CN102448492A - 抗trop-2单克隆抗体及其在治疗和诊断肿瘤中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明教导了具有高亲和力且能识别Trop-2分子不同区域的抗Trop-2单克隆抗体，及其在治疗和诊断肿瘤中的用途，所述肿瘤为例如：子宫内膜、乳腺、头颈部、结肠直肠、胃、肺、卵巢、前列腺、胰腺、肾、宫颈和膀胱(泌尿道上皮)肿瘤。

Description

抗TROP-2单克隆抗体及其在治疗和诊断肿瘤中的用途
本发明涉及抗Trop-2单克隆抗体及其在治疗和诊断肿瘤中的用途。更具体而言，本发明涉及具有高亲和力且能识别Trop-2分子不同区域的抗Trop-2单克隆抗体，以及它们在治疗和诊断肿瘤中的用途，所述肿瘤可为例如：子宫内膜、乳腺、头颈部、结肠直肠、胃、肺、卵巢、前列腺、胰腺、宫颈、肾脏和膀胱(泌尿道上皮)的肿瘤。
Trop-2(AC：P09758)是一种转导决定胞质钙增加的信号的分子1，其涉及上皮组织中细胞-细胞和细胞/基质的粘附。Trop-2还被认为是一种肿瘤相关的钙信号转导蛋白2(TACSTD-2)2，3、GA733-1、EGP、MR23、MR54、RS-7和T164-6。Trop-2全部沿着上皮细胞中的膜定位4。Trop-2的胞外结构域(即球状部分)包含EGF样结构域，其后是甲状腺球蛋白结构域，它涉及细胞粘附。该球状部分之后是不含半胱氨酸的结构域，据认为该结构域起到支持茎(supporting stem)作用3，7。Trop-2的胞内结构域的长度为26个氨基酸，且含有HIKE结构域8，该区域包含PKC磷酸化位点(Ser303)9。
本发明的发明人已证实和扩充了先前的数据4-6，数据显示人的多数肿瘤表达Trop-2。DNA微阵列、EST、SAGE、RNA印迹和RT-PCR分析显示TROP2 mRNA在卵巢、NSCLC、前列腺、乳腺和结肠癌细胞系中表达，且在人的胃、结肠、乳腺、子宫内膜、肾、肺和卵巢肿瘤中表达。TROP2 mRNA的表达还可在正常人的乳腺组织、肺、子宫、前列腺、唾液腺、胰腺、呼吸道、胸腺、肾和胎盘中被检测到。
对1755例人瘤形成进行Trop-2蛋白表达的免疫组织化学分析(图1和表1)显示了Trop-2蛋白在绝大部分恶性上皮瘤形成中高度表达(占病例的64％至90％)。Trop-2表达在宫颈和胰腺肿瘤中最普遍，其次是胃、结肠、乳腺和前列腺癌，再次是卵巢、肺和子宫内膜瘤。淋巴瘤、黑色素瘤、脑肿瘤和肉瘤中不表达Trop-2(图1和表1涉及Trop-2在人原发性肿瘤及其相应转移灶中的表达)。
表1
Figure BPA00001417903800021
a：在正常组织中的表达。
b、c：相对于正常组织中的表达，原发性肿瘤中的表达更高或更低，转移灶则是与相应的原发性肿瘤相比。
d：通过Wilcoxon检验得到的P值。
已在体内、外证实了Trop-2在肿瘤发展中的直接作用。在MTE4-14和Igrov-1中导入Trop-2或Trop-2在KM12SM中的过表达刺激了完全转化和简单永生化细胞的生长(图2a)，这表明Trop-2表达是刺激肿瘤细胞生长所必需的，且其足以刺激肿瘤细胞的生长。
在实验性肿瘤(将293或L肿瘤细胞皮下注射入裸鼠中)中也获得了类似的结果(图2b)。已显示Trop-2的表达诱导了有丝分裂活性、核多型现象和多核巨细胞的增加。肿瘤发展与Trop-2表达水平成比例。
Trop-2胞质区的缺失阻断了Trop-2依赖性生长刺激，这显示该区域在Trop-2信号转导中起到重要作用(图2b)。该尾部包含被PKC磷酸化的丝氨酸残基(S303)9。S303诱变阻断了生长刺激活性，这表明Trop-2的刺激活性是磷酸化依赖性的(图2a)。
在抗体微阵列上进行的蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析可用于识别Trop-2信号转导途径中所涉及的下游分子(图3)。Trop-2诱导的表达变化显示于跨膜酪氨酸激酶受体(PDGFR、Met、Ret、VEGFR)、可溶性酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷酸酯酶、细胞周期调节因子(cell-cycle regulators)和凋亡调节分子。蛋白质印迹分析验证了针对参照分子和磷酸化位点组的抗体微阵列分析。所得结果指示了Trop-2依赖性的PKC-α、FAK和Raf-1活化；PTEN-Akt-GSK3/β-S6K途径的参与；ERK、JNK和p38 MAPK的调控；NF-κB的诱导；以及凋亡因子p53和Rb的调控。据显示该模型中关键因素(例如ERK、细胞周期蛋白D1、NFκB)的调控依赖于完整Trop-2胞质尾区的存在。
转移扩散是人类大部分癌症的主要死因10。在普通肿瘤(如结肠、乳腺和肺癌)的很多病例中，在手术时已发生了转移。转移性肿瘤通常对绝大多数目前所能提供的治疗尝试都具有抗性10。
因此，对肿瘤扩散的分子机理的更好了解对更好地治疗晚期肿瘤性疾病具有重要意义。具体而言，鉴定肿瘤侵占性和转移可能性的新标记物可用于在早期鉴定侵占性病例和提供新颖疗法的新靶标10。
为了这一策略性目标，本发明的发明人显示了TROP2是在不同实验体系中的转移性细胞中过表达的唯一一种基因。Trop-2在人原发性癌症及其相应的转移灶中的表达的大规模分析揭示了Trop-2在来自结肠、胃、乳腺和卵巢肿瘤的转移灶中过表达。该结果通过Northern和Western印迹法以及免疫组织化学法验证(图1和表1、2)。
随后通过用野生型或诱变处理的Trop-2转染KM12SM结肠肿瘤细胞系，显示了Trop2在转移性细胞扩散中的成因性作用。然后将经转染的细胞注射到裸鼠的脾脏中并评估转移的可能性。据显示，Trop-2的表达诱导了向肝脏的转移扩散的增加(在90％的病例中观察到)。表2显示了Trop-2表达细胞的转移能力。
表2
  KM12SM   脾脏摄取率％   尺寸(cm3)   肝脏转移灶％   尺寸(cm3)
  对照   64,9±8,7   0,11±0,04   45,8±14,8   0,50±0,21
  野生型Trop-2   69,0±10,6   0,09±0,03   90,0±12,0a   0,45±0,18
  Dcyto Trop-2   100,0±0b   0,37±0,23   76,9±11,7   3,25±0,64c
  DHIKE Trop-2   84,6±13,3   0,38±0,22   63,6±30,0   0,28±0,15
  Trop-2 S303A   90,0±8,3   0,28±0,21   88,9±6,7   0,85±0,55
  Trop-2 E→K   66,7±17,6   0,20±0,12   75,0±33,3   2,20±0,95d
a：Fisher精确检验：P＝0,0114，与对照比较。
b：Fisher精确检验：P＝0,0382，与野生型Trop-2比较。
c：Student T检验：P＜0,0001，与野生型Trop-2比较。
d：Student T检验：P＝0,0204，与野生型Trop-2比较。
Trop-2表达还可改变生长模式、凋亡诱导、细胞形态、细胞复制率和转移规模。
人肿瘤及其相应转移灶中Trop-2的高频和高表达水平使得该分子成为“继承性”免疫治疗(即基于给予实验生产的抗体)中很有吸引力的靶标(图1和表1)。
早先已获得了抗Trop-2的其它单克隆抗体4-6，但这些抗体基本上并未在临床试验中作为抗肿瘤药物。
此外，许多抗体具有低亲和力，而已知靶向于结构类似于Trop-2的分子(Trop-1、Ep-CAM、GA733-2)3，7的高亲和力抗体对肿瘤细胞具有更高的细胞毒性。关于抗体亲和力和靶抗原密度对抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响的体外数据显示：抗体的高亲和力可诱导对低抗原表达水平的细胞的杀伤，或者如果水平相当的话，则具有更高的效力11。由于靶标抗原表达的不均一性是人肿瘤中的共有特征，采用高亲和力抗体对获得更佳的临床结果具有非常重要的作用。
此外，目前市场上可获得的大部分抗Trop-2单克隆抗体(例如T16)均是采用骨髓瘤细胞系(例如NS-1或SP2-1)作为融合伴侣，其依旧表达亲本免疫球蛋白轻链。这就造成这些抗体事实上是多种抗体的非均一混合物，这些抗体具有直接参与Trop-2识别的一条、两条轻链，或无一轻链直接参与Trop-2识别。
已知专利申请WO03/074566、US2004/001825、US2007/212350和US2008/131363中教导了RS7抗体及其在治疗和诊断肿瘤中的用途。
RS7单克隆抗体是通过用来自肺鳞状细胞癌的组织免疫小鼠获得的，即，未对该抗体抗Trop-2分子的特定和不同部分的反应性进行选择。这就阻碍了各种单克隆抗体的协同和个性化使用，即，为各肿瘤使用最佳的单克隆抗体，这可通过Trop-2翻译后修饰和该分子产生控制肿瘤生长的胞内信号的能力来确定。
已知专利申请WO2008/144891教导了用于肿瘤治疗的一种抗Trop-2单克隆抗体。然而，其中记载的AR47A6.4.2单克隆抗体是通过筛选抗体的体外细胞毒或抑制细胞生长能力而获得的。换言之，该筛选并未基于体内效力，而体内效力是评估这些抗体效力应当测试的基本参数。事实上，上述申请并未通过效力比较公开现有技术抗体(如RS7)改进的任何证据。
此外，AR47A6.4.2单克隆抗体对已在试验动物中生长的生长后期单一类型肿瘤(BxPC-3)显示出效力，该试验被认为是测试针对试验性肿瘤的活性的最严格和可信的测试。
用卵巢肿瘤的组织免疫小鼠获得AR47A6.4.2单克隆抗体，即，未对抗Trop-2分子的特定和不同部分的反应性进行选择。与RS7抗体的情况一样，这就阻碍了不同单克隆抗体的协同和个性化使用，即，为各肿瘤使用最佳的单克隆抗体，这可通过Trop-2翻译后修饰和该分子产生控制肿瘤生长的胞内信号的能力来确定。
最后，专利申请WO2008/144891中使用了小鼠作为仅有的试验模型来显示AR47A6.4.2单克隆抗体不具备毒性。该小鼠并不表达人Trop-2，因此并不足以验证抗Trop-2抗体对正常细胞的毒性。相反，在本申请中教导了Trop-2在人表皮、食管、外分泌胰腺、泌尿道上皮和其它组织的上皮细胞中表达。这暗示了潜在的、极可能发生的严重细胞毒性，例如在全身性给予(如静脉注射)抗Trop-1抗体(ING-1)的情况下，会发生急性胰腺炎。
因此，根据如上所述，明确需要新的抗Trop-2单克隆抗体，以克服现有技术抗体的缺点。
具体而言，抗肿瘤单克隆抗体(例如靶向性抗Her2/neu)定向地抗某分子的特定部分，从而避免特定的构象变化或与其它信号转导分子的相互作用是非常重要的，其在决定抗肿瘤治疗效果中起主要作用12。
另一个重要的方面是获得不竞争结合Trop-2的多种抗体的可能性。当各抗体的靶标(技术术语谓之表位)在肿瘤的不同发展或分化阶段选择性表达时，这样可能结合更多数量的肿瘤细胞。此外，这还使得更多数量的抗体分子可同时结合其靶标，产生相应提高的效力。
本发明的发明人现已制备了新型抗Trop-2单克隆抗体以便在生物医药领域有效使用，它们是同源的且具有高亲和力，并且这些抗体靶向性针对该分子的不同区域(图4和5)，这与已知的抗体不同。本发明教导的抗Trop-2抗体可有效对抗多种类型肿瘤的生长，例如Colo-205、HCT-116和HT29结肠癌；SKOV卵巢癌；SKBR3和MDA MB468乳腺癌。此外，如在免疫抑制小鼠中注射人肿瘤的试验模型中所示(图6)，与现有技术中的RS7抗体相比，本发明所教导的抗体具有更高的抗肿瘤活性。
本发明的发明人已开发了产生可识别Trop-2分子不同区域的单克隆抗体的新策略。为了产生分泌定向抗Trop-2的单克隆抗体的新杂交瘤细胞系，采用由哺乳动物细胞系(L和293)生产的或由表达相应构建物的杆状病毒产生的人Trop-2分子的整个胞外部分(NCBI RefSeq NM_002353)3，对Balb/c小鼠进行多次免疫循环。
抗Trop-2杂交瘤分离策略的关键点是选择具有抗TROP-2转染的L细胞的特异性活性而不具有抗空白载体对照转染的对照L转染子的活性的杂交瘤细胞群，这使得筛选过程严格而有效。该筛选过程通过流式细胞计量法或ELISA测试对转染的或非转染的L细胞进行。
本发明中所用的方法将ELISA和相似的测定法用于重组Trop-2蛋白或该蛋白的诸部分，这些重组蛋白或蛋白部分在用Trop-2杆状病毒转染的昆虫细胞或在哺乳动物细胞中产生。这使得所用重组Trop-2蛋白具有天然折叠和糖基化，由此严格对应于由肿瘤细胞实际表达的分子，以进行有效筛选。
并且，发明人还生产了仅表达Trop-2球状区域或茎状区域的载体。这就能特异性选择靶向抗该分子各部分的单克隆抗体(图4)，从而可能分别提供对同型聚集(omotypic aggregation)/细胞附着、或穿过已建立的Trop-2分子网络的差异化或干扰能力。
用如上所述产生的单克隆抗体识别Trop-2分子的正式证据是通过这些抗体对用人Trop-2基因转染的鼠细胞系MTE-4-14的染色能力来建立的(如免疫荧光试验中所示，图5)。
采用这些新工艺能获得对野生型分子具有高亲和力和对该分子的不同部分具有高特异性的抗Trop-2单克隆抗体。克隆抗体。在裸鼠中显示了靶向Trop-2的单克隆抗体的效力，采用由表达Trop-2的L细胞引起的纤维肉瘤或人肿瘤细胞系(如源自卵巢、乳腺和结肠肿瘤)的异源移植物作模型。然后选择证明在体内具有最佳/最有效的单克隆抗体4，其基本上可达到完全抑制肿瘤生长(图6和7)。
如上所述，本发明教导的抗体与RS7抗体相比具有更高的效力(图6)。用于这些试验中的抗体是mRS7单克隆抗体，其在专利申请WO03/074566中有所教导，且在该申请中显示了与cRS7和hRS7变体具有相同的亲和力和结合活性。
就抗Trop-2抗体的使用策略而言，还发现可通过优化策略降低与高亲和力抗Trop-2抗体相伴的潜在全身性毒性效果，该优化策略可包括“追击(chasing)”过程，以安全/可再生地快速清除残留的循环抗体。作为对该方法的补充，高亲和力抗Trop-2抗体的使用可用于局部区域(locoregional)治疗。具体而言，本发明的发明人已发现由此制得的单克隆抗体可有利地用于治疗性IP给药，其中在全身性扩散的变化中，对抗体的‘追击’通过特异性结合被肿瘤细胞吸收进行。这是由腹膜内抗体给药后所期望的药代动力学和卵巢癌及其转移灶中Trop-2的高水平表达所共同决定的(图1和表1)。基于基本上对应原则的第二种策略是在结肠癌的肝转移灶的病例中采用肝动脉内给药。应理解这些方法可延伸到其它相似的病例中，例如在头颈部肿瘤中局部给药，以及胸膜内、膀胱内和在总体病损内(in generalintralesional)给药。
因此，本发明的一个特定的实施方式是一种包含至少两种分离的抗Trop-2单克隆抗体或由至少两种分离的抗Trop-2单克隆抗体组成的组合，所述至少两种分离的抗Trop-2单克隆抗体选自：于2008年8月27日保藏在意大利热那亚的AID-ICLC，保藏号为PD 08019、PD 08020或PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体。
优选该组合包括保藏号为PD 08019、PD 08020和PD 08021，或PD 08019和PD08020，或PD 08019和PD 08021，或PD 08020和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体，或由上述抗Trop-2单克隆抗体组成。
本发明的另一个实施方式是由保藏号为PD 08019、PD 08020或PD 08021的杂交瘤细胞系产生的各种抗Trop-2单克隆抗体。
本发明所教导的抗体可以是完全人源化或嵌合抗体，其中用人的恒定区替换鼠的恒定区13，或包含相应轻链和/或重链可变区的至少一种CDR的变体，可经诱变以改变其对靶标的亲和力。
上述抗体识别的表位位于球状区域或茎状区域中(图4)。
除了如上所述的抗体，还可使用抗体或嵌合分子片段、Fv、Fab、F(ab)2片段、单链或多聚抗Trop-2抗体。抗体、片段或抗体嵌合体可源自或被工程改造为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE同种型。
并且，还可制备本发明抗体的重组衍生物，其中恒定区被生物活性伴侣取代或与之偶联，所述伴侣可为例如：抗生物素蛋白或其衍生物、生长因子、毒素、细胞因子、抗肿瘤药物和放射性同位素、或具有生物活性和/或可用于提高抗肿瘤治疗效力的任何其它化合物。
可将编码上述蛋白质的核酸克隆到表达载体中。表达载体优选为质粒、粘粒、噬菌粒(pahgemid)、BAC、杆状病毒、用于酵母或植物的载体、噬菌体载体、TI或相似质粒，包括用于转基因生物体、敲除和用于基因治疗的载体。由此，可制备含有且可能表达本发明的核酸分子的细胞。
此外，本发明还教导了一种药物组合物，其包含以下组分或由它们组成：作为活性成分的上述组合或上述抗Trop-2单克隆抗体；和与之组合的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。具体而言，该药物组合物可为适于腹膜内、胸膜内、膀胱内、病损内给药或通过肝动脉给药的形式。
本发明的另一个实施方式是上述组合或上述抗Trop-2单克隆抗体或上述组合物在制备预防或治疗肿瘤和/或转移灶的药物中的用途。
可在移除肿瘤(例如表达Trop-2的肿瘤)之前或之后，通过单独给予抗瘤剂(如抗体或其衍生物)或与其它治疗方案结合对肿瘤进行治疗。具体而言，抗Trop-2抗体及其衍生物的用药程式可为全身性或局部给药，例如腹膜内、胸腔内、膀胱内、肝动脉内或病损内(肿瘤内)给药。基于抗Trop-2抗体的指示性但非穷举的治疗靶标包括：子宫内膜、乳腺、头颈部、结肠直肠、胃、肺、卵巢、前列腺、胰腺、宫颈、肾脏和膀胱(泌尿道上皮)肿瘤。
此外，本发明还教导了上述组合或上述抗Trop-2单克隆抗体在肿瘤体外诊断中的用途。
本发明的另一个实施方式是用于体外诊断肿瘤的试剂盒，其包含上述的组合或上述的抗Trop-2单克隆抗体或上述的组合物，或由上述组合或上述抗Trop-2单克隆抗体或上述组合物。
可将本发明教导的抗体或它们的衍生物与序列、单个残基或合成分子(标签)等融合，以通过亲和层析对抗体进行纯化。所用的标签可用作检测分子或指示物(例如放射性同位素或荧光标签)或可催化可检测底物变化的酶标签，两者均可用于实验室诊断和成像。可用的诊断技术可为例如：光学、共聚焦、多光子和电子显微镜法(multiple foton and electronic microscopy)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫技术以及类似的其它技术。
本发明所教导的抗体可用于制备检测表达Trop-2的瘤(包括体内肿瘤成像)的组合物。可将抗Trop-2抗体与放射性同位素或荧光示踪物连接，例如量子点或有机生色团或酶，其可通过化学发光检测。通过标记抗Trop-2抗体产生的信号可通过扫描仪或断层摄影仪器，根据目前使用的先进设备(如TAC/PET)的原则检测到。
现通过本发明的一些优选实施方式(但不限于此)的图解和实施例对本发明进行描述，尤其参考所附附图。
图1：Trop-2蛋白在人肿瘤中的表达。
图的上部标明了Trop-2在人肿瘤中的表达百分比。图的底部标明了所分析样品的绝对数目。
图2：Trop-2诱导的细胞生长。
(a)用野生型Trop-2或缺失胞质尾的Trop-2(Δcyto)或PKC磷酸化位点突变的Trop-2(S303A)转染的Igrov-1、KM12SM和MTE 4-14细胞的体外生长率。对照细胞以点线表示；野生型Trop-2转染子以实线表示；诱变的Trop-2转染子用虚线表示。误差棒：测定平均值的标准偏差。
(b)源自L(纤维肉瘤)和293(癌)细胞的肿瘤的体内生长率。仅用载体转染的细胞以点线表示；野生型Trop-2转染子以实线表示；诱变的Trop-2转染子用虚线表示。
图3：Trop-2信号转导途径的蛋白质组学分析。
(a)在抗体阵列上分析以Trop-2或对照载体稳定转染的MTE 4-14细胞中的各种信号转导分子的表达水平。表中显示蛋白质绝对水平(泛(pan))中或特定位点磷酸化水平的显著变化。灰色：用Trop-2转染的细胞相对于对照的上升(左)或下降(右)百分比。P：Trop-2表达水平相对于对照的T-检验分析。
(b)平行的蛋白质印迹分析。
图4：通过流式细胞计量法分析所生产的单克隆抗体对Trop-2的特异性识别。
(a)将鼠纤维肉瘤L细胞(细线)或用野生型Trop-2转染的L细胞(粗线)与抗Trop-2单克隆抗体共同孵育。以T16作为阳性对照抗体。
(b)将鼠纤维肉瘤L细胞(细线)或者用分别对应于Trop-2球状区域或干状区域缺失的突变体转染的L细胞(粗线)与抗Trop-2单克隆抗体共同孵育。抗体的结合用偶联于Alexa488荧磷光的山羊抗小鼠抗血清检测。
图5：通过共聚焦显微镜法分析所生产的单克隆抗体对Trop-2的特异性识别。
将用人TROP2基因转染的鼠胸腺上皮细胞MTE 4-14与所示的Trop-2单克隆抗体共同孵育。抗体的结合用偶联于Alexa488荧磷光的山羊抗小鼠抗血清检测。以T16作为阳性对照抗体。
图6：所示抗Trop-2抗体的处理对肿瘤生长的抑制作用。
(a)仅用载体转染且以具有无关特异性的抗体(抗丹酰)处理的细胞以点线表示；TROP2转染子以实线表示；用抗Trop抗体处理的Trop2转染子以虚线表示。误差棒：测试平均值的标准误差。
(b)用不同抗Trop-2抗体处理对肿瘤生长抑制的效力。用具有无关特异性的抗体(抗丹酰)处理的TROP2转染子以实线表示；用RS7抗Trop-2抗体处理的TROP2转染子以点线表示；用本申请所描述的抗Trop-2抗体处理的TROP2转染子以实线表示。误差棒：测试平均值的标准误差。
图7：与用预防性方式处理的肿瘤相比，所示抗Trop-1抗体处理对已生长的后期肿瘤生长的抑制作用。
(a)用预防性方式(同时注入肿瘤细胞和抗体)，以不同抗Trop-2抗体处理对肿瘤(HT29和HCT-116 U5.5)生长抑制的效力。用具有无关特异性的抗体(抗丹酰)处理的肿瘤以点线表示；用抗Trop-2抗体(2G10：方块，2E7：三角)处理的肿瘤以实线表示。误差棒：测试平均值的标准误差。
(b)在后期，以不同抗Trop-2抗体处理的肿瘤(COLO205和HT29)生长抑制效力。用具有无关特异性的抗体(抗丹酰)处理的肿瘤以点线表示；用抗Trop-2抗体(2E7和2G10)处理的肿瘤以实线表示。右图显示了用2E7和2G10共同处理的结果。垂直箭头表示开始用抗体处理。误差棒：测试平均值的标准误差。
实施例1：本发明单克隆抗体的制备及对其效力的效力研究
流式细胞计量法
以流式细胞计量法在细胞系上分析抗Trop-2单克隆抗体与肿瘤和转染细胞表面的结合(图4)。染色和分析基本上按参考文献的描述进行15。
单克隆抗体的产生
对Balb/c小鼠进行多次免疫循环，其中采用了人Trop-2分子的完整胞外区(NCBI Ref Seq NM_002353的nt 339-1157)3，该分子由哺乳动物细胞系(L和293)或含有且表达相应构建物的杆状病毒产生。采用如下的引物，通过PCR扩增TROP2基因来制备该构建物：
hT2-信号肽_EcoRI-正向引物
5′CCCCGAATTCATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGC(SEQ ID NO：1)
hT2-6his-XbaI-反向引物
5′CCCCCTCTAGATCACGTGATGGTGATGGTGATGCCCCCCGGTGAG
GCGCTTCATGGAG                       (SEQ ID NO：2)
将6组氨酸标签加到C末端以便于该蛋白质的纯化。将PCR带(band)亚克隆到载体pBJI-neo中以在哺乳动物细胞内表达，或亚克隆到pFastBac HTA以在杆状病毒中表达(“Bac to Bac”杆状病毒表达系统，美国英杰公司(Invitrogen)。然后，通过在Ni-NTA琼脂糖(恰根(Qiagen)，荷兰)上进行亲和层析，从培养基中纯化以此方式产生的重组Trop-2蛋白。按照本领域中已知的方法14，将获自免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0或NS-0细胞融合。筛选对用TROP2转染的L细胞有特异性反应性、而对用空载体转染的L细胞没有反应性的杂交瘤细胞。这些测试中整合了对重组Trop-2蛋白或其诸部分的ELISA检测。具体而言，产生了各种表达载体以供哺乳动物细胞和杆状病毒表达Trop-2胞外区域的单独的球状区域(nt 339-773)或单独的茎状区域(nt 774-1157)，如此做的目的在于筛选出特异性靶向各区域的单克隆抗体(图4)。采用如下的引物，通过PCR扩增TROP2基因来制备该构建物：
hT2-gl_EcoRI-正向引物
5’CCCCGAATTCTAAATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGC(SEQ ID NO：3)
hT2-gl_HindIII-反向引物
5’GCGAAGCTTTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCAGCGTAGGCTCA
GGTC(SEQ ID NO：4)
对于球状区域；
hT2-st_EcoRI-正向引物
5′CCCCGAATTCTAAATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGCGCCGCCACC
GCTGCGGCTGCCGCTGCTGCTGCTGGTGCTGGCGGCGGATGAGCT
GGTGCGCACC(SEQ ID NO：5)
hT2-st_HindIII-反向引物
5’GCGAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGCCCCCCGGTGAGGCG
CTTCATGGAG(SEQ ID NO：6)
对于茎状区域。
在两种情况下，均在C末端加上6组氨酸标签以便于重组蛋白的纯化。
随后，将片段克隆到pYFP-ΔFP载体中以在哺乳动物细胞中表达或克隆到pFastBac HTA中以在杆状病毒中表达。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
使获自靶组织的抗体制品或裂解物在SDS-PAGE凝胶上跑胶，然后用考马斯蓝(美国英杰公司)染色。对于蛋白质印迹分析，将胶电转移到硝酸纤维素膜上。将膜与一抗和二抗一起孵育以通过化学发光检测靶分子。
细胞转染
采用编码Trop2的构建物的转染如参考文献15中所述进行或通过脂质体转染进行(美国吉必可公司(Gibco-BRL))。
共聚焦显微镜法
用偶联于Alexafluor-48的抗Trop-2单克隆抗体或用未偶联的同一抗体对样品染色，后者以偶联于Alexafluor-488的山羊抗小鼠抗血清显色。用4％多聚甲醛的PBS溶液在室温下固定30分钟后，在含10％血清和0.05％皂甙的PBS进行透化处理，然后在室温下将细胞与抗体共同孵育30分钟，随后(如必要)与山羊抗小鼠抗血清进行第二次共同孵育。然后清洗载玻片并封片以观察。
免疫组织化学
采用基本上如参考文献16中所描述的方法，对正常组织和肿瘤组织的切片进行免疫组织化学分析。
体内模型：无胸腺小鼠的异源移植
将用TROP2或对照空白载体转染的L或293细胞系，或者天然表达Trop-2或用Trop-2转染的人癌(乳腺、卵巢、结肠)细胞皮下注射入多组裸鼠中(10只动物/组)。对于共注射方案(预防性处理)，在注射当日，将200μg抗Trop-2或无关单克隆抗体腹膜内注射入小鼠。对于已在经注射动物中生长的已有肿瘤的处理，用800μg抗Trop-2或无关单克隆抗体处理裸鼠，当肿瘤体积达到约0.1cm3时开始该处理。如所示，在开始处理后的第7、15和22天给予其它3剂。在所有组中，基本如参考文献17中所示，每周两次测定肿瘤的生长。
抗Trop-2单克隆抗体可变区的测序
用Trizol(美国英杰公司)从生产本发明抗Trop-2单克隆抗体的杂交瘤中提取RNA。如参考文献18中所述，通过RT-PCR从总RNA中扩增免疫球蛋白基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(LH)。采用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))对扩增的片段进行测序。在AppliedBiosystems 3130xl遗传分析仪上分析反应产物。如参考文献19所描述，根据免疫遗传学信息系统(IMGT)鉴别VH和VL的FR和CDR区域。
对应于各抗Trop-2单克隆抗体的VH和VL的编码区(开放阅读框，ORF)和氨基酸序列如下所示：
4F6单克隆抗体的VH(杂交瘤细胞系N.PD 08019)
氨基酸序列(SEQ ID NO：8)
4F6单克隆抗体的VL(杂交瘤细胞系N.PD 08019)
Figure BPA00001417903800141
氨基酸序列(SEQ ID NO：10)
Figure BPA00001417903800142
2G10单克隆抗体的VH(杂交瘤细胞系N.PD 08020)
Figure BPA00001417903800151
氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
Figure BPA00001417903800152
2G10单克隆抗体的VL(杂交瘤细胞系N.PD 08020)
氨基酸序列(SEQ ID NO：14)
Figure BPA00001417903800162
2EF单克隆抗体的VH(杂交瘤细胞系N.PD 08021)
氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
2EF单克隆抗体的VL(杂交瘤细胞系N.PD 08021)
Figure BPA00001417903800181
氨基酸序列(SEQ ID NO：18)
Figure BPA00001417903800182
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Figure IPA00001417903400011
Figure IPA00001417903400021
Figure IPA00001417903400031
Figure IPA00001417903400041
Figure IPA00001417903400061

Claims (14)

1.一种包含至少两种分离的抗Trop-2单克隆抗体或由至少两种分离的抗Trop-2单克隆抗体组成的组合，所述分离的抗Trop-2单克隆抗体选自：由保藏号为PD 08019、PD 08020或PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述组合物包含由保藏号为PD08019、PD 08020和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体，或由保藏号为PD 08019、PD 08020或PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体组成。
3.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述组合物包含由保藏号为PD08019和PD 08020的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体，或由保藏号为PD08019和PD 08020的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体组成。
4.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述组合物包含由保藏号为PD08019和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体，或由保藏号为PD08019和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体组成。
5.如权利要求1所述的组合，其特征在于，所述组合物包含由保藏号为PD08020和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体，或由保藏号为PD08020和PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体组成。
6.由保藏号为PD 08019的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体。
7.由保藏号为PD 08020的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体。
8.由保藏号为PD 08021的杂交瘤细胞系产生的抗Trop-2单克隆抗体。
9.一种药物组合物，其包含如下组分或由如下组分组成：作为活性成分的、权利要求1-5中任一项所述的组合或权利要求6-8中任一项所述的抗Trop-2单克隆抗体；与所述活性成分组合的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的形式适于腹膜内、胸膜内、膀胱内、病损内给药或通过肝动脉给药。
11.权利要求1-5中任一项所述的组合、权利要求6-8中任一项所述的抗Trop-2单克隆抗体、或权利要求9-10中任一项所述的组合物在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。
12.权利要求1-5中任一项所述的组合、权利要求6-8中任一项所述的抗Trop-2单克隆抗体、或权利要求9-10中任一项所述的组合物在制备用于肿瘤转移灶预防或治疗的药物中的用途。
13.权利要求1-5中任一项所述的组合或权利要求6-8中任一项所述的抗Trop-2单克隆抗体在体外诊断肿瘤中的用途。
14.用于体外诊断肿瘤的试剂盒，其包含如下物质或由如下物质组成：权利要求1-5中任一项所述的组合、权利要求6-8中任一项所述的抗Trop-2单克隆抗体、或权利要求9-10中任一项所述的组合物。
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