PL208113B1 - Agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-trkC, mysie agonistyczne przeciwciało monoklonalne, ludzkie agonistyczne przeciwciało monoklonalne, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca mysie agonistyczne przeciwciało monoklonalne, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ludzkie przeciwciało anty-trkC, cząsteczka kwasu nukleinowego, linia komórek gospodarza, linia komórek hybrydomy, przeciwciało wytwarzane przez tę linię komórek hybrydomy, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego i wektor zawierający tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, przeciwciało, polipeptyd, kompozycja - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trk-C. Dotyczy on ponadto zastosowania agonistycznych przeciwciał do zapobiegania i/lub leczenia degeneracji komórkowej, włączając w to uszkodzenie komórek nerwowych związane z ostrym uszkodzeniem komórek układu nerwowego i przewlekłymi chorobami neurodegeneracyjnymi, włączając w to neuropatię obwodową.

Stan techniki

Neurofiliny to rodzina małych, zasadowych białek, które pełnią kluczową rolę w rozwoju i utrzymywaniu układu nerwowego. Pierwszym zidentyfikowanym i prawdopodobnie najlepiej poznanym członkiem tej rodziny jest czynnik wzrostu nerwów (ang. nerve growth factor, NGF), który ma duży wpływ na rozwój neuronów czuciowych i współczulnych obwodowego układu nerwowego (Levi-Montalcini, R. i Angeletti, P. U., Physio. Rev. 48,534-569 [1968]; Thoenen, H. i wsp., Rev. Physio. Blochem. Pharmacol. 109, 145-178 [1987]). Jakkolwiek NGF był znany od dłuższego czasu, włączając w to homolog z gruczoł u podż uchwowego myszy, którego dojrzał a, aktywna postać jest nazywana często 2.5S NGF, jednak dopiero wiele lat później zidentyfikowano spokrewnione pod względem sekwencji, ale odrębne polipeptydy o podobnych funkcjach.

Pierwszym z kolei był czynnik zwany pochodzącym z mózgu czynnikiem neurotroficznym (ang. brain-derived neurotrophic factor, BDNF), który został sklonowany i zsekwencjonowany przez Leibrock, J. i wsp. (Nature 341, 149-152 [1989]). Czynnik ten oczyszczono wyjściowo z mózgu świni (Barde, Y. A. i wsp., EMBO J. 1, 549-553 [19821), ale dopiero po sklonowaniu i zsekwencjonowaniu cDNA, jego homologia z NGF stała się oczywista. Całkowita identyczność sekwencji aminokwasowych między NGF i BNDF wynosi około 50%. W świetle tego odkrycia, Leibrock i wsp. spekulowali, iż nie ma powodu aby sądzić, że BDNF i NGF mogły być jedynymi członkami rodziny neurotrofin mającymi wspólne właściwości strukturalne i funkcjonalne.

Rzeczywiście, wkrótce odkryto dalsze neurotrofiny ściśle spokrewnione z NGF i BDNF. Kilka grup zidentyfikowało neurotrofinę wyjściowo nazywaną czynnikiem neuronowym (ang. neuronal factor, NF), a obecnie określaną jako neurotrofina-3 (NT-3) (Ernfors i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,5454-5458 (1990); Hohn i wsp.. Nature 344,339 [1990]; Maisonpierre i wsp.. Science 247,1446 [1990]; Rosenthal i wsp.. Neuron 4, 767 [1990]; Jones i Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060-8064 (1990); Kaisho i wsp., FEBS Lett. 266,187 [1990]. NT-3 ma około 50% aminokwasów wspólnych zarówno z NGF jak i BDNF (NT-2). Do rodziny tej została dodana neurotrofina-4 i -5 (NT-4 i NT-5) (patent USA nr 5364769 opublikowany 15 listopada, 1994; Hallbook, F. i wsp., Neuron 6,845-858 [1991]; Berkmeier, L. R. i wsp.. Neuron 7, 857-866 [1991]; Ip i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89,3060-3064 [1992]). Cząsteczka ssacza wyjściowo opisana przez Berkmeier i wsp. jak wyżej, która okazała się następnie być homologiem NT-4 Xenopus, jest zazwyczaj nazywana NT-4/5. Istnieje ponadto opisane u ssaków homologiczne białko kwaśne, które zostało nazywane NT-6 (Berkemeir, i wsp., Somat. Cell Mol. Genet. 18 (3) : 233-245 [1992]). Ostatnio inne homologiczne bia ł ko z ryby, Xiphophorus zostało również oznaczone NT-6 (Gotz i wsp.. Nature 372: 266-269 [1994]). Dwa białka są opisane w literaturze jako NT-7, jedno sklonowane z karpia, Cyprinus, (Lai, i wsp.. Mol. Cell. Neurosci. 11 (1-2): 64-76 [1998]) i jedno z danio pręgowanego, Danio (Nilsson i wsp., FEBS Letters 424 (3) : 285-90 [19981). Żadna z tych trzech ostatnich opisanych rybich neurotrofin nie została opisana poza rybami i ich pokrewieństwo z którąkolwiek z neurotrofin ssaków jest niejasne. Sekwencja aminokwasowa neurotrophiny-7 danio pręgowanego (zNT-7) jest bardziej spokrewniona z rybim czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) i neurotrofiną-6 (NT-6) niż z jakąkolwiek inną neurotrofiną. zNT-7 jest jednakże w równym stopniu spokrewniony z NGF i NT-6 (65% i 63% identycznoś ci sekwencji aminokwasowej, odpowiednio) co wskazuje że reprezentuje ona odrębną sekwencję neurotrofiny. zNT-7 zawiera 15 reszt aminokwasowych w regionie skrętu beta pośrodku dojrzałego białka. Zrekombinowany zNT-7 ma zdolność wiązania się z ludzkim receptorem neurotrofiny p75 i indukowania fosforylacji tyrozyny szczurzej receptorowej kinazy tyrozynowej trkA, jakkolwiek mniej wydajnie niż szczurza NGF. zNT-7 nie oddziałuje ze szczurzą trkB lub trkC, co wskazuje na podobną do NGF specyficzność receptorową. Proponujemy, że różnicowanie się podrodziny NGF w drzewie ewolucyjnym neurotrofiny następowało w czasie ewolucji ryb kostnoszkieletowych, i jest ona, s ą dzą c na podstawie kilku innych czł onków, takich jak zNT-7 i NT-6, strukturalnie i funkcjonalnie spokrewniona z NGF.

Neurotrofiny, podobnie do innych peptydowych czynników wzrostowych, wpływają na swoje komórki docelowe poprzez oddziaływania z receptorami na powierzchni komórek. Zgodnie z obecną

PL 208 113 B1 wiedzą, jako receptory dla neurotrofiny służą dwa rodzaje transbłonowych glikoprotein. Badania nad równowagą wiązania pokazały, że neutrony odpowiadające na neurotrofinę posiadają wspólny receptor o niskiej masie cząsteczkowej (65-80 kDa) i niskim powinowactwie (LNGFR), nazywany również p75^NTR lub p75, który wiąże NGF, BDNF i NT-3 z KD wynoszącą 2 x 10^-9 M oraz receptory o dużej masie cząsteczkowej (65-80 kDa) i wysokim powinowactwie (130-150 kDa), (KD rzędu 10^-11M), które są członkami rodziny trk receptorowych kinaz tyrozynowych.

Pierwszy członek rodziny receptorów trk, trkA, został wyjściowo zidentyfikowany w wyniku transformacji nowotworowej powodowanej przez translokację sekwencji tropomiozyny do jej domeny katalitycznej (Martin-Zanca i wsp.. Mol. Cell. Biol. 911): 24-33 [1989]). Późniejsza praca zidentyfikowała trkA jako receptor przekazujący sygnały dla NGF. Następnie jako członków rodziny trk zidentyfikowano dwa inne spokrewnione receptory trkB, mysi i szczurzy (Klein i wsp., EMBO J. 8, 3701-3709 [1989]; Middlemas i wsp.. Mol. Cell. Biol. 11,143-153 [1991]; EP 455460 opublikowany 6 listopada 1991) oraz trkC świński, mysi i szczurzy (Lamballe i wsp.. Cell 66,967-979 [1991]; EP 522530 opublikowany 13 stycznia 1993). Struktura receptorów trk jest bardzo podobna, ale alternatywne składanie mRNA zwiększa złożoność rodziny poprzez powstawanie dwóch znanych form trkA, trzech znanych form trkB (dwóch bez funkcjonalnych domen kinaz tyrozynowych) i co najmniej czterech form trkC (kilku bez funkcjonalnej domeny kinazy tyrozynowych i dwóch z niewielkimi wstawkami w domenie kinazy tyrozynowej).

Rola receptorów p75 i trk jest kontrowersyjna. Przyjmuje się generalnie, że receptorowe kinazy tyrozynowe trk odgrywają ważną rolę w nadawaniu specyficzności wiązania poszczególnym neurotrofinom, jednakże komórki wyrażające trkA wiążą nie tylko NGF, ale również NT-3 i NT-415 (ale nie BDNF), trkB komórki wyrażające BDNF wiążą NT-3, NT-4 i NT-415 (ale nie NGF), w przeciwieństwie do komórek wyrażających trkC, dla których doniesiono, że wiążą tylko NT-3 (ale nie inne neurotrofiny). Ponadto, pokazano w systemach modelowych, że różne formy receptorów trk powstające w wyniku alternatywnego składania mogą aktywować różne wewnątrzkomórkowe szlaki przekazywania sygnału, a zatem prawdopodobnie poś redniczą w różnych funkcjach fizjologicznych in vivo. Nie jest jasne, czy komórki wyrażające dany receptor trk receptor w nieobecności p75 wiążą neurotrofiny z niskim czy wysokim powinowactwem (Meakin i Shooter, Trends Neurosci. 15,323-331 [1992]).

Opublikowane wyniki badań z użyciem różnych linii komórkowych są sprzeczne i sugerują, że p75 jest albo konieczny albo zbędny dla odpowiedzi na neurotrofinę. Linie komórkowe, które wyrażają sam p75 wiążą NGF, BDNF, NT-3 i NT-4 z podobnie niskim powinowactwem w stanie równowagi, ale stałe szybkości wiązania są wyraźnie różne. W rezultacie, jakkolwiek, wiązanie p75 jest wspólną właściwością wszystkich neurotrofin, sugeruje się, że receptor p75 może również odgrywać rolę w rozróżnianiu ligandów (Rodriguez-Tebar i wsp., EMBO J. 11, 917-922 [1992]). Jakkolwiek tradycyjnie myśli się o receptorach trk jako znaczących biologicznie receptorach neurotrofiny, pokazano ostatnio, że w liniach komórek czerniaka, w których brak ekspresji trkA, komórki NGF mogą nadal wzbudzać znaczne zmiany w zachowaniu biologicznym prawdopodobnie poprzez p75 (Herrmann i wsp.. Mol. Biol. Cell 4, 1205-1216 [1993]). Davies i wsp. (Neuron 11, 565-574 [1993]) przedstawili wyniki badań nad rolą p75 w przekazywaniu odpowiedzi przeżywania neuronów embrionalnych na neurotrofiny w modelu transgenicznych myszy niosących mutację null genu p75. Stwierdzili oni, że p75 wzmaga wrażliwość zależnych od NGF skórnych neuronów czuciowych na NGF. Jest teraz wiele badań pokazujących, że p75 ma zdolność do pośredniczenia w co najmniej niektórych efektach biologicznych neurotrofin. Dziedzina jest nadal w jakiejś mierze kontrowersyjna, ale postuluje się udział p75 w ś mierci komórkowej i rozroś cie neurytów (Barker, PA, Cell Death Diff. 5: 346356 [1998]; Bredesen i wsp.. Cell Death Diff. 5: 357-364 [1998]; Casaccia-Bonnefil, i wsp.. Cell Death Diff. 5: 357-364 [1998]; Raoul i wsp., Curr. Op. Neurobiol. 10: 111-117 [20001; Davies, AM, Curr. Biol. 10: R198-R200 [2000]). Co istotne, pokazano, że stymulacja p75 modyfikuje efekty stymulacji trkC (Hapner, i wsp., Developm. Biol. 201: 90-100 [19981).

Zewnątrzkomórkowe domeny natywnych receptorów trkA, trkB i trkC pełnej długości mają pięć funkcjonalnych domen, które zostały zdefiniowane w odniesieniu do homologicznych albo w inny sposób podobnych struktur zidentyfikowanych w różnych innych białkach. Domeny te zostały nazwane jako, począwszy od N-końcowej sekwencji aminokwasowej dojrzałych receptorów trk 1) pierwsza domena bogata w cysteinę rozciągająca się od pozycji aminokwasowej 1 do pozycji aminokwasowej około 32 ludzkiego trkA, od pozycji aminokwasowej 1 do pozycji aminokwasowej około 36 ludzkiego trkB i od pozycji aminokwasowej 1 do pozycji aminokwasowej około 48 ludzkiego trkC; 2) domena bogata w leucynę rozciągająca się od pozycji aminokwasowej około 33 do pozycji aminokwasowej

PL 208 113 B1 około 104 w trkA; od pozycji aminokwasowej około 37 do pozycji aminokwasowej około 108 w trkB i od pozycji aminokwasowej okoł o 49 do pozycji aminokwasowej okoł o 120 w trkC; 3) druga domena bogata w cysteinę od pozycji aminokwasowej około 105 do pozycji aminokwasowej około 157 w trkA; od pozycji aminokwasowej około 109 do pozycji aminokwasowej około 164 w trkB i od pozycji aminokwasowej około 121 do pozycji aminokwasowej około 177 w trkC; 4) pierwsza domena immunoglobino-podobna rozciągająca się od pozycji aminokwasowej około 176 do pozycji aminokwasowej około 234 w trkA; od pozycji aminokwasowej około 183 do pozycji aminokwasowej około 239 w trkB; i od pozycji aminokwasowej około 196 do pozycji aminokwasowej około 257 w trkC; oraz 5) pierwsza domena immunoglobino-podobna rozciągająca się od pozycji aminokwasowej około 264 do pozycji aminokwasowej około 330 w trkA; od pozycji aminokwasowej około 270 do pozycji aminokwasowej około 334 w trkB; i od pozycji aminokwasowej około 288 do pozycji aminokwasowej około 351 w trkC.

Neurotrofiny wykazują działanie na odrębne, ale zachodzące na siebie zastawy neuronów obwodowych i ośrodkowych. Efekty te sięgają od odgrywania głównej roli w zapewnieniu przeżywalności rozwijających się neuronów (NGF w neuronach czuciowych i współczulnych) do stosunkowo stabilnych efektów na morfologię neuronów (NT-3 na komórki purkinje). Aktywności te doprowadziły do zainteresowania się użyciem neutrotrofin jako sposobu leczenia pewnych chorób neurodegeneracyjnych. Stwierdzono również, że NT-3 promuje proliferację leukocytów krwi obwodowej i w rezultacie zasugerowano, że NT-3 można użyć do leczenia neutropenii, chorób infekcyjnych i nowotworów (patent USA nr 6015552 wydany 18 czerwca, 2000).

Badano również rolę neurotrofin w regulowaniu rozwoju naczyń sercowych i modulowaniu odpowiedzi układu naczyniowego na zranienia (Donovan i wsp.. Nature Genetics 14: 210-213 [1996]; Donovan i wsp., A. J. Path. 147: 309-324 [1995]; Kraemer i wsp., Arteriol. Thromb. and Vase. Biol. 19: 1041-1050 [1999]). Neurotrofiny opisano jako potencjalne leki do regulowania rozwoju i integralności naczyń (publikacja POT WO 00124415, opublikowana 4 maja, 2000).

Pomimo obietnicy leczenia degeneracji komórkowej, takiej jaka następuje na skutek choroby neurodegeneracyjnej i ostrych uszkodzeń neuronów, a potencjalnie angiogenezy, neurotrofiny mają szereg wad. Jedną ze znaczących wad jest brak specyficzności. Większość neurotrofin reaguje krzyżowo z więcej niż jednym receptorem. Przykładowo, NT-3, korzystny ligand receptorowej kinazy tyrozynowej trkC wiąże się również i aktywuje trkA i trkB (Barbacid, J. Neurobiol. 25: 1386-1403 [1994]; Barbarcid, Ann. New York Acad. Sci. 766: 442-458 [1995]; Ryden i Ibanez, J. Biol. Chem. 271: 5623-5627 [1996]; Belliveau i wsp., J. Cell. Biol. 136: 375-388 [1997]; Farinas i wsp.. Neuron 21: 325-334 [1998]). W rezultacie trudno jest opracować terapie, które będą skierowane wobec specyficznej populacji neuronów. Innym ograniczeniem leczenia neurotrofinami jest to, iż wiadomo, że neurotrofiny, włączając w to NT-3 wywołują przeczulicę bólową (Chaudhry i wsp., Muscle and Nerve 23: 189-192 [20001). Ponadto, niektóre neurotrofiny, takie jak NT-3, mają słabą farmakokinetykę i dostępność biologiczną u gryzoni co nasuwa poważne pytania dotyczące ich zastosowania klinicznego u ludzi (Haase i wsp., J. Neurol. Sci. 160: S97-S105 [1998], dawkowanie stosowane w Helgren i wsp., J. Neurosci. 17 (1): 372-82 [1997] i dane poniżej).

A zatem istnieje wielka potrzeba rozwoju nowych czynników terapeutycznych do leczenia chorób neurodegeneracyjnych i ostrych uszkodzeń komórek nerwowych, które są pozbawione wad neurotrofin.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek jest oparty na opracowaniu i charakteryzacji agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC skierowanych przeciw epitopom w zewnątrzkomórkowej domenie receptora trkC, które naśladują aktywności biologiczne NT-3, naturalnego liganda receptora trkC, ale są wolne od pewnych wad NT-3. Wynalazek pokazuje ponadto przydatność tych antagonistycznych przeciwciał w leczeniu neuropatii w zwierzę cym modelu doś wiadczalnym. Agonistyczne przeciwciał a monoklonalne anty-trkC oferują szereg zalet w stosunku do NT-3 przy profilaktycznym lub leczniczym traktowaniu degeneracji komórkowej, takiej jak uszkodzenie komórki nerwowej, a w szczególności uszkodzenie komórki nerwowej związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak neuropatie obwodowe albo z powodu czynników zewnętrznych, takich jak uraz, czynniki toksyczne, operacja, aby wspomnieć tylko kilka.

W jednym z aspektów, wynalazek dotyczy agonistycznego przeciwciał a monoklonalnego antytrkC, które (a) wykazuje brak reakcji krzyżowej z trkA lub trkB; i (b) rozpoznaje epitop w domenie 5 trkC.

PL 208 113 B1

Pewne agonistyczne przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą dodatkowo rozpoznawać epitop w domenie 4 trkC. W korzystnym wykonaniu, przeciwciała wiążą trkC zarówno ludzki, jak i gryzoni (np. szczura lub myszy) i mogą być przeciwciał ami mysimi, chimerowymi (łącznie z humanizowanymi) lub ludzkimi. Przeciwciała naśladują co najmniej jedną aktywność biologiczną natywnego liganda trkC, NT-3, a zatem mogą być skuteczne w zapobieganiu i/lub leczeniu degeneracji komórkowej, włączając w to na przykład neuropatie, takie jak neuropatia indukowana cisplatyną lub pirydoksyną albo neuropatia cukrzycowa i (gdzie degeneracja komórkowa obejmuje degenerację komórek szpiku kostnego) choroby niedoboru komórek krwi, takie jak leukopenie włączając w to eozynopenię i/lub bazopenię, limfopenę, monocytopenię i neutropenię. W szczególnie korzystnym wykonaniu, przeciwciała agonistyczne według niniejszego wynalazku wykazują lepsze właściwości niż NT-3, na przykład nie powodują przeczulicy bólowej, kiedy są podawane pacjentowi, mają zwiększoną biodostępność i/lub większą aktywność specyficzną w porównaniu z NT-3.

W innym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy ł a ń cucha ciężkiego przeciwciał a anty-trkC zawierającego następujące CDR: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 1, 2, 3, 4 i 5; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 6, 7, 8, 9, 10 i 11 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 12, 13, 14, 15, 16 i 17; oraz łańcuch lekki przeciwciała anty-trkC, który zawiera następujące CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciał o jest skuteczne do naś ladowania aktywnoś ci biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

W dalszym korzystnym aspakcie wynalazku, przeciwcia ł o stanowi mysie przeciwciał o posiadające łańcuch ciężki anty-trkC zawierającego następujące CDRy:

(a) CDR1 o wzorze XaaWXaaXaaWVK (SEK NR ID: 37), gdzie Xaa w pozycji 1 to F albo Y; Xaa w pozycji 3 to I albo M; a Xaa w pozycji 4 to E albo H;

(b) CDR2 o wzorze EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa (SEK NR ID: 38), gdzie Xaa w pozycji 3 to L albo Y; Xaa w pozycji 5 to G albo S; Xaa w pozycji 6 to S albo N; Xaa w pozycji 7 to D albo G; Xaa w pozycji 8 to N albo R i Xaa w pozycji 16 to G albo S; i (c) CDR3 o wzorze KNRNYYGNYVV (SEK NR ID: 12) albo KYYYGNSYRSWYFDV (SEK NR ID: 13) i łańcuch lekki zawiarajacy następujące CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciało jest skuteczne do naśladowania aktywności biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

W kolejnym korzystnym aspekcie wynalazku przeciwciał o stanowi ludzkie przeciwciał o posiadające łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała anty-trkC zawierającego następujące CDR:

(a) CDR1 o wzorze XaaXaaXaaYYWXaa (SEK NR ID : 39), gdzie Xaa w pozycji 1 to S albo l; Xaa w pozycji 2 to G albo S; Xaa w pozycji 3 to G, T albo Y, a Xaa w pozycji 7 to S albo N;

(b) a CDR2 o wzorze XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS (SEK NR ID: 40), gdzie Xaa w pozycji 1 to Y albo R; Xaa w pozycji 3 to Y albo F; Xaa w pozycji 4 to Y albo T; Xaa w pozycji 8 to S albo R; a Xaa w pozycji 10 to N albo Y; i (c) CDR3 o wzorze wybranym z grupy składającej się z DRDYDSTGDYYSYYGMDV (SEK NR ID: 14); DGGYSNPFD (SEK NR ID: 15); ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV (SEK NR ID : 41), gdzie Xaa w pozycji 8 to A albo T i Xaa w pozycji 16 to D albo A i i ł a ń cuch lekki zawiarajacy nastę pują ce CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy skł adają cej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy skł adają cej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciało jest skuteczne do naśladowania aktywności biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

Korzystne jest jeżeli przeciwciało jest ludzkie albo zawiera ludzkie reszty zrębowe i korzystnie, jeżeli nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA lub trkB.

Korzystnie przeciwciało ma strukturę homotetramerową złożoną z dwóch połączonych mostkami dwusiarczkowymi par łańcuch ciężki-łańcuch lekki.

PL 208 113 B1

Korzystnie przeciwciało według wynalazku obejmuje fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv, fragment Fab, fragment Fab' lub fragment F (ab')2.

Przeciwciało według wynalazku nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA i trkB.

Uwzględnione są przeciwciała wszystkich klas i izotypów, ale korzystne są IgG, a w szczególności IgG-2 i IgG-4.

Przeciwciało to korzystnie ma strukturę homotetramerową złożoną z dwóch połączonych mostkami dwusiarczkowymi par łańcuch ciężki-łańcuch lekki. Ponadto korzystnie charakteryzuje się tym, że obejmuje fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv, fragment Fab, fragment Fab' lub fragment F (ab')2. Przeciwciało to może być przeciwciałem IgG, a w szczególności IgG-2 i IgG-4.

Przedmiotem wynalazku jest również mysie agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-trkC, wybrane z grupy składającej się z przeciwciał 2248 (PTA-2147), 2250 (PTA-2149), 2253 (PTA-2145)i 2256 (PTA-2152).

Następnym przedmiotem wynalazku jest ludzkie agonistyczne przeciwciało monoklonalne antytrkC, wybrane z grupy składającej się z przeciwciał 6.1.2 (PTA-2148), 6.4.1 (PTA-2150), 2345 (PTA2146) i 2349 (PTA-2153), 2.5.1 (PTA-2151)i 2344 (PTA-2144).

Korzystnie, ludzkie przeciwciało według wynalazku wybrane jest z grupy składającej się z przeciwciał 6.1.2 (PTA-2148), 6.4.1 (PTA-2150), 2345 (PTA-2146) i 2349 (PTA-2153).

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca mysie agonistyczne przeciwciało anty-trkC, oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ludzkie agonistyczne przeciwciało anty-trkC.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego zdeponowana w ATCC 21 czerwca 2000 pod numerem dostępu wybranym z grupy składającej się z PTA-2136, PTA-2137, PTA-2138; i cząsteczka kwasu nukleinowego zdeponowana w ATCC 21 czerwca 2000 pod numerem dostępu wybranym z grupy składającej się z PTA-2133, PTA-2134, PTA-2135, PTA-2139, PTA-2140, PTA-2141, PTA-2142 i PTA-2143.

W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy wektora zawierającego zdefiniowaną powyżej wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki i/lub lekki. Wynalazek dotyczy również komórek transformowanych takim kwasem nukleinowym. Wynalazek dotyczy ponadto linii komórek hybrydomy transformowanych taką cząsteczką kwasu nukleinowego i przeciwciał wytwarzanych przez takie komórki hybrydomy.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierają cej skuteczną ilość opisanego tu agonistycznego monoklonalnego przeciwciała anty-trkC zmieszanego z farmaceutycznie dopuszczalnym noś nikiem.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy agonistycznego przeciwciał a anty-trkC do leczenia neuropatii albo choroby neurodegeneracyjnej albo naprawiania uszkodzonej komórki nerwowej.

Wspomniana neuropatia jest wybrana z grupy składającej się z neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej i neuropatii dużych włókien czuciowych, a zwłaszcza wspomnianą chorobą neurodegeneracyjną jest stwardniania zanikowe boczne ALS.

Chorobą neurodegeneracyjną może być na przykład stwardnienie zanikowe boczne, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, padaczka, stwardnienie rozsiane, pląsawica Huntingtona. Uszkodzonymi neuronami mogą być neurony obwodowe takie jak czuciowe np. neurony zwoju korzenia grzbietowego, neurony ruchowe np. neurony rdzenia kręgowego albo neurony ośrodkowe, a uszkodzenie może nastąpić na skutek rozmaitych czynników zewnętrznych i wewnętrznych, włączając w to uraz, działanie neurotoksyn, choroby metaboliczne, czynniki infekcyjne, itd.

Przeciwciało według wynalazku jest do podawania dożylnego lub podskórnego oraz ewentualnie do podawania miejscowego.

W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy przeciwciał jak był y one zdefiniowane do zwię kszania proliferacji, utrzymywania lub regeneracji neuronów obwodowych, obejmujący doprowadzenie do kontaktu takich neuronów ze skuteczną ilością przeciwciała według niniejszego wynalazku.

W jeszcze dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy izolowanego kwasu nukleinowego do zastosowania w metodzie leczenia (włączając zapobieganie) choroby albo stanu związanych z degeneracją komórkową u ssaka poprzez wprowadzenie kwasu nukleinowego kodującego opisane tu przeciwciało anty-trkC do komórki takiego osobnika. Korzystne jest, jeżeli sposób (terapia genowa) dotyczy leczenia neuropatii albo choroby neurodegeneracyjnej albo naprawiania uszkodzonej komórki nerwowej. A zatem korzystne jest, jeżeli komórkami biorcy są komórki nerwowe. Kwas nukleinowy korzystnie może być wprowadzany ex vivo lub ewentualnie in vivo.

PL 208 113 B1

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy cząsteczek do dostarczania zawierających materiał genetyczny (kwas nukleinowy) kodujący przeciwciało anty-trkC przydatne do zastosowania w terapii genowej.

W dodatkowym aspekcie wynalazek dotyczy sposobów indukowania angiogenezy poprzez dostarczenie przeciwciała anty-trkC według wynalazku w ilości skutecznej do indukowania angiogenezy. Dostarczenie obejmuje w szczególności podawanie przeciwciał i dostarczenie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciała (np. w terapii genowej).

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania agonistycznego przeciwciała anty-trkC, które nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA lub trkB; i (b) rozpoznaje epitop w domenie 5 trkC, polegają cy na tym, ż e obejmuje wytwarzanie przeciwciał a wiążącego swoiś cie trkC w miejscu zachodzącym na miejsce wiązania natywnego liganda NT-3 wspomnianego trkC, przy czym korzystnie przeciwciało wiąże trkC w zasadniczo tym samym miejscu, co natywny ligand NT-3 wspomnianego trkC.

W innym korzystnym aspekcie przeciwciał o wiąże się z epitopem w obrę bie domeny 5 trkC. Takim trkC korzystnie jest natywny ludzki polipeptyd trkC, a wspomniany epitop obejmuje reszty aminokwasowe L284, E287 i N335 takiego natywnego ludzkiego trkC.

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy wyizolowanej czą steczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki albo lekki mysiego lub ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-trkC wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 58, SEK NR ID: 59, SEK NR ID: 60, SEK NR ID: 61, SEK NR ID: 62, SEK NR ID: 63, SEK NR ID: 64, SEK NR ID: 65, SEK NR ID: 66, SEK NR ID: 67, SEK NR ID: 68, SEK NR ID: 69, SEK NR ID: 70 i SEK NR ID: 71. Niniejszy wynalazek dotyczy również polipeptydu kodowanego przez jedną albo więcej wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego.

Wynalazek opisuje też całą komórkę transformowaną kwasem nukleinowym kodującym łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo obydwa łańcuchy, ciężki i lekki, mysiego lub ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-trkC.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 A-D przedstawia aktywność agonistyczną różnych ludzkich (A i C) i mysich (B i D) monoklonalnych przeciwciał przeciw receptorowi trkC wykazaną przy zastosowaniu KIRA (A i B) i testu rozrostu neurytów w PC12 (C i D). Przeciwciała monoklonalne oczyszczone poprzez białko A rozcieńczano do 27 μg/ml w buforze do stymulacji KIRA (F12/DMEM 50:50 zawierającym 2% bydlęcej albuminy surowiczej [BSA, Intergen Co., Purchase, NY] i 25 mM Hepes, filtrowany przez 0,2 μm). Przeciwciała monoklonalne rozcieńczano następnie 1:3 (razem 8 rozcieńczeń; stężenia Mab w zakresie 0,01-180 nM) w pożywce do stymulacji.

Komórki CHO transfekowane GD (5 x 10⁴ komórek/studzienkę) stymulowano NT-3 albo Mab (rozcieńczenia testowane w dwóch powtórzeniach) przez 6 godzin i test kończono jak opisano w przykładach (Fig. 1A, ludzkie Mab; Fig. 1B, mysie Mab). Oczyszczone Mab testowano pod kątem aktywności agonistycznej w teście rozrostu neurytów w PC12 jak opisano w przykładach.

Komórki szczurze PC12 transfekowano ludzkim trkC pełnej długości i komórki wysiewano przy gęstości 1000 komórek/studzienkę. Trzy dni po transfekcji do studzienek zawierających transfektanty trkC dodawano w trzech powtórzeniach Mab (stężenia w zakresie 0,0002 do 2,7 nM) i inkubowano przez dodatkowe 3 dni w 37°C. Komórki analizowano następnie poprzez mikroskopię w kontraście fazowym i liczono komórki z neurytami przekraczającymi dwukrotnie średnicę komórek.

Fig. 2 pokazuje, że agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC wiążą się swoiście z trkC przy użyciu przeciwciała 6.1.2 jako reprezentatywny przykład.

Fig. 3 pokazuje, że agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC rozpoznają ludzki trkC bardziej wydajnie niż szczurzy trkC. Zdolność monoklonalnych przeciwciał do wiązania szczurzego trkC wykazano przy użyciu konstruktu immunoadhezynowego receptora. TrkC (ludzki trkC-gD lub szczurzy trkC-IgG) unieruchamiano na płytkach do mikromiareczkowania (100 μl roztworu 1 μg/ml rozcieńczonego w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,5) przez noc. Płytki przemywano i blokowano. Mab rozcieńczano następnie do 1 μg/ml w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,05% Tween 20, dodawano do odpowiednich studzienek (100 μl/studzienkę) i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano i dodawano odpowiedniego koniugatu HRP (ludzkie Mab:kozie anty-ludzkie KHRP, 1:5K; mysie Mab: kozie anty-molgG (Fc)-HRP, 1:5 K) i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki następnie przemywano, wywoływano i sczytywano.

Fig. 4 przedstawia reprezentatywny przykład mapowania epitopów przy użyciu testu współzawodnictwa ELISA. Biotynylowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-trkC 6.1.2 inkubowano

PL 208 113 B1 z unieruchomionym trkC w nieobecności albo obecności nadmiaru ró żnych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC.

Fig. 5 podsumowuje wyniki mapowania epitopów przy użyciu testu współzawodnictwa ELISA

Fig. 6A-C przedstawiają schematyczny diagram różnych chimer trkC (A) i ich użycia w mapowaniu epitopów trkC rozpoznawanych przez różne agonistyczne ludzkie (B) i mysie (C) przeciwciała monoklonalne anty-trkC.

Fig. 7 przedstawia sekwencję aminokwasową domeny 4 i 5 ludzkiego trkC z pokazaniem reszt, które stanowiły cel mutagenezy dla rozszyfrowania ich roli w rozpoznawaniu przez agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC.

Fig. 8 przedstawia 3-wymiarowy diagram wstążkowy trkC w kompleksie z przeciwciałami monoklonalnymi anty-trkC. Pokazano konkretne reszty aminokwasowe trkC, które odgrywają prawdopodobnie ważną rolę w rozpoznawaniu przez CDR przeciwciał anty-trkC.

Fig. 9 przedstawia sekwencję aminokwasową regionu zmiennego (VH) łańcucha ciężkiego z mysiego i ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-trkC. Dodatkowo, trzy regiony CDR (CDR1, CDR2 i CDR3) są wytłuszczone. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego 2250 i 2253 jest SEK NR ID: 1. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego 2256 jest SEK NR ID: 2. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego 6.1.2 i 2345 jest SEK NR ID: 3. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 4. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha ciężkiego 2349 jest SEK NR ID: 5. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 2250 i 2253 jest SEK NR ID: 6. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 2256 jest SEK NR ID: 7. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 6.1.2 jest SEK NR ID: 8. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 9. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 2345 jest SEK NR ID: 10. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha ciężkiego 2349 jest SEK NR ID: 11. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 2250 i 2253 jest SEK NR ID: 12. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 2256 jest SEK NR ID: 13. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 6.1.2 jest SEK NR ID: 14. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 15. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 2345 jest SEK NR ID: 16. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha ciężkiego 2349 jest SEK NR ID: 17.

Fig. 10 przedstawia sekwencję aminokwasową regionu zmiennego (VL) łańcucha lekkiego z mysiego i ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-trkC. Dodatkowo, trzy regiony CDR (CDR1, CDR2 i CDR3) są wytłuszczone. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 2250 jest SEK NR ID: 18. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 2253 jest SEK NR ID: 19. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 2256 jest SEK NR ID: 20. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 6.1.2 jest SEK NR ID: 21. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 22. Sekwencja aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 2345 jest SEK NR ID:

23. Sekwencją aminokwasową CDR1 łańcucha lekkiego 2349 jest SEK NR ID: 24. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 2250 jest SEK NR ID: 25. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 2253 jest SEK NR ID: 26. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 2256 jest SEK NR ID: 27. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 6.1.2 jest SEK NR ID: 28. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 29. Sekwencją aminokwasową CDR2 łańcucha lekkiego 2345 i 2349 jest SEK NR ID: 30. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 2250 jest SEK NR ID: 31. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 2253 jest SEK NR ID: 32. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 2256 jest SEK NR ID: 33. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 6.1.2 jest SEK NR ID: 34. Sekwencją aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 6.4.1 jest SEK NR ID: 35. Sekwencja aminokwasową CDR3 łańcucha lekkiego 2345 i 2349 jest SEK NR ID: 36.

Fig. 11 przedstawia sekwencję aminokwasową CDR łańcuchów lekkich i ciężkich mysich i ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciw trkC. Pokazane są również rodziny, do których te sekwencje należą w oparciu o homologię z sekwencjami CDR dostępnymi w bazach danych.

Fig. 12 pokazuje, że agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC mają zwiększony okres półtrwania i biodostępność in vivo.

Fig. 13 pokazuje wpływ agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC na neuropatię indukowaną cisplatyną.

Fig. 14 pokazuje zmniejszenie ekspresji markera powodowane przez neuropatię pirydoksynową.

Fig. 15 pokazuje zmniejszenie efektów niskich dawek pirydoksyny przez agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC.

PL 208 113 B1

Fig. 16 pokazuje zmniejszenie efektów wysokich dawek pirydoksyny przez agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC.

Fig. 17 pokazuje zmniejszenie neuropatii pirydoksynowej przez agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC.

Fig. 18 pokazuje osłabienie przez agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC indukowanego przez pirydoksynę niedostatku w teście drabiny.

Fig. 19 pokazuje, że NT3, ale nie agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC, powoduje przeczulicę bólową w dawkach terapeutycznych.

Fig. 20 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiego receptora trkC (SEK NR ID: 56), gdzie zaznaczone są granice domen 4 i 5.

Fig. 21 (na 2 stronach) przedstawia sekwencję nukleotydową ludzkiego receptora trkC (SEK NR ID: 57).

Fig. 22 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 58) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 59) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2250.

Fig. 23 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 60) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 61) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2253.

Fig. 24 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 62) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 63) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2256.

Fig. 25 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 64) i łańcucha lekkiego (SEK NR ID: 65) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2345.

Fig. 26 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 66) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 67) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2349.

Fig. 27 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 68) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 69) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 6.1.2.

Fig. 28 przedstawia sekwencję nukleotydową łańcucha ciężkiego (A; SEK NR ID: 70) i łańcucha lekkiego (B; SEK NR ID: 71) agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 6.4.1.

Szczegółowy opis konkretnego wykonania

A. Definicje

Termin „neurotrofina oraz jego odmiany gramatyczne są stosowane wymiennie i odnoszą się do rodziny polipeptydów obejmującej czynnik wzrostu nerwu (NGF) oraz spokrewnione z nim sekwencyjnie homologi. Jak dotąd jako członków tej rodziny zidentyfikowano NGF, czynnik wzrostu pochodzący z mózgu (BDNF, znany również jako NT-2), neurotrofinę-3 (NT-3), neurotrofiny-4 i -5 (NT-4/5), neurotrofinę-6 (NT-6) oraz neurotrofinę-7 (NT-7).

Termin „neurotrofina obejmuje neurotrofiny naturalne dowolnego (ludzkiego lub innego niż ludzki) gatunku zwierząt oraz ich funkcjonalne pochodne, oczyszczone z naturalnego źródła, przygotowane przy użyciu sposobów technologii rekombinowania DNA lub syntezy chemicznej albo przy zastosowaniu kombinacji tych lub innych sposobów. Neurotrofiny „natywne lub „o sekwencji natywnej posiadają sekwencję aminokwasową neurotrofiny występującej w naturze w dowolnym ludzkim lub innym niż ludzki gatunku zwierząt, włączając w to naturalnie występujące formy skrócone i odmienne oraz naturalnie występujące odmiany alleliczne.

Określenia „trk, „polipeptyd trk, „receptor trk oraz ich odmiany gramatyczne są stosowane wymiennie i odnoszą się do polipeptydów z nadrodziny receptorowych kinaz tyrozynowych, które są zdolne do wiązania przynajmniej jednej naturalnej neurotrofiny. Obecnie zidentyfikowanymi członkami tej rodziny są trkA (p140^trkA), trkB, oraz trkC.

Stosowane tu wyrażenie „domena zewnątrzkomórkowa lub „ECD odnosi się do dowolnej sekwencji polipeptydowej, która posiada funkcję wiązania ligandu właściwą dla domeny zewnątrzkomórkowej naturalnie występującego receptora. Funkcja wiązania ligandu domeny zewnątrzkomórkowej odnosi się do zdolności polipeptydu do związania ligandu. A zatem, nie ma konieczności obejmowania całkowitej domeny zewnątrzkomórkowej, ponieważ zostało stwierdzone, że mniejsze fragmenty są odpowiednie do wiązania ligandu. Skrócona domena zewnątrzkomórkowa jest generalnie rozpuszczalna. Termin ECD obejmuje sekwencje polipeptydowe, w których hydrofobowa sekwencja transbłonowa (oraz, ewentualnie, 1-20 aminokwasów C-30 końcowych i/lub N-końcowych w stosunku do domeny transbłonowej) dojrzałego receptora została usunięta.

Termin „agonistyczne przeciwciało anty-trkC odnosi się do przeciwciała, które jest zdolne do wiązania i aktywowania receptora trkC o naturalnej sekwencji i/lub szlaków leżących poniżej, w których pośredniczy funkcja sygnałowa trkC, naśladując w ten sposób aktywność biologiczną naturalne10

PL 208 113 B1 go liganda tego receptora, w szczególności NT-3. Przykładowo, agonistyczne przeciwciało może wiązać się z domeną ECD receptora trkC, powodując w ten sposób dimeryzację tego receptora, co prowadzi do aktywacji wewnątrzkomórkowej katalitycznej domeny kinazy. W konsekwencji może to powodować stymulację wzrostu i/lub różnicowania komórek wyrażających ten receptor in vitro i/lub in vivo. Agonistyczne przeciwciała według niniejszego wynalazku rozpoznają zazwyczaj epitop, który obejmuje przynajmniej część domeny (pozycje aminokwasów od około 266 do około 381) i/lub domeny 4 (pozycje aminokwasów od około 178 do około 265) ludzkiego receptora trkC lub odpowiedniego epitopu receptora innego niż ludzki, np. mysiego.

Termin „aktywność biologiczna, stosowany w połączeniu z agonistycznymi przeciwciałami anty-trkC według niniejszego wynalazku, odnosi się generalnie do posiadania funkcji efektorowej wspólnej z NT-3, naturalnym ligandem trkC. Korzystne jest, jeżeli funkcją efektorową jest zdolność do wiązania i aktywowania receptorowej kinazy tyrozynowej trkC i/lub szlaków leżących poniżej, w których pośredniczy funkcja sygnałowa trkC. Preferowane aktywności biologiczne obejmują, bez ograniczania, zdolność do pobudzania rozwoju, proliferacji, utrzymania i/lub regeneracji uszkodzonych komórek, w szczególności neuronów in vitro lub in vivo, włączając w to neurony obwodowe (współczulne, przywspółczulne, czuciowe i jelitowe), neurony ruchowe oraz neurony ośrodkowe (mózg i rdzeń kręgowy), a także komórki nie neuronalne, np. leukocyty krwi obwodowej. Szczególnie korzystną aktywnością biologiczną jest zdolność do leczenia (w tym zapobiegania) neuropatii, np. neuropatii obwodowej lub innej choroby neurodegeneracyjnej lub naprawy uszkodzonej komórki nerwowej. Uszkodzone neurony mogą być neuronami czuciowymi, współczulnymi, przywspółczulnymi lub jelitowymi, (np. neuronami zwojów korzenia grzbietowego), neuronami motorycznymi, oraz neuronami ośrodkowymi, np. neuronami rdzenia kręgowego, a uszkodzenie może mieć różną przyczynę, włączając w to uraz psychiczny, czynniki toksyczne, operację, udar, niedokrwienie, zakażenie, chorobę metaboliczną, niedobór żywieniowy oraz rozmaite stany nowotworowe. Inną charakterystyczną aktywnością biologiczną jest zdolność indukowania angiogenezy.

Stosowany tu termin „leczenie to postępowanie w celu uzyskania korzystnych albo pożądanych wyników klinicznych. Dla potrzeb tego wynalazku, korzystne albo pożądane wyniki kliniczne obejmują między innymi, złagodzenie objawów, zmniejszenie zakresu choroby, stabilizację (tj. nie pogarszanie się) stanu chorobowego, opóźnienie albo zwolnienie postępów choroby, złagodzenie bólu w stanach chorobowych oraz remisję (częściową albo całkowitą), wykrywalną albo niewykrywalną. „Leczenie może również oznaczać przedłużone życie w porównaniu z oczekiwanym czasem przeżycia w przypadku braku leczenia. „Leczenie to interwencja przeprowadzana z intencją zapobiegania rozwojowi albo zmiany patologii choroby. A zatem „leczenie odnosi się zarówno do traktowania terapeutycznego jak i sposobów profilaktycznych albo zapobiegawczych. Potrzebujący leczenia obejmują tych, u których już występuje choroba, jak również tych, u których chce się zapobiec chorobie. Konkretnie, leczenie może bezpośrednio zapobiegać, zwalniać albo w inny sposób zmniejszać patologię degeneracji komórkowej uszkodzenia, takiego jak patologia komórek nerwowych albo może czynić komórki, np. neurony bardziej podatnymi na traktowanie innymi czynnikami terapeutycznymi. W korzystnym wykonaniu, leczenie zmniejsza lub spowalnia postępującą chorobę i/lub stymuluje odtworzenie funkcji docelowych neuronów.

„Patologia (przewlekłej) choroby neurodegeneracyjnej lub ostrego uszkodzenia układu nerwowego obejmuje wszystkie zjawiska, które wpływają na zdrowie pacjenta, włączając w to, bez ograniczania dysfunkcję, degenerację, uszkodzenie i/lub śmierć neuronów.

Terminy „choroba neurodegeneracyjna oraz „zaburzenie neurodegeneracyjne są stosowane w najszerszym znaczeniu obejmują c wszystkie zaburzenia, których patologia obejmuje degenerację i/lub dysfunkcję neuronów, włączając w to, bez ograniczania: neuropatie obwodowe, zaburzenia neuronów ruchowych, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS, choroba Lou Gehrig), porażenie obwodowe nerwu twarzowego (ang. Bell's palsy) oraz różne stany obejmujące zanik lub porażenie mięśni rdzeniowych; oraz inne ludzkie choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, padaczka, stwardnienie rozsiane, pląsawica Huntingtona, zespół Downa, głuchota nerwowa oraz zespół Meniere.

„Neuropatia obwodowa to zaburzenie neurodegeneracyjne, które dotyczy nerwów obwodowych, przejawiające się najczęściej jako dysfunkcja ruchowa, czuciowa, czuciowo-ruchowa lub autonomiczna albo ich kombinacja. Neuropatie obwodowe mogą być przykładowo nabyte genetycznie, mogą być wynikiem choroby ogólnoustrojowej lub mogą być wywołane przez czynnik toksyczny, taki jak środek neurotoksyczny, np. czynnik przeciwnowotworowy lub zanieczyszczenie przemysłowe lub

PL 208 113 B1 środowiskowe. „Czuciowa neuropatia obwodowa charakteryzuje się degeneracją obwodowych neuronów czuciowych, która może być samoistna, może przykładowo następować jako konsekwencja cukrzycy (neuropatia cukrzycowa), terapii nowotworowej z wykorzystaniem leku cystostatycznego (np. leczenie przy użyciu czynników chemoterapeutycznych, takich jak winkrystyna, cisplatyna, metotreksan, 3'-azydo-3'-deoksytymidyna lub taksany, np. paklitaksel [TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, New Jersey, Stany Zjednoczone] lub doksetaksel [TAXOTERE® Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja]), alkoholizmu, nabytego zespołu upośledzenia odporności (AIDS), lub skłonności genetycznej. Genetycznie nabyte neuropatie obwodowe obejmują przykładowo: chorobę Refsuma, chorobę Krabbego, leukodystrofię metachromatyczną, chorobę Fabry'ego, chorobę Dejerine'a-Sottasa, abetalipoproteinemię, chorobę Charcot-Marie-Tooth (znaną również jako zanik mięśnia strzałkowego lub dziedziczna neuropatia ruchowo-czuciowa (ang. Hereditary Motor Sensory Neuropathy, HMSN). Większość rodzajów neuropatii obwodowej rozwija się powoli, przez okres kilku miesięcy lub lat. W praktyce klinicznej takie neuropatie nazywane są przewlekłymi. Czasem neuropatia obwodowa rozwija się szybko, przez okres kilku dni i jest wtedy określana jako ostra. Neuropatia obwodowa wpływa zazwyczaj zarówno na nerwy czuciowe, jak i ruchowe, co powoduje mieszaną neuropatię czuciowo-ruchową, ale czysto czuciowe i czysto ruchowe neuropatię są również znane.

Termin „czynnik toksyczny, używany w kontekście niniejszego wynalazku ma oznaczać substancję, która poprzez swoje działanie chemiczne uszkadza, osłabia lub hamuje aktywność składnika układu nerwowego. Długa lista czynników toksycznych (określanych również jako „czynniki neurotoksyczne) obejmuje, bez ograniczania, czynniki chemoterapeutyczne, takie jak te wymienione powyżej, alkohol, metale, toksyny przemysłowe, zanieczyszczenia żywności i lekarstw itd.

„Ssak dla celów leczenia odnosi się do jakiegokolwiek zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając w to ludzi, zwierzęta domowe i gospodarskie oraz zwierzęta z ogrodów zoologicznych, zwierzęta sportowe i zwierzęta-pupile, takie jak psy, konie, owce, koty, krowy, itd. Korzystnie, jeżeli ssakiem jest człowiek.

Termin „immunoadhezyna trkC jest stosowany wymiennie z wyrażeniem „chimera trkC-immunoglobulina i dotyczy chimerowej cząsteczki, która łączy w sobie część trkC (generalnie jego domenę zewnątrzkomórkową) z sekwencją immunoglobuliny. Korzystne jest, ale niekonieczne, jeżeli sekwencją immunoglobuliny jest domena stała immunoglobuliny. Chimery składające się z sekwencji receptora połączonej z odpowiednią sekwencją domeny stałej immunoglobuliny (immunoadhezyny) są znane w tej dziedzinie. Immunoadhezyny opisane w literaturze obejmują fuzje receptora komórek T cell* (Gascoigne i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2936-2940 [1987]); CD4* (Capon i wsp.. Nature 337: 525-531 [1989]; Traunecker i wsp.. Nature, 339: 68-70 [1989]; Zettmeissl i wsp., DNA Cell. Biol. 9: 347-353 [1990]; Byrn i wsp., Nature, 344: 667-670 [1990]); L-selektynę (receptor zasiedlania) (Watson i wsp. J. Cell. Biol., 110: 2221-2229 [1990]; Watson i wsp.. Nature, 349: 164-167 [1991]); CD44* (Aruffo i wsp.. Cell, 61: 1303-1313 [1990]); CD28* i B7* (Linsley i wsp., J. Exp. Med, 173: 721-730 [1991]); CTLA-4* (Lisley i wsp., J. Exp. Med. 174: 561-569 [1991]); CD22* (Stamenkovic i wsp., Cell, 66: 1133-11144 [1991]); receptor TNF (Ashkenazi i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539 [1991]; Lesslauer i wsp., Eur. J. Immunol., 27: 2883-2886 [1991]; Peppel i wsp., J. Exp. Med., 174: 1483-1489 [1991]); receptory NP (Bennett i wsp., J. Biol. Chem., 266: 23060-23067 [1991]) oraz receptor IgE α* (Ridgway i wsp., J. Cell. Biol., 115: streszcz. 1448 [1991]), gdzie gwiazdka (*) wskazuje, że receptor jest członkiem nadrodziny immunoglobulin.

„Wyizolowany kwas nukleinowy albo polipeptyd w kontekście niniejszego wynalazku to kwas nukleinowy albo polipeptyd zidentyfikowane i oddzielone kwasów nukleinowych albo polipeptydów obecnych w zwierzęcym albo ludzkim źródle kwasu nukleinowego albo polipeptydu. Kwas nukleinowy albo polipeptyd mogą być wyznakowane dla celów diagnostycznych albo jako sondy przy zastosowaniu znacznika, jak opisano i zdefiniowano dalej poniżej w dyskusji testów diagnostycznych.

Generalnie, termin „wariant sekwencji aminokwasowej dotyczy cząsteczek z pewnymi różnicami w ich sekwencjach aminokwasowych w porównaniu do polipeptydu stanowiącego odniesienie (np. sekwencji natywnej). Zmianami sekwencji aminokwasowej mogą być podstawienia, insercje, delecje lub dowolna kombinacja takich zmian w natywnej sekwencji aminokwasowej.

Terminy „kodująca sekwencja DNA, „DNA kodujący i „kwas nukleinowy kodujący dotyczą porządku albo sekwencji deoksyrybonukleotydów wzdłuż nici kwasu deoksyrybonukleinowego. Porządek tych deoksyrybonukleotydów determinuje porządek aminokwasów wzdłuż łańcucha polipeptydowego. Sekwencja DNA koduje zatem sekwencję aminokwasową.

PL 208 113 B1

Terminy „podlegający replikacji wektor ekspresyjny i „wektor ekspresyjny dotyczą kawałka DNA, zwykle dwuniciowego, do którego może być wstawiony kawałek obcego DNA. Obcy DNA jest zdefiniowany jako DNA heterologiczny, którym jest DNA nie znajdywany naturalnie w komórce gospodarza. Wektor jest używany do transportowania obcego albo heterologicznego DNA do odpowiedniej komórki gospodarza. Po znalezieniu się w komórce gospodarza, wektor może replikować się niezależnie od chromosomowego DNA gospodarza i może zostać wytworzonych kilka kopii wektora i wstawionego do niego (obcego) DNA. Dodatkowo, wektor zawiera niezbędne elementy, które umożliwiają translację obcego DNA do polipeptydu. Może być zatem szybko syntetyzowanych wiele cząsteczek polipeptydu zakodowanego przez obcy DNA.

Termin „sekwencje kontrolne dotyczą sekwencji DNA niezbędnych do ekspresji połączonych z nimi funkcjonalnie sekwencji kodują cych w danym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne, które są odpowiednie na przykład dla organizmów prokariotycznych, obejmują promotor, ewentualnie sekwencję operatorową, miejsce wiązania rybosomu i możliwe że inne, słabo dotychczas poznane sekwencje. Wiadomo, że komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, sygnały poliadenylacji i wzmacniacz.

Kwas nukleinowy jest „połączony funkcjonalnie kiedy jest umieszczony w związku funkcjonalnym z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla prosekwencji albo lidera sekrecyjnego jest połączony funkcjonalnie z DNA dla polipeptydu, jeżeli jest wyrażany jako prebiałko, które uczestniczy w sekrecji polipeptydu; promotor albo wzmacniacz jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeżeli wpływa na transkrypcję sekwencji; albo miejsce wiązania rybosomu jest połączone funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeżeli jest umieszczone tak, aby ułatwiać translację.

Generalnie, „połączony funkcjonalnie oznacza, że połączone sekwencje DNA są ciągłe, a w przypadku sekwencji lidera sekrecyjnego ciąg ł e i w fazie odczytu. Natomiast wzmacniacze nie muszą być ciągłe. Połączenie uzyskuje się poprzez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca nie istnieją, stosowane są syntetyczne oligonukleotydy-adaptory albo łączniki, zgodnie z konwencjonalną praktyką.

W kontekście niniejszego wynalazku wyraż enia „komórka, „linia komórkowa i „hodowla komórkowa są stosowane wymiennie i wszystkie te określenia obejmują potomstwo. A zatem słowa „transformanty i „transformowane komórki (gospodarza) obejmują pierwotną komórkę obiektu i hodowle z niej pochodzące niezależnie od liczby transferów. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo nie musi być całkowicie identyczne pod względem zawartości DNA na skutek przemyślanych albo przypadkowych mutacji. Zmutowane potomstwo, które ma taką samą funkcję albo aktywność biologiczną jak poszukiwana przy wyjściowo stransformowanych komórkach, jest również tu włączone. Tam gdzie zamierzone są inne cele, będzie to jasne z kontekstu.

Element „egzogenny jest tu zdefiniowany jako oznaczający sekwencję kwasu nukleinowego, która jest obca dla komórki albo homologiczna dla komórki, ale w pozycji w kwasie nukleinowym komórki gospodarza, w której element nie jest normalnie znajdywany.

„Przeciwciała (Ab) i „immunoglobuliny (Ig) to glikoproteiny mające takie same właściwości strukturalne. Podczas gdy przeciwciała wykazują swoistość wiązania wobec konkretnego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała, jak i inne cząsteczki przeciwciało-podobne, którym brak swoistości antygenu. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju są na przykład wytwarzane na niskich poziomach przez układ limfatyczny i na zwiększonych poziomach przez chłoniaki.

„Przeciwciała natywne i „immunoglobuliny natywne są zwykle heterotetramerowymi glikoproteinami o wielkości około 150000 daltonów, składające się z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łań cuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem dwusiarczkowym, natomiast liczba wiązań dwusiarczkowych pomiędzy łańcuchami ciężkimi jest różna w różnych izotypach immunoglobulin. Każdy łańcuch ciężki lekki ma również regularnie rozmieszczone wewnątrzłańcuchowe mostki dwusiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki ma na jednym końcu domenę zmienną (VH), po której następuje kilka domen stałych. Każdy łańcuch lekki ma na jednym końcu domenę zmienną (VL), a na drugim końcu domenę stałą; domena stała łańcucha lekkiego pasuje do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, a domena zmienna łańcucha lekkiego pasuje do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że poszczególne reszty aminokwasowe tworzą połączenie pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.

Termin „zmienny dotyczy faktu, że niektóre części domen zmiennych przeciwciał wykazują bardzo duże różnice w sekwencji pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane w wiązaniu i specyPL 208 113 B1 ficzności poszczególnych przeciwciał wobec konkretnego antygenu. Jednakże zmienność nie jest równomiernie rozmieszczona na przestrzeni domen zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech odcinakach zwanych regionami hiperzmiennymi w domenach zmiennych zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego. Najbardziej zakonserwowane części domen zmiennych są nazywane regionem zrębowym (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów lekkich i ciężkich zawiera cztery FR (FR1, FR2, FR3 i FR4, odpowiednio) przyjmujące w większości konfigurację beta-kartki, połączone przez trzy regiony hiperzmienne, które tworzą pętle łączące, a w niektórych przypadkach tworzą część struktury beta-kartki. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane razem w bliskości przez FR i wraz z regionami hiperzmiennymi z innego łańcucha uczestniczą w tworzeniu się miejsca wiążącego antygen przeciwciała (patrz Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) strony 647-669). Domeny stałe nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu się przeciwciała z antygenem, ale pełnią funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała.

Stosowany tu termin „region hiperzmienny odnosi się do reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny generalnie obejmuje reszty aminokwasowe z „regionu determinującego dopasowanie, ang. complementarity determining region albo „CDR (np. reszty 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) i/lub reszty z „pętli hiperzmiennej (np. reszty 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego oraz 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Resztami „zrębowymi lub „FR są reszty domeny zmiennej inne niż zdefiniowane tu reszty regionu hiperzmiennego.

Trawienie przeciwciał papainą prowadzi do powstania dwóch identycznych fragmentów wiążących antygen, zwanych fragmentami „Fab, każdy z pojedynczym miejscem wiązania antygenu i pozostały fragment „Fc, którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwiej krystalizacji. Traktowanie pepsyną daje fragment F(ab')2, który ma dwa miejsca połączenia z antygenem i jest nadal zdolny do łączenia się krzyżowego z antygenem.

„Fv to minimalny fragment przeciwciała, który zawiera kompletne miejsce rozpoznania i wiązania antygenu. Region ten składa się z dimeru domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha ciężkiego w ścisłym, niekowalencyjnym związku. W tej konfiguracji trzy regiony hiperzmienne każdej domeny zmiennej oddziałują definiując miejsce wiązania na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie sześć regionów hiperzmiennych nadaje przeciwciału swoistość wiązania antygenu. Jednakże, nawet pojedyncza domena zmienna (połowa Fv zawierająca jedynie trzy regiony hiperzmienne swoiste dla antygenu) ma zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, jakkolwiek z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiązania.

Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt na końcu karboksylowym domeny CH1 łańcucha ciężkiego, włączając w to jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest tu określeniem dla Fab', w którym reszta(y) cysteinowe regionów stałych zawierają wolną grupę tiolową. Wyjściowo wytworzono fragmenty przeciwciała F(ab')2 jako parę fragmentów Fab', które mają pomiędzy sobą zawiasowe cysteiny. Inne połączenia chemiczne fragmentów przeciwciał są również znane.

„Łańcuchy lekkie przeciwciał (immunoglobulin) z dowolnego gatunku kręgowca można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, zwanych kappa () i lambda (), w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych.

W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można zaliczyć do różnych klas. Istnieje pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na „podklasy (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom przeciwciał są nazywane, , , , i , odpowiednio. Struktury podjednostek i trójwymiarowa konfiguracja różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.

Termin „przeciwciało jest tu stosowany w najszerszym znaczeniu i obejmuje ludzkie, inne niż ludzkie (na przykład mysie) i humanizowane przeciwciała monoklonalne (włączając w to przeciwciała

PL 208 113 B1 monoklonalne pełnej długości), przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne) i fragmenty przeciwciał o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną.

„Fragmenty przeciwciał obejmują część przeciwciała pełnej długości, generalnie miejsce wiązania antygenu lub jego domenę zmienną. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2, i Fv, diciała, przeciwciała liniowe, cząsteczki przeciwciał jednołańcuchowych i przeciwciała multispecyficzne wytworzone z fragmentów przeciwciała.

Stosowany tu termin „przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała zawarte w populacji są identyczne z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkiej liczbie. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, będąc skierowanymi wobec pojedynczego miejsca antygenowego. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie antygenu. Określenie „monoklonalny nie ma być traktowane jako wymaganie odnośnie wytwarzania przeciwciała jakąś konkretną metodą. Przykładowo, monoklonalne przeciwciała do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być wytwarzane metodą hybrydom po raz pierwszy opisaną przez Kohler i wsp.. Nature, 256:495 (1975) albo wytwarzane metodami rekombinowania DNA (patrz np. patent USA nr 4816567). „Przeciwciała monoklonalne można również izolować z fagowych bibliotek przeciwciałowych przy zastosowaniu technik opisanych na przykład w Clackson i wsp.. Nature, 352:624-62 8(1991) oraz Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Stosowane tu przeciwciała monoklonalne obejmują w szczególności przeciwciała (immunoglobuliny) „chimerowe, w których część łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego jest identyczna albo homologiczna z odpowiadającymi im sekwencjami przeciwciał pochodzących z określonych gatunków albo należących do określonej klasy przeciwciał, podczas gdy reszta łańcucha(ów) jest identyczna albo homologiczna z odpowiednimi sekwencjami przeciwciał pochodzących z innego gatunku albo należących do określonej klasy albo podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał tak długo, jak wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (patent USA nr 4816567 oraz Morrison i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

„Humanizowane postaci przeciwciał nie-ludzkich (np. mysich) to chimerowe przeciwciała, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny nie-ludzkiej. W większości przypadków, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało-biorca), w którym reszty z regionu hiperzmiennego biorcy są zastąpione resztami hiperzmiennego regionu przeciwciała z gatunku innego niż człowiek (przeciwciało donorowe), takiego jak mysz, szczur, królik albo naczelny nie-człowiek, mającego pożądaną specyficzność, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione przez odpowiadające im reszty nie-ludzkie. Ponadto humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie są znajdywane w przeciwciele biorcy ani w przeciwciele donorowym. Tych modyfikacji dokonuje się w celu dalszej zmiany właściwości przeciwciała. Generalnie, humanizowane przeciwciała będą zawierały zasadniczo wszystkie spośród co najmniej jednej, a typowo dwóch domen zmiennych, w których wszystkie albo zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne odpowiadają tym z immunoglobulin nie-ludzkich i wszystkie albo zasadniczo wszystkie FR są z sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciała będą ewentualnie zawierały co najmniej cześć regionu stałego immunoglobuliny (Fc), typowo z immunoglobuliny ludzkiej. Dla dalszych szczegółów patrz Jones i wsp.. Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann i wsp.. Nature 332:323-329 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992).

Fragmenty „jednołańcuchowe Fv lub „sFv przeciwciała zawierają domeny VH i VL przeciwciała, gdzie domeny te są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Generalnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL, który umożliwia sFv utworzenie pożądanej struktury dla wiązania antygenu. Praca przeglądowa na temat sFv, patrz Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom. 113, Rosenburg i Moore wyd. Springer Verlag, New York, str. 269-315 (1994).

Termin „diciała dotyczy małych fragmentów przeciwciała z dwoma miejscami wiązania antygenu, gdzie fragmenty te zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (VL) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (VH-VL). Poprzez użycie łącznika, który jest zbyt krótki dla umożliwienia tworzenia się par pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, forsuje się tworzenie pary pomiędzy komplementarnymi domenami innego łańcucha

PL 208 113 B1 i tworzenie się dwóch miejsc wiązania antygenu. Diciała są pełniej opisane na przykład w EP 404097; WO 93/11161 i Hollinger i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Stosowane w tym opisie wyrażenie „przeciwciała liniowe dotyczy przeciwciał opisanych w Zapata i wsp.. Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995). Pokrótce, przeciwciała te zawierają parę tandemowych odcinków Fd (VH-CH1-VH-CH-1), które tworzą parę regionów wiążących antygen. Przeciwciała liniowe mogą być bispecificzne albo monospecyficzne.

Termin „epitop jest stosowany w odniesieniu do miejsc wiązania dla przeciwciał (poliklonalnych lub monoklonalnych) na białkowych antygenach.

Przeciwciała, które wiążą się z domeną 5 i/lub 4 w obrębie sekwencji aminokwasowej natywnej sekwencji ludzkiego trkC albo równoważnego epitopu w natywnej sekwencji receptora trkC innego niż ludzki identyfikuje się poprzez „mapowanie epitopów. Istnieje wiele sposobów znanych w tej dziedzinie do mapowania i charakteryzowania położenia epitopów na białku, włączając w to ustalenie struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało, testy współzawodnictwa, testy ekspresji fragmentów genów oraz testy w oparciu o syntetyczne peptydy, jak opisano na przykład w Rozdziale 11 z Harlow i Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Test współzawodnictwa ELISA jest szczegółowo opisany w Przykładzie 1. Według testów ekspresji fragmentów genu, otwarta ramka odczytu kodująca białko jest fragmentowana losowo albo przy użyciu specyficznych konstruktów i określana jest reaktywność wyrażanych fragmentów białka z przeciwciałem, które ma być testowane. Fragmenty genu mogą być na przykład wywarzane poprzez PCR, a następnie ulegać transkrypcji i translacji do białka in vitro, w obecności radioaktywnych aminokwasów. Wiązanie przeciwciała z wyznakowanymi radioaktywnie fragmentami określa się następnie poprzez immunoprecypitację i elektroforezę w żelu. Niektóre epitopy można również zidentyfikować przy zastosowaniu bibliotek fagowych losowych sekwencji peptydowych prezentowanych na powierzchni cząstek fagowych (biblioteki fagowe). Alternatywnie, określoną bibliotekę zachodzących na siebie fragmentów peptydowych można testować pod kątem wiązania przeciwciała w prostych testach wiązania. To ostatnie podejście jest przydatne do definiowania liniowych epitopów o zł o ż onych z okoł o 5 do 15 aminokwasów.

Przeciwciało wiąże się z „zasadniczo takim samym epitopem jak przeciwciało odnośnikowe kiedy dwa przeciwciała rozpoznają identyczne albo przestrzennie pasujące epitopy. Najpowszechniej stosowanymi i szybkimi sposobami określania, czy dwa epitopy wiążą się z identycznymi albo przestrzennie pasującymi epitopami są testy współzawodnictwa, które można zaprojektować w różny sposób, z zastosowaniem wyznakowanego antygenu albo wyznakowanego przeciwciała. Zazwyczaj antygen jest unieruchamiany na 96-studzienkiwej płytce, a zdolność niewyznakowanych przeciwciał do blokowania wiązania wyznakowanych przeciwciał mierzy się przy zastosowaniu znaczników radioaktywnych albo enzymatycznych. Test współzawodnictwa ELISA jest szczegółowo ujawniony w Przykładzie 1.

Stosowany tu termin aminokwas albo reszta aminokwasowa dotyczy występujących naturalnie aminokwasów L albo aminokwasów D jak opisano poniżej w odniesieniu do wariantów. Stosowane są tu powszechnie używane jedno- i trzyliterowe skróty dla aminokwasów (Bruce Alberts i wsp., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (wyd. 3 1994)).

Korzystne jest, jeżeli hybrydyzację przeprowadza się w „ostrych warunkach, co oznacza (1) zastosowanie niskiej siły jonowej i wysokiej temperatury do płukania, na przykład 0,015 chlorku sodowego/0,0015 M cytrynianu sodowego/0,1% sodowego siarczanu dodecylu w 50°C albo (2) zastosowanie w czasie hybrydyzacji czynnika denaturującego, takiego jak na przykład formamid, na przykład 50% (obj./obj.) formamid z 0,1% bydlęcą albuminą surowiczą 0,1% Ficoll/0,1% poliwinylopirolidon/50 mM sodowy bufor fosforanowy pH 6,5 z 750 mM chlorkiem sodowym, 75 mM cytrynianem sodowym w 42°C. Innym przykł adem jest uż ycie 50% formamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynian sodowy), 50 mM fosforan sodowy (pH 6/8), 0,1% pirofosforan sodowy, 5 x roztwór Denhardta, sonikowany DNA ze spermy łososia (50 g/ml), 0,1% SDS i 10% siarczan dekstranu w 42°C, z płukaniem w 42°C w 0,2 x SSC i 0,1% SDS.

B. Sposoby przeprowadzania wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy agonistycznych ludzkich i innych niż ludzkie przeciwciał monoklonalnych (włączając w to humanizowane postaci tych ostatnich), które naśladują pewne aktywności biologiczne NT-3, naturalnego liganda receptora trkC. Ogólne techniki wytwarzania mysich i ludzkich przeciwciał anty-trkC są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane poniżej. Dalsze szczegóły, włączając w to selekcję przeciwciał agonistycznych są przedstawione w Przykładzie 1.

PL 208 113 B1

1. Wytwarzanie przeciwciał (i) Przeciwciała poliklonalne

Sposoby wytwarzania przeciwciał poliklonalnych są dobrze znane w tej dziedzinie. Przeciwciała poliklonalne można wzbudzić u ssaka na przykład poprzez jedno lub większą liczbę wstrzyknięć czynnika immunizującego i, jeśli to pożądane, adiuwanta. Typowo, czynnik immunizujący i/lub adiuwant będą wstrzyknięte ssakowi poprzez wielokrotne podskórne albo dootrzewnowe zastrzyki. Może być przydatne sprzężenie czynnika immunizującego z białkiem, o którym wiadomo, że jest immunogenne u ssaka, który jest immunizowany, takim jak albumina z surowicy albo inhibitorem trypsyny z ziaren soi. Przykłady adiuwantów, które można zastosować obejmują kompletny adiuwant Freunda i MPL-TDM.

(ii) Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć stosując metodę hybrydom opisaną po raz pierwszy przez Kohler i wsp.. Nature, 256:495 (1975) albo można wytwarzać metodami rekombinowania DNA (patent USA nr 4816567).

W metodzie hybrydomy, mysz albo inne odpowiednie zwierzę bę d ą ce gospodarzem, takie jak chomik albo małpę makak, immunizuje się jak opisano powyżej w celu wzbudzenia limfocytów, które wytwarzają albo są zdolne do wytwarzania przeciwciał wiążących się specyficznie z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Limfocyty poddaje się następnie fuzji z komórkami szpiczaka stosując odpowiedni czynnik powodujący fuzję, taki jak glikol polietylenowy, w celu wytworzenia komórek hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986).

Otrzymane w ten sposób komórki hybrydomy wysiewa się i hoduje na odpowiedniej pożywce hodowlanej, która korzystnie zawiera jedną albo większą liczbę substancji, które hamują wzrost i przeżycie nie poddanych fuzji rodzicielskich komórek szpiczaka. Przykładowo, jeśli w rodzicielskim szpiczaku brak jest enzymu fosforybozylotransferazy hipokantyno-guaninowej (HGPRT lub HPRT), pożywka hodowlana dla hybrydom zwykle zawiera hipoksantynę, aminopterynę oraz tymidynę (pożywka HAT), w których to warunkach zapobiega się wzrostowi komórek z brakiem HGPRT.

Korzystnymi komórkami szpiczaka są takie, które podlegają fuzji wydajnie, utrzymują stabilny poziom wytwarzania przeciwciała przez wybrane komórki wytwarzające przeciwciało i są wrażliwe na pożywkę, taką jak HAT. Wśród nich, korzystnymi liniami komórkowymi szpiczaka są linie mysiego szpiczaka, takie jak te pochodzące z mysich nowotworów MOP-21 i M.C.-11 dostępne z Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA oraz komórki SP-2 lub X63-Ag8-653 dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Zostały również opisane komórki ludzkiego szpiczaka i linie komórkowe mysio-ludzkiego heretoszpiczaka do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) oraz Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Pożywki hodowlane, w których hoduje się komórki, testuje się pod kątem wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych wobec antygenu. Korzystne jest, jeżeli specyficzność wiązania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki hybrydomy określa się poprzez immunoprecypitację albo test wiązania in vitro, taki jak test radioimmunologiczny (RIA) albo enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).

Powinowactwo wiązania przeciwciał monoklonalnych można następnie określić poprzez analizę Scatchard według Munson i wsp., Anal. Biochem, 107:220 (1980).

Po zidentyfikowaniu komórek hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klon można subklonować poprzez procedurę ograniczających rozcieńczeń i hodować według standardowych metod (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986). Odpowiednie pożywki hodowlane do tych celów obejmują na przykład pożywkę, D-MEM lub pożywkę RPMI-1640. Ponadto komórki hybrydomy można hodować in vivo w nowotworach puchlinowych u zwierząt.

Monoklonalne przeciwciała wydzielane przez subklony dogodnie jest wydzielać z pożywki hodowlanej, płynów puchlinowych albo surowicy poprzez konwencjonalne procedury oczyszczania przeciwciał, takie jak na przykład chromatografia na białku A-sefarozie, hydroksyloapatycie, elektroforeza w ż elu, dializa albo chromatografia powinowactwa.

DNA kodujący monoklonalne przeciwciała można łatwo wyizolować i zsekwencjonować stosując konwencjonalne procedury (np. poprzez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które mają zdolność wiązania się specyficznie z genami kodującymi lekkie i ciężkie łańcuchy mysich przeciwciał). Komórki hybrydomy służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA

PL 208 113 B1 można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które transfekuje się następnie do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese Hamster Ovary, CHO) lub komórki szpiczaka, które w innym przypadku nie wytwarzają przeciwciała, w celu otrzymania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. DNA można również modyfikować, na przykład poprzez podstawienie sekwencji kodującej domen stałych ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (patent USA nr 4816567 oraz Morrison i wsp.. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) albo poprzez połączenie kowalencyjne sekwencji kodujących immunoglobulinę, całych albo części, z sekwencją kodującą polipeptydu innego niż immunoglobulina. W ten sposób wytwarzane są przeciwciała „chimerowe albo „hybrydowe, które mają specyficzność wiązania opisanych tu przeciwciał monoklonalnych anty-trk.

Typowo, takim polipeptydem innym niż immunoglobulina zastępuje się domeny regionu stałego przeciwciała, albo zastępuje się zmienne miejsca wiązania antygenu w celu wytworzenia chimerowego dwuwartościowego przeciwciała zawierającego jedno miejsce wiązania antygenu mające specyficzność wobec antygenu i inne miejsce wiążące antygen mające specyficzność wobec odmiennego antygenu.

Chimerowe lub hybrydowe przeciwciała można również wytworzyć in vitro stosując znane metody chemiczne dla syntetycznych białek, włączając w to te z udziałem czynników łączących krzyżowo. Przykładowo, immunotoksyny można skonstruować przy zastosowaniu reakcji wymiany dwusiarczkowej albo poprzez tworzenie wiązania tioeterowego. Przykłady odpowiednich odczynników do tego celu obejmują iminotiolan i metylo-4-merkaptobutyrymidan.

Wytwarzanie przeciwciał poprzez rekombinowanie będzie opisane bardziej szczegółowo poniżej.

(iii) Przeciwciała humanizowane

Generalnie, humanizowane przeciwciało ma wprowadzoną jedną albo większą liczbę reszt aminokwasowych ze źródła innego niż człowiek. Te nie-ludzkie reszty są często określane jako reszty „zaimportowane, które są typowo wzięte z „zaimportowanej domeny zmiennej. Humanizację można zasadniczo przeprowadzić według metody Winter i współpracowników (Jones i wsp.. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann i wsp.. Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i wsp.. Science, 239:1534-1536 (1988), poprzez zastąpienie sekwencji jednego lub więcej CDR gryzoni odpowiadającymi im sekwencjami przeciwciała ludzkiego.

A zatem takimi przeciwciałami „humanizowanymi są przeciwciała chimerowe (Cabilly, jak wyżej), gdzie zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka domena zmienna została zastąpiona odpowiednią sekwencją z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, przeciwciałami humanizowanymi są typowo przeciwciała ludzkie, w których niektóre reszty z regionu hiperzmiennego i możliwe że niektóre reszty FR są zastąpione resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.

Ważne jest, żeby przeciwciała były humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa do antygenu i innych korzystnych właściwości biologicznych. Aby osiągnąć ten cel, według korzystnych metod, humanizowane przeciwciała wytwarza się poprzez przeprowadzenie analizy sekwencji rodzicielskich i różnych teoretycznych produktów humanizowanych przy użyciu trójwymiarowych modeli sekwencji rodzicielskich i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i pokazują możliwe trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych kandydatów dla sekwencji immunoglobulin. Badanie tych obrazów umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu sekwencji immunoglobuliny-kandydata, tj. analizę reszt, które wpływają na zdolność immunoglobuliny-kandydata do wiązania się ze swoim antygen. W ten sposób można wybrać reszty FR i połączyć sekwencje biorcy i zaimportowane, uzyskując pożądane właściwości przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo do docelowych antygenu(ów). Generalnie, reszty CDR mają bezpośredni i najbardziej znaczący wpływ na wiązanie antygenu. Dla dalszych szczegółów patrz zgłoszenie USA nr seryjny 07/934373 złożone 21 sierpnia 1992, które stanowi częściową kontynuację zgłoszenia nr seryjny 07/715272 złożonego 14 czerwca 1991.

(iv) Przeciwciała ludzkie

Ludzkie monoklonalne przeciwciała można wytwarzać metodą hybrydom. Linie komórkowe ludzkiego szpiczaka i mysio-ludzkiego heteroszpiczaka do wytwarzania zostały opisane na przykład przez Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984) i Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) .

PL 208 113 B1

Możliwe jest obecnie wytwarzanie transgenicznych zwierząt (np. myszy), które po immunizacji są zdolne do wytwarzania pełnego repertuaru ludzkich przeciwciał w nieobecności wytwarzania endogennych immunoglobulin. Przykładowo, opisano, że homozygotyczna delecja regionu łącznikowego łańcucha ciężkiego (JH) przeciwciała w mutancie chimerowym i w linii płciowej myszy prowadzi do całkowitego zahamowania wytwarzania endogennych przeciwciał. Przeniesienie ludzkiego układu genów z ludzkiej linii płciowej do takiego mutanta w linii płciowej myszy będzie prowadziła do wytwarzania ludzkich przeciwciał po prowokacji antygenem. Patrz np. Jakobovits i wsp.. Proc. Natl Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i wsp.. Nature, 362:255-258 (1993).

Mendez i wsp. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) dalej ulepszyli technologię i wytworzyli linię transgenicznych myszy nazwaną „Xenomouse II, która po prowokacji antygenem wytwarzała całkowicie ludzkie przeciwciała o wysokim powinowactwie. Uzyskano to poprzez wstawienie ludzkich loci dla łańcuchów ciężkich i lekkich, wielkości miliona par zasad do myszy z delecją w obrębie endogennego segmentu JH jak opisano powyżej. Mysz Xenomouse II niesie locus ludzkiego łańcucha ciężkiego długości 1020 kb zawierający około 66 genów VH, pełne regiony DH i regiony

JH oraz trzy różne regiony stałe (μ, δ i χ), a także niesie 800 kb ludzkiego locus κ zawierającego geny Vk, segmenty Jk i geny Ck. Przeciwciała wytworzone w tych myszach przypominają ściśle te obserwowane u człowieka pod każdym względem, włączając w to rearanżację genu, składanie i repertuar. Korzystne jest, jeżeli ludzkie przeciwciała są wyrażane na poziomie wyższym niż przeciwciała endogenne na skutek delecji endogennego segmentu JH, która zapobiega rearanżacji genu w locus mysim.

Alternatywnie można zastosować technologię prezentacji na fagach (McCafferty i wsp.. Nature 348:552-553 (1990)) do wytwarzania ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro z repertuaru genów dla domen zmiennych (V) immunoglobulin z nie immunizowanych dawców. Według tej techniki, geny dla domeny V przeciwciała klonuje się w ramce w genie bądź większego bądź mniejszego białka płaszcza nitkowatego bakteriofaga, takiego jak M 13 lub fd, i prezentuje jako funkcjonalne fragmenty przeciwciał na powierzchni cząstki fagowej. Ponieważ nitkowata cząstka zawiera jednoniciową kopię DNA genomu fagowego, selekcja oparta o funkcjonalne własności przeciwciała prowadzi również do wyboru genu kodującego przeciwciało wykazujące te właściwości. A zatem fag imituje niektóre właściwości komórek B. Prezentację na fagu można przeprowadzać na różne sposoby, dla dokonania ich przeglądu patrz np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Do prezentacji na fagach można użyć kilka źródeł segmentów genu V. Clackson i wsp.. Nature, 352:624-628 (1991) wyizolowali różne zestawy przeciwciał anty-oksazolon z małej losowej biblioteki kombinatorycznej genów V pochodzących ze śledzion immunizowanych myszy. Można skonstruować repertuar genów V z nie immunizowanych ludzkich dawców i przeciwciała wobec różnego zestawu antygenów (włączając w to antygeny własne) można wyizolować zasadniczo według technik opisanych przez Marks i wsp., J. Mol Biol 222:5B1-597 (1991) lub Griffith i wsp., EMBO J. 12:725-734 (1993). W naturalnej odpowiedzi immunologicznej geny dla przeciwciał akumulują w szybkim tempie mutacje (hipermutacja somatyczna). Niektóre z wprowadzonych zmian będą nadawać wyższe powinowactwo, a komórki B prezentujące powierzchniowe immunoglobuliny o wysokim powinowactwie preferencyjnie replikują się i różnicują w czasie kolejnej prowokacji antygenem. Ten naturalny proces można naśladować poprzez zastosowanie techniki znanej jako „tasowanie łańcuchów (Marks i wsp., Bio. Technol. 10, 779-783 [1992]). W metodzie tej powinowactwo „pierwotnych ludzkich przeciwciał otrzymanych poprzez prezentację na fagu można zwiększyć poprzez kolejne zastępowanie genów dla regionu V łańcucha ciężkiego i lekkiego repertuarem występujących naturalnie wariantów (repertuarem) genów dla domeny V otrzymanych od nieimmunizowanych dawców. Technika ta umożliwia wytwarzanie przeciwciał i fragmentów przeciwciał z powinowactwami w zakresie nM. Strategia wytwarzania bardzo dużych repertuarów przeciwciał na fagach (znanych również jako „matka wszystkich bibliotek została opisana przez Waterhouse i wsp.. Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993), a izolacja ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie bezpośrednio z takiej dużej biblioteki fagowej jest opisana przez Griffith i wsp., EMBO J. (1994), w druku. Tasowanie genów zastosowano również do uzyskania ludzkich przeciwciał z przeciwciał gryzoni, gdzie ludzkie przeciwciało ma podobne powinowactwa i specyficzności co wyjściowe przeciwciało gryzonia. Według tej metody, która jest również nazywana „piętnowaniem epitopowym geny dla domeny V łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciał gryzonia otrzymane techniką prezentacji na fagu zastępuje się repertuarem ludzkich genów dla domeny V, tworząc chimery

PL 208 113 B1 gryzonio-ludzkie. Selekcja antygenu prowadzi do izolacji ludzkiej domeny zmiennej zdolnej do odtworzenia funkcjonalnego miejsca wiązania antygenu, tj. epitop kieruje wyborem partnera (pozostawia piętno). Kiedy proces jest powtarzany w celu zastąpienia pozostałej domeny V gryzonia, otrzymuje się przeciwciało ludzkie (patrz zgłoszenie patentowe PCT WO 93/06213, opublikowane 1 kwietnia 1993). W odróż nieniu od tradycyjnego humanizowania przeciwciał gryzoni przez przeszczepienie CDR, technika ta dostarcza całkowicie ludzkich przeciwciał, które nie mają reszt zrębowych ani CDR pochodzących z gryzoni.

(v) Przeciwciała bispecyficzne

Przeciwciałami bispecyficznymi są przeciwciała monoklonalne, korzystnie ludzkie albo humanizowane, które wykazują specyficzność wiązania wobec co najmniej dwóch różnych antygenów. W niniejszym przypadku jedna specyficzność wią zania jest wobec receptora trkC dla dostarczenia przeciwciała agonistycznego, a druga jest dla dowolnego innego antygenu, a korzystnie innego receptora albo podjednostki receptora. Przykładowo, przeciwciała bispecyficzne wiążące się swoiście z receptorem trkC i neutrofiną albo receptorem trkC i innym receptorem trk są w zakresie niniejszego wynalazku.

Sposoby wytwarzania przeciwciał bispecyficznych są znane w tej dziedzinie. Tradycyjne wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał pełnej długości opiera się na jednoczesnej ekspresji dwóch lekkich i ciężkich ła ń cuchów immunoglobuliny, gdzie te dwa ł a ńcuchy mają różne specyficznoś ci (Millstein i wsp.. Nature, 305:537-539 (1983)). Dzięki losowemu doborowi łańcuchów lekkich i ciężkich, hybrydomy te (kwadromy) wytwarzają potencjalnie mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma prawidłową strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie prawidłowej cząsteczki, które zwykle wykonuje się poprzez etapy oczyszczania przez powinowactwo jest raczej kłopotliwe, a wydajność produktów niska. Podobne procedury są ujawnione w WO 93/08829 (opublikowanym 13 maja 1993) i w Traunecker i wsp., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

W innym i bardziej korzystnym podejś ciu domeny zmienne przeciwciała z pożądanymi specyficznościami wiązania (miejsca połączenia przeciwciało-antygen) łączy się z sekwencjami domen stałych immunoglobuliny. Korzystne jest, jeżeli fuzja jest z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierającą co najmniej część regionów: zawiasowego, CH2 i CH3. Korzystne jest posiadanie pierwszego regionu stałego łańcucha ciężkiego (CH1) zawierającego miejsce niezbędne do wiązania łańcucha lekkiego, obecnego w co najmniej jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i jeżeli to pożądane, łańcuch lekki immunoglobuliny, wstawia się do odrębnych wektorów ekspresyjnych i przeprowadza kotransfekcję do odpowiedniego organizmu gospodarza. To daje dużą elastyczność w dobieraniu wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w wykonaniach, tam gdzie stosowanie nierównych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych przy konstrukcji dostarcza optymalnych wydajności. Możliwe jest jednakże wstawienie sekwencji kodujących dla dwóch albo wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, kiedy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach prowadzi do wysokich wydajności lub kiedy stosunki nie mają szczególnego znaczenia. W korzystnym wykonaniu tego podejścia przeciwciała bispecyficzne składają się z hybrydowego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny z pierwszą specyficznością wiązania w jednym ramieniu i hybrydowej pary łańcuchów lekkich immunoglobuliny (dostarczającego drugiej specyficzności wiązania) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta niesymetryczna struktura ułatwia rozdzielenie pożądanych bispecyficznych składników od niepożądanej kombinacji łańcuchów immunoglobulinowych, ponieważ obecność łańcucha lekkiego immunoglobuliny tylko w jedynej połowie bispecyficznej cząsteczki dostarcza łatwego sposobu rozdziału. Podejście to jest ujawnione w WO 94/04690, opublikowanym 3 marca, 1994.

Dla dalszych szczegółów wytwarzania bispecyficznych przeciwciał, patrz na przykład, Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

(vi) Przeciwciała-heterokoniugaty

Przeciwciała-heterokoniugaty są również w zakresie niniejszego wynalazku. Przeciwciała-heterokoniugaty składają się z dwóch połączonych kowalencyjne przeciwciał. Takie przeciwciała zaproponowano na przykład do kierowania komórek układu immunologicznego do niepożądanych komórek (patent USA nr 4676980) i do leczenia infekcji HIV (publikacje zgłoszeń patentowych PCT nr WO 91100360 i WO 921200373; EP 03089). Przeciwciała-heterokoniugaty można wytworzyć dowolną z dogodnych metod łączenia krzyż owego. Odpowiednie czynniki do łączenia krzyż owego są dobrze

PL 208 113 B1 znane w tej dziedzinie i są ujawnione w patencie USA nr 4676980 razem z licznymi technikami łączenia krzyżowego.

(vii) Fragmenty przeciwciał

W niektórych wykonaniach, przeciwciałem anty-trkC (włączając w to przeciwciała mysie, ludzkie i warianty przeciwciała) jest fragment przeciwciała. Opracowano różne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie, fragmenty te pochodziły z proteolitycznego trawienia nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i wsp., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) oraz Brennan i wsp.. Science, 229:81 (1985)). Jednakże fragmenty te mogą być obecnie wytwarzane bezpośrednio przez zrekombinowane komórki gospodarza. Przykładowo, fragmenty Fab'-SH można odzyskiwać bezpośrednio z E. coli i łączyć chemicznie w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2 (Carter i wsp., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Według innego podejścia fragmenty F(ab')2 tworzy się przy zastosowaniu suwaka leucynowego GCN4 dla promowania tworzenia się cząsteczki F(ab')2. Według innego podejścia fragmenty Fv, Fab lub F(ab')2 można izolować bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał będą oczywiste dla wykonawcy-specjalisty.

(viii) Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciał

Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciał anty-trkC wytwarza się poprzez wprowadzenie odpowiednich zmian nukleotydowych do kwasu nukleinowego przeciwciała anty-trkC albo poprzez syntezę peptydów. Takie modyfikacje obejmują na przykład delecje i/lub wstawienia i/lub podstawienia reszt w obrębie sekwencji aminokwasowych przeciwciała anty-trkC. Wykonuje się dowolną kombinację delecji, wstawienia i podstawienia aby uzyskać ostateczny konstrukt, przy założeniu, że ten ostateczny produkt ma pożądane właściwości. Zmiany aminokwasowe mogą również zmieniać potranslacyjną obróbkę humanizowanego albo wariantu przeciwciała anty-trkC, taką jak zmiana liczby i pozycji miejsc glikozylacji.

Przydatną metodą identyfikacji pewnych reszt lub regionów przeciwciała anty-trkC, które są korzystnymi miejscami dla mutagenezy jest tak zwana „alaninowa mutageneza skaningowa jak opisano przez Cunningham i Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). W tym przypadku identyfikuje się resztę albo grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane, takie jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępuje się ją aminokwasami obojętnymi albo naładowanymi ujemnie (najkorzystniej alaniną albo polialaniną) w celu wywarcia wpływu na oddziaływanie aminokwasów z antygenem trkC. Pozycje aminokwasowe wykazujące wrażliwość funkcjonalną na podstawienia dalej są badane poprzez wprowadzenie dalszych albo innych wariantów w miejscu albo zamiast podstawienia. A zatem, jakkolwiek miejsce do wprowadzenia wariantu sekwencji aminokwasowej jest wstępnie określane, natura mutacji jako taka nie musi być wstępnie określana. Przykładowo, w celu przeanalizowania efektów mutacji w danym miejscu, przeprowadza się mutagenezę skaningową z ala lub losową w miejscu docelowego kodonu albo regionu i wyrażone warianty przeciwciała anty-trkC przeszukuje się pod kątem pożądanej aktywności.

Wstawienia sekwencji aminokwasowej obejmują amino- i/lub karboksy-końcowe fuzje o długości w zakresie od jednej reszty do polipeptydów zawierających setkę lub więcej reszt, jak również wstawienia w obrębie sekwencji pojedynczych albo wielu reszt aminokwasowych. Przykłady końcowych wstawień obejmują przeciwciało z N-końcową resztą metionylową albo przeciwciało połączone ze epitopem znacznikowym. Inne warianty insercyjne cząsteczki przeciwciała anty-trkC obejmują dołączenie na końcu N albo C przeciwciała anty-trkC enzymu albo polipeptydu, który zwiększa okres półtrwania przeciwciała w surowicy (patrz poniżej).

Innym typem wariantu jest wariant z podstawieniem aminokwasowym. Warianty te mają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała anty-trkC zastąpioną przez inną resztę. Miejsca najbardziej interesujące z punktu widzenia mutagenezy z podstawieniami obejmują regiony hiperzmienne, ale rozważa się również zmiany w FR. Konserwatywne podstawienia są przedstawione w Tabeli 1 pod nagłówkiem „korzystne podstawienia. Jeżeli takie podstawienia prowadzą do zmiany w aktywności biologicznej, wówczas można wprowadzać bardziej zasadnicze zmiany określone jako „przykładowe podstawienia w Tabeli 1 albo jak opisano dalej poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów, i produkty poddawać analizie.

PL 208 113 B1

T a b e l a 1

Wyjściowe reszty	Przykładowe podstawienia	Korzystne podstawienia
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn(N)	gln; his; asp; lys; arg	gln
Asp(D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (O)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucyna	leu
Leu (L)	norleucyna; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucyna	leu

Zasadnicze modyfikacje we właściwościach biologicznych przeciwciał uzyskuje się poprzez dobranie podstawień, które różnią się znacząco wpływem na utrzymywanie się (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze podstawienia, na przykład konformacji płaskiej albo heliakalnej, (b) ładunku albo hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Występujące naturalnie reszty dzieli się na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych.

(1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile;

(2) obojętne hydrofilowe: cys, ser, thr;

(3) kwaśne: asp, glu;

(4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg;

(5) reszty, które wpływają na orientację łańcucha: gly, pro; oraz (6) aromatyczne: trp, tyr, phe.

Niekonserwatywne podstawienia będą polegały na wymianie przedstawiciela jednej z tych klas na inną klasę.

Można również zastąpić dowolną resztę cysteinową nie uczestniczącą w utrzymywaniu prawidłowej konformacji przeciwciała anty-trkC, generalnie seryną, w celu polepszenia stabilności oksydacyjnej cząsteczki i zapobieganiu nieprawidłowym połączeniom krzyżowym. Odwrotnie, do przeciwciała można dodawać wiązanie(a) cysteinowe dla zwiększenia stabilności (szczególnie gdzie przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv).

Szczególnie korzystny typ wariantu z podstawieniem obejmuje podstawienie jednego albo większej liczby reszt regionu hiperzmiennego przeciwciała rodzicielskiego (np. przeciwciała humanizowanego albo ludzkiego). Generalnie, otrzymany w rezultacie wariant(y) wybierany do dalszych badań będą miały polepszone właściwości biologiczne w stosunku do przeciwciał rodzicielskich, z których zostały wytworzone. Dogodny sposób wytwarzania takich wariantów z podstawieniami obejmuje

PL 208 113 B1 dojrzewanie powinowactwa przy zastosowaniu prezentacji na fagach. Pokrótce, kilka miejsc w regionach hiperzmiennych (np. 6-7 miejsc) mutuje się w celu wytworzenia wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych w każdym miejscu. Wytworzone w ten sposób warianty przeciwciała prezentuje się w sposób jednowartościowy na cząstkach fagów nitkowatych jako fuzje z produktem genu III M13 zapakowane w każdej cząstce. Warianty prezentowane na fagu przeszukuje się następnie pod kątem aktywności biologicznej (np. powinowactwa wiązania) jak tu ujawniono. W celu zidentyfikowania miejsc regionu zmiennego będących kandydatami na modyfikację, przeprowadza się alaninową mutagenezę skaningową w celu zidentyfikowania reszt regionu biorących znaczący udział w wiązaniu antygenu. Alternatywnie, albo dodatkowo, może być korzystna analiza struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało w celu zidentyfikowania miejsc styku pomiędzy przeciwciałem i ludzkim trkC. Takie reszty na styku lub sąsiadujące są kandydatami na podstawienia zgodnie z omówionymi tu technikami. Po wytworzeniu takich wariantów, zestawy wariantów poddaje się przeszukiwaniu, jak tu opisano, i przeciwciała o lepszych właściwościach w jednym albo większej liczbie odpowiednich testów można wybrać do dalszych badań.

(ix) Warianty glikozylacji przeciwciał

Przeciwciała są glikozylowane w konserwowanych pozycjach regionów stałych (Jefferis i Lund, Chem. Immunol. 65:111-128 [1997]; Wright i Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]). Oligosacharydowe łańcuchy boczne immunoglobulin wpływają na funkcję białka (Boyd i wsp.. Mol. Immunol 32:1311-1318 [1996]; Wittwe i Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]) oraz wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania pomiędzy częściami glikoproteiny, co może wpływać na konformację i prezentowaną trójwymiarową powierzchnię glikoproteiny (Hefferis i Lund, jak wyżej; Wyss i Wagner, Current Opin. Biotech. 1:409-416 (1996)). Oligosacharydy mogą również służyć do kierowania danej glikoproteiny do pewnych cząsteczek w oparciu o specyficzne rozpoznawane struktury. Przykładowo, doniesiono, że w nieglikozylowanej IgG, reszta oligosacharydowa „wystaje z przestrzeni między CH2 i końcowe reszty N-acetyloglukozaminy stają się dostępne dla wiązania się z białkiem wiążącym mannozę (Malhotra i wsp.. Nature Med. 1:237-243 [1995]). Usunięcie przez glikopeptydazę oligosacharydów z CAMPATH-1H (zrekombinowane humanizowane mysie monoklonalne przeciwciało IgG1, które rozpoznaje antygen CDw52 ludzkich leukocytów) wytwarzanego w komórkach jajnika chomika chińskiego (ang. Chinese Hamster Ovary, CHO) doprowadziło do całkowitego zmniejszenia lizy z udziałem dopełniacza (CMCL) (Boyd i wsp.. Mol Immunol. 32:1311-1318 [1996]), natomiast selektywne usunięcie reszt kwasu sialowego przy zastosowaniu neuraminidazy nie prowadziło do utraty DMCL. Doniesiono również, że glikozylacja przeciwciał wpływa na zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). W szczególności doniesiono, że komórki CHO z regulowaną przez tetracyklinę ekspresją e(1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnTIII), glikozylotransferazy katalizującej tworzenie się podzielonych na pół GlcNAc, ma zwiększoną aktywność ADCC (Umana i wsp., Nature Biotech. 11:176-180 (1999)).

Warianty glikozylacji przeciwciał to warianty, w których zmieniony jest wzór glikozylacji przeciwciała. Poprzez zmianę rozumie się delecję jednej albo większej liczby reszt węglowodanowych znajdujących się na przeciwciele, dodanie do przeciwciała jednej albo większej liczby reszt węglowodanowych, zmianę składu glikozylacji (wzór glikozylacji), zakres glikozylacji, itd. Warianty glikozylacji można wytworzyć na przykład poprzez usunięcie, zmianę i/lub dodanie jednego albo większej liczby miejsc glikozylacji w sekwencji kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało.

Glikozylacja przeciwciał ma miejsce zazwyczaj poprzez N lub poprzez O. N-glikozylacja dotyczy przyłączenia reszty cukrowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. Tripeptydowe sekwencje asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny są miejscami rozpoznawania dla enzymatycznego przyłączenia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. O-glikozylacja odnosi się do przyłączenia jednego z cukrów N-acetylogalaktozaminy, galaktozy lub ksylozy do kwasu hydroksyaminowego, najczęściej seryny lub treoniny, jakkolwiek można również zastosować 5-hydroksyprolinę lub 5-hydroksylizynę.

Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała zazwyczaj przeprowadza się poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, aby zawierała jedną albo większą liczbę opisanych powyżej sekwencji tripeptydowych (dla miejsc N-glikozylacji). Zmian można również dokonać poprzez dodanie albo zastąpienie jednej albo większej liczby reszt serynowych albo treoninowych w sekwencji wyjściowego przeciwciała (dla miejsc O-glikozylacji).

Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała anty-trkC wytwarza się przy zastosowaniu rozmaitych znanych w tej dziedzinie metod. Metody te obejPL 208 113 B1 mują między innymi izolację z naturalnego źródła (w przypadku występujących naturalnie wariantów sekwencji aminokwasowej) albo wytwarzanie poprzez mutagenezę za pośrednictwem oligonukleotydów (lub ukierunkowaną), mutagenezę poprzez PCR oraz mutagenezę kasetową wytworzonego wcześniej wariantu albo nie wariantowej wersji przeciwciała anty-trkC.

Glikozylacja (włączając w to wzór glikozylacji) przeciwciał może być również zmieniona bez dokonania zmian w sekwencji aminokwasowej albo leżącej u jej podstawy sekwencji nukleotydowej. Glikozylacja zależy w dużym stopniu od komórek gospodarza zastosowanych do ekspresji przeciwciała. Ponieważ typem komórek stosowanych do ekspresji zrekombinowanych glikoprotein, np. przeciwciał jako potencjalnych leków rzadko bywają komórki natywne, można spodziewać się znaczących różnic we wzorze glikozylacji przeciwciał (patrz np. Hse i wsp., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997)). Poza wyborem komórek gospodarza, czynniki, które wpływają na glikozylację w czasie wytwarzania przeciwciał na drodze rekombinowania DNA obejmują sposób hodowania, skład pożywki, gęstość hodowli, natlenienie, pH, schemat oczyszczania i temu podobne. Zaproponowano rozmaite sposoby dla zmiany wzoru glikozylacji uzyskiwanego w poszczególnych organizmach, włączając w to wprowadzanie albo nadprodukcję pewnych enzymów uczestniczących w wytwarzaniu oligosacharydów (patent USA nr 5047335; 5510261 i 5278299). Glikozylacji albo pewnych typów glikozylacji można pozbyć się z glikoprotein enzymatycznie, stosując na przykład endoglikozydazę H (Endo H). Ponadto, zrekombinowane komórki gospodarza można zmieniać poprzez manipulacje genetyczne np. uczynić defektywnymi w obróbce pewnych rodzajów polisacharydów. Te i inne techniki są dobrze znane w tej dziedzinie.

Strukturę glikozylacji przeciwciał można łatwo analizować przy zastosowaniu konwencjonalnych technik analizy węglowodanów, włączając w to chromatografię lektynową, NMR, spektrometrię mas, HPLC, GPC, analizę składu monosacharydów, stopniowe trawienie enzymatyczne i HPAEC-PAD, gdzie stosuje się chromatografię anionowymienną w wysokim pH w celu rozdzielenia oligosacharydów w oparciu o ł adunek. Sposoby uwalniania oligosacharydów dla celów analitycznych s ą również znane i obejmują mię dzy innymi dział anie enzymatyczne (powszechnie przeprowadzane przy zastosowaniu peptydo-N-glikozydazy/endo-e-galaktozydazy), eliminacji przy zastosowaniu ostrego środowiska alkalicznego w celu uwolnienia głównie struktur z wiązaniami-O oraz metody chemiczne z zastosowaniem bezwodnej hydrazyny w celu uwolnienia oligosacharydów połączonych zarówno przez O, jak i przez N.

(x) Inne modyfikacje przeciwciał

Ujawnione tu przeciwciała mogą również być wytwarzane jako immunoliposomy. Liposomy zawierające przeciwciało wytwarza się metodami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak opisane w Epstein i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang i wsp.. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980) oraz pat. USA nr 4485045 i 4544545. Liposomy o zwiększonym czasie krążenia są ujawnione w patencie USA nr 5013556.

Szczególnie przydatne liposomy można wytworzyć przy zastosowaniu metody odparowania z odwróconą fazą z użyciem kompozycji lipidowej zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i pochodne PEG fosfatydyloetanolaminy (PEG-PE). Liposomy przetłacza się przez filtry o określonych rozmiarach porów w celu uzyskania liposomów o pożądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciała według niniejszego wynalazku można łączyć z liposomami jak opisano w Martin i wsp. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) poprzez reakcję wymiany dwusiarczkowej. W liposomie fakultatywnie zawarty jest czynnik chemioterapeutyczny. Patrz Gabizon i wsp. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Przeciwciało według niniejszego wynalazku można również użyć w ADEPT poprzez połączenie przeciwciała z aktywującym prolek enzymem, który przekształca prolek (np. peptydylowy czynnik chemioterapeutyczny, patrz WO 81/01145) w aktywny lek przeciwnowotworowy. Patrz na przykład WO 88/07378 i patent USA nr 4975278.

Składnik enzymatyczny immunokoniugatu przydatny w ADEPT obejmuje dowolny enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w bardziej aktywną, cytotoksyczną postać.

Enzymy, które są użyteczne w tej metodzie obejmują między innymi alkaliczną fosfatazę przydatną do przekształcania proleków zawierających fosforan w wolne leki; arylosulfatazę przydatną do przekształcania proleków zawierających siarczan w wolne leki; deaminazę cytozynową przydatną do przekształcania nietoksyczną 5-fluorocytozynę w lek przeciwnowotworowy, 5-fluorouracyl; proteazy, takie jak proteaza Serratia, termolizyna, subtilizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyny B i L), które są przydatne do przekształcania proleków zawierających peptyd w wolne leki; D-alanylokarboksypeptydazy, przydatne do przekształcania proleków, które zawierają podstawniki D-aminokwasowe; enzymy trawiące węglowodan, takie jak beta-galaktozydaza i neuraminidaza przy24

PL 208 113 B1 datne do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki; betalaktamaza przydatna do przekształcania pochodnych beta-laktamowych leków w wolne leki oraz amidazy penicyliny, takie jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny, przydatne do przekształcania w wolne leki pochodnych leków ze przyłączonymi do azotu w aminie grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi, odpowiednio. Alternatywnie, przeciwciała z aktywnością enzymatyczną, znane również jako „abzymy można zastosować do przekształcania proleków według wynalazku w wolne aktywne leki (patrz, np., Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Koniugaty przeciwciało-abzym można wytworzyć jak tu opisano dla dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych.

Enzymy według tego wynalazku mogą być łączone kowalencyjnie z przeciwciałami technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie, takimi jak zastosowanie dyskutowanych powyżej heterobifunkcjonalnych odczynników łączących krzyżowo. Alternatywnie, można skonstruować fuzje białkowe zawierające co najmniej jeden region wiążący antygen przeciwciała według wynalazku połączony z co najmniej funkcjonalnie aktywną częścią enzymu według wynalazku przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA dobrze znanych w tej dziedzinie (patrz, np. Neuberger i wsp., Nature, 312: 604608 (1984).

W pewnych wykonaniach wynalazku, może być pożądane zastosowanie fragmentu przeciwciała zamiast przeciwciała nienaruszonego. W tym przypadku, może być pożądane zmodyfikowanie fragmentu przeciwciała w celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała w surowicy. Można to uzyskać na przykład poprzez włączenie do fragmentu przeciwciała epitopu ratunkowego wiążącego się z receptorem (np. poprzez mutację odpowiedniego regionu fragmentu przeciwciał a albo poprzez włączenie epitopu do znacznika peptydowego, który łączy się następnie z fragmentem przeciwciała na którymś z końców albo w środku, np. poprzez syntezę DNA lub peptydu). Patrz WO 96/32478 opublikowany 17 października, 1996.

Epitop ratunkowy wiążący się z receptorem stanowi zazwyczaj region, gdzie dowolna, jedna albo więcej reszt aminokwasowych z jednej albo dwóch pętli domeny Fc jest przeniesiona do analogicznego miejsca we fragmencie przeciwciała. Korzystniej jest nawet, jeżeli przeniesione są trzy albo więcej reszt z jednej albo dwóch pętli domeny Fc. Jeszcze korzystniej, jeżeli epitop jest wzięty z domeny CH2 regionu Fc (np. z IgG) i przeniesiony do regionu CH1, CH3 lub VH, albo do więcej niż jednego takiego regionu przeciwciała. Alternatywnie, epitop jest wzięty z domeny CH2 regionu Fc i przeniesiony do regionu CL albo regionu VL fragmentu przeciwciała, albo obydwu.

Zakresem wynalazku objęte są również modyfikacje kowalencyjne humanizowanego albo wariantu przeciwciała anty-trkC (włączając w to warianty glikozylacji). Można je wytworzyć poprzez syntezę chemiczną lub enzymatyczną albo cięcie chemiczne przeciwciała, jeżeli można to zastosować. Inne typy kowalencyjnych modyfikacji przeciwciała wprowadza się do cząsteczki poprzez przeprowadzenie reakcji docelowych reszt aminokwasowych przeciwciała z organicznym czynnikiem derywatyzującym, który ma zdolność reagowania z wybranym łańcuchem bocznym albo resztami N- albo c-końcowymi. Przykładowe kowalencyjne modyfikacje polipeptydów są opisane w patencie USA 5534615, włączonym tu konkretnie jako odniesienie. Korzystny typ kowalencyjnej modyfikacji przeciwciała obejmuje połączenie przeciwciała z jednym z rozmaitych niebiałkowych polimerów, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym lub polioksyalkilenami, w sposób przedstawiony w patentach USA nr 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 lub 4179337.

2. Wektory, komórki gospodarzy i metody rekombinowania DNA

Wynalazek dostarcza również wyizolowany kwas nukleinowy kodujący inne niż ludzkie i ludzkie przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku (włączając w to humanizowane wersje przeciwciał innych niż ludzkie), wektory i komórki gospodarzy zawierające kwas nukleinowy oraz techniki rekombinowania DNA do wytwarzania przeciwciał.

Aby wytworzyć przeciwciało poprzez rekombinowanie DNA, izoluje się kodujący je kwas nukleinowy i wstawia do zdolnego do replikacji wektora w celu dalszego klonowania (powielania DNA) lub do ekspresji. W innym wykonaniu, przeciwciało można wytworzyć poprzez rekombinację homologiczną, np. jak opisano w patencie USA 5204244, włączonym tu konkretnie jako odniesienie. DNA kodujący przeciwciało monoklonalne można łatwo wyizolować i zsekwencjonować przy zastosowaniu konwencjonalnych procedur (np. poprzez użycie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania się z genami kodującymi ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała). Dostępnych jest wiele wektorów. Składniki wektorów generalnie obejmują między innymi jeden albo więcej spośród: sekwencji sygnałowej, początku replikacji, jednego albo większej liczby genów markerowych i elementów wzmacniających, promotora i sekwencji terminacji transkrypcji, np. jak opisano w patencie USA 5534615 wydanym 9 lipca, 1996 i włączonym tu konkretnie jako odniesienie.

PL 208 113 B1

Odpowiednie komórki gospodarza do klonowania i ekspresji DNA w rozważanych tu wektorach są opisanymi powyżej komórkami prokariotycznymi, drożdżowymi albo wyższych Eukaryota. Odpowiednie tego celu organizmy prokariotyczne obejmują Eubacteriae, takie jak organizmy Gram ujemne lub Gram dodatnie, na przykład, Enterobacteriaceae takie jak Escherichia, np., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klehsiella, Proteus, Salmonella, np., Salmonella typhimurium, Serratia, np. Serratia marcescans oraz Shigella, jak również Bacilli takie jak B. subtilis i B. licheniformis (np. B. licheniformis 41 P ujawniony w DD 266710 opublikowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas takie jak P. aeruginosa i Streptomyces. Jednym z korzystnych gospodarzy do klonowania w E. coli jest E. coli 294 (ATCC 31446), jakkolwiek inne szczepy, takie jak E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) i E. coli W3110 (ATCC 27325) są również odpowiednie. Przykłady te stanowią ilustrację, a nie ograniczenie.

Poza organizmami prokariotycznymi, mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby nitkowate albo drożdże są przydatnymi gospodarzami do klonowania i ekspresji dla wektorów kodujących przeciwciało anty-trkC. Saccharomyces cerevisiae albo zwyczajne drożdże piekarnicze są najpowszechniej używanymi wśród mikroorganizmów gospodarzami-niższymi Eukaryota. Jednakże powszechnie dostępne są i przydatne tu liczne inne rodzaje, gatunki i szczepy, takie jak Schizosaccharomyces pombe; gospodarze Kluyveromyces tacy jak, np., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500; K. drosophilarum (ATCC 36906),

K. Thermotolerans oraz K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, taki jak Schwanniomyces occidentalis oraz grzyby nitkowate, takie jak np. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i gospodarze Aspergillus, tacy jak A. nidulans i A. niger.

Odpowiednie komórki gospodarzy do ekspresji glikozylowanego przeciwciała anty-trkC pochodzą z organizmów wielokomórkowych. Przykłady komórek bezkręgowców obejmują komórki roślinne i komórki owadów. Zidentyfikowano liczne szczepy bakulowirusowe i warianty oraz odpowiadające im permisywne komórki gospodarzy owadzich z gospodarzy takich jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypti (komar), Aedes alhopictus (komar), Drosophila melanogaster (muszka owocowa) oraz Bomhyx mori. Rozmaite szczepy wirusowe do transfekcji są publicznie dostępne, np. wariant L-1 Autographa californica NPV oraz szczep Bm-5 Bombyx mori NPV, i takie wirusy można zastosować tu według niniejszego wynalazku, szczególnie do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda. Jako gospodarzy można również użyć hodowle komórek roślinnych: bawełny, kukurydzy, ziemniaka, soi, petunii, pomidora i tytoniu.

Jednakże główne zainteresowanie dotyczy komórek kręgowców i namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowli tkankowej) stało się rutynową procedurą. Przykładami przydatnych linii komórek ssaków-gospodarzy jest linia komórek małpiej nerki CV1 transformowana SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia ludzkiej embrionalnej nerki (293 lub komórki 293 subklonowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i wsp., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); komórki nerki noworodka chomika (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mysie komórki sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); małpie komórki nerki (CV1 ATCC CCL 70); komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej (VERO-76, ATCC CRL-1587); ludzkie komórki raka szyjki macicy (HeLa, ATCC CCL 2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysi rak gruczołu mlecznego (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i wsp., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); komórki MRC 5 i komórki FS4.

Komórki gospodarza transformuje się odpisanymi powyżej wektorami do klonowania i ekspresji w celu wytworzenia przeciwciała anty-trkC i hoduje w konwencjonalnej pożywce hodowlanej zmodyfikowanej odpowiednio do indukowania promotorów, selekcjonowania transformantów albo powielania genów kodujących pożądane sekwencje.

Komórki gospodarzy stosowane do wytwarzania przeciwciała anty-trkC według tego wynalazku można hodować w rozmaitych pożywkach. Dostępne handlowo pożywki, takie jak Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) oraz Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma) są przydatne do hodowania komórek gospodarzy. Ponadto, jako pożywkę hodowlaną dla komórek gospodarza można użyć dowolną z pożywek opisanych w Ham i wsp., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes i wsp., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), pat. USA nr 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 lub 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195 lub patent USA nr 30985. Dowolna z tych pożywek może być uzupełniona, jak potrzeba, hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostowymi

PL 208 113 B1 (takimi jak insulina, transferyna lub nabłonkowy czynnik wzrostowy), sole (takie jak chlorek sodu, wapń, magnez i fosforan) bufory (takie jak HEPES), nukleotydy (takie jak adenozyna i tymidyna), antybiotyki (takie jak lek GENTAMYCIN™), elementy śladowe zdefiniowane jako związki nieorganiczne zwykle obecne w stężeniu końcowym w zakresie mikromolarnym) oraz glukoza lub ekwiwalentne źródło energii. Dowolne inne niezbędne uzupełnienia można również dodać w odpowiednich stężeniach, które będą znane specjalistom w tej dziedzinie. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH i temu podobne, są takie, jak stosowane uprzednio dla komórek gospodarza wybranego do ekspresji i będą oczywiste dla przeciętnego specjalisty w tej dziedzinie.

Kiedy stosuje się techniki rekombinowania DNA, przeciwciało można wytwarzać wewnątrzkomórkowe, w przestrzeni periplazmatycznej albo wydzielane bezpośrednio do pożywki. Jeżeli przeciwciało jest wytwarzane wewnątrzkomórkowo, jako pierwszy etap cząsteczkowe resztki, czy to komórki gospodarza czy fragmenty po lizie, usuwa się na przykład poprzez wirowanie albo ultrawirowanie. Carter i wsp., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuje procedurę izolowania przeciwciał, które są wydzielane do przestrzeni periplazmatycznej E. coli. Pokrótce, masę komórek rozmraża się w obecności octanu sodowego (pH 3,5), EDTA, i fenylometylsulfonylofluorku (PMSF) przez około 30 min. Resztki komórek usuwa się poprzez wirowanie. Tam gdzie przeciwciało jest wydzielane do pożywki, supernatanty z takich systemów ekspresyjnych generalnie najpierw zatęża się przy użyciu dostępnych handlowo filtrów do zatężania białek, na przykład jednostek do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pellicon. Inhibitor proteaz, taki jak PMSF może być dodany na dowolnym z powyższych etapów w celu hamowania proteolizy, a antybiotyki można dodać w celu zapobiegania wzrostu przypadkowych mikroorganizmów.

Kompozycję przeciwciała wytworzonego z komórek można oczyścić stosując na przykład chromatografię na hydroksyloapatycie, elektroforezę w żelu, dializę oraz chromatografię powinowactwa, przy czym korzystną techniką oczyszczania jest chromatografia powinowactwa. Przydatność białka A jako ligandu powinowactwa zależy od rodzaju i izotypu regionu Fc immunoglobuliny, który jest obecny w przeciwciele. Białko A można zastosować do oczyszczania przeciwciał, które opierają się na ludzkich łańcuchach ciężkich 1, 2 lub 4 (Lindmark i wsp., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Białko G jest polecane dla wszystkich izotypów mysich i ludzkiej 3 (Guss i wsp., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). Podłożem, do którego ligand powinowactwa jest przytwierdzony jest najczęściej agaroza, ale dostępne są również inne podłoża. Stabilne mechanicznie podłoża, takie jak szkło o określonych porach lub poli(styrenodiwinylo)benzen umożliwiają szybsze tempo przepływu i krótszy czas obróbki niż można uzyskać z agarozą. Tam gdzie przeciwciało zawiera domenę CH3, do oczyszczania przydatna jest żywica Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Dostępne są również inne techniki oczyszczania białka, takie jak frakcjonowanie na kolumnie jonowymiennej, wytrącanie etanolem, HPLC z odwróconymi fazami, chromatografia na krzemionce, chromatografia na heparyna-SEPHAROSE™, chromatografia na żywicy jonowymiennej anionowej albo kationowej (takiej jak kolumna z kwasu poliasparaginowego), chromatoognoskowanie, SDS-PAGE oraz wytrącanie siarczanem amonu, zależnie od przeciwciała, które ma być odzyskane.

Po wstępnym etapie(ach) oczyszczania mieszaninę zawierającą przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia można poddać chromatografii oddziaływań hydrofobowych w niskim pH przy uż yciu buforu do elucji o pH pomiędzy 2,5-4,5, korzystnie przeprowadzanego przy niskim stężeniu soli (np. od około 0 do 0,25 M soli).

3. Identyfikacja agonistycznych przeciwciał anty-trkC

Agonistyczne przeciwciała można zidentyfikować przykładowo przy zastosowaniu testu aktywacji receptora typu kinazy (ang. kinase receptor activation, KIRA), opisanego w patentach USA nr 5766863 oraz 5891650. Ten test typu ELISA jest odpowiedni dla jakościowego i ilościowego pomiaru aktywacji kinazy poprzez mierzenie autofosforylacji domeny kinazowej receptorowej białkowej kinazy tyrozynowej (rPTK, np. receptora trk), jak również dla wykrywania i charakteryzacji potencjalnych agonistów lub antagonistów wybranej rPTK. Pierwszy etap tego testu obejmuje fosforylację domeny kinazowej receptora typu kinazy, w niniejszym przypadku receptora trkC, który jest obecny w błonie komórkowej komórki eukariotycznej. Receptor ten może być receptorem endogennym lub też kwas nukleinowy kodujący ten receptor albo konstrukt receptorowy mogą być transformowane do komórki. Zazwyczaj pierwsza faza stała (np. studzienka pierwszej płytki testowej) jest opłaszczana zasadniczo jednorodną populacją takich komórek (przeważnie ssaczej linii komórkowej) w ten sposób, że komórki przylegają do fazy stałej. Często komórki te mają naturalną zdolność przylegania i dzięki temu w sposób naturalny przylegają do pierwszej fazy stałej. W przypadku stosowania „konstruktu receptorowePL 208 113 B1 go obejmuje on przeważnie fuzję receptora typu kinazy oraz polipeptydu znacznikowego. Polipeptyd znacznikowy jest rozpoznawany przez czynnik wychwytujący - często jest to przeciwciało wychwytujące, w części ELISA testu. Badany czynnik, taki jak potencjalny agonista, jest następnie dodawany do studzienek płytki testowej, zawierających przylegające komórki, dzięki czemu receptor typu kinazy tyrozynowej (np. receptor trkC) jest wystawiany na działanie (lub wprowadzany w kontakt) badanego czynnika. Test ten umożliwia wykrywanie agonistycznych ligandów dla interesującego receptora typu kinazy (np. trkC). Można go również stosować do wykrywania antagonistów receptora typu kinazy. W celu wykrycia obecnoś ci antagonistycznego ligandu, który blokuje wią zanie się agonisty z receptorem, przylegające komórki są w pierwszej kolejności wystawiane na działanie podejrzewanego antagonistycznego ligandu, a następnie na działanie agonistycznego ligandu, co umożliwia zmierzenie współzawodniczącego hamowania wiązania i aktywacji receptora. Test ten pozwala także na wykrycie antagonisty, który wiąże się z agonistycznym ligandem zmniejszając lub uniemożliwiając w ten sposób jego zdolność wiązania i aktywowania rPTK. W celu wykrycia takiego antagonisty podejrzewany antagonista oraz agonista dla rPTK są inkubowane wspólnie, a następnie przylegające komórki są wystawiane na działanie tej mieszaniny ligandów. Po wystawieniu na działanie badanego czynnika przylegające komórki są rozpuszczane przy użyciu buforu lizującego (który zawiera detergent rozpuszczający) i łagodnego wytrząsania, co prowadzi do uwolnienia lizatu komórkowego, który może zostać bezpośrednio poddany części ELISA testu, bez potrzeby zagęszczania lub oczyszczania lizatu komórkowego.

Przygotowany w ten sposób lizat komórkowy jest gotowy do użycia w etapie ELISA testu. W pierwszym kroku etapu ELISA druga faza sta ł a (przeważ nie studzienka w pł ytce mikrotitracyjnej ELISA) jest opłaszczana czynnikiem wychwytującym (często jest to przeciwciało wychwytujące), który wiąże się specyficznie z receptorem typu kinazy tyrozynowej lub, w przypadku konstruktu receptorowego, z polipeptydem znacznikowym. Opłaszczanie drugiej fazy stałej jest przeprowadzane w ten sposób, że czynnik wychwytujący przylega do drugiej fazy stałej. Czynnik wychwytujący jest zasadniczo przeciwciałem monoklonalnym, ale, jak przedstawiono w przykładach niniejszego opisu, przeciwciała poliklonalne mogą być również stosowane. Otrzymany lizat komórkowy jest następnie wystawiany na działanie, lub wprowadzany w kontakt z przylegającym czynnikiem wychwytującym tak, że receptor lub konstrukt receptorowy przylega do (lub jest wychwytywany) drugiej fazy stałej. Następnie przeprowadzany jest etap płukania, w celu usunięcia nie związanego lizatu komórkowego i pozostawienia wychwyconego receptora lub konstruktu receptorowego. Przylegający lub wychwycony receptor albo konstrukt receptorowy jest następnie wystawiany na działanie, lub wprowadzany w kontakt z przeciwciałem antyfosfotyrozynowym, które wykrywa ufosforylowane reszty tyrozyny w receptorze typu kinazy tyrozynowej. W korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-fosfotyrozyna jest sprzężone (bezpośrednio lub pośrednio) z enzymem, który katalizuje zmianę barwy nie radioaktywnego barwnego odczynnika. Wskutek tego, fosforylacja receptora może być mierzona pośrednio poprzez późniejszą zmianę barwy odczynnika. Enzym może być związany z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna bezpośrednio lub też cząsteczka sprzęgająca (np. biotyna) może być sprzężona z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna, a enzym może być następnie związany z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna za pośrednictwem cząsteczki sprzęgającej. Ostatecznie, wiązanie przeciwciała anty-fosfotyrozyna z wychwyconym receptorem jest poddawane pomiarowi, np. poprzez zmianę barwy barwnego odczynnika.

Po wstępnej identyfikacji aktywność agonistyczna może zostać następnie potwierdzona i dokładnie zanalizowana przy pomocy testów biologicznych, o których wiadomo, że badają docelowe aktywności biologiczne. Dla przykładu, zdolność monoklonalnych przeciwciał anty-trkC do naśladowania aktywności NT-3 może zostać zbadana w teście rozrostu neurytów w PC12, jak opisano w Przykładzie 1 oraz potwierdzona w znanych zwierzęcych modelach chorób neurodegeneracyjnych, takich jak doświadczalne zwierzęce modele neuropatii indukowanych przez cisplatynę i pirydoksynę, opisane w Przykł adzie 2.

3. Zastosowania terapeutyczne i diagnostyczne agonistycznych przeciwciał anty-trkC

Agonistyczne przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku są uważane za użyteczne w leczeniu (w tym zapobieganiu) zaburzeń, których patologia obejmuje degenerację lub dysfunkcję komórkową. Agonistyczne przeciwciała anty-trkC są w szczególności obiecującymi kandydatami do leczenia różnych (przewlekłych) zaburzeń neurodegeneracyjnych lub ostrych uszkodzeń komórek nerwowych. Takie zaburzenia neurodegeneracyjne obejmują, bez ograniczenia: neuropatie obwodowe; zaburzenia neuronów ruchowych, takie jak zanikowe stwardnienie boczne (ALS, choroba Lou Gehrig), porażenie obwodowe nerwu twarzowego oraz różne stany obejmujące rdzeniowy zanik mię28

PL 208 113 B1 śni lub porażenie; oraz inne ludzkie choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, padaczka, stwardnienie rozsiane, pląsawica Huntingtona, zespół Downa, głuchotę nerwową, oraz zespół Meniere'a, a także ostre uszkodzenia komórek nerwowych, spowodowane na przykład urazem psychicznym lub uszkodzeniem rdzenia kręgowego.

Agonistyczne przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku są uważane za szczególnie odpowiednie dla leczenia neuropatii obwodowej, choroby neurodegeneracyjnej, która dotyczy nerwów obwodowych, przejawiającej się najczęściej jako dysfunkcja ruchowa, czuciowa, czuciowo-ruchowa lub autonomiczna albo ich kombinacja. Neuropatie obwodowe mogą być przykładowo nabyte genetycznie, mogą być wynikiem choroby układowej lub mogą być wywołane przez czynnik toksyczny, taki jak środek neurotoksyczny, np. czynnik przeciwnowotworowy lub zanieczyszczenie przemysłowe lub środowiskowe, lub mogą być samoistne. Tak więc, czuciowa neuropatia obwodowa charakteryzuje się degeneracją, albo obniżeniem lub niezdolnością funkcjonowania obwodowych nerwów czuciowych, które mogą wystąpić przykładowo jako konsekwencja cukrzycy (neuropatia cukrzycowa), terapii nowotworowej z wykorzystaniem leku cystostatycznego (np. leczenie przy użyciu czynników chemioterapeutycznych, takich jak winkrystyna, cisplatyna, metotreksan lub 3'-azydo-3'-deoksytymidyna), alkoholizmu, nabytego zespołu upośledzenia odporności (AIDS), lub skłonności genetycznej. Genetycznie nabyte neuropatie obwodowe obejmują przykładowo: chorobę Refsuma, chorobę Krabbego, leukodystrofię metachromatyczną, chorobę Fabry'ego, chorobę Dejerine'a-Sottasa, abetalipoproteinemię, chorobę Charcot-Marie-Tooth (znaną również jako zanik mięśnia strzałkowego lub dziedziczna neuropatia ruchowo-czuciowa (HMSN)).

W oparciu o wykazaną zdolność NT-3, naturalnego ligandu receptora trkC, do pobudzania namnażania leukocytów krwi obwodowej, agonistyczne przeciwciała anty-trkC mogą być również stosowane jako czynniki terapeutyczne w leczeniu neutropenii, różnych zakażeń oraz nowotworów. Jako że ekspresja trkC nie ogranicza się do neuronów, można się spodziewać, że agonistyczne przeciwciała anty-trkC znajdą zastosowanie w zapobieganiu lub leczeniu zaburzeń charakteryzujących się ogólnie degeneracją komórkową, bez ograniczenia do komórek nerwowych.

Przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku można również użyć do indukowania angiogenezy albo leczenia stanów patologicznych/chorób, w których indukcja angiogenezy jest pożądana. Takie stany patologiczne obejmują na przykład, niedokrwienie serca niezależnie od leżącej u jego podłoża patologii, włączając w to choroby naczyniowo-mózgowe powodowane przez niedostateczne krążenie mózgowe. Angiogeneza może być również pożądana przy leczeniu ran, włączając w to owrzodzenia, komplikacje cukrzycowe przy anemii sierpowatej i rany pooperacyjne.

Przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku mogą być również przydatne w diagnozowaniu chorób z udziałem degeneracji komórkowej, a w szczególności chorób neurodegeneracyjnych wymienionych powyżej.

Do zastosowań diagnostycznych, przeciwciało będzie typowo wyznakowane wykrywalną resztą. Dostępnych jest wiele znaczników, które generalnie grupuje się w następujące kategorie:

(a) Radioizotopy, takie jak ³⁵S,¹⁴C, ¹²⁵I, ³H i ¹³¹I. Przeciwciało może być wyznakowane radioizotopem przy użyciu technik opisanych na przykład w Current Protocols in Immunology, Tomy 1 i 2, Coligen i wsp., Wyd. Wiley-Interscience, New York, New York, Wyd. (1991), a radioaktywność można mierzyć przy zastosowaniu zliczania w scyntylatorze.

(b) Znaczniki fluorescencyjne, takie jak chelaty ziem rzadkich (chelaty europu) lub fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, dansyl, Lissamina, fikoerytryna i czerwień teksańska są dostępne. Znaczniki fluorescyjne można połączyć z przeciwciałem przy zastosowaniu technik ujawnionych na przykład w Current Protocols in Immunology, jak wyżej. Fluorescencję można oceniać ilościowo przy użyciu fluorymetru.

(c) Różne znaczniki substrat-enzym są dostępne, a patent USA nr 4275149 dostarcza przeglądu niektórych spośród nich. Enzym generalnie katalizuje zmianę chemiczną chromogennego substratu, którą można mierzyć przy zastosowaniu różnych technik. Na przykład, enzym może katalizować zmianę koloru substratu, którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Alternatywnie, enzym może zmieniać fluorescencję lub chemiluminescencję substratu. Techniki oceny ilościowej zmiany fluorescencji są opisane powyżej. Substrat chemiluminescencyjny staje się wzbudzony elektronicznie przez reakcję chemiczną i może następnie emitować światło, które można mierzyć (stosując na przykład chemiluminometr) albo przekazywać energię do fluorescencyjnego akceptora. Przykłady znaczników fluorescencyjnych obejmują lucyferazy (np. lucyferazę ze świetlika i lucyferazę bakteryjną; patent USA nr 4737456), lucyferynę, 2,3-dihydroftalazynodiony, dehydrogenazę jabłczanową, ureazę, peroksydaPL 208 113 B1 zę, taką jak peroksydaza z chrzanu (HRPO), alkaliczną fosfatazę, β-galaktozydazę, glukoamylazę, lizozym, oksydazy sacharydowe (np. oksydaza glukozy, oksydaza galaktozy oraz dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu), oksydazy heterocykliczne (takie jak urykaza i oksydaza ksantynowa), laktoperoksydaza, mikroperoksydaza i temu podobne. Techniki przyłączania enzymów do przeciwciał są opisane w O'Sullivan i wsp., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, w Methods in Enzym. Wyd. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981).

Przykłady połączenia enzym-substrat obejmują na przykład:

(i) Peroksydazę z chrzanu (HRPO) z nadtlenkiem wodoru jako substratem, gdzie peroksydaza nadtlenkowa utlenia prekursor barwnika (np. ortofenylenodiaminę (OPD) lub 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynohydrochlorek (TMB));

(ii) alkaliczną fosfatazę (AP) z paranitrofenylofosforanem jako substratem chromogennym; oraz (iii) -D-galaktozydazę (-D-Gal) z chromogennym substratem (np. p-nitrofenylo-D-galaktozydazą) lub fluorogennym substratem 4-metyloumbeliferylo-(3- -D-galaktozydazą).

Wiele innych kombinacji enzym-substrat dostępnych jest dla specjalistów w tej dziedzinie. Dla ich ogólnego przeglądu patrz patenty USA nr 4275149 i 4318980.

Czasami znacznik jest połączony z przeciwciałem pośrednio. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział o wielu technikach, którymi można to osiągnąć. Przykładowo, przeciwciało można połączyć z biotyną, a dowolny ze znaczników z tych trzech szerokich kategorii wspomnianych powyżej można połączyć z awidyną lub vice versa. Biotyna wiąże się wybiórczo z awidyną, a zatem w ten pośredni sposób można połączyć znacznik z przeciwciałem. Alternatywnie, aby uzyskać pośrednie połączenie znacznika z przeciwciałem, przeciwciało łączy się z małym haptenem (np. digoksyną), a jeden z różnych typów wspomnianych powyżej znaczników łączy się z przeciwciałem anty-hapten (np. przeciwciałem anty-digoksyna). A zatem można uzyskać pośrednie połączenie znacznika z przeciwciałem.

W innym wykonaniu wynalazku, przeciwciało anty-trkC nie musi być znakowane, a jego obecność może być wykrywana przy zastosowaniu wyznakowanego przeciwciała, które wiąże się z przeciwciałem anty-trkC.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można wykorzystać w dowolnym ze znanych sposobów badania, takich jak testy współzawodnictwa o wiązanie, bezpośrednie i pośrednie testy kanapkowe i testy immunoprecypitacji. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Testy współzawodnictwa o wiązanie polegają na zdolności wyznakowanego standardu do współzawodniczenia z testową próbką badanego związku o wiązanie się z ograniczoną ilością przeciwciała. Ilość białka trkC w próbce testowej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości standardu, który zostaje związany z przeciwciałami. W celu ułatwienia ustalenia ilości standardu, który zostaje związany, przeciwciała generalnie są wydzielane z fazy rozpuszczalnej przed albo po współzawodnictwie, tak, że standard i badany związek, które są związane z przeciwciałami można dogodnie oddzielić od standardu i badanego związku, które pozostają niezwiązane.

Testy kanapkowe obejmują zastosowanie dwóch przeciwciał, każdego zdolnego do wiązania innej części immunogennej albo epitopu białka, które ma być wykrywane. W teście kanapkowym testowa próbka badanego związku jest wiązana przez pierwsze przeciwciało, które jest unieruchamiane na podłożu stałym, a następnie drugie przeciwciało wiąże się z badanym związkiem, tworząc nierozpuszczalny trzyczęściowy kompleks. Patrz patent USA 4376110. Drugie przeciwciało może być samo wyznakowane wykrywalną resztą (bezpośrednie testy kanapkowe) albo może być mierzone przy użyciu przeciwciała anty-immunoglobulina, które jest wyznakowane wykrywalną resztą (pośrednie testy kanapkowe). Przykładowo, jednym z typów testu kanapkowego jest test ELISA, gdzie wykrywalną resztą jest enzym.

Przeciwciała można również zastosować w testach diagnostycznych in vivo. Generalnie, przeciwciało znakuje się radionuklidem (takim jak ¹¹¹I, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P lub ³⁵S), tak, że antygen albo wyrażające go komórki można zlokalizować przy użyciu immunoscyntografii.

Przeciwciała można również użyć jako odczynniki barwiące w patologii, stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie.

Uważa się agonistyczne przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku mają liczne zalety jako czynniki terapeutyczne w porównaniu z NT-3, włączając w to lepsze właściwości farmakokinetyczne (pK) i biodostępność oraz brak przeczulicy bólowej po podawaniu.

PL 208 113 B1

4. Kompozycje farmaceutyczne

Kompozycje terapeutyczne przeciwciał według niniejszego wynalazku wytwarza się w celu przechowywania poprzez mieszanie przeciwciała mającego pożądany stopień czystości z ewentualnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub stabilizatorami (Remington's Pharmaceutical Sciences wydanie 16, Osol, A. Ed. (1980)), w postaci preparatów liofilizowanych albo roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w zastosowanych dawkach i stężeniach i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne, przeciwutleniacze, włączają c w to kwas askorbinowy i metioninę ; ś rodki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy; chlorek heksametoniowy; chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy; alkohol fenolowy, butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub propylowy; katechol; rezorcynol; cycloheksanol; 3-pentanol oraz m-krezol); polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt); białka, takie jak albumina z surowicy, żelatyna albo immunoglobuliny; polimery hydrofilowe takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histidyna, arginina lub lizyna; monosaccharydy, disacharydy i inne węglowodany włączając w to glukozę, mannozę lub dekstryny; czynniki chelatujące, takie jak EDTA; cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; tworzące sole jony, takie jak sodowe; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub niejonowe związki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG).

Rozważane tu kompozycje mogą również zawierać jeden albo większą liczbę związków czynnych niezbędnych podczas leczenia przy poszczególnych wskazaniach, korzystnie o uzupełniających się aktywnościach, które nie mają na siebie wzajemnie szkodliwego wpływu. Takie cząsteczki powinny być obecne w kompozycji w ilościach, które są skuteczne dla zamierzonych potrzeb.

Składniki czynne można również zamykać w mikrokapsułkach wytwarzanych na przykład techniką koacerwacji albo polimeryzacji międzyfazowej, na przykład mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych albo żelatynowych, odpowiednio i mikrokapsułkach poli(metylometacylanowych), odpowiednio, w koloidalnym systemie dostarczania leków (na przykład liposomy, mikrokulki albuminowe, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki) lub w makroemulsjach. Takie techniki są ujawnione w Remington's Pharmaceutical Sciences wyd. 16, Osol, A. Ed. (1980).

Kompozycje do stosowania in vivo muszą być jałowe. To można łatwo osiągnąć poprzez filtrację przez błony filtracyjne.

Można również wytworzyć preparaty o opóźnionym uwalnianiu.

Odpowiednie przykłady preparatów o opóźnionym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne podłoża ze stałych hydrofobowych polimerów zawierających przeciwciało, gdzie podłoża wytwarza się w postaci uformowanych artykułów, np. błon albo mikrokapsułek. Przykłady podłóż o opóź nionym uwalnianiu obejmują poliestry, hydroż ele (na przykł ad, poli(2-hydroksyetylometakrylan) albo poli(winyloalkohol)), polimleczany (pat. USA nr 3773919), kopolimery kwasu L-glutaminowego oraz etylo-L-glutaminianu, nie podlegający rozkładowi octan etyleno-winylowy, podlegające rozkładowi kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT™ (wstrzykiwalne mikrokulki składające się kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidowego) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy. Jakkolwiek polimery, takie jak octan etyleno-winylowy i kwas mlekowy-kwas glikolowy umożliwiają uwalnianie cząsteczek na przestrzeni 100 dni, pewne hydrożele uwalniają białka w krótszych okresach czasu. Po zamknięciu w kapsuł ki przeciwciała pozostają w organizmie przez dł ugi i mogą denaturować albo agregować jako wynik wystawienia na działanie wilgoci w 37°C, co prowadzi do utraty aktywności biologicznej i możliwych zmian w immunogenności. Można zaprojektować racjonalne strategie dla stabilizacji w zależności od mechanizmu, który w tym uczestniczy. Przykładowo, jeżeli odkryty mechanizm agregacji jest tworzeniem się międzycząsteczkowych wiązań S-S poprzez wymianę tio-disiarczkową, stabilizację można uzyskać poprzez modyfikacje reszt sulfhydrylowych, liofilizację z roztworów kwaśnych, kontrolowanie zawartoś ci wilgoci, z zastosowaniem odpowiednich dodatków i opracowywanie specyficznych złóż polimerowych.

Skuteczna ilość przeciwciała według niniejszego wynalazku, która ma być użyta terapeutycznie będzie zależała na przykład od celów terapeutycznych, drogi podawania i stanu pacjenta. A zatem, konieczne będzie dla lekarza określenie dawki i modyfikacja drogi podawania wymaganych dla uzyskania optymalnego efektu terapeutycznego. Typowa dzienna dawka mogłaby mieścić się w zakresie

PL 208 113 B1 od około 1 g/kg do 100 mg/kg lub więcej w zależności od wspomnianych powyżej czynników. Zazwyczaj lekarz będzie podawał cząsteczkę według niniejszego wynalazku aż do osiągnięcia dawki, która dostarczy wymaganego efektu biologicznego. Postęp tej terapii można łatwo śledzić przy zastosowaniu konwencjonalnych testów.

Podawanie może być dowolną konwencjonalną drogą znaną w tej dziedzinie, włączając w to między innymi podawanie dożylne, podskórne, miejscowe, domięśniowe, dotchawiczne, domózgowe, donosowe, dopłucne i dogardłowe.

4. Terapia genowa

Kwas nukleinowy kodujący przeciwciała według niniejszego wynalazku można również zastosować w terapii genowej różnych (przewlekłych) chorób neurodegeneracyjnych i ostrych uszkodzeń komórek nerwowych, a w szczególności uwarunkowanych genetycznie neuropatii obwodowych. Rozwinęły się dwa podstawowe podejścia do terapii genowej: terapia genowa ex vivo i terapia genowa in vivo. W terapii genowej ex vivo komórki pobiera się od pacjenta i hoduje in vitro. Funkcjonalny gen do zamiany wprowadza się do komórek in vitro, zmodyfikowane komórki namnaża się w hodowli, a następnie przeszczepia ponownie osobnikowi. W terapii genowej in vivo komórki docelowe nie są pobierane od pacjenta. W zamian za to przenoszony gen jest wprowadzany do komórek in situ, to jest w obrębie osobnika.

Istnieje szereg doniesień i prac przeglądowych na temat terapii genowej u ludzi ex vivo, na przykład w Anderson, Science 256: 808-813 (1992) oraz Miller, Nature 357: 455-460 (1992).

Potencjał terapii in vivo został zademonstrowany w kilku modelach zwierzęcych, przeglądu których dokonano w Felgner i wsp.. Nature 349: 351-352 (1991). Opisano na przykład bezpośrednie przeniesienie genu do tkanki mięśniowej (Ferry i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8377-8781 [1991]; Quantin i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584 [1992]); ściany tętnic (Nabel i wsp., Science 244: 1342-1344 [1989]) oraz układu nerwowego; (Price i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 156-160 [1987]).

A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza również nośników do dostarczania przydatnych do dostarczania polinukleotydu kodującego agonistyczne przeciwciało anty-trkC do komórek (czy to in vivo czy ex vivo). Generalnie, polinukleotyd kodujący przeciwciało (np. przeciwciało liniowe albo łańcuchy przeciwciała) będą mogły być połączone funkcjonalnie z promotorem i heterologicznym polinukleotydem. Nośniki do dostarczania przydatne do włączenia do nich polinukleotydu kodującego przeciwciało według niniejszego wynalazku do wprowadzania do komórki gospodarza obejmują nośniki niewirusowe i wektory wirusowe. Verma i Somia, Nature 389: 239-242 (1997).

Wiele różnorodnych niewirusowych nośników do dostarczania polinukleotydu kodującego przeciwciało według niniejszego wynalazku jest znanych w tej dziedzinie i objętych niniejszym wynalazkiem. Polinukleotyd kodujący przeciwciało anty-trkC może być dostarczony jako nagi DNA (patent USA nr 5692622; WO 97140163). Alternatywnie, polinukleotyd kodujący opisane tu przeciwciało anty-trkC może być dostarczony do komórek połączony różnymi sposobami z rozmaitymi substancjami (postaciami dostarczania) włączając w to między innymi kationowe lipidy; odpowiednie biologicznie polimery, włączając w to polimery naturalne i syntetyczne; lipoproteiny; polipeptydy; polisacharydy; lipopolisacharydy; sztuczne otoczki wirusowe; cząstki metali oraz bakterie. Nośnikiem do dostarczania może być mikrocząstka. Jako nośniki do dostarczania możne również zastosować mieszaniny albo koniugaty tych różnych substancji. Polinukleotyd kodujący opisane tu przeciwciało może być połączony niekowalencyjnie albo kowalencyjnie z tymi różnymi postaciami dostarczania. Liposomy mogą być nakierowane na konkretny typ komórki, np. do kłębuszkowej komórki nabłonkowej.

Wektory wirusowe obejmują między innymi wektory w oparciu o wirusy DNA, jak te oparte na adenowirusach, wirusie opryszczki pospolitej, wirusach ospy, takich jak wirus krowianki, parwowirusach, włączając w to wirusa towarzyszącego adenowirusowi oraz wektory w oparciu o wirusy RNA włączając w to między innymi wektory retrowirusowe. Wektory retrowirusowe obejmują mysiego wirusa białaczki i lentiwirusy, takie jak ludzki wirus niedoboru odporności. Naldini i wsp., Science 272: 263-267 (1996).

Niewirusowe nośniki do dostarczania zawierające polinukleotyd kodujący przeciwciało anty-trkC można wprowadzać do komórek gospodarza i/lub komórek docelowych dowolną z metod znanych w tej dziedzinie, takich jak technika koprecypitacji z fosforanem wapniowym; elektroporacja; elektropermeabilizacja; transfekcja za pośrednictwem liposomu; transfekcja balistyczna; proces biolistyczny włączając w to bombardowanie mikrocząstkami, wstrzyknięcie strumieniowe, wstrzyknięcie igłą lub

PL 208 113 B1 strzykawką albo poprzez mikrowstrzyknięcie. Liczne sposoby transfekcji są znane specjalistom pracującym w tej dziedzinie.

Wirusowe nośniki do dostarczania mogą być wprowadzone do komórki poprzez infekcję. Alternatywnie, nośniki wirusowe mogą być włączone do dowolnego z niewirusowych nośników do dostarczania opisanych powyżej do dostarczania do komórek. Przykładowo, wektory wirusowe można zmieszać z kationowymi lipidami (Hodgson i Solaiman, Nature Biotechnol. 14: 339-342 [1996]) albo warstwowymi liposomami (Wilson i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 3471 [1977] oraz Faller i wsp. J. Virol. 49: 269 [1984]).

W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy kodujący obydwa łańcuchy ciężki i lekki (włączając w to fragmenty) przeciwciała anty-trkC według niniejszego wynalazku będą obecne w tym samym policistronowym wektorze ekspresyjnym, takim jak opisany w patentach USA nr 4965196 i 4713339. Wektory do policistronowej ekspresji zawierają sekwencje kodujące inne białko i pożądane białko, gdzie zarówno pożądane białko jak i inne białko są kierowane przez ten sam promotor. Sekwencje kodujące są rozdzielone przez kodony sygnału stop i star dla translacji. Ekspresja drugiego białka wpływa na kontrolę nad ekspresją sekwencji dla pożądanego białka, a drugie białko służy jako marker dla selekcji transferowanych komórek.

W terapii genowej in vivo wektor można podawać biorcy na przykład poprzez zastrzyk dożylny (i.v.). Odpowiednie miana będą zależne od rozmaitych czynników, takich jak konkretnie wybrany wektor, gospodarz, siła użytego promotora, ciężkość choroby, która jest leczona.

Wynalazek będzie dalej zilustrowany przez następujące nieograniczające przykłady.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie i charakteryzacja agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC

Wytwarzanie i izotypowanie przeciwciał

Myszy Balb/C typu dzikiego oraz myszy transgeniczne wytwarzające ludzkie przeciwciała IgG2 lub IgG4 (Xenomice, opisane w Mendez i wsp.. Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) były hiperimmunizowane dootrzewnowo, przez poduszeczkę tylnej łapy lub podskórnie 20 μg ludzkiego trkC-IgG (Shelton i wsp., J. Neurosci. 15: 477-491 [1995]) w adiuwancie Frieunda lub Ribi, jak opisano w Mendez i wsp. (jak wyżej). Komórki śledziony z uodpornionych myszy były poddawane fuzji z komórkami szpiczaka (X63.Ag8.653, ATCC Rockville, MD). W sumie przeprowadzono 33 fuzje przy użyciu 253 myszy Xenomice oraz 35 myszy Balb/C typu dzikiego. Płytki (w sumie 21734 studzienki) były przeszukiwane początkowo przy użyciu bezpośredniego testu ELISA z użyciem trkC-IgG. W wyniku przeszukania testem ELISA wykryto 684 hybrydomy trkC dodatnie, z których wszystkie poddano następnie ocenie pod kątem aktywności agonistycznej wobec trkC w teście aktywacji receptora typu kinazy (KIRA). Test KIRA pozwolił na wykrycie 14 hybrydom pochodzących z myszy transgenicznych oraz 22 hybrydom pochodzących z myszy Balb/C typu dzikiego wydzielających agonistyczne przeciwciała anty-trkC. Hybrydomy te zostały podklonowane przez ograniczające rozcieńczanie, przetestowane ponownie w celu potwierdzenia aktywności agonistycznej i zostały użyte do wywołania wodobrzusza poprzez nastrzyknięcie myszy Balb/C traktowanych Pristane lub myszy „nagich (Hongo i wsp., Hybridoma 14: 253-260 [1995]). Przeciwciała monoklonalne obecne w wodobrzuszu zostały oczyszczone poprzez chromatografię powinowactwa z wykorzystaniem białka A (Hongo i wsp., jak wyżej). Wydajność swoistych fuzji (liczba wyników dodatnich/liczba przeszukanych studzienek) wynosiła 3% zarówno dla fuzji uzyskanych przy użyciu komórek pochodzących z myszy transgenicznych, jak i z myszy Balb/C typu dzikiego. Częstość występowania agonistycznych przeciwciał monoklonalnych (liczba agonistów / liczba hybrydom trkC pozytywnych w teście ELISA) wynosiła odpowiednio 3% i 8% dla fuzji uzyskanych przy użyciu komórek pochodzących z myszy Xenomice i z myszy Balb/C typu dzikiego. Izotypy mysich przeciwciał monoklonalnych zostały określone przy pomocy GIBCO BRL dipstick lub zestawu do izotypowania Zymed mouse-typer isotyping kit, zgodnie ze wskazówkami producenta. Myszy transgeniczne należały do szczepu IgG2 lub IgG4 i produkowały przeciwciała odpowiedniego izotypu. Tabela 1 prezentuje izotypy różnych ludzkich i mysich monoklonalnych przeciwciał anty-trkC. W sumie wykryto 8 ludzkich przeciwciał IgG2, 6 ludzkich przeciwciał IgG4, 7 mysich przeciwciał IgG1, 10 mysich przeciwciał IgG2a i 5 mysich przeciwciał IgG2b. Przeciwciała monoklonalne o najsilniejszej aktywności agonistycznej (zaznaczone gwiazdką w Tabeli 2), jak to określono w teście KIRA, zostały wybrane do dogłębnej charakteryzacji.

PL 208 113 B1

T a b e l a 2

Ludzkie przeciwciała monoklonalne (w sumie 14)

Izotyp IgG2 (8 przeciwciał)	Izotyp IgG4 (6 przeciwciał)
2.5.1*	4.8
6.1.2*	2337
6.4.1*	2338
2342	2339
2343	2348
2344*	2349*
2345*
2346

Mysie przeciwciała monoklonalne (w sumie 22)

IgG-i	IgG2a	IgG2b	igG3
(7)	(10)	(5)
2249	2248*	2252
2250*	2272	2273
2253*	2251	2277
2254	2255	2279
2256*	2274	2280
2257	2275
2260	2276
	2278
	2281
	2282

Określanie aktywności agonistycznej a. Test KIRA

W celu określenia aktywności agonistycznej przeciwciał monoklonalnych anty-trkC właściwej dla NT-3 stosowano dwa testy biochemiczne. Test aktywacji receptora typu kinazy (KIRA), który został przedyskutowany bardziej szczegółowo powyżej, mierzy fosforylację tyrozyny w trkC w transfekowanych komórkach w odpowiedzi na stymulację przy pomocy ligandu, takiego jak NT-3 lub agonistyczne przeciwciało monoklonalne (Sadick i wsp., Exp. Cell Res. 234: 354-361 [1997]). Przeciwciała monoklonalne były rozcieńczane do stężenia 27 μg/ml w buforze stymulacyjnym KIRA (F12/DMEM 50:50, zawierający 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA; Intergen Co., Purchase, New York, Stany Zjednoczone) oraz 25 mM Hepes, sterylizowany przy użyciu filtrów 0,2 μm). Przeciwciała monoklonalne były dalej rozcieńczane seryjnie w stosunku 1:3 (w sumie 8 rozcieńczeń; stężenia w zakresie 0,01-180 nM) w pożywce stymulacyjnej. Komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) stabilnie stransfekowane przy użyciu trkC w fuzji z 26-aminokwasowym polipeptydem znacznikowym pochodzącym z glikoproteiny D (gD) wirusa opryszczki (HSV) były wysiewane (5 x 10⁴ komórek/studzienkę) i hodowane w 96-studzienkowych płytkach do hodowli komórkowych. Komórki te były następnie stymulowane przy pomocy NT-3 (jako kontroli pozytywnej) albo różnych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC, przy zastosowaniu seryjnych rozcieńczeń 0,1; 1,56; 3,13; 6,25; 12,5; 25; 50 oraz 100 ng/ml. Wszystkie rozcieńczenia testowano w dwóch powtórzeniach przez 6 godzin. Test był prowadzony zasadniczo tak, jak to opisano w Sadick i wsp. (jak wyżej). W skrócie, komórki były poddawane lizie przy pomocy detergentu Triton X-100, a trkC obecne w lizacie były wyłapywane w teście ELISA przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko epitopowi gD, natomiast ufosforylowane trkC były wykrywane i analizowane ilościowo przy użyciu przeciwciał antyfosfotyrozynowych sprzężonych odpowiednio z enzymem. Prze34

PL 208 113 B1 ciwciało monoklonalne nie skierowane przeciwko trkC (ludzkie przeciwciało IgG2 anty-IL8 pochodzące z myszy Xenomice lub mysie przeciwciał o monoklonalne IgG1 anty-gp120) był o stosowane jako kontrola negatywna. Jak pokazano na Fig. 1 (A oraz B), wszystkie wybrane przeciwciała monoklonalne anty-trkC mogą naśladować aktywność NT-3 o tyle, że mogą one stymulować fosforylację tyrozyny receptora trkC. Ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-trkC (Fig. 1A) wykazywały silniejszą aktywność agonistyczną niż mysie monoklonalne przeciwciała anty-trkC (Fig. 1B). Dla przykładu, najlepsze ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-trkC ma 10-krotnie większą siłę oddziaływania niż najlepsze mysie monoklonalne przeciwciało anty-trkC. Ponadto, ludzkie przeciwciała monoklonalne były prawie tak wydajne, jak NT-3, zwłaszcza w niższym zakresie stężeń.

b. Test rozrostu neurytów w PC12

Innym testem stosowanym do określania aktywności NT-3 monoklonalnych przeciwciał anty-trkC, naśladującej działanie NT-3, był test rozrostu neurytów w PC12. Test ten mierzy procesy rozrostu neurytów w szczurzych zapalnych komórkach cytochromowych (PC12) w odpowiedzi na stymulację przy pomocy odpowiedniego ligandu. Komórki te wyrażają endogenny trkA, dlatego też są wrażliwe na NGF. Nie wyrażają one jednak endogennego trkC, w związku z czym poddawane są transfekcji przy pomocy konstruktu ekspresyjnego trkC w celu wywołania odpowiedzi na NT-3 lub jej agonistów. Komórki PC12 były transfekowane przy pomocy ludzkiego trkC pełnej długości i wysiewane do 96-studzienkowych płytek do hodowli komórkowych (1000 komórek/studzienkę) (Urfer i wsp., Biochem. 36: 4775-4781 [1997]; Tsoulfas i wsp.. Neuron 10: 975-990 [1993]). Trzy dni po transfekcji, dodawano w trzech powtórzeniach monoklonalne przeciwciała anty-trkC (stężenia w zakresie 0,0002 do 2,7 nM) i kontynuowano inkubację przez dodatkowe 3 dni w 37°C. Następnie komórki poddawano analizie przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym i liczono komórki z neurytami, których długość przekraczała 2-krotnie średnicę komórki. Zarówno ludzkie, jak i mysie monoklonalne przeciwciała anty-trkC mogły stymulować rozrost neurytów w komórkach PC12, jak pokazano na Fig. 1C oraz D. Ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-trkC (Fig. 1C) wykazywały znacznie silniejszą aktywność niż mysie monoklonalne przeciwciała anty-trkC (Fig. 1D), potwierdzając w ten sposób wyniki otrzymane w teście KIRA. Ponadto, zgodnie z wynikami testu KIRA, ludzkie monoklonalne przeciwciała anty-trkC powodowały w przybliżeniu podobną stymulację, jak uzyskiwano z użyciem NT-3. Wyniki uzyskane przy pomocy dwóch testów biochemicznych opisanych powyżej stanowią dowód na zdolność monoklonalnych przeciwciał antytrkC do naśladowania aktywności NT-3, naturalnego ligandu receptora trkC.

Agonistyczna aktywność przeciwciał monoklonalnych została uszeregowana według maksymalnej indukcji fosforylacji tyrozyny i obliczonego EC50 krzywych fosforylacji w teście KIRA i teście rozrostu neurytów w PC12. Tabela 3 podsumowuje charakterystykę różnych monoklonalnych przeciwciał anty-trkC.

T a b e l a 3

ID MAb	Izotyp	Agonistyczna aktywność KIRA/PC12	Wiązanie szczurzego trkC	Filtr po reakcji immunologicznej NR/Red	Powinowactwo Kd (nM)
Ludzkie MAb				NR Red.
2.5.1	G2	(+++/+++)	NIE	+ + + +	12
6.1.2	G2	(++++/++++)	NIE	+ +	12,5
6.4.1	G2	(++++/++++)	TAK	+ + +	12
2344	G2	(+++/+++)	NIE	+ + +	19
2345	G2	(++++/++++)	NIE	+ + + +	12,1
2349	G4	(++++/++++)	NIE	+ + +	23
Mysie MAb
2248	G2a	(+/+)	NIE	+ + + -	5,9
2250	G1	(++/++)	NIE	+ + ++	8,7
2253	G1	(++/+)	NIE	+ + ++	42
2256	G1	(+/+)	TAK	+ + +	62

PL 208 113 B1

Testowanie swoistości przeciwciał anty-trkC

Swoistość przeciwciał monoklonalnych anty-trkC testowano przy zastosowaniu bezpośredniego testu ELISA. Płytki do mikromiareczkowania opłaszczano przez noc konstruktem immunoadhezynowym receptora trkA-IgG, trkB-IgG lub trkC-IgG jako antygenów wyłapujących (opisane w Shelton i wsp., J. Neurosci. 15: 477-491 [1995]) przy uż yciu 100 μ l roztworu 1 μ l/ml rozcień czonego w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,5. CD4-IgG (Capon i wsp.. Nature 337: 525-531 [1989]) użyto zamiast antygenu wyłapującego jako kontrolę negatywną. Opłaszczone płytki inkubowano przez 1 godz.

w temperaturze pokojowej z różnymi stężeniami przeciwciał monoklonalnych anty-trkC (100 μΐ 0,01 do 1 μ^^ rozcieńczonych w PBS zawierającym 0,5% BSA i 0,05% Tween 20.

Po przemyciu w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych przeciwciał, dodawano odpowiedni koniugat HRP (ludzkie monoklonalne przeciwciała:kozie anty-ludzkie κ-HRP rozcieńczone 1:5000; mysie monoklonalne przeciwciała:kozie anty-mysie IgG (Fc)-HRP rozcieńczone 1:5000) i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki następnie przemywano, wywoływano i sczytywano jak wcześniej opisano (Hongo i wsp., Hybridoma 14: 253-260 [1995]). Fig. 2 pokazuje reprezentatywny przykład z użyciem ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 6.1.2. Wiązanie było wysoce swoiste wobec trkC i nie obserwowano żadnej znaczącej reakcji krzyżowej ani z trkA ani z trkB. Podobnie, inne ludzkie i mysie przeciwciała monoklonalne anty-trkC wykazywały swoiste rozpoznawanie trkC.

Wiązanie różnych agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC z ludzkim trkC i szczurzym trkC porównywano przy zastosowaniu bezpośredniego testu ELISA zasadniczo jak opisano powyżej z tą różnicą, że użytym antygenem wyłapującym dla ludzkiego trkC był trkC-gD zamiast trkC-IgG. Wyniki pokazane na Fig. 3 pokazują, że wśród ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-trkC jedynie 6.4.1 znacząco rozpoznawały szczurzy trkC, pozostałe były swoiste wobec ludzkiego trkC. Podobnie, wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, jedynie 2256 rozpoznawały szczurzy trkC w znaczącym stopniu, podczas gdy inne wykazywały swoiste rozpoznawanie jedynie wobec ludzkiego trkC.

Badania powinowactwa

Powinowactwa agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC ustalano przy użyciu systemu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) BIAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway,

N. J.). Mikromacierze biosensorowe CM5 aktywowano chlorowodorkiem N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidowym (EDC) i N-hydroksysukcynimidem (NHS) zgodnie z instrukcjami dostawcy. W pierwszej serii doświadczeń nad wiązaniem, antygen trkC ze znacznikiem gD, rozcieńczano w 10 mM buforze-octanie sodowym (pH 4,8) i wstrzykiwano do aktywowanej mikromacierzy w stężeniu

O, 09 mg/ml. Stosując różne czasy ekspozycji, uzyskano cztery zakresy gęstości antygenu: 1400017000 jednostek odpowiedzi (ang. response units, RU), 7000-9000 RU, 2000-3000 RU i 400-600 RU. Mikromacierz blokowano etanolaminą.

W pierwszej serii pomiarów kinetycznych, przeciwciała anty-trkC (IgG) rozcieńczano w buforze do reakcji (PBS zawierający 0,05% Tween-20 i 0,01% azydek sodu) i 0,03 ml (667 nM) wstrzykiwano do macierzy biosensorowej w 25°C przy szybkości przepływu 0,01 ml/min. Regenerację uzyskiwano poprzez 30 sek. puls 10 mM HCl, a następnie 1 min. puls 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 i dwa etapy przemywania.

W drugiej serii doświadczeń, IgG (0,1 mg/ml w 10 mM octanie sodowym, pH 4,8) unieruchomiono jak opisano powyżej, z tą różnicą, że gęstość przeciwciała była ograniczona do 1000-2000 RU. Dwukrotne seryjne rozcieńczenia gD-trkC w zakresie 3, 7 M do 29 nM wstrzykiwano następnie do macierzy biosensorowej w celu pomiarów kinetycznych.

Faza dysocjacji każdej krzywej kinetycznej pasowała do pojedynczej wykładniczej szybkości dysocjacji (koff) i wartości te użyto do obliczenia szybkości asocjacji (kon) z fazy wstrzykiwania, stosując prosty model wiązania 1:1 Langmuir (Lofas & Johnsson, 1990).

Stałe równowagi dysocjacji, Kd, z pomiarów SPR obliczano jako stosunek koff/kon.

Powinowactwa przeciwciał anty-trkC dla gD-trkC mierzono w doświadczeniach kinetycznych SPR z unieruchomionym albo antygenem albo przeciwciałem. Widoczne powinowactwa określone w doświadczeniach z zastosowaniem niskich gęstości unieruchomionego antygenu (0,4 do 0.6 ng/mm²) były generalnie zgodne z tymi ustalonymi w doświadczeniach z unieruchomioną IgG (patrz Tabela 2). Jednakże, przy wyższych gęstościach unieruchomionego gD-trkC, widoczne powinowactwo wiązania przeciwciała stawało się stopniowo coraz bardziej ścisłe aż do 10 razy, prawdopodobnie z powodu efektu zachłanności (ang. avidity) wiązania dwuwartościowego IgG (dane nie pokazane). W niektórych

PL 208 113 B1 przypadkach nie można było wykryć wiązania, kiedy do unieruchomionej IgG wstrzykiwany był trkC. Mogło tak być ponieważ unieruchomienie IgG prowadziło do przestrzennego blokowania miejsca wiązania antygenu. We wszystkich testowanych warunkach, przeciwciało 2248 miało najwyższe widoczne powinowactwo (Kd= 5,6 do 8,5 nM) ze wszystkich testowanych przeciwciał.

T a b e l a 4

Powinowactwo wiązania ustalone poprzez SPR. Wyniki są pokazane dla wiązania IgG do unieruchomionego gD-trkC (400-600 5 RU) i dla wiązania gD-trkC do unieruchomionych IgG (1000-3000 RU).

NDB= brak wykrywalnego wiązania.

	Kd (nM)
Przeciwciało (IgG)	Unieruchomiony gD-trkC	Unieruchomiona IgG
2248	5,9	8,5
2250	8,7	28
2253	42	51
2256	62	300
2344	19	NDB
2345	12	NDB
2349	23	NDB
6.4.1	12	28
6.1.2	13	16
2.5.1	12	NDB

Test współzawodnictwa ELISA

Test współzawodnictwa ELISA zastosowano w celu uzyskania wstępnych informacji na temat różnych grup, do których przeciwciała te należą w zależności od epitopu(ów) na trkC, które rozpoznają. W teście tym, trkC-gD (1 μg/ml) użyto jako antygen wyłapujący do opłaszczenia płytki do mikromiareczkowania. Swoiste biotynylowane przeciwciało monoklonalne anty-trkC (1 μg/ml) dodano do opłaszczonej płytki samo albo w obecności innego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC, które było niewyznakowane i użyte w nadmiarze (50 μg/ml) w porównaniu do przeciwciała wyznakowanego. Jeżeli przeciwciało biotynylowane i przeciwciało niewyznakowane obydwa rozpoznają ten sam albo zachodzące na siebie epitopy, będą współzawodniczyć o wiązanie z unieruchomionym trkC, prowadząc do zmniejszenia wiązania przeciwciała wyznakowanego. Jeżeli rozpoznają różne i nie zachodzące na siebie epitopy, nie będzie między nimi współzawodnictwa i nie będzie wpływu na wiązanie wyznakowanego przeciwciała do unieruchomionego trkC. Niewyznakowane ludzką IgG2 i mysią IgG użyto jako kontrolę negatywną. Reprezentatywne dane na Fig. 4 pokazują, że wszystkie przeciwciała monoklonalne anty-trkC z wyjątkiem mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC 2248, współzawodniczą z wyznakowanym ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-trkC 6.1.2 o wiązanie z unieruchomionym trkC, co sugeruje, że mysie przeciwciało monoklonalne 2248 rozpoznaje epitop na trkC, który jest różny od epitopu (ów) rozpoznawanych przez wszystkie inne przeciwciała anty-trkC.

Co interesujące do odnotowania, to że kiedy niewyznakowane mysie przeciwciało monoklonalne 2248 jest związane najpierw z unieruchomionym trkC, żadne inne (biotynylowane) przeciwciała nie mają dostępu do ich miejsca wiązania, co sugeruje, że nawet jeżeli epitopy są odmienne, może odgrywać rolę zawada przestrzenna. Takie porównanie parami daje wartościową informację i pomaga w zaklasyfikowaniu przeciwciał skierowanych przeciw temu samemu antygenowi do różnych grup w oparciu o rozpoznawanie epitopów. Podsumowanie takiego porównania jest pokazane na Fig. 5. Wyniki wskazują, że przeciwciała można podzielić na dwie odrębne grupy: Grupa 1 obejmuje wszystkie przeciwciała monoklonalne z wyjątkiem 2248, podczas gdy Grupa 2 składa się z 2248.

Mapowanie epitopów

Mapowanie epitopów przy użyciu mutantów z zamienionymi domenami

Dalsze mapowanie epitopów przeprowadzono z zastosowaniem chimerowego trkC, w którym różne domeny zastąpiono odpowiednimi domenami z trkA lub trkB. Podejście to było możliwe dzięki temu, że przeciwciała anty-trkC nie wykazują znaczącej reakcji krzyżowej z trkA ani trkB. ZastosowaPL 208 113 B1 nie takich mutantów z zamienionymi domenami ma wyraźną przewagę w stosunku do mutantów delecyjnych. Delecja domeny może zniszczyć strukturę drugorzędową białka, podczas gdy zastąpienie domeny odpowiednią domeną o podobnych rozmiarach i zasadniczo podobnej sekwencji aminokwasowej ze spokrewnionego białka w mutancie z zamienioną domeną prawdopodobnie zachowa strukturę drugorzędową. Domena zewnątrzkomórkowa receptorów trk składa się z 5 domen jak pokazano na Fig. 6A. D1 i D3 to domeny bogate w cysteinę, D2 to domena bogata w leucynę, a D4 i D5 to domeny typu immunoglobuliny. Wytworzono mutanty trkC z zamienionymi domenami zawierające podstawienia D1, D4 i D5 odpowiednimi domenami z trkB lub trkA (Urfer i wsp., EMBO J, 14: 2795-2805 [1995]). trkC typu dzikiego i trkA typu dzikiego zastosowano jako kontrole pozytywne i negatywne, odpowiednio. Mutanty trkC z zamienionymi domenami projektuje się zgodnie ze źródłem wymienianej domeny. Przykładowo, s1B ma domenę D1 z trkB, s4B ma domenę D4 z trkB, s5B ma domenę D5 z trkB, a s5A ma domenę D5 z trkA. Wszystkie mutanty są wyrażane jako immunoadhezyny, tj. połączone z IgG, i oczyszczone.

Wiązanie każdego z antagonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC do różnych mutantów z zamienionymi domenami oceniano poprzez ELISA. Fragment F(ab')2 z mysiej anty-ludzkiej IgG użyto do opłaszczenia płytek do mikromiareczkowania w celu wyłapania seryjnych rozcieńczeń (100 μg/ml do 2,4 ng/ml, 100 μl/studzienkę, jedna godzina w temperaturze pokojowej) immunoadhezyn (trkC-IgG, trkA-IgG i mutanty z zamienionymi domenami trkC jako immunoadhezyny). Do płytek zawierających unieruchomione immunoadhezyny dodawano niewyznakowane ludzkie albo biotynylowane mysie przeciwciała monoklonalne anty-trkC (100 μl na studzienkę; 1 μg/ml, jedna godzina w temperaturze pokojowej), przemywano w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych odczynników i inkubowano z kozimi przeciwciałami anty-ludzki κ K lub streptawidyną połączoną z HRP. Jak pokazano na Fig. 6B, wszystkie ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-trkC miały zdolność do rozpoznawania mutantów trkC z zamienionymi domenami D1 lub D4. Jednakże, zastąpienie domeny D5 odpowiednią domeną pochodzącą bądź z trkB bądź trkA niszczyła rozpoznawanie przez przeciwciała antytrkC. Stopień rozpoznawania był zmniejszony do takiego samego niskiego poziomu, jak obserwowany dla kontroli negatywnej, trkA. Wyniki sugerują, że wszystkie testowane ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-trkC rozpoznają epitop znajdujący się gdzieś w domenie D5.

Podobną analizę przeprowadzono z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi anty-trkC z tą różnicą, że użytym przeciwciałem drugorzędowym było kozie przeciwciało anty-mysi Fc IgG połączone z HRP. Tak jak w przypadku ludzkich przeciwciał anty-trkC zastąpienie domeny D5 niszczyło wiązanie do wszystkich testowanych mysich przeciwciał monoklonalnych anty-trkC (Fig. 6B). Dodatkowo, zastąpienie domeny D4 również niszczyło wiązanie mysiego przeciwciała monoklonalnego 2248 anty-trkC. Ludzkie, jak również mysie agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC wszystkie wydają się rozpoznawać epitop w domenie 5 z wyjątkiem mysiego przeciwciała 2248, które wydaje się rozpoznawać dodatkowo determinantę domenie 4. Wydaje się, że epitop 2248 może być epitopem liniowym zachodzącym na granicę miedzy domeną 4 i 5. Alternatywnie, przeciwciało 2248 może rozpoznawać strukturę drugorzędową utworzoną przez epitop nieciągły z determinantami pochodzącymi z obydwu domen, domeny 4 i domeny 5. Co interesujące, Urfer i wsp. (J. Biol Chem. 273: 5829-5840 [1998]) wcześniej ustalili istotną rolę domeny 5 w receptorze trkC dla przekazywania oddziaływania z NT-3. Ku zaskoczeniu, opisane tu przeciwciała wiążą się również z epitopem trkC, który w dużej mierze zachodzi za ten rozpoznawany przez NT-3. Jest to zaskakujące z powodu względnej wielkości i rozmiarów cząsteczek NT-3 i immunoglobulin. Prawdopodobny sposób działania tych aktywatorów to połączenie krzyżowe zewnątrzkomórkowych domen dwóch cząsteczek trkC w taki sposób, że zbliżają do siebie ich wewnątrzkomórkowe domeny kinazy tyrozynowej, dokonując krzyżowej fosforylacji i aktywując je.

Wykazano, że w homodimerowym NT-3, dwa obszary cząsteczki, które oddziałują z trkC są położone na diametralnie przeciwnych stronach cząsteczki, 180 stopni względem siebie. Odległość między tymi obszarami jest rzędu 16 A. Z drugiej strony dwa opisane tu miejsca oddziałujące z trkC w cząsteczkach immunoglobulin nie są położone przeciwlegle. Poza prezentowaniem domen wiążących trkC pod innym kątem niż NT-3, immunoglobuliny będą miały domeny wiążące trkC oddzielone od siebie na większą odległość niż w NT-3. Będzie ona różna w zależności od dokładnego kąta dwóch domen Fab, ale jest w zakresie od 50 A do 150 A. Trudno było przewidzieć, że dwa tak bardzo różne czynniki łączące krzyżowo jak NT-3 i agonistyczne Mabs będą działać jako agoniści po związaniu się z tym samym miejscem na trkC.

PL 208 113 B1

Mutageneza ukierunkowana

Podejście z ukierunkowaną mutagenezą zastosowano do określenia udziału wybranych poszczególnych reszt aminokwasowych domeny 5 w rozpoznawaniu przeciwciał anty-trkC. Fig. 7 pokazuje sekwencję aminokwasową domen 4 i 5 ludzkiego trkC. Wszystkie reszty z kropką mutagenizowano do alaniny z wyjątkiem reszt L284, L286 i E287 które zmieniono na E, H i K odpowiednio (Urfer i wsp., J. Biol. Chem. 273: 5829-5840 (1998]). W sumie dokonano 26 pojedynczych mutacji aminokwasowych i oceniano ich wpływ na wiązanie się z monoklonalnymi przeciwciałami anty-trkC. Wartości pokazane w Tabeli 5 reprezentują stosunek wiązania się z przeciwciałem anty-trkC mutanta vs trkC typu dzikiego. W celu zminimalizowania różnic i dostarczenia skutecznego porównania, dla każdego mutanta każdego przeciwciała ustalano wartości EC50 i dzielono przez wartości EC50 otrzymane dla trkC typu dzikiego.

T a b e l a 5

Mutant	NT-3*	2.5.1	6.1.2	6.4.1	2344	2345	2349	2248	2250	2253	2256	143
trkC
trkC	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
R275A	1,1
E280A	0,7
E283A	1,7
L284E	1,1	NB	NB	NB	NB	NB	NB	0,7	0,6	0,7	1,1	0,8
R285A	1,5	1,1	1,2	0,8	0,9	1,0	0,9	0,8	2,6	0,9	NB	0,4
L286H	1,2	0,6	1,3?	NB	0,9	0,5	0,6	0,6	0,4	0,4	0,6	0,6
E287K	27,3	NB	NB	NB	NB	NB	NB	0,6	0,8	0,7	0,7	0,6
E291A	1,0
R295A	11,6
R295A	11,6
Q309A	1,0
R312A	0,8
K315A	0,9
H318A	1,0	0,8	1,1	0,7	0,8	1,0	0,7	1,0	1,0	0,8	0,8	1
E320A	1,0
E324A	1,2
E329A	1,0
N335A	37,8	NB	NB	0,3	NB	NB	1,5	0,6	0,5	0,5	0,5	0,6
K336A	0,9
T338A	30,3
H339A	1,7
H339A	1,7
K350A	1,0
Q358A	1,2
K366A	0,9
E367A	1,2
D372A	1,2
E373A	1,1

PL 208 113 B1

Szare obszary wskazują, że oznaczone mutanty nie miały wyjściowo wpływu na wiązanie przeciwciała monoklonalnego, a zatem nie były ponownie testowane. Mutacje, które całkowicie kasowały wiązanie monoklonalnego przeciwciała są pokazane jako NB (ang. „no binding observed, nie obserwowano wiązania). Analiza wskazuje na główny udział reszt aminokwasowych L284, E287 i N335 w rozpoznawaniu trkC przez testowane agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC. Model kompleksu domeny 5 trkC z NT3 pokazuje pozycję tych reszt w bliskim kontakcie z CDR przeciwciała (Fig. 8). Model ten opiera się na strukturze krystalicznej kompleksu domeny 5 trkA z NGF. Dla dalszych szczegółów patrz, np. Urfer i wsp. J. Biol. Chem., (1998), jak wyżej lub Ultsch i wsp., J. Mol. Biol. 290: 149-159 (1999).

Klonowanie i sekwencjonowanie regionów zmiennych przeciwciał

W celu lepszego zrozumienia podstawy molekularnej oddziaływania między trkC i przeciwciałami monoklonalnymi anty-trkC, sklonowano sekwencje zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego agonistycznych przeciwciał i ustalono sekwencje DNA. Całkowity RNA izolowano z komórek hybrydom wytwarzających ludzkie i mysie przeciwciała anty-trkC przy użyciu zestawu do izolacji RNA ze Stratagene (La Jolla, CA). RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA stosując system SuperScript II (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) i specyficzne startery 3' w oparciu o sekwencje regionu zrębowego 4 pochodzące z odpowiedniej podgrupy łańcucha ciężkiego i lekkiego (Kabat i Wu, J. Immunol. 147: 1709-1719 [1991]). Następnie przeprowadzono amplifikację PCR przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA) w obecności 2,5 M DMSO z zastosowaniem specyficznych lewych starterów w oparciu o N-końcową sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego i lekkiego oraz tych samych starterów 3' które użyto do syntezy cDNA. Produkty PCR subklonowano do wektora F(ab)'2 zawierającego regiony stałe zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego (Carter i wsp., Bio/Technology 10: 163-167 [1992]). Pięć klonów dla każdej z nomen VH and VL sekwencjonowano i otrzymano sekwencję najwyższej zgodności.

Fig. 9 pokazuje wydedukowane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC (2250, SEK NR ID: 42; 2253, SEK NR ID: 43; 2256, SEK NR ID: 44; 6.1.2, SEK NR ID: 45; 6.4.1, SEK NR ID: 46; 2345, SEK NR ID: 47; i 2349, SEK NR ID: 48).

Wydedukowane sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC są pokazane na Fig. 10 (2250, SEK NR ID: 49; 2253, SEK NR ID: 50; 2256, SEK NR ID: 51; 6.1.2, SEK NR ID: 53; 6.4.1, SEK NR ID: 53; 2345, SEK NR ID: 54 oraz 2349, SEK NR ID: 55). Na obydwu. Fig. 9 i Fig. 10 regiony determinujące dopasowanie (ang. Complementarity Determining Regions, CDR) są zaznaczone jako CDR1, CDR2 i CDR3, a odpowiednie reszty aminokwasowe są zaznaczone tłustym drukiem. Fig. 11 zestawia sekwencje CDR łańcucha ciężkiego jak również łańcucha lekkiego różnych anty-trkC przeciwciał monoklonalnych łącznie z zaznaczeniem odpowiedniej rodziny zmiennej łańcucha ciężkiego i lekkiego do której należą.

W oparciu o ustalone sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC możliwe jest dostarczenie wzoru ogólnego dla kilku z tych regionów. Dla przeciwciał mysich CDR1 łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez wzór XaaWXaaXaaWVK (SEK NR ID: 37), gdzie Xaa w pozycji 1 to F albo Y, Xaa w pozycji 3 to I albo M and Xaa w pozycji 4 to E albo H. CDR2 mysiego łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez wzór EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa (SEK NR ID: 38), gdzie Xaa w pozycji 3 to L albo Y, Xaa w pozycji 5 to G albo S, Xaa w pozycji 6 to S albo N, Xaa w pozycji 7 to D albo G, Xaa w pozycji 8 to N albo R a Xaa w pozycji 17 to G albo S. CDR3 mysiego łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez wzór KNRNYYGNYVV (SEK NR ID: 12) albo KYYYGNSYRSWYFDV (SEK NR ID: 13). Dla przeciwciał ludzkich, CDR1 łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez wzór XaaXaaXaaYYWXaa (SEK NR ID: 39), gdzie Xaa w pozycji 1 to S albo I, Xaa w pozycji 2 to G albo S i Xaa w pozycji 3 to G, T albo Y a Xaa w pozycji 7 to S albo N. CDR2 ludzkiego łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez wzór XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS SEK NR ID: 40), gdzie Xaa w pozycji 1 to Y albo R, Xaa w pozycji 3 to Y albo F, Xaa w pozycji 4 to Y albo T, Xaa w pozycji 8 to S albo R a Xaa w pozycji 10 to N albo Y. CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego może być reprezentowany przez DRDYDSTGDYYSYYGMDV (SEK NR ID: 14), DGGYSNPFD (SEK NR ID: 15) albo wzór ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV (SEK NR ID: 41) gdzie Xaa w pozycji 8 to A albo T a Xaa w pozycji 16 to D albo A.

Wydedukowaną sekwencję aminokwasową regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego potwierdzono poprzez ustalenie N-końcowej sekwencji peptydowej tych przeciwciał. Elektrotransfer na błony Millipore Immobilon-PSQ przeprowadzano przez 1 godz. przy stałym natężeniu prądu 250 mA

PL 208 113 B1 w urządzeniu do transferu BioRad Trans-Blot transfer cell (Matsudaira, J. Biol Chem. 262: 10035-10038 [1987]). Błonę PVDF barwiono 0,1% Coomassie Blue R-250 w 50% metanolu, 0,5 min. i odbarwiano przez 2-3 min. 10% kwasem octowym w 50% metanolu. Błonę starannie płukano wodą i umożliwiano wyschnięcie przed przechowywaniem w 20°C. Automatyczne sekwencjonowanie białka przeprowadzano w sekwenatorze Perkin-Elmer model 494A (Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) wyposażonym w równoczesny analizator PTH. Białka poddane elektrotransferowi na błonę PVDF sekwencjonowano w 6 mm szklanym mikropojemniku. Piki poddano integracji przy zastosowaniu oprogramowania Justice Innovation z użyciem interfejsów Nelson Analytical 760. Interpretację sekwencji dokonano na DEC Alpha (Henzel i wsp., J. Chromatography 404: 41-52 [1987]). Tabela 6 podsumowuje klasyfikację ludzkich i mysich agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC w oparciu o ich N-końcowe sekwencje.

T a b e l a 6

Ludzkie agonistyczne mAb anty-trkC	Łańcuch ciężki	Łańcuch lekki
6.1.2	Podgrupa II	Kappa I
6.4.1	Podgrupa II	Kappa I
2345	Podgrupa II	Kappa III
2349	Podgrupa II	Kappa III
2.51	Podgrupa II	Kappa I
234	Podgrupa II	Kappa I
Mysie agonistyczne mAb anty-trkC
2248	Podgrupa IIA	Kappa I
2250	Podgrupa IIA	Kappa I
2253	Podgrupa IIA	Kappa IV
2256	Podgrupa IIA	KappaIII

P r z y k ł ad 2

Wpływ agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC na neuropatie w doświadczalnych modelach zwierzęcych.

Główne zastosowanie agonistów NT-3 to leczenie i/lub zapobieganie neuropatiom obwodowym. Wiadomo, że duże włókna mielinowanych neuronów czuciowych, które uczestniczą w pośredniczeniu w propriocepcji i odczuwaniu wibracji wyrażają trkC, który działa jako receptor dla NT-3 o wysokim powinowactwie. Neuropatie z udziałem tych dużych włókien są powszechne u cukrzyków i są także indukowane w odpowiedzi na pewne czynniki chemioterapeutyczne, a w szczególności cisplatynę i pirydoksynę. Pokazano skuteczność NT-3 w modelach zwierzęcych doświadczalnej neuropatii cukrzycowej i neuropatii indukowanej cisplastyną. Jednakże, w stosowaniu NT-3 poważnie przeszkadza jej słaba biodostępność jak pokazano w modelu u gryzoni. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych anty-trkC jako agonistów NT-3 oferuje liczne korzyści i omija wiele potencjalnych problemów związanych z zastosowaniem NT-3.

Czas półtrwania in vivo agonistycznych przeciwciał monoklonalnych anty-trkC ustalono poprzez wstrzyknięcie dożylnie albo podskórnie zwierzętom doświadczalnym. Na Fig. 12 pokazane są poziomy przeciwciała monoklonalnego 2256 w różnych czasach po wstrzyknięciu dożylnym (IV) 1 mg/kg lub podskórnym (subQ) 5 mg/kg szczurom. Poziomy surowicy ustalono poprzez zastosowanie testu KIRA dla zmierzenia ilości w pełni funkcjonalnego przeciwciała 2256 poprzez jego zdolność do zwiększenia autofosforylacji tyrozynowej trkC. Dane te wskazują, że przeciwciało monoklonalne 2256 u szczurów ma okres półtrwania 9 dni a biodostępność 69% po podaniu podskórnym. Wartości te są zgodne z tymi otrzymanymi dla innych przeciwciał i są w wyraźnie inne od otrzymanych dla NT3. Na Fig. 12 pokazane są również dane po wstrzyknięciu NT-3 w tych samych dawkach i tą samą drogą co Mab 2256 (1 mg/kg, IV; 5 mg/kg subQ). Dane te wskazują na okres półtrwania w surowicy rzędu 4-5 minut dla NT-3 i dostępność podskórną 7%. Dane te wskazują, że przeciwciała stanowią znaczące ulepszenie w stosunku do NT-3 z punktu widzenia bardzo ważnych właściwości biodostępności i okresu półtrwania w surowicy.

PL 208 113 B1

Pokazano w dwóch modelach zwierzęcych neuropatii czuciowej dużych włókien, że NT-3 może chronić albo odwracać efekty uszkodzenia chemicznego. Pokazano, że wysokie dawki NT3 mogą chronić duże włókna neuronów czuciowych przed toksycznym efektem wysokich pirydoksyny i pokazano, że niższe dawki NT3 odwracają efekty podawania cisplatyny. Ponieważ może być wiele różnic w rozmieszczeniu tkankowym NT-3 i opisanych tu agonistycznych Mab waż ne jest ustalenie, czy aktywność Mab in vitro przekłada się na skuteczność w modelach zwierzęcych.

W celu stworzenia modelu zwierzęcego neuropatii indukowanej cisplatyną, dorosłym szczurom podawano dawkę 1 mg/kg cisplatyny dwa razy w tygodniu przez szesnaście tygodni dootrzewnowo (IP). W tym momencie szczury dzielono na cztery grupy. Wszystkie cztery grupy nadal otrzymywały cisplatynę dwa razy w tygodniu. Poza kontynuacją cisplatyny, jedna grupa otrzymywała NT-3 w dawce 1 mg/kg trzy razy w tygodniu, jedna grupa otrzymywał a Mab 2256 w dawce 1 mg/kg raz w tygodniu, jedna grupa otrzymywała Mab 6.4.1 w dawce 1 mg/kg raz w tygodniu, a jedna grupa otrzymywała sól fizjologiczną w dawce 1 mg/kg trzy razy w tygodniu. Dawki NT-3 były podawane podskórnie, podczas gdy Mab i sól fizjologiczna były podawane IV. Ten tryb podawania był kontynuowany przez dodatkowe cztery tygodnie, przez całe dwadzieścia tygodni podawania cisplatyny.

Funkcję neuronów czuciowych z dużymi włóknami badano u tych zwierząt elektrofizjologicznie, poprzez zastosowanie odczytu fali H (Gao i wsp., Ann. Neurol. 38 (1): 30-7 [1995]). Jak można zobaczyć z danych pokazanych na Fig. 13, prędkość przewodzenia czuciowego była bardzo niska u zwierząt traktowanych samą cisplatyną i solą fizjologiczną. Traktowanie NT-3 trzy razy w tygodniu powodowało zwiększenie tej obniżonej prędkości przewodzenia, podobnie jak traktowanie albo Mab 2256 albo Mab 6.4.1 raz w tygodniu. Poziom polepszenia widoczny dla przeciwciał monoklonalnych stosowanych raz w tygodniu był co najmniej tak duż y jak widoczny przy traktowaniu NT-3 trzy razy w tygodniu.

Wiadomo również, że pirydoksyna indukuje neuropatię czuciową, która uszkadza przede wszystkim dużą mielinowaną podpopulację neuronów czuciowych (Helgren i wsp., J. Neurosci. 17 (1):372-82 [1997]). Pokazano, że wysokie dawki NT3 blokują rozwój tej neuropatii (Helgren i wsp., jak wyżej). Traktowanie zwierząt różnymi dawkami pirydoksyny (400 mg/kg lub 600 mg/kg codziennie, IP) przez dwa tygodnie powodowało uszkodzenie dużych neuronów DRG. Uszkodzenie to można było wykryć poprzez wzrost ekspresji kilku białek, dla których wiadomo, że ulegają ekspresji bądź preferencyjnie bądź wyłącznie przez duże neurony w DRG. Poziom ekspresji tych markerów był testowany poprzez pomiar poziomu kodujących ich mRNA poprzez użycie techniki TAQMAN RT-PCR.

Taqman RT-PCR dla agonistycznych efektów trkC:

A. Sondy i startery

NFL

F-CAGCAGAACAAGGTCCTGGAA 21MER (SEK NR ID: 72)

R-AGCGGGAAGGCTCTGAGTG 19MER (SEK NR ID: 73)

P-AGCTGTTGGTGCTGCGCCAGAA 22MER (SEK NR ID: 74)

NSE

F-TCCATTGAAGACCCATTCGAC 21MER (SEK NR ID: 75)

R-GCCGACATTGGCTGTGAAC 19MER (SEK NR ID: 76)

P-AGGATGACTGGGCAGCTTGGTCCA 24MER (SEK NR ID: 77)

TRKC

F-CAGCCCACTGCACCATATCA 20MER (SEK NR ID: 78)

R-CTGTATCCGGCCCAGCAT 18MER (SEK NR ID: 79)

P-CCATGGCATCACTACACCTTCATCGCT 27MER (SEK NR ID: 80)

CALRET

F-TGGGAAAATTGAGATGGCAGA 21MER (SEK NR ID: 81)

R-GCTGCCTGAAGCACAAAAGG 20MER (SEK NR ID: 82)

P-CGCAGATCCTGCCAACCGAAGAGA 24MER (SEK NR ID: 83)

PARVALB.

F-GACACCACTCTTCTGGAAAATGC 23MER (SEK NR ID: 84)

R-TTGCCAAACCAACACCTACCA 21MER (SEK NR ID: 85)

P-ATCGGACACCACCTGTAGGGAGGACC 26MER (SEK NR ID: 86)

GAPDH

F-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGT 21MER (SEK NR ID: 87)

R-AATTTGCCGTGAGTGGAGTC 20MER (SEK NR ID: 88)

P-CCATCAACGACCCCTTCATTGACCTC 26MER (SEK NR ID: 89)

PL 208 113 B1

Startery i sondy zaprojektowano przy użyciu Primer Express, (ABI-Perkin-Elmer). Wskazówki do wyboru sondy znajdują się w Williams i Tucker (1999) PCR applications, str. 365-75 (Academic Press).

Wytwarzanie i ocena ilościowa całkowitego RNA.

L4 i L5 wycięto ze szczurów po perfuzji solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Lewą i prawą stronę izolowano w oddzielnych probówkach. Dla całkowitego RNA używanego do krzywych standardowych, DRG wycinano ze szczurów kontrolnych. Całkowity RNA izolowano przy użyciu mini kolumn Qiagen Rneasy. Tkankę homogenizowano zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowity RNA oceniano ilościowo przy użyciu zestawu Ribogreen Quantitaion Kit (Molecular Probes) i zgodnie z instrukcjami producentów.

C. RT-PCR

Dwadzieścia pięć nanogramów całkowitego RNA użyto na 50 μl mieszaniny reakcyjnej, z wyjątkiem reakcji do krzywej standardowej, gdzie użyto 500, 250, 25 lub 2,5 nanogramów na reakcję. Każda reakcja zawierała 25 pmol każdego ze starterów oligonukleotydowych, 0,2 mM każdego dNTP, 100 nM wyznakowanej fluorescencyjnie sondy, 1X buforu do RT-PCR (PE biosystems), 2,0 mM MgCl2, 20 jedn. Inhibitora RNAzy, 12,5 odwrotnej transkryptazy MuLV (RT, PE biosystems) i 2,5 jedn. Polimerazy Amplitaq Gold (PE biosystems). Odwrotną transkrypcję przeprowadzano przez 30 min. w 48 stopniach C, a następnie 95 stopniach C przez 10 min. dla aktywacji Amplitaq Gold i inaktywacji RT, a następnie PCR; 40 cykli 95 stopni C przez 15 sek. i 60 stopni C przez jedną i pół minuty.

D. Ocena ekspresji genu

Kontrolny RNA użyto do wytworzenia krzywych standardowych dla genów metabolizmu podstawowego i genów będących przedmiotem zainteresowania przy każdym pomiarze Taqman. Krzywą standardową otrzymaną poprzez naniesienie na wykres wartości cyklu progowego (ang. treshold cycle, Ct) otrzymanych z pomiarów Taqman versus log ilości dodanego całkowitego kontrolnego RNA. Otrzymane w rezultacie liniowe równanie rozwiązano dla wartości log RNA. Podanie eksperymentalnej wartości Ct daje log eksperymentalnej wartości ekspresji genu. Dziesięć podniesione do potęgi tej wartości daje eksperymentalną ekspresję genu w nanogramach.

Jak można zobaczyć na Fig. 14, traktowanie pirydoksyną przez dwa tygodnie powodowało zależne od dawki zmniejszenie ekspresji neurowłókna łańcucha lekkiego (neurofilament light chain, NFL), enolazy specyficznej dla neuronu (enolase neuron specific, NSE), trkC i kalretyniny. Zarówno zależność od dawki, jak i wielkość tych spadków różni się od markera do markera, wskazując na różnicową czułość tych białek jako markerów uszkodzenia neuronów.

Na Fig. 15 pokazane są wyniki traktowania zwierząt dwiema dawkami Mab 2256 razem z niską dawką (400 mg/kg dzień) pirydoksyny. NFL i NSE pokazują znaczący spadek ekspresji na tym poziomie traktowania pirydoksyną. Jednoczesne traktowanie zwierząt 5 mg/kg Mab 2256 (subQ co tydzień) całkowicie blokowało ten spadek ekspresji. Dawka Mab 2256 1 mg/kg nie miała widocznego wpływu na ekspresję tych białek. To traktowanie niskimi dawkami pirydoksyny nie ma znaczącego wpływu ani na ekspresję trkC ani kalretyniny, ale traktowanie 5 mg/kg Mab 2256 zwiększa ekspresję trkC ponad poziom kontrolny.

Kiedy zwierzęta traktowano wyższymi dawkami pirydoksyny 600 mg/kg codziennie, ekspresja NFL, NSE i kalretyniny spadała do bardzo niskich poziomów, podczas gdy ekspresja trkC spadała do około 50% wartości kontrolnych (Fig. 16). Jednoczesne traktowanie Mab 2256 w ilości 1 mg/kg lub 5 mg/kg znacząco, ale nie całkowicie blokowało spadek ekspresji widoczny dla trkC i kalretyniny. Istnieje lekka tendencja w stronę ochrony widoczna dla ekspresji NFL i NSE u zwierząt traktowanych Mab 2256, ale nie było to znaczące statystycznie. A zatem, stosując liczne markery biochemiczne uszkodzenia dużych neuronów czuciowych, widać, że Mab 2256 ma zdolność łagodzenia toksyczności traktowania pirydoksyną.

W celu zbadania efektów elektrofizjolgicznych i behawioralnych neuropatii pirydoksynowej, szczury traktowano poprzez dwukrotne wstrzyknięcie 400 mg/kg pirydoksyny przez 8 dni. Funkcję ich doprowadzających nerwów czuciowych o dużej średnicy testowano elektrofizjologicznie poprzez zapisywanie odpowiedzi w mięśniach łapy jako fali M (bezpośredni ruch) i fali H (odruch czuciowy) po stymulacji nerwu kulszowego uda i łydki (Gao i wsp., Ann. Neurol. 38 (1): 30-7 [1995]). Traktowanie pirydoksyna przez 8 dni doprowadziło do znacznego spadku amplitudy odpowiedzi czuciowej w porównaniu do odpowiedzi motorycznej jak widać na Fig. 18. Jednoczesne traktowanie Mab 2256 znacząco blokowało indukowany pirydoksyną spadek amplitudy czuciowej. Jest to podobne do efektów opublikowanych przy użyciu wysokich dawek (20 mg/kg dziennie) NT3 (Helgren i wsp., jak wyżej).

PL 208 113 B1

Zwierzęta traktowane w tym trybie pirydoksyną testowano również behawioralnie pod kątem ich funkcji propriocepcyjnych. Trenowano je aby szły po horyzontalnie ułożonej drabinie uciekając przed jasnym światłem i ostrym bodźcem dźwiękowym do ciemnego pudła. Zwierzęta filmowano na video z dołu i jakość stawiania ich lewych łap na szczeblach drabiny była odczytywana przez obserwatora nic nie wiedzącego o ich traktowaniu. Każde postawienie łapy oceniano jako dobre postawienie (łapa ląduje na przedniej części śródstopia, bezpośrednio za dużym palcem, z palcami natychmiast obejmującymi szczebel), solidne lądowanie (łapa uderza szczebel inaczej niż bezpośrednio za dużym palcem, ale solidnie, palce często nie obejmują szczebla, prawie błędne stąpnięcie (łapa ledwie uderza o szczebel, bądź skrajną przednią częścią palców bądź tylną częścią pięty, ale utrzymuje ciężar) i błędne stąpnięcie (łapa albo całkowicie mija szczebel albo tak złe stąpniecie, że stopa nie utrzymuje ciężaru i spada pod ciężarem z drabiny). Normalnie szczury bardzo szybko uczą się jak stawiać tylne łapy prawidłowo, co wymaga wspaniałego zmysłu propriocepcyjnego, gdzie tylna łapa znajduje się w przestrzeni. Po traktowaniu pirydoksyną (400 mg/kg dwa razy dziennie przez 8 dni), jakość wykonania tego zadania spadła, z prawie trzydziestoprocentowym zmieszeniem prawidłowego stąpania i wzrostem błędnych stąpnięć, jak i prawie błędnych stąpnięć (Fig. 18). Jednoczesne traktowanie zwierząt przez ten czas Mab 2256 umożliwiało zwierzętom utrzymywanie znacznie wyższej jakości wykonania zadania, z mniejszym obniżeniem poziomu prawidłowego stąpania i mniejszym wzrostem błędnych stąpnięć i prawie błędnych stąpnięć.

Podsumowując, jednoczesne traktowanie z Mab 2256 łagodzi toksyczne efekty pirydioksyny, co zmierzono biochemicznie, elektrofizjologicznie i poprzez wykonanie zadań behawioralnych.

Po ustaleniu, że Mab trkC były terapeutycznie prawie tak samo skuteczne jak NT-3, badano obserwowane niekorzystne efekty przeczulicy bólowej. Ten efekt uboczny podawania NT-3 był obserwowany u gryzoni (patrz Fig. 19) i u ludzi (Chaudhary i wsp., Muscle and Nerve 23: 189-192 [2000]). Szczury trenowano i testowano pod kątem wrażliwości termicznej tylnych kończyn przy zastosowaniu urządzenia Hargreavesa, a następnie podawano 1 mg/kg Mab 2256 IV lub 1 mg/kg NT-3 podskórnie w kark. Dwie, cztery i sześć godzin po podaniu szczury testowano ponownie pod kątem czasu cofania się pod wpływem ciepła. Jak można zobaczyć na widać Fig. 19, podawanie NT-3 powoduje znaczącą przeczulicę bólową na ciepło po czterech i sześciu godzinach po podaniu, podczas gdy Mab 2256 trkC nie miały żadnego wpływu na odczuwanie bólu termicznego. A zatem w dawkach, o których wiadomo, że są skuteczne w odwracaniu albo zapobieganiu neuropatii, NT-3 powoduje wzrost wrażliwości na ból, podczas gdy Mab 2256 nie.

Cisplatyna, szeroko stosowany czynnik chemioterapeutyczny, indukuje neuropatię czuciową z wybiórczą utratą odczuwania wibracji i propriocepcji. Tutaj pokazaliśmy, że neurotrofina-3 (NT-3), członek rodziny czynników wzrostu nerwu wśród czynników neurotroficznych, przywracała do prawidłowego poziom obniżonej szybkości przewodnictwa nerwu czuciowego związanego z odruchem H indukowanej przez cisplatynę u szczurów. Traktowanie NT-3 korygowało nieprawidłowe rozmieszczenie białka neurowłókna w dużych neuronach czuciowych w grzbietowym zwoju korzeniowym i zmieszenie liczby włókien mielinowych w nerwach łydkowych powodowane przez cisplatynę. Zależna od NT-3 odwracalna neurotoksyczność cisplatyny sugeruje zatem możliwość zastosowania NT-3 w leczeniu obwodowej neuropatii czuciowej.

Długotrwałe traktowanie dorosłych szczurów przez 2-3 tygodnie wysokimi dawkami pirydoksyny (witaminy B6) prowadziło do głębokiej utraty propriocepcji, podobnej do obserwowanej u ludzi przy przedawkowaniu tej witaminy albo leczeniu czynnikiem chemioterapeutyczym cisplatyną. Toksyczność pirydoksyny manifestuje się jako braki w prostym i precyzyjnym poruszaniu się i funkcji nerwów czuciowych i jako degeneracja grzbietowych nerwów czuciowych o dużej średnicy/dużych włóknach. Jak testowano ilościowo w zadaniu chodzenia po belkach i zapisie EMG fal M wywoływanych przez stymulację nerwów obwodowych, jednoczesne podawanie czynnika neurotroficznego neurotrofiny-3 (NT-3;

5-20 mg/kg/dzień, s.c.) w czasie długotrwałego traktowania pirydoksyną zmniejszało behawioralne i elektrofizjologiczne następstwa związane z toksycznością pirydoksyny.

Ponadto, podawanie NT-3 zapobiegało degeneracji włókien czuciowych w kolumnie grzbietowej rdzenia kręgowego. Dane te są zgodne z tym, że NT-3 jest pochodzącym z tkanki docelowej czynnikiem neurotroficznym dla mięśniowych doprowadzających czuciowych włókien i sugeruje, że dawki farmakologiczne NT-3 mogą być korzystne w leczeniu neuropatii dużych włókien czuciowych.

Depozyt materiału biologicznego

Następujące linie hybrydom i plazmidy zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) 21 czerwca 2000:

PL 208 113 B1

Hybrydoma/Plazmid/Oznaczenie	NrATCC
2.5.1	PTA-2151
6.1.2	PTA-2148
6.4.1	PTA-2150
2344	PTA-2144
2345	PTA-2146
2349	PTA-2153
2248	PTA-2147
2250	PTA-2149
2253	PTA-2145
2256	PTA-2152
DNA pXCA-2250HL	PTA-2136
DNA pXCA-2253HL	PTA-2137
DNA pXCA-2256HL	PTA-2138
DNA pXCA-6.1.2H	PTA-2141
DNA pXCA-6.4.1H	PTA-2143
DNA pXCA-2345H	PTA-2142
DNA pXCA-2349H	PTA-2133
DNA vegf4chim-6.1.2L	PTA-2134
DNA vegf4chim-6.4.1L	PTA-2135
DNA vegf4chim-2345L	PTA-2139
DNA vegf4chim-2349L	PTA-2140

Depozyty te wykonano zgodnie z porozumieniem budapeszteńskim dotyczącym międzynarodowego trybu dokonywania depozytów dla celów procedur patentowych (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) i zawartych tam regulacji (Porozumienie Budapeszteńskie). To zapewni utrzymywanie żywych hodowli przez 30 lat od daty zdeponowania. Organizmy będą udostępniane przez ATCC zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim i zgodnie z porozumieniem pomiędzy Genentech, Inc. a ATCC, które zapewnia stały i nieograniczony dostęp publiczny do potomstwa hodowli po przyznaniu właściwego patentu USA albo po publicznym udostępnieniu, w zależności od tego co będzie pierwsze i zapewnia dostępność potomstwa upoważnionym do tego przez komisję USA U.S. Commissioner of Patents and Trademarks zgodnie z 35 USC $122 i zawartymi tam dotyczącymi tego rozporządzeniami oceniających (włączając w to 37 CFR $ 1.12 ze szczególnym odniesieniem do 886 OG 638).

Co się tyczy tych zasad w przypadku patentu europejskiego, próbka zdeponowanego organizmu będzie dostępna przed opublikowaniem patentu europejskiego albo datą, kiedy zgłoszenie zostało odrzucone albo wycofane lub uważane za wycofane jedynie w przypadku wydania takiej próbki ekspertowi wyznaczonemu przez osobę proszącą o próbkę (Rozporządzenie 28(4) EPC).

Właściciele niniejszego zgłoszenia zgadzają się, że jeżeli hodowle albo depozyt straci żywotność albo zostanie zgubiony przy przechowywaniu w odpowiednich warunkach, będzie natychmiast zastąpiony po uzyskaniu zawiadomienia żywą próbką tej samej hodowli. Dostępność zdeponowanych szczepów nie ma być traktowana jako licencja na wykonywanie wynalazku w niezgodzie z prawami autorskimi gwarantowanymi przez autorytet dowolnego rządu zgodnie z jego prawami patentowymi.

PL 208 113 B1

Lista sekwencji <110> Genentech, Inc.

Devaux, Brigitte Hongo, Jo-Anne S.

Presta, Leonard G.

Shelton, David L.

<120> Agonistyczne przeciwciała monoklonalne anty-trkC <130> GENENT.040QPC <140> 60/238,319 <141> 2000-10-05 <160> 89 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Mysia <400> 1

Phe Trp Ile Glu Trp Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mysia <400> 2

Tyr Trp Met His Trp Val Lys 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ile Ser Thr Tyr Tyr Trp Asn 1 5

PL 208 113 B1 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ser Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mysia <400> 6

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Mysia <400> 7

Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Ser <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 9

Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

PL 208 113 B1

10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mysia <400> 12

Lys Asn Arg Asn Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val Val 15 10 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Mysia <400> 13

Lys Tyr Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val 15 10 15 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Asp Arg Asp Tyr Asp Ser Thr Gly Asp Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Met 15 10 15

Asp Val <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Asp Gly Gly Tyr Ser Asn Pro Phe Asp

1	5
<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo	sapiens
<400> 16

PL 208 113 B1

Glu Arg Ile Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr Tyr Tyr Asn Gly Leu Asp 15 10 15

Val <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Glu Arg Ile Ala Ala Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr Asn Gly Leu Ala 15 10 15

Val <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Mysia <400> 18

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 15 10 15

<210>	19
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Mysia
<400>	19
Ser Ala Ser

<210>	20
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Mysia
<400>	20
Arg Ala Ser

<210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 15 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT

PL 208 113 B1 <213> Homo sapiens <400> 22

Lys Ser Ser Gin Ser Val Ser Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 15 10 15

Ala <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 23

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Thr 15 10 <210 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Arg Ala Ser Gin Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 15 10 <210 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mysia <400 25

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Mysia <400> 26

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Mysia <400> 27

Ala Ala Ser Asn Gin Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 7

PL 208 113 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

5

<210>	31
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mysia
<400>	31
Gln His Ile

<210>	32
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mysia
<400>	32
Gln Gln Arg

<210>	33
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mysia
<400>	33
Gln Gln Ser

<210> 34 <211> 9 <212> PRT

PL 208 113 B1 <213> Homo sapiens <400> 34

Leu Gin His Asn Ser Leu Pro Leu Thr <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Gin Gin His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Pro Ile Thr 15 10

<210>	37
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mysia
<220>
<221>	NIEPEWNA
<222>	1
<223>	Xaa = F i

lub Y <221> NIEPEWNA <222> 3 <223> Xaa - I lub M <221> NIEPEWNA <222> 4 <223> Xaa = E lub H <400> 37

Xaa Trp Xaa Xaa Trp Val Lys 1 5

<210>	38
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Mysia
<220>
<221>	NIEPEWNA
<222>	3
<223>	Xaa = L i
<221>	NIEPEWNA

lub Y

PL 208 113 B1

<222>	5
<223>	Xaa — G lub S
<221>	NIEPEWNA
<222>	6
<223>	Xaa = S lub N
<221>	NIEPEWNA
<222>	7
<223>	Xaa = D lub G
<221>	NIEPEWNA
<222>	8
<223>	Xaa = N lub R
<221>	NIEPEWNA
<222>	17
<223>	Xaa = G lub S
<400>	38
Glu Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa	Xaa Thr Asn Tyr Asn Glu Lys	Phe Lys
1	5	10	15
Xaa

<210>	39
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	NIEPEWNA
<222>	1
<223>	Xaa = S lub I
<221>	NIEPEWNA
<222>	2
<223>	Xaa = G lub S
<221>	NIEPEWNA
<222>	3
<223>	Xaa = G, T lub	Y
<221>	NIEPEWNA
<222>	7
<223>	Xaa = S lub N
<400>	39
Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr	Trp Xaa
1	5

<210>	40
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	NIEPEWNA
<222>	1

PL 208 113 B1

<223>	Xaa = Y lub R
<221>	NIEPEWNA
<222>	3
<223>	Xaa = Y lub F
<221>	NIEPEWNA
<222>	4
<223>	Xaa = Y lub T
<221>	NIEPEWNA
<222>	8
<223>	Xaa = S lub R
<221>	NIEPEWNA
<222>	10
<223>	Xaa = N lub Y
<400>	40
Xaa Ile Xaa Xaa Ser Gly Ser Xaa Thr Xaa Asn Pro Ser Leu Lys Ser

10 15 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> NIEPEWNA <222> 8 <223> Xaa = A lub Τ <221> NIEPEWNA <222> 16 <223> Xaa = D lub A <400> 41

Glu Arg Ile Ala Ala Ala Gly Xaa Asp Tyr Tyr Tyr Asn Gly Leu Xaa 15 10 15

Val <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Mysia <400> 42

Asn 1

Gin

Val

Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala

Glu Leu Met

Gin

Pro 15

Gly

5

10

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Phe

Ser

Asn

20

25

30

Phe

Trp

Ile

Glu

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

His

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Ile

Gly

Glu

Ile

Leu

Pro

Gly

Ser

Asp

Asn

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Phe

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

65

70

75

80

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

PL 208 113 B1

				85					90		95
Cys	Ala	Arg	Lys	Asn	Arg	Asn	Tyr	Tyr	Gly Asn Tyr Val	Val	Trp Gly
			100					105		110
Gin	Gly	Thr	Leu	Val	Thr	Val	Ser	Ala	Cys
		115					120

<210> 43 <211> 122 <212> PRT <213> Mysia <400> 43

Asn Gin Val 1

Gin

Leu 5

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala 10

Glu

Leu

Met

Gin

Pro 15

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Phe

Ser

Asn

20

25

30

Phe

Trp

Ile

Glu

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

His

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Ile

Gly

Glu

Ile

Leu

Pro

Gly

Ser

Asp

Asn

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Phe

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

65

70

75

80

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Lys

Asn

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Val

Val

Trp

Gly

100

105

110

Ala

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

Cys

115

120

<210 44 <211> 126 <212> PRT <213> Mysia <400> 44

Asn Gin 1

Val

Gin

Leu Gin 5

Gin

Pro Gly Ala Glu Leu 10

Val

Lys

Pro 15

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

20

25

30

Tyr

Trp

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Ile

Gly

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

50

55

60

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

65

70

75

80

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

Lys

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Asn

Ser

Tyr

Arg

Ser

Trp

Tyr

Phe

100

105

110

Asp

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

Cys

115

120

125

<210>	45
<211>	130
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	45

PL 208 113 B1

Asn

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

1

5

10

15

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

20

25

30

Gly

Gly

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

35

40

45

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Asn

Pro

50

55

60

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

65

70

75

80

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Asp

Tyr

Asp

Ser

Thr

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Ser

100

105

110

Tyr

Tyr

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

120

125

Ser

Cys

130

<210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Asn

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Arg

Pro

Ser

1

5

10

15

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Thr

20

25

30

Tyr

Tyr

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Ala

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Ile

Gly

Arg

Ile

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

50

55

60

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Met

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

65

70

75

80

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ser

Asn

Pro

Phe

Asp

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Cys

115

<210> 47 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Asn 1

Gin

Val

Gin Leu Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro 10

Gly Leu Val

Lys

Pro 15

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

20

25

30

Gly

Gly

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

His

Pro

Glu

Lys

Gly

Leu

35

40

45

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Phe

Tyr

Ser

Gly

Arg

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

50

55

60

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

65

70

75

80

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Asn

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

PL 208 113 B1

85

90

95

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Ile

Ala

Ala

Ala

Gly

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

100

105

110

Asn

Gly

Leu

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

Cys

<210> 48 <211> 129 <212> PRT <213> Homo :

sapiens

<400> 48

Asn

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

1

5

10

15

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

20

25

30

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

35

40

45

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

50

55

60

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

65

70

75

80

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Ile

Ala

Ala

Ala

Gly

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

100

105

110

Asn

Gly

Leu

Ala

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

125

Cys

<210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Mysia

<400> 49 Asn Asp Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

1

5

10

15

Gly Gin Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Tyr

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Thr

20

25

30

Ser Gly Tyr

Ser

Tyr

Met

His

Trp

Asn

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

35

40

45

Pro Arg Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Val

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Ala Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

65

70

75

80

His Pro Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

His

Ile

85

90

95

Arg Glu Leu

Thr

Arg

Ser

Ala

Arg

Gly

Gin

Ser

Trp

Lys

Lys

Arg

Cys

100

105

110

<210>	50
<211>	109
<212>	PRT
<213>	Mysia

PL 208 113 B1 <400> 50

Asn

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

Met

Ser

Ala

Ser

Pro

1

5

10

15

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Ser

Tyr

20

25

30

Met

Tyr

Trp

Phe

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Thr

Ser

Pro

Lys

Leu

Trp

Ile

35

40

45

Tyr

Ser

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Met

Glu

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Arg

Ser

Ser

Tyr

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

Cys

100

105

<210> 51

<211> 114

<212> PRT

<213> Mysia

<400> 51

Asn

Asp Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Leu

1

5

10

15

Gly

Gin Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Ser

Val

Asp

Asn

20

25

30

Tyr

Gly Ile

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

35

40

45

Pro

Lys Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Gin

Gly

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Ala

Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser

Leu

Asn

Ile

65

70

75

80

His

Pro Met

Glu

Glu

Asp

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

85

90

95

Lys

Glu Val

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Met

Lys

100

105

110

Arg

Cys

<210> 52 <211> 110 <212> PRT <213> Homo :

sapiens

<400> 52 Asn Asp Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

1

5

10

15

Gly Asp Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Gly

Ile

Arg

Asn

20

25

30

Asp Leu Gly

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Arg

Leu

35

40

45

Ile Tyr Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

65

70

75

80

Pro Glu Asp

Phe

Ala

Thr

Phe

Tyr

Cys

Leu

Gin

His

Asn

Ser

Leu

Pro

85

90

95

Leu Thr Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Cys

PL 208 113 B1

	100	105	110
<210 53
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400 53
Asn	Asp Ile Gln Met Thr	Gln Ser Pro Asp Ser	Leu Ala Val Ser Leu
1	5	10	15
Gly	Glu Arg Ala Thr Ile	Asn Cys Lys Ser Ser	Gln Ser Val Ser Tyr
	20	25	30
Ser	Ser Asn Asn Lys Asn	Tyr Leu Ala Trp Tyr	Gln Gln Lys Pro Gly
	35	40	45
Gln	Pro Pro Lys Leu Leu	Ile Tyr Trp Ala Ser	Thr Arg Glu Ser Gly
	50	55	60
Val	Pro Asp Arg Ile Ser	Gly Ser Gly Ser Gly	Thr Asp Phe Thr Leu
65	70	75	80
Thr	Ile Ser Ser Leu Gln	Ala Glu Asp Val Ala	Val Tyr Tyr Cys Gln
	85	90	95
Gln	His Tyr Asn Thr Pro	Leu Thr Phe Gly Gly	Gly Thr Lys Val Glu
	100	105	110
Ile	Lys Arg Cys
	115

<210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Homo ;

sapiens

<400 54 Asn Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

1

5

10

15

Gly Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Ser

Ser

20

25

30

Asn Tyr

Leu

Thr

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

35

40

45

Leu Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

50

55

60

Ser Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

65

70

75

80

Glu Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Tyr

Gly

Arg

Ser

85

90

95

Pro Pro

Ile

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Cys

100

105

110

<210 <211> <212> <213>

55 112 PRT Homo

sapiens

<400>

55

Asn Gly Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

1

5

10

15

Gly Glu Arg

Ala

Thr

Phe

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Gly

Ser

Ser

20

25

30

Thr Tyr Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

35

40

45

PL 208 113 B1

Leu

Ile 50

Tyr

Gly Ala

Ser

Ser 55

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile 60

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

65

70

75

80

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

85

90

95

Pro

Pro

Ile

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Cys

100

105

110

<210> 56 <211> 808 <212> PRT <213> Homo :

sapiens

<400> 56

Cys

Pro

Ala

Asn

Cys

Val

Cys

Ser

Lys

Thr

Glu

Ile

Asn

Cys

Arg

Arg

1

5

10

15

Pro

Asp

Asp

Gly

Asn

Leu

Phe

Pro

Leu

Leu

Glu

Gly

Gin

Asp

Ser

Gly

20

25

30

Asn

Ser

Asn

Gly

Asn

Ala

Asn

Ile

Asn

Ile

Thr

Asp

Ile

Ser

Arg

Asn

35

40

45

Ile

Thr

Ser

Ile

His

Ile

Glu

Asn

Trp

Arg

Ser

Leu

His

Thr

Leu

Asn

50

55

60

Ala

Val

Asp

Met

Glu

Leu

Tyr

Thr

Gly

Leu

Gin

Lys

Leu

Thr

Ile

Lys

65

70

75

80

Asn

Ser

Gly

Leu

Arg

Ser

Ile

Gin

Pro

Arg

Ala

Phe

Ala

Lys

Asn

Pro

85

90

95

His

Leu

Arg

Tyr

Ile

Asn

Leu

Ser

Ser

Asn

Arg

Leu

Thr

Thr

Leu

Ser

100

105

110

Trp

Gin

Leu

Phe

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Gin

Leu

Glu

Gin

115

120

125

Asn

Phe

Phe

Asn

Cys

Ser

Cys

Asp

Ile

Arg

Trp

Met

Gin

Leu

Trp

Gin

130

135

140

Glu

Gin

Gly

Glu

Ala

Lys

Leu

Asn

Ser

Gin

Asn

Leu

Tyr

Cys

Ile

Asn

145

150

155

160

Ala

Asp

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Leu

Phe

Arg

Met

Asn

Ile

Ser

Gin

Cys

165

170

175

Asp

Leu

Pro

Glu

Ile

Ser

Val

Ser

His

Val

Asn

Leu

Thr

Val

Arg

Glu

180

185

190

Gly

Asp

Asn

Ala

Val

Ile

Thr

Cys

Asn

Gly

Ser

Gly

Ser

Pro

Leu

Pro

195

200

205

Asp

Val

Asp

Trp

Ile

Val

Thr

Gly

Leu

Gin

Ser

Ile

Asn

Thr

His

Gin

210

215

220

Thr

Asn

Leu

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

His

Ala

Ile

Asn

Leu

Thr

Leu

Val

225

230

235

240

Asn

Val

Thr

Ser

Glu

Asp

Asn

Gly

Phe

Thr

Leu

Thr

Cys

Ile

Ala

Glu

245

250

255

Asn

Val

Val

Gly

Met

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Ala

Leu

Thr

Val

Tyr

Tyr

260

265

270

Pro

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Leu

Glu

Glu

Pro

Glu

Leu

Arg

Leu

Glu

His

275

280

285

Cys

Ile

Glu

Phe

Val

Val

Arg

Gly

Asn

Pro

Pro

Pro

Thr

Leu

His

Trp

290

295

300

Leu

His

Asn

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Ser

Lys

Ile

Ile

His

Val

Glu

305

310

315

320

Tyr

Tyr

Gin

Glu

Gly

Glu

Ile

Ser

Glu

Gly

Cys

Leu

Leu

Phe

Asn

Lys

325

330

335

Pro

Thr

His

Tyr

Asn

Asn

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Ile

Ala

Lys

Asn

Pro

340

345

350

Leu

Gly

Thr

Ala

Asn

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Pro

PL 208 113 B1

355

360

365

Phe

Pro

Glu

Ser

Thr

Asp

Asn

Phe

Ile

Leu

Phe

Asp

Glu

Val

Ser

Pro

370

375

380

Thr

Pro

Pro

Ile

Thr

Val

Thr

His

Lys

Pro

Glu

Glu

Asp

Thr

Phe

Gly

385

390

395

400

Val

Ser

Ile

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

Ala

Phe

Ala

Cys

Val

Leu

Leu

Val

405

410

415

Val

Leu

Phe

Val

Met

Ile

Asn

Lys

Tyr

Gly

Arg

Arg

Ser

Lys

Phe

Gly

420

425

430

Met

Lys

Gly

Pro

Val

Ala

Val

Ile

Ser

Gly

Glu

Glu

Asp

Ser

Ala

Ser

435

440

445

Pro

Leu

His

His

Ile

Asn

His

Gly

Ile

Thr

Thr

Pro

Ser

Ser

Leu

Asp

450

455

460

Ala

Gly

Pro

Asp

Thr

Val

Val

Ile

Gly

Met

Thr

Arg

Ile

Pro

Val

Ile

465

470

475

480

Glu

Asn

Pro

Gin

Tyr

Phe

Arg

Gin

Gly

His

Asn

Cys

His

Lys

Pro

Asp

485

490

495

Thr

Tyr

Val

Gin

His

Ile

Lys

Arg

Arg

Asp

Ile

Val

Leu

Lys

Arg

Glu

500

505

510

Leu

Gly

Glu

Gly

Ala

Phe

Gly

Lys

Val

Phe

Leu

Ala

Glu

Cys

Tyr

Asn

515

520

525

Leu

Ser

Pro

Thr

Lys

Asp

Lys

Met

Leu

Val

Ala

Val

Lys

Ala

Leu

Lys

530

535

540

Asp

Pro

Thr

Leu

Ala

Ala

Arg

Lys

Asp

Phe

Gin

Arg

Glu

Ala

Glu

Leu

545

550

555

560

Leu

Thr

Asn

Leu

Gin

His

Glu

His

Ile

Val

Lys

Phe

Tyr

Gly

Val

Cys

565

570

575

Gly

Asp

Gly

Asp

Pro

Leu

Ile

Met

Val

Phe

Glu

Tyr

Met

Lys

His

Gly

580

585

590

Asp

Leu

Asn

Lys

Phe

Leu

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Asp

Ala

Met

Ile

Leu

595

600

605

Val

Asp

Gly

Gin

Pro

Arg

Gin

Ala

Lys

Gly

Glu

Leu

Gly

Leu

Ser

Gin

610

615

620

Met

Leu

His

Ile

Ala

Ser

Gin

Ile

Ala

Ser

Gly

Met

Val

Tyr

Leu

Ala

625

630

635

640

Ser

Gin

His

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Thr

Arg

Asn

Cys

Leu

Val

645

650

655

Gly

Ala

Asn

Leu

Leu

Val

Lys

Ile

Gly

Asp

Phe

Gly

Met

Ser

Arg

Asp

660

665

670

Val

Tyr

Ser

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Arg

Leu

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

Asp

675

680

685

Phe

Cys

Ile

Trp

Cys

Glu

Val

Gly

Gly

His

Thr

Met

Leu

Pro

Ile

Arg

690

695

700

Trp

Met

Pro

Pro

Glu

Ser

Ile

Met

Tyr

Arg

Lys

Phe

Thr

Thr

Glu

Ser

705

710

715

720

Asp

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

Val

Ile

Leu

Trp

Glu

Ile

Phe

Thr

Tyr

Gly

725

730

735

Lys

Gin

Pro

Trp

Phe

Gin

Leu

Ser

Asn

Thr

Glu

Val

Ile

Glu

Cys

Ile

740

745

750

Thr

Gin

Gly

Arg

Val

Leu

Glu

Arg

Pro

Arg

Val

Cys

Pro

Lys

Glu

Val

755

760

765

Tyr

Asp

Val

Met

Leu

Gly

Cys

Trp

Gin

Arg

Glu

Pro

Gin

Gin

Arg

Leu

770

775

780

Asn

Ile

Lys

Glu

Ile

Tyr

Lys

Ile

Leu

His

Ala

Leu

Gly

Lys

Ala

Thr

785

790

795

800

Pro

Ile

Tyr

Leu

Asp

Ile

Leu

Gly

805

<210> 57 <211> 2607

PL 208 113 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tgccctgcaa attgtgtctg cagcaagact gagatcaatt gccggcggcc ggacgatggg 60 aacctcttcc ccctcctgga agggcaggat tcagggaaca gcaatgggaa cgccaatatc 120 aacatcacgg acatctcaag gaatatcact tccatacaca tagagaactg gcgcagtctt 180 cacacgctca acgccgtgga catggagctc tacaccggac ttcaaaagct gaccatcaag 240 aactcaggac ttcggagcat tcagcccaga gcctttgcca agaaccccca tttgcgttat 300 ataaacctgt caagtaaccg gctcaccaca ctctcgtggc agctcttcca gacgctgagt 360 cttcgggaat tgcagttgga gcagaacttt ttcaactgca gctgtgacat ccgctggatg 420 cagctctggc aggagcaggg ggaggccaag ctcaacagcc agaacctcta ctgcatcaat 480 gctgatggct cccagcttcc tctcttccgc atgaacatca gtcagtgtga ccttcctgag 540 atcagcgtga gccacgtcaa cctgaccgta cgagagggtg acaatgctgt tatcacttgc 600 aatggctctg gatcacccct tcctgatgtg gactggatag tcactgggct gcagtccatc 660 aacactcacc agaccaatct gaactggacc aatgttcatg ccatcaactt gacgctggtg 720 aatgtgacga gtgaggacaa tggcttcacc ctgacgtgca ttgcagagaa cgtggtgggc 780 atgagcaatg ccagtgttgc cctcactgtc tactatcccc cacgtgtggt gagcctggag 840 gagcctgagc tgcgcctgga gcactgcatc gagtttgtgg tgcgtggcaa ccccccacca 900 acgctgcact ggctgcacaa tgggcagcct ctgcgggagt ccaagatcat ccatgtggaa 960 tactaccaag agggagagat ttccgagggc tgcctgctct tcaacaagcc cacccactac 1020 aacaatggca actataccct cattgccaaa aacccactgg gcacagccaa ccagaccatc 1080 aatggccact tcctcaagga gccctttcca gagagcacgg ataactttat cttgtttgac 1140 gaagtgagtc ccacacctcc tatcactgtg acccacaaac cagaagaaga cacttttggg 1200 gtatccatag cagttggact tgctgctttt gcctgtgtcc tgttggtggt tctcttcgtc 1260 atgatcaaca aatatggtcg acggtccaaa tttggaatga agggtcccgt ggctgtcatc 1320 agtggtgagg aggaotcagc cagoccactg caccacatca accacggcat caccacgccc 1380 tcgtcactgg atgccgggcc cgacactgtg gtcattggca tgactcgcat ccctgtcatt 1440 gagaaccccc agtacttccg tcagggacac aactgccaca agccggacac gtatgtgcag 1500 cacattaaga ggagagacat cgtgctgaag cgagaactgg gtgagggagc ctttggaaag 1560 gtcttcctgg ccgagtgcta caacctcagc ccgaccaagg acaagatgct tgtggctgtg 1620 aaggccctga aggatcccac cctggctgcc cggaaggatt tccagaggga ggccgagctg 1680 ctcaccaacc tgcagcatga gcacattgtc aagttctatg gagtgtgcgg cgatggggac 1740 cccctcatca tggtctttga ataoatgaag catggagacc tgaataagtt cctcagggcc 1800 catgggccag atgcaatgat ccttgtggat ggacagccac gccaggccaa gggtgagctg 1860 gggctctccc aaatgctcca cattgccagt cagatcgcct cgggtatggt gtacctggcc 1920 tcccagcact ttgtgcaccg agacctggcc accaggaact gcctggttgg agcgaatctg 1980 ctagtgaaga ttggggactt cggcatgtcc agagatgtct acagcacgga ttattacagg 2040 ctctttaatc catctggaaa tgatttttgt atatggtgtg aggtgggagg acacaccatg 2100 ctccccattc gctggatgcc tcctgaaagc atcatgtacc ggaagttcac tacagagagt 2160 gatgtatgga gcttcggggt gatcctctgg gagatcttca cctatggaaa gcagccatgg 2220 ttccaactct caaacacgga ggtcattgag tgcattaccc aaggtcgtgt tttggagcgg 2280 ccccgagtct gccccaaaga ggtgtacgat gtcatgctgg ggtgctggca gagggaacca 2340 cagcagcggt tgaacatcaa ggagatctac aaaatcctcc atgctttggg gaaggccacc 2400 ccaatctacc tggacattct tggctagtgg tggctggtgg tcatgaattc atactctgtt 2460 gcctcctctc tccctgcctc acatctccct tccacctcac aactccttcc atccttgact 2520 gaagcgaaca tcttcatata aactcaagtg cctgctacac atacaacact gaaaaaagga 2580 aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaccgc 2607 <210> 58 <211> 360 <212> DNA <213> Mysia <400> 58 caggtccaac tgcagcagtc tggggctgag ctgatgcagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagt ctactggcta cacattcagt aacttctgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gcagtgataa tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagaaagaat 300 cgtaactact atggtaacta cgttgtatgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

PL 208 113 B1 <210> 59 <211> 330 <212> DNA <213> Mysia <400> 59 gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300 tcggctcggg gacaaagttg gaaaaaacgg 330 <210> 60 <211> 360 <212> DNA <213> Mysia <400> 60 caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgcagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagt ctactggcta cacattcagt aacttctgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gcagtgataa tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagaaagaat 300 cgtaactact atggtaacta cgttgtctgg ggcgcaggca ccactctcac agtctcctca 360 <210> 61 <211> 321 <212> DNA <213> Mysia <400> 61 caaattgtgc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagtaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg aactaaaacg g 321 <210> 62 <211> 372 <212> DNA <213> Mysia <400> 62 caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta gcaacggtcg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaaatat 300 tactacggta atagctatcg ttcctggtac ttcgatgtct ggggcgcagg caccactctc 360

acagtctcct ca	372
<210> 63 <211> 336 <212> DNA <213> Mysia

PL 208 113 B1 <400> 63 gacattgtgc atctcctgca caacagaaac ggggtccctg cctatggagg acgttcggtg <210> 64 <211> 381 <212> DNA <213> Homo <400> 64 caggtgcagc acctgcactg cagcacccag tacaacccgt tccctgaagc cggatagcag accacggtca <210> 65 <211> 330 <212> DNA <213> Homo <400> 65 gaaattgtgt ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt ggccaaggga <210> 66 <211> 381 <212> DNA <213> Homo <400> 66 caggtgcagc acctgcactg cagcacccag tacaacccgt tccctgaagc cggatagcag accacggtca <210> 67 <211> 330 <212> DNA <213> Homo <400> 67 ggaattgtgt ttctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt ggccaaggga tgacccagtc gagccagcga caggacagcc ccaggtttag aggatgatac gaggcaccaa sapiens tgcaggagtc tctctggtgg aaaagggcct ccctcaagag tgaactctgt cagctggtgc ccgtctcctc sapiens tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta cacgactgga sapiens tgcaggagtc tctctggtgg ggaagggcct ccctcaagag tgagctctgt cagctggaac ccgtctcctc sapiens tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta cacgactgga tccagcttct aagtgttgat acccaaactc tggcagtggg tgcaatgtat gctggagatg gggcccagga ctccatcagc ggagtggatt tcgagttacc gactgccgcg ggactactac a

tccaggcacc gagtgttagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag gattaaacga gggcccagga ctccatcagc ggagtggatt tcgacttacc gactgccgcg ggactactac a

tccaggcacc gagtggtagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag gattaaacga ttggctgtgt aattatggca ctcatctatg tctgggacag ttctgtcagc aaacgg ctggtgaagc agtggtggtt gggtacatct atatcagtag gacacggccg tacaacggtt ctgtctttgt agcaactact ggtgcatcca gacttcactc cagtatggtc ctggtgaagc agtggttatt gggtacatct atatcagtag gacacggccg tacaacggtt ctgtctttgt agcacctact ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta ctctagggca gagggccacc 60 ttagttttat gaactggttc 120 ctgcatccaa ccaaggatcc 180 acttcagcct caacatccat 240 aaagtaagga ggttcctcgg 300

336 cttcacagac cctgtccctc 60 actactggag ctggatccgc 120 tttacagtgg gaggacctac 180 acacgtctaa gaaccagttc 240 tgtattactg tgcgagagag 300 tggacgtctg gggccaaggg 360

381 ctccagggga aagagccacc 60 taacctggta ccagcagaaa 120 gcagggccac tggcatccca 180 tcaccatcag cagactggag 240 gctcacctcc gatcaccttc 300

330 cttcacagac cctgtccctc 60 attattggag ctggatccgc 120 attacagtgg gagcacctac 180 acacgtctaa gaaccagttc 240 tgtattactg tgcgagagag 300 tggccgtctg gggccaaggg 360

381 ctccagggga aagagccact 60 tagcctggta ccagcagaaa 120 gcagggccac tggcatccca 180 tcaccatcag cagactggag 240 ggtcacctcc gatcaccttc 300

330

PL 208 113 B1 <210> 68 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 caggtgcagc acctgcactg cagcacccag tacaacccgt tccctgaagc cgggactatg gggaccacgg tgcaggagtc tctctggtgg ggaagggcct ccctcaagag tgagctctgt atagtaccgg tcaccgtctc gggcccagga ctccatcagc ggagtggatt tcgagttacc gactgccgcg ggattactac ctca ctggtgaagc agtggtggtt gggtacatct atatcagtgg gacacggccg tcctactacg cttcacagac actactggag attacagtgg acacgtctaa tgtattactg gtatggacgt cctgtccctc 60 ctggatccgc 120 gagcaccaac 180 gaaccagttc 240 tacgagagat 300 ctggggccaa 360

384 <210> 69 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 gatatccaga atcacttgcc gggaaagccc aggttcagcg gaagattttg gggaccaagg tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 caacttttta ctgtctacag cataatagtc ttccgctcac tttcggcgga 300 tggagatcaa acga 324 <210> 70 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 caggtgcagc acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgagct tacagtaacc tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc cttttgacta gggcccagga ctccatcagt gattgggcgt caccatgtca cgcggacacg ctggggccag ctggtgaggc acttactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt ggaaccctgg cttcggagac ggaactggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgag tcaccgtctc cctgtccctc 60 ccggcagccc 120 caactacaac 180 gttctccctg 240 agatgggggc 300 ctca 354 <210> 71 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gatatccaga atcaactgca tggtaccagc gaatccgggg atcagcagcc ccactcactt tgacccagtc agtccagcca agaaacctgg tccctgaccg tgcaggctga tcggcggagg tccagactcc gagtgtttca acagcctcct aatcagtggc agatgtggca gaccaaggtg ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 gtttattact gtcaacaaca ttataatact 300 gagatcaaac ga 342 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny

PL 208 113 B1 <400> 72 cagcagaaca aggtcctgga a <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 73 agcgggaagg ctctgagtg <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 74 agctgttggt gctgcgccag aa <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 75 tccattgaag acccattcga c <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 76 gccgacattg gctgtgaac <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 77 aggatgactg ggcagcttgg tcca <210> 78 <211> 20

PL 208 113 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 78 cagcccactg caccatatca <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 79 ctgtatccgg cccagcat <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 80 ccatggcatc actacacctt catcgct <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 81 tgggaaaatt gagatggcag a <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 82 gctgcctgaa gcacaaaagg <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny

PL 208 113 B1 <400> 83 cgcagatcct gccaaccgaa gaga 24 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 84 gacaccactc ttctggaaaa tgc 23 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 85 ttgccaaacc aacacctacc a 21 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 86 atcggacacc acctgtaggg aggacc 26 <210 87 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400 87 cagtggcaaa gtggagattg t 21 <210 88 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 88 aatttgccgt gagtggagtc 20 <210> 89 <211> 26 <212> DNA

PL 208 113 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 89 ccatcaacga ccccttcatt gacctc 26

Claims (71)

1. Agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-trkC, które (a) wykazuje brak reakcji krzyżowej z trkA lub trkB; i (b) rozpoznaje epitop w domenie 5 trkC.

2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że rozpoznaje ponadto epitop w domenie

4 trkC.

3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże trkC zarówno ludzki, jak i szczurzy.

4. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem ludzkim.

5. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem mysim.

6. Przeciwciało według zastrz. 5, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym.

7. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest skuteczne w leczeniu neuropatii indukowanej pirydoksyną lub cisplatyną.

8. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest skuteczne w leczeniu neuropatii cukrzycowej.

9. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że nie powoduje przeczulicy bólowej, kiedy jest podawane pacjentowi.

10. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że ma zwiększoną biodostępność w porównaniu z NT-3.

11. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że ma wyższą aktywność specyficzną w porównaniu z NT-3.

12. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada łańcuch ciężki zawierający następujące regiony determinujące dopasowanie (CDRy): CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 1, 2, 3, 4 i 5; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 6, 7, 8, 9, 10 i 11 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 12, 13, 14, 15, 16 i 17 i łańcuch lekki zawierający następujące CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciało jest skuteczne do naśladowania aktywności biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

13. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi go mysie przeciwciało posiadające łańcuch ciężki mysiego przeciwciała anty-trkC zawierający następujące CDRy:

(a) CDR1 o wzorze XaaWXaaXaaWVK (SEK NR ID: 37), gdzie Xaa w pozycji 1 to F albo Y; Xaa w pozycji 3 to I albo M; a Xad w pozycji 4 to E albo H;

(b) CDR2 o wzorze EIXaaPXaaXaaXaaXaaTNYNEKFKXaa (SEK NR ID: 38), gdzie Xaa w pozycji 3 to L albo Y; Xaa w pozycji 5 to G albo S; Xaa w pozycji 6 to S albo N; Xaa w pozycji 7 to D albo G; Xaa w pozycji 8 to N albo R i Xaa w pozycji 16 to G albo S; i (c) CDR3 o wzorze KNRNYYGNYVV (SEK NR ID: 12) albo KYYYGNSYRSWYFDV (SEK NR ID: 13) i łańcuch lekki zawierający następujące CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym

PL 208 113 B1 określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciało jest skuteczne do naśladowania aktywności biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

14. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi go ludzkie przeciwciało posiadające łańcuch ciężki ludzkiego przeciwciała anty-trkC zawierający następujące CDRy:

(a) CDR1 o wzorze XaaXaaXaaYYWXaa (SEK NR ID: 39), gdzie Xaa w pozycji 1 to S albo 1; Xaa w pozycji 2 to G albo S; Xaa w pozycji 3 to G, T albo Y, a Xaa w pozycji 7 to S albo N;

(b) a CDR2 o wzorze XaaIXaaXaaSGSXaaTXaaNPSLKS (SEK NR ID: 40), gdzie Xaa w pozycji 1 to Y albo R; Xaa w pozycji 3 to Y albo F; Xaa w pozycji 4 to Y albo T; Xaa w pozycji 8 to S albo R; a Xaa w pozycji 10 to N albo Y; i (c) CDR3 o wzorze wybranym z grupy składającej się z DRDYDSTGDYYSYYGMDV (SEK NR ID: 14); DGGYSNPFD (SEK NR ID: 15); ERIAAAGXaaDYYYNGLXaaV (SEK NR ID: 41), gdzie Xaa w pozycji 8 to A albo T i Xaa w pozycji 16 to D albo A i łańcuch lekki zawierający następujące CDRy: CDR1 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24; CDR2 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 25, 26, 27, 28, 29 i 30 oraz CDR3 wybrany z grupy składającej się z SEK NR ID: 31, 32, 33, 34, 35 i 36, przy czym określenie „przeciwciało obejmuje przeciwciała pełnej długości, przeciwciała wielospecyficzne i fragmenty przeciwciała i przy czym wspomniane agonistyczne przeciwciało jest skuteczne do naśladowania aktywności biologicznej naturalnego liganda receptora trkC.

15. Przeciwciało według zastrz. 13, znamienne tym, że zawiera ludzkie reszty zrębowe.

16. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA lub trkB.

17. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że ma strukturę homotetramerową złożoną z dwóch połączonych mostkami dwusiarczkowymi par łańcuch ciężki-łańcuch lekki.

18. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że fragment przeciwciała jest wybrany z grupy składającej się z fragmentów Fv, Fab, Fab' lub F(ab')2.

19. Przeciwciało według zastrz. 14, znamienne tym, że nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA lub trkB.

20. Przeciwciało według zastrz. 19, znamienne tym, że ma strukturę homotetramerową złożoną z dwóch połączonych mostkami dwusiarczkowymi par łańcuch ciężki-łańcuch lekki przeciwciała.

21. Przeciwciało według zastrz. 19, znamienne tym, że fragment przeciwciała jest wybrany z grupy składającej się z fragmentów Fv, Fab, Fab.' lub F(ab')2.

22. Przeciwciało według zastrz. 19, znamienne tym, że jest to IgG.

23. Przeciwciało według zastrz. 22, znamienne tym, że jest to IgG-2 i IgG-4.

24. Mysie agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-trkC, wybrane z grupy składającej się z przeciwciał 2248 (PTA-2147), 2250 (PTA-2149), 2253 (PTA-2145)i 2256 (PTA-2152).

25. Ludzkie agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-trkC, wybrane z grupy składającej się z przeciwciał 6.1.2 (PTA-2148), 6.4.1 (PTA-2150), 2345 (PTA-2146) i 2349 (PTA-2153), 2.5.1 (PTA-2151) i 2344 (PTA-2144).

26. Przeciwciało według zastrz. 25, wybrane z grupy składającej się z przeciwciał 6.1.2 (PTA-2148), 6.4.1 (PTA-2150), 2345 (PTA-2146) i 2349 (PTA-2153).

27. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca mysie agonistyczne przeciwciało anty-trkC zdefiniowane w zastrz. 24.

28. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca ludzkie agonistyczne przeciwciało anty-trkC zdefiniowane w zastrz. 25.

29. Cząsteczka kwasu nukleinowego zdeponowana w ATCC 21 czerwca 2000 pod numerem dostępu wybranym z grupy składającej się z PTA-2136, PTA-2137 i PTA-2138.

30. Cząsteczka kwasu nukleinowego zdeponowana w ATCC 21 czerwca 2000 pod numerem dostępu wybranym z grupy składającej się z PTA-2133, PTA-2134, PTA-2135, PTA-2139, PTA-2140, PTA-2141, PTA-2142 i PTA-2143.

31. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w którymkolwiek z zastrz. od 27 do 30.

32. Linia komórek gospodarza transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowaną w którymkolwiek z zastrz. od 27 do 30.

33. Linia komórek hybrydomy transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowaną w którymkolwiek z zastrz. od 27 do 30.

PL 208 113 B1

34 . Przeciwciało wytwarzane przez linię komórek hybrydomy zdefiniowaną w zastrz. 33.

35. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch ciężki agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC, gdzie taka wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy składającej się z SEK NR ID: 58, SEK NR ID: 60, SEK NR ID: 62, SEK NR ID: 64, SEK NR ID: 66, SEK NR ID: 68 i SEK NR ID: 70.

36. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch lekki agonistycznego przeciwciała monoklonalnego anty-trkC, gdzie taka wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy składającej się z SEK NR ID: 59, SEK NR ID: 61, SEK NR ID: 63, SEK NR ID: 65, SEK NR ID: 67, SEK NR ID: 69 i SEK NR ID: 71.

37. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 35 albo 36.

38. Linia komórek gospodarza transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowanego w zastrz. 35 albo 36.

39. Linia komórek gospodarza transformowana obydwiema, cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 35 i cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowana w zastrz. 36.

40. Linia komórek hybrydomy transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego według zastrz.

35 albo 36.

41. Linia komórek hybrydomy transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 35 i cząsteczką kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 36.

42. Przeciwciało wytwarzane przez linię komórek hybrydomy zdefiniowaną w zastrz. 40.

43. Przeciwciało wytwarzane przez linię komórek hybrydomy zdefiniowaną w zastrz. 41.

44. Polipeptyd kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 35 albo 36.

45. Polipeptyd, znamienny tym, że zawiera łańcuchy polipeptydowe kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 35 i cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 36.

46. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca skuteczną ilość agonistycznego monoklonalnego przeciwciała anty-trkC zdefiniowanego w zastrz. 1, 13 i 14, zmieszanego z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

47. Przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 1 do zastosowania w leczeniu neuropatii albo choroby neurodegeneracyjnej albo naprawiania uszkodzonej komórki nerwowej.

48. Przeciwciało według zastrz. 47, znamienne tym, że wspomniana neuropatia jest wybrana z grupy składającej się z neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej i neuropatii dużych włókien czuciowych.

49. Przeciwciało według zastrz. 47, znamienne tym, że wspomnianą chorobą neurodegeneracyjną jest stwardnienie zanikowe boczne (ALS).

50. Przeciwciało według zastrz. 47, znamienne tym, że wspomnianą komórką nerwową jest neuron czuciowy lub neuron ruchowy.

51. Przeciwciało według zastrz. 50, znamienne tym, że neuron czuciowy jest ze zwoju korzenia grzbietowego.

52. Przeciwciało według zastrz. 50, znamienne tym, że neuron ruchowy jest z rdzenia kręgowego.

53. Przeciwciało według zastrz. 47, znamienne tym, że jest do podawania dożylnego lub podskórnego.

54. Przeciwciało według zastrz. 47, znamienne tym, że jest do podawania miejscowego.

55. Przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 1, 13 lub 14 do zastosowania w metodzie leczenia obejmującej zwiększenie proliferacji, utrzymywanie lub regenerację neuronów obwodowych.

56. Izolowany kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 1-26 do zastosowania w metodzie leczenia choroby albo stanu związanych z degeneracją komórkową u ssaka.

57. Kwas nukleinowy według zastrz. 56, znamienny tym, że choroba albo stan jest wybrana z grupy składającej się z neuropatii, choroby albo uszkodzenia komórki nerwowej.

58. Kwas nukleinowy według zastrz. 56, znamienny tym, że wspomnianą komórką jest komórka nerwowa.

59. Kwas nukleinowy według zastrz. 56, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórki ex vivo.

60. Kwas nukleinowy według zastrz. 56, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wprowadzany do wspomnianej komórki in vivo.

61. Sposób wytwarzania agonistycznego przeciwciała anty-trkC, które nie wykazuje znaczącej reakcji krzyżowej z trkA lub trkB; i (b) rozpoznaje epitop w domenie 5 trkC, znamienny tym, że obejPL 208 113 B1 muje wytwarzanie przeciwciała wiążącego swoiście trkC w miejscu zachodzącym na miejsce wiązania natywnego liganda NT-3 wspomnianego trkC.

62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że to przeciwciało wiąże trkC w zasadniczo tym samym miejscu, co natywny ligand NT-3 wspomnianego trkC.

63. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że to przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie domeny 5 trkC.

64. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że takim trkC jest natywny ludzki polipeptyd trkC.

65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że wspomniany epitop obejmuje reszty aminokwasowe L284, E287 i N335 takiego natywnego ludzkiego trkC.

66. Zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1-23 do wytwarzania leku do leczenia chorób zdefiniowanych w zastrz. 47-49.

67. Zastosowanie według zastrz. 66, znamienne tym, że wspomniane leczenie jest w komórkach zdefiniowanych w zastrz. 50-52.

68. Zastosowanie według zastrz. 65, znamienne tym, że wspomniany lek jest do podawania takiego jak zdefiniowano w zastrz. 53 - 54.

69. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało zdefiniowane w jednym z zastrz. 1-23 do wytwarzania leku do leczenia chorób zdefiniowanych w zastrz. 56 lub 57.

70. Zastosowanie według zastrz. 69, znamienne tym, że leczenie dotyczy obwodowych komórek nerwowych.

71. Zastosowanie według zastrz. 69 lub 70, znamienne tym, że wspomnianym kwasem nukleinowym do wprowadzania jest kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 56 lub 57.