CN117430710A - 一种针对Trop2的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种针对Trop2的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域。具体而言,本发明涉及一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及所述抗体或片段在肿瘤治疗和诊断中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言,本发明涉及一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及所述抗体或片段在肿瘤治疗和诊断中的用途。
发明背景
人滋养层细胞表面抗原2(Trop2),即肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2),是由Tacstd2基因编码表达的跨膜糖蛋白,由323个氨基酸组成的分子量为36kDa的多肽。Trop2蛋白首次发现于人滋养层细胞,是滋养层细胞表面标志物,在胚胎始祖干细胞中呈现高表达,促进胚胎始祖干细胞增殖,在组织器官形成和胚胎发育过程中发挥重要作用。值得注意的是Trop2也高表达于多种上皮恶性肿瘤,如口腔鳞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。目前Trop2介导的信号通路途径机制尚不完全明确,主要通过上调胞内钙离子浓度、调节细胞周期蛋白表达、降低纤粘蛋白作用进而促进肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移。临床研究发现Trop2抗原高表达于肿瘤组织,且与患者生存期减缩和不良预后密切相关,免疫组化结果显示抗Trop2抗体可高效特异亲和肿瘤组织,因此Trop2是肿瘤靶向疗法中极具潜力的治疗靶标。近年来以Trop2为靶点的抗肿瘤药物研究如抗体、融合蛋白、化学抑制剂、纳米制剂以及抗体偶联药物(ADC)等逐步发展,尤其是ADC药物研究进展突飞猛进。目前正处于临床II/III期试验阶段的ADC药物IMMU-132是由人源化抗Trop2单抗hRS7与拓扑异构酶抑制剂喜树碱衍生物SN-38偶联而成,该药物具有良好的抗肿瘤效果,临床应用于多种治疗方案无效的复发难治性三阴乳腺癌,患者用药后客观缓解率达30%,临床有效率为46%,用药到起效的平均时间只需1.9个月,极大提高患者依从性,并延长患者无进展生存期达6个月,总生存期达16.6个月。在对小细胞肺癌的临床II期试验中,患者在接受IMMU-132治疗后,客观缓解率为19%,中位缓解时间为6个月,临床有效率为43%,中位无进展生存期达5.2个月,中位总生存期达9.5个月。因此IMMU-132为三阴乳腺癌及难治性小细胞肺癌的患者带来了新的希望。
杂交瘤融合技术于1975年由Kohler和Milstein首创,并于1984年荣获得若贝尔医学生物学奖。由于B细胞不能无限增殖,体外存活时间不超多20天,不能大规模产生单克隆抗体,而肿瘤细胞可以无限增殖存活,因此在PEG(聚乙二醇)融合剂作用下使能够产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞发生细胞融合(或电融合),并经多次阳性克隆筛选获得可以稳定分泌抗特定抗原的单克隆杂交瘤细胞株,所产生的抗体即为针对一种抗原决定簇的单克隆抗体,其具有高特异性、高纯度、均质性好、高亲和力、高效价以及成本低等特点。近年来基于单克隆抗体的肿瘤靶向治疗被认为最有潜力和最受瞩目的肿瘤治疗策略之一。据统计截止2018年,FDA共批准24款治疗实体肿瘤的单抗药物,分别靶向了CD抗原(包括CD19,CD20,CD30,CD33,CD38和CD53)、肿瘤细胞表面分子(HER2,EGFR,PD-L1,GD2,PMSA以及SLAMF7)、靶向免疫细胞表面抑制性受体PD-1和CTLA-4以及抑制肿瘤血管生成。但现阶段可以用于单抗药物研发的靶点非常有限,因此发现新的肿瘤特异性抗原,尤其在肿瘤组织中表达量高且发挥重要作用的抗原并研究制备靶向这些抗原的单克隆抗体,用于扩大单抗在肿瘤靶向治疗领域中的应用具有重要意义。
发明简述
在一方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞,其以保藏号CGMCC No.18167于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在一方面,本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生。
在一方面,本发明提供了一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3以及VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。
在一方面,本发明提供了一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。
在一方面,本发明提供了一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方案中,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或与SEQID NO:9具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列(人源化重链版本的可变区)。
在一些实施方式中,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列(人源化轻链版本的可变区)。
在一些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列,且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段与选自细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质的治疗性部分缀合。
在另一方面,本发明提供了一种在患者中治疗和/或预防Trop2相关疾病的方法,所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
在一些实施方案中,所述Trop2相关疾病为高表达Trop2的恶性肿瘤。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤为上皮恶性肿瘤。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤选自男/女性生殖系统肿瘤(例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、消化系统肿瘤(例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌)、头颈部肿瘤(例如口腔鳞癌、咽喉癌)、神经系统肿瘤(例如脑胶质瘤)和呼吸系统肿瘤(例如肺癌,例如小细胞肺癌)。
在一些实施方案中,所述方法还包括给所述患者施用其它抗肿瘤治疗手段,例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。
在另一方面,本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备用于治疗和/或预防Trop2相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中,所述Trop2相关疾病为高表达Trop2的肿瘤。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤为上皮恶性肿瘤。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤选自男/女性生殖系统肿瘤(例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、消化系统肿瘤(例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌)、头颈部肿瘤(例如口腔鳞癌、咽喉癌)、神经系统肿瘤(例如脑胶质瘤)和呼吸系统肿瘤(例如肺癌,例如小细胞肺癌)。
在另一方面,本发明还提供检测生物学样品中Trop2的存在或Trop2的表达水平的方法,包括在本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段与Trop2之间能够形成复合物的条件下,使所述生物学样品和对照样品接触本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段。然后检测复合物的形成,其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中Trop2的存在或Trop2的表达水平。
在另一方面,本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法,包括:
a)使获得自所述患者的生物学样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触;
b)检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合,其中检出代表所述患者中存在恶性肿瘤。
在前述各方面的一些实施方案中,所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤选自男/女性生殖系统肿瘤(例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、消化系统肿瘤(例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌)、头颈部肿瘤(例如口腔鳞癌、咽喉癌)、神经系统肿瘤(例如脑胶质瘤)和呼吸系统肿瘤(例如肺癌,例如小细胞肺癌)。
在另一方面,本发明提供一种用于检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的诊断剂,其包含本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及任选的生理学上可接受的载体。
在另一方面,本发明提供了本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的诊断剂中的用途。
在另一方面,本发明提供一种在对象中检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的方法,包括给所述对象施用本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的诊断剂。
在另一方面,本发明还提供一种分离的核酸分子,其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,其中所述核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区的CDR。具体而言,所述核酸分子具有SEQ ID NO:18-20或26-28所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中,其中所述核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区。在一些实施方案中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:17或25所示核苷酸序列。在一些实施方式中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:35-36所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中,所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
在另一方面,本发明还提供一种表达载体,其包含本发明的核酸分子。
在另一方面,本发明还提供一种宿主细胞,其由本发明的核酸分子或本发明的表达载体转化。
在另一方面,本发明还提供一种生产针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法,包括:
(i)在适合本发明的核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞,和
(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
附图简述
图1是杂交瘤细胞染色体数目鉴定图,平均染色体数目为104,符合杂交瘤细胞染色体理论值,且存在杂交瘤特征性染色体(圆圈标记)。
图2是ELISA法检测抗体效价图,效价高达8000000。
图3是抗体的SDS-PAGE电泳图(Lane M:Marker,Lane1:IMB1636,Lane2:VH、VL)。
图4是HPLC检测抗体纯度图,纯度高达99%。
图5是抗体亚型鉴定图,结果判定该抗体亚类为IgG1,单抗轻链为Kappa。
图6是Biacore法进行抗体抗原亲和分析,测定ka(1/Ms)=1.057×106,kd(1/s)=7.297×10-4,KD=4.842×10-10。
图7是ELISA法获得抗体抗原亲和反应曲线,并得出亲和常数Ka=3.9×1010。
图8是免疫荧光法分析抗体与肿瘤细胞结合能力图,证明抗体与高表达Trop2的肿瘤细胞膜BxPC-3具有高度膜结合活性。
图9是基于Confocal法对抗体与肿瘤细胞亲和活性分析,证明Trop2表达阳性细胞HCC-827可高效内吞该抗体。
图10是流式细胞术分析抗体与肿瘤细胞结合能力图,证明抗体与高表达Trop2抗原的肿瘤细胞膜具有高亲和活性。
图11是小鼠活体成像检测抗体可在体内高度靶向肿瘤组织,在肿瘤组织滞留11天以上。
图12是人肿瘤组织芯片检测抗体可高特异性结合人肺鳞癌肿瘤组织。
图13是鼠源抗Trop2抗体氨基酸序列信息。
图14是鼠源抗Trop2抗体核酸序列信息。
图15是人源化抗Trop2抗体氨基酸序列信息。
图16是人源化抗Trop2抗体核酸序列信息。
图17示出Anti-Trop2-LDM的体内抗肿瘤作用。
发明详述
一、定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用,“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段,无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的,包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此,抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段,例如抗肿瘤细胞抗体片段。如本文所用,因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段,例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如,IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如,IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用,抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分,其少于全长,但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点),并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此,抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物,以及合成产生的衍生物,例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段,包括修饰的片段(参见,例如,Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003);Chapter 1;p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链,例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸,并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段,其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
如本文所用,“单克隆抗体”指相同抗体的群体,表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反,所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917;和Nelson et al.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如,单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备,例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文中所用,术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的,杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如,Harlow&Lane,1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时,其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用,“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体,其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链),并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用,全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体,例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用,dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用,Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段,或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链,所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用,F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段,或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段,其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸,包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用,Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用,scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体,其中可变区序列源自一个物种,恒定区序列源自另一物种,如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式,其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列),含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地,人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体),其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外,在人源化中,还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变,由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变,其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常,引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外,CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此,本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
如本文所用,术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型,例如氨基酸或糖侧链,并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用,可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域,其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性,并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR),CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用,“抗原结合结构域”和“抗原结合位点(antigen-binding site)”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点,每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用,“高变区”、“HV”、“互补决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如,轻链可变区结构域包含3个CDR,命名为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;重链可变区结构域包含3个CDR,命名为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的,但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述,本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如,Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
如本文所用,框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域;在氨基酸序列方面,FR区比高变区相对更保守。
如本文所用,“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域,其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中,每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域,而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域,包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区,而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂,因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能,例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素,例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用,抗体的功能区是包含该抗体的至少VH、VL、CH(例如CH1、CH2或CH3)、CL或铰链区结构域或者至少其功能区的抗体部分。
如本文所用,VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分,从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用,VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分,从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用,关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用,并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常,免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x 108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x 10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定,例如,免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11:54;Englebienne(1998)Analyst.123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见,例如,Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989);还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的,并且可商购(参见,BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden and GE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。
如本文所用,关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位,由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者,在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中,可以但不必需是这种情况。也就是说,第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合,而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而,在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中,无论是相同、更高或更低程度,所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段),本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用,“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
"分离的蛋白质"、"分离的多肽"或"分离的抗体"指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联,(2)不含来自相同物种的其它蛋白质,(3)由来自不同物种的细胞表达,或(4)不在天然中发生。因此,经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分,即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中,合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的,并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常,本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见,例如,Watson et al.,Molecular Biology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用,术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物,包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用,分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基,或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“相同性”具有本领域公认的含义,并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见,例如:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987;and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法,但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
如本文所用,关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如,启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸,从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
如本文所用,“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价,包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽,凝胶电泳之后考马斯蓝染色,Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用,“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时,载体中所含的核酸复制,从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
“密码子优化”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关,而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此,可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得,例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中,并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见,Nakamura Y.等,“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for theyear2000.Nucl.Acids Res.,28:292(2000)。
如本文所用,“载体”是可复制的核酸,当载体转化入适当的宿主细胞时,可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞,用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离,但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体,例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用,载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒,其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用,“表达载体”包括能够表达DNA的载体,所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列,并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA,或者可以包含这两者的元件。因此,表达载体指重组DNA或RNA构建体,例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体,当引入适当的宿主细胞时,导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的,并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用,“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解,或者在治疗后保持不变。因此,治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用,“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果,其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状,或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用,“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此,其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用,“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量,例如,防止或延迟疾病或症状的发生或复发,减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生,并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此,预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的,术语“患者”是指哺乳动物,例如人。
二、针对Trop2的单克隆抗体
本发明是通过杂交瘤融合技术,利用Trop2抗原免疫BALB/C小鼠制备免疫脾脏细胞,与SP2/0细胞融合,建立分泌抗Trop2单克隆抗体杂交瘤细胞株库,从中筛选出稳定且高分泌抗体的杂交瘤细胞株Y1636-1,通过腹水诱生法扩大生产单抗,制备高效价、高亲和活性、高特异性的鼠源抗Trop2单克隆抗体,并完成该抗体的氨基酸序列测定以及鼠源单克隆抗体人源化改造。产生抗Trop2单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株Y1636-1于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
因此,在一方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞,其以保藏号CGMCC No.18167于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在一方面,本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生。
在一方面,本发明提供了一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3以及VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。
在一方面,本发明提供了一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。
因此,本发明提供针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方案中,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述单克隆抗体是人源化抗体。
在一些实施方式中,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或与SEQID NO:1具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或与SEQID NO:9具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中,所述重链可变区包含与SEQ ID NO:9具有约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列(人源化重链版本的可变区)。
在一些实施方式中,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列(人源化轻链版本的可变区)。
在一些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列,且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列。
在一些实施方式中,本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段衍生自由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。在一些实施方式中,本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体结合Trop2上的相同表位。在一些实施方式中,本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争结合Trop2。
在一些实施方式中,本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性靶向肿瘤细胞。本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性靶向的肿瘤细胞包括但不限于男/女性生殖系统肿瘤细胞(例如子宫内膜癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞)、消化系统肿瘤细胞(例如胰腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、食管鳞癌细胞、食管癌细胞、胆管癌细胞、肠癌细胞)、头颈部肿瘤细胞(例如口腔鳞癌细胞、咽喉癌细胞)、神经系统肿瘤细胞(例如脑胶质瘤细胞)和呼吸系统肿瘤细胞(例如肺癌细胞,例如小细胞肺癌)。
三、核酸、载体和抗体产生方法
在另一方面,本发明提供分离的核酸分子,其编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中,所述核酸分子的核苷酸序列针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。在一些实施方式中,本发明的核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
在一些实施方案中,其中所述核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区的CDR。具体而言,所述核酸分子编码VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VHCDR1、VH CDR2或VH CDR3。具体而言,所述核酸分子具有SEQ ID NO:18-20或26-28所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中,其中所述核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区。在一些实施方案中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:17所示核苷酸序列或具有相对于SEQ ID NO:17具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方式中,所述核酸分子具有与SEQ ID NO:17具有约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:25所示核苷酸序列或具有相对于SEQ ID NO:25具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方式中,所述核酸分子具有相对于SEQ ID NO:25具有约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列相同性的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。
本发明还提供表达载体,其包含至少一种前述本发明的核酸分子。
本发明还提供宿主细胞,其由至少一种前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
在另一方面,本发明提供一种生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法,包括:
(i)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞,和
(ii)分离并纯化由所述宿主细胞表达的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及通过上述本发明的方法获得的分离的抗体或其抗原结合片段,其能够特异性结合Trop2。
在一些实施方式中,本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:17-20、SEQ ID NO:25-28、SEQ ID NO:35-36所示的核苷酸序列。
四、抗体缀合物
本发明还提供一种抗体缀合物,其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及与所述抗体或其抗原结合片段缀合的治疗性部分。在一些实施方案中,所述治疗性部分包括诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括:紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。
可用于缀合的治疗性部分还包括,例如:抗代谢物(例如,氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺),烷化剂(例如,氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂),氨茴霉素类(例如,柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素),抗生素(例如,放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)),和抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春碱)。
能与本发明的针对Trop2的抗体或其片段缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。
可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与针对Trop2的抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择,例如,在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头,该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶,如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
本发明的抗体也可以与放射性同位素缀合,产生细胞毒性放射性药物,也被称作放射性抗体缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性抗体缀合物的方法在本领域中已经建立。
本发明的抗体也可以与具有需要的生物活性的蛋白质缀合,可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白质包括,例如:具有酶活性的毒素或其活性片段,如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素;蛋白质,如肿瘤坏死因子或干扰素-γ;或生物学反应调节物,如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-10(“IL-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。
在一些具体实施方案中,所述治疗性部分是力达霉素。例如,力达霉素包含SEQ IDNO:37所示的辅基蛋白LDP,以及与LDP结合的式I所示的发色团AE。在一些实施方案中,所述LDP通过接头例如SEQ ID NO:38所示的接头连接至本发明的抗体,例如连接至本发明抗体的轻链的N端。
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五、疾病治疗和/或预防
本发明提供了一种在患者中治疗和/或预防Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的方法,所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的针对Trop2的抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体缀合物。
可以通过本发明的方法治疗和/或预防的Trop2相关疾病例如是高表达Trop2的肿瘤,包括但不限于男/女性生殖系统肿瘤,例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌;消化系统肿瘤,例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌;头颈部肿瘤,例如口腔鳞癌、咽喉癌;神经系统肿瘤,例如脑胶质瘤;和呼吸系统肿瘤,例如肺癌,优选小细胞肺癌。
在一些实施方案中,所述方法还包括给所述患者施用其它抗肿瘤治疗手段,例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。
六、药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物,其包含本发明的针对Trop2的抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体缀合物,以及药学上可接受的载体。所述药物组合物用于在患者中和/或预防Trop2相关疾病例如恶性肿瘤。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地,该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径,可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中,以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂,如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠,亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有佐剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下,组合物中优选包含等渗剂,例如,糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂,例如单硬脂酸盐和明胶,可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂,除了任何与活性化合物不相容的范围外,都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如,通过使用包衣,例如卵磷脂,在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小,以及通过使用表面活性剂,可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中,并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合,接着无菌微过滤,可制备无菌注射液。通常,通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干),由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常,以100%计,这个量的范围是大约0.01%至大约99%的活性成分,优选大约0.1%至大约70%,最优选大约1%至大约30%的活性成分,与药学上可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如,治疗反应)。例如,可以施用单一推注,可以随时间施用几次分开的剂量,或者根据治疗状况的紧急情况所需,可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位;每个单位含有预定量的活性化合物,经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果,和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体分子的给药而言,剂量范围为约0.0001至100mg/kg,更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如,剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重,10mg/kg体重或20mg/kg体重,或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。
或者,抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药,在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常,人抗体表现出最长的半衰期,之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中,在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中,有时需要以较短的间隔给予较高的剂量,直到疾病的进展减轻或停止,优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后,可以以预防性方案给患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变,以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应,而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素,包括应用的本发明特定组合物的活性,给药途径,给药时间,应用的特定化合物的排泄速率,治疗的持续时间,与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料,接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史,以及医学领域中公知的类似因素。
“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体缀合物优选地导致疾病症状的严重性降低,疾病无症状期的频率和持续时间增加,或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如,对于肿瘤的治疗,相对于未接受治疗的对象,“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10%,优选至少约20%,更优选至少约30%,更优选至少约40%,更优选至少约50%,更优选至少约60%,更优选至少约70%,更优选至少约80%。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者,也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价,这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段能够减小肿瘤大小,或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量,如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的抗体缀合物或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解,给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径,例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式,通常是注射,包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者,本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的抗体缀合物或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药,如局部、表皮或粘膜途径给药,例如,鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备,例如控释制剂,包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见,例如,Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在某些实施方案中,本发明的抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如,血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时),可将它们配制在如脂质体中。
七、联合治疗
本发明的针对Trop2的抗体或其抗原结合片段、本发明的抗体缀合物或药物组合物可以与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体联合施用。
可以与本发明的抗体或本发明的药物组合物组合使用的化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体没有特别限制。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体的实例包括但不限于:异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑、依诺他宾、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、替加氟、替加氟-尿嘧啶、TS-1、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、甲氨蝶呤、伊立替康、依托泊苷、艾立布林、索布佐生、多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春碱、放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁酯、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、比卡鲁胺、托瑞米芬、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、亮丙瑞林、来曲唑、甲基安宫黄体酮、替伊莫单抗、伊马替尼、依维莫司、厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕木单抗、贝伐单抗、硼替佐米、和拉帕替尼。在一个具体的实施方式中,所述化疗剂是含铂的化疗剂,例如顺铂。
本发明的抗体或本发明的抗体缀合物和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下),它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。
本发明的抗体或本发明的抗体缀合物和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体在本发明的药物组合物中的组合剂量没有特别限制。如上所述,本发明的抗体的剂量可以通过参考当所述抗体单独使用时的剂量来确定。所述化疗剂和靶向其他肿瘤抗原的抗体可以根据各自药物标明的剂量使用或可以减少(考虑到和本发明的抗体的组合效果)。
本发明的抗体或本发明的抗体缀合物或本发明的药物组合物还可以与放疗联合,例如包括向患者施用电离辐射,其早于、在其过程中和/或晚于本发明的抗体或药物组合物的施用过程。
八、检测和诊断
在另一方面,本发明还提供检测生物学样品中Trop2的存在或Trop2的表达水平的方法,包括在本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段与Trop2之间能够形成复合物的条件下,使所述生物学样品和对照样品接触本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段。然后检测复合物的形成,其中所述生物学样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中Trop2的存在或Trop2的表达水平。
在一些实施方案中,所述生物学样品是离体样品。
已经发现Trop2在许多肿瘤特别是上皮恶性肿瘤中高表达。因此,本发明针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于诊断与Trop2相关的恶性肿瘤。
因此,本发明还提供了一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法,包括通过本发明的方法检测来自所述患者的生物学样品中的Trop2的表达水平,其中所述患者的生物学样品中的Trop2的表达水平高于来自对照生物学样品的Trop2的表达水平,表示所述患者中存在恶性肿瘤。
在一些实施方案中,所述对照生物学样品是来自健康个体的生物学样品。在一些实施方案中,所述对照生物学样品是来自已知不具有恶性肿瘤的个体的生物学样品。
所述生物学样品包括但不限于组织样品、血液样品、淋巴样品等。
在另一方面,本发明提供一种用于检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的诊断剂,其包含本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及任选的生理学上可接受的载体。在一些实施方案中,所述诊断剂是造影剂。
在另一方面,本发明提供了本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的诊断剂中的用途。在一些实施方案中,所述诊断剂是造影剂。
在另一方面,本发明提供一种在对象中检测和/或诊断Trop2相关疾病例如恶性肿瘤的方法,包括给所述对象施用本发明的针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的诊断剂。
在本发明上述方面的一些实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
所述恶性肿瘤包括但不限于男/女性生殖系统肿瘤,例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌;消化系统肿瘤,例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌;头颈部肿瘤,例如口腔鳞癌、咽喉癌;神经系统肿瘤,例如脑胶质瘤;和呼吸系统肿瘤,例如肺癌,优选小细胞肺癌。
九、试剂盒
本发明的范围内还包括用于本发明的方法的试剂盒,该试剂盒包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的抗体缀合物或本发明的药物组合物或本发明的诊断剂,以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的检测试剂,其用于检测本发明的单克隆抗体的存在。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
实施例
实施例1、杂交瘤细胞系的建立
1.动物免疫
首次免疫:Trop2抗原与完全弗氏佐剂等体积混合,冰浴条件下超声乳化完全,小鼠腹腔注射300μl/只。
第二次免疫:间隔两周,抗原溶液与不完全弗氏佐剂等体积混合,冰浴超声乳化完全,小鼠腹腔注射300μl/只。
第三次免疫:操作同第二次免疫步骤,1周后通过ELISA法检测小鼠血清抗体效价,血清效价达百万。
第四次免疫:每只小鼠腹腔注射300μl,50μg抗原溶液,三天后进行细胞融合。
2.腹腔巨噬细胞制备
取健康雌性5周龄BALB/c小鼠,颈椎脱臼法处死,浸入75%酒精中消毒5min,于超净台内解剖盘中无菌打开腹部皮肤,暴露出腹膜肌肉层,用无菌镊子掀起腹肌,注入腹腔5ml RPMI 1640不完全培养液,轻轻按摩腹部1~2min后,抽出腹腔液,转移至50ml塑料离心管中,重复步骤2-3次。1000rpm离心5min去除上清。添加HAT的1640完全培养基重悬,铺于96孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱培养一天,显微镜下检测是否有污染情况,作细胞融合备用。
3.骨髓瘤细胞处理
SP2/0细胞接种于BALB/c小鼠背部待瘤快长至500mm3左右剥离瘤快研磨制成细胞悬液,用0.4%台盼蓝染液作活细胞计数,(取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中计数,未被染成蓝色的细胞为活细胞),存活率大于90%的骨髓瘤细胞可进行融合,置于37℃备用。
4.脾淋巴细胞的准备
取血清抗体效价达到融合指标的BALB/c小鼠,处死后浸泡于75%酒精中消毒5min。于超净台内取出脾脏轻轻洗涤,剥去周围结缔组织,用无菌剪刀将脾脏剪成小块,用2.5ml注射器内芯挤压磨碎脾脏,并用200目铜网过滤,获得脾细胞悬液,1000rpm离心5min,用无血清培养基洗涤2次,离心同上,取上述悬液用0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
5.细胞融合
取1×108个脾细胞与2×107-5×107个骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(通常比例为10:1—10:5)混合于一支50ml离心管中,1000rpm离心5min,吸净上清,轻击离心管管底使沉淀细胞松散均匀,置40℃水浴中预热备用。用时45s均匀而缓慢的加入1ml预热至40℃的50%PEG-1450溶液(PH 8.0),边加边轻轻旋转离心管,使PEG溶液充分且均匀接触松散的细胞。吸取1ml预热至40℃无血清培养基在60s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;吸取5ml预热至40℃无血清培养基在60s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;吸取10ml预热至40℃无血清培养基在90s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;重复一次;1000rpm离心5min弃去上清。加入添加HAT培养液的1640完全培养基,轻轻吹吸成细胞悬浮,接种于7-8块经镜检无污染的含巨噬细胞的96孔板中,然后置37℃,5%CO2培养箱内培养,5天后用HAT培养基换出1/2培养基,7-10天后用HT培养基换出HAT培养基,第14天后可用普通完全培养基。观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测,并间隔相同时间进行第二次抗体检测,比较两次阳性值结果,挑出阳性值提高或持平的孔,初步断定为阳性孔,并进一步阳性孔筛选克隆化。
6.阳性杂交瘤筛选及亚克隆
利用稀释培养法进行杂交瘤细胞复筛及亚克隆。制备小鼠腹腔细胞,同上。挑取阳性孔的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞至每毫升含2.5、15和50个细胞的不同稀释度细胞悬液,铺板于96孔板,0.2ml/孔,每孔杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10,37℃、5%CO2培养7-10天,出现肉眼可见的克隆,在显微镜下观察,挑出只有单个克隆生长的孔(克隆呈现圆形,且边缘细胞生长轨迹弧线圆润即为单克隆),并进行抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞进行2-3次同上的稀释培养亚克隆筛选后扩大培养,并冻存。
7.杂交瘤细胞稳定性鉴定
检测杂交瘤细胞株冻存前后连续培养,通过间接ELISA法检测细胞上清中抗体效价,结果显示在传代过程中以及重新复苏后的抗体效价无明显变化,证明杂交瘤细胞可以稳定分泌抗Trop2单克隆抗体(图2)。
该杂交瘤细胞以保藏号CGMCC No.18167于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101)。
实施例2、抗Trop2单克隆抗体的制备
一、抗体制备
取7-8周龄雌性BALB/c小鼠,腹腔注射500μl弗氏不完全佐剂进行预处理,7-10天后收集生长状态良好的杂交瘤细胞,1000rpm离心5min后弃上清,杂交瘤细胞重悬于PBS制成浓度为1×107个/ml细胞悬液,每只小鼠腹腔注射200μl,注射三天后每天观察小鼠腹部膨大情况,通常7-10天采集腹水,将收集的腹水10000rpm离心30min,收集上清并经0.45μml滤膜滤除大块脂质,经硫酸铵沉淀法初提,用ProteinG(1ml)亲和层析柱纯化腹水制备抗Trop2单克隆抗体。
二、抗体鉴定
1、抗体纯度鉴定
HPLC法检测抗Trop2单克隆抗体纯度:HPLC的检测条件如下:凝胶柱:SEC S3000;流速:1ml/min;上样量:20μl;流动相:0-16min乙腈比例为5-95%梯度增加,总时长为20min;检测器:280nm;通过单抗特征吸收280nm的积分峰面积,判断所制备单抗的纯度(图4)。
SDS-PAGE电泳法检测抗体纯度:取抗Trop2单抗样品10μl,加入1/4体积的5×loading buffer上样缓冲液,置于沸水中煮沸变性5min待用。配制浓度为12%的分离胶,5%浓缩胶,接通电源于80v进行电泳30min,待样品进入分离胶后将电压调至120v电泳1.5h,电泳完毕,取凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色3h,后用脱色液室温脱色过夜,用凝胶成像系统拍照(图3)。
2、抗体类及亚类鉴定
利用SBA Clonotyping System-HRP小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定抗Trop2单克隆抗体亚型。用浓度为5-10μg/ml的捕获抗体包被酶标板,100μl/孔,4℃过夜;PBST洗涤3次,每次5min。用2%BSA的PBST 200μl/孔,37℃封闭2h,洗涤同上;加入经适当倍数稀释的抗Trop2单克隆抗体稀释液,37℃孵育2h,洗涤同上;分别加入适当稀释度的不同类型二抗,包括:Goat Anti-Mouse Ig,Human ads-HRP(阳性对照);Goat Anti-Mouse IgA-HRP;GoatAnti-Mouse IgG1,Human ads-HRP;Goat Anti-Mouse IgG2a,Human ads-HRP;Goat Anti-Mouse IgG2b,Human ads-HRP;Goat Anti-Mouse IgG3,Human ads-HRP;Goat Anti-MouseIgM,Human ads-HRP;Goat Anti-Mouse Kappa-HRP;Goat Anti-Mouse Lambda-HRP;37℃孵育1.5h,洗涤同上;加TMB底物100μl/孔显色,避光室温放置15min后加2M H2SO2 100μl/孔终止反应,测定A450吸光值,阳性值孔即为对应的抗体亚类类型(图5)。
3、抗体氨基酸序列测定
提取杂交瘤细胞RNA,逆转录获得cDNA库,特殊引物PCR扩增得到单抗基因序列,从而获得单抗重链、轻链的氨基酸序列。
4、鼠源抗体人源化改造
人源化抗体的设计及合成:以鼠源抗体序列为基础,进行人源化设计,合成人源化抗体序列后,构建人源化抗体表达载体;同时构建一个人鼠嵌和抗体的对照抗体表达载体作为对照。对上述制备的表达载体进行质粒大抽,制备转染级别的质粒。
人源化抗体表达及纯化:以上述制备的人源化抗体表达载体瞬时转染至哺乳动物细胞中,并使用Protein A纯化重组抗体,浓缩后使用BCA法定量;使用甲方提供的目标蛋白作为抗原,在96孔板上包被抗原,采用ELISA检测人源化抗体与靶标蛋白的结合情况。
人源化抗体亲和力测定:采用BiaCoreT200,检测上述制备的人源化抗体与目标蛋白的亲和力。
实施例3、抗Trop2单克隆抗体亲和活性测定
1、ELISA法测定抗体抗原亲和常数
将Trop2抗原稀释为三个稀释度(0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml)包被酶标板,抗Trop2单抗稀释浓度为(1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032、0.000064、0.0000128μg/ml),间接ELISA法测定抗原抗体反应曲线,曲线接近平台表示全部抗原被结合,在曲线上找出与抗原最大结合50%的抗体浓度(mol/L),代入如下公式即可求出Ka。Ka=(n-1)/2(n[ab]-[ab]t)。Ka单位是M-1。其中,[Ab]为抗原浓度为[Ag]时A=1/2Amax对应的抗体浓度;[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时A=1/2Amax对应的抗体浓度;[Ag]、[Ag]t:表示抗原浓度;n为抗原[Ag]与[Ag]t间的稀释倍数。(图7)
2、Biacore法检测抗体抗原亲和作用
将抗Trop2抗体氨基偶联于CM5芯片上,pH5.0,抗体浓度10μg/ml,进样时间60s,流速10μl/min,欧联量为378.6。用不同浓度梯度Trop2抗原(0、0.814、1.628、3.256、6.512、13.025、26.05、52.1μg/ml)流过芯片,进样时间60s,流速30μl/min,解离时间600s,再生条件为glycine-HCl,pH1.5(100s,30μl/min)获得Biacore亲和图以及亲和常数。(图6)
3、免疫荧光检测抗体与肿瘤细胞结合能力
分别培养NIH3T3、MDA-MB-231、BXPC-3细胞于细胞爬片中,1×104个/孔,37℃培养24h后用4%多聚甲醛固定30min,用预冷4℃的PBS洗涤3次,用1%BSA的PBST溶液4℃封闭过夜,加浓度为10μg/ml纯化后的抗Trop2抗体4℃过夜,以SP2/0腹水为阴性对照,预冷4℃PBST洗涤3次,加入经1:200稀释的罗丹明标记羊抗鼠IgG二抗,室温避光孵育1.5h,PBST洗涤3次,每孔加入1滴DAPI(1mg/ml)孵育10min,荧光显微镜下观察拍照。(图8)
4、抗Trop2抗体共聚焦免疫荧光检测
将处于对数生长期的HCC-827细胞制成单细胞悬液,细胞计数后以1×104个/孔/200μl接种于细胞爬片中,37℃培养24h后加入抗Trop2抗体10μg/mL,200μL/孔;对于抗体与细胞表面结合情况,加入抗体IMB1636后4℃孵育30min,收集细胞PBS洗3次,4%多聚甲醛(200μL/孔)固定15min,PBST洗3次,0.2%Triton-X100(200μl+100ml PBS)200μL/孔,透化10min,PBST洗3次,5%BSA37℃封闭30min。加二抗(羊抗鼠AF488)3μL+1.5mL PBST,200μL/孔,37℃30min,PBST洗5次,加DAPI核染15min,PBST洗3次,滴加抗荧光猝灭剂,共聚焦显微镜观察。
对于细胞内吞抗体情况,加入抗体IMB1636后37℃孵育2h,另外为证明内吞后的抗体被溶酶体吞噬降解,在细胞封闭后孵育靶向溶酶体表面蛋白的LAMP-1抗体(1:200)200μL/孔37℃2h,并用驴抗兔AF555二抗标记LAMP-1,使得溶酶体被标记为红色荧光,其他步骤同上,观察抗体IMB1636与溶酶体共定位情况。(图9)
5、流式细胞术检测抗体与肿瘤细胞结合能力
取BXPC-3、MDA-MB-231、NIH 3T3细胞各5×10 6个于EP管中,用100μl 4℃预冷的含2%FBS的PBS洗涤后,用100μl 2%FBS的PBS重悬,分别加入浓度为3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003μg/ml的抗Trop2抗体100μl/管,以SP2/0腹水为阴性对照,4℃孵育1.5h,2%FBS的PBS洗涤,加入200μl FITC标记羊抗鼠IgG二抗(1:200倍稀释),4℃避光孵育1h,PBS洗涤3次,流式细胞仪检测。(图10)
6、抗体与人肿瘤组织芯片结合能力测定
本实验选用的各瘤组织芯片购于上海芯超生物科技有限公司,主要实验步骤包括:烘片、脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、封片。(图12)
7、小鼠活体成像监测抗体靶向肿瘤能力
分别取BXPC-3、MDA-MB-231、NIH 3T3细胞接种小鼠腋窝,6×104个/只,待瘤体积达200-300cm2,利用Dylight 680抗体试剂盒标记抗Trop2抗体,尾静脉注射20mg/kg,分别于30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、192h、216h、240h、264进行活体成像拍照。(图11)
8、抗anti-Trop2-LDM和LDM对体外培养的肿瘤细胞的杀伤活性
制备抗Trop2抗体与抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)的偶联物anit-Trop2-LDM(制备方法参考文献:Wang R,Li L,Duan A,Li Y,Liu X,Miao Q,Gong J,Zhen Y.Crizotinibenhances anti-CD30-LDM induced antitumor efficacy in NPM-ALK positiveanaplastic large cell lymphoma.Cancer Lett.2019Apr 28;448:84-93.)。力达霉素的辅基蛋白为LDP,LDP的氨基酸序列示于SEQ ID NO:37。LDP通过SEQ ID NO:38所示的接头融合至SEQ ID NO:34所示的人源化抗Trop2抗体的轻链的N端,然后与重链形成偶联物anit-Trop2-LDp。
取高活性的力达霉素(LDM)纯品,经C4柱分离式I所示活性发色团AE。
流动相为水:乙腈:三氟乙酸=78%:22%:0.1%,检测350nm处的吸收值,收集发色团AE;将anti-Trop2-LDP蛋白与发色团AE按照1:4比例混合,置于摇床上缓慢摇动,4℃避光反应过夜;之后将二者的混合液4℃,3500rpm超滤离心4~6次,去除其中未组装的游离发色团;当超滤出的溶液检测不到发色团时停止超滤,此时的混合液即为抗体偶联药物Anti-Trop2-LDM溶液;超滤浓缩后即得到抗体偶联药物Anti-Trop2-LDM,并利用反相HPLC(C4,300A)检测Anti-Trop2-LDM在350nm处的吸收值。
选传代后生长至对数生长期的肿瘤细胞,制备成单细胞悬液并计数,调整细胞浓度到3×103个/孔,每孔80μL,接种至96孔板;培养24h后,加入20μL稀释至不同浓度的anti-Trop2-IgG、LDM、Anti-Trop2-IgG-LDM,每个浓度设三个平行孔;培养48h后,每孔避光加入10μL的CCK-8试剂,震荡3min,放入培养箱孵育1h;取出96孔板震荡2min,用酶标仪检测450nm处OD值;除以上不同浓度的给药组,还需设不加药对照组及不加细胞空白组各三个平行孔。结果如下表所示:
9、Anti-Trop2-LDM和LDM的体内抗肿瘤作用
利用高表达TROP2的人肺癌肿瘤细胞系HCC827,建立皮下移植瘤模型评价Anti-Trop2-LDM的体内抗肿瘤作用。选取雌性、6周龄的BALB/c裸鼠,在小鼠右侧腋窝皮下接种HCC827肿瘤细胞,每只小鼠接种3×106个细胞,随后观察肿瘤生长情况。在肿瘤接种8天肿瘤体积达100mm3~150mm3时,随机将小鼠分成6组,每组6只,并给予不同的药物进行治疗。如下:不同浓度的Anti-Trop2-LDM(0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg),LDM(0.05mg/kg),TROP2-mAb(0.8mg/kg)分别在8天,16天,24天时,通过尾静脉给药一次,共给药3次,对照组给予等体积的生理盐水。并从第8天起,每隔4天测量肿瘤的长和宽(a:长,b:宽)至第40天,利用公式V=ab2/2计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,同时称量小鼠体重绘制体重变化曲线。结果如图17所示。
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Claims (25)
1.一种针对Trop2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区,
所述轻链可变区包含:
VL CDR1,其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,
VL CDR2,其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列,和
VL CDR3,其包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列;
所述重链可变区包含:
VH CDR1,其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列,
VH CDR2,其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列,和
VH CDR3,其包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述轻链可变区包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。
4.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述重链可变区包含SEQ IDNO:9所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少85%、至少90%、至少95%或更高序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述重链可变区包含SEQ IDNO:33所示氨基酸序列。
6.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述轻链可变区包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列。
7.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述重链可变区包含SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列,且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列。
8.一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体由于2019年6月25日以保藏号CGMCC No.18167保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的小鼠杂交瘤细胞产生。
9.一种杂交瘤细胞,其以保藏号CGMCC No.1816于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
10.一种抗体缀合物,其包含权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及与所述单克隆抗体或其抗原结合片段缀合的选自细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质的治疗性部分。
11.一种药物组合物,其包含权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求10的抗体缀合物,以及药学上可接受的载体。
12.一种在患者中治疗和/或预防Trop2相关疾病的方法,所述方法包括给所述患者施用有效量的权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求10的抗体缀合物或权利要求11的药物组合物。
13.权利要求12的方法,其中所述Trop2相关疾病选自男/女性生殖系统肿瘤(例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、消化系统肿瘤(例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌)、头颈部肿瘤(例如口腔鳞癌、咽喉癌)、神经系统肿瘤(例如脑胶质瘤)和呼吸系统肿瘤(例如肺癌,例如小细胞肺癌)。
14.权利要求12或13的方法,还包括给所述患者施用其它抗肿瘤治疗手段,例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。
15.权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求10的抗体缀合物或权利要求11的药物组合物在制备用于治疗和/或预防Trop2相关疾病的药物中的用途。
16.权利要求15的用途,其中所述Trop2相关疾病选自男/女性生殖系统肿瘤细胞(例如子宫内膜癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞)、消化系统肿瘤细胞(例如胰腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、食管鳞癌细胞、食管癌细胞、胆管癌细胞、肠癌细胞)、头颈部肿瘤细胞(例如口腔鳞癌细胞、咽喉癌细胞)、神经系统肿瘤细胞(例如脑胶质瘤细胞)和呼吸系统肿瘤细胞(例如肺癌细胞,例如小细胞肺癌)。
17.一种检测患者中恶性肿瘤的存在的方法,包括:
a)使获得自所述患者的生物学样品与权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触;
b)检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段与所述生物学样品中的靶抗原的结合,其中检出所述结合代表所述患者中存在恶性肿瘤。
18.权利要求17的方法,其中所述生物学样品包括血液样品、淋巴样品或其组分。
19.权利要求17或18的方法,其中所述恶性肿瘤选自男/女性生殖系统肿瘤(例如子宫内膜癌、子宫癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、消化系统肿瘤(例如胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、食管癌、胆管癌、肠癌)、头颈部肿瘤(例如口腔鳞癌、咽喉癌)、神经系统肿瘤(例如脑胶质瘤)和呼吸系统肿瘤(例如肺癌,例如小细胞肺癌)。
20.一种分离的核酸分子,其编码权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。
21.权利要求20的分离的核酸分子,所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
22.权利要求20的分离的核酸分子,所述核酸分子包含SEQ ID NO:17-20、SEQ ID NO:25-28、SEQ ID NO:35-36所示的核苷酸序列。
23.一种表达载体,其包含权利要求20-22中任一项的核酸分子。
24.一种宿主细胞,其由权利要求20-22中任一项的核酸分子或权利要求23的表达载体转化。
25.一种生产针对Trop2的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法,包括:
(i)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养权利要求24的宿主细胞,和
(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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