CN102300874A - Tmem154多肽和多核苷酸及其作为产生药物和生物制品的药物靶标的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于基于免疫的治疗物和非基于免疫的治疗物的产生和用于疾病诊断的新颖靶标。更具体地，本发明提供了抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的治疗性抗体，和诊断性和治疗性应用，所述抗原在癌症中差异表达。本发明还涉及KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154蛋白和变体的胞外结构域，及其治疗性应用。

Description

TMEM154多肽和多核苷酸及其作为产生药物和生物制品的药物靶标的用途
发明领域
本发明涉及KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154相关的多肽和多核苷酸，所述多肽和多核苷酸在一些癌症和特定的血细胞中差异表达，并因此是用于治疗物和诊断物的开发的适宜的靶标，尤其是用于癌症治疗和免疫相关疾患的治疗的适宜的靶标。
发明背景
理想地将肿瘤抗原定位为生物标志物和药物靶标，并且它们在用作癌症的独立疗法或与常规疗法联合的主动和被动免疫治疗剂的新策略的开发中具有重要作用。肿瘤抗原可被分类为肿瘤特异性抗原(TSA)，其中抗原仅在肿瘤细胞中表达而不在正常组织中表达，或肿瘤相关抗原(TAA)，其中抗原在肿瘤细胞中过表达但仍在正常组织中以低水平存在。
TAA和TSA被确认作为被动(抗体)疗法和利用打破免疫耐受和刺激免疫系统的策略的主动免疫治疗的靶标。这些治疗方法所靶向的抗原表位存在于细胞表面，与非肿瘤细胞对比在肿瘤细胞中过表达，并且被阻止功能活性、抑制细胞增殖或诱导细胞死亡的抗体所靶向。
针对越来越多的肿瘤相关抗原，单克隆抗体已被试验或作为癌症的治疗正在使用。由人类恶性肿瘤所表达的新型肿瘤抗原的识别和分子鉴定是肿瘤免疫性中活跃的领域。已使用了一些方法以鉴定作为免疫治疗的靶标候选者的肿瘤相关抗原，包括基于基因组学和蛋白组学的高通量生物信息学方法。新型TAA或TSA的识别扩展了用于免疫识别的肿瘤抗原靶标的范围并为被动免疫治疗的治疗剂的开发提供了新型靶分子，所述治疗剂包括单克隆抗体，无论是未修饰的还是武装化的。这样的新型抗原可能还指出了通向用于主动免疫治疗或过继免疫治疗的更有效的治疗疫苗的途径。
癌症疫苗接种包括肿瘤抗原的施用，并用来打破免疫耐受并诱导活性T细胞对肿瘤的反应。疫苗疗法包括裸DNA、肽、重组蛋白的使用，和全细胞疗法，其中患者自身的肿瘤细胞用作疫苗的来源。鉴于特异性肿瘤抗原的鉴定，更多地通过树突细胞疗法来进行疫苗接种，由此树突细胞用相关的蛋白或肽加载，或用载体DNA或RNA转染。
用于癌症的治疗的抗TAA抗体的主要应用是利用裸抗体的治疗、利用轭合药物的抗体的治疗和利用细胞免疫的融合治疗。抗体自其发现就被设想为将向患病部位特异递送毒性剂并使非靶标正常组织不受影响的“魔术弹”，所述毒性剂比如药物、毒素、酶和放射性同位素。事实上，抗体，并且尤其是抗体片段，能够作为诸如放射性同位素、药物和毒素的细胞毒性物质的载体发挥作用。利用这样的免疫轭合物的免疫治疗比利用裸抗体更有效。
与血液系统恶性肿瘤治疗中的裸抗体(比如Rituxan和Campath)和轭合抗体(比如Bexxar和Zevalin)的巨大成功相反，在实体瘤的免疫治疗中仅取得了有限的成功。对实体瘤的免疫治疗的成功应用中的主要局限之一是完整免疫球蛋白的大分子尺寸，其导致了延长的血清半衰期但不良的肿瘤渗透和吸收。事实上，被施用的抗体的仅非常少的量(低达0.01％)到达肿瘤。除了它们的尺寸外，抗体在到达它们的靶标抗原之前遭遇在实体瘤的细胞表面上表达的其它障碍物。障碍中的一些包括大型肿瘤中的不良血流量、血管内皮细胞的通透性、肿瘤基质的增高的间质液压和异种抗原表达。
随着抗体工程的到来，已生成了表现出提高的肿瘤渗透的小分子量的抗体片段。这样的抗体片段常与特异的细胞毒性分子轭合并被设计为选择性地将它们递送至癌细胞。即使利用免疫轭合的抗体片段，实体瘤仍是治疗的艰巨挑战。
新一批的优化策略包括调节实体瘤带来的障碍物的生物改性剂的使用。从而，与抗体或其轭合抗体片段的组合，多种剂通过调节基质细胞和细胞外基质成分，上调靶标抗原的表达和提高治疗剂的渗透和存留正在被用以提高肿瘤血流量、增强血管渗透性、降低肿瘤间质液压。
利用抗体的免疫治疗代表与诸如化学疗法的标准模式相结合，以及与不同生物制剂组合而获得协同活性的激动人心的可能性。事实上，当用于与包括其它抗体的其它治疗剂组合使用时，未轭合的单克隆抗体是更有效的。
被动肿瘤免疫治疗利用了免疫系统灵敏的特异性和分解能力以靶向肿瘤特异性抗原并在对正常组织最小伤害下治疗恶性疾病。已使用了一些方法以识别作为免疫治疗的靶标候选者的肿瘤相关抗原。新型肿瘤特异性抗原的识别扩展了可用于免疫识别的肿瘤抗原靶标范围并为用于被动免疫治疗的治疗剂的开发提供了新型分子，该新型分子包括单克隆抗体，无论是未被修饰还是武装化的。这样的新型抗原可能还指出了通向用于主动免疫治疗或过继免疫治疗的更有效的治疗疫苗的途径。
虽然在癌症生物学和癌症治疗的认识上以及在免疫反应涉及的分子的更好的认识上有最新进展，但癌症治疗和免疫相关疾患的治疗的成功率是低的。因此，仍存在对能够成功治疗癌症和免疫相关疾患的新型治疗的未满足需求。
发明简述
在至少一些实施方案中，本发明提供了新颖的氨基酸和核酸序列，它们分别是已知的或“WT”(野生型)KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的相应氨基酸序列和核酸序列的变体。根据本发明的至少一些实施方案，KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154蛋白由一些癌症和特定的血细胞差异表达，且因此是用于癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的适宜靶标。如以下所更详细地描述的，术语“多肽”和“蛋白”用来描述与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154相关的特定的变体、已知的蛋白自身或衍生的氨基酸序列，或以上任何一种的片段或部分。
在至少一些实施方案中，本发明提供了含有KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154蛋白中的至少一种或本文所公开的变体或编码其的核酸序列的新颖治疗和诊断组合物。
在至少一些实施方案中，本发明提供了KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154蛋白的不连续部分、其变体，和编码其的核酸序列或其片段。
在至少一些实施方案中，本发明提供了TMEM154蛋白的分泌性形式，尤其是TMEM 154蛋白的胞外域(ECD)和编码其的核酸序列或其片段或部分或同源物或轭合物，以及含有它们的组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，与TMEM154蛋白的胞外域对应的多肽被用作治疗剂用于癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发。
在至少一些实施方案中，本发明提供了与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A蛋白和/或新型变体的胞外域对应的多肽，和编码其的核酸序列或其片段或同源物。
在至少一些实施方案中，本发明提供了治疗性和诊断性抗体、抗体片段和含有它们的组合物，以及利用所述抗体和抗体片段的治疗和诊断性方法，所述抗体和抗体片段与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154蛋白中的任何一种、或其变体、或其可溶性部分或胞外部分，尤其是胞外域，或其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分特异性结合。
根据本发明的至少一些实施方案。KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白和/或变体多肽和核酸序列用作药物开发的新颖靶标，所述药物与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白和/或新型变体特异性结合，和/或所述药物激动或拮抗其它部分与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白和/或新型变体的结合。
因此，在至少一些实施方案中，本发明提供了KRTCAP3蛋白KRTCAP3(SEQ ID NO：7)(角质形成细胞相关蛋白3)的新颖变体，其不连续部分、和编码其的多核苷酸，和KRTCAP3多肽和其不连续部分，和编码其的多核苷酸，它们可用作诊断性标志物和/或用作癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的靶标，和用作激动或拮抗其它部分与KRTCAP3蛋白的结合和/或激动或拮抗至少一种KRTCAP3相关的生物活性的治疗剂。
根据一些实施方案，本发明提供了分离的多肽，所述分离的多肽选自W93943_P13(SEQ ID NO：10)、W93943_P14(SEQ ID NO：11)、W93943_P18(SEQ ID NO：13)、或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据本发明的一些实施方案，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包括KRTCAP3新颖变体的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分，或其同源物或其片段，和提供了编码所述独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分的核酸序列，及其片段和其轭合物和其作为治疗物和/或用于诊断的用途。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的多肽，所述多肽包括选自由以下任何一种组成的组的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的氨基酸序列片段：对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸残基72-97的SEQ ID NO：146；对应于W93943_P14(SEQ IDNO：11)的氨基酸残基206-221的SEQ ID NO：147，对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸残基206-231的SEQ ID NO：148，或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。根据至少一些实施方案，本发明提供了具有SEQ ID NO：146-148中任何一项所列的氨基酸序列的分离的多肽。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于KRTCAP3蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，所述KRTCAP3蛋白的不连续部分包括对应于以下的胞外域的不同部分：含于W93943_P2(SEQ ID NO：7)、W93943_P14(SEQ ID NO：11)、W93943_P17(SEQ ID NO：12)和W93943_P18(SEQ ID NO：13)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基42-62；或含于W93943_P2(SEQ ID NO：7)、W93943_P14(SEQ ID NO：11)和W93943_P17(SEQ ID NO：12)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基115-162；或含于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基1-20，对应于SEQ ID NO：49中所描绘的氨基酸序列；或含于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基77-91，对应于SEQ ID NO：50中所描绘的氨基酸序列；或含于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基141-188，对应于SEQ ID NO：48中所描绘的氨基酸序列；或含于W93943_P18(SEQ IDNO：13)的序列中的KRTCAP3蛋白序列的残基115-171，对应于SEQ IDNO：51中所描绘的氨基酸序列；或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了选自所述分离的多肽中任何一种、用于兔免疫接种和特异性抗体产生、具有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116中任何一项所列的氨基酸序列的KRTCAP3氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码前述的KRTCAP3蛋白胞外域多肽或其片段或其同源物中的任何一种。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码包含SEQ ID NO：10、11、13、47-51、146-148中所列的氨基酸序列中的任何一个的多肽、或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体的分离的多核苷酸。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含具有W93943_T5(SEQ IDNO：3)、W93943_T8(SEQ ID NO：4)、W93943_T14(SEQ ID NO：6)中任何一个所列的核酸序列的核酸或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或与其同源的序列的分离的多核苷酸。根据至少一些实施方案，前述的片段选自由SEQ ID NO：2、9、94、193-195中任一个组成的组，或其片段，或与其同源的序列。根据另一个实施方案，分离的多核苷酸与SEQ ID NO：2、3、4、6、9、94、193-195中任一个所列的核酸序列至少80、85、90、95、96、97、98或99％同源。
在至少一些实施方案中，本发明提供了假想蛋白LOC441168(SEQ IDNO：15)(SwissProt登记号NP_001010919，FAM26F)的蛋白和不连续部分或编码其的多核苷酸，其可用作癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的诊断标志物和/或靶标，和用作激动或拮抗其它部分与FAM26F蛋白的结合的治疗剂和/或激动或拮抗至少一种FAM26F相关生物活性的治疗剂。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于FAM26F蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，所述FAM26F蛋白的不连续部分包括对应于以下的胞外域的不同部分：T82906_P4(SEQ ID NO：18)的序列的残基40-48、对应于SEQ ID NO：52中所描绘的氨基酸序列；或T82906_P4(SEQ ID NO：18)的序列的残基125-175、对应于SEQ ID NO：53中所描绘的氨基酸序列；或T82906_P3(SEQ ID NO：16)的序列的残基27-143、对应于SEQ ID NO：127中所描绘的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了选自所述分离的多肽中的任何一种、用于兔免疫接种和特异性抗体产生、具有SEQ ID NO：117、118中任何一个所列的氨基酸序列的FAM26A氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
在至少一些实施方案中，本发明提供了MGC52498蛋白和已知的假想蛋白MGC52498(SEQ ID NO：132)(SwissProt登记号NP_872427；LOC348378)的新颖变体，其不连续部分，和编码其的多核苷酸，及其作为癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的诊断标志物和/或靶标的用途，和作为激动或拮抗其它部分与MGC52498蛋白的结合和/或激动或拮抗至少一种MGC52498相关生物活性的治疗剂的用途。
根据一些实施方案，本发明提供了分离的多肽，所述分离的多肽选自AA213820_P6(SEQ ID NO：19)，或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据本发明的一些实施方案，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含MGC52498新颖变体、或其同源物或其片段的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分，和编码所述独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分的核酸序列和其片段，和轭合物和其作为治疗物和/或用于诊断的用途。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的独特的头部分的氨基酸序列，其对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的氨基酸残基1-64，如SEQ ID NO：25中所列；或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了具有如SEQ ID NO：25中所列的氨基酸序列的分离的多肽。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于MGC52498蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，所述MGC52498蛋白的不连续部分包括对应于以下的胞外域的不同部分：序列AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的残基1-55，对应于SEQ ID NO：60中所描绘的氨基酸序列；或序列AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的残基91-190，对应于SEQ ID NO：61中所描绘的氨基酸序列；或序列AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的残基1-71，对应于SEQ ID NO：62中所描绘的氨基酸序列；或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于MGC52498的不连续片段的氨基酸残基的序列的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：150-154、200组成的组，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码前述MGC52498蛋白胞外域多肽或其片段或其同源物的分离的核酸序列。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码包含SEQ ID NO：19、25、60、61、62、150-154、200中所列的氨基酸序列中的任何一个的多肽、或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体的分离的多核苷酸
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含SEQ ID NO：20所列的核酸、或与其至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或与其同源的序列的分离的多核苷酸。根据至少一些实施方案，本发明还提供了包含选自由SEQ ID NO：27、109、201中任何一个组成的组的核酸序列、或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或与其同源的序列的分离的多核苷酸。
在至少一些实施方案中，本发明提供了FAM70A蛋白和已知的假想蛋白FAM70A(SEQ ID NO：29)(SwissProt登记号NP_060408)的新颖变体，其不连续部分，和编码其的多核苷酸，和编码其的多核苷酸，其可用作用于癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的诊断标志物和/或靶标，和激动或拮抗其它部分与FAM70A蛋白的结合和/或激动或拮抗至少一种FAM70A相关生物活性的治疗剂。
根据一些实施方案本发明提供了分离的多肽，所述分离的多肽选自F10649_P7(SEQ ID NO：35)、F10649_P8(SEQ ID NO：36)中的任何一个，或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据本发明的一些实施方案，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含FAM70A变体、或其同源物或其片段的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分，和编码所述独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分以及其片段的核酸序列，和轭合物和其作为治疗物和/或用于诊断的用途。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的多肽，所述多肽包含以下的独特的桥接部分、边缘部分或头部分中的任何一种的氨基酸序列：对应于如SEQ ID NO：156中所列的F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸残基1-141；或对应于如SEQ ID NO：159所列的F10649_P8(SEQ ID NO：36)的氨基酸残基1-144；或对应于SEQ ID NO：155、157、158、160、196、199中任何一个所列的氨基酸序列；或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了具有SEQ ID NO：155-160、196、199中任何一个所列的氨基酸序列的分离的多肽。
根据至少一些实施方案，本发明提供了选自所述分离的多肽中的任何一种、用于兔免疫接种和特异性抗体产生、具有SEQ ID NO：121、186所列的氨基酸序列的FAM70A氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于FAM70A蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，所述FAM70A蛋白的不连续部分包括以下胞外域的不同部分：对应于序列F10649_P4(SEQ ID NO：30)、序列F10649_P5(SEQ ID NO：33)或序列F10649_P7(SEQ ID NO：35)的残基51-59，对应于SEQ ID NO：54中所描绘的氨基酸序列；或序列F10649_P4(SEQ ID NO：30)的残基110-225，对应于SEQ ID NO：55中所描绘的氨基酸序列；或序列F10649_P5(SEQ ID NO：33)的残基110-201，对应于SEQID NO：56中所描绘的氨基酸序列；或序列F10649_P7(SEQ ID NO：35)的残基110-241，对应于SEQ ID NO：58中所描绘的氨基酸序列；或序列F10649_P8(SEQ ID NO：36)的残基51-65，对应于SEQ ID NO：59中所列的氨基酸序列；或序列F10649_P8(SEQ ID NO：36)的残基223-328，或序列F10649_P10(SEQ ID NO：32)的残基80-185，对应于SEQ ID NO：57中所描绘的氨基酸序列；或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码前述的FAM70A蛋白胞外域多肽的任何一个或其片段或其同源物的分离的核酸序列。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：35、36、54-58、121、155-160、186、196、199中所列的氨基酸序列中的任何一个的多肽、与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含具有F10649_T4(SEQ ID NO：24)、F10649_T6(SEQ IDNO：26)中任何一个所列的氨基酸序列的核酸、或其片段或与其至少80、85、90、95、96、97、98或99％同源的序列。根据至少一些实施方案，前述的片段包含SEQ ID NO：103、197、198中任何一个所列的核酸中的任何一种，或其片段，或与其至少80、85、90、95、96、97、98或99％同源的序列。
在至少一些实施方案中，本发明提供了已知的假想蛋白LOC201799(SEQ ID NO：42)(SwissProt登记号NP_689893；TMEM154)的蛋白和不连续部分或编码其的多核苷酸，其可用作用于癌症治疗、免疫相关病症的治疗和药物开发的诊断标志物和/或靶标，和激动或拮抗其它部分与TMEM154蛋白的结合和/或激动或拮抗至少一种TMEM 154相关生物活性的治疗剂。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含TMEM154蛋白的可溶性胞外域(ECD)和其片段和轭合物的分离的多肽，和编码所述可溶性胞外域的核酸序列，以及其作为治疗剂的用途。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含对应于TMEM 154蛋白的不连续部分的氨基酸残基的序列的多肽，所述TMEM 154蛋白的不连续部分包括对应于以下的胞外域的不同部分：序列W38346_P3(SEQ ID NO：42)或序列W38346_P7(SEQ ID NO：46)的残基23-75，对应于SEQ ID NO：63中所描绘的氨基酸序列；或序列W38346_P4(SEQ ID NO：45)的残基20-105，对应于SEQ ID NO：64中所描绘的氨基酸序列；或W38346_P7(SEQ ID NO：46)的序列的残基122-144，对应于SEQ ID NO：162中所描绘的氨基酸；或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了选自分离的多肽中的任何一种、用于兔免疫接种和特异性抗体产生、具有SEQ ID NO：191、192中任何一个所列的氨基酸序列的TMEM154氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码前述TMEM154蛋白胞外域多肽或其片段或其同源物的分离的核酸序列。
根据至少一些实施方案，本发明提供了编码含有SEQ ID NO：63、64、161、162所列的氨基酸序列中的任何一个的多肽、或与其具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的其片段或变体的分离的多核苷酸。
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含SEQ ID NO：23、106中任何一项所列的核酸或其片段或与其至少80、85、90、95、96、97、98或99％同源的序列的分离的多核苷酸。根据另一个实施方案，分离的多核苷酸与SEQ ID NO：23、106中任何一个所列的核酸序列至少80、85、90、95、96、97、98或99％同源。
根据至少一些实施方案，本发明提供了对应于可溶性TMEM 154蛋白和/或TMEM 154蛋白胞外域中的任何一种的前述的多肽中的任何一种，其中所述多肽阻碍或抑制TMEM 154蛋白与相应的功能配体的相互作用。
根据至少一些实施方案，本发明提供了对应于可溶性TMEM 154蛋白和/或TMEM 154蛋白胞外域的前述多肽中的任何一种，其中所述多肽取代或增大了TMEM 154蛋白与对应的功能配体的相互作用。
根据本发明的一些实施方案提供了融合蛋白，或编码其的核酸，所述融合蛋白包含分离的或纯化的TMEM154蛋白和/或TMEM 154蛋白胞外域或其片段或其变体或其同源物。根据本发明的一些实施方案，融合蛋白，或编码其的核酸，任选地可直接或间接分别连接于非TMEM154蛋白或核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，非TMEM154蛋白或核酸序列是可溶性免疫球蛋白区域或片段的至少一部分。
在另一个实施方案中本发明包括前述融合蛋白的任何一种，其中聚烃基氧化物部分比如聚乙二醇被连接至多肽。
在另一个实施方案中本发明包括前述融合蛋白中的任何一种，其中免疫球蛋白重链恒定区是Fc片段。
在另一个实施方案中，本发明包括前述融合蛋白中的任何一种，其中免疫球蛋白重链恒定区是选自由以下组成的组的同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA和IgD。
在另一个实施方案中，本发明包括前述融合蛋白中的任何一种，其中多肽与VASP域融合。
在另一个实施方案中，本发明包括前述融合蛋白中的任何一种，其中融合蛋白调节淋巴细胞激活。
在另一个实施方案中本发明包括前述多肽中的任何一种，被连接于可检测的部分或治疗部分。
根据本发明的一些实施方案，提供了包含前述的核酸序列的任何一种的诸如质粒和重组病毒载体的载体，和包含载体的宿主细胞，所述载体表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白的不连续部分的任何一种、其分泌性形式或可溶性形式和/或ECD或对应于KRTCAP3蛋白、FAM26F蛋白、MGC52498蛋白、FAM70A蛋白、TMEM154蛋白的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分的序列，或其同源物或含有前述的任何一种的轭合物。
根据其它的实施方案，提供了用于生产KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM 154多肽中的任何一种的前述的载体和宿主细胞任何一种的用途。
在另一个实施方案中，本发明包括生产KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154胞外域多肽中的任何一种、对应于KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154多肽的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分的序列、或其片段或同源物或轭合物的方法，所述方法包括培养前述的宿主细胞，其中所述细胞表达由DNA片段或核酸所编码的多肽，和回收所述多肽。
根据本发明的另一个实施方案，KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154多肽，或其片段或其同源物，可利用本领域已知的生物化学合成方法中的任何一种来生产，比如利用标准固相技术。
在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含前述的多核苷酸序列中的任何一种且还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含前述的载体或宿主细胞且还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含前述的多肽中的任何一种和/或前述的融合蛋白中的任何一种且还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
根据本发明的一些实施方案，提供了化合物及其使用，所述化合物包括TMEM 154胞外域或其片段或变体，以及含有它们的药物组合物，其适宜于癌症和/或免疫相关病症的治疗或预防。
根据本发明的一些实施方案，提供了用于治疗或预防癌症和/或免疫相关病症的方法，所述方法包括向需要其的受治疗者施用前述的药物组合物，所述药物组合物包含以下中的任何一种：具有TMEM 154多肽的胞外域、或其片段或其变体或其同源物的分子；或多肽，所述多肽包含与SEQID NO：63、64中所列的氨基酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸残基的序列，或包含具有TMEM154多肽的胞外域的多肽的融合蛋白。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗或预防癌症的前述方法中的任何一种，其中所述癌症选自由以下组成的组：实体瘤，肉瘤，血液系统恶性肿瘤，包括但不限于乳腺癌(如乳癌)，子宫颈癌，卵巢癌(ovary cancer/ovary carcinoma)，子宫内膜癌，黑素瘤，膀胱癌(bladdercancer/bladder carcinoma)，肺癌(如腺癌和非小细胞肺癌)，胰腺癌(例如诸如外分泌性胰腺癌的胰腺癌(pancreatic carcinoma))，结肠癌(例如诸如结肠腺癌和结肠腺瘤的结直肠癌)，前列腺癌，包括晚期疾病，淋巴系统的造血肿瘤(如白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，抗CD20(即利妥昔单抗(Rituximab))抗性淋巴瘤)，髓细胞白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病)，甲状腺癌，甲状腺滤泡癌，骨髓增生异常综合征(MDS)，间叶源性肿瘤(如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤肿瘤)，黑素瘤，葡萄膜黑素瘤，畸胎瘤，神经母细胞瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，皮肤良性肿瘤(如角化棘皮瘤)，肾肿瘤，间变性大细胞淋巴瘤，食管鳞状细胞癌，肝细胞癌，滤泡性树突细胞癌，肠癌，肌肉浸润性癌，精囊肿瘤，表皮癌，脾癌，膀胱癌，头颈部癌，胃癌，肝癌，骨癌，脑癌，视网膜癌，胆道癌，小肠癌，唾液腺癌，子宫癌，睾丸癌，结缔组织癌，前列腺肥大，骨髓发育不良，沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症，鼻咽癌，神经内分泌癌，骨髓增生异常综合征，间皮瘤，血管肉瘤，卡波西氏肉瘤，类癌瘤，食管胃癌，输卵管癌，腹膜癌，乳头状浆液性苗勒氏癌(papillary serous mullerian cancer)，恶性腹水，胃肠道间质瘤(GIST)，以及诸如Li-Fraumeni综合征和Von Hippel-Lindau综合征(VHL)的遗传性癌症综合征，并且其中所述癌症为非转移性的、浸润性的或转移性的。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗或预防癌症的前述方法中的任何一种，所述方法包括向需要其的受治疗者施用前述的药物组合物，所述药物组合物包含以下的任何一种：具有TMEM154胞外域多肽、或其片段或变体或同源物或轭合物的可溶性分子；或多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：63、64中任何一个所列的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸残基的序列，或融合蛋白，或编码其的核酸序列，或含有所述核酸序列的表达载体，或包含前述表达载体的宿主细胞，其中所述癌症选自淋巴瘤、尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌，和/或胰腺癌。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗或预防免疫相关病症、疾病或疾患的前述方法中的任何一种，其中所述免疫相关病症、疾病或疾患选自由以下组成的组但不限于：多发性硬化症；银屑病；类风湿性关节炎；银屑病性关节炎，系统性红斑狼疮，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病；良性淋巴细胞血管炎，血小板减少性紫癜，特发性血小板减少症，特发性自身免疫性溶血性贫血，单纯红细胞再生障碍，斯耶格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)，风湿性疾病，结缔组织病，炎性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿性关节炎，尿酸性关节炎，肌风湿病，慢性多关节炎，冷凝球蛋白血症性血管炎，抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征(Guillian-Barre syndrome)，慢性免疫多发性神经病，自体免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森氏病(Addison′sdisease)，膜性肾小球性肾病，古德帕斯彻氏病(Goodpasture′s disease)，自身免疫性胃炎，恶性贫血，寻常性天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多发性肌炎，纤维肌炎，肌硬结，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，伊凡斯氏综合征(Evans syndrome)，异位性皮炎，银屑病，关节病性银屑病，格雷夫斯氏病(Graves′disease)，格雷夫斯氏眼病(Graves′ophthalmopathy)，硬皮病，系统性硬皮症，哮喘，变态反应症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原疾病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)，显微镜下型多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克氏病(Devic′s disease)，儿童自身免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自身免疫性血细胞减少，预防自身免疫性抗因子VIII抗体在获得性血友病A中的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵硬人综合征(Stiff Person Syndrome)，龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，血管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，和炎性皮肤疾患，选自由以下组成的组：银屑病，异位性皮炎，湿疹，红斑，荨麻疹，痤疮，正常补体型荨麻疹血管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，黑奇特氏综合征(Bechet′s Syndrome)，PAPA综合征(PAPA Syndrome)，布劳氏综合征(Blau′s Syndrome)，痛风，成人和儿童斯蒂尔病(adult andjuvenile Still′s disease)，冷吡啉病(cryropyrinopathy)，穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷引起自身炎症性综合征(familialcold-induced auto-inflammatory syndrome)，新生儿发病多系统炎症性疾病，家族性地中海热，儿童慢性神经病，皮肤和关节综合征，全身型幼年特发性关节炎，高免疫球蛋白D综合征，Schnitzler氏综合征，和肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(TRAPS)，移植排斥反应相关免疫系统疾病，比如器官移植，异基因干细胞移植，自体干细胞移植，骨髓移植的急性和慢性排斥，移植物抗宿主病，炎性肠病，古德帕斯彻综合征(Good pasture′ssyndrome)，恶性贫血，自身免疫性萎缩性胃炎，溃疡性结肠炎，混合性结缔组织病，结节性全身动脉炎，进行性全身性硬皮病，消化性溃疡，溃疡，慢性支气管炎，急性肺损伤，肺部炎症，气道高反应性，败血性休克，炎症性皮肤病，肌硬结、软骨钙质沉着病、甲状腺炎、变应性水肿和肉芽肿。
根据本发明的另外的实施方案，提供了与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白中的任何一种特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体和抗体片段和含有这些的轭合物，任选地和优选地通过与选自由SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、29-33、35、36、42-46、127、132-135中任何一个组成的组的序列、或其片段、或其变体、或其同源物特异性结合，或通过与选自SEQ ID NO：25、146-162、196、199、200中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分、或其片段、或其变体、或其同源物、或其表位特异性结合，或通过与选自SEQ IDNO：47-64的分泌性形式和/或其ECD或其片段、或其变体、或其同源物特异性结合，或通过与选自SEQ ID NO：115-118、121、186、191、192中的任何一个的肽特异性结合。这些抗体作为治疗物和/或诊断剂是潜在有用的(在体外和体内诊断方法中)。
根据本发明的至少一些实施方案，这些抗体对于生成和选择对其特异的抗独特型抗体是有用的，所述抗独特型抗体也可能用作治疗物和/或诊断剂(在体外和体内诊断方法中)。
根据本发明的至少一些实施方案，抗体和片段调节由KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽引起的活性，和/或是免疫激活或免疫抑制的，比如通过ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或CDC(补体依赖性细胞毒性)活性靶向细胞的抗体或片段。
在另一个实施方案中，本发明包括前述抗体或其片段的任何一种，其中所述抗体阻碍或抑制KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽中的任何一种与促进相反的活性或作用的相应的对应部分或细胞组分或组织结构相互作用。
在另一个实施方案中，本发明包括前述的抗体或片段中的任何一种，其中所述抗体替代或增大了KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽中的任何一种与促进相反功能或活性的相应的对应部分或细胞组分或组织结构相互作用。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了包含前述的抗体或抗体片段中的任何一种的治疗或诊断有效形式的药物组合物和诊断组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了包含前述的抗体或抗体片段中的任何一种的治疗有效形式并还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段中的任何一种，或对前述中的任何一种特异的抗独特型抗体，或包含它们的药物组合物，用于治疗或预防KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽中的任何一种，或其分泌性形式或可溶性形式或其ECD和/或其片段或其变体或其同源物在其中差异表达的病症，包括癌症和免疫相关病症。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗癌症的对选自由SEQ ID NO：7、8、10-13、47-51、146-148、115、116中的任何一个组成的组的任何KRTCAP3多肽，和/或其片段或其变体或其同源物特异的前述治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段中的任何一种，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗卵巢癌、肺癌、乳腺癌和/或结肠癌的对任何KRTCAP3多肽特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗癌症和/或免疫相关病症或疾患的对选自由SEQ ID NO：15-18、52、53、127、149、117、118中任何一个组成的组的FAM26F蛋白，和/或其片段或变体或同源物特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段中的任何一种，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤，和/或免疫相关病症或疾患的对FAM26F蛋白中的任何一种特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段中的任何一种，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗癌症和/或免疫相关病症或疾患的对选自由SEQ ID NO：19、25、60-62、132-135、150-154、200中任何一个组成的组的MGC52498蛋白中的任何一种、和/或其片段或其变体或其同源物特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病，尤其是T细胞白血病、和/或肺癌、和/或免疫相关病症或疾患的对MGC52498蛋白中的任何一种特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗癌症和/或免疫相关病症或疾患的对选自由SEQ ID NO：29-33、35、36、54-59、155-160、121、186、196、199中任何一个组成的组的FAM70A蛋白中的任何一种、和/或其片段或其变体或其同源物特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和/或乳腺癌，和/或免疫相关病症或疾患的对FAM70A蛋白中的任何一种特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段、或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗癌症和/或免疫相关病症或疾患的对选自由SEQ ID NO：42-46、63、64、161、162、191、192中任何一个组成的组的TMEM154蛋白中的任何一种，或其片段或其变体或其同源物特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和/或胰腺癌，和/或免疫相关病症或疾患，尤其是SLE(系统性红斑狼疮)的对于TMEM 154蛋白中的任何一种特异的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物。
根据又一些其它的实施方案，提供了前述的特异性抗体的任何一种和抗体片段，和其轭合物，和含有它们的药物组合物在调节(增强或抑制)免疫中的用途。
根据又一些其它的实施方案，提供了对以下多肽特异性的抗体和抗体片段：包含KRTCAP3蛋白的不连续部分的多肽，所述不连续部分包括对应于以下的胞外结构域的不同部分：W93943_P2(SEQ ID NO：7)、W93943_P14(SEQ ID NO：11)、W93943_P17(SEQ ID NO：12)、和W93943_P18(SEQ ID NO：13)的序列中所含的KRTCAP3蛋白序列的残基42-62，或W93943_P2(SEQ ID NO：7)、W93943_P14(SEQ ID NO：11)、和W93943_P17(SEQ ID NO：12)的序列中所含的KRTCAP3蛋白序列的残基115-162，或W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中所含的对应于SEQ ID NO：49中所描绘的氨基酸序列的KRTCAP3蛋白序列的残基1-20，或W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中所含的对应于SEQ ID NO：50中所描绘的氨基酸序列的KRTCAP3蛋白序列的残基77-91；或W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列中所含的对应于SEQ ID NO：48中所描绘的氨基酸序列的KRTCAP3蛋白的残基141-188，或W93943_P18(SEQ ID NO：13)的序列中所含的对应于SEQ ID NO：51中所描绘的氨基酸序列的KRTCAP3蛋白序列的残基115-171；含有包含SEQ ID NO：146-147中所列的氨基酸序列中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的多肽；或其片段。
根据本发明的又一些其它的实施方案，提供了对以下多肽特异性的抗体和抗体片段：包含FAM26F蛋白的不连续部分的多肽，所述FAM26F蛋白的不连续部分包括对应于T82906_P4(SEQ ID NO：18)的序列的残基40-48，对应于SEQ ID NO：52中所描绘的氨基酸序列，或T82906_P4(SEQID NO：18)的序列的残基125-175，对应于SEQ ID NO：53中所描绘的氨基酸序列，或T82906_P3(SEQ ID NO：16)的序列的残基27-143，对应于SEQ ID NO：127中所描绘的氨基酸序列的胞外域的不同部分；或含有包含SEQ ID NO：49中所列的氨基酸序列中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的多肽；或其片段。
根据本发明的又一些其它的实施方案，提供了对以下多肽特异性的抗体和抗体片段：包含MGC52498蛋白的不连续部分的多肽，所述MGC52498蛋白的不连续部分包括对应于AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的序列的残基1-55，对应于SEQ ID NO：60中所描绘的氨基酸序列，或AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的序列的残基91-190，对应于SEQ ID NO：61中所描绘的氨基酸序列，或AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的序列的残基1-71，对应于SEQ ID NO：62中所描绘的氨基酸序列的胞外域的不同部分；或含有包含SEQ ID NO：25、150-154中所列的氨基酸序列中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的多肽；或其片段。
根据本发明的又一些其它的实施方案，提供了对以下多肽特异性的抗体和抗体片段：包含FAM70A蛋白的不连续部分的多肽，所述FAM70A蛋白的不连续部分包括对应于序列F10649_P4(SEQ ID NO：30)、F10649_P5(SEQ ID NO：33)或F10649_P7(SEQ ID NO：35)的残基51-59，对应于SEQ ID NO：54中所描绘的氨基酸序列，或序列F10649_P4(SEQ IDNO：30)的残基110-225，对应于SEQ ID NO：55中所描绘的氨基酸序列，或F10649_P5(SEQ ID NO：33)的序列的残基110-201，对应于SEQ ID NO：56中所描绘的氨基酸序列，或序列F10649_P7(SEQ ID NO：35)的残基110-241，对应于SEQ ID NO：58中所描绘的氨基酸序列，或序列F10649_P8(SEQ ID NO：36)的残基51-65，对应于SEQ ID NO：59中所描绘的氨基酸序列，或序列F10649_P8(SEQ ID NO：36)的残基223-328、或序列F10649_P10(SEQ ID NO：32)的残基80-185，对应于SEQ ID NO：57中所描绘的氨基酸序列的胞外域的不同部分；或含有包含SEQ ID NO：155-160中所列的氨基酸序列中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的多肽；或其片段。
根据本发明的又一些其它的实施方案，提供了对以下多肽特异性的抗体和抗体片段：包含TMEM154蛋白的不连续部分的多肽，所述TMEM154蛋白的不连续部分包括对应于序列W38346_P3(SEQ ID NO：42)或W38346_P7(SEQ ID NO：46)的残基23-75，对应于SEQ ID NO：63中所描绘的氨基酸序列，或序列W38346_P4(SEQ ID NO：45)的残基20-105，对应于SEQ ID NO：64中所描绘的氨基酸序列的胞外域的不同部分；或含有包含SEQ ID NO：161-162中所列的氨基酸序列中的任何一个的独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分中的任何一种的多肽；或其片段。
根据又一些另外的实施方案，提供了用于产生或选择对前述中的任何一种特异的抗独特型抗体的方法。
根据又一些另外的实施方案，提供了使用用于癌症和/或免疫相关病症的治疗或预防的前述的治疗有效的多克隆或单克隆抗体或片段，或抗独特型抗体，或含有它们的药物组合物的方法。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症，和/或免疫相关病症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的前述抗体或其片段或其变体或其轭合物或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症以及用于治疗免疫相关病症或疾患的前述的方法中的任何一种，所述方法利用前述的抗体或其片段或其变体或其轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症的方法，所述方法利用对KRTC AP3蛋白中的任何一种特异的前述的抗体或其片段或其变体或其轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物，其中所述癌症包括但不局限于，卵巢癌、肺癌、乳腺癌和/或结肠癌，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的。根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗或预防癌症的前述的方法中的任何一种，所述方法利用了对FAM26F蛋白中的任何一种特异的前述的抗体或其片段或其变体或其轭合物，或含有它们的药物组合物，其中所述癌症选自但不局限于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的，所述免疫相关病症或疾患包括但不局限于炎症疾病或自身免疫病、移植排斥病或移植物抗宿主病。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症和/或免疫相关病症或疾患的前述的方法中的任何一种，所述方法利用对MGC52498蛋白中的任何一种特异的前述的抗体或其片段或其轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物，其中所述癌症包括但不局限于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病，尤其是T细胞白血病、和/或肺癌。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症和/或免疫相关病症或疾患的前述的方法中的任何一种，所述方法利用对FAM70A蛋白中的任何一种特异的前述的抗体或其片段或其轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物，其中所述癌症包括但不局限于多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和/或乳腺癌。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于治疗，或预防癌症和/或免疫相关病症或疾患的前述的方法中的任何一种，所述方法利用对TMEM 154蛋白中的任何一种、或其分泌性形式或可溶性形式或其ECD和/或其部分或其变体特异性的前述的抗体或其片段或其轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物，其中所述癌症包括但不限于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤，抗CD20(即利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和/或胰腺癌，和/或免疫相关病症或疾患，尤其是SLE。
在另一个实施方案中，本发明包括诱导或增强免疫反应的方法，所述方法包括向需要其的患者施用前述的抗体或片段中的任何一种并检测所述免疫反应的诱导或增强。
在另一个实施方案中，本发明包括用于在患者中增强对抗原的二次免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的前述的抗体或片段中的任何一种。在另一个实施方案中，本发明包括前述的方法，其中所述抗原优选地为癌症抗原、病毒抗原或细菌抗原，且患者任选地接受利用抗癌症疫苗或病毒疫苗的治疗。
在另一个实施方案中，本发明包括对KRTCAP3蛋白、FAM26F蛋白、MGC52498蛋白、FAM70A蛋白或TMEM154蛋白中的任何一种、或引起表达所述蛋白的癌细胞凋亡或裂解的其片段或其变体或其同源物特异的抗体。
在另一个实施方案中，本发明包括前述抗体或片段中的任何一种，其中所述凋亡或裂解活性包括抗体的CDC或ADCC活性。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于在受治疗者中抑制表达KRTCAP3蛋白、FAM26F蛋白、MGC52498蛋白、FAM70A蛋白或TMEM154蛋白中的任何一种的细胞的生长的方法，其包括：向受治疗者施用相应的前述的抗体或其片段或其变体轭合物中的任何一种，或含有它们的药物组合物。
根据至少一些实施方案，本发明提供了前述的抗体或片段，其中所述抗体是嵌合的、人源化的、灵长类动物化的、或完全人抗体。
在另一个实施方案中，本发明包括前述的抗体或片段中的任何一种，其中所述抗原结合位点包括从大约3到7个连续的或非连续的氨基酸，更典型至少5个连续的或非连续的氨基酸。这些结合位点包括构象性表位和非构象性表位。
根据本发明的其它实施方案，提供了抗体片段和其轭合物，包括但不限于Fab、F(ab′)2、Fv或scFv片段。
还是本发明的一个实施方案的是直接地或间接地将主题抗体和片段连接至标记物和诸如可检测标记物的其它效应部分，或连接至效应部分。
在另一个实施方案中，本发明包括前述的抗体或片段中的任何一种，其中所述效应部分选自药物、酶(抗体导向的酶前体药物疗法(ADEPT))、毒素、放射性核素、荧光团、治疗剂或化学治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明包括前述的抗体或片段中的任何一种，其中所述可检测标记物是放射性同位素、金属螯合物、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了化合物，包括调节(激动或拮抗)KRTCAP3相关生物活性、FAM26F相关生物活性、MGC52498相关生物活性、FAM70A相关生物活性或TMEM 154相关生物活性中的至少一种的药物。这样的药物以示例的方式包括与选自SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、115-118、121、127、132-135、146-162、186、191-192、196、199、200中的多肽中的任何一种结合的小分子、适体、肽、抗体和片段，和靶向选自SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、193-195、197、198、201中任何一个的核酸序列或其片段或其变体的核酶或反义或siRNA。这些分子可直接结合或调节由KRTCAP3蛋白、FAM26F蛋白、MGC52498蛋白、FAM70A蛋白和TMEM154蛋白的任何一个或其DNA/RNA或部分或变体引起的活性，或可间接调节KRTCAP3相关生物活性、FAM26F相关生物活性、MGC52498相关生物活性、FAM70A相关生物活性或TMEM154相关生物活性中的至少一种或间接调节分子与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM 154中的任何一种、及其部分和片段的结合，比如调节KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154的任何一种与其对应的反受体或内源性配体的结合，并且可用于治疗或预防癌症、免疫相关病症，包括但不限于炎症疾病和自身免疫疾病、移植排斥病和移植物抗宿主病，和/或阻碍或增强由KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽介导的免疫共刺激。
根据本发明，用于癌症和/或免疫相关病症的治疗或预防的以下的任何一种：TMEM 154胞外域或其片段或其变体或其同源物或其轭合物，或含有它们的药物组合物，和/或结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的特定的抗体和片段，或含有它们的药物组合物，或靶向KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154多肽的化合物，包括诸如小分子、适体、肽的药物，以及靶向KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154核酸序列或其片段或其变体的核酶或反义或siRNA，任选地可与本领域已知的其它治疗方法一起用于联合疗法，所述其它治疗方法选自由放射疗法、抗体疗法、化学疗法、外科手术组成的组，或与其它生物制剂、常规药物、抗癌剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物、化学治疗剂一起用于联合疗法，或用于与靶向其它补体调节蛋白(CRP)的治疗剂的组合。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了用于疾病的诊断的前述的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154多肽中的任何一种，和/或多核苷酸，和/或抗体的用途，其中所述疾病选自癌症和/或免疫相关病症。
如本文所用的，术语“疾病的诊断”包括筛查疾病、诊断疾病、检测疾病的存在或严重度、疾病的预后、监测疾病进展和/或治疗效果和/或疾病、疾患或病症的复发、以及选择疾病的疗法和/或治疗，疾病给定疗法的优化、监测疾病治疗、和/或预测疗法对于特定患者或亚群的适合性或测定治疗产品(therapeutic product)在患者或亚群中的适当剂量给药。
在本发明的至少一些实施方案中，是用于癌症的诊断的前述的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154多肽中的任何一种，和/或多核苷酸，和/或抗体的用途。
在本发明的至少一些实施方案中，提供了前述的KRTCAP3多肽，和/或多核苷酸，和/或抗体中的任何一种用于癌症的诊断的用途，所述癌症选自但不限于卵巢癌、结肠癌、肺癌和/或乳腺癌。
在本发明的至少一些实施方案中，提供了前述的FAM26F多肽，和/或多核苷酸，和/或抗体中的任何一种用于癌症的诊断以及用于免疫相关病症的诊断的用途，所述癌症选自但不限于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
在本发明的至少一些实施方案中，提供了前述的MGC52498多肽，和/或多核苷酸，和/或抗体中的任何一种用于癌症的诊断以及用于免疫相关病症的诊断的用途，所述癌症选自但不限于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病，尤其是T细胞白血病，和/或肺癌。
在本发明的至少一些实施方案中，提供了前述的FAM70A多肽，和/或多核苷酸，和/或抗体中的任何一种用于癌症的诊断以及用于免疫相关病症的诊断的用途，所述癌症选自但不限于多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌，和/或乳腺癌。
在本发明的至少一些实施方案中，提供了前述的TMEM154多肽，和/或多核苷酸，和/或抗体中的任何一种用于癌症的诊断以及用于免疫相关病症的诊断的用途，所述癌症选自但不限于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌，和/或胰腺癌。
在至少一些实施方案中，本发明提供了用于诊断前述的疾病、疾患或病症的诊断方法，所述方法包括检测根据本发明的至少一些实施方案的多肽或多核苷酸。根据本发明的至少一些实施方案，多肽或多核苷酸的表达、水平、或表达或水平的相对变化预示了个体特定的疾病、疾患或病症的发病、严重程度或预后。检测可包括通过本领域任何已知的方式对根据本发明的至少一些实施方案的和如本文所描述的特定的多肽或多核苷酸的表达或水平的检测。
根据一个实施方案，检测多肽或多核苷酸的存在代表着疾病的存在和/或其严重度和/或其进展。根据另一个实施方案，多核苷酸或多肽的表达和/或水平与其在健康受试者或从健康受试者中获得的样品中的表达和/或水平对比的改变指示疾病的存在和/或其严重度和/或其进展。根据另一个实施方案，在较早阶段多核苷酸或多肽的表达和/或水平与其在所述受试者或从所述受试者中获得的样品中的表达和/或水平对比的改变指示疾病的进展。根据又一个实施方案，检测多核苷酸或多肽的存在和/或表达和/或水平中的相对改变对选择疾病的治疗和/或监测疾病的治疗是有用的。根据又一个实施方案，检测多核苷酸或多肽的存在和/或表达和/或水平中的相对改变对预测用于特定患者或亚群的治疗产品的适合性是有用的，或对测定治疗产品在患者或亚群中的适当的剂量给药是有用的。根据又一个实施方案，方法包括定量地和/或定性地测定或评估多肽和/或多核苷酸的表达，所述多肽和/或多核苷酸在指数样品中或在治疗起始前或在治疗过程期间取自受治疗者的样品中的表达的差异指示治疗的效果，或治疗的最佳功效。
因此，根据至少一些实施方案，本发明提供了用于诊断前述的疾病、疾患或病症中的任何一种的方法，所述方法包括在受治疗者中或在获自受治疗者的样品中检测选自由SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、193-195、197、198、201组成的组的任何核酸序列或其片段或变体或同源物。
在至少一些实施方案中，本发明提供了在受治疗者中用于前述的疾病、疾患或病症中的任何一种的诊断的方法，所述方法包括(a)从受治疗者中获得样品和(b)在样品中检测作为SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、193-195、197、198、201中的成员的至少一个多核苷酸和/或多肽，或其片段或变体或同源物。
在本发明的至少一些实施方案中，对全身进行方法。
在本发明的至少一些实施方案中，利用分离自对疾病、疾患或病症易感的或怀疑患有疾病、疾患或病症的受治疗者的样品进行方法。在本发明的至少一些实施方案中，样品是细胞或组织或体液样品。
在至少一些实施方案中，主题发明因此还涉及任选地在取自受治疗者(患者)的生物样品中用于诊断疾病的诊断方法和/或测定，所述生物样品任选地为体液或分泌物的一些类型，包括但不限于精液、血浆、血液，血清，尿液，前列腺液，精液(seminal fluid)、精液(semen)、皮肤，呼吸道，肠道和泌尿道的外分泌物、眼泪，脑脊液，痰，唾液，乳汁，腹腔液，胸膜液，囊液、支气管肺泡灌洗液、生殖系统灌洗液和/或机体或机体中系统的任何其它部分的灌洗液，和粪便样品或组织样品。该术语还任选地包括体内细胞培养成分的样品。在样品与抗体接触之前和/或进行任何其它诊断测定之前，可任选地利用稀释剂稀释所述样品。
在至少一些实施方案中，本发明提供了用于在受治疗者中诊断疾病的方法，所述方法包括在受试者中或在获自所述受试者的样品中检测选自由SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、127、132-135、146-162、196、199、200组成的组中的至少一种多肽或其同源物或片段。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了诊断方法，所述诊断方法包括根据本发明的至少一些实施方案的前述的抗体的任何一种的用途，以示例的方法为免疫组织化学测定、放射成像测定、体内成像、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、核磁共振成像(MRI)、超声、光学成像、计算机断层扫描、放射免疫测定(RIA)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、狭缝印迹、竞争性结合测定、荧光成像测定、蛋白质印迹、FACS及其类似的用途。根据至少一些实施方案，本发明包括诊断方法和/或测定，所述诊断方法和/或测定利用了与具有SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、127、132-135、146-162、115-118、121、186、191、192、196、199、200中的任何一个所列的氨基酸序列的任何一种多肽特异性结合的前述的抗体或片段中的任何一种，或其片段或同源物。
根据本发明的一些实施方案，提供了在生物样品中或在受治疗者中用于体外或体内检测选自由SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、127、132-135、146-162、115-118、121、186、191、192、196、199、200组成的组的至少一种多肽、或其片段或变体或同源物的存在的诊断方法和/或测定，所述诊断方法和/或测定包括将样品或受治疗者与对具有选自由SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、127、132-135、146-162、115-118、121、186、191、192、196、199、200组成的组的氨基酸序列的至少一种多肽、或其片段或变体或同源物、或其组合物具有特异性的抗体相接触，并在样品中或在受治疗者中检测前述的多肽中的任何一种与所述抗体的结合。
根据本发明的一些实施方案，提供了用于疾病的诊断的方法，所述方法包括在受治疗者中或在获自受治疗者的样品中检测KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154多肽中的至少一种的表达和/或水平。
根据本发明的至少一些实施方案，提供了诊断方法，所述诊断方法包括通过利用基于NAT的技术检测选自由SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、193-195、197、198、201组成的组的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154多核苷酸中的至少一种、或其片段或变体或同源物。
在本发明的至少一些实施方案中，基于NAT的测定选自由PCR、实时PCR、LCR、自持续合成反应、Qβ复制酶、循环探针反应、分支DNA、RFLP分析、DGGE/TGGE、单链构象多态性、双脱氧指纹法、微阵列、荧光原位杂交或比较基因组杂交组成的组。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含具有选自由SEQ ID NO：94、97、100、103、106、109、124、171组成的组的核酸序列的扩增子，或具有SEQ ID NO：193-195、197、199、201所列的核酸序列的区段、或其片段或多核苷酸同源物。
在另一个实施方案中，本发明涉及任何引物对，所述引物对包括能够扩增前述的扩增子或区段的一对分离的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及引物对，所述引物对包括具有选自由SEQ ID NO：92-93、95-96、98-99、101-102、104-105、107-108、122-123、169-170、163-168、172、173、176-181、187-188组成的组的序列的一对分离的寡核苷酸。
根据本发明的至少一些实施方案，检测前述的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154多核苷酸中的任何一种包括利用引物对，所述引物对包括能够与具有SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、171、193-195、197、199、201所列的核酸序列的多核苷酸的至少一部分、或其多核苷酸同源物特异性杂交的一对分离的寡核苷酸。
根据本发明的至少一些实施方案，利用能够与SEQ ID NO：1-6、9、14、20-24、26-28、38-41、94、97、100、103、106、109、124、125、131、171、193-195、197、199、201所列的核酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源的核酸序列的至少一部分杂交的寡核苷酸对进行检测。
根据本发明的至少一些实施方案，检测根据本发明的至少一些实施方案的前述的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154多核苷酸中的任何一种，包括利用引物对，所述引物对包含SEQ IDNO：92-93、95-96、98-99、101-102、104-105、107-108、122-123、169-170、163-168、172、173、176-181、187-188中所列的一对分离的寡核苷酸。
在至少一些实施方案中，本发明提供了用于疾病的诊断的诊断试剂盒，所述试剂盒包括用于检测根据本发明的至少一些实施方案的多肽或多核苷酸的表达的定性和/或定量的改变的标记物和试剂。
在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒包括用于通过利用基于NAT的技术检测改变的标记物和试剂。
在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒包括至少一种核苷酸探针或引物。在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒包括能够与根据本发明的教导的核酸序列选择性地杂交的至少一种引物对。在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒包括能够与根据本发明教导的核酸序列选择性地杂交的至少一种寡核苷酸。
在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒包括能够识别根据本发明的至少一些实施方案的多肽或蛋白或与根据本发明的至少一些实施方案的多肽或蛋白相互作用的抗体。在本发明的至少一些实施方案中，试剂盒还包括用于进行免疫组织化学测定、放射成像测定、体内成像、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、核磁共振成像(MRI)、超声、光学成像、计算机断层扫描、放射免疫测定(RIA)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、狭缝印迹、竞争性结合测定、荧光成像测定、蛋白质印迹、FACS和类似的用途的至少一种试剂。
根据本发明的至少一些实施方案，所有的核酸序列和/或氨基酸序列涉及它们的分离的形式。
应该注意地是，寡核苷酸和多核苷酸、或肽、多肽和蛋白可任选地互换使用。
附图简述
图1显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组(panel)上和在利用MED探索引擎(MED discovery engine)的条件下，编码KRTCAP3蛋白的KRTCAP3转录物的表达，表现出肺癌样品中的KRTCAP3转录物与正常肺样品对比的过表达。
图2A和2B呈现了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)中所描绘的扩增子可检测的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)W93943转录物在癌性卵巢样品中相对于在正常样品中的过表达(图2B是图2A的续图)。
图3A和3B呈现了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)中所描绘的扩增子可检测的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)W93943转录物在不同的正常组织中的过表达(图3B是图3A的续图)。
图4A和4B呈现了柱状图，该柱状图显示了通过或根据W93943_seg3j4-6F2R1扩增子(SEQ ID NO：171)可检测的KRTCAP3转录物在癌性卵巢样品中相对于正常样品中的过表达(图4B是图4A的续图)。
图5A和5B呈现了柱状图，该柱状图显示了通过或根据W93943_seg3j4-6F2R1扩增子(SEQ ID NO：171)可检测的KRTCAP3转录物在不同的正常组织中的过表达(图5B是图5A的续图)。
图6A-6C显示了与EGFP融合的或未与EGFP融合的全长KRTCAP3的DNA序列。对应于靶标的全长序列的基因特异性序列以粗体标出，EGFP序列以斜体标出，中间连接区域是非粗体的。图6A代表了KRTCAP3_EGFP(SEQ ID NO：110)的DNA序列；图6B代表了EGFP_KRTCAP3(SEQ IDNO：111)的DNA序列；图6C代表了KRTC AP3(SEQ ID NO：112)的DNA序列。
图7A和7B显示了KRTCAP3_ORF_融合EGFP或KRTCAP3_ORF_未融合EGFP的氨基酸序列。对应于蛋白的全长序列的基因特异性序列以粗体标出，EGFP序列以斜体标出，中间连接区域是非粗体的。图7A代表了KRTCAP3_EGFP蛋白(SEQ ID NO：113)(484aa)的氨基酸序列；图7B代表了EGFP_KRTCAP3蛋白(SEQ ID NO：114)(478aa)的氨基酸序列；图7C代表了KRTCAP3蛋白(SEQ ID NO：7)(240aa)的氨基酸序列。
图8A和8B表现了本发明的KRTCAP3蛋白定位于细胞膜。图8A通过EGFP的绿色荧光表现了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位于细胞膜。该图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。图8B通过抗GFP抗体的红色荧光表现了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位于细胞膜。该图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
图9A和9B表现了EGFP_KRTCAP3_P2蛋白在细胞中的定向。图9A通过EGFP的绿色荧光表现了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白定位于非透化的EGFP-KRTCAP3HEK 293T转染细胞的细胞膜。图9B表现了利用抗GFP免疫染色的非透化的EGFP-KRTCAP3HEK 293T转染的细胞的免疫染色。抗GFP红色荧光的不存在(与图8B对比)表明了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白定位在质膜中且其氨基末端朝向细胞溶胶。图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
图10A-10D表现了在HEK 293T转染的细胞裂解物上利用KRTCAP3抗体的蛋白质印迹。图10A-10B显示了在KRTCAP3-HEK293T细胞裂解物上(泳道1)和pIRESpuro3-HEK293T细胞裂解物上(泳道2)利用KRT223抗体(对应于标记为RB5257和RB5258的兔)的蛋白质印迹分析。图10C-D显示了在KRTCAP3-HEK293T细胞裂解物上(泳道1)和pIRESpuro3-HEK293T细胞裂解物上(泳道2)利用KRT143抗体(对应于标记为RB5259和RB5261的兔)的蛋白质印迹分析。
图11A-11D表现了HEK-293T细胞利用纯化的KRTCAP3抗体的免疫染色。图11A-11B呈现了在KRTCAP3HEK-293T转染的细胞上(图11A)或pIRESpuro3HEK-293T转染的细胞上(图11B)利用KRT143抗体的免疫染色。KRT143抗体在KRTCAP3转染的细胞中表现了特异性信号，该特异性信号在pIRESpuro3转染的细胞中不存在。图11C-11D呈现了在KRTCAP3HEK-293T转染的细胞上(图11C)和在pIRESpuro3HEK-293T细胞上(图11D)利用KRT223抗体的免疫染色。KRT223抗体在KRTCAP3转染的细胞中显示了特异性信号，该特异性信号在pIRESpuro3转染的细胞中不存在。图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
图12表现了利用抗体KRT223，获自一位52岁女性的卵巢癌样品的强烈的免疫组织化学染色。该信号利用0-4等级来定量，为信号强度2。
图13表现了利用抗体KRT223，获自一位31岁女性的转移性胃肠道肿瘤的腺癌样品的显著的免疫组织化学染色。该信号利用0-4等级来定量，为信号强度3。
图14显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM26F蛋白的FAM26F转录物的表达，表现出乳腺癌样品中的FAM26F转录物与正常乳腺样品对比的过表达。
图15显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM26F蛋白的FAM26F转录物的表达，表现出卵巢癌样品中的FAM26F转录物与正常卵巢癌样品对比的过表达。
图16A-16H显示了散点图，该散点图表现了，利用MED探索引擎，在各种患病的组织、正常组织和癌组织中FAM26F转录物的整体过表达。图16A-16H是连续的并按照相继的顺序。
图17A-17C显示了柱状图，该柱状图代表了在肾癌、肝癌、肺癌、NHL淋巴瘤和黑素瘤中通过FAM26F F1/R1引物(SEQ ID NO：95和96)可检测的FAM26F转录物的过表达。图17A-17C是连续的并按照相继的顺序。
图18A和18B显示了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称T82906_seg5-10F7R5(SEQ ID NO：124)中所描绘的扩增子可检测的FAM26F T82906转录物在不同的正常组织中的表达(图18B是图18A的续图)。
图19A和19B显示了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称T82906_seg5-10F7R5(SEQ ID NO：124)中所描绘的扩增子可检测的FAM26F T82906转录物在血液特异性套组(blood-specific panel)中的表达，(图19B是图19A的续图)。
图20呈现了FAM26_P4_FLAG(SEQ ID NO：174)的DNA序列。FLAG序列加下划线。
图21呈现了FAM26_P4_FLAG(SEQ ID NO：175)的氨基酸序列。FLAG序列加下划线。
图22A和22B表现了FAM26_P4蛋白的细胞定位。
图23A和23B表现了在FAM26F转染的细胞上利用抗FAM26F抗体所观察到的定位于细胞膜的特异细胞染色(图23A)；与在pIRESpuro3HEK-293T转染的细胞上利用同样的抗体未观察到染色相对比(图23B)。
图24显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引起的条件下，编码MGC52498蛋白的MGC52498转录物的表达，表现了在肺癌样品中相对于在正常肺样品中MGC52498转录物的过表达。
图25A和25B显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引起的条件下，编码MGC52498蛋白的MGC52498转录物的表达，表现了在不同的白血病样品中相对于在正常血液样品中MGC52498转录物的过表达(图25B是图25A的续图)。
图26A和26B呈现了柱状图，该柱状图显示通过序列名称AA213820_seg8-11F2R2(SEQ ID NO：109)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白MGC52498AA213820转录物在不同的正常组织中的表达(图26B是图26A的续图)。
图27A和27B呈现了柱状图，该柱状图显示了通过序列名称AA213820_seg8-11F2R2(SEQ ID NO：109)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白MGC52498AA213820转录物在血液特异性套组中的表达(图27B是图27A的续图)。
图28A和28B分别呈现了FLAG_MGC_T1_P4-(SEQ ID NO：182)和MGC_T1_P4_FLAG(SEQ ID NO：183)的DNA序列；FLAG序列是下划线的。
图29A和29B分别呈现了FLAG_MGC_T1_P4蛋白(SEQ ID NO：184)和MGC_T1_P4_FLAG(SEQ ID NO：185)的氨基酸序列；FLAG序列是下划线的。
图30A和30B显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM70A蛋白的FAM70A转录物的表达，表现了在肺癌样品中对比在正常肺样品中FAM70A转录物的过表达(图30B是图30A的续图)。
图31显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM70A蛋白的FAM70A转录物的表达，表现了在肝癌样品中对比在正常肝样品中FAM70A转录物的过表达。
图32显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM70A蛋白的FAM70A转录物的表达，表现了在乳腺癌样品中对比在正常乳腺样品中FAM70A转录物的过表达。
图33A和33B显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码FAM70A蛋白的FAM70A转录物的表达，表现了在肾癌样品中对比在正常肾样品中FAM70A转录物的过表达。(图33B是图33A的续图)。
图34A和34B显示了柱状图，该柱状图显示了通过序列名称F10649_seg10-12F1R1(SEQ ID NO：103)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白FLJ20716-FAM70A F10649转录物在不同正常组织中的表达(图34B是图34A的续图)。
图35A和35B显示了柱状图，该柱状图显示了通过序列名称F10649_seg10-12F1R1(SEQ ID NO：103)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白FLJ20716-FAM70A F10649转录物在血液特异套组中的表达(图35B是图35A的续图)。
图36呈现了FAM7O_T1_P5_FLAG(SEQ ID NO：119)的DNA序列。对应于靶标全长序列的基因特异性序列以粗体标出，FLAG序列是非粗体的。
图37代表了FAM70A_T1_P5_FLAG蛋白的(SEQ ID NO：120)氨基酸序列；对应于蛋白的全长序列的基因特异性序列以粗体标出，FLAG序列是非粗体的。
图38A-38D表现了FAM70A_T1_P5_FLAG(SEQ ID NO：120)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位于细胞膜。图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜获得的。
图39A和39B表现了针对选定的FAM70A的肽产生的抗体的特异性。图39A和39B呈现了免疫沉淀、随后分别利用来自兔#5663和#5664的纯化的血清，和FAM70HEK-293T稳定转染的细胞裂解物以及HEK-293T非转染的细胞裂解物通过蛋白质印迹分析的结果。泳道1代表随后IP的HEK-293T转染的细胞裂解物；泳道2代表随后IP的HEK-293T非转染的细胞裂解物；泳道3和泳道4代表HEK-293T转染细胞的全细胞裂解物。
图40A-40F呈现了利用纯化的抗FAM70抗体(兔#5663)不同细胞的免疫染色。图40A和40B呈现了分别利用1∶200或1∶1000稀释，在HEK-293T转染细胞上的结果。图40C和40D呈现了分别利用1∶200或1∶1000稀释，在HEK-293T非转染细胞上的结果。图40E呈现了在CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞上的结果和图40F呈现了在MC/CAR(ATCC，CRL-8083)细胞上的结果。利用兔#5664获得了相似的结果(数据未示出)。
图41A-41D表现了随后分别与0、5倍、25倍、50倍的FAM70肽孵育的293T转染细胞的红色荧光信号。
图41E-41H表现了随后分别与0、5倍、25倍、50倍的FAM70肽孵育的293T非转染细胞的红色荧光信号。
图42显示了散点图，该散点图表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码TMEM154蛋白的TMEM154转录物的表达，表现了在肾癌样品中与正常肾样品中相比TMEM154转录物的过表达。
图43A和43B表现了，在所有组织的虚拟套组上和在利用MED探索引擎的条件下，编码TMEM154蛋白的TMEM154转录物的表达。图43显示了散点图，该散点图表现了在胰腺癌样品中与正常胰腺样品中相比TMEM154转录物的过表达。图43B呈现了利妥昔单抗处理的DLBCL与TMEM 154表达相关的Kaplan-Meier生存曲线。在图43B中时间轴以年来表示；实线代表高TMEM 154表达；虚线代表低TMEM 154表达。
图44A和44B显示了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称W38346_seg6-20F1R1(SEQ ID NO：106)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白FLJ32028TMEM154W38346转录物在不同的正常组织中的表达(图44B是图44A的续图)。
图45A和45B显示了柱状图，该柱状图显示了通过如序列名称W38346_seg6-20F1R1(SEQ ID NO：106)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白FLJ32028TMEM154W38346转录物在血液特异性套组中的表达(图54B是图45A的续图)。
图46呈现了TMEM154_T0_FLAG(SEQ ID NO：189)的DNA序列；FLAG序列是加下划线的。
图47呈现了TMEM154_P3_FLAG(SEQ ID NO：190)的氨基酸序列；FLAG序列是加下划线的。
图48A和48B呈现了TMEM154_P3的定位结果。
图49A和49B呈现了在TMEM154转染的细胞上利用纯化的TM21抗体观察到的定位于细胞膜的特异细胞染色。图49A和49B呈现了利用分别从兔#6285和兔#6286纯化的TM21抗体获得的结果。
图50A和50B呈现了在TMEM154转染的细胞上利用纯化的TM101抗体所观察到的定位于细胞膜的特异细胞染色。图50A和50B呈现了利用分别从兔#6284和兔#6249纯化的TM101抗体获得的结果。
图51A-51C呈现了在阴性对照pIRESpuro3HEK-293T转染的细胞上利用纯化的TM21抗体和TM101抗体所观察到的细胞染色的结果。图51A和51B呈现了分别利用从兔#6285和兔#6286纯化的TM21抗体获得的结果。图51C呈现了利用从兔#6249纯化的TM101抗体获得的结果。
图52A-52C呈现了在三种不同的细胞系上利用纯化的TM21抗体和TM101抗体所观察到的定位于细胞膜的特异性细胞染色：图52A-1到52A-4呈现了在CESS细胞(ATCC目录号TIB-190)上的结果；图52B-1到52B-3呈现了在Ramos细胞(ATCC目录号CRL-1923)上得到的结果；和图52C-1到52C-3呈现了在Daudi细胞(ATCC目录号CCL-213)上得到的结果。图52A-1和52A-2呈现了利用分别从兔#6285和兔#6286纯化的TM21抗体获得的结果。图52A-3和52A-4呈现了利用分别从兔#6248和兔#6249纯化的TM101抗体获得的结果。图52B-1和52B-2呈现了利用分别从兔#6285和兔#6286纯化的TM21抗体获得的结果。图52B-3呈现了利用从兔#6248纯化的TM101抗体获得的结果。图52C-1和52C-2呈现了利用分别从兔#6285和兔#6286纯化的TM21抗体获得的结果。图52C-3呈现了利用从兔#6284纯化的TM101抗体获得的结果。
发明详述
在一些实施方案中，本发明涉及称作KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154多肽的多肽中的任何一种，和其对应的核酸序列，和其片段和变体和同源物，和其作为治疗物和/或诊断靶标的用途。根据至少一些实施方案，提供了这些多肽和其不连续部分作为治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶及其类似物的药物靶标的用途。根据至少一些实施方案，本发明涉及特异性结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM 154多肽和其部分和变体的诊断性和治疗性多克隆抗体和单克隆抗体和其片段，尤其是靶向其胞外域或部分或变体，或其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分、或其片段或变体的那些。根据至少一些实施方案，本发明提供了特异性结合SEQ ID NO：7、8、10-13、15-19、25、29-33、35、36、42-64、115-118、121、127、132-135、146-162、186、191-192、196、199、200中所列的氨基酸序列中的任何一个，或其变体和片段和同源物的人类的或嵌合的单克隆抗体和其片段和抗独特型抗体。
根据本发明的至少一些实施方案，抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，比如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体、生产这样的抗体的方法、包含这样的抗体的免疫轭合物和双特异性分子以及含有这种抗体、免疫轭合物或双特异分子的药物组合物和诊断组合物。
根据本发明的至少一些实施方案，如本文所描述的，特定的抗体可用于癌症和/或免疫相关病症的治疗和/或诊断。
为使本发明可以更易于被理解，首先定义了某些术语。另外的定义贯穿详细描述列出。
如本文所用的术语“KRTCAP3蛋白”包括由KRTCAP3基因产物所编码的任何蛋白，包括已知的或“野生型”蛋白，其任何剪接变体，其任何其它变体，或其任何片段(包括但不限于其任何胞外部分)。
术语“KRTCAP3多肽”指由SEQ ID NO：1-6、9、94、171、193-195中任何一项中所列的核酸序列中的任何一种所编码的多肽，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。这些核酸序列在本文被称为“KRTCAP3多核苷酸”。该术语还指SEQ ID NO：7、8、10-13中任何一个所列的多肽中的任何一种；SEQ IDNO：47-51中任何一个所列的其胞外部分；SEQ ID NO：146-148中任何一个所列的其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分；SEQ ID NO：115、116中任何一个所列的用于兔、小鼠或其它哺乳动物免疫接种和特异性抗体产生的选自分离的多肽中的任何一种的蛋白片段；和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的，术语“KRTCAP3多核苷酸”或“KRTCAP3多肽”，还分别指前述的多核苷酸和多肽中的任何一种，其在诸如癌症中是差异表达的，所述癌症包括但不局限于肺癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的。
如本文所用的术语“KRTCAP3变体”，指由SEQ ID NO：2、3、4、6、9、94、171、193-195中所列的核酸序列中的任何一种所编码的蛋白，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“KRTCAP3新型变体”还指SEQ IDNO：10、11、13、47-51、146-148中任何一个所列蛋白中的任何一种，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。
如本文所用的术语“KRTCAP3蛋白”包括“KRTCAP3多肽”、“KRTCAP3变体”和“KRTCAP3新型变体”的组中的任何蛋白。
如本文所用的术语“FAM26F蛋白”包括由FAM26F基因产物所编码的任何蛋白，包括已知的或“野生型”蛋白，其任何剪接变体，其任何其它变体，或其任何片段(包括但不局限于其任何胞外部分)。
如本文所用的术语“FAM26F多肽”指由SEQ ID NO：14、125、97、124中任何一个所列的核酸序列中的任何一种所编码的多肽，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。这些核酸序列在本文中称为“FAM26F多核苷酸”。该术语还指SEQ ID NO：15-18中任何一个所列的多肽；SEQ ID NO：52、53中任何一个所列的其胞外部分；SEQ ID NO：127、149中任何一个所列的其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分；SEQ ID NO：117、118中任何一个所列的用于兔、小鼠或其它哺乳动物免疫接种和特异性抗体产生的选自分离的多肽中的任何一种的蛋白片段；和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“FAM26F多核苷酸”或“FAM26F多肽”还分别指前述的多核苷酸和多肽中的任何一种，其在诸如癌症中是差异表达的，所述癌症包括但不局限于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的，以及非恶性疾患，比如免疫相关病症或疾患，包括但不局限于炎症疾病或自身免疫疾病、移植排斥病和移植物抗宿主病。
如本文所用的，术语“MGC52498蛋白”包括由MGC52498基因产物所编码的任何蛋白，包括已知的或“野生型”的蛋白，其任何剪接变体，其任何其它变体或其片段(包括但不局限于其任何胞外部分)。
如本文所用的术语“MGC52498多肽”指由SEQ ID NO：20、27、109、131、201中任何一个所列的核酸序列所编码的多肽，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。这些核酸序列在本文中称为“KRTC AP3多核苷酸”。该术语还指SEQID NO：19、132-135中任何一个所列的多肽中的任何一种；SEQ IDNO：60-62中任何一个所列的其胞外部分，SEQ ID NO：25、150-154、200中任何一个所列的其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。本文所用的术语“MGC52498多核苷酸”或“MGC52498多肽”还分别指前述的多核苷酸和多肽中的任何一种，其在诸如癌症中是差异表达的，所述癌症包括但不局限于肺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤，白血病，尤其是T细胞白血病，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的，以及非恶性疾患比如免疫相关病症或疾患，包括但不局限于炎症疾病或自身免疫疾病、移植排斥病和移植物抗宿主病。
本文所用的术语“MGC52498变体”指由SEQ ID NO：20、27、109、201中所列的核酸序列中的任何一个所编码的蛋白，和其片段和同源物，尤其是那些与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“MGC52498新型变体”还指SEQ ID NO：19、25、60-62、150-154、200中任何一个所列的蛋白中的任何一种，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。
如本文所用的术语“MGC52498蛋白”包括“MGC52498多肽”、“MGC52498变体”和“MGC52498新型变体”的组中的任何蛋白。
如本文所用的术语“FAM70A蛋白”包括由FAM70A基因产物所编码的任何蛋白，包括已知的或“野生型”蛋白，其任何剪接变体、其任何变体，或其任何片段(包括但不局限于其任何胞外部分)。
如本文所用的术语“FAM70A多肽”是指由SEQ ID NO：21、22、24、26、28、103、197、198所列的核酸序列中的任何一种所编码的多肽，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。这些核酸序列在本文中称为“FAM70A多核苷酸”。该术语还指SEQ ID NO：29-33、35、36中的任何一个所列的多肽中的任何一种；SEQ ID NO：54-59中的任何一个所列的其胞外部分；SEQ ID NO：155-160、196、199中任何一个所列的其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分；SEQ ID NO：121、186中任何一个所列的用于兔、小鼠或其它哺乳动物免疫接种和特异性抗体产生的选自分离的多肽中的任何一种的蛋白片段；和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“FAM70A多核苷酸”或“FAM70A多肽”，还分别指前述的多核苷酸和多肽中的任何一种，其在诸如癌症中是差异表达的，所述癌症包括但不局限于肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、且其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的，以及非恶性疾患比如免疫相关病症或疾患，包括但不局限于炎症疾病或自身免疫疾病、移植排斥病和移植物抗宿主病。
如本文所用的术语“FAM70A变体”指由SEQ ID NO：26、103、197、198中所列的核酸序列中的任何一个所编码的蛋白，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“FAM70A新型变体”还指SEQ ID NO：36、54-59、155-160、196、199中任何一个所列的蛋白的任何一种，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。
如本文所用的术语“FAM70A蛋白”包括“FAM70A多肽”、“FAM70A变体”和“FAM70A新型变体”的组中的任何蛋白。
如本文所用的术语“TMEM 154蛋白”包括由TMEM154基因产物所编码的任何蛋白，包括已知的或“野生型”蛋白，其任何剪接变体、其任何其它变体，或其任何片段(包括但不局限于其任何胞外部分)。
如本文所用的术语“TMEM154多肽”指由SEQ ID NO：23、38-41、106中所列的核酸序列中的任何一种所编码的多肽，和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。这些核酸序列在本文中被称作“TMEM 154多核苷酸”。该术语还指SEQ ID NO：42-46中任何一个所列的多肽中的任何一种；SEQ ID NO：63、64中任何一个所列的其胞外部分；SEQ ID NO：161、162中任何一个所列的其独特的桥接部分、边缘部分、尾部分或头部分；SEQ ID NO：191、192中任何一个所列的用于兔免疫接种和特异性抗体产生的选自分离的多肽中的任何一种的蛋白片段；和其片段和同源物，尤其是与之具有至少80、85、90、95、96、97、98、99％序列同一性的那些。如本文所用的术语“TMEM154多核苷酸”或“TMEM154多肽”还分别指前述的多核苷酸和多肽中的任何一种，其在诸如癌症中是差异表达的，所述癌症包括但不局限于肾癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、尤其是非霍奇金氏淋巴瘤，其中所述癌症可以是非转移性的、浸润性的或转移性的，以及非恶性疾患比如免疫相关病症或疾患，包括但不局限于炎症疾病或自身免疫疾病，移植排斥病和移植物抗宿主病，尤其是SLE。
术语KRTCAP3多肽的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“细胞外胞外域”指以下所列的多肽序列或对应的核酸序列(不包括KRTCAP3多肽的信号肽和TM(跨膜部分))：
多肽W93943_P2(SEQ ID NO：7)的两个ECD区：
W93943_P2_42-62(SEQ ID NO：47)-序列：
TVLRHVANPRGAVTPEYTVAN(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基32的任何位置并终止于至残基72的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P2_115-162(SEQ ID NO：48)-序列：
LAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDT(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基105的任何位置并终止于至残基172的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W93943_P13(SEQ ID NO：10)的三个ECD区：
W93943_P13_1-20(SEQ ID NO：49)-序列：
MRRCSLCAFDAARGPRRLMR(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基1的任何位置并终止于至残基30的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P13_77-91(SEQ ID NO：50)-序列：DPGGGRAPGEPSRPK(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基67的任何位置并终止于至残基101的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P13_141-188(SEQ ID NO：48)-序列：
LAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDT(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基131的任何位置并终止于至残基198的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W93943_P14(SEQ ID NO：11)的两个ECD区：
W93943_P14_42-62(SEQ ID NO：47)-序列：TVLRHVANPRGAVTPEYTVAN(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基32的任何位置并终止于至残基72的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P14_115-162(SEQ ID NO：48)-序列；
LAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDT(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基105的任何位置并终止于至残基172的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W93943_P17(SEQ ID NO：12)的两个ECD区：
W93943_P17_42-62(SEQ ID NO：47)-序列：TVLRHVANPRGAVTPEYTVAN(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基32的任何位置并终止于至残基72的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P17_115-162(SEQ ID NO：48)-序列：
LAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDT(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基105的任何位置并终止于至残基172的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W93943_P18(SEQ ID NO：13)的两个ECD区：
W93943_P18_42-62(SEQ ID NO：47)-序列：TVLRHVANPRGAVTPEYTVAN(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基32的任何位置并终止于至残基72的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
W93943_P18_115-171(SEQ ID NO：51)-序列：
CCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQLEEMTELESPKCKRQENEQLLDQNQEIRASQRS WV(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基105的任何位置并终止于至残基181的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
和与之具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列同一性的其片段和变体和同源物。
术语FAM26F多肽的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“细胞外胞外域”指以下所列的多肽序列或对应的核酸序列(不包括FAM26F多肽的信号肽和TM(跨膜部分))：
多肽T82906_P4(SEQ ID NO：18)的两个ECD区：
T82906_P4_40-48(SEQ ID NO：52)-序列：QCPCSAAWN(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基30的任何位置并终止于至残基58的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
T82906_P4_125-175(SEQ ID NO：53)-序列：
ECAATGSAAFAQRLCLGRNRSCAAELPLVPCNQAKASDVQDLLKDLKAQSQ(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基115的任何位置并终止于至残基185的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽T82906_P3(SEQ ID NO：16)的一个ECD区：
T82906_P3_27-143(SEQ ID NO：127)-序列
LSPVSFLQLKFWKIYLEQEQQILKSKATEHATELAKENIKCFFEGSHPKEYNTPSMKEWQQIS SLYTFNPKGQYYSMLHKYVNRKEKTHSIRSTEGDTVIPVLGFVDSSGINSTPEL(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基17的任何位置并终止于至残基153的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
和与之具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列同一性的其片段和变体和同源物。
术语MGC52498多肽的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“细胞外胞外域”指以下所列的多肽序列或对应的核酸序列(不包括MGC52498蛋白的信号肽和TM(跨膜部分))：
多肽AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的三个ECD区：
AA213820_P4_1-55(SEQ ID NO：60)-序列：
MSGACTSYVSAEQEVVRGFSCPRPGGEAAAVFCCGFRDHKYCCDDPHSFFPYEHS(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基1的任何位置并终止于至残基65的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
AA213820_P4_91-190(SEQ ID NO：61)-序列：
SSKPHTKLDLGLSLQTAGPEEVSPDCQGVNTGMAAEVPKVSPLQQSYSCLNPQLESNEGQAVNSKRLLHHCFMATVTTSDIPGSPEEASVPNPDLCGPVP(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基81的任何位置并终止于至残基200的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
AA213820_P_61-71(SEQ ID NO：62)-序列：
MASLWPSALTFNTDANIPGPLGFCGGWVRLCSLSSLTPPCGRRLVPCLSAPAPNAPR LPAPARCSIGALIG(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基51的任何位置并终止于至残基81的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)，
和与之具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列同一性的其片段和变体和同源物。
术语FAM70A多肽的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“细胞外胞外域”指以下所列的多肽序列或对应的核酸序列(不包括FAM70A蛋白的信号肽和TM(跨膜部分))：
多肽F10649_P4(SEQ ID NO：30)的两个ECD区：
F10649_P4_51-59(SEQ ID NO：54)-序列：TTRTQNVTV(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基41的任何位置并终止于至残基69的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
F10649_P4_110-225(SEQ ID NO：55)-序列：
DGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAAREVNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSA(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基100的任何位置并终止于至残基235的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽F10649_P5(SEQ ID NO：33)的两个ECD区：
F10649_P5_51-59(SEQ ID NO：54)-序列：TTRTQNVTV(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基41的任何位置并终止于至残基69的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
F10649_P5_110-201(SEQ ID NO：56)-序列：
DGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSA(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基100的任何位置并终止于至残基211的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽F10649_P7(SEQ ID NO：35)的两个ECD区：
F10649_P7_51-59(SEQ ID NO：54)-序列：TTRTQNVTV(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基41的任何位置并终止于至残基69的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
F10649_P7_110-241(SEQ ID NO：58)-序列：
DGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEENPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基100的任何位置并终止于至残基251的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽F10649_P8(SEQ ID NO：36)的两个ECD区：
F10649_P8_51-65(SEQ ID NO：59)-序列：TTRTQNVTVGGYYPG(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基41的任何位置并终止于至残基75的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
F10649_P8_223-328(SEQ ID NO：57)-序列：
GGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基213的任何位置并终止于至残基338的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽F10649_P10(SEQ ID NO：32)的一个ECD区：
F10649_P10_80-185(SEQ ID NO：57)-序列：
GGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基70的任何位置并终止于至残基195的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
和与之具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列同一性的其片段和变体和同源物。
术语TMEM154多肽的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“细胞外胞外域”指以下所列的多肽序列或对应的核酸序列(不包括TMEM154蛋白的信号肽和TM(跨膜部分))：
多肽W38346_P3(SEQ ID NO：42)的一个ECD区：
W38346_P3_23-75(SEQ ID NO：63)-序列：
EELENSGDTTVESERPNKVTIPSTFAAVTIKETLNANINSTNFAPDENQLE(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基13的任何位置并终止于至残基85的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W38346_P4(SEQ ID NO：45)的一个ECD区：
W38346_P4_20-105(SEQ ID NO：64)-序列：
ATYYKRKRTKQEPSSQGSQSALQTYELGSENVKVPIFEEDTPSVMEIEMEELDKWM NSMNRNADFECLPTLKEEKESNHNPSDSES(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基10的任何位置并终止于至残基115的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
多肽W38346_P7(SEQ ID NO：46)的一个ECD区：
W38346_P7_23-75(SEQ ID NO：63)-序列：
EELENSGDTTVESERPNKVTIPSTFAAVTIKETLNANINSTNFAPDENQLE(和任选地，任一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一种的桥接氨基酸，起始于自残基13的任何位置并终止于至残基85的任何位置；和包含该序列或其部分以及该序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非连续氨基酸中的任何一种的非线性表位)；
和与之具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99％序列同一性的其片段和变体和同源物。
术语“免疫反应”指，例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或由肝或脾产生的细胞产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的行为，其导致对侵入病原、感染病原的细胞或组织、癌细胞，或者，在自身免疫或病理炎症的情况下对正常的人类细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体消除。
术语“抗体”在本文中包括完整的多克隆和单克隆抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”指包括由二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个CL结构域组成。可将VH和VL区进一步细分为高变的区域，称作互补决定区(CDR)，间插更保守的区域，称作构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括多种免疫系统的细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体的保留与抗原(例如，KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM 154多肽和蛋白)特异性结合能力的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由轻链可变区、重链可变区、轻链恒定区(CL)和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′).2片段，包括由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区。并且，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因所编码，但可利用重组方法，通过使它们成为单一蛋白链的合成连接体将它们连接，在所述单一蛋白链中VL和VH区配对形成单价分子(被称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单抗抗体也将包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段是利用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与对完整抗体相同的方式根据效用筛选片段。
如本文所用的，“分离的抗体”意在指基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A，或TMEM154多肽的分离的抗体分别基本上不含与除KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或多肽以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或多肽的分离的抗体可以具有与其它抗原的交叉反应性，所述其它抗原比如分别来自其它物种的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A，或TMEM154多肽。并且，分离的抗体可基本上无其它细胞物质和/或化学物。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一的结合特异性和亲和性。
如本文所用的术语“人类抗体”，意在包括具有以下可变区的抗体，所述可变区中的构架区和CDR区都来源于人类种系免疫球蛋白序列。并且，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。根据本发明的至少一些实施方案人类抗体可包括非由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”，意在不包括以下抗体，所述抗体中来源于诸如小鼠的另外的哺乳动物物种的CDR序列被移植到人类构架序列中。
术语“人类单克隆抗体”是指显示单一结合特异性、具有以下可变区的抗体，所述可变区中的构架区和CDR区都来源于人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人类单克隆抗体是由包括融合到永生化细胞的以下B细胞的杂交瘤所产生的，所述B细胞获自具有包括人类重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠。
如本文所用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，比如(a)从人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞中，例如，从转染瘤中，分离的抗体，(c)从重组的、组合的人类抗体库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有以下可变区，所述可变区中的构架区和CDR区都来源于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可将这样的重组人类抗体经受体外诱变(或者，当使用人类Ig序列的转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，因此虽然重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来源于人类种系VH和VL序列并与之相关的，但可能并非天然存在于体内的人类抗体种系全部组成部分中的序列。
如本文所用的，“同种型”指由重链恒定区基因所编码的抗体种类(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
如本文所用的，与人类KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或多肽“特异性结合”的抗体意指与人类KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A、TMEM154蛋白或多肽结合的抗体，任选地具有5×10-8M或更小、3×10-8M或更小、或1×10-9M或更小的KD。
如本文所用的，术语“K-assoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用的，术语“Kdiss”或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的，术语“KD”意指解离常数，其是从Kd比Ka的比率(即，Kd/Ka)获得的并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可利用本领域已确立的方法来测定。用于测定抗体的KD的优选的方法是通过利用表面等离子共振，任选地使用生物传感器，比如
Figure BDA0000079743540000561
系统。
如本文所用的，术语IgG抗体的“高亲和性”是指具有对抗原10-8M或更低、10-9M或更低或10-10M或更低的KD的抗体。然而，对于其它抗体同种型“高亲和性”结合可能是不同的。例如，对于IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体具有10-7M或更低、或10-8M或更低的KD。
如本文所用的，术语“尾”指根据本发明的剪接变体所特有的位于氨基酸序列末端的肽序列。因此，具有这样的尾的剪接变体可任选地被认为是嵌合物，因为剪接变体的至少第一部分通常与对应的已知蛋白的一部分高度同源(常为100％一致)，而变体的至少第二部分包括所述尾。
如本文所用的，术语“头”指根据本发明的剪接变体所特有的位于氨基酸序列起始的肽序列。因此，具有这样的头的剪接变体可任选地被认为是嵌合物，因为剪接变体的至少第一部分包括头，而至少第二部分通常与对应的已知蛋白的一部分高度同源(常为100％一致)。
如本文所用的，术语“边缘部分”指根据本发明的剪接变体的以下两个部分之间的连接，所述两个部分在野生型或已知蛋白中未连接。例如，边缘可任选地由于以上的变体的“已知蛋白”部分和尾之间的连接而产生，和/或如果野生型序列的内部部分不再存在时可发生，如此以致在已知蛋白中为非连续的序列的两个部分现在在剪接变体中是连续的。“桥接”可任选地为以上所描述的边缘部分，但还可包括变体的头和“已知蛋白”部分之间的连接，或变体的尾和“已知蛋白”部分之间的连接，或变体的插入部分和“已知蛋白”部分的连接。
在一些实施方案中，变体的头或尾或独特的插入部分和“已知蛋白”部分之间的桥接，包括至少大约10个氨基酸，或在一些实施方案中至少约20个氨基酸，或在一些实施方案中至少约30个氨基酸，或在一些实施方案中至少约40个氨基酸，其中至少一个氨基酸来自变体的尾/头/插入部分且至少一个氨基酸来自“已知蛋白”部分。在一些实施方案中，桥接可包括从大约10个到大约40个氨基酸的任何数目(例如，10、11、12、13……37、38、39、40个氨基酸的长度，或其间的任何数目)。
应该注意地是桥接在任何方向不能延长超过序列的长度，且应假定每个桥接描述以桥接长度不延长超过序列本身的方式来阅读。
并且，在以下某些情况下，依照滑动窗口(sliding window)来描述桥接。例如，某些桥接描述以以下的格式为特征：两个边缘之间的桥接(其中已知蛋白部分在变体中不存在)可任选地按以下来描述：CONTIG-NAME_P1(代表蛋白的名称)的桥接部分，包括具有长度“n”的多肽，其中n为至少约10个氨基酸的长度，任选地至少约20个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约40个氨基酸、或至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包括XX(桥接中间的两个氨基酸，每个来自边缘的末端)，具有如下的结构(根据CONTIG-NAME-P1的序列编号)：起源于氨基酸编号49-x到49(举例而言)中的任何一个；且终止于氨基酸编号50+((n-2)-x)(举例而言)中的任何一个的序列，其中x从0到n-2变化。在本实例中，还应该被阅读为包括以下桥接，所述桥接中n为10-50个氨基酸长度之间的任何数目。并且，桥接多肽不能延长超过序列，所以其应该如下阅读，所述阅读使得49-x(举例而言)不小于1，且50+((n-2)-x)(举例而言)不大于总序列长度。
如本文所用的，术语“癌症”应被理解为包括以导致恶性生长或肿瘤的异常和不受控制的细胞分裂为特征的任何肿瘤病。可利用根据本发明的至少一些实施方案的组合物来治疗的癌症的非限制性实例为实体瘤，肉瘤，血液系统恶性肿瘤，包括但不限于乳腺癌(如乳癌)，子宫颈癌，卵巢癌(ovary cancer/ovary carcinoma)，子宫内膜癌，黑素瘤，膀胱癌(bladdercancer/bladder carcinoma)，肺癌(如腺癌和非小细胞肺癌)，胰腺癌(例如诸如外分泌性胰腺癌的胰腺癌)，结肠癌(例如诸如结肠腺癌和结肠腺瘤的结直肠癌)，前列腺癌，包括晚期疾病，淋巴系统的造血肿瘤(如白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，B细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，多发性骨髓瘤，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，抗CD20(即利妥昔单抗(Rituximab))抗性淋巴瘤)，髓细胞白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病)，甲状腺癌，甲状腺滤泡癌，骨髓增生异常综合征(MDS)，间叶源性肿瘤(如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤肿瘤)，黑素瘤，葡萄膜黑素瘤，畸胎瘤，神经母细胞瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，皮肤良性肿瘤(如角化棘皮瘤)，肾肿瘤，间变性大细胞淋巴瘤，食管鳞状细胞癌，肝细胞癌，滤泡性树突细胞癌，肠癌，肌肉浸润性癌，精囊肿瘤，表皮癌，脾癌，膀胱癌，头颈部癌，胃癌，肝癌，骨癌，脑癌，视网膜癌，胆道癌，小肠癌，唾液腺癌，子宫癌，睾丸癌，结缔组织癌，前列腺肥大，骨髓发育不良，沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症，鼻咽癌，神经内分泌癌，骨髓增生异常综合征，间皮瘤，血管肉瘤，卡波西氏肉瘤，类癌瘤，食管胃癌，输卵管癌，腹膜癌，乳头状浆液性苗勒氏癌(papillary serous mullerian cancer)，恶性腹水，胃肠道间质瘤(GIST)，以及诸如Li-Fraumeni综合征和Von Hippel-Lindau综合征(VHL)的遗传性癌症综合征。
关于卵巢癌，疾病选自包括但不局限于原发性卵巢癌和转移性卵巢癌的组，包括上皮性卵巢癌，比如浆液性癌、粘液性癌、内膜样癌、透明细胞癌、混合性上皮癌、未分化癌和布伦纳氏瘤(Brenner tumor)，以及卵巢的其他非上皮性肿瘤，包括生殖细胞恶性肿瘤。
关于乳腺癌，疾病选自包括但不局限于原发性乳腺癌和转移性乳腺癌的组，包括乳腺癌比如浸润性管癌、原位管癌、浸润性小叶癌、原位小叶癌、炎性乳腺癌、乳房的佩吉特氏病(Paget′s disease of the breast)、和乳房的其它非上皮性肿瘤，包括纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤。
关于肺癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：鳞状细胞肺癌、肺腺癌、类癌瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
关于肝癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性肝癌和肝内胆管癌，包括肝细胞癌、胆管癌、肝血管肉瘤和肝母细胞瘤。
关于肾癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性肾癌，包括肾细胞癌(即，肾腺癌)，以及其它的非上皮性卵巢肿瘤，包括肾胚细胞瘤(即，Wilm氏瘤)、肾盂的移行细胞肿瘤和肾来源的各种肉瘤。
关于结肠癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性结肠癌，包括腺癌、粘液性癌(包括印环细胞癌和髓状癌)、腺鳞癌、类癌瘤、小细胞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、以及其它非上皮性的结肠肿瘤，包括淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤。
关于胰腺癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性外分泌胰腺癌，包括腺癌、浆液性和粘液性囊腺癌、腺泡细胞癌、未分化癌、胰母细胞瘤和神经内分泌肿瘤，比如胰岛素瘤。
关于黑素瘤，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性恶性黑素瘤，包括皮肤黑素瘤，比如浅表扩展性黑素瘤、结节性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤和恶性痣性黑素瘤，以及粘膜黑素瘤、眼内黑素瘤、结缔组织增生性/嗜神经性黑素瘤和软组织的黑素瘤(透明细胞肉瘤)。
关于前列腺癌，疾病选自由以下组成但不局限于以下的组：原发性和转移性前列腺癌，包括前列腺上皮内瘤、非典型腺瘤性增生、前列腺腺癌、粘液性肿瘤或印环肿瘤、囊性腺样癌、前列腺导管癌、类癌瘤和小细胞未分化癌。
如本文所用的，术语“血液系统恶性肿瘤”指急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、比如霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、低度/滤泡性NHL、小细胞淋巴细胞性(SL)NHL、小细胞NHL、I级小细胞滤泡性NHL、II级混合性小细胞和大细胞滤泡性NHL、III级大细胞滤泡性NHL、大细胞NHL、弥漫性大B细胞NHL、中间等级弥漫性NHL、高等级免疫母细胞型NHL、高等级成淋巴细胞型NHL、高等级小无核裂细胞NHL、肿块性病变NHL、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)，伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)，脾边缘区淋巴瘤(SMZL)，结外边缘区B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿，B细胞前淋巴细胞白血病，前体B成淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，AIDS相关淋巴瘤和Waldenstrom氏巨球蛋白血症
本文所用的术语“免疫相关病症”将包括选自包括但不局限于以下的组的任何疾病或疾患：多发性硬化症；银屑病，类风湿性关节炎；银屑病性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎，克罗恩氏病；良性淋巴细胞血管炎，血小板减少性紫癜，特发性血小板减少症，特发性自身免疫性溶血性贫血，单纯红细胞再生障碍，斯耶格伦氏综合征(Sjogren′ssyndrome)，风湿性疾病，结缔组织病，炎性风湿病，退行性风湿病，关节外风湿病，幼年型类风湿性关节炎，尿酸性关节炎，肌风湿病，慢性多关节炎，冷凝球蛋白血症性血管炎，抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎，抗磷脂综合征，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，格林-巴利综合征(Guillian-Barre syndrome)，慢性免疫多发性神经病，自体免疫性甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病，I型糖尿病，阿狄森氏病(Addison′s disease)，膜性肾小球性肾病，古德帕斯彻氏病(Goodpasture′s disease)，自身免疫性胃炎，恶性贫血，寻常性天疱疮，肝硬化，原发性胆汁性肝硬化，皮肌炎，多发性肌炎，纤维肌炎，肌硬结，腹腔疾病，免疫球蛋白A肾病，亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)，伊凡斯氏综合征(Evanssyndrome)，异位性皮炎，银屑病，关节病性银屑病，格雷夫斯氏病(Graves′disease)，格雷夫斯氏眼病(Graves′ophthalmopathy)，硬皮病，系统性硬皮症，哮喘，变态反应症，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，原发性粘液性水肿，交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，肝炎，慢性活动性肝炎，胶原疾病，强直性脊柱炎，肩周炎，结节性全身动脉炎，软骨钙质沉着病，韦格纳氏肉芽肿病，显微镜下型多血管炎，慢性荨麻疹，大疱性皮肤病，类天疱疮，异位性湿疹，德维克氏病(Devic′s disease)，儿童自身免疫性溶血性贫血，难治性或慢性自身免疫性血细胞减少，预防自身免疫性抗因子VIII抗体在获得性血友病A中的发展，冷凝集素病，视神经脊髓炎，僵硬人综合征(Stiff Person Syndrome)，龈炎，牙周炎，胰腺炎，心肌炎，血管炎，胃炎，痛风，痛风性关节炎，和炎性皮肤疾患，选自由以下组成的组：银屑病，异位性皮炎，湿疹，红斑，荨麻疹，和痤疮，正常补体型荨麻疹血管炎，心包炎，肌炎，抗合成酶综合征，巩膜炎，巨噬细胞活化综合征，黑奇特氏综合征(Bechet′sSyndrome)，PAPA综合征(PAPA Syndrome)，布劳氏综合征(Blau′sSyndrome)，痛风，成人和儿童斯蒂尔病(adult and juvenile Still′s disease)，冷吡啉病(cryropyrinopathy)，穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)，家族性寒冷引起自身炎症性综合征(familial cold-induced auto-inflammatorysyndrome)，新生儿发病多系统炎症性疾病，家族性地中海热，儿童慢性神经病，皮肤和关节综合征，全身型幼年特发性关节炎，高免疫球蛋白D综合征，Schnitzler氏综合征，和肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(TRAPS)，炎性肠病，古德帕斯彻综合征(Good pasture′s syndrome)，恶性贫血，自身免疫性萎缩性胃炎，溃疡性结肠炎，混合性结缔组织病，结节性全身动脉炎，进行性全身性硬皮病，消化性溃疡，溃疡，慢性支气管炎，急性肺损伤，肺部炎症，气道高反应性，败血性休克，炎症性皮肤病，肌硬结、软骨钙质沉着病、甲状腺炎、变应性水肿、肉芽肿、与移植排斥相关的免疫疾患，比如急性和慢性器官移植排斥、异基因干细胞移植、自体干细胞移植、骨髓移植和移植物抗宿主病。
如本文所用的，术语“治疗”指所提供的用来减轻疾病的护理和指治疗处理或预防(prophylactic/preventative)措施，其中目的是为了防止或减缓(减轻)目标病理病症或疾患。需要治疗的那些对象包括已患有疾患的那些对象以及易于患该疾患的那些对象或其中该疾患有待于被预防的那些对象。本文所用的术语治疗还指“维持疗法”，其为在病理病症或疾患经起始疗法消失后给予的防止病理病症或疾患复发的治疗。
术语“治疗有效量”指根据本发明的剂在哺乳动物中有效治疗疾病或疾患的量。
如本文所用的，术语“诊断”指通过其征兆、症状和尤其是从不同诊断程序的结果中鉴定医学病症或疾病的过程，所述多种诊断程序包括，例如，在获自个体的生物样品中(例如，如以下所定义的，在细胞、组织或血清中)检测根据本发明的至少一些实施方案的核酸或多肽的表达。并且，如本文所用的术语“诊断”包括筛查疾病、检测疾病的存在或严重度、将疾病与其它疾病相区分，所述其它疾病包括可能以一种或多种相似或相同的症状为特征的那些疾病、提供疾病的预后、检测疾病进展或复发、以及疾病、疾患或病症的治疗效果和/或复发的评估、以及选择疾病的疗法和/或治疗、疾病的给定疗法的优化、监测疾病的治疗、和/或预测疗法对于特定患者或亚群的适合性或测定治疗产品在患者或亚群中的合适剂量给药。诊断程序可在体内或体外进行。应注意地是“获自受治疗者的生物样品”还可任选地包括未从受治疗者中物理上移除的样品。
如本文所用的，术语“联合疗法”指为治疗单一疾病两种或多种药物或疗法类型的同时施用或连续施用。特别地，该术语指根据本发明的至少一些实施方案的多肽、多核苷酸、抗体或药物组合物中的任何一种与至少一种另外的药物或疗法联合使用。因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的剂的疾病的治疗可与本领域熟知的疗法联合，所述本领域熟知的疗法包括但不局限于，放射性疗法、抗体疗法、化学疗法或外科手术，或可与其它生物制剂、常规药物、抗癌剂、免疫抑制剂、癌症的细胞毒性药物、化学治疗剂进行联合治疗。根据本发明的至少一些实施方案，使用根据本发明的至少一些实施方案的剂的多发性骨髓瘤的治疗可与包括但不局限于美法仑(Melphalan)、强的松(prednisone)、沙利度胺(thalidomide，MPT)或硼替佐米(combination Bortezomib，Velcade)联合美法仑和强的松(VMP)或来那度胺(Lenalidomide)和低剂量地塞米松(dexamethasone)的组合的剂相联合。
根据至少一些实施方案，使用根据本发明的至少一些实施方案的剂的卵巢癌的治疗可与包括但不局限于紫杉醇和顺铂的剂相联合。
根据至少一些实施方案，使用根据本发明的至少一些实施方案的剂的类风湿性关节炎疾病的治疗可与以下相联合但不局限于此：利用诸如阿司匹林(aspirin)和可的松(cortisone，皮质类固醇)的药物的一线联合治疗，所述阿司匹林和强的松用来减少疼痛和炎症，和一种或多种二线联合药物，比如金、氨甲喋呤和羟氯喹(Plaquenil)，促进疾病的缓解并防止进行性关节破坏。根据至少一些实施方案，类风湿性关节炎的治疗可任选地以与包括但不局限于氨甲喋呤和利妥昔单抗的剂联合的根据本发明的剂为特征。
如本文所用的，术语“受治疗者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，比如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。
以下子章节进一步详细描述了本发明的多个方面。
核酸
如本文可互换使用的，“核酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指核酸残基的聚合物。根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸序列指分离的且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式提供的单链或双链核酸序列。
因此，本发明包括本文以上所描述的核酸序列；其片段、可与之杂交的序列、与其同源的序列[例如，与本文所列的核酸序列至少90％、至少95、96、97、98或99％或更高一致]、利用不同的密码子使用编码相似的多肽的序列、以诸如一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代的突变为特征的改变的序列，所述突变是天然存在的或随机地或以靶向方式人工诱导的。本发明还包括同源的核酸序列(即，形成根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸序列的一部分的核酸序列)，其包括根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸独有的序列区。
在根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸序列编码先前未鉴定的多肽的情况下，本发明还包括由本文以上所描述的分离的多核苷酸和其各自的核酸片段所编码的新型多肽或其部分。
因此，本发明还包括由根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸序列所编码的多肽。本发明还包括这些多肽的同源物，如可利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用缺省参数所测定的，这样的同源物与以下所列的氨基酸序列可以是至少90％、至少95、96、97、98或99％或更高同源的。最后，本发明还包括以上所描述的多肽和具有突变的多肽的片段，所述突变比如天然存在的或随机地或以靶向方式人工诱导的一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。
对于按照以上描述设计的本文所提供的序列中的任何一种，设计用于进行根据本发明的至少一些实施方案的方法的寡核苷酸可按照本领域已知的任何寡核苷酸合成方法来生成，所述方法比如酶促合成或固相合成。用于进行固相合成的设备和试剂可商业上获自，例如，Applied Biosystems。还可使用用于这样的合成的任何其它方式；寡核苷酸的实际合成在本领域技术人员的能力范围内。
根据本发明的至少一些实施方案根据这个方面所使用的寡核苷酸是具有选自从大约10到大约200碱基，任选地为大约15到大约150碱基，大约20到大约100碱基，或大约20到大约50碱基的范围的长度的那些。
根据本发明的至少一些实施方案的寡核苷酸可包括由嘌呤和嘧啶碱基组成的以3′到5′磷酸二酯键连接的杂环核苷酸。
肽
本文所可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可被修饰，例如，通过添加碳水化合物残基来形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”包括糖蛋白，以及非糖蛋白。
多肽产物可被生物化学合成，比如通过利用标准固相技术。这样的方法包括完全固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典液相合成。当肽相对短(即，10kDa)时和/或当肽不能通过重组技术来产生(即，不是由核酸序列所编码)时可任选地使用这些方法，且因此涉及不同化学反应。
固相多肽合成方法是本领域中熟知的且由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(固相肽合成)(第二版，Pierce Chemical Company，1984)进一步描述。
合成的多肽可通过制备型高效液相色谱来纯化[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles(蛋白、结构和分子原理).WHFreeman and Co.N.Y.]且其组成可通过氨基酸测序来验证。
当需要大量的多肽时，可利用重组技术来生成，比如由Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol.153：516-544，Studier等人(1990)Methodsin Enzymol.185：60-89，Brisson等人(1984)Nature 310：511-514，Takamatsu等人(1987)EMBO J.6：307-311，Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-1680和Brogli等人，(1984)Science 224：838-843，Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565和Weissbach & Weissbach，1988，Methods for PlantMolecular Biology(植物分子生物学方法)、Academic Press，NY，VIII章，第421页-第463页所描述的。
应理解根据本发明的至少一些实施方案的肽可以是降解产物、合成肽或重组肽以及肽模拟物，通常，合成的肽和类肽和半类肽是肽类似物，其可以具有，例如，使肽在体内更稳定或使肽更有能力渗入细胞的修饰。这样的修饰包括，但不局限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰，包括，但不局限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、骨架修饰和残基修饰。用于制备肽模拟物化合物的方法是本领域中熟知的，并且在，例如，Quantitative Drug Design(定量药物设计)，C.A.Ramsden Gd.，17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992)中详细说明，其在此通过引用并入如同其被完整列出。在此方面进一步的详细描述在以下提供。
肽内的肽键(-CO-NH-)可被例如以下取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)、其中R为诸如甲基的任意的烷基，carba键(-CH2-NH-)，羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)，硫代酰胺键(-CS-NH-)，烯烃双键(-CH＝CH-)，逆酰胺键(-NH-CO-)，肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常的”侧链。
这些修饰可发生在沿肽链的任何键上且甚至同时发生在一些(2-3)上。
天然芳香氨基酸、Trp、Tyr和Phe可被合成的非天然酸所取代，所述非天然酸比如苯基甘氨酸、TIC、萘基甘氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或o-甲基-Tyr。
除以上之外，根据本发明的至少一些实施方案的肽还可包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复合糖等)。
如在本文的说明书和以下的权利要求书部分中所用的，术语“氨基酸(amino acid/amino acids)”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；在体内常被翻译后修饰的那些氨基酸，包括，例如，羟脯氨酸，磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，以及其他不常见氨基酸，包括但不局限于，2-氨基己二酸，羟赖氨酸、异锁链素、正-缬氨酸，正-亮氨酸和鸟氨酸。并且，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
根据本发明的至少一些实施方案的肽可包括一个或多个非天然的或天然的极性氨基酸，包括但不局限于丝氨酸和苏氨酸，它们由于其含羟基的侧链而能够提高肽溶解度。
根据本发明的至少一些实施方案的肽可被生物化学合成，比如通过利用标准固相技术。这些方法包括完全固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典液相合成。当肽相对短(即，10kDa)时和/或当肽不能通过重组技术来产生(即，不是由核酸序列所编码)时可任选地使用这些方法，且因此涉及不同化学反应。
固相多肽合成方法是本领域中熟知的且由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(固相肽合成)(第二版，Pierce Chemical Company，1984)进一步描述。
合成的肽可通过制备型高效液相色谱来纯化[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles(蛋白、结构和分子原理).WHFreeman and Co.N.Y.]且其组成可通过氨基酸测序来验证。
当需要大量的根据本发明至少一些实施方案的肽时，可利用重组技术来生成肽，比如由Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol.153：516-544，Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185：60-89，Brisson等人(1984)Nature 310：511-514，Takamatsu等人(1987)EMBO J.6：307-311，Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-1680和Brogli等人，(1984)Science224：838-843，Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565和Weissbach& Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)、Academic Press，NY，VIII章，第421页-第463页所描述的。
多肽的重组表达
将异源多核苷酸导入到哺乳动物细胞的方法是本领域中熟知的，且包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，聚凝胺介导的转染，原生质体融合，电穿孔，多核苷酸在脂质体中的包封，基因枪注射(biolistic injection)和DNA直接微注射到核。此外，可通过病毒载体将核酸分子导入到哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域中熟知的。参见，例如，美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号、和第4,959,455号(所述专利在此通过引用并入)。转化植物细胞的方法是本领域中熟知的，包括，例如，农杆菌介导的转化，基因枪转化，直接注射，电穿孔和病毒转化。转化细菌细胞和酵母细胞的方法也是本领域中熟知的。
作为用于表达的宿主可获得的哺乳动物细胞系是本领域中熟知的并包括许多从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的永生化的细胞系。这些包括，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，A549细胞、3T3细胞、和许多其它的细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、狗细胞、猴细胞、猪细胞、山羊细胞、牛细胞、马细胞和仓鼠细胞。通过测定哪个细胞系具有高表达水平而选择特别优选的细胞系。可使用的其它细胞系为昆虫细胞系比如Sf9细胞、两栖类动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当编码根据本发明的至少一些实施方案的多肽或其片段的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养一段足够的时间以允许多肽在宿主细胞中的表达，或者更优选地，多肽分泌到宿主细胞生长的培养基中，从而产生多肽。可利用标准蛋白纯化方法从培养基中回收多肽。植物宿主细胞包括，例如，烟草(Nicotiana)、拟南芥(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦，马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌(Streptomyces)。酵母宿主细胞包括裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
此外，来自生产细胞系的根据本发明的至少一些实施方案的多肽(或由其衍生的其它部分)的表达可利用许多已知的技术来增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下用于增强表达的常见方法。GS系统在欧洲专利第0 216 846号、第0 256 055号、第0 338 841号和第0 323 997号中被完整地或部分地讨论。
由不同的细胞系或转基因动物中表达的多肽可能将具有不同的糖基化形式。然而，所有由本文所提供的核酸分子编码的多肽，或包含本文所提供的氨基酸序列的多肽，无论其糖基化形式如何，都是本发明的一部分。
载体
根据至少一些实施方案，本发明提供了包含编码本发明的至少一些实施方案的多肽、融合蛋白、修饰的多肽和多肽片段的核酸分子的载体。
为表达根据本发明的至少一些实施方案的多肽，或其片段，将按以上描述获得的编码部分或全长多肽的DNA插入到表达载体中而使基因可操作地连接到转录和翻译调控序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒，比如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒，粘粒、YAC、EBV来源附加体和类似物。将基因连接到载体中从而载体中的转录和翻译调控序列行使其调节基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。通过标准方法将基因插入到表达载体中(例如，基因片段和载体上的互补性的限制性位点的连接，或如果不存在限制性位点时的平末端连接)。
方便的载体是编码功能完整序列的载体，具有工程化(engineered)的合适限制性位点，从而如以上所描述的任何序列可易于被插入和表达。在编码区下游的天然染色体位点上发生聚腺苷酸化和转录终止。重组表达载体还可编码协助多肽从宿主细胞分泌的信号肽。可将基因克隆到载体中而使信号肽框内(in-frame)连接到基因的氨基端。
除了根据本发明的至少一些实施方案的核酸之外，重组表达载体携带调控基因在宿主细胞中表达的调控序列。本领域技术人员将理解的是，表达载体的设计，包括调控序列的选择可取决于诸如待被转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物细胞表达的优选的调控序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平的蛋白表达的病毒元件，比如来源于逆转录病毒LTR的启动子和/或增强子、巨细胞病毒(CMV)(比如CMV启动子/增强子)、猿猴肾病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))，多瘤病毒启动子和强哺乳动物启动子，比如天然免疫球蛋白启动子和肌动蛋白启动子。关于病毒调控元件和其序列的进一步的描述，参见，例如，美国专利第5,168,062号、第4,510,245号和第4,968,615号，其每一个在此通过引用并入。在细菌细胞或在诸如酵母细胞的真菌细胞中表达多肽的方法也是本领域中熟知的。
除了根据本发明的至少一些实施方案的核酸和调控序列之外，根据本发明的至少一些实施方案的重组表达载体可携带另外的序列，比如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如，复制起始点)和选择标记基因。选择标记基因协助被导入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。例如，通常选择标记基因在被导入载体的宿主细胞上赋予对药物的抗性，所述药物比如G418、潮霉素或氨甲喋呤。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、neo基因(对于G418选择)，和谷氨酸合成酶基因。
蛋白质修饰
融合蛋白
本发明包括用于治疗的融合蛋白(轭合物)，所述融合蛋白含有TMEM154可溶部分包括胞外域或其部分或变体。举例而言，本发明包括其中TMEM154的ECD被连接到免疫球蛋白或其片段上的轭合物。本发明考虑了其用于治疗本文所描述的癌症和/或免疫相关病症、疾病或疾患的用途。
根据至少一些实施方案，融合蛋白可从根据本发明的至少一些实施方案的蛋白通过与包含免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白的部分相融合来制备。任选地，免疫球蛋白的部分包含重链恒定区，其任选地和更为优选地为人类重链恒定区。重链恒定区任选地为IgG重链恒定区，且任选地为Fc链，或包括CH2和CH3结构域的IgG Fc片段。虽然可任选地使用任何IgG亚型，IgG1亚型是优选的。Fc链可任选地为已知的或“野生型”Fc链，或可替代地为突变的。非限制性的、例证性的、示例性的突变类型在2006年2月16日公开的美国临时专利申请第20060034852号中被描述，在此通过引用并入如同其被完整列出。术语“Fc链”任选地还包括Fc片段的任何类型。
在IgG亚类中对抗体恒定区介导的活性重要的几个特定的氨基酸残基已被鉴定。因此，这些特定氨基酸的加入、取代或排除允许特定免疫球蛋白恒定区介导的活性的加入或排除。并且，特定的改变可导致对Fc链的去糖基化(举例而言)和/或其它所期望的改变。如以下所更加详细描述的，可任选地生成至少一些改变来阻止被认为是不希望的Fc功能，比如不希望的免疫系统效应。
可对Fc进行的调节融合蛋白的活性的突变的非限制性的、例证性的实例包括以下的改变(依照由Kabat给出的Fc序列命名法来给出，来自Kabat EA等人：Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上感兴趣的蛋白序列).US Department of Health and Human Services(美国健康与人类服务部)，NIH，1991)：220C-＞S；233-238ELLGGP-＞EAEGAP；265D-＞A，优选地与434N-＞A；297N-＞A结合(例如以阻止N-糖基化)；318-322EYKCK-＞AYACA；330-331AP-＞SS；或其组合(关于这些突变和它们的效应的描述，参见例如M.Clark，“Chemical Immunol and AntibodyEngineering”(化学免疫和抗体工程)，第1页-第31页)。以以上的改变为特征的Fc链的构建体任选地且优选地包括铰链区与CH2和CH3结构域的组合。
可任选地进行以上的突变以增强所期望的性质或可选地以阻止非所期望的性质。例如，显示了抗体的去糖基化在阻止T细胞的消除或触发细胞因子释放(可任选地为不希望的功能)的同时维持了所需的结合功能性(参见M.Clark，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(化学免疫和抗体工程)，第1页-第31页)。331位脯氨酸取代为丝氨酸可阻止激活补体的能力，该能力可任选地被认为是不希望的功能(参见M.Clark，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(化学免疫和抗体工程)，第1页-第31页)。将该改变与330位丙氨酸变为丝氨酸的改变组合也可增强希望的阻止激活补体的能力的效应。
已显示残基235和237参与了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，从而如果ADCC被认为是不希望的功能，改变如所述的从233-238的残基的阻遏也可阻止这种活性。
对于来自IgG1的Fc，残基220通常是半胱氨酸，在该位点重链与轻链形成共价连接。任选地，该残基可被改变为丝氨酸，以避免任何类型的共价连接(参见M.Clark，“Chemical Immunol and Antibody Engineering”(化学免疫和抗体工程)，第1页-第31页)
以上对残基265和残基434的改变可任选地进行以减少或阻止与Fc受体的结合，其可任选地阻止与Fc的免疫系统功能相关的不希望的Fc的功能性(参见，“Binding site on Human IgG1 for Fc Receptors(人类IgG1上的Fc受体结合位点)”，Shields等人，第276卷，第6591页-第6604页，2001)。
以上的改变仅作为可选的改变的示例并不意在以任何方式进行限制。并且，以上所提供的解释仅为描述的目的，并不希望被单一假说所束缚。
基团的添加
如果根据本发明的蛋白是线性分子，可能地是将多种官能团置于易被化学修饰或适宜于被化学修饰的该线性分子的多个位点。可将官能团添加到根据本发明的至少一些实施方案的蛋白的线性形式的末端。在一些实施方案中，官能团在一个或多个特性方面提高了蛋白的活性，包括但不局限于：提高的稳定性、渗透性(穿过细胞膜和/或组织屏障)、组织定位、效力、降低的清除率、降低的毒性、提高的选择性、对细胞泵排出的抗性的提高和类似的方面的增强。为方便起见且不希望为限制性的，根据本发明的至少一些实施方案的组合物中所含有的序列的其中之一的游离的N-末端将被称为组合物的N-末端，而序列的游离C末端被认为是组合物的C末端。可将序列的C-末端或N-末端，或二者分别连接至羧酸官能团或胺官能团。
适宜的官能团的非限制性实例在Green和Wuts，“Protecting Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基团)”，John Wiley和Sons，第5章和第7章，1991中被描述，其教导在此通过引用并入。优选的保护基团是协助所连接的活性组分运输到细胞中的那些，例如，通过降低活性组分的亲水性并提高活性组分的亲油性来进行协助，这些基团是“用于穿过细胞膜运输的部分”的实例。
这些部分可任选地在细胞中通过水解或酶解在体内被裂解。(Ditter等人，J.Pharm.Sci.57：783(1968)；Ditter等人，J.Pharm.Sci.57：828(1968)；Ditter等人，J.Pharm.Sci.58：557(1969)；King等人，Biochemistry 26：2294(1987)；Lindberg等人，Drug Metabolism and Disposition 17：311(1989)；和Tunek等人，Biochem.Pharm.37：3867(1988)，Anderson等人，Arch.Biochem.Biophys.239：538(1985)和Singhal等人，FASEB J.1：220(1987))。羟基保护基团包括酯保护基团、碳酸酯保护基团和氨基甲酸酯保护基团。如以上关于N-末端保护基团所描述的，胺保护基团包括烷氧基和芳氧基羰基基团。如以上关于C-末端保护基团所描述的，羧酸保护基团包括脂肪族酯、苄基酯和芳基酯。在一个实施方案中，在根据本发明的至少一些实施方案的组合物中的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链中的羧酸基团是被保护的，任选地利用甲酯、乙酯、苄基酯或取代的苄基酯。
N-末端保护基团的非限制性的示例性的实例包括酰基基团(-CO-R1)和和烷氧基羰基基团或芳氧基羰基基团(-CO-O-R1)，其中R1是脂族基、取代的脂族基、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基。酰基的具体实例包括但不局限于乙酰基、(乙基)-CO-、正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬酯酰基、油酰苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苄基-CO-和(取代的苄基)-CO-。烷氧基羰基和芳氧基羰基基团的实例包括CH3-O-CO-、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO-、异丙基-O-CO-、正丁基-O-CO-、仲丁基-O-CO-、叔丁基-O-CO-、苯基-O-CO-、取代的苯基-O-CO-和苄基-O-CO-，(取代的苄基)-O-CO-、金刚烷、萘、肉豆蔻烯醇基、甲苯、联苯、肉桂酰基、硝基苯甲酰、甲苯酰基、糠酰、苯甲酰基、环己烷、降莰烷、或Z-己酸(Z-caproic)。为协助N-酰化，一个到四个甘氨酸残基可存在于分子的N-末端。
化合物的C-末端的羧基基团可被保护，例如，通过以下的基团来保护，包括但不局限于酰胺(即，C-末端的羟基基团被-NH2、-NHR2和-NR2R3所替代)或酯(即，C-末端的羟基基团被-OR2所替代)。R2和R3任选地独立为脂族基、取代的脂族基、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基。此外，R2和R3可任选地与氮原子共同形成具有大约0-2个另外的杂原子的C4-C8杂环，所述杂原子比如氮、氧或硫。适宜的杂环的非限制性的适宜的实例包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基或哌嗪基。C-末端保护基团的实例包括但不局限于-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基)2、-N(甲基)(乙基)，-NH(苄基)，-N(C1-C4烷基)(苄基)，-NH(苯基)，-N(C1-C4烷基)(苯基)，-OCH3、-O-(乙基)，-O-(正丙基)，-O-(正丁基)，-O-(异丙基)，-O-(仲丁基)，-O-(叔丁基)，-O-苄基和-O-苯基。
肽模拟物部分的取代
“肽模拟物有机部分”可任选地作为保守性取代或非保守性取代来取代本发明的组合物中的氨基酸残基。这些部分也称为“非天然氨基酸”并可任选地替代氨基酸残基、氨基酸或在肽内作为间隔基团替代缺失的氨基酸。肽模拟物有机部分任选地具有与被替代的氨基酸相似的空间性质、电子性质或构型性质并且这样的肽模拟物被用来在重要的位置替代氨基酸，并被认为是保守性取代。然而这样的相似性不是必需的。根据本发明的至少一些实施方案，一个或多个肽模拟物选择为使得组合物与根据本发明的天然蛋白相比至少基本上保留其生理活性。
肽模拟物可任选地被用来抑制通过酶解过程或其它降解过程的肽的降解。肽模拟物可任选地由有机合成技术来产生。适宜的肽模拟物的非限制性的实例包括对应的L氨基酸的D氨基酸、四唑(Zabrocki等人，J.Am.Chem.Soc.110：5875-5880(1988))；酰胺键的等排体(Jones等人，Tetrahedron Lett.29：3853-3856(1988))；LL-3-氨基-2-丙二酮-6-羧酸(LL-Acp)(Kemp等人，J.Org.Chem.50：5834-5838(1985))。相似的类似物显示于Kemp等人，Tetrahedron Lett.29：5081-5082(1988)和Kemp等人，Tetrahedron Lett.29：5057-5060(1988)，Kemp等人、Tetrahedron Lett.29：4935-4938(1988)和Kemp等人，J.Org.Chem.54：109-115(1987)。其它适宜的但示例性的肽模拟物显示于Nagai和Sato，Tetrahedron Lett.26：647-650(1985)；Di Maio等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.，1687(1985)；Kahn等人，Tetrahedron Lett.30：2317(1989)；Olson等人，J.Am.Chem.Soc.112：323-333(1990)；Garvey等人，J.Org.Chem.56：436(1990)。另外的适宜的示例性肽模拟物包括羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，J.Takeda Res.Labs 43：53-76(1989))；1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，J.Am.Chem.Soc.133：2275-2283(1991))；组氨酸异喹啉酮羧酸(HIC)(Zechel等人，Int.J.Pep.Protein Res.43(1991))；(2S、3S)-甲基-苯丙氨酸，(2S、3R)-甲基-苯丙氨酸，(2R、3S)-甲基-苯丙氨酸和(2R、3R)-甲基-苯丙氨酸(Kazmierski和Hruby，Tetrahedron Lett.(1991))。
示例性的、例证性的但非限制性的非天然氨基酸包括β-氨基酸(β3和β2)，高氨基酸、环状氨基酸、芳香族氨基酸、脯氨酸和酪氨酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、链状核心氨基酸(linear core amino acid)或二氨基酸。它们可从多个供应商获得，比如Sigma-Aldrich(USA)。
化学修饰
在本发明中，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白的任何部分可任选地被化学修饰，即，通过官能团的添加而改变。例如出现在天然序列中的侧链氨基酸残基可任选地被修饰，虽然如以下所描述的，可选地，蛋白的其它部分也可任选地被修饰，以附加或替代侧链氨基酸残基的方式。如果按照化学合成过程，修饰可任选地在分子的合成过程中进行，例如通过添加化学修饰的氨基酸来添加。然而，对已经在分子中存在的氨基酸的化学修饰(“原位”修饰)也是可能的。
分子的任何序列区域的氨基酸可任选地根据以下示例性的修饰类型中的任何一种来修饰(概念上在肽中被看作是“化学修饰”)。非限制性的示例性的修饰类型包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键可任选地被用来将丝氨酸或苏氨酸羟基连接至糖的羟基。酰胺键可任选地用来将谷氨酸羧基或天冬氨酸羧基连接至糖上的氨基(Garg和Jeanloz，Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry，第43卷，AcademicPress(1985)；Kunz、Ang.Chem.Int.Ed.English 26：294-308(1987))。也可任选地在氨基酸和碳水化合物之间形成缩醛和缩酮键。可任选地生成脂肪酸酰基衍生物，例如，通过游离氨基基团(例如，赖氨酸)的酰化来生成(Toth等人，Peptides：Chemistry、Structure and Biology(肽：化学、结构和生物)，Rivier和Marshal，编辑，ESCOM Publ.，Leiden、1078-1079(1990))。
如本文所用的术语“化学修饰”，当指根据本发明的蛋白或肽时，指蛋白或肽中的氨基酸残基中的至少一个被天然过程或被本领域熟知的化学修饰技术所修饰，所述天然过程比如加工或其它翻译后修饰。多种已知的修饰的实例通常包括，但不局限于：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化，糖基化，GPI锚形成、脂质或脂质衍生物的共价连接，甲基化，十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化，泛素化或任何相似的过程。
其它修饰类型任选地包括将环烷烃部分添加至诸如蛋白的生物分子，如PCT申请第WO 2006/050262号中所描述的，在此通过引用并入如同其被完整列出。这些部分被设计用于与生物分子一起使用并可任选地被用于赋予蛋白多种性质。
并且，任选地，蛋白上的任何位点可被修饰。例如，蛋白上的糖基化部分可任选地进行聚乙二醇化，如PCT申请第WO 2006/050247号中所描述的，在此通过引用并入如同其被完整列出。可任选地将一个或多个聚乙二醇基团添加到O-连接的和/或N-连接的糖基化中。PEG基团可任选地为分支的或线性的。可任选地将任何类型的水溶性聚合物通过糖基连接体连接到蛋白的糖基化位点上。
改变的糖基化
根据本发明的至少一些实施方案的蛋白可被修饰而具有改变的糖基化形式(即，从原始的或天然的糖基化形式改变)。如本文所用的，“改变的”意思是一个或多个碳水化合物部分被去除和/或至少一个糖基化位点被添加至原始蛋白。
蛋白的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分连接到天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任何一个的存在创建了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖其中之一连接至羟基氨基酸，所述羟基氨基酸最常见的为丝氨酸或苏氨酸，虽然5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可被使用。
将糖基化位点添加到根据本发明的至少一些实施方案的蛋白通过改变蛋白质的氨基酸序列而使其含有一个或多个上述的三肽序列而方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。改变还可通过在原始蛋白的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或被取代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来生成(对于O-连接的糖基化位点)。蛋白的氨基酸序列还可通过在DNA水平上导入改变来改变。
提高蛋白上的碳水化合物部分的数量的另外的方式是通过将糖苷化学偶联或酶偶联至蛋白的氨基酸残基。依照所用的偶联方式，可将糖连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离的羧基基团，(c)游离的硫氢基基团比如半胱氨酸的那些，(d)游离的羟基基团比如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO 87/05330中和在Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，22：259-306(1981)中被描述。
将根据本发明的至少一些实施方案的蛋白上存在的任何碳水化合物部分除去可通过化学方法或酶促方法来完成。化学方法去糖基化需要将蛋白暴露于三氟甲磺酸或等效的化合物。这种处理导致了除连接的糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外绝大多数或所有糖的裂解，而保持氨基酸序列不受影响。
化学方法去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)；和Edge等人，Anal.Biochem.，118：131(1981)所描述。蛋白上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用多种内切糖苷酶或外切糖苷酶来实现，如由Thotakura等人，Meth.Enzymo1.，138：350(1987)所描述的。
使用TMEM154多肽和蛋白治疗的方法
如本文以上所述，根据本发明的至少一些实施方案的TMEM 154蛋白和多肽，或其核酸序列或片段，尤其是TMEM 154蛋白和多肽的胞外域或分泌性形式，可用来治疗癌症，包括但不仅限于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌，和/或免疫相关病症或疾患。
因此，根据本发明的至少一些实施方案提供了治疗癌症，和/或免疫相关病症或疾患的方法。
如本文所用的术语“治疗”指预防、治愈、逆转、削弱、减轻、最小化、抑制或阻止上述疾病、疾患或病症的有害效应。本文所用的术语治疗还指“维持治疗”，其为在病理病症或疾患经起始疗法消失后给予的防止病理病症或疾患复发的治疗。
根据本发明的治疗可通过特异性上调受治疗者中根据本发明的至少一些实施方案的多肽的表达而实现。
任选地，如本文所描述的上调可通过向受治疗者施用根据本发明的至少一些实施方案的多肽(例如，重组的或合成的)的至少一种或其活性部分来实现。然而，因为大型多肽的生物利用率由于高降解率和低渗透率可能潜在相对较小，多肽的施用优选地限于小型肽片段(例如，大约100氨基酸)。如以下更详细地描述的，多肽或肽可任选地作为药物组合物的部分来施用。
应理解地是，根据本发明的上述疾病的治疗可与本领域已知的其它治疗方法相组合(即，联合疗法)。
抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体
根据本发明的至少一些实施方案的抗体，包括具有特定的种系序列的那些抗体、同源抗体、具有保守性修饰的抗体、工程化的和修饰的抗体，通过抗体的特定的功能特征或性质来表征。例如，抗体特异性结合人KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽。任选地，根据本发明的至少一些实施方案的抗体以高亲和性结合对应的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽，例如以10-8M或更小或10-9M或更小或甚至10-10M或更小的KD来结合。根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体任选地表现出以下特点的一种或多种：
(i)以5.X10-8M或更小的KD结合对应的人KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽中的一种；
(ii)结合由癌细胞表达的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原中的一种，所述癌细胞包括例如卵巢癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和血液系统恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、白血病、T细胞白血病，但基本上不与正常细胞结合。此外，任选地，这些抗体和其轭合物将有效地引起这样的癌细胞的选择性杀伤和有效地用于调节自身免疫作用和癌症所涉及的免疫反应。
任选地，抗体以3X10-8M或更小的KD或以1X10-9M或更小的KD或以0.1X10-9M或更小的KD或以0.05X10-9M或更小的KD或以1X10-9和1X10-11M之间的KD结合对应的人KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原中的一种。
评估抗体对于KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的结合能力的标准测定是本领域中已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹和RIA。适宜的测定在实施例中被详细描述。抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)也可通过本领域中已知的标准测定来评估，比如通过Biacore分析来评估。
从能够结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的抗体产生抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体序列后，可将VH和VL序列“混合和匹配”以生成其它的根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154结合分子。这种“混合和匹配”抗体的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154结合可利用以上所描述的诸如ELISA的结合测定来检验。任选地，当VH和VL链混合和匹配时，来自特定的VH/VL对的VH序列被结构上相似的VH序列所替代。同样地，任选地，来自特定的VH/VL对的VL序列被结构上相似的VL序列所替代。例如，同源抗体的VH和VL序列尤其顺从于混合和匹配。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体包括来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如本文所用的，如果人类抗体的可变区从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得，则该抗体包括为特定的种系序列的产物或来源于特定的种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括利用感兴趣的抗原免疫携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用感兴趣的抗原筛选人类免疫球蛋白噬菌体展示基因库。作为人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可通过比较该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列上最接近该人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列来鉴定。
作为人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可包含与种系序列相比的氨基酸差异，所述氨基酸差异是由，例如，天然存在的体细胞突变或定点突变的有意导入导致的。然而，所选择的人类抗体通常在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，小鼠种系序列)对比时证明人类抗体为人类的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体可在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，来源于特定的人类种系序列的人类抗体将显示不超过10个不同于由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的氨基酸差异。在某些情况下，人类抗体可显示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个不同于由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列的氨基酸差异。
同源抗体
在又一个另外的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含与优选的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体的分离的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A、抗TMEM154氨基酸序列分别同源的氨基酸序列，其中所述抗体保留了亲本抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A、抗TMEM154抗体的所需功能性质。
如本文所用的，两个氨基酸序列之间的百分比同源性与两个序列之间的百分比同一性是相等的。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目X100)，并考虑到为两个序列的最优比对而需引入的空位数目和每个空位的长度。如以下的非限制性实例中所描述的，两个序列的序列对比和百分比同一性的测定可利用数学算法来完成。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可利用并入到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))来测定，利用PAM120权重残基表(weight residue table)，空位长度罚值(gap length penalty)12和空位罚值(gap penalty)4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可利用并入到GCG软件包(可商业上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法来测定，利用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和空位权重(gap weight)16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。
另外地或可选地，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白序列还可用作“检索序列”来进行对公共数据库的搜索以例如鉴定相关序列。这样的搜索可利用Altschul等人，(1990)J Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。BLAST蛋白搜索可利用XBLAST程序，分值(score)＝50，字长(wordlength)＝3来获得与根据本发明的至少一些实施方案的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于对比目的的空位比对，可利用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所描述的Gapped BLAST程序。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体包括含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包括基于利用本文的方法所分离和产生的优选的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体，或其保守性修饰的具体的氨基酸序列，并且其中所述抗体各自保留了根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体的所需功能性质。
在多个实施方案中，抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体可以是，例如，人类抗体、人源化抗体或嵌合的抗体。
如本文所用的，术语“保守性序列修饰”意指不明显影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术将修饰导入到根据本发明的至少一些实施方案的抗体中，所述标准技术比如定点突变和PCR介导诱变。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被确定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，根据本发明的至少一些实施方案的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基所取代，并可利用本文所描述的功能测定检验改变的抗体的保留的功能(即，以上(c)到(j)所列的功能)。
工程化的和修饰的抗体
根据本发明的至少一些实施方案的抗体可利用具有来源于抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体起始材料的VH和/或VL序列中的一个或多个的抗体以工程化为修饰的抗体而制备，所述修饰的抗体可具有不同于起始抗体的改变的性质。可通过修饰一个可变区或两个可变区(即，VH和/或VL)内的一个或多个残基来工程化抗体，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内。另外地或可选地，可通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如以改变抗体的效应功能。
可进行的可变区工程化的一个类型是CDR移植(CDR grafting)。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。基于此原因，各个抗体之间的CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责绝大部分的抗体-抗原相互作用，可能地是通过构建包括以下CDR序列的表达载体来表达模拟特殊的天然存在的抗体的性质的重组抗体，该CDR序列来自特定的天然存在的抗体，移植到来自具有不同性质的不同的抗体的构架序列上。(参见，例如Riechmann，L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等人(1986)Nature321：522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；授予Winter的美国专利第5,225,539号，和授予Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。
适宜的构架序列可从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在以下中查找：“VBase”人类种系序列数据库(可在互联网上获得)，以及Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学上感兴趣的蛋白序列)，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services(美国健康与人类服务部)，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops(人类种系VH序列的全部组成揭示了大约50类具有不同高变环的VH片段)”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a StrongBias in their Usage(人类种系VH片段的目录揭示了其使用的强烈偏好)”Eur.J Immunol.24：827-836；其每一个的内容在此通过引用明确并入。
可变区修饰的另一类型是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基进行突变，从而以提高感兴趣的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲合性)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响可在适当的体外或体内测定中来评估。任选地引入保守性修饰(如以上所讨论的)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但优选地为取代。并且，通常CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
根据本发明的至少一些实施方案的工程化的抗体包括其中对VH和/或VL内的构架残基作出修饰的抗体，例如，以改良抗体的性质。通常作出这样的构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”到对应的种系序列。更具体地，经历体细胞突变的抗体可能含有不同于该抗体来源的种系序列的构架残基。这样的残基可通过将抗体构架序列与该抗体来源的种系序列相对比来鉴定。
除在构架内或CDR区内作出的修饰外，或替代在构架内或CDR区内作出的修饰，根据本发明的至少一些实施方案的抗体可被工程化以包括Fc区内的修饰，通常为改变抗体的一种或多种功能性质，比如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖的细胞的细胞毒性。并且，根据本发明的至少一些实施方案的抗体可被化学修饰(例如，可将一种或多种化学部分连接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，同样为改变抗体的一种或多种功能性质。以下进一步描述了这样的实施方案。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引中的编号。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰而使铰链区中的半胱氨酸残基数目改变，例如，增多或减少。该方法在由Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中被进一步描述。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目以，例如，协助轻链和重链的组装或以提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入到Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域交界区而使抗体相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有削弱的SpA结合。该方法在Ward等人的美国专利第6,165,745号中被进一步详细描述。
在另一个实施方案中，抗体被修饰以提高其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，以下突变的一个或多个可被导入：T252L、T254S、T256F，如授予Ward的美国专利第6,277,375号中所描述的。可选地，为提高生物学半衰期，可在CH1或CL区内对抗体进行改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救的受体结合表位，如在Presta等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所描述的。
在又一个另外的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，可利用不同的残基替代选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸残基而使抗体具有对效应配体改变的亲和性，但保留了亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和性改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中被进一步详细描述。
在另一个实例中，可利用不同的氨基酸残基取代选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸而使抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中被进一步详细描述。
在另一个实例中，氨基酸第231位和第239位中的一个或多个氨基酸残基被改变从而改变了抗体结合补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中被进一步详细描述。
在又一个另外的实例中，通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对于Fcy受体的亲和性：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在Presta的PCT公布WO00/42072中被进一步详细描述。并且，人类IgG1上对于Fcγr、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被绘制并且具有提高的结合的变体已被描述(参见Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。已显示第256位、第290位、第298位、第333位、第334位和第339位上的特定突变提高了对于FcyRIII的结合。此外，已显示以下的组合突变体提高了FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一个实施方案中，抗体的糖基化被修改。例如，可生成去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。糖基化可被改变以，例如，提高抗体对于抗原的亲和性。这样的碳水化合物修饰可通过，例如，改变抗体序列中的糖基化的一个或多个位点来实现。例如，可生成一个或多个氨基酸取代从而导致一个或多个可变区构架糖基化位点的消除因此在那个位点消除糖基化。这样的去糖基化可提高抗体对于抗原的亲和性。这样的方法在Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中被进一步详细描述。
另外地或可选地，可生成具有改变的糖基化类型的抗体，比如具有减少的数量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增多的平分型GlcNac结构的抗体。已证实这样的改变的糖基化形式提高了抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可通过，例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已被描述且可用作在其中表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，而使在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8.-/-细胞系通过利用两个置换型载体在CHO/DG44细胞中对FUT8基因进行靶向破坏而构建(参见Yamane等人的美国专利第20040110704号和Yamane-Ohnuki等人(2004)BiotechnolBioeng 87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，从而通过减少或消除α1，6键相关酶使在这样的细胞中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Hanai等人还描述了对将岩藻糖添加到结合抗体的Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上具有低酶活性或者不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，Lec13细胞，其对将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物具有降低的能力，也导致了该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(还参见Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342描述了工程化的细胞系以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))而使在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增高的平分型GlcNac结构，该结构导致了抗体增高的ADCC活性(还参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。可选地，可利用岩藻糖苷酶裂解抗体的岩藻糖残基。例如岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上移除了岩藻糖基残基(Tarentino，A.L.等人(1975)Biochem.14：5516-23)。
本发明考虑的本文的抗体的另一个修饰形式是聚乙二醇化。可将抗体聚乙二醇化以，例如，提高抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常在使一个或多个聚乙二醇基团与抗体或抗体片段连接的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇反应，比如与聚乙二醇的反应性酯或醛衍生物反应。任选地，可通过利用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应而进行聚乙二醇化。如本文所用的，术语“聚乙二醇”意在包括用于衍生其它蛋白的任何形式的PEG，比如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或马来酰亚胺基聚乙二醇。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白的方法是本领域中已知的且可被用于根据本发明的至少一些实施方案的抗体中。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
工程化抗体的方法
如以上所讨论的，具有本文所公开的VH和VK序列的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体可通过修饰VH和/或VL序列，或与其连接的恒定区而分别用以构建新型抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体。因此，根据本发明的至少一些实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体的结构特征被分别用来构建结构上相关的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体，所构建的抗体保留了根据本发明的至少一些实施方案的抗体的至少一种功能性质，比如与人KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154的结合。例如，一个KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗体或其突变形式的一个或多个CDR区可与已知构架区和/或CDR重组结合以构建另外的重组工程化的如以上所讨论的根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体。修饰的其它类型包括在以上章节中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是本文所提供的VH和/或VK序列中的一个或多个，或其一个或多个CDR区。为构建工程化的抗体，不需要实际制备(即，表达为蛋白)具有本文所提供的一个或多个VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，序列中所含的信息被用作起始材料而构建来源于原始序列的“第二代”序列且然后制备“第二代”序列并表达蛋白。
可使用标准的分子生物学技术来制备和表达改变的抗体序列。
任选地，由改变的抗体序列所编码的抗体是利用本文所提供的序列和方法所生产的、分别保留了抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性质包括以特定的KD水平或更低的KD水平与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原结合，和/或与所期望的表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的靶标细胞选择性结合，所述靶标细胞比如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和血液系统恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、白血病、T细胞白血病。
改变的抗体的功能性质可利用本领域可获得和/或本文所描述的标准测定来评估。
在根据本发明的至少一些实施方案的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可随机地或选择性地沿抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体编码序列的全部或部分导入突变，并且可根据结合活性和/或其它所期望的功能性质筛选所得的修饰的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体。
突变方法在本领域中已经被描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780描述了利用饱和诱变、合成连接组装或它们的组合用于构建和筛选抗体突变的方法。可选地，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679描述了利用计算扫描方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
编码抗体的核酸分子
根据本发明的至少一些实施方案涉及编码根据本发明的至少一些实施方案的抗体的核酸分子。核酸可存在于全细胞、细胞裂解物或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术被纯化脱离其它细胞组分或其它杂质例如，其它细胞核酸或蛋白时，核酸是“分离的”或“表现为基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术。参见，F.Ausubel，等人，编辑(1987)Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。根据本发明的至少一些实施方案的核酸可以是，例如，DNA或RNA并可含或可不含内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
根据本发明的至少一些实施方案的核酸可利用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，如以下进一步描述的，由携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠而制备的杂交瘤)，编码由杂交瘤生成的抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术而获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，利用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可从文库中回收。
获得编码VH和VL区段的DNA片段后，可通过标准重组DNA技术对这些DNA片段进行进一步操作，例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些实施方案中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接到编码另外的蛋白的另外的DNA片段上，比如抗体恒定区或柔性接头。
如本文所用的术语“可操作地连接”意指两个DNA片段连接而使由两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在框内。
可通过将VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外的DNA分子可操作地连接而将分离的编码VH区的DNA可操作地转变为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上感兴趣的蛋白的序列)，第五版，美国健康与人类服务部，NIH出版号91-3242)且包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因，可将VH编码DNA与仅编码重链CH1恒定区的另外的DNA分子可操作地连接。
通过将VL-编码DNA与编码轻链恒定区CL的另外的DNA分子可操作地连接可将分离的编码VL区的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上感兴趣的蛋白的序列)，第五版，美国健康与人类服务部，NIH出版号91-3242)并且包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区。
为构建scFv基因，将VH和VL编码DNA片段与编码柔性接头的另外的片段可操作地连接，比如，与编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段可操作地连接，而使得VH和VL序列可作为连续的单链蛋白被表达，且VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。
抗KRTCAP3单克隆抗体、抗FAM26F单克隆抗体、抗MGC52498单克隆抗体、抗FAM70A单克隆抗体、抗TMEM154单克隆抗体的产生
根据本发明的至少一些实施方案的单克隆抗体(mAb)可通过多种技术来产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256：495的标准体细胞杂交技术。虽然体细胞杂交方法是优选的，原则上，其它用于产生单克隆抗体的技术也可被应用，例如，B淋巴细胞的病毒转化或原癌基因转化。
优选的用于制备杂交瘤的动物细胞是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是相当成熟的方法。免疫方案和用于融合的免疫的脾细胞的分离的技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
根据本发明的至少一些实施方案的嵌合的或人源化的抗体可基于以上所描述的所制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可从感兴趣的鼠杂交瘤中获得并可利用标准分子生物学技术被工程化以含有非鼠的(例如，人的)免疫球蛋白序列。例如，为构建嵌合的抗体，可利用本领域中已知的方法(参见，例如，Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)将鼠可变区连接到人类恒定区。为构建人源化的抗体，可利用本领域中已知的方法(参见，例如Winter的美国专利第5,225,539号、和Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)将鼠CDR区插入到人类构架区。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体是人类的单克隆抗体。这样的抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的人类单克隆抗体可利用携带人类免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体的小鼠来生成。这些转基因或转染色体的小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠RTM和KM小鼠RTM的小鼠，且本文中统称为“人类Ig小鼠”。HuMAb小鼠TM.(Medarex.Inc.)含有编码未重排的人类重链(μ链和γ链)免疫球蛋白序列和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源性μ链和κ链基因座失活的靶突变的人类免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)(参见，例如，Lonberg，等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ链的降低的表达，并且响应于免疫接种，所导入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以生成高亲和性的人类IgGκ.单克隆抗体(Lonberg、N.等人(1994)，同前；Lonberg、N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology(实验药理学手册)113：49-101中的综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠RTM的制备和使用，以及这样的小鼠携带的基因组修饰，在以下中被进一步描述：Taylor，L.等人(1992)NucleicAcids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)International Immunology5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBOJ.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；和Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些的内容在此具体地以其整体通过引用并入。还参见，美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；和第5,770,429号；均授予Lonberg和Kay；Surani等人的美国专利第5,545,807号；PCT公布编号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962，均授予Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公布编号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的人类抗体可利用在转基因上或转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠来产生，比如携带人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠。这样的小鼠，本文中称作“KM小鼠TM.”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中被详细描述。
更进一步地，可选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域中可获得的并可被用来生成根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体。例如，可使用称作Xenomouse(Abgenix、Inc.)的可选的转基因系统；这样的小鼠在，例如，Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6、150,584号和第6,162,963号中被描述。
并且，可选的表达人类免疫球蛋白基因的转染色体动物系统是本领域中可获得的并可被用于生成根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体的小鼠；这样的小鼠在Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad Sci.USA 97：722-727中被描述。此外，携带人类重链和轻链转染色体的牛在本领域中已被描述(Kuroiwa等人(2002)NatureBiotechnology 20：889-894)并且可用来生成根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体、抗TMEM154抗体。
还可利用用于筛选人类免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法制备根据本发明的至少一些实施方案的人类单克隆抗体。本领域中已建立了这样的用于分离人类抗体的噬菌体展示方法。参见例如：Ladner等人的美国专利第5,223,409号；第5,403,484号；和第5,571,698号；Dower等人的美国专利第5,427,908号和第5,580,717号；McCafferty等人的美国专利第5,969,108号和第6,172,197号；和Griffiths等人的美国专利第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号和第6,593,081号。
还可利用以下SCID小鼠制备根据本发明的至少一些实施方案人类单克隆抗体，人类免疫细胞已被重建到该SCID小鼠中从而可在免疫后产生人类抗体反应。这样的小鼠在，例如，Wilson等人的美国专利第5,476,996号和第5,698,767号中被描述。
人类Ig小鼠的免疫
当使用人类Ig小鼠生成根据本发明的至少一些实施方案的人类抗体时，可利用KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原和/或重组的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154融合蛋白的纯化或富集制剂对这样的小鼠进行免疫，如由Lonberg，N.等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild、D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424中所描述的。优选地，在第一次输注时小鼠将是6-16周龄。例如，可使用KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的纯化或重组制剂(5-50μg)腹膜注射免疫人类Ig小鼠。
其他人利用不同抗原的先前的经验已表明当利用含抗原的弗氏完全佐剂初次腹膜内(IP)免疫转基因小鼠，然后每隔一周利用含抗原的弗氏不完全佐剂IP免疫(总共达6次)时，转基因小鼠作出响应。然而，除弗氏佐剂外的佐剂也被发现是有效的。此外，无佐剂的全细胞被发现具有高度免疫原性。可在免疫过程中利用从眼球后采血获得的血浆样品来监测免疫反应。可通过ELISA(如以下所描述的)来筛选血浆，并且具有足够滴度的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在处死小鼠和移去脾前3天可对小鼠静脉内加强免疫。据推测每次免疫可需要进行2-3次融合。对于每种抗原通常免疫6到24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12系。此外，HCo7和HCo12转基因可被杂交成具有两种不同人类重链转基因的单一小鼠(HCo7/HCo12)。可选地或另外地，可使用KM小鼠.RTM.系。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的生成
为生成产生根据本发明的至少一些实施方案的人单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，比如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选所得的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。例如，使用50％PEG，可将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)相融合。细胞以大约2X 10-5铺板在平底微量滴定板中，然后在含20％胎儿克隆血清(fetal Clone Serum)、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中培养两周。大约两周后可将细胞培养在用HT替换HAT的培养基中。然后可通过ELISA对每个孔筛选人单克隆IgM和IgG抗体。当发生扩大的杂交瘤生长时，通常在10-14天后可观察培养基。可将抗体分泌性杂交瘤再铺板，再次筛选，并且如果仍是人IgG阳性，可通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成少量的抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可在2升旋转瓶中培养所选择的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。在利用蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway、N.J.)进行亲合色谱之前可过滤并浓缩上清液。可通过凝胶电泳和高效液相色谱来检验洗脱的IgG以保证纯度。可将缓冲溶液交换为PBS，且可利用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体分成小份并在-80℃下贮存。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
还可利用，例如，本领域中熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生根据本发明的至少一些实施方案的抗体。(例如，Morrison、S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为表达抗体，或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长的轻链和重链的DNA，并可将DNA插入到表达载体中而使基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该上下文中，术语“可操作地连接”意指抗体基因被连接到载体中而使载体中的转录和翻译调控序列行使它们调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。可将抗体轻链和抗体重链基因插入到独立的载体中，或，更典型地，将两种基因插入到同一表达载体中。可通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或如果不存在限制性位点时平末端连接)。本文所描述的抗体的轻链和重链可变区可用于构建任何抗体同种型的全长的抗体基因，通过将本文所描述的抗体的轻链和重链可变区插入到已编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而使VH区段与载体中的CH区段可操作地连接，和使VK区段与载体中的CL区段可操作地连接。另外地或可选地，重组表达载体可编码协助抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中而使信号肽与抗体链基因的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)
除抗体链基因外，根据本发明的至少一些实施方案的重组表达载体携带控制宿主细胞中抗体链基因的表达的调控序列。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列已被描述，例如，在Goeddel(Gene Expression Technology(基因表达技术).Methods in Enzymology(酶学中的方法)185，Academic Press、San Diego、Calif(1990))中。将被本领域中的技术人员理解地是，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调控序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，比如来源于巨细胞病毒(CMV)、猴肾病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。可选地，可使用非病毒调控序列，比如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。更进一步地，由来自不同来源的序列组成的调控元件，比如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列外，根据本发明的至少一些实施方案的重组表达载体可携带另外的序列，比如调控宿主细胞中载体的复制的序列(例如，复制的起始点)和选择性标记物基因。选择性标记物基因协助其中被导入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。例如，通常选择性标记物基因赋予其中被导入载体的宿主细胞对药物的抗性，所述药物比如G418、潮霉素或氨甲喋呤。优选的选择性标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhrf-宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为表达轻链和重链，通过标准方法将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意在包括将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞的各种常用技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染和类似的技术。虽然在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施方案的抗体理论上是可能的，但真核细胞中的抗体的表达是最优选的，且最优选地为哺乳动物宿主细胞，因为这样的真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌适当地折叠且具有免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达用于活性抗体的高产量的生产是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today6：12-13)。
用于表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中被描述，利用DHFR选择性标记物，例如，在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中被描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，为用于NSO骨髓瘤细胞，另一种优选的表达系统是WO87/04462、WO 89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当编码抗体基因的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达，或，优选的，抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间而产生抗体。可利用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
与抗原结合的抗体的表征
可通过例如标准ELISA来检测根据本发明的至少一些实施方案的抗体与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的结合。简言之，用含0.25μg/ml纯化的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的PBS包被微量滴定板，且然后用含5％牛血清白蛋白的PBS封闭。将抗体的稀释物(例如，来自KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154免疫的小鼠的血浆的稀释物)添加到每个孔并在37℃下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板且然后用与碱性磷酸酶轭合的第二试剂(例如，对于人抗体为山羊抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂)在37℃下孵育1小时。洗涤后，用pNPP底物(1mg/ml)对培养板进行显色，并在405-650的OD处进行分析。优选地，形成最高滴度的小鼠将用于融合。
以上所描述的ELISA测定还可用于筛选表现出KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154免疫原阳性活性的杂交瘤。将以高亲合性(avidity)与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154结合的杂交瘤亚克隆并进一步表征。来自每个杂交瘤的一个克隆，其保留了母细胞的反应性(通过ELISA)，可被选择用于制造贮存在-140℃下的5-10小管细胞库，和用于抗体纯化。
为纯化抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体，所选择的杂交瘤可在2升旋转瓶中生长以用于单克隆抗体纯化。在利用蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway、N.J.)进行亲合色谱之前可过滤并浓缩上清液。可通过凝胶电泳和高效液相色谱来检验洗脱的IgG以保证纯度。可将缓冲溶液交换为PBS，且可利用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体分成小份并在-80℃下贮存。
为测定所选择的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154单克隆抗体是否与独特的表位结合，可利用商业上可获得的试剂(Pierce，Rockford，III)对每个抗体进行生物素化。可利用如上所描述的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154包被的ELISA培养板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。生物素化的mAb结合可利用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针来检测。
为测定纯化的抗体的同种型，可利用对特定的同种型的抗体特异的试剂来进行同种型ELISA。例如，为检测人单克隆抗体的同种型，可用1μg/ml的抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的每个孔，在4℃下过夜。在用1％BSA封闭后，用1μg/ml或更少的检验单克隆抗体或纯化的同种型对照与培养板反应，在室温下持续1至2小时。且然后可将孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶轭合的探针反应。如上所述使培养板显色并对其分析。
可通过蛋白质印迹进一步检验抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154人IgG与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的反应性。简言之，可制备KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原并使其经受十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％的胎牛血清封闭，然后用待检验的单克隆抗体探针标记。可利用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis、Mo.)进行显色。
轭合物或免疫轭合物
根据至少一些实施方案，本发明以免疫轭合物为特征，所述免疫轭合物包括与治疗部分轭合的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体，或其片段，所述治疗部分比如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素。这样的轭合物被称作“免疫轭合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫轭合物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的(例如，杀伤)任何剂。例子包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括，例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、塞替哌(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(原道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(原放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素和安曲霉素(anthramycin(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
可与根据本发明的至少一些实施方案轭合的治疗性细胞毒素的其它优选的实例包括倍癌霉素(duocarmycins)、加利车霉素(calicheamicins)、美登素(maytansines)和阿瑞斯他丁(auristatins)，及其衍生物。加利车霉素抗体轭合物的实例是商业上可获得的(Mylotarg.TM.；Wyeth)。
利用本领域可获得的连接体技术可将细胞毒素与根据本发明的至少一些实施方案的抗体轭合。已用于将细胞毒素与抗体轭合的连接体类型的实例包括，但不局限于，腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽连接体。可选择例如易于在溶酶体区室中通过低pH裂解或通过蛋白酶裂解的连接体，所述蛋白酶比如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，比如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)。
关于细胞毒素、连接体的类型和用于将治疗剂与抗体轭合的方法的进一步讨论，还参见Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
还可将根据本发明的至少一些实施方案的抗体与放射性同位素轭合以生成细胞毒性放射性药物，也称作放射免疫轭合物。可与抗体轭合的用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括，但不局限于，碘131、铟111、钇90和镥177。用于制备放射免疫轭合物的方法在本领域中已建立。放射免疫轭合物的实例是商业上可获得的，包括Zevalin.TM.(IDECPharmaceuticals)和Bexxar.TM.(Corixa Pharmaceuticals)，以及可使用类似的方法来制备使用根据本发明的至少一些实施方案的抗体的放射免疫轭合物。
根据本发明的至少一些实施方案的抗体轭合物可用来改变给定的生物反应，且药物部分不应认为局限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望的生物活性的蛋白或多肽。这样的蛋白可包括，例如，酶活性毒素或其活性片段，比如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白比如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或，生物反应调节剂，比如，例如，淋巴因子、白介素-1(“IL-I”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
用于将这样的治疗部分与抗体轭合的技术是熟知的，参见，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”(癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体)，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，第243页-第256页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For DrugDelivery”(用于药物递送的抗体)，Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第二版)，Robinson等人(编辑)，第623页-第653页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述)，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications(单克隆抗体′84：生物和临床应用)，Pinchera等人(编辑)，第475页-第506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”(放射标记的抗体在癌症治疗中的治疗应用的分析、结果和未来前景)，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)，Baldwin等人(编辑)，第303页-第316页(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性性质)，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
双特异性分子
在另一方面，本发明以双特异性分子为特征，所述双特异性分子含有根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体或其片段。可将根据本发明的至少一些实施方案的抗体，或其抗原结合部分衍生或连接到另外的功能分子，例如，另外的肽或蛋白(例如，另外的抗体或受体的配体)，以生成与至少两种不同结合位点或靶标分子结合的双特异性分子。实际上可将根据本发明的至少一些实施方案的抗体衍生或连接到一个以上的其它功能分子以生成与两个以上不同结合位点和/或靶标分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也被本文所用的术语“双特异性分子”所包括。为构建根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子，可将根据本发明的至少一些实施方案的抗体与一种或多种其它结合分子功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它的方式)，所述其它结合分子比如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括含有至少一种对于KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的第一结合特异性，和对于第二靶标表位的第二结合特异性的双特异性分子。在根据本发明的至少一些实施方案的特定实施方案中，第二靶标表位是Fc受体，例如，人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够与表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，和与分别表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的靶标细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154多肽的细胞靶向至效应细胞并触发Fc受体介导的效应细胞活性，比如表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧化物阴离子的生成。
在其中双特异性分子是多特异性的根据本发明的至少一些实施方案的一个实施方案中，除抗Fc结合特异性和抗-6f结合特异性之外，分子可进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合的分子，且因此提高了对靶标细胞的免疫反应。
“抗增强因子部分”可以是抗体、功能性抗体片段或与给定的分子例如抗原或受体结合的配体，并因此导致Fc受体或靶标细胞抗原的结合决定子的效应的增强。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶标细胞抗原。可选地，抗增强因子部分可与不同于第一和第二结合特异性结合的实体的实体结合。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-I或其它导致对靶标细胞提高的免疫反应的免疫细胞)。
在一个实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子包括作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，所述抗体片段包括，例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体或其任何的极小的片段，比如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利第4,946,778号中所描述的，其内容在此通过引用明确并入。
某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的生产和表征由Fanger等人在PCT公布WO 88/00052和美国专利第4,954,617号中描述，其教导的内容在此通过引用完整并入。这些抗体与Fc RI、FcyRII或FcyRIII的表位在不同于受体的Fc结合位点的位点结合，并且，因此它们的结合基本上不受生理水平的IgG阻碍。本发明中有用的特异的抗Fc RI抗体是mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC登录号HB9469。在另外的实施方案中，抗Fcy受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano，R.F.等人(1995)J.Immunol.155(10)：4996-5002和PCT公布WO 94/10332中被描述。产生H22抗体的细胞系以名称HAO22CLI保藏于美国典型培养物保藏中心，且登录号为CRL 11177。
在又一些另外的优选的实施方案中，Fc受体的结合特异性由与人IgA受体例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，其结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)所阻碍。术语“IgA受体”意在包括位于19号染色体上的一个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码55到10kDa的一些可变剪接的跨膜同种型。
FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上被组成型表达，但不在非效应细胞群上表达。FcαRI对IgA1和IgA2均具有中等亲和性(约5X10-7M-1)，所述亲和性在暴露于诸如G-CSF或GM-CSF的细胞因子时增高(Morton，H.C.等人(1996)Critical Reviewsin Immunology 16：423-440)。已描述了四种Fca RI特异性单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62和A77，其在IgA配体结合结构域外结合FcαRI(Monteiro，R.C.等人(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI和FcγRI是用于根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞上表达，比如，单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞；(2)以高水平表达(例如，5,000-100,000每细胞)；(3)细胞毒性活性(例如，ADCC、吞噬作用)的介导物；(4)介导靶向它们的抗原的增强的抗原呈递，所述抗原包括自体抗原。
虽然人单克隆抗体是优选的，但可用于根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子的其它抗体为鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。
根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子可通过利用本领域中已知的方法将组成型结合特异性轭合来制备，所述组成型结合特异性例如，抗FcR和抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154多肽结合特异性。例如，可独立地生成双特异性分子的每个结合特异性并将其彼此轭合。当结合特异性是蛋白或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价轭合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见，例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt No.78、118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)，和Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中描述的那些。优选的轭合剂为SATA和磺基-SMCC，均可从PierceChemical Co.(Rockford，III)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链的C末端铰链区的巯基键合而轭合。在一个特别优选的实施方案中，在轭合前铰链区被修饰以包含奇数数目的巯基残基，优选地为一个。
可选地，两种结合特异性可由同一载体所编码和在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab′)2或配体XFab融合蛋白时该方法是尤其有用的。根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定子的单链分子，或包含两个结合决定子的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法已被描述，例如在美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；和美国专利第5,482,858号中被描述。
双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或蛋白质印迹测定来验证。这些测定中的每一种通常通过使用对感兴趣的复合物特异性的被标记的试剂(例如，抗体)来检测特定的感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可利用诸如识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶连接的抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。可选地，可利用多种其它免疫测定来检测复合物。例如，抗体可被放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)(参见，例如Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays(放射免疫测定原理)，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques(第七届放射性配体测定技术培训教程)，TheEndocrine Society，March，1986，其在此通过应用并入)。放射性同位素可通过诸如γ计数器或闪烁计数器的使用来检测或通过放射自显影来检测。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了组合物，例如，含有与药学上可接受的载体一起配制的根据本发明的至少一些实施方案的单克隆抗体或其抗原结合部分的一种或组合的药物组合物。这样的组合物可包括根据本发明的至少一些实施方案的抗体或免疫轭合物或双特异性分子的一种或组合(例如，两种或多种不同的)。例如，根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物可包括与靶标抗原上不同的表位结合的或具有互补活性的抗体(或免疫轭合物或双特异性物)的组合。
如上所讨论的，本发明的至少一些实施方案还包括鉴定特异性结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原或多肽和/或调节(增强或抑制)分别由KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原或多肽引起的活性的其它分子，比如小有机分子、肽、核酶、碳水化合物、糖蛋白、siRNA、反义RNA和类似物。这些分子可通过已知的诸如结合测定的筛选方法来鉴定。通常这些测定将是高通量的且将筛选合成化合物或天然化合物的大型文库，以鉴定结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154和/或调节KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154相关活性的推断的药物候选者。
具体地，本发明包括含有TMEM154抗原或多肽的胞外域，或其片段或变体或对应的编码其的核酸序列的药物的开发。
因此，本发明以药物组合物为特征，所述药物组合物包括治疗有效量的根据本发明的治疗剂。根据本发明治疗剂可以是TMEM154胞外域，或其片段或变体或轭合物或对应的编码它们的核酸序列中的任何一种。
根据本发明的药物组合物还任选地用于癌症和/或免疫相关病症或疾患的治疗。
可将根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂单独提供给受治疗者，或作为其中其与药学上可接受的载体相混合的药物组合物的部分来提供给受治疗者。
还可将根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物在联合疗法(即，与其它剂结合)中施用。例如，联合治疗可包括与至少一种其它治疗剂或免疫调节剂联合的，根据本发明的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154调节剂，比如含有TMEM154多肽的胞外域的可溶性多肽轭合物或小分子，所述小分子比如与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽结合的肽、核酶、siRNA或其它药物。
可利用本领域中已知的各种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用根据本发明的至少一些实施方案的组合物。将被技术人员所理解的是，施用的途径和/或模式将根据所期望的结果而不同。根据本发明的至少一些实施方案的抗体的优选的施用途径包括静脉内施用途径、肌内施用途径、皮内施用途径、腹膜内施用途径、皮下施用途径、脊髓施用途径或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“胃肠外施用”意为除肠胃施用和局部施用外的施用模式，通常通过注射，且包括，不限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。
如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、和生理上相容的类似物。优选地，载体适宜于静脉内施用、肌内施用、皮下施用、胃肠外施用、脊髓施用或表皮施用(例如，通过注射或输注)。依照施用途径不同，可将活性化合物，即，抗体、免疫轭合物或双特异性分子，包覆在材料中以保护化合物不受酸和其它可能使化合物失活的天然条件的作用。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，比如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠及类似物；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-III生育酚，及类似物；和(3)金属螯合剂，比如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，及类似物。可用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物的适宜的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(比如甘油、丙二醇、聚乙二醇，及类似物)，和其适宜的混合物、植物油，比如橄榄油，和可注射有机酯，比如油酸乙酯。可通过例如使用诸如卵磷脂的包覆材料、分散体情况下通过维持所需粒径，和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物存在的预防可通过灭菌方法和前述的各种抗细菌剂和抗真菌剂的包含来保证，所述抗细菌剂和抗真菌剂比如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸，及类似物。所期望的还可包括等渗剂，比如糖、氯化钠，和类似物加入到组合物中。此外，可注射药物形式的延长吸收可通过诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的剂的包含来产生。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。用于药物活性物质的这样的介质和剂的使用是本领域中已知的。除与活性化合物不相容的外，考虑任何常规介质或剂在根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的使用。补充的活性化合物也可被包含在组合物中。
治疗组合物在生产和贮存的条件下通常必须是无菌且稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或适宜于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇，和液体聚乙二醇，及类似物)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。可通过例如使用诸如卵磷脂的包覆材料、在分散体情况下通过维持所需粒径，和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如，糖、多元醇，比如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠在组合物中。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的剂来产生，比如单硬脂酸盐和明胶。无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需要的量按照所需包含在具有以上列举的成分的一种或其组合的适当溶剂中、然后微量过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将活性化合物加入含有基本分散介质和所需的其它来自以上所列的那些的成分的无菌运载体来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其它所期望的成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需要的量按照所需包含在具有以上列举的成分的一种或其组合的适当溶剂中、然后微量过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将活性化合物加入含有基本分散介质和所需的其它来自以上所列的那些的成分的无菌运载体来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其它所期望的成分的粉末。
可与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量可依被治疗的受治疗者和具体的施用模式而不同。可与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的组合物的量。通常，基于100％，该量将在从活性成分的约0.01％到99％，任选地从活性成分的约0.1％到约70％，任选地从活性成分的约1％到约30％与药学上可接受的载体结合的范围变化。
调整剂量方案以提供最佳的所期望的响应(例如，治疗响应)。例如，可施用单一丸剂、可随时间施用一些分次的剂量或按照治疗情形的急需所指示的成比例减小或增大剂量。为容易施用和剂量均匀性而将胃肠外组合物配制为单位剂量形式是尤其有利的。本文使用的单位剂量形式指适合作为用于待治疗的受治疗者的单一剂量的物理上分散的单位；每个单位含有与所需药物载体缔合以产生所期望的治疗效果的所计算的预定量的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的单位剂量形式的规格由以下所决定且直接取决于(a)活性化合物的独特特点和待获得的特定治疗效果，和(b)配制用于在个体中易感性的治疗的这样的活性化合物的本领域中固有的限制。
为抗体施用目的，剂量范围从大约0.0001mg/kg宿主体重到100mg/kg宿主体重，且更常为0.01mg/kg宿主体重到5mg/kg宿主体重。例如剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案每周进行一次施用、每两周进行一次、每三周进行一次、每四周进行一次、每月进行一次、每3个月进行一次或每3-6个月进行一次。
可选地，可将抗体作为持续释放制剂来使用，在这种情况下需要较不频繁的施用。剂量和频率依照患者中的抗体的半衰期而不同。通常，人类抗体显示了最长的半衰期，然后是人源化的抗体、嵌合的抗体和非人类的抗体。施用的剂量和频率可依照治疗是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性的施用中，在长期的时间段中以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其剩余的生命时间中继续接受治疗。在治疗性施用中，有时需要以相对短的间隔的相对高剂量，直到疾病的进程减缓或终止，且优选地为直到患者显示疾病的症状的部分地或完全地改善。此后，可对患者施用预防性方案。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以是不同的以获得有效实现对特定的患者、组合物和施用模式的所期望的治疗响应而对患者无毒性的活性成分的有效量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的根据本发明的至少一些实施方案的特定组合物，或其酯、盐或酰胺，施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、被治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、健康状况和先前病史，及医药领域中熟知的类似的因素。
根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体的“治疗有效剂量”导致疾病症状的严重度的下降、疾病无症状时期的频率和持续时间的提高、寿命的提高、疾病缓解或由于疾病痛苦造成的损伤或残疾的预防。例如，对于KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽阳性肿瘤的治疗，例如，卵巢肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺癌、黑素瘤和血液系统恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、白血病、T细胞白血病，“治疗有效剂量”任选地相对于未治疗患者至少约20％、40％、60％、80％地抑制细胞生长或肿瘤生长。可在预测在人类肿瘤中的效力的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。可选地，组合物的这种性质可通过检验化合物抑制的能力来评价，这样的体外抑制的测定是技术人员已知的。
可选地或另外地，“治疗有效剂量”优选地导致至少稳定的疾病，优选地为部分地响应，更优选地为完全响应，如用于肿瘤响应的WHO或RECIST标准所评估的(Natl Cancer Inst 1999；91：523-8和Cancer 1981；47：207-14)。
治疗有效量的治疗化合物可减少肿瘤尺寸，或以其他方式改善受治疗者中的症状，或按照以上所测定的，以其他方式维持部分地或完全地稳定的疾病和/或部分地或完全地响应。本领域中的普通技术人员将能够基于诸如受治疗者的体积、受治疗者的症状的严重度，和特定组合物或所选择的施用途径的因素来确定这样的量。
可利用本领域中已知的医疗装置来施用治疗组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可利用皮下注射器装置施用根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物，比如在美国专利第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；或第4,596,556号中所公开的装置。用于本发明的熟知的植入物和模件的实例包括：美国专利第4,487,603号，其公开了用于以受控制的速率配药的可植入的微量输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开了用于穿过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其公开了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开了用于持续的药物递送的变流可植入输注设备；美国专利第4,439,196号，其公开了具有多室隔间的渗透的药物递送系统；和美国专利第4,475,196号，其公开了渗透的药物递送系统。这些专利在此通过引用并入。许多其它的这样的植入物、递送系统和模件对于本领域中的技术人员是已知的。
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体或其它KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154相关药物可被配制以保证体内的合适分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性的化合物。为保证根据本发明的至少一些实施方案的治疗化合物穿过BBB(如需要)，可将其配制在例如脂质体中。关于生产脂质体的方法，参见，例如美国专利第4,522,811号；第5,374,548号；和第5,399,331号。脂质体可包含被选择性地运输到特定细胞或器官中的一种或多种组分，从而增强了靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
考虑到根据本发明的至少一些实施方案的抗体对于KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的特异性结合，可将抗体用于特异性检测细胞表面上表达的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154，和，并且可通过免疫亲和纯化将抗体用于纯化KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原。
而且，考虑到KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽在不同肿瘤细胞上的表达，可将根据本发明的至少一些实施方案的人类抗体、抗体组合物和方法用来治疗患有生瘤性疾患的受治疗者，所述生瘤性疾患例如，以表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的肿瘤细胞的存在为特征的疾患，比如，如上所述的，卵巢癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和血液系统恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、白血病、T细胞白血病。
在一个实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的抗体(例如，人类单克隆抗体、多特异性分子和双特异性分子和组合物)可用来检测KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的水平或分别在其膜表面含有KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的细胞的水平，然后可将其水平与某种疾病症状关联。
可选地，可将抗体用来抑制或阻碍KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽行使功能，从而其能够与某种疾病症状的预防或改善相关联，因此分别暗示KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽作为疾病的介导物。这可通过在允许KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽和分别对应的抗体之间的复合物的形成的条件下将样品和对照样品与抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体相接触来实现。对抗体和KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽之间形成的任何复合物进行检测并在样品和对照中进行对比。
在另一个实施方案中，可初步检测根据本发明的至少一些实施方案的抗体(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子和组合物)与体外治疗性或诊断性用途有关的结合活性。例如，可利用低细胞计数测定来检测根据本发明的至少一些实施方案的组合物。
如先前所描述的，可将根据本发明的至少一些实施方案的抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体与一种或其它多种治疗剂共施用，所述治疗剂例如，细胞毒性剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂。可将抗体与剂连接(作为免疫复合物)或可将抗体与剂分开施用。在后者的情况下(分开施用)，可将抗体在剂之前施用、在剂之后施用或与剂同时施用或与其它已知的治疗共施用，所述已知的治疗例如，抗癌治疗，例如，放射疗法。这样的治疗剂包括但不限于，抗肿瘤剂，比如多柔比星(阿霉素(adriamycin))，顺铂、硫酸博来霉素、亚硝脲氮芥(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)和环磷酰胺羟基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其自身仅在对患者毒性或亚毒性的水平是有效的。顺铂以100mg/剂每四周静脉施用一次，和阿霉素以60-75mg/ml剂每21天静脉施用一次。根据本发明的至少一些实施方案的人类抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体或抗TMEM154抗体，或其抗原结合片段与化学治疗剂的共施用提供了通过对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应的不同机制运作的两种抗癌剂。这样的共施用可解决由于药物抗性形成或使得肿瘤细胞与抗体不反应的肿瘤细胞的抗原性改变而导致的问题。
还在根据本发明的至少一些实施方案的范围中的是包括根据本发明的至少一些实施方案的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽或抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫轭合物)的试剂盒和使用说明。试剂盒可进一步含有一种或多种另外的试剂，比如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射性毒性剂或根据本发明的至少一些实施方案的一种或多种另外的人类抗体(例如，不同于第一人类抗体的具有结合KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原中的表位的互补活性的人类抗体)。
在另外的实施方案中，可利用调节(例如，增强或抑制)Fcy或Fcy受体的表达或活性的剂另外地治疗受治疗者，例如，利用细胞因子治疗受治疗者。用于在利用多特异性分子的治疗过程中施用的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、干扰素γ(IFN-γ)，和肿瘤坏死因子(TNF)。
还可将根据本发明的至少一些实施方案的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子和双特异性分子)用来靶向表达FcγR或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154的细胞，例如为了标记这样的细胞。为了这样的用途，可将结合剂与可被检测的分子连接。因此，本发明提供了用于离体或体外定位表达Fc受体比如FcγR、或KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原的细胞。可检测标记可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽、多核苷酸和抗体的诊断用途
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的多肽和/或多核苷酸被用作疾病诊断的标志物，KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽和/或多核苷酸在所述疾病其中差异存在。根据至少一些实施方案，疾病选自但不局限于癌症，和免疫相关病症(如本文所定义的)。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的肺癌标志物联合使用，包括但不局限于CEA、CA15-3、β-2-微球蛋白、CA19-9、TPA，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的卵巢癌标志物联合使用，包括但不局限于CEA、CA125(粘蛋白16)、CA72-4TAG、CA-50、CA54-61、CA-195和CA 19-9联合CA-125，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的乳腺癌标志物联合使用，包括但不局限于降钙素、CA15-3(粘蛋白1)、CA27-29、TPA、CA 15-3和CEA的组合、CA 27.29(抗MUC1的单克隆抗体)、雌激素2(β)、HER-2(c-erbB2)，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的肾癌标志物联合使用，包括但不局限于尿蛋白、肌酸酐和肌酐清除率，和/或用于肾癌尤其是肾细胞癌的预后的诊断或评估的标志物，包括但不局限于血管内皮生长因子、白介素-12、可溶性白介素-2受体、细胞间粘附分子-1、人绒毛膜促性腺素β、胰岛素样生长因子-1受体、碳酸酐酶9(CA 9)、内皮抑制素、胸苷磷酸化酶，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的肝癌标志物联合使用，包括但不局限于甲胎蛋白(AFP)、脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)-免疫球蛋白M(IgM)、AFP(L3)，或岩藻糖基化的AFP、GP73(高尔基体蛋白标志物)及其岩藻糖基化形式、(TGF)-β1、HS-GGT、游离胰岛素样生长因子(IGF)-II。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的黑素瘤癌症标志物联合使用，包括但不局限于S100-β、黑素瘤抑制活性(MIA)、乳酸脱氢酶(LDH)、酪氨酸酶、5-S-半胱氨酸多巴、L-多巴/L-酪氨酸、VEGF、bFGF、IL-8、ICAM-1、MMP、IL-6、IL-10、sIL-2R(可溶性白介素-2-受体)、sHLA-DR(可溶性HLA-DR)、sHLA-I类(可溶性HLA-I类)、TuM2-PK、Fas/CD95、sHLA-I类(可溶性HLA-I类)、白蛋白、TuM2-PK(肿瘤丙酮酸激酶M2型)、sFas/CD95、YKL-40、CYT-MAA(细胞质黑素瘤相关抗原)、HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关抗原)、STAT3、STAT1、gp100/HMB45、p16INK4A、PTEN、pRb(视网膜母细胞瘤蛋白)、EGFR、p-Akt、c-Kit、c-myc、AP-2、HDM2、bcl-6、Ki67(通过Mib1检测)、细胞周期蛋白A、B、D、E、p21CIP1、联会蛋白(Geminin)、PCNA(增殖细胞核抗原)、bcl-2、bax、bak、APAF-1、LYVE-1(淋巴血管内皮透明质酸受体-1)、PTN、P-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、β-联蛋白、整联蛋白β1和β3、MMP(基质金属蛋白酶)、抗粘附素、CEACAM1(癌胚抗原相关细胞粘附分子1)、骨粘连蛋白、TA、黑素抑制素、ALCAM/CD166(活化的白细胞粘附分子)、CXCR4、金属硫蛋白。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的前列腺癌标志物联合使用，包括但不局限于PSA、PAP(前列腺酸性磷酸酶)，CPK-BB、PSMA、PCA3、DD3，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的胰腺癌标志物联合使用，包括但不局限于CA19-9，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的血液系统癌症标志物联合使用，包括但不局限于如P-选择蛋白的肿瘤标志物的可溶性形式、CD-22、白介素、细胞因子，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。
根据另外的实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的标志物可任选地单独使用或与一种或多种本文所描述的其它化合物联合使用，和/或与已知的结肠癌标志物联合使用，包括但不局限于CEA、CA19-9、CA50，和/或与本文所描述的多种标志物的已知蛋白联合使用。诊断测定在受治疗者中或从受治疗者中获得的样品中进行。
根据一些实施方案，取自受治疗者以进行根据本发明的至少一些实施方案的诊断测定的样品选自由体液或分泌物组成的组，所述体液或分泌物包括但不局限于血液、血清、尿、血浆、前列腺液、精液、精子、皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道外分泌物、眼泪、脑脊液、痰液、唾液、乳汁、腹膜液、胸膜液、囊液、乳腺导管系统分泌物(和/或其灌洗物)、支气管肺泡灌洗物、生殖系统灌洗物和身体或身体中的系统的任何其它部分的灌洗物；包括分离的细胞或组织的任何器官的样品，其中所述细胞或组织可从选自但不局限于以下的器官获得：肺、结肠、肾、胰腺、卵巢、前列腺、肝脏、皮肤、骨髓、淋巴结、乳腺、和/或血液组织；大便或组织样品或它们的任何组合。在进行诊断测定之前，可任选地将样品用适宜的稀释剂稀释。在某些实施方案中，在进行诊断测定前将从样品中获得的细胞在体外进行培养。
多种熟知的组织或体液收集方法可用来从受治疗者中收集生物样品以测定受治疗者中感兴趣的标志物的核酸和/或多肽的水平。
实例包括，但不局限于，细针穿刺活检、穿刺活检、芯针穿刺活检和手术活检(例如，脑活检)和灌洗。无论使用何种方法，一旦获得了活检物/样品则可测定标志物的水平且从而可作出诊断。
在至少一些实施方案中，本发明提供了变体蛋白，其可任选地被用作诊断标志物，任选地作为体内成像的标志物。根据本发明的至少一些实施方案，因此克服了背景技术关于获得组织样品的需要和关于结果的主观解释的许多缺陷。作为体内成像标志物，根据本发明的至少一些实施方案的标志物也可提供用于多种疾病和/或病理症状的不同的和/或更佳的测量参数。利用这些标志物的分子成像可与诸如CT和MRI的其它成像模式结合进行，CT和MRI捕捉人体解剖并将之与体内标志物分布重叠。
在至少一些实施方案中本发明还涉及用于诊断疾病的诊断测定，尤其在取自受治疗者(患者)的样品中，所述样品任选地为血液样品或身体分泌物样品。在本发明的至少一些实施方案中，诊断测定是免疫测定，包括，例如，免疫组织化学测定、放射性成像测定、体内成像、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、核磁共振成像(MRI)、超声、光学成像、计算机断层扫描、放射免疫测定(RIA)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、狭缝印迹、竞争性结合测定、荧光成像测定、蛋白质印迹、FACS及类似测定。根据另外的实施方案，诊断测定是基于NAT(核苷酸扩增技术)的测定，包括，例如，核酸杂交测定、PCR或其变化形式，例如，实时PCR。诊断测定可以是定性的或定量的。
在一些实施方案中，短语“差异存在”指取自患有本文所描述的疾病或病症其中之一的受治疗者的样品中存在的标志物的量与取自未患有本文所描述的疾病或病症其中之一的受治疗者的样品相比的差异。例如，例如通过杂交和/或基于NAT的测定所测量的，如果一个样品中的核酸片段的量与另一个样品中的核酸片段的量显著不同，核酸片段可任选地是在两个样品之间差异存在的。如果一个样品中的多肽的量与另一个样品中的多肽的量显著不同，多肽是在两个样品之间差异存在的。应注意地是如果标志物在一个样品中是可检测的，而在另一个样品中是不可检测的，则这样的标志物可被认为是差异存在的。任选地，如本文所描述的，相对低的上调的量可作为标志物。本领域中的技术人员之一将容易测定标志物的这样的相对水平；以下每个单独的标志物的描述中提供了进一步的指导。
本发明的上下文中的术语“标志物”指核酸片段、肽，或多肽，其在取自患有本文所描述的疾病或病症其中之一的受治疗者的样品中与取自未患有本文所描述的疾病或病症其中之一的受治疗者的样品相比是差异存在的。
根据本发明的至少一些实施方案，诊断测定可以提供关于样品中的标志物的水平的定性的或定量的信息。
在一些实施方案中，当提及本文所描述的多核苷酸或多肽的表达水平的差异时，短语“定性的”指表达的存在和表达的不存在的比较，或在一些实施方案中，指表达的暂时(temporal)调控，或在一些实施方案中，指表达的时间，或在一些实施方案中，指对表达的分子的任何翻译后修饰，及指将被本领域中的技术人员所理解的其它含义。在一些实施方案中，当提及本文所描述的多核苷酸或多肽的表达水平的差异时，短语“定量的”指由本领域已知的任何方式所测定的表达的量的绝对差异，或在其它的实施方案中指相对差异，所述差异可以是统计学显著的，或在一些实施方案中，当从总体上看时或当经过延长时间段时，等等，指示了关于表达差异的趋势。
术语“水平”指根据本发明的至少一些实施方案的标志物的核酸(例如，RNA)和/或多肽的表达水平。
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的诊断标志物通过其本身的存在与否与病症或疾病相关。在其它的实施方案中，可建立诊断标志物的阈水平，且可将患者的样品中的标志物的水平与阈水平相比。
在一些实施方案中，术语标志物的“检验量”指与特定疾病或病症的诊断一致的受治疗者的样品中的标志物的量。检验量可以是绝对量(例如，微克/ml)或是相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施方案中，术语标志物的“对照量”可以是待与标志物的检验量相比的任何量或量的范围。例如，标志物的对照量可以是患有特定的疾病或病症的患者或未患有这样的疾病或病症的人中的标志物的量。对照量可以是绝对量(例如，微克/ml)或是相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施方案中，术语“检测”指鉴定待检测的对象的存在与否或待检测的对象的量。
在一些实施方案中，术语“标记”包括通过分光镜方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法或化学方法可检测的任何部分或物质。例如，有用的标记包括32P、35S、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用的)、生物素-链霉亲和素、地高辛配基、半抗原和蛋白，对于所述半抗原和蛋白的抗血清或单克隆抗体是可得的，或具有与靶标互补的序列的核酸分子。标记通常生成可测量的信号，比如放射性信号、生色信号或荧光信号，所述信号可被用来定量样品中所结合的标记的量。可将标记共价地、或通过离子键、范德华键或氢键结合到或连接到引物或探针中，例如，掺入放射性核苷酸或链霉亲和素识别的生物素化的核苷酸。标记可以是直接或间接可检测的。间接检测可包括第二标记与第一标记直接或间接的结合。例如，标记可以是结合伴侣的配体，比如作为链霉亲和素的结合伴侣的生物素，或作为特异性杂交的互补序列的结合伴侣的核苷酸序列。结合伴侣自身可以是直接可检测的，例如，抗体自身可以被荧光分子所标记。结合伴侣还可以是间接可检测的，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支的DNA分子的一部分，该分支的DNA分子可通过与其它标记的核酸分子的杂交来检测(参见，例如，P.D.Fahrlander和A.Klausner，Bio/Technology 6：1165(1988))。信号的定量可通过诸如闪烁计数或密度测量术或流式细胞术来实现。
示例性的任选地用于免疫测定的可检测的标记，包括但不局限于磁珠、荧光染料、放射性标记、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它ELISA中常用的酶)、和诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠的量热标记。可选地，样品中的标志物可利用间接测定来检测，其中，例如，使用第二种被标记的抗体来检测被结合的标志物特异性的抗体，和/或在竞争或抑制测定中，其中，例如，将与标志物的不同表位结合的单克隆抗体与混合物同时孵育。
当指蛋白或肽(或其它表位)时，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“与之特异性免疫反应”或“特异性相互作用或结合”在一些实施方案中指作为蛋白和其它生物产物的异源群体中的蛋白的存在的决定因素的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定的蛋白的结合至少高于背景(非特异性信号)两倍，并且基本上不以显著的量与样品中存在的其它蛋白结合。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要由于其对于特定蛋白的特异性而被选择的抗体。例如，可选择来自诸如大鼠、小鼠或人的特定物种的精子碱性蛋白的多克隆抗体以仅获得与精子碱性蛋白特异性免疫反应而不与除精子碱性蛋白的多态性变体和等位基因之外的其它蛋白特异性免疫反应的那些多克隆抗体。该选择可通过除去与来自其它物种的精子碱性蛋白分子交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定类型可被用来选择与特定的蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常被用来选择与蛋白特异性免疫反应的抗体(参见，例如Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，关于免疫测定类型和可被用来测定特异性免疫反应性的条件的描述)。典型地，特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪音的两倍，且更典型地为背景的10-100倍以上。根据本发明的至少一些实施方案的诊断测定包括，但不局限于免疫测定和基于核酸的测定。“免疫测定”是利用抗体特异性结合抗原的测定。免疫测定以利用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向和/或定量抗原为特征。
根据至少一些实施方案，本发明提供了用于在生物样品中检测根据本发明的至少一些实施方案的多肽的方法，其包括：将生物样品与特异性识别根据本发明的至少一些实施方案的多肽的抗体相接触并检测所述相互作用；其中相互作用的存在与生物样品中多肽的存在相关联。
根据至少一些实施方案，本发明利用基于NAT的测定提供了用于在生物样品中检测根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸的方法，其包括：将分离的核酸分子或至少大约最小长度的寡核苷酸片段与生物样品的核酸物质杂交并检测杂交复合物；其中杂交复合物的存在与生物样品中的多核苷酸的存在相关联。
方法或测定的非限制性实例如以下所描述。
本发明还涉及基于这样的诊断方法或测定的试剂盒。
免疫测定
免疫结合测定包括，例如，酶免疫测定(EIA)，比如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射性免疫测定(RIA)、蛋白质印迹测定或狭缝印迹测定(参见，例如美国专利第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；和第4,837,168号)。通常将受治疗者或获自受治疗者的样品和与根据本发明的至少一些实施方案的多肽或其片段特异性结合的抗体相接触。任选地，在将抗体与样品接触前可将抗体固定在固体支持物上。固体支持物的例子包括但不局限于诸如微量滴定板、杆、珠子或微球的形式的玻璃或塑料。将样品与抗体孵育之后，洗涤混合物且所形成的抗体-标志物复合物可被检测。这可通过将所洗涤的化合物与检测试剂一起孵育来完成。可选地，样品中的标志物可利用间接测定来检测，其中，例如，第二种被标记的抗体被用来检测被结合的标志物特异性的抗体。在测定过程中，在每次结合试剂后，孵育步骤和/或洗涤步骤可能是所需要的。孵育步骤可从约5秒钟到几小时之间变化，优选地从约5分钟到约24小时。然而，孵育时间将取决于测定类型、标志物、体积、浓度和类似条件。虽然可在一系列的温度比如10℃到40℃下进行测定，但通常将在室温下进行测定。
抗体-标志物复合物的量可任选地通过与标准对比或与对照量和/或对照信号对比来测定。
放射性免疫测定(RIA)：根据一个实施方案，该方法包括将生物样品与特定抗体相接触，然后将生物样品与固定在诸如琼脂糖珠子的可沉淀载体上的放射性标记的第二抗体或抗体结合蛋白(例如，用I125标记的蛋白A)相接触。沉淀颗粒中计数的数目与样品中的标志物多肽的量成比例。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：该方法包括将含有靶标多肽的样品固定到诸如微量滴定板的孔的表面。使用与酶偶联的底物特异性抗体且允许其与靶标多肽结合。然后检测抗体的存在并利用与抗体偶联的酶通过比色反应来定量。这种方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。样品中存在的底物的量与所产生的颜色的量成比例。通常使用底物标准以提高定量准确度。
蛋白质印迹：该方法涉及通过丙烯酰胺凝胶然后将多肽转移到膜(例如，尼龙膜或PVDF膜)上的方式来分离含有靶标多肽的溶液。然后靶标多肽的存在可通过特定的抗体来检测，然后通过抗体结合试剂来检测所述特定的抗体。抗体结合试剂可以是，例如，蛋白A，或二级抗体。抗体结合试剂可以是如本文以上所描述的放射性标记的或酶连接的。可通过放射自显影法、比色反应或化学发光来检测。该方法允许靶标多肽的量的定量测定和其身份的测定，所述测定通过膜上代表在电泳过程中在丙烯酰胺凝胶中的迁移距离的相对位置来测定。
免疫组织化学测定：该方法涉及在固定的细胞中在原位通过特定的抗体来检测底物。抗体可以是酶连接的或与荧光团连接的。检测可通过显微术和主观评价来进行。如果使用酶连接的抗体，可能需要比色反应。
荧光激活细胞分选术(FACS)：该方法涉及在细胞中在原位通过特定的抗体检测靶标多肽。抗体与荧光团连接。检测借助细胞分选机器来进行，所述细胞分选机器读取当细胞通过光束时从每个细胞发出的光的波长。该方法可同时使用两种或多种抗体。
基于核酸技术(NAT)的测定
根据至少一些实施方案，本发明还考虑了与根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸选择性地杂交的核酸。以下是基于核酸技术的测定的非限制性实例：聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、连接酶链式反应(LCR)、自持续合成反应、Q-β复制酶、循环探针反应、分支DNA、RFLP分析、DGGE/TGGE、单链构象多态性、双脱氧指纹法、微阵列、荧光原位杂交或比较基因组杂交。生物样品中感兴趣的核酸的检测可通过涉及核酸扩增技术的测定来实现。可通过本领域中已知的多种适宜的方法对靶标核酸序列进行扩增。扩增技术的非限制性实例包括基于引物的PCR、LCR、链置换扩增(SDA)、基于转录的扩增、q3复制酶系统和NASBA(Kwoh等人，1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173-1177；Lizardi等人，1988，BioTechnology 6：1197-1202；Malek等人，1994，Methods Mol.Biol.，28：253-260；和Sambrook等人，1989，同前)。如本文所用的，“引物”指能够与靶标序列退火(杂交)从而产生双链区的寡核苷酸，所述双链区能够作为在适宜的条件下DNA合成的起始点。术语“扩增对”(或“引物对”)在本文中指一对寡核苷酸(oligo)，所述寡核苷酸被选择共同用于扩增所选择的核酸序列，所述扩增通过扩增方法的多种类型其中之一来进行，优选地为聚合酶链式反应。
根据本发明的至少一些实施方案的寡核苷酸引物可以具有任何适宜的长度，取决于具体的测定形式和具体的需求以及所使用的靶标基因组。任选地，寡核苷酸引物长度为至少12个核苷酸，优选地在15和24个核苷酸之间，并且可将其改变以特别适合所选择的核酸扩增系统。如本领域中通常已知的，可通过考虑寡核苷酸引物和其靶标序列杂交的解链温度来设计寡核苷酸引物(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning-A LaboratoryManual(分子克隆-实验室手册)，第二版，CSH Laboratories；Ausubel等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现代实验方案)，John Wiley & Sons Inc.，N.Y.)。
放射性成像方法
这些方法包括但不局限于，正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。这两种技术均为非侵入性的，并可用来检测和/或测量多种组织事件和/或功能，比如，举例而言，检测癌细胞。与PET不同，SPECT可任选地与两种标记同时使用。SPECT还具有一些其它的优点，例如关于成本和可用的标记的类型。例如，美国专利第6,696,686号描述了SPECT用于乳腺癌的检测的用途。
根据至少一些实施方案本发明还涉及基于这样的诊断方法或测定的试剂盒。
治疗诊断(THERANOSTICS)：
根据至少一些实施方案本发明还涉及根据本发明的至少一些实施方案的标志物和抗体用于治疗诊断的用途。术语治疗诊断描述了使用诊断检验以诊断疾病、根据诊断检验的结果选择恰当的治疗方案和/或根据诊断检验的结果监测患者对治疗的响应。治疗诊断检验可任选地用于选择特别易于从治疗中受益且不易产生副作用的患者。治疗诊断检验还可提供病人个体中治疗效果的早期指示和客观指示，从而可在最小的延迟内改变治疗(如需要)。例如，DAKO和Genentech联合生产了用于乳腺癌治疗的HercepTest和Herceptin(曲妥单抗(trastuzumab))，这是被批准的与新型治疗药物同时联合的第一个治疗诊断检验。除HercepTest(其为一种免疫组织化学检验)之外，利用传统临床化学、免疫测定、基于细胞的技术和核酸检验的其它诊断治疗检验正在开发中。PPGx′s最近推出了TPMT(巯嘌呤S-甲基转移酶)检验，该检验能够使医生鉴定患者是否处于对6-巯基嘌呤(用于白血病治疗的剂)的潜在致命有害反应的风险。而且，NovaMolecular率先进行了载脂蛋白E基因的SNP基因分型，以预测阿尔茨海默病患者对拟胆碱作用剂治疗的响应，并且其现在广泛用于此适应症的新型药物的临床试验。因此治疗诊断的领域代表着与诊断检验信息的交叉，在对于特定患者的合适的治疗的选择下预测了患者对治疗的响应。
替代标志物(SURROGATE MARKERS)：
根据至少一些实施方案，本发明还涉及根据本发明的至少一些实施方案的标志物和抗体作为替代标志物的用途。替代标志物是在实验室中可检测的和/或根据患者中的特征或症状可检测的标志物，且其在治疗试验中用作临床上有意义的终点的替代物。替代标志物是关于患者感觉、功能或存活如何的直接量度，预期其可预测治疗的效果。对替代标志物的需求主要出现在替代标志物与被称作临床终点的在治疗对患者的效果方面感兴趣的终点相比可被更早地、更方便地或更频繁地测量时。理想地，替代标志物将是生物学上合理的，预测了疾病的进程并可通过标准化测定(包括但不局限于传统临床化学、免疫测定、基于细胞的技术、核酸检验和成像模式)可测量的。
替代终点首先主要应用于心血管领域。例如，抗高血压药物基于它们在降低血压中的有效性而被批准。相似地，在过去，降胆固醇剂基于它们降低血清胆固醇的能力已被批准，而非基于它们降低动脉粥样硬化性心脏病的死亡率的直接证据。胆固醇水平的测量目前是动脉粥样硬化的被接受的替代标志物。此外，HIV研究中目前常用的两种替代标志物是CD4+T细胞计数和定量的血浆HIV RNA(病毒载量)。本领域技术人员理解，在本发明的一些实施方案中，多肽/多核苷酸表达模式可用作特定疾病的替代标志物。
小干扰核酸和反义分子
根据至少一些实施方案，本发明还涉及小干扰核酸，尤其是包括能够与根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸(即，与F04175T5和F04175T15的部分)特异性杂交并特异性地使这些基因沉默的互补序列的siNA。根据至少一些实施方案，本发明还涉及编码这样的核酸的序列和构建体和这样的核酸或构建体用于改变F04175T5或F04175T15基因表达的用途，尤其是降低或抑制基因表达。
某些单链核酸分子能够形成自身互补双链区，其中核酸序列的一部分能与序列的另一部分在序列的反向重复之间通过Watson-Crick碱基配对来相互作用。当重复区域互相邻近或紧接时，双链区可形成称作发卡结构的结构。发卡结构利用发卡结构的一端的未配对的核苷酸的“环”，以及退火的反向重复序列而形成。环可协助核酸链的折叠。
发卡RNA序列可被用于干扰RNA技术和基因沉默技术。这样的技术在例如美国专利第6,573,099号和Grimm D.(Adv.Drug Deliv.Rev.2009 61(9)：672-703)中被描述。根据至少一些实施方案本发明还考虑了与根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸或其任何片段互补的反义RNA分子。可将反义RNA导入到细胞中以通过与根据本发明的至少一些实施方案的多核苷酸杂交并阻碍翻译机制而抑制互补mRNA的翻译。
根据本发明的至少一些实施方案的siNA或反义分子可被用作治疗工具以在体内抑制F04175 T5和F04175 T15基因表达。
以下所提供的实施例仅用作例证性目的，并不意在以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中所引用的所有专利和参考文献在此通过引用整体并入。
实施例
实施例1：
为分析RNA表达所用的方法
对根据本发明的至少一些实施方案的靶标关于在多种癌性和非癌性组织中的表达和/或关于其在宽泛系列的含有免疫细胞的多种类型的人类样品，和血液系统恶性肿瘤样品和细胞系，以及正常组织的一些样品中的表达进行检测。表1中提供了实施例3_2中(显示在图13中)所用的正常组织套组和癌性组织系列中所用的样品的说明。以下表2中提供了用于qRT-PCR分析的血液特定RNA样品。表2_1中提供了表2中描述的来自血液套组的多发性骨髓瘤样品的说明。表3中提供了正常组织套组中所用的样品的说明。以下表4中提供了卵巢癌检测套组中所用的样品的说明。表4的关键内容在表4_1中给出。然后按照以下章节“材料和实验方法”中的描述进行检测。
表1
Figure BDA0000079743540001261
Figure BDA0000079743540001271
Figure BDA0000079743540001281
Figure BDA0000079743540001291
表2
Figure BDA0000079743540001292
Figure BDA0000079743540001301
Figure BDA0000079743540001311
表2_1：多发性骨髓瘤样品详述
Figure BDA0000079743540001321
表3：正常套组中的组织样品：
Figure BDA0000079743540001322
Figure BDA0000079743540001331
表4：卵巢套组中的组织样品
Figure BDA0000079743540001341
Figure BDA0000079743540001351
Figure BDA0000079743540001361
为获得表达数据使用的材料和实验方法
RNA制备-
RNA从以下处获得：ABS(Wilmington、DE 19801，USA，http://www.absbioreagents.com)、BioChain Inst.Inc.(Hayward，CA 94545USA www.biochain.com)、卵巢样品的GOG——儿科人类组织协作网(Pediatic Cooperative Human Tissue Network)，妇科肿瘤组织库(Gynecologic Oncology Group Tissue Bank)，哥伦布儿童医院(ChildrenHospital of Columbus)(Columbus OH 43205USA)、Clontech(Franklin Lakes，NJ USA 07417，www.clontech.com)、Ambion(Austin，TX 78744USA，http://www.ambion.com)、Asternad(Detroit，MI 48202-3420，USA，www.asterand.com)、AllCells，LLC.(Emeryville，CA 94608USA，www，allcells.co，)、IMBCR-骨髓瘤和骨癌研究所(West Hollywood，CA90069，USA，www.imbcr.org)和Seracare的分部Genomics Collaborative Inc.(Cambridge，MA 02139，USA，www.genomicsinc.com)。可选地，根据生产商的说明，利用TRI-试剂(Molecular Research Center)从血液细胞、细胞系或组织样品中生成RNA。组织和RNA样品从患者中或从尸体中获得。绝大多数总RNA样品用DNA酶I(Ambion)进行处理。
RT PCR-将纯化的RNA(2-10μg)与300-1500ng的RandomHexamer引物(Invitrogen)和500μM dNTP在31.2至156μl的总体积中混合。将混合物在65℃下孵育5分钟，然后在冰上快速冷却。然后，添加10-50μl的5X SuperscriptII第一链缓冲液(Invitrogen)、4.8-24μl的0.1M DTT和80-400单位的RNasin(Promega)，并将混合物在25℃下孵育10分钟，然后在42℃下继续孵育2分钟。然后，添加2-10μl(400-2000单位)的SuperscriptII(Invitrogen)并在42℃下将反应物孵育50分钟，然后在70℃下灭活15分钟。将所得的cDNA在TE缓冲液(10mM Tris pH＝8，1mM EDTA pH＝8)中1∶20稀释。
按以下所描述的进行实时RT-PCR分析-在实时PCR反应中(终体积为20μl)将按照以上所描述制备的cDNA(5μl)用作模板，并利用SYBR Green I测定(PE Applied Biosystem)，使用特异性引物和UNG酶(Eurogentech或ABI或Roche)。按照以下来实现扩增：50℃下持续2分钟，95℃下持续10分钟，然后进行40个循环，每个循环在95℃下持续15秒，接着在60℃下持续1分钟，然后进行分解步骤。通过利用PE AppliedBiosystem SDS 7000进行检测。其中反应达到荧光的阈值水平的循环(Ct＝阈值循环，在以下详细描述)被记录并被用来计算RT反应中的相对转录量。利用等式Q＝效率^-Ct来计算相对量。PCR反应的效率由通过利用一些逆转录(RT)反应物的不同稀释度生成的标准曲线来计算。为将RT反应之间的内在差异最小化，利用以以下途径计算的标准化因子对所得的相对量进行标准化：
在每个套组中检验一些管家(HSKP)基因的表达。将按以上描述所计算的每个样品中的每个管家基因的相对量(Q)除以所有套组样品中的该基因的中值量以获得“与中值相关的相对Q”。然后，对于每个样品计算所选择的管家基因的“与中值相关的相对Q”的中值，并将其作为该样品的标准化因子用于进一步的计算。应注意的是这种分析类型提供了相对定量。
对于每个RT样品，将特定扩增子的表达按照如以上章节中所描述的由不同管家基因的表达所计算的标准化因子进行标准化。
对于每个套组，这些管家基因是不同的。
在所有卵巢癌实施例中所测量的管家基因的引物和扩增子的序列为HPRT1、SDHA和G6PD。
SDHA(GenBank登录号NM_004168(SEQ ID NO：136)；扩增子-SDHA-扩增子(SEQ ID NO：85))，SDHA正向引物(SEQ ID NO：83)；SDHA反向引物(SEQ ID NO：84)；
HPRT1(GenBank登录号NM_000194(SEQ ID NO：137)；扩增子-HPRT1-扩增子(SEQ ID NO：88))；HPRT1正向引物(SEQ ID NO：86))，HPRT1反向引物(SEQ ID NO：87)；
G6PD(GenBank登录号NM_000402(SEQ ID NO：138)；G6PD扩增子(SEQ ID NO：91))，G6PD正向引物(SEQ ID NO：89)，G6PD反向引物(SEQ ID NO：90)。
在正常组织样品套组上的所有实例中所测量的管家基因的序列如下：
SDHA(GenBank登录号NM_004168(SEQ ID NO：136)；扩增子-SDHA-扩增子(SEQ ID NO：85))，正向引物(SEQ ID NO：83)，SDHA反向引物(SEQ ID NO：84).
泛素(GenBank登录号BC000449(SEQ ID NO：139)；扩增子-泛素-扩增子(SEQ ID NO：82))，泛素正向引物(SEQ ID NO：80)，泛素反向引物(SEQ ID NO：81).
TATA框(GenBank登录号NM_003194(SEQ ID NO：140)；TATA扩增子(SEQ ID NO：79))，TATA框正向引物(SEQ ID NO：77)，TATA框反向引物(SEQ ID NO：78)。
血液套组的所有实例中所测量的管家基因的序列如下：
HSB1L_人(登录号Q9Y450(SEQ ID NO：141))，T05337_seg30-34F1-正向引物(SEQ ID NO：68)，T05337_seg30-34R1反向引物(SEQ ID NO：69)，T05337_seg30-34扩增子(SEQ ID NO：70)。
DHSA_人(登录号P31040(SEQ ID NO：142))，M78124_seg45-48F1正向引物(SEQ ID NO：71)，M78124_seg45-48R1-反向引物(SEQ IDNO：72)，M78124_seg45-48扩增子(SEQ ID NO：73)。
SLC25A3(登录号Q7Z7N7(SEQ ID NO：144))，SSMPCPseg24-25-29F1-正向引物(SEQ ID NO：74)，SSMPCPseg24-25-29R1-反向引物(SEQID NO：75)，SSMPCPseg24-25-29扩增子(SEQ ID NO：76)。
SFRS4_HUMSRP75A(登录号Q08170(SEQ ID NO：143))，HUMSRP75Aseg30-33F1正向引物(SEQ ID NO：65)，HUMSRP75Aseg30-33R1反向引物(SEQ ID NO：66)，HUMSRP75Aseg30-33扩增子(SEQ ID NO：67)。
HPRT1(登录号NM_000194(SEQ ID NO：137)，HUMHPRTCseg5-7F1-正向引物(SEQ ID NO：34)，HUMHPRTCseg5-7R1-反向引物(SEQ IDNO：37)，HUMHPRTCseg5-7扩增子(SEQ ID NO：126)。
TBP-TATA框结合蛋白(登录号P20226(SEQ ID NO：145))，HSTFIIDXseg7-9F1-正向引物(SEQ ID NO：128)，HSTFIIDXseg7-9R1-反向引物(SEQ ID NO：129)，HSTFIIDXseg7-9扩增子(SEQ ID NO：130)。
用来预测根据本发明的至少一些实施方案的蛋白的表达模式的另一种方法是MED探索引擎：
MED是用于公共基因表达数据的集合、标准化、注释和进行多种搜索的平台。来自最广泛使用的Affymetrix微阵列的表达数据从GeneExpression Omnibus(GEO-www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)来下载。通过将95百分位数设置到恒定值(标准化表达＝1200)而对数据进行乘性(multiplicatively)标准化，通过将较低的30％设置到0来过滤噪音。对实验进行注释，首先自动注释，然后人工注释，以鉴定组织和病症，并按照该注释对芯片分组，并通过将每个芯片的基因的总表达模式与该组中基因的总平均表达模式进行对比而对该分组进行交叉验证。每组中的每个探针组被分配一个表达值，该表达值是该探针组在该组中所包括的所有芯片中的表达的中值。某组中所有探针组的表达的载体是该组的虚拟芯片，所有这样的虚拟芯片的集合为虚拟套组。可搜索该套组(或亚套组)以鉴定具有所需行为(例如，在组织的子集合中的特定表达，或在疾病和健康组织中的差异表达)的探针组。通过探针水平的绘图，这些探针组与LEADS毗连序列群和RefSeqs(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)相关联，用于进一步的分析。
所下载的Affymetrix平台为HG-U95A和HG-U133族(A、B、A2.0和PLUS 2.0)。建立了三种虚拟套组：基于对应的平台的U95和U133Plus2.0、和U133，其使用了用于HG-U133A、HG-U133A2.0和HG-U133PLUS2.0+的一套通用探针组。
MED探索引擎的结果显示在散点图中。散点图是给定套组(组的集合)的紧密表示。y轴是(标准化的)表达且x轴描述了套组中的组。对于每组，中值表达由实心标记所代表，且组中不同芯片的表达值由小破折号(“-”)来表示。按照如下来排序和标记组：三角代表“其它”组(例如，良性疾病、非癌性疾病等)，方形代表处理的细胞，圆圈代表正常的，十字形代表匹配的，和菱形代表癌症。每组中芯片的编号写于临近其名称处。
实施例2：KRTCAP3多肽和多核苷酸、和其作为药物靶标用于生产药物和生物制品的用途
实施例2_1：簇W93943的描述
簇W93943(内部编号72425829)以感兴趣的6种转录物为特征，所述转录物的名称在表5中给出。所选择的蛋白变体在表6中给出。
表5-感兴趣的转录物
转录物名称
W93943_T0(SEQ ID NO：1)
W93943_T5(SEQ ID NO：3)
W93943_T8(SEQ ID NO：4)
W93943_T13(SEQ ID NO：5)
W93943_T14(SEQ ID NO：6)
表6-感兴趣的蛋白
Figure BDA0000079743540001421
这些序列是已知蛋白角质形成细胞相关蛋白3(SwissProt登记号KCP3_人(SEQ ID NO：7)；也称为KCP-3、KRTCAP3)的变体。
KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)在数个大规模研究中被鉴定，所述大规模研究比如角质形成细胞中的分泌蛋白和膜蛋白的鉴定(Bonkobara等人，2003，Br J Dermatol.148(4)：654-64)，分泌蛋白初探(Clark等人2003、Genome Research 13(10)：2265-70)，染色体2和4的注释(Hillier等人2005，Nature 434(7034)：724-31)，和全长cDNA计划(Gerhard等人2004，Genome Res.14(10B：2121-7；Strausberg等人2002，PNAS 99(26)：16899-903)。然而关于KRTCAP3没有特别的信息公开。
除其它具有疏水结构域的人类蛋白之外，WO2000000506中报道了由对应的W93943_T13(SEQ ID NO：5)所编码的W93943_P17(SEQ ID NO：12)中所描绘的序列。然而WO2000000506专利申请没有教导对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)或W93943_T13(SEQ ID NO：5)的序列在卵巢癌、肺癌或任何其它病状中的差异表达。而且，WO2000000506申请中也没有教导W93943_P17(SEQ ID NO：12)或W93943_T13(SEQ IDNO：5)可用作癌症和/或免疫相关病症的治疗或其诊断的药物靶标。而且，WO2000000506申请没有教导W93943_P17(SEQ ID NO：12)、其可溶性胞外域、和/或其片段特异性的抗体可用作癌症和/或免疫相关病症的治疗的治疗剂或诊断剂。
W93943_P2(SEQ ID NO：7)中所描绘的序列在一些专利申请中被报道。例如，US20070065888除大量的其它基因外报道了W93943_P2(SEQID NO：7)。US20070065888旨在公开用于评价癌症预后和用于治疗用途的包括对多种肿瘤抗原特异性的抗体的方法和试剂。然而US20070065888专利申请没有教导对应于W93943_P2(SEQ ID NO：7)的序列的表达或其抗体的使用与癌症，或乳腺癌、结肠癌或卵巢癌，和/或免疫相关病症的治疗或诊断特别相关。
WO200190304除大量其它基因外报道了W93943_P2(SEQ ID NO：7)序列。WO200190304旨在公开编码新型多肽和与这些多肽结合的抗体的分离的核酸分子。该申请还旨在涉及用于诊断、治疗、预防和/或预后与这些新型多肽相关的疾患的诊断和治疗方法，和涉及用于鉴定这些多核苷酸和多肽的激动剂和拮抗剂的筛选方法。该申请还旨在提供用于抑制或增强这些多肽的生产和功能的方法和/或组合物，包括基于抗体的治疗。然而，WO200190304专利申请没有提供将指导有经验的技术人员使用对由对应于KRTCAP3的序列所编码的多肽特异性的抗体来进行癌症或具体地卵巢癌、肺癌、乳腺癌或结肠癌，和/或免疫相关病症的治疗或诊断的任何具体教导或启发。
WO2004091511除大量其它基因外报道了KRTCAP3。该申请主要涉及旨在用于协助肺细胞的肿瘤病症的诊断的组合物和方法，和筛选用于肿瘤病症的逆转的潜在治疗剂的方法。还依其描述提供了抑制肺肿瘤细胞的生长和治疗含有肺肿瘤细胞的个体的组合物和方法。然而WO2004091511专利申请没有教导对应于KRTCAP3的序列在卵巢癌或乳腺癌或结肠癌或在免疫相关病症中是差异表达的。而且，WO2004091511申请没有教导对KRTCAP3、其可溶性胞外域，和/或其片段特异性的抗体可用作用于癌症，尤其是卵巢癌和/或乳腺癌和/或结肠癌，和/或免疫相关病症的治疗的治疗剂或诊断剂。
US2003100727专利申请和其相关文件公开了PRO9898(角质形成细胞相关蛋白3)并旨在教导用于癌症治疗的对于该蛋白和其它分泌蛋白的抗体的生产和使用。然而这些申请似乎没有教导或提出卵巢癌的治疗或诊断。而且，US2003100727申请没有教导对KRTCAP3、其可溶性胞外域，和/或其片段特异性的抗体可用作用于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌或肺癌和/或免疫相关病症的治疗的治疗剂或诊断剂。
WO06110593专利申请旨在描述通过检测基因的一种或多种或任何组合的表达的差异来检测、诊断、监测和预后癌症的方法，所述基因包括KRTCAP3。WO06110593还旨在描述用于筛选和鉴定调节这样的基因的一种或多种或任何组合和对应的基因产物的表达的化合物的方法。其还提及这样的化合物在癌症的预防、治疗、管理和改善中的用途。该申请涉及描述用于癌症的预防、治疗、管理和改善的有效量的一种或多种治疗物包括抗体的施用，所述治疗物调节所公开的一种或多种癌症靶标的表达和/活性。然而WO06110593申请中没有教导对KRTCAP3、其可溶性胞外域，和/或其片段特异性的抗体和对其特异性的抗体可用作用于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌或肺癌和/或免疫相关病症的治疗的治疗剂或诊断剂。
本申请的申请人先前已在美国专利申请第11/043,860号中公开了W93943_P13(SEQ ID NO：10)和W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列。然而美国专利申请第11/043,860号中没有教导KRTCAP3可溶性胞外域，以及其片段和对其特异性的抗体可用作用于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌或肺癌和/或免疫相关病症的治疗的治疗剂或诊断剂。
特别地，本发明的至少一些实施方案涉及新颖KRTCAP3变体和其不连续部分作为治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶及其类似物的药物靶标的用途。更具体地本发明涉及结合KRTCAP3变体和其部分和变体的诊断性和治疗性多克隆和单克隆抗体和其片段。根据本发明的至少一些实施方案的特定的目的是使用抗KRTCAP3抗原、其分泌性形式或可溶性形式轭合物，或其片段的抗体和抗体片段用于治疗和诊断卵巢癌和/或乳腺癌、和/或结肠癌和/或免疫相关病症，其中该抗原是差异表达的。
已知的KRTCAP3蛋白(SEQ ID NO：7)多态性79位的A到T；14位的G到R；和114位的L到P先前已被报道。
角质形成细胞相关蛋白3(SEQ ID NO：7)被认为是多次跨膜蛋白。
如上所述，簇W93943以5种转录物为特征，所述5种转录物在以上表5中列出。这些转录物编码作为蛋白角质形成细胞相关蛋白3(SEQ IDNO：7)的变体的蛋白。现已提供了根据本发明的至少一些实施方案的每个变体蛋白的描述。
蛋白W93943_P2(SEQ ID NO：7)由以下的转录物所编码：W93943_T0(SEQ ID NO：1)。转录物W93943_T0(SEQ ID NO：1)的编码部分起始于77位且终止于796位。转录物还具有以下的SNP，如表7中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表7-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001451
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W93943_P13(SEQ IDNO：10)具有由转录物W93943_T5(SEQ ID NO：3)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.W93943_P13(SEQ ID NO：10)和已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸1-71且还对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸1-71的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLL至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与具有对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸72-97的序列VSAAGDPGGGRAPGEPSRPKALCLPQ(SEQ ID NO：146)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸72-240且还对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸98-266的SVSVGLVALLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQLEEMTELESPKCKRQENEQLLDQNQEIRASQRSWV至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列VSAAGDPGGGRAPGEPSRPKALCLPQ(SEQ ID NO：146)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
2.W93943_P13(SEQ ID NO：10)和已知蛋白NP_776252(SEQ IDNO：8)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸1-71且还对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸1-71的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLL至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与具有对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸72-97的序列VSAAGDPGGGRAPGEPSRPKALCLPQ(SEQ ID NO：146)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸72-78且还对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸98-104的SVSVGLV至少90％同源，对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸105的桥接氨基酸A，和第四氨基酸序列，所述第四氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸80-240且还对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的氨基酸106-266的LLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQLEEMTELESPKCKRQENEQLLDQNQEIRASQRSWV至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、第三氨基酸序列、桥接氨基酸和第四氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P13(SEQ ID NO：10)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P13(SEQ ID NO：10)的序列VSAAGDPGGGRAPGEPSRPKALCLPQ(SEQ ID NO：146)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白W93943_P13(SEQ ID NO：10)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表8中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表8：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置             替代的氨基酸
14                                G-＞R
140                               L-＞P
转录物W93943_T5(SEQ ID NO：3)的编码部分起始于77位且终止于874位。转录物具有如下的SNP，如表9中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表9-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001471
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W93943_P14(SEQ IDNO：11)具有由转录物W93943_T8(SEQ ID NO：4)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.W93943_P14(SEQ ID NO：11)和已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸1-205且还对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸1-205的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLVALLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQ至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与具有对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸206-221的序列VRKANRKGSFHRDWLC(SEQ ID NO：147)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P14(SEQ ID NO：11)的序列VRKANRKGSFHRDWLC(SEQ ID NO：147)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
2.W93943_P14(SEQ ID NO：11)和已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸1-78且还对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸1-78的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLV至少90％同源，对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸79的桥接氨基酸A，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸80-205且还对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸80-205的LLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQ至少90％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与具有对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的氨基酸206-221的序列VRKANRKGSFHRDWLC(SEQ ID NO：147)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列、桥接氨基酸、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P14(SEQ ID NO：11)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P14(SEQ ID NO：11)的序列VRKANRKGSFHRDWLC(SEQ ID NO：147)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白W93943_P14(SEQ ID NO：11)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表10中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表10：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置              替代的氨基酸
14                                 G-＞R
114                                L-＞P
转录物W93943_T8(SEQ ID NO：4)的编码部分起始于77位且终止于739位。转录物具有如下的SNP，如表11中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表11-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001501
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W93943_P17(SEQ IDNO：12)具有由转录物W93943_T13(SEQ ID NO：5)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.W93943_P17(SEQ ID NO：12)和已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸1-205且还对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸1-205的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLVALLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAAL SGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQ至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与具有对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸206-231的序列VVAGCDARVKQKAWQPRFPGIKVKAL(SEQ ID NO：148)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P17(SEQ ID NO：12)的序列VVAGCDARVKQKAWQPRFPGIKVKAL(SEQ ID NO：148)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
2.W93943_P17(SEQ ID NO：12)和已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸1-78且还对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸1-78的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLV至少90％同源，对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸79的桥接氨基酸A，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸80-205且还对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸80-205的LLASRNLLRPPLHWVLLALALVNLLLSVACSLGLLLAVSLTVANGGRRLIADCHPGLLDPLVPLDEGPGHTDCPFDPTRIYDTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQ至少90％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与具有对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的氨基酸206-231的序列VVAGCDARVKQKAWQPRFPGIKVKAL(SEQ IDNO：148)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列、桥接氨基酸、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P17(SEQ ID NO：12)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包括与W93943_P17(SEQ ID NO：12)的序列VVAGCDARVKQKAWQPRFPGIKVKAL(SEQ ID NO：148)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白W93943_P17(SEQ ID NO：12)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表12中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表12：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置                 替代的氨基
14                                    G-＞R
114                                   L-＞P
转录物W93943_T13(SEQ ID NO：5)的编码部分起始于77位且终止于769位。转录物具有如下的SNP，如表13中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表13-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001521
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W93943_P18(SEQ IDNO：13)具有由转录物W93943_T14(SEQ ID NO：6)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.W93943_P18(SEQ ID NO：13)和已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸1-91且还对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸1-91的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLVALLASRNLLRPPL至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白KCP3_人(SEQ ID NO：7)的氨基酸161-240且对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸92-171的DTALALWIPSLLMSAGEAALSGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQLEEMTELESPKCKRQENEQLLDQNQEIRASQRSWV至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包括长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含LD，具有如下的结构：起始于氨基酸编号91-x至91中的任何位置；且终止于氨基酸编号92+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
2.W93943_P18(SEQ ID NO：13)和已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸1-78且还对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸1-78的MRRCSLCAFDAARGPRRLMRVGLALILVGHVNLLLGAVLHGTVLRHVANPRGAVTPEYTVANVISVGSGLLSVSVGLV至少90％同源，对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸79的桥接氨基酸A，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸80-91且还对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸80-91的LLASRNLLRPPL至少90％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_776252(SEQ ID NO：8)的氨基酸161-240且对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的氨基酸92-171的DTALALWIPSLLMSAGEAAL SGYCCVAALTLRGVGPCRKDGLQGQLEEMTELESPKCKRQENEQLLDQNQEIRASQRSWV至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、桥接氨基酸、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于W93943_P18(SEQ ID NO：13)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包括长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含LD，具有如下的结构：起始于氨基酸编号91-x至91中的任何位置；且终止于氨基酸编号92+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白W93943_P18(SEQ ID NO：13)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表14中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表14：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置             替代的氨基酸
14                                G-＞R
转录物W93943_T14(SEQ ID NO：6)的编码部分起始于77位且终止于589位。转录物还具有以下的SNP，如表15中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表15-核酸SNP
多态性                            核苷酸序列上的SNP位置
G-＞A                             116，652
G-＞C                             116
实施例2_2：KRTCAP3转录物的表达的分析
本文实施例1中所描述的MED探索引擎被用来评估KRTCAP3转录物的表达。如图1中所显示的，发现KRTCAP3转录物在肺癌中过表达。图1显示了Affymetrix探针组235148_at的表达图。图1显示了KRTCAP3转录物在来自肺癌实验和正常肺实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，KRTCAP3转录物相对于其在正常肺中(圆圈标记)的表达，在肺癌组织中(菱形标记)过表达。
在正常组织和癌性卵巢组织中由序列名称W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)中所描绘的扩增子可检测的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)W93943转录物的表达
通过或根据seg7_10F1R1——W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)扩增子和引物W93943_seg7-10F1(SEQ ID NO：92)和W93943_seg7-10R1(SEQ ID NO：93)可检测的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)转录物的表达在卵巢套组和正常套组中通过实时PCR来测量。所用的样品相应地在实施例1中的表3和表4中被详细描述。
卵巢套组-
对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以正常样品(样品编号52-78，以上表4)的量的中值，以获得对于每个样品的相对于正常样品的中值的上调倍数的值。
图2是柱状图，显示了以上指出的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)转录物在癌性卵巢癌样品中相对于正常样品的过表达。
如从图2中明显的，通过以上的扩增子在浆液癌、粘液癌、子宫内膜样癌和腺癌样品中可检测的KRTCAP3转录物的表达显著高于在非癌性样品(样品编号52-78，以上表4)中的表达。显著地，在38个浆液癌样品的33个中、在12个粘液癌样品的10个中、在10个子宫内膜样癌样品的7个中和在69个腺癌样品的56个中发现了至少5倍的过表达。
利用统计学分析检验了这些结果的显著性，如以下所描述。
KRTCAP3转录物在卵巢浆液癌样品、卵巢粘液癌样品、卵巢子宫内膜样品和卵巢腺癌样品中通过以上的扩增子可检测的表达水平与正常组织样品相比的差异的P值通过T检验来测定，分别为，6.32e-005、8.72e-003、1.04e-002和2.33e-005。
发现5倍过表达的阈值区分浆液癌样品、粘液癌样品、子宫内膜样癌样品和腺癌样品和正常样品，且由Fisher精确检验所检验的P值分别为4.01e-012、1.07e-006、8.51e-005和8.77e-013。
以上的值显示了结果的统计学显著性。
正常套组-
对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以卵巢样品(样品编号31-34，以上表3)的量的中值，以获得相对于卵巢样品的中值的每个样品的相对表达的值。
图3是柱状图，显示了在不同的正常组织中通过序列名称W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)所描述的扩增子可检测的KRTCAP3(角质形成细胞相关蛋白3)W93943转录物的过表达。
引物对也是任选地且优选地包括在本发明中；例如，对于以上实验，使用了仅作为适宜引物对的非限制性示例的以下引物对：W93943_seg7-10F1正向引物(SEQ ID NO：92)；和W93943_seg7-10R1反向引物(SEQ ID NO：93)。
本发明还优选地包括通过任何适宜引物对所获得的任何扩增子；例如，对于以上实验，获得了仅作为适宜扩增子的非限制性示例的以下扩增子：W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94)。
正向引物(W93943_seg7-10F1)(SEQ ID NO：92)：
CCCCTTTGACCCCACAAGA
反向引物(W93943_seg7-10R1)(SEQ ID NO：93)：
CAGCCACACAGCAGTAACCAG
扩增子(W93943_seg7-10F1R1(SEQ ID NO：94))：
CCCCTTTGACCCCACAAGAATCTATGATACAGCCTTGGCTCTCTGGATCCCTTCTTTGCTCATGTCTGCAGGGGAGGCTGCTCTATCTGGTTACTGCTGTGTGGCTG
在正常组织和癌性卵巢组织中由序列名称W93943_seg3j4-6F2R1(SEQ ID NO：171)中所描绘的扩增子可检测的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)W93943转录物的表达
通过或根据W93943_seg3j4-6F2R1扩增子(SEQ ID NO：171)和引物W93943_seg3j4-6F2(SEQ ID NO：169)和W93943_seg3j4-6R1(SEQ ID NO：170)可检测的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物的表达通过实时PCR来测量。平行地，对一些管家基因——SDHA(GenBank登录号NM_004168；扩增子-SDHA-扩增子)、HPRT1(GenBank登录号NM_000194；扩增子-HPRT1-扩增子)和G6PD(GenBank登录号NM_000402；扩增子-G6PD-扩增子)的表达进行相似的测量。对于每个RT样品，按照如“材料和方法”章节中的标准化方法2中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以正常样品(样品编号53、60、61、63、64、65、66、67、68、71、72、73、74、76和77，以上表4)的量的中值，以获得相对于正常样品的中值的每个样品的上调倍数的值。
图4是柱状图，显示了以上指出的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物在癌性卵巢癌样品中相对于正常样品的过表达。
如从图4中明显的，通过以上的扩增子在浆液癌、粘液癌和腺癌样品中可检测的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物的表达显著高于在非癌性样品(样品编号53、60、61、63、64、65、66、67、68、71、72、73、74、76和77，以上表4)中的表达。显著地，在39个浆液癌样品的25个中、在12个粘液癌样品的6个中和在9个子宫内膜样癌样品的6个中发现了至少5倍的过表达。
利用统计学分析检验了这些结果的显著性，如以下所描述。
人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物在卵巢浆液癌样品中通过以上的扩增子可检测的表达水平与正常组织样品相比的差异的P值通过T检验测定为，8.93e-006。人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物在卵巢粘液癌样品中通过以上的扩增子可检测的表达水平与正常组织样品相比的差异的P值通过T检验测定为1.76e-002。人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物在卵巢子宫内膜样癌样品中通过以上的扩增子可检测的表达水平与正常组织样品相比的差异的P值通过T检验测定为7.94e-003。人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物在卵巢腺癌样品中通过以上的扩增子可检测的表达水平与正常组织样品相比的差异的P值通过T检验测定为，5.75e-006。
发现5倍过表达的阈值区分浆液癌样品和正常样品，且由Fisher精确检验所检验的P值为1.25e-004。发现5倍过表达的阈值区分粘液癌样品和正常样品，且由Fisher精确检验所检验的P值为1.64e-002。发现5倍过表达的阈值区分子宫内膜样癌样品和正常样品，且由Fisher精确检验所检验的P值为3.71e-003。发现5倍过表达的阈值区分腺癌样品和正常样品之，且由Fisher精确检验所检验的P值为1.75e-004。
以上的值显示了结果的统计学显著性。
引物对也是任选地且优选地包括在本发明中；例如，对于以上实验，使用了仅作为适宜引物对的非限制性示例的以下引物对：W93943_seg3j4-6F2正向引物(SEQ ID NO：169)；和W93943_seg3j4-6R1反向引物(SEQ ID NO：170)。
本发明还优选地包括通过任何适宜引物对所获得的任何扩增子；例如，对于以上实验，获得了仅作为适宜扩增子的非限制性示例的以下扩增子：W93943_seg3j4-6F2R1(SEQ ID NO：171)。
正向引物(W93943_seg3j4-6F2)(SEQ ID NO：169)：AGAGCCCAGCAGGCCAAAG
反向引物(W93943_seg3j4-6R1)(SEQ ID NO：170)：AGCAGGACCCAGTGCAGTG
扩增子(W93943_seg3j4-6F2R1)(SEQ ID NO：171)：
AGAGCCCAGCAGGCCAAAGGCTTTGTGTCTTCCACAGAGCGTTTCCGTGGGACTTGTGGCCCTCCTGGCGTCCAGGAACCTTCTTCGCCCTCCACTGCACTGGGTCCTGCT
在不同的正常组织中由序列名称W93943_seg3j4-6F2R1(SEQ ID NO：171)中所描绘的扩增子可检测的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)W93943转录物的表达
通过或根据W93943_seg3j4-6F2R1扩增子(SEQ ID NO：171)和引物W93943_seg3j4-6F2(SEQ ID NO：169)和W93943_seg3j4-6R1(SEQ ID NO：170)可检测的人类角质形成细胞相关蛋白3(KRTCAP3)转录物的表达通过实时PCR来测量。平行地，对一些管家基因——SDHA(GenBank登录号NM_004168；扩增子-SDHA-扩增子)、泛素(GenBank登录号BC000449；扩增子-泛素-扩增子)和TATA框(GenBank登录号NM_003194；TATA扩增子)的表达进行相似的测量。对于每个RT样品，按照如“材料和方法”章节中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以卵巢样品(样品编号31、32、33和34，以上表3)的量的中值，以获得相对于卵巢样品的中值的每个样品的相对表达的值。
正向引物(W93943_seg3j4-6F2)：AGAGCCCAGCAGGCCAAAG
反向引物(W93943_seg3j4-6R1)：AGCAGGACCCAGTGCAGTG
扩增子(W93943_seg3j4-6F2R1)：
AGAGCCCAGCAGGCCAAAGGCTTTGTGTCTTCCACAGAGCGTTTCCGTGGGACTTGTGGCCCTCCTGGCGTCCAGGAACCTTCTTCGCCCTCCACTGCACTGGGTCCTGCT
图5是柱状图，显示了在不同的正常组织中通过或根据序列名称W93943_seg3j4-6F2R1扩增子(SEQ ID NO：171)可检测的KRTCAP3转录物的过表达。
实施例2_3
与EGFP未融合和与EGFP融合的KRTCAP3ORF的克隆
按照以下所描述的进行与EGFP融合的KRTCAP3可读框(ORF)的克隆，然后进行未融合的KRTCAP3ORF的克隆。
KRTCAP3-EGFP(SEQ ID NO：110)的克隆用两个步骤来完成。第一步构建EGFP表达载体，然后第二步将KRTCAP3ORF亚克隆到EGFP表达构建体中。按照以下构建EGFP表达载体：用NheI和NotI消化EGFP-N1载体(Clontech目录号：6085-1)以切下EGFP基因。然后将EGFP插入物连接到先前已被同样的酶消化的pIRESpuro3(Clontech目录号：631619)中，以获得EGFP-pIRESpuro3载体。利用以下步骤来完成KRTCAP3可读框(ORF)的克隆：
1.按照以下进行反转录反应：将10μg纯化的肺癌RNA与150ng的Random Hexamer引物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，目录号48190-011)和500μM的dNTP在156μl的总体积中混合。将混合物在65℃下孵育5分钟，并接着在冰上快速冷却。然后，添加50μl的5X Superscript II第一链缓冲液(Invitrogen，目录号：18064-014，货号(part number)：Y00146)、24μl的0.1M DTT和400单位的RNasin(Promega，Milwaukee，WS，U.S.A.，目录号：N2511)，然后将混合物在25℃下孵育10分钟，然后在42℃下进一步孵育2分钟。然后，添加10μl(2000单位)的Superscript II(Invitrogen，目录号：18064-014)并将反应物(终体积250μl)在42℃下孵育50分钟且然后在70℃下灭活15分钟。将所得的cDNA在TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA pH 8)中1∶20稀释。
表16中给出了关于KRTCAP3ORF的亚克隆的PCR细节。PCR#1被设计以生成KRTCAP3ORF DNA(SEQ ID NO：112)，然后将其亚克隆到以上所描述的EGFP pIRESpuro3中的EGFP的上游，而PCR#2被设计以生成KRTCAP3ORF DNA，然后将其亚克隆到来自以上的EGFP pIRESpuro的下游。
2.利用Platinum PFXTM(Invitrogen.，Carlsbad，CA，USA，目录号：1178-021)在以下条件下完成PCR：50μl的总反应体积中的5μl的PlatinumPFX 10x缓冲液；5μl-来自以上的cDNA；2μl-10mM dNTP(每种核苷酸2.5mM)；0.5μl-Platinum PFX酶；37μl-H2O；和1.5μl-每种引物(10μM)；反应程序为：95℃中5分钟；35个循环：94℃下30秒、55℃下30秒、68℃下50秒；然后68℃下10分钟。所用的引物包括如以下表16中所列的对应于蛋白的所需坐标的基因特异性序列、限制性酶切位点和Kozak序列。表16中的粗体字母代表特定的基因序列，而用于克隆目的的限制性位点延伸为斜体和kozak序列为下划线。
将5μl的PCR产物加载到用溴化乙锭染色的1％的琼脂糖凝胶上，在100V下在1xTBE溶液中进行电泳，并在UV光下观察。对所预期的条带大小进行验证后，对剩余的PCR产物进行处理以利用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QiagenTM，Valencia，CA，U.S.A.，目录号28106)进行DNA纯化。如表16中所列，用合适的限制性酶(New England Biolabs，Beverly，MA，U.S.A.)消化所提取的PCR产物。消化后，如以上所描述的将DNA加载到1％的琼脂糖凝胶上。将所期望的条带大小切下并利用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号：28707)从凝胶中进行提取。
利用LigaFastTM快速DNA连接系统(Promega，目录号：M8221)将消化的ORF DNA连接到EGFP_pIRESpuro3载体。根据生产商的说明，将所得的DNA转化到感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBC Bioscience，Taipei，Taiwan，目录号：RH816)中，然后涂布到用于重组质粒的选择的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。
第二天，在选择性平板上生长的来自每个转化的大量菌落被取出，通过在另一选择性平板上划线接种并利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号：M7122)通过PCR以进行进一步分析。利用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR筛选阳性克隆(数据未示出)。所有PCR循环完成后，按以上所描述的利用1％的琼脂糖凝胶对反应物的一半进行分析。验证所期望的条带大小后，使来自每个连接反应的2个阳性菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml Terrific肉汤中生长，并在37℃下震荡过夜。利用QiaprepTM Spin Miniprep Kit(Qiagen，目录号：27106)从细菌培养物中分离质粒DNA。通过对插入物进行测序来验证准确的克隆(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。验证无差错的菌落(即，ORF中无突变)后，将重组质粒进行进一步的分析。
将来自以上的两种KRTCAP3-EGFP构建体用于亚克隆KRTCAP3pIRESpuro3构建体。亚克隆按以下来完成：利用BlpI和NheI限制性酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，U.S.A.)对KRTCAP3-EGFP pIRESpuro3进行双酶切，然后切下对应于KRTCAP3的5′端的220个碱基对的片段。接着，利用同样的限制性酶(New England Biolabs，Beverly，MA，U.S.A.)对EGFP-KRTCAP3pIRESpuro3也进行双酶切，然后切下对应于KRTCAP3和pIRESpuro序列的3′端的5629个碱基对片段。连接两个片段并按以上所描述的将其转化到大肠杆菌中。将所得的构建体称为KRTCAP3pIRESpuro3。
图6A-C中显示了所得的KRTCAP3-EGFP；EGFP-KRTCAP3和KRTCAP3的DNA序列；对应于KRTCAP3ORF序列的基因特异性序列以粗体标示，EGFP序列为斜体，且中间接头区域为非粗体的。图6A代表了KRTCAP3_EGFP(SEQ ID NO：110)的DNA序列；图6B代表了EGFP_KRTCAP3(SEQ ID NO：111)的DNA序列；图6C代表了KRTCAP3(SEQ ID NO：112)的DNA序列。
图7A-C显示了KRTCAP3-EGFP；EGFP-KRTCAP3和KRTCAP3的氨基酸序列；对应于KRTCAP3ORF的氨基酸序列以粗体标示，EGFP序列为斜体，且中间接头区域为非粗体的。图7A代表了KRTCAP3_EGFP蛋白(SEQ ID NO：113)的氨基酸序列；图7B代表了EGFP_KRTCAP3蛋白(SEQ ID NO：114)的氨基酸序列；图7C代表了KRTCAP3蛋白(SEQ IDNO：7)的氨基酸序列。
表20：KRT融合到EGFP的克隆细节
Figure BDA0000079743540001621
实施例2_4测定KRTCAP3的细胞定位
预测KRTCAP3蛋白为具有四个跨膜结构域的跨膜蛋白。为验证KRTCAP3的细胞定位，按以上所描述的将KRTCAP3克隆为EGFP(增强型绿色荧光蛋白)融合蛋白。在瞬时转染(Chen等人，Molecular Vision 2002；8；372-388)后利用共聚焦显微镜观察蛋白定位。在转染后48小时观察细胞的荧光产物的存在。
随后按照以下将EGFP-KRTCAP3pIRESpuro3(SEQ ID NO：111)和KRTCAP3-EGFP pIRESpuro3(SEQ ID NO：110)构建体瞬时转染到HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到13mm直径的无菌玻璃盖玻片(Marienfeld，目录号：01 115 30)上，将盖玻片放置到6孔板中，使用2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清、Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-lA]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μl FuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。
瞬时转染后48小时，将盖玻片上的细胞进行进一步免疫染色处理并在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，然后用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)(稀释于PBS中)的溶液固定盖玻片15分钟。通过在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)(稀释于PBS中)中孵育5分钟而完成PFA的猝灭。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用0.1％triton-X100(稀释于PBS中)透化细胞5分钟。两次5分钟的PBS洗涤后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)完成非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用在含5％BSA的PBS中1∶500稀释的兔抗GFP抗体(MBL International Corporation，目录号：598)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时，接着在PBS中进行三次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Gel Mount Aqueous medium)(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。结果显示在图8中。
利用两种EGFP融合的构建体(EGFP-KRTCAP3 pIRESpuro3和KRTCAP3-EGFP pIRESpuro3)证明了KRTCAP3的质膜定位。通过检测EGFP融合蛋白荧光(图8A)或通过利用抗GFP(图8A)的免疫染色来观察细胞定位。仅示出了对于一种构建体(EGFP-KRTCAP3 pIRESpuro3)的数据。
图8A通过EGFP的绿色荧光显示了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位在细胞膜。该图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜来获得的。
图8B通过轭合Cy3荧光团的抗GFP抗体的红色荧光显示了EGFP_KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：114)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位在细胞膜。该图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜来获得的。
实施例2_5
测定KRTCAP3在细胞膜中的定向
通过以上的EGFP-KRTCAP3瞬时转染的细胞的免疫染色来测定KRTCAP3蛋白在细胞中的定向。免疫染色如上所述进行，但此次利用非透化的瞬时转染的HEK 293T细胞(与实施例2_4相对)来完成抗体染色。细胞透化使抗体渗透入细胞，因此，非透化的细胞的免疫染色将导致位于细胞的胞外区域的蛋白表位的检测，而将不检测内部的表位。
瞬时转染后48小时，将盖玻片上的细胞进行进一步的处理以免疫染色并通过共聚焦显微镜进行分析。将盖玻片在冷的PBS中洗涤2次并用5％的BSA(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)在冰上封闭盖玻片的非特异性区域，持续20分钟。且然后利用在含5％BSA的PBS中1∶500稀释的兔抗GFP抗体(MBL International Corporation，目录号：598)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在冷PBS中进行3次5分钟的洗涤后，用3％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)(稀释于PBS中)的溶液固定盖玻片上的细胞15分钟。通过在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)(稀释于PBS中)中孵育5分钟而完成PFA的猝灭，然后在PBS中进行两次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
图9中所显示的结果表明KRTCAP3的氨基末端区域在细胞表面的内部。在非透化的瞬时转染的EGFP_KRTCAP3 HEK 293T细胞中所观察到的EGFP的绿色荧光，表明了融合蛋白定位到细胞膜上(图9A)，然而，这些细胞中的抗GFP抗体的红色荧光的不存在表明EGFP_KRTCAP3融合蛋白位于质膜中而其氨基末端朝向细胞溶胶(图9B)。该图像是利用共聚焦显微镜的40x物镜来获得的。
实施例2_6
对KRTCAP3变体特异性的多克隆抗体的产生
所有多克隆Ab产生过程，包括肽合成、肽轭合、动物免疫、采血和抗体纯化，均在Sigma-Aldrich(Israel)进行。
动物
对两对兔进行注射以制备KRTCAP3的抗体(兔编号5257和5258，5259和5261)。所有动物照管、处理和注射均由Sigma(Israel)来进行。
肽合成
用于兔免疫的肽如下：EQLLDQNQEIRASQRS-C(KRT223(SEQ IDNO：115)，取自对应于KRTCAP3蛋白(KRTCAP3_P2；SEQ ID NO：7)的氨基酸223-238的C末端的序列，其中为了KLH轭合将半胱氨酸添加到该肽的C’末端，和LDEGPGHTDCPFDPTR(KRT143 SEQ ID NO：116)，取自对应于KRTCAP3蛋白(KRTCAP3_P2；SEQ ID NO：7)的氨基酸143-160的ECD环的序列。合成了具有95％纯度的25mg的每种肽，将其中的10mg与KLH载体轭合。
免疫
按照以下利用对应的轭合的肽来免疫每对兔：利用KRT223肽(KRT223 SEQ ID NO：115)免疫兔5257和5258，且利用KRT143肽(KRT143 SEQ ID NO：116)免疫兔5259和5261。每两周免疫动物。采集3个2-3ml的检验血并利用ELISA进行分析。从每个兔采集100ml的生产血。
抗体纯化
对来自两个兔血清的抗体进行纯化：兔5257(利用肽KRT223免疫的)和兔5261(利用肽KRT143免疫的)。利用产生相应的抗体的肽进行亲和纯化。利用ELISA对纯化的抗体进行分析。
实施例2_7
利用KRTCAP3转染细胞裂解物通过蛋白质印迹对纯化的KRTCAP3抗体的表征
为验证针对所选择的KRTCAP3的肽而产生的抗体的特异性，利用来自如以上所描述的兔5257；5258；5259和5261的非纯化的血清和KRTCAP3稳定转染体细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。
生成了两种稳定转染的库，KRTCAP3 pIRESpuro3和阴性对照空载pIRESpuro3。如以下将两种构建体转染到HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到适合组织培养的无菌6孔板中，使用2ml预热的完全培养基，DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清、Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μl FuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。转染后48小时，将转染的细胞转移到含有15ml选择培养基的75cm2的组织培养瓶，所述选择培养基为：含5μg\ml嘌呤霉素(Sigma，目录号P8833)的完全培养基。将细胞放置在培养箱中，每3-4天更换培养基，直到观察到克隆形成。
足够量的细胞通过选择后，收获3-5百万个细胞。在含蛋白酶抑制剂(Roche，目录号：11873580001)的300ul的RIPA缓冲液(50mM Tris HClpH 8，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解细胞，在4℃下持续1.5小时。在4℃下在20,000xg下离心15分钟后，将透明上清液转移到干净的管中并添加100ul的4X
Figure BDA0000079743540001671
LDS样品缓冲液(Invitrogen，目录号：NP0007)。并且，添加1，4-二硫苏糖醇(DTT；一种还原剂)达100mM的终浓度。然后将样品在100℃下孵育3分钟，然后在20,000xg下离心1分钟。以每泳道25ul样品将样品加载到12％的
Figure BDA0000079743540001672
Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号：NP0341)中而进行SDS-PAGE(Laemmli、U.K.，Nature 1970；227；680-685)，且凝胶在1xMOPS SDS电泳缓冲液(Invitrogen，目录号：NP0001)中电泳，根据生产商的说明利用XCell SureLockTM Mini-Cell(Invitrogen，目录号：E10001)进行电泳。根据生产商的说明利用XCellTM II印迹装置(Invitrogen，目录号E19051)将所分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，目录号：401385)。
按照如下对含有印迹蛋白的膜进行抗体检测：
通过在室温下在Tris缓冲盐溶液(TBS)+0.05％Tween-20(TBST)中稀释的10％的脱脂乳中孵育1小时(所有随后的孵育均在室温下发生，持续1小时)而封闭膜的非特异性区域。然后用第一抗体溶液替换封闭溶液，第一抗体溶液为：在封闭溶液中1∶500稀释的以上所描述的兔抗-KRT抗体的第三次采血(纯化前)。3次10分钟的洗涤后，使用第二抗体：在封闭溶液中1∶10,000稀释的轭合辣根过氧化物酶的山羊抗兔(JacksonImmunoResearch，目录号111-035-144)。3次10分钟的洗涤后，使用ECL底物(GE-Amersham，目录号：RPN2209)1分钟，然后暴露于X-射线胶片(Fuji，目录号：100NIF)。
图10A-D显示了四种血清5257；5258；5259和5261均分别识别KRTCAP3蛋白。通过由KRTCAP3转染细胞所获得的而在空载pIRESpuro3转染细胞中不存在的差异信号证明了特异性。
实施例2_8
通过KRTCAP3转染细胞的免疫染色对纯化的KRTCAP3抗体的表征
为进一步表征针对KRTCAP3多肽而产生的亲和纯化的抗体，利用KRTCAP3稳定转染的HEK293T细胞的免疫染色对抗体-蛋白相互作用进行研究。
将以上所描述的稳定表达KRTCAP3的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)或空载体pIRES puro3以每孔500,000个细胞接种到直径13mm的无菌玻璃盖玻片上(Marienfeld，目录号：01 115 30)，所述盖玻片被放置到6孔板中，使用了2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：04-001-IA]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：03-020-1A]。
将细胞接种到盖玻片上后48小时，将其进行进一步免疫染色并在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，并用天然缓冲的10％福尔马林溶液(Formalin solution，natural buffered 10％)(Sigma，目录号：HT501128)固定盖玻片15分钟。在PBS中进行2次5分钟的洗涤后，用0.1％的triton-X100(稀释于PBS中)对细胞进行透化，持续5分钟。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)进行非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用以上所描述的纯化的兔抗KRT抗体：在含5％BSA的PBS中1∶2000稀释的抗KRT143(RB 5261，0.9mg/ml)和在5％BSA中1∶1000稀释的抗KRT223(RB5257，1mg/ml)，在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。将抗体在PBS中进行3次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(JacksonImmunoResearch，目录号：711-165-152)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
在KRTCAP3转染的细胞上利用纯化的KRT143抗体和KRT223抗体观察到了特异的细胞染色(分别为图11A和图11C)，然而，使用这些抗体在pIRESpuro3HEK-293T转染细胞上没有观察到染色(分别为图11B和11D)。图11A和11C中所获得的红色荧光相对于图11B和11D中的信号的不存在表明了KRT143和KRT223抗体对KRTCAP3_P2(SEQ ID NO：7)的特异性。
实施例2_9：在组织样品上进行KRT223和KRT143抗体的免疫组织化学分析
抗体滴定方案和阳性对照研究结果：
利用兔多克隆抗体KRT223和KRT143在LifeSpan Biosciences(USA)进行抗体滴定实验以建立将导致最小化的背景和最大化的信号检测的浓度。在由LifeSpan BioSciences(USA)提供的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织上和作为阳性对照的瞬时转染KRTCAP3的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞系上和作为阴性对照的空载体上以20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml和2.5ug/ml进行连续稀释。该研究表明对于抗体KRT223最高的信噪比在2.5ug/ml的浓度，且对于抗体KRT143在2.5ug/ml和1.25ug/ml的浓度。抗体KRT223和KRT143被用作第一抗体，且主要的检测系统由Vector抗兔二抗(BA-1000)和VectorABC-AP试剂盒(AK-5000)组成，所述Vector ABC-AP试剂盒具有被用来产生紫红色沉淀物的Vector Red底物试剂盒(SK-5100)。通过在柠檬酸钠缓冲液中蒸汽加热而进行抗原修复。利用阳性对照抗体(CD31和波形蛋白(vimentin))对组织进行染色以保证组织抗原被保留且可进行免疫组织化学分析。仅选择显示阳性的CD31和波形蛋白染色的组织用于本研究。阴性对照由在邻近切片上在第一抗体不存在的情况下进行完整的免疫组织化学步骤组成。利用连接到Nikon显微镜的DVC1310C数码相机使玻片成像。抗体KRT223在阳性对照细胞中表现良好且在组织中显示了呈特异性分布的染色。染色为膜染色和细胞质染色(数据未示出)，而抗体KRT143显示了较宽的阳性谱。
在卵巢组织样品上对KRT223的免疫组织化学分析
在正常卵巢样品中，以及在一系列的卵巢癌的样品和来自肠胃肿瘤的转移癌的样品中检查抗体KRT223。利用2.5ug/ml浓度的抗体KRT223按以上所描述的进行染色。在正常卵巢样品中，在良性卵巢表面上皮(间皮)中已鉴定阳性染色，且较弱的染色常存在于卵母细胞、卵泡细胞、卵泡膜细胞和卵巢基质中。如图12中所示，在约20％的样品中卵巢癌显示了弱的阳性染色，而如图13中所示，在来自肠胃肿瘤的转移癌样品中鉴定了更显著的染色，该肿瘤常转移至卵巢，且有时被称为“Krukenberg”肿瘤。
图12表明了利用抗体KRT223，获自一位52岁女性的卵巢癌样品的强免疫组织化学染色。利用0-4级来定量信号，该信号强度为2。
图13表明了利用抗体KRT223，来自从一位31岁女性获得的转移性肠胃肿瘤的腺癌样品的显著的免疫组织化学染色。利用0-4级来定量信号，该信号强度为3。
在常见的癌组织样品上对KRT143的免疫组织化学分析
在一系列常见的癌症中检查2.5ug/ml和1.25ug/ml的浓度的抗体KRT143，所述常见癌症包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。从本研究中获得的染色的质量非常好，在分泌物、血清和渐进性坏死碎片中具有不同的细胞质染色、膜染色、核染色和偶见的细胞外染色(数据未示出)。在绝大部分癌症中鉴定了阳性染色。在卵巢癌、肺癌和前列腺癌的个体样品中鉴定了最显著的染色，其中在恶性细胞中存在聚集的强细胞质染色。其余的大多数癌症亚型在恶性细胞中显示了较弱的但均匀的核染色和细胞质染色(数据未示出)。另外的阳性细胞类型包括炎性细胞、外周神经和神经节细胞。血管平滑肌和良性前列腺纤维肌基质也偶见阳性(数据未示出)。需要进一步的研究和校准来评估抗体KRT143特异性。
实施例3：FAM26F多肽和多核苷酸，及其作为生产药物和生物制品的药物靶标的用途
实施例3_1：簇T82906的描述
簇T82906(内部编号72304721)以感兴趣的3个转录物为特征，其名称在表17中给出。所选择的蛋白变体在表18中给出。
表17-感兴趣的转录物
转录物名称
T82906_T0(SEQ ID NO：125)
T82906_T1(SEQ ID NO：14)
表18-感兴趣的蛋白
蛋白名称                        对应转录物
T82906_P3(SEQ ID NO：16)        T82906_T0(SEQ ID NO：125)
T82906_P4(SEQ ID NO：18)        T82906_T1(SEQ ID NO：14)
这些序列是已知蛋白假想蛋白LOC441168(SEQ ID NO：15)(SwissProt登记号NP_001010919，同义名：FAM26F)的变体。
FAM26F(具有序列相似性的家族26，成员F)是在6号染色体的注释(Mungall等人2003，Nature 425(6960)：805-11)中被鉴定的基因之一。关于FAM26F没有公开具体信息。仅FAM26的另一个成员已被注释：FAM26C-钙平衡调节蛋白(Dreses_Werringloer等人2008，Cell133：1149-1161)。
FAM26F抗原已在WO2003025138专利申请中被报道，其声称对应于FAM26F的AI796870和Hs.54277的序列在黑素瘤、肾癌和纤维化病中差异表达。然而，WO2003025138专利申请没有教导，对应于FAM26F的序列在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤和/或免疫相关病症中差异表达。并且，WO2003025138申请也没有教导FAM26F可用作卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤和/或免疫相关病症的治疗或它们的诊断的药物靶标。并且，WO2003025138申请也没有教导对FAM26F、其可溶性胞外域，和/或其片段特异性的抗体可用作卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤和/或免疫相关病症的治疗或它们的诊断的治疗物。
FAM26F抗原还在以下专利申请中被报道：WO9961471、WO2005019258、WO200501692、WO2008079406，其声称对应于FAM26F的序列对于诊断、治疗或预防所选择的免疫相关疾患是有用的。然而这些申请中没有教导或暗示FAM26F可用作卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤的治疗、预防或诊断的药物靶标。
FAM26F抗原还在以下专利申请中被报道：WO200177292、WO200006719，然而，这些申请中没有教导或暗示FAM26F可用作卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤的治疗、预防或诊断的药物靶标。
相对地且令人惊奇地，本发明人发现FAM26F抗原和其不连续部分可任选地用作治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶和类似物的药物靶标。还可任选地产生结合FAM26F和其部分和变体的诊断性和治疗性多克隆抗体和单克隆抗体及其片段。根据本发明的至少一些实施方案，提供了抗FAM26F抗原、其分泌性形式或可溶性形式或ECD和/或其变体、轭合物或片段的抗体和抗体片段以及其片段和变体用于治疗和诊断卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤的用途，其中该抗原是差异表达的。
如上所述，簇T82906以3个转录物为特征，其在以上表17中被列出。这些转录物编码作为蛋白假想蛋白LOC441168(SEQ ID NO：15)的变体的蛋白。现提供了根据本发明的至少一些实施方案每种变体蛋白的描述。
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白T82906_P3(SEQ ID NO：16)由转录物T82906_T0(SEQ ID NO：125)所编码。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系描述如下：
T82906_P3(SEQ ID NO：16)和已知蛋白Q5R3K2_人(SEQ ID NO：17)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于T82906_P3(SEQ ID NO：16)的氨基酸1-3的序列MFP的多肽至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5R3K2_人(SEQ ID NO：17)的氨基酸19-158，且还对应于T82906_P3(SEQ ID NO：16)的氨基酸4-143的VLGWILIAVVIIILLIFTSVTRCLSPVSFLQLKFWKIYLEQEQQILKSKATEHATELAKENIKCFFEGSHPKEYNTPSMKEWQQISSLYTFNPKGQYYSMLHKYVNRKEKTHSIRSTEGDTVIPVLGFVDS SGINSTPEL至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按照如下关于细胞：分泌来定位。
变体蛋白T82906_P3(SEQ ID NO：16)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表19中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表19：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置                  替代的氨基
87                                     Q-＞R
111                                    K-＞T
转录物T82906_T0(SEQ ID NO：125)的编码部分起始于165位且终止于593位。转录物具有如下的SNP，如表20中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表20-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001741
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白T82906_P4(SEQ ID NO：18)由转录物T82906_T1(SEQ ID NO：14)所编码。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定FAM26F蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。FAM26F蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白T82906_P4(SEQ ID NO：18)也具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表21中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表21：氨基酸突变
Figure BDA0000079743540001751
转录物T82906_T1(SEQ ID NO：14)的编码部分起始于232位且终止于1176位。转录物还具有如下的SNP，如表22中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表22-核酸SNP
Figure BDA0000079743540001752
实施例3_2：FAM26F转录物的表达的分析
使用本文的实施例1中所描述的MED探索引擎来评价FAM26F转录物的表达。发现FAM26F转录物在乳腺癌和卵巢癌中过表达，分别如图14和15所示。图14和15显示了Affymetrix探针组229390_at的表达图。图14显示了来自乳腺癌实验和正常乳腺实验的微阵列芯片中FAM26F转录物的表达。如可见的，FAM26F转录物相对于其在正常乳腺中的表达(圆圈标记)在乳腺癌组织中过表达(菱形标记)。图15显示了来自卵巢癌实验的微阵列芯片中FAM26F转录物的表达。如图16中可见的，FAM26F转录物在卵巢癌中相对于正常卵巢样品是过表达的。图16显示了在各种患病组织、正常组织和癌症组织中FAM26F转录物的过表达。
FAM26F qRT PCR结果：
在5ul体积的5ng模板上，以12μl的终体积在384孔板上进行实时RT-PCR分析。按照以下来实现扩增：50℃持续2分钟，95℃持续10分钟，且然后进行95℃持续15秒、接着60℃持续30秒、然后95℃持续15秒的分解步骤、然后65℃持续15秒、95℃持续15秒的最终步骤的40个循环。利用PCR产物连续稀释的标准曲线计算量。
引物：
T82906_seg5-10F1(SEQ ID NO：95)：GGCCAAGGCGTCGGAC
T82906_seg5-10R1(SEQ ID NO：96)：GAAAACTAACTGGAGATAGGCATCG
扩增子：T82906_DB63_seg5-10F1R1(SEQ ID NO：97)：
GGCCAAGGCGTCGGACGTGCAGGACCTCCTGAAGGATCTGAAGGCTCAGTCGCAGGTGTTGGGCTGGATCTTGATAGCAGTTGTTATCATCATTCTTCTGATTTTTACATCTGTCACCCGATGCCTATCTCCAGTTAGTTTTC
用于该qRT-PCR分析的组织套组在本文的表1中被描述。代表qRTPCR结果的柱状图显示于图17中。该结果显示了FAM26F在肾癌、肝癌、肺癌、NHL淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的过表达。
在血液特异性套组和在不同正常组织中通过序列名称T82906_seg5-10F7R5(SEQ ID NO.124)中所描述的扩增子可检测的LOC441168-FAM26T82906转录物的表达
在血液套组(表2)和正常套组(表3)中通过或根据seg5-10F7R5-T82906_seg5-10F7R5(SEQ ID NO：124)扩增子和引物T82906_seg5-10F7(SEQ ID NO：122)和T82906_seg5-10R5(SEQ ID NO：123)可检测的LOC441168-FAM26转录物的表达通过实时PCR来测定。
正常套组-对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以肾样品(样品编号19-23，表3)的量的中值，以获得每个样品的相对于肾样品的中值的相对表达的值，如图18中所示。在脾和PBMC样品中观察到了高表达。
血液套组-对于血液套组-将每个RT样品的标准化的量然后除以正常肾样品(样品编号65-67，以上表2)的量的中值，以获得每个样品的相对于正常肾样品的中值的相对表达的值。
该分析的结果在图19中的柱状图中被描述。以上指出的LOC441168-FAM26转录物在PBMC、B细胞、CD34+、淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者样品中高表达。
正向引物(T82906_seg5-10F7)(SEQ ID NO：122)：
CTGAAGGATCTGAAGGCTCAGTC
反向引物(T82906_seg5-10R5)(SEQ ID NO：123)
GGATCTGCTGCTCCTGTTCC
扩增子(T82906_seg5-10F7R5)(SEQ ID NO：124)：
CTGAAGGATCTGAAGGCTCAGTCGCAGGTGTTGGGCTGGATCTTGATAGCAGTTGTTATCATCATTCTTCTGATTTTTACATCTGTCACCCGATGCCTATCTCCAGTTAGTTTTCTGCAGCTGAAATTCTGGAAAATCTATTTGGAACAGGAGCAGCAGATCC
实施例3_3对FAM26F_P4蛋白特异性的多克隆抗体的产生
所有多克隆抗体产生步骤，包括肽合成、肽轭合、动物免疫、动物照管和处理、采血和抗体纯化，均在EZBiolab(IN，USA)进行。
肽合成-用于兔免疫的肽如下：EKFRAVLDLHVKH(FAM26F-1(SEQID NO：117)，取自对应于FAM26F_P4蛋白(SEQ ID NO：18)的氨基酸2-14的N末端的序列，其中为了KLH轭合将半胱氨酸添加到肽的N’末端，和CNQAKASDVQDLLKD(FAM26F-2(SEQ ID NO：118)，取自对应于FAM26F_P4蛋白(SEQ ID NO：18)的氨基酸155-169的ECD环的序列。合成了具有95％纯度的肽并与KLH载体轭合。
免疫-利用以上的肽来免疫每两对兔。对于每种抗体收集共200ml血清。
抗体纯化-将对来自兔血清的抗体进行纯化。使用免疫亲和柱利用产生相应的抗体的肽进行亲和纯化。
FAM26F-1肽序列SEQ ID NO：117
EKFRAVLDLHVKH
FAM26F-2肽序列SEQ ID NO：118
CNQAKASDVQDLLKD
实施例3_4
与FLAG标签融合的FAM26F_P4的克隆
按照以下所描述的通过PCR进行与FLAG融合的FAM26F可读框(ORF)的克隆。
利用含5％DMSO的Super-Therm(Roche，目录号：JMR-801)，使用来自以上所描述的血液套组的MalLym2的10μl cDNA和0.5μl(10μM)的每种引物#100-921(SEQ ID NO：172)和#100-922(SEQ ID NO：173)以25μl的终反应体积进行PCR；反应程序为94℃下2分钟；45个循环：94℃下30秒、50℃下30秒、72℃下1分钟；然后72℃下10分钟。所用的引物包括基因特异性序列；限制性酶切位点；Kozak序列和FLAG标签。
将5μl的PCR产物加载到用溴化乙锭染色的1.2％的琼脂糖凝胶上，在100V下在1xTAE溶液中进行电泳，并在UV光下观察。对所预期的条带大小进行验证后，利用QiaQuickTM PCR纯化试剂盒(Qiage，目录号28004)对PCR产物进行纯化。利用NheI和AgeI限制性酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，U.S.A.)消化所纯化的PCR产物。消化后，如以上所描述的将DNA加载到1.2％的琼脂糖凝胶上。将所期望的条带大小切下并利用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号：28707)从凝胶中将其提取。利用LigaFastTM快速DNA连接系统(Promega，目录号：M8221)将消化的DNA连接到先前已用上述限制性酶消化的pIRESpuro3载体。根据生产商的说明，将所得的DNA转化到感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBCBioscience，Taipei，Taiwan，目录号：RH816)中，然后接种到用于重组质粒的选择的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。第二天，利用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR筛选阳性菌落(数据未示出)。按以上所描述的利用1.2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行分析。验证所期望的条带大小后，使阳性菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml Terrific肉汤中生长，并在37℃下震荡过夜。利用QiaprepTM SpinMiniprep Kit(Qiagen，目录号：27106)从细菌培养物中分离质粒DNA。通过对插入物进行测序来验证准确的克隆(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。验证无差错的菌落(即，ORF中无突变)后，将重组质粒进行进一步的测定。
图20中显示了所得的FAM26_P4_FLAG(SEQ ID NO：174)的DNA序列；FLAG序列是下划线的。
图21中显示了FAM26_P4_FLAG(SEQ ID NO：175)的氨基酸序列；FLAG序列是下划线的。
实施例3_5
测定FAM26_P4的细胞定位
为测定FAM26_P4的细胞定位，按以上所描述的将FAM26_P4框内克隆到FLAG标签。在瞬时转染(如Chen等人，Molecular Vision 2002；8；372-388所述)后利用共聚焦显微镜观察蛋白定位。在转染后48小时，利用与轭合Cy-3荧光团的抗FLAG抗体(Sigma，目录号：A9594)对细胞进行染色并观察细胞的荧光产物的存在。
如下将FAM26_P4_FLAG(SEQ ID NO：174)pIRESpuro3构建体瞬时转染到HEK-293T细胞中：将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到13mm直径的无菌玻璃盖玻片(Marienfeld，目录号：01 115 30)上，将盖玻片放置到6孔板中，使用2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清、Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μl FuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。瞬时转染后48小时，将盖玻片上的细胞进行进一步免疫染色处理并在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)(稀释于PBS中)的溶液固定盖玻片15分钟。通过在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)(稀释于PBS中)中孵育5分钟而完成PFA的猝灭。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用0.1％triton-X100(稀释于PBS中)透化细胞5分钟。两次5分钟的PBS洗涤后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)完成非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用在含5％BSA的PBS中1∶100稀释的小鼠抗FLAG-Cy3抗体(Sigma，目录号：A9594)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时，接着在PBS中进行三次5分钟的洗涤。利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
图22中显示了细胞定位。FAM26_P4定位于细胞膜。
实施例3_6
通过FAM26F_P4转染的细胞的免疫染色对纯化的FAM26F_P4抗体的表征
为进一步表征针对FAM26_P4而产生的亲和纯化的抗体，利用FAM26F_P4稳定转染的HEK293T细胞的免疫染色对抗体-蛋白相互作用进行研究。
生成了两种稳定转染的库，FAM26_P4 pIRESpuro3和阴性对照，空载pIRESpuro3。如以下将两种构建体转染到HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到用于组织培养的无菌6孔板中，使用2ml预热的完全培养基，DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清、Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μl FuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。转染后48小时，将转染的细胞转移到含有15ml选择培养基的75cm2的组织培养瓶，所述选择培养基为：含5μg\ml嘌呤霉素(Sigma，目录号P8833)的完全培养基。将细胞放置在培养箱中，每3-4天更换培养基，直到观察到克隆形成。
FAM26F转染的细胞的免疫染色
将以上所描述的稳定表达FAM26F或空载体pIRES puro3的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)以每孔500,000个细胞接种到直径13mm的无菌玻璃盖玻片上(Marienfeld，目录号：01 115 30)，所述盖玻片被放置到6孔板中，使用了2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-IA]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。
将细胞接种到盖玻片上后48小时，将其进行进一步免疫染色并在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)(稀释于PBS中)的溶液固定盖玻片25分钟。在PBS中进行2次5分钟的洗涤后，用0.1％的triton-X100(稀释于PBS中)对细胞进行透化，持续5分钟。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)进行非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用以上所描述的在EZBiolabs中生产的纯化的兔抗FAM26F抗体在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时，在PBS中进行3次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
细胞染色不是特异性的，利用在EZBiolabs转染的细胞阴性对照中产生的纯化的抗FAM26F抗体在FAM26F转染的细胞和pIRESpuro3HEK-293T细胞的细胞核中均观察到染色(数据未示出)，从而需要寻找另外的FAM26F抗体。
为进一步分析FAM26F蛋白在转染体中的表达和定位，利用在5％BSA中1∶50稀释的对FAM26F蛋白特异性的商业抗体(Sigma，目录号：HPA017948)如上所述对细胞进行免疫染色。
在FAM26F转染的细胞上利用抗FAM26F抗体观察到定位到细胞膜的特异性细胞染色(图23A)；然而，在pIRESpuro3 HEK-293T转染的细胞上利用这些抗体没有观察到染色(图23B)。图23A中所获得的红色荧光相对于图23B中信号的不存在表明FAM26F抗体对FAM26F_P4的特异性。
为测定FAM26F的内源性表达，如以上所描述的利用对FAM26_P4蛋白(Sigma、目录号HPA017948)特异性的抗体对RPMI8226细胞(ATCCcat#CCL-155)进行免疫染色。
在RPMI8226细胞系上利用特异性抗体(Sigma，目录号HPA017948)观察到细胞染色。然而，定位不能被确定为膜定位(数据未示出)。
实施例3_7：在组织样品上对FAM26抗体的免疫组织化学分析
抗体滴定方案和阳性对照研究结果：
利用兔多克隆抗体FAM26(SIGMA目录号#HPA017948)在LifeSpanBiosciences(USA)进行抗体滴定实验以建立将导致最小化的背景和最大化的信号检测的浓度。在由LifeSpan BioSciences(USA)提供的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织上和作为阳性对照的瞬时转染FAM26的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞系上或作为阴性对照的空载体上以20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml和2.5ug/ml进行连续稀释。抗体FAM26(SIGMA目录号#HPA017948)被用作第一抗体，且主要的检测系统由Vector抗兔二抗(BA-1000)和Vector ABC-AP试剂盒(AK-5000)及被用来产生紫红色沉淀物的Vector Red底物试剂盒(SK-5100)组成。
利用抗CD20(DAKO，目录号#MO755，小鼠单克隆)抗体进行抗体滴定实验以建立将导致最小化的背景和最大化的信号检测的稀释。以1∶1000、1∶2000和1∶4000进行连续稀释。抗CD20的抗体被用作第一抗体，且主要的检测系统由Vector抗兔二抗(BA-2000)和Vector ABC-AP试剂盒(AK-5000)及被用来产生紫红色沉淀物的Vector Red底物试剂盒(SK-5100)组成。
利用阳性对照抗体(CD31和波形蛋白)对组织进行染色以保证组织抗原被保留且可进行免疫组织化学分析。仅选择显示阳性的CD31和波形蛋白染色的组织用于本研究。阴性对照由在邻近切片上在第一抗体不存在的情况下进行完整的免疫组织化学步骤而组成。利用连接到Nikon显微镜的DVC1310C数码相机使玻片成像。
抗体FAM26在5微克/mL时在阳性细胞系中显示显著的细胞质染色和膜染色，且在阴性细胞系中仅有弱的染色(数据未示出)。在正常组织中，最显著的染色存在于单核细胞衍生的细胞类型(巨噬细胞和组织细胞)亚组中且偶见于淋巴细胞中，其显示细胞质染色和核染色(数据未显示)。与CD20抗体相比，单核细胞类型中的染色模式更显著，且淋巴细胞染色不局限于典型的B-淋巴细胞区。在大多数其它的细胞类型中抗体显示了弱的细胞质染色和核染色。对抗FAM26的抗体的进一步表征正在进行中。
实施例4：MGC52498多肽和多核苷酸，及其作为生产药物和生物制品的药物靶标的用途
实施例4_1：簇AA213820的描述
簇AA213820(内部编号69312991)以感兴趣的2个转录物为特征，其名称在表23中给出。所选择的蛋白变体在表24中给出。
表23-感兴趣的转录物
转录物名称
AA21382O_T1(SEQ ID NO：131)
AA213820_T6(SEQ ID NO：20)
表24-感兴趣的蛋白
蛋白名称                             对应转录物
AA213820_P4(SEQ ID NO：135)          AA21382O_T1(SEQ ID NO：131)
AA213820_P6(SEQ ID NO：19)           AA213820_T6(SEQ ID NO：20)
这些序列是已知的假想蛋白LOC348378(SEQ ID NO：132)(SwissProt登记号NP_872427；同义名：MGC52498)的变体。
MGC52498也称作FAM159A(具有序列相似性的家族159，成员A)，在两项大型研究中被鉴定：分泌蛋白初探(Clark等人2003，GenomeResearch 13(10)：2265-70)，和全长cDNA计划(Strausberg等人2002，PNAS99(26)：16899-903)。然而关于该蛋白没有具体研究公开。
在WO2004081199中，除其它用于诊断、预防和治疗的，在自身免疫病中表现出改变的表达模式的人类基因之外，报道了以PRO90951描述的序列，对应于AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的序列。在WO2004047728中，除其它用于免疫相关疾病的诊断和治疗的在活化的人类CD4+T细胞中具有表达谱的人类基因外，也报道了对应于AA213820_P4(SEQ IDNO：135)的序列。
然而，WO2004081199或WO2004047728申请没有教导或暗示对应于AA213820_P4(SEQ ID NO：135)的序列在癌症中差异表达。WO2004081199和WO2004047728也没有教导或暗示AA213820_P4(SEQID NO：135)在淋巴瘤中差异表达，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病，尤其是T细胞白血病、或肺癌中差异表达。而且，WO2004081199或WO2004047728申请中没有教导或暗示AA213820_P4(SEQ ID NO：135)可用作癌症的治疗或癌症诊断的药物靶标。而且，WO2004081199申请没有教导或暗示对AA213820_P4(SEQ ID NO：135)、其可溶性胞外域、和/或其片段特异性的抗体可用作癌症治疗的治疗剂或诊断剂。
相对地且令人惊奇地，本发明人已发现MGC52498抗原和其不连续部分可任选地用作治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶和类似物的药物靶标。还可任选地产生结合MGC52498的诊断性和治疗性多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，和其部分和变体。根据本发明的至少一些实施方案，提供了抗MGC52498抗原、其分泌性形式或可溶性形式或ECD和/或其变体、轭合物或片段的抗体和抗体片段以及其片段和变体用于治疗和诊断淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病，尤其是T细胞白血病，和肺癌的用途，其中该抗原是差异表达的。
如上所述，簇AA213820以2个转录物为特征，其列于以上的表23中。这些转录物编码作为蛋白假想蛋白LOC348378(SEQ ID NO：132)的变体的蛋白。现提供了根据本发明的至少一些实施方案每种变体蛋白的描述。
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白AA213820_P4(SEQ IDNO：135)具有由转录物AA21382O_T1(SEQ ID NO：131)所编码的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按照如下关于细胞：膜来定位。
转录物AA21382O_T1(SEQ ID NO：131)的编码部分起始于287位且终止于856位。
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白AA213820_P6(SEQ IDNO：19)具有由转录物AA213820_T6(SEQ ID NO：20)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白之间的关系的描述如下：
1.AA213820_P6(SEQ ID NO：19)和已知蛋白Q6UWV7_人(SEQ IDNO：135)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的氨基酸1-64的序列MASLWPSALTFNTDANIPGPLGFCGGWVRLCSLSSLTPPCGRRLVPCLSAPAPNAPRLPAPARC(SEQ ID NO：153)的多肽至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q6UWV7_人(SEQ ID NO：135)的氨基酸5-134，且还对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的氨基酸65-194的SIGALIGLSVAAVVLLAFIVTACVLCYLFISSKPHTKLDLGLSLQTAGPEEVSPDCQGVNTGMAAEVPKVSPLQQSYSCLNPQLESNEGQAVNSKRLLHHCFMATVTTSDIPGSPEEASVPNPDLCGPVP(SEQ ID NO：152)至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的头部的分离的多肽，其包含与AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的序列MASLWPSALTFNTDANIPGPLGFCGGWVRLCSLSSLTPPCGRRLVPCLSAPAPNAPRLPAPARC(SEQ ID NO：153)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％和最优选地至少约95％同源的多肽。
2.AA213820_P6(SEQ ID NO：19)和已知蛋白Q6ZRG4_人(SEQ IDNO：135)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的氨基酸1-64的序列MASLWPSALTFNTDANIPGPLGFCGGWVRLCSLSSLTPPCGRRLVPCLSAPAPNAPRLPAPARC(SEQ ID NO：153)的多肽至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q6UWV7_人(SEQID NO：135)的氨基酸61-109，且还对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的氨基酸65-113的SIGALIGLSVAAVVLLAFIVTACVLCYLFIS SKPHTKLDLGLSLQTAGP至少90％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与具有对应于AA213820_P6(SEQID NO：19)的氨基酸114-194的序列EEVSPDCQGVNTGMAAEVPKVSPLQQSYSCLNPQLESNEGQAVNSKRLLHHCFMATVTTSDIPGSPEEASVPNPDLCGPVP(SEQ ID NO：151)的多肽至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的头部的分离的多肽，包含与AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的序列MASLWPSALTFNTDANIPGPLGFCGGWVRLCSLSSLTPPCGRRLVPCLSAPAPNAPRLPAPARC(SEQ ID NO：153)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的多肽。
C.对应于AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的边缘部分的分离的多肽，其包含与AA213820_P6(SEQ ID NO：19)的序列EEVSPDCQGVNTGMAAEVPKVSPLQQSYSCLNPQLESNEGQAVNSKRLLHHCFMATVTTSDIPGSPEEASVPNPDLCGPVP(SEQ ID NO：151)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
转录物AA213820_T6(SEQ ID NO：20)的编码部分起始于2位且终止于496位。
实施例4_2MGC52498转录物的表达分析
本文实施例1中所描述的MED探索引擎被用来评估MGC52498转录物的表达。发现MGC52498转录物在肺癌中过表达，如图24中所表示的，且在白血病中过表达，如图25中所表示的。图24和图25显示了Affymetrix探针组1555379_at的表达图。图24显示了MGC52498转录物在来自肺癌实验和正常肺实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，MGC52498转录物相对于其在正常肺中(圆圈标记)的表达，在肺癌组织中(菱形标记)过表达。
图25显示了MGC52498转录物在来自血癌实验和正常血实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，MGC52498转录物相对于其在正常血样品中(圆圈、方形和三角标记)的表达，在多种白血病样品中(菱形标记)过表达。
在血液特异性套组和在不同正常组织中通过由序列名称AA213820_seg8-11F2R2(SEQ ID NO：109)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白MGC52498AA213820转录物的表达
在血液特异性套组和正常套组中通过或按照seg8-HF2R2-AA213820_seg8-11F2R2(SEQ ID NO：109)扩增子和引物AA213820_seg8-11F2(SEQ ID NO：107)和AA213820_seg8-11R2(SEQ IDNO：108)可检测的假想蛋白MGC52498转录物的表达通过实时PCR来测量。用于血液套组的样品在表2和21中被详述。用于正常套组的样品在表3中被描述。
正常套组-
对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以肾样品(样品编号19-23，以上表3)的量的中值，以获得相对于肾样品的中值的每个样品的相对表达的值，如图26中所示。在PBMC和脾正常样品中观察到了高表达。
血液套组-
对于血液套组-对于每个样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。将每个RT样品的标准化的量除以正常肾样品(样品编号65-67，以上表2)的量的中值，以获得对于每个样品的相对于正常肾样品的中值的相对表达的值。
图27中的柱状图中描述了该分析的结果。以上指出的假想蛋白MGC52498转录物在不同的血液衍生细胞、不同的淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者样品中是高表达的。
正向引物(AA213820_seg8-11F2)(SEQ ID NO：107)：CAGCATTGGCGCTCTCATAGG
反向引物(AA213820_seg8-llR2)(SEQ ID NO：108)：GTGTTCACACCTTGGCAGTCAG
扩增子(AA213820_seg8-11F2R2(SEQ ID NO：109))：
CAGCATTGGCGCTCTCATAGGCCTGTCCGTAGCAGCAGTGGTTCTTCTCGCCTTCATTGTTACCGCCTGTGTGCTCTGCTACCTGTTCATCAGCTCTAAGCCCCACACAAAGTTGGACCTGGGCTTGAGCTTACAGACAGCAGGCCCTGAGGAGGTTTCTCCTG
ACTGCCAAGGTGTGAACAC
实施例4_3：与FLAG融合的编码MGC52498T1_P4的全长ORF的克隆
与FLAG标签融合的编码MGC的全长ORF的克隆，无论在C末端或在N末端融合，按以下所描述的进行。
在以下条件下利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号M7122)来进行PCR：10.5μl-来自以上所描述的血液套组的cDNA(XXXLym_MantleCell1)；1μl-每种引物(10μM)；12.5μl ReadyMix，且反应程序为95℃下3分钟；94℃下30秒、50℃下30秒、72℃下1.5分钟的40个循环；然后72℃下10分钟。所用的引物是引物#100-946(SEQ IDNO：176)和引物#100-947(SEQ ID NO：177)。为增加PCR产物和产生后接NheI限制性位点的在N/C末端的Flag标签和Kozak序列，以及C末端的EcoRI限制性位点，利用第一次的PCR产物作为模板和利用如下的特定引物进行第二次PCR：用于N末端Flag的引物#100-948(SEQ ID NO：178)和引物#100-949(SEQ ID NO：179)，或用于C末端Flag的引物#100-954(SEQ ID NO：180)和引物#100-955(SEQ ID NO：181)。PCR条件与以上所描述的相同。
将PCR产物加载到用溴化乙锭染色的1％的琼脂糖凝胶上，在100V下在1xTBE溶液中进行电泳，并在UV光下观察。对所预期的条带大小进行验证后，利用Qiaquick凝胶提取纯化试剂盒(QiagenTM，Valencia，CA，U.S.A.，目录号28706)进行提取。利用合适的限制性酶NheI和EcoRI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，U.S.A.)消化所提取的PCR产物。消化后，如以上所描述的将DNA加载到1％的琼脂糖凝胶上。将所期望的条带大小切下并利用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号：28707)从凝胶中将其提取。
利用LigaFastTM快速DNA连接系统(Promega，目录号：M8221)将所消化的靶标ORF DNA连接到pIRESpuro3载体。根据生产商的说明，将所得的DNA转化到感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBC Bioscience，Taipei，Taiwan，目录号：RH816)中，然后接种到用于重组质粒的选择的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。
第二天，利用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号：M7122)通过PCR筛选大量来自转化的菌落(数据未示出)。验证所期望的条带大小后，使两个阳性菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml Terrific肉汤中生长，并在37℃下震荡过夜。利用QiaprepTM Spin Miniprep Kit(Qiagen，目录号：27106)从细菌培养物中分离质粒DNA。通过对插入物进行测序来验证准确的克隆(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。验证无差错的菌落(即，ORF中无突变)后，将重组质粒进行进一步的分析。
图28A和28B分别代表了FLAG_MGC_T1_P4-(SEQ ID NO：182)和MGC_T1_P4_FLAG(SEQ ID NO：183)的DNA序列；FLAG序列是下划线的。
图29A和29B分别代表了FLAG_MGC_T1_P4蛋白(SEQ ID NO：184)和MGC_T1_P4_FLAG(SEQ ID NO：185)的氨基酸序列；FLAG序列是下划线的。
实施例4_4测定MGC52498蛋白的细胞定位
利用共聚焦显微镜来测定MGC52498的细胞定位。如下将以上所描述的MGC_T1_P4_FLAG pIRESpuro3或FLAG_MGC_T1_P4 pIRESpuro3构建体或pIRESpuro3空载体随后瞬时转染到HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到13mm直径的无菌玻璃盖玻片(Marienfeld，目录号：01 115 30)上，将盖玻片放置到6孔板中，使用2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清]+4mML-谷氨酰胺。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μlFuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。
瞬时转染后48小时，将细胞进一步处理以在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片3次，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)和3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)组成的固定溶液固定盖玻片15分钟，然后在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)中孵育5分钟。在PBS中洗涤1次后，利用0.1％triton-X100/PBS溶液透化细胞5分钟。在PBS中洗涤2次之后，将细胞在含5％的牛血清白蛋白(Sigma，目录号：A4503)的PBS溶液中孵育20分钟。且然后将细胞与在含5％BSA的PBS中1∶100稀释的轭合cy3的抗FLAG抗体(Sigma，目录号：A9594)一起孵育1小时，然后在PBS中进行三次5分钟的洗涤。且然后利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
从表达MGC_T1_P4_FLAG(SEQ ID NO：184)或FLAG_MGC_T1_P4(SEQ ID NO：185)的细胞获得的红色荧光信号，相对于从pIRESpuro3空载体获得的信号的不存在，表明了MGC的异位表达。虽然如此，在HEK293T细胞的细胞膜中不能检测到重组蛋白(数据未示出)。为进一步理解MGC P4细胞定位，将检验内源性表达而非异位表达。
实施例5：FAM70A多肽和多核苷酸，及其作为生产药物和生物制品的药物靶标的用途
实施例5_1：簇F10649的描述
簇F10649(内部编号72834556)以感兴趣的8个转录物为特征，其名称在表25中给出。所选择的蛋白变体在表26中给出。
表25-感兴趣的转录物
转录物名称
F10649_T0(SEQ ID NO：21)
F1O649_T1(SEQ ID NO：22)
F10649_T4(SEQ ID NO：24)
F10649_T6(SEQ ID NO：26)
F10649_T8(SEQ ID NO：28)
表26-感兴趣的蛋白
Figure BDA0000079743540001931
这些序列是已知的假想蛋白LOC55026(SEQ ID NO：29)(SwissProt登记号NP_060408；同义名：FAM70A)的变体。
FAM70A(具有序列相似性的家族70，成员A)，在一些大型研究中被鉴定，比如人类基因的推定的替代启动子的鉴定和表征(Kimura等人.2006，Genome Res.16(1)：55-65)、染色体X的注释(Ross等人.2005，Nature434(7031)：325-37)和全长cDNA计划(Gerhard等人.2004，Genome Res.14(10B)：2121-7；Strausberg等人.2002，PNAS 99(26)：16899-903；Ota等人.2004，Nat Genet 36(1)：40-5)。但关于FAM70A的研究尚未具体发表。
在WO2003083039中，除其它在细胞、组织、器官或生物体中具有与生物化学或生理反应的刺激相关的性质的新型多肽和编码其的核酸之外，报道了对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)和F10649_P5(SEQ ID NO：33)的序列。在EP1293569中，除其它参与神经细胞分化的新型多肽和编码其的核酸之外，也报道了对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)和F10649_P5(SEQ ID NO：33)的序列。然而WO2003083039或EP1293569中没有教导或暗示对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)和F10649_P5(SEQ ID NO：33)的序列在多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌中差异表达。而且，这些申请中没有教导或暗示F10649_P4(SEQ ID NO：30)和F10649_P5(SEQ ID NO：33)可用作癌症治疗，尤其是多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌，和/或免疫相关病症的治疗或用于它们的诊断的药物靶标。而且这些申请中没有教导或暗示对F10649_P4(SEQ ID NO：30)、F10649_P5(SEQ ID NO：33)、其可溶性胞外域、和/或其片段特异性的抗体可用于癌症治疗，尤其是多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌，和/或免疫相关病症的治疗或用于它们的诊断的治疗物。
除其它多种与癌症和/或免疫相关疾病相关的多肽之外，WO2003057160、WO200222660、WO2004039956和WO2004041170报道了对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的序列。与本申请相比，WO2003057160表明了肾肿瘤中对应于F10649_P10的序列与正常肾组织中相比发生失调。WO2003057160、WO200222660、WO2004039956和WO2004041170申请没有教导或暗示对应于F10649_P10的序列可用作多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌、和/或免疫相关病症的治疗，或用于它们的诊断的药物靶标。而且，这些申请中没有教导或暗示对F10649_P10、其可溶性胞外域、和/或其片段特异性的抗体可用于癌症治疗，尤其是多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌，和/或免疫相关病症的治疗或用于它们的诊断的治疗物。
相对地且令人惊奇地，本发明人已发现FAM70A抗原和其不连续部分可任选地用作治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶和类似物的药物靶标。还可任选地产生结合FAM70A和其部分和变体的诊断性和治疗性的多克隆抗体和单克隆抗体，和其片段。根据本发明的至少一些实施方案，提供了抗FAM70A抗原、其分泌性形式或可溶性形式或ECD和/或其变体、轭合物或片段的抗体和抗体片段以及其片段和变体用于治疗和诊断癌症，尤其是用于治疗多发性骨髓瘤、肾癌、肺癌、肝癌和乳腺癌，和/或免疫相关病症，其中该抗原是差异表达的。
如上所述，簇F10649以8个转录物为特征，其列于以上的表25中。这些转录物编码作为蛋白假想蛋白LOC55026(SEQ ID NO：29)的变体的蛋白。现提供了根据本发明的至少一些实施方案每种变体蛋白的描述。
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白F10649_P4(SEQ ID NO：30)具有由转录物F10649_T0(SEQ ID NO：21)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.F10649_P4(SEQ ID NO：30)和已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)之间的对比报告：
A.分离的嵌合的多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸1-318，且还对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-318的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAAREVNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSAS至少90％同源，对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸319的桥接氨基酸P，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ IDNO：31)氨基酸320-349，且还对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸320-349的SPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、桥接氨基酸和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
2.F10649_P4(SEQ ID NO：30)和已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的对比报告：
A.分离的嵌合的多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的氨基酸1-344，且还对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-344的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAAREVNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKP至少90％同源，对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸345的桥接氨基酸P，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的氨基酸346-349，且还对应于F10649_P4(SEQID NO：30)的氨基酸346-349的PYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列，桥接氨基酸和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
3.F10649_P4(SEQ ID NO：30)和已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ IDNO：32)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-165的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAARE(SEQ ID NO：155)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ ID NO：32)的氨基酸2-185，且对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的166-349的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVS SCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P4(SEQ ID NO：30)的头部的分离的多肽，其包含与F10649_P4(SEQ ID NO：30)的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAARE(SEQ ID NO：155)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的多肽。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自Signa1P和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白F10649_P4(SEQ ID NO：30)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表27中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表27：氨基酸突变
Figure BDA0000079743540001971
转录物F10649_T0(SEQ ID NO：21)的编码部分起始于248位且终止于1294位。转录物具有如下的SNP，如表28中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表28-核酸SNP
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白F10649_P5(SEQ IDNO：33)具有由转录物F10649_T1(SEQ ID NO：22)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系描述如下：
1.F10649_P5(SEQ ID NO：33)和已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ IDNO：30)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-141，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸1-141的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAA RHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸166-349，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸142-325的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包含长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含EV，具有如下的结构：起始于氨基酸编号141-x至141中的任何位置；且终止于氨基酸编号142+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
2.F10649_P5(SEQ ID NO：33)和已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸1-141，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的1-141的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKT SQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少90％同源，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸166-318，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸142-294的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVS SCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSAS至少90％同源，对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸295的桥接氨基酸P，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸320-349，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸296-325的SPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、桥接氨基酸和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包括长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含EV，具有如下的结构：起始于氨基酸编号141-x至141中的任何位置；且终止于氨基酸编号142+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
3.F10649_P5(SEQ ID NO：33)和已知蛋白NP_060408与Q86Y72_人(SEQ ID NO：29)之间的比对报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人(SEQ ID NO：29)的氨基酸1-141，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸1-141的MHQSLTQQRS SDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAA RHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少90％同源，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人(SEQ ID NO：29)氨基酸166-344，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸142-320的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPS SPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKP至少90％同源，对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸321的桥接氨基酸P，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的氨基酸346-349，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸322-325的PYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、桥接氨基酸和第三氨基酸是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包括长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含EV，具有如下的结构：起始于氨基酸编号141-x至141中的任何位置；且终止于氨基酸编号142+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
4.F10649_P5(SEQ ID NO：33)和已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ IDNO：32)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸1-141的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ ID NO：32)的氨基酸2-185，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸142-325的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPS SPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的头部的分离的多肽，所述多肽包含与F10649_P5(SEQ ID NO：33)的序列MHQSLTQQRS SDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAA RHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的多肽。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白F10649_P5(SEQ ID NO：33)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表29中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表29：氨基酸突变
转录物F10649_T1(SEQ ID NO：22)的编码部分起始于248位且终止于1222位。转录物具有如下的SNP，如表30中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表30-核酸SNP
Figure BDA0000079743540002012
Figure BDA0000079743540002021
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白F10649_P7(SEQ IDNO：35)具有由转录物F10649_T4(SEQ ID NO：24)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系描述如下：
1.F10649_P7(SEQ ID NO：35)和已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ IDNO：30)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-141，且还对应于F10649_P7(SEQ ID NO：35)的氨基酸1-141的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸250-349，且还对应于F10649_P5(SEQ ID NO：33)的氨基酸142-241的NPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P7(SEQ ID NO：35)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包含长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含EV，具有如下的结构：起始于氨基酸编号141-x至141中的任何位置；且终止于氨基酸编号142+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
2.F10649_P7(SEQ ID NO：35)和已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ IDNO：32)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P7(SEQ ID NO：35)的氨基酸1-141的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAA RHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ ID NO：32)的氨基酸86-185，且还对应于F10649_P7(SEQ ID NO：35)的氨基酸142-241的NPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSP PSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P7(SEQ ID NO：35)的头部分的分离的多肽，所述多肽包含与F10649_P7(SEQ ID NO：35)的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILGFGSFLGIIGSNLIENKRQMLVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEE(SEQ ID NO：156)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的多肽。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白F10649_P7(SEQ ID NO：35)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表31中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表31：氨基酸突变
Figure BDA0000079743540002041
转录物F10649_T4(SEQ ID NO：24)的编码部分起始于248位且终止于970位。转录物还具有如下的SNP，如表32中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表32-核酸SNP
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白F10649_P8(SEQ IDNO：36)具有由转录物F10649_T6(SEQ ID NO：26)编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系的描述如下：
1.F10649_P8(SEQ ID NO：36)和已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ IDNO：30)之间的对比报告
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸1-67，且还对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的氨基酸1-67的MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVI(SEQ ID NO：159)至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ IDNO：30)的氨基酸89-349，且还对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的氨基酸68-328的LVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAAREVNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的边缘部分的分离的嵌合多肽，所述多肽包含长度“n”的多肽，其中n是至少约10个氨基酸的长度，任选地为至少约20个氨基酸的长度，优选地至少约30个氨基酸的长度，更优选地至少约40个氨基酸的长度且最优选地至少约50个氨基酸的长度，其中至少两个氨基酸包含IL，具有如下的结构：起始于氨基酸编号67-x至67中的任何位置；且终止于氨基酸编号68+((n-2)-x)中的任何位置的序列，其中x在从0至n-2之间变化。
2.F10649_P8(SEQ ID NO：36)和已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ IDNO：32)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的1-144的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAARE(SEQID NO：159)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q9NWN8_人(SEQ ID NO：32)的氨基酸2-185，且还对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的氨基酸145-328的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.对应于F10649_P8(SEQ ID NO：36)的头部分的分离的多肽，所述多肽包含与F10649_P8(SEQ ID NO：36)的序列MHQSLTQQRSSDMSLPDSMGAFNRRKRNSIYVTVTLLIVSVLILTVGLAATTRTQNVTVGGYYPGVILVASIVFISFGVIAAFCCAIVDGVFAARHIDLKPLYANRCHYVPKTSQKEAEEVISSSTKNSPSTRVMRNLTQAARE(SEQID NO：159)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的多肽。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白F10649_P8(SEQ ID NO：36)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表33中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表33：氨基酸突变
Figure BDA0000079743540002061
转录物F10649_T6(SEQ ID NO：26)的编码部分起始于248位且终止于1231位。转录物具有如下的SNP，如表34中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表34-核酸SNP
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白F10649_P10(SEQ IDNO：32)具有由转录物F10649_T8(SEQ ID NO：28)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系描述如下：
1.F10649_P10(SEQ ID NO：32)和已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ IDNO：30)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸1-1的序列M的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q5JRV8_人(SEQ ID NO：30)的氨基酸166-349，且还对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸2-185的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
2.F10649_P10(SEQ ID NO：32)和已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ IDNO：31)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的序列M的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸166-318，且还对应于F10649_P10(SEQ IDNO：32)的氨基酸2-154的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSAS至少90％同源，对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸155的桥接氨基酸P，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白Q7Z4S8_人(SEQ ID NO：31)的氨基酸320-349，且还对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸156-185的SPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKPPPYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、桥接氨基酸和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
3.F10649_P10(SEQ ID NO：32)和已知蛋白NP_060408与Q86Y72_人之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与具有对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸1-1的序列M的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的氨基酸166-344，且还对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸2-180的VNCPHLSREFCTPRIRGNTCFCCDLYNCGNRVEITGGYYEYIDVSSCQDIIHLYHLLWSATILNIVGLFLGIITAAVLGGFKDMNPTLPALNCSVENTHPTVSYYAHPQVASYNTYYHSPPHLPPYSAYDFQHSGVFPSSPPSGLSDEPQSASPSPSYMWSSSAPPRYSPPYYPPFEKP至少90％同源，对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸181的桥接氨基酸P，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与对应于已知蛋白NP_060408和Q86Y72_人的氨基酸346-349，且还对应于F10649_P10(SEQ ID NO：32)的氨基酸182-185的PYSP至少90％同源，其中所述第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、桥接氨基酸和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白F10649_P10(SEQ ID NO：32)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表35中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表35：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置                   替代的氨基酸
155                                     P-＞S
转录物F10649_T8(SEQ ID NO：28)的编码部分起始于103位且终止于657位。转录物具有如下的SNP，如表36中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表36-核酸SNP
实施例5_2：FAM70A转录物的表达分析
本文实施例1中所描述的MED探索引擎被用来评估FAM70A转录物的表达。发现FAM70A转录物在肺癌中过表达，如图30所表示的；在肝癌中过表达，如图31所表示的；在乳腺癌中过表达，如图32所表示的；在肾癌中过表达，如图33所表示的。图30-33显示了Affymetrix探针组219895_at的表达图。图30显示了FAM70A转录物在来自肺癌实验和正常肺实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，FAM70A转录物相对于其在正常肺中(圆圈标记)的表达，在肺癌组织中(菱形标记)过表达。
图31显示了FAM70A转录物在来自肝癌实验和正常肝实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，FAM70A转录物相对于其在正常肝中(圆圈和三角标记)的表达，在肝癌组织中(菱形标记)过表达。
图32显示了FAM70A转录物在来自乳腺癌实验和正常乳腺实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，FAM70A转录物相对于其在乳腺中(圆圈、十字和三角标记)的表达，在乳腺癌组织中(菱形标记)过表达。
图33显示了FAM70A转录物在来自肾癌实验和正常肾实验的微阵列芯片中的表达。如所见到的，FAM70A转录物相对于其在正常肾中(圆圈、十字和三角标记)的表达，在肾癌组织中(菱形标记)过表达。
在血液特异性套组和不同正常组织中由序列名称F10649_seg10-12F1R1(SEQ ID NO：103)中所描绘的扩增子可检测的假想蛋白FLJ20716-FAM70A F10649转录物的表达
通过或根据seg10-12F1R1-F10649_seg10-12F1R1(SEQ ID NO：103)扩增子和引物F10649_seg10-12F(SEQ ID NO：101)和F10649_seg10-12R(SEQ ID NO：102)可检测的假想蛋白FLJ20716-FAM70A转录物在血液套组和正常套组中的表达通过实时PCR来测量。用于血液套组的样品在表2和21中被详述，用于正常套组的样品在表3中被详述。
正常套组-
对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以肾样品(样品编号19-23，以上表3)的量的中值，以获得相对于肾样品的中值的每个样品的相对表达的值，如图34中所示。在正常卵巢样品样品中观察到了非常高的表达，在正常脑和心脏中观察到了高表达。
对于血液套组-对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。将每个RT样品的标准化的量除以正常肾样品(样品编号65-67，以上表2)的量的中值，以获得对于每个样品的相对于正常肾样品的中值的相对表达的值。
图35中的柱状图描绘了该分析的结果。以上指出的假想蛋白FLJ20716-FAM70A转录物的表达在成熟和未成熟巨噬细胞和树突细胞样品，和在5个多发性骨髓瘤细胞系的2个中非常高。
正向引物(F10649_seg10-12F)(SEQ ID NO：101)：CTGGTGGCTTCTATCGTGTTTATCAG
反向引物(F10649_seg10-12R)(SEQ ID NO：102)：CGGTTAGCGTAGAGTGGTTTCAG
扩增子(F10649_seg10-12F1R1(SEQ ID NO：103))(SEQ ID NO：103)：
CTGGTGGCTTCTATCGTGTTTATCAGCTTTGGTGTGATTGCGGCTTTTTGTTGTGCCATAGTTGACGGGGTCTTTGCTGCCAGACACATTGATCTGAAACCACTCTACGCTAACCG
实施例5_3：
与FLAG融合的编码FAM70A T1_P5的全长ORF的克隆
按以下所描述的进行编码与FLAG融合的FAM70A的全长ORF的克隆。
1.按照以下进行逆转录反应：将从RPMI 8226细胞系(ATCCCCL-155)提取的10μg的纯化的RNA与150ng的Random Hexamer引物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，目录号：48190-011)和500μM的dNTP混合于156μl的总体积中。将混合物在65℃下孵育5分钟且然后在冰上快速冷冻。然后，添加50μl的5X Superscript II第一链缓冲液(Invitrogen，目录号：18064-014，货号：Y00146)，24μl的0.1M DTT和400单位的RNasin(Promega，Milwaukee，WS，U.S.A.，目录号：N2511)，并将混合物在25℃下孵育10分钟，然后在42℃下进一步孵育2分钟。然后，添加10μl(2000单位)的SuperscriptII(Invitrogen，目录号：18064-014)并使反应物(250μl的终体积)在42℃下孵育50分钟且然后在70℃灭活15分钟。将所得的cDNA在TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA pH 8)中1∶20稀释。
2.在以下条件下利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号M7122)来进行PCR：10.5μl-来自以上的cDNA；1μl-每种引物(10μM)(表48)；12.5μl ReadyMix，且反应程序为95℃下3分钟；94℃下30秒、52℃下30秒、72℃下1.5分钟的30个循环；然后72℃下10分钟。所用的引物包括对应于蛋白的所需坐标的基因特异性序列和限制性酶切位点和Kozak序列，如以下表37中所列。表37中的粗体字母代表基因特异性序列，而用于克隆目的的限制性位点延伸为斜体，和kozak序列是下划线的。FLAG标签为斜粗体。为增加PCR产物，利用Platinum PFXTM(Invitrogen.，Carlsbad，CA，USA，目录号：1178-021)和作为模板的以上的PCR产物(5μl)进行第二次PCR。PCR条件如下：在50μl的总反应体积中，1μl的Platinum PFX酶；1μl-10mM的dNTP(每种核苷酸2.5mM)；0.5μl-50mM的MgSO4；和1μl-每种引物(10μM)；PCR程序如下：95℃下3分钟；94℃下30秒、52℃下30秒、68℃下1.5分钟的30个循环；然后68℃下10分钟。表1-FAM70A克隆引物细节
表37
将Platinum PFXTM PCR产物加载到用溴化乙锭染色的1％的琼脂糖凝胶上，在100V下在1xTBE溶液中进行电泳，并在UV光下观察。对所预期的条带大小进行验证后，利用Qiaquick凝胶提取纯化试剂盒(QiagenTM，Valencia，CA，U.S.A.，目录号28706)进行提取。利用NheI和NotI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，U.S.A.)消化所提取的PCR产物。消化后，如以上所描述的将DNA加载到1％的琼脂糖凝胶上。将所期望的条带大小切下并利用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号：28706)从凝胶中将其提取。
利用LigaFastTM快速DNA连接系统(Promega，目录号：M8221)将来自以上的消化的PCR产物连接到pIRESpuro3载体。根据生产商的说明，将所得的DNA转化到感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBC Bioscience，Taipei，Taiwan，目录号：RH816)中，然后接种到用于重组质粒的选择的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。
第二天，在选择性平板上生长的来自转化的大量菌落被取出，通过划线接种将其接种到另外的选择性平板上并利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号：M7122)通过PCR以进行进一步分析。利用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR筛选阳性菌落(数据未示出)。所有PCR循环完成后，按以上所描述的利用1％的琼脂糖凝胶对反应物的一半进行分析。验证所期望的条带大小后，使来自每个连接反应物的2个阳性菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml Terrific肉汤中生长，并在37℃下震荡过夜。利用QiaprepTM Spin Miniprep Kit(Qiagen，目录号：27106)从细菌培养物中分离质粒DNA。通过对插入物进行测序来验证准确的克隆(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。验证无差错的菌落(即，ORF中无突变)后，将重组质粒进行进一步的分析。
图36代表FAM70_T1_P5_FLAG(SEQ ID NO：119)的DNA序列，对应于靶标全长序列的基因特异性序列以粗体标出，FLAG序列是非粗体的。
图37代表了FAM70A_T1_P5_FLAG蛋白(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列；对应于蛋白的全长序列的基因特异性序列以粗体标出，FLAG序列是非粗体的。
实施例5_4：测定FAM70A的细胞定位
利用共聚焦显微镜来测定FAM70A的细胞定位。如下将以上所描述的FAM70A-FLAG pIRESpuro3构建体随后瞬时转染到HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到13mm直径的无菌玻璃盖玻片(Marienfeld，目录号：01 115 30)上，将盖玻片放置到6孔板中，使用2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清]+4mML-谷氨酰胺。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μlFuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。
瞬时转染后48小时，将细胞进行进一步处理以在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片3次，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)和3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)组成的固定溶液固定盖玻片15分钟，然后在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)中孵育5分钟。在PBS中洗涤1次后，通过与0.1％triton X-100/PBS溶液一起孵育而使细胞透化5分钟。在PBS中洗涤2次之后，将细胞在含5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)的PBS溶液中孵育20分钟。然后将细胞与在含3％BSA的PBS中1∶100稀释的轭合cy3的抗FLAG抗体(Sigma，目录号：A9594)一起孵育1小时。在PBS中三次洗涤后，利用封固溶液(Sigma，目录号：G0918)将盖玻片粘着到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光的存在。结果在图38中显示。
图38表示了FAM70A_T1_P5_FLAG(SEQ ID NO：119)融合蛋白在HEK 293T细胞中表达后定位到细胞膜。利用共聚焦显微镜的40x物镜获得了图像。
实施例5_5：对FAM70变体特异性的多克隆抗体的产生
所有多克隆Ab产生过程，包括肽合成、肽轭合、动物免疫、采血和抗体纯化，均在Sigma-Aldrich(Israel)进行。
肽合成——用于兔免疫的肽序列如下：CHYVPKTSQKEAEEV(FAM70_128 SEQ ID NO：121)，其为取自对应于FAM70_P5蛋白(FAM70_P5；SEQ ID NO：33)的氨基酸128-142的ECD环的序列。合成了具有95％纯度的25mg肽，将其中的10mg与KLH载体轭合。
免疫——按照以下利用轭合的肽来免疫两只兔(#5663，#5664)：每两周免疫动物。采集3个2-3ml的检验血并利用ELISA进行分析。从每个兔采集100ml的生产血。
抗体纯化——对来自兔血清的抗体进行纯化。在免疫亲和柱中利用产生相应的抗体的肽进行亲和纯化。在HEK-293T细胞系中表达的重组FAM70_P5上通过ELISA和通过蛋白质印迹对纯化的抗体进行分析。将利用这些Ab通过免疫组织化学(IHC)测定内源性蛋白定位。
FAM70肽序列(SEQ ID NO：121)CHYVPKTSQKEAEEV
实施例5_6：表达FAM70_P5蛋白的稳定库的生成
为生成表达FAM70A_P5蛋白的HEK-293T细胞的稳定库，按照以下将FAM70_P5_Flag pIRESpuro3构建体转染到HEK-293T细胞中：将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种到适宜于组织培养的无菌6孔板中，使用2ml预热的完全培养基，DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek，Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清、Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。每孔的500,000个细胞使用稀释于94μl DMEM的6μlFuGENE 6试剂(Roche，目录号：11-814-443-001)用2μg的DNA构建体来转染。将混合物在室温下孵育15分钟。将这一复杂的混合物滴加到细胞中并旋涡摇动。将细胞放置在37℃下含5％CO2的培养箱中。转染后48小时，将转染的细胞转移到含有15ml选择培养基的75cm2的组织培养瓶，所述选择培养基为：含5μg\ml嘌呤霉素(Sigma，目录号P8833)的完全培养基。将细胞放置在培养箱中，每3-4天更换培养基，直到观察到克隆形成。
实施例5_7：通过在FAM70A_P5转染的细胞上进行蛋白质印迹分析对纯化的FAM70A抗体的表征
为验证针对所选择的FAM70A的肽而产生的抗体的特异性，利用来自如以上所描述的兔5663和5664的纯化的血清和FAM70 HEK-293T稳定转染体细胞裂解物以及HEK-293T未转染的细胞裂解物来进行免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹分析。
利用抗Flag抗体(Anti Flag M2 affinity Gel Freezer-Safe，Sigma.目录号：A220)对稳定表达FAM70_P5_FLAG的HEK-293T和未转染的细胞裂解物进行免疫沉淀，并利用先前所描述的1∶250稀释的针对FAM70肽产生的纯化的抗体通过蛋白质印迹进行分析。
图39A和39B分别代表了获自兔#5663和#5664的纯化的血清的信号。图39A说明了随后IP的在HEK-293T转染的细胞裂解物上从兔#5663的纯化的血清中观察到36kDa的特异性条带大小(图39A中泳道1)。然而，全细胞裂解物提取物没有显示所预期的条带大小(泳道3)。利用兔#5663或#5664的纯化血清观察到了52kDa的非特异性条带(分别为图39A和39B中的泳道3和4)。
实施例5_8：通过FAM70A_P5转染的细胞的免疫染色对纯化的FAM70A抗体的表征
为进一步表征针对FAM70A而产生的亲和纯化的抗体，利用FAM70_P5稳定转染的HEK293T细胞的免疫染色对抗体-蛋白相互作用进行研究。
FAM70A转染的细胞的免疫染色：
将稳定表达FAM70A的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)或未转染的HEK-293T的每孔500,000个细胞接种到直径13mm的无菌玻璃盖玻片上(Marienfeld，目录号：01 115 30)，所述盖玻片被放置到6孔板中，使用了2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。
将细胞接种到盖玻片上后48小时，将其进行进一步免疫染色的处理并通过共聚焦显微镜进行分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，然后用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)固定盖玻片15分钟。在PBS中进行2次5分钟的洗涤后，用0.1％的triton-X100(稀释于PBS中)对细胞进行透化，持续5分钟。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)进行非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后如上所描述的利用在5％BSA中1∶200/1∶1000稀释的兔5663抗体的纯化血清在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时，然后将其在PBS中进行3次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(Jackson ImmunoResearch，目录号：711-165-152)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
如图40中所示，在HEK-293T转染的细胞上利用1∶200或1∶1000的纯化的抗FAM70抗体(以上所描述的兔#5663和#5664)观察到细胞染色定位到细胞膜上(分别为图40A和40B)。然而，在HEK-293T非转染的细胞上利用1∶200或1∶1000(分别为图40C和40D)以及在CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞上(图40E)和MC/CAR(ATCC，CRL-8083)细胞上(图40F)观察到阳性信号。
为进一步测定在非转染的细胞中获得的阳性信号是否是由于内源性表达或缺乏特异性而导致的，如先前所描述的在HEK-293T上以及MC/CAR cDNA上，利用GoTaq_ReadyMix(Promega，M712B)进行RTPCR。所用的引物是FAM70特异性的：引物#100-923(SEQ ID NO 167)和引物#100-924(SEQ ID NO 168)。
如先前所描述的，将获自HEK-293cDNA的所预期的PCR产物大小进行纯化并通过测序来验证。测序结果表明FAM70A在HEK-293T未转染的细胞中表达。然而，当利用MC/CAR cDNA作为模板时未观察到产物(数据未示出)。
为进一步分析特异性，在与FAM70A肽预孵育或不与其预孵育的条件下，利用以上所描述的抗FAM70A抗体对以上所描述的FAM70AHEK-293T转染的细胞进行免疫染色。
图41A-41D显示了随后分别与0、5倍、25倍、50倍的FAM70肽一起孵育后的293T转染的细胞的红色荧光信号。
图41E-41H显示了随后分别与0、5倍、25倍、50倍的FAM70肽一起孵育的293T非转染的细胞的红色荧光信号。
如图41A和图41E中所示，在HEK-293T转染的细胞和HEK-293T未转染的细胞中分别观察到了膜定位。
然而，观察到了非特异性信号，随后肽封闭。
为进一步分析FAM70A表达，生成了抗另外的肽序列的多克隆抗体。
用于兔免疫的肽序列如下：MHQSLTQQRSSDMSLPDS(FAM70_1，SEQ ID NO：186)，其为取自对应于FAM70_P5蛋白(SEQ ID NO：33)的氨基酸残基1-18的N末端的序列。在Sigma(Israel)合成了具有95％纯度的25mg的肽，将其中的10mg与KLH载体轭合。
免疫：按照以下利用轭合的肽来免疫两只兔：每两周免疫动物。从每个兔采集60ml的生产血。
抗体纯化：对来自兔血清的抗体进行纯化。在免疫亲和柱中利用产生相应的抗体的肽进行亲和纯化。在以上所描述的FAM70_P5 HEK-293T转染的细胞系上通过免疫染色对纯化的抗体进行分析。免疫染色验证后，通过免疫组织化学(IHC)，将这些抗体进一步用于人类组织阵列中的内源性蛋白定位。
实施例6
实施例6_1
簇W38346的描述
簇W38346(内部编号70579958)以感兴趣的4个转录物为特征，其名称在表38中给出。所选择的蛋白变体在表39中给出。
表38-感兴趣的转录物
转录物名称
W38346_T0(SEQ ID NO：38)
W38346_T1(SEQ ID NO：39)
W38346_T2(SEQ ID NO：40)
W38346_T5(SEQ ID NO：41)
表39-感兴趣的蛋白
Figure BDA0000079743540002191
这些序列是已知的假想蛋白LOC201799(SEQ ID NO：42)(SwissProt登记号NP_689893；同义名：TMEM154)的变体。
TMEM 154(跨膜蛋白154)在2项全长cDNA计划(Strausberg等人2002、PNAS 99(26)：16899-903；Ota等人2004、Nat Genet 36(1)：40-5)中被鉴定。然而没有具体公开关于TEEM154的研究。
对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)的序列已在WO2004110369专利申请中被报道，该专利申请声称对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)的FLJ32028的序列与人类慢性淋巴细胞白血病相关。该申请还涉及单克隆抗体和用于抗体筛选和产生的方法及其作为B-CLL的诊断标志物或治疗靶标的用途。然而，WO2004110369专利申请没有提供将指导有经验的技术人员的任何特别的教导或提示以将对TMEM154特异性的抗体用于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤，肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，特别是SLE的治疗或诊断。WO2004110369专利申请也没有教导，TMEM 154可溶性胞外域，和其片段和轭合物，以及其抗体可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤，肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，特别是SLE的治疗的治疗剂或诊断剂。
在WO2004081199专利申请中，除其它用于自身免疫病的诊断、预防和治疗的、在自身免疫病中具有改变的表达谱的基因之外，已报道了对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)蛋白的PRO92173。然而WO2004081199专利申请没有教导，对应于PRO92173的序列在系统性红斑狼疮(SLE)中、和/或在癌症中差异表达，所述癌症尤其是淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，所述淋巴瘤尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤。WO2004081199专利申请也没有教导，对应于PRO92173的序列可用作SLE，和/或癌症的治疗和/或其诊断的药物靶标，所述癌症包括淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌。WO2004081199专利申请也没有教导PRO92173可溶性胞外域、及其片段和轭合物和其抗体可用作癌症的治疗的治疗剂或诊断剂，所述癌症包括淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE的治疗的治疗剂或诊断剂。
WO03090694专利申请除其它用于诊断或监测自身免疫病和慢性炎性疾病的基因之外，还报道了对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)的TMEM154序列。然而WO03090694专利申请没有教导，对应于TMEM 154的序列可用作免疫相关病症尤其是SLE的治疗的药物靶标。WO03090694专利申请也没有教导，对应于TMEM154的序列在癌症中差异表达，所述癌症尤其是淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，所述淋巴瘤尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤。WO03090694专利申请也没有教导，对应于TMEM154的序列可用作淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌的治疗或其诊断的药物靶标，所述淋巴瘤尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤。WO03090694专利申请也没有教导，TMEM154可溶性胞外域，及其片段和轭合物和其抗体可用作淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌的治疗的治疗剂或诊断剂，所述淋巴瘤尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，和/或免疫相关病症，尤其是SLE的治疗的治疗剂或诊断剂。
对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)的TMEM154抗原在WO06020266专利申请中已被报道，其意在公开来源于慢性淋巴细胞白血病细胞的多肽和抗体，及其用途。然而WO06020266没有教导，对应于TMEM 154的序列可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE的治疗的药物靶标。WO06020266专利申请没有提供将指导有经验的技术人员的任何特别的教导或提示以将对TMEM154特异性的抗体用于淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE的治疗或诊断。WO06020266专利申请也没有教导，TMEM 154可溶性胞外域，及其片段和轭合物和其抗体可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症、尤其是SLE(系统性红斑狼疮)的治疗的治疗剂或诊断剂。
对应于W38346_P3(SEQ ID NO：42)的TMEM154抗原还在WO2008112177、WO200270539和EP1293569专利申请中被报道。对应于W38346_P4(SEQ ID NO：45)的TMEM154抗原在WO2008112177专利申请中已被报道。然而，这些专利申请中没有一个教导，对应于TMEM 154的序列可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE(系统性红斑狼疮)的治疗或诊断的药物靶标。这些申请也没有教导，TMEM 154可溶性胞外域，以及其片段和轭合物和其抗体可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症、尤其是SLE(系统性红斑狼疮)的治疗的治疗剂或诊断剂。
对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的TMEM 154抗原已由本申请的申请人在美国专利申请第11/043,860号中报道。然而，美国专利申请第11/043,860号中没有教导W38346_P7(SEQ ID NO：46)可溶性胞外域，以及其片段和其特异性抗体可用作淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE(系统性红斑狼疮)的治疗的治疗剂或诊断剂。
特别地，本发明使用TMEM 154抗原和其不连续部分作为治疗性小分子、肽、抗体、反义RNA、siRNA、核酶和类似物的药物靶标。更具体地，本发明涉及与TMEM 154、和其部分和变体结合的诊断性和治疗性多克隆抗体和单克隆抗体和其片段。根据本发明的至少一些实施方案，使用了抗TMEM 154抗原，其分泌性形式或可溶性形式或ECD和/或其变体、轭合物或片段的抗体和抗体片段以及其片段和变体用于治疗和诊断癌症，尤其是用于治疗淋巴瘤，尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤，多发性骨髓瘤、肾癌或胰腺癌，和/或免疫相关病症，尤其是SLE(系统性红斑狼疮)，其中该抗原是差异表达的。
如上所述，簇W38346以4个转录物为特征，其列于以上表38中。这些转录物编码作为蛋白假想蛋白LOC201799(SEQ ID NO：42)的变体的蛋白。现提供了根据本发明的至少一些实施方案的每个变体蛋白的描述。
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W38346_P3(SEQ IDNO：42)具有由转录物W38346_T0(SEQ ID NO：38)和W38346_T1(SEQID NO：39)所编码的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按照如下关于细胞：膜来定位。
转录物W38346_T0(SEQ ID NO：38)的编码部分起始于233位且终止于781位。转录物还具有如下的SNP，如表40中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表40-核酸SNP
Figure BDA0000079743540002231
转录物W38346_T1(SEQ ID NO：39)的编码部分起始于233位且终止于781位。转录物还具有如下的SNP，如表41中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表41-核酸SNP
Figure BDA0000079743540002232
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W38346_P4(SEQ IDNO：45)具有由转录物W38346_T2(SEQ ID NO：40)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白与已知蛋白的关系描述如下：
2.W38346_P4和已知蛋白Q96MQ8_人之间的对比报告：
A.编码W38346_P4的分离的嵌合多肽，其包含与对应于已知蛋白Q96MQ8_人的氨基酸79-183，且还对应于W38346_P4氨基酸1-105的MVLIPLILLVLLLLSVVFLATYYKRKRTKQEPSSQGSQSALQTYELGSENVKVPIFEEDTPSVMEIEMEELDKWMNSMNRNADFECLPTLKEEKESNHNPSDSES至少90％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：分泌物来定位。
转录物W38346_T2(SEQ ID NO：40)的编码部分起始于516位且终止于830位。转录物还具有如下的SNP，如表42中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表42-核酸SNP
Figure BDA0000079743540002241
根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白W38346_P7(SEQ IDNO：46)具有由转录物W38346_T5(SEQ ID NO：41)所编码的氨基酸序列。根据本发明的至少一些实施方案的变体蛋白和已知蛋白之间的关系的描述如下：
1.W38346_P7(SEQ ID NO：46)与已知蛋白Q96MQ8_人和NP_689893之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q96MQ8_人和NP_689893的氨基酸1-121，且还对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸1-121的MQAPRAALVFALVIALVPVGRGNYEELENSGDTTVESERPNKVTIPSTFAAVTIKETLNANINSTNFAPDENQLEFILMVLIPLILLVLLLLSVVFLATYYKRKRTKQEPSSQGSQSALQT至少90％同源，和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸122-144的序列CKIQLSWKVIPAFCLESSHRNAL(SEQ ID NO：162)至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.W38346_P7(SEQ ID NO：46)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包含与W38346_P7(SEQ ID NO：46)的序列CKIQLSWKVIPAFCLESSHRNAL(SEQ ID NO：162)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
2.W38346_P7(SEQ ID NO：46)和已知蛋白Q6P9G4_人(SEQ IDNO：44)之间的对比报告：
A.分离的嵌合多肽，其包含第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列与对应于已知蛋白Q6P9G4_人(SEQ ID NO：44)的氨基酸1-92，且还对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸1-92的MQAPRAALVFALVIALVPVGRGNYEELENSGDTTVESERPNKVTIPSTFAAVTIKETLNANINSTNFAPDENQLEFILMVLIPLILLVLLLL至少90％同源，对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸93的桥接氨基酸S，第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列与对应于已知蛋白Q6P9G4_人(SEQ ID NO：44)的氨基酸94-121，且还对应于W38346_P7(SEQ IDNO：46)的氨基酸94-121的VVFLATYYKRKRTKQEPSSQGSQSALQT至少90％同源，和第三氨基酸序列，所述第三氨基酸序列与具有对应于W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸122-144的序列CKIQLSWKVIPAFCLESSHRNAL(SEQ ID NO：162)的多肽至少70％，任选地至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％且最优选地至少95％同源，其中所述第一氨基酸序列、桥接氨基酸、第二氨基酸序列和第三氨基酸序列是连续的且顺序排列。
B.W38346_P7(SEQ ID NO：46)的边缘部分的分离的多肽，所述多肽包含与W38346_P7(SEQ ID NO：46)的序列CKIQLSWKVIPAFCLESSHRNAL(SEQ ID NO：162)至少70％，任选地至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％且最优选地至少约95％同源的氨基酸序列。
根据来自多种不同的软件程序和分析的结果确定变体蛋白的定位，所述分析包括来自SignalP和其它专用程序的分析。变体蛋白被认为按如下关于细胞：细胞膜来定位。
变体蛋白W38346_P7(SEQ ID NO：46)还具有以下的非沉默SNP(单核苷酸多态性)，如表43中所列，(根据其在氨基酸序列中的位置给出，并列出了替代的氨基酸)。
表43：氨基酸突变
氨基酸序列上的SNP位置                 替代的氨基酸
137                                   E-＞D
转录物W38346_T5(SEQ ID NO：41)的编码部分起始于233位且终止于664位。转录物还具有如下的SNP，如表44中所列(根据其在核苷酸序列中的位置给出，并列出了替代的核酸)。
表44-核酸SNP
Figure BDA0000079743540002261
实施例6_2：TMEM154转录物的表达分析
还发现TMEM 154转录物在肾癌中过表达，如图42中所示；和在胰腺癌中过表达，如图43所示的。图42-43显示了Affymetrix探针组238063_at的表达图。图42显示了TMEM154转录物在来自肾癌实验和正常肾实验的微阵列芯片中的表达。如可见到的，TMEM154转录物相对于其在正常肾中(圆圈和三角标记)的表达，在肾癌组织中(菱形标记)过表达。
图43A显示了TMEM154转录物在来自胰腺癌实验和正常胰腺实验的微阵列芯片中的表达。如可见到的，TMEM154转录物在胰腺癌组织中过表达(菱形标记)。
图43B显示了TMEM154探针(238063_at，超过中值表达的样品)的高表达，和在来自利妥昔单抗治疗的DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)的样品中的低表达(中值以下)的Kaplan-Meier存活曲线。明显地是，TMEM154高表达与差的存活率有关，并因此可作为抗CD20抗性淋巴瘤患者的潜在治疗。在图43B中，时间刻度以年来显示；实线代表高TMEM154表达；虚线代表低TMEM 154表达。
在不同正常组织和在血液特异性套组中通过序列名称W38346_seg6-20F1R1(SEQ ID NO：106)中所描述的扩增子可检测的假想蛋白FLJ32028、TMEM 154 W38346转录物的表达
通过或根据seg6-20F1R1-W38346_seg6-20F1R1(SEQ ID NO：106)扩增子和引物W38346_seg6-20F(SEQ ID NO：104)和W38346_seg6-20R(SEQ ID NO：105)可检测的假想蛋白FLJ32028TMEM154转录物在血液套组和正常套组中的表达通过实时PCR来测定。用于血液套组的样品在表2和2_1中被详述。用于正常套组的样品在表3中被详述。
正常套组-
对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。然后将每个RT样品的标准化的量除以肾样品(样品编号19-23，以上表3)的量的中值，以获得相对于肾样品的中值的每个样品的相对表达的值，如图44中所示。在正常的PBMC、脾和食管中观察到了高表达。
对于血液套组-对于每个RT样品，按照如实施例1中所描述的从一些管家基因的表达所计算的标准化因子对以上扩增子的表达进行标准化。将每个RT样品的标准化的量除以正常肾样品(样品编号65-67，以上表2)的量的中值，以获得对于每个样品的相对于正常肾样品的中值的相对表达的值。
图45中的柱状图中描述了该分析的结果。以上指出的假想蛋白FLJ32028 TMEM154转录物在PMN、单核细胞、多发性骨髓瘤患者和一些淋巴瘤样品中是高表达的。
正向引物(W38346_seg6-20F)(SEQ ID NO：104)：
CCTTCTAGCCAAGGATCTCAGAGTG
反向引物(W38346_seg6-20R)(SEQ ID NO：105)：
CTTGGGTTGTGATTTGATTCCTTCTC
扩增子(W38346_seg6-20F1R1(SEQ ID NO：106))(SEQ ID NO：106)：
CCTTCTAGCCAAGGATCTCAGAGTGCTTTACAGACATATGAACTGGGAAGTGAAAACGTGAAAGTCCCTATTTTTGAGGAAGATACACCCTCTGTTATGGAAATTGAAATGGAAGAGCTTGATAAATGGATGAACAGCATGAATAGAAATGCCGACTTTGAATGTTTACCTACCTTGAAGGAAGAGAAGGAATCAAATCACAACCCAAG
实施例6_3：与FLAG标签融合的CGEN928 TMEM154_T0P3 ORF的克隆
按以下所描述的通过RT PCR进行与FLAG融合的TMEM154_T0_P3可读框(ORF)的克隆。
将来自血液套组的RT18PMN(从表2样品18得到的RT-PCR产物)和RT19单核细胞(从表2样品19得到的RT-PCR产物)1∶20稀释于TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA pH 8)中并用作PCR的模板。
在以下条件下利用GoTaq ReadyMix(Promega，目录号M7122)来进行PCR：在25μl的总反应体积中，10μl-来自以上所描述的cDNA；1.5μl-H2O；和0.5μl(10μM)-每种引物#100-952(SEQ ID NO：187)和#100-953(SEQ ID NO：188)；且反应程序为94℃下2分钟；94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分钟的40个循环；然后72℃下10分钟。所用的引物包括基因特异性序列；限制性酶切位点；Kozak序列和Flag标签。
将5μl的PCR产物加载到用溴化乙锭染色的1.2％的琼脂糖凝胶上，在100V下在1xTAE溶液中进行电泳，并在UV光下观察。对所预期的条带大小进行验证后，利用QiaQuickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28004)对PCR产物进行纯化。利用NheI和AgeI限制性酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，U.S.A.)消化所纯化的PCR产物。消化后，如以上所描述的将DNA加载到1.2％的琼脂糖凝胶上。将所期望的条带大小切下并利用QiaQuickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号：28707)从凝胶中将其提取。利用LigaFastTM快速DNA连接系统(Promega，目录号：M8221)将消化的DNA连接到先前已用以上的限制性酶消化的pIRESpuro3载体。根据生产商的说明，将所得的DNA转化到感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBC Bioscience，Taipei，Taiwan，目录号：RH816)中，然后接种到用于重组质粒的选择的LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃下孵育过夜。第二天，利用pIRESpuro3载体特异性引物和基因特异性引物通过PCR筛选阳性菌落(数据未示出)。按以上所描述的利用1.2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行分析。验证所期望的条带大小后，使阳性菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml Terrific肉汤中生长，并在37℃下震荡过夜。利用QiaprepTMSpin Miniprep Kit(Qiagen，目录号：27106)从细菌培养物中分离质粒DNA。通过对插入物进行测序来验证准确的克隆(Weizmann Institute，Rehovot，Israel)。验证无差错的菌落(即，ORF中无突变)后，将重组质粒进行进一步的分析。
图46中显示了所得的TMEM154_T0_FLAG(SEQ ID NO：189)的DNA序列；FLAG序列是下划线的。
图47中显示了TMEM154_P3_FLAG(SEQ ID NO：190)的氨基酸序列；FLAG序列是下划线的。
实施例6_4：测定TMEM154_P3的细胞定位
为测定TMEM154_P3的细胞定位，按以上所描述的将TMEM154_T0_P3框内克隆到FLAG标签。在瞬时转染后利用共聚焦显微镜观察蛋白定位(Chen等人，Molecular Vision 2002；8；372-388)。在转染后48小时，利用与轭合Cy-3荧光团的抗FLAG抗体对细胞进行染色并观察细胞的荧光信号的存在。
按照如上所述将TMEM154_T0_P3_FLAG(SEQ ID NO：189)pIRESpuro3构建体瞬时转染到HEK-293T细胞中。瞬时转染后48小时，将盖玻片上的细胞进行进一步免疫染色处理并通过共聚焦显微镜进行分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)(稀释于PBS中)的溶液固定盖玻片15分钟。通过在3mM甘氨酸(Sigma，目录号：G7126)(稀释于PBS中)中孵育5分钟而完成PFA的猝灭。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用0.1％triton-X100(稀释于PBS中)透化细胞5分钟。两次5分钟的PBS洗涤后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)完成非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用在含5％BSA的PBS中1∶100稀释的小鼠抗FLAG-Cy3抗体(Sigma，目录号：A9594)在潮湿的室中将盖玻片孵育1小时，接着在PBS中进行三次5分钟的洗涤。利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
图48中显示了细胞定位。TMEM154_P3定位于细胞膜。
实施例6_5：对TMEM154_P3蛋白特异性的多克隆抗体的产生
所有多克隆Ab产生过程，包括肽合成、肽轭合、动物免疫、采血和抗体纯化，均在Sigma-Aldrich(Israel)进行。对两对兔(每个表位一对)进行注射以制备TMEM154_P3的抗体(兔编号分别为6285和6286、6248和6249)。动物照管、处理和注射均由Sigma(Israel)来进行。
用于兔免疫的肽如下：命名为TM21RGNYEELENSGDTTVESER(SEQID NO：191)，其为取自对应于TMEM154_P3蛋白(SEQ ID NO：42)的氨基酸21-39的N’末端的序列。待使用的第二肽序列为：命名为TM101的YKRKRTKQEPSSQGSQS(SEQ ID NO：192)，其为取自对应于TMEM154_P3蛋白(SEQ ID NO：42)的氨基酸101-117的C’末端的序列。合成了具有95％纯度的25mg的每种肽，将其中的10mg与KLH载体轭合。按照以下利用对应的轭合的肽来免疫每对兔：利用TM21肽(SEQ ID NO：191)免疫兔6285和6286，且利用TM101肽(SEQ ID NO：192)免疫兔6248和6249。每两周免疫动物。从每个兔采集60ml的生产血并利用产生相应的抗体的肽进行亲和纯化。
实施例6_6：通过TMEM154转染的细胞的免疫染色对纯化的TMEM154_P3抗体的表征
为进一步表征针对TMEM154_P3而产生的亲和纯化的抗体，利用TMEM154_P3稳定转染的HEK293T细胞的免疫染色对抗体-蛋白相互作用进行研究。
表达TMEM154_P3蛋白的稳定库的生成
生成了两种稳定转染的库，TMEM154_P3 pIRESpuro3和阴性对照，空载pIRESpuro3。如以上所描述的将两种构建体转染到HEK-293T细胞中。
TMEM154转染的细胞的免疫染色
将以上所描述的稳定表达TMEM154或空载体pIRES puro3的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)的每孔500,000个细胞接种到直径13mm的无菌玻璃盖玻片上(Marienfeld，目录号：01 115 30)，所述盖玻片被放置到6孔板中，使用了2ml预热的DMEM[Dulbecco改良的Eagle培养基，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清，Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：04-001-IA]+4mM L-谷氨酰胺[Biological Industries(Beit Ha′Emek、Israel)，目录号：03-020-1A]。
将细胞接种到盖玻片上后48小时，将其进行进一步处理以免疫染色并在共聚焦显微镜下分析。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤盖玻片，并用3.7％多聚甲醛(PFA)(Sigma，目录号：P-6148)/3％葡萄糖(Sigma，目录号：G5767)固定盖玻片25分钟。在PBS中进行2次5分钟的洗涤后，用0.1％的triton-X100(稀释于PBS中)对细胞进行透化，持续5分钟。两次5分钟的PBS洗涤之后，利用5％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，目录号：A4503)(稀释于PBS中)进行非特异性区域的封闭，持续20分钟。然后利用以上所描述的纯化的兔抗TMEM 154抗体：含5％BSA的PBS中1∶1000稀释的TM21(兔6285、62861mg/ml)和5％BSA中1∶1000稀释的TM101(兔62486249，1mg/ml)将盖玻片在潮湿的室中孵育1小时。将抗体在PBS中进行3次5分钟的洗涤。然后利用在含3％BSA的PBS中1∶200稀释的第二抗体：轭合Cy-3荧光团的驴抗兔(JacksonImmunoResearch，目录号：711-165-152)将盖玻片在潮湿的室中孵育1小时。在PBS中进行三次5分钟的洗涤后，利用凝胶封固水介质(Sigma，目录号：G0918)将固定的盖玻片封固到载玻片上，并利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光产物的存在。
在TMEM154转化的细胞上利用纯化的TM21和TM101抗体观察到定位于细胞膜的特异性细胞染色(分别为图49和图50)，而在阴性对照pIRESpuro3 HEK-293T转染的细胞上利用这些抗体没有观察到染色(图51)。从图49和图50中获得的红色荧光，相对于从图51中的信号的不存在，表明了TM21和TM101抗体对TMEM154_P3(SEQ ID NO：42)的特异性。
实施例6_7：通过淋巴母细胞细胞系的免疫染色对TMEM154_P3的内源性表达的证明
为测定TMEM 154的内源性表达，选择三个细胞系用于利用如以上所描述的对TMEM154_P3蛋白特异性的抗体的免疫染色。
将来自每个细胞系：Ramos(ATCC目录号CRL-1923)、CESS(ATCC目录号TIB-190)、Daudi(ATCC目录号CCL-213)的500000个细胞用含3％葡萄糖的3.7％的PFA进行固定并将其接种到预先用聚L赖氨酸(poly-L-Lysin)0.01％(Sigma目录号P4832)处理的盖玻片上。按以上所描述的将细胞进行进一步的处理以免疫染色并通过共聚焦显微镜进行分析。
如图52中所示，在全部的三个细胞系上利用纯化的TM21和TM101抗体观察到定位于细胞膜的特异性细胞染色。
实施例7
完全人类抗KRTCAP3抗体、抗FAM26F抗体、抗MGC52498抗体、抗FAM70A抗体和抗TMEM154抗体的开发
抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154抗原的人类单克隆抗体的生成
通过标准重组方法生成了由与IgG2 Fc多肽连接的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154的胞外结构域组成的融合蛋白，并用作免疫的抗原。
转基因的HuMab小鼠
利用来自表达人类抗体基因的转基因HuMab小鼠
Figure BDA0000079743540002331
的HCo7系的小鼠制备抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154的完全人类单克隆抗体。在该小鼠种系中，如Chen等人(1993)EMBO J.12：811-820中所描述的已将内源性的小鼠κ轻链基因纯合破坏，且如PCT公布WO 01/09187的实施例1中所描述的已将内源性小鼠重链基因纯合破坏。并且，该小鼠种系携带如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851中所描述的人类κ轻链转基因，KCo5，和如美国专利第5,545,806号；第5,625,825号；和第5,545,807号中所描述的人类重链转基因，HCo7。
HuMab免疫：
为生成抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A和TMEM154多肽的完全人类单克隆抗体，可利用纯化的重组KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154融合蛋白免疫HCo7HuMab小鼠
Figure BDA0000079743540002341
种系的小鼠，所述融合蛋白来源于被含有编码该融合蛋白的基因的表达载体转染的哺乳动物细胞。用于HuMab小鼠
Figure BDA0000079743540002342
的一般免疫方案在Lonberg，N.等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和PCT公布WO 98/24884中被描述。在抗原的第一次输注时，小鼠为6-16周龄。纯化的重组KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原制剂(5-50微克，从表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154融合蛋白的转染的哺乳动物细胞中纯化的)用来腹膜内免疫HuMab小鼠。
利用含抗原的弗氏完全佐剂或Ribi佐剂对转基因小鼠进行两次IP免疫，然后利用含有抗原的弗氏不完全佐剂或Ribi佐剂进行3-21天的IP(最多共计11次免疫)。通过眼眶后取血来监测免疫反应。通过ELISA(如下所描述的)来筛选血浆，且使用具有抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154人类免疫球蛋白的足够滴度的小鼠用于融合。在处死小鼠和移去脾前3天，对小鼠静脉注射抗原加强免疫。
产生抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的HuMab小鼠
Figure BDA0000079743540002343
的选择：
为选择产生与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽结合的抗体的HuMab小鼠
Figure BDA0000079743540002344
通过如最初由Fishwild，D.等人(1996)所描述的修改的ELISA对来自免疫的小鼠的血清进行检验。简言之，利用以1-2μg/ml于PBS中的纯化的重组KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154融合蛋白以50μl/孔包被微量滴定板，在4℃下进行过夜孵育，且然后利用含5％BSA的PBS以200μl/孔进行封闭。将来自KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154免疫的小鼠的血浆的稀释物添加到每孔并在室温下孵育1-2小时。利用PBS/Tween洗涤培养板并在室温下将其与碱性磷酸酶轭合的山羊抗人κ轻链多克隆抗体孵育1小时。洗涤后，利用pNPP底物使板显色并通过分光光度计在OD 415-650处进行分析。使用形成最高滴度的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的小鼠用于融合。按以下所描述的进行融合并通过ELISA检验杂交瘤上清液的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154活性。
产生抗KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
基于标准方案，利用PEG将从HuMab小鼠分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。且然后筛选所得的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。利用50％的PEG(Sigma)将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与四分之一数量的P3X63Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性小鼠骨髓瘤细胞融合。将细胞以约1×10-5/孔接种到平底微量滴定板中，然后在含10％胎牛血清、含origen(IGEN)的RPMI、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、青霉素、链霉素、庆大霉素、1x HAT和β-巯基乙醇的选择性培养基中孵育约两周。1-2周后，将细胞培养在用HT替换HAT的培养基中。且然后通过ELISA(以上所描述的)筛选每个孔的人类抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154单克隆IgG抗体。一旦发生大量的杂交瘤生长，通常在10-14天后监测培养基。再接种分泌杂交瘤的抗体、再次筛选，并且，如果仍为人类IgG阳性的话，则通过有限稀释将抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154单克隆抗体进行至少两次亚克隆。且然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成少量的抗体，用于进一步表征。
选择用于进一步分析的杂交瘤克隆
所期望的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154人类单克隆抗体的结构表征
利用标准PCR技术从所得的杂交瘤中分别获得编码所获得的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并利用标准DNA测序技术对该cDNA序列进行测序。
鉴定了重链可变区和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。可将这些序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链和重链序列进行比较，并鉴定所获得的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154序列的每个重链和轻链的CDR。
抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154人类单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征
通过Biacore分析来检验抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的结合亲和性、结合动力学、结合特异性和交叉竞争。并且，还通过流式细胞术来检验结合特异性。
结合亲和性和动力学
通过Biacore分析(Biacore AB、Uppsala、Sweden)表征根据本发明所产生的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的亲和性和结合动力学。利用标准胺偶联化学和由Biacore所提供的试剂盒，通过伯胺将纯化的重组人类KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154融合蛋白与CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)共价连接。通过提供含267nM的浓度的抗体的HBS EP缓冲液(由BIAcore AB所提供)和50μl/min的流速来测量结合。跟踪抗原-抗体结合动力学3分钟且跟踪解离动力学7分钟。利用B1Aevaluation软件(Biacore AB)，结合曲线和解离曲线拟合1∶1的Langmuir结合模型。在结合常数的评估中为使亲合性最小化，仅将对应于结合相和解离相的数据的起始部分用于拟合。
所获得的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的表位绘图
Biacore被用来测定抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的表位分组，分别用来对KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原上的其表位作图。将这些不同的抗体包被到相同芯片的三个不同的表面上，每个达8000RU。以10μg/mL起始制备每种mAb的稀释物，并将其与Fc融合的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154(50nM)孵育1小时。将所孵育的复合物同时以20μL/分钟的流速持续1.5分钟注射到全部三个表面(和空白表面)上。在1.5分钟末将来自每个表面的信号减去适当的空白，对应复合物中mAb的浓度绘制曲线。对数据进行分析后，依据表位绘图结果将抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体归为不同的表位组。并对比它们的功能性质。
建立了在细胞表面表达KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，并通过流式细胞术将其用以测定KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154HuMAb的特异性。利用含有编码KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154抗原或其变体的跨膜形式的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。在N末端含有表位标签的转染蛋白用于通过对该表位特异性的抗体来检测。抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154MAb的结合通过将转染的细胞与10微克/ml的浓度的KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗体中的每一种进行孵育来评估。洗涤细胞并利用FITC-标记的抗人IgGAb来检测结合。使用鼠抗表位标签Ab、然后是标记的抗鼠IgG作为阳性对照。使用非特异性的人类和鼠Ab作为阴性对照。所获的数据被用来评价HuMAb对KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原靶标的特异性。
对KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154多肽特异性的这些抗体和其它抗体可被用于以上所描述的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154相关治疗，比如其中KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原差异表达的癌症的治疗，比如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和血液系统恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、白血病和T细胞白血病，涉及KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM154抗原，比如在癌症和炎性疾病或自身免疫病的治疗中，其中这种抗体将，例如，防止针对所需的靶标癌细胞的T细胞活性负向刺激或防止T细胞活性的正向刺激从而引起所需的抗自身免疫效应。
已描述了本发明，并提供了与所期望的用作治疗物的抗KRTCAP3、抗FAM26F、抗MGC52498、抗FAM70A或抗TMEM154抗体的生产和选择和诊断方法的预示实施方案，其中疾病或病症与KRTCAP3、FAM26F、MGC52498、FAM70A或TMEM 154抗原相关。现在通过以下的权利要求来进一步描述本发明。
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Claims (55)

1.一种多克隆或单克隆抗体或片段，所述抗体或片段与选自由SEQ IDNO：42-46、63、64、161、162、191、192组成的组的TMEM154多肽中的至少一个、或与其具有至少85％序列同一性的其片段或变体或同源物特异性结合。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体阻滞或抑制选自由SEQ ID NO：42-46组成的组的多肽中的至少一个与其对应物相互作用。
3.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段替代或增强选自由SEQ ID NO：42-46组成的组的多肽中的至少一个与其对应物相互作用。
4.根据权利要求1所述的抗体或片段，所述抗体或片段通过调节选自由SEQ ID NO：42-46组成的组的TMEM154蛋白中的至少一个的活性而适用于癌症或免疫相关病症的治疗或预防。
5.根据权利要求4所述的抗体或片段，其中所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌组成的组。
6.根据权利要求4所述的抗体或片段，其中所述免疫相关病症是SLE(系统性红斑狼疮)。
7.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中抗原结合位点含有以上序列的任何一种的大约3-7个连续的或非连续的氨基酸。
8.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体是完全人类抗体、人源化的抗体或灵长类动物化的抗体，或嵌合的抗体。
9.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体选自由Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单元组成的组。
10.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中所述抗体与可检测的标记物或效应部分偶联。
11.根据权利要求10所述的抗体或片段，其中所述效应部分是放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、化学治疗剂、细胞因子抗体、细胞因子受体或免疫调节剂中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的抗体或片段，其中所述可检测的标记物是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物中的一种或多种。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-12中任一项的抗体或片段。
14.一种用于调节淋巴细胞活性的方法，所述方法包括将对选自由SEQ ID NO：42-46组成的组的TMEM154多肽阳性的淋巴细胞与有效调节至少一种淋巴细胞活性的量的能够调节TMEM154介导的信号传递的生物活性剂相接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述剂包含TMEM154介导的信号传递的拮抗剂，且其中所述接触抑制了由这种信号传递介导的淋巴细胞活性的衰弱。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述接触提高了淋巴细胞活性。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述拮抗剂包括能够干扰TMEM154抗原和其对应物的功能性相互作用的阻滞剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所施用的拮抗剂是通过调节TMEM154蛋白中的任何一种的活性而适宜于癌症的治疗或预防的抗体或片段。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所施用的抗体或片段抑制针对癌细胞的T细胞活性的负向刺激。
20.一种治疗或预防TMEM154阳性的癌症或免疫相关病症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求1-13中任一项的抗体或片段或药物组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述治疗与另外的药物或治疗方法联合提供。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌组成的组。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述免疫相关病症是SLE(系统性红斑狼疮)。
24.一种抗体或片段，所述抗体或片段与SEQ ID NO：42-46、63、64、161、162、191、192中的任何一个的至少一种多肽、或其片段或变体特异性结合，用于诊断以选自由SEQ ID NO：42-46组成的组的TMEM154多肽中的至少一个、或其片段或变体的差异表达为特征的癌症或免疫相关病症。
25.根据权利要求24所述的抗体，其中所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌组成的组。
26.根据权利要求24所述的抗体，其中所述免疫相关病症是SLE(系统性红斑狼疮)。
27.一种用于在受治疗者中诊断癌症或免疫相关病症的方法，所述方法包括在受治疗者中或在获自所述受治疗者的样品中检测以下多肽的存在和/或所述多肽的过表达水平，所述多肽具有与TMEM154多肽中的任何一种、或其片段至少85％同源的序列，所述TMEM154多肽具有选自由SEQID NO：42-46、63、64、161、162组成的组的氨基酸序列；其中所述过表达水平是相对于所述多肽在相应的正常组织中的正常水平来测定的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述检测通过免疫测定来进行。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述免疫测定使用根据权利要求1、10或24中任一项的抗体。
30.一种用于在样品中检测生物样品中的选自由SEQ ID NO：42-46中任何一个组成的组的TMEM154蛋白中的任何一种、或其片段或变体的存在的测定，所述测定包括将样品与根据权利要求1、10或24中任一项的抗体或片段相接触。
31.根据权利要求27所述的方法，其中检测TMEM154多肽、或其片段或变体的存在和/或过表达的水平在体内或体外进行。
32.一种用于在受治疗者中诊断癌症或免疫相关病症的方法，所述方法包括在受治疗者中或在获自所述受治疗者的样品中检测以下多核苷酸的存在和/或所述多核苷酸的过表达水平，所述多核苷酸具有与SEQ IDNO：23、38-41或106中的至少一个中所列的核酸序列至少85％同源的序列；其中所述过表达水平是相对于所述多核苷酸在相应的正常组织中的正常水平来测定的。
33.根据权利要求27或32的任一项所述的方法，其中诊断包括在受治疗者中筛选癌症或免疫相关病症、在受治疗者中检测癌症或免疫相关病症的存在或严重度、区分癌症或免疫相关病症与其它疾病、提供癌症或免疫相关病症的预后、在受治疗者中监测癌症或免疫相关病症的进程或复发、在受治疗者中对癌症或免疫相关病症的治疗效果或复发的评估、在受治疗者中选择癌症或免疫相关病症的疗法和治疗、在受治疗者中对癌症或免疫相关病症的给定疗法的优化、在受治疗者中监测癌症或免疫相关病症的治疗、预测疗法对于特定患者或亚群的适合性、测定治疗产品在患者或亚群中的适当剂量给药。
34.根据权利要求27或32的任一项所述的方法，其中所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌组成的组。
35.根据权利要求27或32的任一项所述的方法，其中所述免疫相关病症是SLE(系统性红斑狼疮)。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述检测利用能够和与SEQ IDNO：23、38-41或106中任何一个所列的核酸序列至少85％同源的核酸序列的至少一部分杂交的寡核苷酸对来进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述检测利用SEQ IDNO：104-105中的任何一个所列的寡核苷酸对来进行。
38.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含具有SEQ IDNO：106所列的核酸序列的扩增子、或其片段、或与其同源的多核苷酸。
39.一种引物对，所述引物对包含能够扩增SEQ ID NO：23、38-41或106中的至少一个所列的核酸序列、或其片段、或与其同源的多核苷酸的一对分离的寡核苷酸。
40.根据权利要求39所述的引物对，所述引物对包含具有选自由SEQID NO：104-105组成的组的序列的一对分离的寡核苷酸。
41.一种分离的多肽，所述分离的多肽为TMEM154胞外域、或与其具有至少95％序列同一性的其片段或变体。
42.根据权利要求41所述的多肽，所述多肽包含与以下序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述序列选自由以下组成的组：序列W38346_P3(SEQ ID NO：42)或W38346_P7(SEQ ID NO：46)的氨基酸残基23-75，对应于SEQ ID NO：63中所描述的氨基酸序列；或序列W38346_P4(SEQ ID NO：45)的氨基酸残基20-105，对应于SEQ ID NO：64中所描述的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：63、64、161、162、191或192中任何一个所列的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的其片段。
43.根据权利要求41或42中的任一项所述的多肽，所述多肽与非TMEM154蛋白序列融合，或与可检测的部分或治疗性部分连接。
44.根据权利要求43所述的融合蛋白，其中所述非TMEM154蛋白是免疫球蛋白分子的至少一部分。
45.一种核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求41、42、43或44中任一项的TMEM154胞外域多肽。
46.根据权利要求45所述的核酸序列，所述核酸序列具有SEQ IDNO：23所列的序列、或与其具有至少95％序列同一性的其片段或变体。
47.一种表达载体，所述表达载体含有根据权利要求45或46中任一项的核酸序列。
48.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求47的表达载体。
49.一种产生TMEM154胞外域多肽、或其片段或轭合物的方法，所述方法包括在使细胞表达由DNA区段或核酸所编码的多肽的条件下培养根据权利要求48的宿主细胞，并回收所述多肽。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据权利要求41、42、43或44中任一项的多肽，且还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
51.一种用于治疗或预防癌症或免疫相关病症的方法，所述方法包括向需要其的受治疗者施用根据权利要求50的药物组合物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、抗CD20(即，利妥昔单抗)抗性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌和胰腺癌组成的组。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述免疫相关病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
54.一种siRNA、反义RNA或核酶，所述siRNA、反义RNA或核酶与编码TMEM154多肽中的任何一种的转录物结合并抑制其表达。
55.根据权利要求13或50中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于与另外的药物或治疗方法联合使用。
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