）を、腫瘍体積および腫瘍重量のそれぞれについて示した。表２に示した通り、各クローン抗体投与群において、それぞれＴ／Ｃ＝６２〜７２％の有意な阻害が得られた。
また、クローンＫ５−７０、クローンＴ６−１６、クローンＫ５−１１６−２−１について、それぞれ膵癌細胞株ＰＫ−５９細胞のｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルでの抗腫瘍活性を検討した。それぞれのクローンにおいて、抗体投与後全ての個体で（Ｎ＝８）腫瘍成長が阻害され、クローンＫ５−７０投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、投与開始後１８日目（Ｄａｙ１８）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が８８０．８±２０６．４ｍｍ３に対し、６２．４±８０．４ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と９２．９％の腫瘍成長阻害活性を示し、クローンＴ６−１６投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、投与開始後２８日目（Ｄａｙ２８）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が９９２．３±２５０．８ｍｍ３に対し、１５２．１４±１２２．３ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と８４．６％の腫瘍成長阻害活性、クローンＫ５−１１６−２−１投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、クローンＫ５−１１６−２−１投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、投与開始後２０日目（Ｄａｙ２０）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が１１５９．４±４１３．３ｍｍ３に対し、２０７．７±３１９．２ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と８２．１％の腫瘍成長阻害活性を示した（図１４，表３）。また、すべての実験において、試験期間を通じて、コントロール群と抗ｈＴＲＯＰ−２抗体投与群の間に、平均体重の変化に有意な差はなかった。
下記表３に、各クローン抗体投与群の、実験最終日におけるコントロール群との比率（Ｔ／Ｃ）を、腫瘍体積および腫瘍重量それぞれについて示した。表３に示したとおり、各クローン抗体投与群において、有意な腫瘍成長阻害が見られ、特にクローンＫ５−７０投与群では、Ｔ／Ｃ＝１０％以下の顕著な効果が確認された。
公知の抗ＴＲＯＰ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２（米国特許第７４２００４１号）は、様々なヒト癌細胞株を用いた２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルで腫瘍成長阻害効果を示しているが、ヒト膵臓癌細胞株ＰＬ４５細胞では、ほぼ１００％の腫瘍成長を阻害しているものの、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３では約５０％、前立腺癌細胞株ＰＣ−３では約４０％，乳癌細胞株であるＭＣＦ−７では約６０％，大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５で約４０％の腫瘍成長阻害効果であったことに対して、本願発明の抗ｈＴＲＯＰ−２抗体は、半分の投与量（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で、より強い腫瘍成長阻害効果を発揮した。
［ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルおよびｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）における抗腫瘍活性の検討］
上記のヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９細胞のｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルを用いた場合と同様に、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３細胞のｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル及びｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでの抗腫瘍活性を、クローンＫ５−７０について検討した。
クローンＫ５−７０投与群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）と比較して、腫瘍成長が有意に阻害され、５２日目（Ｄａｙ５２）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が６１６．３±２６６．８ｍｍ３であったのに対し、クローンＫ５−７０投与群（Ｎ＝８）では２３６．０±１３６．４ｍｍ３と６１．７％の腫瘍成長阻害効果を示した（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）（図１５）。
以上の結果より、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体は、少なくとも２つ以上の複数の癌細胞種に対して、ｉｎ ｖｉｖｏでの有意な腫瘍成長阻害活性を示すことが明らかとなった。
［抗ｈＴＲＯＰ２抗体（クローンＫ５−７０）の、ｈＴＲＯＰ２発現膵癌細胞株（ＰＫ−５９細胞）ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性］
抗ｈＴＲＯＰ−２抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長阻害活性を、より詳細に検討する目的で用量依存性試験を行った。図１６に示したとおり、ＰＫ−５９細胞の腫瘍の成長はＫ５−７０抗体の投与によって用量依存的に阻害され、抗体投与後２１日目（Ｄａｙ２１）において、コントロール群（Ｎ＝８の腫瘍体積が９３７．８±２９５．３ｍｍ３であったのに対し、Ｋ５−７０抗体（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８）が４９３．５±３０５．１ｍｍ３と５０％の阻害率を示し、Ｋ５−７０抗体（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８）が１２４．７±８９．０ｍｍ３と９０％の阻害効果を示し、公知の抗ＴＲＯＰ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２（米国特許第７４２００４１号）と比較して、２０分の１の投与量でほぼ同等のｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長阻害効果を示し、４分の１の投与量では、より高い９０％の阻害効果を示すことが明らかになった。
［エピトープアッセイ］
ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２タンパク質の作製
ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２遺伝子はＰＣＲ法を用いて作製した。ヒトＴＲＯＰ−２遺伝子配列およびマウスＴＲＯＰ−２遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２００４７）をもとに以下に示すＰＣＲプライマーを設計した。
ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−Ｃプライマー
ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−Ａプライマー
ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−Ｂプライマー
マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−Ｄプライマー
マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−Ｅプライマー
マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−Ｆプライマー
マウスＴＲＯＰ−２プライマー
マウスＴＲＯＰ−２リバース側プライマーにはストップコドンを除き、Ｘｈｏ Ｉによる制限酵素消化配列を付加した。作製したヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２タンパク質の模式図を図１７に示す。
ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａキメラタンパク質は、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から６９番目までのポリペプチドとマウスＴＲＯＰ−２タンパク質の６４番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。ｈｍＴＲＯＰ２−Ｂキメラタンパク質は、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から１０１番目までのポリペプチドとマウスＴＲＯＰ−２タンパク質の９６番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。ｈｍＴＲＯＰ２−Ｃキメラタンパク質は、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から１４５番目までのポリペプチドとマウスＴＲＯＰ−２タンパク質の１４０番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄキメラタンパク質は、マウスＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から１３９番目までのポリペプチドとｈＴＲＯＰ−２タンパク質の１４６番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅキメラタンパク質は、マウスＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から１８７番目までのポリペプチドとｈＴＲＯＰ−２タンパク質の１９４番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆキメラタンパク質は、マウスＴＲＯＰ−２タンパク質のＮ末端から２２７番目までのポリペプチドとｈＴＲＯＰ−２タンパク質の２３４番目からＣ末端までのポリペプチドから成るキメラタンパク質である。
上記キメラタンパク質を作製するための発現ベクターは、具体的には以下の方法で構築した。ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａキメラ遺伝子を作製するためｈＴＲＯＰ−２遺伝子を鋳型にして、ｈＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー及びヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＡプライマーＹ６１３を用いてＰＣＲを行った。同様にマウスＴＲＯＰ−２遺伝子を鋳型にして、ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＡプライマーＹ６１２及びマウスＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片はアクリルアミドゲルを用いて展開、目的バンドの抽出により回収した。次に抽出した２種類のＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ｈＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー及びマウスＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により展開し、目的のＤＮＡ断片を抽出した。抽出したＤＮＡ断片はｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし（ｐＣＲＢ−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａ）、遺伝子配列を確認した。動物細胞用発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴＲＯＰ−２−ｍｙｃ／ＨｉｓからＥｃｏ ＲＩ／Ｘｈｏ Ｉ消化によりｈＴＲＯＰ−２遺伝子を除き、ｐＣＲＢ−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａから調製したｈｍＴＲＯＰ−２−Ａキメラ遺伝子を含むＥｃｏ ＲＩ／Ｘｈｏ Ｉ断片を挿入することで作製した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。その他ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｂ（ヒトＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー、ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＢプライマーＹ６１５、ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＢプライマーＹ６１４及びマウスＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを使用）、ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃ（ヒトＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー、ヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＣプライマーＹ６０７及びヒト／マウスＴＲＯＰ−２−ＣプライマーＹ６０６、マウスＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを使用）、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄ（マウスＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー、マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＤプライマーＹ６０９及びマウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＤプライマーＹ６０８、ヒトＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを使用）、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅ（マウスＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー、マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＥプライマーＹ６１７及びマウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＥプライマーＹ６１６、ヒトＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを使用）、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆ（マウスＴＲＯＰ−２フォワード側プライマー、マウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＦプライマーＹ６１９及びマウス／ヒトＴＲＯＰ−２−ＦプライマーＹ６１８、ヒトＴＲＯＰ−２リバース側プライマーを使用）についても同様の方法でキメラ遺伝子を作製し、発現ベクターを構築した（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｂ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。
ｈＴＲＯＰ−２、ヒト／マウスキメラＴＲＯＰ−２−Ｃ、及びマウス／ヒトキメラＴＲＯＰ−２−Ｄタンパク質を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞株の樹立
ＨＥＫ２９３細胞株に上記発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＴＲＯＰ−２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１−ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄ−ｍｙｃ／Ｈｉｓをそれぞれ遺伝子導入した。抗生物質Ｇ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）による選択を行い、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質、ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃキメラタンパク質およびｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄキメラタンパク質を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を樹立した。
膵臓癌細胞株ＰＫ−５９を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、薬効を示した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体Ｋ５−７０、Ｔ５−８６、Ｋ５−１０７、Ｔ６−４、Ｔ６−１６およびＫ５−１１６−２−１について結合領域の同定を行った。まずｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃ、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄ、それぞれのキメラタンパク質を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて、薬効を示した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の反応性をＦＡＣＳ解析により検討した（図１８）。その結果、Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｔ５−８６およびＫ５−１１６−２−１抗体はｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃと反応したがｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄとは反応しなかった。一方、Ｔ６−４およびＴ６−１６抗体はｍｈＴＲＯＰ−２−Ｄと反応したがｈｍＴＲＯＰ−２−Ｃとは反応しなかった。これらのことからＫ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｔ５−８４およびＫ５−１１６−２−１抗体の結合領域はｈＴＲＯＰ−２のＮ末端から１４５番目のアミノ酸までの領域、Ｔ６−４およびＴ６−１６抗体の結合領域はｈＴＲＯＰ−２の１４６番目のアミノ酸からＣ末端までの領域に限定された（図１８）。
さらに詳細に結合領域の解析を行うため、ｈｍＴＲＯＰ−２−Ａ、ｈｍＴＲＯＰ−２−Ｂ、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅ及びｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆキメラタンパク質発現用ベクターを作製し、薬効を示す抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体との反応性を検討した（図１９）。新たに作製したキメラタンパク発現用ベクターをＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、一過性に発現させた細胞を用いてＦＡＣＳ解析を行った。Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｔ５−８６およびＫ５−１１６−２−１抗体はｈｍＴＲＯＰ−２−Ａとは反応したがｍｈＴＲＯＰ−２−Ｂとは反応しなかった。調べた６種類のモノクローナル抗体はすべてｈＴＲＯＰ−２とは反応を示した。このことからＫ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｔ５−８６およびＫ５−１１６−２−１抗体の結合領域はｈＴＲＯＰ−２のＮ末端から６９番目のアミノ酸までの領域に存在することが明らかとなった。またＴ６−４およびＴ６−１６抗体はｍｈＴＲＯＰ−２−Ｅ、ｍｈＴＲＯＰ−２−Ｆ共に反応しなかったことから、ｈＴＲＯＰ−２の１４６番目から１９３番目のアミノ酸までの領域を認識することが示唆された。
［免疫組織化学］
＜材料・方法＞
免疫組織染色に使用した正常および癌組織アレイは以下の通りである。
ヒト正常組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｎｏｒｍａｌ ｏｒｇａｎｓ ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＡＢ１，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｓｉｎｇｌｅ ｓｐｏｔｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：Ａ１０３（ＶＩ），ＩＳＵ ＡＢＸＩＳ）
肺癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｎｏｒｍａｌ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＣＡ３，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｍａｒｇｉｎ ｔｉｓｓｕｅ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＲｓＬｕｇ０３−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
膵臓癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏ−ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ６０ｃａｓｅｓ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＤｇＰａｎ０３−００１，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
肝臓癌組織アレイ：
Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｇｒａｄｅ Ｉ〜ＩＩＩ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ，６３ｃａｓｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＳ０３−０１−００２Ｕ，Ｃｙｂｒｄｉ）
Ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏ−ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ３０ｃａｓｅｓ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＤｇＬｉｖ０２−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
大腸癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＤ３，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｍａｒｇｉｎ ｔｉｓｓｕｅ，２ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＤｇＣｏｌ０３−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
大腸癌リンパ節転移、肝転移組織アレイ：
Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ（ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｔｕｍ）ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙ，４４ｃａｓｅｓ／９９ｃｏｒｅｓ，ｔｒｉａｌ ｓｌｉｄｅ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＯ９９１ｔ，Ｂｉｏｍａｘ ｕｓ）
Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ（ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｔｕｍ）ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙ，４３ｃａｓｅｓ／９９ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＯ９９２，Ｂｉｏｍａｘ ｕｓ）
Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ＿ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：Ａ２０３（ＩＶ），ＩＳＵ ＡＢＸＩＳ）
乳癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｎｏｒｍａｌ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＢＡ３，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｍａｒｇｉｎ ｔｉｓｓｕｅ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＲｐＢｒｅ０３−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
胃癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＱ１，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｍａｒｇｉｎ ｔｉｓｓｕｅ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＤｇＳｔｍ０３−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
食道癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ ｃａｎｃｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＲ１，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
Ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐｈａｇｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｍａｒｇｉｎ ｔｉｓｓｕｅ，２ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｒｅｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＯＤ−ＣＴ−ＤｇＥｓｏ０３−００２，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
卵巣癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｏｖａｒｙ ｃａｎｃｅｒ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＪ１，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ
前立腺癌組織アレイ：
Ｈｕｍａｎ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ−ｎｏｒｍａｌ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＡ３，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）
膀胱癌組織アレイ：
Ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ／ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｇｒａｄｅ Ｉ〜ＩＩＩ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙｓ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＣＣ１２−０１−００１Ｕ，Ｃｙｂｒｄｉ）
上記組織アレイの患者情報および臨床情報は添付のデータシートおよび各社のホームページから入手した。
免疫組織染色法
ヒト正常組織および癌組織の組織アレイパラフィン切片は、脱パラフィン処理後、３７℃で５分間ペプシンによるプロテアーゼ処理を行い、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体を用いた免疫染色に使用した。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジン）を基質とて発色反応を行った後、対比染色としてヘマトキシリンによる核染色を行った。
これらの操作はより具体的には次のようにして行なった。パラフィン包埋された切片を脱パラフィン処理した後、３７℃で５分間ペプシン（ＤＡＫＯ）によるプロテアーゼ処理を行った。抗原賦活化後、メタノールに終濃度０．３％となるように過酸化水素水を加えた溶液により、室温で２０分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。ＰＢＳで室温５分間の洗浄を２回行った後、１．５％の正常ウマ血清（ＤＡＫＯ）を含むＰＢＳ溶液を用いて室温３０分間のブロッキングを行い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に１．５％の正常ウマ血清を含むＰＢＳ溶液により希釈した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ Ｋ５−６３−１７（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで室温５分間の洗浄を３回行い、続いて１．５％の正常ウマ血清を含むＰＢＳ溶液により２００倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を室温で３０分間反応させた。ＰＢＳによる室温５分間の洗浄を３回行った後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）の試薬を説明書通りに混合しＡＢＣコンプレックスを作り、これを室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで室温５分間の洗浄を３回行った後、ヒストファインペルオキシダーゼ基質シンプルステインＤＡＢ溶液（ニチレイバイオサイエンス）によって発色を行った。発色を確認した後、脱イオン水で５分間洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液（和光純薬）によって核を染色し、その後アルコールで脱水、キシレンで透徹してエンテランニュー（メルク・ジャパン株式会社）で封入した。
＜結果＞
ヒト正常組織におけるｈＴＲＯＰ−２の発現
ヒト正常組織におけるｈＴＲＯＰ−２の発現パターンについて、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−６３−１７を用いて解析した。ヒト正常組織組織アレイ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．：ＡＢ１，Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ）を脱パラフィン、親水化処理を行った後、タンパク質分解酵素ペプシンによる抗原の賦活化を行い、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−６３−１７で免疫染色を行った（図２０）。その結果、皮膚、食道、腎臓（皮質及び髄質）、膵臓、前立腺、膀胱、扁桃腺で染色が見られた。ほとんどの染色像は細胞膜への局在を示していたが（図２０Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆ，Ｇ．Ｈ）、一部細胞質にも発現が見られた（図２０．Ｅ，Ｈ）。一方、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、骨格筋、肺、脾臓、胸腺などでは染色されなかった（図２０．Ｉ，Ｊ）。
ヒト癌組織におけるｈＴＲＯＰ−２の発現
ヒト癌組織におけるｈＴＲＯＰ−２の発現（ｈＴＲＯＰ−２の陽性率）を調べるため、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体 クローン Ｋ５−６３−１７を用いて、ヒトの各癌種の癌組織アレイの免疫染色を行った。癌細胞の１０％以上が染色される組織切片をｈＴＲＯＰ−２陽性とした。この染色結果を表４に示した。
また、代表的な染色像を図２１に示した。ｈＴＲＯＰ−２の発現を検討した癌種では、前立腺癌で最も陽性率が高く（９２．１％）、肺癌（６５．４％）、食道癌（７６．７％）、膀胱癌（７１．２％）などで高い陽性率であった。最も陽性率の低かったのは肝臓癌で７．６１％であった。癌細胞でも正常細胞と同様に、ｈＴＲＯＰ−２は細胞膜に強く局在している染色像が見られた（図２１．Ａ〜Ｆ，Ｈ，Ｉ）。また一部は細胞質にも発現していた（図２１．Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｇ）。
膵臓癌でのｈＴＲＯＰ−２の陽性率は４１．９％であった。このときのｈＴＲＯＰ−２陽性率と膵臓癌のグレード（分化度）との関係について検討した。その結果、グレードが高い、すなわち低分化膵臓癌で高頻度に発現していた（表５）。
［Ｋ５−７０抗体の単回投与による、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルでの抗腫瘍効果］
クローンＫ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ）のｉｎ ｖｉｖｏにおける強い抗腫瘍活性は、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で１回投与した場合においても示された。コントロール群（マウスＩｇＧ １０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝３）では、全ての個体において腫瘍形成が観察され、細胞移植後２８日目（Ｄａｙ２８）における腫瘍体積は７８１．７±７４．５ｍｍ３であったのに対して、癌細胞移植日（Ｄａｙ１）に１回Ｋ５−７０抗体を投与した群では（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝３）、Ｄａｙ２８における腫瘍体積は１４４．４±１７６．９ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と８１．５％の腫瘍成長阻害活性を示した（図２２Ａ）。腫瘍重量においては、Ｄａｙ２８においてコントロール群が０．５９±０．０６ｇであったのに対し、クローンＫ５−７０抗体投与群では０．０７±０．１０ｇ（Ｐ＜０．０１ ｂｙ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ））と８８％の阻害活性を示した（図２２Ｂ）。腫瘍体積、腫瘍重量のいずれにおいても、Ｋ５−７０抗体投与群では３個体中２個体では、１回の１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与で、完全に腫瘍形成が阻害された（図２２Ｃ）。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗ヒｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体の抗腫瘍活性］
抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローンＫ５−７０，Ｋ５−１１６−２−１およびＴ６−１６）の抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を６週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階で群分けを行い（Ｄａｙ７又はＤａｙ１０），Ｄａｙ７又はＤａｙ１０から３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を開始した。クローンＫ５−７０抗体の抗腫瘍活性評価と、クローンＫ５−１１６−２−１抗体およびクローンＴ６−１６抗体の抗腫瘍活性評価は、それぞれ独立した試験で評価した。Ｋ５−７０抗体の抗腫瘍活性評価試験においては、癌細胞移植から４４日目（Ｄａｙ４４）におけるコントロール群（マウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ体重），Ｎ＝８）の腫瘍体積が３６５．４±２１４．６ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では、２７．４±２９．４ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と著しく腫瘍形成が阻害された（阻害率９２．５％）（図２３Ａ）。腫瘍重量においては、コントロール群が０．１１±０．０７ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では０．００５±０．００７（ｇ）（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と９５．５％の阻害率であった（図２３Ｂ）。特に、Ｋ５−７０抗体投与群では８個体中２個体では、完全に腫瘍形成が阻害され腫瘍の確認が出来なかった。
別に行ったＫ５−１１６−２−１抗体およびＴ６−１６抗体の抗腫瘍活性評価試験においては、Ｄａｙ４２におけるコントロール群の腫瘍体積が７１３．８±３５４．５ｍｍ３（Ｎ＝８）であったのに対して、Ｋ５−１１６−２−１抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、１８８．９±９７．４ｍｍ３（Ｎ＝８，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）（図２４Ａ），Ｔ６−１６抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重）では、２９２．８±１９９．７ｍｍ３（Ｎ＝８，Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）（図２５Ａ）と、それぞれ７３．５％，５９．０％の阻害率であった。腫瘍重量についても同様に、コントロール群では０．３９±０．１９ｇであったのに対して、Ｋ５−１１６−２−１抗体投与群、Ｔ６−１６抗体投与群では、０．１０±０．０７ｇ（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），０．１７±０．１４ｇ（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と、それぞれ７２．２％，５６．４％の阻害率を示した（図２４Ｂ，図２５Ｂ）。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるクローンＫ５−７０の用量依存的な抗腫瘍活性］
次に、Ｋ５−７０抗体の用量依存的な抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を６週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階でコントロール群（マウスＩｇＧ １０ｍｇ／ｋｇ体重投与群、Ｎ＝８，１０４．４±１７．６ｍｍ３），１ｍｇ／ｋｇ体重のＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．３±１６．１ｍｍ３），５ｍｇ／ｋｇ体重のＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．６±１５．９ｍｍ３），１０ｍｇ／ｋｇ体重のＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．８±１４．９ｍｍ３）に群分を行い、３日に１回の腹腔内投与を行った。Ｄａｙ４２におけるコントロール群の腫瘍体積が７１３．８±３５４．５ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では用量依存的な腫瘍形成阻害活性が観察され、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、４８５．０±２０７．３ｍｍ３（阻害率３２．１％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３３９．５±２５３．２ｍｍ３（阻害率５２．４％），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３５５．４±２０２．８ｍｍ３（阻害率５０．２％，Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２６Ａ）。同様に、Ｄａｙ４２における腫瘍重量については、コントロール群が０．３９±０．１９ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体の１ｍｇ／ｋｇ体重 投与群では，０．２４±０．１１ｇ（阻害率３７．８％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．１７±０．１４ｇ（阻害率５５．８％，Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．２０±０．１３ｇ（阻害率４７．１％）となり、用量依存的な抗腫瘍活性が確認された（図２６Ｂ）。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＫ５−７０抗体の投与間隔の検討］
さらに、Ｋ５−７０抗体の至適投与間隔を検討するために、週に１回（７日に１回）投与を行った際の抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を６週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階でコントロール群（マウスＩｇＧ，１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，１０４．４２±１５．１ｍｍ３），Ｋ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，１０４．３±１６．１ｍｍ３）に群分を行い、７日に１回の腹腔内投与を行った。Ｄａｙ４２におけるコントロール群の腫瘍体積が７１３．８±３５４．５ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群（週１回投与）では、３３２．３±２３９．９ｍｍ３（阻害率５５％，Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）となった（図２７Ａ）。更に、投与間隔を空け１０日に１回および２週間に１回投与した場合、Ｄａｙ３９におけるコントロール群の腫瘍体積が９５６．９±３６７．８ｍｍ３であったのに対して、１０日に１回のＫ５−７０抗体投与群では、５２５．４±１８０．６ｍｍ３（阻害率４５．１％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）２週間に１回のＫ５−７０抗体投与群では４５９．４±２１７．６ｍｍ３（阻害率５２．０％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）となった（図２７Ｂ）。先行技術（ＵＳ ７４２００４０，ＵＳ ７４２００４１）では、膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ−３）を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、２０ｍｇ／ｋｇ体重、週に３回の抗体投与（投与間隔２日間）で、阻害率５０−６０％の抗腫瘍活性を示しているのに対し、Ｋ５−７０抗体は１回の投与量が半分（１０ｍｇ／ｋｇ体重）、かつ２週間に１回の投与（投与間隔１３日間）で、先行技術に匹敵する抗腫瘍活性を示した。従ってＫ５０−７０抗体は少なくとも先行技術の１２分の１の総投与量で顕著な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＴ６−１６抗体の用量依存的な抗腫瘍活性］
次に、Ｔ６−１６抗体の用量依存的な抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を６週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階でコントロール群（マウスＩｇＧ １０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，１０５．８±９．９ｍｍ３），１ｍｇ／ｋｇ体重のＴ６−１６抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．４±１３．３ｍｍ３），５ｍｇ／ｋｇ体重のＴ６−１６抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．７±１３．０ｍｍ３），１０ｍｇ／ｋｇ体重のＴ６−１６抗体投与群（Ｎ＝８，１０４．８±１２．４ｍｍ３）に群分を行い、３日に１回の腹腔内投与を行った。Ｄａｙ４３におけるコントロール群の腫瘍体積が４７３．５±１３７．０ｍｍ３であったのに対して、Ｔ６−１６抗体投与群では用量依存的な腫瘍形成阻害活性が観察され、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３９７．９±９７．５ｍｍ３（阻害率１６．０％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１９５．９±８９．７ｍｍ３（阻害率５８．７％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１９０．２±５６．５ｍｍ３（阻害率５９．８％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２８Ａ）。同様に、Ｄａｙ４３における腫瘍重量は、コントロール群が０．１９±０．０７ｇであったのに対して、１ｍｇ／ｋｇ体重のＴ６−１６抗体投与群では、０．２０±０．０８ｇ，５ｍｇ／ｋｇ体重の投与群では、０．０８±０．０４ｇ（阻害率５７．９％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与群では、０．０９±０．０４ｇ（阻害率５２．６％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）となり、用量依存的な抗腫瘍活性が確認された（図２８Ｂ）。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＴ６−１６抗体の投与間隔の検討］
さらに、Ｔ６−１６抗体の至適投与間隔を検討するために、週に１回（７日に１回）および１０日に１回の投与間隔での抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を６週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階でコントロール群（マウスＩｇＧ，１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，１０５．８±９．９ｍｍ３），週１回のＴ６−１６抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，１０５．０±１１．６ｍｍ３），１０日に１回のＴ６−１６抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝５，１３０．８±２．４ｍｍ３）に群分けを行い、投与を開始した。Ｄａｙ４３におけるコントロール群の腫瘍体積が４７３．５±１３７．０ｍｍ３であったのに対して、週１回のＴ６−１６抗体投与群では、２４３．７±６５．３ｍｍ３（阻害率４８．５％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０日に１回のＴ６−１６抗体投与群では、２９７．８±５４．４ｍｍ３（阻害率３７．１％，Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）となった（図２９）。先行技術（ＵＳ ７４２００４０，ＵＳ ７４２００４１）が膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ−３）を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、週に３回投与（投与間隔２日間）で、阻害率５０−６０％の抗腫瘍活性を示しているのに対し、Ｔ６−１６抗体は、１回の投与量が、先行技術の半分の用量かつ、１０日に１回の投与（投与間隔９日間）で、顕著な抗腫瘍活性を示した。従って、Ｔ６−１６抗体は少なくとも先行技術の８分の１の総投与量で顕著な抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
［ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける抗腫瘍活性の検討］
クローンＫ５−７０のヒト前立腺癌に対する抗腫瘍活性を、ＤＵ−１４５細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，ＲＣＢ２１４３）を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルで評価した。５×１０６細胞のＤＵ−１４５細胞を６週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）の皮下に移植し、移植当日をＤａｙ１とし、コントロール群（マウスＩｇＧ）（Ｎ＝８）とＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８）に群分けを行い、Ｄａｙ１から３日に１回の頻度で１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で腹腔内投与した。Ｄａｙ４０において、コントロール群における腫瘍体積が３６８．２±３０７．８ｍｍ３であったのに対し、Ｋ５−７０抗体投与群では３０．６±２９．６ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と約９０％の腫瘍形成阻害活性を示した（図３０Ａ）。腫瘍重量においては、更に顕著な抗腫瘍活性が認めらた。Ｄａｙ４０におけるコントロール群の腫瘍重量が０．１８±０．１８ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では８個体の全てにおいて腫瘍が消失しており、完全に腫瘍形成が阻害された（図３０Ｂ）。以上の結果から、抗ヒトＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体クローンＫ５−７０は、ヒト前立腺癌細胞に対しても強い抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
［ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９細胞の肝転移モデルを用いたＫ５−７０抗体の転移抑制活性］
消化器癌の治療において、癌の転移は臨床上の予後を左右する重要な因子であり、転移をコントロールすることは治療上重要な意味を有する。 ＴＲＯＰ−２を標的とした癌治療用抗体投与により、腫瘍形成の抑制のみならず、癌細胞の他臓器への転移を抑制することが可能であれば、高い臨床上の有用性が期待されるため、癌治療抗体として望ましい特性である。
ＴＲＯＰ−２は多くの癌腫における発現が確認されているが、特に転移巣において高発現していることが示されている（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００８）；９９：１２９０−１２９５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）；１２：３０５７−３０６３，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００８）；２１：１８６−１９１）。さらに、Ｔｒｏｐ−２遺伝子を導入した癌細胞を経脾的あるいは経膵的にヌードマウスに移植した場合に、肝転移の発症率が増加すること（ＷＯ ２０１０／０８９７８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ（２０１０）；９：２５３）が報告され、ＴＲＯＰ−２の癌転移過程における重要性が示唆されている。しかしながら、ＴＲＯＰ−２を標的とした抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏで転移抑制作用を具体的に示した報告はこれまでに認められない。
本発明により見出された抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体Ｋ５−７０は、ヒト膵臓癌細胞を皮下に移植したゼノグラフトモデルにおいて高い治療効果が示されているが、癌細胞の増殖抑制効果に加え、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９の遊走能を抑制することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイで示されており、癌の転移をｉｎ ｖｉｖｏにおいても抑制する可能性が考えられた。そこで、ＰＫ−５９細胞をヌードマウスの脾臓から注入し、肝転移を発生させるモデルを用いて抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体の転移抑制効果を検証した。
癌細胞移植の前日に、マウスを群分し、抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体Ｋ５−７０あるいは対照抗体（精製マウスＩｇＧ）を１０ｍｇ／ｋｇ体重にて腹腔内投与した。翌日、ｈＴＲＯＰ−２を内在的に発現するヒト膵癌細胞株（ＰＫ−５９）をトリプシン処理で剥がし、ＰＢＳで２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液は移植時まで氷上に保管した。６〜７週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）をペントバルビタールの腹腔内投与により麻酔し、麻酔下で左側腹部を１０〜１５ｍｍ切開し、脾臓を腹腔外に引き出し、２７Ｇのシリンジを用いて５０μＬの細胞懸濁液（１ ｘ １０６ｃｅｌｌ）を脾臓内に注入した。細胞注入４分後に脾門部を５−０ｓｉｌｋにて結紮し、脾臓を摘出した。切開した腹膜を４−０ｓｉｌｋで閉創し、Ｗｏｕｎｄ Ｃｌｉｐｓ（ＡＵＴＯＣＬＩＰ ９ｍｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて閉腹した。癌細胞移植７日後に、さらにＫ５−７０抗体および対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。癌細胞移植から４〜６週間後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させ、肝臓を摘出し、転移巣の有無を確認した。
コントロールとして用いたマウスＩｇＧを投与した群においては、ＰＫ−５９細胞を移植した６匹のマウス中、４匹において、移植後４から６週間後に肝葉辺縁部への明らかな転移巣（２〜７個）が認められた（図３１Ａ、転移発生率６７％，表６）。これに対し、Ｋ５−７０抗体投与群では、ＰＫ−５９細胞を移植した４匹のマウスにおいて、いずれの個体でもまったく肝臓への転移巣が認められず、転移発生率は０％であった（図３１Ｂ，表６）。
これらの結果から、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体Ｋ５−７０は、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９の肝転移に対して極めて強い抑制作用を有することが明らかとなった。
［ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおける塩酸イリノテカン投与後の癌再発モデルにおけるＫ５−７０抗体の抗腫瘍活性］
癌治療剤として近年、癌細胞の増殖を抑制する化学療法剤が多く開発され、一定の治療成績を上げているが、癌細胞以外の正常細胞に対する増殖抑制作用に伴う副作用と、治療中止後の癌の再発が大きな問題となっている。したがって、ＴＲＯＰ−２を標的とした癌治療用抗体投与により、化学療法剤による治療後の腫瘍再発を抑制することが可能であれば、高い臨床上の有用性が期待されるため、癌治療抗体として望ましい特性である。
大腸癌の治療剤としては、５−ＦＵ，白金製剤に加え、トポイソメラーゼ阻害効果を有する塩酸イリノテカン（トポテシン、第一三共株式会社）が近年臨床適応され、動物モデルにおいても、大腸癌をはじめとした種々のヒト腫瘍細胞を移植したマウスモデルにおける抗腫瘍効果が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９１）；２８（３）：１９２−８）。そこで、塩酸イリノテカン投与後の腫瘍再発に対する抗ｈＴＲＯＰ−２抗体クローンＫ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ）の再発予防効果について、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を８週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、移植から１１日後（Ｄａｙ１１）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３以上に達した段階で無処置群（生理食塩水投与群、Ｎ＝８，１３０．７±１６．２ｍｍ３），塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１，トポテシン、第一三共株式会社）投与群（Ｎ＝１６，１２３．０±２１．４ｍｍ３）に群分けを行い、塩酸イリノテカンを４０ｍｇ／ｋｇ体重で３日に１回、合計３回（Ｄａｙ１１，１４，１７）腹腔内投与した。塩酸イリノテカンの最終投与から３日目（Ｄａｙ２０）に、無処置群の腫瘍体積は２３２．１±２１．１ｍｍ３に達したのに対し、塩酸イリノテカン投与群は１２６．６．±２６．６ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、明らかな腫瘍抑制効果が認められた。この段階で腫瘍サイズに基づき塩酸イリノテカン投与群を２群に分け、一方はＫ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８，Ｄａｙ２０の腫瘍体積１２６．０±２８．０ｍｍ３）とし、もう一方はマウスＩｇＧ投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝８，Ｄａｙ２０の腫瘍体積１２７．２±２７．０ｍｍ３）とした。それぞれ３日に１回の抗体の腹腔内投与と腫瘍体積の測定を行い腫瘍の再発を評価した（図３２）。マウスＩｇＧ投与群では、塩酸イリノテカンの最終投与から１８日目（Ｄａｙ３５）より腫瘍体積が３００ｍｍ３を超える明らかな再発腫瘍を有する個体が複数認められ、塩酸イリノテカンの最終投与から３０日目（Ｄａｙ４７）においては、８例中５例で３００ｍｍ３を超える腫瘍が認められた（腫瘍平均体積４０１．７±１７２．７ｍｍ３）。これに対し、Ｋ５−７０抗体投与群では顕著に腫瘍再発が抑制され、腫瘍平均体積は、１８０．５±１４２．１ｍｍ３，（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３２）。特に、Ｋ５−７０抗体投与群では、Ｄａｙ４７における腫瘍体積が群分け時（１２６．０±２８．０ｍｍ３）よりも退縮し、１００ｍｍ３未満となった個体が８例中４例認められた。これらの結果から、抗ｈＴＲＯＰ−２抗体Ｋ５−７０は、塩酸イリノテカン投与後の腫瘍再発に対しても極めて強い抑制作用を有することが明らかとなった。
［ＣＬＩＰＳ技術を用いたエピトープマッピング］
＜材料と方法＞
ペプチド合成
本実験で使用した直鎖型１５−ｍｅｒ及び３０−ｍｅｒのＴＲＯＰ−２細胞外領域に由来するペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法による固相合成により取得した。また不連続エピトープ解析のため、両端にシステイン残基を付加したＴＲＯＰ−２細胞外領域に由来する１７−ｍｅｒのペプチドを合成し、ＣＬＩＰＳ技術（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりループ構造を一つまたは二つ有する立体構造を再構築した。付加したシステイン残基近傍に別のシステイン残基が存在する場合、アラニンに置換した。
エピトープスクリーニングＥＬＩＳＡ
５０３４種類の合成したペプチドをＰＥＰＳＣＡＮカード（４５５ペプチド／カード）へ共有結合させ、ＥＬＩＳＡ法により合成ペプチドと抗体の結合を検証した。ＰＥＰＳＣＡＮカードはブロッキングバッファー（４％ウマ血清、５％卵白アルブミン、１％Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝液）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｋ５−１１６−２−１、Ｔ５−８６、Ｔ６−１６）と反応させた。洗浄後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ−二次抗体複合体と２５℃、１時間反応させた。洗浄後、基質溶液（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＡＢＴＳ）と２μＬの３％過酸化水素水を含む溶液）を加え、１時間発色反応を行った。抗体結合活性はＣＣＤカメラで撮影し、画像解析を行い定量した。
＜結果＞
薬効を示した抗ｈＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｋ５−１１６−２−１、Ｔ５−８６、Ｔ６−１６についてＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術を利用しエピトープ解析を行った。なお、以下、本実施例において「アミノ酸番号」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ｈＴＲＯＰ−２タンパク質（３２３アミノ酸残基））中のアミノ酸番号を意味する。
Ｋ５−７０抗体についての解析結果を下記表７に示す。その結果、３３ペプチドがＫ５−７０抗体と強い結合を示すことが明らかとなった。これら３３ペプチドの中で、ＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡＬＧＳＧＭＡＶＤ（アミノ酸番号４３−６５）を含む配列（表７中に記載のペプチドＮｏ．１−７，９）、ＨＨＩＬＩＤＬＲＨＲＰＴＡＧ（アミノ酸番号１５２−１６５）を含む配列（表７中に記載のペプチドＮｏ．１４，２２−２４，２８）、ＶＨＹＥＱＰＴＩＱＩＥＬＲＱ（アミノ酸番号１９３−２０６）を含む配列（表７中に記載のペプチドＮｏ．８，１０，１２，１３，１８，２０，２１，２３，２６，２８，３０，３２）、ＤＬＤＡＥＬＲＲＬＦＲＥＲ（アミノ酸番号１７１−１８３）を含む配列（表７中に記載のペプチドＮｏ．１１，１６，１８，１９，２１，２２，２９，３１）は、繰り返し出現した。Ｋ５−７０抗体は、特にＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡＬＧＳＧＭＡＶＤを含む配列に強く結合した。これらの結果から、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質中、上記４種類のペプチド配列領域がＫ５−７０抗体のエピトープである可能性が示唆された。
Ｋ５−１０７についての解析結果を下記表８に示す。その結果、ＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡＬＧＳＧＭＡＶＤ（アミノ酸番号４３−６５）を含む配列が２０ペプチド中１０ペプチド（表８中に記載のペプチドＮｏ．１−６，８，９，１４，１７）に含まれていた（表８）。
従って、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質中、上記ＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡＬＧＳＧＭＡＶＤのペプチド配列領域がＫ５−１０７抗体のエピトープであることが示唆された。
Ｋ５−１１６−２−１抗体についての解析結果を下記表９に示す。当該解析では、ＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡＬＧＳＧＭＡＶＤ（アミノ酸番号４３−６５）を含む配列（表９中に記載ののペプチドＮｏ．１−７，１５，２５）、ＨＨＩＬＩＤＬＲＨＲＰＴＡＧ（アミノ酸番号１５２−１６５）を含む配列（表９中のペプチドＮｏ．８−１１，１６，１７，１９，２０，２２−２４，２７−２９）、ＤＬＤＡＥＬＲＲＬＦＲＥＲ（アミノ酸番号１７１−１８３）を含む配列（表９中に記載のペプチドＮｏ．１１−１４，１７，１９，２１，２３，２９）の３種類のペプチド配列が複数回出現した（表９）。従って、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質中、これら３種類のペプチド配列領域がＫ５−１１６−２−１抗体のエピトープであることが示唆された。
Ｔ５−８６及びＴ６−１６抗体についての解析結果を下記表１０及び表１１に示す。当該解析では、ＤＰＥＧＲＦＫＡＲＱＣＮ（アミノ酸番号１０９−１２０）の配列を含むペプチドと強く結合した。Ｔ５−８６抗体に対しては結合する２６ペプチド中２２ペプチド（表１０中に記載のペプチドＮｏ．１−４，６−８，１０−１３，１５−１９，２１−２６）に、Ｔ６−１６抗体に対しては結合する２６ペプチド中４ペプチド（表１１中に記載のペプチドＮｏ．１，２，９，１３）に、上記ペプチド配列が含まれていた（表１０及び表１１）。またＴ５−８６抗体についての解析では、ＤＰＥＧＲＦＫＡＲＱＣＮ（アミノ酸番号１０９−１２０）を含む配列以外にもＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡ（アミノ酸番号４３−５７）を含む配列（表１０中に記載ののペプチドＮｏ．５，１４，２０）が複数回出現した。さらに、Ｔ６−１６抗体についての解析でも、他の配列としてＨＨＩＬＩＤＬＲＨＲＰＴＡＧ（アミノ酸番号１５２−１６５）を含む配列（表１１中に記載のペプチドＮｏ．４−８，１０−１２，１９，２１，２３，２５，２６）が複数回確認された。従って、Ｔ５−８６抗体のエピトープとしては、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質中、ＤＰＥＧＲＦＫＡＲＱＣＮ（アミノ酸番号１０９−１２０）、ＶＣＳＰＤＧＰＧＧＲＣＱＣＲＡ（アミノ酸番号４３−５７）の２種類のペプチド配列領域が示唆され、Ｔ６−１６抗体のエピトープとしては、ｈＴＲＯＰ−２タンパク質中、ＤＰＥＧＲＦＫＡＲＱＣＮ（アミノ酸番号１０９−１２０）、ＨＨＩＬＩＤＬＲＨＲＰＴＡＧ（アミノ酸番号１５２−１６５）の２種類のペプチド配列領域が示唆された。
［マウス抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（クローンＫ５−７０，Ｋ５−１０７，Ｋ５−１１６−２−１およびＴ６−１６）の抗体遺伝子の可変領域の配列決定］
３×１０６個のマウス抗ＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。クローンＫ５−７０，クローンＫ５−１０７およびクローンＫ５−１１６−２−１については、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、キット添付の方法に従い、マウスＩｇＧのＨ鎖特異的プライマー（５’−ＴＣＣＡＫＡＧＴＴＣＣＡ−３’（配列番号２４））と、Ｌ鎖特異的プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２５））を用いてｃＤＮＡを合成した。クローンＴ６−１６については，ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、キット添付の方法に従い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。クローンＫ５−７０（マウスＩｇＧ２ａ），クローンＫ５−１０７（マウスＩｇＧ１）、およびクローンＫ５−１１６−２−１（マウスＩｇＧ２ａ）のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶＨ，ＶＬ）をコードする遺伝子は、上記合成後のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。この際、５’−プライマーはＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔに添付されている１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ（ＵＰＭ）を使用した。一方、３’−プライマーは、ＶＨ増幅用３’−プライマーとしてはマウスＩｇＧ Ｈ鎖に特異的な配列を有するものを使用し、ＶＬ増幅用３’−プライマーとしてはマウスＩｇＧ Ｌ鎖に特異的なな配列を有するものを使用した。
５’−プライマー（１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ（ＵＰＭ））：
Ｌｏｎｇ（０．４μＭ）
Ｓｈｏｒｔ（２μＭ）
３’−プライマー（Ｒプライマー）：
上記各プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。またＶＨのｃＤＮＡ増幅のＲプライマーは上記の２配列を等モル数ずつ混合して使用した。
＜反応液組成＞
＜反応条件＞
９４℃（１０ｓｅｃ）反応させた後、「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（５ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３０サイクル反応させた後、最後に７２℃（３ｍｉｎ）反応させた。
合成したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、ｐＭＤ２０−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）にサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のＶＨクローン及びＶＬクローンの塩基配列を解読し、マウスＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図３３及び図３４に、Ｋ５−７０のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。図３５及び図３６に、Ｋ５−１０７のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。図３７及び図３８に、Ｋ５−１１６−２−１のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。
クローンＴ６−１６のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶＨ，ＶＬ）をコードする遺伝子は、上記合成後のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。この際、この際、５’−プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔに添付されているものを使用した。一方、３’−プライマーは、ＶＨ増幅用３’−プライマーとしてはマウスＩｇＧ Ｈ鎖に特異的な配列を有するものを使用し、ＶＬ増幅用３’−プライマーとしてはマウスＩｇＧ Ｌ鎖に特異的な配列を有するものを使用した。
５’−プライマー（Ｆプライマー）：
３’−プライマー（Ｒプライマー）：
上記各プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
＜反応液組成＞
＜反応条件＞
「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５７℃（１０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル。
合成したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のＶＨクローン及びＶＬクローンの塩基配列を解読し、マウスＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図３９及び図４０に、Ｔ６−１６のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。
［ヒト型化Ｋ５−７０抗体のデザイン］
先の実施例で作製したＫ５−７０抗体について、その可変領域（ＶＨ，ＶＬ）のヒト型化を、Ｑｕｅｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３，１９８９）に従って以下のように行った。まず、Ｋ５−７０抗体可変領域の立体構造の分子モデリングをコンピュータで行い、次いで、ヒト抗体遺伝子の可変領域配列とのホモロジー検索によって、Ｋ５−７０ ＶＨのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）領域を提供するアクセプターとしてＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＤＡ９８０１０２のｃＤＮＡ配列（ＤＡ９８０１９２ ＶＨ）を選択した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１６：５５−６５，２００６）。同様に、Ｋ５−７０ ＶＬのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）領域を提供するアクセプターとしてＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＬ４１１７４のｃＤＮＡ配列（Ｌ４１１７４ ＶＬ）を選択した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２４５７−１２４６５，１９９５）。
Ｋ５−７０ ＶＨのヒト型化では、Ｋ５−７０ ＶＨのＣＤＲ配列をアクセプターであるＤＡ９８０１０２ ＶＨの対応する位置に置き換えて挿入した。コンピュータモデリングによる立体構造解析により、Ｋ５−７０ ＶＨのＣＤＲに隣接し、その構造維持に重要な役割を果たしていると考えられるアミノ酸残基（４８番目のイソロイシン（Ｉ）、６６番目のリジン（Ｋ）、６７番目のアラニン（Ａ）、７１番目のバリン（Ｖ）、９３番目のスレオニン（Ｔ））についてはＫ５−７０ ＶＨのものを保持し、それ以外のＦＲ領域をアクセプター配列に置き換えた。ＶＨおよびＶＬ内のアミノ酸残基位置番号はＫａｂａｔらの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）に準拠した。
また、アクセプター配列ＤＡ９８０１０２ ＶＨの８２番目のアミノ酸残基であるメチオニン（Ｍ）は、ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎによる特殊なアミノ酸残基である可能性が高いと考えられる。そこで潜在的抗原性を小さくするために、８２番目のアミノ酸残基として最も一般的なロイシン（Ｌ）に置き換えた。上述の通りデザインしたヒト型化Ｋ５−７０ ＶＨ（ＨｕＫ５−７０ ＶＨ）、Ｋ５−７０ ＶＨおよびＤＡ９８０１０２ ＶＨのアミノ酸配列アライメントを図４１に示した。
ヒト型化Ｋ５−７０ ＶＬのデザインついても同様にＣＤＲ配列の移植を行い、ＣＤＲの構造維持に重要なアミノ酸残基（４９番目のリジン（Ｋ））はＫ５−７０ ＶＬのものを保持し、それ以外のＦＲ領域をアクセプター配列に置き換えた（ＨｕＫ５−７０ ＶＬ）。ＨｕＫ５−７０ ＶＬ、Ｋ５−７０ ＶＬおよびＬ４１１７４ ＶＬのアミノ酸配列アライメントを図４２に示した。
［ヒト型化Ｔ６−１６抗体のデザイン］
先の実施例で作製したＴ６−１６抗体について、その可変領域（ＶＨ，ＶＬ）のヒト型化を、Ｑｕｅｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３，１９８９）に従って以下のように行った。まず、Ｔ６−１６抗体可変領域の立体構造の分子モデリングをコンピュータで行い、次いで、ヒト抗体遺伝子の可変領域配列とのホモロジー検索によって、Ｔ６−１６ ＶＨのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）領域を提供するアクセプターとしてＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＤＡ９３５２３８のｃＤＮＡ配列（ＤＡ９３５２３８ ＶＨ）を選択した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１６：５５−６５，２００６）。同様に、Ｔ６−１６ ＶＬのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）領域を提供するアクセプターとしてＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＭ９９６０８のｃＤＮＡ配列（Ｍ９９６０８ ＶＬ）を選択した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２５１８−２５２９，１９９２）。
Ｔ６−１６ ＶＨのヒト型化では、Ｔ６−１６ ＶＨのＣＤＲ配列をアクセプターであるＤＡ９３５２３８ ＶＨの対応する位置に置き換えて挿入した。コンピュータモデリングによる立体構造解析により、Ｔ６−１６ ＶＨのＣＤＲに隣接し、その構造維持に重要な役割を果たしていると考えられるアミノ酸残基（４８番目のイソロイシン（Ｉ）、６７番目のアラニン（Ａ）、７３番目のリジン（Ｋ））についてはＴ６−１６ ＶＨのものを保持し、それ以外のＦＲ領域をアクセプター配列に置き換えた（ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１）。また７３番目のリジン残基（Ｋ）については、抗原結合部位の適切な形成に対する影響が少ない可能性があり、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１のリジン残基をより寛容なアミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）に置き換えたアミノ酸配列を別途デザインした（ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２）。デザインしたヒト型化Ｔ６−１６ ＶＨ（ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１およびＨｕＴ６−１６ ＶＨ２）、Ｔ６−１６ ＶＨおよびＤＡ９８０１０２ ＶＨのアミノ酸配列アライメントを図４３に示した。
ヒト型化Ｔ６−１６ ＶＬのデザインについても、同様にＣＤＲ配列の移植を行った。ＣＤＲの構造維持に重要なアミノ酸残基はアクセプター配列でも保持されており、ＦＲ配列はアクセプター配列と同じ配列を用いた（ＨｕＴ６−１６ ＶＬ）。ＨｕＴ６−１６ＶＬ、Ｔ６−１６ ＶＬおよびＬ４１１７４ ＶＬのアミノ酸配列アライメントを図４４に示した。
［ヒト型化Ｋ５−７０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子合成］
ＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびＨｕＫ５−７０ ＶＬをコードする遺伝子は以下のように作製した。上述のようにデザインしたＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびＶＬのＮ末端側に、それぞれＫ５−７０ ＶＨ、ＶＬ由来のシグナルペプチド配列を付加したアミノ酸配列をもとに遺伝子合成を行った（Ｏｐｅｒｏｎ社）。その際、それぞれ合成したＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびＨｕＫ５−７０ ＶＬの遺伝子配列の５’末端側にＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）を付加し、またＨｕＫ５−７０ ＶＨの５’末端には、制限酵素部位としてＥｃｏＲＩの部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）を付加し、３’末端にはＮｈｅＩ（ＧＣＴ ＡＧＣ）の部位を付加した。同様に、ＨｕＫ５−７０ ＶＬの５’末端には、制限酵素部位としてＡｇｅ Ｉの部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）を付加し、３’末端にはＢｓｉＷＩの部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加した。合成したＨｕＫ５−７０ ＶＨ遺伝子、およびＨｕＫ５−７０ ＶＬ遺伝子は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＡクローニングにより組み込んだ。遺伝子合成により作製したＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびＶＬの遺伝子配列をそれぞれ図４５及び４６に示した。
［ヒト型化Ｔ６−１６ ＶＨ１、Ｔ６−１６ ＶＨ２およびＴ６−１６ ＶＬ遺伝子合成］
ＨｕＴ６−１６ ＶＨ１、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２およびＨｕＴ６−１６ ＶＬをコードする遺伝子は以下のように作製した。デザインしたＨｕＴ６−１６ ＶＨ１、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２のＮ末端側にＴ６−１６ ＶＨ由来のシグナルペプチド配列を、ＨｕＴ６−１６ ＶＬのＮ末端側にＴ６−１６ ＶＬ由来のシグナルペプチド配列をそれぞれ付加したアミノ酸配列をもとに遺伝子合成を行った（Ｏｐｅｒｏｎ社）。その際、それぞれ合成したＨｕＴ６−１６ ＶＨ１、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２およびＨｕＴ６−１６ ＶＬの遺伝子配列の５’末端側にＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）を付加し、またＨｕＴ６−１６ ＶＨ１およびＨｕＴ６−１６ ＶＨ２の５’末端には、制限酵素部位としてＥｃｏＲＩの部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）を付加し、３’末端にはＮｈｅＩの部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。同様に、ヒト型化Ｔ６−１６ ＶＬの５’末端には、制限酵素部位としてＡｇｅ Ｉの部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）を付加し、３’末端にはＢｓｉＷＩの部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加した。合成したＨｕＴ６−１６ ＶＨ１遺伝子およびＨｕＴ６−１６ ＶＨ２遺伝子ならびにＨｕＴ６−１６ ＶＬ遺伝子は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＡクローニングにより組み込んだ。
遺伝子合成により作製したＨｕＴ６−１６ ＶＨ１、ＨｕＴ６−１６ ＶＨ２およびＨｕＴ６−１６ ＶＬの遺伝子配列をそれぞれ図４７〜４９に示した。
［ヒト型化Ｋ５−７０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子発現ベクター構築］
ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込まれたＨｕＫ５−７０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ Ｉ、Ａｇｅ Ｉ及びＢｓｉＷＩによって消化し、遺伝子断片の回収を行った。次に、切り出したＨｕＫ５−７０ ＶＨ遺伝子はヒトＩｇＧ１フォームの発現用の動物細胞発現ベクターである、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＥｃｏＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ部位に挿入し（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０）、ＨｕＫ５−７０ ＶＬ遺伝子はヒトＩｇ κフォーム発現用ベクターであるｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＡｇｅ Ｉ／ＢｓｉＷＩ部位に挿入して（ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０）、それぞれ、コンストラクトを完成させた。
［ヒト型化Ｔ６−１６ ＶＨ１、Ｔ６−１６ ＶＨ２およびＴ６−１６ ＶＬ遺伝子発現ベクター構築］
ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込まれたＴ６−１６ ＶＨ１、Ｔ６−１６ ＶＨ２遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅ Ｉで消化し、Ｔ６−１６ ＶＬ遺伝子はＡｇｅ Ｉ及びＢｓｉＷＩで消化し、遺伝子断片の回収を行った。次に、切り出したＴ６−１６ ＶＨ１遺伝子はｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＥｃｏＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ部位に挿入し（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−１）、Ｔ６−１６ ＶＨ２遺伝子も同様にｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＥｃｏＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ部位に挿入し（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−２）、Ｔ６−１６ ＶＬ遺伝子はｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＡｇｅＩ／ＢｓｉＷＩ部位にに挿入して（ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６）、それぞれ、コンストラクトを完成させた。
［ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体を安定的に発現する２９３Ｆ細胞株の樹立］
２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持、培養した。２９３Ｆ細胞への遺伝子導入は２９３ ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコルに従い行った。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０を共に２９３Ｆ細胞へ導入し、Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）およびＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）による薬剤選択を行うことでＨｕＫ５−７０抗体を安定的に発現する細胞株を樹立した。同様に、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−１およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６を共に２９３Ｆ細胞へ導入し、上記の薬剤選択を行うことでＨｕＴ６−１６−１抗体を安定的に発現する細胞株を樹立した。また同様に、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−２およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６を共に２９３Ｆ細胞へ導入し、上記の薬剤選択を行うことでＨｕＴ６−１６−２抗体を安定的に発現する細胞株を樹立した。
［ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体タンパク質の精製］
樹立した各抗体発現細胞株は１〜２．５ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に接種し、６〜８日間ローラーボトル培養を行った。培養上清を回収した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定法に従い各ヒト型化抗体の精製を行った。
図５０に、ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体を発現させた２９３Ｆ細胞の培養上清中の、各ヒト型化抗体タンパク質の発現をウエスタンブロットで確認した図を示した。具体的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＩＰＶＨ０００１０）に転写した。メンブレンは５％スキムミルクを含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を用いて室温、３０分間ブロッキングを行った。０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）で５分間、３回洗浄した後、１次抗体との反応を行った。
レーン１は遺伝子導入を行っていない２９３Ｆ細胞の培養上清（ネガティブコントロール）、レーン２はｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０を導入した２９３Ｆ細胞の培養上清を示す。ＨｕＫ５−７０抗体の重鎖および軽鎖タンパク質の検出はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いた。レーン３は２９３Ｆ細胞にｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−１およびｐＦＵｓＥ２−ｃＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６を導入した２９３Ｆ細胞の上清、レーン４はｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＴ６−１６−２およびｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＴ６−１６を導入した２９３Ｆ細胞の上清を示し、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の重鎖タンパク質はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体の軽鎖タンパク質はビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）でそれぞれ検出した。
その結果、ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体のいずれにおいても、重鎖および軽鎖タンパク質の培養上清中での発現が確認された。
また、図５１に、精製したＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、ＣＢＢ染色した図を示した。還元条件下で、いずれも約５０ｋＤの重鎖と約２５ｋＤの軽鎖が検出され、上述したウエスタンブロットで検出された各重鎖および軽鎖と同じ位置にバンドが確認された。以上の結果から、ＨｕＫ５−７０抗体タンパク質、ＨｕＴ６−１６−１抗体タンパク質及びＨｕＴ６−１６−２抗体タンパク質の産生が確認された。
［ヒト型化Ｋ５−７０抗体（ＨｕＫ５−７０）及びヒト型化Ｔ６−１６抗体（ＨｕＴ６−１６−１，ＨｕＴ６−１６−２）の抗原親和性］
精製したＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体及びＨｕＴ６−１６−２抗体の抗原親和性をＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡを用いた方法で検討した。
ＦＡＣＳは、実施例５に記載したＨＥＫ２９３細胞にヒト全長ＴＲＯＰ−２遺伝子を安定的に発現させたＨＥＫ２９３−ｈＴＲＯＰ−２細胞と内在的にヒトＴＲＯＰ−２タンパク質を細胞表面に発現している膵臓癌細胞株ＰＫ−５９を用いて行った。トリプシン処理によって培養皿から剥がした細胞（ＨＥＫ２９３−ｈＴＲＯＰ−２細胞、又はＰＫ−５９細胞）の懸濁液（５ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ）に対し、１次抗体として１０％ ＦＣＳを含む培地で１μｇ／ｍｌに希釈した抗体溶液１００μｌ加え、４℃で２０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。その後、１ｍｌの１０％ ＦＣＳを含む培地で洗浄し、フィコエリスリン（ＰＥ）標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびビオチン標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）をそれぞれ２００倍、２０００倍希釈した２次抗体溶液１００μｌを加えた。４℃で２０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、再び１ｍｌの１０％ ＦＣＳを含む培地で洗浄した。２次抗体としてビオチン標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いた場合は、蛍光標識試薬としてストレプトアビジン標識ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を４００倍希釈した標識溶液を１００μｌ加え、４℃で２０分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、１ｍｌの１０％ＦＣＳを含む培地で洗浄した。その後、標識細胞を含むサンプルは１ｍｌの１％ ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ入りのＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。その結果、ＨＥＫ２９３−ｈＴＲＯＰ−２細胞においても、ＰＫ−５９細胞においても、ＨｕＫ５−７０抗体は、マウスＫ５−７０抗体と同等の反応性を示した。同様にＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体はＴ６−１６抗体と同等の反応性を示した（図５２）。
更にＥＬＩＳＡ法により抗原親和性について検証した。ＥＬＩＳＡは、実施例３で示したｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを使用して行った。具体的には、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）をＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈したｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質を５０μｌ／ｗｅｌｌでコーティングした（４℃、一晩）。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキングバッファー（２％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌで添加しブロッキングを行った（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、ＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体、ＨｕＴ６−１６−２抗体、Ｋ５−７０抗体およびＴ６−１６抗体をＥＬＩＳＡバッファー（１％スキムミルク、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３．０５ ｘ １０−４〜５μｇ／ｍｌの範囲で２倍希釈系列サンプルを調製し、各５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、２時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、検出用抗体としてＥＬＩＳＡバッファーで２０００倍希釈したＨＲＰ標識ｇｏａｔ抗ヒトκ鎖抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）もしくは２０００倍希釈したＨＲＰ標識ｓｈｅｅｐ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＳＩＧＭＡ）を基質溶液として５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、発色反応を行った。１Ｍ硫酸を２５μｌ／ｗｅｌｌで加え反応を停止させた後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、６５５ｎｍの吸光度をリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、Ｋ５−７０およびＨｕＫ５−７０の反応曲線はほぼ重なり、ＥＣ５０はぞれぞれ２７ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌであった（図５３）。同様に、Ｔ６−１６、ＨｕＴ６−１６−１及びＨｕＴ６−１６−２の反応曲線もほぼ重なり、ＥＣ５０はそれぞれ３０ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌであった（図５４）。これらの結果からＨｕＫ５−７０抗体、ＨｕＴ６−１６−１抗体およびＨｕＴ６−１６−２抗体は、それぞれ、ヒト型化する前の親抗体であるＫ５−７０又はＴ６−１６抗体と同等の抗原親和性を示すことが明らかとなった。
［ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０）のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性］
次に、ＨｕＫ５−７０抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にヒトＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階で群分けを行い（Ｄａｙ９），Ｄａｙ９から３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を開始した。癌細胞移植から３９日目（Ｄａｙ３９）におけるコントロール群（ＰＢＳ投与，Ｎ＝８）の腫瘍体積が８２４．３±１８８．８ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＫ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、４５５．５±２０８．６ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり有意に腫瘍形成が阻害された（阻害率４４．７％）（図５５Ａ）。腫瘍重量においては、コントロール群が０．５０９±０．１６１ｇであったのに対して、ＨｕＫ５−７０抗体投与群では０．２７２±０．１６２ｇ（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり４６．６％の阻害率であった（図５５Ｂ）。
［ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０及びＨｕＴ６−１６−２）のヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性］
ＨｕＫ５−７０及びＨｕＴ６−１６−２抗体の用量依存的な抗腫瘍活性を、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＷ４８０細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、癌細胞移植から９日目（Ｄａｙ９）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した段階でコントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，１０１．６５±８．３５ｍｍ３），１ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０３．１８±９．８６ｍｍ３），５ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０１．３４±８．９４ｍｍ３），１０ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＫ５−７０抗体投与群（Ｎ＝８，１０１．５３±８．９８ｍｍ３），１ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＴ６−１６−２抗体）投与群（Ｎ＝８，１０３．１８±９．８６ｍｍ３），５ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＴ６−１６−２抗体投与群（Ｎ＝８，１０１．３４±８．９４ｍｍ３），１０ｍｇ／ｋｇ体重のＨｕＴ６−１６−２抗体投与群（Ｎ＝８，１０１．５３±８．９８ｍｍ３）に群分を行い、Ｄａｙ９より３日に１回の間隔で抗体の腹腔内投与を行った。癌細胞移植から４８日目（Ｄａｙ４８）におけるコントロール群の腫瘍体積が７５４．６７±２７６．０５ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＫ５−７０抗体投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、５２１．８１±１８３．４５ｍｍ３（阻害率３０．９％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、２５８．７８±１３７．０２ｍｍ３（阻害率６５．７％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３１４．６０±１５２．８９ｍｍ３（阻害率５８．３％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図５６Ａ）。ＨｕＴ６−１６−２抗体投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、６００．４１±３１９．８４ｍｍ３（阻害率２０．４％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３１５．３２±１８９．０２ｍｍ３（阻害率５８．２％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、２７０．７９±２６６．７１ｍｍ３（阻害率６４．１％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図５７Ａ）。Ｄａｙ４８における腫瘍重量については、コントロール群が０．４２２±０．２０１ｇであったのに対して、ＨｕＫ５−７０抗体投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群で，０．３０１±０．１６０ｇ（阻害率２８．７％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群で、０．１１５±０．０８３ｇ（阻害率７２．７％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群で、０．２４４±０．１８１ｇ（阻害率４２．２％）となった（図５６Ｂ）。ＨｕＴ６−１６−２抗体投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群で，０．４２２±０．２５５ｇ（阻害率０％），５ｍｇ／ｋｇ体重投与群で、０．２４７±０．１５１ｇ（阻害率４１．５％），１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群で、０．１９０±０．１９０ｇ（阻害率５３．１％，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）となった（図５７Ｂ）。これらの結果から、ＨｕＫ５−７０及びＨｕＴ６−１６−２抗体の用量依存的な抗腫瘍活性が確認された。
［抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体Ｋ５−７０及びＴ６−１６のヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗腫瘍活性］
親抗体であるＫ５−７０及びＴ６−１６抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＫ−ＯＶ−３細胞を７週齢雌のヌードマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、癌細胞移植から１１日目（Ｄａｙ１１）に、明らかな腫瘍形成が確認された個体（平均の腫瘍体積約５０ｍｍ３）について群分けを行い，Ｄａｙ１１から週に２回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。癌細胞移植から５６日目（Ｄａｙ５６）におけるコントロール群（ＰＢＳ投与，Ｎ＝８）の腫瘍体積が６５２．６±３４９．１ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、２５３．７±１３７．３ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害され（阻害率６１．１％）、Ｔ６−１６抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、２１４．６±９８．６ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害された（阻害率６７．１％）（図５８Ａ）。腫瘍重量においては、コントロール群が０．４１３±０．２１８ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では０．１９４±０．１１２（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と５３．０％の阻害率、Ｔ６−１６抗体投与群では０．１８３±０．０９３（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と５５．７％の阻害率であった（図５８Ｂ）。
［抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体Ｋ５−７０及びＴ６−１６のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗腫瘍活性］
同様に、Ｋ５−７０ならびにＴ６−１６抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を７週齢雌のヌードマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、癌細胞移植から１２日目（Ｄａｙ１２）に、明らかな腫瘍形成が確認された個体（平均の腫瘍体積約５０ｍｍ３）について群分けを行い，Ｄａｙ１２から週に２回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。癌細胞移植から５４日目（Ｄａｙ５４）におけるコントロール群（ＰＢＳ投与，Ｎ＝８）の腫瘍体積が２１８．６±７５．５ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、７０．２±３７．４ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害され（阻害率６７．９％）、Ｔ６−１６抗体投与群投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、８８．３±４２．９ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害された（阻害率５９．６％）（図５９Ａ）。Ｄａｙ５４における腫瘍重量においては、コントロール群が０．１４２±０．０４９ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では０．０５０±０．０３３（ｇ）（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と６４．８％の阻害率、Ｔ６−１６抗体投与群では０．０７７±０．０４６（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と４５．８％の阻害率であった（図５９Ｂ）。
［抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体Ｋ５−７０及びＴ６−１６のヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗腫瘍活性］
同様に、Ｋ５−７０抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト肺癌細胞株Ｃａｌｕ−３を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＣａｌｕ−３細胞を７週齢雌のヌードマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、癌細胞移植から９日目（Ｄａｙ９）に、明らかな腫瘍形成が確認された個体（平均の腫瘍体積約１００ｍｍ３）について群分けを行い，Ｄａｙ９から週に２回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。癌細胞移植から４１日目（Ｄａｙ４１）におけるコントロール群（ＰＢＳ投与，Ｎ＝８）の腫瘍体積が３９５．７±２２１．２ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、１２０．７±１２５．６ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害され（阻害率６９．５％）、Ｔ６−１６抗体投与群投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝８）では、１４６．３±１２８．４ｍｍ３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害された（阻害率６３．０％）（図６０Ａ）。腫瘍重量においては、コントロール群が０．３０１±０．１８９ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では０．０８±０．０８５（ｇ）（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と７３．５％の阻害率、Ｔ６−１６抗体投与群では０．１０６±０．０９６（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と６４．９％の阻害率であった（図６０Ｂ）。
［抗ｈＴＲＯＰ−２マウスモノクローナル抗体Ｋ５−７０のヒト胆管癌細胞株ＴＦＫ−１細胞ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルにおける抗腫瘍活性］
同様に、Ｋ５−７０抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト胆管癌細胞株ＴＦＫ−１を用いたｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｔモデルで検討した。５×１０６ｃｅｌｌｓのＴＦＫ−１細胞を７週齢雌のヌードマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ１）し、同日より、週に２回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を開始した。癌細胞移植から３１日目（Ｄａｙ３１）におけるコントロール群（ＰＢＳ投与，Ｎ＝５）の腫瘍体積が１０００．４±２６８．９ｍｍ３であったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群（１０ｍｇ／ｋｇ体重，Ｎ＝５）では、１９７．２±２１５．５ｍｍ３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と有意に腫瘍形成が阻害された（阻害率８０．３％）（図６１Ａ）。腫瘍重量においては、コントロール群が０．４４３±０．０７０ｇであったのに対して、Ｋ５−７０抗体投与群では０．０６３±０．０５２（ｇ）（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）と８５．８％の阻害率であった（図６１Ｂ）。
［ＨｕＫ５−７０およびＨｕＴ６−１６−２抗体のａｖｉｄｉｔｙ解析］
ＨｕＫ５−７０およびＨｕＴ６−１６−２抗体の抗原結合活性について、低密度の抗原を固相化した９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いたＥＬＩＳＡ法（低密度抗原固相化ＥＬＩＳＡ）により検討した。９６穴プレートに０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．３）で０．１μｇ／ｍＬに調製したリコンビナントｈＴＡＣＳＴＤ２−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした後、実施例４０と同様の解析をおこなった。被験抗体はＥＬＩＳＡバッファー（１％スキムミルク、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２０μｇ／ｍＬから２倍希釈系列（１５点）を作製し使用した。その結果、ＨｕＴ６−１６−２抗体はＴ６−１６抗体とほぼ同等の結合活性であるのに対し（ＥＣ５０値はそれぞれ４９ｎｇ／ｍＬと４１ｎｇ／ｍＬ）、ＨｕＫ５−７０抗体のＥＣ５０値はＫ５−７０抗体の約２０倍となった（それぞれ２２２ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、図６２）。
次にＨｕＫ５−７０およびＫ５−７０抗体の抗原結合活性について、、一価の抗原―抗体反応を解析するＥＬＩＳＡにより検討した。９６穴プレートに０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．３）で１μｇ／ｍＬに希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および３μｇ／ｍＬに希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（γ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキングバッファー（２％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで添加しブロッキングを行った（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファー（１％スキムミルク、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１μｇ／ｍＬ希釈した試験抗体を５０μＬ／ウェルで添加した。この際、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）をコートしたウェルにはＨｕＫ５−７０抗体を添加し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（γ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）をコートしたウェルにはＫ５−７０抗体を添加した。室温で１時間静置した後、洗浄バッファーで洗浄し、実施例３で示したｈＴＲＯＰ−２細胞外領域のリコンビナントタンパク質（ｈＴＲＯＰ−２ ＥＣ）をＥＬＩＳＡバッファーで５μｇ／ｍＬから３倍希釈系列（１０点）を作製し、各５０μＬ／ウェルで添加した。室温で１時間静置した後、洗浄バッファーで洗浄し、１次抗体としてＥＬＩＳＡバッファーで２μｇ／ｍＬに希釈したａｎｔｉ−Ｈｉｓ（Ｇ−１８）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を５０μＬ／ウェルで添加した。室温で１時間静置した後、洗浄バッファーで洗浄し、２次抗体としてＥＬＩＳＡバッファーで１０００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０μＬ／ウェルで添加した。室温で１時間静置した後、洗浄バッファーで洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＳＩＧＭＡ）を基質溶液として５０μＬ／ウェルで添加し、発色反応を行った。１Ｍ硫酸を２５μＬ／ウェルで加え反応を停止させた後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて、６５５ｎｍの吸光度をリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｈＴＲＯＰ−２ＥＣタンパク質のＫ５−７０およびＨｕＫ５−７０抗体との結合カーブから算出されるＥＣ５０はそれぞれ７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬとなった（図６３）。このことから一価の抗原―抗体反応においてはＨｕＫ５−７０抗体とＫ５−７０抗体は同等の抗原親和性（アフィニティー）であることが示された。
実施例４０で示したとおり、高密度の抗原（０．５μｇ／ｍＬ）を固相化した９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いたＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ）ではＫ５−７０抗体とＨｕＫ５−７０抗体の抗原親和性が同等であったことから（図５３）、低密度の抗原（０．１μｇ／ｍＬ）を固相化したＥＬＩＳＡ法でＨｕＫ５−７０抗体の抗原結合活性がＫ５−７０抗体と比べて相対的に低い原因として、ＨｕＫ７−５０抗体では２つの抗原結合アームの運動能に関するフレキシビィリティー、いわゆる“アビディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ）”が、Ｋ５−７０抗体と比べて相対的に低いことが考えられた。
［ヒト型化Ｋ５−７０抗体の変異体の作製とキャラクラリゼーション］
ＨｕＫ５−７０抗体の“アビディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ）”を向上させることを目的として、以下の実験を行った。
前述のとおりＨｕＫ５−７０抗体の“アビディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ）”が相対的に低いことが、ＶＨとＶＬのどちらに起因するのかを以下の実験で検討した。まず、親抗体であるＫ５−７０抗体のＨ鎖可変領域（Ｋ５−７０ ＶＨ），およびＬ鎖可変領域（Ｋ５−７０ ＶＬ）をコードする遺伝子を遺伝子合成により作製した（Ｏｐｅｒｏｎ社）。その際、Ｋ５−７０ ＶＨおよびＫ５−７０ ＶＬの遺伝子配列の５’末端側にＫｏｚａｋ配列（ＡＣＣ ＡＣＣ）を付加した。さらにＫ５−７０ ＶＨの５’末端には制限酵素部位としてＥｃｏＲＩの部位（ＧＡＡ ＴＴＣ）を、３’末端にはＮｈｅＩの部位（ＧＣＴ ＡＧＣ）を付加した。同様に、Ｋ５−７０ ＶＬの５’末端には制限酵素部位としてＡｇｅ Ｉの部位（ＡＣＣ ＧＧＴ）を、３’末端にはＢｓｉＷＩの部位（ＣＧＴ ＡＣＧ）を付加した。合成したＫ５−７０ ＶＨ遺伝子、およびＫ５−７０ ＶＬ遺伝子は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだ。遺伝子合成により作製したＫ５−７０ ＶＨおよびＶＬの遺伝子配列をそれぞれ図６４と図６５に示した。ｐＣＲ２．１ベクターに組み込まれたＫ５−７０ ＶＨおよびＫ５−７０ ＶＬ遺伝子は、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅ Ｉ、Ａｇｅ ＩおよびＢｓｉＷＩによって消化し、遺伝子断片の回収を行った。次に、切り出したＫ５−７０ ＶＨ遺伝子は、ヒトＩｇＧ１フォーム発現用ベクターである、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＥｃｏＲＩ／Ｎｈｅ Ｉ部位に、Ｋ５−７０ ＶＬ遺伝子はヒトＩｇ κフォーム発現用ベクターであるｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のＡｇｅ Ｉ／ＢｓｉＷＩ部位にそれぞれ挿入し、マウス−ヒトキメラコンストラクトを完成させた（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＭｕＫ５−７０、ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＭｕＫ５−７０）。
上記で作製したコンストラクトと、実施例３６で作製したＨｕＫ５−７０Ｈ鎖発現ベクター（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０）およびＨｕＫ５−７０ Ｌ鎖発現ベクター（ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０）を、下記表の１〜４のとおりの組み合わせで２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に共発現させた。
２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションは、ＮｅｏＦｅｃｔｉｏｎ試薬（Ａｓｔｅｃ）を用いて添付の方法に従った。トランスフェクション後、５日間ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃、ＣＯ２濃度８％のＣＯ２インキュベーターで培養を行った後培養上清を回収した。培養上清中の抗体濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。具体的には、９６穴プレートをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、ブロッキングバッファー（２％スキムミルクと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで添加し、１時間、室温にてブロッキングを行った。洗浄バッファーで洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファー（１％スキムミルクと０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で適当な希釈倍率に希釈した培養上清を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間反応させた。標準品としてＨｕＫ５−７０抗体を用いた。洗浄バッファーで洗浄した後、検出用抗体としてＥＬＩＳＡバッファーで１，０００倍希釈したＨＲＰ標識Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ（κ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで洗浄した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＳＩＧＭＡ）基質溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、発色反応を行った。１Ｍ硫酸を２５μＬ／ウェルで加え反応を停止させた後、ｉＭａｒｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて６５５ｎｍの吸光度をリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。４種類の培養上清中の抗体とｈＴＲＯＰ−２との結合は、前述した低密度抗原固相化ＥＬＩＳＡで測定した。その結果、マウスＫ５−７０ＶＨとＨｕＫ５−７０ ＶＬから構成されるＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ抗体のｈＴＲＯＰ−２に対する結合はＣｈＫ５−７０抗体と同等であったが、ＨｕＫ５−７０ ＶＨとマウスＫ５−７０ ＶＬから構成されるＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ抗体のｈＴＲＯＰ−２に対する結合活性は、ＣｈＫ５−７０と比べて相対的に低かった（図６６）。このことから、ＨｕＫ５−７０ ＶＨがＨｕＫ５−７０の“アビディティー”に関与していることが示唆された。そこで、ＨｕＫ５−７０抗体の“アビディティー”を向上させた改変抗体を作製するために、ＨｕＫ５−７０ ＶＨのアミノ酸の置換を行った。図４１に示したＨｕＫ５−７０ ＶＨとＫ５−７０ ＶＨのアミノ酸配列のアライメントから分かるとおり、アミノ酸番号が５，７，１１，１２，１３，２０，３８，４０，４４，７３，７５，８１，８２ｃ，８３，８７，１０８および１０９番目の合計１７個のアミノ酸が、ＨｕＫ５−７０ ＶＨとＫ５−７０ ＶＨとの間で異なっている（アミノ酸番号はＫａｂａｔらの定義（１９９１）に従った）。ＨｕＫ５−７０ ＶＨのこれらのアミノ酸を対応するＫ５−７０ ＶＨのアミノ酸に１つずつ置換した変異体を遺伝子合成により作製し、発現ベクター（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０変異体）を作製した。さらに、Ｌａｎｄｏｌｆｉらの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１７４８，２００１）によると、ＶＨの１１番目と３８番目のアミノ酸がヒト型化抗体のアビディティーに関与しており、両者のアミノ酸を対応するマウス由来のアミノ酸に置換することにより、アビディティー、および生物活性が向上することが報告されている。そこで、１１番目と３８番目のアミノ酸の２重変異体も併せて作製した。図６７に作製した１８種類のＨｕＫ５−７０ ＶＨ変異体の名称とアミノ酸配列を示した。
作製した１８種類のＨｕＫ５−７０ ＶＨ変異体（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０変異体の発現ベクター）を、それぞれＨｕＫ５−７０ Ｌ鎖発現ベクター（ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０）と組み合わせて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、その培養上清を用いて各アミノ酸置換抗体とｈＴＲＯＰ−２との結合活性を低密度抗原固相化ＥＬＩＳＡで検討した。その結果、１８種類のＨｕＫ５−７０ ＶＨ変異体のうち、ＨｕＫ５−７０ ＶＨの４４番目のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）に置換したＲ４４Ｇ変異体（ＨｕＫ５−７０ Ｒ４４Ｇ；以下ＨｕＫ５−７０−２）において、明らかな抗原結合活性の向上が認められた（図６８）。ＨｕＫ５−７０ ＶＨ Ｒ４４Ｇ（以下ＨｕＫ５−７０ ＶＨ２）遺伝子の配列は図６９に示した。
［ＨｕＫ５−７０−２抗体の精製およびキャラクラリゼーション］
ＨｕＫ５−７０ Ｒ４４Ｇ変異型抗体であるＨｕＫ５−７０−２抗体は、以下のように精製した。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨｕＫ５−７０ Ｒ４４ＧとｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ＨｕＫ５−７０を２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、５日間培養を行った後、培養上清を回収した。回収した培養上清からｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＨｕＫ５−７０−２抗体を精製した。精製したＨｕＫ５−７０−２抗体を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したところ、約５０ｋＤａのＨ鎖と約２５ｋＤａのＬ鎖が確認され、それぞれの抗体の純度は９５％以上であった（図７０）。
精製したＨｕＫ５−７０−２およびＨｕＫ５−７０抗体のｈＴＲＯＰ−２との結合活性を高密度抗原固相化ＥＬＩＳＡおよび低密度抗原固相化ＥＬＩＳＡで検討した。高密度抗原固相化ＥＬＩＳＡで（１μｇ／ｍＬのｈＴＲＯＰ−２を固相化した９６ウェルプレートを使用）、アフィニティーの検証を行った結果、ＨｕＫ５−７０抗体とＨｕＫ５−７０−２抗体の結合曲線はほぼ重なり、両者のアフィニティーは同等であり、次に低密度抗原固相化ＥＬＩＳＡ（０．１μｇ／ｍＬのｈＴＲＯＰ−２を固相化した９６ウェルプレートを使用）によりアビディティーの検証を行った結果、培養上清を用いた場合の結果と同様、ＨｕＫ５−７０−２抗体の抗原結合活性はＨｕＫ５−７０抗体より明らかに高かった（図７１）。具体的には、ＥＣ５０値は、Ｋ５−７０抗体が１１．４ｎｇ／ｍＬ、ＨｕＫ５−７０抗体が３３．４ｎｇ／ｍＬ、ＨｕＫ５−７０−２抗体が１１．４ｎｇ／ｍＬであり、ＨｕＫ５−７０−２抗体は、ＨｕＫ５−７０抗体と比べて“アビディティー”が向上し、Ｋ５−７０抗体と同等の活性を有するものであることが示された。
［ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の測定］
（１）標的細胞溶液の調整
標的細胞としては、内在的にｈＴＲＯＰ−２を発現するヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０、ヒト膵臓癌細胞株ＰＫ−５９、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を用いた。１０ｃｍ細胞培養ディッシュで培養したターゲット細胞をトリプシン処理によってプレートから剥離し、アッセイ培地に懸濁した。ＡＤＣＣアッセイ用の培地は，０．５％ ＦＢＳを加えたＬｅｉｖｏｖｉｔｚ Ｌ−１５培地（ＳＷ４８０細胞）またはＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＫ−５９、ＰＣ−３細胞）を用いた。遠心後（１０００ｒｐｍ，３分、室温）、ペレットを同じ培地で２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞密度になるように調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒト末梢血単核細胞の分離
健常人静脈血をヘパリン採血し、ＰＢＳで２倍に希釈後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品）上に重層し遠心した（室温、７５０ｒｐｍ，５分、次に２０００ｒｐｍ，２０分）。遠心後、中間層分画にある単核細胞（健常人末梢血単核球）を回収し、ＰＢＳで３回洗浄後、アッセイ培地で細胞懸濁液を調製し、エフェクター細胞として使用した。
（３）ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０，ＨｕＫ５−７０−２およびＨｕＴ６−１６−２抗体）のＡＤＣＣ活性
９６穴平底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に調製した標的細胞溶液の１００μＬ（２×１０４ｃｅｌｌ／ウェル）を分注した。次いで、ヒト末梢血単核細胞（エフェクター細胞）を、エフェクター細胞：ターゲット細胞比が４０：１となるように添加した。更に、被験抗体として、ヒト型化抗ｈＴＲＯＰ−２抗体（ＨｕＫ５−７０，ＨｕＫ５−７０−２およびＨｕＴ６−１６−２抗体）を最終濃度が０．１〜３０μｇ／ｍＬとなるように加えて、全量を２００μＬとしてＣＯ２インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２）で６時間培養を行った。培養後、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ６４４ ７９３００１）を用い、Ｋｉｔ添付のプロトコールに従って、エフェクター細胞により傷害を受けたターゲット細胞の細胞質から培養上清へ放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定し、この測定結果を指標としてＡＤＣＣ活性を評価した。
図７２Ａ〜７２Ｃに示したとおり、ＨｕＫ５−７０、およびＨｕＴ６−１６−２抗体はｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現するヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０（図７２Ａ）、ヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９（図７２Ｂ）、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（図７２Ｃ）に対して、用量依存的にＡＤＣＣ活性を発揮することが明らかとなった。また図７２Ｂおよび図７２Ｃに示したとおり、ＨｕＫ５−７０−２抗体はヒト膵癌細胞株ＰＫ−５９およびヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３細胞に対して、ＨｕＫ５−７０抗体よりも強いＡＤＣＣ活性を発揮することが明らかとなった。ＨｕＫ５−７０−２抗体は、前述のとおり、ＨｕＫ５−７０ ＶＨの４４番目のＲ（アルギニン）をＧ（グリシン）に置換することにより、ｈＴＲＯＰ−２に対する結合能（アビディティー）が向上した抗体であり、ＨｕＫ５−７０抗体に比べて向上したアビディティーがＡＤＣＣ活性に反映していることが示された。したがって、ＨｕＫ５−７０−２抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ＨｕＫ５−７０抗体と同様に優れた抗腫瘍活性を有する（好ましくは、ＨｕＫ５−７０抗体より高い抗腫瘍活性を有し得る）ものと推認される。以上の結果から、ＨｕＫ５−７０、ＨｕＫ５−７０−２及びＨｕＴ６−１６−２抗体は、ｈＴＲＯＰ−２を細胞表面に発現する癌に対して有効な治療用抗体となることが示唆された。
本発明によれば、ｈＴＲＯＰ−２と特異的に反応し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて高い抗腫瘍活性を有する抗体、具体的には、低用量でｉｎ ｖｉｖｏでの高い抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体、特に当該抗体のうちヒト型化抗体であるものを提供することができる。さらに本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体の断片、当該抗体等と各種薬剤との複合体、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍の検出方法、腫瘍の検出用又は診断用キットを提供することができる。
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３１：合成ＤＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号７４：組換えＤＮＡ
配列番号７５：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号７６：組換えＤＮＡ
配列番号７７：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号７８：組換えＤＮＡ
配列番号７９：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号８０：組換えＤＮＡ
配列番号８１：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号８２：組換えＤＮＡ
配列番号８３：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号９２：組換えタンパク質
配列番号９３：組換えタンパク質
配列番号９４：組換えタンパク質
配列番号９５：組換えタンパク質
配列番号９６：組換えタンパク質
配列番号９７：組換えタンパク質
配列番号９８：組換えタンパク質
配列番号９９：組換えＤＮＡ
配列番号１００：組換えＤＮＡ
［配列表］

Claims (43)

  1. Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９８で示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９３で示されるアミノ酸配列からなるヒトTROP-2に対する抗体。
  2. 抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３６〜３８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１〜４３で示されるアミノ酸配列である、請求項１記載の抗体。
  3. Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９５で示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号９６で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトTROP-2に対する抗体。
  4. 抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６６〜６８で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号７１〜７３で示されるアミノ酸配列である、請求項３記載の抗体。
  5. 抗体がヒト型化抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 抗体がin vivoで抗腫瘍活性を有するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 5〜20mg/kg体重の投与量で50％以上の腫瘍成長阻害活性を示すものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 前記腫瘍成長阻害活性を示すための投与回数が多くても１週間に１回である、請求項７記載の抗体。
  9. 10mg/kg体重の単回投与で50％以上の腫瘍成長阻害活性を示すものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
  10. 2種以上のヒト腫瘍細胞株に対して抗腫瘍活性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 解離定数（Kd値）が1.0×10-10 M以下である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
  13. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
  14. 腫瘍がヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト肺癌、ヒト乳癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
  15. 腫瘍が再発癌又は転移癌である、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
  16. 腫瘍細胞株が、ヒト膵癌細胞株PK-59、ヒト膵癌細胞株BxPC-3、ヒト膵癌細胞株KP-3L、ヒト膵癌細胞株KP-2、ヒト膵癌細胞株PK-1、ヒト膵癌細胞株PK-45H、ヒト膵癌細胞株PK-45P、ヒト膵癌細胞株TCC-PAN2、ヒト膵癌細胞株SUIT-2、ヒト大腸癌細胞株CACO-2、ヒト大腸癌細胞株SW480、ヒト大腸癌細胞株DLD-1、ヒト大腸癌細胞株HCT 116、ヒト乳癌細胞株JIMT-1、ヒト乳癌細胞株HCC1143、ヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-468、ヒト前立腺癌細胞株DU145、ヒト前立腺癌細胞株PC-3、ヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3、ヒト肺癌細胞株Calu-3、ヒト胆管癌細胞株TFK-1からなる群より選ばれる少なくとも2種である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
  17. 腫瘍細胞株が、ヒト膵癌細胞株PK-59、ヒト膵癌細胞株BxPC-3、ヒト大腸癌細胞株SW480、ヒト肺癌細胞株Calu-3、ヒト乳癌細胞株MBA-MD-468及びヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3からなる群より選ばれる少なくとも2種である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
  18. 配列番号９８で示されるアミノ酸配列、及び、配列番号９３で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１、２及び５〜１７のいずれか１項に記載の抗体断片。
  19. 配列番号９５で示されるアミノ酸配列、及び、配列番号９６で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の抗体断片。
  20. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体−薬剤複合体。
  21. 請求項１８又は１９記載の抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する物質とを含む、抗体断片−薬剤複合体。
  22. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２０又は２１記載の複合体。
  23. 腫瘍がヒト膵癌、ヒト大腸癌、ヒト肺癌、ヒト乳癌及びヒト卵巣癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２０又は２１記載の複合体。
  24. 腫瘍が再発癌又は転移癌である、２０〜２３のいずれか１項に記載の複合体。
  25. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８又は１９記載の抗体断片、及び請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
  26. 腫瘍の治療に用いるものである、請求項２５記載の組成物。
  27. 体重減少の副作用を有しないものである、請求項２６記載の組成物。
  28. 腫瘍の診断に用いるものである、請求項２５記載の組成物。
  29. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 腫瘍が再発癌又は転移癌である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８又は１９記載の抗体断片、及び請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
  32. 体重減少の副作用を有しないものである、請求項３１記載の治療剤。
  33. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３１又は３２記載の治療剤。
  34. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８又は１９記載の抗体断片、及び請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍診断剤。
  35. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３４記載の診断剤。
  36. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８又は１９記載の抗体断片、及び請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。
  37. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３６記載の方法。
  38. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、請求項１８又は１９記載の抗体断片、及び請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット。
  39. 腫瘍が、ヒト膵癌、ヒト前立腺癌、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト卵巣癌、ヒト肺癌及びヒト胆管癌からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３８記載のキット。
  40. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  41. 請求項１８又は１９記載の抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
  42. 請求項４０又は４１記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  43. 請求項４２記載の組換えベクターを含む形質転換体。
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