MX2014006037A - Anticuerpo anti-trop-2 humano que tiene una actividad antitumoral in vivo. - Google Patents

Anticuerpo anti-trop-2 humano que tiene una actividad antitumoral in vivo.

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Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo (particularmente un anticuerpo humanizado) que reacciona específicamente con hTROP-2 y que exhibe actividad antitumoral in vivo, un hibridoma que produce dicho anticuerpo; una composición de dicho anticuerpo y un fármaco, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método de detección de tumor, y un kit para detectar o diagnosticar un tumor.

Description

ANTICUERPO ANTI-TROP-2 HUMANO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ANTITUMORAL IN VIVO Campo de la invención La presente invención se refiere a un anticuerpo TROP-2 anti-humano que tiene actividad antitumoral, y particularmente, a un anticuerpo anti-TROP-2 humano que tiene actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención se relaciona con un hibridoma, que produce el anticuerpo anteriormente mencionado, y con un uso del anticuerpo anteriormente mencionado.
Antecedentes de la Invención TROP-2 humano (Tacstd2, GA733-1 y EGP-1) (más adelante también designado como "hTROP-2") es una simple transmembrana, proteína de membrana celular tipo 1 que consiste de 323 residuos de aminoácidos (ver SEC ID NO: 2), y esta proteína se ha conocido por sobreexpresarse en varios tipos de carcinomas de la célula epidérmica. La presencia de una proteína de membrana celular asociada con resistencia inmunológica, que se expresa comúnmente en ambos trofoblastos y células cancerosas humanas, se ha sugerido durante mucho tiempo (Documento no Relacionado con Patente 1). Se identificó una molécula del antígeno reconocida por los anticuerpos monoclonales de ratón (162-25.3, 162-46.2) reacciona con la proteína de membrana celular de una línea celular de coriocarcinoma humana BeWo. Esta molécula del antígeno se considera como una de las moléculas expresadas en trofoblastos humanos, y se nombró como Trop-2 (Documento no Relacionado con Patente 2). Después de esto, la misma molécula fue descubierta por otros investigadores. Es decir, un antígeno tumoral reconocido por un anticuerpo monoclonal de ratón GA733 que es obtenido mediante inmunización con células cancerosas del estómago SW948 se nombró como GA733-1 (Documento no Relacionado con Patente 3), y una glicoproteína epitelial reconocida por un anticuerpo monoclonal de ratón RS7-3G11 que es obtenido mediante inmunización con las células cancerosas del pulmón de célula no pequeña se nombró como un antígeno epitelial/carcinoma, EGP-1 (Documento no Relacionado con Patente 4). En 1995, se clonó el gen Trop-2, y como resultado, se confirmó que estas son las mismas moléculas (Documento no Relacionado con Patente 5). Por otra parte, se aclaró que la molécula tiene una función para amplificar señales de calcio intracelular en células cancerosas (Documento no Relacionado con Patente 6), y por lo tanto, también se refiere como un transductor de señal de calcio asociado a tumor 2 (TACSTD2, por sus siglas en inglés).
El gen hTROP-2 se asigna en el cromosoma 1p32, y constituye una familia del gen TACSTD junto con GA733-2 que tiene una homología de aproximadamente 50% del mismo (que se ha conocido como "TACSTD 1 ," "glicoproteína epitelial EGP-2," "EpCAM" o "Trop-1") (Documento no Relacionado con Patente 7). La proteína hTROP-2 (323 residuos de aminoácidos; SEC DE ID NO: 2) tiene un peso molecular de aproximadamente 36K Dalton, y esta proteína consiste de un péptido de señal hidrofílica (1r a 26o aminoácidos), un dominio extracelular (27o a 274o aminoácidos), un dominio de transmembrana (275o a 297o aminoácidos) y un dominio intracelular (298o a 323o aminoácidos). El dominio extracelular tiene cuatro sitios de glicosilación enlazados a N heterogéneo, y su aparente peso molecular es aumentado por 11 a 13K Dalton debido a la adición de cadenas de azúcar (Documento no Relacionado con Patente 5). Se considera que la familia del gen de TACSTD tiene una secuencia de tiroglobulina característica (TY, por sus siglas en inglés) en el dominio extracelular y se asocia con la proliferación, la invasión y la metástasis de células cancerosas.
Hasta la fecha, un ligando fisiológico de hTROP-2 no se ha identificado, y la función molecular del mismo no se ha aclarado. Sin embargo, se ha descrito que hTROP-2 transmite una señal de calcio en células tumorales (Documento no Relacionado con Patente 6). Además, de los hechos que la serina intracelular 303 es fosforilada por la proteína cinasa C que es la cinasa dependiente de Ca2+ (Documento no Relacionado con Patente 4) y que hTROP-2 tiene una secuencia de unión a PIP2 en su dominio intracelular, se ha sugerido que hTROP-2 tiene una función de señalización en células tumorales (Documento no Relacionado con Patente 8).
Como resultado de los análisis como inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) y citometría de flujo, la sobreexpresión de hTROP-2 en muchos tipos de carcinomas derivados del epitelio como cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer ovárico, cáncer de mamas, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de hígado y cáncer del esófago se ha informado. En cambio, la expresión de hTROP-2 en tejidos normales se limita a células en la región epitelial, y el nivel de expresión de hTROP-2 en células normales es menor que en las células cancerosas. Así, se sugiere la asociación de TROP-2 con la formación de tumores (Documentos de Patente 1-3 y 9).
Por otra parte, se ha demostrado que la expresión de hTROP-2 usada como biomarcador en muestras clínicas se correlaciona con la malignidad del cáncer colorrectal (Documentos no Relacionados con Patentes 10 y 11), del cáncer pancreático (Documento no Relacionado con Patente 12) o del cáncer oral (Documento no Relacionado con Patente 13), y que cuando hTROP-2 es sobreexpresado, la posibilidad de la metástasis o la recurrencia de tal cáncer es significativamente alta. Además, en un análisis de expresión de gen a gran escala al usar una técnica de micromatriz de ADNc, hTROP-2 se ha identificado como un racimo de gen, que se sobreexpresa en el más alto nivel en el adenocarcinoma papilar severa del ovario, en comparación con en el epitelio ovárico normal (Documento no Relacionado con Patente 14).
Aún más, estos últimos años, un papel importante de hTROP-2 en la formación de tumores ha sido demostrado en los modelos al usar células del cáncer de colon (Documento no Relacionado con Patente 15). Puesto que la expresión de hTROP-2 promueve la proliferación celular independiente de anclaje de células tumorales y se requiere para la formación y proliferación tumoral de células cancerosas trasplantadas subcutáneamente en ratones inmunodeficientes, se planteó la posibilidad que hTROP-2 actuaría como un antígeno tumoral funcional y sería usado como un nuevo objetivo terapéutico.
Hasta la fecha, los estudios con respecto a los efectos antitumorales de varios anticuerpos anti-hTROP-2 se han informado. Un anticuerpo RS7 (Documento de Patente 1) ha sido examinado empleando modelos in vivo, en los cuales se usaron anticuerpos radiactivos etiquetados con sustancias, y se demostrada la actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto en ratones desnudos. Sin embargo, no se han informado los efectos antitumorales mediante el anticuerpo solo (un anticuerpo desnudo).
Además, se ha informado la citotoxicidad de un anticuerpo monoclonal BR110 anti-hTROP-2 unido a citotoxina (Documento de patente 2) en líneas celulares de cáncer humano H3619, H2987, MCF-7, H3396 y H2981 en experimentos in vitro. Sin embargo, no se ha informado la citotoxicidad de un anticuerpo desnudo o de un inmunoconjugado de BR110 in vivo.
Estos últimos años, se ha informado que un anticuerpo monoclonal aislado, que se produjo a partir de una línea celular de hibridoma AR47A6.4.2 o AR52A301.5 obtenida al inmunizar ratones con los tejidos de cáncer de ovarios humanos, unido a hTROP-2, y que, por primera vez, exhibido, como un anticuerpo desnudo, actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de ratones desnudos, así como citotoxicidad in vitro (Documentos de Patente 3 y 4). En estos documentos de patente, el anticuerpo anteriormente mencionado exhibió efectos antitumorales mediante el tratamiento con el anticuerpo solo en modelos de xenoinjerto de ratones, en los cuales las líneas celulares de cáncer pancreático BxPC-3 y PL45, una línea celular de cáncer de próstata PC-3, una línea celular de cáncer de mamas MCF-7 y una línea celular de cáncer de colon Colo205 habían sido trasplantadas. Los efectos terapéuticos del anticuerpo han aparecido en los modelos, en los cuales las células BxPC-3 habían sido trasplantadas. Con excepción de esto, la formación y la proliferación tumoral se suprimieron simplemente de manera parcial (aproximadamente 40% a 60%) mediante la administración preventiva del anticuerpo, y una cantidad extremadamente grande (aproximadamente 20 mg/kg) del anticuerpo fue necesaria para tal supresión de la formación y de la proliferación tumoral.
Con base en los hallazgos previos mencionados anteriormente, se ha sugerido el uso potencial del anticuerpo anti-hTROP-2 como un anticuerpo antitumoral. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-hTROP-2 exhiben efectos antitumorales mediante tratamiento con el anticuerpo solo como anticuerpos desnudos in vivo. Los anticuerpos exhiben diferentes acciones en hTROP-2, dependiendo de un sitio de enlace, de afinidad y de las propiedades de un anticuerpo monoclonal.
Documento de Patente 1: Número de Patente Americana 6653104 Número de Patente Americana 2: Número de Patente Americana 5840854 Número de Patente Americana 3: Número de Patente Americana 7420040 Número de Patente Americana 4: Número de Patente Americana 7420041 Documento no Relacionado con Patente 1: Faulk WP, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 75(4), págs. 1947-1951 (1978) Documento no Relacionado con Patente 2: Lipinski M, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 78(8), págs. 5147-5150 (1981) Documento no Relacionado con Patente 3: Linnenbach AJ, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 86(1), págs. 27-31 (1989) Documento no Relacionado con Patente 4: Basu A, et al., Int. J. Cáncer, 62(4), págs.472-479 (1995) Documento no Relacionado con Patente 5: Fornaro M, et al., Int. J. Cáncer, 62(5), págs. 610-618 (1995) Documento no Relacionado con Patente 6: Ripani E, et al., Int. J. Cáncer, 76(5), págs. 671-676 (1998) Documento no Relacionado con Patente 7: Calabrese G, et al., Cell Genet., 92(1-2), págs. 164-165 (2001) Documento no Relacionado con Patente 8: El Sewedy T et al., Int. J. Cáncer, 75(2), págs. 324-330 (1998) Documento no Relacionado con Patente 9: Cubas R, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1796(2), págs. 309-314 (2009) Documento no Relacionado con Patente 10: Ohmachi T et al., Clin. Cáncer Res., 12(10), págs. 3057-3063 (2006) Documento no Relacionado con Patente 11: Fang YJ, et al., Int. J. Colorectal Dis., 24(8), págs. 875-884 (2009) Documento no Relacionado con Patente 12: Fong D, et al., Br. J. Cáncer, 99(8), págs. 1290-1295 (2008) Documento no Relacionado con Patente 13: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), págs. 186-191 (2008) Documento no Relacionado con Patente 14: Santin AD, et al., Int. J. Cáncer, 112(1), págs. 14-25 (2004) Documento no Relacionado con Patente 15: Wang J, et al., Mol. Cáncer Ther., 7(2), págs. 280-285 (2008) Breve Descripción de la Invención Bajo circunstancias mencionadas anteriormente, se ha deseado para desarrollar un anticuerpo anti-hTROP-2 (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2) que tenía alta actividad antitumoral ¡n vivo, y específicamente, un anticuerpo anti-hTROP- 2 o similares, que tiene un efecto antitumoral como un anticuerpo desnudo solo in vivo y además, que tiene el efecto antitumoral en una baja dosis, y particularmente, tal anticuerpo anti-hTROP-2, que es un anticuerpo humanizado.
Se ha terminado la presente invención, mientras que toma en consideración las circunstancias mencionadas anteriormente. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-hTROP-2 (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2), un hibridoma, que produce el anticuerpo, un fragmento del anticuerpo, un conjugado (un inmunoconjugado) del anticuerpo o similares y un fármaco, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar un tumor, un kit para detectar o diagnosticar un tumor, y similares, que será descrito más adelante. (1) Un anticuerpo contra TROP-2 humano en el cual una región V de cadena H del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 92 o 98, y una región V de cadena L del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 93.
En el anticuerpo de acuerdo con (1) antes, las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la Región V de cadena L del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 41 a 43, respectivamente. (2) Un anticuerpo contra TROP-2 humano en el cual una región V de cadena H del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 94 o 95, y una región V de cadena L del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 96.
En el anticuerpo de acuerdo con (2) anterior, las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 66 a 68, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 71 a 73, respectivamente.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo humanizado.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral in vivo.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo que exhibe 50% o más de actividad inhibidora del crecimiento tumoral en una dosis de 5 a 20 mg/kg de peso corporal. En la presente, la frecuencia de administración para exhibir la actividad inhibidora del crecimiento tumoral es, por ejemplo, a lo más una vez por semana.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo que exhibe 50% o más de la actividad inhibidora del crecimiento tumoral por una simple administración de anticuerpo en una dosis de 10 mg/kg de peso corporal.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas celulares de tumor humano.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo que tiene un constante de disociación (valor de Kd) de 1.0 x 10-10 M o menor.
Un ejemplo del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores es un anticuerpo monoclonal.
En la presente, el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, el cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. El tumor es preferiblemente por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos.
Además, el tumor es, por ejemplo, un cáncer recurrente o un cáncer metastático.
Por otra parte, las líneas celulares tumorales son, por ejemplo, por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de una línea celular de cáncer pancreático humano PK-59, una línea celular de cáncer pancreático humano BxPC-3, una línea celular de cáncer pancreático humano KP-3L, una línea celular de cáncer pancreático humano KP-2, una línea celular de cáncer pancreático humano PK-1, una línea celular de cáncer pancreático humano PK-45H, una línea celular de cáncer pancreático humano PK-45P, una línea celular de cáncer pancreático humano TCC-PAN2, una línea celular de cáncer pancreático humano SUIT-2, una línea celular de cáncer de colon humano CACO-2, una línea celular de cáncer de colon humano SW480, una línea celular de cáncer de colon humano DLD-1, una línea celular de cáncer de colon humano HCT 116, una línea celular de cáncer de mamas humanas JIMT-1, una línea celular de cáncer de mamas humanas HCC1143, una línea celular de cáncer de mamas humanas MCF-7 una línea celular de cáncer de mamas humanas MDA-MD-468, una línea celular de cáncer de próstata humana DU145, una línea celular de cáncer de próstata humana PC-3, una línea celular de cáncer de pulmón humano Calu-3, una línea celular de cáncer de ovarios humanos SK-OV-3 y una línea celular de colangiocarcinoma humano TFK-1. Entre otros, las líneas celulares tumorales son preferiblemente por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de una línea celular de cáncer pancreático humano PK-59, una línea celular de cáncer pancreático humano BxPC-3, una línea celular de cáncer de colon humano SW480, una línea celular de cáncer de pulmón humano Calu-3, una línea celular de cáncer de mamas humanas MDA-MB-468 y una línea celular de cáncer de ovarios humanos SK-OV-3. (3) Un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores.
Los ejemplos del fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior incluyen un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 92 o 98 y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 93, o un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 94 o 95 y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 96. (4) Un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células. (5) Un conjugado de fragmento-fármaco de anticuerpo, que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células.
En el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. Por otra parte, el tumor es, por ejemplo, un cáncer recurrente o un cáncer metastático. (6) Una composición farmacéutica, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores.
Los ejemplos de la composición de acuerdo con (6) anterior incluyen una composición que se usa en el tratamiento del tumor, una composición que no cause la pérdida de peso como un efecto secundario y una composición que se usa en la diagnosis del tumor. En la presente, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. Por otra parte, el tumor es, por ejemplo, un cáncer recurrente o un cáncer metastático. (7) Un agente terapéutico contra tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores.
Un ejemplo del agente terapéutico contra tumor de acuerdo con (7) anterior es un agente terapéutico contra tumor que no causa la reducción de peso como un efecto secundario. En la presente, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. (8) Un agente de diagnóstico del tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores.
En el agente de diagnóstico del tumor de acuerdo con (8) anterior, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. (9) Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores, para reaccionar con una muestra recolectada de un cuerpo vivo; y entonces detectando una señal del anticuerpo y/o del fragmento reaccionados del anticuerpo.
En el método para detectar un tumor de acuerdo con (9) anterior, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. (10) Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior y el conjugado de acuerdo con (4) y (5) anteriores.
En el kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor de acuerdo con (10) anterior, el tumor es, por ejemplo, por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano. Entre otros, el tumor es preferiblemente por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de pulmón humano y cáncer de ovarios humanos. (11) Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de acuerdo con (1) y (2) anteriores. (12) Un polinucleótido que codifica el fragmento de anticuerpo de acuerdo con (3) anterior. (13) Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con (11) o (12) anterior. (14) Un transformante que comprende el vector recombinante de acuerdo con (13) anterior.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la medición de la afinidad de unión al antígeno (Kd: constante de disociación) de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70). Abt: Anticuerpo (total); Agf: Antígeno (libre).
La Figura 2 muestra la reactividad de un sobrenadante del hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2, con células HuH-7 (hTROP-2-negativo) y células HuH-7-hTROP-2. El histograma lleno indica células HuH-7, y el histograma abierto indica células HuH-7-hTROP-2.
La Figura 3 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 con una línea celular de cáncer pancreático humano (células PK-59), que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. El histograma lleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 4 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 con una línea celular de cáncer pancreático humano (células BxPC-3), que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. El histograma lleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 5 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) con líneas celulares de cáncer pancreático humano. El histograma lleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de la línea celular con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 6 muestra la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) con las líneas celulares de cáncer de colon humano (Colo320, CAC02, SW480, DLD1, CW2 y HCT 116), las líneas celulares de cáncer de mamas humanas (JIMT-1 y HCC1143) y las líneas celulares de cáncer de próstata humana (PC-3 y DU145). El histograma lleno indica la reacción de la línea celular solamente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de la línea celular con el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 7 muestra la reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con TROP-2 de ratón. Se usaron células preparadas permiten que un gen TROP-2 de ratón sea expresado transitoriamente en células CHO-K1, y se usó un anticuerpo T2-102 (IgG 1 de ratón) que exhibía reactividad cruzada con el TROP-2 de ratón como un anticuerpo de control positivo. El histograma lleno indica la reacción de las células simplemente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de las células con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 8 muestra la reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con EpCAM/TROP- humano. Se usaron células preparadas permiten que un gen EpCAM/TROP-1 humano sea expresado transitoriamente en células CHO-K1, y se usó un anticuerpo monoclonal EpCAM antihumano etiquetado con PE (Becton, Dickinson and Company) como anticuerpo de control positivo. El histograma lleno indica la reacción de las células simplemente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE antí-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de las células con cada anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
La Figura 9 muestra la actividad inhibidora del crecimiento celular de los anticuerpos anti-hTROP-2 (T6-16, T5-86, K5-70 y K5-107) en una línea celular de cáncer pancreático humano (células PK-59). La mlgG indica un anticuerpo de control (IgG de ratón), e YY01 indica un anticuerpo anti-hTROP-2 comercialmente disponible (Santa Cruz). Columna blanca: 0 pg/ml; columna gris: 0.1 g/ml; columna negra: 1 pg/ml. El nivel de actividad se expresó mientras que una relación del valor actual al valor obtenido cuando un anticuerpo no se ha agregado (0 pg/ml). La barra de error indica una desviación estándar. *P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 10 muestra un ensayo de raspado de una línea celular de cáncer pancreático humano (células PK-59) en presencia de anticuerpos anti-hTROP-2 (T6-16 y K5-70).
La figura 10A muestra ejemplos representativos de las fotografías de las regiones de ralladura de las células PK-59. El día O muestra un ejemplo representativo inmediatamente después del raspado. La mlgG (día 1) muestra una fotografía tomada 1 día (24 horas) después de raspar y después de agregar un anticuerpo de control (IgG de ratón, 1 pg/ml) al medio. K5-70 (día 1) muestra una fotografía tomada 1 día (24 horas) después de raspar y después de agregar un anticuerpo K5-70 (1 pg/ml) al medio. T6-16 (día 1) muestra una fotografía tomada 1 día (24 horas) después de raspar y después de agregar un anticuerpo T6-16 (1 Mg/ml) al medio. Cada flecha en cada fotografía indica el ancho de una región de raspado.
Figura 10B. El área de una región de raspado se analizó al usar el software de análisis de imagen (Scion Image), y basado en el valor obtenido, el valor de cada anticuerpo de la prueba se calculó al usar el valor obtenido el día 0 del grupo de adición del anticuerpo de control (mlgG, por sus siglas en inglés) como un valor estándar de 1.
*P <0.05, ** P < 0.01 (por la prueba t de Student's).
La Figura 11 es una vista que ilustra FACS que muestra la expresión de un marcador de células madre en una línea celular de cáncer pancreático humano PK-59. La Figura 11A es una vista que ilustra FACS que muestra la expresión de EpCAM en las células PK-59. El histograma lleno indica la reacción de las células solamente con un anticuerpo secundario (IgG etiquetada con PE anti-ratón), y el histograma abierto indica la reacción de las células con un anticuerpo EpCAM anti-humano (Becton, Dickinson and Company). Las Figuras 11B y C son vistas que ilustran FACS que muestra la expresión de P-glicoproteína/MCR1 en células PK-59 (Figura 1 B) , y la expresión de ABCG2 en células PK-59 (Figura 11C). El histograma azul indica la reacción de las células solamente con un anticuerpo secundario, y el histograma rojo indica la reacción de las células con un anticuerpo P-glicoproteína/MDR1 anti-humano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11 B ) , o con un anticuerpo ABCG2 antihumano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11C). La Figura 11D muestra el análisis de FACS, en el cual las células PK-59 se sometieron a doble tinción con marcadores de células madre de cáncer pancreático, un anticuerpo CD24 anti-humano etiquetado con FITC (BD Biosciences Pharmingen) y un anticuerpo CD44 anti-humano Etiquetado con PE (BD Biosciences Pharmingen). Cada número en la Figura 11D indica la relación existente de las células en cada fracción.
La Figura 12 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un nuevo clon K5-70 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (lgG2a de ratón) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células PK-59.
La Figura 12A muestra el curso de tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control ( : IgG ratón) y un anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) grupo de la administración (O) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 12B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón al tiempo del 21° día (día 21) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 12A. El valor numérico en cada diagrama indica un valor promedio ± desviación estándar. ** P < 0.01 (por la prueba t de Student).
La Figura 13 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-107 (A), de un clon T6-16 (b) y de un clon K5-116-2-1 (C) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células PK-59. El símbolo " " indica un grupo de control (IgG de ratón), y el símbolo "O " indica un grupo de administración de anticuerpo anti-hTROP-2 (10 mg/kg de peso corporal). La flecha en la gráfica indica un período de administración de anticuerpo, y el valor numérico en cada diagrama indica un valor promedio ± desviación estándar. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 14 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-70 (Figura 14A), de un clon T6-16 (Figura 14B) y de un clon K5-116-2-1 (Figura 14C) en modelos de prevención de xenoinjerto al usar células PK-59. El símbolo " f' indica un grupo de control (IgG de ratón), y el símbolo "O" indica un grupo de administración de anticuerpo anti-hTROP-2 (10 mg/kg de peso corporal). La flecha en la gráfica indica un período de administración de anticuerpo, y el valor numérico en cada diagrama indica un valor promedio ± desviación estándar. ** P < 0.01 (por la prueba t de Student).
La Figura 15 muestra la evaluación de la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de prevención y de tratamiento del xenoinjerto ai usar células BxPC-3. La Figura 15A muestra el curso de tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control (f: IgG de ratón) y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (O) en los modelos de la prevención (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (por la prueba t de Student). La Figura 15B muestra el curso de tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control (f: IgG ratón) y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) ( Q) en los modelos del tratamiento (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05 (por la prueba t de Student).
La Figura 16 muestra la actividad antitumoral dependiente de dosis de un clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto al usar células PK-59. El volumen de un tumor se expresa como valor promedio ± desviación estándar.
La Figura 16A muestra el curso de tiempo del crecimiento tumoral de un grupo de control (f: IgG ratón) y grupos de administración de anticuerpo K5-70 (|Hj 1 mg/kg de peso corporal, ? : 5 mg/kg de peso corporal) en diferentes dosis (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student), ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 16B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 17° día (día 17) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 16A. El número numérico en cada diagrama indica un valor promedio ± desviación estándar. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 17 es una vista esquemática de una proteína quimérica humana/de ratón TROP-2 usada en el experimento. SP: secuencia de señal; TY Dominio: región tipo 1 de tiroglobulina; T : región de transmembrana; C: región intracelular, donde la región llenada es un polipéptido derivado de hTROP-2, mientras que la región abierta es un polipéptido derivado a partir de TROP-2 de ratón. El número en la posición superior de la vista esquemática de la proteína quimérica indica el número de aminoácidos de una proteína TROP-2 de ratón, y el número en la posición inferior del mismo indica el número de aminoácidos de una proteína hTROP-2.
La Figura 18 muestra los resultados obtenidos identificando una región de unión al anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2, al usar el TROP-2 quimérico humano/de ratón. Al usar células HEK293, que expresan constantemente el TROP-2 quimérico humano/de ratón-C (hmTROP-2-C, por sus siglas en inglés) o proteínas TROP-2-D quimérico de ratón/humano (mhTROP-2-D, por sus siglas en inglés), se estudió la reactividad con los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 mostrada en la figura. Como un control negativo, se usó la lgG2b de ratón.
La Figura 19 muestra los resultados obtenidos identificando la región de unión al anticuerpo de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
Un gen hTROP-2 y cada gen TROP-2 quimérico humano/de ratón se introdujo en células HEK293, y el análisis de FACS entonces se realizó al usar las células, en las cuales los genes se expresaron transitoriamente. En la Figura 19(A), se estudió la reactividad de los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 con hTROP-2 (caso superior), con hmTROP-2-? (caso medio) y con hmTROP-2-? (caso menor). Como un control negativo, se usó la lgG2b de ratón. En la Figura 19(B), se estudió la reactividad de los anticuerpos T6-4 y T6-16 con hTROP-2 (caso superior), con mhTROP-2-? (caso medio) y con mhTROP-2-F (caso menor). Como un control negativo, se usó la lgG2b de ratón.
La Figura 20 muestra la expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos. Las matrices de tejido humano normal se inmunotiñeron con un clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. (A) piel, (B) esófago, (C) riñón (corteza), (D) riñon (médula), (E) páncreas, (F) próstata, (G) vejiga, (H) amígdala, (I) corazón, (J) hígado (ampliación: ? 200) La Figura 21 muestra la expresión de hTROP-2 en tejidos de cáncer. Las matrices de tejido de cáncer humano se inmunotiñeron con un clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. (A) cáncer de mamas, (B) cáncer de pulmón, (C) cáncer de esófago, (D) cáncer de estómago, (E) cáncer pancreático, (F) cáncer colorrectal, (G) cáncer de vejiga, (H) cáncer de próstata, (I) cáncer ovárico (ampliación: ? 100) La Figura 22 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 por una simple administración en modelos de prevención de xenoinjerto al usar células PK-59.
La Figura 22A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( : IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (Q) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica la administración de anticuerpo. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student), ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 22B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 28v0 día (día 28) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 22A. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 22C muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en cada ratón en un grupo de control (f . IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (< >- La flecha indica la administración de anticuerpo.
La Figura 23 muestra la actividad antitumoral de un clon K5- 70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar las células SW480 de cáncer de colon humano.
La Figura 23A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( £: IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) ( (")) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 23B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 44 o día (día 44) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 23A. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 24 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-116-2-1 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar las células SW480.
La Figura 24A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( f : IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-116-2-1 (10 mg/kg de peso corporal) (Q) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 24B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 42v0 día (día 42) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 24A. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 25 muestra la actividad antitumoral de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480.
La Figura 25A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control { '¦ IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) {(~)) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 25B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 42o día (día 42) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 25A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 26 muestra la actividad antitumoral dependiente de dosis de un clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480.
La Figura 26A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( : IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (Q: 1 mg/kg de peso corporal, ?: 5 mg/kg de peso corporal, Q : 10 mg/kg de peso corporal) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 26B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 420v día (día 42) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 26A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 27 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar las células SW480.
La Figura 27A muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo K5-70 en los intervalos de administración de una vez por semana. Se muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( f: IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) ( Q : 10 mg/kg) (un valor promedio ± desviación estándar). Las cabezas de flechas (días 10, 17, 24, 31, y 38) indican la administración de un anticuerpo K5-70. * P < 0.05 por la prueba t de Student.
La Figura 27B es una vista que muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo K5-70 en los intervalos de administración una vez cada diez días (q10d) o una vez de cada dos semanas (q14d). La Figura muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: IgG de ratón, 10 mg/kg) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (Q : q10d, 10 mg/kg, ¿ ¦ q14d, 10 mg/kg) (un valor promedio ± desviación estándar). Las puntas de flecha llenadas (T: Días 9, 19, y 29) y las puntas de flechas abiertas (V: Los días 9, 23, y 37) indican la administración de un anticuerpo K5-70. * P < 0.05, ** P < 0.01 mediante la prueba t de Student.
La Figura 28 muestra la actividad antitumoral dependiente de dosis de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480.
La Figura 28A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( £: IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo T6-16 iQ: 1 mg/kg de peso corporal, ? : 5 mg/kg de peso corporal, Q : 10 mg/kg de peso corporal) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** p < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 28B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 43v0 día (día 43) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 28A. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 29 muestra la actividad antitumoral de un clon T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480. Se muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal) y en un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (Q : q7d, q10d) (un valor promedio ± desviación estándar). Las puntas de flechas (Días 10, 17, 24, 31, y 38) y las flechas (Días 10, 20, 30, y 40) indican la administración de un anticuerpo T6-16. Se realizó la administración una vez cada tres días al grupo de control. * P < 0.05, ** P < 0.01 mediante la prueba t de Student.
La Figura 30 muestra la actividad antitumoral de un clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto al usar células DU-145 de próstata humana.
La Figura 30A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( : IgG de ratón) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (Q) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 30B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 40vo día (día 40) (el día final de experimento) en la prueba de la Figura 30A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 31 muestra la actividad inhibidora de metástasis de un clon K5-70 en modelos metastáticos del hígado al usar células PK-59.
Las Figuras 31A y 31B muestran la imagen del hígado elimina de un grupo de control (#: IgG de ratón) (A) y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (B), que se tomaron 6 semanas después del trasplante de células. Las flechas indican focos metastáticos del hígado.
La Figura 32 muestra la actividad antitumoral de K5-70 en modelos de xenoinjerto al usar células SW480, que son modelos de cáncer recurrente después de la administración de clorhidrato de irinotecán. Esta Figura muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo no tratado (?), en un clorhidrato de irinotecán (40 mg/kg de peso corporal) + grupo de administración de anticuerpo K5-70 (Q : 10 mg/kg de peso corporal), y en un clorhidrato de irinotecán (40 mg/kg de peso corporal) + grupo de administración de IgG de ratón ( : 10 mg/kg de peso corporal) (un valor promedio ± desviación estándar). Las puntas de flecha (días 11, 14, y 17) indican la administración del clorhidrato de irinotecán. Se administró el anticuerpo K-70 o la IgG de ratón una vez cada tres días a partir del día 20. La flecha indica un período de administración de anticuerpo. *P < 0.05, ** P < 0.01 mediante la prueba t de Student.
La Figura 33 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VH) de cadena H del clon K5-70 (SEC DE ID NO: 34) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 35). Un péptido de señal se muestra en itálicas. La glutamina doble subrayado (Q) indica el residuo de aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de los CDR (subrayadas; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD, y TSMADY) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Número de Publicación de NIH 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de los 1 a 3 CDR de la VH del clon K5-70 se muestran en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, respectivamente.
La Figura 34 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VL) de cadena L del clon K5-70 (SEC DE ID NO: 39) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 40). Un péptido de señal se muestra en itálicas. El ácido aspártico doble subrayado (D) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; RASQSIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR del clon K5-70 VL se muestran en las SEC DE ID NOS: 41 a 43, respectivamente.
La Figura 35 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VH) de cadena H del clon K5-107 (SEC DE ID NO: 44) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 45). Un péptido de señal se muestra en itálicas. La glutamina doble subrayada (Q) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; SYWMH, N IYPGGGYTN YDEKFKS , y SSVFDY) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VH del clon K5-107 se muestran en las SEC DE ID NOS: 46 a 48, respectivamente.
La Figura 36 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VL) de cadena L del clon K5-107 (SEC DE ID NO: 49) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 50). Un péptido de señal se muestra en itálicas. El ácido aspártico doble subrayado (D) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; RASQNIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VL del clon K5-107 se muestran en las SEC DE ID NOS: 51 a 53, respectivamente.
La Figura 37 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VH) de cadena H del clon K5-116-2-1 (SEC DE ID NO: 54) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 55). Un péptido de señal se muestra en itálicas. La glutamina doble subrayada (Q) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; SYWIT, N IYPSDSYTN YNQKFRD, y LFDY) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VH del clon K5-116-2-1 se muestran en las SEC DE ID NOS: 56 a 58, respectivamente.
La Figura 38 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VL) de cadena L del clon K5-116-2-1 (SEC DE ID NO: 59) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 60). Un péptido de señal se muestra en itálicas. El ácido aspártico doble subrayado (D) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; RASQSIGTSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VL del clon K5-116-2-1 se muestran en las SEC DE ID NOS: 61 a 63, respectivamente.
La Figura 39 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VH) de cadena H del clon T6-16 (SEC DE ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO. 65). Un péptido de señal se muestra en itálicas. El ácido glutámico doble subrayado (E) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; DYNMH, YIYPYNGGTGYNQRFKS, y EDYGSSPSYAMDY) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VH del clon T6-16 se muestran en las SEC DE ID NOS: 66 a 68, respectivamente.
La Figura 40 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de una región variable (VL) de cadena L del clon T6-16 (SEC DE ID NO: 69) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC DE ID NO: 70). Un péptido de señal se muestra en itálicas. El ácido aspártico doble subrayado (D) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; RSSQSLVHGNGNTYLH, KVSNRFS, y SQTTHVPT) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la VL del clon T6-16 se muestran en las SEC DE ID NOS: 71 a 73, respectivamente.
La Figura 41 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 35) de la región variable de cadena H de un clon K5-70 (K5-70 VH), la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 75) de la región variable de cadena H de un K5-70 humanizado (HuK5-70 VH), y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 85) de la región variable de cadena H de un aceptor (Número de acceso de Genbank DA980102; SEC DE ID NO: 84) usadas para la producción del anticuerpo humanizado (DA980102 VH). (Debe observarse que cada una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura indica una porción de la secuencia de aminoácidos de cada región variable de cadena H (específicamente, la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína madura a partir de la cual se elimina una porción del péptido de señal)).
La secuencia de aminoácidos subrayada en el K5-70 VH indica una secuencia de la CDR determinada de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Además, el número en la posición superior de la secuencia de aminoácidos indica el número de posición de un aminoácido determinado de acuerdo con las definiciones mencionadas anteriormente de Kabat et al. Cada secuencia de la CDR en la VH DA980102 se expresa con el símbolo y la así se omite la descripción. Puesto que el aminoácido subrayado en la VH HuK5-70 se asumió para ser importante para el mantenimiento de la estructura de CDR, la secuencia de la VH K5-70 se mantuvo. Además, con respecto al aminoácido doble subrayado en la VH HuK5-70, el aminoácido de la VH DA980102 correspondiente (metionina ( )) se encuentra raramente en esta posición. Por lo tanto, con el fin de disminuir la antigenicidad, se sustituyó el aminoácido doble subrayado en la VH HuK5-70 con leucina (L) como un aminoácido representativo que pertenecía al mismo subgrupo.
La Figura 42 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 40) de la región variable de cadena L de un clon K5-70 (K5-70 VL), la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 77) de la región variable de cadena L de un K5-70 humanizado (HuK5-70 VL), y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 87; Número de acceso AAA64877 de Genbank) de la región variable de cadena L de un aceptor (Número de acceso de Genbank L41174; SEC DE ID NO: 86) usadas para la producción del anticuerpo humanizado (L41174 VL). (Debe observarse que cada una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura indica una porción de la secuencia de aminoácidos de cada Región variable de cadena L (específicamente, la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína madura a partir de la cual se elimina una porción de péptido de señal)).
La secuencia de aminoácidos subrayada en la K5-70 VL indica una secuencia de la CDR determinada de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Además, el número en la posición superior de la secuencia de aminoácidos indica el número de posición de un aminoácido determinado de acuerdo con las definiciones mencionadas anteriormente de Kabat et al.. Cada secuencia de la CDR en la VL de L41174 se expresa con el símbolo y así se omite la descripción. Puesto que el aminoácido subrayado en la HuK5-70 VL se asumió para ser importante para el mantenimiento de la estructura de las CDR, se mantuvo la secuencia de la K5-70 VL.
La Figura 43 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 65) de la región variable de cadena H de un clon T6-16 (T6-16 VH), las secuencias de aminoácidos (SEC DE ID NOS: 79 y 81, respectivamente) de las regiones variables de cadena H de dos tipos de T6-16 humanizado (HuT6-16 VH 1 y HuT6-16 VH2), y de la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 89) de la región variable de cadena H de un aceptor (Número de acceso de Genbank DA935238; SEC DE ID NO: 88) usadas para la producción del anticuerpo humanizado (DA935238 VH). (Debe observarse que cada una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura indica una porción de la secuencia de aminoácidos de cada región variable de cadena H (específicamente, la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína madura a partir de la cual se elimina una porción del péptido de señal)).
La secuencia de aminoácidos subrayada en la HuT6-16 VH indica una secuencia de la CDR determinada de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Además, el número en la posición superior de la secuencia de aminoácidos indica el número de posición de un aminoácido determinado de acuerdo con las definiciones mencionadas anteriormente de Kabat et al. Cada secuencia de la CDR en la DA935238 VH se expresa con el símbolo y así se omite la descripción. Puesto que los aminoácidos subrayados en la HuT6-16 VH1 y la HuT6-16 VH2 se asumieron para ser importantes para el mantenimiento de la estructura de CDR, se mantuvo la secuencia de la T6-16 VH. Además, la Usina (K) en la posición 73 en la HuT6-16 VH1 fue sustituida con una treonina (T) derivada a partir de DA935238 como una secuencia aceptora en la HuT6-16 VH2.
La Figura 44 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 70) de la región variable de cadena L de un clon T6-16 (T6-16 VL, por sus siglas en inglés), la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 83) de la región variable de cadena L de un T6-16 humanizado (HuT6-16 VL, por sus siglas en inglés), y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 91; Número de acceso de Genbank AAA60341) de la región variable de cadena L de un aceptor (Número de acceso de Genbank M99608; SEC DE ID NO: 90) usadas para la producción del anticuerpo humanizado (M99608 VL). (Debe observarse que cada una de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura indica una porción de la secuencia de aminoácidos de cada región variable de cadena L (específicamente, la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína madura a partir de la cual se elimina una porción del péptido de señal)).
La secuencia de aminoácidos subrayada en la T6-16 VL indica una secuencia de la CDR determinada de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Además, el número en la posición superior de la secuencia de aminoácidos indica el número de posición de un aminoácido determinado de acuerdo con las definiciones mencionadas anteriormente de Kabat et al. Cada secuencia de la CDR en la M99608 VL se expresa con el símbolo y así se omite la descripción.
La Figura 45 muestra la secuencia del gen (SEC DE ID NO: 74) y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 75) de la HuK5-70 VH.
La posición superior de cada línea indica que la secuencia del gen (secuencia del ADNc) y la posición inferior del mismo indica la secuencia de aminoácido. En la secuencia de aminoácido, una porción del péptido de señal se subraya con una línea discontinua y cada secuencia de la CDR (1 a 3 CDR) se subrayan con una línea continua (la secuencia de aminoácidos de solamente la porción de proteína madura, a partir de la cual se elimina la porción del péptido de señal, se muestra en la SEC DE ID NO: 92). Un sitio de EcoRI (GAA TTC) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) se agregaron al extremo 5' del gen de la HuK5-70 VH, y un sitio de Nhel (GCT AGC) se agregó al extremo 3' del mismo.
La Figura 46 muestra la secuencia del gen (SEC DE ID NO: 76) y las secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 77) de la HuK5-70 VL.
La posición superior de cada línea indica la secuencia del gen (secuencia del ADNc) y la posición inferior de la misma indica la secuencia de aminoácido. En la secuencia de aminoácidos, una porción del péptido de señal se subraya con una línea discontinua y cada secuencia de la CDR (1 a 3 CDR) se subrayan con una línea continua (la secuencia de aminoácidos de solamente la porción de proteína madura, a partir de la cual se elimina la porción del péptido de señal, se muestra en la SEC DE ID NO: 93). Un sitio de Agel (ACC GGT) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) se agregaron al extremo 5' del gen de la HuK5-70 VL, y un sitio de BsiWI (CGT ACG) se agregó al extremo 3' de la misma.
La Figura 47 muestra la secuencia del gen (SEC DE ID NO: 78) y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 79) de la HuT6-16 VH 1.
La posición superior de cada línea indica que la secuencia del gen (secuencia del ADNc) y la posición inferior de la misma indica la secuencia de aminoácidos. En la secuencia de aminoácido, una porción del péptido de señal se subraya con una línea discontinua y cada secuencia de la CDR (1 a 3 CDR) se subrayan con una línea continua (la secuencia de aminoácidos de solamente la porción de proteína madura, a partir de la cual se elimina la porción del péptido de señal, se muestra en la SEC DE ID NO: 94). Un sitio de EcoRI (GAA TTC) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) se agregaron al extremo 5' del gen de HuT6-16 VH1, y un sitio de Nhel (GCT AGC) se agregó al extremo 3' de la misma.
La Figura 48 muestra la secuencia del gen (SEC DE ID NO: 80) y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 81) de la HuT6-16 VH2.
La posición superior de cada línea indica la secuencia del gen (secuencia del ADNc) y la posición inferior de la misma indica la secuencia de aminoácidos. En la secuencia de aminoácidos, una porción del péptido de señal se subraya con una línea discontinua y cada secuencia de la CDR (1 a 3 CDR) se subrayan con una línea continua (la secuencia de aminoácidos de solamente la porción de proteína madura, a partir de la cual se elimina la porción del péptido de señal, se muestra en la SEC DE ID NO: 95). Un sitio de EcoRI (GAA TTC) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) se agregaron al extremo 5' del gen de la HuT6-16 VH2, y un sitio de Nhel (GCT AGC) se agregó al extremo 3' de la misma.
La Figura 49 muestra la secuencia del gen (SEC DE ID NO: 82) y la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 83) de la HuT6-16 VL.
La posición superior de cada línea indica que la secuencia del gen (secuencia del ADNc) y la posición inferior de la misma indica la secuencia de aminoácidos. En la secuencia de aminoácidos, una porción del péptido de señal se subraya con una línea discontinua y cada secuencia de la CDR (1 a 3 CDR) se subrayan con una línea continua (la secuencia de aminoácidos de solamente la porción de proteína madura, a partir de la cual se elimina la porción del péptido de señal, se muestra en la SEC DE ID NO: 96). Se agregaron un sitio de Agel (ACC GGT) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) al extremo 5' extremo del gen de la HuT6-16 VL, y se agregó un sitio de BsiWI (CGT ACG) al extremo 3' de la misma.
La Figura 50 muestra los resultados obtenidos confirmando la expresión del anticuerpo HuK5-70, del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2.
Figura 50(A) Los vectores de expresión pFUSE-CHIg- HuK5-70 y pFUSE2-CLIg-HuK5-70 se introdujeron en las células 293F, y la expresión del anticuerpo HuK5-70 en el sobrenadante de cultivo se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western. La banda 1 indica el sobrenadante de cultivo de las células 293F en las cuales ninguno de los genes se introdujeron (control negativo), y la banda 2 indica el sobrenadante de cultivo de las células 293F en las cuales los vectores de expresión anteriormente mencionados se introdujeron. Se detectaron las proteínas de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo HuK5-70 con un anticuerpo F(ab')2 de IgG etiquetada con biotina anti-humana.
Figura 50(B) Se introdujeron los vectores de expresión pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (banda 3), y los vectores de expresión pFUSE-CHIg-HuT6-16-2 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (banda 4), en células 293F en estas combinaciones. Entonces, se analizó la expresión del anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se detectaron las proteínas de cadena pesada del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2 con un anticuerpo Fe de IgG etiquetada con biotina anti-humana, y se detectaron las proteínas de cadena ligera del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2 con un anticuerpo F(ab')2 de IgG etiquetada con biotina anti-humana.
La Figura 51 muestra los resultados obtenidos tiñendo el anticuerpo HuK5-70 purificado, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 con Coomassie.
Se cargaron el anticuerpo HuK5-70 purificado (banda 1), el anticuerpo HuT6-16-1 (banda 2) y el anticuerpo HuT6-16-2 (banda 3) en cantidades de 1 pg cada uno en SDS-PAGE, y después se tiñeron con Coomassie.
La Figura 52 muestra los resultados obtenidos analizando la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo HuK5-70, del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2, al usar un citómetro de flujo.
Se analizó la reactividad de cada anticuerpo mostrada en la Figura con células HEK293-hTROP-2 (Figura 52A) y células PK-59 (Figura 52B) mediante FACS. El anticuerpo secundario solamente se usó como un control negativo (lleno), y se indicó la reactividad de cada anticuerpo con una línea gris.
La Figura 53 muestra los resultados obtenidos midiendo la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo HuK5-70 de acuerdo con un método de ELISA.
La capacidad de unión al antígeno del anticuerpo K5-70 y del anticuerpo HuK5-70 se analizó de acuerdo con un método de ELISA cubierto con antígeno. El símbolo ? indica los resultados de la medición del anticuerpo K5-70, y el símbolo f indica los resultados de la medición del anticuerpo HuK5-70.
La Figura 54 muestra los resultados obtenidos midiendo la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2 de acuerdo con un método de ELISA.
Se analizó la capacidad de unión al antigeno del anticuerpo T6-16, del anticuerpo HuT6-16-1 y del HuT6-16-2 de acuerdo con un método de ELISA cubierto con antígeno. El símbolo ? indica los resultados de la medición del anticuerpo T6-16, el símbolo indica los resultados de la medición del anticuerpo HuT6-16-1, y el símbolo |indica los resultados de la medición del anticuerpo HuT6-16-2.
La Figura 55 muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado (anticuerpo HuK5-70) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480 del cáncer de colon humano.
La Figura 55A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f : PBS) y en un grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 (10 mg/kg de peso corporal) ( )) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 55B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 39VD día (día 39) (Día final de experimento) en la prueba de la Figura 55A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 56 muestra la actividad antitumoral dependiente de dosis de un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado (HuK5-70) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480 del cáncer de colon humano.
La Figura 56A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: PBS) y en los grupos de una administración de anticuerpo HuK5-70 (Q : 1 mg/kg de peso corporal, ?: 5 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 56B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 48v0 día (día 48) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 56A. ** p < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 57 muestra la actividad antitumoral dependiente de dosis de un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado (HuT6-16-2) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células SW480 del cáncer de colon humano.
La Figura 57A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: PBS) y en los grupos de una administración de anticuerpo HuT6-16-2 (Q : 1 mg/kg de peso corporal, ?: 5 mg/kg de peso corporal, C : 10 mg/kg de peso corporal) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 57B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 48v0 día (día 48) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 57A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 58 muestra la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-hTROP-2 de ratón (K5-70 y T6-16) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células del cáncer ovárico SK-OV-3 humano.
La Figura 58A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: PBS), en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (?' ^ en un 9ruP° de administración de anticuerpo T6-16 (peso corporal 10 mg/kg) (?) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 58B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 56vo día (día 56) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 58A. * P < 0.05 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 59 muestra la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-hTROP-2 de ratón (K5-70 y T6-16) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células del cáncer de mamas MDA-MB-468 humanas.
La Figura 59A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: PBS), en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (( , y en un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (peso corporal 10 mg/kg) (?) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 59B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 54v0 día (día 54) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 59A. * P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 60 muestra la actividad antitumoral de los anticuerpos anti-hTROP-2 de ratón (K5-70 y T6-16) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar células del cáncer de pulmón Calu-3 humano.
La Figura 60A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control (f: PBS), en un grupo de administración de anticuerpo 5-70 (10 mg/kg de peso corporal) ( ' v en un 9ruP° de administración de anticuerpo T6-16 (peso corporal 10 mg/kg) (?) (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. * P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 60B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 41v0 día (día 41) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 60A. * P < 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 61 muestra la actividad antitumoral de un anticuerpo K5-70 anti-hTROP-2 de ratón en modelos de prevención de xenoinjerto al usar células TFK-1 de colangiocarcinoma humano.
La Figura 61A muestra el curso de tiempo de la formación de tumores en un grupo de control ( : PBS) y en un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (( (un valor promedio ± desviación estándar). La flecha indica un período de administración de anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 61B muestra el peso de tumor trazado de cada ratón en el momento del 31v0 día (día 31) (el día final de experimento) después del trasplante de la célula cancerosa en la prueba de la Figura 61A. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 62 muestra los resultados obtenidos analizando la actividad de unión de los anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2 de acuerdo con ELISA cubierto con antígeno de baja densidad. Una placa de 96 pozos se cubrió con 0.1 pg/ml de una proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante, y después de la misma, los anticuerpos de prueba (anticuerpos K5-70, HuK5-70, T6-16 y HuT6-16-2), que habían sido preparados en concentraciones de 20 Mg/ml a una serie de diluciones de dos ceses, se dejaron reaccionar con la proteína. En la Figura 62(A), los anticuerpos K5-70 (A) y HuK5-70 ( ) se usaron como anticuerpos de prueba, y en la Figura 62(B), el anticuerpo T6-16 (A) y HuT6-16-2 ( ) se usaron como anticuerpos de prueba.
La Figura 63 muestra los resultados obtenidos analizando la actividad de unión de los anticuerpos hTROP-2 a K5-70 y HuK5-70 mediante ELISA. Se cubrió una placa de 96 pozos con los anticuerpos K5-70 y HuK5-70 a través de la IgG anti-ratón (cadena ? específica) y la lgG1 anti-humana (Fcy específico), y después de la misma, estos anticuerpos se dejaron reaccionar con las proteínas hTROP-2-EC-His, que habían sido preparadas en concentraciones de 5 Mg/ml a una serie de diluciones de dos veces. Se detectó la unión de tal proteína de hTROP-2-EC-His al usar un anticuerpo anti-etiqueta Su.
(A) Anticuerpo K5-70 y ( ) anticuerpo HuK5-70.
La Figura 64 muestra la secuencia de nucleótidos (casi superior; SEC DE ID NO: 99) y secuencia de aminoácidos (caso inferior; SEC DE ID NO: 35) de un gen de K5-70 VH que se preparó mediante síntesis de gen. Con respecto a esta secuencia de nucleótidos, se agregaron un sitio de EcoRI (GAA TTC) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) al extremo 5", se agregó un sitio de Nhel (GCT AGC) al extremo 3'. La secuencia de aminoácidos es mostrada por el código de una sola letra. Un péptido de señal en el lado N-terminal se muestra en itálicas. La glutamina doble subrayada (Q) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD, y TSMADY) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Número de Publicación 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR del clon K5-70 VH se muestran en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, respectivamente.
La Figura 65 muestra la secuencia de nucleótidos (caso superior; SEC DE ID NO: 100) y secuencia de aminoácidos (caso inferior; SEC DE ID NO: 40) de un gen de K5-70 VL que se preparó mediante síntesis de gen. Con respecto a esta secuencia de nucleótidos, se agregaron un sitio de Agel (ACC GGT) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) al extremo 5', y se agregó un sitio de BsiWI (CGT ACG) al extremo 3'. La secuencia de aminoácidos es mostrada por el código de una sola letra. Un péptido de señal en el lado N-terminal se muestra en itálicas. El ácido aspártico doble subrayado (D) indica el residuo del aminoácido N-terminal de un péptido maduro. Se determinaron las secuencias de la CDR (subrayadas; RASQSIG TSIH, YASESIS, y QQSNSWPFT) de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (como se describe anteriormente, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Se muestran las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR del clon de K5-70 VL en las SEC DE ID NOS: 41 a 43, respectivamente.
La Figura 66 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ChK5-70, HuK5-70, HuVH/MuVL (en los cuales se sustituye la VL del anticuerpo HuK5-70 con la VL del anticuerpo K5-70) y MuVH/HuVL (en el cual se sustituye la VH del anticuerpo HuK5-70 con la VH del anticuerpo K5-70) a hTROP-2. Se cubrió una placa de 96 pozos con 0.1 pg/ml de una proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante. Un sobrenadante de cultivo de las células, en las cuales los anticuerpos de prueba (anticuerpos ChK5-70, HuK5-70, HuVH/MuVL y MuVH/HuVL) habían sido expresados transitoriamente, se diluido para dar lugar a concentraciones de anticuerpo de 1, 0.1, 0.01 y 0.001 pg/ml. Así, los anticuerpos de prueba diluidos se dejaron reaccionar con el antígeno. (A) Anticuerpo ChK5-70, (?) anticuerpo MuVH/HuVL, (Q) anticuerpo HuVH/MuVL y ( ) anticuerpo HuK5-70.
La Figura 67 muestra las secuencias de aminoácidos de la HuK5-70 VH y sus mutantes de sustitución de aminoácidos. Los aminoácidos se muestran por el código de una sola letra. El aminoácido de cada mutante de sustitución de aminoácidos, que es la misma que la HuK5-70 VH, se indica con el símbolo y solamente los aminoácidos sustituidos son mostrados por el código de una sola letra. El número en la posición superior de la secuencia indica un número de aminoácidos (Kabat et al., 1991).
La Figura 68 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ChK5-70, HuK5-70, A40R de la HuK5-70 VH (un mutante en el cual la alanina en la posición 40 de la VH del anticuerpo HuK5-70 se sustituye con una arginina) y R44G de la HuK5-70 VH (un mutante en el cual la arginina en la posición 44 de la VH del anticuerpo HuK5-70 se sustituye con una glicina) a hTROP-2. Se cubrió una placa de 96 pozos con 0.1 pg/ml de una proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante. Un sobrenadante de cultivo de las células, en las cuales los anticuerpos de prueba (anticuerpos ChK5-70, HuK5-70, A40R de la HuK5-70 VH y R44G de la HuK5-70 VH) habían sido expresados transitoriamente, se diluyó para dar lugar a concentraciones de 0.5 Mg/ml a una serie de diluciones de dos veces (seis muestras). Así, los anticuerpos de prueba diluidos se dejaron reaccionar con el antígeno. (A) Anticuerpo ChK5-70, (?) anticuerpo R44G de la HuK5-70 VH, iQ) anticuerpo A40R de la HuK5-70 VH y (f) anticuerpo HuK5-70.
La Figura 69 muestra la secuencia de nucleótidos (caso superior) y la secuencia de aminoácidos (caso inferior) de un gen R44G de la HuK5-70 VH que se preparó mediante síntesis de gen. Con respecto a esta secuencia de nucleótidos, se agregaron un sitio de EcoRI (GAA TTC) y una secuencia de Kozak (ACC ACC) al extremo 5' extremo, y se agregó un sitio de Nhel (GCT AGC) al extremo 3'. La secuencia de aminoácidos es mostrada por código de una sola letra. Un péptido de señal en el lado N-terminal se muestra en itálicas. El aminoácido (Q: glutamina) en el lado N-terminal de la VH madura doble-subrayada, y se subrayaron las secuencias de CDR (Kabat et al., 1991).
La Figura 70 muestra SDS-PAGE realizado en un anticuerpo HuK5-70-2 purificado. Se cargó el anticuerpo HuK5-70-2 (1 g) en 11% de un gel de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Banda 1: un marcador de peso molecular (Precisión Plus Dual Standard (BIO-RAD)), banda 2: un anticuerpo HuK5-70-2. El valor numérico en el lado izquierdo de la figura indica un peso molecular.
La Figura 71 muestra la actividad de unión de los anticuerpos K5-70, HuK5-70 y HuK5-70-2 a hTROP-2. Se cubrió una placa de 96 pozos con una proteína recombinante de 0.1 µg/ml de hTACSTD2-Fc-His. Se diluyeron los anticuerpos de prueba purificados (anticuerpos K5-70, HuK5-70 y HuK5-70-2) para dar lugar a concentraciones a partir de 1 pg/ml a una serie de diluciones de dos veces (diez muestras). Así, los anticuerpos de prueba diluidos se dejaron reaccionar con antígeno. (¦) anticuerpo K5-70, (?) anticuerpo HuK5-70-2, y (f) anticuerpo HuK5-70.
La Figura 72A muestra la actividad de ADCC de anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (columna abierta: HuK5-70, y columna llena: HuT6-16-2). Más específicamente, un anticuerpo HuK5-70 y un anticuerpo HuT6-16-2 (que están en concentraciones de 0, 0.1, 0.3, 1, 3, y 10 pg/ml) y se agregaron los monocitos de sangre periférica humana sanos a una línea celular SW480 del cáncer de colon humano, y entonces se cultivaron durante 6 horas. Después de lo anterior, se midió la actividad de LDH liberado en el sobrenadante de cultivo, de modo que la actividad de ADCC pudiera medirse (un valor promedio ± desviación estándar (N = 3), efector/objetivo (E/T) = 40). La concentración del anticuerpo que es 0 indica la no-adición del anticuerpo. *P< 0.05, ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 72B muestra la actividad de ADCC de los anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (columna abierta: HuK5-70, columna gris: HuK5-70-2, y columna llena: HuT6-16-2). Más específicamente, un anticuerpo HuK5-70, un anticuerpo HuK5-70-2 y un anticuerpo HuT6-16-2 (que estaban en concentraciones de 0, 0.3, 1, 3, 10 y 30 pg/ml) y se agregaron los monocitos de sangre periférica humana sanos a una línea celular de cáncer pancreático humano (PK-59), y entonces se cultivaron durante 6 horas. Después de lo anterior, se midió la actividad de LDH liberado en el sobrenadante de cultivo, de modo que la actividad del ADCC pudiera ser medida (un valor promedio ± desviación estándar (N = 3), efector/objetivo (E/T) = 40). La concentración del anticuerpo que es 0 indica la no-adición del anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
La Figura 72C muestra la actividad de ADCC de los anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (columna abierta: HuK5-70, columna gris: HuK5-70-2, y columna llena: HuT6-16-2). Más específicamente, un anticuerpo HuK5-70, un anticuerpo HuK5-70-2 y un anticuerpo HuT6-16-2 (que estaban en concentraciones de 0, 0.3, 1, 3, 10 y 30 pg/ml) y se agregaron los monocitos de sangre periférica humana sanos a una línea celular del cáncer de próstata humano (PC-3), y entonces se cultivaron durante 6 horas. Después de lo anterior, se midió la actividad de LDH liberado en el sobrenadante de cultivo, de modo que la actividad de ADCC pudiera ser medida (un valor promedio ± desviación estándar (N = 3), efector/objetivo (E/T) = 40). La concentración del anticuerpo que es 0 indica la no-adición del anticuerpo. ** P < 0.01 (mediante la prueba t de Student).
Descripción Detallada de la Invención Más abajo, la presente invención será descrita detalladamente. Las siguientes descripciones no se proponen para limitar el alcance de la presente invención. Con excepción de los siguientes ejemplos, la presente invención puede modificarse y puede realizarse, como se apropiado, dentro de un intervalo que no deteriore la intención de la presente invención La presente especificación incluye todo el contenido como se describe en la especificación del Número de Solicitud de Patente Provisional Americana 61/562,672 (presentado el 22 de noviembre de 2011), que es un documento de prioridad de la presente solicitud.
Además, todas las publicaciones citadas en la presente especificación, que incluyen documentos de la técnica anterior y documentos de patente como publicaciones de solicitud pendiente y publicaciones de patente, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. 1. Breve Descripción de la Invención Como se menciona anteriormente, TROP-2 humano (hTROP-2) es una simple transmembrana, proteína de membrana tipo 1 que tiene una longitud completa de 323 residuos de aminoácidos. Se ha conocido que un gen hTROP-2 y un producto de gen del mismo están expresados en varios tipos de células cancerosas.
Como se menciona anteriormente, se ha deseado para desarrollar un anticuerpo anti-hTROP-2 (un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2) o similares que tenían alta actividad antitumoral in vivo. Bajo tales circunstancias, el presente inventor realizó una evaluación a través de un número extremadamente grande de clones, y como resultado, el inventor tuvo éxito en obtener un clon que tenía alta actividad antitumoral in vivo. Específicamente, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal, que reconoce específicamente la región extracelular de hTROP-2 in vivo, y particularmente, un anticuerpo monoclonal que exhibe alta afinidad en un orden de picomol (pM, por sus siglas en inglés). El anticuerpo de la presente invención es extremadamente útil en que es un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (particularmente, un anticuerpo humanizado), que exhibe actividad inhibidora del crecimiento de tumor significante a una dosis inferior que la del anticuerpo anti-hTROP-2 existente (por ejemplo, a una dosis de 1/20) cuando se administra solo como un anticuerpo desnudo, y que también exhibe actividad inhibidora del crecimiento de tumor significante en los modelos del tratamiento de ratón que contiene el tumor, en los cuales se usan tipos múltiples de células cancerosas humanas. 2. Producción del anticuerpo anti-hTROP-2 (1) Preparación del antígeno Información con respecto a la secuencia de aminoácidos (SEC DE ID NO: 2) de hTROP-2 se describe bajo el "Número de acceso NP_002344" en el sitio Web de, por ejemplo, NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Información con respecto a una secuencia de nucleótidos (SEC DE ID NO: 1) que codifica la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 se describe bajo el "Número de acceso NM_002353" en el mismo sitio Web como se describe anteriormente.
Como un antígeno, un polipéptido o un péptido (que también se refieren solamente como un péptido) que comprende por lo menos una porción (el entera o una parte) de la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 puede ser usado, y preferiblemente, un péptido que comprende por lo menos una porción (la entera o una pieza) de la secuencia de aminoácidos de la región extracelular de hTROP-2 puede ser usado. La región extracelular (que incluye un péptido de señal) de hTROP-2 indica una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 1 a 274 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 2 (el péptido de señal: los aminoácidos en las posiciones 1 a 26). En la presente, con respecto a un péptido usado como un antígeno, la descripción anterior "por lo menos una porción de la secuencia de aminoácido" no está particularmente limitada en términos de longitud. Por ejemplo, una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 1 a 145 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 2, una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 146 a 274 de la misma secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente, y similares son preferibles.
Un péptido usado como un antígeno se puede producir mediante síntesis química, o mediante síntesis de acuerdo con un método de ingeniería genética al usar Escherichia Coli o similares. Puede aplicarse un método bien conocido por los expertos en la técnica.
Cuando un péptido es producido mediante síntesis química, puede sintetizase mediante un método de síntesis de péptido bien conocido. Además, ya sea un método de síntesis en fase sólida o un método de síntesis en fase líquida puede aplicarse a la síntesis de péptido. Un sintetizador de péptido comercialmente disponible (por ejemplo, PSSM-8 fabricado por Shimadzu Corporation, etc.) puede también usarse.
Cuando un péptido es sintetizado mediante un método de ingeniería genética, primero, se diseña y se sintetiza el ADN que codifica el péptido. El diseño y la síntesis de tal ADN se pueden realizarse de acuerdo con un método de PCR, al usar un vector que comprende un gen hTROP-2 de longitud completa o similares como un molde, y también al usar las cebadores diseñados para poder sintetizar una región de ADN deseada. Después de lo anterior, se liga el ADN a un vector adecuado para obtener un vector recombinante usado para la expresión de proteína, y este vector recombinante entonces se introduce en un huésped para de modo que puede expresarse un gen de interés en el mismo, de tal modo obteniendo un transformante (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
Como vector, se usa un fago o un plásmido capaz de replicarse autónomamente en un microorganismo de huésped. Además, un virus animal o un vector del virus de insecto pueden también usarse. Para producir un vector recombinante, un ADN purificado puede separarse con enzimas de restricción adecuadas, y la porción de ADN así separada puede entonces insertarse en el sitio de la enzima de restricción o similares de un ADN de vector adecuado, así como para ligarla al vector. El tipo de un huésped usado en la transformación no está particularmente limitado, mientras pueda expresar un gen de interés. Los ejemplos de tal huésped incluyen bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras, células animales (células COS, células CHO, etc.), células de insectos, e insectos. Un mamífero como una cabra puede también usarse como tal huésped. Un método para introducir un vector recombinante en un huésped se conoce públicamente.
Se cultiva el transformante descrito antes, y un péptido usado como un antígeno entonces se recolecta del cultivo. El término "cultivo" se usa en la presente para entender (a) un sobrenadante de cultivo, y (b) células cultivadas, una masa de células cultivadas o un producto desintegrado del mismo.
Después de la terminación del cultivo, cuando se produce un péptido de interés en una masa de células o en células, el péptido es extraído desintegrando la masa de células o las células. Por una parte, cuando un péptido de interés se produce fuera de una masa de células o de células exteriores, una solución de cultivo se usa directamente, o la masa de células o las células se eliminan de la solución de cultivo mediante centrifugación o similares. Después de lo anterior, el péptido de interés se puede aislar y purificar mediante un simple uso de métodos bioquímicos usados comúnmente en el aislamiento y la purificación de péptidos, como precipitación de sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, o combinando apropiadamente los métodos bioquímicos anteriormente mencionados.
En la presente invención, un péptido usado como un antígeno puede también obtenerse mediante la traducción in vitro al usar un sistema de síntesis libre de células. En este caso, dos métodos, es decir, pueden aplicarse un método al usar ARN como un molde y un método al usar el ADN como un molde (transcripción/traducción). Como un sistema de síntesis libre de células, puede usarse un sistema comercialmente disponible, como el sistema de Expressway™ (Invitrogen), PURESYSTEM (marca registrada; Post Genome Institute) o sistema de TNT (marca registrada; Promega).
El péptido así obtenido puede unirse a una proteína de portador adecuado como albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH, por sus siglas en inglés), tiroglobulina humana o ?-globulina de pollo.
Por otra parte, el antígeno puede ser un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que comprende una supresión, sustitución o adición de uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 (SEC DE ID NO: 2) o una secuencia parcial del mismo como se describe anteriormente. Allí puede usarse, por ejemplo, un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos, en la cual se suprimen una o más (preferiblemente una o varias (por ejemplo, 1 a 10, y preferiblemente 1 a 5)) aminoácidos, se sustituyen o uno o más (preferiblemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10, y preferiblemente 1 a 5)) aminoácidos con otros aminoácidos, se agregan o uno o más (preferiblemente uno o varios (por ejemplo, 1 a 10, y preferiblemente 1 a 5)) otros aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 o a una secuencia parcial del mismo.
En la presente invención, un gen que se introducirán en una célula o similares es un gen que codifica una proteína hTROP-2 o un fragmento parcial del mismo, o una proteína muíante del mismo o un fragmento del mismo. Como tal gen, un gen que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC DE ID NO: 1 o una secuencia parcial del mismo puede usarse, por ejemplo.
Además, como gen que se introducirá en una célula o similares, allí se puede también usar una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones rigurosas con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC DE ID NO: 1 y codifica una proteína que tiene actividad de hTROP-2, o una secuencia parcial del mismo.
La descripción "condiciones rigurosas" se usa en la presente para entender las condiciones de lavado después de la terminación de la hibridación. Como tales condiciones rigurosas, una concentración de sal (sodio) en amortiguador es 10 a 500 mM y una temperatura es 42°C a 72°C, y preferiblemente, la condición de sal anteriormente mencionada es 50 a 300 mM y una temperatura es 55°C a 68°C.
La mutación puede introducirse en un gen de acuerdo con un método conocido como un método de Kunkel o un método doble de Gapped, al usar, por ejemplo, un kit de introducción de mutación que usa mutagénesis dirigida al sitio, como sistema de Mutagénesis Dirigida al Sitio de GeneTailor™ (fabricado por Invitrogen) o Sistema de La Mutagénesis Dirigida al Sitio de TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.; fabricado por Takara Bio Inc.). (2) Producción de anticuerpo policlonal El antígeno preparado se administra a un mamífero para inmunización. El tipo de tal mamífero no está particularmente limitado. Por ejemplo, una rata, un ratón y un conejo pueden usarse, y entre ellos, un ratón es preferible.
La dosis del antígeno por animal puede determinarse, como sea apropiado, dependiendo de la presencia o de la ausencia de un adyuvante. Los ejemplos de tal adyuvante incluyen un adyuvante completo de Freund (FCA, por sus siglas en inglés), un adyuvante incompleto de Freund (FIA, por sus siglas en inglés) y un adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización puede realizarse principalmente inyectando el antígeno en la vena, la almohadilla plantar, la hipodermis o la cavidad abdominal de un animal. Además, el intervalo de inmunización no está particularmente limitado, y la inmunización se realiza a intervalos de varios días a varias semanas, preferiblemente a intervalos de 1 semana, 1 a 10 veces, y preferiblemente 2 o 3 veces. Tres a siete días después del día final de inmunización, un título de anticuerpo es medido mediante inmunoensayo de enzima (ELISA o EIA), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) u otros métodos. La fecha en la cual se obtiene un título de anticuerpo deseado, la sangre puede recolectarse para obtener el antisuero. En el método descrito antes de recolectar un anticuerpo, si es necesario purificar el anticuerpo, el anticuerpo puede purificarse seleccionando un método adecuado de los métodos conocidos como precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad, o combinando los métodos anteriormente mencionados, como sea apropiado. Después de lo anterior, es medida la reactividad de un anticuerpo policlonal en el antisuero mediante el método de ELISA o similares. (3) Producción de anticuerpo monoclonal (3-1) Recolección de células productoras de anticuerpo El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención no está limitado, pero es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
El antígeno preparado se administra a un mamífero, como una rata, un ratón o un conejo, para inmunización. La dosis del antígeno por animal puede determinarse, como sea apropiado, dependiendo de la presencia o de la ausencia de un adyuvante. Los mismos adyuvantes como se describen anteriormente pueden usarse en la presente. También, los mismos métodos de inmunización como se describe anteriormente pueden aplicarse en la presente. Uno a sesenta días, y preferiblemente, uno a catorce días después del día final de inmunización, se recolectan las células productoras de anticuerpo. Los ejemplos de tales células productoras de anticuerpo incluyen células esplénicas, células de nodulos linfáticos y células de sangre periférica. De éstas, las células de nodulos linfáticos y las células esplénicas son preferibles. (3-2) Fusión celular Para obtener hibridomas (una línea celular productora de anticuerpo), se realiza la fusión celular de células productoras de anticuerpo con células de mieloma. Como células de mieloma que se fusionarán con células productoras de anticuerpo, pueden usarse las células establecidas comúnmente disponibles de animales como ratones. La línea celular usada en la presente es preferiblemente una línea celular, que tiene selectividad de fármaco, no puede sobrevivir en un estado no fusionado en un medio selectivo de HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina), y puede sobrevivir solamente en un estado fusionado con células productoras de anticuerpo.
Los ejemplos de células de mieloma incluyen líneas celulares de mieloma de ratón como P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1 (P3U1), P3/NS 1/1 -Ag4-1 (NS1) y Sp2/0-Ag14 (Sp2/0). Las células de mieloma pueden seleccionarse, mientras se toma en consideración la compatibilidad con células productoras de anticuerpo, como sea apropiado.
Posteriormente, las células de mieloma se fusionan con células productoras de anticuerpo. Para tal fusión celular, las células productoras de anticuerpo (1 ? 106 a 1 ? 107 células/ml) se mezclan con células de mieloma (2 ? 105 a 2 ? 106 células/ml) en un medio para células animales, como DMEM o un medio RPMI-1640 que no contiene suero. No está limitada la relación de células entre las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma (células productoras de anticuerpo: células de mieloma). En general, la relación de células es preferiblemente 1 :1 a 10:1 , y preferiblemente 3:1. Después de lo anterior, una reacción de fusión se realiza en presencia de un promotor de fusión celular. Como tal promotor de fusión celular, puede usarse el polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de 1,000 a 6,000 Dalton (D) o similares. Además, es también posible fusionar células productoras de anticuerpo con células de mieloma, empleando un aparato de fusión celular comercialmente disponible que usa estimulación eléctrica (por ejemplo, electroporación) . (3-3) Selección y clonación de hibridomas Los hibridomas de interés se seleccionan a partir de células después del tratamiento de fusión celular. Como un método para seleccionar hibridomas, se diluye la suspensión de células apropiadamente con, por ejemplo, un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal, y la solución diluida entonces se dispersa en una placa de microtitulación. Después de lo anterior, un medio selectivo se agrega a cada pozo. Mientras que el medio selectivo se intercambia apropiadamente por uno recién preparado, se realiza el cultivo. Como un resultado, aproximadamente 14 días después de la iniciación del cultivo en el medio selectivo, el crecimiento celular a partir del medio selectivo puede obtenerse como hibridomas.
Posteriormente, se realiza la evaluación para examinar si o no un anticuerpo que reacciona con hTROP-2 está presente en un sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento. La evaluación de los hibridomas puede realizarse de acuerdo con un método ordinario, y así, el método de evaluación no está particularmente limitado. Por ejemplo, una alícuota se recolecta del sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento contenidos en el pozo, y la evaluación entonces se realiza mediante ELISA, EIA, RIA o similares.
La clonación de las células fusionadas puede realizarse mediante un método de dilución limitante o similar. Un anticuerpo que muestra alta reactividad con hTROP-2 es determinado mediante citometría de flujo o similares, y un hibridoma que produce este anticuerpo entonces se selecciona. El hibridoma seleccionado se establece como un clon. (3-4) Recolección del anticuerpo monoclonal Como método para cultivar el hibridoma establecido y después de recolectar un anticuerpo monoclonal a partir del cultivo obtenido, un método de cultivo celular común, un método de formación de ascitis o similares pueden adoptarse. El término "cultivo" se usa en la presente para dar a entender que permite que los hibridomas crezcan en un plato de cultivo o una botella de cultivo, o permite que los hibridomas crezcan en la cavidad abdominal de un animal, como descrito más adelante.
En el caso del método de cultivo celular, los hibridomas se cultivan en un medio para células animales, como un medio de RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10%, un medio de MEM o un medio libre de suero, bajo condiciones de cultivo común (por ejemplo, 37°C, 5% de concentración de C02) por 7 a 14 días, y después de lo anterior, un anticuerpo puede obtenerse a partir del sobrenadante de cultivo.
En el caso del método de formación de ascitis, aproximadamente 1 ? 107 hibridomas se administra en la cavidad abdominal de un animal de la misma especie que el mamífero del cual se derivan las células de mieloma, de manera que se permiten granes cantidades de hibridomas proliferen. Después, las últimas 2 a 3 semanas, se recolectan las ascitis preferiblemente.
En los métodos de recolección de anticuerpo descritos antes, si es necesario purificar el anticuerpo, el anticuerpo puede ser purificado apropiadamente seleccionando un método adecuado a partir de métodos conocidos como precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad, o combinando los métodos anteriormente mencionados. (3-5) Selección de clon que tiene actividad antitumoral El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral in vivo.
El término "actividad antitumoral" se usa en la presente para entender la actividad de células tumorales de eliminación (células cancerosas) o la actividad de inhibir el crecimiento tumoral. Los ejemplos preferidos de tal actividad antitumoral incluyen la actividad de inhibir el crecimiento de células cancerosas y la actividad de inhibir la angiogénesis tumoral. El tipo de tumor humano (células tumorales), en el cual el anticuerpo de la presente invención puede exhibir actividad antitumoral, incluye varios tipos de tumores humanos conocidos, en los cuales la expresión de hTROP-2 se ha confirmado. El tipo de tal tumor humano no está particularmente limitado. Por ejemplo, uno o dos o más tipos seleccionados de varios tumores humanos como cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectai humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano son preferibles; y uno o dos o más tipos seleccionados de cáncer pancreático humano, de cáncer colorrectai humano, de cáncer de próstata humana, de cáncer colorrectai humano, de cáncer de mamas humanas, de cáncer de ovarios humanos y de cáncer de pulmón humano son más preferibles. El cáncer pancreático humano y/o cáncer colorrectai humano son además preferibles.
Por otra parte, el tumor descrito antes puede ser un cáncer recurrente o un cáncer metastático. El anticuerpo de la presente invención puede también exhibir excelente actividad antitumoral en estos tipos de tumores.
La presencia de actividad antitumoral in vivo se puede confirmar, por ejemplo, empleando un ratón portador de tumor (un modelo de xenoinjerto de ratón), en la hipodermis del cual se han trasplantado las células tumorales deseadas, y después administrando el anticuerpo como se obtuvo antes al ratón. En este caso, el anticuerpo puede administrarse inmediatamente después del trasplante de las células tumorales (modelos de prevención). Alternativamente, puede ser administrado después de confirmar que el tumor trasplantado ha alcanzado un volumen predeterminado (modelos de tratamiento). El método de administración no está limitado. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse una vez cada tres días, cada semana, cada diez días, o cada dos semanas, o mediante una simple administración (solamente una vez), en una dosis de 5 a 20 mg/kg de peso corporal, a través de administración intraperitoneal o similares. En el caso de modelos de prevención, la presencia o la ausencia de actividad antitumoral y el nivel de la misma puede evaluarse basada en la frecuencia de la formación de tumores y volumen tumoral. En el caso de modelos de tratamiento, la presencia o la ausencia de actividad antitumoral y el nivel del mismo puede evaluares basados en el volumen de tumor.
En la presente invención, un ejemplo preferido del anticuerpo anti-hTROP-2 que tiene actividad antitumoral in vivo es un anticuerpo en el cual las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 41 a 43, respectivamente. Un ejemplo preferido de la región V de cadena H es una región V de cadena H que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 35. Un ejemplo preferido de la región V de cadena L es una región V de cadena L que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 40.
Como otra modalidad del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención, un ejemplo preferido es un anticuerpo en el cual las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 46 a 48, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 51 a 53, respectivamente. Un ejemplo preferido de la región V de cadena H es una región V de cadena H que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 45. Un ejemplo preferido de la región V de cadena L es una región V de cadena L que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 50.
Asimismo, como una modalidad adicional del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención, un ejemplo preferido es un anticuerpo en el cual las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 56 a 58, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 61 a 63, respectivamente. Un ejemplo preferido de la región V de cadena H es una región V de cadena H que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 55. Un ejemplo preferido de la región V de cadena L es una región V de cadena L que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 60.
Asimismo, como una modalidad adicional del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención, un ejemplo preferido es un anticuerpo en el cual las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 66 a 68, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del mismo se muestran en las SEC DE ID NOS: 71 a 73, respectivamente. Un ejemplo preferido de la región V de cadena H es una región V de cadena H que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 65. Un ejemplo preferido de la región V de cadena L es una región V de cadena L que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO. 70.
En la presente invención, más específicamente, los ejemplos preferidos de un anticuerpo anti-hTROP-2 que tiene actividad antitumoral in vivo incluyen: un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-70) producido por un hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11251; un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-107) producido por un hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11252; un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: K5-116-2- 1) producido por un hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11253; un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: T6-16) producido por un hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11346; y un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (nombre del clon: T5-86) producido por un hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11254.
En la presente, el hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11251 se nombró como "hibridoma K5-70 de ratón-ratón" y depositado el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11252 se nombró como "hibridoma K5-107 de ratón-ratón" y depositado el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11253 se nombró como "hibridoma K5-116-2-1 de ratón-ratón" y depositado el 12 de mayo de 2010; el hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11346 se nombró como "hibridoma T6-16 de ratón-ratón" y depositado el 1 de marzo de 2011; y el hibridoma con el Número de acceso FERM BP-11254 se nombró como "hibridoma T5-86 de ratón-ratón" y depositado el 12 de mayo de 2010. Se depositaron todos estos hibridomas con el International Patent Organism Depositary (IPOD, por sus siglas en inglés), la National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, una Institución Administrativa Independiente bajo el Ministerio de Economía, Comercio e Industria (la AIST, Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, código postal: 305-8566).
Aún además, otro ejemplo preferido del anticuerpo anti- hTROP-2 de la presente invención es un anticuerpo anti-hTROP-2 que une a un sitio (por ejemplo, un epítopo), al cual se une un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el Número de acceso FERM BP-11251, FERM BP-1 252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 o FERM BP-11254 (reconoce).
Los ejemplos preferidos de tal epítopo serán dados en (3-6) a continuación. (3-6) Epítopo del anticuerpo anti-hTROP-2 El tipo de un epítopo (un determinante antigénico) del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención no está limitado, con tal de que sea al menos una porción de hTROP-2 como un antígeno. Por ejemplo, tal epítopo es preferiblemente por lo menos una porción de una región formada eliminando una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 252 a 260 de la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 mostrada en la SEC DE ID NO: 2, más preferiblemente por lo menos una porción de una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 1 a 69 o por lo menos una porción de una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 100 a 274 (a excepción de una región que consiste de los aminoácidos en la posición 252 a 260), y además preferiblemente por lo menos una porción de una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 27 a 69 o de una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 109 a 206. Los ejemplos preferidos particularmente del epítopo descrito antes incluyen una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 109 a 120, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 193 a 206, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 43 a 56, y una porción que comprende tal región, en la secuencia de aminoácidos de hTROP-2 mostrada en la SEC DE ID NO: 2. Ejemplos particularmente preferido adicionales incluyen una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 43 a 65, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 152 a 165, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 171 a 183, una región que consiste de los aminoácidos en las posiciones 109 a 120, y una porción que comprende tal región. Un anticuerpo anti-hTROP-2, que reconoce las regiones descritas antes (unido a las regiones o a las porciones descritas antes que comprenden tales regiones), tiene alta actividad de internalización en las células tumorales, por ejemplo, y así es extremadamente útil como un inmunoconjugado de acuerdo con lo descrito más adelante. (3-7) Características del anticuerpo anti-hTROP-2 Como se describe anteriormente, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención es un anticuerpo que tiene alta actividad antitumoral in vivo en una baja dosis. Específicamente, es preferible que el presente anticuerpo anti-hTROP-2 exhibe la actividad inhibidora del crecimiento tumoral del 50% o más (preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 90% o más, además preferiblemente 95% o más, y particularmente de manera preferible casi 100% (por ejemplo, 98% o más, o 99% o más)) en una dosis (como un anticuerpo desnudo) de 20 mg/kg de peso corporal o menos (preferiblemente 10 mg/kg de peso corporal o menos, más preferiblemente 5 mg/kg de peso corporal o menos, y además preferiblemente 1 mg/kg de peso corporal o menos) con respecto a un modelo animal portador de tumor.
En la presente, puede calcularse la actividad inhibidora del crecimiento tumoral (%), por ejemplo, mediante la siguiente fórmula: La actividad inhibidora del crecimiento tumoral (%) = 100 -[(volumen tumoral o masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo)/(volumen tumoral o masa de tumor del grupo de control)] ? 100 Además, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención tiene preferiblemente actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas celulares de tumor humano. El tipo de tal línea celular de tumor humano no está limitado. Por ejemplo, tales líneas celulares de tumor humano son por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de varios tipos de líneas celulares de cáncer pancreático humano, de líneas celulares humanas del cáncer de próstata, de líneas celulares cáncer colorrectal humano, de líneas celulares de cáncer de mamas humanas, de líneas celulares de cáncer ovárico humano, de líneas celulares de cáncer de pulmón humano y de líneas celulares de colangiocarcinoma humano. Específicamente, los ejemplos preferidos de tales líneas celulares de tumor humano incluyen por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de una línea celular de cáncer pancreático humano PK-59, una línea celular de cáncer pancreático humano BxPC-3, una línea celular de cáncer pancreático humano KP-3L, una línea celular de cáncer pancreático humano P-2, una línea celular de cáncer pancreático humano PK-1, una línea celular de cáncer pancreático humano PK-45H, una linea celular de cáncer pancreático humano PK-45P, una línea celular de cáncer pancreático humano TCC-PAN2, una línea celular de cáncer pancreático humano SUIT-2, una línea celular de cáncer de colon humano CACO-2, una línea celular de cáncer de colon humano SW480, una línea celular de cáncer de colon humano DLD-1, una línea celular de cáncer de colon humano HCT 116, una línea celular de cáncer de mamas humanas JIMT-1, una línea celular de cáncer de mamas humanas HCC1143, una línea celular de cáncer de mamas humanas MCF-7, una línea celular de cáncer de mamas humanas MBA-MD-468, una línea celular de cáncer de próstata humana DU145, una línea celular de cáncer de próstata humana PC-3, una línea celular de cáncer de ovarios humanos SK-OV-3, una línea celular de cáncer de pulmón humano Calu-3 y una línea celular de colangiocarcinoma humano TFK-1. De éstos, como dos o más tipos de líneas celulares de tumor humano descritos antes, por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de la línea celular humana PK-59 del cáncer pancreático, la línea celular BxPC-3 de cáncer pancreático humano, la línea celular de SW480 de cáncer de colon humano, la línea celular Calu-3 de cáncer de pulmón humano, la línea celular MBA- D-468 de cáncer de mamas humanas y la línea celular SK-OV-3 de cáncer ovárico humano son más preferibles.
Por otra parte, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención tiene un constante de disociación (valor de Kd) de preferiblemente 1.0 * 10"10 o menos, más preferiblemente 1.0 * 10"11 M o menos, y además preferiblemente 1.0 * 10"12 M o menos. En la presente, la capacidad de unión (afinidad) del anticuerpo se puede medir en la forma de una constante de disociación (valor de Kd), una constante de velocidad de disociación (Kdiss [1/Seg]) o una constante de velocidad de asociación (Kass [1/M.Seg]), por ejemplo, mediante análisis de Scatchard o sensor de resonancia de plasmón de superficie llamado Biacore. Como tales aparatos de Biacore, pueden usarse Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J y Biacore Q (que se fabricaron por Biacore), por ejemplo. Es preferible que el anticuerpo tenga una constante de disociación (valor de Kd) que sea tan pequeña como sea posible debido a que podría tener alta capacidad de unión (afinidad). Es determinado el valor de Kd basado en los dos parámetros de Kdiss y de Kass, y puede expresarse en la fórmula: Kd[M] = Kdiss/Kass. Como un método para calcular el valor de Kd, el método descrito en los Ejemplos como se describen más adelante (específicamente, el Ejemplo 10) puede adoptarse preferiblemente. (4) Anticuerpo y fragmento de anticuerpo genéticamente recombinantes (4-1) Anticuerpo genéticamente recombinante En una modalidad preferida del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención, se proporciona un anticuerpo genéticamente recombinante. El tipo de un anticuerpo tan genéticamente recombinante no está limitado. Los ejemplos incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo humano.
Un anticuerpo quimérico (es decir, un anticuerpo quimérico humanizado) es un anticuerpo formado ligando (conjugado) la región variable de un anticuerpo derivado de ratón a la región constante de un anticuerpo derivado de humano (por favor referirse a Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 81_, 6851-6855, (1984), etc.). Cuando se produce tal anticuerpo quimérico, el anticuerpo así enlazado puede construirse fácilmente mediante una técnica genética de recombinación.
Cuando se produce un anticuerpo humanizado, una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) se trasplanta desde la región variable de un anticuerpo de ratón en la región variable de un anticuerpo humano, para producir una región variable reconstruida, en la cual una región de marco (FR, por sus siglas en inglés) se deriva del humano y se deriva de la CDR del ratón (qué se llama injerto de la CDR (trasplante de la CDR)). Posteriormente, la región variable humana así humanizada, reconstruida se liga a una región constante humana. Tal método para producir un anticuerpo humanizado es bien conocido en el presente campo técnico (por favor referirse para ver Nature, 321 , 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196. 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Publicación de patente JP (Kohyo) No. 4-502408 A (1992) (Número de Patente Japonesa 2828340; Queen et al.), etc.).
En la presente, el tipo de una secuencia de la CDR derivada de ratón, que puede usarse en el anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado de la presente invención, no está particularmente limitado. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 36 a 38 o las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC DE ID NO: 66 a 68 se usan preferiblemente como 1 a 3 CDR de la región V de cadena H (VH, por sus siglas en inglés), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 41 a 43 o las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC DE ID NO: 71 a 73 se usan preferiblemente como 1 a 3 CDR de la región V de cadena L (VL, por sus siglas en inglés), respectivamente.
Además, los ejemplos preferidos de la secuencia de aminoácidos de una región V de cadena H en una región variable humana reconstruida humanizada incluyen: la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 92 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 36 a 38; la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 75); la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 98 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 36 a 38; la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 97); la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 94 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 66 a 68; la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 79); y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 95 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 66 a 68; la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 81). En la presente, la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente de la región V de cadena H mostrada en la SEC DE ID NO: 98 es una secuencia de aminoácidos modificada en la cual la arginina (R) en la posición 44 de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente de la región V de cadena H mostrada en la SEC DE ID NO: 92 se sustituye con una glicina (G).
Asimismo, los ejemplos preferidos de la secuencia de aminoácidos de una región V de cadena L en una región variable humana reconstruida humanizada incluyen: la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 93 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 41 a 43; y la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 77); y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 96 (que comprende 1 a 3 CDR que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 71 a 73; la secuencia de aminoácidos que además comprende un péptido de señal se muestra en la SEC DE ID NO: 83).
En la presente, los ejemplos preferidos del anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado de la presente invención incluyen: (i) un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado, en el cual la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena H se muestra en la SEC DE ID NO: 92 y la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena L se muestra en la SEC DE ID NO: 93; y (ii) un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado, en el cual la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena H se muestra en la SEC DE ID NO: 98 y la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena L se muestra en la SEC DE ID NO: 93. En particular, el anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado descrito en (ii) anterior, en el cual la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena H se muestra en la SEC DE ID NO: 98, tiene una avidez mejorada (que es flexibilidad del movimiento de dos brazos de unión al antígeno) y tiene alta actividad de unión al antígeno, y así, este anticuerpo es particularmente preferible.
También, otros ejemplos preferidos del anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado de la presente invención incluyen: (iii) un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado, en el cual la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena H se muestra en la SEC DE ID NO: 94 y la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena L se muestra en la SEC DE ID NO: 96; y (ii) un anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado, en el cual la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena H se muestra en la SEC DE ID NO: 95 y la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena L se muestra en la SEC DE ID NO: 96.
En general, en el caso de un anticuerpo humano (un anticuerpo humano completo), su estructura que comprende una región Hipervariable que está el sitio de unión al antígeno de una región V, otras partes de la región V, y una región constante es la misma que la estructura del anticuerpo de un humano. Sin embargo, un sitio Hipervariable se puede también derivar de otros animales. Una técnica para producir un anticuerpo humano se conoce públicamente, y un método para producir secuencias de gen que son comunes en humanos mediante ingeniería genética se ha establecido. Un anticuerpo humano se puede obtener, por ejemplo, mediante un método al usar un ratón productor de anticuerpo humano que tiene fragmentos cromosómicos humanos que comprende los genes de la cadena H y de la cadena L del anticuerpo humano (por favor referirse a Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. y lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et. al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727, etc.), o mediante un método para obtener una presentación de anticuerpos en superficie de fagos seleccionada de una biblioteca de anticuerpo humano (por favor referirse a Wormstone, I. M. et. al, I nvestigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology , (2002) 109 (3), 427-431, etc.).
En el caso del anticuerpo quimérico anteriormente mencionado, del anticuerpo humanizado y del anticuerpo humano, la cadena de azúcar ligada a N-glucósido en la región de Fe de anticuerpo es preferiblemente una cadena de azúcar, en la cual la fucosa no une a la N-acetilglucosamina en la terminal de reducción de la misma. Un ejemplo específico es un anticuerpo que consiste de moléculas de anticuerpo genéticamente recombinantes, que tiene, en la región de Fe de las moléculas de anticuerpos, una cadena de azúcar en la cual la posición 1 de la fucosa no se une a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en la terminal de reducción de la cadena de azúcar ligada al N-glucósido a través de un enlace a. Tal anticuerpo es capaz de mejorar significativamente la actividad de ADCC. Este punto (las características de la cadena de azúcar ligada al N-glucósido en la región de Fe del anticuerpo) es preferible también para el anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal anteriormente mencionados. (4-2) Fragmento de anticuerpo El fragmento de anticuerpo anti-hTROP-2 (fragmento parcial) de la presente invención se incluye en el anticuerpo de la presente invención. En la presente, el fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene actividad de unión a hTROP-2 (es decir, es capaz de unir a hTROP-2) y también tiene actividad antitumoral in vivo, como en el caso del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención.
El fragmento del anticuerpo se entiende una región de una porción de un anticuerpo policlonal anti-hTROP-2 o del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (es decir, un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención). Los ejemplos de tal fragmento de anticuerpo incluyen péptidos que comprenden, como por lo menos una porción de los mismos, Fab, Fab', F(ab')2, Fv (fragmento variable del anticuerpo), un anticuerpo de una sola hélice (una cadena H, una cadena L, una región V de cadena H, y una región V de cadena L, etc.), scFv, diacuerpo (dímero de scFv), dsFv (una región V estabilizada con disulfuro), y una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés).
Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50,000 que tienen actividad de unión al antígeno, que es formado al unir aproximadamente una mitad en el lado N-terminal de la cadena H a la cadena L entera a través de un enlace de disulfuro, entre los fragmentos obtenidos tratando las moléculas de anticuerpo con una proteasa, papaína. Además, es también posible producir tal Fab insertando el ADN que codifica el Fab de un anticuerpo en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100,000 que tienen actividad de unión al antígeno, cuyo tamaño es ligeramente mayor que Fab que une a Fab a través del enlace de disulfuro en la región de bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando moléculas de anticuerpo con una proteasa, pepsina. Además, es también posible producir tal F(ab')2 por el enlace de tioéter o el enlace de disulfuro de Fab, como se describen más adelante.
Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50,000 que tienen actividad de unión al antígeno, que es formada dividiendo el enlace de disulfuro en la región de bisagra del F(ab')2 anteriormente mencionado. Además, es también posible producir tal Fab" insertando el ADN que codifica el fragmento Fab' de un anticuerpo en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. scFv es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión al antígeno, que es un polipéptido de VH-P-VL o de VL-P-VH formado ligando una simple región V de cadena H (VH) a una sola región V de cadena L (VL) al usar un enlazador de péptido (P) adecuado. Tal scFv puede ser producido obteniendo el ADNc que codifica la VH y la VL de un anticuerpo, construyendo el ADN que codifica el scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
El diacuerpo es un fragmento de anticuerpo formado mediante dimerización del scFv, que tiene actividades de unión al antígeno divalente. Tales actividades de unión al antígeno divalente pueden ser idénticas entre sí, o pueden también ser diferentes entre sí. Tal diacuerpo puede producirse obteniendo el ADNc que codifica la VH y la VL de un anticuerpo, construyendo el ADN que codifica el scFv de tal manera que la longitud de la secuencia de aminoácidos de P es 8 residuos o menos, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. dsFv es un fragmento de anticuerpo formado al unir los polipéptidos, en cuál el residuo de aminoácidos en cada uno de la VH y de la VL se ha sustituido con un residuo de cisteína, a los demás a través de un enlace de disulfuro entre los residuos de cisteína. El residuo del aminoácido que se sustituirá con residuos de cisteína puede seleccionarse basado en la estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el método de Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). Tal dsFv puede producirse obteniendo el ADNc que codifica la VH y la VL de un anticuerpo, construyendo el ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo.
Un péptido que comprende una CDR comprende por lo menos una región de CDRs de VH (1 a 3 CDR) y CDRs de VL (1 a 3 CDR). Ejemplos más preferidos de tal péptido incluyen un péptido que comprende todas las CDRs de VH y un péptido que comprende todas las CDRs de VL. Un ejemplo particularmente preferido del péptido es un péptido que comprende todas las CDRs de VH y de VL (total 6 regiones). Los ejemplos preferidos de la secuencia de aminoácidos de tal CDR incluyen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, 41 a 43, 46 a 48, 51 a 53, 56 a 58, 61 a 63, 66 a 68, y 71 a 73, como se describe anteriormente. Un péptido que comprende múltiples CDRs puede unirse entre sí, directamente o a través de un enlazador de péptido adecuado. Tal péptido que comprende la CDR puede producirse construyendo el ADN que codifica la VH y la VL de un anticuerpo, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector de expresión en una procariota o una eucariota a fin de permitir que el ADN se exprese en el mismo. Por otra parte, tal péptido que comprende la CDR puede también producirse mediante métodos de síntesis química como un método de Fmoc (un método de fluorenilmetiloxicarbonilo) y un método de tBoc (un método de t-butiloxicarbonilo).
El fragmento de anticuerpo de la presente invención, tal como está, puede ser un fragmento de anticuerpo, el cual comprende una parte o la región de Fe de anticuerpo entera en la cual la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en la terminal de reducción de una cadena de azúcar ligada al N-glucósido. De otra manera, el fragmento de anticuerpo de la presente invención puede también ser una proteína de fusión, en la cual el fragmento de anticuerpo anteriormente mencionado está fusionado con una parte o la región de Fe de anticuerpo entera en la cual la fucosa no se una a N-acet¡lglucosamina en la terminal de reducción de una cadena de azúcar ligada al N-glucósido. Tal fragmento de anticuerpo es capaz de mejorar significativamente la actividad de ADCC, y es así preferible.
Más adelante, en las descripciones de la presente especificación, los fragmentos de anticuerpo anteriormente mencionados también se incluyen en el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención. 3. Polinucleótido, vector recombinante y transformante En la presente invención, un polinucleótido (un gen, ADN) que codifica el anticuerpo anti-hTROP-2 descrito antes de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo puede también proporcionarse. Específicamente, el presente polinucleótido es preferiblemente un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cada secuencia de aminoácidos ejemplificada como el anticuerpo anti-hTROP-2 descrito antes de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo. Por otra parte, el polinucleótido de la presente invención puede ser un polinucleótido que consiste de un simple polinucleótido que codifica el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo, o un polinucleótido que comprende el presente polinucleótido como una porción del mismo y también comprende las secuencias de nucleótidos conocidas necesarias para la expresión de gen (por ejemplo, un promotor transcripcional, una secuencia de SD, una secuencia de Kozak, un terminador, etc.)- Así, el tipo del presente polinucleótido no está limitado.
Con respecto al polinucleótido que codifica el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo, el codón que corresponde a los aminoácidos individuales después de la traducción no está particularmente limitado. El polinucleótido puede comprender el ADN del nucleótido que muestra un codón usado comúnmente en mamíferos como un humano (preferiblemente, un codón frecuentemente usado), o puede también comprender el ADN de nucleótido que muestra un codón usado comúnmente en microorganismos como Escherichia coli o levadura, plantas y similares (preferiblemente, un codón frecuentemente usado).
En la presente invención, un vector recombinante que comprende el polinucleótido descrito antes de la presente invención, o un transformante que comprende el vector recombinante, puede también proporcionarse.
Un promotor transcripcional, una secuencia de SD (en un caso en el cual el huésped es una célula procariótica) y una secuencia de Kozak (en un caso en el cual el huésped es una célula eucariótica) pueden ligarse previamente corriente arriba desde un polinucleótido (un gen, ADN) que se incorporará en un vector de expresión usado como vector recombinante. Por otra parte, un terminador puede ligarse a la corriente abajo del polinucleótido. Además, un mejorador, una señal de empalme, una señal adicional de poli(A), un marcador selectivo y similares puede también ligarse al polinucleótido. Los elementos individuales necesarios para la expresión de gen, como el promotor transcripcional descrito antes, pueden comprenderse en el presente polinucleótido desde el principio. Cuando estos elementos se comprenden originalmente en un vector de expresión, pueden usarse. Así, el uso de elementos individuales no está particularmente limitado.
Como los métodos para incorporar el presente polinucleótido en un vector de expresión, varios tipos de métodos que usan técnicas de recombinación genética conocidas, como un método al usar las enzimas de restricción o un método al usar topoisomerasa, pueden adoptarse. El tipo de un vector de expresión no está limitado, con tal de que sea capaz de retener un polinucleótido (un gen, ADN) que codifica el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo, y un vector adecuado para que las células hospedadoras sean usadas pueda seleccionarse, como sea apropiado, y pueda usarse. Los ejemplos de tal vector de expresión incluyen el ADN de plásmido, el ADN bacteriófago, el ADN de retrotransposón , un vector de retrovirus y el ADN cromosómico artificial.
Posteriormente, el vector recombinante así construido se introduce en un huésped para obtener un transformante, y el transformante obtenido entonces se cultiva, de manera que pueda expresarse el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo. Debe observarse que el término "transformante" se usa en la presente invención para entender un huésped en el cual se ha introducido un gen extranjero. Los ejemplos de tal transformante incluyen: un huésped en el cual un gen extranjero se ha introducido mediante la introducción del ADN de plásmido o similares (transformación); y un huésped en el cual un gen extranjero ha sido introducido infectando al huésped con varios tipos de virus y fagos (transducción).
El tipo de un huésped no está limitado, con tal de que sea capaz de expresar el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo, después de que el vector recombinante descrito antes se haya introducido en el huésped. Así, un huésped puede seleccionarse, como sea apropiado. Los ejemplos de tal huésped incluyen huéspedes conocidos como varios tipos de células animales como un humano o un ratón, y varios tipos de células de plantas, de bacterias, de levaduras y de células de plantas.
Cuando las células animales se usan como células hospedadoras, los ejemplos de tales células animales incluyen: fibroblastos humanos, células de riñon embrionarias humanas, células HEK293, células 293F, células CHO, células COS-7 de mono, Vero, células L de ratón, GH3 de rata y células FL humanas. Por otra parte, las células de insectos como células Sf9 o células Sf21 pueden también usarse como células hospedadoras.
Cuando las bacterias se usan como huéspedes, los ejemplos de tales bacterias incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Cuando la levadura se usa como huésped, los ejemplos de tal levadura incluyen Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe.
Cuando las células de plantas se usan como células hospedadoras, las células BY-2 de tabaco se usan por ejemplo.
El método para obtener un transformante no está limitado, y puede ser seleccionado, como sea apropiado, mientras se toma en consideración una combinación del tipo de un huésped y del tipo de un vector de expresión. Los ejemplos preferidos del método para obtener un transformante incluyen electroporación, lipofección, un método del choque térmico, PEG, un método de fosfato de calcio, un método de dextrano de DEAE, y un método para infectar a un huésped con varios tipos de virus como virus de ADN o virus de ARN.
En el transformante obtenido, el tipo de codón de un polinucleótido contenido en un vector recombinante comprendido puede ser idéntico a o diferente del tipo de codón de un huésped usado. Así, el tipo de codón no está limitado. 4. Preparación del conjugado de anticuerpo-fármaco Como un inmunoconjugado preparado al usar el anticuerpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado de la presente invención, se puede proporcionar un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo anteriormente mencionado y una sustancia (un compuesto, etc.) que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células. Debe observarse que un conjugado formado previamente preparando cada una de la molécula de anticuerpo anteriormente mencionada y la sustancia anteriormente mencionada que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células, por separado, y después combinándolas, se refiere generalmente como inmunoconjugado. Por una parte, un conjugado obtenido ligando una toxina de proteína usada como una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células a un gen de anticuerpo en un gen de acuerdo con una técnica de recombinación genética, a fin de permitir que exprese como una simple proteína (una proteína de fusión), se refiere generalmente como una inmunotoxina.
Los ejemplos de una sustancia que tiene actividad antitumoral incluyen doxorubicina, calicheamicina, mitomicina C, Auristatina E e isótopo radiactivo. Los ejemplos de una sustancia que tiene actividad de eliminación de las células incluyen saporina, Usina, exotoxina de pseudomonas, toxina de difteria e isótopo radiactivo. De éstos, la exotoxina y la saporina de pseudomonas se usan preferiblemente. El tipo de Rl que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de las células no está particularmente limitado, y los ejemplos de tal Rl incluyen 90? 111 | ? 125 | ? 35S ] 14^ 186Re 188Re 177^ 67^ 212B j 213B¡ ] 211At i 198AU j 224ACi 126^ 133^ 77^ HSm,^ 95,,^ 97^ 103RU ) 105Ru, 07Hg, 203Hg, 9 mTc, 2 mTe, 22mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 16 Tb, 66Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 5 Cr, 59Fe, 18F, 75Se, 201TI, 2 5Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 66Dy, 212Pb y 223Ra.
Un método para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco no está limitado. Por ejemplo, es aplicado un método para combinar un anticuerpo con un fármaco a través de un enlace de disulfuro o un enlace de hidrazona.
El anticuerpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado de la presente invención es excelente en términos de actividad de internalización en células tumorales objetivo que expresan hTROP-2. Así, previamente combinando una sustancia que tiene actividad antitumoral y actividad de eliminación de las células con el anticuerpo anti-hTROP-2, llega a ser posible permitir tal sustancia para actuar directa y altamente selectiva en las células tumorales. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención es extremadamente excelente en términos de capacidad de liberar el agente a las células tumorales objetivo.
La actividad de internalización en las células puede evaluarse fluorescentemente etiquetando un anticuerpo con rodamina o similares y después observando el comportamiento y la localización migratorios del anticuerpo al usar un microscopio de fluorescencia o similares.
Por otra parte, en la presente invención, además del conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado, puede también proporcionarse un conjugado de anticuerpo de fragmento-fármaco, en el cual el fragmento de anticuerpo anteriormente mencionado se usa en vez de un anticuerpo. Con respecto a los detalles de tal conjugado de anticuerpo de fragmento-fármaco, las descripciones del conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado pueden aplicarse, como sea apropiado.
Más adelante, en las descripciones de la presente especificación, tal conjugado de anticuerpo de fragmento-fármaco también se incluye en el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención. 5. Composición farmacéutica El anticuerpo anti-hTROP-2 y el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención son útiles como ingredientes activos contenidos en una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica es útil como una composición farmacéutica para tratar y/o diagnosticar un tumor. En particular, ya que el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención y un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprenden el anticuerpo anteriormente mencionado tienen excelente actividad inhibidora de crecimiento tumoral como actividad antitumoral, se usan preferiblemente en el tratamiento del tumor. Es decir, el anticuerpo anti-hTROP-2 y el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención son útiles como ingredientes activos contenidos en un agente terapéutico contra tumor y un agente de diagnóstico de tumor. Debe observarse que el tratamiento descrito antes del tumor incluye la inhibición del crecimiento tumoral y la supresión del crecimiento tumoral. Específicamente, si es un agente terapéutico contra tumor, los ejemplos del agente terapéutico contra tumor incluyen un inhibidor del crecimiento tumoral y un supresor del crecimiento tumoral.
Es preferible proporcionar la composición farmacéutica de la presente invención en la forma de composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención como ingredientes activos, y además comprende un portador farmacológicamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede usar en combinación con agentes antitumorales conocidos. Mediante tal uso combinado, un alto efecto antitumoral puede obtenerse.
Las enfermedades objetivo (tumores), a las cuales la composición farmacéutica de la presente invención es aplicada, incluyen: los varios tipos anteriormente mencionados de tumores humanos conocidos, en los cuales la expresión de hTROP-2 se ha confirmado previamente. Entre otros, uno o dos o más tipos seleccionados a partir de varios tipos de tumores humanos como cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocárcinoma humano son particularmente preferibles. Tal enfermedad objetivo puede ser una simple enfermedad, o dos o más enfermedades pueden desarrollarse en combinación. Por otra parte, el tumor objetivo puede ser un cáncer recurrente o un cáncer metastático. La composición farmacéutica de la presente invención (además, el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención) se puede usar eficazmente como un agente terapéutico y un agente de diagnóstico para un cáncer recurrente o un cáncer metastático.
Los ejemplos del "portador farmacológicamente aceptable" incluyen un excipiente, un diluyente, un extensor, un desintegrador, un estabilizador, un conservador, un amortiguador, un emulsionante, un aromático, un agente colorante, un dulcificante, un espesante, un corrector, un solubilizante y otros aditivos. Al usar uno o más tipos de tales portadores, una composición farmacéutica puede prepararse en la forma de una inyección, un agente líquido, una cápsula, una suspensión, una emulsión, un jarabe, etc. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse oral o parenteralmente. Otra forma para la administración parenteral es, por ejemplo, una inyección que comprende uno o más ingredientes activos, que es preparada mediante un método ordinario. Tal inyección puede producirse disolviendo o suspendiendo el presente anticuerpo en un portador farmacológicamente aceptable como una solución salina normal o un agua destilada comercialmente disponible usada para la inyección.
En particular, cuando un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención (particularmente, un fragmento de anticuerpo con un bajo peso molecular) se administra en un cuerpo vivo, un sistema de dispersión coloidal puede usarse en adición a los componentes anteriormente mencionados. Tal sistema de dispersión coloidal se anticipa para tener un efecto de mejorar la estabilidad de un compuesto (un fragmento de anticuerpo) en un cuerpo vivo o un efecto de eficientemente transportar tal compuesto a un órgano, un tejido, o una célula específica. El tipo de tal sistema de dispersión coloidal no está limitado, con tal que sea usado comúnmente. Los ejemplos de un sistema de dispersión coloidal incluyen sistemas de dispersión que comprenden, como bases, polietilenglicol , un conjugado macromolecular, un agregado macromolecular, una nanocápsula, microesfera, gránulos, y lípidos incluyendo un emulsionante de aceite en agua, una micela, una micela mezclada y un liposoma. Los ejemplos preferidos de tal sistema de dispersión coloidal incluyen múltiples liposomas y las vesículas de la membrana artificial, que tienen un efecto de eficientemente transportar tal compuesto a un órgano, un tejido, o una célula específica (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Bíophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención difiere dependiendo de la edad, sexo, peso corporal y síntomas de un paciente, efectos terapéuticos, un método de administración, un tiempo de tratamiento, los tipos del anticuerpo anti-hTROP-2 y conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención contenidos en la composición farmacéutica, etc. En general, la presente composición farmacéutica puede administrarse dentro del intervalo entre 600 pg y 6,000 mg por adulto por administración. Sin embargo, la dosis no se limita al intervalo anteriormente mencionado.
En un caso en el cual la composición farmacéutica se administre en la forma de una inyección, por ejemplo, puede administrarse en una dosis de 100 pg a 100 mg, por administración, por peso corporal de un paciente humano, una vez o dividida en varias administraciones, como una dosis diaria promedio. Preferiblemente, la composición farmacéutica puede administrarse una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada diez días, o una vez cada dos semanas, o por una sola administración (donde el número total de las administraciones es 1). Los ejemplos de la forma de dosis incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal. De éstas, la inyección intravenosa es preferible. Además, tal inyección puede prepararse en la forma de diluyente no acuoso (por ejemplo, polietilenglicol, aceite vegetal como aceite de oliva, alcoholes como etanol, etc.), una suspensión, o una emulsión. Tal inyección puede esterilizarse mediante esterilización mecánica al usar un filtro, la mezcla de un microbicida, etc. La inyección puede producirse en la forma de una inyección que se preparará antes de uso. Es decir, una composición sólida esterilizada es preparada mediante un método de deshidratación por congelación o similares, y la composición entonces se disuelve en agua destilada esterilizada usada para la inyección u otros solventes antes de usarse, de modo que puede entonces usarse.
La presente invención proporciona un uso del anticuerpo anti-hTROP-2 y/o el conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado de la presente invención en la producción de un agente farmacéutico (un fármaco) para tratar y/o diagnosticar un tumor. Además, la presente invención proporciona el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado de la presente invención, que se usan para tratar y/o diagnosticar un tumor.
Por otra parte, la presente invención proporciona un método para tratar y/o diagnosticar un tumor, que se caracteriza en que comprende usar (es decir, administrando a los pacientes) el anticuerpo anti-hTROP-2 y/o el conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado de la presente invención. Además, la presente Invención también proporciona el uso del anticuerpo anti-hTROP-2 y/o el conjugado de anticuerpo-fármaco anteriormente mencionado de la presente invención en el tratamiento y/o la diagnosis del tumor. 6. Método para detectar el tumor El método para detectar un tumor de la presente invención se caracteriza en que comprende permitir que el anticuerpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado de la presente invención reaccione con una muestra recolectada a partir de un cuerpo vivo (más adelante referida como una muestra biológica), y detectando un señales del anticuerpo reaccionado.
Como se describe anteriormente, hTROP-2 se ha confirmado para ser expresado específicamente en varios tipos de células tumorales. Así, hTROP-2, y particularmente, hTROP-2 libre (una porción de región extracelular de hTROP-2) puede usarse como un marcador para varios tipos de tumores. En particular, tal hTROP-2 puede usarse preferiblemente como un marcador para el cáncer pancreático humano, el cáncer de próstata humana, el cáncer colorrectal humano y el cáncer de mamas humanas.
Por lo tanto, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención se permite reaccionar con una muestra biológica, y una señal del anticuerpo reaccionado entonces se detecta, para detectar un tumor. La señal de anticuerpo obtenida puede usarse como un indicador de la cantidad de un antígeno en la muestra biológica (es decir, una cantidad de hTROP-2 o una cantidad de una hTROP-2 libre). En la detección de un tumor al usar el anticuerpo de la presente invención, primero, una muestra biológica recolectada como un analito de un sujeto, como una sección de tejido o sangre usada como un objetivo de prueba, es permitida para unir al anticuerpo de la presente invención por una reacción del antígeno-anticuerpo. Posteriormente, basado en los resultados de medición de la cantidad del anticuerpo unido, la se mide cantidad de un antígeno de interés contenido en la muestra biológica. Esta medición puede realizarse de acuerdo con métodos de inmunoensayo conocidos. Por ejemplo, un método de inmunoprecipitación, un método de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, inmunonefelometría, un método de transferencia de tipo Western, citometría de flujo y similares pueden usarse. En radioinmunoensayo, se usa un anticuerpo etiquetado, y así una señal de anticuerpo se expresa como la cantidad del anticuerpo etiquetado que se detecta directamente. De lo contrario, un anticuerpo cuya concentración o título de anticuerpo se ha conocido puede usarse como una solución estándar, y así una señal del anticuerpo objetivo puede expresarse como un valor relativo. Es decir, la solución estándar y el analito pueden medirse al usar un dispositivo de medición, y una señal de anticuerpo en una muestra biológica puede expresarse como valor con relación al valor de la solución estándar usada como un criterio. Los ejemplos de tal radioinmunoensayo incluyen el método de ELISA, el método de El, el método de RIA, el inmunoensayo de fluorescencia (FIA, por sus siglas en inglés), y el inmunoensayo de luminiscencia. De éstos, el método de ELISA es particularmente preferible en que es simple y altamente sensible.
En la presente invención, el estado de un tumor puede evaluarse o diagnosticarse, al usar el resultado de detección obtenido mediante el método de detección anteriormente mencionado como un indicador. Por ejemplo, cuando el resultado de detección excede un valor estándar predeterminado, el estado de un tumor se define como positivo al tumor, y cuando el resultado de detección es menor que el valor estándar predeterminado, se define como negativo al tumor. En el caso de positivo al tumor, se determina que cierto tipo de tumor habría podido ser desarrollado, y así el estado de tumor puede evaluarse. El término "el estado de un tumor" se usa en la presente para entender la presencia o la ausencia del desarrollo de un tumor, o el grado de progresión, del mismo. Así, los ejemplos específicos del estado de un tumor incluyen la presencia o la ausencia del desarrollo de un tumor, el grado de progresión del mismo, el grado de malignidad, la presencia o la ausencia de metástasis, y la presencia o la ausencia de recurrencia.
En la evaluación anteriormente mencionada, como un estado de un tumor que se evaluará, solamente un estado puede seleccionarse de los ejemplos anteriormente mencionados, o múltiples ejemplos pueden combinarse y seleccionarse. La presencia o la ausencia de un tumor puede evaluarse determinando independientemente de si o no se ha desarrollado el tumor, con referencia al valor estándar predeterminado usado como un límite, basado en el resultado de detección obtenido. El grado de malignidad se usa como un indicador que indica el grado de progresión de un cáncer. Basado en el resultado de detección, el tumor objetivo puede clasificarse en cierta etapa de enfermedad y puede evaluarse. De lo contrario, un cáncer temprano y un cáncer avanzado pueden distinguirse entre sí, y entonces pueden evaluarse. Por ejemplo, es también posible determinar el tumor objetivo como un cáncer temprano o un cáncer avanzado, al usar el resultado de detección como un indicador. La metástasis del tumor puede evaluarse determinando sí o no el neoplasma ha aparecido en un sitio aparte de la posición de la lesión inicial, al usar el resultado de detección como un indicador. La recurrencia puede evaluarse determinando sí o no el resultado de detección ha excedido el valor estándar predeterminado de nuevo después de la etapa de intervalo o la remisión. 7. Kit para detectar o diagnosticar el tumor El anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención puede proporcionarse en la forma de kit para detectar o diagnosticar un tumor. El kit de la presente invención comprende una sustancia de etiquetado, un reactivo de fase sólida en el cual el anticuerpo o el anticuerpo etiquetado se han inmovilizado, etc., así como el anticuerpo anteriormente mencionado. Una sustancia de etiquetado que etiqueta el anticuerpo se entiende una sustancia etiquetada con una enzima, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, etc. El kit de la presente invención puede también comprender otros reactivos usados para realizarse la detección de la presente invención, además de los elementos constitucionales anteriormente mencionados. Por ejemplo, cuando tal sustancia de etiquetado es una sustancia de etiquetado enzimático, el kit de la presente invención puede comprender un sustrato enzimático (un sustrato cromogénico, etc.), una solución de disolución de sustrato de enzima, una reacción enzimática para la solución, un diluyente usado para los analitos, etc. Por otra parte, el presente kit puede comprender además varios tipos de amortiguadores, agua esterilizada, varios tipos de recipientes de cultivo celular, varios tipos de reactores (un tubo de Eppendorf, etc.), un agente de bloqueo (un componente de suero como albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), leche descremada, o suero de cabra), un agente de lavado, un tensioactivo, varios tipos de placas, un antiséptico como azida de sodio, un manual de operación experimental (instrucción), etc.
El kit de la presente invención puede usarse eficazmente para realizarse el método de detección anteriormente mencionado de la presente invención, y es así extremadamente útil.
Más adelante, la presente invención será descrita más específicamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no se proponen para limitar el alcance de la presente invención.
[Ejemplo 1 ] [Reproducción del gen hTROP-2] Se aisló un gen hTROP-2 de longitud completa a partir de hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad) de acuerdo con un método de RT-PCR. Primero, los siguientes cebadores de PCR se diseñaron basados en la secuencia de un gen hTROP-2 (Número de acceso de Genbank NM 002353).
Cebador directo: 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (SEC DE ID NO: 3) Cebador inverso: 5'-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3' (SEC DE ID NO: 4) Cuando estos cebadores se diseñaron, se agregó una secuencia digerida a la enzima de restricción Xho\ a excepción de un codón de detención al cebador inverso. Se sintetizó el ADNc a partir del ARN total (TAKARA) preparado a partir del hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad). Al usar este ADNc como un molde, se realizó una reacción de PCR con los cebadores mencionados anteriormente. Después de lo anterior, se realizó el desarrollo mediante electroforesis en gel de agarosa y la extracción de una banda de interés, y entonces se clonó en un vector pCRM (Invitrogen) (pCRII-hTROP-2). El ADNc hTROP-2 clonado se confirmó secuencialmente.
Se construyó un vector de expresión dividiendo un fragmento EcoR\/Xho\ que comprende un gen hTROP-2 a partir de pCRII-hTROP-2, y después insertando el fragmento en el sitio EcoR\/Xho\ de un vector pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hTROP-2-myc/His). Por otra parte, se cortó un fragmento Hind\\\IHinó\ que comprende un gen hTROP-2 de pcDNA4-hTROP-2-myc/His (donde la porción de separación de H¡nd\\\ fue adyacente), y el fragmento entonces insertó en un sitio Hind\ de un vector pcDNA3.1( + ) (Invitrogen), para construir un vector de expresión que comprende un gen de resistencia a neomícina (pcDNA3.1 - hTROP-2 -mycl i s).
[Ejemplo 2] [Construcción de la línea celular capaz establemente expresar el gen hTROP-2] El vector de expresión (pcDNA3.1 -hTROP-2-myc/His) que codificaba el ADNc de longitud completa de hTROP-2, que había sido producido mediante el método descrito antes, se introdujo en células HEK293 (RIKEN), células HuH-7 (HSRRB), células 7E2-C (descritas en el documento WO 2005/052156) y células CHO-K1 (HSRRB), al usar un reactivo de lipofectamina 2000 (Invitrogen), y la selección entonces se realizó al usar un antibiótico G418 (geneticina; GIBCO BRL). Después de lo anterior, una línea celular, que expresó el hTROP-2 estable, se estableció y se obtuvo.
[Ejemplo 3] [Producción de la proteína recombinante de región extracelular hTROP-2] Se amplificó un fragmento de gen que codifica una porción de la región extracelular de hTROP-2 (específicamente, una región que consiste de aminoácidos en las posiciones 1 a 263 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 2) mediante un método de PCR. Los siguientes cebadores se usaron en la amplificación.
Cebador directo: 5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (SEC DE ID NO: 3) Cebador inverso: 5'-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3' (SEC DE ID NO: 5) En esta operación, se agregó una secuencia digerida con enzima de restricción Xho\ al cebador inverso. Se convirtió el fragmento de ADN amplificado mediante el método de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, y entonces se purificó al usar el Kit de Extracción en Gel QIAquick (marca registrada) (QIAGEN). Se subclonó el fragmento de ADN purificado en un vector pCR Blunt (Invitrogen) (pCRB-hTROP-2 EC), y se confirmó la secuencia de gen. Posteriormente, se cortó un fragmento EcoR\IXho\ que comprende el fragmento de gen que codificaba la región extracelular de hTROP-2 del pCRB-hTROP-2 EC, y entonces se insertó en el sitio EcoR\/Xho\ de un vector pcDNA4//77yc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). Además, para producir un sitio de separación de enzima de restricción Nru\, se asociaron los siguientes oligonucleótidos y se insertaron en el sitio SamHI/EcoRI del pcDNA4mH-hTROP-2 EC.
Oligonucleótido 1: 5'-gatccactagtcgcgagtggtgg-3' (SEC DE ID NO: 6) Oligonucleótido 2: 5'-aattccaccactcgcgactagtg-3' (SEC DE ID NO: 7) Asimismo, se insertó un enlazador pBgl II (TAKARA) en el sitio Hind\ del pcDNA4mH-hTROP-2 EC (pcDNA4mH-N B-hTROP-2 EC). Para producir una proteína recombinante al usar baculovirus, se cortó un fragmento ?rty I / B g 111 que comprende el fragmento de gen que codificaba la región extracelular del hTROP-2 del PcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC, y entonces insertó en el sitio ?/riyl/Bglll de un vector pPSC8 (Nosan Corporation) (pPSC8-hTROP-2 EC). La producción de la proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-2 al usar baculovirus se delegó a Nosan Corporation.
Se purificó la proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-2 como sigue. Se agregó Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Biosciences) a un sobrenadante de cultivo que comprende la proteína recombinante, de modo que se dejaron unir entre sí a 4°C durante 2 horas. Después de lo anterior, se lavó el resultante con un amortiguador de fosfato que contenía 20 mM e imidazol, empleando EconoColumn (BIO RAD), y entonces se eluyó con un amortiguador de fosfato que contenía 300 m de imidazol, de modo que se purificó.
[Ejemplo 4] [Aislamiento del ADNc humano de EpCAM y construcción del vector de expresión] Se aisló un gen EpCAM humano de longitud completa a partir del hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad) de acuerdo con un método de RT-PCR. Primero, se diseñaron los siguientes cebadores de PCR basados en la secuencia de un gen EpCAM humano (Número de acceso Genbank 002354).
Cebador directo: 5'-tcctcgtgtcccactcccgg-3' (SEC DE ID NO: 8) Cebador inverso: 5'-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3' (SEC DE ID NO: 9) Cuando estos cebadores se diseñaron, se agregó una secuencia digerida por enzima de restricción Xho\ a excepción de un codón de detención al cebador inverso. Se sintetizó el ADNc a partir del ARN total (TAKARA) del hígado fetal humano (embrión de 10 semanas de edad). Al usar este ADNc como un molde, se realizó una reacción de PCR con los cebadores mencionados anteriormente. Después de lo anterior, se realizó el desarrollo mediante electroforesis en gel de agarosa y la extracción de una banda de interés, y entonces se clonó en un vector pCRM (Invitrogen) (pCRII-hEpCAM). El ADNc de EpCAM humano clonado se confirmó mediante secuenciado.
Se construyó un vector de expresión dividiendo un fragmento EcoR\/Xho\ que comprende un gen EpCAM humano a partir del pCRII-hEpCAM, y después insertando el fragmento en el sitio EcoR\!Xho\ de un vector pcDNA4//77yc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). Por otra parte, se cortó un fragmento Hind\\\IHind\ que comprende un gen EpCAM humano de pcDNA4-hEpCAM-myc/His (donde la porción de separación de Hind\\\ de extremo romo), y el fragmento entonces se insertó en el sitio Hind\ de un vector pcDNA3.1( + ) (Invitrogen), para construir un vector de expresión que comprende un gen de resistencia a neomicina (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His).
[Ejemplo 5] [Producción del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2] Como inmunógenos, se usaron líneas celulares capaces de establemente expresar células hTROP-2 (células HEK293-hTROP-2, células CHO-K1 -hTROP-2 y células 7E2-C-hTROP-2); la línea celular de cáncer pancreático humano endógenamente expresan una proteína hTROP-2 en la superficie celular (PK-59, RCB1901; adquirido del banco de células de RIKEN); y la proteína recombinante de la región extracelular de hTROP-2 producido por el método descrito antes.
En el caso de las líneas celulares capaces establemente expresar hTROP-2, se usó 1 ? 107 células, y en el caso de la proteína hTROP-2 recombinante, se usaron 20 pg de proteína. Se mezclaron las líneas celulares o la proteína recombinante con un ayudante TiterMax Gold (Funakoshi Corporation) a una relación de mezcla de 1:1, a fin de preparar una emulsión. La emulsión entonces se inyectó en las dos almohadilla plantares o la cavidad abdominal de un ratón (C57/BL6, Balb/c) (inmunización inicial).
Cuando se realizó la inmunización mediante inyección en las dos almohadillas plantares por un corto período de tiempo, el refuerzo se realizó tres a diez días después de la inmunización inicial. En el día después de la inmunización final, se recolectaron los nodos linfáticos de ambas rodillas, y los linfocitos entonces se prepararon. Cuando se realizó la inmunización mediante inyección en la cavidad abdominal durante un largo periodo de tiempo, se realizaron los refuerzos a intervalos de una vez por semana después de la inmunización inicial (donde se realizaron los refuerzos durante 1 a 2 meses). Después de lo anterior, se aislaron las células B del bazo de acuerdo con un método ordinario. En el caso de la inmunización al usar células como inmunógenos, se usó una suspensión de células que fue PBS que contenía 5 ? 106 células para los refuerzos. En el caso de usar una proteína como inmunógeno, se usaron 5 \ g de una solución de PBS.
Se mezclaron los linfocitos preparados con una línea celular de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653) a una relación de mezcla de 3:1, y la fusión celular entonces se realizó de acuerdo con un método de polietilenglicol. Después de lo anterior, se cultivaron células fusionas durante 7 a 28 días en un medio de metilcelulosa (nombre comercial: ClonaCell-HY Cloning Médium D; Stem Cell), que contenía HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina). Las colonias individuales de hibridomas en crecimiento cada una se tomaron y colocaron en una placa de fondo plano de 96 pozos, y usando un HAT que contenía medio selectivo líquido, se cultivaron los hibridomas en una incubadora con C02 al 5%. Se sometió un sobrenadante de cultivo de hibridomas en crecimiento de colonias individuales a una evaluación primaria a través de Cell ELISA (descrito más adelante) y entonces a una evaluación secundaria a través de análisis de FACS al usar células HuH-7-hTROP-2, PK-59, de tal modo estableciendo 300 tipos de hibridomas, que producen los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 reconociendo las proteínas hTROP-2 expresadas en la superficie celular de células vivas.
[Ejemplo 6] [Evaluación primaria al usar Cell ELISA] Las células CHO-K1 (hTROP-2 control negativo; adquirido de Japan Health Sciences Foundation) y células CHO-K1 -hTROP-2 (o células HUH-7 (hTROP-2 control negativo; adquirido de Japan Health Sciences Foundation) y células HuH-7-hTROP-2) alternativamente se inocularon en una placa de cultivo de 96 pozos (BD Falcon) a una densidad de 3 ? 104 células/pozo, y las células entonces se cultivaron en una atmósfera de C02 al 5% a 37°C durante 1 a 2 días. Se eliminó el medio de cultivo celular mediante decantación. Después de lo anterior, se lavaron las células con PBS helado, y después se trataron con 4% de paraformaldehído-PBS durante 5 minutos, de modo que las células se inmovilizaron. Se lavaron las células con PBS que había sido enfriado en hielo, y una placa de ELISA entonces se preparó. Después de lo anterior, se realizó ELISA de acuerdo con un método ordinario. Los procedimientos específicos serán descritos más adelante.
Primero, el bloqueo con 2% de una solución de leche descremada-PBS se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora. Posteriormente, se agregó el sobrenadante de cultivo de hibridoma al mismo, y entonces se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lo anterior, se lavó el resultante con 0.1% de una solución de Tween20-PBS tres veces. Como un anticuerpo secundario, la IgG anti-ratón etiquetada con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare Biosciences), que había sido 1000 veces diluida con una solución de bloqueo, se agregó al resultante, y entonces se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lo anterior, se lavó el resultante con 0.1% de una solución de Tween20-PBS tres veces. Se agregó una solución de sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina: SIGMA) a la solución de reacción para realizar una reacción de color, y la reacción entonces se terminó agregando ácido sulfúrico 1M. Después de lo anterior, se midió la absorbencia (405 nm) al usar el lector de Microplaca Modelo 550 (BIO RAD). Los hibridomas que correspondían a un sobrenadante de cultivo de hibridoma que exhibía un alto valor de absorbencia al control negativo se sometieron a un cultivo a gran escala en una placa fondo plano de 24 pozos, y después se sometieron a una evaluación secundaria al usar análisis de FACS.
[Ejemplo 7] [Evaluación secundaria al usar análisis de FACS] Los hibridomas, que se encontraron positivos en la evaluación primaria descrita antes al usar Cell ELISA, se sometieron a una evaluación secundaria al usar el análisis de FACS. En la evaluación de células de hibridoma, las células HuH-7, que fueron células de cáncer de hígado humano que no expresaron hTROP-2, se usaron como células de control negativo y la reactividad con células HuH-7-hTROP-2, que se expresa establemente hTROP-2, se usaron como un indicador. Entonces, se realizó la evaluación basada en la reactividad con células PK-59 (RCB1901; adquirido del banco de células de RIKEN), que fueron células de cáncer pancreático humano endógenamente expresaron una proteína hTROP-2 en la superficie celular.
Las células se eliminaron de la placa de cultivo mediante un tratamiento con tripsina, y una suspensión celular entonces se preparó (densidad de célula: 2 ? 106 células/ml). El sobrenadante de cultivo de hibridoma, que exhibió positivo en la evaluación primaria al usar Cell ELISA, se hizo reaccionar con 100 µ? de la suspensión celular a 4°C durante 20 minutos. Se lavó la mezcla de reacción con PBS, y entonces se hizo reaccionar con IgG de ratón etiquetado con PE (BD Pharmingen) (0.1 µg) (4°C, 30 minutos). Después de lo anterior, se analizó la mezcla de reacción al usar FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Eventualmente, aproximadamente 300 tipos de hibridomas, que producen un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 que reconoce una proteína hTROP-2 expresada en la superficie celular de células vivas, se establecieron.
[Ejemplo 8] [Identificación del isotipo] El isotipo del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 producido se identificó al usar el MOUSE MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (Serotec) de acuerdo con un método incluido con el kit mencionado antes.
[Ejemplo 9] [Formación de ascitis y purificación del anticuerpo TROP-2] Las clones de hibridoma producidos mediante el método descrito antes se administraron a una densidad de 3 ? 106 clones en la cavidad abdominal de un ratón desnudo BALB/c, al cual el 2,6, 10, 14-tetrametilpentadecano (pristano) (siete días antes) había sido administrado previamente. Dos semanas más adelante, se recolectaron las ascitis. Por otra parte, estas ascitis se sometieron a precipitación de ácido caprílico, y después a purificación de afinidad al usar una columna de proteína G (proteína G de HiTrap; GE Healthcare Biosciences) o una columna de proteína A (proteína A de HiTrap; GE Healthcare Biosciences), para obtener los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 de clones de hibridoma individual.
[Ejemplo 10] [Medición de afinidad de unión al antígeno (medición del valor de Kd)] La afinidad de unión al antígeno (valor de Kd) del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 generado se calculó mediante un método al usar ELISA (Djavadi-Ohaniance L. et al (1996), In Antibody Engineering, Chapter 4, págs. 77-97. IRL Press, Oxford).
Específicamente, se agregó la proteína hTROP-2 recombinante purificada (0.1 g/ml) a una placa de cultivo de 96 pozos (Corning) de modo que la placa se cubrió con el antígeno (a temperatura ambiente durante 1 hora, o a 4°C durante la noche). Posteriormente, se lavó el resultante con PBS tres veces, y 2% de leche descremada (solución de PBS) entonces se agregó al mismo para bloquearlo (a temperatura ambiente durante 1 hora). Se lavó el resultante con PBS dos veces. Después de lo anterior, un complejo de antígeno-anticuerpo que había sido formado previamente mezclando una solución de antígeno (una proteína hTROP-2 purificada; 50, 25, 12.5, 6.25, o 3.125 nM) con cada clon (0.5 nM) del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 y después de equilibrar la mezcla, se agregó a la placa de ELISA descrita antes, y se hizo reaccionar (a temperatura ambiente durante 1 hora). Se lavó el producto de reacción con PBS tres veces, y entonces se hizo reaccionar con la IgG anti-ratón etiquetada con HRP (concentración final: 1 pg/ml) (GE Healthcare Biosciences) diluido con una solución de bloqueo (a temperatura ambiente durante 1 hora). Posteriormente, se lavó el producto de reacción con 0.1% de una solución de Tween20-PBS tres veces, y un sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina: SIGMA) entonces se agregó al resultante para realizarse una reacción de color. Entonces, se agregó ácido sulfúrico 1 M al producto de reacción para terminar la reacción. Al usar el lector de Microplaca modelo 550 (BIO RAD), se midió la absorbencia.
Las siguientes expresiones de cálculo se usaron para medir la constante de disociación (Kd).
De acuerdo con la ley de la acción de masa, una reacción de antígeno-anticuerpo está representada por las siguientes expresiones. k1 Ag (Antígeno) + Ab (Anticuerpo) <=> Ag-Ab (complejo de Antígeno- k2 Anticuerpo)¦ · (1 ) Kd = k2/k1 = AgfxAbf / Ag-Ab = AgfxAbf / x (2) En la expresión (2), Agf representa la concentración de un antígeno libre, Abf representa la concentración de un anticuerpo libre, y el AG-Ab representa la concentración de un complejo de antígeno-anticuerpo. Si el AG-Ab = x, la concentración del anticuerpo libre está representada por la siguiente expresión.
Abf = Abt - x (3) La expresión anterior (2) por lo tanto puede ser Kd= Agf x(Abt-x) / x (4) Si ambos términos de la expresión (4) son multiplicados por x/KdxAbt, x/Abt = Agfx(1-x/Abt)x1/Kd x/Abt*1/Agf = (1 -x/Abt)x1/Kd (5) Si X = x/Abt e Y = x/AbtxAgf en la expresión (5), Y = (1-X)x1/Kd (6) Basado en la expresión (6), se calculó el valor de Kd.
Se midieron los valores de Kd de los 300 clones de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 generados por el método descrito antes. Como un resultado, había 133 clones que exhibían un valor de Kd de 1 ? 10"10 (M) o menor, 59 clones que exhibían un valor de Kd de 1 ? 10"11 (M) o menor, y 2 clones que exhibían un valor de Kd de 1 * 10"12 (M) o menor.
Entre los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2, que exhibieron actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo, los valores de Kd de K5-70 (lgG2a de ratón), T6-16 (lgG2a de ratón), K5-107 (lgG1 de ratón), K5-116-2-1 (lgG2a de ratón) y T5-86 (lgG1 de ratón) se encontraron para ser 6.8 10'12 (M), 4.3 ? 10" 12 (M), 4.7 10-12 (M), 2.69 ? 10"11 (M) and 8.49 x 10"11 (M), respectivamente (Figura 1 y Tabla 1).
Tabla 1 Valores de Kd de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 No. de clon K5-70 T6-16 K5-107 K5-116-2-1 T5-86 Kd( xi012M) 6.8 4.3 4.7 26.9 84.9 [Ejemplo 11] [Reactividad de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 con líneas celulares de cáncer humano] Las líneas celulares de cáncer humano (líneas celulares de tumor humano) usadas en estos estudios se adquirieron de Health Science Research Resources Bank (HSRRB), RIKEN cell bank (RIKEN), ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures) y DSMZ (Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Específicamente, se usaron las siguientes líneas celulares de cáncer. huH-1 (HSRRB), HUH-6 (HSRRB), HuH-7 (HSRRB), JHH-5 (HSRRB), JHH-6 (HSRRB), JHH-7(HSRRB), H LE (HSRRB), HLF (HSRRB), HepG2 (HSRRB), Alexander (HSRRB), KP-1N (HSRRB), KP-1NL (HSRRB), KP-2 (HSRRB), KP-3 (HSRRB), KP-3L (HSRRB), PK-1 (RIKEN), PANC-1 (RIKEN), MIA PaCa-2 (HSRRB), PK-59 (RIKEN), PK-45H (RIKEN), PK-45P (RIKEN), BxPC-3 (ATCC), SUIT-2 (HSRRB), TCC-PAN2 (HSRRB), SW480 (ATCC), DLD-1 (HSRRB), LoVo (HSRRB), COLO-320 (RIKEN), CACO-2 (RIKEN), CW-2 (RIKEN), HCT 116 (ATCC), HCC-56 (HSRRB), MCF-7 (HSRRB), JIMT-1 (DSMZ), HCC1143 (ATCC), A549 (HSRRB), DU145 (RIKEN) y PC-3 (HSRRB).
Se eliminaron las células cancerosas de una placa de cultivo mediante un tratamiento con tripsina y una suspensión celular entonces se preparó (densidad de célula: 2 * 106 células/ml). Se agregó un anticuerpo monocional anti-hTROP-2 (0.1 pg) a 100 µ? de la suspensión celular, y entonces se hizo reaccionar a 4°C durante 20 minutos. Se lavó la solución de reacción con PBS, y entonces se hizo reaccionar con IgG antiratón etiquetada con PE (BD Biosciences Pharmingen) (0.1 pg) (a 4°C durante 30 minutos). Después de lo anterior, el resultante se analizó mediante FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Todos los anticuerpos anti-hTROP-2 generados no se unieron a una línea celular de cáncer de hígado humano HuH-7, que no expresó endógenamente hTROP-2. Por una parte, los anticuerpos anti-hTROP-2 unidos a las células HuH-7-hTROP-2, en las cuales un gen hTROP-2 se expresó estable (Figura 2). Posteriormente, se examinó la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados con líneas celulares de cáncer humano (en cuáles una proteína hTROP-2 se expresó endógenamente en la superficie celular) mediante análisis de FACS. Como un resultado, los 300 tipos generados de anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 todos unidos a las líneas celulares de cáncer pancreático humano (PK-59 y BxPC-3). En particular, anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86, que exhibieron actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo, todos unidos a las líneas celulares de cáncer humano a altos niveles. Por ejemplo, cuando se compararon con un caso en el cual las líneas celulares de cáncer se hicieron reaccionar con solamente la IgG anti-ratón etiquetada con PE (BD Biosciences Pharmingen), los anticuerpos anteriormente mencionados exhibieron la siguiente capacidad de unión a células PK-59 y a células BxPC-3 a intensidad de fluorescencia media: K5-70 (44 veces), T6-16 (59 veces), K5-107 (89 veces), K5-116-2-1 (122 veces) y T5-86 (15 veces) (a células PK-59; Figura 3); y K5-70 (45 veces), T6-16 (25 veces), K5-107 (90 veces), K5-116-2-1 (121 veces) y T5-86 (10 veces) (a células BxPC-3; Figura 4).
Con respecto a líneas celulares de cáncer humano con excepción de PK-59 y de BxPC-3, entre 12 tipos de líneas celulares de cáncer pancreático, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 unidos a KP-2, KP-3L, PK-1, PK-45H, SUIT-2 y TCC-PAN2, y no unidos a KP-1N, a KP-1NL, a KP-3, a PANC-1 y a MIA-PaCa2 (Figura 5). Entre líneas celulares de cáncer humano de colon, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 unidos a CACO-2, SW480, DLD-1 y HCT 116, y no unidos a COLO-320 y CW-2 (Figura 6). Además, los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 unidos a JIMT- y HCC1143 (que fueron líneas celulares de cáncer de mamas humanas) y PC-3 y DU145 (que fueron líneas celulares de cáncer de próstata humano). Así, reconocieron las proteínas hTROP-2 endógenamente expresadas en la superficie celular de muchos tipos de líneas celulares de cáncer humano (Figura 6).
[Ejemplo 12] [Reactividad cruzada con la proteína TROP-2 de ratón y la proteína TROP-1 /EpCAM humana] Con el fin de examinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados, la reactividad de los anticuerpos con una proteína TROP-2 de ratón que muestra la homología del 80% al nivel de secuencia de aminoácidos con la proteína hTROP-2, y con una proteína TROP-1 /EpCA humana que muestra la homología del 50% al nivel de secuencia de aminoácidos con la proteína hTROP-2, se examinó mediante análisis de FACS.
Específicamente, cada uno de un vector de expresión (TROP-2-pcDNA3.1 ( + ) de ratón, suministrado por el Institute of Molecular and Cellular Biosciences, the University of Tokyo) que comprende el ADNc de longitud completa de un gen TROP-2 de ratón (Número de acceso de GenBank NM_020047, Y08830), y un vector de expresión (pcDNA3.1 -hEpCAM-myc/His) que comprende el ADNc de longitud completa de un gen TROP-1 /EpCAM humano (Número de acceso de GenBank NM_002354), se introdujo transitoriamente en células CHO-K1, al usar el reactivo Lipofectamine2000 (Invitrogen). Después de lo anterior, 24 a 48 horas más adelante, se eliminaron las células de una placa de cultivo tratándolas con tripsina, y una suspensión de células entonces se preparó. La suspensión celular así preparada se hizo reaccionar sucesivamente con el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 producido (0.1 pg) y con la IgG anti-ratón etiquetada con PE, y entonces se analizó mediante FACSCalibur.
Un anticuerpo T2-102 ( I g G 1 de ratón) usado como un control positivo, que mostró reactividad cruzada con el TROP-2 de ratón, exhibió alta capacidad de unión a las células CHO-K1 en las cuales el gen TROP-2 de ratón se expresó transitoriamente. Por una parte, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86 no mostraron tal reactividad cruzada con el TROP-2 de ratón (Figura 7).
Similarmente, un anticuerpo monoclonal EpCAM anti-humano (BD Biosciences Pharmingen) usado como un control positivo exhibió alta capacidad de unión a células CHO-K1 en las cuales el EpCAM/TROP-1 humano se expresó transitoriamente. Por una parte, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86 no mostraron tal reactividad cruzada con EpCAM/TROP-1 humano (Figura 8).
Los resultantes anteriormente mencionados demostraron que los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 generados, y en particular, los anticuerpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 y T5-86, que exhibieron actividad antitumoral in vivo, unidos específicamente a hTROP-2.
[Ejemplo 13] [Medición de la actividad inhibidora del crecimiento celular] Como método para examinar la actividad del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 para inhibir la función de hTROP-2, la influencia del anticuerpo en el crecimiento celular de las células cancerosas humanas, que endógenamente expresan hTROP-2 en la superficie celular, se evaluó midiendo el número de células vivas al usar TetraColor ONE (Seikagaku Corporation). Específicamente, se suspendieron células PK-59 en un medio RPMI1640 que contenía 0.5% de suero bovino fetal (fabricado por BioWest) a una concentración celular de 2 ? 105 células/ml, y 100 µ? de la suspensión celular preparada entonces se agregaron a cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos. Posteriormente, se agregaron la IgG de ratón (control negativo) y los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 (concentraciones finales: 0.1 y 1 Mg/ml) a los pozos, y las mezclas entonces se cultivaron a 37°C en una incubadora de C02 al 5% durante 72 horas. Como un control, se usó un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 comercialmente disponible (clon YY01, Santa Cruz). Se agregó TetraColor ONE (Seikagaku Corporation) a los pozos, y entonces se hicieron reaccionar en una incubadora de C02 al 5% durante 1 a 2 horas. Después de la terminación de la reacción, la placa de cultivo de 96 pozos se sometió directamente a la medición de la absorbencia a una longitud de onda de 490 nm (longitud de onda de control: 655 nm), al usar el lector de Microplaca. El experimento se realizó al usar 3 pozos para cada grupo. Se realizó una prueba de diferencia significativa de acuerdo con la prueba t de Student, y se determinó P < 0.05 para ser estadísticamente significante.
Entre los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2, que habían sido generados por nuestra propia compañía hasta ahora, se examinaron aproximadamente 160 clones por el método descrito antes, en términos de su efecto sobre el crecimiento celular de células PK-59. Como un resultado, T6-16, T5-86, K5- 70 y K5-107, que habían exhibido actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo, se confirmaron para tener actividad inhibidora del crecimiento celular del 20% al 40%, en comparación con la IgG de ratón (control negativo). Se hizo evidente que estos anticuerpos anti-hTROP-2 tienen actividad de unir a las proteínas hTROP-2, que se expresaron en la superficie de células cancerosas humanas, para neutralizar las proteínas hTROP-2, e inhibir el crecimiento de las células cancerosas (Figura 9).
[Ejemplo 14] [Análisis de raspado] El efecto de un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en la capacidad migratoria de células cancerosas humanas se evaluó mediante un análisis de raspado. Se suspendieron las células PK-59 en un medio RPMI1640 que contenía 10%de suero bovino fetal a una concentración celular de 3 ? 105 células/ml, y 100 µ? de la suspensión celular preparada entonces se agregaron a cada pozo una placa de cultivo de 96 pozos. Cuando las células llegaron a ser confluentes, una porción de las células cultivadas en monocapas se desprendió, de tal manera que la placa se raspó en una dirección longitudinal con el final de una punta. Se agregaron un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 y una IgG de ratón usados como un control negativo al medio a concentraciones finales de 0.1 y 1 pg/ml, respectivamente, y el cultivo entonces se realizó durante 24 horas. Antes de la adición del anticuerpo (Día 0) y 24 horas después del cultivo (Día 1), la región desprendida celular se fotografió, y la distancia entre las células entonces se midió. Por otra parte, se cuantificó el área de tal región desprendida al usar el software Scion Image. Se realizó el experimento al usar 8 pozos para cada grupo. Se realizó una prueba de diferencia significativa de acuerdo con la prueba t de Student, y se determinó P < 0.05 para ser estadísticamente significativa.
Se examinó el efecto de un anticuerpo hTROP-2 en la capacidad migratoria de las células que invadían la región de raspado. Como con el ensayo de inhibición de crecimiento celular, se evaluaron los anticuerpos que tenían efectos beneficiosos. Como un método de evaluación, se fotografiaron las células el día 0 (cuando el anticuerpo se agregó) y el día 1 (24 horas después de la adición del anticuerpo), y se determinaron la distancia migratoria (pm) y el área de una región de raspado mediante análisis de imagen. Como un resultado, como se muestra en la Figura 10, las diferencia claras se observaron en términos de capacidad migratoria de las células. Los anticuerpos T6-16 y K5-70, que se usaron en la presente prueba, tenían actividad inhibidora de crecimiento celular significante, cuando se compararon con el control. Incluso en una prueba de reproductibilidad, se observó la misma tendencia. Particularmente, T6-16 tenía un resultado de P < 0.01 (mediante la prueba t de Student), y se encontró la correlación con la prueba in vivo.
[Ejemplo 15] [Evaluación de efectos beneficiosos del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en ratones portadores de tumor] Modelo de prevención Las líneas celulares de cáncer pancreático (PK-59 y BxPC-3), que expresaron TROP-2, se cosecharon mediante tratamiento con tripsina, y se agregó PBS a las mismas a fin de preparar una suspensión celular que tenía una concentración de 1 ? 108 células/ml. La suspensión celular así preparada se mezcló con una cantidad igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) en hielo. Al usar jeringa 26 G, se inyectaron 100 µ? de la mezcla obtenida (5 ? 106 células) en la hipodermis del flanco derecho de cada ratón hembra desnudo de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). En el día del trasplante de las células cancerosas (Día 1), los ratones se dividieron en grupos, y se inició la administración de anticuerpo los del (1, 5 o 10 mg/kg de peso corporal, administración intraperitoneal). Después de lo anterior, la administración del anticuerpo se continuó a intervalos una vez cada tres días. Se evaluó la actividad antitumoral basada en la frecuencia de formación de tumores y el volumen tumoral. Se calculó el volumen tumoral por la siguiente fórmula.
Volumen tumoral (mm3) = (menor eje)2 ? (mayor eje) ? tt/6 Modelo de tratamiento Las líneas celulares de cáncer pancreático (PK-59 y BxPC- 3), que expresaron hTROP-2, se cosecharon por el tratamiento con tripsina, y se agregó PBS a las mismas para preparar una suspensión celular que tenía una concentración de 1 ? 108 células/ml. Se mezcló la suspensión celular así preparada con una cantidad igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) en hielo. Al usar una jeringa de 26 G, se inyectaron 100 µ? de la mezcla obtenida (5 ? 106 células) en la hipodermis del flanco derecho de cada de ratón hembra desnudo de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). Cinco a seis días después del trasplante de las células cancerosas, los ratones cuyo volumen tumoral había aumentado de 50 a 150 mm3 (valor promedio: aproximadamente 100 mm3) se divididero en grupos. Se definió el día en el cual los ratones se dividieron en grupos como un primer día (Día 1), y se inició la administración del anticuerpo. El anticuerpo se administró intraperitonealmente a intervalos de una vez cada tres días (10 mg/kg de peso corporal). Se evaluó la actividad antitumoral midiendo el volumen tumoral. Se realizó una prueba de diferencia significativa de acuerdo con la prueba t de Student, y se determinó P < 0.05 para ser estadísticamente significativa. [Ejemplo 16] [Análisis de actividad antitumoral in vivo del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en modelo de xenoinjerto de célula de cáncer pancreático humano] Es esencial para un anticuerpo usado para el tratamiento del cáncer, que se dirige a hTROP-2, para tener la actividad eliminar específicamente tejidos de tumor que expresan hTROP-2 o que inhiben el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto.
Los anticuerpos monoclonales Anti-hTROP-2 (aproximadamente 160 clones), que se produjeron nuevamente en la presente invención, se evaluaron al usar los modelos de tratamiento de xenoinjerto de una línea celular de cáncer pancreático PK-59. Las células PK-59 expresan, en la superficie de las mismas, EpCAM (Figura 11A) que actúa como un marcador de células madre de cáncer pancreático (Chen, C. J. et al. Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R. , et al. Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996)), que son transportadores de ABC asociados con resistencia a fármaco. Además, las células PK-59 contienen un positivo de fracción celular (8.93%) (Figura 11 D) para CD24 y CD44, que es característico para las células madre de cáncer pancreático, y se asume para ser una línea celular de cáncer pancreático humano altamente maligna (Chenwei Li, et al. Cáncer Res 2007; 67: (3). 1030-1037, Jane E. Visvader and Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cáncer. Vol. 8(10):755-68, 2008).
La mayor de los recién generado aproximadamente 160 clones no exhibió efectos beneficiosos sobre los modelos de tratamiento de xenoinjerto de las células PK-59. Entre tales clones, podían obtenerse los clones que exhibían actividad inhibidora de crecimiento tumoral significante, es decir clones K5-70, T6-16, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1.
En un grupo de administración del clon K5-70 (lgG2a de ratón), la velocidad de crecimiento tumoral se inhibe estadísticamente de manera significativa. En el 21v0 día después de la iniciación de la administración (día 21), el volumen tumoral de un grupo de control (N = 14) fue 1200.8 ± 377.3 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-70 fue 748.7 ± 175.0 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 12A). Cuando el volumen tumoral en el momento de la iniciación de la administración del anticuerpo se definió como 1.0, el volumen tumoral en el 21vo día (Día 21) fue 7.8 en el grupo de administración del clon K5-70, mientras que el volumen tumoral del grupo de control fue 12.5 (Figura 12A). La masa de tumor suprimido fue 0.43 ± 0.14 g (P < 0.01 mediante la prueba t de Student) en el grupo de administración del clon K5-70, mientras que el grupo de control fue 0.73 ± 0.26 g. Así, el clon K5-70 exhibió actividad inhibidora de aproximadamente 60% (Figura 12B).
Similarmente, la velocidad de crecimiento tumoral fue inhibida estadísticamente de manera significativa incluso en un grupo de administración del clon K5-107 (IgG 1 de ratón) (N = 8), un grupo de administración del clon T6-16 (lgG2a de ratón) (N = 8), un grupo de administración del clon T5-86 ( I g G 1 de ratón) y un grupo de administración del clon K5-116-2-1 (lgG2a de ratón) (N = 8). En el 17V0 día después de la iniciación de la administración (Día 17), los volúmenes del tumor del grupo de administración del clon K5-107 (N = 8) y el grupo de administración del clon T6-16 (N = 8) fue 698.2 ± 175.9 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student) y 707.2 ± 254.5 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), respectivamente, mientras que el volumen tumoral del grupo de control fue 1039.3 ± 271.6 mm3. Asimismo, en el 16vo día después de la iniciación de la administración (Día 16), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-116-2-1 (N = 8) fue 508.5 ± 225.2 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 797.0 ± 172.9 mm3 (Figura 13).
Por una parte, en el caso del clon T5-86, en el 15v0 día después de la iniciación de la administración (Día 15), el tumor del grupo de administración del clon T5-86 (N = 8) fue 744.1 ± 289.1 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 1033.2 ± 319.4 mm3. Así, no se encontró ninguna diferencia significativa en términos del volumen de tumor. Sin embargo, en la comparación del peso de tumor, que se realizó en el mismo día, el peso de tumor del grupo de administración del clon T5-86 fue 0.44 ± 0.13 g (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), mientras que el peso de tumor del grupo de control fue 0.62 ± 0.14 g. Así, el clon T5-86 exhibió actividad inhibidora significativa.
Por otra parte, en términos del volumen de tumor y el peso de tumor, la relación (T/C) de cada grupo de administración de anticuerpo del clon al grupo de control en el día final del experimento se muestra en la Tabla 2 a continuación. Como se muestra en la Figura 2, cada anticuerpo de clon exhibió actividad inhibidora significativa (T/C = 62% a 72%) en cada grupo de administración de anticuerpo del clon.
Tabla 2 Grupo N (número de ratones) Volumen tumoral T/C (%) Peso de tumor T/C (%) ** ** K5-70 14 62.3 58.8 * K5-107 8 67.2 65.0* T6-16 8 68.0* 64.7* * T5-86 8 72.0 70.5 * K5-116-2-1 8 63.8* 60.5 *P < 0.05, **P < 0.01 (mediante la prueba t-Student) Además, se analizó la actividad antitumoral de cada uno de los clones K5-70, T6-16 y K5-116-2-1 en los modelos de prevención de xenoinjerto de la línea celular de cáncer pancreático PK-59. Después de la terminación de la administración de cada clon de anticuerpo, el crecimiento tumoral se inhibió en todos los individuos (N = 8). En el 18 0 día después de la iniciación de la administración (Día 18), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) fue 62.4 ± 80.4 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 880.8 ± 206.4 mm3. Así, el clon K5-70 exhibió la actividad inhibidora del crecimiento tumoral de 92.9%. En el 280 día después de la iniciación de la administración (Día 28), el volumen tumoral del grupo de administración del clon T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) fue 152.14 ± 122.3 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 992.3 ± 250.8 mm3. Así, el clon T6-16 exhibió la actividad inhibidora del crecimiento tumoral de 84.6%. En el 20vo día después de la iniciación de la administración (Día 20), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-116-2-1 (10 mg/kg de peso corporal) fue 207.7 ± 319.2 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 1159.4 ± 413.3 mm3. Así, el clon K5-116-2-1 exhibió la actividad inhibidora del crecimiento tumoral de 82.1% (Figura 14 y Tabla 3). Por otra parte, en todos los experimentos, no hubo diferencia significativa entre el grupo de control y cada grupo de administración de anticuerpo anti-hTROP-2 en términos de un cambio en peso corporal promedio a través del período de prueba.
En términos del volumen tumoral y la masa de tumor, la relación (T/C) de cada grupo de administración de anticuerpo del clon al grupo de control en el día final de experimento se muestra en la Tabla 3 a continuación. Como se muestra en la Tabla 3, se observó la inhibición del crecimiento tumoral significante en cada grupo de administración de anticuerpo del clon, y en particular, un efecto se significante como T/C = 10% o menor se confirmó el grupo de administración del clon K5-70.
Tabla Grupo N (número de ratones) Volumen tumoral T/C (%) Peso de tumor T/C (%) ** ** K5-70 8 7.1 5.8 ** ** T6-16 8 15.3 10.5 K5-116-2-1 8 23.2 21.5 **P < 0.01 (mediante la prueba t-Student) El anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 conocido (Número de Patente Americana 7420041) ha exhibido el efecto de inhibir el crecimiento tumoral, a una dosis de 20 mg/kg, en modelos de prevención de xenoinjerto al usar varias líneas celulares de cáncer humano. Este anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 ha inhibido el crecimiento tumoral de una línea celular de cáncer pancreático humano PL45 a un porcentaje de casi 100%. Sin embargo, este anticuerpo ha tenido el efecto de inhibir el tumor en una línea celular de cáncer pancreático BxPC-3 en un porcentaje de aproximadamente 50%, en una línea celular de cáncer de próstata PC-3 en un porcentaje de aproximadamente 40%, en una línea celular de cáncer de mamas MCF-7 en un porcentaje de aproximadamente 60%, y en una línea celular de cáncer de colon Colo205 en un porcentaje de aproximadamente 40%. En cambio, el anticuerpo anti-hTROP-2 de la invención de la presente solicitud ha exhibido un mayor efecto inhibidor de crecimiento tumoral a una dosis de la mitad de la dosis anteriormente mencionada (10 mg/kg de peso corporal).
[Ejemplo 17] [Análisis de actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto (modelos de prevención y modelos de tratamiento) de línea celular de cáncer pancreático humano BxPC-3) Como en el caso de usar los modelos de tratamiento de xenoinjerto descritos antes de la línea celular de cáncer pancreático humano PK-59, se analizó la actividad antitumoral del clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto y modelos de tratamiento de xenoinjerto de una línea celular de cáncer pancreático BxPC-3 humano.
Cuando se compara con un grupo de control (N = 8), el crecimiento tumoral del grupo de administración del clon K-70 se inhibió significativamente. En el 52v0 día (Día 52), el volumen tumoral del grupo de administración del clon K5-70 (N = 8) fue 236.0 ± 136.4 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 616.3 ± 266.8 mm3. Así, el clon K-70 exhibió un efecto inhibidor del crecimiento tumoral de 61.7% (P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 15).
De los resultados anteriormente mencionados, se hizo evidente que el anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 exhibe actividad inhibidora del crecimiento tumoral significante in vivo en por lo menos dos especies de células cancerosas.
[Ejemplo 18] [Actividad antitumoral dependiente de dosis del anticuerpo anti-hTROP-2 (clon K5-70) en modelos de prevención de xenoinjerto de línea celular de cáncer pancreático que expresa hTROP-2 (células PK-59)] Con el fin de analizar más detalladamente la actividad inhibidora del crecimiento tumoral in vivo del anticuerpo anti-hTROP-2, se realizó una prueba dependiente de dosis. Como se muestra en la Figura 16, el crecimiento tumoral de las células PK-59 fue inhibido dependientemente de dosis mediante la administración del anticuerpo K5-70. En el 21vo día después de la administración de anticuerpo (Día 21), el volumen tumoral del grupo de control (N = 8) fue 937.8 ± 295.3 mm3. Por una parte, el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8) fue 493.5 ± 305.1 mm3, que muestra un índice inhibidor del 50%, y el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8) fue 124.7 ± 89.0 mm3, que muestra un índice inhibidor del 90%. Así, se hizo evidente que, en comparación con el anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 conocido (Número de Patente Americana 7420041), el anticuerpo anti-hTROP-2 de la presente invención exhibe in vivo un efecto inhibidor del crecimiento tumoral equivalente al del anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2 a una dosis de una-vigésima del anticuerpo AR47A6.4.2 anti-TROP-2, y que exhibe un mayor efecto inhibidor del 90% en una dosis de un cuarto del mismo.
[Ejemplo 19] [Ensayo del epítopo] Preparación de la proteína TROP-2 quimérica humana/de ratón Se preparó un gen TROP-2 humano/de ratón de acuerdo con un método de PCR. Los cebadores de PCR como se muestra a continuación se diseñaron basados en una secuencia del gen TROP-2 humano y una secuencia del gen TROP-2 de ratón (Número de acceso de Genbank N _020047).
Cebadores TROP-2-C humano/de ratón Y606 (lado directo): 5'-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3' (SEC ID NO: 10) Y607 (lado inverso): 5'-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3' (SEC ID NO: 11) Cebadores TROP-2-A humano/de ratón Y612 (lado directo): 5'-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3' (SEC ID NO: 12) Y613 (lado inverso): 5'-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3' SEC ID NO: 13) Cebadores TROP-2-B humano/de ratón Y614 (lado directo): 5'-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3' (SEC ID NO: 14) Y615 (lado inverso): 5'-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3' (SEC ID NO: 15) Cebadores TROP-2-D de ratón/humano Y608 (lado directo): 5'-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3' (SEC ID NO: 16) Y609 (lado inverso): 5'-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3' (SEC ID NO: 17) Cebadores TROP-2-E de ratón/humano Y616 (lado directo): 5'-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3' (SEC ID NO: 18) Y617 (lado inverso): 5'-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3' (SEC ID NO: 19) Cebadores TROP-2-F de ratón/humano Y618 (lado directo): 5'-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3' (SEC ID NO: 20) Y619 (lado inverso): 5'-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3' (SEC ID NO: 21) Cebadores TROP-2 de ratón Cebador directo: 5-ctactccaccccaccctggcg-3' (SEC ID NO: 22) Cebador inverso: 5'-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3' (SEC ID NO: 23) Al cebador inverso TROP-2 de ratón, se agregó una secuencia digerida por enzima de restricción Xho\ a excepción de un codón de detención. Una vista esquemática de las proteínas TROP-2 quiméricas humano/de ratón preparadas se muestra en la Figura 17.
La proteína quimérica hmTROP-2-? es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N- terminal al aminoácido en la posición 69 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 64 a la C-terminal de la proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica hmTROP-2-? es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 101 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 96 a la C-terminal de la proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica hmTROP-2-C es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 145 de la proteína hTROP-2 y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 140 a la C-terminal de la proteína TROP-2 de ratón. La proteína quimérica mhTROP-2-D es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 139 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 146 a la C-terminal de la proteína hTROP-2. La proteína quimérica mhTROP-2-? es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 187 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 194 a la C-terminal de la proteína hTROP-2. La proteína quimérica mhTROP-2-F es una proteína quimérica, que consiste de un polipéptido que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 227 de la proteína TROP-2 de ratón y un polipéptido que oscila desde el aminoácido en la posición 234 a la C-terminal de la proteína hTROP-2.
Los vectores de expresión usados en la preparación de las proteínas quiméricas descritas antes se construyeron específicamente mediante los siguientes métodos. A fin de preparar un gen quimérico hmTROP-2-?, se usó el gen hTROP-2 como un molde, y se realizó PCR al usar el cebador directo hTROP-2 y el cebador TROP-2-A humano/de ratón Y613. Asimismo, se usó el gen TROP-2 de ratón como un molde, y se realizó PCR al usar el cebador TROP-2-A humano/de ratón Y613 y la cebador inverso TROP-2 de ratón. Se desarrolló un fragmento de ADN amplificado mediante el PCR al usar el gel de acrilamida, y una banda de interés entonces se recuperó mediante extracción. Posteriormente, se mezclaron los dos tipos extraídos de fragmentos de ADN para preparar un molde, y se realizó el PCR entonces al usar el cebador directo hTROP-2 y el cebador inverso TROP-2 de ratón. Se desarrolló un producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, y un fragmento de ADN de interés entonces se extrajo. Se clonó el fragmento de ADN extraído en un vector PCR Blunt (marca registrada) (Invitrogen) (pCRB-hmTROP-2-?), y una secuencia de gen entonces se confirmó. Se produjo un vector de expresión para células animales eliminando el gen hTROP-2 de pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His mediante digestión de EcoR\/Xho\, y después insertando en el mismo un fragmento de EcoRI/???? que contenía un gen quimérico hmTROP-2-? preparado a partir de pCRB-hmTROP-2-? (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). Adicionalmente, se prepararon los siguientes genes quiméricos por el mismo método como se describe anteriormente, y se construyeron los vectores de expresión: hmTROP-2-? (al usar un cebador directo TROP-2 humano, un cebador TROP-2-B humano/de ratón Y615, un cebador TROP-2-B humano/de ratón Y614 y un cebador inverso TROP-2 de ratón), hmTROP-2-C (al usar un cebador directo TROP-2 humano, un cebador TROP-2-C humano/de ratón Y607, un cebador TROP-2-C humano/de ratón Y606 y un cebador inverso TROP-2 de ratón), mhTROP-2-D (al usar un cebador directo TROP-2 de ratón, un cebador TROP-2-D de ratón/humano Y609, un cebador TROP-2-D de ratón/humano Y608 y un cebador inverso TROP-2 humano), mhTROP-2-? (al usar un cebador directo TROP-2 de ratón, un cebador TROP-2-E de ratón/humano Y617, un cebador TROP-2-E de ratón/humano Y616 y un cebador inverso TROP-2 humano), mhTROP-2-F (al usar un cebador directo TROP-2 de ratón, un cebador TROP-2-F de ratón/humano Y619, un cebador TROP-2-F de ratón/humano Y618 y un cebador inverso TROP-2 humano) (pcDNA3.1 -hmTROP-2-?-myc/His, pcDNA3.1 -hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1 -mhTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1 -mhTROP-2-E-myc/His, y pcDNA3.1 -mhTROP-2-F-myc/His).
Establecimiento de líneas celulares HEK293, que constitutivamente expresan hTROP-2, TROP-2-C humano/de ratón y proteínas quiméricas TROP-2-D de ratón/humano La expresión descrita antes vectores pcDNA3.1 -hTROP-2-myc/His, pcDNA3.1 -hmTROP-2-C-myc/His y pcDNA3.1 -mhTROP-2-D- T7yc/His cada uno se introdujo en células HEK293. Se realizó la selección al usar un antibiótico G418 (Calbiochem), y las líneas celulares HEK293 constitutivamente que expresan la proteína hTROP-2, se establecieron la proteína quimérica hmTROP-2-C y la proteína quimérica mhTROP-2-D.
Las regiones de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 K5-70, T5-86, K5-107, T6-4, T6-16 y K5-116-2-1, que habían exhibido efectos beneficiosos sobre los modelos de tratamiento de xenoinjerto de la línea celular de cáncer pancreático PK-59, se identificaron. Primero, la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 que exhibían efectos beneficiosos con las células HEK293, que expresan constantemente las proteínas quiméricas hmTROP-2-C y mhTROP-2-D, se examinó mediante análisis de FACS (Figura 18). Como un resultado, se encontró que los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 reaccionaron con hmTROP-2-C, pero que estos anticuerpos no reaccionaron con mhTROP-2-D. Por una parte, los anticuerpos T6-4 y T6-16 reaccionaron con mhTROP-2-D, pero no reaccionaron con hmTROP-2-C. A partir de estos resultados, se limitó la región de unión de cada uno de los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-84 y K5-116-2-1 a una región que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 145 de hTROP-2, y se limitó la región de unión de cada uno de los anticuerpos T6-4 y T6-16 a una región que oscila desde el aminoácido en la posición 146 a la región C-terminal de hTROP-2 (Figura 18).
Para analizar las regiones de unión más detalladamente, se prepararon los vectores usados en la expresión de las proteínas quiméricas hmTROP-2-?, hmTROP-2-?, mhTROP-2-? y mhTROP-2-F, y se analizó la reactividad de las proteínas quiméricas con los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 que exhibían efectos beneficiosos (Figura 19). Los vectores de expresión nuevamente preparados, que debían usarse en la expresión de las proteínas quiméricas, cada uno se introdujo en las células HEK293, y el análisis de FACS entonces se realizó, al usar células que expresaron transitoriamente las proteínas quiméricas. Los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 reaccionaron con hmTROP-2-?, pero no reaccionaron con mhTROP-2-?. Los 6 tipos examinados de anticuerpos monoclonales reaccionaron todos con hTROP-2. Estos resultantes mostraron claramente que la región de unión de los anticuerpos K5-70, K5-107, T5-86 y K5-116-2-1 está presente en una región que oscila desde la N-terminal al aminoácido en la posición 69 de hTROP-2. Por otra parte, los anticuerpos T6-4 y T6-16 no reaccionaron con mhTROP-2-? ni mhTROP-2-F. Esto sugirió que estos anticuerpos reconozcan una región que oscila desde el aminoácido en la posición 146 al aminoácido en la posición 193 de hTROP-2.
[Ejemplo 20] [Inmunohistoquímica] <Materiales/Método> Las siguientes matrices de tejido normal y de cáncer se usaron en inmunohistotinción.
Matrices de tejido humano normal: Órganos humanos, normales en duplicado (Número de Catálogo: AB1, Super Bio Chips) Tejidos normales más manchas individuales (Número de Catálogo: A103(VI), ISU ABXIS) Matrices de tejido de cáncer de pulmón: Cáncer-metástasis-normal de pulmón humano (Número de Catálogo: CCA3, Super Bio Chips) Tejido de carcinoma de pulmón humano con tejido de margen, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-Rsl_ug03-002, Shanghai Outdo Biotech) Matriz de tejido de cáncer pancreático: Tejido de carcinoma del páncreas humano con tipo mono-patológico a partir de 60 casos, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-DgPan03-001 , Shanghai Outdo Biotech) Matrices de tejido de cáncer de hígado: Carcinoma hepatocelular, grados I a III con controles de tejido normal, 63 casos de matrices de tejido (Número de Catálogo: CS03-01 -002U, Cybrdi) Tejido de carcinoma de hígado humano con tipo mono- patológico a partir de 30 casos, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech) Matrices de tejido de cáncer colorrectal: Cáncer colorrectal humano (Número de Catálogo: CD3, Super Bio Chips) Carcinoma de colon humano con tejido de margen, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-DgCol03-002, Shanghai Outdo Biotech) Metástasis de nodulos linfáticos de cáncer colorrectal y matrices de tejido de metástasis de hígado: Cáncer colorrectal (colon y recto) con matriz de tejido de metástasis de nodulos linfáticos compatibles, 44 casos/99 núcleos, portaobjeto de ensayo (Número de Catálogo: C0991t, Biomax us) Cáncer colorrectal (colon y recto) con metástasis de nodulos linfáticos compatibles y matriz de tejido adyacente normal, 43 casos/99 núcleos (Número de Catálogo: C0992, Biomax us) Metástasis del hígado de tejidos de cáncer de colon (Número de Catálogo: A203 (IV), ISU ABXIS) Matrices de tejido de cáncer de mamas: Cáncer-metástasis-normal de mamas humanas (Número de Catálogo: CBA3, Super Bio Chips) Carcinoma de mamas humanas con tejido de margen, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-RpBre03- 002, Shanghai Outdo Biotech) Matrices de tejido de cáncer de estómago: Cáncer de estómago humano (Número de Catálogo: CQ1, Super Bio Chips) Carcinoma gástrico humano con tejido de margen, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech) Matriz de tejido de cáncer de esófago: Cáncer de esófago humano (Número de Catálogo: CR1, Super Bio Chips) Carcinoma esófago humano con tejido de margen, 2 núcleos de localización (Número de Catálogo: OD-CT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech) Matriz de tejido de cáncer ovárico: Cáncer de ovario humano (Número de Catálogo: CJ1, Super Bio Chips) Matriz de tejido de cáncer de próstata: Cáncer de próstata normal humano (Número de Catálogo: CA3, Super Bio Chips) Matriz de tejido de cáncer de vejiga: Carcinoma de vejiga/carcinoma de célula transitoria, grados I a III con matrices de tejido normal (Número de Catálogo: CC12-01-001U, Cybrdi) La información del paciente y la información clínica con respecto a las matrices de tejido descritas antes se obtuvieron a partir de las hojas de datos que se adjuntan y las páginas principales de compañías individuales.
Método de Inmunohistotinción Después de la terminación de un tratamiento de desparafinización, se sometieron los portaobjetos de matriz de tejido de tejidos normales humanos y tejidos de cáncer a un tratamiento de proteasa con pepsina a 37°C durante 5 minutos. Después de lo anterior, las secciones se usaron en inmunotinción al usar un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. Se realizó una reacción de color al usar la DAB(3,3'-diaminobencidina) como un sustrato, y como un teñido contrario, el teñido nuclear entonces se realizó al usar hematoxilina.
Más específicamente, estas operaciones se realizaron como sigue. Se sometió una sección incrustada en parafina a un tratamiento de desparafinización, y después sometió a un tratamiento de proteasa con pepsina (DAKO) a 37°C durante 5 minutos. Después de la activación del antígeno, se trató la sección a temperatura ambiente durante 20 minutos al usar una solución preparada agregando una solución de peróxido de hidrógeno al metanol a una concentración final de 0.3%, de modo que la actividad de peroxidasa endógena se eliminó. Se lavó el resultante con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos dos veces, y entonces se bloqueó a temperatura ambiente durante 30 minutos al usar una solución de PBS que contenía 1.5% de sueros de caballo normal (DAKO), así como para realizar una operación para bloquear la unión no específica en los tejidos. Posteriormente, el resultante se hizo reaccionar con el clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (concentración final: 10 g/ml), que habían sido diluido con una solución de PBS que contenía 1.5% de suero de caballo normal, a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces. Después de lo anterior, un anticuerpo IgG anti-ratón biotinilado (Vector), que había sido 200 veces diluido con una solución de PBS que contenía 1.5% de suero de caballo normal, se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lavó el producto de reacción con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces, y se mezcló un reactivo del kit de Vectastain ABC (Vector) de acuerdo con el manual de instrucción incluido con el mismo, a fin de preparar un complejo de ABC. Este complejo de ABC se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lavó el producto de reacción con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces, y el desarrollo de color entonces se realizó al usar la solución de DAB de Tinción Simple de Sustrato de Histofina Peroxidasa (Nichirei Biosciences). Después de la terminación del desarrollo de color, se lavó el producto de reacción con agua desionizada durante 5 minutos, y el núcleo se tiño con solución de hematoxilina de Mayer (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.). Después de lo anterior, se realizó la deshidratación con alcohol, seguido por penetración con xileno y montaje en Enteilan New (Merck Japón). <Resultados> Expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos Se analizó el patrón de expresión de hTROP-2 en tejidos normales humanos al usar el clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2. Se deparafinizó una matriz de tejido normal humano (Número de Catálogo: AB1, Super Bio Chips), y después se sometió a un tratamiento hidrofílico. Después de lo anterior, se activó el antígeno con una proteasa, pepsina, y la inmunotinción entonces se realizó al usar el clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (Figura 20). Como un resultado, se observó el teñido en la piel, esófago, riñon (corteza y médula), páncreas, próstata, vejiga y amígdalas. Una mayoría de las imágenes teñidas localizadas en la membrana celular (Figura 20A, B, C, D, F, G y H), pero las expresión hTROP-2 se observó parcialmente incluso en el citoplasma (Figura 20E y H). Por una parte, tal teñido no se observó en el corazón, hígado, estómago, intestino delgado, intestino grueso, músculo esquelético, pulmón, bazo, glándula de timo y similares (Figura 20I y J).
Expresión de hTROP-2 en tejidos de cáncer humano Para examinar la expresión de hTROP-2 (índice de hTROP-2-positivo) en tejidos de cáncer humano, las matrices de tejido de cáncer de varias especies de cáncer humano se inmunotiñeron al usar el clon K5-63-17 de anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2.
Una sección de tejido, en la cual 10% o más de células cancerosas se tiñeron, se define como hTROP-2-positivo. Los resultantes de teñido se muestran en la Figura 4.
Tabla 4 Se muestran las imágenes teñidas representativas en la Figura 21. Entre la especies de cáncer, con respecto a que la expresión de hTROP-2 había sido analizada, el cáncer de próstata tenía mayor índice positivo (92.1%), y también, el cáncer de pulmón (65.4%), cáncer de esófago (76.7%), cáncer de vejiga (71.2%) y similares tenía altos índices positivos. El cáncer de hígado tenía inferior índice positivo (7.61%). Se observó a partir de imágenes teñidas que, como con células normales, hTROP-2 se localizó altamente en la membrana celular incluso en el caso de células cancerosas (Figura 21 A a F, H e I). Además, hTROP-2 también se localizó en el citoplasma en algunos casos (Figura 21A, B, E y G).
El índice de hTROP-2-positivo en cáncer pancreático fue 41.9%. Se analizó la relación entre este índice de hTROP-2-positivo y el grado (grado de diferenciación) del cáncer pancreático. Como un resultado, se expresó hTROP-2 a alta frecuencia en cáncer pancreático con un alto grado, es decir, con un bajo grado de diferenciación (Figura 5).
Tabla 5 Puntos de hTROP-2-positivo de cáncer pancreático 26/62 (41.94%) Grado - + índice positivo I 8 0 0% ?-? 5 0 0% ? 19 21 52.5% ?-?? 4 5 55.6% p<0.01 total 36 26 [Ejemplo 21] [Actividad antitumoral del anticuerpo K5-70 mediante simple administración en modelos de prevención de xenoinjerto de línea celular humana PK-59 de cáncer pancreático] Se exhibió fuerte actividad antitumoral in vivo de un clon K5-70 (lgG2a de ratón) incluso mediante una simple administración de K5-70 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal a los modelos de prevención de xenoinjerto al usar una línea celular humana PK-59 de cáncer pancreático. En un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal, N = 3), se observó la formación de tumores en todos los individuos, y el volumen tumoral en el 28v0 día después del trasplante celular (Día 28) fue 781.7 ± 74.5 mm3. Por una parte, en un grupo en el cual se administró el anticuerpo K5-70 solamente una vez en el día del trasplante de células cancerosas (Día 1 ) (10 mg/kg de peso corporal, N = 3), el volumen tumoral en el Día 28 fue 144.4 ± 176.9 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), mostrando la actividad inhibidora de crecimiento tumoral de 81.5% (Figura 22A). Con respecto a masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control en el día 28 fue 0.59 ± 0.06 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo de clon K5-70 fue 0.07 ± 0.10 g (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), que muestra una actividad inhibidora del 88% (Figura 22B). Con respecto al volumen tumoral y a la masa de tumor, la formación de tumores se inhibió totalmente en 2 de cada 3 individuos en el grupo de administración de anticuerpo K5-70 a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal por administración (Figura 22C).
[Ejemplo 22] [Actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 en modelos de tratamiento de xenoinjerto de línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Se examinó la actividad antitumoral de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-hTROP-2 (clones K5-70, K5-116-2- 1, y T6-16) con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 * 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad (Día 1). Cuando el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se realizó la agrupación (Día 7 o Día 10). A partir del Día 7 o del Día 10, se realizó la administración intraperitoneal del anticuerpo a intervalos de administración de una vez cada tres días. Se evaluaron la actividad antitumoral del anticuerpo del clon K5-70 y las actividades antitumores del anticuerpo del clon K5-116-2-1 y el anticuerpo del clon T6-16 mediante estudios independientes, por separado. En el estudio de evaluación la actividad antitumoral del anticuerpo K5-70, el volumen tumoral de un grupo de control (IgG de ratón (10 mg/kg de peso corporal), N = 8) en el 44v0 día después del trasplante de células cancerosas (Día 44) fue 365.4 ± 214.6 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) fue 27.4 ± 29.4 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores se inhibió significativamente en el grupo de administración K5-70 (relación inhibidora: 92.5%) (Figura 23A). Con respecto a la masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control fue 0.11 ± 0.07 g, mientras que la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 0.005 ± 0.007 (g) (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), que muestra un índice inhibidor de 95.5% (Figura 23B). En particular, en dos fuera de los ocho ratones individuales en el grupo de administración de anticuerpo K5-70, la formación tumoral se inhibió totalmente, y la presencia de tumor no podría ser confirmada.
En el estudio para evaluar las actividades antitumores del anticuerpo K5-116-2-1 y del anticuerpo T6-16, que se realizó por separado, el volumen tumoral del grupo de control en el Día 42 fue 713.8 ± 354.5 mm3 (N = 8). En cambio, el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-116-2-1 (10 mg/kg de peso corporal) fue 188.9 ± 97.4 mm3 (N = 8, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 24A), y el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) fue 292.8 ± 199.7 mm3 (N = 8, P < 0.05 mediante la prueba t de Student) (Figura 25A). Así, los dos grupos de administración anteriormente mencionados mostraron índices inhibidores de 73.5% y 59.0%, respectivamente. Con respecto a la masa de tumor también, la masa de tumor del grupo de control fue 0.39 ± 0.19 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-116-2-1 fue 0.10 ± 0.07 g (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 fue 0.17 ± 0.14 g (P < 0.05 mediante la prueba t de Student). Así, los dos grupos de administración anteriormente mencionados mostraron índices inhibidores de 72.2% y 56.4%, respectivamente (Figura 24B y Figura 25B).
[Ejemplo 23] [La actividad antitumoral dependiente de dosis del clon K5-70 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Posteriormente, se examinó la actividad antitumoral dependiente de dosis del anticuerpo K5-70 con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 ? 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) en los cuales el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se dividieron los ratones en un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de grupo de administración de peso corporal, N = 8, 104.4 ± 17.6 mm3), un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104.3 ± 16.1 mm3), un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104.6 ± 15.9 mm3), y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 104.8 ± 14.9 mm3). Entonces, se realizó la administración intraperitoneal a intervalos de administración de una vez cada tres días. El día 42, el volumen tumoral del grupo de control fue 713.8 ± 354.5 mm3. Por una parte, en los grupos de administración de anticuerpo K5-70, se observó la actividad inhibidora de formación del tumor dependiente de dosis. Es decir, el volumen tumoral del grupo de administración de peso corporal de 1 mg/kg fue 485.0 ± 207.3 mm3 (índice inhibidor: 32.1%), el volumen tumoral del grupo de administración del peso corporal de 5 mg/kg fue 339.5 ± 253.2 mm3 (índice inhibidor: 52.4%), y el volumen tumoral del grupo de administración del peso corporal de 10 mg/kg fue 355.4 ± 202.8 mm3 (índice inhibidor: 50.2%, P < 0.05 mediante la prueba t de Student) (Figura 26A). Asimismo, con respecto a masa de tumor en el día 42, la masa de tumor del grupo de control fue 0.39 ± 0.19 g. Por una parte, la masa de tumor del grupo administración de anticuerpo K5-70 (1 mg/kg de peso corporal) fue 0.24 ± 0.11 g (índice inhibidor: 37.8%), la masa de tumor del grupo de administración de peso corporal de 5 mg/kg fue 0.17 ± 0.14 g (índice inhibidor: 55.8%, P < 0.05 mediante la prueba t de Student), y la masa de tumor del grupo de administración de peso corporal de 10 mg/kg fue 0.20 ± 0.13 g (índice inhibidor: 47.1%). Así, se confirmó la actividad antitumoral dependiente de dosis (Figura 26B).
[Ejemplo 24] [Análisis de intervalos de administración de anticuerpo K5-70 a modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Posteriormente, para analizar los óptimos intervalos de administración del anticuerpo K5-70, se examinó la actividad antitumoral del clon K5-70 cuando se administró una vez por semana (una vez cada 7 días) con modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 ? 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) en los cuales el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se dividieron los ratones en un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104.42 ± 15.1 mm3) y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104.3 ± 16.1 mm3). Entonces, se realizó la administración intraperitoneal una vez cada 7 días. En el día 42, el volumen tumoral del grupo de control fue 713.8 ± 354.5 mm3, mientras que el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 (administrado una vez por semana) fue 332.3 ± 239.9 mm3 (índice inhibidor: 55%, P < 0.05 mediante la prueba t de Student) (Figura 27A). Por otra parte, cuando se aumentó el intervalo de administración una vez a cada 10 días y una vez a cada dos semanas, el volumen tumoral del grupo de control en el día 39 fue 956.9 ± 367.8 mm3. Por una parte, el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 (administrado una vez que cada 10 días) en el día 39 fue 525.4 ± 180.6 mm3 (índice inhibidor: 45.1%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 (administrado una vez que cada 2 semanas) fue 459.4 ± 217.6 mm3 (índice inhibidor: 52.0%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 27B). En las técnicas anteriores (US 7420040 y US 7420041), cuando se administraron los anticuerpos a los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular del cáncer pancreático (BxPC-3) a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, tres veces a la semana (a intervalos de administración de 2 días), los anticuerpos exhibieron actividad antitumoral a un índice inhibidor del 50% al 60%. En cambio, el anticuerpo K5-70 exhibió actividad antitumoral equivalente a las de las técnicas anteriores, a una dosis de la mitad de las técnicas anteriores (10 mg/kg de peso corporal), una vez cada 2 semanas (a intervalos de administración de 13 días). Por consiguiente, se hizo evidente que el anticuerpo K5-70 exhibió actividad antitumoral significante a una dosis total de por lo menos una duodécima de los de las técnicas anteriores.
[Ejemplo 25] [La actividad antitumoral dependiente de dosis del anticuerpo T6-16 en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Posteriormente, se examinó la actividad antitumoral dependiente de dosis del anticuerpo T6-16 con modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 * 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de ratones NOD-scid hembras de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) en los cuales el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se dividieron los ratones en un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 105.8 ± 9.9 mm3), un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (1 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104.4 ± 13.3 mm3), un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (5 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104.7 ± 13.0 mm3), y un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 104.8 ± 12.4 mm3). Entonces, se realizó la administración intraperitoneal a intervalos de administración de una vez cada tres días. En el día 43, el volumen tumoral del grupo de control fue 473.5 ± 137.0 mm3. Por una parte, en los grupos de administración de anticuerpo T6-16, se observó la actividad inhibidora de la formación dependiente de dosis del tumor. Es decir, el volumen tumoral del grupo de administración de peso corporal de 1 mg/kg fue 397.9 ± 97.5 mm3 (índice inhibidor: 16.0%), el volumen tumoral del grupo de administración de peso corporal de 5 mg/kg fue 195.9 ± 89.7 mm3 (índice inhibidor: 58.7%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de peso corporal de 10 mg/kg fue 190.2 ± 56.5 mm3 (índice inhibidor: 59.8%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 28A). Asimismo, con respecto a la masa de tumor en el Día 43, la masa de tumor del grupo de control fue 0.19 ± 0.07 g. Por una parte, la masa de tumor del grupo administración de anticuerpo T6-16 (1 mg/kg de peso corporal) fue 0.20 ± 0.08 g, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 (5 mg/kg de peso corporal) fue 0.08 ± 0.04 g (índice inhibidor: 57.9%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) fue 0.09 ± 0.04 g (índice inhibidor: 52.6%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student). Así, se confirmó la actividad antitumoral dependiente de dosis (Figura 28B).
[Ejemplo 26] [Análisis de intervalos de administración de anticuerpo T6-16 a modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Posteriormente, para analizar los óptimos intervalos de administración de anticuerpo T6-16, la actividad antitumoral del clon T6-16 cuando se administró a intervalos de administración de una vez por semana (una vez cada 7 días) y una vez cada 10 días se examinó con modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 x 1 O6 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón NOD-scid hembra de 6 semanas de edad. Diez días después del trasplante (Día 10) en los cuales el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se dividieron los ratones en un grupo de control (IgG de ratón, 10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 105.8 ± 9.9 mm), un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (una vez por semana) (10 mg/kg de peso corporal, N = 8, 105.0 ± 11.6 mm3), y un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (una vez cada 10 días) (10 mg/kg de peso corporal, N = 5, 130.8 ± 2.4 mm3). Entonces, se inició la administración. En el día 43, el volumen tumoral del grupo de control fue 473.5 ± 137.0 mm3. Por una parte, el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo T6-16 (una vez por semana) fue 243.7 ± 65.3 mm3 (índice inhibidor: 48.5%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo T6-16 (una vez que cada 10 días) fue 297.8 ± 54.4 mm3 (índice inhibidor: 37.1%, P < 0.05 mediante la prueba t de Student) (Figura 29). En las técnicas anteriores (US 7420040 and US 7420041), cuando se administraron los anticuerpos a los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular de cáncer pancreático (BxPC-3) a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, tres veces a la semana (a intervalos de administración de 2 días), los anticuerpos exhibieron actividad antitumoral a un índice inhibidor del 50% al 60%. En cambio, el anticuerpo T6-16 exhibió actividad antitumoral significante, cuando se administró a una dosis de la mitad de las técnicas anteriores y a una frecuencia una vez cada 10 días (a intervalos de administración de 9 días). Por consiguiente, se hizo evidente que el anticuerpo T6-16 exhibió actividad antitumoral significante a una dosis total de por lo menos un octavo de los de las técnicas anteriores.
[Ejemplo 27] [Análisis de actividad antitumoral del clon K5-70 en modelos de prevención de xenoinjerto al usar la línea celular DU- 45 de cáncer de próstata humana] Se evaluó la actividad antitumoral del clon K5-70 en cáncer de próstata humana con modelos de prevención de xenoinjerto al usar células DU-145 ( IKEN Cell Bank, RCB2143). Las células DU-145 (5 x 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en cada ratón desnudo hembra de 6 semanas de edad (Balb/c, nu/nu). El día en el cual el trasplante se realizó se definió como el día 1. Los ratones se dividieron en un grupo de control (IgG de ratón) (N = 8) y un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (N = 8). A partir del día 1, el anticuerpo K-70 y el anticuerpo de control se administraron intraperitonealmente a los ratones a una frecuencia de una vez cada 3 días a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. En el día 40, el volumen tumoral del grupo de control fue 368.2 ± 307.8 mm3. Por una parte, el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 30.6 ± 29.6 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), que muestra una actividad inhibidora de formación tumoral de aproximadamente 90% (Figura 30A). Con respecto a la masa de tumor, se observó la actividad antitumoral significante adicional. La masa de tumor del grupo de control en el día 40 fue 0.18 ± 0.18 g. En cambio, en el grupo de administración de anticuerpo K5-70, los tumores desaparecieron de todos los 8 ratones individuales, y así, la formación de tumores fue inhibida totalmente (Figura 30B). A partir de los resultantes anteriormente mencionados, se hizo evidente que el clon K5-70 de anticuerpo monoclonal TROP-2 anti-humano muestra fuerte actividad antitumoral incluso en células de cáncer de próstata humana.
[Ejemplo 28] [Actividad Inhibidora de metástasis de anticuerpo K5-70 en modelos de metástasis de hígado al usar la línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano] La metástasis del cáncer es un factor importante que influencia el pronóstico clínico en el tratamiento del cáncer gastrointestinal. El control de la metástasis es terapéuticamente de manera significante importante. Si no solamente la formación de tumores pero también la metástasis del cáncer a otros órganos podría suprimirse administrando un anticuerpo para el uso en la terapia contra el cáncer que dirige a TROP-2, alta utilidad clínica sería anticipada. Así, esto es una propiedad deseada como un anticuerpo terapéutico contra el cáncer.
La expresión de TROP-2 se confirmó en muchos tipos de carcinomas. Fue reportó que TROP-2 se expresó en un alto nivel particularmente en focos metastáticos (Br. J. Cáncer (2008); 99: 1290-1295, Clin. Cáncer Res. (2006); 12: 3057-3063, Mod. Pathol. (2008); 21: 186-191). Por otra parte, también se reportó que, cuando las células cancerosas introducidas por el gen Trop-2 se trasplantaron un ratones desnudos a través de la administración transesplénica o transpancreástica, la incidencia de la metástasis de hígado aumentó (WO 2010/089782, Molecular Cáncer (2010); 9: 253), y así, el reporte sugirió la importancia de TROP-2 en el proceso de la metástasis del cáncer. Sin embargo, hasta la fecha, no ha habido reportes que describan específicamente que un anticuerpo que dirige TROP-2 tiene acción inhibidora de metástasis in vivo.
El anticuerpo monoclonal K5-70 anti-hTROP-2 de ratón, que fue descubierto por la presente invención, exhibe altos efectos terapéuticos sobre los modelos de xenoinjerto, en la hipodermis de la cual se han trasplantado células cancerosas pancreáticas humanas. Se demostró mediante un ensayo de raspado realizado in vitro que el anticuerpo K5-70 es capaz de suprimir la capacidad de migración de una línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano, además del efecto de suprimir el crecimiento de células cancerosas. Así, se consideró que el anticuerpo K5-70 podría inhibir la metástasis del cáncer in vivo. Por lo tanto, se examinó el efecto inhibidor de la metástasis de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-hTROP-2, al usar modelos en los cuales las células PK-59 se inyectaron en el bazo de ratones desnudos de modo que se desarrolló la metástasis del hígado.
En el día antes del trasplante de células cancerosas, los ratones se dividieron en grupos. Entonces, un anticuerpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5-70) o un anticuerpo de control (IgG de ratón purificado) se administró intraperitonealmente a los ratones a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. En el día siguiente, una línea celular de cáncer pancreático humano (PK-59) endógenamente que expresa hTROP-2 se cosechó mediante tratamiento con tripsina, y una suspensión celular de 2 ? 107 células/ml entonces se preparó con PBS. La suspensión celular se preservó en hielo hasta el trasplante. Se anestesió cada ratón desnudo hembra de 6 o 7 semanas de edad (Balb/c, nu/nu) mediante la administración intraperitoneal de pentobarbital , y 10 a 15 mm del flanco izquierdo del mismo se eliminaron bajo anestesia. El bazo se extrajo de la cavidad abdominal, y 50 µ? de suspensión celular (1 x 106 células) entonces se inyectaron en el bazo al usar una jeringa 27G. Cuatro minutos después de la inyección de las células, el h i I i o del bazo se ligó con 5-0 suturas de seda, y el bazo entonces se eliminó. El peritoneo de corte se cerró con 4-0 suturas de seda, y el sitio quirúrgico entonces se cerró con Clips para heridas (AUTOCLIP de 9 mm, Becton Dickinson). Además, siete días después del trasplante de la célula cancerosa, el anticuerpo K-70 y el anticuerpo de control se administraron a los ratones a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal. Cuatro a seis semanas después del trasplante de la célula cancerosa, se sometieron los ratones a eutanasia mediante dislocación cervical. Entonces, se eliminó el hígado de cada ratón, se confirmó y la presencia o la ausencia de focos metastáticos.
En el grupo de control en el cual la IgG de ratón se administró a los ratones, en 4 de hasta 6 ratones en los cuales las células PK-59 habían sido trasplantadas, se observaron focos metastáticos evidentes (2 a 7 focos) alrededor del lóbulo del hígado cuatro a seis semanas después del trasplante (Figura 31A, incidencia de metástasis: 67%, Figura 6). En cambio, en cuatro ratones en el grupo de administración de anticuerpo K5-70, en el cual las células PK-59 también habían sido trasplantadas, tales focos metastáticos no se observaron en el hígado de todos los ratones, y así, una incidencia de metástasis fue 0% (Figura 31B, Figura 6).
Tabla 6 Efecto de supresión de metástasis del clon K5-70 en modelos de la metástasis del hígado producido mediante trasplante transesplénico de células PK-59 en ratones desnudos Grupo de Semanas después Número de Número de foco Determinación de administración del trasplante individuos metastático la metástasis Grupo de control 4W C-1 4W C-2 6W C-3 6W C-4 6W C-5 6W C-6 Número promedio del Incidencia de 35 67% foco metastático metástasis Grupo de 4W K-1 administración K5-70 6W K-2 6W K-3 6W K-4 Número promedio del Incidencia de foco metastático metástasis o% A partir de estos resultantes, se hizo evidente que el anticuerpo K5-70 anti-hTROP-2 tiene acción inhibidora extremadamente fuerte en la metástasis del hígado de la línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano.
[Ejemplo 29] [Actividad antitumoral del anticuerpo K5-70 en modelos de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano, que son modelos de cáncer recurrente después de la administración del clorhidrato de irinotecán] En los últimos años, muchos fármacos quimioterapéuticos para suprimir el crecimiento de células cancerosas se han desarrollado como fármacos terapéuticos contra el cáncer. Estos fármacos han alcanzado ciertos resultantes de tratamiento. Sin embargo, estos fármacos quimioterapéuticos han sido problemáticas en términos de efectos secundarios asociados con la acción represiva del crecimiento de los mismos en células normales con excepción de las células cancerosas y la recurrencia del cáncer después de la suspensión del tratamiento. Por consiguiente, si la recurrencia del tumor después de la terminación del tratamiento con los fármacos quimioterapéuticos se podría suprimir mediante la administración de un anticuerpo terapéutico contra el cáncer dirigido a TROP-2, alta utilidad clínica sería anticipada. Así, esto es una propiedad deseada como un anticuerpo terapéutico contra el cáncer.
Como agentes terapéuticos para el cáncer colorrectal, además de 5-FU y fármacos que contienen platino, clorhidrato de irinotecán (Topotecina, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) que tiene un efecto inhibidor de topoisomerasa se han aplicado recientemente a sitios clínicos. Con respecto a los modelos animales así como, el efecto antitumoral del clorhidrato de irinotecán en modelos de ratón, en los cuales los varios tipos de células tumorales humanas incluyendo cáncer de colon como un ejemplo común había sido trasplantado, se han reportado (Cáncer Chemother Pharmacol. (1991); 28(3):192-8). Así, el efecto de prevención a recurrencia del anticuerpo monoclonal K5-70 anti-hTROP-2 de ratón (lgG2a de ratón) en el tumor recurrente después de la administración del clorhidrato de irinotecán se ha examinado con modelos de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 * 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de ratones NOD-scid hembras de 8 semanas de edad. Once días después del trasplante (Día 11) en el cual el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo sin tratar (grupo de administración de solución salina normal, N = 8, 130.7 ± 16.2 mm3) y un grupo de administración de clorhidrato de irinotecán (CPT-11, Topotecina, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) (N = 16, 123.0 ± 21.4 mm3). Después de lo anterior, el clorhidrato de irinotecán se administró intraperitonealmente a los ratones a una dosis de 40 mg/kg de peso corporal, una vez cada 3 días, total 3 veces (Días 11, 14, y 17). En el tercer día después de la administración final del clorhidrato de irinotecán (Día 20), el volumen tumoral del grupo sin tratar alcanzó 232.1 ± 21.1 mm3. Por una parte, el volumen tumoral del grupo de administración de clorhidrato de irinotecán fue 126.6 ± 26.6 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, se observó un efecto de supresión de tumor evidente. En esta etapa, se dividió el grupo de administración de clorhidrato de irinotecán en dos grupos basados en el tamaño de tumor. Se definió un grupo como un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8, volumen tumoral en el Día 20: 126.0 ± 28.0 mm3), y se definió otro grupo como un grupo de administración de IgG de ratón (peso corporal 10mg/kg, N = 8, volumen tumoral en el Día 20: 127.2 ± 27.0 mm3). Se realizaron la administración intraperitoneal de los anticuerpos y la medición de un volumen tumoral en cada grupo una vez cada 3 días, de modo que se evaluó la recurrencia de un tumor (Figura 32). En el grupo de administración de IgG de ratón, a partir del décimo octavo día después de la administración final de clorhidrato de irinotecán (Día 35), se observaron varios ratones que tenían un tumor recurrente evidente con un volumen tumoral de más de 300 mm3. En el trigésimo día después de la administración final del clorhidrato de irinotecán (Día 47), se observó un tumor con un volumen tumoral de más de 300 mm3 en 5 de los 8 ratones (volumen tumoral promedio: 401.7 ± 172.7 mm3). En cambio, en el grupo de administración de anticuerpo K5-70, la recurrencia del tumor se elimina significativamente, y el volumen tumoral promedio fue 180.5 ± 142.1 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student) (Figura 32). En particular, en el grupo de administración de anticuerpo K5-70, el volumen tumoral en el día 47 llegó a ser más pequeño que el volumen tumoral cuando los ratones se dividieron en los grupos (126.0 ± 28.0 mm3).
El volumen tumoral se volvió en menos de 100 mm3 en 4 de los 8 ratones. A partir de estos resultantes, se hizo evidente que el anticuerpo K5-70 anti-hTROP-2 tiene acción represiva extremadamente fuerte incluso en el tumor recurrente después de la administración del clorhidrato de irinotecán.
[Ejemplo 30] [Asignación del epítopo al usar tecnología de CLIPS] <Materiales y métodos> Síntesis del péptido 15-mer y 30-mer de péptidos lineales derivados de dominios extracelulares TROP-2, que se usaron en el presente experimento, se obtuvieron mediante síntesis fase sólida de acuerdo con un método de Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo). Además, para el análisis de epítopo discontinuo, un péptidos 17-mer derivado de un dominio extracelular TROP-2, a ambos extremos de los cuales los residuos de cisteína habían sido agregados, se sintetizaron, y una conformación que tenía una o dos estructuras de bucle se reconstruyeron mediante tecnología de CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds technology). Cuando otro residuo de cisteína estaba presente cerca del residuo de cisteína agregado, se sustituyó con alanina.
Evaluación de epítopo mediante ELISA 5034 tipos de los péptidos sintetizados covalentemente se unieron a las tarjetas de PEPSCAN (455 péptidos/tarjeta), y la unión de los péptidos sintetizados a anticuerpos entonces se analizó mediante el método de ELISA. Las tarjetas de PEPSCAN se dejaron reaccionar con anticuerpos monoclonales TROP-2 antihumanos (K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86, y T6-16) que habían sido diluidos a una concentración de 1 pg/ml con un amortiguador de bloqueo (un amortiguador de fosfato que contiene 4% de suero de caballo, 5% de ovalbumina, y 1% de Tween). Después del lavado, el resultante se dejó reaccionar con un complejo de anticuerpo secundario de peroxidasa diluido 1000 veces a 25°C durante 1 hora. Después del lavado, se agregó una solución de sustrato (una solución que contiene sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS, por sus siglas en inglés) y 2 µ? de solución de peróxido de hidrógeno al 3%) a la solución de reacción, seguida por una reacción cromogénica durante 1 hora. La actividad de unión de los anticuerpos se cuantificó fotografiando con una cámara CCD y después realizando un análisis de imagen. <Resultados> Los anticuerpos monoclonales K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 y T6-16 anti-hTROP-2, que exhibieron efectos beneficiosos, se sometieron a análisis de epítopo al usar tecnología de CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds). Debe observarse que el término "número de aminoácidos" se usa en los presentes ejemplos para entender el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 2 (proteína hTROP-2 (323 residuos de aminoácidos)).
El resultado del análisis para el anticuerpo K5-70 se muestra en la Tabla 7 a continuación. Como un resultado, se encontró que 33 péptidos exhiben fuerte actividad de unión al anticuerpo K5-70. En estos 33 péptidos, una secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (Números de aminoácidos 43-65) (Números de péptidos 1-7 y 9 mostrados en la Tabla 7), una secuencia que comprende HHILIDLRHRPTAG (Números de aminoácidos 152-165) (Números de péptidos 14, 22-24 y 28 mostrados en la Tabla 7), una secuencia que comprende VHYEQPTIQIELRQ (Números de aminoácidos 193-206) (Números de péptidos 8, 10, 12, 13, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30 y 32 mostrados en la Tabla 7), y una secuencia que comprende DLDAELRRLFRER (Números de aminoácidos 171-183) (Números de péptidos 11, 16, 18, 19, 21, 22, 29 y 31 mostrados en la Tabla 7) aparecieron repetidamente. El anticuerpo K5-70 particularmente de manera fuerte une a la secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD. A partir de estos resultados, sé sugirió que, en la proteína hTROP-2, los 4 tipos anteriormente mencionados de regiones de secuencia de péptido son probables que sean epitopos del anticuerpo K5-70.
Tabla 7 Unión del anticuerpo K5-70 a los péptidos CLIPS derivado a partir de los dominios extracelulares TROP-2 humano número péptido unión de K5-70 1 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2742 2 TVCSPDGPGGRCQCRAIGSG AVDCSTLTS 2604 3 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2562 4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2402 5 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 1770 6 PTNNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG AVDC 1391 7 VCSPDGPGGRCQCRALGSG AVDCSTITSK 932 8 CAAVHYEQPTIQIELRCAAVHYEQPTIQIELRC 876 9 CPTNK TVCSPDGPGGRCQCRALGSG AVD 839 10 CVHYEQPTIQIELRQNCVHYEQPTIQIELRQNC 825 11 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 725 12 RLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQ 687 13 AVHYEQPTIQIELRQ 642 14 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 624 15 CPK FVAAVH YEQPTIQCG LD LRVRG EPLQVERC 579 16 CHSDLDAELRRLFRERCGLDLRV 538 17 FQGRGGLDIRVRGEP 538 18 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 524 19 CHSDLDAELRRLFRERCRGEPLQ 519 20 CTIQIELRQNTSQKAACVHYEQPTIQIELRQNC 513 21 CVHYEQPTIQIELRQNCHSDLDAELRRLFRERC 511 22 CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 489 23 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 489 24 CHHILIDLRHR PTAG ACG LD LR VR G E PLQVE RC 488 25 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 483 26 CVHYEQPTIQIELRQNC 483 27 CAFNHSOLDAELRRLF CVHYEQPTIQIELRQNC 478 28 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 473 29 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 472 30 VHYEQPTIQIELRQNCGLDLRVRGEPLQVERC 470 31 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERC 469 32 AVHYEQPTIQIELRQCAVHYEQPTIQIELRQC 468 33 CHSDLDAELRRLFRERCDELVRTHHILIDLRHC 466 El resultado del análisis para el anticuerpo K5-107 se muestra en la Tabla 8 a continuación. Como un resultado, se encontró que una secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (Números de aminoácidos 43-65) se comprende en 10 de los 20 péptidos (Números de péptidos 1-6, 8, 9, 14 y 17 mostrados en la Tabla 8) (Tabla 8).
Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, la región de secuencia de péptido anteriormente mencionada que consiste de VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD puede ser un epítopo del anticuerpo K5-107.
Tabla 8 Unión del anticuerpo K5-107 a los péptidos CLIPS derivados a partir de dominios extracelulares humanos TROP-2 número péptido unión de 5-107 1 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2763 2 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2761 3 K TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2752 4 MTVCSPDG PGGRCQCRALGSG MAVDCSTLT 2726 5 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2723 6 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2720 7 TCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV 2716 8 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 2689 9 CSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKC 2655 10 CTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMA 2655 11 NCTCPTNK TVCSPDGPGGRCQCRALGSGM 2207 12 DNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG 1816 13 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 1525 14 CTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTLTSKC 1118 15 QDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGS 874 16 SPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCL 561 17 CTN MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTC 380 18 TVCSPDG PGG RCQCR 312 19 CAPKNARTLVRPSEHACARTLVRPSEHALVDNC 284 20 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 272 El resultado del análisis para el anticuerpo K5-116-2-1 se muestra en la Figura 9 a continuación. En este análisis, tres tipos de secuencias de péptido, es decir, una secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (Números de aminoácidos 43-65) (Números de péptidos 1-7, 15 y 25 mostrados en la Figura 9), una secuencia que comprende HHILIDLRHRPTAG (Números de aminoácidos 152-165) (Números de péptidos 8-11, 16, 17, 19, 20, 22-24, y 27-29 mostrados en la Tabla 9), y una secuencia que comprende DLDAELRRLFRER (Números de aminoácidos 171-183) (Números de péptidos 11-14, 17, 19, 21, 23 y 29 mostrados en la Tabla 9) aparecieron varias veces (Tabla 9). Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, estos tres tipos de regiones de secuencia de péptido pueden ser epítopos del anticuerpo K5-116-2-1.
Tabla 9 Unión del anticuerpo K5-116-2-1 a péptidos CLIPS derivados a partir de dominios extracelulares TROP-2 humano número péptido unión de K5-116-2-1 1 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2672 2 N KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG AVDCST 2613 3 TN KMTVCSPDGPGG RCQC RALGSGMAVDCS 2482 4 MTVCSPDGPGGRCQC RALGSGMAV DCSTLT 2440 5 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2423 6 CPTN KMTVCSPDGPGGRCQC RALGSGMAV D 2136 7 PTN KMTVCSPDGPG GRCQC RALGSGMAV DC 1723 8 CAGAFNHSDLDAELRRCHH1UDLRHRPTAGAC 1643 9 CTHHILIDLRHRPTAGC 1586 10 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 1504 11 CHHILIDLRHRPTAGCHSDLDAELRRLFRERC 1475 12 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1467 13 CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 1462 14 CDAELRRLFRERYRLHCPK 1442 15 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 1432 16 DLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNH 1421 17 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 1392 18 CFQGRGGLDLRVRGEPC 1376 19 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1366 20 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRFTAGAC 1342 21 CHSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1331 22 CDELVRTHHIUDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 1323 23 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1266 24 CHHI Ll DLRHRPTAGACRGEPLQVERTLIYYLC 1229 25 CSPDGPGGRCQC AL 1227 26 CTVASPDGPGGRAQARACVHYEQPTIQIELRQNC 1223 27 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 1222 28 LSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHS 1220 29 CDELVRTHHILIDLRHCHSDLDAELRRLFRERC 1205 Los resultantes del análisis para los anticuerpos T5-86 y Te¬ 16 se muestran en la Tabla 10 y la Tabla 11 a continuación, respectivamente. En estos análisis, los anticuerpos unidos fuertemente a un péptido que comprende una secuencia que consiste de DPEGRFKARQCN (Números de aminoácidos 109-120). La secuencia de péptido mencionada anteriormente se comprende en 22 de los 26 péptidos que unen al anticuerpo T5-86 (Números de péptidos 1-4, 6-8, 10-13, 15-19, y 21-26 mostrados en la Tabla 10), y se comprende en 4 de los 26 péptidos que unen al anticuerpo T6-16 (Números de péptidos 1, 2, 9 y 13 mostrados en la Tabla 11) (Tabla 10 y Tabla 11). Por otra parte, en el análisis con respecto al anticuerpo T5-86, con excepción de la secuencia que comprende DPEGRFKARQCN (Números de aminoácidos 109-120), una secuencia que comprende VCSPDGPGGRCQCRA (Números de aminoácidos 43-57) (Números de péptidos 5, 14 y 20 mostrados en la Tabla 10) aparecieron varias veces. Además, en el análisis con respecto el anticuerpo T6-16 así como, otra secuencia que comprende HHILIDLRHRPTAG (Números de aminoácidos 152-165) (Números de péptidos 4-8, 10-12, 19, 21, 23, 25 y 26 mostrados en la Tabla 11) se encontró varias veces. Por consiguiente, se sugirió que, en la proteína hTROP-2, dos tipos de regiones de secuencias de péptido, es decir, DPEGRFKARQCN (Números de aminoácidos 109-120) y VCSPDGPGGRCQCRA (Números de aminoácidos 43-57), pueden ser epítopos del anticuerpo K5-86. También se sugirió que, en la proteína hTROP-2, dos tipos de regiones de secuencias de péptido, es decir, DPEGRFKARQCN (Números de aminoácidos 109-120) y HHILIDLRHRPTAG (Números de aminoácidos 152-165), puede ser epítopos del anticuerpo T6-16.
Tabla 10 Unión del anticuerpo T5-86 a péptidos CLIPS derivados a partir de dominios extracelulares TROP-2 humano número péptido unión de T5-86 1 CYDPDADPEGRFKARQCADPEGRFKARQANQTC 2306 2 PDCDPEGRFKARQCN 2292 3 CADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 2287 4 VCSPDGPGGRCQCRA 2263 5 CYDPDADPEGRFKARQCPDADPEGRFKARQANC 2260 6 CADPEGRFKARQANQTCTDPDADPEGRFKARQC 2240 7 CADPEGRFKARQANQTCYDPDADPEGRFKARQC 2208 8 DCDPEGRFKARQCNQ 2150 9 CTVASPDGPGGRAQARCHSDLDAELRRIFRERC 2086 10 CDADPEGRFKARQANQCDADPEGRFKARQANQC 2035 11 DGRFKARQANQTSVAWCARTLVRPSEHALVDNC 2019 12 DADPEGRFKARQANQTCPDADPEGRFKARQANC 1980 13 CPDADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 1950 14 CSPDGPGGRCQCRAL 1946 1S CEGRFKARQANQTSVACEGRFKARQANQTSVAC 189S 16 CTVAS PDGPGG RAQARCPDAD PEG RFK ARQANC 1890 17 CGLYDPDADPEGRFKACPDADPEGRFKARQANC 1857 18 DPDCDPEGRFKARQCNCQTSVCWCVN5VGVR 1850 19 CPEGRFKARQANQTSVCDELVRHHILIDLRHC 1841 20 CPDGPGGRAQARALGSCHSDLDAELRRLFRERC 1830 21 CTLVR PS EH ALVD N DG CG RF K ARQANQTS VAWC 1820 22 CPDADPEGRFKARQANCYDPDADPEGRFKARQC 1795 23 CGLYDPDADPEGRFKACPEGRFKARQANQTSVC 1793 24 YDPDCDPEGRFKARQ 1775 25 CPDADPEGRFKARQANCADPEGRFKARQANQTC 1773 26 CDPEGRFKARQCNQT 1772 Tabla 11 Unión del anticuerpo T6-16 a péptidos CLIPS derivados a partir de dominios extracelulares TROP-2 humano número péptido le unión de T6-16 1 CVNSVGVRRTDKGDLSCPDCYDPDADPEGRFKARQC 1072 2 CSVG VRRTDKG DLSLRCYDPDADPEG RF KARQC 786 3 HSDLDAELRRLFRE CHSDLDAELRRLFRERC 714 4 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 713 5 CVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILI 688 6 VRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRP 670 7 CVERTLIYYLDEIPPKCHHILIDLRHRPTAGAC 626 8 CHHI Ll DLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFR ERC 620 9 CVNSVGVRRTDKGDLSCPDADPEGRFKARQANC 611 10 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 602 11 VGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRH 601 12 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC S92 13 CSVGVRRTDKGDLSLRCPDADPEGRFKARQANC 585 14 CVRPSEHALVDNDGLYCSVGVRRTDKGDLSLRC 573 15 CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 566 16 CSVGVRRTDKGDLSLRCNDGLYDPDADPEGRFC 559 17 CVNSVGVRRTDKGDLSCGLYDPDADPEGRFKAC 553 18 CDLDAELRRLFRERYRCHSDLDAELRRLF RE RC 534 19 CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 534 20 CAGAFNHSDLDAELRRCDLDAELRRLFRERYRC 529 21 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 527 22 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 526 23 CHHILIDIRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 524 24 CGVRRTDKGDLSLRADCGVRRTDKGDLSLRADC 524 25 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 521 26 CDLDAELRRLFRERYRCDELVRTHHILIDLRHC 516 [Ejemplo 31] [Secuencia de regiones variables de genes de anticuerpo de anticuerpos anti-hTROP-2 de ratón (clones K5-70, K5-107, K5-116-2-1 y T6-16)] Se extrajo el ARN total a partir de 3 " 106 hibridomas que producen el anticuerpo monoclonales anti-TROP-2 de ratón, al usar el reactivo de TRIzol (Invitrogen). Con respecto al clon K5-70, el clon K5-107 y el clon K5-116-2-1, se sintetizó ADNc empleando el kit de amplificación de ADNc de SMARTer™ RACE (Clontech) de acuerdo con el método incluido con el kit, al usar un cebador específico de cadena H de IgG de ratón (5'- TCCAKAGTTCCA-3' (SEC DE ID NO: 24)) y un cebador específico de cadena L de IgG de ratón (5'-GCTGTCCTGATC-3' (SEC DE ID NO: 25)). Con respecto al clon T6-16, se sintetizó el ADNc que emplea el kit de GeneRacer (Invitrogen) de acuerdo con el método incluido con el kit, al usar un cebador oligo-dt. Los genes que codifican las regiones variables (VH, VL) de las cadenas H y L del clon K5-70 (lgG2a de ratón), del clon K5-107 (lgG1 de ratón) y del clon K5-116-2-1 (lgG2a de ratón) se clonó cada uno mediante un método de PCR al usar el ADNc sintetizado antes como un molde. En esta operación, 10 * Mezcla de Cebador A Universal (UPM, por sus siglas en inglés) incluida con el kit de Amplificación del ADNc de SMARTer™ RACE se usó como un cebador 5'. Por una parte, mientras que el cebador 3' para la amplificación de VH, se usó un cebador que tenía una secuencia específica a la cadena H de IgG de ratón, y como un cebador 3' para la amplificación de VL, se usó un cebador que tenía una secuencia específica a la cadena L de IgG de ratón.
Cebador 5' (10 Mezcla de Cebador A Universal (UPM, por sus siglas en inglés)): Largo (0.4 µ?) 5'- CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT -3' (SEC DE ID NO: 26) Corto (2 µ?) 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEC DE ID NO: 27) Cebador 3' (cebador R): VH: 5'-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3' (SEC DE ID NO: 28) 5'-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3' (SEC DE ID NO: 29) VL: 5'-CACTGCCATCAATVCTCCACTTGACA-3' (SEC DE ID NO: 30) Al usar cada uno de los cebadores descritos antes, PCR se realizó bajo la siguiente composición de la solución de reacción y las condiciones de reacción. Además, se preparó un cebador R para la amplificación del ADNc de VH mezclando las dos secuencias anteriores entre sí a una relación equimolar y después se usó. <Composición de la solución de reacción> ADNc de molde: 2.5 µ? 5 x amortiguador de PrimeSTAR (Mg2+ más): 10 µ? 2.5 mM de dNTP: 4 µ? Polimerasa de ADN de PrimeSTAR HS (2.5 U/µ?): 0.5 µ? 10 x Mezcla de Cebador A Universal (UPM) 5 µ? Cebador R (10 µ?): 1 µ? Agua esterilizada: 27 ul Total: 50 µ? <Condiciones de reacción> Se realizó una reacción a 94°C (10 seg), y después de lo anterior, se realizó un ciclo que consiste de "desnaturalización /disociación por calor "a 98°C (10 seg) ? recocido a 60°C (5 seg) ? síntesis/elongación a 72°C (60 seg)" 30 veces en total.
Finalmente, se realizó una reacción a 72°C (3 min).
Se subclonaron los ADNc de VH y de VL sintetizados en un vector pMD20-T (Takara Bio Inc.), y se determinaron las secuencias de nucleótido de los mismos. Se descodificaron las secuencias de nucleótido de una pluralidad de clones de VH y de clones de VL, y se identificaron las secuencias de nucleótidos específicas a las regiones variables de cadena H y de cadena L de ratón. La Figura 33 y la Tabla 34 muestran las secuencias de nucleótido del ADNc de consenso de la VH y de la VL de K5-70, y las secuencias de aminoácidos putativas. La Figura 35 y la Tabla 36 muestran las secuencias de nucleótido del ADNc de consenso de la VH y de la VL de K5-107, y las secuencias de aminoácidos putativas. La Figura 37 y la Tabla 38 muestran las secuencias de nucleótido del ADNc de consenso de la VH y de la VL de K5-116-2-1, y las secuencias de aminoácidos putativas.
Se clonaron los genes que codifican las regiones variables (VH, VL) de las cadenas H y L del clon T6-16 mediante un método de PCR al usar el ADNc sintetizado antes como un molde. En esta operación, un cebador incluido con el kit de GeneRacer se usó como un cebador 5'. Por una parte, como el cebador 3' para la amplificación de VH, se usó un cebador que tenía una secuencia específica a la cadena H de IgG de ratón, y como un cebador 3' para la amplificación de VL, se usó un cebador que tenía una secuencia específica a la cadena L de IgG de ratón. Cebador 5' (cebador F): 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (SEC DE ID NO: 31) Cebador 3' (cebador R): VH: 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (SEC DE ID NO: 32) VL: 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEC DE ID NO: 33) Al usar cada uno de los cebadores descritos antes, se realizó PCR bajo la siguiente composición de la solución de reacción y las condiciones de reacción. <Composición de la solución de reacción> ADNc de molde: 1.0 µ I 5 x amortiguador de PrimeSTAR (Mg2+ más): 10 µ? 2.5 mM de dNTP: 4 µ? Polimerasa de ADN de PrimeSTAR HS (2.5 U/µ?): 0.5 µ? Cebador F (10 µ?): 3 µ? Cebador R (10 µ?): 1.0 µ? Agua esterilizada: 30.5 ul Total: 50 µ? <Condiciones de reacción> Se realizó in ciclo que consiste de "desnaturalización /disociación por calor "a 98°C (10 seg) ? recocido a 57°C (10 seg) ? síntesis/elongación a 72°C (60 seg)" 35 veces en total.
Se subclonaron los ADNc de VH y de VL sintetizadas en un vector pCR4Blunt-TOPO (I nvitrogen) , y se determinaron las secuencias de nucleótido de los mismo. Se descodificaron las secuencias de nucleótido de una pluralidad de clones de VH y de clones de VL, y se identificaron las secuencias de nucleótido específicas a las regiones variables de cadena H y de cadena L de ratón. La Figura 39 y la Tabla 40 muestran las secuencias de nucleótido del ADNc de consenso de la VH y de la VL de T6-16, y secuencias de aminoácidos putativas.
[Ejemplo 32] [Diseño del anticuerpo K5-70 humanizado] Se realizó la humanización de las regiones variables (VH, VL) del anticuerpo K5-70 preparado en los Ejemplos anteriores como sigue de acuerdo con el método de Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989). Primero, se realizó el modelado molecular de la estructura tridimesional de cada región variable del anticuerpo K5-70 al usar una computadora. Posteriormente, se realizó la búsqueda de la homología con las secuencias de región variable de los genes de anticuerpo humano. Como un resultado, se seleccionó una secuencia de ADNc (DA980102 VH) con el Número de acceso de GenBank DA980102 como un aceptor que proporciona una región de marco (FR, por sus siglas en inglés) necesaria para la humanización de la VH K5-70 (genoma Res. 16:55-65, 2006). Asimismo, una secuencia del ADNc (VL L41174) con el Número de acceso de GenBank de L41174 se seleccionó como aceptor que proporciona una región del marco necesaria para la humanización de la VL K5-70 (Biol del J.270:12457 de la quím. -12465, 1995).
Para la humanización de la VH K5-70, se sustituyó la secuencia de la CDR de la VH K5-70 con la posición correspondiente de la VH DA980102 usada como un aceptor. Como un resultado del análisis de la estructura tridimensional de acuerdo con el modelado por computadora, con respecto a los residuos de aminoácidos (isoleucina (I) en la posición 48, Usina (K) en la posición 66, alanina (A) en la posición 67, valina (V) en la posición 71 y treonina (T) en la posición 93) que están adyacentes a la CDR de la VH K5-70 y se asume para desempeñar papeles importantes para el mantenimiento de la estructura, aquellos de la VH K5-70 se conservaron, y la región de FR residual se sustituyó con la secuencia aceptora. Los números de posición del residuo de aminoácido en VH y VL se usaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991).
Por otra parte, la metionina (M) como un residuo del aminoácido en la posición 82 de la VH DA980102 de secuencia aceptora fue altamente probable ser un residuo del aminoácido especial causado por hipermutación somática. Así, para disminuir la antigenicidad potencial, la metionina anteriormente mencionada se sustituyó con leucina (I) que es la más común como un residuo del aminoácido en la posición 82. Una alineación de las secuencias de aminoácidos de la VH K5-70 humanizada así diseñada (VH de HuK5-70), VH de K5-70 y VH de DA980102 se muestra en la Figura 41.
Con respecto al diseño de la VL K5-70 humanizada también, se realizó el mismo trasplante de una secuencia de CDR como se describe anteriormente. Como un residuo de aminoácido (lisina (K) en la posición 49) importante para el mantenimiento de la estructura de CDR, se conservó la VL K5-70, y se sustituyó la región de FR residual con la secuencia aceptora (VL HuK5-70). Una alineación de las secuencias de aminoácidos de la VL HuK5-70, de la VL K5-70 y de la VL L41174 se muestra en (Tabla 42. [Ejemplo 33] [Diseño del anticuerpo T6-16 humanizado] Se realizó la humanización de las regiones variables (VH, VL) del anticuerpo T6-16 preparado en los Ejemplos anteriores como sigue de acuerdo con el método de Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989). Primero, se realizó el modelado molecular de la estructura tridimesional de cada región variable del anticuerpo T6-16 al usar una computadora. Posteriormente, se realizó la búsqueda de la homología con las secuencias de región variable de genes de anticuerpo humano. Como un resultado, se seleccionó una secuencia de ADNc (VH DA935238) con el número de acceso de GenBank DA935238 como un aceptor que proporciona una región de marco (FR, por sus siglas en inglés) necesaria para la humanización de la VH T6-16 (Genome Res. 16:55-65, 2006). Asimismo, se seleccionó una secuencia de ADNc (VL M99608) con el Número de acceso de GenBank M99608 como un aceptor que proporciona una región de marco (FR, por sus siglas en inglés) necesaria para la humanización de la VL T6-16 (J. Inmunol. 149:2518-2529, 1992).
Para la humanización de la VH T6-16, se sustituyó la secuencia de la CDR de la VH T6-16 con la posición correspondiente de la VH DA935238 usada como un aceptor. Como un resultado del análisis de la estructura tridimensional de acuerdo con el modelado por computadora, con respecto a los residuos de aminoácidos (isoleucina (I) en la posición 48, alanina (A) en la posición 67 y lisina (K) en la posición 73) que están adyacentes a la CDR de la VH T6-16 y se asumen para desempeñar papeles importantes del mantenimiento de la estructura, aquellos de la VH T6-16 se conservaron, se sustituyó y la región de FR residual con la secuencia aceptora (VH HuT6-161). Además, el residuo de lisina (K) en la posición 73 fue poco probable que tenga influencia en la formación apropiada de un sitio de unión al antígeno, y así, se sustituyó una secuencia de aminoácidos, en la cual el residuo de lisina de la VH HuT6-161 con la treonina (T) como un residuo de aminoácido más generoso, se diseñó, por separado (VH HuT6-162). Una alineación de las secuencias de aminoácidos de la VH T6-16 humanizada así diseñada (VH HuT6-161 y VH HuT6-162), de a VH T6-16 y la VH DA935238 se muestra en la Figura 43.
Con respecto al diseño de la VL T6-16 humanizada también, se realizó el mismo trasplante de una secuencia de la CDR como se describe anteriormente. Los residuos de aminoácidos importantes para el mantenimiento de la estructura de CDR se conservaron también en la secuencia aceptora, y como una secuencia de FR, se usó la misma secuencia como la secuencia aceptora (VL HuT6-16). Una alineación de las secuencias de aminoácidos de la VL HuT6-16, de la VL T6-16 y de la VL L41174 se muestra en la Figura 44.
[Ejemplo 34] [Síntesis de los genes de VH y VL K5-70 humanizadas] Los genes que codifican la VH HuK5-70 y la VL HuK5-70 se prepararon como sigue. El gen se sintetizó basado en una secuencia de aminoácidos en la cual una secuencia de péptido de señal derivada a partir de la VH o la VL K5-70 había sido agregada al lado N-terminal de cada una de la VH y de la VL HuK5-70 antes diseñada (Operon). En esta operación sintética de gen, se agregó una secuencia de Kozak (ACC ACC) al lado de terminal 5' de la secuencia de gen de cada una de la VH HuK5-70 y de la VL HuK5-70 sintetizadas. Además, se agregó un sitio EcoRI (GAA TTC) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de la VH HuK5-70, y se agregó un sitio Nhel (GCT AGC) al extremo 3' del mismo. Asimismo, se agregó un sitio Agel (ACC GGT) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de la VL HuK5-70, y un sitio BsiWI (CGT ACG) se agregó al extremo 3' del mismo. El gen de la VH HuK5-70 sintetizada y el gen de la VL HuK5-70 se incorporaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen) de acuerdo con la clonación de TA. Las secuencias de genes de la VH y la VL HuK5-70 preparados mediante la síntesis de gen se muestran en las Figuras 45 y 46, respectivamente.
[Ejemplo 35] [Síntesis de genes de VH T6-161, de VH T6-162 y de VL T6-16 humanizadas] Los genes que codifican VH HuT6-161, VH HuT6-162 y VL HuT6-16 se prepararon como sigue. El gen se sintetizó, basado en una secuencia de aminoácidos en la cual una secuencia de péptido de señal derivada de la VH T6-16 había sido agregada al lado N-terminal de cada una de la VH1HuT6-16 y de la VH HuT6-162 antes diseñadas, y una secuencia de aminoácidos en la cual una secuencia de péptido de señal derivada a partir de la VL T6-16 había sido agregada al lado N-terminal de la VL HuT6-16 (Operon). En esta operación sintética de gen, se agregó una secuencia de Kozak (ACC ACC) al lado de terminal 5' de la secuencia de gen de cada una de la VH1 HuT6-16, de la VH HuT6-162 y de la VL HuT6-16 sintetizadas. Además, se agregó un sitio EcoRI (GAA TTC) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de cada una de la VH HuT6-161 y de la VH HuT6-162, y se agregó un sitio Nhel (GCT AGC) al extremo 3' del mismo. Asimismo, se agregó un sitio Agel (ACC GGT) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de la VL T6-16 humanizada, y se agregó un sitio BsiWI (CGT ACG) al extremo 3' del mismo. El gen de la VH HuT6-161 sintetizada, el gen de la VH HuT6-162 y el gen de la VL HuT6-16 se incorporaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen) de acuerdo con la clonación de TA.
Las secuencias de genes de la VH HuT6-161, de la VH HuT6-162 y de la VL HuT6-16 preparadas mediante la síntesis de gen se muestran en las Figuras 47 a 49, respectivamente.
[Ejemplo 36] [Construcción de los vectores de expresión de gen para los genes de la VH y la VL K5-70 humanizadas] Los genes de la VH y de la VL HuK5-70, que habían sido cada uno incorporados en el vector pCR2.1 (Invitrogen), se digirieron con las enzimas de restricción EcoR\ y Nhel, y Agel y BsiWI, respectivamente, y los fragmentos de genes entonces se recuperaron. Posteriormente, el gen de la VH HuK5-70 dividido se insertó en el sitio de EcoRI/Nhel de un vector pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) como un vector expresión de célula animal para la expresión de una forma de IgG 1 humana (pFUSE-CHIg-HuK5-70), mientras que el gen de VL HuK5-70 se insertó en el sitio Agel/BsiWI de un vector pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) como un vector de expresión de forma lgi< humano (pFUSE2-CLIg-HuK5-70). Así, cada constructo se terminó.
[Ejemplo 37] [Construcción de los vectores de expresión de gen para los genes de VH T6-161, de VH T6-162 y de VL T6-16 humanizados] Los genes de VH T6-161 y de VH T6-162, que habían sido cada uno incorporados en el vector pCR2.1 (Invitrogen), se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y Nhel, y el gen de la VL T6-16 se digirió con las enzimas de restricción Agel y BsiWI. Entonces, se recuperaron los fragmentos de gen. Posteriormente, el gen de la VH T6-161 dividido se insertó en el sitio EcoRI/Nhel de un vector pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) (pFUSE-CHIg-HuT6-16-1), y el gen de la VH T6-162 también se insertó en el sitio EcoRI/Nhel de un vector pFUSE-CHIg-hG1 (pFUSE-CHIg-HuT6-16-2). El gen de la VL T6-16 se insertó en el sitio Agel/BsiWI de un vector pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) (pFUSE2-CLIg-HuT6-16). Así, cada constructo se terminó.
[Ejemplo 38] [Establecimiento de la línea celular 293F capaz de establemente expresar el anticuerpo HuK5-70, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2] Se mantuvieron células 293F (Invitrogen) y se cultivaron en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen). Se introdujeron los genes en las células 293F al usar un reactivo de fectina 293 (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos incluidos con los mismos. Es decir, pFUSE-CHIg-HuK5-70 y pFUSE2-CLIg-HuK5-70 ambos se introdujeron en las células 293F, y la selección del fármaco entonces se realizó al usar Zeocina (InvivoGen) y Blasticidina (InvivoGen), para establecer una línea celular capaz establemente expresar un anticuerpo HuK5-70. También, pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 ambos se introdujeron en las células 293F, y la selección de fármaco mencionada anteriormente entonces se realizó, para establecer una línea celular capaz de establemente expresar un anticuerpo HuT6-16-1. También, pFUSE-CH lg-HuT6-16-2 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 ambos se introdujeron en las células 293F, y la selección de fármaco mencionada anteriormente entonces se realizó, para establecer una línea celular capaz establemente expresar un anticuerpo HuT6-16-2.
[Ejemplo 39] [Purificación de proteínas del anticuerpo HuK5-70, del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2] Las líneas celulares que expresan el anticuerpo establecido cada una se inoculó en el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a una densidad de célula de 1 a 2.5 ? 105 células/ml, y después de lo anterior, el cultivo de la botella giratoria se realizó durante 6 a 8 días. Después de lo anterior, se recuperó un sobrenadante de cultivo, y cada anticuerpo humanizado entonces se purificó al usar el rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) de acuerdo con un método ordinario.
La Figura 50 muestra los resultantes obtenidos al confirmar mediante transferencia de tipo Western la expresión de cada proteína de anticuerpo humanizado en un sobrenadante de cultivo de las células 293F, en las cuales un anticuerpo HuK5-70, un anticuerpo HuT6-16-1 y un anticuerpo HuT6-16-2 se expresaron. Específicamente, después de la terminación de SDS-PAGE, cada proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore, IPVH00010). La membrana se bloqueó a temperatura ambiente durante 30 minutos al usar TBS (solución salina amortiguada con Tris) que contenía 5% de leche descremada. Se lavó el resultante con 0.1% de TBST (TBS que contiene 0.1% de Tween 20) durante 5 minutos tres veces, y después se dejó reaccionar con un anticuerpo primario.
La banda 1 indica un sobrenadante de cultivo de las células 293F en las cuales no se había introducido ninguno de los genes (control negativo), y la banda 2 indica un sobrenadante de cultivo de células 293F en las cuales pFUSE-CHIg-HuK5-70 y pFUSE2-CLIg-HuK5-70 habían sido introducidos. Para la detección de las proteínas de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo HuK5-70, se usó un anticuerpo IgG F(ab')2 anti-humano etiquetado con biotina (Rockland). La banda 3 indica un sobrenadante de cultivo de células 293F en las cuales pFUSE-CHIg-HuT6-16-1 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 habían sido introducidos, y la banda 4 indica un sobrenadante de cultivo de células 293F en las cuales pFUSE-CHIg-HuT6-16-2 y pFUSE2-CLIg-HuT6-16 habían sido introducidos. Las proteínas de cadena pesada del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2 se detectaron con un anticuerpo IgG Fe anti-humano etiquetado con biotina (Rockland), mientras que las proteínas de cadena ligera del anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 se detectó con un anticuerpo IgG F(ab')2 anti-humano etiquetado con biotina (Rockland).
Como un resultado, en todos los casos del anticuerpo HuK5-70, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2, la expresión de proteínas de cadena pesada y de cadena ligera se confirmó en cada sobrenadante de cultivo.
Por otra parte, la Figura 51 muestra los resultados obtenidos cargando el anticuerpo HuK5-70, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 purificados en SDS-PAGE y después tiñéndolos con CBB. En todos los casos, se detectaron una cadena pesada de aproximadamente 50 kD y una cadena ligera de aproximadamente 25 kD bajo condiciones de reducción, y se confirmaron las bandas en las mismas posiciones que la cadena pesada y la cadena ligera detectadas mediante inmunotransferencia de tipo Western descrita antes. A partir de estos resultados, se confirmó que se generaron una proteína de anticuerpo HuK5-70, una proteína de anticuerpo HuT6-16-1 y una proteína de anticuerpo HuT6-16-2.
[Ejemplo 40] [Afinidad de antígeno del anticuerpo K5-70 humanizado (HuK5-70) y los anticuerpos T6-16 humanizados (HuT6-16-1 y HuT6-16-2)] La afinidad de antígeno del anticuerpo HuK5-70, del anticuerpo HuT6-16-1 y del anticuerpo HuT6-16-2 purificados se examinó mediante los métodos al usar FACS y ELISA.
Se realizó FACS, al usar células HEK293-hTROP-2 en las cuales un gen TROP-2 humano de longitud completa se expresó establemente en células HEK293, y una línea celular PK-59 de cáncer pancreático que endógenamente expresó una proteína TROP-2 humana en la superficie celular. 100 µ? de una solución de anticuerpo usada como un anticuerpo primario, que había sido diluido a 1 pg/ml con un medio que contenía 10% de FCS, se agregaron a una suspensión (5 ? 105 células) de las células (células HEK293-hTROP-2 o células PK-59), que había sido eliminado de una placa de cultivo mediante tratamiento con tripsina, y la mezcla obtenida entonces se incubó a 4°C durante 20 minutos. Después de lo anterior, se lavó el resultante con 1 mi de un medio que contenía 10% de FCS. Entonces, el anticuerpo secundario (100 µ? de cada uno), en el cual un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen) o un anticuerpo IgG Fe anti-humano etiquetado con biotina (Rockland) se diluyó hasta 200 veces o 2000 veces, respectivamente, se agregó al resultante. La mezcla obtenida se incubó a 4°C durante 20 minutos, y después se lavó con 1 mi de un medio que contenía 10% FCS de nuevo. En un caso en el cual el anticuerpo IgG Fe anti-humano etiquetado con biotina se usó como un anticuerpo secundario, 100 µ? de una solución de etiquetado, en la cual se diluyó PE etiquetado con estreptavidina (BD Pharmingen) hasta 400 veces, se agregaron a la misma como un reactivo de etiquetado de fluorescencia. Después de lo anterior, la mezcla obtenida se incubó a 4°C durante 20 minutos, y después se lavó con 1 mi de un medio que contenía 10% de FCS. Posteriormente, se suspendió la muestra que contenía células etiquetadas en 1 mi de PBS que contenía 1% de FCS y 2 mM de EDTA, y la suspensión obtenida entonces se analizó al usar FACSCalibur (Becton Dickinson). Como un resultado, se encontró que el anticuerpo HuK5-70 mostró reactividad equivalente a la de un anticuerpo K5-70 de ratón en las células HEK293-hTROP-2 y en las células PK-59. Asimismo, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 mostraron reactividad equivalente a la de un anticuerpo T6-16 (Figura 52).
Además, la afinidad del antígeno también se examinó mediante un método de ELISA. Se realizó ELISA al usar una placa de ELISA que se cubrió con la proteína recombinante de la región extracelular hTROP-2 como se describen en el Ejemplo 3. Específicamente, se cubrió una placa de 96 pozos (BD FALCON) con una proteína recombinante de 50 µ?/???? de una región extracelular hTROP-2 que había sido diluida con PBS a 0.5 g/ml (a 4°C durante la noche). Después de lo anterior, se lavó el resultante con un amortiguador deslavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20), y un amortiguador de bloqueo (PBS que contiene 2% de leche descremada y 0.05% de Tween 20) entonces se agregó al mismo (200 µ?/????) para bloquearlo (a temperatura ambiente durante 1 hora). Se lavó el resultante con un amortiguador de lavado. Después de lo anterior, se diluyeron un anticuerpo HuK5-70, un anticuerpo HuT6-16-1, un anticuerpo HuT6-16-2, un anticuerpo K5-70 y un anticuerpo T6-16 con un amortiguador de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20) a un intervalo de concentración a partir de 3.05 ? 10"4 a 5 pg/ml, a fin de preparar una serie de muestras de dilución dos veces. Las muestras de dilución obtenidas cada una se agregó a una cantidad de 50 µ?/???? a la placa de ELISA descrita antes (a temperatura ambiente durante 2 horas). Se lavó el producto de reacción con un amortiguador de lavado, y después de lo anterior, un anticuerpo de cadena ? anti-humano de cabra etiquetado con HRP (SouthernBiotech) o un anticuerpo IgG anti-ratón de oveja etiquetado con HRP (GE Healthcare), cada uno de los cuales había sido diluido a 2000 veces con un amortiguador de ELISA, se agregó (50 µ?/????) como un anticuerpo de detección al producto de reacción (a temperatura ambiente durante 1 hora). Después de que la mezcla hubiera sido lavada con un amortiguador de lavado, se agregó una solución de sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina: SIGMA) (50 µ?/????) al resultante para realizar una reacción de color. Entonces, se agregó ácido sulfúrico 1 M (25 µ?/????) al producto de reacción para terminar la reacción. Al usar el lector de microplaca Modelo 550 (BioRad), se midió una absorbencia a 450 nm con una absorbencia a 655 nm usado como una referencia. Como un resultado, las curvas de reacción de K5-70 y de HuK5-70 casi fueron traslapadas entre sí, y los valores de EC50 de las mismas fueron 27 ng/ml y 22 ng/ml, respectivamente (Figura 53).
También, las curvas de reacción de T6-16, HuT6-16-1 y HuT6-16-2 casi fueron traslapadas entre sí, y los valores de EC50 de las mismas fueron 30 ng/ml, 27 ng/ml y 27 ng/ml, respectivamente (Figura 54). A partir de estos resultantes, se hizo evidente que todos del anticuerpo HuK5-70, el anticuerpo HuT6-16-1 y el anticuerpo HuT6-16-2 exhiben afinidad de antígeno equivalente a la del anticuerpo K5-70 o T6-16 que es un anticuerpo madre antes de la humanización.
[Ejemplo 41] [Actividad antitumoral del anticuerpo anti-hTROP-2 humanizado (HuK5-70) in vivo] Posteriormente, se examinó la actividad antitumoral de un anticuerpo HuK5-70 in vivo con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano, que endógenamente expresa TROP-2 humano en la superficie celular. Las células SW480 (5 * 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembras de 7 semanas de edad (Día 1). Cuando el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, se realizaron las agrupación (Día 9). A partir del día 9, se realizó la administración intraperitoneal del anticuerpo a intervalos de administración de una vez cada tres días. En el 39v0 día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 39), el volumen tumoral de un grupo de control (administración de PBS, N = 8) fue 824.3 ± 188.8 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 455.5 ± 208.6 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación tumoral fue inhibida significativamente en el grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 (índice inhibidor: 44.7%) (Figura 55A). Con respecto a la masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control fue 0.509 ± 0.161 g. En cambio, en el grupo de administración de anticuerpo HuK5-70, la masa de tumor del grupo de control fue 0.272 ± 0.162 g (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), que muestra un índice inhibidor de 46.6% (Figura 55B).
[Ejemplo 42] [Actividad antitumoral dependiente de dosis de anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (HuK5-70 y HuT6-16-2) en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SW480 de cáncer de colon humano] Se examinó la actividad antitumoral dependiente de dosis de anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2 con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SW480 de cáncer de colon humano. Las células SW480 (5 ? 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembras de 7 semanas de edad (Día 1). En el 9no día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 9) en el cual el volumen tumoral promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (grupo de administración de PBS, N = 8, 101.65 ± 8.35 mm3), un grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 de 1 mg/kg de peso corporal (N = 8, 103.18 ± 9.86 mm3), un grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 de 5 mg/kg de peso corporal (N = 8, 101.34 ± 8.94 mm3), un grupo de administración de anticuerpo HuK5-70 de 10 mg/kg de peso corporal (N = 8, 101.53 ± 8.98 mm3), un grupo de administración de anticuerpo HuT6-16-2 de 1 mg/kg de peso corporal (N = 8, 103.18 ± 9.86 mm3), un grupo de administración de anticuerpo HuT6-16-2 de 5 mg/kg de peso corporal (N = 8, 101.34 ± 8.94 mm3), y un grupo de administración de anticuerpo HuT6-16-2 de 10 mg/kg de peso corporal (N = 8, 101.53 ± 8.98 mm3). Entonces, a partir del Día 9, se realizó la administración intraperitoneal de cada anticuerpo a intervalos de administración de una vez cada tres días. En el 48v0 día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 48), el volumen tumoral del grupo de control fue 754.67 ± 276.05 mm3. Por una parte, en los grupos de administración de anticuerpo HuK5-70, ei volumen tumoral del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal fue 521.81 + 183.45 mm3 (índice inhibidor: 30.9%), el volumen de cuerpo del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal fue 258.78 ± 137.02 mm3 (índice inhibidor: 65.7%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal fue 314.60 ± 152.89 mm3 (índice inhibidor: 58.3%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 56A). En los grupos de administración de anticuerpo HuT6-16-2, el volumen tumoral del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal fue 600.41 ± 319.84 mm3 (índice inhibidor: 20.4%), el volumen tumoral del grupo de administración 5 mg/kg de peso corporal fue 315.32 ± 189.02 mm3 (índice inhibidor: 58.2%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y el volumen tumoral del grupo de administración 10 mg/kg de peso corporal fue 270.79 ± 266.71 mm3 (índice inhibidor: 64.1%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 57A). Con respecto a la masa de tumor en el Día 48, la masa de tumor del grupo de control fue 0.422 ± 0.201 g. Por una parte, en los grupos de administración de anticuerpo HuK5-70, la masa de tumor del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal fue 0.301 ± 0.160 g (índice inhibidor: 28.7%), la masa de tumor del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal fue 0.115 ± 0.083 g (índice inhibidor: 72.7%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y la masa de tumor del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal fue 0.244 ± 0.181 g (índice inhibidor: 42.2%) (Figura 56B). En los grupos de administración de anticuerpo HuT6-16-2, la masa de tumor del grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal fue 0.422 ± 0.255 g (índice inhibidor: 0%), la masa de tumor del grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal fue 0.247 ± 0.151 g (índice inhibidor: 41.5%), y la masa de tumor del grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal fue 0.190 ± 0.190 g (índice inhibidor: 53.1%, P < 0.01 mediante la prueba t de Student) (Figura 57B). A partir de estos resultados, se confirmó que los anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2 tienen actividad antitumoral dependiente de dosis.
[Ejemplo 43] [Actividad antitumoral de anticuerpos monoclonales K5-70 y T6-16 anti-hTROP-2 de ratón en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular SK-OV-3 de cáncer ovárico humano] Se examinó la actividad antitumoral de anticuerpos K5-70 y T6-16 como anticuerpos madre in vivo con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular SK-OV-3 de cáncer ovárico humano, que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. Las células SK-OV-3 (5 ? 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de los ratones desnudos hembras de 7 semanas de edad (Día 1). En el 11vo día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 11), ratones individuales, en los cuales se observó la formación clara del tumor (volumen tumoral promedio: aproximadamente 50 mm3), se dividieron en grupos. Entonces, a partir del día 11, se realizó la administración intraperitoneal de cada anticuerpo a intervalos de administración de dos veces por semana. En el 56 o día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 56), el volumen tumoral de un grupo de control (administración de PBS, N = 8) fue 652.6 ± 349.1 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 253.7 ± 137.3 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 61.1%); y el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 214.6 ± 98.6 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 67.1%) (Figura 58A). Con respecto a la masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control fue 0.413 + 0.218 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 0.194 ± 0.112 (g) (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), que muestra un índice inhibidor de 53.0%; y la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 fue 0.183 d± 0.093 (g) (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), que muestra un índice inhibidor de 55.7% (Figura 58B).
[Ejemplo 44] [Actividad antitumoral de anticuerpos monoclonales K5-70 y T6-16 anti-hTROP-2 de ratón en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular MDA-MB-468 de cáncer de mamas humanas] Asimismo, se examinó la actividad antitumoral de los anticuerpos K5-70 y T6-16 in vivo con modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular MBA-MD-468 del cáncer de mamas humanas, que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. Las células MBA-MD-468 (5 * 10s células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de los ratones desnudos hembras de 7 semanas de edad (Día 1). En el 12v0 día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 12), ratones individuales, en los cuales se observó la formación clara del tumor (volumen tumoral promedio: aproximadamente 50 mm3), se dividieron en grupos. Entonces, a partir del día 12, se realizó la administración intraperitoneal de cada anticuerpo a intervalos de administración de dos veces por semana. En el 54v0 día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 54), el volumen tumoral de un grupo de control (administración de PBS, N = 8) fue 218.6 ± 75.5 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 70.2 ± 37.4 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 67.9%); y el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 88.3 ± 42.9 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 59.6%) (Figura 59A). Con respecto a la masa de tumor en el día 54, la masa de tumor del grupo de control fue 0.142 ± 0.049 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 0.050 ± 0.033 (g) (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), muestra un índice inhibidor de 64.8%; y la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 fue 0.077 ± 0.046 (g) (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), muestra un índice inhibidor de 45.8% (Figura 59B).
[Ejemplo 45] [Actividad antitumoral de anticuerpos monoclonales K5-70 y T6-16 anti-hTROP-2 de ratón en modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar la línea celular Calu-3 de cáncer de pulmón humano] Asimismo, se examinó la actividad antitumoral de los anticuerpos K5-70 y T6-16 in vivo con los modelos de tratamiento de xenoinjerto al usar una línea celular Calu-3 del cáncer de pulmón humano, que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. Las células Calu-3 (5 * 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de ratones desnudos hembras de 7 semanas de edad (Día 1). En el 9no día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 9), ratones individuales, en los cuales la formación clara del tumor se observó (volumen tumoral promedio: aproximadamente 100 mm3), se dividieron en grupos. Entonces, a partir del día 9, la administración intraperitoneal de cada anticuerpo se realizó a intervalos de administración de dos veces por semana. En el 41vo día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 41), el volumen tumoral de un grupo de control (administración de PBS, N = 8) fue 395.7 ± 221.2 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 120.7 ± 125.6 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 69.5%); y el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal, N = 8) fue 146.3 + 128.4 mm3 (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 63.0%) (Figura 60A). Con respecto a la masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control fue 0.301 ± 0.189 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 0.08 ± 0.085 (g) (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), muestra un índice inhibidor de 73.5%; y la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo T6-16 fue 0.106 ± 0.096 (g) (P < 0.05 mediante la prueba t de Student), muestra un índice inhibidor de 64.9% (Figura 60B).
[Ejemplo 46] [Actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal K5-70 anti-hTROP-2 de ratón en modelos de prevención de xenoinjerto al usar la línea celular TFK-1 de cáncer hepático humano] Asimismo, se examinó la actividad antitumoral de un anticuerpo K5-70 in vivo con modelos de prevención de xenoinjerto al usar una línea celular TFK-1 de colangiocarcinoma humano, que endógenamente expresa hTROP-2 en la superficie celular. Las células TFK-1 (5 ? 106 células) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco derecho de cada uno de los ratones desnudos hembras de 7 semanas de edad (Día 1), y desde el mismo día, se inició la administración intraperítoneal del anticuerpo a intervalos de administración de dos veces por semana. En el 31 0 día después del trasplante de la célula cancerosa (Día 31), el volumen tumoral de un grupo de control (administración de PBS, N = 5) fue 1000.4 ± 268.9 mm3. Por una parte, el volumen tumoral de un grupo de administración de anticuerpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal, N = 5) fue 197.2 ± 215.5 mm3 (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), y así, la formación de tumores fue inhibida significativamente (índice inhibidor: 80.3%) (Figura 61A). Con respecto a la masa de tumor, la masa de tumor del grupo de control fue 0.443 ± 0.070 g. En cambio, la masa de tumor del grupo de administración de anticuerpo K5-70 fue 0.063 ± 0.052 (g) (P < 0.01 mediante la prueba t de Student), muestra un índice inhibidor de 85.8% (Figura 61 B).
[Ejemplo 47] [Análisis de avidez de anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2] Se examinó la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2 de acuerdo con un método de ELISA (ELISA cubierto con antígeno de baja densidad) al usar una placa de 96 pozos en la cual un antígeno de baja densidad ha sido cubierto. Se agregó una proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante (Creative BioMart), que habían sido preparada a una concentración de 0.1 g/ml con un amortiguador de acetato 0.1 M (pH 5.3), a una cantidad de 50 µ?/???? a una placa de 96 pozos, y se realizó el recubrimiento a 4°C durante la noche. Después de lo anterior, se realizó el mismo análisis como en el Ejemplo 40. Se diluyeron los anticuerpos de prueba con un amortiguador de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20), a fin de preparar muestras con un intervalo de concentración a partir de 20 pg/ml a una serie de diluciones de dos veces (15 muestras) y usarlas. Como un resultado, se encontró que el anticuerpo HuT6-16-2 tenía actividad de unión que fue casi equivalente a la del anticuerpo T6-16 (donde sus valores de EC50 fueron 49 ng/ml y 41 ng/ml, respectivamente), pero que el valor de EC50 del anticuerpo HuK5-70 fue aproximadamente 20 veces mayor que el del anticuerpo K5-70 (donde sus valores de EC50 fueron 222 ng/ml y 12 ng/ml, respectivamente; Figura 62).
Posteriormente, se examinó la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos HuK5-70 y K5-70 mediante ELISA para analizar una reacción de antígeno-anticuerpo monovalente. La anti-lgG humana de cabra (Fcy específico) (Southern Biotech) que había sido diluida a 1 pg/ml con un amortiguador de acetato 0.1 M (pH 5.3) y la IgG anti-ratón de cabra (cadena ? específica) (Southern Biotech) que había sido diluida a 3 pg/ml se agregó en cada cantidad de 50 µ?/???? a una placa de 96 pozos. Después de lo anterior, se realizó el recubrimiento a 4°C durante la noche. Después de lo anterior, se lavó el producto de reacción con un amortiguador de lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20), y un amortiguador de bloqueo (PBS que contiene 2% de leche descremada y 0.05% de Tween 20) entonces se agregó al mismo (200 µ?/????) para bloquearlo (a temperatura ambiente durante 1 hora). Se lavó el resultante con un amortiguador de lavado. Después de lo anterior, el anticuerpo de prueba, que había sido diluido a 1 µg/ml con un amortiguador de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20), se agregó a una cantidad de 50 µ?/???? a la placa descrita antes. Durante esta operación, se agregó un anticuerpo HuK5-70 a un pozo cubierto con la IgG anti-humano de cabra (Fcy específico), y se agregó un anticuerpo K5-70 a un pozo cubierto con la IgG anti-ratón de cabra (cadena ? específica). La mezcla se dejó a reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, y el producto de reacción entonces se lavó con un amortiguador de lavado. Se diluyó la proteína recombinante de la región extracelular hTROP-2 descrita en el Ejemplo 3 (hTROP-2 EC) con un amortiguador de ELISA para preparar muestras con un intervalo de concentración a partir de 5 pg/ml a una serie de dilusiones de tres veces (10 muestras). La muestra así obtenida se agregó en cada cantidad de 50 µ?/???? a la placa. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, y el producto de reacción entonces se lavó con un amortiguador de lavado. Entonces, anti-His (G-18) (Santa Cruz), que había sido diluido a 2 pg/ml con un amortiguador de ELISA, se agregó como un anticuerpo primario al producto de reacción (50 µ?/????). La mezcla obtenida se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces se lavó con un amortiguador de lavado. Después de lo anterior, la IgG anti-conejo etiquetada con HRP (GE Healthcare), que había sido diluida a 1000 veces con un amortiguador de ELISA, se agregó como un anticuerpo secundario al producto de reacción (50 µ?/????). La mezcla obtenida se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces se lavó con un amortiguador de lavado. Después de lo anterior, se agregó una solución de sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina: SIGMA) a una cantidad de 50 µ?/???? al resultante para realizar una reacción de color. Entonces, se agregó ácido sulfúrico 1 M (25 µ?/????) al producto de reacción para terminar la reacción. Al usar el lector de microplaca Modelo 550 (BioRad), se midió una absorbencia a 450 nm con una absorbencia a 655 nm usada como una referencia. Como un resultado, los valores de EC50 calculados a partir de las curvas de unión de la proteína hTROP-2EC con los anticuerpos K5-70 y HuK5-70 fue 7 ng/ml y 6 ng/ml, respectivamente (Figura 63). Estos resultantes demostraron que el anticuerpo HuK5-70 y el anticuerpo K5-70 tienen afinidad de antígeno equivalente a una reacción de antígeno-anticuerpo monovalente.
Como se describe en el Ejemplo 40, en un método de ELISA al usar una placa de 96 pozos en la cual un antígeno de alta densidad (0.5 pg/ml) había estado cubierto (ELISA cubierto con antígeno), la afinidad de antígeno del anticuerpo K5-70 fue equivalente a la afinidad de antígeno del anticuerpo HuK5-70 (Figura 53). Así, se consideró que la actividad de unión al antígeno del anticuerpo HuK5-70 que es relativamente menor que la del anticuerpo K5-70 en un método de ELISA, en el cual un antígeno de baja densidad (0.1 pg/ml) ha sido cubierto en una placa, puede causarse por el hecho de que la flexibilidad del movimiento de dos brazos de unión al antígeno, es decir, "avidez" es relativamente menor en el anticuerpo HuK7-50 que en el anticuerpo K5-70.
[Ejemplo 48] [Preparación y caracterización de mutantes de anticuerpo K5-70 humanizado] Con el fin de mejorar la "avidez" de un anticuerpo HuK5-70, se realizó el experimento siguiente.
Si la "avidez" relativamente baja mencionada anteriormente del anticuerpo HuK5-70 es causada por VH o por VL se examinó por el siguiente experimento. Primero, los genes que codifican la región variable de cadena H (VH K5-70) y la región variable de cadena L (VL K5-70) de un anticuerpo K5-70 como un anticuerpo madre se prepararon mediante síntesis de gen (Operon). Durante la síntesis del gen, se agregó una secuencia Kozak (ACC ACC) al lado 5'-terminal de la secuencia de gen de cada una de la VH K5-70 y de la VL K5-70. Además, se agregó un sitio EcoRI (GAA TTC) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de la VH K5-70, y un sitio Nhel (GCT AGC) se agregó como un sitio de enzima de restricción del extremo 3' del mismo. Asimismo, se agregó un sitio Agel (ACC GGT) como un sitio de enzima de restricción al extremo 5' de la VL K5-70, y se agregó un sitio BsiWI (CGT ACG) como un sitio de enzima de restricción al extremo 3' del mismo. El gen de VH K5-70 así sintetizado y el gen VL K5-70 cada uno se incorporó en un vector pCR2.1 (Invitrogen). Las secuencias de gene de la VH y la VL K5-70 preparadas mediante la síntesis de gen se muestran en la Figura 64 y la Figura 65, respectivamente. Los genes de la VH K5-70 y la VL K5-70 incorporados en el vector pCR2.1 se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y Nhel, y Agel y BsiWI, respectivamente, y los fragmentos de gen entonces se recuperaron. Posteriormente, el gen de la VH K5-70 dividido se insertó en el sitio EcoRI/Nhel de un vector pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) como un vector de expresión para la expresión de una forma de lgG1 humana, mientras que el gen de la VL K5-70 se insertó en el sitio Agel/BsiWI de un vector de pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) como un vector de expresión en forma de Ig humana, de tal modo terminando los constructos quiméricos ratón-humano (pFUSE-CHIg-MuK5-70 y pFUSE2-CLIg-MuK5-70).
Los constructos así preparados, y el vector de expresión de cadena H HuK5-70 (pFUSE-CHIg-HuK5-70) y el vector de expresión de cadena L HuK5-70 (pFUSE2-CLIg-HuK5-70), que habían sido preparados en el Ejemplo 36, se dejaron co-expresan en células 293F (Invitrogen) por las combinaciones 1 a 4 en la siguiente tabla.
Se realizó la transfección de los vectores de expresión descritos antes en células 293F (Invitrogen) al usar el reactivo de NeoFection (Astee) de acuerdo con el método descrito en las instrucciones incluidas con el mismo. Después de la terminación de la transfección, se cultivó el resultante durante 5 días al usar el Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a 37°C en una incubadora de C02 con una concentración de C02 del 8%. Después de lo anterior, se recuperó un sobrenadante de cultivo. Se midió la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo mediante un método de ELISA en Sandwich. Específicamente, IgG anti-humano de cabra (Fcy específico) (Southern Biotech), que había sido diluida a 1 g/ml con PBS, se agregó a una cantidad de 50 µ?/???? a una placa de 96 pozos. Después de lo anterior, se realizó recubrimiento a 4°C durante la noche. Después de lo anterior, se lavó el producto de reacción con un amortiguador de lavado (PBS que contiene 0.05% de Tween 20), y un amortiguador de bloqueo (PBS que contiene 2% de leche descremada y 0.05% de Tween 20) entonces se agregó al mismo (200 µ?/????) para bloquearlo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó el resultante con un amortiguador de lavado. Después de lo anterior, un sobrenadante de cultivo, que había sido diluido a una ampliación de dilución apropiada con un amortiguador de ELISA (PBS que contiene 1% de leche descremada y 0.025% de Tween 20), se agregó a una cantidad de 50 µ?/???? a la placa descrita antes, y una reacción entonces se realizó a temperatura ambiente durante 2 horas. Como una preparación estándar, se usó un anticuerpo HuK5-70. El producto de reacción entonces se lavó con un amortiguador de lavado. Como anticuerpo de detección, kappa anti-humana de cabra etiquetada con HRP (cadena ? específica) (Southern Biotech), que había sido diluida a 1,000 veces con un amortiguador de ELISA, se agregó a una cantidad de 50 µ?/???? al producto de reacción, y una reacción entonces se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó el producto de reacción con un amortiguador de lavado, y después de lo anterior, se agregó una solución de sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina: SIGMA) a una cantidad de 50 µ?/???? al resultante para realizar una reacción de color. Entonces, se agregó ácido sulfúrico 1 M (25 µ?/????) al producto de reacción para terminar la reacción. Al usar el lector de microplaca de iMark (BioRad), se midió una absorbencia a 450 nm con una absorbencia a 655 nm usada como una referencia. Se midió la unión de los 4 tipos de anticuerpos contenidos en los sobrenadantes de cultivo a hTROP-2 mediante ELISA cubierto con antígeno de baja densidad descrito antes. Como un resultado, se encontró que la actividad de unión de un anticuerpo de MuVH/HuVL constituido con la VH K5-70 de ratón y la VL HuK5-70 a hTROP-2 fue equivalente a la de un anticuerpo ChK5-70, pero que la actividad de unión de un anticuerpo HuVH/MuVL constituido con al VH HuK5-70 y la VL K5-70 de ratón fue relativamente inferior que la del ChK5-70 (Figura 66). Estos resultantes sugirieron que la VH HuK5-70 estar implicada en la "avidez" de HuK5-70. Por lo tanto, a fin de preparar anticuerpos modificados, en los cuales la "avidez" del anticuerpo Huk5-70 se ha mejorado, la sustitución del aminoácido se realizó en la VH HuK5-70. Como se encuentra a partir de una alineación de las secuencias de aminoácidos de la VH HuK5-70 y la VH K5-70 como se muestra en la Figura 41, un total de 17 aminoácidos con números de aminoácidos 5, 7, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 44, 73, 75, 81, 82c, 83, 87, 108 y 109 son diferentes entre la VH HuK5-70 y la VH K5-70 (donde los números de aminoácidos se usan de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (1991)). Los aminoácidos anteriormente mencionados de la VH HuK5-70 se sustituyeron con los aminoácidos correspondientes de la VH K5-70, de modo que los mutantes se prepararon de acuerdo con la síntesis de gen. Entonces, se preparó un vector de expresión (un mutante pFUSE-CHIg-HuK5-70). De acuerdo con el reporte por Landolfi et al. (J. Immunol. 166:1748, 2001), se ha reportado que los aminoácidos en las posiciones 11 y 38 de VH se implicaron en la avidez de un anticuerpo humanizado, y que la avidez y la actividad biológica son mejoradas sustituyendo los dos aminoácidos anteriormente mencionados con los aminoácidos correspondientes derivados del ratón. Por lo tanto, un doble mutante que comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 11 y 38 también se preparó. Los nombres de los así 18 tipos preparados de mutantes de VH HuK5-70 y sus secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 67.
Los 18 tipos preparados de los mutantes de VH HuK5-70 (vectores de expresión para mutantes pFUSE-CHIg-HuK5-70) fueron cada uno combinados con un vector de expresión de cadena L HuK5-70 (pFUSE2-CLIg-HuK5-70), y los vectores de expresión así obtenidos cada uno se transfectó en células HEK293. Entonces, al usar el sobrenadante de cultivo obtenido, se examinó la actividad de unión de cada anticuerpo de sustitución de aminoácido a hTROP-2 mediante ELISA cubierto con antígeno de baja densidad. Como un resultado, entre los 18 tipos de mutantes de VH HuK5-70, un mutante R44G, en el cual la R (arginina) en la posición 44 de la VH HuK5-70 había sido sustituida con G (glicina) (HuK5-70 R44G; que en lo sucesivo se refiere como HuK5-70-2), se observó para tener una actividad de unión al antígeno al parecer mejorada (Figura 68). La secuencia de un gen de la VH HuK5-70 R44G (en lo sucesivo referida como VH de HuK5-702) se muestra en la Figura 69.
[Ejemplo 49] [Purificación y caracterización del anticuerpo HuK5-70-2] Se purificó el anticuerpo HuK5-70-2 que es un anticuerpo muíante Hu 5-70 R44G como sigue. Es decir, se transfectaron pFUSE-CHIg-HuK5-70 R44G y pFUSE2-CLIg-HuK5-70 en células 293F, y el resultante entonces se cultivó durante 5 días. Después de lo anterior, se recuperó un sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo HuK5-70-2 a partir del sobrenadante de cultivo recuperado, al usar Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). Se cargó el anticuerpo HuK5-70-2 purificado en SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Como un resultado, una cadena H de aproximadamente 50 kDa y una cadena L de aproximadamente 25 kDa se encontraron. La pureza de cada anticuerpo fue del 95% o más (Figura 70).
Se examinó la actividad de unión de los anticuerpos HuK5-70-2 y HuK5-70 purificados a hTROP-2 mediante ELISA cubierto con antígeno de alta densidad y ELISA cubierto con antígeno de baja densidad. Se examinó la afinidad de los anticuerpos mediante ELISA cubierto con antígeno alta densidad (al usar una placa de 96 pozos que se cubrió con 1 pg/ml de hTROP-2). Como un resultado, se encontró que la curva de unión del anticuerpo HuK5-70 casi fue traslapada con la curva de unión del anticuerpo HuK5-70-2, y que su afinidad fue equivalente entre sí. Posteriormente, se examinó la avidez de los anticuerpos mediante ELISA cubierto con antígeno de baja densidad (al usar una placa de 96 pozos que se cubrió con 0.1 pg/ml de hTROP-2). Como un resultado, se encontró que, como el mismo caso con usar un sobrenadante de cultivo, la actividad de unión al antígeno del anticuerpo HuK5-70-2 fue claramente mayor que la actividad de unión al antígeno del anticuerpo HuK5-70 (Figura 71). Específicamente, el valor de EC50 de un anticuerpo K5-70 fue 11.4 ng/ml, que el de un anticuerpo HuK5-70 fue 33.4 ng/ml, y el de un anticuerpo HuK5-70-2 fue 11.4 ng/ml. Así, se demostró que el anticuerpo HuK5-70-2 tiene una avidez mejorada en comparación con el anticuerpo HuK5-70, y que el anticuerpo HuK5-70-2 tiene actividad equivalente a la del anticuerpo K5-70. [Ejemplo 50] [Medición de la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) de anticuerpos anti-hTROP-2 human izad os] (1) Preparación de la solución de célula objetivo Como células objetivo, una línea celular SW480 de cáncer de colon humano, una línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano, y una línea celular PC-3 del cáncer de próstata humana, cada una de las cuales endógenamente expresa hTROP-2, se usaron. Se cosecharon células objetivo cultivadas en una placa del cultivo celular de 10 cm a partir de la placa mediante tratamiento con tripsina, y después se suspendieron en un medio de ensayo. Un medio de Leivovitz L-15 (para células SW480) o un medio RPMI-1640 (para células PK-59 y PC-3), al cual 0.5% de FBS había sido agregado, se usó para el ensayo de ADCC. Después de la terminación de la centrifugación (a 1000 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente), se prepararon las pelotillas a una densidad de 2 ? 105 células/ml con el mismo medio que el usado antes, y así una solución de célula objetivo se preparó. (2) Separación de células mononucleares de sangre periférica humana Se recolectó sangre venosa sana con heparina, y después se diluyó a 2 veces con PBS. Después de lo anterior, la sangre diluida se cubrió en Lymphoprep (Daiichi Kagaku Yakuhin K.K.) y después se centrifugó (a temperatura ambiente a 750 rpm durante 5 minutos, y después a 2000 rpm durante 20 minutos). Después de la terminación de la centrifugación, las células mononucleares (monocitos de sangre periférica sana) se recuperaron a partir de una fracción de capa intermedia, y después se lavaron con PBS tres veces. Después de lo anterior, se preparó una suspensión celular con un medio de ensayo, y las células preparadas se usaron como células efectoras. (3) Actividad de ADCC de anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (anticuerpos HuK5-70, HuK5-70-2 y HuT6-16-2).
Se dispensaron 100 µ? (2 ? 104 células/pozo) de la solución celular objetivo preparada en una placa de fondo plana de 96 pozos (fabricada por FALCON). Posteriormente, se agregaron células mononucleares de sangre periférica humana (células efectoras) a la placa, de modo que la relación entre las células efectoras y las células objetivo pudiera ser 40:1. Después de lo anterior, los anticuerpos anti-hTROP-2 humanizados (anticuerpos HuK5-70, HuK5-70-2 y HuT6-16-2) cada uno se agregó como anticuerpos de prueba a la placa a una concentración final de 0.1 a 30 pg/ml. Se ajustó la mezcla a una cantidad total de 200 µ?, y entonces se cultivó en una incubadora de C02 (a 37°C en 5% de C02) durante 6 horas. Después de la terminación del cultivo, se midió la actividad de la lactato deshidrogenasa liberada a partir del citoplasma de las células objetivo dañadas por las células efectoras al usar el kit de Detección de Citotoxicidad (LDH, por sus siglas en inglés) (Roche, Cat. No. 11 644 793 001) de acuerdo con los protocolos incluidos con el kit, y la ADCC entonces se evaluó al usar el resultado de medición como un indicador.
Como se muestra en las Figuras 72A a 72C, se hizo evidente que los anticuerpos HuK5-70 y HuT6-16-2 dependientemente de dosis exhiben actividad de ADCC de a una línea celular SW480 de cáncer de colon humano (Figura 72A), una línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano (Figura 72B) y una línea celular PC-3 de cáncer de próstata humana (Figura 72C), cada una de las cuales expresa hTROP-2 en la superficie celular. Además, como se muestra en las Figuras 72B y 72C, se hizo evidente que el anticuerpo HuK5-70-2 exhibe actividad de ADCC en la línea celular PK-59 de cáncer pancreático y la línea celular PC-3 de cáncer de próstata humana, donde la actividad de ADCC mencionada anteriormente es más fuerte que la del anticuerpo HuK5-70. Como se menciona antes, el anticuerpo HuK5-70-2 es un anticuerpo cuya capacidad de unión (avidez) a hTROP-2 ha sido mejorada sustituyendo la R (arginina) en la posición 44 de la VH HuK5-70 con G (glicina). Se demostró que la avidez del anticuerpo HuK5-70-2, que había sido mejorada en comparación con el anticuerpo HuK5-70, está reflejada en la actividad de ADCC. Por lo tanto, se asume que el anticuerpo HuK5-70-2 tiene excelente actividad antitumoral incluso in vivo, como con el anticuerpo HuK5-70 (donde el anticuerpo HuK5-70-2 puede preferiblemente tener actividad antitumoral mayor que la del anticuerpo HuK5-70). A partir de los resultados descritos antes, se sugirió que los anticuerpos HuK5-70, HuK5-70-2 y HuT6-16-2 se convierten en anticuerpos terapéuticos útiles para el cáncer que expresa hTROP-2 en la superficie celular.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL La presente invención puede proporcionar un anticuerpo, que reacciona específicamente con hTROP-2 y tiene alta actividad antitumoral in vivo, y específicamente, un anticuerpo

Claims (44)

230 REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo contra TROP-2 humano en el cual una región V de cadena H del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 92 o 98, y una región V de cadena L del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 93.
2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 36 a 38, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 41 a 43, respectivamente.
3. Un anticuerpo contra TROP-2 humano en el cual una región V de cadena H del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 94 o 95, y una región V de cadena L del anticuerpo consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 96.
4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, donde las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena H del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 66 a 68, respectivamente, y/o las secuencias de aminoácidos de 1 a 3 CDR de la región V de cadena L del anticuerpo se muestran en las SEC DE ID NOS: 71 a 73, 231 respectivamente.
5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene un anticuerpo humanizado.
6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene actividad antitumoral in vivo.
7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que exhiba el 50% o más de actividad inhibidora del crecimiento tumoral a una dosis de 5 a 20 mg/kg de peso corporal.
8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, donde la frecuencia de administración para exhibir la actividad inhibidora del crecimiento tumoral es a lo más una vez por semana.
9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que exhiba el 50% o más de la actividad inhibidora del crecimiento tumoral por una simple administración de anticuerpo a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal.
10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene actividad antitumoral en dos o más tipos de líneas celulares de tumor humano.
11. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la constante de disociación (valor de Kd) es 1.0 ? 10"10 o menor.
12. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que tiene un anticuerpo monoclonal. 227 monoclonal que tiene alta actividad antitumoral in vivo a una dosis baja, y particularmente, tal anticuerpo, que es un anticuerpo humanizado. Además, la presente invención puede proporcionar un hibridoma, que produce el anticuerpo, un fragmento del anticuerpo, un complejo del anticuerpo o similares y varios tipos de fármacos, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar un tumor, y un kit para detectar o diagnosticar un tumor. TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 3 ADN sintético SEC ID NO: 4 ADN sintético SEC ID NO: 5 ADN sintético SEC ID NO: 6 ADN sintético SEC ID NO: 7 ADN sintético SEC ID NO: 8 ADN sintético SEC ID NO: 9 ADN sintético SEC ID NO: 10 ADN sintético SEC ID NO: 11 ADN sintético SEC ID NO: 12 ADN sintético SEC ID NO: 13 ADN sintético SEC ID NO: 14 ADN sintético SEC ID NO: 15 ADN sintético SEC ID NO: 16 ADN sintético SEC ID NO: 17 ADN sintético SEC ID NO: 18 ADN sintético 228 SEC ID NO: 19 ADN sintético SEC ID NO: 20 ADN sintético SEC ID NO: 21 ADN sintético SEC ID NO: 22 ADN sintético SEC ID NO: 23 ADN sintético SEC ID NO: 24 ADN sintético SEC ID NO: 25 ADN sintético SEC ID NO: 26 ADN sintético SEC ID NO: 27 ADN sintético SEC ID NO: 28 ADN sintético SEC ID NO: 29 ADN sintético SEC ID NO: 30 ADN sintético SEC ID NO: 31 ADN sintético SEC ID NO: 32 ADN sintético SEC ID NO: 33 ADN sintético SEC ID NO: 74 ADN Recombinante SEC ID NO: 75 Constructo sintético recombinante) SEC ID NO: 76 ADN Recombinante SEC ID NO: 77 Constructo sintético recombinante) SEC ID NO: 78 ADN Recombinante SEC ID NO: 79 Constructo sintético recombinante) SEC ID NO: 80 ADN Recombinante 229 SEC ID NO: 81 Constructo sintético (proteína recombinante) SEC ID NO: 82 ADN Recombinante SEC ID NO: 83 Constructo sintético (proteína recombinante) SEC ID NO: 92 Proteína recombinante SEC ID NO: 93 Proteína recombinante SEC ID NO: 94 Proteína recombinante SEC ID NO: 95 Proteína recombinante SEC ID NO: 96 Proteína recombinante SEC ID NO: 97 Proteína recombinante SEC ID NO: 98 Proteína recombinante SEC ID NO: 99 ADN Recombinante SEC ID NO: 100 ADN Recombinante.
13. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
14. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de pulmón humano, cáncer de mamas humanas y cáncer de ovarios humanos.
15. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, donde el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastático.
16. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde las líneas celulares tumorales son por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de una línea celular PK-59de cáncer pancreático humano, una línea celular BxPC-3de cáncer pancreático humano, una línea celular KP-3L de cáncer pancreático humano, una línea celular KP-2 de cáncer pancreático humano, una línea celular PK-1 de cáncer pancreático humano, una línea celular PK-45H de cáncer pancreático humano, una línea celular PK-45P de cáncer pancreático humano, una línea celular TCC-PAN2 de cáncer pancreático humano, una línea celular SUIT-2 de cáncer pancreático humano, una línea celular CACO-2 de cáncer de colon humano, una línea celular SW480 de cáncer de colon humano, una línea celular DLD-1 de cáncer de colon humano, una línea celular HCT 116 de cáncer de colon humano, una línea celular JIMT-1 de cáncer de mamas humanas, una línea celular HCC1143 de cáncer de mamas humanas, una línea celular MCF-7 de cáncer de mamas humanas, una línea celular MBA- D-468 de cáncer de mamas humanas, una línea celular DU145 de cáncer de próstata humana, una línea celular PC-3 de cáncer de próstata humana, una línea celular SK-OV-3 de cáncer de ovarios humanos, una línea celular Calu-3 de cáncer de pulmón humano y una línea celular TFK-1 de colangiocarcinoma humano.
17. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde las líneas celulares tumorales son por lo menos dos tipos seleccionados del grupo que consiste de una línea celular PK-59 de cáncer pancreático humano, una línea celular BxPC-3 de cáncer pancreático humano, una línea celular SW480 de cáncer de colon humano, una línea celular Calu-3 de cáncer de pulmón humano, una línea celular MBA-MD-468 de cáncer de mamas humanas y una línea celular SK-OV-3 de cáncer ovárico humano.
18. Un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 17.
19. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 92 o 98 y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 93.
20. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 94 o 95 y/o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC DE ID NO: 96.
21. Un conjugado de anticuerpo-fármaco, que comprende el anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 17 y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células.
22. Un conjugado de fragmento-fármaco del anticuerpo, que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 18 a 20 y una sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de eliminación de células.
23. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 21 o 22, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
24. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 21 o 22, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer colorrectal humano, cáncer de pulmón humano, cáncer de mamas humanas y cáncer de ovarios humanos.
25. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastático.
26. Una composición farmacéutica, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 17, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 18 a 20 y el conjugado de acuerdo con de las reivindicaciones 21 a 25.
27. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, que se usa en el tratamiento del tumor.
28. La composición de acuerdo con la reivindicación 27, que no causa la reducción de peso como un efecto secundario.
29. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, que se usa en la diagnosis del tumor.
30. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
31. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, donde el tumor es un cáncer recurrente o un cáncer metastático.
32. Un agente terapéutico contra tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 17, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 18 a 20 y el conjugado de acuerdo con de las reivindicaciones 21 a 25.
33. El agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 32, que no causa la reducción de peso como un efecto secundario.
34. El agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
35. Un agente de diagnóstico del tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 17, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y el conjugado de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 21 a 25.
36. El agente de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 35, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
37. Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y el conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, para reaccionar con una muestra recolectada de un cuerpo vivo; y después detectar señales del anticuerpo reaccionado y/o fragmento de anticuerpo.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
39. Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor, que comprende por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y el conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25.
40. El kit de acuerdo con la reivindicación 39, donde el tumor es por lo menos un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer pancreático humano, cáncer de próstata humana, cáncer colorrectal humano, cáncer de mamas humanas, cáncer de ovarios humanos, cáncer de pulmón humano y colangiocarcinoma humano.
41. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
42. Un polinucleótido que codifica el fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.
43. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 41 o 42.
44. Un transformante que comprende el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 43.
MX2014006037A 2011-11-22 2012-11-21 Anticuerpo anti-trop-2 humano que tiene una actividad antitumoral in vivo. MX362720B (es)

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