BR112014012119A2 - anticorpo anti-trop-2 humano tendo uma atividade anti-tumor in vivo - Google Patents

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Kentaro Okamura
Maki Tamura
Hiroyuki Yanai
Toru Kanke
Naoya Tsurushita
Shankar Kumar
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Abstract

anticorpo anti-trop-2 humano tendo uma atividade anti-tumor in vivo. a presente invenção fornece: um anticorpo que reage especificamente com htrop-2 e tem atividade anti-tumor in vivo (particularmente, um anticorpo humanizado); um hibridoma que produz o anticorpo já mencionado ; um conjugado do anticorpo já mencionado e um medicamento; uma composição farmacêutica para diagnosticar ou tratar um tumor; um método para detectar um tumor e um kit para detectar ou diagnosticar um tumor.

Description

“ANTICORPO ANTI-TROP-2 HUMANO TENDO UMA ATIVIDADE ANTI-TUMOR IN VIVO”
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-TROP-2 humano tendo atividade anti-tumor e, particularmente, a um anticorpo anti-TROP-2 humano tendo atividade anti-tumor in vivo. Além disso, a presente invenção diz respeito a um hidridoma, que produz o anticorpo já mencionado e ao uso do anticorpo já mencionado.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] TROP-2 humano (Tacstd2, GA733-1 e EGP-1) (a seguir também referido como “hTROP-2”) é uma proteína de membrana celular tipo 1 de transmembrana simples que consiste de 323 resíduos de aminoácido (ver SEQ ID Nº: 2) e esta proteína foi conhecida ser super-expressada em vários tipos de carcinomas de célula epidérmica. A presença de uma proteína de membrana celular associada com resistênci imunológica, que é comumente expressada tanto em trofoblastos humanos quanto em células cancerígenas, foi sugerida (Documento que não de patente 1). Uma molécula de antígeno reconhecida por anticorpos monoclonais de camundongo (162-25.3, 162-46.2) que reagem com a proteína de membrana celular de uma linhagem celular de coriocacinoma humana BeWeo foi identificada. Esta moléculad e antígeno foi considerada com uma das moléculas expressadas em trofoblastos humanos e foi denominado como Trop-2 (Documento que não de patente 2). A seguir, a mesma molécula foi descoberta por outros pesquisadores. Isto é, um antígeno tumoral reconhecido por um anticorpo monoclonal de camundongo GA733 que é obtido pela imunização com células de câncer de estômago SW948 foi denomiando como GA733-1 (Documento que não de patente 3) e uma glicoproteína epitelial reconhecida como um anticorpo monoclonal de camundongo RS7-3G11 que é obtido pela imunização com células de câncer pulmonar de célula não pequena foi denomiando como um antígeno epitelial/carcinoma, EGP-1 (Documento que não de patente 4). Em 1995, o gene Trop-2 foi clonado e como um resultado, foi confirmado que estas são as mesmas moléculas (Documento que não de patente 5). Além disso, foi esclarecido que a molécula tem uma função de amplificar os sinais de cálcio intracelulares nas células cancerígenas (Documento que não de patente 6) e, portanto, também é referido como um transdutor de sinal de cálcio associado com tumor 2 (TACSTD?2).
[0003] O gene hTROP-2 pe mapeado no cromossomo 1p32 e constitui uma família do gene TACSTD junto com GA733-2 tendo uma homologia de aproximadamente 50 % com este (que foi conhecido como “TACSTD1/,
“glicoproteína epitelial EGP-2," “EpCAM” ou “Trop-1”) (Documento que não de patente 7). A proteína hTROP-2 (323 resíduos de aminoácido; SEQ ID Nº: 2) tem um peso molecular de aproximadamente 36K Dalton e esta proteína consiste de um peptídeo sinalizador hidrofílico (1º ao 26º aminoácidos), um domínio extracelular (27º a 274º aminoácidos), um domínio de transmembrana (275º a 297º aminoácidos) e um domínio intracelular (298º a 323º aminoácidos). O domínio extracelular teve quatro locais de glicosilação ligado por N heterogêneo e seu peso molecular aparente é aumentado por 11 a 13K Dalton devido à adição de cadeias de açúcar (Documento que não de patente 5). É considerado que a família do gene TACSTD teve uma sequência de tiroglobulina característica (TY) no domínio extracelular e é associado com a proliferação, invasão e metástase de células cancerígenas.
[0004] Até hoje, um ligando fisiológico de hTROP-2 não foi identificado, a função molecular deste não foi esclarecido. Entretanto, foi descrito que o hTROP-2 transmite um sinal de cálcio em células tumorais (Documento que não de patente 6). Além disso, a partir dos fatos que a serina intracelular 303 é fosforilada pela proteína cinase C (PKC) que é cinase dependente de Ca? (Documento que não de patente 4) e que a hTROP-2 teve uma sequência de ligação PIP2 em seu domínio intracelular, foi sugerido que a hTROP-2 teve uma função de sinalização em células tumorais (Documento que não de patente 8).
[0005] Como um resultado das análises, tais como imuno-histoquímica (IHC) e citometria de fluxo, super-expressão de hTROP-2 em muitos tipos de carcinomas derivados de epitélio, tais como câncer de estômago, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer ovriano, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de fígado e câncer de esôfago foi relatado. Em contraste, a expressão de hTROP-2 em tecidos normais é limitada às células na região epitelial e o nível de super-expressão de hTROP-2 em células normais é menor do que células cancerígenas. Desta maneira, a associação de TROP-2 com a formação de tumor é sugerido (Documentos de patente 1a3e9).
[0006] Além disso, foi demonstrado que a expressão de hTROP-2 usado como um biomarcador em amostras clínicas correlaciona-se com a malignidade do câncer colorretal (Documentos que não de patente 10 e 11), câncer pancreático (Documento que não de patente 12) ou câncer oral (Documento que não de patente 13), e que quando hTROP-2 é superexpressado, a possibilidade de metástase ou recorrência de câncer é significantemente alta. Além disso, em uma análise de expressão genética em grande escala usando-se uma técnica de microensaio de cDNA, hTROP-2 foi identificado como um grupo genético, que é superexpressado no nível mais alto em adenocarcinoma papilar grave do ovário, em comparação com o epitélio ovariano normal (Documento que não de patente 14).
[0007] Ainda, em anos recentes, um papel importante de hTROP-2 na formação de tumores foi demonstrado em modelos usando-se células de câncer do cólon (Documento que não de Patente 15). Uma vez que a expressão de hTROP-2 promove a proliferação de células independente de ancoragem das celulas tumorais e é necessário para a formação de tumor e a proliferação de células cancerígenas transplantadas subcutaneamente em camundogos imunodeficientes, levantou a possibilidade de que hTROP-2 deve atuar como um antígeno de tumor funcional e deve ser usado como um novo alvo terapêutico.
[0008] Até o momento, foram relatados estudos sobre os efeitos anti- tumorais de diversos anticorpos anti-hTROP-2. Um anticorpo RS7 (Documento de patente 1) foi examinado utilizando-se modelos in vivo, em que foram usados anticorpos marcados com substância radioativa e atividade anti-tumoral foi demonstrada em modelos de xenoenxerto de camundongos nus. Entrentanto, os efeitos anti-tumorais apenas (um anticorpo nu) não foram relatados.
[0009] Além disso, a citotoxicidade de um anticorpo monoclonal anti-hTROP BR110 (Documento de patente 2) em linhagens celulares de cancro humano
H3619, H2987, MCF-7, H3396 e H2981 em experimentos in vitro foi relatados . Entretanto, a citotoxicidade de um anticorpo nu ou um imunoconjugado de BR110 in vivo não foi divulgado.
[0010] Em anos recentes, foi relatado que um anticorpo monoclonal isolado, que foi produzido a partir de uma linhagem celular de hibridoma AR47A6.4.2 ou ARS2A301.5 obtida pela imunização de camundongos com tecidos de câncer de ovário humano, ligado a hTROP-2, e que, pela primeira vez, apresentado, como um anticorpo nu, a atividade anti-tumoral em modelos de xenoenxerto de camundongo nu, bem como citotoxicidade in vitro (Documentos de patente 3 e 4). Nestes documentos de patente, o anticorpo já mencionado apresentou efeitos anti-tumor pelo tratamento com anticorpo apenas em modelos de xenoenxerto de camundongo, em que linhas de célula de câncer pancreático BxPC-3 e PL45, uma linha de célula de câncer de próstata PC-3, uma linha de célula de câncer de mama MCF-7 e uma linha de câncer de cólon Colo205 foram transplantadas. Os efeitos terapêuticos do anticorpo apareceram nos modelos, em que as células BxPC-3 foram transplantadas. Outros que não, transformação e proliferação de tumor foram apenas parcialmente (aproximadamente 40 % a 60 %) suprimidos pela administração preventiva do anticorpo e uma quantidade extremamente grande (aproximadamente 20 mg/kg)
do anticorpo foi necessário para tal supressão da formação e proliferação de tumor.
[0011] Com base nas descobertas prévias mencionadas acima, o uso potencial do anticorpo anti-hTROP-2 como um anticorpo anti-tumor foi sugerido. Entretanto, nem todos os anticorpos anti-hTROP-2 apresentaram efeitos anti- tumor pelo tratamento com anticorpo apenas como anticorpos nus in vivo. Os anticorpos apresentam ações diferentes em hTROP-2, dependendo de um local de ligação, afinidade e das propriedades de um anticorpo monoclional.
[0012] Documento de patente 1: Patente U. S. Nº 6653104
[0013] “Documento de patente 2: Patente U. S. Nº 5840854
[0014] Documento de patente 3: Patente U. S. Nº 7420040
[0015] Documento de patente 4: Patente U. S. Nº 7420041
[0016] “Documento que não de patente 1: Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75(4), pp. 1947-1951 (1978)
[0017] Documento que não de patente 2: Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78(8), pp. 5147-5150 (1981)
[0018] Documento que não de patente 3: Linnenbach AJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86(1), pp. 27-31 (1989)
[0019] Documento que não de patente 4: Basu A, et al., Int. J. Cancer, 62(4),
pp. 472-479 (1995)
[0020] Documento que não de patente 5: Fornaro M, et al., Int. J. Cancer, 62(5), pp. 610-618 (1995)
[0021] Documento que não de patente 6: Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76(5), pp. 671-676 (1998)
[0022] Documento que não de patente 7: Calabrese G, et al., Cell Genet, 92(1-2), pp. 164-165 (2001)
[0023] “Documento que não de patente 8: El Sewedy T et al., Int. J. Cancer, 75(2), pp. 324-330 (1998)
[0024] Documento que não de patente 9: Cubas R, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1796(2), pp. 309-314 (2009)
[0025] “Documento que não de patente 10: Ohmachi T et al., Clin. Cancer Res., 12(10), pp. 3057-3063 (2006)
[0026] Documento que não de patente 11: Fang YJ, et al., Int. J. Colorectal Dis., 24(8), pp. 875-884 (2009)
[0027] Documento que não de patente 12: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), pp. 1290-1295 (2008)
[0028] “Documento que não de patente 13: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), pp. 186-191 (2008)
[0029] Documento que não de patente 14: Santin AD, et al., Int. J. Cancer, 112(1), pp. 14-25 (2004)
[0030] Documento que não de patente 15: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), pp. 280-285 (2008)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0031] Sob as circunstâncias já mencionadas, foi desejado desenvolver um anticorpo anti-hTROP-2 (um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2) tendo atividade anti-tumoral alta in vivo e, especificamente, um anticorpo anti-hTROP- 2 ou semelhante, tendo um efeito anti-tumor como um anticorpo nu sozinho in vivo e ainda, tendo o efeito anti-tumor em uma dose menor e, particularmente, um tal anticorpo anti-hTROP-2, que é um anticorpo humanizado.
[0032] A presente invenção foi completada, enquanto leva-se em consideração as circunstancias já mencionadas. A presente invenção fornece um anticorpo anti-hTROP-2 (um anticorpo monocilonal anti-hTROP-2), um hibridoma, que produz o anticorpo, um fragmento do anticorpo, um conjugado (um imunoconjugado) do anticorpo ou semelhante e um medicamento, uma composição farmacêutica para diagnosticar ou tratar um tumor, um método para detectar um tumor, a kit para detectar ou diagnosticar um tumor e outros, que serão descritos abaixo.
[0033] (1)Um anticorpo contra TROP-2 humano em que uma região V da cadeia H do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 92 ou 98, and an região V da cadeia L do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 93.
[0034] No anticorpo de acordo com (1) acima, as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 36 a 38, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1a 3 da região V da cadeia L do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 41 a 43, respectivamente.
[0035] (2)Um anticorpo contra TROP-2 humano em que uma região V da cadeia H do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 94 or 95, and an região V da cadeia L do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 96.
[0036] No anticorpo de acordo com (2) acima, as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 66 a 68, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1a 3 da região V da cadeia L do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 71 a 73, respectivamente.
[0037] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo humanizado.
[0038] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo tendo atividade anti-tumor in vivo.
[0039] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo que apresenta 50 % ou mais de atividade inibidora do desenvolvimento tumoral em uma dosagem de 5 a 20 mg/kg de peso corporal. Aqui, a frequência de administração para apresentar a atividade inibidora do desenvolvimento tumoral é, por exemplo, de uma vez por semana.
[0040] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo exhibiting 50 % ou mais da atividade inibidora do desenvolvimento tumoral por uma administração simples do anticorpo em uma dosagem de 10 mg/kg de peso corporal.
[0041] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo tendo atividade anti-tumor em dois ou mais tipos de linhagens celulares tumorais humanas.
[0042] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo tendo uma constante de dissociação (valor Kd) de 1,0 x 10º M ou menos.
[0043] Um exemplo do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima é um anticorpo monoclonal.
[0044] Aqui, o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. O tumor é, preferivelmente, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano.
[0045] Além disso, o tumor é, por exemplo, um câncer recorrente ou um câncer metastático.
[0046] Além disso, as linhagens celulares tumorais são, por exemplo, pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, uma linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-3L, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-1, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45H, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45P, uma linhagem celular de câncer pancreático humano TCC-PAN2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano SUIT-
2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano CACO-2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480, uma linhagem celular de câncer de cólon humano DLD-1, uma linhagem celular de câncer de cólon humano HCT 116, uma linhagem celular de câncer de mama humano JIMT-1, uma linhagem celular de câncer de mama humano HCC1143, uma linhagem celular de câncer de mama humano MCF-7, uma linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-468, uma linhagem celular de câncer de próstata humano DU145, uma linhagem celular de câncer de próstata humano PC-3, uma linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3, uma linhagem celular de câncer de ovariano humano SK-OV-3 e uma linhagem celular de câncer de duto biliar humano TFK-
1. Entre outros, as linhagens celulares tumorais são, preferivelmente, pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, uma linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, uma linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3, uma linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-468 e uma linhagem celular de câncer de ovariano humano SK-OV-3.
[0047] (3)Um fragmento de anticorpo derivado do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima.
[0048] Os exemplos do fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima incluem um fragmento de anticorpo que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 92 ou 98 e/ou a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 93 ou um fragmento de anticorpo que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 94 or 95 e/ou a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 96.
[0049] (4)um conjugado de droga-anticorpo, que compreende o anticorpo de acordo com (1) e (2) acima e uma substância tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular.
[0050] (5)um conjugado de droga-fragmento de anticorpo, que compreende o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e uma substância tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular.
[0051] No conjugado de acordo com (4) e (5) acima, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano. Além disso, o tumor é, por exemplo, um câncer recorrente ou um câncer metastático.
[0052] (6)Uma composição farmacêutica, que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima, o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e o conjugado de acordo com (4) e (5) acima.
[0053] Os exemplos da composição de acordo com (6) acima incluem uma composição que é usada no tratamento de tumor, uma composição que não causa a redução de peso como um efeito colateral e uma composição que é usada no diagnóstico de tumor. Aqui, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano. Além disso, o tumor é, por exemplo, um câncer recorrente ou um câncer metastático
[0054] (7)Um agente terapêutico tumoral, que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima, o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e o conjugado de acordo com (4) e (5) acima.
[0055] Um exemplo do agente terapêutico tumoral de acordo com (7) acima é um agente terapêutico tumoral que não causa a redução de peso como um efeito colateral. Aqui, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano.
[0056] (8)Um agente de diagnóstico tumoral, que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima, o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e o conjugado de acordo com (4) e (5) acima.
[0057] No agente de diagnóstico tumoral de acordo com (8) acima, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano,
câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano.
[0058] (9)Um método para detectar um tumor, que compreende: permitir pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima, o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e o conjugado de acordo com (4) e (5) acima, reaja com a amostra coletada a partir de um corpo vivente e então detectar os sinais do anticorpo reagido e/ou fragmento de anticorpo.
[0059] No método para detectar um tumor de acordo com (9) acima, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano.
[0060] (10)Um kit para tratar, diagnosticar ou detectar um tumor, que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com (1) e (2) acima, o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima e o conjugado de acordo com (4) e (5) acima.
[0061] No kit para tratar, diagnosticar ou detectar um tumor de acordo com (10) acima, o tumor é, por exemplo, pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano. Entre outros, o tumor é, preferivelmente pelo menos um selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer pulmonar humano e câncer ovariano humano.
[0062] (11)Um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de acordo com (1) e (2) acima.
[0063] (12)Um polinucleotídeo que codifica o fragmento de anticorpo de acordo com (3) acima.
[0064] (13)Um vetor recombinante que compreende the polynucleotide de acordo com (11) or (12) acima.
[0065] (14)Um transformante que compreende o vetor recombinante de acordo com (13) acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0066] A Figura1 mostra a medição da afinidade de ligação de antígeno (Kd: constante de dissociação) de um anticorpo monoclional anti-hTROP-2 (K5-70). Abt: Anticorpo (total); Agf: Antígeno (livre).
[0067] A Figura 2 mostra a reatividade de um sobrenadante de cultura de hibridoma que produz anticorpo monoclonal anti-hTROP-2, com células HuH-7 (hTROP-2-negativa) e células HuH-7-hTROP-2. O hidrograma preenchido indica as células HuH-7, e o hidtograma aberto indica as células HuH-7-hTROP-2.
[0068] A Figura 3 mostra a reatividade de um anticorpo monoclional anti- hTROP-2 com uma linhagem celular de câncer pancreático humano (células PK- 59), que expressam endogenamente hTROP-2 na superfície celular. o histograma preenchido indica uma reação da linhagem celular apenas com um anticorpo secundário (IG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação da linhagem celular com cada anticorpo monoclonal anti-hTROP.
[0069] A Figura 4 mostra a reatividade de um anticorpo monoclonal anti- hTROP-2 com uma linhagem celular de câncer pancreático humano (células BxPC-3), que expressam endogenamente hTROP-2 na superfície celular. O histograma preenchido indica uma reação da linhagem celular apenas com um anticorpo secundário (IgG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação da linhagem celular com cada anticorpo monoclonal anti-hTROP.
[0070] A Figura 5 mostra a reatividade de um anticorpo monoclional anti- hTROP-2 (K5-70) com linhagens celulares de câncer pancreático humano. O histograma preenchido indica uma reação da linhagem celular apenas com um anticorpo secundário (IG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação da linhagem celular com cada anticorpo monocional anti-hTROP.
[0071] A Figura 6 mostra a reatividade de um anticorpo monoclional anti- hTROP-2 (K5-70) com linhagens celulares de câncer de cólon humano (Colo320, CACO2, SW480, DLD1, CW2 e HCT 116), com linhagens celulares de câncer de mama humano (JIMT-1 e HCC1143) e com linhagens celulares de câncer de próstata humano (PC-3 e DU145). O histograma preenchido indica uma reação da linhagem celular apenas com um anticorpo secundário (IgG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação da linhagem celular com o anticorpo monoclonal anti-hTROP.
[0072] A Figura7 mostra a reatividade cruzada de anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 com TROP-2 de camundongo. As células preparadas permitindo que o gene TROP-2 de camundongo seja transitoriamente expressado em células CHO-K1 foram usadas e um anticorpo T2-102 (I9G1 de camundongo) apresentando reatividade cruzada com TROP-2 de camundongo foi usado como um anticorpo de controle positivo. O histograma preenchido indica uma reação das células apenas com um anticorpo secundário (IgG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação das células apenas com cada anticorpo monoclonal anti-hTROP.
[0073] A Figura 8 mostra a reatividade cruzada de anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 com EpcCAM/TROP-1 humano. As células preparadas permitindo que um gene EpCAM/TROP-1 humano seja transitoriamente expressado em células CHO-K1 foram usadas e um anticorpo monoclonal anti-EpCAM humano marcado com PE (Becton, Dickinson and Company) foi usado como um anticorpo de controle positivo. O histograma preenchido indica uma reação das células apenas com um anticorpo secundário (IgG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação das células apenas com cada anticorpo monoclonal anti-hTROP.
[0074] A Figura 9 mostra a atividade inibidora do desenvolvimento celular de anticorpos anti-hTROP-2 (T6-16, T5-86, K5-70 e K5-107) on uma linhagem celular de câncer pancreático humano (células PK-59). mIlgG indica um anticorpo de controle (IMG de camundongo) e YYO01 indica um anticorpo anti- hTROP-2 comercialmente disponível (Santa Cruz). Coluna branca: O ug/mL; coluna cinza: 0,1 ug/mL; coluna preta: 1 ugmL. O nível de atividade foi expressado como uma razão do valor real para o valor obtido quando um anticorpo não foi adicionado (0 ug/mL). A barra de erro indica um desvio padrão. *P < 0,05, **P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0075] A Figura 10 mostra um ensaio de arranhão de uma linhagem celular de câncer pancreático humano (células PK-59) na presença de anticorpos anti- hTROP-2 (T6-16 e K5-70).
[0076] A Figura 10A mostra os exemplos representativos de fotografias das regiõêês de arranhão de células PK-59. O dia O mostra um exemplo representativo imediatamente após o arranhão. mIgG (dia 1) mostra uma fotografia tirada 1 dia (24 horas) após o arranhão e depois adição um anticorpo de controle (IgG de camundongo, 1 ug/mL) ao meio. K5-70 (Dia 1) mostra uma fotografia tirada 1 dia (24 horas) após o arranhão e depois adição ao anticorpo K5-70 (1 ug/mL) ao meio. T6-16 (Dia 1) mostra uma fotografia tirada 1 dia (24 horas) após o arranhão e depois adição ao anticorpo T6-16 (1 ug/mL) ao meio. Cada seta em cada fotografia indica a largura de uma região de arranhão.
[0077] Figura 10B.A área de uma região de arranhão foi analisada usando-se um software de análise de imagem (Scion Image) e fundamentado no valor obtido, o valor de cada anticorpo de teste foi calculado usando-se o valor obtido no Dia O do anticorpo do grupo de adição de controle (mlgG) como um valor padrão de 1.
[0078] *P<0,05,**P<0,01 (pelo teste t de Student).
[0079] A Figura 11 é uma vistaque ilustra FACS que mostra a expressão de um marcador de célula tronco em uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59. A Figura 11A é uma vista que ilustra FACS que mostram a expressão de EpCAM nas células PK-59. O histograma preenchido indica uma reação das células apenas com um anticorpo secundário (IgG anticamundongo marcado com PE) e o histograma aberto indica uma reação das células apenas com um anticorpo anti-EpCAM humano (Becton, Dickinson and Company). Figuras 11B e C são vistas que ilustram FACS que mostram a expressão de P- glicoproteína/MCR1 nas células PK-59 (Figura 11B), e a expressão de ABCG2 nas células PK-59 (Figura 11C). O histograma azul indica uma reação das células apenas com um anticorpo secundário e o hidrograma vermelho indica uma reação das células apenas com um anticorpo anti- P-glicoproteína/MDR1 humano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11B) ou com um anticorpo anti-
ABCG2 humano (BD Biosciences Pharmingen) (Figura 11C). A Figura 11D mostra a análise de FACS, em que as células PK-59 foram tingidas duplas com marcadores de célula tronco de câncer pancreático, um Anticorpo anti-CD24 humano marcado com FITC (BD Biosciences Pharmingen) e a anticorpo anti- CD44 humano marcado com PE (BD Biosciences Pharmingen). Cada número na Figura 11D indica a razão existente das células em cada fração.
[0080] A Figura 12 mostra a avaliação da atividade anti-tumoral de um novo clone de anticorpo monoclonal anti-hTROP K5-70 (IgG de camundongo2a) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células PK-59.
[0081] Figura 12A mostra o curso de tempo de desenvolvimento tumoral de um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (0) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05, ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0082] A Figura 12B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 21º dia (Dia 21) (o dia final do experimento) no teste da Figura 12A. O valor numérico em cada plotagem indica um valor médio + desvio padrão. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0083] A Figura 13 mostra a avaliação da atividade anti-tumoral de um clone
K5-107 (A), um clone T6-16 (B) e um clone K5-116-2-1 (C) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células PK-59. O símbolo “e” indica um grupo de controle (IMG de camundongo) e o símbolo “o” indica um grupo de administração de anticorpo anti-hTROP-2 (10 mg/kg de peso corporal). A seta no gráfico indica um período de administração de anticorpo e o valor numérico em cada plotagem indica um valor médio + desvio padrão. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[0084] A Figura 14 mostra a avaliação da atividade anti-tumoral de um clone K5-70 (Figura 14A), um clone T6-16 (Figura 14B) e um clone K5-116-2-1 (Figura 14C) em modelos de prevenção de xenoenxerto usando-se células PK-59. O símbolo “e” indica um grupo de controle (IgG de camundongo) e o símbolo “o” indica um grupo de administração de anticorpo anti-hTROP-2 (10 mg/kg de peso corporal). A seta no gráfico indica um período de administração de anticorpo e o valor numérico em cada plotagem indica um valor médio + desvio padrão. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0085] A Figura 15 mostra a avaliação da atividade anti-tumoral de um clone K5-70 na prevenção de xenoenxerto e modelos de tratamento usando-se células BxPC-3. A Figura 15A mostra o curso de tempo de desenvolvimento tumoral de um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) em modelos de prevenção (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student). A Figura 15B mostra o curso de tempo de desenvolvimento tumoral de um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) em modelos de tratamento (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[0086] A Figura 16 mostra a atividade anti-tumoral dependente de dose de um clone K5-70 na prevenção de modelos de xenoenxerto usando-se células PK-59. O volume de um tumor é expressado como um valor médio + desvio padrão.
[0087] A Figura 16A mostra o curso de tempo de desenvolvimento tumoral de um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e grupos de administração de anticorpo K5-70 (50: 1 mg/kg de peso corporal, A: 5 mg/kg de peso corporal) em doses diferentes (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student), ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0088] A Figura 16B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 17º dia (Dia 17) (o dia final do experimento) no teste da Figura 16A. O número numérico em cada plotagem indica um valor médio + desvio padrão. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0089] A Figura 17 é uma vista esquemática de uma proteína TROP-2 quimérica humana/de camundongo usada no experimento. SP: sequência sinalizadora; domínio TY: região tipo 1 de tiroglobulina; TM: região de transmembrana; C: região intracelular, em que a região enchida é um polipeptídeo derivado de hTROP-2, visto que a região aberta é umj polipeptídeo derivado de TROP-2 de camundongo. O número na posição superior da vista esquemática da proteína quimérica indica o número de aminoácido da proteína TROP-2 de camundongo e o número na posição inferior deste indica o número de aminoácido de uma proteína hTROP-2.
[0090] A Figura 18 mostra os resultados obtidos pela identificação de uma região de ligação de anticorpo monoclonal anti-hTROP, usando-se TROP-2 quimérico humano/de camundongo. Usando-se as células HEK293, que expressam constantemente proteínas TROP-2-C quimérico humano/de camundongo (hmMTROP-2-C) ou TROP-2-D quimérico humano/de camundongo (MhTROP-2-D), a reatividade com os anticorpos monocionais anti-hTROP-2 mostrada na figura foi estudada. Como um controle negativo, IgG de camundongo2b foi usado.
[0091] A Figura 19 mostra os resultados obtidos pela identificação da região de ligação de anticorpo de um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2.
[0092] Um gene hTROP-2 e cada gene TROP-2 quimérico humano/de camundongo foram introduzidos em células HEK293 e a análise de FACS foi então realizada usando-se as células, em que os genes foram transitoriamente expressados. Na Figura 19(A), a reatividade de anticorpos K5-70, K5-107, T5-86 e K5-116-2-1 com hTROP-2 (caso superior), com hm TROP-2-A (caso médio) e com hmTROP-2-B (caso inferior) foi estudado. como um controle negativo, IgG de camundongo2b foi usado. Na figura 19(B), a reatividade de anticorpos T6-4 e T6-16 com hTROP-2 (caso superior), com mhTROP-2-E (caso médio) e com mMhTROP-2-F (caso inferior) foi estudado. Como um controle negativo, IgG de camundongo2b foi usado.
[0093] A Figura 20 mostra a expressão de hTROP-2 em tecido normais humanos. Séries de tecido normal humano foram imunotingidos com um clone de anticorpo monoclonal anti-hTROP K5-63-17. (A) pele, (B) esôfago, (C) rim (córtex), (D) rim (medula), (E) pâncreas, (F) prostata, (G) bexiga, (H) amígdala, (1) coração, (J) fígado (magnificação: x 200)
[0094] A Figura21 mostra a expressão de hTROP-2 em tecidos de câncer.
As séries de tecido cancerígeno humano imunotingidos com um clone de anticorpo monoclonal anti-hTROP K5-63-17. (A) câncer de mama, (B) câncer de pulmão, (C) câncer de esôfago, (D) câncer de estômago, (E) câncer pancreático, (F) câncer colorretal, (G) câncer de bexiga, (H) câncer de próstata, (|) câncer ovariano (magnificação: x 100)
[0095] A Figura 22 mostra a atividade anti-tumoral de um clone K5-70 por uma administração simples na prevenção de modelos de xenoenxerto usando- se células PK-59.
[0096] A Figura 22A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) (um valor médio + desvio padrão). a seta indica a administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student), ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0097] A Figura 22B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 28º dia (Dia 28) (o dia final do experimento) no teste da Figura 22A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[0098] A Figura22C mostra o curso de tempo de formação de tumor em cada camundongo em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (0). A seta indica a administração de anticorpo.
[0099] A Figura 23 mostra a atividade anti-tumoral de um clone K5-70 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer de cólon humanas SWA480.
[00100] A Figura 23A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (0) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00101] A Figura 23B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 44º dia (Dia 44) (o dia final do experimento) no teste da Figura 23A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00102] A Figura 24 mostra a atividade anti-tumoral de um clone K5-116-2-1 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SWA480.
[00103] A Figura 24A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo de K5-116-2-1 (10 mg/kg de peso corporal) (o) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00104] A Figura 24B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 42º dia (Dia 42) (o dia final do experimento) no teste da Figura 24A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00105] A Figura 25 mostra a atividade anti-tumoral de um clone T6-16 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SW480.
[00106] A Figura 25A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (0) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00107] A Figura 25B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 42º dia (Dia 42) (o dia final do experimento) no teste da Figura 25A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00108] A Figura 26 mostra a atividade anti-tumoral dependente de dose de um clone K5-70 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SWA480.
[00109] A Figura 26A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (o: 1 mg/kg de peso corporal, A: 5 mg/kg de peso corporal, o:
mg/kg de peso corporal) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00110] A Figura 26B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 42º dia (Dia 42) (o dia final do experimento) no teste da Figura 26A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00111] A Figura 27 mostra a atividade anti-tumoral de um clone K5-70 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SW480.
[00112] A Figura 27A mostra a atividade anti-tumoral de um anticorpo K5-70 em intervalos de administração de uma vez por semana. O curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (0: 10 mg/kg) é mostrado (um valor médio + desvio padrão). A ponta da seta (dias 10, 17, 24, 31 e 38) indicam a administração de um anticorpo K5-70. * P < 0,05 pelo teste t de Student.
[00113] A Figura 27B é uma vista que mostra a atividade anti-tumoral de um anticorpo K5-70 em intervalos de administração de uma vez a cada dez dias (910d) ou uma vez a cada duas semanas (q14d). A figura mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo, 10 mg/kg) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (o: q10d, 10 mg/kg, a: q14d, 10 mg/kg) (um valor médio + desvio padrão). As pontas de seta preenchidas (V: Dias 9, 19 e 29) e as pontas de seta abertas (V: Dias 9,23 e 37) indicam a administração de um anticorpo K5-70. * P < 0,05, ** P < 0,01 pelo teste t de Student.
[00114] A Figura 28 mostra a atividade anti-tumoral dependente de dose de um clone T6-16 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SWA480.
[00115] A Figura 28A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um anticorpo T6-16 grupo de administração (0: 1 mg/kg de peso corporal, a: 5 mg/kg de peso corporal, 5: 10 mg/kg de peso corporal) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00116] A Figura 28B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 43º day (Dia 43) (o dia final do experimento) no teste da Figura 28A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00117] A Figura 29 mostra a atividade anti-tumoral de um clone T6-16 em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células SW480. O curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo, mg/kg de peso corporal) e em um grupo de administração de anticorpo T6-16
(10 mg/kg de peso corporal) (o: q7d, a: q10d) é mostrado (um valor médio + desvio padrão). As pontas de seta (Dias 10, 17, 24, 31 e 38) e as setas (Dias 10, 20, 30 e 40) indicam a administração de um anticorpo T6-16. A administração foi realizada uma vez a cada três dias para o grupo de controle. * P <0,05, * P < 0,01 pelo teste t de Student.
[00118] A Figura 30 mostra a atividade anti-tumoral de um clone K5-70 na prevenção de modelos de xenoenxerto usando-se células de próstata humanas DU-145.
[00119] A Figura 30A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: IgG de camundongo) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00120] A Figura 30B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 40º dia (Dia 40) (o dia final do experimento) no teste da Figura 30A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00121] A Figura 31 mostra a atividade inibidora de metástase de um clone K5-70 em modelos metastáticos de fígado usando-se células PK-59.
[00122] Figuras 31A and 31B show the excised liver image de um grupo de controle (e: IgG de camundongo) (A) e um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (B), que foi retirado 6 semanas após o transplante celular. A seta indica os focos metastáticos de fígado.
[00123] A Figura 32 mostra a atividade anti-tumoral de K5-70 em modelos de xenoenxerto usando-se células SWA480, que são modelos de câncer recorrentes após a administração de cloridreto de irinotecan. Esta figura mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo sem tratamento (+), em um cloridreto de irinotecan (40 mg/kg de peso corporal) + grupo de administração Anticorpo K5-70 (o: 10 mg/kg de peso corporal) e em um cloridreto de irinotecan (40 mg/kg de peso corporal) + grupo de administração IgG de camundongo (e: mg/kg de peso corporal) (um valor médio + desvio padrão). As pontas de seta (Dias 11, 14 e 17) indicam a administração de cloridreto de irinotecan. O anticorpo K-70 ou o IgG de camundongo foi administrado uma vez a cada três dias a partir do Dia 20. A seta indica um período de administração de anticorpo. *P < 0,05, **P < 0,01 pelo teste t de Student.
[00124] A Figura 33 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região variável de cadeia de clone K5-70 H (VH) (SEQ ID Nº: 34) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 35). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. A glutamina sublinhada dupla (Q) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD e TSMADY) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta Edição, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-70 VH são mostradas na SEQ ID Nº: 36 a 38, respectivamente.
[00125] A Figura 34 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região de cadeia variável de clone K5-70 L (VL) (SEQ ID Nº: 39) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 40). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. O ácido aspártico duplo sublinhado (D) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; RASQSIGTSIH, YASESIS e QQSNSWPFT) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-70 VL são mostradas na SEQ ID Nº: 41 a 43, respectivamente.
[00126] A Figura 35 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região variável de cadeia do clone K5-107 H (VH) (SEQ ID Nº: M)ea sequência de aminoácido duplicada (SEQ ID Nº: 45). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. A glutamina sublinhada dupla (Q) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; SYWMH, NIYPGGGYTNYDEKFKS e SSVFDY) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-107 VH são mostradas na SEQ ID Nº: 46 a 48, respectivamente.
[00127] A Figura 36 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região variável de cadeia do clone K5-107 L (VL) (SEQ ID Nº: 49) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 50). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. O ácido aspártico duplo sublinhado (D) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; RASQNIGTSIH, YASESIS e QOSNSWPFT) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-107 VL são mostradas na SEQ ID Nº: 51 a 53, respectivamente.
[00128] A Figura 37 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de um clone K5-116-2-1 H região de cadeia variável (VH) (SEQ ID Nº: 54) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 55). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. A glutamina sublinhada dupla (Q) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; SYWIT, NIYPSDSYTNYNQKFRD e LFDY) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-116-2-1 VH são mostradas na SEQ ID Nº: 56 a 58, respectivamente.
[00129] A Figura 38 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região variável de cadeia do clone K5-116-2-1 L (VL) (SEQ ID Nº: 59) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 60). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. O ácido aspártico duplo sublinhado (D) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; RASQSIGTSIH, YASESIS e QQSNSWPFT) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-116-2-1 VL são mostradas na SEQ ID Nº: 61 a 63, respectivamente.
[00130] A Figura 39 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de uma região de cadeia variável do clone T6-16 H (VH) (SEQ ID Nº: 64) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 65). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. The double-sublinhado glutamic acid (E) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; DYNMH, YIYPYNGGTGYNQRFKS e EDYGSSPSYAMDY) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone T6-16 VH são mostradas na SEQ ID Nº: 66 a 68, respectivamente.
[00131] A Figura 40 mostra a sequência de nucleotídeo de cDNA de um clone T6-16 região L de cadeia variável (VL) (SEQ ID Nº: 69) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID Nº: 70). Um peptídeo sinalizador é mostrado em itálico. O ácido aspártico duplo sublinhado (D) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; RSSQSLVHGNGNTYLH, KVSNRFS e SQTTHVPT) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone T6-16 VL são mostradas na SEQ ID Nº: 71 a 73, respectivamente.
[00132] A Figura 41 mostra um alinhamento da sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 35) da região de cadeia variável H de um clone K5-70 (K5-70 VH), a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 75) da região de cadeia variável H of a humanized K5-70 (HuK5-70 VH), e a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 85)
da região de cadeia variável H de um receptor (Acessão GenBank Nº DAS980102; SEQ ID Nº: 84) usado para a produção do anticorpo humanizado (DA980102 VH). (deve ser observado que cada um da sequência de aminoácidos shown na figura indica um porção da sequência de aminoácido de região de cadeia variável H (especificamente, a sequência de aminoácido de uma porção de proteína madura a partir do qual uma porção do peptídeo sinalizador é removida)).
[00133] A sequência de aminoácido sublinhada no K5-70 VH indica uma sequência de CDR determinada de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Além disso, o número na posição superior da sequência de aminoácido indica o número da posição de um aminoácido determinado de acordo com as definições já mencionadas de Kabat et al. Cada sequência de CDR em DA980102 VH é expressada com o símbolo “---” e, desta maneira a descrição é omitida. Visto que o aminoácido sublinhado na HuK5-70 VH foi assumido ser importante para a manutenção da estrutura de CDR, a sequência do K5-70 VH foi mantida. Além disso, com respeito ao aminoácido duplo sublinhado na HuK5-70 VH, o aminoácido do DA980102 VH correspondente (metionina (M)) é raramente encontrado neste posição. Em consequência, para o propósito de diminuir a antigenicidade, o aminoácido duplo sublinhado na HuK5-70 VH foi substituído por leucina (L) como um aminoácido representativo que pertence ao mesmo subgrupo.
[00134] Figura 42 mostra um alinhamento da sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 40) da região L de cadeia variável de um clone K5-70 (K5-70 VL), a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 77) da região L de cadeia variável de um K5-70 humanizado (HuK5-70 VL) e a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 87; Acessão Genbank Nº AAA64877) da região L de cadeia variável de um receptor (Acessão Genbank Nº L41174; SEQ ID Nº: 86) usado para a produção do anticorpo humanizado (L41174 VL). (Deve ser observado que cada uma das sequências de aminoácido mostradas na figura indicam uma porção da sequência de aminoácido de cada região L de cadeia variável (especificamente, a sequência de aminoácido de uma porção de proteína madura a partir do qual um porção de peptídeo sinalizador é removida)).
[00135] A sequência de aminoácido sublinhado na K5-70 VL indica uma sequência de CDR determinada de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Além disso, o número na posição superior da sequência de aminoácido indica o número de posição de um aminoácido determinado de acordo com as definições já mencionadas de Kabat et al. Cada sequência de CDR na L41174 VL é expressada com o símbolo “---” e, desta maneira, a descrição é omitida. Visto que o aminoácido sublinhado na HuK5-70 VL foi assumido ser importante para manutenção da estrutura de CDR, a sequência do K5-70 VL foi mantida.
[00136] A Figura 43 mostra um alinhamento da sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 65) da região de cadeia variável H de um clone T6-16 (T6-16 VH), a sequência de aminoácidos (SEQ ID Nº: 79 e 81, respectivamente) das regiões de cadeias variáveis H de dois tipos de T6-16 (HuT6-16 VH1 e HuT6-16 VH2) humanizado e uma sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 89) da região de cadeia variável H de um receptor (Acessão Genbank Nº DA935238; SEQ ID Nº: 88) usado para a produção do anticorpo humanizado (DA935238 VH). (Deve ser observado que cada da sequência de aminoácidos mostradas na figura indicam uma porção da sequência de aminoácido de each H região de cadeia variável (especificamente, a sequência de aminoácido de uma porção de proteína madura a partir do qual um porção de peptídeo sinalizador é removida)).
[00137] A sequência de aminoácido sublinhado na HuT6-16 VH indica uma sequência de CDR determinada de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Além disso, o número na posição superior da sequência de aminoácido indica o número de posição de um aminoácido determinado de acordo com as definições já mencionadas de Kabat et al. Cada sequência de CDR na DA935238 VH é expressada com o símbolo “---” e, desta maneira, a descrição é omitida. Visto que os aminoácidos sublinhados na HuT6-16 VH1 and HuT6-16 VH2 foram assumidos serem importantes para a manutenção da estrutura de CDR, a sequência do T6-16 VH foi mantida. Além disso, a lisina (K) na posição 73 na HuT6-16 VH1 foi substituída por uma treonina (T) derivada de DA935238 como uma sequência receptora na HuT6-16 VH2.
[00138] Figura 44 mostra um alinhamento da sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 70) da região L de cadeia variável de um clone T6-16 (T6-16 VL), a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 83) da região L de cadeia variável de um T6-16 humanizado (HuT6-16 VL) e a sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 91; Acessão Genbank Nº AAA60341) da região L de cadeia variável de um receptor (Acessão Genbank Nº M99608; SEQ ID Nº: 90) usado para a produção do anticorpo humanizado (M99608 VL). (Deve ser observado que cada da sequência de aminoácidos mostrada na figura indica uma porção da sequência de aminoácido de cada região L de cadeia variável (especificamente, a sequência de aminoácido de uma porção de proteína madura a partir do qual um porção de peptídeo sinalizador é removida)).
[00139] A sequência de aminoácido sublinhado na T6-16 VL indica uma sequência de CDR determinada de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima; U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Além disso, o número na posição superior da sequência de aminoácido indica o número de posição de um aminoácido determinado de acordo com as definições já mencionadas de Kabat et al. Cada sequência de CDR na M99608 VL é expressada com o símbolo “---” e, desta maneira, a descrição é omitida.
[00140] A Figura 45 mostra a sequência genética (SEQ ID Nº: 74) e sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 75) de HuK5-70 VH.
[00141] A posição superior de cada linha indica a sequência genética (CDNA sequence) e a sua posição inferior indica um sequência de aminoácido. Na sequência de aminoácido, um porção de peptídeo sinalizador é sublinhada com uma linha tracejada e cada sequência de CDR (CDR 1 a 3) é sublinhado com uma linha sólida (a sequência de aminoácido apenas da porção de proteína madura, a partir da qual a porção de peptídeo sinalizador é removida, é mostrada na SEQ ID Nº: 92). Um local EcoRI (GAA TTC) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5º do gene HuK5-70 VH e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionada à sua extremidade 3".
[00142] A Figura 46 mostra a sequência genética (SEQ ID Nº: 76) e sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 77) de HuK5-70 VL.
[00143] A posição superior de cada linha indica a sequência genética (CDNA sequence) e a sua posição inferior indica um sequência de aminoácido. Na sequência de aminoácido, um porção de peptídeo sinalizador é sublinhada com uma linha tracejada e cada sequência de CDR (CDR 1 a 3) é sublinhado com uma linha sólida (a sequência de aminoácido apenas da porção de proteína madura, a partir da qual a porção de peptídeo sinalizador é removida, é mostrada na SEQ ID Nº: 93). Um local Agel (ACC GGT) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' do gene HuK5-70 VL e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado à sua extremidade 3'.
[00144] A Figura 47 mostra a sequência genética (SEQ ID Nº: 78) e sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 79) de HuT6-16 VH1.
[00145] A posição superior de cada linha indica a sequência genética (CDNA sequence) e a sua posição inferior indica um sequência de aminoácido. Na sequência de aminoácido, um porção de peptídeo sinalizador é sublinhada com uma linha tracejada e cada sequência de CDR (CDR 1 a 3) é sublinhado com uma linha sólida (a sequência de aminoácido apenas da porção de proteína madura, a partir da qual a porção de peptídeo sinalizador é removida, é mostrada na SEQ ID Nº: 94). Um local EcoRI (GAA TTC) e uma sequência
Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' do gene HuT6-16 VH1 e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado à sua extremidade 3'.
[00146] A Figura 48 mostra a sequência genética (SEQ ID Nº: 80) e sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 81) de HuT6-16 VH2.
[00147] A posição superior de cada linha indica a sequência genética (CDNA sequence) e a sua posição inferior indica um sequência de aminoácido. Na sequência de aminoácido, um porção de peptídeo sinalizador é sublinhada com uma linha tracejada e cada sequência de CDR (CDR 1 a 3) é sublinhado com uma linha sólida (a sequência de aminoácido apenas da porção de proteína madura, a partir da qual a porção de peptídeo sinalizador é removida, é mostrada na SEQ ID Nº: 95). Um local EcoRI (GAA TTC) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' of the HuT6-16 VH2 gene e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado à sua extremidade 3".
[00148] A Figura 49 mostra a sequência genética (SEQ ID Nº: 82) e sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 83) de HuT6-16 VL.
[00149] A posição superior de cada linha indica a sequência genética (CDNA sequence) e a sua posição inferior indica um sequência de aminoácido. Na sequência de aminoácido, um porção de peptídeo sinalizador é sublinhada com uma linha tracejada e cada sequência de CDR (CDR 1 a 3) é sublinhado com uma linha sólida (a sequência de aminoácido apenas da porção de proteína madura, a partir da qual a porção de peptídeo sinalizador é removida, é mostrada na SEQ ID Nº: 96). Um local Agel (ACC GGT) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' do gene HuT6-16 VL e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado à sua extremidade 3'.
[00150] A Figura 50 mostra os resultados obtidos pela confirmação da expressão do anticorpo HuK5-70, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2.
[00151] Figura 50(A)JOs vetores de expressão pFUSE-CHIg-HuK5-70 e pFUSE2-CLIg-HuK5-70 foram introduzidos em células 293F e a expressão do anticorpo HuK5-70 no sobrenadante de cultura foi analisado por Western blotting. A faixa 1 indica o sobrenadante de cultura de células 293F em que nenhum gene foi introduzido (controle negativo) e faixa 2 indica o sobrendante de cultura de células 293F em que os vetores de expressão já mencionados foram introduzidos. As proteínas de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo HuK5-70 foram detectadas com um anticorpo anti-lgG F(ab')2 humano marcado com biotina.
[00152] Figura 50(B)Os vetores de expressão pFUSE-CHlIg-HuT6-16-1 e pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (faixa 3) e os vetores de expressão pFUSE-CHlIg-HuT6- 16-2 e pFUSE2-CLIg-HuT6-16 (faixa 4), foram introduzidos em células 293F nestas combinações. Então, a expressão do anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 foi analisado por Western blotting. As proteínas de cadeia pesada do anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 foram detectadas com um anticorpo anti-lgG Fc humano marcado com biotina e as proteínas de cadeia leve do anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 foram detectadas com um anticorpo anti-lgG F(ab')2 humano marcado com biotina.
[00153] A Figura 51 mostra os resultados obtidos pelo tingimento do Anticorpo Hu KB5-70 purificado, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 com Coomassie.
[00154] O anticorpo Hu K5-70 purificado (faixa 1), anticorpo HuT6-16-1 (faixa 2) e anticorpo HuT6-16-2 (faixa 3) foram carregados em quantidades de 1 ug cada em SDS-PAGE e foram então tingidos com Coomassie.
[00155] A Figura 52 mostra os resultados obtidos pela análise da capacidade de ligação de antígeno do anticorpo HuK5-70, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2, usando-se um citômetro de fluxo.
[00156] A reatividade de cada anticorpo mostrado na figura com células HEK293-hTROP-2 (Figura 52A) e células PK-59 (Figura 52B) foi analisado por FACS. anticorpo secundário apenas foi usado como um controle negativo (preenchido) e uma reatividade de cada anticorpo foi indicado com uma linha cinza.
[00157] A Figura 53 mostra os resultados obtidos pela medição da capacidade de ligação do antígeno do anticorpo HuK5-70 de acordo com um método ELISA.
[00158] A capacidade de ligação do antígeno do anticorpo K5-70 e anticorpo HuK5-70 foi analisado de acordo com um método ELISA revestido com antígeno. O símbolo À indica os resultados de medição do anticorpo K5-70 e o símbolo e indica os resultados de medição do anticorpo HuK5-70.
[00159] A Figura 54 mostra os resultados obtidos pela medição da capacidade de ligação do antígeno do anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 de acordo com um método ELISA.
[00160] A capacidade de ligação do antígeno do anticorpo T6-16, anticorpo HuT6-16-1 e HuT6-16-2 foi analisado de acordo com um método ELISA revestido com antígeno. O símbolo à indica os resultados de medição do anticorpo T6-16, o símbolo e indica os resultados de medição do anticorpo HuT6-16-1 e o símbolo 1 indica os resultados de medição do anticorpo HuT6- 16-2.
[00161] A Figura 55 mostra a atividade anti-tumoral de um de um anticorpo anti-hTROP-2 (Anticorpo HuK5-70) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer de cólon humanas SW480.
[00162] Figura 55A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS) e em um anticorpo HuK5-70 (10 mg/kg de peso corporal) grupo de administração (0) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05, ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00163] A Figura 55B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 39º dia (Dia 39) (o dia final do experimento) no teste da Figura 55A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00164] A Figura 56 mostra a atividade anti-tumoral dependente de dose de um anticorpo anti-hTROP-2 (HuK5-70) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer de cólon humanas SWA480.
[00165] A Figura 56A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS) e em grupos de administração de anticorpo HuK5-70 (o: 1 mg/kg de peso corporal, A: 5 mg/kg de peso corporal, 5: 10 mg/kg de peso corporal) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00166] A Figura 56B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 48º dia (Dia 48) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 56A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00167] A Figura 57 mostra a atividade anti-tumoral dependente de dose de um anticorpo anti-hTROP-2 (HuT6-16-2) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer de cólon humanas SWA480.
[00168] A Figura 57A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS) e em grupos de administração de anticorpo HuT6- 16-2 (0: 1 mg/kg de peso corporal, A: 5 mg/kg de peso corporal, 5: 10 mg/kg de peso corporal) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00169] A Figura 57B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 48º dia (Dia 48) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 57A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00170] A Figura 58 mostra a atividade anti-tumoral de anticorpos anti-hTROP- 2 de camundongo (K5-70 e T6-16) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer ovariano humano SK-OV-3.
[00171] A Figura 58A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS), em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) e em um grupo de administração de anticorpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (A) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,01 (pelo teste t de
Student).
[00172] A Figura 58B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 56º dia (Dia 56) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 58A. * P < 0,05 (pelo teste t de Student).
[00173] A Figura 59 mostra a atividade anti-tumoral de anticorpos anti-hTROP- 2 de camundongo (K5-70 e T6-16) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer de mama humano MDA-MB-468.
[00174] A Figura 59A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS), em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) e em um grupo de administração de anticorpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (A) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00175] A Figura 59B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 54º dia (Dia 54) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 59A. * P < 0,05, ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00176] A Figura 60 mostra a atividade anti-tumoral de anticorpos anti-hTROP- 2 de camundongo (K5-70 e T6-16) em modelos de tratamento de xenoenxerto usando-se células de câncer pulmonar humano Calu-3.
[00177] A Figura 60A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS), em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (o) e em um grupo de administração de anticorpo T6-16 (10 mg/kg de peso corporal) (A) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. * P < 0,05, ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00178] A Figura 60B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 41º dia (Dia 41) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 60A. * P < 0,05, ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00179] Figura 61 mostra a atividade anti-tumoral of a mouse anti-hTROP-2 antibody K5-70 na prevenção de modelos de xenoenxerto usando-se human células de câncer do duto de bile TFK-1 humanas.
[00180] Figura 61A mostra o curso de tempo de formação de tumor em um grupo de controle (e: PBS) e em um grupo de administração de anticorpo K5-70 (10 mg/kg de peso corporal) (0) (um valor médio + desvio padrão). A seta indica um período de administração de anticorpo. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00181] Figura 61B mostra o peso tumoral plotado de cada camundongo no período do 31º dia (Dia 31) (o dia final do experimento) após o transplante de célula cancerígena no teste da Figura 61A. ** P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00182] A Figura 62 mostra os resultados obtidos pela análise da atividade de ligação dos anticorpos HuK5-70 e HuT6-16-2 de acordo com ELISA revestido com antígeno de baixa densidade. Uma placa de 96 reservatórios foi revestido com uma proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante de 0,1 ug/mL e, a seguir, os anticorpos de teste (anticorpos K5-70, HuK5-70, T6-16 e HuT6-16-2), que foram preparados em concentrações de 20 ug/mlL a uma série de diluições duplas, foram deixados reagir com a proteína. Na figura 62(A), os anticorpo K5-70 (A) e HuK5-70 (e) foram usados como anticorpos de teste e, na figura 62(B), T6-16 (à) e anticorpo HuT6-16-2 (e) foram usados como anticorpos de teste.
[00183] A Figura 63 mostra os resultados obtidos pela análise da atividade de ligação de hTROP-2 aos anticorpos K5-70 e HuK5-70 por ELISA. Uma placa de 96 reservatórios foi revestida com os anticorpos K5-70 e HuK5-70 por intermédio de anti-lgG de camundongo (cadeia específica y) e anti-lgG1 humano (Fcy específico) e, a seguir, estes anticorpos foram deixados reagir com proteínas hTROP-2-EC-His, que foram preparados em concentrações de 5 ug/mL a uma série de diluições duplas. A ligação de uma tal proteína hTROP-2- EC-His foi detectada usando-se um anticorpo de rótulo anti-His tag.
[00184] (A) Anticorpo K5-70 e (e) Anticorpo HuK5-70.
[00185] A Figura 64 mostra a sequência de nucleotídeo (caso superior; SEQ ID Nº: 99) e sequência de aminoácido (caso inferior; SEQ ID Nº: 35) de um gene K5-70 VH que foi preparado pela síntese genética. Com respeito a esta sequência de nucleotídeo, um local EcoRI (GAA TTC) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado à extremidade 3'. A sequência de aminoácido é mostrada por código de letra simples. Um peptídeo sinalizador no lado do terminal N é mostrado em itálico. A glutamina sublinhada dupla (Q) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD, e TSMADY) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta Edição, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-70 VH são mostradas na SEQ ID Nº: 36 a 38, respectivamente.
[00186] A Figura 65 mostra a sequência de nucleotídeo (caso superior; SEQ ID Nº: 100) e sequência de aminoácido (caso inferior; SEQ ID Nº: 40) de um gene K5-70 VL que foi preparado pela síntese genética. Com respeito a esta sequência de nucleotídeo, um local Agel (ACC GGT) e uma sequência Kozak
(ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado à extremidade 3'. A sequência de aminoácido é mostrada por código de letra simples. Um peptídeo sinalizador no lado do terminal N é mostrado em itálico. O ácido aspártico duplo sublinhado (D) indica o resíduo de aminoácido de terminal N de um peptídeo maduro. As sequências de CDR (sublinhado; RASQSIGTSIH, YASESIS, e QQSNSWPFT) foram determinadas de acordo com as definições de Kabat et al. (como descrito acima, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 do clone K5-70 VL são mostradas na SEQ ID Nº: 41 a 43, respectivamente.
[00187] A Figura 66 mostra a atividade de ligação de anticorpos ChK5-70, HuK5-70, HuVH/MuVL (em que o VL do anticorpo HuK5-70 é substituído com o VL do anticorpo K5-70) e MuVH/HuVL (em que o VH do anticorpo HuK5-70 é substituído com o VH do anticorpo K5-70) quanto a hTROP-2. Uma placa de 96 reservatórios foi revestida com uma proteína hTACSTD2-Fce-His recombinante 0,1 ug/mL. Um sobrenadante de cultura de células, em que os anticorpos de teste (anticorpos ChK5-70, HuK5-70, HuUVH/MuVL e MuVH/HuVL) foram transitoriamente expressados, foi diluído para resultar em concentrações de anticorpo de 1, 0,1, 0,01 e 0,001 ug/ml. Desta maneira, os anticorpos de teste diluídos foram deixados reagir com o antígeno. (A) anticorpo ChK5-70, (A)
anticorpo MuVH/HuVWVL, (o) anticorpo HuVH/MuVL e (e) Anticorpo HuK5-70.
[00188] A Figura 67 mostra as sequências de aminoácido de HuK5-70 VH e seus mutantes de substituição de aminoácido. Os aminoácidos são mostrados por código de letra simples. O aminoácido de cada substituição de mutante de aminoácido, que é o mesmo como aquele do HuK5-70 VH, é indicado com o símbolo “-” e apenas os aminoácidos substituídos são mostrados por código de letra simples. Onúmero na posição superior da sequência indica um número de aminoácido (Kabat et al., 1991).
[00189] A Figura 68 mostra a atividade de ligação de anticorpos ChK5-70, HuK5-70, HuK5-70 VH A40R (um mutante em que a alanina na posição 40 do VH do anticorpo HuK5-70 é substituído por uma arginina) e HuK5-70 VH R44G (um mutante em que a arginina na posição 44 do VH do anticorpo HuK5-70 é substituído com uma glicina) a hTROP-2. Uma placa de 96 reservatórios foi revestida com um proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante 0,1 pg/ml. Um sobrenadante de cultura de células, em que os anticorpos de teste (anticorpos ChK5-70, HuK5-70, HuK5-70 VH A40R e HuK5-r70 VH R44G) foi transitoriamente expressado, foi diluído para resultar em concentrações de 0,5 ug/mL a uma série de diluições duplas (seis amostras). Desta maneira, os anticorpos de teste diluídos foram deixados reagir com o antígeno. (A)
anticorpo ChK5-70, (4) anticorpo HuK5-70 VH R44G, (o) anticorpo HuK5-70 VH A40R e (e) Anticorpo HuK5-70.
[00190] A Figura 69 mostra a sequência de nucleotídeo (caso superior) e sequência de aminoácido (caso inferior) de um gene HuK5-70 VH R44G que foi preparado pela síntese genética. Com respeito a esta sequência de nucleotídeo, um local EcoRI (GAA TTC) e uma sequência Kozak (ACC ACC) foram adicionados à extremidade 5' e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado à extremidade 3'. A sequência de aminoácido é mostrada por código de letra simples. Um peptídeo sinalizador no lado do terminal N é mostrado em itálico. O aminoácido (Q: glutamina) no lado do terminal N de VH maduro é sublinado duplo e a sequência de CDR (Kabat et al., 1991) é sublinhado.
[00191] A Figura 70 mostra o SDS-PAGE realizado em um anticorpo HuK5-70- 2 purificado. O anticorpo HuK5-70-2 (1 ug) foi carregado em um gel de SDS- PAGE a 11 % sob condições redutoras. Linha 1: um marcador de peso molecular (Precision Plus Dual Standard (BIO-RAD)), linha 2: um anticorpo HuK5-70-2. O valor numérico no lado esquerdo da figura indica um peso molecular.
[00192] A Figura 71 mostra a atividade de ligação de anticorpos K5-70, HuK5- 70 e HuK5-70-2 a hTROP-2. Uma placa de 96 reservatórios foi revestida com um proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante 0,1 ug/mL. Os anticorpos de teste purificados (anticorpos K5-70, HuK5-70 e HuK5-70-2) foram diluídos para resultar em concentrações de 1 ug/mL a uma série de diluições duplas (dez amostras). Desta maneira, os anticorpos de teste diluídos foram deixados reagir com o antígeno. (=) anticorpo K5-70, (A) anticorpo HuK5-70-2 e (e) anticorpo HuK5-70.
[00193] A Figura 72A mostra a atividade de ADCC de anticorpos anti-hTROP- 2 humanizados (coluna aberta: HuK5-70, e a coluna preenchida: HuT6-16-2). Mais especificamente, um anticorpo HuK5-70 e um anticorpo HuT6-16-2 (todos os quais estiveram em concentrações de O, 0,1, 0,3, 1, 3, e 10 ug/mL) e monócitos de sangue periférico humano saudável foram adicionados a uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480 e estes foram então cultivados por 6 horas. A seguir, a atividade de LDH liberada no sobrendante de cultura foi medido, de modo que a atividade de ADCC pode ser medido (um valor médio + desvio padrão (N = 3), atuador/alvo (E/T) = 40). A concentração de anticorpo que é O indica a não adição do anticorpo. *P< 0,05, **P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00194] A Figura 72B mostra a atividade de ADCC de anticorpos anti-hTROP- 2 humanizados (coluna aberta: HuK5-70, coluna cinza: HuK5-70-2, e a coluna preenchida: HuT6-16-2). Mais especificamente, um anticorpo HuK5-70, um anticorpo HuK5-70-2 e um anticorpo HuT6-16-2 (todos os quais estiveram em concentrações de O, 0.3, 1, 3, 10 e 30 ug/mL) e monócitos de sangue periférico humano saudável foram adicionados a uma linhagem celular de câncer pancreático humano (PK-59) e estes foram então cultivados por 6 horas. À seguir, a atividade de LDH liberada no sobrendante de cultura foi medida, de modo que a atividade de ADCC pode ser medida (um valor médio + desvio padrão (N = 3), atuador/alvo (E/T) = 40). A concentração de anticorpo que é O indica a não adição do anticorpo. **P < 0,01 (pelo teste t de Student).
[00195] A Figura 72C mostra a atividade de ADCC de anticorpos anti-hTROP- 2 humanizados (coluna aberta: HuK5-70, coluna cinza: HuK5-70-2, e a coluna preenchida: HuT6-16-2). Mais especificamente, um anticorpo HuK5-70, um anticorpo HuK5-70-2 e um anticorpo HuT6-16-2 (todos os quais estiveram em concentrações de O, 0,3, 1, 3, 10 e 30 ug/mL) e monócitos de sangue periférico humano saudável foram adicionados a uma linhagem celular de câncer de próstata humano (PC-3) e estes foram então cultivados por 6 horas. A seguir, a atividade de LDH liberada no sobrendante de cultura foi medido, de modo que a atividade de ADCC pode ser medido (um valor médio + desvio padrão (N = 3), atuador/alvo (E/T) = 40). A concentração de anticorpo que é O indica a não adição do anticorpo. **P < 0,01 (pelo teste t de Student).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00196] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. As seguintes descrições não são pretendidas limitarem o escopo da presente invenção. Outros que não os seguintes exemplos, a presente invenção pode ser modificada e pode ser realizada, como apropriado, dentro de uma faixa que não prejudica a intenção da presente invenção.
[00197] O presente relatório descritivo inclui todos os conteúdos como divulgado na especificação do Pedido de Patente Condicional U. S. Nº 61/562,672 (depositado em 22 de novembro de 2011), que é um documento de prioridade do presente pedido.
[00198] Além disso, todas as publicações citadas no presente relatório descritivo, que incluem documentos da técnica anterior e documentos de patente, tais como publicações de pedido aberto ao público e publicações de patente, são incorporados aqui por referência em sua totalidade.
[00199] 1. Sumárioda presente invenção
[00200] Como mencionado acima, TROP-2 humano (hTROP-2) é uma proteína de membrana do tipo 1 transmembrana simples tendo um compriemnto total de 323 resíduos de aminoácido. Foi conhecido que um gene hTROP-2 e um produto genético deste são expressados em vários tipos de células cancerígenas.
[00201] Como mencioando acima, foi desejado desenvolver um anticorpo anti- hTROP-2 (um anticorpo monoclonal anti-hTROP) ou semelhante tendo atividade anti-tumoral alta in vivo. Sob tais circunstâncias, o presente inventor realizou uma triagem através de uma número extremamente grande de clones e como um resultado, o inventor foi bem sucedido na obtenção de um clone tendo atividade anti-tumoral alta in vivo. Especificamente, a presente invenção fornece um anticorpo monoclional, que, especificamente, reconhece a região extracelular de hTROP-2 in vivo e, particularmente, um anticorpo monoclonal apresentando afinidade alta em uma ordem de picomol (pM). O anticorpo da presente invenção é extremamente útil em que este é um anticorpo monoclional anti- hTROP (particularmente, um anticorpo humanizado), que apresenta atividade inibidora significante do desenvolvimento tumoral em uma dose mais baixa do que aquela do anticorpo anti-hTROP-2 existente (por exemplo, em uma dosagem de 1/20) quando este é administrado unicamente como um anticorpo nu e que também apresenta atividade inibidora significante do desenvolvimento tumoral em modelos de camundongo que carregam o tumor, em que os tipos múltiplos de células de câncer humano são usados.
[00202] 2. Produção de anticorpo anti-hTROP-2
[00203] (1) Preparação de antígeno
[00204] Informação com respeito à sequência de aminoácido (SEQ ID Nº: 2) de hTROP-2 é divulgado sob “Número de acessão NP 002344” no website da, por exemplo, NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nIm.nih.gov/). Informação com respeito à sequência de nucleotídeo com respeito a uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID Nº: 1) que codifica a sequência de aminoácido de hTROP- 2 é divulgado sob “Número de acessão NM 002353” no mesmo website como descrito acima.
[00205] Como um antígeno, um polipeptídeo ou peptídeo (que também é simplesmente referido como um peptídeo) que compreende pelo menos uma porção (toda ou uma parte) da sequência de aminoácido de hTROP-2 pode ser usadae, preferivelmente, um peptídeo que compreende pelo menos uma porção (toda ou uma parte) da sequência de aminoácido da região extracelular de hTROP-2 pode ser usada. A região extracelular (incluindo um peptídeo sinalizador) de hTROP-2 indica um região que compreende os aminoácidos na posição 1 a 274 da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 2 (o peptídeo sinalizador: os aminoácidos na posição 1 a 26). Aqui, com respeito a um peptídeo usado como um antígeno, a descrição acima “pelo menos uma porção da sequência de aminoácido” não é particularmente limitado em termos de comprimento. Por exemplo, uma região que compreende os aminoácidos na posição 1 a 145 da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 2, uma região que compreende os aminoácidos na posição 146 a 274 a partir da mesma sequência de aminoácido como descrito acima e outros são preferíveis.
[00206] Um peptídeo usado como um antígeno pode ser produzido pela síntese química ou pela síntese de acordo com um método de engenharia genética usando-se Escherichia coli ou semelhante. Um método bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica.
[00207] Quando um peptídeo é produzido pela síntese química, este pode ser sintetizado por um método de síntese de peptídeo bem conhecido. Além disso, um método de síntese de fase sólida ou um método de síntese de fase líquida pode ser aplicado à síntese do peptídeo. Um sintetizador de peptídeo comercialmente disponível (por exemplo, PSSM-8 fabricado pela Shimadzu Corporation, etc.) também pode ser usado.
[00208] Quando um peptídeo é sintetizado por um método de engenharia genética, primeiro, o DNA que codifica o peptídeo é projetado e sintetizado. O projeto e a síntese de tal DNA pode ser realizado de acordo com um método de PCR, usando-se um vetor que compreende um gene hTROP-2 de comprimento total ou semelhante como um padrão e também usando-se iniciadores projetados para serem capazes de sintetizar uma região de DNA desejada. À seguir, o DNA é ligado a um vetor adequado para obter um vetor recombinante usado para a expressão de proteína e este vetor rcombinante é então introduzido em um hospedeiro de modo que um gene de interesse possa ser expressado aqui, desse modo obtendo um transformante (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
[00209] Como um vetor, um fago ou um plasmídeo capaz de replicar de maneira autônoma em um microorganismo hospedeiro. Além disso, um vetor de vírus animal ou de um vírus de inseto também podem ser usados. Para a produção de um vetor recombinante, um DNA purificado pode ser clivado com enzimas de restrição adequadas e a porção deDNA clivada desta maneira pode ser então inserida no local de enzima de restrição ou semelhante de um DNA de vetor adequado, a fim de ligar ao vetor. O tipo de um hospedeiro usado na transformação não é particularmente limitado, contanto que este seja capaz de expressar um gene de interesse. Os exemplos de um tal hospedeiro incluem bactérias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), levedura, células animais (células COS, células CHO, etc.), células de inseto e insetos. Un mamífero, tal como uma cabra também pode ser usado como um tal hospedeiro. Um método de introduzir um vetor recombinante em um hospedeiro é publicamente conhecido.
[00210] O transformante descrito acima é cultivado e um peptídeo usado como um antígeno é então coletado a partir da cultura. O termo “cultura” é usado aqui para significar tanto (a) um sobrenadante de cultura e (b) células cultivadas, uma massa de células cultivada ou um produto desintegrado destas.
[00211] Após a finalização da cultura, quando um peptídeo de interesse produzido em uma massa celular ou em células, o peptídeo é extraído pela desintegração da massa celular ou as células. Por outro lado, quando um peptídeo de interesse é produzido fora da massa celular ou fora das células, uma solução de cultura é diretamente usada ou a massa celular ou as células são removidas da solução de cultura por centrifugação ou semelhante. A seguir, o peptídeo de interesse pode ser isolado e purificado por um uso simples de métodos bioquímicos comumente usados no isolamento e purificação de peptídeos, tais como precipitação de sulfato de amônio, iltração de gel, cromatografia de troca de íon e cromatografia por afinidade ou combinando-se apropriadamente os métodos bioquímicos já mencionados.
[00212] Na presente invenção, um peptídeo usado como um antígeno também pode ser obtido pela tradução in vitro usando-se um sistema de biossíntese isento de células. Neste caso, dois métodos, isto é, um método usando-se RNA como um padrão e um método usando-se DNA como um padrão (transcrição/tradução) pode ser aplicado. Com uma tal sistema de síntese isenta de célula, um sistema comercialmente disponível, tal como o sistema Expressway"" (Invitrogen), PURESYSTEM (marca registrada; Post Genome Institute) ou sistema TNT (marca registrada; Promega) pode ser usada.
[00213] Desta maneira o peptídeo obtido pode ligar a uma proteína carregadora adequada, tal como albumina de soro bovino (BSA), hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), tiroglobulina humana ou y-globulina de frango.
[00214] Além disso, o antígeno pode ser um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido que compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos com respeito à sequência de aminoácido de hTROP-2 (SEQ ID Nº: 2) ou uma sequência parcial desta como descrito acima. Pode ser usado, por exemplo, um peptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido, em que um ou mais (preferivelmente um ou diversos (por exemplo, 1a10e mais preferivelmente de 1 a 5)) aminoácidos são anulados ou um ou mais (preferiveimente um ou diversos (por exemplo, 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5)) aminoácidos são subsituídos por outros aminoácidos ou um ou mais (preferivelmente um ou diversos (por exemplo, 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5)) outros aminoácidos são adicionados, com respeito à sequência de aminoácido de hTROP-2 ou uma sequência parcial deste.
[00215] Na presente invenção, um gene a ser introduzido em uma célula ou semelhante é um gene que codifica uma proteína hTROP-2 ou um fragmento parcial desta ou uma proteína mutante desta ou um fragmento desta. Como tal, um gene, um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID Nº: 1 ou uma sequência parcial deste pode ser usada, por exemplo.
[00216] Além disso, como um gene a ser introduzido em uma célula ou semelhante, também pode ser usado uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID Nº: 1 e que codifica uma proteína tendo atividade de hTROP-2 ou uma sequência parcial desta.
[00217] A descrição “condições estringentes” é usada aqui para significar as condições de lavagem após a finalização da hibridização. Como tais condições estringentes, uma cocnentração de sal (sódio) em tampão é de 10 a 500 mM e uma temperatura é de 42º C a 72º Ce, preferivelmente, a condição de sal mencionada acima é de 50 a 300 mM e uma temperature é de 55º Ca 68º C.
[00218] A mutação pode ser introduzida em um gene de acordo com um método conhecido tal como um método de Kunkel o um método duplex com Gapped, usando-se, por exemplo, um kit de introdução de mutação que utilizam a mutagênese direcionada ao local, tal como sistema de Mutagênese direcionada ao local GeneTailor""M (fabricado pela Invitrogen) ou Sistema de mutagênese direcionada ao local TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.; fabricado pela Takara Bio Inc.).
[00219] (2) Produção de anticorpo monoclonal
[00220] O antígeno preparado é administrado a um mamífero para a imunização. O tipo de um tal mamífero não é particularmente limitado. Por exemplo, um rato, um camundongo e um coelho pode ser usada e entre estes, um camundongo é preferível.
[00221] A dosagem do antígeno por animal pode ser determinado, como apropriado, dependendo da presença ou ausência de um adjuvante. Os exemplos de um tal adjuvante incluem um adjuvante completo de Freund (FCA), um adjuvante incompleto de Freund (FIA) e um adjuvante de hidróxido de alumínio. A imunização pode ser realizada principalmente pela injeção do antígeno da veia, almofada da pata, subcutis ou cavidade abdominal de um animal. Além disso, o intervalo de imunização não é particularmente limitado e a imunização é realizada em intervalos de diversos dias a diversas semanas,
preferivelmente em intervalos de 1 semana, 1 a 10 vezes e, preferivelmente, 2 ou 3 vezes. Três a sete dias após o dia da imunização final, um titulador de anticorpo é medido pelo imunoensaio de enzima (ELISA or EIA), radioimunoensaio (RIA) ou outros métodos. Na data em que um titulador de anticorpo desejado é obtido, o sangue pode ser coletado para obter anti-soro. No método descrito acima de coletar um anticorpo, se for necessário purificar o anticorpo, o anticorpo pode ser purificado pela seleção de um método adequado a partir de métodos conhecidos, tais como precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel e cromatografia de afinidade ou pela combinação dos métodos mencionados acima, como apropriado. A seguir, a reatividade de um anticorpo policlonal no anti-soro é medido pelo método ELISA ou semelhante.
[00222] (3) Produção de anticorpo monocilonal
[00223] (3-1) Coleta de células produtoras de anticorpo
[00224] O anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção não é limitado, mas é, preferivelmente, um anticorpo monoclonal.
[00225] O antígeno preparado é adminsitrado a um mamífero, tal como um rato, um camundongo ou um coelho para a imunização. A dosagem do antígeno para animal pode ser determinado, como apropriado, dependendo da presença ou ausência de um adjuvante. O mesmo adjuvante como descrito acima pode ser usada aqui. Também, os mesmos métodos de imunização como descritos acima podem ser aplicados aqui. De um a sessenta dias, preferivelmente, um a quatorze dias após o dia da imunização final, as células produtoras de anticorpo são coletadas. Os exemplos de tais células produtoras de anticorpo incluem células esplênicas, células de linfo nodos e células de sangue periférico. Destes, as células de linfonodo e as céluls esplênicas são preferíveis.
[00226] (3-2) Fusão celular
[00227] A fim de obter hibridomas (uma linhagem celular produtora de anticorpo), a fusão de células produtoras de anticorpo com células de mieloma é realizada. As céluals de mieloma a serem fundidas com as células produtoras de anticorpo, as células estabelecidas comumente disponíveis de animais, tais como camundongos podem ser usadas. A linhagem celular usada aqui é, preferivelmente, uma linhagem celular que tem sensibilidade a medicamento, pode não sobreviver em um estado não fundido em um meio seletivo de HAT (contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) e podem sobreviver apenas em um estado fundido com células produtoras de anticorpo.
[00228] Os exemplos de células de mieloma incluem linhas de células de mieloma de camundongo, tais como P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8(X63), P3-
X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS 1/1-Ag4-1(NS1) e Sp2/0-Ag14(Sp2/0). As células de mieloma podem ser selecionadas, enquanto levam-se em consideração a compatibilidade com células produtoras de anticorpo, como apropriado.
[00229] Subsequentemente, as células de mieloma são fundidas com células produtoras de anticorpo. Para tal fusão celular, células produtoras de anticorpo (1x 10º a1x10' células/ml) são misturadas com células de mieloma (2 x 10º a 2 x 10º células/ml) em um meio para células animais, tal como DMEM ou um meio RPMI-1640 não contendo soro. A razão celular entre as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma (células produtoras de anticorpo : células de mieloma) não é limitado. Em geral, a razão celular é preferivelmente de 1: 1 a 10: 1 e mais preferivelmente de 3 : 1. A seguir, uma reação de fusão é realizada na presença de um promotor de fusão celular. Tal como um promotor de fusão, polietileno glicol tendo um peso molecular médio de 1.000 a
6.000 Dalton (D) ou semelhante pode ser usado. Além disso, também é possível fundir células produtoras de anticorpo com células de mieloma, que utilizam um mecanismo de fusão celular comercialmente disponível que utiliza o estímulo elétrico (por exemplo, eletroporação).
[00230] (3-3) Seleção e clonagem de hibridomas
[00231] Os hibridomas de interesse são selecionados a partir das células após o tratamento de fusão celular. Como um método de selecionar os hibridomas, a suspensão celular é apropriadamente diluído com, por exemplo, um meio RPMI- 1640 contendo soro fetal bovino e a solução diluída é então dispersada em uma placa microtituladora. A seguir, um meio seletivo é adicionado a cada reservatório. Enquanto o meio seletivo é apropriadamente mudado por um fresco, a cultura é realizada. Como um resultado, aproximdamente 14 dias após o início da cultura no meio seletico, as células desenvolvem-se a partir do meio seletivo pode ser obtido como hibridomas.
[00232] Subsequentemente, a avaliação é realizada para examinar se ou não um anticorpo que reage com hTROP-2 está presente em um sobrenadante de cultura de desenvolvimento de hibridomas. A avaliação de hibridomas pode ser realizada de acordo com um método comum e, desta maneira, o método de avaliação não é particularmente limitado. Por exemplo, uma alíquota é coletada a partir do sobrendante de cultura do desenvolvimento de hibridoma contidos no reservatório e a avaliação é então realizada por ELISA, EIA, RIA ou semelhante.
[00233] A clonagem das células fundidas pode ser realizada por um método de diluição limitante ou semelhante. Um anticorpo que mostra a reatividade alta com hTROP-2 é determinado por citometria de fluxo ou semelhante e um hibridoma que produz este anticorpo é então selecionado. O hibridoma selecionado é estabelecido como um clone.
[00234] (3-4) Coleta de anticorpo monocional
[00235] Como um método de cultivar o hibridoma estabelecido e então coletando um anticorpo monoclional a partir da cultura obtida, um método de cultura de célula comum, um método de formação de ascite ou semelhante pode ser adotado. O termo “cultura” é usado aqui para significar permitir os hibridomas para desenvolver em uma placa de cultura ou uma garrafa de cultura ou permitir que os hibridomas desenvolvam-se na cavidade abdominal de um animal, como descrito abaixo.
[00236] No caso do método de cultura celular, os hibridomas são cultivados em um meio para células animais, tal como um meio RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10 %, um meio MEM ou um meio isento de soro, sob condições de cultura comum (por exemplo, 37º C, 5 % de concentração de CO>z) por 7 a 14 dias e, a seguir, um anticorpo pode ser obtido a partir do sobrendante de cultura.
[00237] No caso da método de formação de ascite, aproximadamente 1 x 107 hibridomas são administrados na cavidade abdominal de um animal das mesmas espécies como o mamífero a partir do qual as células de mieloma são derivadas, de modo que quantidades grandes de hibridomas são deixados proliferar. A seguir, 2 a 3 semanas depois, o ascite é preferivelmente coletado.
[00238] Nos métodos de coleta de anticorpo descrito acima, se for necessário purificar o anticorpo, o anticorpo pode ser purificado, apropriadamente, selecionando um método adequado a partir dos métodos conhecidos, tais como precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, filtração de gel e cromatografia de afinidade ou pela combinação dos métodos mencioandos acima.
[00239] (3-5) Seleção de clone tendo atividade anti-tumor
[00240] O anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção é um anticorpo tendo atividade anti-tumor in vivo.
[00241] O termo “atividade anti-tumoral” é usado aqui significar a atividade de matar as células tumorais (células cancerígenas) ou atividade de inibir o desenvolvimento tumoral. Os exemplos preferidos de tal atividade anti-tumoral incluem a atividade de inibir o desenvolvimento de células cancerígenas e atividade de inibir a angiogênese tumoral. O tipo de tumor humano (células tumorais), em que o anticorpo da presente invenção é capaz de apresentar a atividade anti-tumoral, inclui vários tipos de tumores humanos conhecidos, em que a expressão de hTROP-2 foi confirmado. O tipo de tal tumor humano não é particularmente limitado. Por exemplo, um ou dois ou mais tipos selecionados de vários tumores humanos, tais como câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano are preferable; and um ou dois ou mais tipos selecionados de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano e câncer pulmonar humano são mais preferíveis. Câncer pancreático humano e/ou câncer colorretal humano ainda são preferíveis.
[00242] Além disso, o tumor descrito acima pode ser um câncer recorrente ou um câncer metastático. O anticorpo da presente invenção também é capaz de apresentar atividade anti-tumoral excelente nestes tipos tumorais.
[00243] A presença de atividade anti-tumoral in vivo pode ser confirmado, por exemplo, pela utilização de um camundongo que carrega tumor (um modelo de xenoenxerto de camundongo), na subcutis de cada células tumorais desejadas foram transplantados e então pela administração do anticorpo como obtido acima ao camundongo. Neste caso, o anticorpo pode ser administrado imediatamente após o transplante de células tumorais (modelos de prevenção). Alternativamente, este pode ser administrado após a confirmação que o tumor transplantado ter atingido um volume predeterminado (modelos de tratamento). O método de administração não é limitado. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado uma vez a cada três dias, a cada semana, a cada dez dias ou a cada duas semanas ou por uma administração simples (apenas uma vez), em uma dosagem de 5 a 20 mg/kg de peso corporal, por intermédio da administração intraperitoneal ou semelhante. No caso de modelos de prevenção, a presença ou ausência de atividade anti-tumoral e o nível deste pode ser avaliado com base na frequência de formação tumoral e volume tumoral. No caso de modelos de tratamento, a presença ou ausência de atividade anti- tumoral e o nível deste pode ser avaliado com base no volume tumoral.
[00244] Na presente invenção, um exemplo preferido do anticorpo anti- hTROP-2 tendo atividade anti-tumor in vivo é um anticorpo em que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H destes são mostradas na SEQ ID Nº: 36 a 38, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L deste são mostradas na SEQ ID Nº: 41 a 43, respectivamente. Um exemplo preferido da região V da cadeia H é uma região V de cadeia H que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 35. Um exemplo preferido da região V da cadeia L é uma região V da cadeia L que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 40.
[00245] Como uma outra forma de realização do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção, um exemplo preferido é um anticorpo em que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H deste são mostradas na SEQ ID Nº: 46 a 48, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L deste são mostradas na SEQ ID Nº: 51 a 53, respectivamente. Um exemplo preferido da região V da cadeia H é uma região V de cadeia H que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº:
45. Um exemplo preferido da região V da cadeia L é uma região V da cadeia L que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 50.
[00246] Da mesma maneira, como uma forma de realização adicional do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção, um exemplo preferido é um anticorpo em que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H deste são mostradas na SEQ ID Nº: 56 a 58, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L deste são mostradas na SEQ ID Nº: 61 a 63, respectivamente. Um exemplo preferido da região V da cadeia H é uma região V de cadeia H que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 55. Um exemplo preferido da região V da cadeia L é uma região V da cadeia L que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 60.
[00247] Da mesma maneira, como uma forma de realização adicional do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção, um exemplo preferido é um anticorpo em que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H deste são mostradas na SEQ ID Nº: 66 a 68, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L deste são mostradas na SEQ ID Nº: 71 a 73, respectivamente. Um exemplo preferido da região V da cadeia H é uma região V de cadeia H que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 65. Um exemplo preferido da região V da cadeia L é uma região V da cadeia L que consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 70.
[00248] Na presente invenção, mais especificamente, os exemplos preferidos de um anticorpo anti-hTROP-2 tendo atividade anti-tumor in vivo incluem: um anticorpo monoclonal anti-hTROP (nome do clone: K5-70) produzido por um hibridoma com Número de acessão FERM BP-11251; um anticorpo monoclional anti-hTROP (nome do clone: K5-107) produzido por um hibridoma com Número de acessão FERM BP-11252; um anticorpo monoclonal anti-hTROP (nome do clone: K5-116-2-1) produzido por um hibridoma com Número de acessão FERM BP-11253; um anticorpo monoclonal anti-hTROP (nome do clone: T6-16) produzido por um hibridoma com Número de acessão FERM BP-11346; and um anticorpo monoclonal anti-hTROP (nome do clone: T5-86) produzido por um hibridoma com Número de acessão FERM BP-11254.
[00249] Aqui, o hibridoma com Número de acessão FERM BP-11251 foi denominado como “Hibridoma Camundongo-Camundongo K5-70” e foi depositado em 12 de maio, 2010; o hibridoma com Número de acessão FERM BP-11252 foi denominado como “Hibridoma Camundongo-Camundongo K5-107”" e foi depositado em 12 de maio, 2010; o hibridoma com Número de acessão FERM BP-11253 foi denominado como “Hibridoma Camundongo-Camundongo K5-116-2-1" e foi depositado em 12 de maio, 2010; o hibridoma com Número de acessão FERM BP-11346 foi denominado como “Hibridoma Camundongo- Camundongo T6-16" e foi depositado em 1 de março de 2011 we o hibridoma com Número de acessão FERM BP-11254 foi denominado como “Hibridoma Camundongo-Camundongo T5-86” e foi depositado em 12 de maio, 2010. Todos estes hibridomas foram depositados com the International Patent Organism Depositary (IPOD), the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, an Independent Administrative Institution under the Ministry of Economy, Trade and Industry (the AIST, Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan, postal code: 305-8566).
[00250] Ainda, um outro exemplo preferido do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção é um anticorpo anti-hTROP-2 que liga-se a um local (por exemplo, um epítopo), ao qual um anticorpo monocilonal produzido pelo hibridoma tendo acessão Nº FERM BP-11251, FERM BP-11252, FERM BP- 11253, FERM BP-11346 ou FERM BP-11254 liga (reconhece).
[00251] Os exemplos preferidos de um tal epítopo será dado em (3-6) abaixo.
[00252] (3-6) O epítopo do anticorpo anti-hTROP-2
[00253] O tipo de um epítopo (um determinante antigênico) do anticorpo anti- hTROP-2 da presente invenção não é limitado, contando que este seja de pelo menos uma porção de hTROP-2 como um antígeno. Por exemplo, um tal epítopo é preferivelmente pelo menos uma porção de uma região formada pela remoção de uma região que consiste de aminoácidos nas posições de 252 a 260 da sequência de aminoácido de hTROP-2 mostrada na SEQ ID Nº: 2, mais preferivelmente pelo menos uma porção de uma região que consiste de aminoácidos nas posições 1 a 69 ou pelo menos uma porção de uma região que consiste de aminoácidos nas posições 100 a 274 (exceto para uma região que consiste de aminoácidos na posição 252 a 260) e ainda preferivelmente pelo menos uma porção de uma região que consiste de aminoácidos nas posições 27 a 69 ou uma região que consiste de aminoácidos nas posições 109 a 206. Particularmente os exemplos preferidos do epítopo descrito acima incluem uma região que consiste de aminoácidos nas posições 43 a 65, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 152 a 165, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 171 a 183, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 109 a 120, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 193 a 206, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 43 a 56 e uma porção que compreende uma tal região, na sequência de aminoácido de hTROP-2 mostrada na SEQ ID Nº: 2. Ainda particularmente os exemplos preferidos incluem uma região que consiste de aminoácidos nas posições 43 a 65, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 152 a 165, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 171 a 183, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 109 a 120 e uma porção que compreende uma tal região. Um anticorpo anti-hTROP-2, que reconhece as regiões descritas acima (liga-se às regiões descritas acima ou porções que compreendem tais regiões), teve alternativa de internalização alta em células tumorais, por exemplo e, desta maneira, é extremamente útil como um imunoconjugado as descrito depois.
[00254] (3-7) Características de anticorpo anti-hTROP-2
[00255] Como descrito acima, o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção é um anticorpo tendo atividade anti-tumoral alta in vivo em uma dose baixa. Especificamente, é preferível que o presente anticorpo anti-hTROP-2 apresenta atividade inibidora do desenvolvimento tumoral de 50 % ou mais (preferivelmente 80 % ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda preferivelmente 95 % ou mais e, particularmente, preferivelmente quase 100 % (por exemplo, 98 % ou mais, or 99 % ou mais)) em uma dose (como um anticorpo nu) de 20 mg/kg de peso corporal ou menos (preferivelmente 10 mg/kg de peso corporal ou menos, mais preferivelmente 5 mg/kg de peso corporal ou menos e ainda preferivelmente 1 mg/kg de peso corporal ou menos) com respeito ao modelo animal que carrega tumor.
[00256] Aqui, a atividade inibidora do desenvolvimento tumoral (%) pode ser calculado, por exemplo, pela seguinte fórmula:
[00257] Atividade inibidora do desenvolvimento tumoral (%) = 100 — [(tumor volume ou peso tumoral de anticorpo grupo de administração) / (tumor volume ou peso tumoral de grupo de controle)] x 100
[00258] Além disso, o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção preferivelmente tem atividade anti-tumoral em dois ou mais tipos de linhagens celulares tumorais humanas. O tipo de uma tal linhagem celular de tumor humano não é limitada. Por exemplo, tais linhagens celulares tumorais humanas são pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de vários tipos de linhas celualres de câncer pancreático humano, com linhagens celulares de câncer de próstata humano, linhagens celulares de câncer colorretal humano, com linhagens celulares de câncer de mama humano, linhagens celulares de câncer ovariano humano, linhagens celulares de câncer pulmonar humano e linhagens celulares de câncer do duto biliar humano.
Especificamente, os exemplos preferidos e tais linhagens celulares tumorais humanas incluem pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, uma linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-3L, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-1, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45H, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45P, uma linhagem celular de câncer pancreático humano TCC-PAN2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano SUIT- 2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano CACO-2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480, uma linhagem celular de câncer de cólon humano DLD-1, uma linhagem celular de câncer de cólon humano HCT 116, uma linhagem celular de câncer de mama humano JIMT-1, uma linhagem celular de câncer de mama humano HCC1143, uma linhagem celular de câncer de mama humano MCF-7, uma linhagem celular de câncer de mama humano
MDA-MB-468, uma linhagem celular de câncer de próstata humano DU145, uma linhagem celular de câncer de próstata humano PC-3, uma linhagem celular de câncer de ovariano humano SK-OV-3, uma linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3 e uma linhagem celular de câncer de duto biliar humano TFK-1. Destes, como os dois ou mais tipos de linhagens celulares tumorais humanas descritas acima, pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste da linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, a linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, a linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, a linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3, a linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-468 e a linhagem celular de câncer ovariano humano SK-OV-3 são mais preferíveis.
[00259] Além disso, o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção tem um constante de dissociação (valor Kd) de preferivelmente 1,0 x 107º M ou menos, mais preferivelmente 1,0 x 10º M ou menos e ainda preferivelmente 1,0 x 10" 1? M ou menos. Aqui, a capacidade de ligação (afinidade) do anticorpo pode ser medido na forma de uma constante de dissociação (valor Kd), um constante de taxa de dissociação (Kdiss [1/Sec]) ou um constante de taxa de associação (Kass [1/M.Sec]), por exemplo, pela análise Scatchard ou sensor de ressonância de plasmon de superfície denominado Biacore. Como tal mecanismo Biacore,
Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J and Biacore Q (todos de que foram fabricados pela Biacore) pode ser usado, por exemplo. É preferível que o anticorpo tem uma constante de dissociação (valor Kd) que é tão menor quanto possível por causa deste ter a capacidade de ligação (afinidade). O valor Kd é determinado com base em dois parâmetros de Kdiss e Kass e pode ser expressado na fórmula: Kd[M] = Kdiss/Kass. Como um método de calcular o valor Kd, o método descrito nos exemplos como descrito por último (especificamente, Exemplo 10) pode ser preferivelmente adotado.
[00260] (4) Anticorpo geneticamente recombinante e fragmento de anticorpo
[00261] (4-1) Anticorpo geneticamente recombinante
[00262] Em uma forma de realização preferida do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção, aqui é fornecido um anticorpo geneticamente recombinante. O tipo de tal um anticorpo geneticamente recombinante não é limitado. Exemplos incluem um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.
[00263] Um anticorpo quimérico (isto é, um anticorpo quimérico humanizado) é um anticorpo formado pela ligação (conjugação) da região variável de um anticorpo derivado por camundongo à região constante de um anticorpo derivado por humano (favor referir-se a Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-
6855, (1984), etc.). Quando um tal anticorpo quimérico é produzido, desta maneira anticorpo ligado pode ser facilmente construído por uma técnica de recombinação genética.
[00264] Quando um anticorpo humanizado é produzido, uma região de determinação complementar (CDR) é transplantada a partir da região variável de um anticorpo de camundongo na região variável de um anticorpo humano, de modo a produzir uma região variável reconstruída, em que a reagião de estrutura (FR) é derivada a partir de um humano e CDR é derivado a partir do camundongo (que é denominado enxerto de CDR (transplante de CDR)). Subsequentemente, a região variável humana reconstruída desta maneira humanizada é ligada a uma região constante humana. Um tal método para produzir um anticorpo humanizado é bem conhecido no presente campo técnico (favor referir-se a Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); Publicação de Patente JP (Kohyo) Nº 4-502408 A (1992) (Patente Japonesa Nº 2828340; Queen et al.), etc.).
[00265] Aqui, o tipo de uma sequência de CDR derivada do camundongo, que pode ser usada em um anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção, não é particularmente limitado. Por exemplo, a sequência de aminoácidos mostrada na
SEQ ID Nº: 36 a 38 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 66 a 68 são, preferivelmente, usados como o CDR 1 a 3 da região V da cadeia H (VH), respectivamente. A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 41 a 43 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 71 a 73 são, preferivelmente, usados como o CDR 1 a 3 da região V da cadeia L (VL), respectivamente.
[00266] Além disso, os exemplos preferidos da sequência de aminoácido de uma rgião V de cadeia H em uma região variável humana reconstruída humanizada incluem: a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 92 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 36 a 38; a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 75) a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 98 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 36 a 38; a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 97); a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 94 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 66 a 68; a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 79); and a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 95 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 66 a 68; a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 81). Aqui, sequência de aminoácido da região V da cadeia H mencionada acima mostrada na SEQ ID Nº: 98 é como a sequência de aminoácido modificada em que a arginina (R) na posição 44 da sequência de aminoácido da região V da cadeia H mencionada acima mostrada na SEQ ID Nº: 92 é substituída com uma glicina (G).
[00267] Da mesma maneira, os exemplos preferidos da sequência de aminoácido de uma região V da cadeia L em uma região variável humana reconstruída humanizada incluem: a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 93 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 41 a 43 e a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 77) e a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 96 (que compreende CDR 1 a 3 que consiste da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 71 a 73; a sequência de aminoácido que ainda compreende um peptídeo sinalizador é mostrada na SEQ ID Nº: 83).
[00268] Aqui, os exemplos preferidos de um anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção inclui: (i) um anticorpo anti-hTROP-2, em que a sequência de aminoácido da região V da cadeia H é mostrada na SEQ |D Nº: 92 e a sequência de aminoácido da região V da cadeia L é mostrada na SEQ ID Nº: 93; e (ii) um anticorpo anti-hTROP-2, em que a sequência de aminoácido da região V da cadeia H é mostrada na SEQ ID Nº: 98 e a sequência de aminoácido da região V da cadeia L é mostrada na SEQ ID Nº: 93. Em particular, um anticorpo anti-hTROP-2 descrito em (ii) acima, em que a sequência de aminoácido da região V da cadeia H é mostrada na SEQ ID Nº: 98, tem uma avidez melhorada (que é flexível ao movimento de dois membros de ligação de antígeno) e tem atividade de ligação de antígeno alta e desta maneira, este anticorpo é particularmente preferível.
[00269] Também, outros exemplos preferidos de um anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção incluem: (iii) um anticorpo anti-hTROP-2, em que a sequência de aminoácido da região V da cadeia H é mostrada na SEQ ID Nº: 94 e a sequência de aminoácido da região V da cadeia L é mostrada na SEQ ID Nº: 96; e (ii) um anticorpo anti-hTROP-2, em que a sequência de aminoácido da região V da cadeia H é mostrada na SEQ ID Nº: 95 e a sequência de aminoácido da região V da cadeia L é mostrada na SEQ ID Nº: 96.
[00270] Em geral, no caso de um anticorpo humano (um anticorpo humano completo), sua estrutura que compreende uma Região hiper variável que é o local de ligação de antígeno de uma Região V, outras partes da Região V e uma região constante é a mesma como a estrutura do anticorpo de um humano.
Entretanto, um tal Local hiper variável também pode ser derivado a partir de outros animais.
Uma técnica de produzir um anticorpo humano que é publicamente conhecido e um método para produzir as sequências do gene que são comuns em humanos pela engenharia genética foi estabelecida.
Um anticorpo humano pode ser obtido, por exemplo, pelo método usando-se um camundongo que produz anticorpo humano que tem os fragmentos cromossomais humanos que compreende os genes da c adeia H e cadeia L do anticorpo humano (favor referir-se a Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc.
Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and liima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et. al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, (2000) 97, 722-727, etc.), ou pelo método de obter um anticorpo humano derivado de apresentação de fago selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpo humano (favor referir-se a Wormstone, |. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and
Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431, etc.).
[00271] No caso do anticorpo quimérico anteriormente mencionado, anticorpo humanizado e anticorpo humano, a cadeia de açúcar ligada por glicosídeo N na região de anticorpo Fc é preferivelmente uma cadeia de açúcar, em que fucose não liga-se a N-acetilglucosamina no terminal de redução destes. Um exemplo específico é um anticorpo que consiste de moléculas de anticorpo geneticamente recombinante, que tem, na região Fc das moléculas de anticorpo, uma cadeia de açúcar em que a posição 1 da fucose não liga-se à posição 6 de N-acetilglucosamina no terminal de redução da cadeia de açúcar ligada por glicosídeo N por intermédio de uma ligação a. Um tal anticorpo é capaz de melhorar significantemente atividade ADCC. Este ponto (as características da cadeia de açúcar ligada por glicosídeo N na região de anticorpo Fc) também é preferível pelo anticorpo policlonal anteriormente mencionado e anticorpo monoclional.
[00272] (4-2) Fragmento de anticorpo
[00273] O fragmento de anticorpo anti-hTROP-2 (fragmento parcial) da presente invenção é incluído no anticorpo da presente invenção. Aqui, o fragmento de anticorpo da presente invenção tem atividade de ligação a hTROP-2 (isto é, é capaz de ligar ao hTROP-2) e também tem atividade anti- tumoral in vivo, commo no caso do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção.
[00274] O fragmento do anticorpo significa uma região de uma porção de um anticorpo policlonal anti-hTROP-2 ou anticorpo monoclonal anti-hTROP (isto é, um fragmento de anticorpo derivado a partir do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção). Exemplos de um tal fragmento de anticorpo inclui peptídeos que compreende, como pelo menos uma porção deste, Fab, Fab', F(ab')z, Fv (fragmento variável de anticorpo), um anticorpo filamentado simples (uma cadeia H, uma cadeia L, uma região V da cadeia H e uma região V da cadeia L, etc.), scFv, diacorpo (dímero scFv), dsFv (uma região V estabilizada por bissulfeto) e uma região de determinação complementar (CDR).
[00275] Fab é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de aproximadamente 50.000 tendo atividade de ligação de antígeno, que é formado pela ligação de cerca de metade no lado do terminal N da cadeia H a cadeia L inteira por intermédio de uma ligação de bissulfeto, entre os fragmentos obtidos pelo tratamento das moléculas de anticorpo com uma protease, papaína. Além disso, também é possível produzir tal Fab pela inserção de DNA que codifica o Fab de um anticorpo em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste.
[00276] F(ab'), é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de aproximadamente 100.000 tendo atividade de ligação de antígeno, cujo tamanho é lentamente menor do que Fab que liga-se a Fab por intermédio da ligação de bissulfeto na região de junta, entre os fragmentos obtidos pelo tratamento das moléculas de anticorpo com a protease, pepsina. Além disso, também é possível produzir tal F(ab'), pela ligação de tioéter ou ligação de bissulfeto de Fab, como descrito posteriormente.
[00277] Fab' é um fragmento de anticorpo com um peso molecular de aproximadamente 50.000 tendo atividade de ligação de antígeno, que é formado pela clivagem da ligação de bissulfeto na região de junta do F(ab'), anteriormente mencionado. Além disso, também é possível produzir tal Fab' pela inserção de DNA que codifica o fragmento Fab' de um anticorpo em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste.
[00278] O scFv é um fragmento de anticorpo tendo atividade de ligação de antígeno, que é um polipeptídeo VH-P-VL ou VL-P-VH formado pela ligação de uma região V simples da cadeia H (VH) a uma região V simples da cadeia L (VL) usando-se um ligador de peptídeo adequado (P). Tal scFv pode ser produzido para obter o cDNA que codifica o VH e VL de um anticorpo, DNA de construção que codifica scFv, inserção do DNA em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste.
[00279] O diacorpo é um fragmento de anticorpo formado pela dimerização de scFv, que tem atividades de ligação de antígeno bivalentes. Tais atividades de ligação de antígeno bivalentes podem ser idênticas a cada outra, ou estas também podem ser diferentes de cada outro. Tal diacorpo pode ser produzido para obter cCDNA que codifica o VH e VL de um anticorpo, DNA de construção que codifica scFv tal que o comprimento da sequência de aminoácido de P são 8 resíduos ou menos, inserção do DNA em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste.
[00280] O dsFv é um fragmento de anticorpo formado pelos polipeptídeos de ligação, em que um resíduo de aminoácido em cada um de VH e VL foi substituído com um resíduo de cisteína, a cada outro por intermédio de uma ligação de bissulfeto entre os resíduos de cisteína. O resíduo de aminoácido a ser substituído com os resíduos de cisteína pode ser selecionado com base na avaliação da estrutura tricdimensional do anticorpo de acordo com o método de Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). Tal dsFv pode ser produzido para obter cDNA que codifica o VH e VL de um anticorpo, DNA de construção que codifica dsFv, inserção do DNA em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste.
[00281] Um peptídeo que compreende um CDR que compreende pelo menos uma região de CDRs de VH (CDR 1 a 3) e CDRs de VL (CDR 1 a 3). Mais exemplos preferidos um tal peptídeo inclui um peptídeo que compreende todos dos CDRs de VH e um peptídeo que compreende todos dos CDRs de VL. Um exemplo particularmente preferido do peptídeo é um peptídeo que compreende todos dos CDRs de VH e VL (6 regiões totais). Os exemplos preferidos da sequência de aminoácido de um tal CDR inclui uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 36 a 38, 41 a 43, 46 a 48, 51 a 53, 56 a 58, 61 a 63, 66 a 68 e 71 a 73, como descrito acima. Um peptídeo que compreende CDRs múltiplos pode ser ligado a um outro, diretamente ou por intermédio de um ligador de peptídeo adequado. Um tal peptídeo que compreende CDR pode ser produzido pelo DNA de construção que codifica o VH e VL de um anticorpo,
inserção do DNA em um vetor de expressão de procariota ou um vetor de expressão eucariota e então introduz o vetor de expressão em uma procariota ou uma eucariota de modo a permitir o DNA para expressar neste. Além disso, um tal peptídeo que compreende CDR também pode ser produzido pelos métodos de síntese químico tal como um método Fmoc (um método de fluorenilmetiloxicarbonila) e um método tBoc (um método de t-butiloxicarbonila).
[00282] O fragmento de anticorpo da presente invenção, como é, pode ser um fragmento de anticorpo, que compreende uma parte de ou a região Fc de anticorpo inteiro em que fucose não liga-se a N-acetilglucosamina no terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada por glicosídeo N. De outra maneira, o fragmento de anticorpo da presente invenção também pode ser uma proteína de fusão, em que o fragmento de anticorpo anteriormente mencionado é fundido com uma parte de ou a região Fc de anticorpo inteiro em que fucose não liga-se a N-acetilglucosamina no terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada por glicosídeo N. Um tal fragmento de anticorpo é capaz de melhorar significantemente atividade ADCC e desta maneira é preferível.
[00283] Em seguida, nas descrições da presente especificação, os fragmentos de anticorpo anteriormente mencionados também são incluídos no anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção.
[00284] 3. Polinucleotídeo, vetor recombinante e transformante
[00285] Na presente invenção, um polinucleotídeo (um gene, DNA) que codifica o anticorpo anti-hTROP-2 descrito acima da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste também pode ser fornecido. Especificamente, o presente polinucleotídeo é preferivelmente um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica cada sequência de aminoácido exemplificada como o anticorpo anti-hTROP-2 descrito acima da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste. Além disso, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser um polinucleotídeo que consiste de um polinucleotídeo sozinho que codifica o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste, ou um polinucleotídeo que compreende o presente polinucleotídeo como uma porção deste e também que compreende sequências de nucleotídeo conhecidas necessárias pela expressão do gene (por exemplo um promotor transcripcional, uma sequência SD, uma sequência Kozak, um terminador, etc.). Desta maneira, o tipo do presente polinucleotídeo não é limitado.
[00286] Com relação ao polinucleotídeo que codifica o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste, o códon correspondente a aminoácidos individuais após tradução não é particularmente limitada. O polinucleotídeo pode compreender DNA de nucleotídeo mostrando um códon comumente usado nos mamíferos tal como um humano (preferivelmente, um códon frequentemente usado), ou também pode compreender DNA de nucleotídeo mostrando um códon comumente usado nos microorganismos tal como Escherichia coli ou levedura, plantas e outros (preferivelmente, um códon frequentemente usado).
[00287] Na presente invenção, um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo descrito acima da presente invenção, ou um transformante que compreende o vetor recombinante, também pode ser fornecido.
[00288] Um promotor transcripcional, uma sequência SD (em um caso em que o hospedeiro é uma célula procariótica) e uma sequência Kozak (no caso em que o hospedeiro é uma célula eucariótica) pode ser previamente ligado a montante de um polinucleotídeo (um gene, DNA) a ser incorporado em um vetor de expressão usado como um vetor recombinante. Além disso, um terminador pode ser ligado a jusante do polinucleotídeo. Além disso, um intensificador, um sinal de união, um sinal poli(A) adicional, um marcador seletivo e outros também pode ser ligado ao polinucleotídeo. Os elementos individuais necessários pela expressão do gene, tal como o promotor transcripcional descrito acima, pode ser compreendido na presente polinucleotídeo a partir do início. Quando estes elementos são originalmente compreendidos em um vetor de expressão, estes podem ser usados. Desta maneira, o uso dos elementos individuais não é particularmente limitado.
[00289] Como métodos de incorporar o presente polinucleotídeo em um vetor de expressão, vários tipos de métodos utilizando as técnicas de recombinação genética conhecida, tal como um método usando-se enzimas de restrição ou um método usando-se topoisomerase, pode ser adotado. O tipo de um vetor de expressão não é limitado, contanto que este é capaz de reter um polinucleotídeo (um gene, DNA) que codifica o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste e um vetor adequado pelas células hospedeiras a ser usado pode ser selecionado, como apropriado e pode ser usado. Exemplos de um tal vetor de expressão inclui DNA de plasmídeo, DNA de bacteriofago, DNA de retrotransposon, um vetor de retrovífus e DNA cromossomal artificial.
[00290] Subsequentemente, desta maneira o vetor recombinante construído é introduzido em um hospedeiro para obter um transformante e o transformante obtido é então cultivado, de modo que o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste pode ser expressado. Este é notado que o termo “transformante” é usado em uma presente invenção para significar um hospedeiro em que um gene estranho foi introduzido. Exemplos de um tal transformante inclui: um hospedeiro em que um gene estranho foi introduzido pela introdução do DNA de plasmídeo ou outros (transformação); e uma hospedeira em que um gene estranho foi introduzido pela infecção dos hospedeiros com vários tipos dos vírus e fagos (transdução).
[00291] O tipo de um hospedeiro não é limitado, contanto que é capaz de expressar o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção ou um fragmento de anticorpo deste, após o vetor recombinante descrito acima foi introduzido no hospedeiro. Desta maneira, um hospedeiro pode ser selecionado, como apropriado. Exemplos de um tal hospedeiro inclui os hospedeiros conhecidos tal como vários tipos das células animais tal como um humano ou um camundongo e vários tios de células vegetais, bactéria, leveduras e células vegetais.
[00292] Quando as células animais são usadas como células hospedeiras, exemplos de tais células animais incluem: fibroblastos humanos, células do rim embriônico humano, células HEK293, células 293F, células CHO, células COS-7 de macaco, Vero, células L de camundongo, células GH3 rato e FL humano. Além disso, as células de inseto tais como células Sf9 ou células Sf21 também podem ser usadas como células hospedeiras.
[00293] Quando a bactéria são usadas como hospedeiros, exemplos de tal bactéria inclui Escherichia coli e Bacillus subtilis.
[00294] Quando levedura é usada como um hospedeiro, exemplos de tal levedura inclui Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe.
[00295] Quando as células vegetais são usadas como as células hospedeiras, células de tabaco BY-2 são usadas por exemplo.
[00296] O método de obter um transformante não é limitado e pode ser selecionado, como apropriado, enquanto leva em consideração de uma combinação do tipo de um hospedeiro e o tipo de um vetor de expressão. Os exemplos preferidos do método de obter um transformante inclui a eletroporação, lipofecção, um método de choque por calor, PEG, um método de fosfato de cálcio, um método de dextrano de DEAE e um método de infectar um hospedeiro com vários tipos de vírus tal como vírus de DNA ou vírus de RNA.
[00297] No transformante obtido, o tipo de códon de um polinucleotídeo contido em um vetor recombinante compreendido pode ser idêntico ou diferente a partir do tipo de códon de um hospedeiro usado. Desta maneira, o tipo de códon não é limitado.
[00298] 4. Preparaçãoo do conjugado de droga-anticorpo
[00299] Como um imunoconjugado preparado usando-se o anticorpo anti- hTROP-2 anteriormente mencionado da presente invenção, aqui pode ser fornecido um conjugado de droga-anticorpo, que compreende o anticorpo anteriormente mencionado e uma substância (um composto, etc.) tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular. É notado que um conjugado formado para preparar previamente cada um da molécula de anticorpos — anteriormente — mencionados e a substância anteriormente mencionada tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular, separadamente e então combinado a este, é geralmente referido como um imunoconjugado. De outra maneira, um conjugado obtido pela ligação de uma toxina de proteína usado como uma tal substância tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular em um gene de anticorpo em um gene de acordo com uma técnica de recombinação genética, de modo a permitir expressar como uma proteína simples (a proteína de fusão), é geralmente referida como uma imunotoxina.
[00300] Os exemplos da substância tendo atividade anti-tumor inclui doxorubicina, calicheamicina, mitomicina C, Auristatina E e isótopo radioativo (RI). Os exemplos da substância tendo atividade da morte celular inclui saporina, lisina, pseudomonas exotoxina, toxina de difteria e isótopo radioativo (RI). Desta, saporina e pseudomonas exotoxina são, preferivelmente, usadas. O tipo de RI tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular não é particularmente limitado e exemplos de tal RI inclui ººY, mn, 11, *H, *s, “Cc, *SRe, **F*Re, 1%ºRe, Vlu, Cu, 212Bj, 213Bj, UA, 1 AU, 2?4AC, 126, 19, "Br, 13mIn, RU, Ru, 1º3RU, 1ºSRy, "Hg, 2 Hg, BmTÇC, P2inTE, 122mTe, 125mTe, Tm, Tm, Tm, Ag, 19Pt, 1ººPq, sp, 33p, “Sc, Sm, Vu, 1º5Rh, 142Pr, 13Pr, Tp, 166Ho, 1ººAu, Co, Oo, Er, S%Fe, 1, "Se, 20 TI, 2? Ac, T6Br, sy, 16ºYpb, 166Dy, ?1?Pb e Ra.
[00301] Um método para produzir um conjugado de droga-anticorpo não é limitado. Por exemplo, um método de ligação de um anticorpo com um medicamento por intermédio de uma ligação de bissulfeto ou uma ligação de hidrazona é aplicada.
[00302] O anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado da presente invenção é excelente em termos da atividade de internalização nas células de tumor alvo que expressa hTROP-2. Desta maneira, previamente combinando uma substância tendo atividade anti-tumor e atividade de morte celular com o anticorpo anti-hTROP-2, este torna-se possível para permitir uma tal substância diretamente e altamente selecionado atua nas células de tumor. O conjugado de droga-anticorpo da presente invenção é extremamente excelente em termos da capacidade para liberar o agente as células de tumor alvo.
[00303] A atividade de internalização nas células pode ser avaliada pela rotulação fluorescente de um anticorpo com rodamina ou outros e então observa o comportamento migratório e localização do anticorpo usando-se um microscópio de fluorescência ou outros.
[00304] Além disso, na presente invenção, além do conjugado de droga- anticorpo anteriormente mencionado, também pode ser fornecido um fragmento de conjugado anticorpo-medicamento, em que o fragmento de anticorpo anteriormente mencionado é usado em vez de um anticorpo. Com relação aos detalhes de um tal fragmento de conjugado anticorpo-medicamento, as descrições do conjugado de droga-anticorpo anteriormente mencionado pode ser aplicado, como apropriado.
[00305] Em seguida, nas descrições da presente especificação, um tal fragmento de conjugado anticorpo-medicamento também é incluído no conjugado anticorpo-medicamento da presente invenção.
[00306] 5. Composição farmacêutica
[00307] O anticorpo anti-hTROP-2 e conjugado de droga-anticorpo da presente invenção são úteis como ingredientes ativos contido em uma composição farmacêutica.
[00308] A composição farmacêutica é útil como uma composição farmacêutica para tratamento e/ou diagnóstico de um tumor. Em particular, visto que o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção e um conjugado de droga- anticorpo que compreende o anticorpo anteriormente mencionado tem atividade inibidora excelente do desenvolvimento tumoral tal como atividade anti-tumoral, estes são, preferivelmente, usado no tratamento de tumor. Isto é para dizer, o anticorpo anti-hTROP-2 e conjugado de droga-anticorpo da presente invenção são úteis como os ingredientes ativos contidos em um agente terapêutico tumoral e um agente de diagnóstico tumoral. É notado que o tratamento descrito acima do tumor inclui a inibição de desenvolvimento tumoral e supressão de desenvolvimento tumoral. Especificamente, se este é um agente terapêutico tumoral, os exemplos do agente terapêutico tumoral incluem um inibidor de desenvolvimento tumoral e um supressor de desenvolvimento tumoral.
[00309] É preferível fornecer a composição farmacêutica da presente invenção na forma de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti- hTROP-2 e/ou conjugado de droga-anticorpo da presente invenção como ingredientes ativos e ainda compreende um carregador farmacologicamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada em combinação com os agentes anti-tumor conhecidos. Para um tal uso combinado, um efeito anti-tumor maior pode se obtido.
[00310] As doenças alvos (tumores), em que a composição farmacêutica da presente invenção é aplicada, inclui: os vários tipos anteriormente mencionados dos tumores humanos conhecidos, em que a expressão de hTROP-2 foi previamente confirmado. Entre outros, um ou dois ou mais tipos selecionados de vários tipos de tumores humanos tal como câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano são particularmente preferíveis. Tal doença alvo pode ser uma doença simples, ou dois ou mais doenças podem ser desenvolvidas em combinação. Além disso, o tumor alvo pode ser um câncer recorrente ou um câncer metastático. A composição farmacêutica da presente invenção (ainda, o anticorpo anti-hTROP-2 e/ou conjugado de droga-anticorpo da presente invenção) pode ser efetivamente usado como um agente terapêutico e um agente diagnóstico por um câncer recorrente ou um câncer metastático.
[00311] Exemplos do “carregador farmacologicamente aceitável” inclui um excipiente, um diluente, um extensor, um desintegrador, um estabilizador, um preservante, um tampão, um emulsificador, um aromático, um agente de coloração, um adoçante, um espessador, um corretor, um solubilizador e outros aditivos. Usando-se um ou mais tipos de tais carregadores, uma composição farmacêutica pode ser preparada na forma de uma injeção, um agente líquido,
uma cápsula, uma suspensão, uma emulsão, um xarope, etc. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas oralmente ou parenteralmente. Outra forma para administração parenteral é, por exemplo, uma injeção que compreende um ou mais ingredientes ativos, que é preparado por um método usual. Uma tal injeção pode ser produzida para dissolver ou recolocar em suspensão o presente anticorpo em um carregador farmacologicamente aceitável tal como uma solução salina normal ou uma água destilada comercialmente disponível usada pela injeção.
[00312] Em particular, quando um fragmento de anticorpo derivado a partir do anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção (particularmente, um fragmento de anticorpo com um peso molecular baixo) é administrado em um corpo vivente, um sistema de dispersão coloidal pode ser usado além dos componentes anteriormente mencionados. Um tal sistema de dispersão coloidal é antecipado para ter um efeito de intensificar a estabilidade de um composto (um fragmento de anticorpo) em um corpo vivente ou um efeito de transportar eficientemente um tal composto em um órgão específico, tecido ou célula. O tipo de um tal sistema de dispersão coloidal não é limitado, contanto que este é comumente usado. Exemplos de um tal sistema de dispersão coloidal inclui os sistemas de dispersão que compreende, as bases, polietileno glicoli/ um conjugado macromolecular, um agregado macromolecular, uma nanocápsula, microesfera, pérolas e lipídeos incluindo um óleo no emulsificador de água, micela, micela misturada e lipossomo. Exemplos preferidos de um tal sistema de dispersão coloidal inclui lipossomos múltiplos e as bexigas da membrana artificial, que tem um efeito do transporte eficientemente tal como um composto em um órgão específico, tecido ou célula (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al,, Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
[00313] A dosagem da composição farmacêutica da presente invenção difere dependente da idade, sexo, peso corporal e sintomas de um paciente, efeitos terapêuticos, um método de administração, um tempo de tratamento, os tipos do anticorpo anti-hTROP-2 e conjugado de droga-anticorpo da presente invenção contido na composição farmacêutica, etc. Em geral, a presente composição farmacêutica pode ser administrada dentro de uma faixa entre 600 ug e 6.000 mg por adulto pela administração. Entretanto, a dosagem não é limitada a faixa anteriormente mencionada.
[00314] Em um caso em que a composição farmacêutica é administrada na forma de uma injeção, por exemplo, pode ser administrada em uma dosagem de
100 ug a 100 mg, pela administração, pelo peso corporal de um paciente humano, um vez ou dividido nas diversas administrações, como uma dosagem diária média. Preferivelmente, a composição farmacêutica pode ser administrada uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada dez dias, ou uma vez a cada duas semanas, ou por uma administração simples (em que o número total de administração é 1). Exemplos da forma de dosagem inclui injeção intravenosa, injeção subscutânea, injeção intradérmica, injeção intramuscular e injeção intraperitoneal. Desta injeção intravenosa é preferível. Além disso, uma tal injeção pode ser preparada na forma de um diluente não aquoso (por exemplo polietileno glicol, óleo vegetal tal como óleo de oliva, álcoois tal como etanol, etc.), uma suspensão, ou uma emulsão. Uma tal injeção pode ser esterilizada pela esterilização mecânica usando-se um filtro, a mistura de um microbicida, etc. A injeção pode ser produzida na forma de uma injeção a ser preparada antes do uso. Isto é, uma composição sólida esterilizada é preparada pelo método congelamento-secagem ou outros e a composição é então dissolvida na água destilada esterilizada usada pela injeção ou outros solventes antes deste ser usado, de modo que este pode ser então usado.
[00315] A presente invenção fornece o uso do anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado e/ou conjugado de droga-anticorpo da presente invenção na produção de um agente farmacêutico (um medicamento) para tratar e/ou diagnosticar um tumor. Além disso, a presente invenção fornece o anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado e/ou conjugado de droga- anticorpo da presente invenção, que são usadas para tratar e/ou diagnosticar um tumor.
[00316] Além disso, a presente invenção fornece um método para tratar e/ou diagnosticar um tumor, que é caracterizado naquele que compreende usando-se (isto é, adminitrar aos pacientes) o anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado e/ou conjugado de droga-anticorpo da presente invenção. Além disso, a presente invenção também fornece o uso do anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado e/ou conjugado de droga-anticorpo da presente invenção no tratamento e/ou diagnóstico do tumor.
[00317] 6. Método para detectar o tumor
[00318] O método para detectar um tumor da presente invenção é caracterizado naquele que compreende permitir o anticorpo anti-hTROP-2 anteriormente mencionado da presente invenção reaja com a amostra coletada a partir de um corpo vivente (em seguida referido como uma amostra biológica) e detecta os sinais do anticorpo reagido.
[00319] Como descrito acima, hTROP-2 foi confirmado ser especificamente expressado em vários tipos de células de tumor. Desta maneira, hTROP-2 e, particularmente, hTROP-2 livre (uma porção da regiaô extracelular de hTROP-2) pode ser usada como um marcador para vários tipos de tumores. Em particular, tal NTROP-2 pode ser preferivelmente usado como um marcador para o câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano e câncer de mama humano.
[00320] Visto que o anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção é permitido para reagir com uma amostra biológica e um sinal do anticorpo reagido é então detectado, de modo a detectar um tumor. O sinal de anticorpo obtido pode ser usado como um indicador da quantidade de um antígeno na amostra biológica (isto é, uma quantidade hTROP-2 ou uma quantidade hTROP-2 livre). Em detecção de um tumor usando-se o anticorpo da presente invenção, primeiro, uma amostra biológica coletada como um analito a partir de um paciente, tal como a seção do tecido ou sangue usado como um alvo testado, é permitido para ligar ao anticorpo da presente invenção por uma reação de anticorpo de antígeno. Subsequentemente, com base nos resultados de medição da quantidade do anticorpo de ligação, a quantidade de um antígeno de interesse contido na amostra biológica é medida. Esta medição pode ser realizada de acordo com os métodos de imunoensaios conhecidos. Por exemplo, um método de imunoprecipitação, um método de imunoaglutinação, radioimunoensaio, imunonefelometria, um método de Western blot, citometria de fluxo e outros pode ser usado. No radioimunoensaio, um anticorpo marcado é usado e desta maneira um sinal de anticorpo é expressado como a quantidade do anticorpo marcado que é diretamente detectado. De outra maneira, uma concentração cujo anticorpo ou titulador de anticorpo foi conhecido pode ser usados como uma solução padrão e desta maneira um sinal do anticorpo alvo pode ser expressado como um valor relativo. Isto é, tanto a solução padrão quanto o analito podem ser medidos usando-se um dispositivo de medição e um sinal de anticorpo na amostra biológica podem ser expressados como um valor relativo ao valor da solução padrão usado como um critério. Exemplos de tal radioimunoensaio inclui o método ELISA, o método El, o método RIA, imunoensaio de fluorescência (FIA) e imunoensaio de luminscência. Deste o método ELISA é particularmente preferível naquele é simples e altamente sensível.
[00321] Na presente invenção, o estado de um tumor pode ser avaliado ou diagnosticado, usando-se o resultado de detecção obtido pelo método de detecção anteriormente mencionado como um indicador. Por exemplo, quando o resultado de detecção excede um valor padrão pré-determinado, o estado de um tumor é definido como tumor positivo e quando o resultado de detecção é menor do que o valor padrão pré-determinado, este é definido como tumor negativo. No caso do tumor positivo, é determinado que certo tipo de tumor deve ser desenvolvido e desta maneira o estado do tumor pode ser avaliado. O termo “o estado do tumor” é usado neste para significar a presença ou ausência do desenvolvimento de um tumor, ou o grau de progressão deste. Desta maneira, os exemplos específicos do estado do tumor incluem a presença ou ausência do desenvolvimento de um tumor, o grau de progressão deste, o grau de nocividade, a presença ou ausência de metástase e a presença ou ausência de recorrência.
[00322] Na avaliação anteriormente mencionada, como um estado do tumor a ser avaliado, apenas um estado pode ser selecionado a partir dos exemplos anteriormente mencionados ou exemplos múltiplos podem ser combinados e selecionados. A presença ou ausência de um tumor pode ser avaliada pela determinação se ou não o tumor foi desenvolvido, com referência ao valor padrão pré-determinado usado como um limite, com base no resultado de detecção obtido. O grau da nocividade é usado como um indicador que indica o grau de progressão do câncer. Com base no resultado da detecção, o tumor alvo pode ser classificado em certos estágios da doença e este pode ser avaliado. De outra maneira, precocemente um câncer e um câncer avançado pode ser distinto a partir de cada outro e então estes podem ser avaliados. Por exemplo, também é possível determinar o tumor alvo como um câncer precoce ou um câncer avançado, usando-se o resultado de detecção como um indicator. A metástase do tumor pode ser avaliada pela determinação se ou não o neoplasma apareceu em um local à parte a partir da posição da lesão inicial, usando-se o resultado de detecção como um indicador. A recorrência pode ser avaliada pela determinação se ou não o resultado de detecção excedeu o valor padrão pré-determinado novamente após o estágio de intervalor ou remissão.
[00323] 7. Kit para detecção ou diagnóstico do tumor
[00324] O anticorpo anti-hTROP-2 da presente invenção pode ser fornecido na forma de um kit para detectar ou diagnosticar um tumor. O kit da presente invenção que compreende uma susbtância de rotulação, um reagente de fase sólida em que o anticorpo ou o anticorpo marcado foi imobilizado, etc., bem como o anticorpo anteriormente mencionado. Uma substância de rotulação que rotula o anticorpo significa uma substância rotulada com uma enzima, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto quimioluminescente, etc. O kit da presente invenção também pode compreender outros reagentes usados pela realização da detecção da presente invenção, além dos elementos constitucionais anteriormente mencionados. Por exemplo, quando uma tal substância de rotulação é uma substância de rotulação de enzima, o kit da presente invenção pode compreender um substrato de enzima (um substrato cromogênico, etc.), an substrato da solução que dissolve enzima, uma solução de interrupção de reação de enzima, um diluente usado pelos analitos, etc. Além disso, o presente kit ainda pode compreender vários tipos de tampões, água esterilizada, vários tipos de recipientes de cultura celular, vários tipos dos reatores (um tubo Eppendorf, etc.), um agente de bloqueio (um componente de soro tal como albumina de soro bovino (BSA), leite desnatado, ou soro de cabra), um agente de lavagem, um tensoativo, vários tipos de placas, um antisséptico tal como azida sódica, um manual de operação experimental (instrução), etc.
[00325] O kit da presente invenção pode ser efetivamente usado para realizar o método de detecção anteriormente mencionado da presente invenção e desta maneira é extremamente útil.
[00326] Em seguida, a presente invenção será mais especificamente descrita nos seguintes exemplos. Entretanto, estes exemplos não são pretendidos limitar o escopo da presente invenção.
[00327] Exemplo 1
[00328] Clonagem do gene hTROP-2
[00329] Um gene hTROP-2 de comprimento total foi isolado a partir do fígado fetal humano (embrião de 10 semanas de idade) de acordo com um método RT- PCR. Primeiro, os seguintes iniciadores PCR foram projetados com base na sequência de um gene hTROP-2 (Acessão Genbank Nº. NM 002353).
[00330] Iniciador avançado: 5'-ttectecgececaceatage-3' (SEQ ID Nº: 3)
[00331] Iniciador reverso: 5'-ctegagcaagctegagttecttteto-3' (SEQ ID Nº: 4)
[00332] Quando estes iniciadores foram projetados, uma sequência digerida por enzima de restrição Xhol exceto por um códon de interrupção foi adicionado ao iniciador reverso. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total (TAKARA) preparado a partir do fígado fetal humano (embrião de 10 semanas de idade). Usando este cDNA como um modelo, uma reação de PCR foi realizada com os iniciadores anteriormente mencionados. Em seguida, o desenvolvimento pela eletroforese em gel de agarose e extração de um grupo de interesse foram realizados e foi então clonado em um vetor pCRII (Invitrogen) (pCRII-hTROP-2). O cDNA hTROP-2 clonado foi confirmado pelo sequenciamento.
[00333] Um vetor de expressão foi construído pela clivagem de um fragmento EcoRI/Xhol que compreende um gene hTROP-2 de pCRII-hTROP-2 e então inserindo o fragmento no local EcoRI/Xhol de um vetor pcDNA4/myc-HisO
(Invitrogen) (pcDNA4-hTROP-2-myc/His). - Além disso, um fragmento Hindlll/Pmel que compreende um gene hTROP-2 foi cortado de pcDNA4- hTROP-2-myc/His (em que a porção de clivagem Hindlll foi de extremidade abrupta) e o fragmento foi então inserido em um local Pmel de um vetor pcDNA3.1(+) (Invitrogen), deste modo a construir um vetor de expressão que compreende um gene de resistência a neomicina (pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His).
[00334] Exemplo 2
[00335] Contrução da linhagem celular capaz de expressar estavelmente o gene hTROP-2
[00336] O vetor de expressão (pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His) que codifica o cDNA de comprimento total de hTROP-2, que foi produzido pelo método descrito acima, foi introduzido nas células HEK293 (RIKEN), células HuH-7 (HSRRB), células 7E2-C (descritas no WO 2005/052156) e células CHO-K1 (HSRRB), usando um reagente de lipofectamina 2000 (Invitrogen) e seleção foi então realizada usando um antibiótico G418 (geneticina; GIBCO BRL). Portanto, a linhagem celular, que estavelmente expressa hTROP-2, foi estabelecida e obtida.
[00337] Exemplo3
[00338] Produção da proteína recombinante da região extracelular hnTROP-2
[00339] Um fragmento do gene que codifica uma porção da região extracelular de hTROP-2 (especificamente, uma região que consiste de aminoácidos nas posições 1 a 263 a partir da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 2) foi amplificada por um método PCR. Os seguintes iniciadores foram usados na amplificação.
[00340] Iniciador avançado: 5'-ttectecgececaceatage-3' (SEQ ID Nº: 3)
[00341] Iniciador reverso: 5'-ctegagctegtecaggtaatagatgageg-3' (SEQ ID Nº: 5)
[00342] Nesta operação, a sequência digerida por enzima de restrição Xho! foi adicionada ao iniciador reverso. O fragmento de DNA amplificado pelo método PCR foi desenvolvido pela eletroforese em gel de agarose e foi então purificado usando kit de extração em gel QIAquick (marca registrada) (QIAGEN). O fragmento de DNA purificado foi subclonado em um vetor pCR Blunt (Invitrogen) (PCRB-hTROP-2 EC) e a sequência do gene foi confirmada. Subsequentemente, um fragmento EcoRI/Xhol que compreende o fragmento do gene que codifica a região extracelular de hTROP-2 foi cortado de pPCRB-hTROP-2 EC e foi então inserido no local EcoRI/Xhol de um vetor pcDNA4/myc-HisO (Invitrogen) (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). Aind, a fim de produzir um local de clivagem de enzima de restrição Nrul, os seguintes oligonucleotídeos foram associados e inseridos no local BamHI/EcoRI de pc/DNA4mH-hTROP-2 EC.
[00343] Oligonucleotídeo 1: 5'-gatccactagtegegagtagtag-3' (SEQ ID Nº: 6)
[00344] Oligonucleotídeo 2: 5'-aatteccaccactegegactagta-3' (SEQ ID Nº: 7)
[00345] Igualmente, um ligador pBgl Il (TAKARA) foi inserido no local Pmel de pcDNA4mH-hTROP-2 EC (pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC). A fim de produzir uma proteína recombinante usando baculovírus, um fragmento Nrul/Bglll que compreende o fragmento do gene que codifica a região extracelular de hTROP- 2 foi cortado de pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC e foi então inserido no local Nrul/Bglll de um vetor pPSC8 (Nosan Corporation) (pPSC8-hTROP-2 EC). À produção da proteína recombinante da região extracelular de hTROP-2 usando baculovírus foi delegada a Nosan Corporation.
[00346] A proteína recombinante da região extracelular de hTROP-2 foi purificada como seguem. Ni Sefarose 6 fluxo rápido (GE Healthcare Biosciences) foi adicionado a um sobrenadante de cultura que compreende a proteína recombinante, de modo que etes foram permitidos ligar em cada outros a 4º C por 2 horas. Portanto, o resultante foi lavado com um tampão de fosfato contendo 20 mM de imidazol, utilizando EconoColumn (BIO RAD) e foi então eluído com um tampão de fosfato contendo 300 mM de imidazol, de modo que este foi purificado.
[00347] Exemplo 4
[00348] Isolamento de EpCAM cDNA humano e contrução do vetor de expressão
[00349] Um gene EDPCAM humano de comprimento total foi isolado a partir do fígado fetal humano (embrião de 10 semanas de idade) de acordo com um método RT-PCR. Primeiro, os seguintes iniciadores PCR foram projetados com base na sequência de um gene EpCAM humano (Acessão Genbank Nº. NM 002354).
[00350] Iniciador avançado: 5'-tectegtgteccactecegg-3' (SEQ ID Nº: 8)
[00351] Iniciador reverso: 5'-ctegagtgcattgagttecctatae-3' (SEQ ID Nº: 9)
[00352] Quando estes iniciadores foram projetados, a sequência digerida por enzima de restrição Xhol exceto por um códon de interrupção foi adicionado ao iniciador reverso. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total (TAKARA) a partir do fígado fetal humano (embrião de 10 semanas de idade). Usando este cCDNA como um modelo, uma reação de PCR foi realizada com os iniciadores anteriormente mencionados. Portanto, o desenvolvimento pela eletroforese em gel de agarose e extração de um grupo de interesse foram realizados e foram então clonados em um vetor pCRII (Invitrogen) (pCRII-hEpCAM). O cDNA humano EpCAM clonado foi confirmado pelo sequenciamento.
[00353] Um vetor de expressão foi construído pela clivagem de um fragmento
EcoRI/Xhol que compreende um gene EpCAM humano de pCRII-hEpcAM e então inserindo o fragmento no local EcoRI/Xhol de um vetor pc/DNA4/myc-HisO (Invitrogen) (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). Além disso, um fragmento Hindlll/Pmel que compreende um gene EpCAM humano foi cortado de pc/DNA4-hEpCAM- myc/His (em que a porção de clivagem Hindlll foi de extremidade abrupta) e o fragmento foi então inserido no local Pmel de um vetor pcDNA3.1(+) (Invitrogen), deste modo a construir um vetor de expressão que compreende um gene de resistência a neomicina (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His).
[00354] Exemplo 5
[00355] Produção do anticorpo monoclonal anti-hTROP-2
[00356] Como imunogênios, aqui estavam as linhagens celulares usadas capazes de estavelmente expressar as células hTROP-2 (HEK293-hTROP-?2, células CHO-K1I-hTROP-2 e células 7E2-C-hTROP-2); linhagem celular de câncer pancreático humano endogenosamente expressando uma proteína hTROP-2 na superfície celular (PK-59, RCB1901; adquirido do banco celular RIKEN); e a proteína recombinante da região extracelular de hTROP-2 produzida pelo método descrito acima.
[00357] No caso das linhagens celulares capazes de estavelmente expressar hTROP-2, células 1 x 10º foram usadas e no caso da proteína hTROP-2 recombinante, 20 ug da proteína foi usada. As linhagens celulares ou a proteína recombinante foi misturada com um adjuvante TiterMax Gold (Funakoshi Corporation) em uma razão da mistura de 1 : 1, de modo a preparar uma emulsão. A emulsão foi então injetada nas duas almofadas das patas ou cavidade abdominal de um camundongo (C57/BL6, Balb/c) (imunização inicial). Quando a imunização foi realizada pela injeção nas duas almofadas das patas por um período curto de tempo, intensificador foi realizado três a dez dias após a imunização inicial. No dia seguindo a imunização final, linfonodos foram coletados a partir de ambos os joelhos e linfócitos foram então preparados. Quando a imunização foi realizada pela injeção na cavidade abdominal por um longo período de tempo, intensificadores foram realizados nos intervalos de uma vez por semana após a imunização inicial (em que os intensificadores foram realizados por 1 a 2 meses). Portanto, as células B foram isoladas a partir do baço de acordo com um método comum. No caso da imunização usando células como imunogênios, uma suspensão celular que foi PBS contendo células 5 x 10º foi usado pelos intensificadores. No caso do uso de uma proteína como um imunogênio, 5 ug de uma solução PBS foi usada.
[00358] Os linfócitos preparados foram misturados com uma linhagem celular de mieloma de camundongo (P3-X63-Ag8.653) em uma razão da mistura de 3 :
1 e fusão celular foi então realizada de acordo com um método de polietileno glicol. Portanto, as células fundidas foram cultivadas por 7 a 28 dias em um meio de metil celulose (nome comercial: ClonaCell-HY Meio de clonagem D; Célula tronco), no qual o HAT contido (hipoxantina, aminopterina e timidina). As colônicas simples do desenvolvimento dos hibridomas foram cada um selecionados e colocados em uma placa da parte superior de fundo plano de 96 reservatórios e usando um meio seletivo líquido contendo HAT, os hibridomas foram cultivados em uma incubadora CO2 a 5 %. Um sobrenadante de cultura que desenvolve os hibridomas a partir das colônias simples foi submetida a uma avaliação primária por intermédio de ELISA celular (descrito por último) e então em uma avaliação secundária por intermédio da análise FACS usando as células HuH-7-hTROP-2, PK-59, portanto estabelecendo os 300 tipos de hibridomas, que produzem anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 que reconhece as proteínas hTROP-2 expressadas na superfície celular das células viventes.
[00359] Exemplo 6
[00360] Avaliação primária usando ELISA celular
[00361] As células CHO-K1 (controle negativo hTROP-2; adquirido de Japan Health Sciences Foundation) e células CHO-K1I-hTROP-2 (ou células HUH-7
(controle negativo hTROP-2; adquirido de Japan Health Sciences Foundation) e células HuH-7-hTROP-2) foram alternativamente inoculadas em uma placa de cultura de 96 reservatórios (BD Falcon) em uma densidade celular de 3 x 10º células/reservatório e as células foram então cultivadas em uma atmosfera CO2 a 5% a 37º C por 1 a 2 dias. O meio de cultura celular foi removido pela decantação. Portanto, as células foram lavadas com PBS gelado e foram então tratados com 4 % de paraformaldeído-PBS por 5 minutos, de modo que as células foram imobilizadas. As células foram lavadas com PBS no qual foram esfriadas em gelo e uma placa ELISA foi então preparada. Portanto, ELISA foi realizada de acordo com um método comum. Os procedimentos específicos serão descritos abaixo.
[00362] Primeiro, o bloqueio com uma solução de PBS de leite desnatado a 2 % foi realizada em temperatura ambiente por 30 minutos a 1 hora. Subsequentemente, o hibridoma sobrenadante de cultura foi adicionado a este e estes foram então reagidos em temperatura ambiente por 1 hora. Portanto, o resultante foi lavado com uma solução de Tween20-PBS a 0,1 % três vezes. Como um anticorpo secundário, IgG anti-ccamundongo marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (GE Healthcare Biosciences), que foi 1000 vezes diluído com uma solução de bloqueio, foi adicionado ao resultante e estes foram então reagidos em temperatura ambiente por 1 hora. Portanto, o resultante foi lavado com uma solução de Tween20-PBS a 0,1 % três vezes. Uma solução de substrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina: SIGMA) foi adicionada a solução de reação para realizar uma reação de cor e a reação foi então terminada pela adição de 1 M do ácido sulfúrico. Portanto, absorbância (405 nm) foi medida usando Modelo 550 leitor de microplaca (BIO RAD). Os hibridomas correspondentes a um sobrenadante de cultura de hibridoma exibindo um valor de absorbância alta ao controle negativo foram submetidos a uma cultura de escala ampla em uma placa da parte funda plana de 24 reservatórios e foram então submetidas em uma avaliação secundária usando análise FACS.
[00363] Exemplo 7
[00364] Avaliação secundária usando análise FACS
[00365] Os hibridomas, que foram observados positivos na avaliação primária descrita acima usando ELISA celular, foram submetidos a uma avaliação secundária usando análise FACS. Na avaliação das células de hibridoma, células HuH-7, que foram células de câncer hepático humanas que não expressam hTROP-2, foram usadas como células de controle negativo e a reatividade com células HuH-7-hTROP-2, que expressaram estavelmente hTROP-2, foi usada como um indicador. Então, a avaliação foi realizada com base na reatividade com células PK-59 (RCB1901; adquirido do banco celular RIKEN), que foram células cancerígenas —pancreática humana endogenosamente expressando uma proteína hTROP-2 na superfície celular.
[00366] As células foram removidas a partir do disco de cultura por um tratamento de tripsina e uma suspensão celular foi então preparada (densidade celular: 2 x 10º células/mL). O hibridoma sobrenadante de cultura, que exibiu positivo na avaliação primária usando ELISA celular, foi reagido com 100 ul da suspensão celular a 4º C por 20 minutos. A mistura de reação foi lavada com PBS e foi então reagida com IgG de camundongo marcado com PE (BD Pharmingen) (0,1 ug) (4º C, 30 minutos). Portanto, a mistura de reação foi analisada usando FACSCAalibur (Becton, Dickinson and Company).
[00367] Eventualmente, aproximadamente 300 tipos de hibridomas, que produzem um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 reconhece uma proteína hTROP-2 expressada na superfície celular das células viventes, foram estabelecidas.
[00368] Exemplo8
[00369] Identificação do isotipo
[00370] O isotipo do anticorpo monocional anti-hTROP-2 produzido foi identificado usando KIT DE TESTE DE ISOTIPAGEM DE ANTICORPO MONOCLONAL DE CAMUNDONGO (Serotec) de acordo com um método incluído com o kit mencionado acima.
[00371] Exemplo 9
[00372] Formação de Ascite e purificação do Anticorpo TROP-2
[00373] Os clones de hibridoma produzidos pelo método descrito acima foram administrados em uma densidade de 3 x 10º clones na cavidade abdominal em um camundongo nu BALB/c, em que 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) foi previamente administrado (sete dias antes). Duas semanas posteriores, ascite foi coletado. Além disso, estes ascite foram submetidos a precipitação do ácido caprílico e então a purificação por afinidade usando uma coluna de protéina G (proteína HiTrap G; GE Healthcare Biosciences) ou uma coluna de proteína A (proteína HiTrap A; GE Healthcare Biosciences), de modo a obter os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 a partir dos clones de hibridoma individual.
[00374] Exemplo 10
[00375] Medição da afinidade de ligação de antígeno (medição do valor Kd)
[00376] A afinidade de ligação de antígeno (Valor Kd) do anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 gerado foi calculada por um método usando ELISA
(Djavadi-Ohaniance L. et al (1996), In Anticorpo Engineering, Capítulo 4, pp. 77-
97. IRL Press, Oxford).
[00377] Especificamente, a proteína hTROP-2 recombinante purificada (0,1 ug/mL) foi adicionada a uma placa de cultura de 96 reservatórios (Corning) de modo que como a placa foi revestida com o antígeno (em temperatura ambiente por 1 hora, ou em 4º C durante a noite). Subsequentemente, o resultante foi lavado com PBS três vezes e 2 % de leite desnatado (Solução PBS) foi então adicionada a este para bloqueá-lo (em temperatura ambiente por 1 hora). O resultante foi lavado com PBS duas vezes. Portanto, um complexo de anticorpo de antígeno que foi previamente formado pela mistura de uma solução de antígeno (uma proteína hTROP-2 purificada; 50, 25, 12,5, 6,25, ou 3,125 nM) com cada clone (0,5 nM) do anticorpo monocional anti-hTROP-2 e então equilibrando a mistura, foi adicionado à placa ELISA descrita acima e estes foram reagidos (em temperatura ambiente por 1 hora). O produto de reação foi lavado com PBS três vezes e foi então reagido com IgG anti-camundongo marcado com HRP (concentração final: 1 ug/mL) (GE Healthcare Biosciences) diluído com uma solução de bloqueio (em temperatura ambiente por 1 hora). Subsequentemente, o produto de reação foi lavado com uma solução de Tween20-PBS a 0,1 % três vezes e uma solução de substrato TMB (3,3',5,5'-
tetrametilbenzidina: SIGMA) foi então adicionada ao resultante para realizar uma reação de cor. Então, 1 M de ácido sulfúrico foi adicionado ao produto de reação para finalizar a reação. Usando o Modelo 550 leitor de microplaca (BIO RAD), a absorbância foi medida.
[00378] As seguintes expressões de cálculo foram usadas para medir constante de dissociação (Kd).
[00379] De acordo com a lei da ação de massa, uma reação de anticorpo de antígeno é representada pelas seguintes expressões.
[00380] k1 Ag (Antígeno) + Ab (Anticorpo) & Ag-Ab (Complexo de Antígeno-Anticorpo) (1)
[00381] k2 Kd = k2/k1 = AgfxAbf / Ag-Ab = AgfxAbf / x (2)
[00382] Na expressão (2), Agf representa a concentração de uma antígeno livre, Abf representa a concentração de um anticorpo livre e Ag-Ab representa a concentração de um complexo de anticorpo de antígeno. Se Ag-Ab = x, a concentração de anticoropo livre é representada pela seguinte expressão. Abf = Abt — x -------(3)
[00383] A expressão acima (2) portanto pode ser Kd= Agf x(Abt—x) / x (4)
[00384] Se ambos termos da expressão (4) são multiplicados por x / KdxAbt, x / Abt = Agfx(1 —x/Abt)x1/Kd x/Abtx1/Agf = (1 —x/Abt)x1/Kd (5)
[00385] SeX=x/AbteY =x/AbtxAgf na expressão (5), Y=(1-X)x1/Kd ++: ----(6)
[00386] Com base na expressão (6), o valor Kd foi calculado.
[00387] Os valores Kd dos clones de anticorpo monoclonal 300 anti-hTROP-2 gerados foram medidos pelo método descrito acima. Como um resultado, existem 133 clones exibindo um Valor Kd de 1 x 107º (M) ou menos, 59 clones exibindo um Valor Kd de 1 x 107! (M) ou menos e 2 clones exibindo um Valor Kd de 1 x 10? (M) ou menos.
[00388] Entre os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2, que exibiram atividade inibidora de desenvolvimento de tumor in vivo, os valores Kd de K5-70 (IgG2a de camundongo), T6-16 (IgG2a de camundongo), K5-107 (I9G1 de camundongo), K5-116-2-1 (lgG2a de camundongo) e T5-86 (I9G1 de camundongo) foram observados ser 6,8 x 10? (M), 4,3 x 10? (M), 4,7 x 107? (M), 2,69 x 10 (M) e 8,49 x 10 (M), respectivamente (Figura 1 e tabela 1).
[00389] Tabela 1
[00390] Valores Kd dos anticorpos monoclonais anti-hTROP-2
[00391] Exemplo 11
[00392] Reatividade dos anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 com linhagens celulares de câncer humano
[00393] As linhagens celulares de câncer humano (linhagens celulares de tumor humano) usados nestes estudos foram adquiridos de Health Science Research Resources Bank (HSRRB), banco celular RIKEN (RIKEN), ATCC (American Type Culture Collection) ECACC (European Collection of Cell Cultures) e DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Especificamente, as seguintes linhagens celulares cancerígenas foram usadas.
[00394] huH-1 (HSRRB), HUH-6 (HSRRB), HuH-7 (HSRRB), JHH-5 (HSRRB), JHH-6 (HSRRB), JHH-7(HSRRB), HLE (HSRRB), HLF (HSRRB), HepG2 (HSRRB), Alexander (HSRRB), KP-1N (HSRRB), KP-INL (HSRRB), KP-2 (HSRRB), KP-3 (HSRRB), KP-3L (HSRRB), PK-1 (RIKEN), PANC-1 (RIKEN), MIA PaCa-2 (HSRRB), PK-59 (RIKEN), PK-45H (RIKEN), PK-45P (RIKEN), BxPC-3 (ATCC), SUIT-2 (HSRRB), TCC-PAN2 (HSRRB), SW480 (ATCC), DLD- 1 (HSRRB), LoVo (HSRRB), COLO-320 (RIKEN), CACO-2 (RIKEN), CW-2 (RIKEN), HCT 116 (ATCC), HCC-56 (HSRRB), MCF-7 (HSRRB), JIMT-1 (DSMZ),
HCC1143 (ATCC), A549 (HSRRB), DU145 (RIKEN) e PC-3 (HSRRB).
[00395] As células cancerígenas foram removidas a partir do disco de cultura por um tratamento de tripsina e a suspensão celular foi então preparada (densidade celular: 2 x 10º células/mL). Um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 (0,1 ug) foi adicionado a 100 ul da suspensão celular e estes foram então reagidos a 4º C por 20 minutos. A solução de reação foi lavada com PBS e foi então reagida com IgG anti-ccamundongo marcado com PE (BD Biosciences Pharmingen) (0,1 ug) (a 4º C por 30 minutos). Portanto, o resultante foi analisada por FACSCAalibur (Becton, Dickinson and Company).
[00396] Todos dos anticorpos anti-hTROP-2 gerados não liga a uma linhagem celular de câncer hepático humano HuH-7, que não endogenosamente expressa hTROP-2. De outra maneira, os anticorpos anti-hTROP-2 ligam as células HuH- 7-hTROP-2, em que um gene hTROP-2 foi estavelmente expressado (Figura 2). Subsequentemente, a reatividade dos anticorpos monoclionais anti-hTROP-2 gerados com as linhagens celulares de câncer humano (em que uma proteína hTROP-2 foi endogenosamente expressada na superfície celular) foi examinada pela análise FACS. Como um resultado, os 300 tipos de anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 gerados todos ligados as linhagens celulares de câncer pancreático humano (PK-59 e BxPC-3). Em particular, anticorpos K5-70, T6-16,
K5-107, K5-116-2-1 e T5-86, que exibiram atividade inibidora de desenvolvimento de tumor in vivo, todos ligam as linhagens celulares de câncer humano nos níveis altos. Por exemplo, quando comparado com um caso em que as linhagens celulares cancerígenas foram reagidas com apenas IgG anti- camundongo marcado com PE (BD Biosciences Pharmingen), os anticorpos anteriormente mencionados exibindo a seguinte capacidade de ligação as células PK-59 e as células BxPC-3 na intensidade da fluorescência média: K5- 70 (44 vezes), T6-16 (59 vezes), K5-107 (89 vezes), K5-116-2-1 (122 vezes) and T5-86 (15 vezes) (as células PK-59; Figura 3); e K5-70 (45 vezes), T6-16 (25 vezes), K5-107 (90 vezes), K5-116-2-1 (121 vezes) e T5-86 (10 vezes) (as células BXPC-3; Figura 4).
[00397] Com relação as linhagens celulares de câncer humano outros do que PK-59 e BxPC-3, entre 12 tipos de linhagens celulares cancerígenas pancreáticas, os anticorpos monocionais anti-hTROP-2 ligam a KP-2, KP-3L, PK-1, PK-45H, SUIT-2 e TCC-PAN2 e não ligam a KP-1N, KP-INL, KP-3, PANC-1 e MIA-PaCa2 (Figura 5). Entre as linhagens celulares cancerígenas de cólon humano, os anticorpos monocilonais anti-hTROP-2 ligam a CACO-2, SWA480, DLD-1 e HCT 116 e não ligam a COLO-320 e CW-2 (Figura 6). Além disso, os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 ligam a JIMT-1 e HCC1143 (que foram ambas linhagens celulares cancerígenas de mama humano) e PC-3 e DU145 (que foram ambas linhagens celulares cancerígenas de próstata humana). Deste modo, estas proteinas hTROP-2 reconhecidas endogenosamente expressando na superfície celular de muitos tipos de linhagens celulares de câncer humano (Figura 6).
[00398] Exemplo 12
[00399] Reatividade cruzada com proteína TROP-2 de camundongo e proteína TROP-1/EpCAM humana
[00400] Para o propósito de examinar a especificidade dos anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 gerados, a reatividade de anticorpos com uma proteína TROP-2 de camundongo mostrando uma homologia de 80 % no nível de sequência do aminoácido com a proteína hTROP-2 e com uma proteína TROP-1/EpCAM humana mostrando a homologia de 50 % no nível de sequência do aminoácido com a proteína hTROP-2, foi examinada por análise FACS.
[00401] Especificamente, cada um de um vetor de expressão (TROP-2- pcDNA3.1(+) de camundongo, fornecido pelo Institute of Molecular and Cellular Biosciences, the University of Tokyo) que compreende o cDNA de comprimento total de um gene TROP-2 de camundongo (Acessão Genbank Nº. NM 020047, YO08830) e um vetor de expressão (pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His) que compreende o cDNA de comprimento total de um gene TROP-1/EpCAM humano (Acessão Genbank Nº. NM 002354), foi aleatoriamente introduzido nas células CHO-K1, usando reagente de Lipofectamina2000 (Invitrogen). Portanto, 24 a 48 horas depois, as células foram removidas a partir do disco de cultura pelo tratamento deste com tripsina e a suspensão celular foi então preparada. À suspensão celular deste modo preparada foi sucessivamente reagida com o anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 produzido (0,1 ug) e com IgG anti- camundongo marcado com PE e foi então analisado por FACSCAalibur.
[00402] Um anticorpo T2-102 (I9G1 de camundongo) usado como um controle positivo, que mostrou a reatividade cruzada com TROP-2 de camundongo, exibiu a capacidade de ligação alta às células CHO-K1 em que o gene TROP-2 de camundongo foi aleatoriamente expressado. De outra maneira, anticorpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 e T5-86 não mostram tal reatividade cruzada com TROP-2 de camundongo (Figura 7).
[00403] Similarmente, um anticorpo monoclonal anti-EpbCAM humano (BD Biosciences Pharmingen) usado como um controle positivo que exibe uma capacidade de ligação alta às células CHO-K1 em que o EpCAM/TROP-1 humano foi aleatoriamente expressado. De outra maneira, anticorpos K5-70, T6- 16, K5-107, K5-116-2-1 e T5-86 não mostram tal reatividade cruzada com
EpCAM/TROP-1 humano (Figura 8).
[00404] Os resultados anteriormente mencionados demonstrados que os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 gerados e em particular, anticorpos K5-70, T6-16, K5-107, K5-116-2-1 e T5-86, que exibiram atividade anti-tumor in vivo, especificamente ligam a hTROP-2.
[00405] Exemplo 13
[00406] Medição da atividade inibidora de desenvolvimento celular
[00407] Como um método de examinar a atividade do anticorpo monoclional anti-hTROP-2 para inibir a função de hTROP-2, a influência do anticorpo no desenvolvimento — celular das células cancerígenas humanas, que endogenosamente expressam hTROP-2 na superfície celular, foi avaliada pela medição do número de células viventes usando TetraColor ONE (Seikagaku Corporation). Especificamente, as células PK-59 foram recolocadas em suspensão em um meio RPMII640 contendo 0,5 % de soro bovino fetal (fabricado por BioWest) em uma concentração de 2 x 105º células/mL e 100 ul da suspensão celular preparada foi então adicionada em cada reservatório da placa de cultura de 96 reservatórios. Subsequentemente, IgG de camundongo (controle negativo) e anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 (concentração final: 0,1 e 1 ug/mL) foram adicionados aos reservatórios e as misturas foram então cultivadas a 37º C em uma incubadora CO2 a 5 % por 72 horas. Como um controle, um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 comercialmente disponível (clone YY01, Santa Cruz) foi usado. TetraColor ONE (Seikagaku Corporation) foi adicionado aos reservatórios e estes foram então reagidos em uma incubadora CO?2 a 5% por 1 a 2 horas. Após finalização da reação, a placa de cultura de 96 reservatórios foi diretamente submetida à medição da absorbância em um comprimento de onda de 490 nm (comprimento de onda de controle: 655 nm), usando Leitor de microplaca. O experimento foi realizado usando 3 reservatórios para cada grupo. Um teste de diferença significante foi realizado de acordo com o teste t de Student e P < 0,05 foi determinado a ser estatisticamente significante.
[00408] Entre os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2, que foi gerado por sua própria companhia de modo que, aproximadamente 160 clones foram examinadas pelo método descrito acima, em termos de seu efeito no desenvolvimento celular das células PK-59. Como um resultado, T6-16, T5-86, K5-70 e K5-107, que tem a atividade inibidora exibida de desenvolvimento de tumor in vivo, foram confirmadas ter a atividade inibidora de desenvolvimento celular de 20 % a 40 %, quando comparado com IgG de camundongo (controle negativo). Torna-se claro que estes anticorpos anti-hTROP-2 tem atividade para ligar as proteínas hTROP-2, que foram expressadas na superfície das células cancerígenas humanas, para neutralizar as proteínas hTROP-2 e para inibir o desenvolvimento das células cancerígenas (Figura 9).
[00409] Exemplo 14
[00410] Ensaio de arranhão
[00411] O efeito de um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 na capacidade migratória das células cancerígenas humanas foi avaliada por um ensaio de arranhão. As células PK-59 foram recolocadas em suspensão em um meio RPMI1640 contendo 10 % de soro bovino fetal em uma concentração de 3 x 10º células/mL e 100 ul da suspensão celular preparada foi então adicionada em cada reservatório da placa de cultura de 96 reservatórios. Quando as células tornam-se confluente, uma porção das células cultivadas de monocamada foi granulada, de modo que a placa foi arranhada em uma direção longitudinal com a extremidade de tampa. Um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 e IgG de camundongo usado como um controle negativo foram adicionados ao meio as concentrações finais de 0,1 e 1 ug/mL, respectivamente e a cultura foi então realizada por 24 horas. Antes da adição do anticorpo (Dia 0) e 24 horas após a cultura (Dia 1), a região granulada por célula foi fotografada e a distância entre as células foi então medida. Além disso, a área de uma tal região granulada foi quantificada usando o software Scion Image. O experimento foi realizado usando 8 reservatórios para cada grupo. Um teste de diferença significante foi realizado de acordo com o teste t de Student e P < 0,05 foi determinado a ser estatisticamente significante.
[00412] O efeito de um anticorpo hTROP-2 na capacidade migratória das células invadindo a região de arranhão foi examinada. Como com o ensaio de inibição do desenvolvimento celular, anticorpos tendo os efeitos benéficos foram avaliados. Como um método de avaliação, as células foram fotografadas no dia O (quando o anticorpo foi adicionado) e no dia 1 (24 horas após a adição do anticorpo) e a distância migratória (um) e a área de uma região de arranhão foram determinadas pela análise de imagem. Como um resultado, como mostrado na Figura 10, as diferenças claras foram observadas em termos da capacidade migratória das células. Os anticorpos T6-16 e K5-70, que foram usados no presente teste, tem atividade inibidora significante de desenvolvimento celular, quando comparado com o controle. Ainda em um teste de reprodutibilidade, a mesma tendência foi observada. Particularmente, T6-16 tem um resultado de P < 0,01 (pelo teste t de Student) e existem correlação observada no teste in vivo.
[00413] Exemplo 15
[00414] Avaliação dos efeitos benéficos de anticorpo anti-hTROP-2 monoclonal nos camundongos que carregam o tumor
[00415] Modelo de prevenção
[00416] As linhagens celulares cancerígenas pancreáticas (PK-59 e BxPC-3), que expressam hTROP-2, foram coletadas pelo tratamento com tripsina e PBS foi adicionado para preparar a suspensão celular tendo uma concentração de 1 x 10º células/mL. Deste modo a suspensão celular preparada foi misturada com uma quantidade igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) em gelo. Usando uma seringa 26 G, 100 ul da mistura obtida (5 x* 10º células) foi injetada na subcutis do flanco direito de cada um do camundongo nu fêmea de 6 semanas de idade (Balb/c, nu/ínu), No dia do transplante das células cancerígenas (Dia 1) os camundongos foram divididos nos grupos e administração do anticorpo (1, 5 ou 10 mg/kg do peso corporal, administração intraperitoneal) foi iniciada. Portanto, administração do anticorpo foi continua nos intervalos de uma vez a cada três dias. A atividade anti-tumor foi avaliada com base na frequência da formação de tumor e volume de tumor. O volume de tumor foi calculado pelas seguintes fórmulas.
Volume do tumor (mm?) = (eixo menor)? x (eixo maior) * 1r/6
[00417] Modelo de tratamento
[00418] As linhagens celulares cancerígenas pancreáticas (PK-59 e BxPC-3), que expressam hTROP-2, foram coletadas pelo tratamento com tripsina e PBS foi adicionado com para preparar a suspensão celular tendo uma concentração de 1 x 10º células/mL. Deste modo a suspensão celular preparada foi misturada com uma quantidade igual de Matrigel (BD Biosciences Pharmingen) em gelo. Usando uma seringa 26 G, 100 ul da mistura obtida (5 x 10º células) foi injetada na subcutis do flanco direito de cada camundongo nu fêmea de 6 semanas de idade (Balb/c, nu/nu). Cinco a seis dias após um transplante das células cancerígenas, camundongos cujo o volume do tumor tem aumentado a 50 a 150 mm? (valor médio: aproximadamente 100 mm?) foram divididos nos grupos. No dia em que os camundongos foram divididos nos grupos foi definido como o primeiro dia (Dia 1) e administração do anticorpo foi iniciada. O anticorpo foi intraperitonealmente administrado em intervalos de uma vez a cada três dias (10 mg/kg do peso corporal). A atividade anti-tumor foi avaliada pela medição do volume do tumor. Um teste de diferença significante foi realizada de acordo com o teste t de Student e P < 0,05 foi determinado a ser estatisticamente significante.
[00419] Exemplo 16
[00420] Análise da atividade anti-tumor in vivo de anticorpo anti-hTROP-2 monoclonal no modelo de xenoenxerto da célula cancerígena pancreática humana
[00421] É essencial por um anticorpo usado pelo tratamento do câncer, que os alvos hTROP-2, tem a atividade de especificamente matar os tecidos do tumor expressando hTROP-2 ou inibindo o desenvolvimento do tumor em um modelo de xenoenxerto.
[00422] Os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 (aproximadamente 160 clones), que foram recentemente produzidas na presente invenção, foram avaliadas usando o modelo de xenoenxerto de tratamentos de uma linhagem celular do câncer pancreático PK-59. As células PK-59 expressam, na superfície destes, EDPCAM (Figura 11A) atuando como um marcador de célula tronco do câncer pancreático (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007; 67: (3). 1030-1037) e também expressam P-glicoproteína/MDR1 (Figura 11B) e ABCG2/CDw338 (Figura 11C) (Chen, C. J. et al. Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R., et al. Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996)), que são transportadores ABC associados com a resistência ao medicamento. Além disso, as células PK-59 contém uma fração celular (8,93 %) (Figura 11D) positivas tanto para CD24 quanto CD44, que é característica pelas células troncos do câncer pancreático e estes são supostos ser uma linhagem celular de câncer pancreático humano altamente maligno (Chenwei Li, et al. Cancer Res 2007; 67: (3). 1030-1037, Jane E. Visvader and Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cancer. Vol. 8(10):755-68, 2008).
[00423] Mais dos recentemente gerados aproximadamente 160 clones não exibem os efeitos benéficos nos modelos de xenoenxerto de tratamento das células PK-59. Entre tais clones, clones exibem a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor significante, isto é clones K5-70, T6-16, K5-107, T5- 86 e K5-116-2-1 devem ser obtidos.
[00424] Em um grupo de administração do clone K5-70 (lg9G2a de camundongo), taxa de desenvolvimento de tumor é estatisticamente significantemente inibido. No 21º dia após iniciação da administração (dia 21), o volume de tumor de um grupo de controle (N = 14) foi 1200,8 + 377,3 mmº, considerando o volume de tumor do grupo de administração do clone K5-70 foi de 748,7 + 175,0 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 12A). Quando o volume de tumor no tempo de iniciação da administração do anticorpo foi definido como 1,0, o volume de tumor no 21º dia (Dia 21) foi 7,8 no grupo de administração do clone K5-70, considerando o volume de tumor do grupo de controle foi de 12,5 (Figura 12A). O peso do tumor taxado foi de 0,43 + 0,14 g (P < 0,01 pelo teste t de Student) no grupo de administração do clone K5-70,
considerando do grupo de controle foi 0,73 + 0,26 g. Deste modo, o clone K5-70 exibiu atividade inibidora de aproximadamente 60 % (Figura 12B).
[00425] Similarmente, taxa de desenvolvimento de tumor foi estatisticamente significantemente inibida ainda em um grupo de administração do clone K5-107 (I9G1 de camundongo) (N = 8), um grupo de administração do clone T6-16 (IgG2a de camundongo) (N = 8), um grupo de administração do clone T5-86 (I9G1 de camundongo) e um grupo de administração do clone K5-116-2-1 (IgG2a de camundongo) (N = 8). No 17º dia após iniciação da administração (Dia 17), o volume de tumores do grupo de administração do clone K5-107 (N = 8) e o grupo de administração do clone T6-16 (N = 8) foram 698,2 + 175,9 mm? (P < 0,05 pelo teste t de Student) e 707,2 + 254,5 mm*? (P < 0,05 pelo teste t de Student), respectivamente, considerando o volume de tumor do grupo de controle foi de 1039,3 + 271,6 mm?. Igualmente, no 16º dia após iniciação da administração (Dia 16), o volume de tumor do grupo de administração do clone K5-116-2-1 (N = 8) foi 508,5 + 225,2 mm? (P < 0,05 pelo teste t de Student), considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 797,0 + 172,9 mm? (Figura 13).
[00426] De outra maneira, no caso das clone T5-86, no 15º dia após iniciação da administração (Dia 15), o tumor do grupo de administração do clone T5-86 (N
= 8) foi 744,1 + 289,1 mm?, considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 1033,2 + 319,4 mmº?. Deste modo, não foi observado a diferença significante em termos do volume do tumor. Entretanto, em comparação do peso do tumor, que foi realizado no mesmo dia, o peso do tumor do grupo de administração do clone T5-86 foi de 0,44 + 0,13 g ( P < 0,05 pelo teste t de Student), considerando o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,62 + 0,14 g. Deste modo, o clone T5-86 exibiu atividade inibidora significante.
[00427] Além disso, em termos tanto de volume do tumor quanto o peso do tumor, a razão (T/C) de cada grupo de administração de anticorpo de clone ao grupo de controle no dia final do experimento é mostrado na Tabela 2 abaixo. Como mostrado na Tabela 2, cada anticorpo de clone exibiu atividade inibidora significante (T/C = 62 % a 72 %) em cada grupo de administração de anticorpo de clone.
[00428] Tabela 2 Grupo — N (número de camundongos) Volume de tumor T/C(%) Peso de tumor T/C (%) K5-70 14 62.3” 588 K5-107 8 672º 65.0 T6-16 8 68.0* 64.7” T5-86 8 72.0 70.5 K5-116-2-1 8 63.8 60.5" *P<0.05,** P < 0.01 (by Student's t-test)
(pelo teste t de Student)
[00429] Além disso, a atividade anti-tumor de cada um dos clones K5-70, T6- 16 e K5-116-2-1 nos modelos de xenoenxerto de prevenção da linhagem celular do câncer pancreático PK-59 foi analisada. Após finalização da administração de cada anticorpo do clone, o desenvolvimento do tumor foi inibido em todos os indivíduos (N = 8). No 18º dia após iniciação da administração (Dia 18), o volume de tumor do grupo de administração do clone K5-70 (10 mg/kg do peso corporal) foi 62,4 + 80,4 mmº (P < 0,01 pelo teste t de Student), considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 880,8 + 206,4 mmº?. Deste modo, o clone K5-70 exibiu a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor de 92,9 %. No 28º dia após iniciação da administração (Dia 28), o volume de tumor do grupo de administração do clone T6-16 (10 mg/kg do peso corporal) foi 152,14 + 122,3 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student), considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 992,3 + 250,8 mm?. Deste modo, o clone T6-16 exibiu a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor de 84,6 %. No 20º dia após iniciação da administração (Dia 20), o volume de tumor do grupo de administração do clone K5-116-2-1 (10 mg/kg do peso corporal) foi 207,7 + 319,2 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student), considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 1159,4 + 413,3 mm?. Deste modo, o clone
K5-116-2-1 exibiu a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor de 82,1 % (Figura 14 e tabela 3). Além disso, em todos dos experimentos, não existe diferença significante entre o grupo de controle e cada grupo de administração de anti-anticorpo hTROP-2 em termos de uma mudança no peso corporal médio através do período de teste.
[00430] Em termos tanto de volume do tumor quanto o peso do tumor, a razão (T/C) de cada grupo de administração de anticorpo de clone ao grupo de controle no dia final do experimento é mostrado na Tabela 3 abaixo. Como mostrado na Tabela 3, inibição do desenvolvimento do tumor significante foi observado em cada grupo de administração de anticorpo de clone e em particular, um efeito significante tal como T/C = 10 % ou menos foi confirmada no grupo de administração do clone K5-70.
[00431] Tabela3 Grupo — N (número de camundongos) Volume de tumor T/C(%) Peso de tumor T/C (%) K5-70 8 71º 58" T6-16 8 15.37 10.5” K5-116-2-1 8 232” 21.5” ** P<0.01 (pelo teste t de Student)
[00432] O anticorpo anti-TROP-2 AR47A6.4.2 conhecido (Patente U.S. Nº.
7420041) tem exibido o efeito de inibição do desenvolvimento do tumor, em uma dosagem de 20 mg/kg, nos modelos de xenoenxerto de prevenção usando várias linhagens celulares de câncer humano. Este anticorpo anti-TROP-2 ARA47A6.4.2 tem inibido o desenvolvimento do tumor de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PL45 em uma porcentagem de quase 100 %. Entretanto, este anticorpo teve o efeito de inibição do tumor em uma linhagem celular do câncer pancreático BxPC-3 em uma porcentagem de aproximadamente 50 %, em uma linhagem celular de câncer de próstata PC-3 em uma porcentagem de aproximadamente 40 %, em uma em uma linhagem celular de câncer de mama MCF-7 em uma porcentagem de aproximadamente 60 % e em uma em uma linhagem celular de câncer de cólon Colo205 em uma porcentagem de aproximadamente 40 %. Em contraste, o anti-anticorpo hTROP- 2 da invenção da presente aplicação exibiu um efeito inibidor de desenvolvimento do tumor maior em uma dosagem da metade da dosagem anteriormente mencionada (10 mg/kg do peso corporal).
[00433] Exemplo 17
[00434] Análise de atividade anti-tumor nos modelos de xenoenxerto (modelos de prevenção e modelos de tratamentos) da linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3
[00435] Como no caso do uso do modelo de xenoenxerto de tratamentos descritos acima da linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, a atividade anti-tumor do clone K5-70 nos modelos de xenoenxerto de prevenção e modelo de xenoenxerto de tratamentos da linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3 foi analisada.
[00436] Quando comparado com um grupo de controle (N = 8) o desenvolvimento do tumor do grupo de administração do clone K-70 foi significantemente inibido. No 52º dia (Dia 52), o volume de tumor do grupo de administração do clone K5-70 (N = 8) foi de 236,0 + 136,4 mm, considerando o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 616,3 + 266,8 mmº?. Deste modo, o clone K-70 exibiu um desenvolvimento do efeito inibidor do tumor de 61,7 % (P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 15).
[00437] A partir dos resultados anteriormente mencionados, torna-se claro que o anticorpo anti-hTROP-2 monoclional exibiu a atividade inibidora significante do desenvolvimento de tumor in vivo em pelo menos duas espécies da célula cancerígena.
[00438] Exemplo 18
[00439] Atividade anti-tumor dependente da dosagem de anti-anticorpo hTROP-2 (clone K5-70) nos modelos de xenoenxerto de prevenção de hTROP-
2-que expressa linha a celular do câncer pancreático (células PK-59)
[00440] Para o propósito de analisar em mais detalhes a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor in vivo do anti-anticorpo hTROP-2, um teste dependente da dosagem foi realizada. Como mostrado na Figura 16, o desenvolvimento do tumor de células PK-59 foi inibida dependentemente da dosagem pela administração do anticorpo K5-70. No 21º dia após administração do anticorpo (Dia 21), o volume de tumor do grupo de controle (N = 8) foi 937,8 + 295,3 mm?. De outra maneira, o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (1 mg/kg do peso corporal) (N = 8) foi 493,5 + 305,1 mm?, mostrando uma taxa inibidora de 50 % e o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (5 mg/kg do peso corporal) (N = 8) foi 124,7 + 89,0 mmº, mostrando uma taxa inibidora de 90 %. Deste modo, torna-se claro que, quando comparado com o anticorpo anti-TROP-2 AR47A6.4.2 conhecido (Patente U.S. Nº. 7420041), o anti-anticorpo hTROP-2 da presente invenção exibe in vivo um desenvolvimento do efeito inibidor do tumor equivalente aquele do anticorpo anti-TROP-2 AR47A6.4.2 em uma dosagem de um vigésimo do anticorpo anti-TROP-2 AR47A6.4.2 e que este exibe um efeito inibidor maior de 90 % em uma dosagem de um quarto deste.
[00441] Exemplo 19
[00442] Ensaio de epítopo
[00443] Preparação da proteína TROP-2 quimérica de camundongo/humano
[00444] Um gene TROP-2 de camundongo/humano foi preparado de acordo com um método PCR. Os iniciadores PCR como mostrado abaixo foram projetados com base em uma sequência do gene TROP-2 humano e uma sequência do gene TROP-2 de camundongo (Acessão Genbank Nº. NM 020047).
[00445] Iniciadores de TROP-2-C de camundongo/humano
[00446] Y606 (local avançado): 5'-cctgagcctacgctagcgacgaagtgataca-3' (SEQ ID Nº: 10)
[00447] Y607 (local reverso): 5'-cgcaccacttegtegcagegtaggcteagg-3' (SEQ ID Nº: 11)
[00448] Iniciadores de TROP-2-A de camundongo/humano
[00449] Y612 (local avançado): 5'-gactgctccacgctgactticcaagtacceta-3' (SEQ ID Nº: 12)
[00450] Y613 (local reverso): 5'-caggcacttggaagtcagegtagagcagte-3' SEQ ID Nº: 13)
[00451] Iniciadores de TROP-2-B de camundongo/humanos
[00452] Y614 (local avançado): 5 -ctegtagacaacgatggcctetacgacecg-3' (SEQ
ID Nº: 14)
[00453] Y615 (local reverso): 5'-cgggtegtagaggccategttatecacgag-3' (SEQ ID Nº: 15)
[00454] Iniciadores TROP-2-D de camundongo/humano
[00455] Y608 (local avançado): 5'-ccaaagcctgcgctgcgatgagetagtigege-3' (SEQ ID Nº: 16)
[00456] Y609 (local reverso): 5'-gegcaccagcteategcagegeaggcetttag-3' (SEQ ID Nº: 17)
[00457] Iniciadores TROP-2-E de camundongo/humano
[00458] Y616 (local avançado): 5'-agcttectateegeggtacactacgageag-3' (SEQ ID Nº: 18)
[00459] Y617 (local reverso): 5'-ctgctegtagtgcacegeggataggaaget-3' (SEQ ID Nº: 19)
[00460] Iniciadores TROP-2-F de camundongo/humano
[00461] Y618 (local avançado): 5'-gacattaaaggcgagtctcetattccaggge-3' (SEQ ID Nº: 20)
[00462] Y619 (local reverso): 5'-gccctaggaatagagactcgcctitaatate-3' (SEQ ID Nº: 21)
[00463] Iniciadores TROP-2 de camundongo
[00464] Iniciador avançado: 5-ctactecaccececacectageg-3' (SEQ ID Nº: 22)
[00465] Iniciador reverso: 5'-ctegagcaagcetaggttegettcto-3' (SEQ ID Nº: 23)
[00466] Ao iniciador reverso TROP-2 de camundongo, a sequência digerida por enzima de restrição Xhol exceto por um códon de interrupção foi adicionado. Uma visão esquemática das proteinas TROP-2 quiméricas de camundongo/humano preparadas é mostrada na Figura 17.
[00467] A proteína quimérica hmTROP-2-A é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 69 da proteína hTROP-2 e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 64 ao terminal C da proteína TROP-2 de camundongo. À proteína quimérica hm TROP-2-B é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 101 da proteína hTROP-2 e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 96 ao terminal C da proteína TROP-2 de camundongo. A proteína quimérica hmTROP-2-C é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 145 da proteína hTROP-2 e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 140 ao terminal C da proteína TROP-2 de camundongo. A proteína quimérica mhTROP-2-D é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 139 da proteína TROP-2 de camundongo e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 146 ao terminal C da proteína hTROP-2. A proteína quimérica mhTROP-2-E é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 187 da proteína TROP-2 de camundongo e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 194 ao terminal C da proteína hTROP-2. A proteína quimérica mhTROP-2-F é uma proteína quimérica, que consiste de um polipeptídeo que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 227 da proteína TROP-2 de camundongo e um polipeptídeo que varia a partir do aminoácido na posição 234 ao terminal C da proteína hTROP-2.
[00468] Os vetores de expressão usados na preparação das proteínas quiméricas descritas acima foram especificamente construídos pelos seguintes métodos. A fim de preparar um gene quimérico hmTROP-2-A, o gene hTROP-2 foi usado como um modelo e PCR foi realizado usando o iniciador avançado hTROP-2 e o iniciador Y613 TROP-2-A de camundongo/humano. Igualmente, o gene TROP-2 de camundongo foi usado como um modelo e PCR foi realizado usando o iniciador Y6812 TROP-2-A de camundongo/humano e o iniciador reverso TROP-2 de camundongo. Um fragmento de DNA amplificado pelo PCR foi desenvolvido usando gel de acrilamida e um grupo de interesse foi então recuperado pela extração.
Subsequentemente, os dois tipos de fragmentos de DNA extraídos foram misturados para preparar um modelo e PCR foi então realizado usando o iniciador avançado hTROP-2 e o iniciador reverso TROP-2 de camundongo.
Um produto de PCR foi desenvolvido pela eletroforese em gel de agarose e um fragmento de DNA de interesse foi então extraído.
O fragmento de DNA extraído foi clonado em um vetor pCR (marca registrada)- Blunt (Invitrogen) (pCRB-hmTROP-2-A) e uma sequência do gene foi então confirmada.
Um vetor de expressão pelas células animais foi produzido pela remoção do gene hTROP-2 a partir de pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His pela digestão EcoRI/Xhol e então inserindo neste um fragmento EcoRl/Xhol contendo um gene quimérico hmTROP-2-A preparado a partir do pCRB- hmTROP-2-A (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). Adicionalmente, os seguintes genes quiméricos foram preparados pelo mesmo método como descrito acima e vetores de expressão foram construídos: hmTROP-2-B (usando um iniciador avançado —TROP-2 humano, um iniciador Y615 TROP-2-B de camundongo/humano, um iniciador Y614 TROP-2-B de camundongo/humano e um iniciador reverso TROP-2 de camundongo), hmTROP-2-C (usando um iniciador avançado TROP-2 humano, um iniciador Y607 TROP-2-C de camundongo/humano, um iniciador Y806 TROP-2-C de camundongo/humano e um iniciador reverso TROP-2 de camundongo), mhTROP-2-D (usando um iniciador avançado TROP-2 de camundongo, um iniciador Y809 TROP-2-D de camundongo/humano, um iniciador Y808 TROP-2-D de camundongo/humano e um iniciador reverso TROP-2 humano), mhTROP-2-E (usando um iniciador avançado TROP-2 de camundongo, um iniciador Y617 TROP-2-E de camundongo/humano, um iniciador Y816 TROP-2-E de camundongo/humano e um iniciador reverso TROP-2 humano), mhTROP-2-F (usando um iniciador avançado TROP-2 de camundongo, um iniciador Y619 TROP-2-F de camundongo/humano, um iniciador Y618 TROP-2-F de camundongo/humano e um iniciador reverso TROP-2 humano) (pcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1- mMhTROP-2-E-myc/His e pcDNA3.1-mhTROP-2-F-myc/His).
[00469] Estabelecimento das linhagens celulares HEK293, que expressam constitutivamente proteínas quiméricas hTROP-2, TROP-2-C de camundongo/humano e TROP-2-D de camundongo/humano
[00470] Os vetores de expressão descritos acima pcDNA3.1-hTROP-2- myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His e pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His foram cada um introduzido nas células HEK293. A seleção foi realizada usando um antibiótico G418 (Calbiochem) e as linhagens celulares HEK293 constitutivamente expressam a proteína hTROP-2, a proteína quimérica hmTROP-2-C e a proteína quimérica mMhTROP-2-D foram estabelecidas.
[00471] As regiões de ligação dos anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 K5- 70, T5-86, K5-107, T6-4, T6-16 e K5-116-2-1, que exibiram os efeitos benéficos nos modelos de xenoenxerto de tratamento da linhagem celular do câncer pancreático PK-59, foram identificados. Primeiro, a reatividade dos anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 exibiram os efeitos benéficos com as células HEK293, que constantemente expressam as proteínas quiméricas hm TROP-2-C e mhTROP-2-D, foram examinadas por análise FACS (Figura 18). Como um resultado, foi observado que os anticorpos K5-70, K5-107, T5-86 e K5-116-2-1 reagidos com hmTROP-2-C, mas que estes anticorpos não reagem com mMhTROP-2-D. De outra maneira, os anticorpos T6-4 e T6-16 reagidos com mMhTROP-2-D, mas estes não reagem com hmTROP-2-C. A partir destes resultados, a região de ligação de cada um dos anticorpos K5-70, K5-107, T5-84 e K5-116-2-1 foi limitada a uma região que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 145 de hTROP-2 e a região de ligação de cada um dos anticorpos T6-4 e T6-16 foi limitada a uma região que varia do aminoácido na posição 146 a região terminal C de hTROP-2 (Figura 18).
[00472] A fim de analisar as regiões de ligação em mais detalhes, vetores usados na expressão das proteínas quiméricas hmTROP-2-A, hmTROP-2-B, mMhTROP-2-E e mhTROP-2-F foram preparadas e a reatividade das proteínas quiméricas com os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 que exibe os efeitos benéficos foi analisada (Figura 19). Os vetores de expressão recentemente preparados, que foram usados na expressão das proteínas quiméricas, foram cada um introduzido nas células HEK293 e análise FACS foi então realizada, usando as células que aleatoriamente expressam as proteínas quiméricas. Os anticorpos K5-70, K5-107, T5-86 e K5-116-2-1 reagidos com hmTROP-2-A, mas não reagem com mhTROP-2-B. Os 6 tipos de anticorpos monoclionais examinados todos reagidos com hTROP-2. Estes resultados claramente mostraram que a região de ligação dos anticorpos K5-70, K5-107, T5-86 e K5- 116-2-1 está presente em uma região que varia a partir do terminal N ao aminoácido na posição 69 de hTROP-2. Além disso, os anticorpos T6-4 e T6-16 reagidos com nenhum mhTROP-2-E ou tampouco mhTROP-2-F. Este sugere que estes anticorpos reconhecem uma região que varia do aminoácido na posição 146 ao aminoácido na posição 193 de hTROP-2.
[00473] Exemplo 20
[00474] Imunohistoquímica
[00475] <Materiais/Método>
[00476] Os seguintes séries de tecido normais e cancerígenos foram usadas em imunohistotingimento.
[00477] Séries de tecido normal humano:
[00478] Órgãos normais, humanos em duplicatas (Catálogo Nº.: AB1, Super Bio Chips)
[00479] Tecidos normais mais do que manchas simples (Catálogo Nº. A103(VI), ISU ABXIS)
[00480] Séries de tecido de câncer pulmonar:
[00481] Câancer-metástase-normal pulmonar humano (Catálogo Nº.: CCA3, Super Bio Chips)
[00482] Tecido de carcinoma pulmonar com tecido marginal humano, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-RsLug03-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00483] Série de tecido de câncer pancreático:
[00484] Tecido de carcinoma do pâncreas humano com tipo mono-patológico de 60 casos, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-DgPan03-001, Shanghai Outdo Biotech)
[00485] Série de tecido de câncer hepático:
[00486] Carcinoma hepatocelular, graus | a Ill com os controles de tecido normal, 63 casos de ensaios de tecido (Catálogo Nº.: CS03-01-002U, Cybrdi)
[00487] Tecido de carcinoma hepático humano com tipo mono-patológico de casos, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00488] Ensaios de tecido de câncer colorretal:
[00489] Câncer colorretal, humano (Catálogo Nº.: CD3, Super Bio Chips)
[00490] Carcinoma de cólon com tecido marginal humano, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-DgCol03-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00491] Ensaios de tecido da metástase de linfonodo do câncer colorretal e metástase do fígado:
[00492] Câncer colorretal (cólon e reto) com ensaio de tecido de metástase de linfonodo pontuado, 44 casos/99 núcleos, lâmina de ensaio (Catálogo Nº.: CO991t, Biomax us)
[00493] Câncer colorretal (cólon e reto) com ensaio de tecido adjacente normal e metástase de linfonodo pontuado, 43 casos/99 núcleos (Catálogo Nº.: CO992, Biomax us)
[00494] Tecido de câncer de cólon-metástase do fígado (Catálogo Nº.: A203(IV), ISU ABXIS)
[00495] Ensaios de tecido do câncer de mama:
[00496] Câncer de mama-metastase-normal, humano (Catálogo Nº.: CBA3, Super Bio Chips)
[00497] Carcinoma de mama com tecido marginal humano, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-RpBre03-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00498] Ensaios de tecido do câncer de estômago:
[00499] Câncer de estômago, humano (Catálogo Nº.: CQ1, Super Bio Chips)
[00500] Carcinoma gástrico com tecido marginal humano, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00501] Série de tecido do câncer de esôfago:
[00502] Câncer de esôfago, humano (Catálogo Nº.: CR1, Super Bio Chips)
[00503] Carcinoma de esôfago com tecido marginal humano, 2 núcleos de localização (Catálogo Nº.: OD-CT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech)
[00504] Série de tecido do câncer ovariano:
[00505] Câncer de ovário, humano (Catálogo Nº.: CJ1, Super Bio Chips)
[00506] Série de tecido do câncer de próstata:
[00507] Câncer de próstata-normal, humano (Catálogo Nº.: CA3, Super Bio Chips)
[00508] Série de tecido do câncer de bexiga:
[00509] Carcinoma de bexiga / carcinoma da célula transicional, graus | a Ill com ensaios de tecido normal (Catálogo Nº.: CC12-01-001U, Cybrdi)
[00510] A informação do paciente e informação clínica com relação aos ensaios de tecido descritos acima foram obtidos a partir folhas de dados ligadas com estes e as homepages de companhias individuais.
[00511] Método de imuno-histotingimento
[00512] Após finalização de um tratamento de desparafinização, a série das lâminas de tecido dos tecidos normais humanos e tecidos de câncer foram submetidos a um tratamento de protease com pepsina a 37º C por 5 minutos. Portanto, as seções foram usadas no imunotingimento usando um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2. Uma reação de cor foi realizada usando DAB(3,3"- diaminobenzidina) como um susbtrato e como um contra-tingimento, tingimento nuclear foi então realizado usando hematoxilina.
[00513] Mais especificamente, estas operações foram realizadas como seguem. Uma seção embebida por parafina foi submetida a um tratamento de desparafinização e foi então submetida a um tratamento de protease com pepsina (DAKO) a 37º C por 5 minutos. Após ativação do antígeno, a seção foi tratada em temperatura ambiente por 20 minutos usando uma solução preparada pela adição de uma solução de peróxido de hidrogênio ao metanol em uma concentração final de 0,3 %, de modo que a atividade de peroxidase endógena foi eliminada.
O resultante foi lavado com PBS em temperatura ambiente por 5 minutos duas vezes e foi então bloqueada em temperatura ambiente por 30 minutos usando uma solução PBS contendo 1,5 % de soro de cavalo normal (DAKO), de modo para realizar uma operação para bloquear a ligação não específica nos tecidos.
Subsequentemente, o resultante foi reagido com anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 clone K5-63-17 (concentração final: 10 ug/ml), que foi diluído com uma solução PBS contendo 1,5 % de soro de cavalo normal, em temperatura ambiente por 1 hora e foi então lavado com PBS em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes.
Portanto, um anticorpo anti-lgG de camundongo biotinilado (Vector), que foi 200 vezes diluído com uma solução PBS contendo 1,5 % soro de cavalo normal, foi reagido em temperatura ambiente por 30 minutos.
O produto de reação foi lavado com PBS em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes e um reagente do kit Vectastain ABC (Vector) foi misturado de acordo com um manual de instrução incluído neste, deste modo para preparar um complexo ABC.
Este complexo ABC foi reagido em temperatura ambiente por 30 minutos.
O produto de reação foi lavado com PBS em temperatura ambiente por 5 minutos três vezes e desenvolvimento da cor foi então realizado usando solução DAB de tingimento simples de substrato de peroxidase de histofina (Nichirei Biosciences). Após finalização do desenvolvimento da cor, o produto de reação foi lavado com água desionizada por 5 minutos e o núcleo foi tingido com solução de hematoxilina de Mayer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Portanto, a desidratação foi realizada com álcool, seguida pela penetração com xileno e montagem em Entellan New (Merck Japan).
[00514] <Resultados>
[00515] Expressão de hTROP-2 nos tecidos normais humanos
[00516] O padrão de expressão de hTROP-2 nos tecidos normais humanos foi analisado usando o anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 clone K5-63-17. A série de tecido normal humano (Catálogo Nº: AB1, Super Bio Chips) foi desparafinizado e foi então submetida a um tratamento hidrofílico. Portanto, o antígeno foi ativado com uma protease, pepsina e imunotingimento foi então realizada usando o anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 clone K5-63-17 (Figura 20). Como um resultado, o tingimento foi observado na pele, esôfago, rim (córtex e medula), pâncreas, próstata, bexiga e amígdala. Uma maioria das imagens tingidas localizada na membrana celular (Figura 20A, B/ C, D /F, Ge H), mas expressão hTROP-2 foi parcialmente observada ainda no citoplasma (Figura 20E e H). De outra maneira, tal tingimento não foi observado no coração,
fígado, estômago, intestino delgado, intestino grosso, músculo esqueletal, pulmão, baço, glândula vascular e outros (Figura 20l e J).
[00517] Expressão de hTROP-2 nos tecidos de câncer humanos
[00518] A fim de examinar a expressão de hTROP-2 (hTROP-2-taxa positiva) nos tecidos de câncer humanos, os ensaios de tecido de câncer de várias espécies de câncer humano foram imunotingidas usando o anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 clone K5-63-17. Uma seção de tecido em que 10 % ou mais das células cancerígenas foram tingidas, foi definida como hTROP-2- positiva. Os resultados do tingimento são mostrados na Tabela 4.
[00519] Tabela4 Número de TROP-2- TROP-2-taxa positiva Tecido do câncer casos positivos / número (%) total de casos ' câncer de esôfago 69/90 câncer pancreático 26/62 câncer de próstata 35/38
[00520] As imagens tingidas representativas são mostradas na Figura 21. Entre as espécies de câncer, relativamente no qual a expressão de hTROP -2 foi analisada, câncer de próstata tem a taxa positiva mais alta (92,1 %) e também, câncer de pulmão (65,4 %), câncer de esôfago (76,7 %), câncer de bexiga (71,2 %) e outros tem as taxas positivas altas. O câncer de fígado te a taxa positiva mais baixa (7,61 %). Esta foi observada a partir das imagens tingidas que, como com nas células normais, hTROP-2 foi altamente localizada na membrana celular ainda no caso das células cancerígenas (Figura 21 Aa F, He 1). Além disso, hTROP-2 também foi localizado no citoplasma em alguns casos (Figura 21h, B EeG).
[00521] A hTROP-2-taxa positiva no câncer pancreático foi 41,9 %. A conexão entre esta hTROP-2-taxa positiva e o grau (grau de diferenciação) do câncer pancreático foi analisada. Como um resultado, hTROP-2 foi expressado na frequência alta no câncer pancreático com um grau alto, isto é, com um grau baixo da diferenciação (Tabela 5).
[00522] Tabela5 manchas de câncer pancreático hTROP-2-positivas 26/62 (41.94%) Grau - + Taxa positiva 1 8 o 0% I-1 5 o 0% TI 19 21 52.5% 1-M 4 5 55.6% p<0.01 total 36 26
[00523] Exemplo 21
[00524] Atividade anti-tumor de anticorpo K5-70 pela administração simples nos modelos de xenoenxerto de prevenção da linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59
[00525] A atividade anti-tumor forte in vivo de um clone K5-70 (IgG2a de camundongo) foi exibida ainda por uma administração simples de K5-70 em uma dosagem de 10 mg/kg do peso corporal aos modelos de xenoenxerto de prevenção usando uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59. Em um grupo de controle (IgG de camundongo, 10 mg/kg do peso corporal, N = 3), formação de tumor foi observado em todos dos indivíduos e o volume de tumor no 28º dia após transplante da célula (Dia 28) foi 781,7 + 74,5 mmº?. De outra maneira, em um grupo em que o anticorpo K5-70 foi administrado apenas uma vez no dia do transplante das células cancerígenas (Dia 1) (10 mg/kg do peso corporal, N = 3), o volume de tumor no Dia 28 foi 144,4 + 176,9 mm? (P< 0,05 pelo teste t de Student), mostrando a atividade inibidora de desenvolvimento de tumor de 81,5 % (Figura 22A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle no dia 28 foi 0,59 + 0,06 g. Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo de clone K5-
70 foi 0,07 + 0,10 g (P < 0,01 pelo teste t de Student), mostrando uma atividade inibidora de 88 % (Figura 22B). Com relação tanto do volume do tumor quanto peso do tumor, formação de tumor foi completamente inibida em 2 fora de 3 indivíduos no grupo de administração do anticorpo K5-70 em uma dosagem de mg/kg do peso corporal por administração (Figura 22C).
[00526] Exemplo 22
[00527] Atividade anti-tumor de anticorpo anti-hTROP-2 monoclonal nos modelos de xenoenxerto de tratamento em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480
[00528] A atividade anti-tumor de cada um dos anticorpos monoclonais anti- hTROP-2 (clones K5-70, K5-116-2-1 e T6-16) foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480. As células SW480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongo NOD -scid fêmea de 6 semanas de idade (Dia 1). Quando o volume médio do tumor atingiu 100 mm?, o agrupamento foi realizado (Dia 7 ou Dia 10). A partir do Dia 7 ou Dia 10, administração intraperitoneal do anticorpo foi realizada nos intervalos de administração de uma vez a cada três dias. A atividade anti-tumor do anticorpo de clone K5-70 e as atividades anti-tumor do anticorpo de clone K5-116-2-1 e o anticorpo de clone T6-16 foram avaliados pelos estudos independentes, separadamente. No estudo de avaliar uma atividade anti-tumor do anticorpo K5- 70, o volume de tumor de um grupo de controle (IgG de camundongo (10 mg/kg do peso corporal), N = 8) no 44º dia após transplante da célula cancerígena (Dia 44) foi de 365,4 + 214,6 mm?. De outra maneira, o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal) foi 27,4 + 29,4 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida no Grupo de administração K5-70 (taxa inibidora: 92,5 %) (Figura 23A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,11 + 0,07 g, considerando o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 foi 0,005 + 0,007 (g) (P < 0,01 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 95,5 % (Figura 23B). Em particular, em dois dos oito camundongo individuais no grupo de administração do anticorpo K5-70, formação de tumor foi completamente inibido e a presença do tumor não deve ser confirmado.
[00529] No estudo da avaliação das atividades anti-tumor do anticorpo K5- 116-2-1 e o anticorpo T6-16, que foi realizado separadamente, o volume de tumor do grupo de controle no dia 42 foi 713,8 + 354,5 mm? (N=8) Em contraste, o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-116-2-
1 (10 mg/kg do peso corporal) foi 188,9 + 97,4 mmº? (N = 8, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 24A) e o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal) foi de 292,8 + 199,7 mmº (N=8,P < 0,05 pelo teste t de Student) (Figura 25A). Deste modo, dos dois grupos de administração acima mostram taxas inibidoras de 73,5 % e 59,0 %, respectivamente. Com relação ao peso do tumor também, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,39 + 0,19 g. Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-116-2-1 foi 0,10 + 0,07 g (P < 0,01 pelo teste t de Student) e o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 foi 0,17 + 0,14 g (P < 0,05 pelo teste t de Student). Deste modo, dos dois grupos de administração acima mostram taxas inibidoras de 72,2 % e 56,4 %, respectivamente (Figura 24B e Figura 25B).
[00530] Exemplo 23
[00531] Atividade anti-tumor dependente da dosagem de clone K5-70 nos modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480
[00532] Subsequentemente, a atividade anti-tumor dependente da dosagem do anticorpo K5-70 foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480.
As células SWA480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongo NOD-scid fêmea de 6 semanas de idade.
Dez dias após um transplante (Dia 10) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mmº, os camundongos foram divididos em um grupo de controle (IgG de camundongo, 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração, N = 8, 104,4 + 17,6 mm?), um grupo de administração do anticorpo K5-70 (1 mg/kg do peso corporal) (N = 8, 104,3 + 16,1 mm?), um grupo de administração do anticorpo K5-70 (5 mg/kg do peso corporal) (N = 8, 104,6 + 15,9 mm?) e um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal) (N=8, 104,8 + 14,9 mm?). Então, administração intraperitoneal foi realizada nos intervalos de administração de uma vez a cada três dias.
No dia 42, o volume de tumor do grupo de controle foi de 713,8 + 354,5 mm?. De outra maneira, nos grupos de administração do anticorpo K5-70, atividade inibidora da formação de tumor dependente da dosagem foi observada.
Isto é, o volume de tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi de 485,0 + 207,3 mm? (taxa inibidora: 32,1 %), o volume de tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 339,5 + 253,2 mm? (taxa inibidora: 52,4 %) e o volume de tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 355,4 + 202,8 mmº (taxa inibidora: 50,2 %, P < 0,05 pelo teste t de Student)
(Figura 26A). Igualmente, com relação ao peso do tumor no dia 42, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,39 + 0,19 g. De outra maneira, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (1 mg/kg do peso corporal) foi de 0,24 + 0,11 g (taxa inibidora: 37,8 %), o peso do tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,17 + 0,14 g (taxa inibidora: 55,8 %, P < 0,05 pelo teste t de Student) e o peso do tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,20 + 0,13 g (taxa inibidora: 47,1 %). Deste modo, atividade anti-tumor dependente da dosagem foi confirmada (Figura 26B).
[00533] Exemplo 24
[00534] Análise dos intervalos de administração de anticorpo K5-70 aos modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480
[00535] Subsequentemente, a fim de analisar os ótimos intervalos de administração do anticorpo K5-70, a atividade anti-tumor de clone K5-70 quando esta foi administrada uma vez por semana (uma vez a cada 7 dias) foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480. As células SWA480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongo NOD-scid fêmea de 6 semanas de idade.
Dez dias após um transplante (Dia 10) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mmº?, os camundongos foram divididos em um grupo de controle (IgG de camundongo, mg/kg do peso corporal, N = 8, 104,42 + 15,1 mm?) e um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8, 104,3 + 16,1 mm?). Então, administração intraperitoneal foi realizada uma vez a cada 7 dias.
No dia 42, o volume de tumor do grupo de controle foi de 713,8 + 354,5 mm?, considerando o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (administrado uma vez por semana) foi de 332,3 + 239,9 mm? (taxa inibidora: 55 %, P < 0,05 pelo teste t de Student) (Figura 27A). Além disso, quando o intervalo da administração foi aumentado a uma vez a cada 10 dias e a uma vez a cada duas semanas, o volume de tumor do grupo de controle no dia 39 foi 956,9 + 367,8 mmº.
De outra maneira, o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (administrado uma vez a cada 10 dias) no dia 39 foi 525,4 + 180,6 mm? (taxa inibidora: 45,1 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 (administrado uma vez a cada 2 semanas) foi de 459,4 + 217,6 mm? (taxa inibidora: 52,0 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 27B). Nas técnicas anteriores (U.S. 7420040 e U.S. 7420041), quando os anticorpos foram administrados aos modelos de xenoenxerto de tratamento usando uma linhagem celular do câncer pancreático (BxPC-3) em uma dosagem de 20 mg/kg do peso corporal, três vezes por semana (nos intervalos de administração de 2 dias), os anticorpos exibiram a atividade anti-tumor em uma taxa inibidora de 50 % a 60 %. Em contraste, o anticorpo K5-70 exibiu a atividade anti-tumor equivalente aquelas das técnicas anteriores, em uma dosagem de metade das técnicas anteriores (10 mg/kg do peso corporal), uma vez a cada 2 semanas (nos intervalos de administração de 13 dias). Consequentemente, torna-se claro que que o anticorpo K5-70 exibiu atividade anti-tumor significante em uma dosagem total de pelo menos uma décima segunda daquelas técnicas anteriores.
[00536] Exemplo 25
[00537] Atividade anti-tumor dependente da dosagem de anticorpo T6-16 nos modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480
[00538] Subsequentemente, a atividade anti-tumor dependente da dosagem do anticorpo T6-16 foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480. As células SW480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um dos camundongos NOD-scid fêmeas de 6 semanas de idade.
Dez dias após um transplante (Dia 10) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mm?, os camundongos foram divididos em um grupo de controle (IgG de camundongo, 10 mg/kg do peso corporal, N = 8, 105,8 + 9,9 mm?), um grupo de administração do anticorpo T6-16 (1 mg/kg do peso corporal, N=8, 104,4 + 13,3 mmº?), um grupo de administração do anticorpo T6-16 (5 mg/kg do peso corporal, N = 8, 104,7 + 13,0 mm?) e um grupo de administração do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8, 104,8 + 12,4 mm?). Então, administração intraperitoneal foi realizada nos intervalos de administração de uma vez a cada três dias.
No dia 43, o volume de tumor do grupo de controle foi de 473,5 + 137,0 mmº?. De outra maneira, no grupo de administração do anticorpo T6-16s, atividade inibidora da formação de tumor dependente da dosagem foi observada.
Isto é, o volume de tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 397,9 + 97,5 mmº (taxa inibidora: 16,0 %), o volume de tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 195,9 + 89,7 mm? (taxa inibidora: 58,7 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o volume de tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 190,2 + 56,5 mmº? (taxa inibidora: 59,8 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 28A). Igualmente, com relação ao peso do tumor no dia 43, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,19 + 0,07 g.
De outra maneira, o peso do tumor do anticorpo T6-16 (1 mg/kg do peso corporal) grupo de administração foi 0,20 + 0,08 g, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 (5 mg/kg do peso corporal) foi 0,08 + 0,04 g (taxa inibidora: 57,9 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o peso do tumor do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal) grupo de administração foi 0,09 + 0,04 g (taxa inibidora: 52,6 %, P < 0,01 pelo teste t de Student). Deste modo, atividade anti-tumor dependente da dosagem foi confirmada (Figura 28B).
[00539] Exemplo 26
[00540] Análise dos intervalos de administração de anticorpo T6-16 aos modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480
[00541] Subsequentemente, a fim de analisar ótimos intervalos de administração do anticorpo T6-16, a atividade anti-tumor de clone T6-16 quando foi foi administrada nos intervalos de administração uma vez por semana (uma vez a cada 7 dias) e uma vez a cada 10 dias foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480. As células SW480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongo NOD-scid fêmea de 6 semanas de idade. Dez dias após um transplante (Dia 10) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mmº?, os camundongos foram divididos em um grupo de controle (IgG de camundongo, 10 mg/kg do peso corporal, N = 8, 105,8 + 9,9 mm?), um grupo de administração do anticorpo T6-16 (uma vez por semana) (10 mg/kg do peso corporal, N = 8, 105,0 + 11,6 mm?) e um grupo de administração do anticorpo T6-16 (uma vez a cada 10 dias) (10 mg/kg de peso corporal, N = 5, 130,8 + 2,4 mm?). Então, a administração foi iniciada.
No dia 43, o volume de tumor do grupo de controle foi de 473,5 + 137,0 mm?. De outra maneira, o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 (uma vez por semana) foi 243,7 + 65,3 mm? (taxa inibidora: 48,5 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 (uma vez a cada 10 dias) foi 297,8 + 54,4 mm? (taxa inibidora: 37,1 %, P < 0,05 pelo teste t de Student) (Figura 29). Nas técnicas anteriores (U.S. 7420040 e U.S. 7420041), quando os anticorpos foram administrados aos modelos de xenoenxerto de tratamento usando uma linhagem celular do câncer pancreático (BXPC-3) em uma dosagem de 20 mg/kg do peso corporal, três vezes por semana (nos intervalos de administração de 2 dias), os anticorpos exibiram a atividade anti-tumor em uma taxa inibidora de 50 % to 60 %. Em contraste, o anticorpo T6-16 exibiu atividade anti-tumor significante, quando este foi administrado em uma dosagem de metade das técnicas anteriores e em uma frequência de uma vez a cada 10 dia (nos intervalos de administração de 9 dias). Consequentemente, torna-se claro que que o anticorpo T6-16 exibiu atividade anti-tumor significante em uma dosagem total de pelo menos um oitavo daquelas técnicas anteriores.
[00542] Exemplo 27
[00543] Análise de atividade anti-tumor de clone K5-70 nos modelos de xenoenxerto de prevenção usando a linhagem celular de câncer de próstata humano DU-145
[00544] A atividade anti-tumor de clone K5-70 no câncer de próstata humano foi avaliada com os modelos de xenoenxerto de prevenção usando as células DU-145 (RIKEN Cell Bank, RCB2143). As células DU-145 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas em cada um do camundongo nu fêmea de 6 semanas de idade (Balb/c, nu/nu). O dia em que o transplante foi realizado foi definido como Dia 1. Os camundongos foram divididos em um grupo de controle (IgG de camundongo) (N = 8) e um grupo de administração do anticorpo K5-70 (N = 8). A partir do dia 1, o anticorpo K-70 e o anticorpo de controle foram intraperitonealmente administrados aos camundongos em uma frequência de uma vez a cada 3 dias em uma dosagem de 10 mg/kg do peso corporal. No dia 40, o volume de tumor do grupo de controle foi de 368,2 +
307,8 mmº?. De outra maneira, o volume de tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 foi 30,6 + 29,6 mm? (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando a formação de tumor atividade inibidora de aproximadamente 90 % (Figura 30A). Com relação ao peso do tumor, ainda a atividade anti-tumor significante foi observada. O peso do tumor do grupo de controle no dia 40 foi 0,18 + 0,18 g. Em contraste, no grupo de administração do anticorpo K5-70, os tumores desapararecem dfe todos os 8 camundongo individuais e deste modo, formação de tumor foi completamente inibida (Figura 30B). A partir dos resultados mencionados acima, torna-se claro que o anticorpo monoclonal Anti- TROP-2 humano de clone K5-70 mostrou a atividade anti-tumor forte ainda nas células de câncer de próstata humano.
[00545] Exemplo 28
[00546] Metastase-atividade inibidora de anticorpo K5-70 nos modelos de metástase do fígado usando linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59
[00547] A metástase do câncer é um fator importante que influencia a prognóstico clínico no tratamento do câncer gastrointestinal. O controle da metástase é terapeuticamente significante importante. Se não apenas a formação de tumor mas também a metástase do câncer em outros órgãos deve ser suprimida pela administração de um anticorpo para uso na terapia contra o câncer que alveja o TROP-2, a utilidade clínica alta deve ser antecipada. Deste modo, esta é uma propriedade desejada como um anticorpo terapêutico do câncer.
[00548] A expressão de TROP-2 foi confirmada em muitos tipos de carcinomas. Foi relatado que TROP-2 foi expressado em um nível particularmente alto no foco metastático (Br. J. Cancer (2008); 99: 1290-1295, Clin. Cancer Res. (2006); 12: 3057-3063, Mod. Pathol. (2008); 21: 186-191). Além disso, também foi relatado que, quando as células cancerígenas introduzidas pelo Trop-2-gene foram transplantadas nos camundongos nús por intermédio da administração transesplênica ou transpancreática, a incidência da metástase do fígado aumentada (WO 2010/089782, Molecular Cancer (2010); 9: 253) e deste modo, o relatório sugere a importância de TROP-2 no processo de metástase do câncer. Entretanto, para datary, não existe relatório especificamente descrito que um anticorpo que alveja TROP-2 tem ação inibidora de metástase in vivo.
[00549] O anticorpo monoclonal K5-70 anti-hTROP-2 de camundongo, que foi recuperado pela presente invenção, exibe efeitos terapêuticos altos nos modelos de xenoenxerto, na subcutis da qual as células cancerígenas pancreáticas humana foram transplantadas. Foi demonstrado pelo ensaio de arranhão realizado in vitro que o anticorpo K5-70 é capaz de suprimir a capacidade de migração da linhagem celular de câncer pancreático humano PK- 59, além do efeito de suprimir o desenvolvimento das células cancerígenas. Deste modo, foi considerado que o anticorpo K5-70 deve inibir metástase do câncer in vivo. Visto que o efeito inibidor da metástase de um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 de camundongo foi examinado, usando os modelos em que as células PK-59 foram injetadas no baço dos camundongos nús de modo que a metástase do fígado foi desenvolvida.
[00550] No dia antes do transplante da célula cancerígena, os camundongos foram divididos nos grupos. Então, um anticorpo monoclonal anti-hTROP-2 (K5- 70) ou um anticorpo de controle (IGG de camundongo purificado) foi de intraperitonealmente administrado aos camundongos em uma dosagem de 10 mg/kg do peso corporal. Nos seguintes dia, a linhagem celular de câncer pancreático humano (PK-59) endogenosamente que expressa hTROP-2 foi coletada pelo tratamento com tripsina e a suspensão celular 2 x 10” células/mL foi então preparada com PBS. A suspensão celular foi preservada em gelo até o transplante. Cada um de camundongo nu fêmea de 6 ou 7 semanas de idade (Balb/c, nu/ínu) foi anestesiado pela administração intraperitoneal de pentobarbital e 10 a 15 mm do flanco esquerdo deste foi taxado sob anestesia. O baço foi retirado da cavidade abdominal e 50 ul da suspensão celular (1 x 10º células) foi então injetada no baço usando uma seringa 27G. Quatro minutos após injeção das células, o hílio do baço foi ligado com suturas de seda 5-0 e o baço foi então taxado. O corte no peritôneo foi fechado com suturas de seda 4-0 e o local cirúrgico foi então fechado com Wound Clips (AUTOCLIP 9 mm, Becton Dickinson). Além disso, sete dias após um transplante da célula cancerígena, o anticorpo K-70 e o anticorpo de controle foram administrados aos camundongos em uma dosagem de 10 mg/kg do peso corporal. Quatro a seis semanas após um transplante da célula cancerígena, os camundongos foram submetidos a eutanásia pelo deslocamento cervical. Então, o fígado foi taxado a partir de cada camundongo e a presença ou ausência do foco metastático foi confirmada.
[00551] No grupo de controle em que o IgG de camundongo foi administrado aos camundongos, em 4 de 6 camundongos no qual as células PK-59 foram transplantadas, os focos metatásticos aparentes (2 a 7 focos) foram observados em torno do lobo do fígado quatro a seis semanas após um transplante (Figura 31A, incidência de metástase: 67 %, Tabela 6). Em contraste, em quatro camundongos no grupo de administração do anticorpo K5-70, em que as células
PK-59 foram transplantadas, tais focos metatástico não foram observados no fígado de todos dos camundongos e deste modo, uma incidência de metástase foi 0 % (Figura 31B, Tabela 6).
[00552] Tabela 6
[00553] Efeito de supressão da metástase do clone K5-70 nos modelos da metástase do fígado produzidos pelo transplante transesplênico das células PK- 59 em camundongos nús Grupo de administração Semanas após tansplante — Indivíduo Nº — Número de focos metatásticos Determinação da metastase 4W c1 o - Grupo de conrole 4Ww Cc-2 5 + 6ew c-3 Fá +” 6ew ca T + 6ew c-5 2 + SW CS 2 - Número médio dos focos metastácicos — 3.5 Incidência da metástase 67% ATTTTF A AI NINO] o ODDIDD —— Grupo de administração Ks-70 — 6W K-2 o = 6w K-3 o - 8 Número médio dos focos metastácicos o Incidência da metástase o%
[00554] A partir destes resultados, torna-se claro que o anti-anticorpo hTROP- 2 K5-70 tem ação inibidora extremamente forte na metástase do fígado da linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59.
[00555] Exemplo 29
[00556] Atividade anti-tumor de anticorpo K5-70 nos modelos de xenoenxerto usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480, que são modelos de câncer recorrentes após administração de cloridreto de irinotecan
[00557] Nos anos recentes, muitos medicamentos quimioterapêuticos para suprimir o desenvolvimento das células cancerígenas que foram desenvolvidas como medicamento terapêuticos contra o câncer. Estes medicamentos atingiram certos — resultados de tratamento. Entretanto, estes medicamentos quimioterapêuticos foram problemáticos em termos dos efeitos colaterais associados com a ação de supressão do desenvolvimento destes nas células normais outros do que as células cancerígenas e a recorrência do câncer após suspensão do tratamento. Consequentemente, se a recorrência do tumor após finalização do tratamento com medicamentos quimioterapêuticos deve ser suprimida pela administração de um anticorpo terapêutico do câncer alvejando o TROP-2, utilidade clínica alta deve ser antecipada. Deste modo, esta é uma propriedade desejada como um anticorpo terapêutico do câncer.
[00558] Como os agentes terapêuticos para o câncer colorretal, além dos medicamentos contendo 5-FU e platina, cloridreto de irinotecan (Topotecin, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) tendo um efeito inibidor de topoisomerase foi recentemente aplicação aos locais clínicos. Com relação aos modelos de animais também, o efeito anti-tumor de cloridreto de irinotecan nos modelos de camundongo, em que vários various tipos de células de tumor humana incluindo câncer de cólon como um exemplo típico foi transplantado, e foi relatado
(Cancer Chemother Pharmacol. (1991); 28(3):192-8). Deste modo, o efeito de prevenção-recorrência do anti-anticorpo hTROP-2 clone K5-70 (lIgG2a de camundongo) no tumor recorrente após administração de cloridreto de irinotecan foi examinado com os modelos de xenoenxerto usados em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480. As células SW480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito dos camundongos NOD-scid fêmeas de 8 semanas de idade.
Onze dias após um transplante (Dia 11) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mmº?, os camundongos foram divididos em um grupo de não tratamento (grupo de administração de solução salina normal, N = 8, 130,7 + 16,2 mm?) e um grupo de administração de cloridreto de irinotecan (N = 16, 123,0 + 21,4 mm?) (CPT-11, Topotecin, Daiichi Sankyo Co., Ltd.). Portanto, cloridreto de irinotecan foi intraperitonealmente administrado aos camundongos em uma dosagem de 40 mg/kg do peso corporal, uma vez a cada 3 dias, total 3 vezes (Dias 11, 14 e 17). No terceiro dia após a final administração de cloridreto de irinotecan (Dia 20), o volume de tumor de grupo de não tratamento atingiu 232,1 + 21,1 mm?. De outra maneira, o volume de tumor do grupo de administração de cloridreto de irinotecan foi 126,6 + 26,6 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, um efeito que suprime o tumor aparente foi observado.
Neste estágio, o grupo de administração de cloridreto de irinotecan foi divided em dois grupos com base no tamanho de tumor.
Um grupo foi definido como um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8, volume do tumor no dia 20: 126,0 + 28,0 mm?) e o outro grupo foi definido como um Grupo de administração de IgG de camundongo (10 mg/kg do peso corporal, N = 8, volume do tumor no dia 20: 127,2 + 27,0 mm?). Administração intraperitoneal dos anticorpos e a medição de um volume do tumor foram realizados em cada grupo uma vez a cada 3 dias, de modo que como recorrência de um tumor foi avaliada (Figura 32). No grupo de administração de IgG de camundongo, a partir do 18º dia após a administração final de cloridreto de irinotecan (Dia 35), diversos camundongos tendo um tumor recorrente aparente com um volume do tumor maior do que 300 mm? foram observados.
No 30º dia após a administração final de cloridreto de irinotecan (Dia 47), um tumor com um volume do tumor maior do que 300 mm? foi observado em 5 dos 8 camundongos (volume médio do tumor: 401,7 + 172,7 mm?º?). Em contraste, no grupo de administração do anticorpo K5-70, a recorrência do tumor foi significantemente suprimida e o volume médio do tumor foi 180,5 + 142,1 mm? (P < 0,05 pelo teste t de Student) (Figura 32). Em particular, no grupo de administração do anticorpo K5-70, o volume de tumor no dia 47 torna-se menor do que o volume de tumor quando os camundongos foram divididos nos grupos (126,0 + 28,0 mm?). O volume de tumor torna-se menor do que 100 mm? em 4 dos 8 camundongos. À partir destes resultados, torna-se claro que o anti-anticorpo hTROP-2 K5-70 tem ação supressiva extremamente forte ainda no tumor recorrente após administração de cloridreto de irinotecan.
[00559] Exemplo 30
[00560] Mapeamento do epítopo usando tecnologia CLIPS
[00561] <Materiais e métodos >
[00562] Síntese de peptídeo
[00563] 15-mer e 30-mer dos peptídeos lineares derivados a partir dos domínios extracelulares TROP-2, que foram usados no presente experimento, foram obtidos pela síntese de fases sólida de acordo com um método de Fmoc (9-Fluorenilmetoxicarbonil). Além disso, pela análise de epítopo descontínua, os peptídeos 17-mer derivados de um domínio extracelular TROP-2, ambas extremidades de que os resíduos de cisteína foram adicionados, foram sintetizados e uma conformação tendo uma ou duas estruturas de arco foi reconstruídas pela tecnologia CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds technology). Quando outro resíduo de cisteína esteve presente no resíduo de cisteína adicionado, foi substituído com alanina.
[00564] Avaliação de epítopo ELISA
[00565] 5034 tipos dos peptídeos sintetizados foram covalentemente ligados aos cartões PEPSCAN (455 peptídeos/cartão) e a ligação dos peptídeos sintetizados aos anticorpos foi então analisado pelo método ELISA. Os cartões PEPSCAN foram deixados reagir com os anticorpos monoclonais anti TROP-2 - humanos (K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 e T6-16) que foram diluídos a uma concentração de 1 ug/ml com um tampão de bloqueio (um tampão de fosfato contendo 4 % de soro de cavalo, 5 % de ovalbumina e 1 % de Tween). Após lavagem, o resultante foi deixado reagir com um complexo de anticorpo secundário de peroxidase diluída 1000 vezes a 25º C por 1 hora. Após lavagem, uma solução de substrato (uma solução contendo sulfonato de 2,2'-azino-di-3- etilbenztiazolina (ABTS) e 2 uL de 3 % da solução de peróxido de hidrogênio) foi adicionado a solução de reação, seguido pela reação cromogênica por 1 hora. A atividade de ligação dos anticorpos foi quantificada fotografando-se com uma câmera CCD e então realização de uma análise de imagem.
[00566] <Resultados>
[00567] Os anticorpos monoclonais anti-hTROP-2 K5-70, K5-107, K5-116-2-1, T5-86 e T6-16, que exibiram efeitos benéficos, foram submetidos a análise de epítopo usando CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) technology. É notado que o termo “número de aminoácido” é usado nos presentes exemplos para significar o número de aminoácido na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 2 (proteína hTROP-2 (323 resíduos de aminoácidos)).
[00568] O resultado da análise pelo anticorpo K5-70 é mostrado na Tabela 7 abaixo. Como um resultado, foi observado que os 33 peptídeos exibiram a atividade de ligação forte ao anticorpo K5-70. Nestes 33 peptídeos, uma sequência que compreende VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (números de aminoácido 43-65) (peptídeo Nº. 1-7 e 9 mostrados na Tabela 7), uma sequência que compreende HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152- 165) (peptídeo Nº. 14, 22-24 e 28 mostrado na Tabela 7), uma sequência que compreende VHYEQPTIQIELRQO (números de aminoácidos 193-206) (peptídeo Nº. 8, 10, 12, 13, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30 e 32 mostrado na Tabela 7) e uma sequência que compreende DLDAELRRLFRER (números de aminoácidos 171- 183) (peptídeo Nº. 11, 16, 18, 19, 21, 22, 29 e 31 mostrado na Tabela 7) repetidamente aparece. O anticorpo K5-70 particularmente liga fortemente a sequência que compreende VCESPDGPGGRCQCRALGSGMAVD. A partir destes resultados, foi sugerido que, na proteína hTROP-2, os 4 tipos das regiões da sequência de peptídeo anteriormente mencionados são igualmente ser aos epítopos do anticorpo K5-70.
[00569] Tabela7
[00570] Ligação do anticorpo K5-70 aos peptídeos CLIPS derivados a partir dos domínios extracelulares TROP-2 humanos Número Peptídeo Ligação de K5-70 OA NWKMIVCSPDGPGGRCACRALGSGMAVDEST||À|ÀúÀúhM 27ME 2 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2604 3 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2562 4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2402 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 1770 6 PTNNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDC 1391 7 VCSPDGPGGRCOCRALGSGMAVDCSTLTSK 932 8 CAAVHYEQPTIQIELRCAAVHYEQPTIQIELRE 876 9 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 839 CVHYEQPTIQIELRQNCVHYEQPTIQIELRONC 825 u HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 725 12 RLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRO 687 13 AVHYEQPTIQIELRA 642 14 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLIRHRPTAGAC 624 CPKFVAAVHYEQPTIQCGLDLRVRGEPLQVERC 579 16 CHSDLDAELRRLFRERCGLDLRV 538 17 FOGRGGLDLRVRGEP 538 18 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 524 19 CHSDLDAELRRLFRERCRGEPLO 519 CTIQIELRONTSQKAACVHYEQPTIQIELRONC 513 21 CVHYEQPTIQIELRQONCHSDLDAELRRLFRERC 511 22 CHHILIDLIRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 489 23 CHHILIDIRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 489 24 CHHILIDLRHRPTAGACGLDLRVRGEPLQVERC 488 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 483 26 CVHYEQPTIQIELRONC 483 27 CAFNHSDLDAELRRLFCVHYEQPTIQIELRAQNC 478 28 CVHYEQPTIQIELRQONCHHILIDIRHRPTAGAC 473 29 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 472 VHYEQPTIQIELRQNCGLDLRVRGEPLQVERC 470 31 CDELVRTHHILIDLIRHCDLDAELRRLFRERC 469 32 AVHYEQPTIQIELRQCAVHYEQPTIQIELRAC 468 33 CHSDLDAELRRLFRERCDELVRTHHILIDLRHC 466
[00571] O resultado da análise pelo anticorpo K5-107 é mostrado na Tabela 8 abaixo. Como um resultado, foi observado que a uma sequência que compreende VCESPDGPGGRCQAQCRALGSGMAVD (números de aminoácidos 43- 65) foi compreendida 10 dos 20 peptídeos (peptídeo Nº. 1-6, 8, 9, 14 e 17 mostrado na Tabela 8) (Tabela 8).
[00572] Consequentemente, foi sugerido que, na proteína hTROP-2, a região da sequência de peptídeo anteriormente mencionado que consiste de VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD pode ser um epítopo do anticorpo K5-107.
[00573] Tabela8
[00574] Ligação do anticorpo K5-107 aos peptídeos CLIPS derivados dos domínios extracelulares TROP-2 humanos Número Peptídeo Ligação de K5-70 1 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2763 2 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2761 3 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2752 4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2726 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2723 6 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2720 7 TCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV 2716 8 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 2689 9 CSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKC 2655 CTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMA 2655 au NCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGM 2207 12 — DNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG 1816 13 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 1525 14 CTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTLTSKC 1118 QDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGS 874 16 SPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCL 561 17 CTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTC 380 18 TVCSPDGPGGRCQCR 312 19 — CAPKNARTLVRPSEHACARTLVRPSEHALVDNC 284 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 272
[00575] O resultado da análise pelo anticorpo K5-116-2-1 é mostrado na Tabela 9 abaixo. Nesta análise, três tipos das sequências de peptídeo, isto é, uma sequência que compreende VCOSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (números de aminoácidos 43-65) (peptídeo Nº. 1-7, 15 e 25 mostrado na Tabela 9), uma sequência que compreende HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152- 165) (peptídeo Nº. 8-11, 16, 17, 19, 20, 22-24 e 27-29 mostrado na Tabela 9) e uma sequência que compreende DLDAELRRLFRER (números de aminoácidos 171-183) (peptídeo Nº. 11-14, 17, 19, 21, 23 e 29 mostrado na Tabela 9) diversas vezes aparece (Tabela 9). Consequentemente, foi sugerido que, na proteína hTROP-2, estes três tipos das regiões da sequência de peptídeo pode ser epítopos do anticorpo K5-116-2-1.
[00576] Tabela9
[00577] Ligação de anticorpo K5-116-2-1 aos peptídeos CLIPS derivados a partir dos domínios extracelulares TROP-2 humanos
Número Peptideo Ligação de K5-70 1 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2672 2 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2613 3 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2482 4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV DCSTLT 2440 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2423 6 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2136 7 PTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV DC 1723 8 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDIRHRPTAGAC 1643 9 CTHHILIDLRHRPTAGC 1586 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 1504 1 CHHILIDIRHRPTAGCHSDLDAELRRLFRERC 1475 12 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1467 13 CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 1462 14 CDAELRRLFRERYRLHCPK 1442 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 1432 16 DLSLRCDELVRTHHILIDLIRHRPTAGAFNH 1421 17 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 1392 18 CFOGRGGLDLRVRGEPC 1376 19 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1366 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDIRHRPTAGAC 1342 21 CHSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1331 22 CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDIRHRPTAGAC 1323 23 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1266 24 CHHILIDLRHRPTAGACRGEPLQVERTLIYYLC 1229 CSPDGPGGRCOCRAL 1227 26 CTVASPDGPGGRAQARACVHYEQPTIQIELRONC 1223 27 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRONC 1222 28 LSLRCDELVRTHHILIDIRHRPTAGAFNHS 1220 29 CDELVRTHHILIDLRHCHSDLDAELRRLFRERC 1205
[00578] Os resultados da análise pelos anticorpos T5-86 e T6-16 são mostrados na Tabela 10 e tabela 11 abaixo, respectivamente. Nestas análises, os anticorpos fortemente ligam a um peptídeo que compreende uma sequência que consiste de DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120). À sequência de peptídeo mencionado acima foi compreendida em 22 dos 26 ligações de peptídeos ao anticorpo T5-86 (peptídeo Nº. 1-4, 6-8, 10-13, 15-19 e 21-26 mostrado na Tabela 10) e foi compreendid em 4 das 26 ligações de peptídeos ao anticorpo T6-16 (peptídeo Nº. 1, 2, 9 é 13 mostrado na Tabela 11)
(Tabela 10 e tabela 11). Além disso, na análise com relação ao anticorpo T5-86, outro do que a sequência que compreende DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120), uma sequência que compreende VCSPDGPGGRCQCRA (números de aminoácidos 43-57) (peptídeo Nº. 5, 14 e 20 mostrado na Tabela 10) diversas vezes aparecem. Além disso, uma análise com relação ao anticorpo T6-16 também, outra sequência que compreende HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152-165) (peptídeo Nº. No. 4-8, 10-12, 19, 21, 23, 25 e 26 mostrado na Tabela 11) foi observado diversas vezes. Consequentemente, foi sugerido que, na proteína hTROP-2, dois tipos de regiões da sequência de peptídeo, isto é, DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120) e VCSPDGPGGRCQCRA (números de aminoácidos 43-57), podem ser epítopos do anticorpo K5-86. Também foi sugerido que, na proteína hTROP-2, dois tipos de regiões da sequência de peptídeo, isto é, DPEGRFKARQCN (números de aminoácidos 109-120) e HHILIDLRHRPTAG (números de aminoácidos 152-165), podem ser epítopos do anticorpo T6-16.
[00579] Tabela 10
[00580] Ligação de anticorpo T5-86 aos peptídeos CLIPS derivados a partir dos domínios extracelulares TROP-2 humanos
Número Peptideo Ligação de K5-70 1 CYDPDADPEGRFKARQCADPEGRFKARQANQTC 2306 2 PDCDPEGRFKARQCN 2292 3 CADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 2287 4 VCSPDGPGGRCOCRA 2263 CYDPDADPEGRFKARQCPDADPEGRFKARQANC 2260 6 CADPEGRFKARQANQTCTDPDADPEGRFKARQC 2240 7 CADPEGRFKARQANQTCYDPDADPEGRFKARQC 2208 8 DCDPEGRFKARQCNQ 2150 9 CTVASPDGPGGRAQARCHSDLDAELRRLFRERC 2086 CDADPEGRFKARQANQCDADPEGRFKARQANQC 2035 1 DGRFKARQANQTSVAWCARTLVRPSEHALVDNC 2019 12 DADPEGRFKARQANQTCPDADPEGRFKARQANC 1980 13 CPDADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC 1950 14 CSPDGPGGRCOCRAL 1946 CEGRFKARQANQTSVACEGRFKARQANQTSVAC 1895 16 CTVASPDGPGGRAQARCPDADPEGRFKARQANC 1890 17 CGLYDPDADPEGRFKACPDADPEGRFKARQANC 1857 18 DPDCDPEGRFKARQCNCQTSVCWCVNSVGVR 1850 19 CPEGRFKARQANQTSVCDELVRHHILIDLRHC 1841 CPDGPGGRAQARALGSCHSDLDAELRRLFRERC 1830 21 CTLVRPSEHALVDNDGCGRFKARQANQTSVAWC 1820 22 CPDADPEGRFKARQANCYDPDADPEGRFKARQC 1795 23 CGLYDPDADPEGRFKACPEGRFKARQANQTSVC 1793 24 YDPDCDPEGRFKARQ 1775 CPDADPEGRFKARQANCADPEGRFKARQANQTC 1773 26 CDPEGRFKARQCNQT 1772
[00581] Tabela 11
[00582] Ligação de anticorpo T6-16 aos peptídeos CLIPS derivados a partir dos domínios extracelulares TROP-2 humanos
Número Peptideo Ligação de K5-70 1 — CVNSVGVRRTDKGDLSCPDCYDPDADPEGRFKARQC 1072 2 CSVGVRRTDKGDLSLRCYDPDADPEGRFKARQC 786 3 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDA ELRRLFRERC 714 4 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERY RC 713 CVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILI 688 6 VRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRP 670 7 CVERTLIYYLDEIPPKCHHILIDLRHRPTAGAC 626 8 CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 620 9 CVNSVGVRRTDKGDLSCPDADPEGRFKARQANC 611 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDIRHRPTAGAC 602 1 VGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRH 601 12 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 592 3 CSVGVRRTDKGDLSLRCPDADPEGRFKARQANC 585 14 CVRPSEHALVDNDGLYCSVGVRRTDKGDLSLRC 573 CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDA ELRRLFRERC 566 16 —CSVGVRRTDKGDLSLRCNDGLYDPDADPEGRFC 559 17 CVNSVGVRRTDKGDLSCGLYDPDADPEGRFKAC 553 18 CDLDAELRRLFRERYRCHSDLDAELRRLFRERC 534 19 CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 534 CAGAFNHSDLDAELRRCDLDAELRRLFRERY RC 529 21 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 527 2 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERY RC 526 23 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 524 24 CGVRRTDKGDLSLRADCGVRRTDKGDLSLRADC 524 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 521 26 CDLDAELRRLFRERYRCDELVRTHHILIDLRHC 516
[00583] Exemplo 31
[00584] Sequenciamento das regiões variáveis dos genes de anticorpo dos anticorpos anti-hTROP-2 de camundongo (clones K5-70, K5-107, K5-116-2-1 and T6-16)
[00585] O RNA total foi extraído de 3 x 10º hibridomas de produção de anticorpo monoclonal anti-TROP-2 de camundongo, usando reagente TRlizol (Invitrogen). Com relação ao clone K5-70, clone K5-107 e clone K5-116-2-1, CDNA foi sintetizado utilizando kit de amplificação SMARTer"Y RACE cDNA
(Clontech) de acordo com o método incluído com o kit, usando um Iniciador específico pela cadeia de H de IgG de camundongo (5'-TCCAKAGTTCCA-3' (SEQ ID Nº: 24)) e um Iniciador específico pela cadeia L de IgG de camundongo (S-GCTGTCCTGATC-3' (SEQ ID Nº: 25)). Com relação ao clone T6-16, CONA foi sintetizado utilizando kit GeneRacer (Invitrogen) de acordo com o método incluído com o kit, usando um iniciador oligo dT. Os genes que codificam as regiões variáveis (VH, VL) das cadeias H e L do clone K5-70 (lIgG2a de camundongo), clone K5-107 (I9G1 de camundongo) e clone K5-116-2-1 (I9G2a de camundongo) foram cada um clonada por um método PCR usando o cDNA sintetizado acima como um modelo. Nesta operação, 10 x Mistura de iniciador À universal (UPM) incluído com kit de amplificação SMARTer'"Y RACE cDNA foi usado como um iniciador 5. De outra maneira, como um iniciador 3' pela amplificação VH, um iniciador tendo uma sequência específica a cadeia H de IgG de camundongo foi usada e como um iniciador 3' pela amplificação VL, um iniciador tendo uma sequência específica a cadeia de IgG de camundongo L foi usada.
[00586] Iniciador 5' (10 x Mistura de iniciador A universal (UPM)):
[00587] Longo (0,4 uM)
[00588] 5-
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (SEQ ID Nº: 26)
[00589] Curto (2 uM)
[00590] 5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID Nº: 27)
[00591] Iniciador 3' (iniciador R):
[00592] VH:5-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3' (SEQ ID Nº: 28)
[00593] 5-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3' (SEQ ID Nº: 29)
[00594] VL:5-CACTGCCATCAATVCTCCACTTGACA-3' (SEQ ID Nº: 30)
[00595] Usando cada um dos iniciadores descritos acima, PCR foi realizado sob as seguintes composições da solução de reação e condições de reação. Além disso, um iniciador R pela amplificação de VH cDNA foi preparado pela mistura de duas sequências acima com cada outro em uma razão equimolar e foi então usada.
[00596] <Composição da solução de reação>
[00597] cDNA de modelo:2,5 ul
[00598] 5x tampão de PrimeSTAR (Mg?* mais):10 ul
[00599] 2,5 mM de dNTP:4 ul
[00600] Polimerase de DNA PrimeSTAR HS (2,5 U/uL):0,5 ul
[00601] 10 x Mistura de iniciador A universal (UPM):5 ul
[00602] Iniciador R (10 uM):1 ul
[00603] Água esterilizada:27 ul
[00604] Total:50 ul
[00605] <Condições de reação>
[00606] Uma reação foi realizada a 94º C (10 segundos) e portanto, um ciclo que consiste de “desnaturação/dissociação de calor a 98º C (10 segundos) — recozimento a 60º C (5 segundos) -—» síntese/alongamento a 72º C (60 segundos)" foi realizada 30 vezes no total. Finalmente, uma reação foi realizada a 72º C (3 min).
[00607] Os cDNA VH e VL sintetizados foram subclonados em um vetor pMD20-T (Takara Bio Inc.) e as sequência de nucleotídeos destes foram determinadas. As sequências de nucleotídeo de uma pluralidade dos clones VH e clones VL foram decodificados e as sequências de nucleotídeos específicos às regiões variáveis de cadeia H e cadeia L de camundongo foram identificadas. A Figura 33 e Figura 34 mostra as sequências de nucleotídeos de cDNA consenso do VH e VL de K5-70 e sequências de aminoácidos putativos. Figura e Figura 36 mostra as sequências de nucleotídeos de cDNA consenso do VH e VL de K5-107 e sequências de aminoácidos putativos. Figura 37 e Figura 38 mostra as sequências de nucleotídeos de cDNA consenso do VH e VL de K5-
116-2-1 e sequências de aminoácidos putativos.
[00608] Os genes que codificam as regiões variáveis (VH, VL) das cadeias H e L do clone T6-16 foram clonados por um método PCR usando o cDNA sintetizado acima como um modelo. Nesta operação, um iniciador incluído com kit GeneRacer foi usado como um iniciador 5º. De outra maneira, como um iniciador 3' pela amplificação VH, um iniciador tendo uma sequência específico a cadeia H de IgG de camundongo foi usado e como um iniciador 3' pela amplificação VL, um iniciador tendo uma sequência específica a cadeia IgG de camundongo L foi usada.
[00609] Iniciador 5' (iniciador F):
[00610] 5-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (SEQ ID Nº: 31)
[00611] Iniciador 3' (Iniciador R):
[00612] VH: 5- GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (SEQ ID Nº: 32)
[00613] VL:5- GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID Nº: 33)
[00614] Usando cada um dos iniciadores descritos acima, PCR foi realizado sob as seguintes composições da solução de reação e condições de reação.
[00615] <Composição da solução de reação>
[00616] cDNA de modelo:1,0 ul
[00617] 5*tampão de PrimeSTAR (Mg?* mais):10 ul
[00618] 2,5mM de dNTP:4 ul
[00619] Polimerase de PrimeSTAR HS DNA (2,5 U/uL):0,5 ul
[00620] Iniciador F (10 uM):3 ul
[00621] Iniciador R (10 uM):1,0 ul
[00622] Água esterilizada:30,5 ul
[00623] Total:50 ul
[00624] <Condições de reação>
[00625] Um ciclo que consiste de “desnaturação/dissociação de calor a 98º C (10 segundos) —> recozimento a 57º C (10 segundos) > síntese/alongamento a 72º C (60 segundos)” foi realizado 35 vezes no total.
[00626] Os cDNAs VH e VL sintetizados foram clonados em um vetor pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) e as sequência de nucleotídeos destes foram determinadas. As sequências de nucleotídeo de uma pluralidade dos clones VH e clones VL foram decodificados e sequências de nucleotídeos específicas as regiões variáveis de cadeia H e cadeia L de camundongo foram identificadas. Figura 39 e Figura 40 mostram as sequências de nucleotídeos de cDNA consenso do VH e VL de T6-16 e sequências de aminoácidos putativos.
[00627] Exemplo 32
[00628] Projeto de anticorpo K5-70 humanizado
[00629] A humanização das regiões variáveis (VH, VL) do anticorpo K5-70 preparada nos prévios Exemplos foi realizado como seguem de acordo com o método de Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989). Primeiro, a modelagem molecular da estrutura tricdimensional de cada região variável de anticorpo K5-70 foi realizada usando um computador. Subsequentemente, a busca da homologia foi realizada com as sequências da região variável dos genes de anticorpo humano. Como um resultado, uma sequência de cDNA (DA980102 VH) com o número de acessão GenBank de DAS980102 foi selecionado como um aceitante que fornece uma região de estrutura (FR) necessária pela humanização de K5-70 VH (Genome Res. 16:55- 65, 2006). Igualmente, a sequência de cDNA (L41174 VL) com o número de acessão GenBank de L41174 foi selecionado como um aceitante que fornece uma região de estrutura (FR) necessária pela humanização de K5-70 VL (J. Biol. Chem. 270:12457-12465, 1995).
[00630] Pela humanização de K5-70 VH, a sequência de CDR de K5-70 VH foi substituída com a posição correspondente de DAS80102 VH usado como um aceitante. Como um resultado da análise da estrutura tri-dimensional de acordo com a modelagem de computador, com relação ao resíduos de aminoácidos (isoleucina (|) na posição 48, lisina (K) na posição 66, alanina (A) na posição 67,
valina (V) na posição 71 e treonina (T) na posição 93) que são adjacentes a CDR de K5-70 VH e são assumidos para apresentar os papéis importantes pela manutenção da estrutura, aqueles de K5-70 VH foram retidos e a região FR residual foi substituída com a sequência aceitante. Os números da posição do resíduo de aminoácido em VH e VL foram usados de acordo com as definições de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edição, Publicação NIH Nº. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991).
[00631] Além disso, a metionina (M) como um resíduo de aminoácido na posição 82 de uma sequência aceitante DA980102 VH foi altamente semelhante aos resíduos de aminoácido especiais causados pela hipermutação somática. Deste modo, a fim de diminuir antigenicidade potencial, a metionina anteriormente mencionada foi substituída com leucina (L) que é mais comum como um resíduo de aminoácido na posição 82. Um alinhamento das sequências de aminoácido deste modo K5-70 VH humanizados projetados (HuK5-70 VH), K5-70 VH e DA980102 VH é mostrado na Figura 41.
[00632] Com relação ao projeto do K5-70 VL humanizado também, o mesmo transplante de uma sequência CDR como descrito acima foi realizada. Como um resíduo de aminoácido (lisina (K) na posição 49) importante pela manutenção da estrutura de CDR, que do K5-70 VL foi retido e a região FR residual foi substituída com a sequência aceitante (HuK5-70 VL). Um alinhamento das sequências de aminoácido de HuK5-70 VL, K5-70 VL e L41174 VL é mostrado na Figura 42.
[00633] Exemplo 33
[00634] Projeto do anticorpo humanizado T6-16
[00635] A humanização das regiões variáveis (VH, VL) do anticorpo T6-16 preparada nos prévios Exemplos foi realizado como seguem de acordo com o método de Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989). Primeiro, a modelagem molecular da estrutura tri-dimensional de cada região variável de anticorpo T6-16 foi realizada usando um computador. Subsequentemente, busca da homologia foi realizada com as sequências da região variável dos genes de anticorpo humano. Como um resultado, a sequência de cCDNA (DA935238 VH) com o número de acessão GenBank de DAS935238 foi selecionado como um aceitante que fornece uma região de estrutura (FR) necessária pela humanização de T6-16 VH (Genome Res. 16:55- 65, 2006). Igualmente, a sequência de cDNA (M99608 VL) com o número de acessão GenBank de M99608 foi selecionado como um aceitante que fornece uma região de estrutura (FR) necessária pela humanização de T6-16 VL (J.
Immunol. 149:2518-2529, 1992).
[00636] Pela humanização de T6-16 VH, a sequência de CDR de T6-16 VH foi substituída com a posição correspondente de DA935238 VH usada como um aceitante. Como um resultado da análise da estrutura tri-cdimensional de acordo com a modelagem de computador, com relação ao resíduos de aminoácidos (isoleucina (1) na posição 48, alanina (A) na posição 67 e lisina (K) na posição 73) que são adjacentes a CDR de T6-16 VH e são assumidos para apresentar os papéis importantes pela manutenção da estrutura, aqueles de T6-16 VH foram retidos e a região FR residual foi substituída com a sequência aceitante (HuT6-16 VH1). Além disso, o resíduo de lisina (K) na posição 73 foi improvável ter a influência de uma formação apropriada de um local de ligação de antígeno e deste modo, uma sequência de aminoácido, em que o resíduo de lisina de HuT6-16 VH1 foi substituída com treonina (T) como um resíduo de aminoácido mais generoso, foi proposto, separadamente (HuT6-16 VH2). Um alinhamento das sequências de aminoácido deste modo o T6-16 VH humanizado projetado (HuT6-16 VH1 e HuT6-16 VH2), T6-16 VH e DA935238 VH é mostrado na Figura 43.
[00637] Com relação ao projeto do T6-16 VL humanizado também, o mesmo transplante de uma sequência CDR como descrito acima foi realizada. Os resíduos de aminoácido importantes pela manutenção da estrutura de CDR foram retidos também na sequência aceitante e como uma sequência FR, a mesma sequência como uma sequência aceitante foi usada (HuT6-16 VL). Um alinhamento das sequências de aminoácido de HuT6-16 VL, T6-16 VL e L41174 VL é mostrado na Figura 44.
[00638] Exemplo 34
[00639] Síntese dos genes K5-70 VH e VL humanizados
[00640] Os genes que codificam HuK5-70 VH e HuK5-70 VL foram preparados como seguem. Os genes foram sintetizados com base em uma sequência de aminoácido em que uma sequência de peptídeo de sinal derivado a partir dos K5-70 VH ou VL foi adicionado ao local de terminal N de cada um do HuK5-70 VH e VL projetado acima (Operon). Nesta operação sintética do gene, uma sequência Kozak (ACC ACC) foi adicionado ao local de terminal 5' da sequência do gene de cada um do HuK5-70 VH e HuK5-70 VL sintetizado. Além disso, um local EcoRI (GAA TTC) foi adicionado como uma enzima de restrição à extremidade de 5' do HuK5-70 VH e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado a extremidade 3' deste. Igualmente, um local Agel (ACC GGT) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 5' de HuK5-70 VL e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado a extremidade 3' deste. O gene HuK5-70
VH e gene HuK5-70 VL sintetizado foram incorporados em um vetor pCR2.1 (Invitrogen) de acordo com a clonagem TA. A sequência dos genes de HuK5-70 VH e VL preparada pela síntese de gene é mostrada nas Figuras 45 e 46, respectivamente.
[00641] Exemplo 35
[00642] Síntese dos genes T6-16 VH1, T6-16 VH2 e T6-16 VL humanizados
[00643] Os genes que codificam HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 e HuT6-16 VL foram preparados como seguem. Os genes foram sintetizados, com base em uma sequência de aminoácido em que a sequência de peptídeo de sinal derivado a partir dos T6-16 VH foi adicionado ao local de terminal N de cada um do HuT6-16 VH1 e HuT6-16 VH2 projetado acima e uma sequência de aminoácido em que a sequência de peptídeo de sinal derivada a partir de T6-16 VL foi adicionado ao local de terminal N de HuT6-16 VL (Operon). Nesta operação sintética do gene, uma sequência Kozak (ACC ACC) foi adicionada ao local de terminal 5' da sequência do gene de cada um dos HuT6-16 VH1, HuT6- 16 VH2 e HuT6-16 VL sintetizados. Além disso, um local EcoRI (GAA TTC) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 5' de cada um de HuT6-16 VH1 e HuT6-16 VH2 e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado a extremidade 3' deste. Igualmente, um local Agel (ACC GGT) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 5' do T6-16VL humanizado e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado a extremidade 3' deste. O gene HuT6-16 VH1, gene HuT6-16 VH2 e gene HuT6-16 VL sintetizado foram incorporados em um vetor pCR2.1 (Invitrogen) de acordo com a clonagem TA.
[00644] A sequência dos genes de HuT6-16 VH1, HuT6-16 VH2 e HuT6-16 VL preparada pela síntese do gene é mostrada nas Figuras 47 a 49, respectivamente.
[00645] Exemplo 36
[00646] Contrução dos vetores de expressão do gene pelos genes K5-70 VH e VL humanizados
[00647] Os genes HuK5-70 VH e VL, que foram cada um incorporados no vetor pCR2.1 (Invitrogen), foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e Nhel e Agel e BsiWIl, respectivamente e fragmentos do gene foram então recuperados. Subsequentemente, o gene HuK5-70 VH clivado foi inserido no Local EcoRI/Nhel de um vetor pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) como um vetor de expressão da célula animal pela expressão de uma forma IgG1 humana (PFUSE-CHlIg-HuK5-70), considerando o gene HuK5-70 VL foi inserido no local Agel/BsiWIl de um vetor pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) como um vetor de expressão da forma Igx humana (pFUSE2-CLIg-HuK5-70). Deste modo, cada construção foi finalizada.
[00648] Exemplo 37
[00649] Contrução dos vetores de expressão do gene pelos genes T6-16 VH1, T6-16 VH2 e T6-16 VL humanizados
[00650] Os genes T6-16 VH1 e T6-16 VH2, que foram cada um incorporados no vetor pCR2.1 (Invitrogen), foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI! e Nhel e o gene T6-16 VL foi digerido com as enzimas de restrição Agel e BsiWl. Então, fragmentos do gene foram recuperados. Subsequentemente, o gene T6-16 VH1 clivado foi inserido no Local EcoRI/Nhel de um vetor pFUSE- CHIg-hG1 (InvivoGen) (pFUSE-CHlIg-HuT6-16-1) e o gene T6-16 VH2 também foi inserido no Local EcoRI/Nhel de um vetor pFUSE-CHIg-hG1 (pFUSE-CHlIg- HuT6-16-2). O gene T6-16 VL foi inserido no local Agel/BsiWI de um vetor pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) (pFUSE2-CLIg-HuT6-16). Deste modo, cada construção foi finalizada.
[00651] Exemplo 38
[00652] Estabelecimento das linhagens celulares 293F capazes de estavelmente expressar anticorpo HuK5-70, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2
[00653] As células 293F (Invitrogen) foram mantidas e cultivadas no mei ode expressão FreeStyle 293 (Invitrogen). Os genes foram introduzidos nas células 293F usando um reagente de fectina 293 (Invitrogen) de acordo com os protocolos incluídos a este. Isto é, pFUSE-CHIg-HuK5-70 e pFUSE2-CLIg- HuK5-70 foram ambos introduzidos nas células 293F e seleção de medicamento foi então realizada usando Zeocina (InvivoGen) e Blasticidina (InvivoGen), de modo a estabelecer as linhagens celulares capazes de estavelmente expressar um anticorpo HuK5-70. Também, pFUSE-CHlIg-HuT6-16-1 e pFUSE2-CLIg- HuT6-16 foram ambos introduzidos nas células 293F e a seleção de medicamento mencionada acima foi então realizada, de modo a estabilizar as linhagens celulares capazes de estavelmente expressar um anticorpo HuT6-16-
1. Também, prFUSE-CHlg-HuT6-16-2 e pFUSE2-CLIg-HuT6-16 foram ambos introduzidos nas células 293F e a seleção de medicamento mencionada acima foi então realizada, de modo a estabilizar as linhaes celulares capazes de estavelmente expressar um anticorpo HuT6-16-2.
[00654] Exemplo 39
[00655] Purificação das proteínas do anticorpo HuK5-70, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2
[00656] As linhagens celulares que expressam o anticorpo estabelecido foram cada um inoculado no meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen) em uma densidade celular de 1 a 2,5 x 10º células/ml e portanto, cultura em garrafa rolante foi realizada por 6 a 8 dias. Portanto, um sobrenadante de cultura foi recuperado e cada anticorpo humanizado foi então purificado usando fluxo rápido de sefarose rProteína A (GE Healthcare) de acordo com um método comum.
[00657] A Figura 50 mostra os resultados obtidos pela confirmação pelo Western blotting da expressão de cada um da proteína de anticorpo humanizado em um sobrenadante de cultura das células 293F, em que um anticorpo HuK5- 70, um anticorpo HuT6-16-1 e um anticorpo HuT6-16-2 foram expressados. Especificamente, após finalização de SDS-PAGE, cada proteína foi transferida em uma membrana PVDF (Immobilon-P, Millipore, IPVHOO010). A membrana foi bloqueada em temperatura ambiente por 30 minutos usando TBS (Solução temponada por Tris) contendo 5 % de leite desnatado. O resultante foi lavado com 0,1 % de TBST (TBS contendo 0,1 % de Tween 20) por 5 minutos três vezes e foi então deixado reagir com um anticorpo primário.
[00658] A linha 1 indica um sobrenadante de cultura das células 293F em que nenhum dos genes foi introduzido (controle negativo) e a linha 2 indica um sobrenadante de cultura das células 293F em que pFUSE-CHIg-HuK5-70 e pFUSE2-CLIg-HuK5-70 foram introduzidos. Para detecção das proteínas da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo HuK5-70, um anticorpo anti-lgG F(ab')] humano marcado com biotina (Rockland) foi usado. A linha 3 indica uma sobrenadante de cultura das células 293F em que prFUSE-CHIg-HuT6-16-1 e pFUSE2-CLIg-HuT6-16 foram introduzidos e linha 4 indica um sobrenadante de cultura das células 293F em que pFUSE-CHlIg-HuT6-16-2 e pFUSE2-CLIg- HuT6-16 foram introduzidos. As proteínas de cadeia pesada do anticorpo HuT6- 16-1 e os anticorpos HuT6-16-2 foram detectados com um anticorpo anti-lgG Fc humano marcado com biotina (Rockland), considerando as proteínas de cadeia leve do anticorpo HuT6-16-1 e o anticorpo HuT6-16-2 foram detectados com um anticorpo anti-lgG F(ab')? humano marcado com biotina (Rockland).
[00659] Como um resultado, em todos os casos do anticorpo HuK5-70, o anticorpo HuT6-16-1 e o anticorpo HuT6-16-2, a expressão da cadeia pesada e proteínas de cadeia leve foi confirmada em cada sobrenadante de cultura.
[00660] Além disso, Figura 51 mostra os resultados obtidos pelo carregamento do anticorpo HuK5-70 purificado, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 em SDS-PAGE e então o tingimento deste com CBB. Em todos dos casos, a cadeia pesada de aproximadamente 50 kD e uma cadeia leve de aproximadamente 25 kD foram detectados sob as condições de redução e grupos foram confirmados nas mesmas posições como a cadeia pesada e cadeia leve detectada pelo Western blotting descrito acima. A partir destes resultados, foi confirmado que uma proteína de anticorpo HuK5-70, uma proteína de anticorpo HuT6-16-1 e uma proteína de anticorpo HuT6-16-2 foram gerados.
[00661] Exemplo 40
[00662] Afinidade de antígeno do anticorpo K5-70 humanizado (HuK5-70) e anticorpos T6-16 humanizados (HuT6-16-1 e HuT6-16-2)
[00663] A afinidade de antígeno do anticorpo HuK5-70 purificado, anticorpo HuT6-16-1 e anticorpo HuT6-16-2 foi examinada pelos métodos usando FACS e ELISA.
[00664] FACS foi realizado, usando células HEK293-hTROP-2 em que um gene TROP-2 humano de comprimento total foi estavelmente expressado nas células HEK293 e a linhagem celular do câncer pancreático PK-59 que endogenosamente expressado uma proteína TROP-2 humana na superfície celular. 100 ul de uma solução de anticorpo usado como um anticorpo primário, que foi diluído a 1 ug/ml com um meio contendo 10 % de FCS, foi adicionado a uma suspensão (5 x 10º células) das células (células HEK293-hTROP-2 ou células PK-59), que foi removida a partir do disco de cultura pelo tratamento com tripsina e a mistura obtida foi então incubada a 4º C por 20 minutos.
Portanto, o resultante foi lavado com 1 ml de um meio contendo 10 % de FCS.
Então, anticorpo secundário (100 ul cada), em que um anticorpo anti-lgG de camundongo marcado com ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen) ou um anticorpo anti-lgG Fc humano marcado com biotina (Rockland) foi de diluído até 200 vezes ou 2000 vezes, respectivamente, foi adicionado ao resultante.
A mistura obtida foi incubada a 4º C por 20 minutos e foi então lavada com 1 ml de um meio contendo 10 % de FCS novamente.
Em um caso em que o anticorpo anti- IgG Fc humano marcado com biotina foi usado como um anticorpo secundário, 100 ul de uma solução de rotulação, em que PE marcado com estreptavidina (BD Pharmingen) foi de diluído até 400 vezes, foi adicionado a este como um reagente de rotulação de fluorescência.
Portanto, a mistura obtida foi incubada a 4º C por 20 minutos e foi então lavada com 1 ml de um meio contendo 10 % de FCS.
Subsequentemente, as células rotuladas contendo amostra foi recolocada em suspensão em 1 ml de PBS contendo 1 % de FCS e 2 mM de EDTA e a suspensão obtida foi então analisada usando FACSCAalibur (Becton Dickinson). Como um resultado, foi observado que os anticorpo HuK5-70 mostraram reatividade equivalente aquele de um anticorpo K5-70 de camundongo tanto nas células HEK293-hTROP-2 quanto nas células PK-59. Igualmente, o anticorpo HuT6-16-1 e o anticorpo HuT6-16-2 mostram reatividade equivalente aquele de um anticorpo T6-16 (Figura 52).
[00665] Além disso, a afinidade de antígeno também foi examinada por um método ELISA. ELISA foi realizada usando uma placa ELISA que foi revestida com a proteína recombinante da região extracelular NTROP-2 como descrita no Exemplo 3. Especificamente, uma placa de 96 reservatórios (BD FALCON) foi revestido com uma proteína recombinante 50 ul/reservatório de uma regiçao extracelular hTROP-2 que foi diluída com PBS a 0,5 ug/ml (a 4º C durante a noite). Portanto, o resultante foi lavado com um tampão de lavagem (PBS contendo 0,05 % de Tween 20) e um tampão de bloqueio (PBS contendo 2 % de leite desnatado e 0,05 % de Tween 20) foi então adicionado a este (200 ul/reservatório) para bloquear (em temperatura ambiente por 1 hora). O resultante foi lavado com um tampão de lavagem. Portanto, um anticorpo HuK5- 70, um anticorpo HuT6-16-1, um anticorpo HuT6-16-2, um anticorpo K5-70 e um anticorpo T6-16 foram diluídos com um tampão ELISA (PBS contendo 1 % de leite desnatado e 0,025 % de Tween 20) em uma faixa de concentração de 3,05 x 10º a5 ng/ml, de modo a preparar uma série de amostras de diluição duas vezes. As amostras de diluição obtidas foram cada uma adicionadas em uma quantidade de 50 ul/reservatório a placa ELISA descrita acima (em temperatura ambiente por 2 horas). O produto de reação foi lavado com um tampão de lavagem e portanto, um anticorpo de cadeia x anti-humano de cabra marcado com HRP (SouthernBiotech) ou um anticorpo anti-lgG de camundongo de ovelha rotulada por HRP (GE Healthcare), cada um de que foi diluído a 2000 vezes com um tampão ELISA, foi adicionado (50 ul/reservatório) como um anticorpo de detecção ao produto de reação (em temperatura ambiente por 1 hora). Após uma mistura ser lavada com um tampão de lavagem, um TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina: SIGMA) solução de substrato foi adicionada (50 ul/reservatório) ao resultante para realizar uma reação de cor.
Então, 1 M de ácido sulfúrico (25 ul/reservatório) foi adicionado ao produto de reação para finalizar a reação.
Usando leitor de microplaca Modelo 550 (BioRad), uma absorbância a 450 nm foi medida com uma absorbância a 655 nm usada como uma referência.
Como um resultado, as curvas de reação de K5-70 e HuK5-70 foram quase sobreposta com cada outro e os valores EC50 destes foram 27 ng/ml e 22 ng/ml, respectivamente (Figura 53). Também, as curvas de reação de T6-16, HuT6-16-1 e HuT6-16-2 foram quase sobrepostos com um outro e os valores EC50 destes foram 30 ng/ml, 27 ng/ml e 27 ng/ml, respectivamente (Figura 54). A partir destes resultados, torna-se claro que todos do anticorpo HuK5-70, o anticorpo HuT6-16-1 e o anticorpo HuT6-16-2 exibe o equivalente da afinidade de antígeno aquele de K5-70 ou anticorpo T6-16 que é um anticorpo precursor antes da humanização.
[00666] Exemplo 41
[00667] Atividade anti-tumor de anticorpo anti-hTROP-2 humanizado (HuK5- 70) in vivo
[00668] Subsequentemente, a atividade anti-tumor de um anticorpo HuK5-70 in vivo foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, que expressa endogenamente TROP-2 humano na superfície celular. As células SWA480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um dos camundongos NOD-scid fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1). Quando o volume médio do tumor atingiu 100 mm?, o agrupamento foi realizado (Dia 9). A partir do dia 9, administração intraperitoneal do anticorpo foi realizada nos intervalos de administração de uma vez a cada três dias. No 39º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 39), o volume de tumor de um grupo de controle (administração PBS, N = 8) foi de 824,3 + 188,8 mmº?. De outra maneira, o volume de tumor de um Grupo de administração do anticorpo HuK5- 70 (10 mg/kg do peso corporal , N = 8) foi de 455,5 + 208,6 mmº (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida no grupo de administração do anticorpo HuK5-70 (taxa inibidora: 44,7 %)
(Figura 55A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,509 + 0,161 g. Em contraste, no grupo de administração do anticorpo HuK5-70, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,272 + 0,1629g (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 46,6 % (Figura 55B).
[00669] Exemplo 42
[00670] Atividade anti-tumor dependente da dosagem de anticorpos anti- hTROP-2 humanizados (HuK5-70 e HuT6-16-2) nos modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480
[00671] A atividade anti-tumor dependente da dosagem de anticorpos HuK5- 70 e HuT6-16-2 foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usada em uma linhagem celular de câncer de cólon humano SW480. As células SWA480 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongos NOD-scid fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1). No 9º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 9) em que o volume médio do tumor atingiu 100 mm?, os camundongos foram divididos em um grupo de controle (PBS grupo de administração, N = 8, 101,65 + 8,35 mm?), 1 mg/kg do peso corporal do grupo de administração do anticorpo HuK5-70 (N = 8, 103,18 + 9,86 mm?), 5 mg/kg do peso corporal do grupo de administração do anticorpo HuK5-70 (N = 8, 101,34 + 8,94 mm?º), 10 mg/kg do peso corporal do grupo de administração do anticorpo HuK5-70 (N = 8, 101,53 + 8,98 mm?), 1 mg/kg do peso corporal do grupo de administração de anticorpo HuT6-16-2 (N = 8, 103,18 + 9,86 mmº), 5 mg/kg do peso corporal do grupo de administração do anticorpo HuT6-16-2 (N = 8, 101,34 + 8,94 mm?) e a 10 mg/kg do peso corporal do grupo de administração do anticorpo HuT6-16-2 (N = 8, 101,53 + 8,98 mm?). Então, a partir do dia 9, administração intraperitoneal de cada anticorpo foi realizada nos intervalos de administração de uma vez a cada três dias.
No 48º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 48), o volume de tumor do grupo de controle foi de 754,67 + 276,05 mm.
De outra maneira, nos grupos de administração do anticorpo HuK5-70, o volume de tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 521,81 + 183,45 mm? (taxa inibidora: 30,9 %), o volume do corpo de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 258,78 + 137,02 mmº (taxa inibidora: 65,7 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o volume de tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 314,60 + 152,89 mm? (taxa inibidora: 58,3 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 56A). Nos grupos de administração de anticorpo HuT6-16-2, o volume de tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 600,41 + 319,84 mm? (taxa inibidora: 20,4 %), o volume de tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 315,32 + 189,02 mm? (taxa inibidora: 58,2 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o volume de tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 270,79 + 266,71 mm? (taxa inibidora: 64,1 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 57A). Com relação ao peso do tumor no dia 48, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,422 + 0,201 g.
De outra maneira, nos grupos de administração do anticorpo HuK5-70, o peso do tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,301 + 0,160 g (taxa inibidora: 28,7 %), o peso do tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,115 + 0,083 g (taxa inibidora: 72,7 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) e o peso do tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,244 + 0,181 g (taxa inibidora: 42,2 %) (Figura 56B). Nos grupos de administração de anticorpo HuT6-16-2, o peso do tumor de 1 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,422 + 0,255 g (taxa inibidora: O %), o peso do tumor de 5 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,247 + 0,151 g (taxa inibidora: 41,5%) e o peso do tumor de 10 mg/kg de peso corporal do grupo de administração foi 0,190 + 0,190 g (taxa inibidora: 53,1 %, P < 0,01 pelo teste t de Student) (Figura 57B). A partir destes resultados, foi confirmado que os anticorpos HuK5-70 e HuT6-16-2 tem atividade anti-tumor dependente da dosagem.
[00672] Exemplo 43
[00673] Atividade anti-tumor de anticorpos monoclionais K5-70 anti-hTROP-2 de camundongo e T6-16 nos modelos de xenoenxerto de tratamento usando linhagem celular do câncer ovariano humano SK-OV-3
[00674] A atividade de anticorpos anti-tumor de K5-70 e T6-16 como anticorpos precursores in vivo foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usando uma linhagem celular do câncer ovariano humano SK-OV- 3, que expressa endogenosamente hTROP-2 na superfície celular. As células SK-OV-3 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um dos camundongos nús fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1). No 11º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 11), camundongos individuais, em que a formação de tumor claro foi observado (volume médio do tumor: aproximadamente 50 mm?), foram divididos nos grupos. Então, a partir do dia 11, administração intraperitoneal de cada anticorpo foi realizada nos intervalos de administração duas vez por semana. No 56º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 56), o volume de tumor de um grupo de controle (administração PBS, N = 8) foi de 652,6 + 349,1 mmº?. De outra maneira, o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo
K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 253,7 + 137,3 mmº (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 61,1 %); e o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 214,6 + 98,6 mmº (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibido (taxa inibidora: 67,1 %) (Figura 58A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,413 + 0,218 g. Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 foi 0,194 + 0,112 (g) (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 53,0 %; e o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 foi 0,183 + 0,093 (g) (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 55,7 % (Figura 58B).
[00675] Exemplo 44
[00676] Atividade anti-tumor de anticorpo monoclonais K5-70 anti-hTROP-2 e T6-16 de camundongo nos modelos de xenoenxerto de tratamento usando human em uma linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-468
[00677] Igualmente, a atividade dos anticorpos anti-tumor de K5-70 e T6-16 in vivo foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usando um humano em uma linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-468, que expressa endogenosamente hTROP-2 na superfície celular.
MDA-MB-468 células (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um dos camundongos nús fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1). No 12º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 12), camundongos individuais, em uma formação de tumor claro foi observado (volume médio do tumor: aproximadamente 50 mm?º), foram divididos nos grupos.
Então, a partir do dia 12, administração intraperitoneal de cada anticorpo foi realizada nos intervalos de administração duas vezes por semana.
No 54º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 54), o volume de tumor de um grupo de controle (Administração PBS, N = 8) foi de 218,6 + 75,5 mmº?. De outra maneira, o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 70,2 + 37,4 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 67,9 %); e o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 88,3 + 42,9 mm? (P< 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 59,6 %) (Figura 59A). Com relação ao peso do tumor no dia 54, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,142 + 0,049 g.
Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo
K5-70 foi 0,050 + 0,033 (g) (P < 0,01 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 64,8 %; e o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 foi 0,077 + 0,046 (g) (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 45,8 % (Figura 59B).
[00678] Exemplo 45
[00679] Atividade anti-tumor de anticorpo monoclonais K5-70 anti-hTROP-2 e T6-16 de camundongo nos modelos de xenoenxerto de tratamento usando human câncer de pulmão linhagem celular Calu-3
[00680] Igualmente, a atividade dos anticorpos anti-tumor de K5-70 e T6-16 in vivo foi examinada com os modelos de xenoenxerto de tratamento usando uma linhagem celular de câncer de pulmão humano Calu-3, que expressa endogenosamente hTROP-2 na superfície celular. As células Calu-3 (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongos nús fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1). No 9º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 9), camundongos individuais, em uma formação de tumor claro foi observado (volume médio do tumor: aproximadamente 100 mm?º), foram divididos nos grupos. Então, a partir do dia 9, administração intraperitoneal de cada anticorpo foi realizada nos intervalos de administração duas vezes por semana. No 41º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 41), o volume de tumor de um grupo de controle (Administração PBS, N = 8) foi de 395,7 + 221,2 mmº?. De outra maneira, o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 120,7 + 125,6 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 69,5 %); e o volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo T6-16 (10 mg/kg do peso corporal, N = 8) foi de 146,3 + 128,4 mmº? (P < 0,05 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 63,0 %) (Figura 60A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,301 + 0,189 g. Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 foi 0,08 + 0,085 (g) (P < 0,01 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 73,5 %; e o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo T6-16 was 0,106 + 0,096 (g) (P < 0,05 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 64,9 % (Figura 60B).
[00681] Exemplo 46
[00682] Atividade anti-tumor de anticorpo monoclonal K5-70 anti-hTROP-2 de camundongo nos modelos de xenoenxerto de prevenção usando linhagem celular do câncer do duto biliar humano TFK-1
[00683] Igualmente, a atividade anti-tumor de um anticorpo K5-70 in vivo foi examinada com os modelos de xenoenxerto de prevenção usando um linhagem celular do câncer do duto biliar humano TFK-1, que expressa endogenosamente hTROP-2 na superfície celular. TFK-1 células (5 x 10º células) foram subcutaneamente transplantadas no flanco direito de cada um do camundongos nús fêmeas de 7 semanas de idade (Dia 1) e a partir do mesmo dia, administração intraperitoneal do anticorpo foi iniciada nos intervalos de administração duas vezes por semana. No 31º dia após um transplante da célula cancerígena (Dia 31), o volume de tumor de um grupo de controle (Administração PBS, N = 5) foi de 1000,4 + 268,9 mmº?. De outra maneira, O volume de tumor de um grupo de administração do anticorpo K5-70 (10 mg/kg do peso corporal, N = 5) foi de 197,2 + 215,5 mm? (P < 0,01 pelo teste t de Student) e deste modo, formação de tumor foi significantemente inibida (taxa inibidora: 80,3 %) (Figura 61A). Com relação ao peso do tumor, o peso do tumor do grupo de controle foi de 0,443 + 0,070 g. Em contraste, o peso do tumor do grupo de administração do anticorpo K5-70 foi 0,063 + 0,052 (g) (P < 0,01 pelo teste t de Student), mostrando uma taxa inibidora de 85,8 % (Figura 61B).
[00684] Exemplo 47
[00685] Análise de avidez de anticorpos HuK5-70 e HuT6-16-2
[00686] A atividade de ligação de antígeno dos anticorpos HuK5-70 and HuT6- 16-2 foi examinada de acordo com um método ELISA (ELISA revestido pelo antígeno de densidade baixa) usando uma placa de 96 reservatórios em que um antígeno de densidade baixa foi revestida. Uma proteína hTACSTD2-Fc-His recombinante (Creative BioMart), que foi preparada em uma concentração de 0,1 ug/ml com um tampão de acetato 0,1 M (pH 5,3), foi adicionado em uma quantidade de 50 ul/reservatório a uma placa de 96 reservatórios e revestimento foi realizado a 4º C durante a noite. Portanto, a mesma análise como aquele no Exemplo 40 foi realizada. Os anticorpos de teste foram diluídos com um tampão ELISA (PBS contendo 1 % de leite desnatado e 0,025 % de Tween 20), de modo a preparar as amostras com uma faixa de concentração de ug/ml em uma série de diluições duas vezes (15 amostras) e para usar. Como um resultado, foi observado que o anticorpo HuT6-16-2 tem atividade de ligação que foi quase equivalente aquele do anticorpo T6-16 (em que os valores de ar EC50 foram 49 ng/mL e 41 ng/mL, respectivamente), mas que o valor ECB50 do anticorpo HuK5-70 foi aproximadamente 20 vezes maior do que aquele do anticorpo K5-70 (em que valores de ar EC50 foram 222 ng/mL e 12 ng/mL, respectivamente; Figura 62).
[00687] Subsequentemente, a atividade de ligação de antígeno dos anticorpos
HuK5-70 e K5-70 foi examinada por ELISA pela análise de uma reação de anticorpo de antígeno monovalente.
IgG anti-humano de cabra (Fcy específico) (Southern Biotech) que foi diluído a 1 ug/ml com um tampão de acetato 0,1 M (pH 5,3) e IgG anticcamundongo de cabra (cadeia y específica) (Southern Biotech) que foi diluída a 3 ug/mL foram adicionadas em cada quantidade de 50 ulL/reservatório em uma placa de 96 reservatórios.
Portanto, o revestimento foi realizado a 4º C durante a noite.
Portanto, o produto de reação foi lavado com um tampão de lavagem (PBS contendo 0,05 % de Tween 20) e um tampão de bloqueio (PBS contendo 2 % de leite desnatado e 0,05 % de Tween 20) foi então adicionado a este (200 ulL/reservatório) para bloquear (em temperatura ambiente por 1 hora). O resultante foi lavado com um tampão de lavagem.
Portanto, o anticorpo testado, que foi diluído a 1 ug/mlL com um tampão ELISA (PBS contendo 1 % de leite desnatado e 0,025 % de Tween 20), foi adicionado em uma quantidade de 50 uL/reservatório à placa descrita acima.
Durante esta operação, um anticorpo HuK5-70 foi adicionado a um reservatório revestido com IgG anti-humano de cabra (Fcy específico) e um anticorpo K5-70 foi adicionado a um reservatório revestido com IgG anti-ccamundongo de cabra (cadeia y específica). A mistura foi deixada no restante em temperatura ambiente por 1 hora e o produto de reação foi então lavado com um tampão de lavagem.
À proteína recombinante da região extracelular hTROP-2 descrita no Exemplo 3 (hTROP-2 EC) foi de diluída com um tampão ELISA para preparar as amostras com uma faixa de concentração de 5 ug/ml em uma série de diluições de três vezes (10 amostras). Deste modo a amostra obtida foi adicionada em cada gauantidade de 50 uL/reservatório a placa.
A mistura foi deixada no restante em temperatura ambiente por 1 hora e o produto de reação foi então lavado com um tampão de lavagem.
Então, anti-His (G-18) (Santa Cruz), que foi diluído a 2 ug/ml com um tampão ELISA, foi adicionado como um anticorpo primário ao produto de reação (50 uL/reservatório). A mistura obtida foi deixada no restante em temperatura ambiente por 1 hora e foi então lavada com um tampão de lavagem.
Portanto, IgG anti-coelho marcado com HRP (GE Healthcare), que foi diluído a 1000 vezes com um tampão ELISA, foi adicionado como um anticorpo secundário ao produto de reação (50 uLl/reservatório). A mistura obtida foi deixada no restante em temperatura ambiente por 1 hora e foi então lavada com um tampão de lavagem.
Portanto, uma solução de substrato TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidina: SIGMA) foi adicionada em uma quantidade de 50 uL/reservatório ao resultante para realizar uma reação de cor.
Então, 1 M de ácido sulfúrico (25 ul/reservatório) foi adicionado ao produto de reação para finalizar a reação.
Usando Modelo 550 leitor de microplaca (BioRad), uma absorbância a 450 nm foi medida com uma absorbância a 655 nm usada como uma referência. Como um resultado, os valores EC50 calculados a partir das curvas de ligação da protéina NTROP-2EC com os anticorpos K5-70 e HuK5-70 foram 7 ng/ml e 6 ng/mL, respectivamente (Figura 63). Estes resultados demonstram que o anticorpo HuK5-70 e o anticorpo K5-70 tem afinidade de antígeno equivalente em uma reação de anticorpo de antígeno monovalente.
[00688] Como descrito no Exemplo 40, em um método ELISA usando uma placa de 96 reservatórios em que um antígeno de densidade alta (0,5 ug/mL) foi revestida (ELISA revestida por antígeno), a afinidade de antígeno do anticorpo K5-70 foi equivalente a afinidade de antígeno do anticorpo HuK5-70 (Figura 53). Deste modo, foi considerado que a atividade de ligação de antígeno do anticorpo HuK5-70 que é relativamente menor que do aquele do anticorpo K5-70 é um método ELISA, em que um antígeno de densidade baixa (0,1 ug/mL) foi revestido em uma placa, pode ser causado pelo fato que a flexibilidade do movimento de dois membros de ligação de antígeno, isto é, “avidez” é relativamente menor no anticorpo HuK7-50 do que aquele no anticorpo K5-70.
[00689] Exemplo 48
[00690] Preparação e caracterização dos mutantes de anticorpo K5-70 humanizado
[00691] Para o propósito do melhoramento da “avidez" de um anticorpo HuK5- 70, o seguinte experimento foi realizado.
[00692] Se a “avidez” relativamente baixa mencionada acima do anticorpo HuK5-70 é causado pelo VH ou por VL foi examinado pelo seguinte experimento. Primeiro, genes que codificam a região variável de cadeia H (K5-70 VH) e região variável de cadeia L (K5-70 VL) de um anticorpo K5-70 como um anticorpo precursor foram preparados pela síntese do gene (Operon). Durante a síntese do gene, uma sequência Kozak (ACC ACC) foi adicionada ao local de terminal 5' da sequência do gene de cada um do K5-70 VH e o K5-70 VL. Ainda, um local EcoRI (GAA TTC) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 5' de K5-70 VH e um local Nhel (GCT AGC) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 3' deste. Igualmente, um local Agel (ACC GGT) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 5º de K5-70 VL e um local BsiWI (CGT ACG) foi adicionado como um local de enzima de restrição à extremidade 3' deste. Deste modo o gene K5- 70 VH sintetizado e o gene K5-70 VL foram cada um incorporado em um vetor pCR2.1 (Invitrogen). A sequência dos genes de K5-70 VH e VL preparada pela síntese do gene é mostrada na Figura 64 e Figura 65, respectivamente. Os genes K5-70 VH e K5-70 VL incorporados no vetor pCR2.1 foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e Nhel e Agel e BsiWIl, respectivamente e fragmentos do gene foram então recuperados. Subsequentemente, o gene K5- 70 VH clivado foi inserido no local EcoRI/Nhel de um vetor pFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen) como um vetor de expressão pela expressão de uma forma IgG1 humana, considerando o gene K5-70 VL foi inserido no local Agel/BsiWI de um vetor pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) como um vetor de expressão da forma Igx humana, portanto completando as construções quiméricas de camundong- humano (pFUSE-CHIg-MuK5-70 e pFUSE2-CLIg-MuK5-70).
[00693] Deste modo as construções preparadas e o vetor de expressão de cadeia HuK5-70 H (pFUSE-CHlIg-HuK5-70) e o vetor de expressão de cadeia HuK5-70 L (pFUSE2-CLIg-HuK5-70), que foi preparado no Exemplo 36, foram deixados para co-expressar nas células 293F (Invitrogen) pelas combinações 1 a 4 na seguinte tabela. Anticorpo Cadeia H Cadeia L Observações gerado anticorpo pFUSE-CHlg- pFUSE2-CLIg- anticorpo 1 humanizado K5- HuK5-70 HuK5-70 HuK5-70 70 K5-70 VH 2 pFUSE-CHlIg- pFUSE2-CLIg- anticorpo humanizado/K5- HuK5-70 MuK5-70 HuVvVH/MuVL 70 VL de camundongo
K5-70 VH de 3 pFUSE-CHlg- pFUSE2-CLIg- anticorpo | camundongo/ K5- MuK5-70 HuK5-70 MuVH/HuvL 70 VL humanizado pFUSE-CHlg- pFUSE2-CLIg- anticorpoCh | anticorpo K5-70
[00694] A transfecção dos vetores de expressão descritos acima nas células 293F (Invitrogen) foi realizada usando reagente NeoFection (Astec) de acordo com um método descrito nas instruções incluídas com este. Após finalização da transfecção, o resultante foi cultivado por 5 dias usando meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen) a 37º C em uma incubadora CO;, com uma concentração CO, de 8 %. Portanto, um sobrenadante de cultura foi recuperado. A concentração de anticorpo no sobrenadante de cultura foi medida por um método de sandwich ELISA. Especificamente, IgG anti-humano de cabra (Fcy específico) (Southern Biotech), que foi diluído a 1 ug/ml com PBS, foi adicionado em uma quantidade de 50 uL/reservatório a uma placa de 96 reservatórios. Portanto, o revestimento foi realizado a 4º C durante a noite. Portanto, o produto de reação foi lavado com um tampão de lavagem (PBS contendo 0,05 % de Tween 20) e um tampão de bloqueio (PBS contendo 2 % de leite desnatado e 0,05 % de Tween 20) foi então adicionado a este (200 uL/reservatório) para bloquear em temperatura ambiente por 1 hora. O resultante foi lavado com um tampão de lavagem.
Portanto, um sobrenadante de cultura, que foi diluído a um aumento de diluição apropriado com um tampão ELISA (PBS contendo 1 % de leite desnatado e 0,025 % de Tween 20), foi adicionado em uma quantidade de 50 uL/reservatório à placa descrita acima e uma reação foi então realizada em temperatura ambiente por 2 horas.
Como uma preparação padrão, um anticorpo HuK5-70 foi usado.
O produto de reação foi então lavado com um tampão de lavagem.
Como um anticorpo de detecção, anti-humano de kapa de cabra marcado com HRP (cadeia K específica) (Southern Biotech), que foi diluído a 1.000 vezes com um tampão ELISA, foi adicionado em uma quantidade de 50 uL/reservatório ao produto de reação e uma reação foi então realizado em temperatura ambiente por 1 hora.
O produto de reação foi lavado com um tampão de lavagem e portanto, uma solução de substrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina: SIGMA) foi adicionada em uma quantidade de 50 uL/reservatório ao resultante para realizar uma reação de cor.
Então, 1 M de ácido sulfúrico (25 uL/reservatório) foi adicionado ao produto de reação para finalizar a reação.
Usando Leitor de microplaca iMark (BioRad), uma absorbância a 450 nm foi medida com uma absorbância a 655 nm usada como uma referência. a ligação dos 4 tipos de anticorpos contidos no sobrenadante de cultura a hTROP-2 foi medido pelo ELISA revestido pelo antígeno de densidade baixa descrito acima.
Como um resultado, foi observado que a atividade de ligação de um anticorpo MuVH/HuVL constituído com K5-70 VH e HuK5-70 VL de camundongo a hTROP-2 foi equivalente aquele de um anticorpo ChK5-70, mas que a atividade de ligação de um anticorpo HuVH/MuVL constituído com HuK5-70 VH e K5-70 VL de camundongo foi relativamente menor do que aquele de ChK5-70 (Figura 66). Estes resultados sugeridos que HuK5-70 VH envolve a “avidez” de HuK5-70. Visto que a fim de preparar os anticorpos modificados, em que a “avidez” do anticorpo Huk5-70 foi melhorado, substituição de aminoácido foi realizada no HuK5-70 VH.
Como é observado a partir de um alinhamento das sequências de aminoácido de HuK5- 70 VH e K5-70 VH como mostrado na Figura 41, um total de 17 aminoácidos com os números de aminoácidos 5, 7, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 44, 73, 75, 81, 82c, 83, 87, 108 e 109 são diferentes entre HuK5-70 VH e K5-70 VH (em que os números de aminoácidos são usados de acordo com as definições de Kabat et al. (1991)). Os aminoácidos anteriormente mencionados de HuK5-70 VH foram substituídos com os aminoácidos correspondentes de K5-70 VH, deste modo que os mutantes foram preparados de acordo com a síntese do gene.
Então, um vetor de expressão (um mutante pFUSE-CHIg-HuK5-70) foi preparado.
De acordo com o relatório por Landolfi et al. (J.
Immunol. 166:1748, 2001), foi relacionado que os aminoácidos nas posições 11 e 38 de VH são envolvidos na avidez de um anticorpo humanizado e que a avidez e atividade biológica são melhoradas pela substituição de dois aminoácidos acima com os aminoácidos correspondentes derivados a partir do camundongo. Visto que o mutante duplo que compreende a substituição dos aminoácidos nas posições 11 e 38 também foi preparado. Os nomes deste modo preparados 18 tipos de mutantes HuK5-70 VH e suas sequências de aminoácido são mostradas na Figura 67.
[00695] Os 18 tipos de mutantes HuK5-70 VH preparados (vetores de expressão pelos mutantes pFUSE-CHIg-HuK5-70) foram cada um combinado com um vetor de expressão HuK5-70 L de cadeia (pFUSE2-CLIg-HuK5-70) e deste modo os vetores de expressão obtidos foram cada um transfectados nas células HEK293. Então, usando o sobrenadante de cultura obtido, a atividade de ligação de cada anticorpo de substituição de aminoácido a hTROP-2 foi examinado por ELISA revestido pelo antígeno de densidade baixa. Como um resultado, entre os 18 tipos de mutantes HuK5-70 VH, um mutante R44G, em que o R (arginina) na posição 44 de HuK5-70 VH foi susbtituído com G (glicina) (HuK5-70 R44G; que é depois referido como HuK5-70-2), foi observado para ter uma atividade de ligação de antígeno aparentemente melhorada (Figura 68). À sequência de um gene HuK5-70 VH R44G (em seguida referido como HuK5-70
VH2) é mostrado na Figura 69.
[00696] Exemplo 49
[00697] Purificação e caracterização do anticorpo HuK5-70-2
[00698] O anticorpo HuK5-70-2 que é um anticorpo mutante HuK5-70 R44G foi purificado como seguem. Isto é, pFUSE-CHIg-HuK5-70 R44G e pFUSE2- CLIg-HuK5-70 foram transfectados nas células 293F e o resultante foi então cultivado por 5 dias. Portanto, um sobrenadante de cultura foi recuperado. O anticorpo HuK5-70-2 foi purificado a partir do sobrenadante de cultura recuperado, usando fluxo rápido de sefarose rProteína A (GE Healthcare). O anticorpo HuK5-70-2 purificado foi carregado em um SDS-PAGE sob as condições de redução. Como um resultado, uma cadeia H de aproximadamente 50 kDa e uma cadeia L de aproximadamente 25 kDa foram observadas. A pureza de cada anticorpo foi 95 % ou mais (Figura 70).
[00699] A atividade de ligação dos anticorpos HuK5-70-2 e HuK5-70 purificados a hTROP-2 foi examinada por antígeno de densidade alta-revestida por ELISA e ELISA revestida pelo antígeno de densidade baixa. A afinidade dos anticorpos foi examinada pelo antígeno de densidade alta-revestida por ELISA (usando uma placa de 96 reservatórios que foi revestida com 1 ug/ml hTROP-2). Como um resultado, foi observado que a curva de ligação do anticorpo HuK5-70 foi quase sobreposta com a curva de ligação do anticorpo HuK5-70-2 e que sua afinidade foi equivalente em cada outro. Subsequentemente, a avidez dos anticorpos foi examinada por ELISA revestido pelo antígeno de densidade baixa (usando uma placa de 96 reservatórios que foi constituída com 0,1 ug/mL de hTROP-2). Como um resultado, foi observado que, como o mesmo o caso com o uso de um sobrenadante de cultura, a atividade de ligação de antígeno do anticorpo HuK5-70-2 foi claramente maior do que a atividade de ligação de antígeno do anticorpo HuK5-70 (Figura 71). Especificamente, o valor EC5,o de um anticorpo K5-70 foi 11,4 ng/mL, aquele de um anticorpo HuK5-70 foi 33,4 ng/mL e aquele de um anticorpo HuK5-70-2 foi 11,4 ng/ml. Deste modo, foi demonstrado que o anticorpo HuK5-70-2 tem uma avidez melhorada em comparação com o anticorpo HuK5-70 e que o anticorpo HuK5-70-2 tem atividade equivalente aquele do anticorpo K5-70.
[00700] Exemplo 50
[00701] Medição da atividade de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) dos anticorpos anti-hTROP-2 humanizados
[00702] (1) Preparação da solução de célula alvo
[00703] Como as células alvos, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59 e uma linhagem celular de câncer de próstata humano PC-3, cada um que expressa endogenosamente hTROP-2, foram usados. As células alvos cultivadas em um disco de cultura da célula 10-cm foram coletadas a partir da placa pelo tratamento com tripsina e foram então recolocadas em suspensão em um meio de ensaio. Um meio Leivovitz L-15 (para as células SW480) ou um meio RPMI-1640 (para células PK-59 e PC-3), em que 0,5 % de FBS foi adicionado, foi usado pelo ensaio ADCC. Após finalização da centrifugação (em 1000 rpm por 3 minutos em temperatura ambiente), os grânulos foram preparados em uma densidade celular de 2 x 10º células/ml com o mesmo meio como aquele usado acima e deste modo uma solução de célula alvo foi preparado.
[00704] (2) Separação das células mononucleares de sangue periférico humano
[00705] O sangue venoso saudável foi coletado com heparina e foi então diluído a 2 vezes com PBS. Portanto, o sangue diluído foi submetido em camada em Lymphoprep (Daiichi Kagaku Yakuhin K.K.) e foi então centrifugado (em temperatura ambiente a 750 rpm por 5 minutos e então a 2000 rpm por 20 minutos). Após finalização da centrifugação, células mononucleares (monócitos de sangue periférico saudável) foram recuperados a partir de uma fração de camada intermediária foram então lavadas com PBS três vezes. Portanto, a suspensão celular foi preparada com um meio de ensaio e as células preparadas foram usadas como células efetivas.
[00706] (3) Atividade ADCC dos anticorpos anti-hTROP-2 humanizados (anticorpos HuK5-70, HuK5-70-2 e HuT6-16-2)
[00707] 100 ul (2 x 10º células/reservatório) da solução de célula alvo preparada foi dispensada em uma placa de parte funda plana de 96 resevatórios (fabricado por FALCON). Subsequentemente, as células mononucleares de sangue periférico humano (células efetivas) foram adicionadas à placa, de modo que como razão entre as células efetivas e as células alvo devem ser 40 : 1. Portanto, anticorpos anti-hTROP-2 humanizados (anticorpos HuK5-70, HuK5-70- 2 e HuT6-16-2) foram cada um adicionados como anticorpos de teste à placa em uma concentração final de 0,1 a 30 ug/mL. A mistura foi ajustada em uma quantidade total de 200 uL e foi então cultivada em uma incubadora CO, (a 37º C em 5 % de CO>z) por 6 horas. Após finalização da cultura, a atividade da desidrogenase de lactato liberada a partir do citoplasma das células alvos danificadas pelas células efetivas foi medida usando kit de detecção de citotoxicidade (LDH) (Roche, Cat. Nº. 11 644 793 001) de acordo com os protocolos incluindo o kit e atividade ADCC foi então avaliada usando o resultado de medição como um indicador.
[00708] Como mostrado nas Figuras 72A a 72C, torna-se claro que os anticorpos HuK5-70 e HuT6-16-2 dependentemente da dosagem exibiram a atividade ADCC em um humano em uma linhagem celular de câncer de cólon SWA480 (Figura 72A), a linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59 (Figura 72B) e uma linhagem celular de câncer de próstata humano PC-3 (Figura 72C), cada um de que expressam hTROP-2 na superfície celular. Além disso, como mostrado nas Figuras 72B e 72C, torna-se claro que o anticorpo HuK5-70-2 exibe atividade ADCC na linhagem celular do câncer pancreático PK-59 e a linhagem celular do câncer de próstata humano PC-3, em que a atividade ADCC mencionada acima é mais forte do que aquela do anticorpo HuK5-70. Como mencionado acima, o anticorpo HuK5-70-2 é um anticorpo cujo a capacidade de ligação (avidez) a NTROP-2 foi melhorada pela substituição de R (arginina) na posição 44 de HuK5-70 VH com G (glicina). Foi demonstrado que a avidez do anticorpo HuK5-70-2, que foi melhorado quando comparado com o anticorpo HuK5-70, é refletido na atividade ADCC. Portanto, é assumido que o anticorpo HuK5-70-2 tem atividade anti-tumor excelente ainda in vivo, como com o anticorpo HuK5-70 (em que um anticorpo HuK5-70-2 pode ter preferivelmente a atividade anti-tumor maior do que aquela do anticorpo HuK5-
70). A partir dos resultados descritos acima, foi sugerido que os anticorpos HuK5-70, HuK5-70-2 e HuT6-16-2 tornam-se anticorpos terapêuticos úteis para o câncer que expressam hTROP-2 na superfície celular.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00709] A presente invenção é capaz de fornecer um anticorpo, que especificamente reage com hTROP-2 e tem atividade anti-tumor in vivo alta e especificamente, um anticorpo monoclonal tendo atividade anti-tumor in vivo alta em uma dosagem baixa e particularmente, um tal anticorpo, que é um anticorpo humanizado. Além disso, a presente invenção é capaz de fornecer um hibridoma, que produz o anticorpo, um fragmento do anticorpo, um complexo do anticorpo ou outros e vários tipos de medicamentos, uma composição farmacêutica para diagnóstico ou tratamento de um tumor, um método para detectar um tumor e um kit para detectar ou diagnosticar um tumor.

Claims (44)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo contra TROP-2 humano, caracterizado pelo fato de que uma região V da cadeia H do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 92 ou 98 e uma região V da cadeia L do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 93.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 36 a 38, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 41 a 43, respectivamente.
3. Anticorpo contra TROP-2 humano caracterizado pelo fato de que uma região V da cadeia H do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 94 ou 95 e uma região V da cadeia L do anticorpo consiste da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 96.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia H do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 66 a 68, respectivamente e/ou as sequências de aminoácido de CDR 1 a 3 da região V da cadeia L do anticorpo são mostradas na SEQ ID Nº: 71 a 73, respectivamente.
5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 5, que tem atividade anti-tumor in vivo.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que apresenta 50 % ou mais de atividade inibidora do desenvolvimento tumoral em uma dosagem de 5 a 20 mg/kg de peso corporal.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a frequência de administração para apresentar a atividade inibidora do desenvolvimento tumoral é, no máximo, de uma vez por semana.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que apresenta 50 % ou mais da atividade inibidora do desenvolvimento tumoral por uma administração simples do anticorpo em uma dosagem de 10 mg/kg de peso corporal.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que tem atividade anti-tumor em dois ou mais tipos de linhagens celulares tumorais humanas.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação (valor Kd) é de
1,0 x 107º M ou menos.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monocional.
13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer pulmonar humano, câncer de mama humano e câncer ovariano humano.
15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizado pelo fato de que o tumor é um câncer recorrente ou um câncer metastático.
16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que as linhagens celulares tumorais são pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, uma linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-3L, uma linhagem celular de câncer pancreático humano KP-2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-1, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45H, uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-45P, uma linhagem celular de câncer pancreático humano TCC- PAN2, uma linhagem celular de câncer pancreático humano SUIT-2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano CACO-2, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, uma linhagem celular de câncer de cólon humano DLD-1, uma linhagem celular de câncer de cólon humano HCT 116, uma linhagem celular de câncer de mama humano JIMT-1, uma linhagem celular de câncer de mama humano HCC1143, uma linhagem celular de câncer de mama humano MCF-7, uma linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-468, uma linhagem celular de câncer de próstata humano DU145, uma linhagem celular de câncer de próstata humano PC-3, uma linhagem celular de câncer de ovariano humano SK-OV-3, uma linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3 e uma linhagem celular de câncer de duto biliar humano TFK-1.
17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que as linhagens celulares tumorais são pelo menos dois tipos selecionados do grupo que consiste de uma linhagem celular de câncer pancreático humano PK-59, uma linhagem celular de câncer pancreático humano BxPC-3, uma linhagem celular de câncer de cólon humano SWA480, uma linhagem celular de câncer pulmonar humano Calu-3, uma linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-468 e uma linhagem celular de câncer de ovariano humano SK-OV-3.
18. Fragmento de anticorpo, caracterizado pelo fato de que é derivado do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.
19. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 92 ou 98 e/ou a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 93.
20. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 94 ou 95 e/ou a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 96.
21. Conjugado de droga-anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 e uma substância tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular.
22. Conjugado de droga-fragmento de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e uma substância tendo atividade anti-tumor e/ou atividade matadora celular.
23. Conjugado de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
24. Conjugado de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer colorretal humano, câncer pulmonar humano, câncer de mama humano e câncer ovariano humano.
25. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o tumor é um câncer recorrente ou um câncer metastático.
26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25.
27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que é usado no tratamento de tumor.
28. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que não causa a redução de peso como um efeito colateral.
29. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que é usada no diagnóstico de tumor.
30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizada pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
31. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 26 a 30, caracterizada pelo fato de que o tumor é um câncer recorrente ou um câncer metastático.
32. Agente terapêutico de tumor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25.
33. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que não causa a redução de peso como um efeito colateral.
34. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
35. Agente de diagnóstico de tumor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25.
36. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
37. Método para detectar um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende: permitir que pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a e o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, reaja com a amostra coletada a partir de um corpo vivente e então detectar os sinais do anticorpo reagido e/ou fragmento de anticorpo.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
39 Kit para tratar, diagnosticar ou detectar um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 e o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25.
40. Kit de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o tumor é pelo menos um tipo selecionado do grupo que consiste de câncer pancreático humano, câncer de próstata humano, câncer colorretal humano, câncer de mama humano, câncer ovariano humano, câncer pulmonar humano e câncer do duto biliar humano.
41 .Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.
42.Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20.
43.Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 41 ou 42.
44 Transformante, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor recombinante de acordo com a reivindicação 43.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003209447B8 (en) 2002-03-01 2008-10-23 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
KR102088169B1 (ko) 2013-12-25 2020-03-12 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
JP5998289B2 (ja) 2014-01-31 2016-09-28 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体−薬物コンジュゲート
AU2015357054A1 (en) * 2014-12-04 2017-06-29 Abruzzo Theranostic S.R.L. Humanized anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
JP6787890B2 (ja) 2015-06-29 2020-11-18 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートの選択的製造方法
KR102632796B1 (ko) 2016-03-10 2024-02-02 비엘라 바이오, 인크. Ilt7 결합 분자 및 이의 사용 방법
JPWO2018110515A1 (ja) 2016-12-12 2019-10-24 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
WO2018135501A1 (ja) 2017-01-17 2018-07-26 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
CN107446050A (zh) * 2017-08-11 2017-12-08 百奥泰生物科技(广州)有限公司 Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
AU2018327170B2 (en) 2017-08-31 2021-03-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel method for producing antibody-drug conjugate
KR20200041993A (ko) 2017-08-31 2020-04-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 개량 제조 방법
JP7278623B2 (ja) * 2018-04-13 2023-05-22 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド 抗ｃｄ２７抗体およびその使用
SG11202010496WA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-muc1 antibody-drug conjugate
US20210340628A1 (en) 2018-08-23 2021-11-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
EP3876998A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
CN112243443B (zh) * 2019-05-10 2023-03-17 江苏豪森药业集团有限公司 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
EP3976113A1 (en) 2019-05-29 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
WO2021067403A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Immunomedics, Inc. Biomarkers for antibody-drug conjugate monotherapy or combination therapy
CN112646038A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Trop-2抗体及其应用
JP2023524271A (ja) 2020-05-08 2023-06-09 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド エラスターゼ－基質ペプチドリンカーイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
MX2023001679A (es) 2020-08-13 2023-02-22 Bolt Biotherapeutics Inc Inmunoconjugados de pirazolazepina y usos de estos.
JP2023545742A (ja) 2020-10-14 2023-10-31 上▲海▼翰森生物医▲薬▼科技有限公司 抗ｔｒｏｐ－２抗体、その抗原結合断片又はその変異体、及びそれらの医学的使用
CN114685669A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 和铂医药(苏州)有限公司 结合trop2的抗体及其用途
EP4313162A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
EP4313161A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
CN113122494B (zh) * 2021-04-25 2023-01-31 上海交通大学医学院附属第九人民医院 人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法
TW202317200A (zh) 2021-06-11 2023-05-01 美商基利科學股份有限公司 Ｍｃｌ－１抑制劑與抗體藥物接合物之組合
TW202315637A (zh) 2021-06-11 2023-04-16 美商基利科學股份有限公司 Mcl-1抑制劑與抗癌劑之組合
KR20240058146A (ko) 2021-09-23 2024-05-03 상하이 한서 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드 항체-약물 접합체, 이의 제조 방법 및 의약적 용도
WO2023076983A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
MX2024005066A (es) 2021-10-29 2024-05-24 Gilead Sciences Inc Compuestos de cd73.
EP4422697A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
KR20240113514A (ko) 2021-11-30 2024-07-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 프로테아제 분해성 마스크 항체
EP4438627A1 (en) * 2021-12-07 2024-10-02 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-trop-2 antibody or antigen-binding fragment thereof
CN114195888B (zh) * 2021-12-07 2023-06-09 江苏中新医药有限公司 一种抗新冠抗体药物的核心序列
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023133509A2 (en) * 2022-01-08 2023-07-13 Carogen Corporation Multi-antigen therapeutic vaccines to treat or prevent chronic hepatitis b virus infection
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
AU2023218678A1 (en) 2022-02-09 2024-08-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Environmentally responsive masked antibody and use thereof
IL315083A (en) 2022-03-17 2024-10-01 Gilead Sciences Inc The IKAROS family of zinc fingers degrades and uses them
IL315207A (en) 2022-03-23 2024-10-01 Synaffix B V Antibody pairs for targeting TROP-2 expressing tumors
WO2023192289A2 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Adept Therapeutics Inc. Anti-trophoblast cell surface antigen 2 (trop-2) antibodies
AU2023252914A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 Arcus Biosciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
WO2023201268A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating tumor antigen expressing cancers
AU2023256670A1 (en) 2022-04-21 2024-10-17 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
CN117430710A (zh) * 2022-07-21 2024-01-23 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种针对Trop2的单克隆抗体及其应用
WO2024097812A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Therapy for treating bladder cancer
US20240254118A1 (en) 2022-12-22 2024-08-01 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
WO2024173387A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP0856054B1 (en) 1995-10-19 2004-04-28 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody br110 and uses thereof
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
AU2003209447B8 (en) 2002-03-01 2008-10-23 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
CA2552553C (en) 2003-11-28 2015-01-06 Kanagawa Academy Of Science And Technology Method of detecting liver cancer, diagnostic for liver cancer and remedy for cancer
US20080131428A1 (en) * 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
US7420041B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
AU2009339664B2 (en) 2009-02-05 2014-12-04 Oncoxx Biotech S.R.L. Anti-Trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors
SG185583A1 (en) 2010-05-17 2012-12-28 Livtech Inc Anti-human trop-2 antibody having antitumor activity in vivo

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